Kulturelle sowie 16S rDNA basierte Untersuchungen der aeroben
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Tierärztliche Hochschule Hannover Kulturelle sowie 16S rDNA basierte Untersuchungen der aeroben und anaeroben Keimflora des equinen Uterus INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.) vorgelegt von MAREIKE TÄTE aus Bremen Hannover 2011 Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Burkhard Meinecke Institut für Reproduktionsbiologie 1. Gutachter: Prof. Dr. Burkhard Meinecke 2. Gutachter: Prof. Dr. Heinrich Bollwein Tag der mündlichen Prüfung: 28.10.2011 Diese Arbeit wurde durch die Stiftung Gestüt Fährhof gefördert Philipp und meinen Eltern Inhaltsverzeichnis Inhalt 1 Einleitung .......................................................................................... 1 2 Literaturübersicht ............................................................................ 3 2.1 Der Genitaltrakt der Stute ........................................................................... 3 2.1.1 Anatomie und Ontogenese ..................................................................... 3 2.1.2 Histologie des Uterus .............................................................................. 4 2.1.3 Uterine Abwehrmechanismen ................................................................. 5 2.1.3.1 Resistente und empfängliche Stuten ................................................. 8 2.1.3.2 Mögliche Ursachen der Empfänglichkeit von Stuten gegenüber Endometritiden .................................................................................. 9 2.1.4 Altersabhängige Veränderungen .......................................................... 10 2.1.5 Zyklusabhängige Veränderungen ......................................................... 12 2.2 Endometritis ............................................................................................... 14 2.2.1 Infektiöse Endometritis ......................................................................... 14 2.2.1.1 Endometritis und Nachweis aerober Bakterien ............................... 15 2.2.1.2 Endometritis und Nachweis anaerober Bakterien ........................... 20 2.2.1.3 Pathogenitätsmechanismen ............................................................ 21 2.2.2 Nicht infektiöse Endometritis................................................................. 26 2.3 Nachweis von Bakterien ............................................................................ 27 2.3.1 Probenentnahme .................................................................................. 27 2.3.2 Kulturabhängiger Nachweis .................................................................. 31 2.3.3 Kulturunabhängiger Nachweis .............................................................. 31 2.3.4 Aussagekraft bakteriologischer Ergebnisse .......................................... 33 2.4 Exfoliative Endometriumzytologie ........................................................... 34 2.5 Physiologische Keimflora ......................................................................... 36 2.6 Mikrobielle Flora des Genitaltraktes der Stute ........................................ 37 2.6.1 Bakterienflora des Vestibulums, der Vagina und der Zervix ................. 37 2.6.2 Bakterienflora des Uterus ..................................................................... 40 Inhaltsverzeichnis 3 Material und Methode .................................................................... 45 3.1 Versuchsaufbau ......................................................................................... 45 3.2 Probanden .................................................................................................. 47 3.3 Gynäkologische Untersuchung ................................................................ 47 3.4 Versuchsgruppeneinteilung...................................................................... 50 3.5 Probenentnahme........................................................................................ 51 3.5.1 Probenentnahme bei Fohlen ................................................................ 52 3.5.2 Probenentnahme bei zweijährigen und älteren Stuten ......................... 55 3.5.3 Entnahmetechnik für die bakteriologische Untersuchung ..................... 56 3.5.4 Entnahmetechnik für die zytologische Untersuchung ........................... 56 3.6 Prüfung der Probenentnahme bezüglich Kontaminationen ................... 57 3.7 Probenentnahme für den Vergleich der Entnahmetechniken ................ 58 3.8 Probenaufbereitung und Auswertung ...................................................... 58 3.8.1 Probenaufbereitung und Auswertung der bakteriologischen Untersuchung ....................................................................................... 58 3.8.2 Probenaufbereitung und Auswertung der exfoliativen Endometriumzytologie .......................................................................... 61 3.9 Molekularbiologische Untersuchungen ................................................... 62 3.9.1 Nukleinsäure-Extraktion ........................................................................ 62 3.9.2 Partielle Amplifikation des 16S rDNA Gens .......................................... 63 3.9.3 Agarosegelelektrophorese .................................................................... 64 3.9.4 PCR-Produktaufreinigung ..................................................................... 64 3.9.5 Sequenzierung der PCR-Produkte ....................................................... 64 3.9.6 Auswertung der Sequenzen ................................................................. 66 3.9.7 Taxonomische Einordnung ................................................................... 67 3.10 Statistische Auswertung ........................................................................... 68 4 Ergebnisse ...................................................................................... 70 4.1 Angaben zum Stutenkollektiv und der gynäkologischen Untersuchung ............................................................................................ 70 4.2 Ergebnisse der bakteriologischen Untersuchungen .............................. 71 4.2.1 Fakultativ pathogene Bakterienarten .................................................... 72 Inhaltsverzeichnis 4.2.2 Apathogene Bakterienarten .................................................................. 73 4.2.3 Aerobe und anaerobe Bakterien ........................................................... 74 4.2.4 Stärke des Keimgehaltes ...................................................................... 75 4.3 Bakteriologische Ergebnisse in Bezug zu den Versuchsgruppen ........ 76 4.3.1 Fohlen ................................................................................................... 76 4.3.2 Maidenstuten ........................................................................................ 77 4.3.3 Stuten, die resorbiert haben, und güste sowie umrossende Stuten ...... 77 4.3.4 Klinisch auffällige Stuten ....................................................................... 78 4.3.5 Versuchsgruppen vergleichend ............................................................ 79 4.4 Ergebnisse der Exfoliativzytologie........................................................... 82 4.5 Zytologische Ergebnisse in Bezug zu den Versuchsgruppen ............... 84 4.6 Bakteriologische Befunde in Zusammenhang mit zytologischen Befunden .................................................................................................... 85 4.7 Bakteriologische und zytologische Befunde in Zusammenhang mit den Versuchsgruppen ............................................................................... 86 4.8 Bakteriologische und zytologische Befunde in Zusammenhang mit gynäkologischer Untersuchung sowie Anamnese ................................. 87 4.8.1 Vulva-Befundkategorie und Bakteriologie und Zytologie ...................... 87 4.8.2 Zyklusstand und Bakteriologie und Zytologie ....................................... 88 4.8.3 Vulva-Befundkategorie in Zusammenhang mit dem Alter der Stuten ... 89 4.9 Ergebnis der Prüfung der Probenentnahme bezüglich Kontaminationen ....................................................................................... 90 4.10 Vergleich der Entnahmetechniken ........................................................... 91 4.11 Ergebnisse der molekularbiologischen Untersuchungen ...................... 92 4.11.1 Molekularbiologische Differenzierung ausgewählter Bakterienisolate .. 92 4.11.2 Bestimmung der Nukleinsäuresequenz ................................................ 95 4.11.3 Genbankabgleich der Nukleinsäuresequenzen .................................... 96 4.11.4 Taxonomische Einordnung der molekularbiologisch nicht bestimmbaren Bakterienisolate........................................................... 100 5 Diskussion .................................................................................... 105 5.1 Diskussion der Methodik ........................................................................ 105 Inhaltsverzeichnis 5.2 Bakteriologische und zytologische Untersuchungen .......................... 108 5.2.1 Fohlen und Maidenstuten ................................................................... 108 5.2.2 Anamnestisch auffällige Stuten........................................................... 114 5.2.3 Klinisch auffällige Stuten ..................................................................... 116 5.3 Molekularbiologische Untersuchungen ................................................. 119 5.4 Weitere Untersuchungen ........................................................................ 124 5.5 Ausblick und Fazit für die Praxis............................................................ 129 6 Zusammenfassung ...................................................................... 131 7 Summary ....................................................................................... 133 8 Literaturverzeichnis ..................................................................... 135 9 Anhang .......................................................................................... 158 9.1 Laborgeräte .............................................................................................. 158 9.2 Verbrauchsmaterialien ............................................................................ 158 9.3 Chemikalien .............................................................................................. 159 9.4 Puffer und Lösungen ............................................................................... 160 9.5 Nährmedien .............................................................................................. 160 9.6 Tabellenverzeichnis ................................................................................. 162 9.7 Abbildungsverzeichnis ............................................................................ 163 9.8 DNA Sequenzen ....................................................................................... 166 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung BLAST Basic Local Alignment Search Tool BU Bakteriologische Untersuchung bp engl.: base pair(s) (Basenpaare) bzw. beziehungsweise ca. circa °C Grad Celsius CEM engl.: contagious equine metritis (kontagiöse equine Metritis) cm Zentimeter dest. destillata DNA engl.: deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) dNTPs Desoxyribonukleosid-Triphosphate ddNTPs Didesoxyribonukleosid-Triphosphate E. coli Escherichia coli engl. englisch et al. lat.: et alii (und andere) Fa. Firma g Erdbeschleunigung HPLC-Wasser engl.: High Performance Liquid Chromatography (Wasser für die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) Ig Immunglobulin K Kapseltyp Kap. Kapitel lat. lateinisch LAVES Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit Lsg. Lösung MHz Megahertz min Minute Abkürzungsverzeichnis ml Milliliter mm Millimeter µl Mikroliter n Probenzahl NCBI National Center for Biotechnology Information nm Nanometer Nr. Nummer p Signifikanz PCR engl.: polymerase chain reaction (Polymerasekettenreaktion) PG Prostaglandin PVP Polyvinylpyrrolidon rDNA engl.: ribosomal deoxyribonucleic acid (ribosomale Desoxyribonukleinsäure) rpm engl.: rounds per minute (Umdrehungen pro Minute) s Sekunde s. siehe Sc. Streptococcus SDS Sodium-Dodecyl-Sulfat (engl. Natriumdodecylsulfat) sp. Spezies ssp. Subspezies Tab. Tabelle TAE Tris-Acetat-Ethylendiamintetraessigsäure Taq Thermus aquaticus Tris Tri-(Hydroxymethyl-) Aminomethan UV Ultraviolett VBNC engl.: viable but not culturable (lebensfähig aber nicht kultivierbar) z. B. zum Beispiel ZU Zytologische Untersuchung Einleitung 1 Einleitung Bakterielle Endometritiden sind bei der Stute die häufigste Ursache von Fertilitätsstörungen und ein Hauptgrund für wirtschaftliche Verluste in der kommerziellen Pferdezucht (MERKT 1957, CAUSEY 2006). Bei der Diagnose von Endometritiden ist neben der klinisch gynäkologischen Untersuchung die bakteriologische Untersuchung von Endometriumtupfern die Standardmethode. Da der gesunde Uterus laut Fachliteratur lediglich nach der Geburt sowie nach der Bedeckung physiologisch Bakterien aufweist, werden in Endometriumtupferproben nachgewiesene Bakterien stets als pathologische oder kontaminationsbedingte transiente Besiedler des Uterus gewertet (WOOLCOCK 1980, TILLMANN et al. 1982, HINRICHS et al. 1988, HANDLER 2005). Die Annahme, dass der gesunde Uterus der Stute steril ist, wurde vorbehaltlos akzeptiert, obwohl es kaum Studien gibt, die diese Ansicht belegen. Es ist schwer nachzuvollziehen, wie diese Annahme entstanden ist und zur allgemeinen Lehrmeinung werden konnte, da fast alle Studien zum bakteriologischen Keimgehalt des Uterus an infertilen Stuten erfolgten und dabei in der Regel nur die fakultativ pathogenen, nicht aber die apathogenen Bakterien berücksichtigt wurden. Lediglich SCOTT et al. (1971), RICKETTS und MACKINTOSH (1987) sowie NASH et al. (2010) zweifelten die Annahme des sterilen Uterus an und vermuteten, dass der Nachweis von Bakterien aus dem Uterus ohne weitere Entzündungsanzeichen ein Hinweis auf eine ständige bakterielle Besiedlung des Uterus ist. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den equinen Uterus von Fohlen und gesunden adulten Stuten auf das Vorkommen einer physiologischen bakteriellen Besiedlung zu untersuchen. Hierzu wurden sowohl von Fohlen als auch von klinisch geschlechtsgesunden Maidenstuten Uterustupferproben auf aerobe, mikroaerophile sowie anaerobe Bakterien untersucht. Die parallele Entnahme und Bewertung einer zytologischen Probe erlaubte die sichere Feststellung eines reaktionsfreien 1 Einleitung Endometriums, so dass eventuell nachgewiesene Bakterien tatsächlich als physiologische Besiedler der Gebärmutter eingestuft werden konnten. Des Weiteren wurde das mikrobielle Keimspektrum anamnestisch sowie gynäkologisch auffälliger Stuten analysiert. Dies erfolgte durch die parallele Untersuchung und Bewertung bakteriologischer und zytologischer Proben von Stuten, die resorbiert haben, güsten Stuten, umrossenden Stuten sowie von klinisch auffälligen Stuten. Um nähere Informationen über die apathogenen und anaeroben Bakterien des Uterus zu erhalten, wurden die in der Mikrobiologie isolierten apathogenen sowie anaeroben Bakterien molekularbiologisch untersucht und über ihre 16S rDNA Sequenz identifiziert. Um aussagekräftige bakteriologische Ergebnisse zu gewährleisten, wurde im Vorfeld der Vorgang der Probenentnahme und der Probenverarbeitung auf mögliche Kontaminationsquellen geprüft. 2 Literaturübersicht 2 Literaturübersicht 2.1 Der Genitaltrakt der Stute 2.1.1 Anatomie und Ontogenese Die weiblichen Geschlechtsorgane setzen sich aus den Ovarien, den Eileitern, dem Uterus, der Vagina, dem Vestibulum vaginae, der Vulva und der Klitoris zusammen. Während die Eileiter, der Uterus und die Vagina embryonal aus den paarigen Müllerschen Gängen entstehen, geht das Vestibulum vaginae aus dem Sinus urogenitalis hervor (SCHNORR u. KRESSIN 2001). An der Verschmelzungsstelle der Müllerschen Gänge mit dem Sinus urogenitalis ist bei Maidenstuten eine unvollständige Trennwand, das Hymen, ausgebildet (BARTMANN et al. 2002). Der Uterus der Stute ist ein Uterus bicornis und beginnt kaudal mit der 60-70 mm langen Cervix uteri. Sie dient als Verschluss- und Schutzeinrichtung und bildet den Canalis cervicalis, der mit dem trichterförmigen Ostium uteri internum in den Uterus mündet. Das Ostium uteri externum wird von der deutlich in die Vagina vorspringenden Portio vaginalis aufgenommen. Die Schleimhaut des Canalis cervicalis weist Längsfalten auf und aufgrund ihrer kräftigen Wandmuskulatur sowie ihres derben Bindegewebes lässt sich die Zervix von rektal gut palpieren. Im Gegensatz zu anderen Haussäugetieren besitzt die Zervix beim Pferd keine besonderen Verschlussvorrichtungen und ist auch im geschlossenen Zustand für geeignete Instrumente passierbar. Der Uterus weist einen großen und geräumigen, etwa 250 mm langen Corpus uteri auf, der von der Becken- in die Bauchhöhle hineinragt. Die beiden ebenfalls etwa 250 mm langen, schlauchförmigen Cornua uteri divergieren ventral konvex durchgebogen vom Uteruskörper nach kranial, wo sie mit ihren stumpfen Enden die Eileiter erreichen. In Position gehalten werden der 3 Literaturübersicht Uteruskörper und die Uterushörner von dem flächig ausgedehnten Mesometrium (BARTMANN et al. 2002, LEISER 1999). 2.1.2 Histologie des Uterus Der Uterus weist einen typischen Schichtenaufbau aus Endometrium (Tunica mucosa), Myometrium (Tunica muscularis) und Perimetrium (Tunica serosa) auf (KENNEY 1978). Das luminale Endometrium wird in die Lamina epithelialis und die Lamina propia unterteilt. Bei der Lamina epithelialis handelt es sich um ein einschichtiges, hochprismatisches Oberflächenepithel, von dem weniger als die Hälfte der Zellen Zilien tragen (KENNEY 1978). Die Lamina propia ist aus proliferationsaktivem, spinozellulärem Bindegewebe aufgebaut, welches zahlreiche tubulär verzweigte Uterindrüsen und Gefäße einschließt. Subepithelial ist das Bindegewebe reich an spezifischen und unspezifischen Immunzellen wie Makrophagen, Lymphozyten, Plasmazellen und Mastzellen (LEISER 1990, LIEBICH 2004). Die endometriale Oberfläche formt 12 bis 15 longitudinale Schleimhautfalten. Im Querschnitt bildet der Uterus durch diese Falten radial angeordnete Bereiche, die jeweils von 2 aktiven endometrialen Oberflächen umgeben werden. Das uterine Lumen besteht also, besonders deutlich ausgeprägt zwischen den aneinanderliegenden Schleimhautfalten, lediglich aus kapillaren Spalten (KENNEY 1978). Dem Endometrium schließt sich ohne Submucosa das Myometrium an. Es besteht aus einer inneren, sehr kräftigen, zirkulär angeordneten Schicht glatter Muskulatur, einer mittleren gefäßführenden Bindegewebsschicht und einer äußeren, schwächeren, longitudinal verlaufenden Schicht glatter Muskulatur (BARTMANN et al. 2002, LIEBICH 2004). 4 Literaturübersicht Peripher bildet der auf den Uterus übertretende Bauchfellüberzug als Perimetrium den Abschluss der Uteruswand (LEISER 1999). Bei der Cervix uteri ist die Tunica mucosa in Primärfalten gelegt, welche wiederum mit Sekundär- und Tertiärfalten besetzt sind. Die hohen Zervikalfalten gehen nach kranial in die flacher werdenden Längsfalten des Uterus über. Die Tunica mucosa der Zervix setzt sich neben Becherzellen und Flimmerzellen vor allem aus muzinogenen Zellen zusammen, was es ihr ermöglicht, relativ große Mengen von flüssigem bis viskösem Sekret zu produzieren. Das Bindegewebe ihrer Lamina propia ist zell- und faserreich sowie von derber Konsistenz und auch ihr Myometrium ist sehr kräftig ausgebildet (LEISER 1990, LIEBICH 2004). Nach Angaben von KLEINEN (2006) macht der bindegewebige Anteil der Cervix uteri beim Pferd 44,3 % aus. KLEINEN (2006) erklärte diesen hohen Bindegewebsanteil mit der Notwendigkeit eines festen Schlusses der Zervix bei der Stute, die ja eine relativ kurze Zervix ohne weitere Verschlusseinrichtungen besitzt. 2.1.3 Uterine Abwehrmechanismen Die Abwehrmechanismen des Uterus bestehen aus komplexen Interaktionen zwischen anatomischen, immunologischen und physikalischen Komponenten. Als anatomische Barrieren wirken die eng aneinander liegenden Labien der Vulva, der Hymenalring, der vor allem während des Diöstrus aufgrund des Musculus constrictor vestibulae eine Sphinkterfunktion hat, und die Zervix. Im Östrus öffnet sich die Zervix, produziert Mukus und ermöglicht so einen nach kaudal gerichteten reinigenden Sekretstrom, während sie im Diöstrus aufgrund der Kontraktion der glatten Muskulatur und des zähen Zervikalmukus als Verschluss fungiert (TILLMANN et al. 1982). HINRICHS et al. (1988) und KLEIN et al. (2009) wiesen entlang der kaudokranialen Achse des Genitaltraktes am Übergang vom Vestibulum zur Vagina die größte Reduktion der bakteriellen Besiedlung nach. Sie leiteten daraus ab, dass 5 Literaturübersicht vor allem der Hymenalring der Stute einen unspezifischen Schutz vor aufsteigenden bakteriellen Kontaminationen bietet. Bei Defekten der anatomischen Barrieren können paarungsunabhängig Keime über die Vagina in den Uterus aufsteigen und eine chronische Endometritis etablieren (HURTGEN 2006). Zu den wichtigsten immunologischen Abwehrkomponenten des Uterus zählen Immunglobuline, neutrophile Granulozyten und das Komplementsystem. Bakterien und anderes antigenetisches Material führen im Uterus zu einem schnellen Influx von neutrophilen Granulozyten und zu einer Freisetzung von chemotaktischen Mediatoren wie Komplementproteinen, Leukotrienen und Prostaglandinen, welche wiederum eine Migration von neutrophilen Granulozyten und Immunglobulinen in das Uteruslumen fördern (WATSON et al. 1987). Eine wichtige Rolle bei der Phagozytose von Antigenen spielt die Opsonisierung. Die Opsonine, vor allem Immunglobuline und Komplementproteine, erhöhen die Bindung von Antigenen an die Zellmembran der Phagozygoten und beschleunigen so den Prozess der Phagozytose (ASBURY und LYLE 1993). Eine Akkumulation von Flüssigkeit im Uterus führt zu einer Inaktivierung von Komplementproteinen, was wiederum zu einer verminderten Phagozytoseleistung führt (TROEDSSON 1999). Das equine Endometrium wird als Teil des „mucosa-associated lymphoid tissue“ betrachtet, das auch im Gastrointestinal- und Respirationstrakt vorkommt (WIDDERS et al. 1985). Es enthält Immunzellen wie z. B. die Langerhans-Zellen, die Antigene erkennen und präsentieren können, B-Lymphozyten, die Antikörper produzieren und über spezielle Zellen an die Schleimhautoberfläche abgeben können, und T-Lymphozyten. Von den in Uterussekreten nachgewiesenen Immunglobulinen IgG, IgA und IgM ist das IgG aufgrund seiner wichtigen Rolle bei der Opsonisierung das bedeutendste Immunglobulin im Uterus (WATSON 1988). Zu den physikalischen Komponenten der uterinen Abwehrmechanismen zählt unter anderem die myometriale Kontraktion. Intrauterine bakterielle Infusionen führen am Uterus von Stuten zu einer erhöhten myometrialen Aktivität. TROEDSSON et al. vermuteten (1993a), dass die von den neutrophilen Granulozyten freigesetzten 6 Literaturübersicht Prostaglandine für die Zunahme der myometrialen Aktivität während einer Infektion verantwortlich sind. In einer nachfolgenden Studie konnte dieselbe Arbeitsgruppe nachweisen, dass sowohl PGF2α und PGE2 als auch Oxytocin eine verstärkte myometriale Aktivität hervorrufen (TROEDSSON et al. 1995). Neben der zervikalen Dilatation und der myometrialen Kontraktion ist auch die lymphatische Drainage für die uterine clearance wichtig. Lymphgefäße und Lymphknoten sorgen im Uterus für den Abfluss von überschüssiger Flüssigkeit aus der Submukosa und dem Lumen (LEBLANC et al. 1995). Zilientragende Endometriumzellen mit einer Zilienschlagfrequenz von etwa 13 Schlägen pro Sekunde und der Nachweis von Mukus auf der endometrialen Oberfläche führten zu der Hypothese, dass der equine Uterus einen mukoziliaren Apparat, wie er im Respirationstrakt vorkommt, als zusätzlichen Abwehrmechanismus gegen Infektionen besitzt (CAUSEY 2007). In den Atemwegen entfernt der gerichtete Transport des Bronchialschleims nicht nur potentielle Pathogene, sondern auch Zelldebris. Im Gegensatz zu dem mukoziliaren Apparat des Respirationstraktes interferiert der Mukus im Uterus allerdings nicht mit Luft, sondern mit einem flüssigen Milieu (CAUSEY et al. 2000, CAUSEY 2007). Die zwischen den auf die Zervikalfalten übergehenden Uterusfalten gelegenen länglichen kapillaren Spalten (KENNEY 1978) könnten als eine Art Führung für mukoziliäre Ströme fungieren (CAUSEY 2007). Für eine optimale Funktion des mukoziliaren Apparates ist auch die Beschaffenheit des Mukus wichtig. Veränderungen der Elastizität und Viskosität können mit seiner Fähigkeit, Partikel aufzunehmen und über längere Strecken zu transportieren, interferieren. Wenn der Mukus in freier Flüssigkeit gelöst wird, kommt es zu einer Abnahme der Viskosität und umgekehrt können zähe Sekrete eine zu hohe Viskosität erzeugen (CAUSEY 2007). Während bei akuten und subakuten Endometritiden die Mukusproduktion verstärkt ist, haben Stuten mit chronischen Entzündungen eine Zunahme der Viskosität des Mukus. Auch die an der Endometritis beteiligte Bakterienart kann die Beschaffenheit des Mukus beeinflussen (LEBLANC et al. 2007). Der Mukus verhindert außerdem, dass Bakterien sich an Zellrezeptoren binden (CAUSEY 2006). 7 Literaturübersicht Zu den wichtigsten Abwehrmechanismen hochentwickelter Organismen zählen neben den anatomischen und chemisch-physikalischen Barrieren sowie dem Immunsystem auch die individuelle wirtseigene Keimflora der Haut, der Schleimhäute und der nach außen offenen Körperhöhlen (MAYR 2002). Da die meisten Autoren in der Literatur jedoch davon ausgehen, dass der Uterus steril ist (SPARKS et al. 1977, TILLMANN et al. 1982, HANDLER 2005, PAETZ 2009), liegen keine Angaben über eine mögliche Beteiligung einer physiologischen Keimflora an der Keimabwehr des Uterus vor. 2.1.3.1 Resistente und empfängliche Stuten Anhand ihrer Fähigkeit, experimentelle bakterielle Infektionen des Uterus innerhalb von 96 Stunden selbständig und erfolgreich zu bekämpfen, können Stuten in resistent oder empfänglich gegenüber einer persistierenden Endometritis eingeordnet werden (TROEDSSON und LIU 1991a). Bereits 1969 haben Untersuchungen von PETERSEN et al. ergeben, dass nach einer intrauterinen Verabreichung von Streptococcus zooepidemicus-Suspensionen güste und multipare Stuten häufiger eine persistierende Endometritis entwickeln als Maidenstuten. Auch HUGHES und LOY (1969) stellten bei ihren Untersuchungen eine hohe Resistenz von jungen Stuten gegenüber einer künstlichen bakteriellen Infektion fest. ASBURY und LYLE (1993) merkten an, dass ein Versagen der uterinen Abwehrmechanismen den Prozess der uterinen clearance meistens jedoch nur verlangsamt und die Empfänglichkeit gegenüber einer Endometritis keinen absoluten Status einer Zuchtstute darstellt. Empfängliche Stuten haben eine Tendenz zur Akkumulation von Flüssigkeit im Uterus. Bei Untersuchungen von TROEDSSON und LIU (1991a) akkumulierte bei empfänglichen Stuten nach einer bakteriellen Infektion sechsmal so viel Flüssigkeit im Uterus wie bei resistenten Stuten. 8 Literaturübersicht 2.1.3.2 Mögliche Ursachen der Empfänglichkeit von Stuten gegenüber Endometritiden In verschiedenen Studien wurde untersucht, ob bestimmte Defekte der Abwehrmechanismen des Uterus für die Emdometritisempfänglichkeit von Stuten verantwortlich sein können. LIU et al. (1986) fanden heraus, dass sich die Anzahl der neutrophilen Granulozyten im Uterus nach einer Infektion bei resistenten und empfänglichen Stuten nicht unterscheidet. Die Hypothese, dass empfängliche Stuten einen Defekt bei der Freisetzung von Opsoninen haben (ASBURY et al. 1984), konnte durch spätere Studien widerlegt werden (BROWN et al. 1985a). Auch die ursprüngliche Annahme, dass empfängliche Stuten zu wenig Immunglobuline im Uterus haben, wurde durch die Arbeitsgruppe von ASBURY et al. (1980) widerlegt, die bei empfänglichen Stuten sogar höhere Antikörperkonzentrationen nachwies als bei resistenten Stuten. KATILA (1996) stellte abschließend fest, dass es bisher keinen schlüssigen Beweis für eine immunologische Fehlfunktion bei empfänglichen Stuten gibt. Eine verzögerte mechanische clearance empfänglicher Stuten konnten TROEDSSON und LIU (1991b) bei dem Vergleich von empfänglichen mit resistenten Stuten hinsichtlich der Eliminierung eines nicht-antigenen Markers aus dem Uterus feststellen. TROEDSSON et al. (1993a) wiesen bei resistenten Stuten eine höhere Frequenz, höhere Intensität und längere Dauer der myometrialen Aktivität als bei empfänglichen Stuten nach. Obwohl die myometriale Aktivität vor allem bei älteren und multiparen Stuten reduziert ist, können auch Maidenstuten mit guter myometrialer Aktivität endometritisempfänglich sein. Verschiedene Autoren (LEBLANC 2003, MALSCHITZKY et al. 2006) gehen davon aus, dass bei diesen Stuten eine Fehlfunktion der Zervix, die mit einem zu frühen Verschluss einhergeht, die Hauptursache für persistierende Endometritiden darstellt. 1994 stellten LEBLANC et al. folgende Hypothese für die Pathogenese der Endometritis auf: Wenn der Uterus nicht gereinigt ist, bevor sich die Zervix schließt, sorgt bei resistenten Stuten 9 Literaturübersicht das Lymphsystem für den Abtransport von Entzündungsprodukten. Bei empfänglichen Stuten verbleiben Entzündungsprodukte im Uteruslumen und führen dann zu weiteren entzündlichen Vorgängen sowie zu einer Irritation des Endometriums (LEBLANC et al. 1994). Verglichen mit resistenten Stuten ist bei empfänglichen Stuten die lymphatische Drainage geringer ausgeprägt (LEBLANC et al. 1995). Laut KATILA (1996) bieten Defekte in der mechanischen Drainage des Uterus bisher die besten Erklärungen für die Empfänglichkeit von Stuten gegenüber Uterusinfektionen. Einige Studien sind der Hypothese gefolgt, dass bei empfänglichen Stuten Störungen der mukoziliaren clearance vorliegen. Empfängliche Stuten weisen zum Beispiel eine reduzierte Anzahl uteriner Längsfalten auf und häufig findet man bei ihnen auch Epitheldefekte sowie eine verminderte Anzahl von Zilien (BRACHER et al. 1992, CAUSEY 2007). Die Annahme, dass beim Pferd ein mukoziliarer Apparat vorkommt und dass Störungen des Mukusflusses an der Pathogenese von persistierenden Infektionen beteiligt sind, erscheint schlüssig, doch bisher gibt es dafür keine ausreichenden Beweise (CAUSEY 2007). 2.1.4 Altersabhängige Veränderungen Die Geschlechtsorgane von juvenilen Tieren sind von geringerer Größe und geringerem Gewicht als die von adulten Tieren. Sie lassen erkennen, dass sie ihre spätere Funktion noch nicht aufgenommen haben. Ihre Schleimhaut weist eine hellere Färbung auf und die Bänder des Aufhängeapparates sind dünn, zum Teil sogar durchsichtig, und enthalten sehr feine nur wenig geschlängelte Blutgefäße. Der Uterus ist symmetrisch und ebenso wie die Zervix von weicher Konsistenz. Die Schleimhautfaltung der Zervix zeigt bereits ihre arttypische Struktur, ist aber zierlicher und weniger deutlich ausgeprägt (SEIFERLE 1933). Bei Untersuchungen am Genitaltrakt eines Kalbes stellte SEIFERLE 1933 fest, dass der Zervikalkanal für seine Schere immer leicht passierbar und mehr oder weniger weit offen war. 10 Literaturübersicht Der Genitaltrakt von geschlechtsreifen Tieren ist in seiner Gesamtheit beträchtlich größer. Die Wandungen sind dicker, die Zervix ist von fester Beschaffenheit und die Schleimhäute zeigen eine intensivere Färbung. Der Geschlechtsapparat ist voll funktionstüchtig und unterliegt den zyklussynchronen Veränderungen (LEISER 1999, SEIFERLE 1933). Untersuchungen an Stuten zeigen, dass die Wandung der Zervix mit zunehmendem Alter immer dicker wird. So stellte RÖBER 1914 bei einer jungen Maidenstute eine Wanddicke von 1,5 cm und bei einer zwanzigjährigen Stute von 3,5 cm fest. Weitere Veränderungen der Geschlechtsorgane vollziehen sich während und im Anschluss an eine Trächtigkeit. Das mikroskopische Bild des juvenilen equinen Uterus zeigt einen einheitlichen Aufbau. Die typischen Schichten der Uteruswand sind durch eine gleichmäßige Verteilung der Gewebeelemente noch nicht deutlich ausgebildet. Das Bindegewebe ist noch recht locker und gleichmäßig verteilt, es sind relativ wenig Uterindrüsen vorhanden, die Muskulatur ist nur spärlich ausgebildet und es ist kein deutliches Stratum vasculare vorhanden. Das geschilderte histologische Bild der Uteruswand erklärt sich aus der bisherigen Funktionslosigkeit des Organs (SEIFERLE 1933). Das Zervixepithel von juvenilen Rindern besteht vor allem aus Basalzellen und Zylinderzellen, während zilientragende Zellen nur sehr selten vorkommen. Bei adulten Tieren weist das Epithel mehr als zehnmal so viele Zilienzellen auf (WROBEL 1971). Ein deutlicher Unterschied zwischen Juvenilen und Adulten zeigt sich bei dem Vorkommen von Abwehrzellen im Uterus. WIDDERS et al. (1985) konnten im Epithel des Genitaltraktes von juvenilen Stuten keinerlei Plasmazellen und Immunglobuline feststellen. In der Lamina propia war der Unterschied dann nicht mehr ganz so eindeutig, lediglich das Vorkommen von IgM war bei juvenilen Stuten deutlich reduziert. Beim Kalb sind in der Zervix auch die Mastzellen nur selten darzustellen (WROBEL 1971). WIDDERS et al. (1985) und WROBEL (1971) erklärten das verminderte Vorkommen von Immunzellen bei juvenilen Tieren mit dem fehlenden stimulierenden Einfluss von antigenetischem Material. 11 Literaturübersicht 2.1.5 Zyklusabhängige Veränderungen Mit einem Alter von 291 bis 408 Tagen erreichen im Frühjahr geborene Stuten die Geschlechtsreife (BROWN-DOUGLAS et al. 2004). Stuten zählen zu den saisonalpolyöstrischen Tieren und ihr Sexualzyklus weist eine Länge von 18 bis 22 Tagen auf. Die verschiedenen Phasen des Sexualzyklus spiegeln sich in makroskopischen und mikroskopischen zyklischen Veränderungen der Genitalorgane wider, die durch die Steroide Östrogen und Progesteron beeinflusst werden. Eine Ausnahme stellen die Ovarien dar, deren Funktionen durch Gonadotropine reguliert werden. Makroskopisch sind vor allem die zyklischen Veränderungen an der Zervix und dem Uterus auffällig. Mit beginnendem Östrus wird die Zervix unter Östrogeneinfluss weicher und die Portio vaginalis senkt sich auf den Vaginalboden. Sie ist für 3 oder mehr Finger passierbar, ödematisiert und ihre Schleimhaut ist hyperämisch. Durch die vermehrte Produktion von dünnflüssigem Schleim im Östrus erscheint die Schleimhaut der Vagina und der Zervix feucht glänzend. Unter Progesteroneinfluss im Diöstrus stellt sich die Zervix durch einen hohen Muskeltonus gut abgrenzbar dar. Der äußere Muttermund ist verschlossen und der nur in geringen Mengen sezernierte, hochvisköse Schleim zeigt eine typische Graufärbung. Die Schleimhäute der Vagina und der Zervix sind blass und trocken. Auch die Uteruswand zeigt unter Östrogeneinfluss eine deutliche Ödematisierung, wodurch im Ultraschall das Erscheinungsbild einer „Radspeichenstruktur“ entsteht. Im Diöstrus geht unter Progesteroneinfluss das Ödem zurück und der Uterus stellt sich homogen dar (KAINER 1993, HANDLER und AURICH 2005). Die mikroskopischen zyklussynchronen Veränderungen betreffen vor allem das Endometrium, an dem 3 Funktionsphasen unterschieden werden können. Die unter Östrogeneinfluss stehende Proliferationsphase (Präöstrus, Östrus, Postöstrus, ca. 8 Tage) ist durch vermehrte Epithelzellanzahl, zunehmende Epithelhöhe, Stromaödem und gestreckte Schlauchdrüsen gekennzeichnet. Um den Ovulationszeitpunkt herum sezernieren die Epithelzellen vermehrt dünnflüssigen Mukus. Unter Progesteron12 Literaturübersicht dominanz geht das Endometrium in die Sekretionsphase (früher und mittlerer Diöstrus, ca. 9 Tage) über. Während die Epithelien in dieser Phase an Höhe verlieren und das Stromaödem zurückgeht, sind die Lumina der Uterindrüsen erweitert, mit Sekret gefüllt und geben ein mukoides Sekret ab. Während der Involutionsphase (später Diöstrus, ca. 4 Tage) sind die inaktiven Uterindrüsen stark gewunden und die Epithelien flach (BRUNCKHORST u. SCHOON 1990, KENNEY 1978, SCHOON et al. 1992). Es gilt als gesicherte Erkenntnis, dass Stuten unter Progesterondominanz empfänglicher für Uterusinfektionen sind als Stuten unter Östrogeneinfluss. Auf immunologischer Ebene bestehen Unterschiede im Vorkommen von Abwehrzellen im Genitaltrakt. Während des Östrus haben neutrophile Granulozyten die Tendenz, in kleinen Kapillaren der Uteruswand zu akkumulieren (KENNEY 1978). Auch können sie im Östrus extravaskulär sowohl in der Propia als auch im luminalen Epithel nachgewiesen werden (BRUNCKHORST und SCHOON 1990). WASHBURN et al. (1982) stellten in ihren Untersuchungen fest, dass die Phagozytosekapazität der zirkulierenden neutrophilen Granulozyten, im Gegensatz zu ihrer Anzahl, jedoch unabhängig vom Zyklus ist. Anders sieht die Situation allerdings nach einer experimentellen bakteriellen Infektion aus. Die zirkulierenden neutrophilen Granulozyten von mit Östrogen behandelten Stuten zeigen dann eine bessere phagozytotische Aktivität als die von mit Progesteron behandelten oder ovariektomierten Stuten (WASHBURN et al. 1982). Plasmazellen kommen beim Pferd im gesamten Genitaltrakt vor. Ein Einfluss des Zyklus auf ihre Anzahl kann allerdings nicht festgestellt werden (WATSON u. STROKES 1988). Im Zervikalgewebe kommt es im Östrus zu einer verstärkten Infiltration mit eosinophilen Granulozyten und Mastzellen (HUCHZERMEYER 2003). Wenn man die physikalischen Abwehrkomponenten des Uterus betrachtet, wird der Einfluss von Östrogen und Progesteron auf die uterinen Abwehrmechanismen deutlicher. Unter Östrogeneinfluss ist die Zervix geöffnet, während sie unter Progesteroneinfluss geschlossen ist. Die myometrialen Kontraktionen des Uterus variieren auch zyklusabhängig. Während die Frequenz immer gleich bleibt, ist die 13 Literaturübersicht Aktivitätsdauer im Diöstrus länger und die Intensität im Östrus höher (TROEDSSON et al. 1993b). Außerdem zeigen Uterusepithelzellen von Stuten, die mit Östrogen behandelt wurden, eine geringere Adhäsion von Bakterien als Epithelzellen von unbehandelten Stuten (WATSON et al. 1988). 2.2 Endometritis Als Endometritis werden, unabhängig von ihrer Ätiologie, entzündliche Veränderungen des Endometriums bezeichnet, bei denen das Vorkommen von freien Entzündungszellen über das physiologische Maß einer im endometrialen Zyklus stets auftretenden Infiltration hinausgeht. Die entzündlichen Veränderungen lassen sich histopathologisch anhand der vorherrschenden Zelltypen, der Lokalisationen im Endometrium sowie der Verteilung und dem Grad der Infiltration charakterisieren (SCHOON et al. 1992). Entzündliche Veränderungen des Endometriums werden als Hauptursache für Fruchtbarkeitsstörungen bei der Stute angesehen (LEIDL et al. 1976). Eine durch TRAUB-DARGATZ et al. (1991) durchgeführte Befragung von 1149 Pferdetierärzten in den USA ergab, dass in Abhängigkeit vom Praxistyp, der Mitarbeiteranzahl sowie der Praxislage die Endometritis der dritt- bis fünfthäufigste Grund ist, weshalb adulte Pferde dort dem Tierarzt vorgestellt werden. 2.2.1 Infektiöse Endometritis Es kommt zu Uterusinfektionen, wenn nach dem Eindringen von Erregern die uterinen Selbstreinigungsmechanismen versagen, wie es bei endometritis- empfänglichen Stuten der Fall ist, oder die Pathogenität der Erreger sowie der Infektionsdruck sehr hoch sind. 14 Literaturübersicht Zu den möglichen Erregern einer Endometritis zählen Bakterien, Hefen und Pilze, wobei den Bakterien die größte Bedeutung zukommt. Hefen und Pilze werden vermehrt nach antibiotischen Behandlungen in Uterustupfern nachgewiesen (DASCANIO et al. 2001). Bei Versuchen von BLUE (1983) konnten bei 3 zuvor geschlechtsgesunden Stuten nach einer Penicillin-Behandlung und einer Manipulation des Uterus zweimal Aspergillus fumigatus und einmal Candida albicans nachgewiesen werden. Im Gastrointestinaltrakt kann es durch den Einsatz von Antibiotika zu einer Enteritis kommen, wenn die physiologische Keimflora aus dem Gleichgewicht gerät. Warum es im Uterus, der nach den meisten Literaturangaben steril ist, nach einer antibiotischen Behandlung vermehrt zu Pilz- und Hefeinfektionen kommt, ist noch unklar. Es wird vermutet, dass es vaginal zu einer Verschiebung der Keimflora zu Gunsten der Pilze und Hefen kommt und diese dann durch Bedeckungen oder Manipulationen in den Uterus gelangen und dort bei empfänglichen Stuten eine Endometritis verursachen (DASCANIO et al. 2001). 2.2.1.1 Endometritis und Nachweis aerober Bakterien Bei Bakterien wird zwischen apathogenen, fakultativ pathogenen und obligat pathogenen Bakterien unterschieden. Apathogene Bakterien des Uterus Zu den im Uterus vorkommenden aeroben apathogenen Bakterien zählen Acinetobacter Streptokokken, ssp., Actinobacillus anhämolysierende ssp., Aerococcus Streptokokken, ssp., α-hämolysierende coryneforme Bakterien, Enterococcus ssp., Enterobacter ssp., E. coli, koagulasenegative Staphylokokken, Pasteurella ssp., Proteus ssp., Staphylococcus intermedius, Staphylococcus epidermidis (MERKT et al. 1987, ALBIHIN et al. 2003, KLEIN et al. 2009). Sie sind primär nicht dazu in der Lage, eine Infektion auszulösen, können aber zusammen mit 15 Literaturübersicht fakultativ pathogenen Bakterien im Rahmen einer Endometritis nachgewiesen werden. Fakultativ pathogene Bakterien des Uterus Fakultativ pathogene Bakterien können bei Organismen mit einer Abwehrschwäche oder bei sehr hoher Keimdichte zu einer Infektion führen, während sie bei gesunden Organismen keine Auswirkung zeigen. Der Nachweis von fakultativ pathogenen Bakterien muss daher stets im Zusammenhang mit den klinischen Symptomen, der Intensität der Besiedlung sowie dem Vorkommen der Bakterien in Rein- oder Mischkultur bewertet werden (LEIDL et al. 1976). Die Wahrscheinlichkeit, dass Bakterien zu Uterusinfektionen führen können, ist bei dichten Reinkulturen größer als bei wenigen Bakterienkolonien in Mischkultur (TILLMANN et al. 1982, NIELSEN 2005). Beim Pferd werden in der Regel folgende aerobe Bakterienarten bzw. gruppen den fakultativ pathogenen Bakterien des Uterus zugeordnet (LEIDL et al. 1976, RICKETTS 1981, TILLMANN et al. 1982, MERKT et al. 1987, ALBIHIN et al. 2003, KLEIN et al. 2009): ○ β-hämolysierende Streptokokken ○ E. coli variatio hämolytica ○ Klebsiella pneumoniae ○ Pseudomonas aeruginosa ○ Staphylococcus aureus ○ Taylorella equigenitalis Seltener werden auch Proteus ssp. und Enterobacter aerogenes (RICKETTS 1981), nicht hämolysierende E. coli und Bordetella bronchiseptica (MERKT et al. 1987) sowie Actinobacillus equuli und Corynebacterium equi (TILLMANN et al. 1982) genannt. 16 Literaturübersicht Die größte Bedeutung als Krankheitserreger haben die β-hämolysierenden Streptokokken, die für mehr als 50 % der bakteriellen Uterusinfektionen verantwortlich sind (MERKT et al. 1987, NIELSEN 2005, FRONTOSO et al. 2008). Streptococcus equi ssp. zooepidemicus ist dabei die häufigste Ursache der Endometritis bei der Stute (MERKT et al. 1987, NIELSEN 2005). Aber auch die ebenfalls zu den β-hämolysierenden Streptokokken zählende Bakterienart Streptococcus dysgalactiae ssp. equisimilis wird gelegentlich im Rahmen der Endometritisdiagnostik in Uterustupferproben nachgewiesen. Das Verhältnis von Streptococcus equi ssp. zooepidemicus zu Streptococcus dysgalactiae ssp. equisimilis beträgt dabei etwa 9 zu 1 (BOCKLISCH et al. 1988, PLAGEMANN 1988). Bei 83,7 % der in Reinkultur nachgewiesenen β-hämolysierenden Streptokokken konnten TILLMANN et al. (1982) auch zytologisch eine entzündliche Reaktion des Endometriums feststellen. Klinisch auffällig ist bei Endometritiden durch βhämolysierende Streptokokken vor allem die massive Produktion von wässrigem Exsudat, welches sich im Ultraschallbild gut darstellen lässt (DIMOCK und EDWARDS 1928, LEBLANC et al. 2007). Während einige Autoren nur hämolysierende E. coli den fakultativ pathogenen Bakterien zuordnen (LEIDL et al. 1976), stufen andere Autoren auch ein auf der Agarplatte dominierendes Wachstum nicht hämolysierender E. coli (ALBIHIN et al. 2003, NIELSEN 2005, FRONTOSO et al. 2008) oder jegliches Wachstum nicht hämolysierender E. coli als fakultativ pathogen ein (TILLMANN et al. 1982, HUCHZERMEYER 2003, RIDDLE et al. 2007). Häufig wird auch gar nicht zwischen hämolysierenden und nicht hämolysierenden E. coli unterschieden. Bei den Studien, in denen eine Unterscheidung vorgenommen wurde, liegt der Anteil der hämolysierenden E. coli an den nachgewiesenen E. coli bei etwa 2 bis 6 % (ALBIHIN et al. 2003, FRONTOSO et al. 2008, NEUBERG 2009). Je nach äußeren Umständen, der Entnahmetechnik sowie dem Anteil fertiler und infertiler Stuten variiert der Anteil von E. coli an der Gesamtzahl der nachgewiesenen fakultativ pathogenen Bakterien. Bei den jährlichen Herbstuntersuchungen von Vollblutstuten von 1961 bis 1985 wurde in 11 % der 2118 Tupferproben mit fakultativ pathogenem 17 Literaturübersicht Keimgehalt hämolysierende oder nicht hämolysierende E. coli nachgewiesen (MERKT et al 1987). NIELSEN (2005) und RIDDLE et al. (2007) erhielten mit 14 bzw. 15 % ähnliche Werte. Bei den Untersuchungen von ALBIHIN et al. von 2003 kamen nicht hämolysierende E. coli als häufigster Keim mit einen Anteil von mehr als 50 % vor. ALBIHIN et al. (2003) konnten außerdem eine signifikante Korrelation zwischen dem Nachweis nicht hämolysierender E. coli und wiederholtem symptomlosen Umrossen nachweisen. TILLMANN et al. (1982) stellten hingegen fest, dass nur 21,3 % der in Reinkultur nachgewiesenen hämolysierenden sowie nicht hämolysierenden E. coli-Isolate auch eine entzündliche Reaktion des Endometriums auslösten. Auch WAELCHLI et al. (1993) konnten bei in Reinkultur isolierten hämolysierenden sowie nicht hämolysierenden E. coli nur in 12,5 % der Fälle gleichzeitig eine positive zytologische Untersuchung nachweisen. Die Bedeutung von hämolysierenden sowie nicht hämolysierenden E. coli als Endometritiserreger ist demnach noch nicht vollständig geklärt. Klinisch gehen E. coli-Endometritiden häufig mit einem zähen Entzündungsexsudat einher (LEBLANC et al. 2007). Klebsiella pneumoniae hat einen Anteil von 0 bis 11 % an der Gesamtheit der fakultativ pathogenen Bakterien des Uterus (MERKT et al. 1987, ALBIHIN et al. 2003, NIELSEN 2005, FRONTOSO et al. 2008). Bei den Untersuchungen von TILLMANN et al. (1982) induzierten sie, wenn sie als Reinkultur vorlagen, in 85,9 % der Fälle eine entzündliche Veränderung des Endometriums. Klebsiella pneumoniaeEndometritiden gehen bei der Stute meistens mit einem trüben, zähen sowie schleimigen Entzündungsexsudat im Uteruslumen einher (DIMOCK und EDWARDS 1928, WOOLCOCK 1980). Der Anteil von Pseudomonas aeruginosa an den fakultativ pathogenen Bakterien liegt bei 6 bis 9 % (MERKT et al. 1987, NIELSEN 2005, FRONTOSO et al. 2008). Klinisch treten Infektionen des Uterus mit Pseudomonas aeruginosa vor allem durch ein zähes, milchiges, weiß bis gelbgrünes Entzündungsexsudat in Erscheinung (DIMOCK und EDWARDS 1928, WOOLCOCK 1980). 18 Literaturübersicht Staphylococcus aureus zählt zu den Plasmakoagulase-positiven Staphylokokken und macht 0 bis 5 % der fakultativ pathogenen Bakterien aus (MERKT et al. 1987, ALBIHIN et al. 2003, NIELSEN 2005, FRONTOSO et al. 2008). Einer der Hauptpathogenitätsfaktoren von Staphylococcus aureus ist die Biofilmbildung. Taylorella equigenitalis ist der Erreger der meldepflichtigen kontagiösen equinen Metritis (contagious equine metritis, CEM). Es handelt sich bei der CEM um eine primäre Deckinfektion, die erstmals 1977 bei Vollblütern in Irland und Großbritannien nachgewiesen wurde (CROWHURST 1977, TIMONEY et al. 1977). Klinisch äußert sich die Erkrankung bei der Stute meistens als Endometritis und Vaginitis mit mukopurulentem Ausfluss, während sie beim Hengst in der Regel symptomlos verläuft (SELBITZ 2002, AURICH 2005). Begünstigt durch die hohe Infektiosität des Erregers, das Vorkommen latent infizierter Tiere beider Geschlechter sowie dem vermehrten internationalen Transport von Pferden kam es in den darauf folgenden Jahren zu einer weltweiten Verbreitung der Erkrankung. Durch die routinemäßige Untersuchung von Zuchttieren vor der Decksaison sowie Import- und Exportbestimmungen von Pferden und Tiefgefriersperma konnte die Erkrankung jedoch zurückgedrängt werden (TIMONEY und POWELL 1988, TIMONEY 1996). Vereinzelt gibt es seitdem neue Krankheitsausbrüche, wobei meistens nur Einzeltiere oder kleine Gruppen betroffen sind (COOKE und PARKER 2003, KRISTULA und SMITH 2004). Die Mehrzahl der als Endometritiserreger in Frage kommenden Bakterien sind demnach Opportunisten, die sowohl extragenitale Lokalisationen als auch die kaudalen Genitalorgane besiedeln. Der Fokus der Ursachenforschung der Endometritis liegt daher vermehrt auf prädisponierenden Faktoren, wie zum Beispiel einem mangelhaften Schamschluss oder anderen Defiziten im Bereich der uterinen Abwehrmechanismen (s. Kap. 2.1.3). 19 Literaturübersicht Obligat pathogene Bakterien des Uterus Obligat pathogene Bakterien führen auch bei einem gesunden Organismus zu einer Erkrankung. Nach POHL et al. (1977) kommen sie im Genitaltrakt der Stute nicht vor. ALLEN und NEWCOMBE (1979) sowie RICKETTS (1981) zählen allerdings die im Genitaltrakt vorkommenden Taylorella equigenitalis, einige Kapseltypen von Klebsiella pneumoniae und Pseudomonas aeruginosa, die alle Erreger venerischer Infektionen sind, zu den obligat pathogenen Bakterien. Von anderen Autoren werden sie dagegen den fakultativ pathogenen Bakterien zugeordnet (LEIDL et al. 1976, TILLMANN et al. 1982). 2.2.1.2 Endometritis und Nachweis anaerober Bakterien Die Kenntnisse über die Rolle anaerober Bakterien bei Genitalinfektionen in der Veterinärmedizin sind noch unzureichend, obwohl ihre Bedeutung für die Humanmedizin nachgewiesen ist (SZEMERÉDI et al. 2003). In der Routinediagnostik von Uterustupferproben ist der Nachweis anaerober Keime nicht mit eingeschlossen. RICKETTS und MACKINTOSH (1987) haben 347 Proben aus dem Uterus von Stuten auf anaerobe Bakterien untersucht. In 119 (47 %) der 251 ungeschützten Tupfer, in 23 (32 %) der 84 geschützten Tupfer und in 7 (58 %) der 12 Uterusspülproben konnten sie anaerobe Bakterien nachweisen. Am häufigsten handelte es sich um Bacteroides fragilis, gefolgt von Fusobacterium mortiferum, Peptostreptococcus anaerobius, Peptostreptococcus ssp. und Clostridium perfringens. Die Autoren vermuteten, dass es sich bei Clostridium perfringens und Bacteroides fragilis um fakultativ pathogene Bakterien handelt, da ihr Nachweis in 39 % bzw. 30 % der Fälle mit positiven zytologischen Ergebnissen einherging. Das bei den 41 mit in die Untersuchung eingeschlossenen Maidenstuten in 21 (51 %) Proben anaerobe Bakterien nachgewiesen wurden, während die zytologische Untersuchung stets negativ ausfiel, führte zu der Annahme, dass der Uterus 20 Literaturübersicht anaerobe Bakterien als ständige Oberflächenkommensalen aufweist. Von den 41 Proben der Maidenstuten wurden 29 mit ungeschützten Tupfern und 12 mit geschützten Tupfern entnommen. Von welchen Tupfern die 21 positiven Proben stammen, wurde jedoch nicht aufgeführt (RICKETTS und MACKINTOSH 1987). Auch bei einer 1997 von LANGONI et al. durchgeführten Studie an 580 güsten Stuten konnte Bacteroides fragilis als häufigster anaerober Keim festgestellt werden. Da der Nachweis von anaeroben Bakterien in 78,8 % der Fälle auch mit zytologischen Befunden einherging, vermuteten LANGONI et al. (1997) eine klinische Relevanz anaerober Bakterien. Von SZEMERÉDI et al. (2003) aus Ungarn liegen neuere Erkenntnisse über Bacteroides ureolyticus vor. Dieser Erreger wurde dort bei Stuten mit Uterusinfektionen und einer deutlichen Verringerung der Geburtenrate nachgewiesen. Es ist bekannt, dass Bacteroides ureolyticus die kaudalen Genitalorgane besiedelt und auch bereits beim Menschen bei Genitalinfektionen aus dem Gebärmutterbereich isoliert wurde (WOOLEY et al. 1992). Sowohl in der bakteriologischen Untersuchung als auch in der klinischen Symptomatik ähnelt er Taylorella equigenitalis (FODOR et al. 1995, SZEMERÉDI et al. 2003). Es ist also davon auszugehen, dass Clostridium perfringens, Bacteroides fragilis sowie Bacteroides ureolyticus zu den fakultativ pathogenen Bakterien des Uterus zu zählen sind. Ob weitere anaerobe Bakterien beim Endometritisgeschehen der Stute eine Rolle spielen, ist allerdings noch nicht bekannt. 2.2.1.3 Pathogenitätsmechanismen Im Rahmen einer Besiedlung des Uterus mit Bakterien kommt es zu komplexen Interaktionen zwischen dem Endometrium und den Bakterien. Die fakultativ pathogenen Bakterien des Uterus haben unterschiedliche Virulenzfaktoren und unterschiedliche Strategien, um die Immunantwort des Wirtes zu umgehen. Daraus resultieren spezifische Wirt-Pathogen-Interaktionen, die zu unterschiedlichen klinischen Symptomen und Laborbefunden führen. Neuere Studien weisen darauf 21 Literaturübersicht hin, dass die Biofilmbildung von Bakterien ein sehr wichtiger Pathogenitätsfaktor ist, der in der Humanmedizin eine zunehmend größere Bedeutung hat (HALLSTOODLEY und STOODLEY 2009). Bakterielle Biofilme Bakterielle Biofilme sind definiert als strukturierte Bakterienzellkolonien, die von einer selbstproduzierten polymeren Matrix umgeben sind und einer lebenden oder inerten Oberfläche anhaften (COSTERTON et al. 1999). Biofilme kommen sowohl in der Natur als auch auf dem menschlichen Körper vor. Sie wachsen langsam und bestehen in der Regel aus verschiedenen Bakterienarten, die in den meisten Fällen ein Bestandteil der Normalflora sind. Aerobe und anaerobe Zonen können im Abstand von wenigen hundert Mikrometern vorkommen, so dass in Biofilmen auch aerobe und anaerobe Bakterien direkt nebeneinander leben können. Innerhalb eines Biofilms können Bakterien mit Hilfe von Autoinducern, wie zum Beispiel dem AcylHomoserinlakton, bestimmte genetische Programme aktivieren. Dieses als „quorum sensing“ bezeichnete Kommunikationssystem dient der Steuerung wichtiger Vorgänge der Biofilmbildung und des fertigen Biofilms (FUGUA et al. 1994, SZEWZYK und SZEWZYK 2003). Die Biofilmbildung beginnt mit der Anlagerung von Mikrokolonien an eine Oberfläche. Während dieser Anlagerungsphase der Bakterien kommt es zur Aktivierung bestimmter Gene und die Produktion der extrazellulären Matrix beginnt. Nach einer bestimmten Zeit differenzieren die Mikrokolonien zu echten Biofilmen. Die Oberflächen werden von den Biofilmen zunächst flächig besiedelt, später bilden sie auch mehrschichtige, heterogene Strukturen. Es stellt sich ein Gleichgewicht zwischen Erweiterung und Abbau des Biofilms ein. Koordiniert durch das „quorum sensing“ kommt es immer wieder zum Ablösen größerer Bakterienansammlungen, die versuchen, neue Oberflächen zu besiedeln (COSTERTON et al. 1999). Eine der wichtigsten Eigenschaften von bakteriellen Biofilmen ist ihre Resistenz gegenüber antibakteriellen Substanzen und bestimmten Komponenten des Immunsystems (DRENKARD 2003). Wahrscheinlich sind mehrere Mechanismen für diese erhöhte Resistenz verantwortlich. Eine Theorie besagt, dass 22 Literaturübersicht die Penetration beeinträchtigt ist und antibakterielle Substanzen und Immunglobuline nur schwer durch die extrazelluläre Matrix zu den Bakterienzellen vordringen können (COSTERTON et al. 1999). Laut einer weiteren Hypothese ist an bestimmten Stellen des Biofilms das Nährstoffangebot limitiert und die Bakterienzellen zeigen dort einen reduzierten Stoffwechsel und langsame Wachstumsraten auf. Sie gehen zum Teil in einen totalen Ruhezustand (VBNC – „viable but not culturable“) über. Diese Bakterien sind wenig empfindlich gegenüber antibakteriellen Substanzen (STEWART 2002, SZEWZYK und SZEWZYK 2003). Eine dritte Theorie geht davon aus, dass es innerhalb eines Biofilms so genannte „Persister-Zellen“ gibt, die in der Anwesenheit von antimikrobiellen Substanzen weder wachsen noch sterben (BROOUN et al. 2000, HALL-STOODLEY et al. 2004). Dieses Phänomen entsteht nicht durch limitierte Nährstoffangebote, sondern durch Aktivierung bestimmter Gene innerhalb des Biofilms (COSTERTON et al. 1999). Der Biofilm als Lebensform hat sich so gut bewährt, dass die überwiegende Zahl der Bakterien in Form von Biofilmen lebt (HALL-STOODLEY et al. 2004). Die klinische Bedeutung von Biofilmen wird häufig unterschätzt. So sind zum Beispiel beim Menschen wahrscheinlich in mehr als 60 % der bakteriellen Infektionen biofilmproduzierende Bakterien beteiligt (FUX et al. 2005). Wenn das Gleichgewicht innerhalb eines Biofilms gestört ist, können sich fakultativ pathogene Bakterien verstärkt vermehren und eine Infektion auslösen. Auch aus dem Biofilm abgelöste, freie fakultativ pathogene Bakterien können zu wiederkehrenden Infektionen und Symptomen führen (COSTERTON et al. 1999). Typisch für Infektionen mit biofilmproduzierenden Bakterien sind chronische Erkrankungen mit wiederkehrenden Symptomen. Antimikrobielle Substanzen können zwar die freien Bakterien und die durch sie verursachten Symptome beseitigen, sind aber nicht dazu in der Lage, den Biofilm selber abzutöten. Es kommt in Folge der Entstehung von Biofilmen daher typischerweise auch nach antibiotischen Behandlungen zu erneuten Krankheitsausbrüchen (COSTERTON et al. 1999). Biofilme werden in der Humanmedizin mit einer Reihe von Erkrankungen in 23 Literaturübersicht Verbindung gebracht. Dazu zählen zum Beispiel die Endokarditis, Periodontitis, Prostatitis, Otitis media und Urethritis (COSTERTON et al. 1999, DRENKARD 2003). Obwohl über das Vorkommen von Biofilmen bei Tieren bisher wenige Studien vorliegen, wird davon ausgegangen, dass sie auch hier häufig für zahlreiche Krankheiten, wie zum Beispiel Pneumonien, Enteritiden, Mastitiden und Wundinfektionen, verantwortlich sind (CLUTTERBUCK et al. 2007). Vermutlich spielt die Biofilmbildung auch im Rahmen der chronischen Endometritis bei der Stute eine wichtige Rolle (CAUSEY 2006, LEBLANC 2010). Zu den biofilmbildenden Bakterien, die regelmäßig aus dem Uterus der Stute isoliert werden, zählen Pseudomonas aeruginosa und E. coli (LEBLANC 2010). Der Nachweis von Bakterien aus Biofilmen im Uterus stellt sich allerdings schwierig dar. Biofilminfektionen gehen in der Regel nicht mit der Produktion von wässrigem Entzündungsexsudat einher, so dass es schwierig ist, mit Uteruskulturtupfern bakterienenthaltendes Untersuchungsmaterial zu gewinnen. Manchmal sind auch nur bestimmte Bereiche des Uterus von der Biofilmbildung betroffen, die dann nicht zwangsläufig bei der Probenentnahme mit erfasst werden (LEBLANC 2010). Außerdem können sich die entnommenen Bakterien auch in der Ruhephase befinden, in der sie zwar lebensfähig aber nicht kultivierbar sind (SARDESSAI 2005). Virulenzfaktoren einiger Endometritiserreger Ein wichtiger Pathogenitätsmechanismus von Bakterien ist die Adhäsion am befallenen Gewebe, um dadurch bestimmte Abwehrmechanismen des Wirtes zu umgehen. Die β-hämolysierenden Streptokokken haften durch fibronectinbindende Proteine an den endometrialen Epithelzellen (LINDMARK et al. 1996). Mittels einer Hyaluronsäurekapsel können sie der Phagozytose entgehen, da Hyaluronsäure als Bestandteil des normalen Wirtsgewebes keine Abwehrreaktion hervorruft (WIBAWAN et al. 1999). Einen weiteren Schutz vor der Phagozytose erreichen sie durch Antigenvariation und antiphagozytotische M-Proteine, welche die Aktivierung des Komplementsystems und die Funktion der Immunglobuline beeinträchtigen 24 Literaturübersicht (WITTENBRINK et al. 2008). Außerdem setzen sie Streptokinasen, Superantigene und weitere Toxine frei, die zu einer Irritation des Endometriums sowie einer nachfolgenden starken Produktion von Entzündungsexsudat führen (CAUSEY 2006). Entzündliches Sekret, dass im Uteruslumen verbleibt, führt zu einer zusätzlichen Behinderung des Komplementsystems (ASBURY et al. 1984). Mit über 250 verschiedenen Serotypen ist E. coli ein sehr variantenreiches Bakterium, dass beim Menschen sowohl als harmloser Oberflächenkommensale als auch als primäre Ursache von urogenitalen Infektionen in Erscheinung tritt (KASPER et al. 2004). Für Endometritis induzierende E. coli wird bei der Stute eine in vitro Hämolyse auf Blutagar als ein wichtiges Pathogenitätsmerkmal gewertet. Die Hämolyse gilt dabei als Indikator für die Sezernierung zellschädigender bakterieller Produkte (WITTENBRINK et al. 2008). Bei Untersuchungen von E. coli-Isolaten, die im Uterus infertiler Stuten nachgewiesen wurden, konnte aber nur bei sehr wenigen Isolaten eine Hämolyse festgestellt werden (ALBIHIN et al. 2003, FRONTOSO et al. 2008, NEUBERG 2009). Viele Isolate von E. coli haben in vitro und in vivo die Fähigkeit, einen Biofilm zu bilden. In der Humanmedizin sind chronische Harnwegsinfektionen mit biofilmproduzierenden E. coli ein bekanntes Problem. Die E. coli-Bakterien schützen dabei sich selbst und andere Bakterien durch den Biofilm vor dem Immunsystem des Wirtes (EMODY et al. 2003, SOTO et al. 2006). Die Bindung von E. coli an Wirtszellen erfolgt mittels Fimbrien. Als weitere Virulenzfaktoren sind Endo-, Entero- und Cytotoxine für die Pathogenität von E. coli ausschlaggebend (SELBITZ 2002). Klebsiella pneumoniae kann sich mit Hilfe von Fimbrien und einer Polysaccharidkapsel an endometriale Epithelzellen heften (FAVRE-BONTE et al. 1999). Die Kapsel wirkt zusätzlich als Barriere gegen Immunglobuline sowie Bestandteile des Komplementsystems und bietet dadurch einen Schutz vor der Phagozytose (DOMENICO et al. 1994). Die meisten klinisch bedeutsamen Klebsiella pneumoniae-Isolate sind bekapselt. Es lassen sich 77 verschiedene Kapseltypen unterscheiden (ØRSKOV 1984), wobei nur die Kapseltypen K1, K2, K5 und K7 25 Literaturübersicht ursächlich mit der Endometritis bei der Stute in Verbindung gebracht werden (PLATT et al. 1976, SELBITZ 2002). Ein wichtiger Virulenzfaktor ist die Stärke der Bekapselung. Bei Versuchen von KIKUCHI et al. (1987) führten stark bekapselte Arten von Klebsiella pneumoniae Kapseltyp1 zu einer mittelgradigen bis hochgradigen Endometritis, schwach bekapselte Arten führten in der Hälfte der Fälle zu einer geringgradigen Endometritis und nicht bekapselte Arten konnten keine Endometritis induzieren. Ein weiterer Virulenzfaktor ist die Invasivität von Klebsiella pneumoniae. Untersuchungen von SAHLY et al. (2000) haben gezeigt, dass Klebsiella pneumoniae in humanen Epithelzellen der Harnblase, der Lunge und des Darmes invadieren kann (SAHLY et al. 2000, CORTES et al. 2002). Dies könnte die beim Menschen wiederkehrenden Harnwegsinfektionen durch Klebsiella pneumoniae sowie deren Resistenz gegen antibiotische Behandlungen erklären (SAHLY et al. 2000). Durch die Bildung eines Biofilms kann sich Pseudomonas aeruginosa vor vielen Abwehrmechanismen des Wirtes schützen. Die Biofilmbildung führt häufig zu persistierenden Infektionen sowie zu einer hohen Resistenz des Erregers gegen viele antimikrobiell wirksame Substanzen (DRENKARD 2003, LEBLANC 2010). Die Adhäsion an Epithelzellen des Uterus erfolgt bei Pseudomonas aeruginosa durch Fimbrien, die an Oberflächenrezeptoren der Wirtszellen binden. Weitere Virulenzfaktoren sind Endotoxine, Exotoxine wie das Exotoxin A und Enzyme wie Hämolysine und Proteasen (SELBITZ 2002). 2.2.2 Nicht infektiöse Endometritis Zu den Ursachen einer nicht infektiösen Endometritis zählen unter anderem Urinansammlungen, eine Pneumovagina, Spermaexpositionen, immunologische Reaktionen auf Fremdproteine und intrauterine Infusionen mit irritierenden Substanzen (RIDDLE et al. 2007). 26 Literaturübersicht Die persistierende besamungsinduzierte Endometritis ist ein Sonderfall der chronischen Endometritis. Durch eine Paarung oder künstliche Besamung kommt es zur Übertragung von Samen und Bakterien in das Uteruslumen. Spermatozoen sind beim Pferd hochpotente Auslöser einer Entzündung des Endometriums, so dass es zu einer physiologischen transienten postkoitalen Endometritis kommt. Sie dauert etwa 48 bis 72 Stunden und dient der Beseitigung von überflüssigem Sperma, Bakterien, Zelltrümmern und anderen Kontaminanten aus dem Uteruslumen. Wenn uterine Abwehrmechanismen defekt sind, entsteht aus der physiologischen postkoitalen Endometritis die persistierende besamungsinduzierte Endometritis. Die Rolle der Bakterien ist dabei noch nicht vollständig geklärt. Zwar werden sie postkoital auch häufiger nachgewiesen, aber der ursprüngliche entzündungsauslösende Stimulus wird den Spermatozoen zugesprochen (WATSON 2000, TROEDSSON 2006, NASH et al. 2008). Im Gegensatz zu der chronischen infektiösen Endometritis, die in der Regel antibiotisch behandelt wird, dient die Behandlung der persistierenden besamungsinduzierten Endometritis insbesondere der Unterstützung der uterinen Abwehrmechanismen. 2.3 Nachweis von Bakterien 2.3.1 Probenentnahme Von großer Bedeutung für die Endometritisdiagnostik ist die strikt intrauterine Probenentnahme, da verschiedene Studien gezeigt haben, dass eine zervikal entnommene Probe nicht den intrauterinen Zustand widerspiegelt (NEWCOMBE 1978, KLEIN et al. 2009). Bei Stuten können intrauterine Proben zu jedem Zeitpunkt des Zyklus genommen werden, da die Zervix auch im Diöstrus passierbar ist. Von den meisten Autoren wird aber eine Probenentnahme im Östrus empfohlen (ALLEN und NEWCOMBE 1979, RICKETTS 1981, WINGFIELD DIGBY und RICKETTS 1982, NIELSEN 2005). Die Zervix ist in dieser Zyklusphase leichter passierbar und 27 Literaturübersicht die endometriale Entnahmegeräte Sekretion mit sorgt für eine Untersuchungsmaterial. ausreichende Außerdem Benetzung ist bei der einer Probenentnahme im Diöstrus das Risiko einer iatrogenen Infektion erhöht, da die Infektionsabwehr unter Progesteroneinfluss herabgesetzt ist. Uterustupfer Um eine Kontamination des Tupfers mit Keimen aus Vestibulum, Vagina oder Zervix zu vermeiden, werden geschützte Tupfersysteme empfohlen. (ALLEN und NEWCOMBE 1979, BLANCHARD et al. 1981, RICKETTS 1981). Es stehen zur kontaminationsarmen Probenentnahme inzwischen kommerziell erhältliche doppelt geschützte Tupfersysteme zur Verfügung, bei denen der eigentliche Tupfer durch 2 Kunststoffhüllen geschützt ist. Zur Entnahme wird hierbei die äußere Hülle in den Zervikalkanal eingeführt, dann die innere Hülle in das Uteruslumen vorgeführt und erst danach der Tupfer nach kranial vorgeschoben. Das Entfernen erfolgt in umgekehrter Reihenfolge. Das Einführen des Tupfers kann entweder mittels Spreizspekulum und Zervixfasszange oder transvaginal mit einer handschuhgeschützten Hand erfolgen. Bei der Probenentnahme mittels Spekulum wird unter optischer Kontrolle die Zervix ventral mit der Zervixfasszange fixiert. Durch Zug an der Zervixfasszange wird der Zervikalkanal gestreckt und der Tupfer kann leichter eingeführt werden. MERKT et al. (1987) hielten den Einsatz der Zervixfasszange vor allem bei Stuten im Diöstrus mit geschlossener Zervix für wichtig. Bei der manuellen transvaginalen Probenentnahme wird der Tupfer unter der handschuhgeschützten Hand vaginal eingeführt, die Zervix mittels Zeigefinger passiert und der Tupfer nach kranial in den Uterus vorgeschoben. Diese Entnahmetechnik ist jedoch häufiger von Kontaminationen mit Bakterien aus den kaudalen Abschnitten der Genitalorgane betroffen (WAELCHLI et al. 1992, HANDLER 2005). WAELCHLI et al. (1992) verglichen die Kontamination von Uterustupfern mit vulvovestibulären Bakterien bei der Entnahme mittels Spekulum mit der manuellen transvaginalen Entnahme. Sie applizierten dafür 28 Literaturübersicht Streptomycin-resistente E. coli-Stämme, die nicht im Genitaltrakt von Stuten vorkommen, als Marker in den vulvovestibulären Bereich. Bei den Tupferproben, die manuell transvaginal entnommen wurden, konnten signifikant häufiger die MarkerBakterien nachgewiesen werden als bei den Proben, die mittels Spekulum entnommen wurden. Eine Kontamination mit den Marker-Bakterien konnte aber auch bei den mit Spekulum entnommenen Proben nicht vollständig ausgeschlossen werden. Zu bedenken ist hierbei, dass WAELCHLI et al. (1992) die Versuche mit einfach geschützten und nicht mit doppelt geschützten Systemen durchgeführt haben. In der Fachliteratur wird demzufolge eine Probenentnahme mit doppelt geschützten Tupfersystemen mit Hilfe eines Spekulums und einer Zervixfasszange empfohlen (WAELCHLI et al. 1992, HANDLER 2005). Laut der Gesellschaft für Pferdemedizin (Rundschreiben 1998) ist jedoch die transvaginale manuelle Entnahmetechnik ein international übliches Verfahren und die Verwendung eines Spekulums bei der Tupferentnahme nicht zwingend notwendig. Bei der Probenentnahme für molekularbiologische Untersuchungen muss zusätzlich beachtet werden, dass die kommerziell erhältlichen Uterustupfer zwar steril sind, aber trotzdem inaktivierte bakterielle DNA enthalten können, die mit den molekularbiologischen Methoden erfasst werden kann. Die Tupfer müssen also einer zusätzlichen DNA-zerstörenden Behandlung, wie zum Beispiel einer UV- Bestrahlung, unterzogen werden. Uterusspülung Bei der Uterusspülung mit geringem Volumen werden 50 bis 60 ml einer sterilen Kochsalzlösung durch einen Uteruskatheter in das Uteruslumen instilliert. Die Einführung des Katheters geschieht dabei transvaginal durch eine handschuhgeschützte Hand. Von rektal erfolgt eine Massage des Uterus, um die Lösung gleichmäßig zu verteilen. Anschließend wird die Flüssigkeit entweder der 29 Literaturübersicht Schwerkraft folgend oder durch Aspiration zurückgewonnen und zentrifugiert. Das dadurch gewonnene Sediment kann dann für die bakteriologische und zytologische Untersuchung genutzt werden. Als Vorteile dieser Technik gelten die Materialgewinnung von einer größeren Fläche des Endometriums und die Konzentration der Mikroorganismen während der Zentrifugation. Bei Versuchen von BALL et al. (1988) konnten bei normalen und bei subfertilen Stuten durch Uterusspülungen mit geringem Volumen signifikant häufiger Bakterien nachgewiesen werden als bei der Tupferentnahme. LEBLANC et al. untersuchten 2007 Uterusspülproben von 308 subfertilen Stuten. Sie konnten in 282 (70 %) Proben Bakterien nachweisen, wobei E. coli, gefolgt von den β-hämolysierenden Streptokokken, am häufigsten isoliert wurde. Verglichen mit den Ergebnissen von 498 untersuchten Tupferproben aus der Praxis von LeBlanc waren das etwa doppelt so viele positive Ergebnisse und E. coli konnte signifikant häufiger nachgewiesen werden. Von den 282 positiven Uterusspülproben wiesen aber nur 86 (30 %) auch eine positive zytologische Untersuchung auf. Wurde die Anwesenheit von Neutrophilen als einziges Anzeichen einer Entzündung gewertet, waren 196 (70 %) der von LEBLANC et al. (2007) untersuchten 282 positiven Proben falsch positiv oder enthielten Bakterien, die als Oberflächenkommensalen den Uterus besiedeln. Wenn aber das Vorkommen von Debris in der Zytologie und ein trübes Aussehen des Effluxes mit als Entzündungsanzeichen gewertet wurden, reduzierte sich die Anzahl falsch positiver Resultate auf nur noch 11 %. LEBLANC et al. (2007) räumten selber ein, dass es bei der Uterusspülung zu Kontaminationen kommen kann, da es sich um ein ungeschütztes Entnahmesystem handelt, das transvaginal manuell eingeführt wird. Es lässt sich also nicht eindeutig sagen, ob es sich bei der Uterusspülung um eine sehr sensitive Methode handelt oder ob die vielen positiven Proben und der häufige Nachweis von E. coli teilweise auch als Kontaminationen gewertet werden müssen. 30 Literaturübersicht Uterusbiopsie Ebenso können auch Uterusbiopsien kulturell untersucht werden. NIELSEN (2005) verglich die bakteriologischen Ergebnisse von Uterustupfern mit denen von Uterusbiopsien. Die Entnahme der Biopsien erfolgte dabei mit einer Biopsiezange, die durch ein Biopsiespekulum in den Uterus eingeführt wurde. NIELSEN (2005) konnte in den Biopsien häufiger Bakterien nachweisen als in den Tupfern. Hierbei ist wiederum zu bedenken, dass es sich bei diesen Bakterien auch um Kontaminationen handeln kann, da die Biopsiezange nicht zusätzlich geschützt wurde. 2.3.2 Kulturabhängiger Nachweis Zum Nachweis von Bakterien sind kulturelle Verfahren mit der Anzucht von Erregern in flüssigen oder auf festen Nährmedien mit nachfolgender biochemischer Differenzierung die Standardmethode. In der Endometritisdiagnostik bei Pferden werden in der Regel Uterustupferproben auf aerobe Bakterien untersucht. Es besteht jedoch auch die Möglichkeit, Uterusspülungen sowie Uterusbiopsien kulturell zu untersuchen. Auch die mikroaerophile sowie anaerobe Kultivierung wird von einigen Autoren empfohlen (RICKETTS und MACKINTOSH 1987, LANGONI et al. 1997, HANDLER 2005). Um Bakterien kulturell nachweisen zu können, müssen sie vital sein, unter Laborbedingungen kultivierbar sein und das Nährmedium sowie die physikalischen Kulturbedingungen müssen ihren Ansprüchen genügen. 2.3.3 Kulturunabhängiger Nachweis Viele Mikroorganismen sind aufgrund ihrer spezifischen und komplexen Nährstoffbedürfnisse nur schwer oder gar nicht kultivierbar. Es wird geschätzt, dass gegenwärtig weniger als 1 % aller Mikroorganismen kultivierbar sind (STALEY und KONOPKA 1985, AMANN et al. 1995). 31 Um Bakterien kulturunabhängig Literaturübersicht nachzuweisen oder kultivierbare nicht bestimmbare Bakterien zu identifizieren, werden molekularbiologische Verfahren eingesetzt. Mit diesen Methoden können auch kleinste Mengen bakterieller DNA nachgewiesen werden, unabhängig davon, ob die Bakterien bereits abgetötet oder artifiziell nicht vermehrungsfähig sind. Das am weitesten verbreitete Verfahren ist die Amplifikation der Nukleinsäure mittels Polymerase-Kettenreaktion (polymrase chain reaction, PCR) und die nachfolgende Sequenzierung. Hierfür bedarf es phylogenetischer Markermoleküle, die mit der phylogenetischen Entwicklung der Bakterien korrelieren. Besonders gut geeignet ist das 16S rRNA Gen, über das mittlerweile sehr umfangreiche Datenbanken vorliegen. Dieses Gen ist in allen Bakterien vorhanden und besitzt sowohl hoch konservierte Bereiche, wodurch auch bei unbekannten Bakterien die Bindung von PCR-Primern möglich ist, als auch variable Bereiche, welche die Identifikation der Bakterien auf Genus- oder Speziesebene erlauben (WOESE 1987, WANG und ZANG 2000). Mit dieser Methode wurden bereits viele neue, nicht kultivierbare Bakterienspezies entdeckt und beim Menschen unter anderem die Mikroflora der Mundhöhle (KAZOR et al. 2003), des Ösophagus (PEI et al. 2004), der Vagina (OAKLEY et al. 2008) und des Kolon (ECKBURG et al. 2005) charakterisiert. Neben dem Vorteil der Identifikation und Klassifizierung von nicht kultivierbaren Bakterien birgt die Methode jedoch auch bekannte Einschränkungen. Der wesentliche Nachteil ist die Kontaminationsanfälligkeit der hochsensitiven PCR, bei der bereits kleinste Mengen kontaminierender DNA amplifiziert werden können. Mögliche Kontaminationsquellen sind die PCR-Reagenzien, das Laborequipment und die Umgebung (BORST et al. 2004). Besonders häufig ist die Taq-Polymerase mit DNA kontaminiert, wobei auch von Kontaminationen in den DNA-Extraktionssäulen, den Primern und den PCRPuffern berichtet wird (RUECKERT und MORGAN 2007). Ebenso können kontaminierte Reaktionsgefäße, Sterilbänke oder auch nukleinsäurehaltige Aerosole zu falsch positiven Ergebnissen führen. Alle Versuche, Reagenzien und Oberflächen zu 100 % DNA-frei zu machen, sind bisher gescheitert. Es können also lediglich Maßnahmen getroffen werden, um Kontaminationen so weit wie möglich zu reduzieren (BORST et al. 2004). Kontaminierende DNA in den PCR-Reagenzien kann zum Beispiel durch verschiedene Dekontaminationsverfahren wie einer UV- 32 Literaturübersicht Bestrahlung, einer Behandlung mit einer für doppelsträngige DNA spezifischen DNAse I oder einer 8-Methoxypsoralen-Behandlung zerstört oder inaktiviert werden. Das 8-Methoxypsoralen bindet dabei kovalent an doppelsträngige DNA und führt so zu ihrer Deaktivierung. All diese Verfahren können aber nur begrenzt eingesetzt werden, da sie auch immer zu einer verringerten Sensitivität führen (MEIER et al. 1993, KLASCHIK et al. 2002, HEININGER et al. 2003). Um Kontaminationen zu vermeiden, sollten die Herstellung des PCR-Ansatzes und die Durchführung der PCR in getrennten Räumen mit separaten Pipetten stattfinden. Das Arbeiten unter UV-Werkbänken sowie das Tragen von Handschuhen und Schutzkleidung sind heute selbstverständlich. Des Weiteren sollten vor und nach jedem PCR-Ansatz die Oberflächen sorgfältig dekontaminiert werden, wobei darauf zu achten ist, dass die DNA nicht nur inaktiviert sondern auch zerstört wird. Trotz dieser bekannten Problematik wird geschätzt, dass immer noch 2 % aller mit der PCR-Technik arbeitenden Veröffentlichungen sich irrtümlich mit Kontaminationen statt mit tatsächlichen Ergebnissen beschäftigen (BORST et al. 2004). Ein weiterer Nachteil der rDNA Technik besteht darin, dass bestimmte Bakterien sich nicht oder nur bedingt nachweisen lassen, wenn es zum Beispiel in der Aufbereitung nicht gelingt, sie adäquat zu lysieren oder der Primer nicht an ihre DNA bindet. Für die Routinediagnostik sind diese molekularbiologischen Methoden allerdings noch zu teuer und zu aufwändig. 2.3.4 Aussagekraft bakteriologischer Ergebnisse Der Nachweis von Bakterien bedeutet nicht, dass auch eine Endometritis vorliegen muss und umgekehrt kann eine Endometritis auch nicht ausgeschlossen werden, wenn der Nachweis von Bakterien nicht gelingt (TILLMANN und MEINECKE 1980, TILLMANN et al. 1982, WAELCHLI et al. 1988). Falsch positive Ergebnisse entstehen vor allem durch Kontaminationen mit Umweltkeimen oder Bakterien aus den kaudalen Abschnitten der Genitalorgane 33 Literaturübersicht (RICKETTS 1981). Aber auch im Untersuchungslabor kann es zu Kontaminationen kommen (RICKETTS et al. 1993). Durch falsch positive Ergebnisse sowie durch die falsche Interpretation der Signifikanz von nachgewiesenen Bakterien werden häufig unnötige antibiotische Behandlungen durchgeführt (RICKETTS 1981). Die Ursachen für falsch negative Ergebnisse sind wesentlich vielfältiger. Etwa 99 % aller Bakterien lassen sich grundsätzlich nicht im Labor kultivieren (AMANN et al. 1995). Des Weiteren kann man Bakterien häufig nicht nachweisen, wenn sie in zu geringer Anzahl vorkommen, wenn sie nur in bestimmten Bereichen des Uterus vorkommen, wenn die Kultivierungsbedingungen nicht adäquat sind, wenn ungeeignete Entnahmetechniken angewendet werden oder der Tupfer nach der Entnahme austrocknet (RICKETTS 1981). Auch biofilmbildende Bakterien lassen sich nur schwer nachweisen (s. Kap. 2.2.1.3.1). Daher sollten immer das klinische Erscheinungsbild und Ergebnisse weiterer Untersuchungen, wie zum Beispiel einer zytologischen Untersuchung oder einer Uterusbiopsie, mit in die Beurteilung der Geschlechtsgesundheit einbezogen werden (TILLMANN et al. 1982, RICKETTS et al. 1993). 2.4 Exfoliative Endometriumzytologie In der Humanmedizin haben sich zytologische Untersuchungen des Endometriums schon früh in der Diagnostik uteriner Erkrankungen bewährt (CARY 1943). Aber erst 1964 wurde durch eine Arbeit von KNUDSEN die exfoliative Endometriumzytologie als diagnostisches Verfahren in der Endometritisdiagnostik bei der Stute eingeführt. Bei entzündlichen Veränderungen sind in den Ausstrichen körpereigene Entzündungszellen, vor allem polymorphkernige Leukozyten zu finden (TILLMANN und MEINECKE 1980). Während in der Vagina und auch in der Zervix physiologisch vermehrt neutrophile Granulozyten vorkommen, sind sie im gesunden Uterus nur selten und vereinzelt nachzuweisen (BRUNCKHORST und SCHOON 1990). 34 Literaturübersicht Lediglich post partum sowie nach einer Belegung können neutrophile Granulozyten auch in der Endometriumzytologie von gesunden Stuten vermehrt nachgewiesen werden (BROOK 1993, AGUILAR et al. 2006). Der Vorteil der zytologischen Untersuchung liegt in dem geringem Aufwand und der schnellen Verfügbarkeit der Ergebnisse. KNUDSEN (1964) stellte eine hohe Korrelation zwischen dem Vorkommen von neutrophilen Granulozyten in der Zytologie und einem positiven bakteriologischen Ergebnis fest. Diese Korrelation können zahlreiche weitere Studien belegen (POHL et al. 1977, TILLMANN und MEINECKE 1980, WINGFIELD DIGBY und RICKETTS 1982, MATTOS et al. 1984, BROOK 1985, REINEMUND 1988, RIDDLE et al. 2007). Einige Studien kommen zu dem Ergebnis, dass sich mit einer zytologischen Untersuchung Entzündungen des Uterus exakter nachweisen bzw. ausschließen lassen als mit einer bakteriologischen Untersuchung (POHL et al. 1977, WINGFIELD DIGBY und RICKETTS 1982, MATTOS et al. 1984, RIDDLE et al. 2007). Bei den Untersuchungen von Pohl et al. (1977) konnte bei 73 % der Stuten mit negativem bakteriologischen, aber zytologisch positivem Befund das Vorliegen einer Endometritis durch die klinische Untersuchung bestätigt werden. RIDDLE et al. (2007) identifizierten mit der zytologischen Untersuchung doppelt so viele Stuten mit einer Endometritis wie mit der bakteriologischen Untersuchung. Sowohl eine positive bakteriologische als auch eine positive zytologische Untersuchung gehen mit verringerten Trächtigkeitsraten einher (RIDDLE et al. 2007). Von praktischer Bedeutung ist die zytologische Untersuchung für die Beurteilung bakteriologischer Befunde. Bei einer Endometritis sind nicht immer Bakterien nachweisbar und umgekehrt führen anwesende Bakterien nicht zwangsläufig zu einer Entzündung des Endometriums. In Abhängigkeit von der Virulenz der Bakterien können diese nicht reaktiv die Oberflächen besiedeln oder zu einer geringgradigen bis hochgradigen Endometritis führen (BROOK 1993). Diese Variabilität des Endometriums, auf Bakterien zu reagieren, macht es schwierig, Bakteriennachweise zu beurteilen. Die zytologische Untersuchung hat sich dabei zur Differenzierung zwischen einer weniger bedenklichen und einer entzündungsauslösenden Besiedlung bewährt. Trotz der genannten Vorteile konnte sich die exfoliative Endometriumzytologie im Rahmen 35 Literaturübersicht der routinemäßigen gynäkologischen Untersuchung von Stuten bisher nur wenig etablieren (WALTER und WEHREND 2009). Auch bei der Entnahme von Material zur zytologischen Untersuchung sollten doppelt geschützte Systeme eingesetzt werden. AGUILAR et al. (2006) nahmen für ihre Studie von 41 Stuten sowohl mit doppelt geschützten als auch mit ungeschützten Systemen Proben für die zytologische Untersuchung. Während bei dem ungeschützten System 87,8 % der zytologischen Untersuchungen positiv waren, konnten nur in 7,3 % der mit dem doppelt geschützten System entnommenen Proben vermehrt neutrophile Granulozyten nachgewiesen werden. Als Entnahmesystem eignet sich am besten die in der Humanmedizin sowie in der Rinderpraxis eingesetzte Zytologiebürste. Sie liefert die meisten auswertbaren Proben und die beste Zellmorphologie (BOURKE et al. 1997, NEUBERG 2009). Zur Färbung der Zytologien hat sich die Diff-Quick®-Methode bewährt. Sie ermöglicht eine gute Zelldifferenzierung und ist schnell durchführbar (BROOK 1993, WALTER et al. 2006). 2.5 Physiologische Keimflora Die Haut und einige Schleimhäute des menschlichen und tierischen Körpers sind mit einer physiologischen Keimflora besiedelt, die den Wirtsorganismus schützt, indem sie das Wachstum anderer, pathologischer Mikroorganismen erschwert. Zu den mit Mikroorganismen besiedelten Körperoberflächen zählen neben der Haut, der Nasopharynx, der obere Anteil der Trachea, der Gastrointestinaltrakt sowie die Vagina (HINGHOFER-SZALKAY 1999, WALKER 2004). Direkt nach der Geburt beginnt beim Menschen die Besiedlung mit Keimen aus der Umwelt und von der Mutter. Die Mikroflora von Säuglingen ist zunächst vielfältiger und beherbergt mehr fakultativ pathogene gramnegative Bakterien als die Mikroflora adulter Menschen. Sie passt sich aber bereits innerhalb der ersten Lebensmonate der mikrobiellen Flora von Erwachsenen an (HINGHOFER-SZALKAY 1999). 36 Literaturübersicht Als physiologisch steril werden in der Literatur hingegen das Mittelohr, Nasennebenhöhlen, Lungenalveolen, Gallenwege und Pankreasgang, Harnleiter und Harnblase sowie Eileiter und Gebärmutter angesehen (KAHN und JONES 1987, HOSEMAN und KÜHNEL 2001, WALKER 2004, PAETZ 2009). Neuere Studien zweifeln dies jedoch immer häufiger an (ROGERS et al. 2004, ARMOUGOM et al. 2009, TONNAER et al. 2009, HILTY et al. 2010, HUANG et al. 2010, MLADINA et al. 2010, ERB-DOWNWARD et al. 2011). So konnte mittels kulturunabhängiger Methoden gezeigt werden, dass die Lunge bei gesunden Menschen nicht steril ist und sich ihr Keimspektrum je nach Erkrankung verändert (ROGERS et al. 2004, ARMOUGOM et al. 2009, HILTY et al. 2010, HUANG et al. 2010, ERB-DOWNWARD et al. 2011). Diese Studien widerlegen die Ergebnisse früherer Untersuchungen mit klassischen kulturellen Verfahren, die besagen, dass die Lunge bei gesunden Individuen steril ist (KAHN und JONES 1987, THORPE et al. 1987). Auch im Mittelohr gesunder Kinder konnten mit kulturunabhängigen Methoden in der Mehrzahl der Proben sowohl einzelne Bakterien als auch Bakterien in Biofilmformationen nachgewiesen werden (TONNAER et al. 2009). MLADINA et al. (2010) stellten bei ihren kulturunabhängigen Untersuchungen fest, dass sich auf der Schleimhaut der Nasennebenhöhlen auch bei gesunden Menschen ein bakterieller Biofilm befindet. Früher aufgestellte Annahmen über die Sterilität bestimmter Körperregionen sollten daher kritisch hinterfragt werden. 2.6 Mikrobielle Flora des Genitaltraktes der Stute 2.6.1 Bakterienflora des Vestibulums, der Vagina und der Zervix Vestibulum Studien zum Keimgehalt des Vestibulums bei der Stute liegen von LEIDL et al. 1976, MERKT et al. (1987), HINRICHS et al. (1988), SCHUBERT (1994) und HUCHZERMEYER (2003) vor. Bei den Untersuchungen von LEIDL et al. (1976) 37 Literaturübersicht wiesen 51 % der Proben und bei den Untersuchungen von SCHUBERT (1994) 76 % der Proben fakultativ pathogene Bakterien auf. Angaben über das Vorkommen apathogener Bakterien wurden in beiden Arbeiten nicht gemacht. MERKT et al. isolierten 1987 aus allen 9 untersuchten Proben des Vestibulums eine unbedenkliche Bakterienflora und bei 5 Proben konnten sie zusätzlich fakultativ pathogene Bakterien nachweisen. Die bakterielle Flora des Vestibulums unterschied sich dabei nur geringfügig von der Flora der äußeren Labien (MERKT et al. 1987). HINRICHS et al. (1988) beschrieben, dass in 31 % der Tupfer weder apathogene noch fakultativ pathogene Bakterien nachgewiesen werden konnten. Bei den Untersuchungen von HUCHZERMEYER (2003) waren alle Proben aus dem Vestibulum positiv und aus 75 % der Proben konnten neben apathogenen Bakterien auch fakultativ pathogene Bakterien isoliert werden. Auch wenn nur relativ wenig Untersuchungen über die mikrobielle Besiedlung des Vestibulums bei der Stute vorliegen, wird davon ausgegangen, dass bei der Stute wie beim Menschen eine physiologische bakterielle Besiedlung des Vestibulums besteht (LEIDL et al. 1976, WOOLCOCK 1980, WALKER 2004, HANDLER 2005). Vagina Beim Pferd konnten in verschiedenen Studien der vaginalen Bakterienflora in 25 % (LEIDL et al. 1976), 44 % (MERKT et al. 1987), 42 % (HINRICHS et al. 1988) bzw. 40 % (HUCHZERMEYER 2003) der Proben Bakterien nachgewiesen werden. Zu beachten ist, dass LEIDL et al. (1976) nur fakultativ pathogene Bakterien mit in die Ergebnisse einbezogen haben. Alle oben genannten Autoren stellten außerdem eine deutliche Reduktion der vaginalen Bakterien im Vergleich zu den Bakterien im Bereich des Vestibulums fest. Obwohl in den Untersuchungen nur in weniger als 50 % der Proben Bakterien nachgewiesen wurden, wird heute davon ausgegangen, dass bei der Stute eine ständige bakterielle Besiedlung der Vagina vorhanden ist (WOOLCOCK 1980, WALKER 2004, HANDLER 2005). Bei der Frau besteht die nachgewiesene bakterielle Flora der Vagina vor der Pubertät vor allem aus Staphylokokken und Streptokokken, während nach der 38 Literaturübersicht Pubertät die Laktobazillen dominieren (BROLL et al. 2008). Durch neuere molekularbiologische Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die Vaginalflora der Frau zudem noch wesentlich vielfältiger ist, als es kulturelle Verfahren vermuten ließen (ZHOU et al. 2004, OAKLEY et al. 2008). Zervix In der Fachliteratur liegen wenig Informationen zur Keimflora der Zervix beim Pferd vor. Bei den Untersuchungen von LEIDL et al. (1976) konnten in 23 % der Proben von der Zervix fakultativ pathogene Bakterien nachgewiesen werden. Dies entsprach in etwa den für die Vagina (25 %) sowie für den Uterus (19 %) ermittelten Werten. In 45 % der von HUCHZERMEYER (2003) untersuchten 20 Zervixproben konnten Bakterien nachgewiesen werden. Zweimal handelte es sich dabei auch um fakultativ pathogene Bakterien. HUCHZERMEYER (2003) stellte eine deutliche Reduktion fakultativ pathogener Bakterien von der Vagina zur Zervix fest und nahm daher an, dass die Zervix eine selektive Barriere für fakultativ pathogene Bakterien darstellt. Ob es sich bei zervikal nachgewiesenen Bakterien um transiente Mikroorganismen handelt oder sie ein Bestandteil einer ständigen zervikalen Keimflora sind, ist gegenwärtig nicht eindeutig geklärt. Die meisten Autoren beziehen zu diesem Sachverhalt keine Stellung. Lediglich LEIDL et al. (1976), WOOLCOCK (1980) sowie TILLMANN et al. (1982) gehen davon aus, dass die Zervix der Stute normalerweise keimfrei ist. Bei der Frau ist eine bakterielle Besiedlung der Zervix nachgewiesen (BARTLETT et al.1978, BROWN et al. 1985b, HEMSELL et al. 1989). Die Zervixflora unterscheidet sich beim Menschen nur wenig von der vaginalen Flora (BARTLETT et al.1978, BROWN et al. 1985b). 39 Literaturübersicht 2.6.2 Bakterienflora des Uterus Zum uterinen Keimgehalt der Stute liegen viele Untersuchungen vor (SCOTT et al. 1971, TILLMANN et al. 1982, RICKETTS und MACKINTOSH 1987, HINRICHS et al. 1988, WINGFIELD DIGBY und RICKETTS 1982, SCHUBERT 1994, ALBIHIN et al. 2003, HUCHZERMEYER 2003, LEBLANC et al. 2007, FRONTOSO et al. 2008, NEUBERG 2009). Es ist jedoch schwer, die Ergebnisse zu vergleichen, da häufig unterschiedliche Entnahmetechniken genutzt und die Proben entweder zervikal, zerviko-uterin oder intrauterin genommen wurden. Zudem fand in der Regel keine eindeutige Differenzierung zwischen fertilen und infertilen Stuten statt und die meisten Autoren sind nur auf fakultativ pathogene, aber nicht auf apathogene Bakterien eingegangen. Zum Teil wurden auch nur Reinkulturen und Mischkulturen, bei denen ein Keim die Agarplatte deutlich dominiert, mit in die Ergebnisse einbezogen (NIELSEN 2005, FRONTOSO et al. 2008). Die Annahme von LEBLANC et al. (1989), dass sich die bakteriologischen Ergebnisse von Uterustupfern im Östrus und im Diöstrus unterscheiden, konnte durch Untersuchungen von HINRICHS et al. (1988) und HUCHZERMEYER (2003) nicht bestätigt werden. Uterine Bakterienflora infertiler Stuten Bei Untersuchungen von infertilen Stuten fielen die bakteriologischen Befunde von Uterustupfern in 49 % (FRONTOSO et al. 2008), 51 % (TILLMANN et al. 1982), 64 % (ALBIHIN et al. 2003) bzw. 70 % (LEBLANC et al. 2007) der Fälle positiv aus. Während FRONTOSO et al. (2008), TILLMANN et al. (1982) sowie ALBIHIN et al. (2003) ihre Proben Tupfersystemen Uterusspülungen mit entnommen mit einfach haben, geringem geschützten kamen Volumen bei zum oder doppelt LEBLANC Einsatz. et geschützten al. RICKETTS (2007) und MACKINTOSH (1987) konnten in 49 % der Proben von güsten Stuten anaerobe Bakterien nachweisen. Die Probenentnahme erfolgte dabei zum Teil mit geschützten und zum Teil mit ungeschützten Tupfern. 40 Literaturübersicht Bei vielen Studien wurden sowohl von fertilen als auch von infertilen Stuten Proben genommen (LEIDL et al. 1976, WINGFIELD DIGBY und RICKETTS 1982, MERKT et al. 1987, NIELSEN 2005, RIDDLE et al. 2007, NEUBERG 2009). Der Anteil der positiven Proben lag zwischen 11 % (RIDDLE et al. 2007) und 74 % (NEUBERG 2009). Die Probenentnahme erfolgte bei allen Autoren, außer bei WINGFIELD DIGBY und RICKETTS (1982), mit einfach geschützten oder doppelt geschützten Tupfern. Da die Ergebnisse der bakteriologischen Untersuchungen von den Autoren allerdings nicht differenziert für fertile und infertile Stuten betrachtet wurden, lassen sich weder auf die Bakterienflora gesunder noch auf die Bakterienflora infertiler Stuten Rückschlüsse ziehen. SCOTT et al. (1971) haben den isolierten Uterus von 100 geschlachteten Stuten mit unbekannter Vorgeschichte mikrobiologisch untersucht. Aus 33 % der Proben konnten Bakterien isoliert werden. Es ist jedoch zu berücksichtigen, dass keine Vorkehrungen getroffen wurden, um den Uterus nach der postmortalen Erschlaffung der Sphinkter vor Kontaminationen zu bewahren (HINRICHS et al. 1988). HUCHZERMEYER (2003) verglich die Ergebnisse von in vivo und post mortem untersuchten Uterustupferproben bei Stuten. Die Diskrepanz der Ergebnisse der beiden Versuchsgruppen führte zu dem Schluss, dass post mortem ermittelte bakteriologische Ergebnisse nicht als Anhaltspunkt für die in vivo existierende Bakterienflora geeignet sind (HUCHZERMEYER 2003). Uterine Bakterienflora geschlechtsgesunder Stuten Untersuchungen zur mikrobiellen uterinen Keimflora bei gesunden Stuten liegen nur vereinzelt vor. MERKT et al. nahmen 1987 von 9 geschlechtsgesunden Stuten intrauterine Proben. Die Probenentnahme erfolgte mit Spekulum, Zervixfasszange sowie einem geschützten Tupfersystem. Während sie aus 2 (22 %) der 9 Proben eine unbedenkliche aerobe Bakterienflora isolierten, konnten fakultativ pathogene Bakterien in keiner Probe nachgewiesen werden. Es wurden keine Angaben gemacht, um welche apathogenen Bakterien es sich handelte. RICKETTS und 41 Literaturübersicht MACKINTOSH (1987) haben Uterustupferproben von fertilen sowie von infertilen Stuten auf anaerobe Bakterien untersucht. Die Probenentnahme erfolgte zum Teil mit geschützten und zum Teil mit ungeschützten Tupfern. Zwar wurde bei den Ergebnissen nicht das verwendete Tupfersystem berücksichtigt, dafür aber die Ergebnisse getrennt nach dem Reproduktionsstatus aufgeführt. Das Vorkommen von anaeroben Bakterien in mehr als 50 % der Tupfer von 41 untersuchten geschlechtsgesunden Maidenstuten bei gleichzeitiger negativer Zytologie führte bei RICKETTS und MACKINTOSH (1987) zu der Annahme, dass im equinen Uterus anaerobe Bakterien als ständige Oberflächenkommensalen vorkommen. Bei den Untersuchungen von HINRICHS et al. (1988) wurden von 48 geschlechtsgesunden Stuten mit doppelt geschützten Tupfern manuell transvaginal Uterustupferproben entnommen. In 31 % der Proben konnte bakterielles Wachstum festgestellt werden, wobei es sich aber ausschließlich um apathogene Bakterien in geringer Anzahl handelte. Hierzu zählten Bacillus sp., Corynebacterium sp., α-hämolysierende Streptokokken, anhämolysierende Streptokokken, Nocardia sp. sowie nicht coliforme Stäbchen. HINRICHS et al. (1988) vermuteten, dass es sich bei den isolierten Bakterien um transiente Bakterien des Uterus oder um Kontaminationen handelte, da sie nur in wenigen Tupfern sowie nur in geringer Anzahl nachgewiesen wurden. Bei den von SCHUBERT (1994) entnommenen 37 Uterustupferproben von geschlechtsgesunden Stuten wiesen 32 % der Proben einen fakultativ pathogenen Keimgehalt auf. Apathogene Bakterien wurden in dieser Studie nicht berücksichtigt. HUCHZERMEYER (2003) stellte bei 20 aus dem Uterus geschlechtsgesunder Stuten entnommener Proben in 7 Fällen (35 %) bakterielles Wachstum fest. 2 der 7 positiven Proben wiesen dabei neben apathogenen auch fakultativ pathogene Bakterien auf und in einer Probe konnten auch anaerobe Bakterien nachgewiesen werden. Bei den fakultativ pathogenen Bakterien handelte es sich um βhämolysierende Streptokokken und bei den apathogenen um Staphylococcus epidermicus, α-hämolysierende Streptokokken, aerobe Bazillen, Alcaligenes faecalis, Corynebacterium sp. sowie die nicht weiter differenzierten anaeroben Bakterien. Die Probenentnahme erfolgte mit Hilfe eines Spekulums und mit geschützten Tupfern (HUCHZERMEYER 2003). 42 Literaturübersicht Ob der gesunde Uterus der Stute steril ist oder eine natürliche bakterielle Besiedlung aufweist, konnte bis heute nicht geklärt werden. Der Nachweis von Bakterien aus dem Uterus ohne weitere Entzündungsanzeichen führte bei einigen Autoren zu der Annahme, dass der gesunde Uterus eine physiologische Keimflora aufweist (SCOTT et al. 1971, RICKETTS und MACKINTOSH 1987, NASH et al. 2010). Die meisten Autoren gehen jedoch davon aus, dass der gesunde Uterus steril ist. Sie interpretieren den bakteriellen Nachweis uteriner Keime aufgrund der geringen Keimanzahl und der großen Keimvariation als eine transiente, kontaminationsbedingte bakterielle Besiedlung. Lediglich nach einer Bedeckung bzw. einer Uterusmanipulation sowie post partum weist der Uterus ihrer Ansicht nach auch physiologisch Bakterien auf (LEIDL et al. 1976, WOOLCOCK 1980, TILLMANN et al. 1982, HINRICHS et al. 1988, HANDLER 2005). Unter klinischen Aspekten ist die Frage, ob die Gebärmutter eine permanente bakterielle Besiedlung aufweist, für die Formulierung des Therapieziels im Rahmen einer Endometritis wichtig. Dies könnte entweder „keimfreier Uterus“ oder „Wiederherstellung der physiologischen uterinen Keimflora“ lauten und hätte Konsequenzen im Hinblick auf die einzusetzenden Medikamente. Uterine Bakterienflora anderer Tierarten SCHULTHEISS et al. (1999) untersuchten den Keimgehalt von gesunden caninen und felinen Uteri. Dafür wurden direkt nach der Hysterektomie Proben zur bakteriologischen Untersuchung genommen. Bei den Katzen waren 11 % der Proben und bei den Hunden 25 % der Proben positiv. Dabei konnten gehäuft Bakterien aus den Proben der präpubertären sowie der diöstrischen Hunde isoliert werden. SCHULTHEISS et al. (1999) interpretierten das Ergebnis ihrer Studie als einen Hinweis auf das Vorkommen einer uterinen bakteriellen Normalflora beim Hund und bei der Katze. In einer Studie von WATTS et al. (1996) konnten in allen Uterustupfern von Hunden, die während des Präöstrus sowie des Östrus entnommen wurden, Bakterien nachgewiesen werden, während in den anderen Zyklusstadien nur 43 Literaturübersicht 3 % der Tupfer positiv waren. WATTS et al. (1996) nahmen daher an, dass lediglich im Präöstrus sowie im Östrus eine natürliche Mikroflora vorkommt. Bei den von GUNAY et al. (2010) untersuchten 55 Hunden in unterschiedlichen Zyklusphasen waren hingegen alle 20 Proben aus dem hysterektomierten Uterus negativ. Sie schlossen daraus, dass der gesunde Uterus von Hündinnen steril ist. Bei den von JACQUES et al. (1986) entnommenen Uterustupferproben von euthanasierten Kaninchen wiesen 45 % der Proben ein positives bakteriologisches Ergebnis auf. Die Autoren gehen davon aus, dass es sich bei den nachgewiesenen Bakterien um den Bestandteil einer physiologischen uterinen Keimflora handelt. Uterine Bakterienflora der Frau Auch beim Menschen konnte die Frage nach dem Vorkommen einer physiologischen bakteriellen Besiedlung des Uterus noch nicht beantwortet werden. Die meisten bakteriologischen Untersuchungen des Uterus wurden post partum oder bei Frauen mit Uterusinfektionen durchgeführt (BOLLINGER 1964). Es liegen nur wenige bakteriologische Studien über den gesunden, nicht schwangeren Uterus vor. Während einige Autoren die Meinung vertreten, dass der gesunde Uterus der Frau steril ist (SPARKS et al. 1977, TEISELA 1987), gehen andere Autoren davon aus, dass er eine natürliche endometriale Keimflora beherbergt (BOLLINGER 1964, HEMSELL et al. 1989, COWLING et al. 1992). Sowohl in der Veterinärmedizin als auch in der Humanmedizin muss demnach die Frage, ob der gesunde Uterus steril ist oder eine natürliche bakterielle Besiedlung aufweist, als noch nicht eindeutig beantwortet gelten. 44 Material und Methode 3 Material und Methode 3.1 Versuchsaufbau Wie schematisch in der Abbildung 1 dargestellt, wurden für die Untersuchungen von Zuchtstuten im Anschluss an eine gynäkologische Untersuchung sowie von Fohlen und zweijährigen Stuten 2 Tupferproben mittels Uteruskulturtupfer für Stuten (Fa. Minitüb, Tiefenbach) zur bakteriologischen Untersuchung und ein Endometriumabstrich mittels Zytologiebürste für Stuten (Fa. Minitüb, Tiefenbach) zur zytologischen Untersuchung genommen. Stuten, Fohlen Zytologische Untersuchung Nachweis bekannter Keime Bakteriologische Untersuchung Nachweis unbekannter Keime Kein Keimnachweis 16 S rDNA Sequenzanalyse Keime identifizierbar Keime nicht identifizierbar Taxonomische Einordnung mittels Stammbaum Abb. 1: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus 45 Material und Methode Die Untersuchung der Tupfer auf aerobe, mikroaerophile und anaerobe Bakterien sowie deren phänotypische und biochemische Charakterisierung erfolgte im Institut für Mikrobiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Bakteriengattungen, die beim Vorkommen im Uterus des Pferdes als apathogen eingestuft werden sowie anaerobe Bakterienisolate, wurden in der Mikrobiologie nicht bis zur Speziesebene differenziert. Sie wurden anschließend mit den Bakterienisolaten, die kulturellbiochemisch nicht bestimmt werden konnten, molekularbiologisch untersucht. Hierzu wurde zunächst die DNA von den Bakterien isoliert. Von der isolierten DNA wurden dann mit bakterienspezifischen Primern die ersten 460 bis 560 Basenpaare des 16S rDNA Gens mittels PCR amplifiziert und anschließend deren Nukleinsäuresequenz bestimmt. Zur Identifizierung der Bakterien wurden ihre Sequenzen mit denen der Genbank des National Center for Biotechnology Information (U.S. National Library of Medicine, Bethesda, USA) verglichen. Für die Bakterien, die auch über ihre Sequenz nicht bestimmt werden konnten, erfolgte eine taxonomische Einordnung durch die Erstellung eines phylogenetischen Baumes. Die Exfoliativzytologie des Endometriums wurde mit der Diff-Quick®-Färbung (Fa. Medion Diagnostics, Düdingen, Schweiz) gefärbt und auf das Vorhandensein von neutrophilen Granulozyten untersucht, um eine eventuelle Entzündung des Endometriums zu erkennen. Die gynäkologischen Untersuchungen, die Probenentnahmen, die zytologischen Untersuchungen sowie die gesamten molekularbiologischen Untersuchungen wurden eigenständig durchgeführt, während die mikrobiologische Untersuchung der Uterustupfer durch Mitarbeiter des Institutes für Mikrobiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover und die Erstellung der phylogenetischen Bäume durch die Firma nadicom (nadicom - Gesellschaft für angewandte Mikrobiologie, Marburg) erfolgte. 46 Material und Methode 3.2 Probanden Die Proben wurden zwischen März und August 2010 von 60 Warmblutstuten und 15 Stutfohlen des Pferdezuchtbetriebs Vorwerk in 49393 Lohne, von 6 Warmblutstuten aus dem Landgestüt Celle sowie von 7 Warmblutstuten aus dem Patientengut der Reproduktionsmedizinischen Einheit der Kliniken der Tierärztlichen Hochschule Hannover entnommen. Von allen Stuten wurde der Vorbericht über den Reproduktionsstatus aufgenommen. Hierbei wurden das Alter der Stuten, ihre Lebensnummer sowie Angaben zu vorherigen Besamungen, Trächtigkeitsuntersuchungen, Geburten und bakteriologischen Untersuchungen erfasst. 3.3 Gynäkologische Untersuchung Vor der Probenentnahme wurde bei den dreijährigen und älteren Stuten eine gynäkologische Untersuchung durchgeführt (Tab. 1). Diese umfasste eine Prüfung des Rosseverhaltens am Probierhengst, eine Untersuchung des äußeren Genitals sowie eine rektale palpatorische und ultrasonographische (LOGIQ e, 4-10 MHz Endolinearsonde, beides GE Healthcare, Solingen) Untersuchung des Uterus und der Ovarien. Für die innere Untersuchung wurde ein Einmalrektalhandschuh (cpPharma, Burgdorf) mit Gleitgel (Wirtschaftsgenossenschaft Deutscher Tierärzte eG, Garbsen) verwendet. 47 Material und Methode Tab. 1: Untersuchungsparameter der gynäkologischen Untersuchung Untersuchung Erfasste Parameter Rosseverhalten "Stehen" "Blitzen und Schleimen" Heben des Schweifes Adspektion und Palpation äußeres Genital Vaginaler Ausfluss Stellung und Schluss der Vulva Rektale Palpation Uterusgröße Symmetrie des Uterus Kontraktionsbereitschaft des Uterus Größe der Ovarien Konsistenz des dominanten Follikels Rektale Ultrasonographie Ödematisierung des Uterus Größe des dominanten Follikels Corpus luteum Flüssigkeitsansammlungen Bei der Prüfung des Rosseverhaltens wurden die drei Parameter einzeln bewertet und in positiven Fällen mit einem „+“ und in negativen Fällen mit einem „-“ gekennzeichnet (KLUG 1999). Bei der Betrachtung des äußeren Genitals wurde auf das Vorhandensein von Ausfluss und Sekretspuren geachtet. Außerdem wurde adspektorisch der Verlauf der Rima vulvae und palpatorisch die Position des ventralen Schamwinkels sowie der Schamschluss beurteilt. Die Einteilung der Befunde bezüglich des Schlusses und der Stellung der Vulva erfolgte in 3 Kategorien (HANDLER u. AURICH 2005): Kategorie 1 – Physiologischer Zustand der Vulva ○ Die Schamlippen sind normal ausgebildet ○ Die Schamspalte ist geschlossen ○ Die Schamspalte verläuft gerade 48 Material und Methode ○ Der dorsale Schamwinkel überragt den Beckenboden maximal 4 cm nach dorsal ○ Die Vulva steht senkrecht bzw. ist bis zu 10 Grad von kraniodorsal nach kaudoventral geneigt Kategorie 2 – Mittelgradige Abweichungen ○ Der dorsale Schamwinkel ist bis zu 7 cm über das Niveau des Beckenbodens verschoben ○ Die Vulva verläuft in Relation zur Senkrechten in einem Winkel von 10 bis 30 Grad von kraniodorsal nach kaudoventral Kategorie 3 – Hochgradige Abweichungen ○ Der dorsale Schamwinkel ist bis zu 9 cm über den Beckenboden verlagert ○ Der Neigungswinkel erreicht Werte über 30 Grad Der Durchmesser des dominanten Follikels wurde in cm gemessen und die Ödematisierung der Gebärmutter folgendermaßen dokumentiert: - Kein endometriales Ödem + Geringgradig ausgeprägtes endometriales Ödem ++ Mittelgradig ausgeprägtes endometriales Ödem, deutliche Radspeichenstruktur +++ Hochgradig ausgeprägtes endometriales Ödem Bei Flüssigkeitsansammlungen im Uterus wurde der Durchmesser bestimmt, hierbei wurde weniger als 1,5 cm als geringgradig, mehr als 1,5 cm als mittelgradig und mehr als 5 cm als hochgradig eingestuft. Außerdem wurde die Echogenität des Exsudates beurteilt. Die Größe, die Symmetrie und die Kontraktionsbereitschaft des Uterus sowie die Größe der Ovarien und die Konsistenz des dominanten Follikels wurden 49 Material und Methode entsprechend dem Schlüssel für die Aufzeichnung gynäkologischer Untersuchungsbefunde nach KLUG (1999) dokumentiert. Die Einteilung der Stuten in die Zyklusstadien Östrus und Diöstrus erfolgte anhand der Ergebnisse der Kontrolle des Rosseverhaltens sowie der rektalen Untersuchung. Eine Stute wurde als rossig erfasst, wenn mindestens 2 Parameter der Kontrolle des Rosseverhaltens positiv waren, 1 Follikel mit einem Durchmesser von mindestens 3 cm und ein endometriales Ödem vorlagen. Bei den Fohlen und den zweijährigen Stuten erfolgte keine Einteilung in Zyklusstadien. 3.4 Versuchsgruppeneinteilung Anhand der Anamnese und der Ergebnisse der gynäkologischen Untersuchung erfolgte eine Einteilung der Probanden in 6 verschiedene Versuchsgruppen: ○ Fohlen ○ Maidenstuten ○ Güste Stuten ○ Umrossende Stuten ○ Stuten, die resorbiert haben ○ Klinisch auffällige Stuten Bei den Maidenstuten wurden ausschließlich zwei- und dreijährige Stuten mit in die Untersuchung einbezogen, bei denen noch keinerlei Manipulation in Form von Bedeckung, Besamung oder Probenentnahme stattgefunden hat. Als güste Stuten galten solche, die aus einer Besamung oder Bedeckung aus der vorherigen Zuchtsaison nicht tragend geworden sind. Stuten, die in der laufenden Zuchtsaison bereits belegt wurden und nicht tragend geworden sind, wurden als umrossend eingestuft. Als Kriterium für die Zugehörigkeit in die Gruppe der Stuten, die resorbiert haben, galt eine positive Trächtigkeitsuntersuchung zwischen Tag 16 und Tag 20 50 Material und Methode und eine anschließende negative Trächtigkeitsuntersuchung. Als klinisch auffällig galten Stuten, wenn mittelgradige oder hochgradige intrauterine Flüssigkeitsansammlungen oder vaginaler Ausfluss festgestellt werden konnte. Da geringgradige intrauterine Flüssigkeitsansammlungen im Östrus auch physiologisch vorkommen können, mussten Stuten mit geringgradigen intrauterinen Flüssigkeitsansammlungen sich zusätzlich zum Zeitpunkt der Probenentnahme im Diöstrus befinden oder sich ihre Flüssigkeitsansammlung im Ultraschallbild unregelmäßig echoarm mit echogenen Bereichen darstellen, um zu der Gruppe der klinisch auffälligen Stuten zu zählen. 3.5 Probenentnahme Vor jeder Probenentnahme wurde das äußere Genital zunächst trocken, dann mit einer PVP-Jodlösung (Fa. B. Braun Melsungen AG, Melsungen) und anschließend noch einmal trocken gereinigt. Die Probenentnahme für die bakteriologische Untersuchung erfolgte mit einem doppelt geschützten Uteruskulturtupfer (Abb. 2) und für die zytologische Untersuchung mit einer Zytologiebürste (Abb. 3). Es wurden 2 Tupferproben pro Proband genommen. Der erste Tupfer wurde auf aerobe sowie mikroaerophile Keime und der zweite Tupfer auf anaerobe Keime untersucht. Abb. 2: Uteruskulturtupfer für Stuten 51 Material und Methode Abb. 3: 3.5.1 Zytologiebürste für Stuten Probenentnahme bei Fohlen Bei den Fohlen erfolgte die Probenentnahme mit einem Röhrenspekulums (Fa. Eickemeyer, Tuttlingen), welches mindestens 14,5 cm weit vaginal eingeführt wurde (Abb. 4). Die äußere Hülle des ersten Uteruskulturtupfers wurde dann mindestens 25 cm durch das Röhrenspekulum vorgeschoben, so dass sie aufgrund der noch nicht vollständig ausgebildeten Zervix direkt in das Cavum uteri gelangte. Abb. 4: Röhrenspekulum Um die Probenentnahmetechnik zu entwickeln und um nähere Erkenntnisse über die Anatomie des Genitaltraktes bei neugeborenen Stutfohlen zu bekommen, wurde eine Sektion bei einem 1 Tag alten Fohlen durchgeführt, welches zuvor aufgrund einer Gaumenspalte in der Klinik für Pferde der Tierärztlichen Hochschule Hannover euthanasiert werden musste. Zunächst wurden ein Röhrenspekulum und der Uteruskulturtupfer für Pferde vaginal eingeführt, um ihren Sitz nach dem Eröffnen der Bauchhöhle und der Entnahme des 52 Material und Methode Darmes zu kontrollieren und auszumessen. Durch eine Fensterung des Uterus konnte die Lage der Entnahmegeräte dokumentiert werden (Abb. 5). Abb. 5: Gefensterter Uterus eines 1 Tag alten Fohlens in situ mit Tupfer sowie Spekulum nach Eröffnung der Bauchhöhle und Entnahme des Darmes 1 = Ovarien 2 = Uterus 3 = Wattespitze des Uteruskulturtupfers 4 = Durchstoßene Verschlusskappe des Uteruskulturtupfers 5 = Äußere Hülle des Uteruskulturtupfers 6 = Spekulumspitze Anschließend wurde der Uterus mit den Ovarien, dem Nabelstrang und dem letzten Abschnitt des Mastdarmes entnommen. Eine Zervix in Form einer bindegewebigen Verdickung des kaudalen Gebärmutterabschnitts der Gebärmutterwand war nicht zu fühlen. Lediglich an der geöffneten Gebärmutter waren kleine Schleimhautfalten im Bereich der späteren Zervix zu sehen (Abb. 6). 53 Material und Methode 5 1 4 3 2 1 6 4 cm Abb. 6: Eröffneter Uterus eines 1 Tag alten Fohlens 1 = Ovarien 2 = Uterus 3 = Schleimhautfalten der Zervix 4 = Vagina 5 = Mastdarm 6 = Nabelstrang Bei einer Einführungstiefe von 14,5 cm für das Spekulum und einer von 25 cm für den Uteruskulturtupfer war eine sichere Probenentnahme aus dem Cavum uteri von Fohlen gewährleistet. Es wurde auch geprüft, ob es möglich ist, bei einjährigen Stuten eine Tupferprobe direkt aus dem Uterus zu entnehmen. Bei Jährlingsstuten konnte der Tupfer aber 54 Material und Methode nicht wie bei den Fohlen blind mittels Röhrenspekulum vorgeschoben werden, da bei ihnen bereits eine Zervix mit einer dickeren und festeren Wand ausgebildet ist (RÖBER 1914) und es daher nicht gewährleistet ist, dass der Tupfer direkt in den Uterus gelangt. Für die Entnahme mittels Spreizspekulum und Zervixfasszange ist das knöcherne Becken noch zu eng, ein gleichzeitiges Einführen der Zervixfasszange und eine optische Kontrolle ihrer Position waren somit nicht möglich. Da also eine sichere Probenentnahme direkt aus dem Uterus mit den auf einem Gestüt durchführbaren Methoden bei Jährlingsstuten nicht möglich ist, wurden stattdessen von zweijährigen Stuten Proben genommen, deren knöchernes Becken ausreichend entwickelt ist. 3.5.2 Probenentnahme bei zweijährigen und älteren Stuten Bei den zweijährigen und älteren Stuten erfolgte die Probenentnahme mit Hilfe eines Spreizspekulums nach Polansky (Fa. Hauptner, Solingen) und einer Zervixfasszange nach Götze mit Beleuchtung (Fa. Hauptner, Solingen; Abb. 7). Abb. 7 Spreizspekulum nach Polansky und Zervixfasszange nach Götze Nachdem das Spekulum vaginal eingeführt wurde, erfolgte unter optischer Kontrolle zunächst eine Fixierung der Zervix mit der Fasszange und ebenfalls unter optischer Kontrolle konnte dann der erste Tupfer in die Zervix vorgeführt werden. 55 Material und Methode 3.5.3 Entnahmetechnik für die bakteriologische Untersuchung Die äußere Schutzhülle des ersten Tupfers wurde in den Zervikalkanal eingeführt und dann die innere Schutzhülle in das Uteruslumen vorgeschoben. Erst im Cavum uteri wurde dann der eigentliche Tupfer aus der inneren Schutzhülle vorgeführt und über mindestens 30 Sekunden mit dem Endometrium in Kontakt gehalten. Das Zurückziehen erfolgte in umgekehrter Reihenfolge, wobei die äußere Schutzhülle in der Zervix belassen wurde. So konnte die innere Schutzhülle des zweiten Tupfers direkt durch die äußere Schutzhülle des ersten Tupfers in den Uterus vorgeschoben werden. Die weitere Probenentnahme erfolgte wie beim ersten Tupfer. Beim Entfernen des zweiten Tupfers wurde die äußere Hülle für die anschließende Entnahme der Zytologieprobe weiterhin in der Zervix belassen. Nach der Entnahme aus dem Uterus wurden die Tupfer in ein AMIESTransportmedium (Heinz Herenz Medizinalbedarf, Hamburg) überführt und gekühlt mittels Express-Versand (Deutsche Post AG, Bonn) innerhalb von 24 Stunden an das Untersuchungslabor des Instituts für Mikrobiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover gesendet. 3.5.4 Entnahmetechnik für die zytologische Untersuchung Die Entnahme der Probe für die zytologische Untersuchung erfolgte im Anschluss an die Probenentnahme für die bakteriologische Untersuchung. Die Schutzhülle der Zytologiebürste wurde durch die in der Zervix verbliebene äußere Schutzhülle des Uteruskulturtupfers in den Uterus vorgeschoben. Dann wurde die Bürste vorgeführt, und durch vorsichtiges Bewegen über die Oberfläche des Endometriums erfolgte die Entnahme von Probenmaterial. Anschließend wurde die Bürste in die Schutzhülle zurückgezogen und mit der äußeren Schutzhülle des Uteruskulturtupfers zusammen aus dem Genitaltrakt entnommen. 56 Material und Methode Das Probenmaterial von der Zytologiebürste wurde auf Objektträger (76 x 26 mm, Fa. Carl Roth, Karlsruhe) ausgerollt und für einige Minuten luftgetrocknet. 3.6 Prüfung der Probenentnahme bezüglich Kontaminationen Die Sterilität der Uteruskulturtupfer wurde geprüft, indem 3 Tupfer im Untersuchungslabor des Instituts für Mikrobiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus ihrer Verpackung entnommen und direkt auf Nährmedien ausgestrichen wurden. Des Weiteren wurde geprüft, ob es bei der Überführung der Tupfer in das Transportmedium oder bei dem anschließenden Transport zu Kontaminationen kommen kann. Hierzu wurden 3 Tupfer auf dem Gestüt Vorwerk aus ihrer Verpackung entnommen, in das Transportmedium verbracht und mittels ExpressVersand an das Untersuchungslabor gesandt. Ebenso wurde getestet, ob es bei doppelt geschützten Tupfersystemen zu Kontaminationen kommen kann, wenn die äußere Hülle bereits Kontakt zu der Schleimhaut des Genitaltraktes hatte. Hierzu wurden bei 5 Pferden mit Hilfe eines Spekulums Uteruskulturtupfer unter optischer Kontrolle in die Zervix vorgeführt. Die inneren Hüllen wurden aber erst vorgeschoben, nachdem der Uteruskulturtupfer wieder vollständig aus dem Genitaltrakt entnommen wurde. Direkt anschließend wurde ein weiterer Uteruskulturtupfer unter Handschutz bis in die Zervix vorgeführt. Die inneren Hüllen wurden allerdings auch erst wieder außerhalb des Pferdes vorgeschoben. 57 Material und Methode 3.7 Probenentnahme für den Vergleich der Entnahmetechniken Die Entnahmetechnik mit Hilfe von Spekulum und Zervixfasszange wurde mit der manuellen transvaginalen Entnahmetechnik, bei der die Uteruskulturtupfer unter Handschutz in die Zervix vorgeführt wurden, verglichen. Bei 27 Stuten des Gestütes Vorwerk wurden hierfür manuell transvaginal Proben entnommen. Die Einteilung der Stuten in Versuchsgruppen und ihre Vorbereitung erfolgte genauso wie bei der Entnahme mittels Spekulum. Es wurde ein steriler Plastikhandschuh übergezogen und mit steriler Kochsalzlösung benetzt. Unter dem Schutz des benetzten Handschuhs wurde der Tupfer dann in die Zervix eingeführt und die Probe entnommen. Die Ergebnisse dieser Proben wurden mit den Ergebnissen der 88 Proben, die mit Spekulum und Zervixfasszange entnommen wurden, verglichen. 3.8 Probenaufbereitung und Auswertung 3.8.1 Probenaufbereitung und Auswertung der bakteriologischen Untersuchung Die bakteriologische Untersuchung der Tupfer wurde im Institut für Mikrobiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt. Hierfür wurde der Tupfer für die aerobe Untersuchung auf Blutagar ausgestrichen und anschließend in einer Nährbouillon angereichert. Die Inkubation der Blutagarplatten erfolgte bei 37°C, nach 24 und 48 Stunden wurden sie ausgewertet. Der Tupfer für die anaerobe Untersuchung wurde auf Schaedler II- und Schaedler IV-Agar ausgestrichen und danach in eine Thioglykolatbouillon überführt. Die Schaedler-Agarplatten wurden bei 37°C in einem anaeroben Milieu inkubiert und nach 48 und 72 Stunden ausgewertet. Nach einer vierundzwanzigstündigen Inkubation bei 37°C wurden ca. 10 µl aus der Nährbouillon und der Thioglykolatbouillon entnommen, erneut auf den oben angegebenen Agarplatten ausgestrichen 58 und anschließend dem jeweiligen Material und Methode Untersuchungsschema unterzogen. Die Zusammensetzungen und Lieferanten der Nährmedien sind im Anhang aufgeführt. Die Differenzierung und Identifizierung der Bakterien erfolgte kulturell-biochemisch gemäß den Standardmethoden eines bakteriologischen Labors. Die Bakterienisolate wurden erfasst und die Stärke ihres Befalls wurde semiquantitativ angegeben: ○ Geringgradiger Keimgehalt <30 Kolonien ○ Mittelgradiger Keimgehalt 30 bis 100 Kolonien ○ Hochgradiger Keimgehalt >100 Kolonien Die Einteilung in fakultativ pathogene und apathogene Bakterien erfolgte entsprechend den Angaben in der Literatur (LEIDL et al. 1976, RICKETTS 1981, TILLMANN et al. 1982, MERKT et al. 1987, RICKETTS und MACKINTOSH 1987, ALBIHIN et al. 2003, SZEMERÉDI et al. 2003, KLEIN et al. 2009). Folgende Bakterienarten bzw. -gruppen wurden als fakultativ pathogen angesehen: ○ Bacteroides fragilis ○ Bacteroides ureolyticus ○ β-hämolysierende Streptokokken ○ Clostridium perfringens ○ E. coli variatio hämolytica ○ Klebsiella ssp. ○ Pseudomonas aeruginosa ○ Staphylococcus aureus ○ Taylorella equigenitalis Auch ein mittelgradiger oder hochgradiger Keimgehalt von nicht hämolysierenden E. coli wurde als fakultativ pathogen eingestuft. 59 Material und Methode Als apathogene Bakterienarten bzw. -gruppen wurden gewertet: o Acinetobacter ssp. o Actinobacillus ssp. o Aerococcus ssp. o α-hämolysierende Streptokokken ○ Anhämolysierende Streptokokken ○ Coryneforme Bakterien o Enterococcus ssp. o Enterobacter ssp. o E. coli (nicht hämolysierend) o Fusobacterium ssp. ○ Koagulasenegative Staphylokokken ○ Pasteurella ssp. ○ Peptostreptococcus ssp. ○ Proteus ssp. ○ Staphylococcus intermedius ○ Staphylococcus epidermidis Ein Nachweis von Bacillus sp. mit geringem Keimgehalt wurde als Kontamination gewertet und nicht mit angegeben. Bei Bakterien, die kulturell-biochemisch nicht bestimmt werden konnten, wurden Eigenschaften wie Verhalten in der Gramfärbung, Form, Wachstumsbedingungen und eine eventuell vorhandene Hämolyse angegeben. Bakteriengattungen, die beim Vorkommen im Uterus des Pferdes als apathogen eingestuft werden, sowie anaerobe Bakterien wurden in der Mikrobiologie nicht bis zur Speziesebene differenziert. Bei den nicht vollständig differenzierten Bakterien erfolgte mit Ausnahme von den koagulasenegativen Staphylokokken, Enterococcus sp., Aerococcus sp., Acinetobacter sp. und 60 Lactobacillus sp. später eine Material und Methode molekularbiologische Analyse. Hierzu wurden Kolonien der einzelnen Bakterien asserviert, indem sie in Glycerinkultur verbracht und bei -70°C eingefroren wurden. 3.8.2 Probenaufbereitung und Auswertung der exfoliativen Endometriumzytologie Zum Färben der luftgetrockneten Exfoliativzytologien wurde als Schnellfärbemethode die Diff-Quick®-Färbung durchgeführt. Hierbei wurden die Präparate durch mehrmaliges kurzes Eintauchen in die 3 verschiedenen Diff-Quick®-Lösungen gleichzeitig fixiert und gefärbt (Tab. 2). Tab. 2: Diff-Quick®-Färbung Diff-Quick®-Lösungen Funktion Hauptbestandteil Anzahl der Wiederholungen Lösung 1 Fixierlösung Methanol 5 x 1 Sekunde Lösung 2 Färbelösung 1 Eosin 5 x 1 Sekunde Lösung 3 Färbelösung 2 Thiazin 5 x 1 Sekunde Im Anschluss an das Eintauchen in die Färbelösungen wurden die Objektträger mit destilliertem Wasser gespült und erneut an der Luft getrocknet. Zur Aufbewahrung wurden dann das schnell erhärtende Eindeckmittel Histofluid (Fa. Marienfeld, LaudaKönigshofen) und ein Deckgläschen (24 x 60 mm, Fa. Carl Roth, Karlsruhe) auf die Ausstriche aufgebracht. Die Auswertung der exfoliativen Zytologien erfolgte mit Hilfe eines Lichtmikroskopes (BX 60, Fa. Olympus, Hamburg). Jeder Ausstrich wurde bei 400-facher Vergrößerung auf das Vorhandensein von neutrophilen Granulozyten untersucht. Die Interpretation der Befunde erfolgte dann nach einem Schema von DASCANIO (2003): - ≤ 5 neutrophile Granulozyten pro 10 Gesichtsfelder + > 5 neutrophile Granulozyten pro 10 Gesichtsfelder 61 Material und Methode 3.9 Molekularbiologische Untersuchungen Zur Identifizierung der phänotypisch nicht differenzierten Bakterien (s. Kap. 3.8.1) wurden molekularbiologische Untersuchungen im Veterinärinstitut Hannover des Niedersächsischen Landesamtes für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES) durchgeführt. Die benötigten Laborgeräte, Verbrauchsmaterialien und Chemikalien sind im Anhang aufgeführt. 3.9.1 Nukleinsäure-Extraktion Die Extraktion der genomischen DNA erfolgte mit dem NucleoSpin® 96 Tissue Kit entsprechend dem Protokoll des Herstellers in einem Extraktionsautomaten. Zunächst wurden hierfür die asservierten Isolate erneut angezüchtet und von jedem Isolat 1 bis 2 Kolonien in ein Reaktionsgefäß mit Lyse-Puffer überführt. Nach der Zugabe einer Proteinase K-Lösung erfolgte eine Inkubation der Proben für 1 Stunde bei 55°C. Das im Lyse-Puffer enthaltene Sodium-Dodecyl-Sulfat (SDS) ist ein anionisches Detergenz. Es hebt die ionischen Interaktionen zwischen Nukleinsäuren und Proteinen auf, so dass diese sich voneinander lösen und es zur Lyse der Kernmembran kommt. Die Proteinase K führt zur Proteolyse der Zellproteine. Die Durchführung der weiteren Schritte erfolgte in einem Extraktionsautomaten. Zum Lysat wurde zunächst Bindungs-Puffer und hochprozentiges Ethanol zugesetzt. Der Puffer enthält ein chaotropes Salz, das die an die Nukleinsäure gebundenen Wassermoleküle löst. Über die nun freiliegende negative Ladung der Phosphatreste kann die Nukleinsäure an Kationen auf einem Silicagel gebunden werden. Im nächsten Schritt wurde das Lysat auf eine Silica-Membran pipettiert, an die sich die DNA dann selektiv und reversibel gebunden hat. Es folgten zwei Waschschritte mit verschiedenen Wasch-Puffern zur Entfernung von Verunreinigungen, bevor die 62 Material und Methode gebundene DNA durch Zugabe eines schwach alkalischen Puffers ohne das chaotrope Salz von der Membran eluiert wurde. Das Eluat konnte direkt als Template in der PCR eingesetzt werden. 3.9.2 Partielle Amplifikation des 16S rDNA Gens Die Amplifikation der ersten 460 bis 560 Basenpaare des 16S rDNA Gens wurde mit dem MicroSeq® 500 16S rDNA PCR Kit durchgeführt. Hierzu wurden 15 µl des Templates und 15 µl von dem PCR Master-Mix des Kits in 0,2 ml PCR-Reaktionsgefäße pipettiert. Der Master-Mix enthält eine Polymerase, Desoxyribonukleosid-Triphosphate (dNTPs), einen Vorwärts-Primer, einen Rückwärts-Primer, Magnesiumchlorid und einen PCR-Puffer, der die optimalen Reaktionsbedingungen herstellt. Als Negativkontrolle wurden 15 µl nukleasefreies Wasser und als Positivkontrolle 15 µl E. coli-DNA-Lösung zu 15 µl Master-Mix gegeben. Diese Arbeitsschritte erfolgten unter einer PCR-Sicherheitswerkbank, die nach jedem Arbeitsgang mit UV-Licht bestrahlt wurde, um so eventuell vorhandene DNA-Reste zu entfernen. Für die anschließende PCR im Thermocycler galten folgende Amplifikationsbedingungen: Tab. 3: PCR-Amplifikationsbedingungen Funktion Aktivierung der Polymerase Denaturierung Hybridisierung Elongation Finale Elongation Temperatur 95°C 95°C 60°C 72°C 72°C 63 Dauer 10 Min 30 Sek 30 Sek 45 Sek 10 Min 30 Zyklen Material und Methode 3.9.3 Agarosegelelektrophorese Zur Analyse wurden 10 µl des PCR-Produktes mit 2 µl Probenpuffer gemischt und auf ein zweiprozentiges Agarosegel aufgetragen. Als Laufpuffer wurde TAE-Puffer verwendet. Während der Gelelektrophorese bei einer Spannung von 60 Volt für ca. 1 Stunde wurden die Amplifikate im elektrischen Feld ihrer Größe nach aufgetrennt und anschließend mit Hilfe von Ethidiumbromid unter UV-Licht sichtbar gemacht. Die Visualisierung der Amplifikate basiert auf der Wechselwirkung von doppelsträngiger DNA mit Ethidiumbromid und dessen Fluoreszenz unter UV-Licht bei einer Wellenlänge von 312 nm. Die Bestimmung der Fragmentlänge der PCR-Produkte erfolgte über den Vergleich mit einem parallel aufgetrennten DNA-Größenmarker. 3.9.4 PCR-Produktaufreinigung Die Aufreinigung der PCR-Produkte wurde mit ExoSap-IT® durchgeführt. Dieses Kit enthält in einem speziellen Puffer die beiden hydrolytischen Enzyme Exonuklease I und Shrimp Alkaline Phosphatase. Die Exonuklease I spaltet enzymatisch einzelsträngige Primer und andere in der PCR produzierte belanglose einzelsträngige DNA. Die Shrimp Alkaline Phosphatase entfernt die restlichen dNTPs aus dem PCR-Produkt. 10 µl von dem PCR-Produkt wurden hierfür mit 4 µl ExoSap-IT® gemischt und für 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Um die Enzyme zu inaktivieren, erfolgte anschließend eine fünfzehnminütige Inkubation bei 80°C. 3.9.5 Sequenzierung der PCR-Produkte Die Sequenzierung der PCR-Produkte erfolgte mit dem MicroSeq® 500 16S rDNA Seq Kit nach dem Cycle-Sequencing-Verfahren, welches auf der DidesoxynukleotidKettenabbruchmethode (SANGER et al. 1977) basiert. Das MicroSeq® 500 64 Material und Methode 16S rDNA Seq Kit setzt die BigDye®Terminator v3.1 Chemie ein. Sowohl der Vorwärts- als auch der Rückwärts-Sequenzier Mix des Kits enthalten zusätzlich zu den unmarkierten dNTPs auch mit Fluoreszenzfarbstoff markierte Didesoxyribonukleosid-Triphosphate (ddNTPs). Die ddNTPs besitzen keine 3’Hydroxygruppe, so dass beim Einbau eines ddNTP die Synthese abbricht. Es entstehen dadurch nach dem Zufallsprinzip DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge, die je nach Abbruch-Nukleotid mit einem anderen Fluoreszenzfarbstoff markiert sind. Mittels Kapillarelektrophorese werden die DNA-Fragmente dann ihrer Länge nach aufgetrennt und mit einem Laser zur Fluoreszenz angeregt. Die spezifischen Emissionen werden von einem Detektor gemessen und ihre Abfolge wird als Chromatogramm wiedergegeben, von dem die Sequenz der DNA direkt abgelesen werden kann. Für die Sequenzierungsreaktion wurden jeweils 7 µl des gereinigten PCR-Produktes mit 13 µl des Vorwärts- und Rückwärts-Sequenzier Mixes des Kits versetzt. Im Unterschied zur PCR wurde also lediglich ein Primer pro Ansatz dazugegeben, so dass zwei Sequenzierungsreaktionen pro PCR-Produkt durchgeführt wurden. Im Thermocycler galten dabei folgende Konditionen: Tab. 4: Cycle-PCR-Amplifikationsbedingungen Funktion Denaturierung Hybridisierung Elongation Temperatur 96°C 50°C 72°C Dauer 10 s 5s 4 min 25 Zyklen Zur Verringerung der Hintergrundfluoreszenz wurden die Ansätze der Sequenzierungsreaktion mit Performa® DTR Gel Filtration Cartridges aufgereinigt. Dabei handelt es sich um eine Gelfiltration im Säulenformat, bei der die restlichen BigDye® Terminatoren, dNTPs, ddNTPs und Primer im Gel zurückgehalten werden, während sich die DNA-Fragmente im Durchfluss befinden. Zunächst wurden hierfür die Gelsäulen in 1,5 ml Reaktionsgefäßen für 3 Minuten bei 850 x g zentrifugiert und in neue 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt. 20 µl des Reaktionsansatzes wurden zentral auf die Säule gegeben. Durch erneute 65 Material und Methode Zentrifugation für 3 Minuten bei 850 x g wurde das Eluat mit der DNA gewonnen. Die Säulen mit den unerwünschten Rückständen konnten verworfen werden. 4 µl des Eluats wurden mit 16 µl HPLC-Wasser verdünnt und in den ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer eingesetzt. Anschließend wurde die automatische Sequenzierung entsprechend den Angaben des Herstellers gestartet. 3.9.6 Auswertung der Sequenzen Nach der visuellen Prüfung der von dem Sequenzierer ausgegebenen Chromatogramme der Nukleotidsequenzen (Abb. 8) erfolgte das manuelle Editieren der Sequenzen mit der ABI PRISM® DNA Analysis Software Version 3.7. Abb. 8: Ausschnitt aus einem mit der ABI PRISM® DNA Analysis Software geöffnetem Chromatogramm Die fertigen Sequenzen wurden mit denen der Genbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) unter Verwendung der BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) Funktion verglichen. 66 Material und Methode Für die Bestimmung der Bakterien wurden die von DRANCOURT et al. (2000) beschriebenen Kriterien genutzt: ○ Bestimmung der Bakterienart: ○ 16S rDNA Sequenz Ähnlichkeit von ≥ 99 % zu der Sequenz des nächsten Verwandten in der Genbank ○ Bestimmung der Bakteriengattung: ○ 16S rDNA Sequenz Ähnlichkeit von ≥ 97 % zu der Sequenz des nächsten Verwandten in der Genbank Eine Sequenz wurde auch als nur bis zur Bakteriengattung bestimmbar eingeordnet, wenn eine Ähnlichkeit von ≥ 99 % zu einer Sequenz eines Bakteriums in der Genbank bestand, von welchem aber nur die Gattung angegeben wurde. Sequenzen, die zum Zeitpunkt der Analyse (November 2010) eine Ähnlichkeit von weniger als 97 % zu der Sequenz des nächsten Verwandten in der Genbank aufwiesen, wurden als nicht bestimmbar eingestuft. 3.9.7 Taxonomische Einordnung Bakterien, die weder mit kulturell biochemischen noch mit molekularbiologischen Methoden identifiziert werden konnten, wurden mit Hilfe eines phylogenetischen Baumes taxonomisch eingeordnet. Die Berechnung des Stammbaumes erfolgte anhand der Sequenzdaten durch die Firma nadicom nach der „neighbor-joining“Methode (SAITOU und NEI 1987) und dem Evolutionsmodell Felsenstein 64. Bei der „neighbor-joining“-Methode handelt es sich um eine distanzbasierte Methode, welche die Anzahl gemeinsamer bzw. abweichender Merkmale bestimmt, daraus ein Ähnlichkeitsmaß berechnet und die Distanzwerte anschließend zu einem Baum verrechnet. Das Evolutionsmodell dient dabei als eine Art Korrekturfaktor, der versucht, den komplexen Prozess der Sequenzevolution zu modellieren, um die 67 Material und Methode Genauigkeit des Distanzwertes entsprechend empirisch beobachteter Daten der Sequenzevolution zu korrigieren. Die Grundannahme aller Evolutionsmodelle ist, dass Nukleotidsubstitutionen als stochastischer Prozess ablaufen und dass eine bestimmte Substitution mit einer bestimmten Wahrscheinlichkeit auftritt. So wird zum Beispiel durch das Evolutionsmodell berücksichtigt, dass Transitionen aufgrund der Biochemie der vier Nukleotide häufiger auftreten als Transversionen. 3.10 Statistische Auswertung Die Datenverwaltung erfolgte mit Microsoft Office Excel 2007 (Microsoft Corporation, Redmond, USA). Mit der Diagrammfunktion dieses Programms wurden auch die graphischen Darstellungen und die Tabellen erstellt. Die statistische Auswertung der Versuchsergebnisse erfolgte unter Verwendung der SAS®-Software ("Statistical Analysis System", SAS Institute, Iowa, USA) in Zusammenarbeit mit Dr. Karl Rohn vom Institut für Biometrie und Epidemiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Mit dem Fisher-Exact-Test wurde geprüft, ob zwischen den folgenden Merkmalen signifikante Zusammenhänge bestehen: ○ Versuchsgruppe – bakteriologische Ergebnisse ○ bakteriologische Ergebnisse – zytologische Ergebnisse ○ bakteriologische Ergebnisse – Vulva-Befundkategorie ○ bakteriologische Ergebnisse – Zyklusstand ○ zytologische Ergebnisse – Vulva-Befundkategorie ○ zytologische Ergebnisse – Zyklusstand Die Überprüfung, ob die Vulvastellung und der Vulvaschluss von dem Alter der Stuten abhängig sind, erfolgte mit dem Kruskal-Wallis-Test. Mit dem Wilcoxon-Test wurde geprüft, ob bei der Probenentnahme unter Handschutz häufiger Bakterien 68 Material und Methode nachgewiesen wurden als bei der Probenentnahme mit Spekulum und Zervixfasszange. Das Signifikanzniveau wurde auf p ≤ 0,05 festgelegt. Als „statistisch auffällig“ galten p-Werte zwischen 0,05 und 0,1, da sie auf eventuell bestehende statistische Unterschiede hinweisen. 69 Ergebnisse 4 Ergebnisse 4.1 Angaben zum Stutenkollektiv und der gynäkologischen Untersuchung Es wurden von 88 Pferden Proben entnommen. Durch die anamnestischen Angaben und die gynäkologische Untersuchung erfolgte ihre Zuteilung in die in Kapitel 3.4 beschriebenen Versuchsgruppen (Tab. 5). Tab. 5: Versuchsgruppen und Alter der Probanden (n = 88) Versuchsgruppe 0-2 Jahre Fohlen 16 - - 16 Maidenstuten 15 2 - 17 Güste Stuten - 10 5 15 Umrossende Stuten - 8 6 14 Stuten, die resorbiert haben - 6 5 11 Klinisch auffällige Stuten - 5 10 15 31 31 26 88 Summe 3-11 Jahre 12-21 Jahre n/Gruppe Die Fohlen und Stuten waren zwischen 8 Tagen und 21 Jahren alt, wobei das Durchschnittsalter bei 7,8 Jahren lag. Von den 15 klinisch auffälligen Stuten wiesen 2 Stuten hochgradige, 10 Stuten mittelgradige und 3 Stuten geringgradige intrauterine Flüssigkeitsansammlungen auf. Da geringgradige intrauterine Flüssigkeitsansammlungen alleine als Kriterium für die Zugehörigkeit zu der Gruppe der klinisch auffälligen Stuten nicht ausreichten (s. Kap. 3.4), wiesen die 3 Stuten mit geringgradigen Flüssigkeitsansammlungen zusätzlich ein unregelmäßiges echoarmes Exsudat mit echogenen Bereichen auf oder befanden sich zum Zeitpunkt der Probenentnahme im Diöstrus. Außerdem wurde bei den 2 Stuten mit hochgradigen, bei 4 Stuten mit mittelgradigen und bei 2 Stuten Flüssigkeitsansammlungen vaginaler Ausfluss festgestellt. 70 mit geringgradigen Ergebnisse Im Rahmen der gynäkologischen Untersuchung der 57 dreijährigen und älteren Stuten wurden die Befundkategorien bezüglich der Stellung und des Schlusses der Vulva sowie der Zyklusstand dokumentiert. Bei der Beurteilung der Vulva wiesen 22 Stuten einen physiologischen Zustand, 24 Stuten mittelgradige und 11 Stuten hochgradige Abweichungen auf. Sie wurden in die in Kapitel 3.3 beschriebenen Befundkategorien eingeteilt. Zum Zeitpunkt der Probenentnahme befanden sich 42 Stuten im Östrus und 15 Stuten im Diöstrus. 4.2 Ergebnisse der bakteriologischen Untersuchungen Bei 35 (39,8 %) der 88 Proben konnten Bakterien nachgewiesen werden, bei den übrigen 53 Proben (60,2 %) zeigte sich kein Bakterienwachstum. Von den 35 positiven Proben wiesen 7 (20 %) Proben das Wachstum fakultativ pathogener Keime auf. Bei 13 positiven Proben (37,1 %) konnten fakultativ pathogene sowie apathogene Bakterien und bei den restlichen 15 positiven Proben (42,9 %) apathogene Bakterien isoliert werden (Abb. 9). Kein Bakteriennachweis Nachweis apathogener Bakterien 13 53 35 15 7 Nachweis fakultativ pathogener und apathogener Bakterien Nachweis fakultativ pathogener Bakterien Abb. 9: Ergebnis der bakteriologischen Uterustupferproben (n = 88) 71 Untersuchung der Ergebnisse In den 35 positiven Proben konnten 93 Bakterienisolate differenziert werden. Sie verteilten sich auf 19 verschiedene Bakterienarten (Tab. 6). Tab. 6: Absolute und relative Häufigkeit der nachgewiesenen Bakterienarten in den Uterustupferproben (n = 93) Bakterienart Absolute Häufigkeit Relative Häufigkeit (%) Streptococcus equi ssp. zooepidemicus 17 19 α-hämolysierende Streptokokken 13 15 E. coli 11 13 Koagulasenegative Staphylokokken 10 11 Gramnegative anaerobe Stäbchen 8 9 Coryneforme Bakterien 7 8 Anhämolysierende Streptokokken 6 7 Streptococcus dysgalactiae ssp. equisimilis 4 5 Actinobacillus equuli ssp. hämolyticus 3 3 Acinetobacter sp. 2 2 Aerococcus sp. 2 2 Grampositive anaerobe Kokken 2 2 Gramnegative aerobe Stäbchen 2 2 Klebsiella pneumoniae 1 1 Enterococcus sp. 1 1 Lactobacillus sp. 1 1 Pasteurella sp. 1 1 Staphylococcus intermedius 1 1 Grampositive aerobe Stäbchen 1 1 4.2.1 Fakultativ pathogene Bakterienarten Die nachgewiesenen fakultativ pathogenen Bakterien verteilten sich auf 3 Bakterienarten: Streptococcus equi ssp. zooepidemicus und Streptococcus dysgalactiae ssp. equisimilis, die beide zu den β-hämolysierenden Streptokokken zählen, sowie Klebsiella pneumoniae. Fünfzehnmal wurde Streptococcus equi ssp. 72 Ergebnisse zooepidemicus ohne ein Wachstum weiterer fakultativ pathogener Bakterien, zweimal in Mischkultur mit Streptococcus dysgalactiae ssp. equisimilis und einmal in Mischkultur mit Klebsiella pneumoniae nachgewiesen. Streptococcus dysgalactiae ssp. equisimilis zeigte zweimal ein Wachstum ohne weitere fakultativ pathogene Bakterien (Abb. 10). Streptococcus equi ssp. zooepidemicus Streptococcus equi ssp. zooepidemicus Mischkultur mit Streptococcus dysgalactiae ssp. equisimilis Streptococcus equi ssp. zooepidemicus Mischkultur mit Klebsiella pneumoniae Streptococcus dysgalactiae ssp. equisimilis Abb. 10: 4.2.2 Nachweis von fakultativ pathogenen Bakterienarten Uterustupferproben und deren Verteilung (n = 20) in Apathogene Bakterienarten Die in 28 Proben nachgewiesenen 71 apathogenen Bakterienisolate verteilten sich auf 16 verschiedene Bakterienarten, wobei die α-hämolysierenden Streptokokken, E. coli und die koagulasenegativen Staphylokokken den größten Anteil ausmachten (Abb. 11). Bei 17 Proben handelte es sich um Mischkulturen mit zwei oder mehr apathogenen Bakterienarten und in 11 Proben wuchs eine apathogene Bakterienart. 73 Ergebnisse 14 13 12 11 Anzahl der Nachweise 10 10 8 8 7 6 6 4 3 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 0 Abb. 11: 4.2.3 Absolute Häufigkeit der in den Uterustupferproben nachgewiesenen apathogenen Bakterienarten [Sc. = Streptokokken, Staph. = Staphylokokken, sp. = spezies] (n = 71) Aerobe und anaerobe Bakterien Insgesamt wurden zehnmal anaerobe Bakterien nachgewiesen. Achtmal handelte es sich dabei um gramnegative anaerobe Stäbchen und zweimal um grampositive anaerobe Kokken. Mit 10 (10,8 %) Nachweisen wurden anaerobe Bakterien damit seltener festgestellt als aerobe Bakterien mit insgesamt 83 (89,2 %) Nachweisen. 74 Ergebnisse 4.2.4 Stärke des Keimgehaltes Bis auf die 7 in der Abbildung 12 aufgeführten Bakterien wiesen alle isolierten Bakterien einen geringen Keimgehalt auf. Bei den 2 Bakterienarten mit hohem Keimgehalt handelte es sich um Streptococcus equi ssp. zooepidemicus und bei den 5 Bakterienarten mit mittlerem Keimgehalt handelte es sich zweimal um Streptococcus equi ssp. zooepidemicus sowie jeweils einmal um Klebsiella pneumoniae, Lactobacillus sp. und gramnegative anaerobe Stäbchen. Hochgradiger Keimgehalt 2 Anzahl der Nachweise 2 1 Streptococcus equi ssp. zooepidemicus Abb. 12: Mittelgradiger Keimgehalt 1 Klebsiella Pneumoniae Lactobacillus sp. 1 Gramnegative anaerobe Stäbchen Absolute Häufigkeit der in Uterustupferproben nachgewiesenen Bakterienarten mit mittlerem und hohem Keimgehalt (n = 7) 75 Ergebnisse 4.3 Bakteriologische Ergebnisse in Bezug zu den Versuchsgruppen 4.3.1 Fohlen Bei 10 (62,5 %) der 16 Proben von den Fohlen wurden Bakterien nachgewiesen. Sechsmal handelte es sich hierbei um fakultativ pathogene und apathogene und viermal um apathogene Bakterien. In 6 (37,5 %) Proben konnten keine Bakterien nachgewiesen werden (Abb. 13). Kein Bakteriennachweis Nachweis apathogener Bakterien Nachweis fakultativ pathogener und apathogener Bakterien Abb. 13: Ergebnis der bakteriologischen Untersuchung der Uterustupferproben von den Fohlen (n = 16) 7 (70 %) der insgesamt zehnmal nachgewiesenen anaeroben Bakterien und 5 (83,3 %) der insgesamt sechsmal nachgewiesenen Streptokokken wurden aus den Tupferproben der Fohlen isoliert. 76 anhämolysierenden Ergebnisse 4.3.2 Maidenstuten Bei den Maidenstuten konnten aus einer Probe fakultativ pathogene und apathogene und aus einer anderen Probe apathogene Bakterien isoliert werden. Bei den übrigen Proben dieser Gruppe wurden keine Bakterien festgestellt. Bei den Maidenstuten waren demnach 2 (11,8 %) von 17 Proben positiv (Abb. 14). Kein Bakteriennachweis Nachweis apathogener Bakterien Nachweis fakultativ pathogener und apathogener Bakterien Abb. 14: 4.3.3 Ergebnis der bakteriologischen Untersuchung der Uterustupferproben von Maidenstuten (n = 17) Stuten, die resorbiert haben, und güste sowie umrossende Stuten Bei den Stuten, die resorbiert haben, konnten dreimal apathogene und einmal fakultativ pathogene und apathogene Bakterien nachgewiesen werden. Die übrigen 7 Proben zeigten kein Bakterienwachstum. In 4 (36,4 %) von 11 Proben konnten demzufolge Bakterien nachgewiesen werden. Von den güsten und den umrossenden Stuten zeigte jeweils eine Probe ein Wachstum fakultativ pathogener und apathogener und jeweils eine Probe das Wachstum apathogener Bakterien. Bei den übrigen Proben dieser Gruppen wurden keine Bakterien festgestellt. Bei den güsten Stuten waren demnach 2 (13,3 %) von 15 und bei den umrossenden Stuten 2 (14,3 %) von 14 Proben positiv (Abb. 15). In keiner Versuchsgruppe der 77 Ergebnisse anamnestisch auffälligen Stuten konnte eine Bakterienart insgesamt häufiger als zweimal nachgewiesen werden. Stuten, die resorbiert haben Güste Stuten Umrossende Stuten Kein Bakteriennachweis Nachweis apathogener Bakterien Nachweis apathogener und fakultativ pathogener Bakterien Abb. 15: 4.3.4 Ergebnis der bakteriologischen Untersuchung der Uterustupferproben von den Stuten, die resorbiert haben (n = 11), und den güsten (n = 15) sowie den umrossenden Stuten (n = 14) Klinisch auffällige Stuten Bei den klinisch auffälligen Stuten konnten in allen 15 Proben Bakterien nachgewiesen werden. Siebenmal handelte es sich dabei um fakultativ pathogene, fünfmal um apathogene und dreimal um fakultativ pathogene und apathogene Bakterien (Abb. 16). Der Nachweis fakultativ pathogener Bakterien ohne apathogene Begleitflora gelang ausschließlich bei Probanden dieser Gruppe. Bei den fakultativ pathogenen Bakterien handelte es sich elfmal um β-hämolysierende Streptokokken und einmal um Klebsiella pneumoniae. 78 Ergebnisse Nachweis apathogener Bakterien Nachweis fakultativ pathogener und apathogener Bakterien Nachweis fakultativ pathogener Bakterien Abb. 16: Ergebnis der bakteriologischen Untersuchung der Uterustupferproben von den klinisch auffälligen Stuten (n = 15) Mit Ausnahme der gramnegativen anaeroben Stäbchen stammten alle Bakterien mit mittelgradigem Keimgehalt von den klinisch auffälligen Stuten. Die mit hohem Keimgehalt nachgewiesenen Bakterien wurden aus den Tupfern der beiden klinisch auffälligen Stuten mit hochgradigen intrauterinen Flüssigkeitsansammlungen isoliert (s. Kap. 4.2.4). 4.3.5 Versuchsgruppen vergleichend In der Abbildung 17 sind die Ergebnisse der bakteriologischen Untersuchungen der 6 Versuchsgruppen vergleichend dargestellt. Mit 100 % positiven Proben wurden bei den klinisch auffälligen Stuten am häufigsten Bakterien nachgewiesen. In der Gruppe der Fohlen wurden aus 62,5 % der Proben Bakterien isoliert. Sie hatten damit mehr positive Proben als die Stuten, die resorbiert haben (36,4 %), die Maidenstuten (11,8 %), die güsten Stuten (13,3 %) sowie die umrossenden Stuten (14,3 %). Die bakteriologischen Ergebnisse der Versuchsgruppen sind signifikant unterschiedlich (p < 0,0001). Beim Vergleich der Ergebnisse der Fohlen mit den Ergebnissen der anderen Gruppen ist lediglich der Unterschied zu den Stuten, die resorbiert haben, 79 Ergebnisse nicht statistisch signifikant (p = 0,35). Die Fohlen haben statistisch signifikant mehr Proben mit einem Bakteriennachweis als die Maidenstuten (p = 0,004), die güsten Stuten (p = 0,009) sowie die umrossenden Stuten (p = 0,01). Auch der Unterschied zu den klinisch auffälligen Stuten, die in 7 Proben fakultativ pathogenen Bakterien aufwiesen und bei denen keine Probe ohne Bakteriennachweis war, ist statistisch signifikant (p = 0,0013). 16 Kein Bakteriennachweis Anzahl der Nachweise 14 12 Nachweis apathogener Bakterien 10 8 Nachweis fakultativ pathogener und apathogener Bakterien 6 4 2 Nachweis fakultativ pathogener Bakterien 0 Abb. 17: Ergebnis der Versuchsgruppen bei der Untersuchung der Uterustupferproben (n = 88) 80 bakteriologischen Ergebnisse Es konnten zehnmal anaerobe Bakterien nachgewiesen werden. 7 der 10 anaeroben Bakterienisolate stammten von der Gruppe der Fohlen und die anderen 3 anaeroben Bakterienisolate kamen von der Gruppe der Maidenstuten (Abb. 18). Anzahl der Nachweise Gramnegative anaerobe Stäbchen Grampositive anaerobe Kokken 6 2 1 1 Fohlen Abb. 18: Maidenstuten Verteilung der in den Uterustupferproben nachgewiesenen anaeroben Bakterien auf die Versuchsgruppen (n = 10) Auch die sechsmal nachgewiesenen anhämolysierenden Streptokokken verteilten sich ausschließlich auf die Gruppe der Fohlen (5) und der Maidenstuten (1). 81 Ergebnisse 4.4 Ergebnisse der Exfoliativzytologie Von den 88 untersuchten Proben waren nach dem Beurteilungsschema von DASCANIO (2003) 8 (9 %) Proben positiv und 80 (91 %) Proben negativ. Die Anzahl der neutrophilen Granulozyten pro 10 Gesichtsfelder lag bei den positiven Proben zwischen 9 und 214. Die Endometriumzellen ließen sich von den neutrophilen Granulozyten aufgrund der für den jeweiligen Zelltyp charakteristischen morphologischen Besonderheiten gut differenzieren. Der überwiegend basal liegende, lila angefärbte rundliche Kern der Endometriumzellen war meistens von einem blau gefärbten Zytoplasmasaum umgeben (Abb. 19). 1 2 Abb. 19. Endometriumzytologie von einer Stute im Östrus. Dargestellt sind Endometriumzellen (1) und neutrophile Granulozyten (2) Die Form der Endometriumzellen schwankte zwischen rund, säulenförmig und kubisch. Häufig konnte auch eine Gruppen- oder Nesterbildung beobachtet werden (Abb. 20). 82 Ergebnisse Abb. 20: Endometriumzytologie von einer Stute im Östrus. Dargestellt ist eine Nesterbildung der Endometriumzellen Die neutrophilen Granulozyten hatten eine rundliche Form. Während ihr Zellkern deutlich lila gefärbt und gut darstellbar war, färbte sich ihr Zytoplasma meistens nur schwach an (Abb. 21). Überwiegend handelte es sich um Granulozyten mit segmentiertem Kern. Stabkernige neutrophile Granulozyten konnten nur selten nachgewiesen werden. Abb. 21: Endometriumzytologie von einer Stute mit Endometritis. Dargestellt sind segmentkernige neutrophile Granulozyten 83 Ergebnisse 4.5 Zytologische Ergebnisse in Bezug zu den Versuchsgruppen Die Verteilung der 8 positiven Zytologieproben auf die Versuchsgruppen ist in der Abbildung 22 dargestellt. Bei den klinisch auffälligen Stuten konnten in 6 Proben vermehrt neutrophile Granulozyten nachgewiesen werden, während bei den Stuten, die resorbiert haben, und den umrossenden Stuten jeweils in einer Probe vermehrt neutrophile Granulozyten vorkamen. Bei den Fohlen, den Maidenstuten und den güsten Stuten waren alle Ausstriche zytologisch negativ. Die klinisch auffälligen Stuten wiesen also häufiger positive zytologische Befunde auf als die Probanden der anderen Gruppen. Anzahl positiver Zytologien 6 5 4 3 2 1 0 Klinisch auffällige Stuten Abb. 22: Stuten, die resorbiert haben Umrossende Stuten Verteilung der positiven zytologischen Untersuchungen auf die Versuchsgruppen (n = 8) 84 Ergebnisse 4.6 Bakteriologische Befunde in Zusammenhang mit zytologischen Befunden In der Tabelle 7 sind die Befunde der zytologischen und der bakteriologischen Untersuchungen vergleichend dargestellt. Die Probanden mit dem Nachweis fakultativ pathogener Bakterien hatten weitaus häufiger eine positive zytologische Untersuchung als Probanden mit anderen bakteriologischen Befunden. Probanden mit einer negativen zytologischen Untersuchung hatten in 65 % der Fälle auch einen negativen bakteriologischen Befund und Probanden mit einer positiven zytologischen Untersuchung zeigten in 87,5 % der Fälle auch ein Bakterienwachstum. Die Ergebnisse der bakteriologischen Untersuchung sind bei Probanden mit einer positiven zytologischen Untersuchung signifikant häufiger positiv als bei Probanden mit einer negativen zytologischen Untersuchung (p < 0,0001). Tab. 7: Ergebnis der zytologischen Untersuchung in Bezug zu dem Ergebnis der bakteriologischen Untersuchung (n = 88) Bakteriologische Untersuchung Zytologische Untersuchung positiv negativ Kein Bakteriennachweis 1 (12,5 %) 52 (65 %) Nachweis apathogener Bakterien 1 (12,5 %) 14 (16,5 %) Nachweis fakultativ pathogener und apathogener Bakterien 1 (12,5 %) 12 (15 %) Nachweis fakultativ pathogener Bakterien 5 (62,5 %) 2 (2,5 %) Summe 8 (100 %) 80 (100 %) 85 Ergebnisse 4.7 Bakteriologische und zytologische Befunde in Zusammenhang mit den Versuchsgruppen In der Abbildung 23 sind die bakteriologischen und zytologischen Befunde in Bezug zu den Versuchsgruppen dargestellt. Hierbei wurde nicht zwischen apathogenen und fakultativ pathogenen Bakterien unterschieden. Bei den Stutfohlen war keine zytologische Untersuchung positiv, obwohl bei ihnen in 10 Proben Bakterien nachgewiesen werden konnten. Bei den klinisch auffälligen Stuten konnten in 15 Proben Bakterien nachgewiesen werden, aber es zeigten auch 6 zytologische Untersuchungen ein positives Ergebnis. Anzahl positiver Ergebnisse 16 14 12 10 8 6 4 BU positiv 2 ZU positiv 0 Abb. 23: Anzahl positiver bakteriologischer (BU, n = 35) und zytologischer Untersuchungen (ZU, n = 8) in Bezug zu den Versuchsgruppen 86 Ergebnisse 4.8 Bakteriologische und zytologische Befunde in Zusammenhang mit gynäkologischer Untersuchung sowie Anamnese 4.8.1 Vulva-Befundkategorie und Bakteriologie und Zytologie Beim Vergleich der Ergebnisse der bakteriologischen Untersuchung mit den Befundkategorien bezüglich Stellung und Schluss der Vulva wurde deutlich, dass Stuten der Kategorie 1 (77,3 %) häufiger einen negativen bakteriologischen Befund hatten als Stuten der Kategorie 2 (58,3 %) und diese wiederum häufiger einen negativen bakteriologischen Befund aufwiesen als Stuten der Kategorie 3 (27,3 %). Außerdem zeigten sich in 36,4 % der Proben der Stuten der Kategorie 3 fakultativ pathogene Bakterien, was bei Stuten der Kategorie 2 (8,3 %) und 1 (4,5 %) weitaus seltener der Fall war (Tab. 8). Die Verteilung der bakteriologischen Ergebnisse auf die 3 Befundkategorien war statistisch signifikant unterschiedlich (p = 0,018). Mit einem p-Wert von 0,013 wiesen Stuten der Kategorie 1 statistisch signifikant häufiger negative und seltener positive bakteriologische Befunde auf als Stuten der Kategorie 3. Die Unterschiede zwischen der Kategorie 1 und 2 (p = 0,095) sowie der Kategorie 2 und 3 (p = 0,073) waren statistisch auffällig. Tab. 8: Ergebnis der bakteriologischen Untersuchung in Bezug zur VulvaBefundkategorie (n = 57) Kategorie 1 Kategorie 2 Kategorie 3 17 (77,3 %) 14 (58,3 %) 3 (27,3 %) Nachweis apathogener Bakterien 1 (4,5 %) 7 (29,2 %) 2 (18,2 %) Nachweis fakultativ pathogener und apathogener Bakterien 3 (13,6 %) 1 (4,2 %) 2 (18,2 %) Nachweis fakultativ pathogener Bakterien 1 (4,5 %) 2 (8,3 %) 4 (36,4 %) 22 (100 %) 24 (100 %) 11 (100 %) Kein Bakteriennachweis Summe 87 Ergebnisse Der Zusammenhang zwischen den Befunden der zytologischen Untersuchung und der Vulva-Befundkategorie der Stuten ist in der Tabelle 9 dargestellt. Während Stuten der Kategorie 1 in 4,5 % der Fälle und Stuten der Kategorie 2 in 12,5 % der Fälle eine positive zytologische Untersuchung aufwiesen, waren bei den Stuten der Kategorie 3 insgesamt 63,6 % der Proben zytologisch positiv. Lediglich der Unterschied zwischen den Ergebnissen der Kategorie 1 und 3 war statistisch signifikant (p = 0,03). Tab. 9: Ergebnis der zytologischen Untersuchung (ZU) in Bezug zur Vulva-Befundkategorie (n = 57) Kategorie 1 Kategorie 2 Kategorie 3 ZU positiv 1 (4,5 %) 3 (12,5 %) 4 (36,4 %) ZU negativ 21 (95,5 %) 21 (87,5 %) 7 (63,6 %) Summe 22 (100 %) 24 (100 %) 11 (100 %) 4.8.2 Zyklusstand und Bakteriologie und Zytologie Von den 15 im Diöstrus entnommenen Proben wiesen 60 % ein negatives bakteriologisches Ergebnis auf und auch von den 42 im Östrus entnommenen Proben waren 60 % in der bakteriologischen Untersuchung negativ. Die anderen bakteriologischen Ergebnisse kamen sowohl bei den Stuten im Östrus als auch bei den Stuten im Diöstrus mit einer Häufigkeit von 9 bis 13,3 % vor (Tab. 10). Statistisch konnte kein signifikanter zyklusabhängiger Unterschied bei den bakteriologischen Ergebnissen festgestellt werden (p = 0,96). 88 Ergebnisse Tab. 10: Ergebnis der bakteriologischen Untersuchung in Bezug zum Zyklusstand (n = 57) Östrus Kein Bakteriennachweis Diöstrus 25 (60 %) 9 (60 %) Nachweis apathogener Bakterien 8 (19 %) 2 (13,3 %) Nachweis fakultativ pathogener und apathogener Bakterien 4 (9 %) 2 (13,3 %) Nachweis fakultativ pathogener Bakterien 5 (12 %) 2 (13,3 %) Summe 42 (100 %) 15 (100 %) 26,7 % der im Diöstrus entnommenen Proben zeigten ein positives und 73,3 % ein negatives zytologisches Ergebnis. Von den Proben der 42 Stuten im Östrus waren 9,5 % zytologisch positiv und 90,5 % zytologisch negativ (Tab. 11) Auch bei den zytologischen Ergebnissen konnte kein statistisch signifikanter zyklusabhängiger Unterschied festgestellt werden (p = 0,19). Tab. 11: Ergebnis der zytologischen Untersuchung (ZU) in Bezug zum Zyklusstand (n = 57) Östrus Diöstrus ZU positiv 4 (9,5 %) 4 (26,7 %) ZU negativ 38 (90,5 %) 11 (73,3 %) Summe 42 (100 %) 15 (100 %) 4.8.3 Vulva-Befundkategorie in Zusammenhang mit dem Alter der Stuten Stuten mit einem Alter von 6 bis 9 Jahren wiesen in 90,9 % der Fälle einen Befund der Kategorie 1 und in keinem Fall einen Befund der Kategorie 3 auf, während die Stuten zwischen 16 und 21 Jahren in 53,3 % der Fälle der Kategorie 3 und in 6,7 % der Fälle der Kategorie 1 angehörten (Tab. 12). Die Befundkategorie war mit einem 89 Ergebnisse p-Wert von < 0,0001 statistisch signifikant abhängig von dem Alter der Stuten. Mit zunehmendem Alter weisen die Stuten also häufiger Befunde der Kategorie 3 auf, während junge Stuten häufiger der Kategorie 1 zuzuordnen sind. Tab. 12: Vulva-Befundkategorie in Bezug zum Alter (n = 57) 3-6 Jahre 7-10 Jahre 11-15 Jahre 16-21 Jahre Kategorie 1 10 (90,9 %) 10 (58,8 %) 1 (7,1 %) 1 (6,7 %) Kategorie 2 1 (9,1 %) 7 (41,2 %) 10 (71,4 %) 6 (40 %) Kategorie 3 - - Summe 11 (100 %) 17 (100 %) 3 (21,4 %) 8 (53,3 %) 14 (100 %) 15 (100 %) 4.9 Ergebnis der Prüfung der Probenentnahme bezüglich Kontaminationen Beim direkten Ausstreichen der 3 Uteruskulturtupfer auf Nährmedien ohne vorherige Probenentnahme konnte kein Bakterienwachstum festgestellt werden. Auch aus den 3 Tupfern zur Prüfung der Überführung der Tupfer in das Nährmedium und des anschließenden Transportes konnten keine Bakterien isoliert werden. Mit 10 Tupfern wurde getestet, ob es bei doppelt geschützten Tupfersystemen zu Kontaminationen kommen kann, wenn die äußere Hülle bereits Kontakt zu der Schleimhaut des Genitaltraktes hatte. Hierzu wurde die äußere Hülle der Uteruskulturtupfer unterschiedlich intensiv mit den Genitalschleimhäuten in Berührung gebracht. Die inneren Hüllen wurden dann immer erst nach der Entnahme des gesamten Uteruskulturtupfers aus dem Genitaltrakt, also an der Luft, vorgeführt. In den 5 Uteruskulturtupfern, die zuvor mittels Spekulum und unter optischer Kontrolle in die Zervix vorgeführt wurden, konnten keine Bakterien nachgewiesen werden. Von den 5 Tupfern, die vor ihrer Entnahme aus dem Genitaltrakt unter Handschutz bis in die Zervix vorgeführt 90 wurden, zeigten 3 Tupfer ein Ergebnisse Bakterienwachstum und 2 Tupfer kein Bakterienwachstum. Aus einem der 3 positiven Tupfer konnten coryneforme Bakterien, aus einem Acinetobacter sp. und aus einem Acinetobacter sp., E. coli, Staphylococcus aureus und Streptococcus equi ssp. zooepidemicus isoliert werden. 4.10 Vergleich der Entnahmetechniken Bei 27 Stuten aus unterschiedlichen Versuchsgruppen wurden Uterustupferproben unter Handschutz ohne Hilfe eines Spekulums genommen (Tab. 13). Tab. 13: Versuchsgruppen bei der Probenentnahme unter Handschutz (n = 27) Stuten Anzahl Maidenstuten 15 Güste Stuten 6 Umrossende Stuten 1 Stuten, die resorbiert haben 3 Klinisch auffällige Stuten 2 Summe 27 Die Ergebnisse der bakteriologischen Untersuchung dieser Proben wurden mit den Ergebnissen der 88 mit Spekulum und Zervixfasszange entnommen Proben verglichen (Abb. 24). Von den 27 manuell transvaginal gewonnenen Proben zeigten 14 Proben ein Wachstum apathogener und 13 Proben ein Wachstum apathogener und fakultativ pathogener Bakterien. 91 Ergebnisse Kein Bakteriennachweis Nachweis apathogener Bakterien Nachweis fakultativ pathogener und apathogener Bakterien Anzahl der Nachweise Nachweis fakultativ pathogener Bakterien 53 15 14 13 7 Spekulum Abb. 24: 13 Handschutz Ergebnis der bakteriologischen Untersuchung Uterustupferproben, die mit Spekulum (n = 88) oder Handschutz genommen wurden (n = 27) der unter Bei der Probenentnahme unter Handschutz wurden statistisch signifikant häufiger Bakterien nachgewiesen als bei der Probenentnahme mit Spekulum und Zervixfasszange (p < 0,0001). 4.11 Ergebnisse der molekularbiologischen Untersuchungen 4.11.1 Molekularbiologische Differenzierung ausgewählter Bakterienisolate Die in der Tabelle 14 aufgeführten 40 Bakterienisolate wurden molekularbiologisch untersucht. Dabei handelte es sich um 13 α-hämolysierende Streptokokken, 8 gramnegative anaerobe Stäbchen, 7 coryneforme Bakterien, 6 anhämolysierende Streptokokken, 2 grampositive anaerobe Kokken, 2 gramnegative aerobe Stäbchen und jeweils einmal um grampositive aerobe Stäbchen sowie Pasteurella sp. 92 Ergebnisse Tab. 14: Angaben zu den molekularbiologisch untersuchten Bakterien (n = 40) Phänotypische Bestimmung α-hämolysierende Streptokokken α-hämolysierende Streptokokken α-hämolysierende Streptokokken α-hämolysierende Streptokokken α-hämolysierende Streptokokken α-hämolysierende Streptokokken α-hämolysierende Streptokokken α-hämolysierende Streptokokken α-hämolysierende Streptokokken α-hämolysierende Streptokokken α-hämolysierende Streptokokken α-hämolysierende Streptokokken α-hämolysierende Streptokokken Anhämolysierende Streptokokken Anhämolysierende Streptokokken Anhämolysierende Streptokokken Anhämolysierende Streptokokken Anhämolysierende Streptokokken Anhämolysierende Streptokokken Coryneforme Bakterien Coryneforme Bakterien Coryneforme Bakterien Coryneforme Bakterien Coryneforme Bakterien Coryneforme Bakterien Coryneforme Bakterien Gramnegative aerobe Stäbchen Gramnegative aerobe Stäbchen Gramnegative anaerobe Stäbchen Gramnegative anaerobe Stäbchen Gramnegative anaerobe Stäbchen Gramnegative anaerobe Stäbchen Gramnegative anaerobe Stäbchen Gramnegative anaerobe Stäbchen Gramnegative anaerobe Stäbchen Gramnegative anaerobe Stäbchen Grampositive aerobe Stäbchen Grampositive anaerobe Kokken Grampositive anaerobe Kokken Pasteurella sp. Versuchsgruppe Umrossend Güst Güst Fohlen Fohlen Fohlen Fohlen Fohlen Maidenstute Maidenstute Klinisch auffällig Klinisch auffällig Klinisch auffällig Fohlen Fohlen Fohlen Fohlen Fohlen Maidenstute Resorbiert Resorbiert Resorbiert Resorbiert Maidenstute Maidenstute Klinisch auffällig Fohlen Klinisch auffällig Fohlen Fohlen Fohlen Fohlen Fohlen Fohlen Maidenstute Maidenstute Fohlen Fohlen Maidenstute Fohlen 93 Isolatnummer 35 2 1 3 15 4 5 6 7 8 9 10 40 11 12 13 14 16 17 20 21 22 23 18 19 24 25 34 26 27 28 33 29 30 31 32 36 37 38 39 Ergebnisse 28 (70 %) der 40 untersuchten Isolate stammten aus den Tupferproben der Fohlen (20) und der Maidenstuten (8), 12 Bakterienisolate (30 %) stammten von den übrigen 4 Versuchsgruppen (Abb. 25). Anzahl molekularbiologisch untersuchter Bakterien 20 Abb. 25: 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 Anzahl molekularbiologisch untersuchter Bakterienisolate pro Versuchsgruppe (n = 40) Obwohl bei der Gruppe der klinisch auffälligen Stuten in jeder der 15 Proben Bakterien nachgewiesen wurden, mussten nur 5 Bakterienisolate molekularbiologisch untersucht werden, da die übrigen Isolate leicht phänotypisch und biochemisch bestimmt werden konnten. Die Gruppe der Fohlen hatte 10 bakteriologisch positive Proben und wies mit 20 nicht identifizierbaren Isolaten wesentlich mehr nicht identifizierte Bakterien auf als die anderen Gruppen. Bei den Maidenstuten hatten nur 2 der 17 Proben ein positives bakteriologisches Ergebnis und dennoch hatten sie mit 8 nicht identifizierten Bakterienisolaten die zweithöchste Anzahl an molekularbiologisch untersuchten Bakterien. 94 Ergebnisse 4.11.2 Bestimmung der Nukleinsäuresequenz Zunächst wurde von den Bakterienisolaten die Nukleinsäure extrahiert und diese dann als Template in der PCR zur partiellen Amplifikation des 16S rDNA Gens eingesetzt. Mittels Agarosegelelektrophorese konnten die Amplifikate dargestellt werden (Abb. 26). Während bei der Positivkontrolle und bei den Bakterienisolaten deutliche Banden im Längenbereich von 500 bis 600 Basenpaaren zu erkennen waren, wies die Negativkontrolle erwartungsgemäß keine Bande auf. Abb. 26: Darstellung der Amplifikationsprodukte der partiellen 16S rDNA PCR in der Agarosegelelektrophorese [bp = Basenpaare] Lauf 1: Positivkontrolle Lauf 2: Negativkontrolle Lauf 3: Isolat 1, α-hämolysierende Streptokokken Lauf 4: Isolat 11, anhämolysierende Streptokokken Lauf 5: Isolat 28, gramnegative anaerobe Stäbchen 95 Ergebnisse Nach der Aufreinigung der PCR-Produkte und der Sequenzierungsreaktion wurden mit dem ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer die Nukleinsäuresequenzen bestimmt. Diese hatten eine Länge von 444 bis 502 Basenpaaren, wobei die Durchschnittslänge bei 479 Basenpaaren lag. Die Sequenzen der 19 Streptokokken waren mit einer durchschnittlichen Länge von 494 Basenpaaren länger als die der 21 übrigen Bakterien mit einer durchschnittlichen Länge von 465 Basenpaaren. Die vollständigen komplementären Nukleinsäuresequenzen sind im Anhang aufgeführt. 4.11.3 Genbankabgleich der Nukleinsäuresequenzen Bei dem Abgleich der Nukleinsäuresequenzen mit der Genbank des National Center for Biotechnology Information unter Verwendung der BLAST Funktion konnte von 22 (55 %) der 40 Bakterien die Bakterienart bestimmt werden (Tab. 15). Die 6 anhämolysierenden Streptokokken konnten alle als Streptococcus uberis identifiziert werden, während sich die 16 anderen Bakterienisolate auf 14 verschiedene Bakterienarten verteilten. Die Sequenzen der Isolate 8 und 9, der Isolate 11,12,13,14,16 und 17 und der Isolate 29 und 32 sind jeweils zu 99 bis 100 % identisch. Die Eigenschaften der über die 16S rDNA bestimmten Bakterienarten stimmten bei allen Isolaten mit den phänotypisch ermittelten Eigenschaften überein. 96 Ergebnisse Tab. 15: 16S rDNA basierte Bestimmung der Bakterienart (n = 22) Phänotypische Bestimmung 16S rDNA basierte Bestimmung (%1) Zugangsnr.² 2 α-hämolysierende Streptokokken Enterococcus canis (100 %) AY156090.1 8 α-hämolysierende Streptokokken Streptococcus equinus (100 %) DQ148956.1 9 α-hämolysierende Streptokokken Streptococcus equinus (99 %) DQ148956.1 15 α-hämolysierende Streptokokken Streptococcus thoraltensis (99 %) NR_026368.1 11 Anhämolysierende Streptokokken Streptococcus uberis (100 %) AM946015.1 12 Anhämolysierende Streptokokken Streptococcus uberis (100 %) AM946015.1 13 Anhämolysierende Streptokokken Streptococcus uberis (100 %) AM946015.1 14 Anhämolysierende Streptokokken Streptococcus uberis (100 %) AM946015.1 16 Anhämolysierende Streptokokken Streptococcus uberis (99 %) AM946015.1 17 Anhämolysierende Streptokokken Streptococcus uberis (100 %) AM946015.1 24 Coryneforme Bakterien Nocardia nova (99 %) AY505493.1 19 Coryneforme Bakterien Microbacterium foliorum (100 %) EU714371.1 21 Coryneforme Bakterien Corynebacterium jeikeium (99 %) DQ778040.1 22 Coryneforme Bakterien Dietzia cinnamea (99 %) AJ920289.1 29 Gramnegative anaerobe Stäbchen Bacteroides heparinolyticus (99 %) GQ422742.1 32 Gramnegative anaerobe Stäbchen Bacteroides heparinolyticus (99 %) GQ422742.1 26 Gramnegative anaerobe Stäbchen Bacteroides vulgatus (100 %) AB510712.1 27 Gramnegative anaerobe Stäbchen Bacteroides fragilis (100 %) FQ312004.1 28 NR_028933.1 36 Gramnegative anaerobe Stäbchen Fusobacterium equinum (99 %) Bacteroides thetaiotaomicrom Gramnegative anaerobe Stäbchen (100 %) Grampositive aerobe Stäbchen Actinomyces hyovaginalis (99 %) 39 Pasteurella sp. AY634649.1 Nr. 33 1 Pasteurella caballi (99 %) AB510710.1 AF489585.1 Prozent Ähnlichkeit zwischen der Sequenz des Isolates und der Sequenz aus der Genbank ² Genbank Zugangsnummer der Referenzsequenz Von 11 (27,5 %) der 40 molekularbiologisch untersuchten Bakterienisolate konnte über die Sequenz der 16S rDNA die Bakteriengattung bestimmt werden (Tab. 16). Auch die Eigenschaften der so ermittelten Bakteriengattung stimmten mit den phänotypisch ermittelten Bakterieneigenschaften überein. 97 Ergebnisse Tab. 16: 16S rDNA basierte Bestimmung der Bakteriengattung (n = 11) Nr. Phänotypische Bestimmung 16S rDNA basierte Bestimmung (%1) Zugangsnr.² 35 α-hämolysierende Streptokokken Streptococcus sp. (99 %) FN377819.1 1 α-hämolysierende Streptokokken Streptococcus sp. (99 %) FN377819.1 4 α-hämolysierende Streptokokken Streptococcus ovis (97 %) NR_026471.1 5 α-hämolysierende Streptokokken Streptococcus sp. (99 %) EU483250.1 6 α-hämolysierende Streptokokken Streptococcus ovis (97 %) NR_026471.1 10 α-hämolysierende Streptokokken Streptococcus sp. (99 %) FN377819.1 20 Coryneforme Bakterien Corynebacterium sp. (100 %) AF227828.1 23 Coryneforme Bakterien Brevibacterium sp. (98 %) AB210939.1 34 Gramnegative aerobe Stäbchen Acidovorax sp. (99 %) AY258065.1 31 Gramnegative anaerobe Stäbchen Fusobacterium sp. (97 %) GU902771.1 37 Grampositive anaerobe Kokken L04166.1 1 Peptostreptococcus sp. (99 %) Prozent Ähnlichkeit zwischen der Sequenz des Isolates und der Sequenz aus der Genbank ² Genbank Zugangsnummer der Referenzsequenz Die in der Tabelle 17 aufgeführten 7 Bakterien (17,5 %) konnten auch über die Sequenz ihrer 16S rDNA nicht bestimmt werden. Tab. 17: Bakterienisolate, die nicht über ihre 16S rDNA bestimmt werden konnten (n = 7) Isolatnummer Phänotypische Bestimmung 3 α-hämolysierende Streptokokken 7 α-hämolysierende Streptokokken 40 α-hämolysierende Streptokokken 18 Coryneforme Bakterien 25 Gramnegative aerobe Stäbchen 30 Gramnegative anaerobe Stäbchen 38 Grampositive anaerobe Kokken Von den insgesamt 13 molekularbiologisch untersuchten Isolaten der α- hämolysierenden Streptokokken konnte bei 4 Isolaten die Art bestimmt werden. Es handelte sich zweimal um Streptococcus equinus und jeweils einmal um Streptococcus thoraltensis und Enterococcus canis. Bei 6 Isolaten konnte eine 98 Ergebnisse Zugehörigkeit zu der Gattung der Streptokokken bestätigt werden und bei 3 Isolaten war keine Zuordnung möglich. Bei den 8 gramnegativen anaeroben Stäbchen konnte von 6 Isolaten die Art, zweimal Bacteroides heparinolyticus, einmal Bacteroides vulgatus, einmal Bacteroides fragilis, einmal Bacteroides thetaiotaomicrom und einmal Fusobacterium equinum, bestimmt werden. Zusätzlich konnte die Zugehörigkeit von einem Isolat zu der Gattung Fusobacterium festgestellt werden, während 1 Isolat nicht identifiziert werden konnte. Die gramnegativen anaeroben Stäbchen verteilten sich also auf 2 verschiedene Gattungen. Die Gruppe der coryneformen Bakterien wies ein heterogenes Ergebnis auf. Bei den 4 Isolaten, deren Art bestimmt werden konnte, handelte es sich um Nocardia nova, Microbacterium foliorum, Corynebacterium jeikeium und Dietzia cinnamea. Des Weiteren konnte 1 Isolat der Gattung Corynebacterium und 1 Isolat der Gattung Brevibacterium zugeordnet werden. Die Isolate der coryneformen Bakterien gehören zwar alle in die Ordnung Actinomycetales, verteilten sich aber auf 5 verschiedene Familien und Gattungen. Bei einem Isolat konnte weder die Art noch die Gattung bestimmt werden. Die fünfmal aus der Gruppe der Fohlen und einmal aus der Gruppe der Maidenstuten nachgewiesenen anhämolysierenden Streptokokken wurden alle als Streptococcus uberis identifiziert. Von den 2 grampositiven anaeroben Kokken wurde 1 Isolat den Peptostreptokokken zugeordnet, während das andere Isolat nicht identifiziert werden konnte. Außerdem wurde 1 Isolat der gramnegativen aeroben Stäbchen der Gattung Acidovorax zugeordnet. Pasteurella sp. konnte als Pasteurella caballi und die grampositiven aeroben Stäbchen als Actinomyces hyovaginalis bestimmt werden. 99 Ergebnisse 4.11.4 Taxonomische Einordnung der molekularbiologisch nicht bestimmbaren Bakterienisolate Die weder kulturell-biochemisch noch durch Sequenzierung der 16S rDNA zu bestimmenden Bakterienisolate wurden durch die Erstellung eines phylogenetischen Baumes taxonomisch eingeordnet. Die Isolate 3, 7 und 40 konnten aufgrund ihrer Ähnlichkeit gemeinsam in einem Baum dargestellt werden (Abb. 27). Sie gehören zu der Gattung Streptococcus. Abb. 27: Distanzbasierter phylogenetischer Stammbaum der Isolate 3, 7 und 40. Vor den Artnamen sind die Zugangsnummern der NCBIDatenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) angegeben. (T) = Referenznummer Typstamm (G) = Referenznummer des gesamten sequenzierten Genoms 100 Ergebnisse Das Isolat 18 wurde durch den phylogenetischen Baum der Gattung Corynebacterium zugeordnet (Abb. 28). Abb. 28: Distanzbasierter phylogenetischer Stammbaum des Isolats 18. Vor den Artnamen sind die Zugangsnummern der NCBIDatenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) angegeben. (T) = Referenznummer Typstamm (G) = Referenznummer des gesamten sequenzierten Genoms 101 Ergebnisse Bei dem Isolat 25 wurde eine Zugehörigkeit zu der Gattung Flavobacterium festgestellt (Abb. 29). Abb. 29: Distanzbasierter phylogenetischer Stammbaum des Isolats 25. Vor den Artnamen sind die Zugangsnummern der NCBIDatenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) angegeben. (T) = Referenznummer Typstamm (G) = Referenznummer des gesamten sequenzierten Genoms 102 Ergebnisse Das Isolat 30 zählte zu der Gattung Fusobacterium (Abb. 30). Abb. 30: Distanzbasierter phylogenetischer Stammbaum des Isolats 30. Vor den Artnamen sind die Zugangsnummern der NCBIDatenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) angegeben. (T) = Referenznummer Typstamm (G) = Referenznummer des gesamten sequenzierten Genoms 103 Ergebnisse Bei dem Isolat 38 konnte auch mit Hilfe des Stammbaumes keine Zuordnung zu einer Gattung oder einer Familie erfolgen (Abb. 31). Die nächsten Verwandten dieses Isolates zählen zu der Ordnung Clostridiales. Diese Ordnung beinhaltet Bakterienfamilien wie die Lachnospiraceae, Clostridiaceae, Eubacteriaceae und Ruminococcaceae. Abb. 31: Distanzbasierter phylogenetischer Stammbaum des Isolats 38. Vor den Artnamen sind die Zugangsnummern der NCBIDatenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) angegeben. (T) = Referenznummer Typstamm (G) = Referenznummer des gesamten sequenzierten Genoms 104 Diskussion 5 Diskussion Es ist schwer nachzuvollziehen, wie die Annahme, dass der gesunde Uterus der Stute steril ist, zur allgemeinen Lehrmeinung werden konnte, da fast alle Studien zum bakteriologischen Keimgehalt des Uterus an infertilen Stuten erfolgten und dabei in der Regel nur die fakultativ pathogenen, aber nicht die apathogenen Bakterien berücksichtigt wurden. Lediglich SCOTT et al. (1971), RICKETTS und MACKINTOSH (1987) sowie NASH et al. (2010) zweifelten die Annahme des sterilen Uterus an und vermuteten, dass der Nachweis von Bakterien aus dem Uterus ohne weitere Entzündungsanzeichen ein Hinweis auf eine ständige bakterielle Besiedlung des Uterus ist. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, durch bakteriologische und parallele zytologische Untersuchungen den Uterus von Fohlen und gesunden adulten Stuten auf das Vorkommen einer physiologischen bakteriellen Besiedlung zu untersuchen. Des Weiteren wurde das Keimspektrum von Stuten mit unterschiedlichem Vorbericht sowie unterschiedlicher Geschlechtsgesundheit analysiert. Um nähere Informationen über die apathogenen und anaeroben Bakterien des Uterus zu erhalten, wurden die in der Mikrobiologie nicht bis zur Art bestimmten apathogenen sowie anaeroben Bakterien molekularbiologisch untersucht. Außerdem wurde der Vorgang der Probenentnahme und Probenverarbeitung auf mögliche Kontaminationsquellen geprüft, um aussagekräftige bakteriologische Ergebnisse zu gewährleisten. 5.1 Diskussion der Methodik Bisher durchgeführte Studien zum uterinen Keimgehalt der Stute sind schwer zu bewerten, da häufig unterschiedliche Entnahmetechniken genutzt und die Proben entweder zervikal, zerviko-uterin oder intrauterin genommen wurden. Zudem erfolgte in der Regel keine eindeutige Differenzierung zwischen fertilen und infertilen Stuten 105 Diskussion und die meisten Autoren berücksichtigten nur fakultativ pathogene, aber nicht apathogene Bakterien (SCOTT et al. 1971, TILLMANN et al. 1982, RICKETTS und MACKINTOSH 1987, HINRICHS et al. 1988, ALBIHIN et al. 2003, HUCHZERMEYER 2003, FRONTOSO et al. 2008, NEUBERG 2009). In dieser Studie wurde daher ein Vorbericht erhoben und eine gynäkologische Untersuchung der Stuten durchgeführt, um eine Differenzierung in geschlechtsgesunde, anamnestisch auffällige und klinisch auffällige Stuten sowie eine Einteilung in definierte Versuchsgruppen zu ermöglichen. Um die Vergleichbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten, wurde für die Probenentnahme ein Verfahren gewählt, das sowohl bei Fohlen als auch bei adulten Stuten angewendet werden kann. Außerdem sollte das Entnahmeverfahren so wenig Kontaminationen wie möglich zulassen, um Aussagen über physiologische bakterielle Besiedler des Uterus treffen zu können. Da Uterusspülungen und Uterusbiopsien bei Fohlen nur schwer durchzuführen sind, erfolgte die Probenentnahme in dieser Studie mit doppelt geschützten Uteruskulturtupfern, die bei den Fohlen mit Hilfe eines Röhrenspekulums und bei erwachsenen Stuten mit Hilfe eines Spreizspekulums nach Polansky in den Uterus vorgeführt wurden. Durch die Sektion eines 1 Tag alten Fohlens mit Eröffnung des Uterus konnte nachgewiesen werden, dass beim Fohlen mit Hilfe eines Röhrenspekulums eine direkte intrauterine Tupferprobenentnahme möglich ist. In der Literatur wird eine Probenentnahme mit geschützten Tupfersystemen empfohlen (ALLEN und NEWCOMBE 1979, BLANCHARD et al. 1981, RICKETTS 1981) und die Entnahme mit Spekulum und Zervixfasszange der manuellen transvaginalen Entnahmetechnik vorgezogen (WAELCHLI et al. 1992, HANDLER 2005). Es liegen jedoch keine Studien darüber vor, ob auch bei doppelt geschützten Tupfersystemen die manuelle transvaginale Entnahme eine höhere Kontaminationsgefahr birgt als die Entnahme mit Spekulum und Zervixfasszange. Während HANDLER (2005) auch bei doppelt geschützten Tupfersystemen die Entnahme mit Spekulum und Zervixfasszange empfiehlt, ist laut der Gesellschaft für Pferdemedizin (Rundschreiben 1998) die transvaginale manuelle Entnahmetechnik ein international 106 Diskussion übliches Verfahren und die Verwendung eines Spekulums bei der Tupferentnahme nicht zwingend notwendig. In der vorliegenden Arbeit wurden beide Entnahmetechniken unter Verwendung von doppelt geschützten Tupfern miteinander verglichen. Bei der manuellen transvaginalen Entnahme konnten signifikant häufiger Bakterien nachgewiesen werden als bei der Entnahme mit Spekulum und Zervixfasszange. Außerdem konnten in 3 der 5 manuell transvaginal in die Zervix vorgeführten doppelt geschützten Tupfer, deren inneren Hüllen aber erst außerhalb des Pferdes vorgeschoben wurden, Bakterien nachgewiesen werden. Es kann also auch mit doppelt geschützten Tupfersystemen bei der manuellen transvaginalen Probenentnahme zu Kontaminationen kommen. Aus der vorliegenden Studie lässt sich demnach die Empfehlung ableiten, auch bei doppelt geschützten Uteruskulturtupfern die Probenentnahme mit Hilfe eines Spekulums und einer Zervixfasszange durchzuführen. Zusätzlich wurde geprüft, ob es bei der Überführung der Tupfer in das Transportmedium oder bei dem anschließenden Transport zu Kontaminationen kommen kann und ob die originalverpackten Uteruskulturtupfer tatsächlich steril sind. Hierbei konnten keine weiteren Kontaminationsquellen aufgezeigt werden. Da RICKETTS und MACKINTOSH (1987) eine ständige Besiedlung des Uterus mit anaeroben Oberflächenkommensalen vermuteten und es nur vereinzelt Studien zu anaeroben uterinen Bakterien bei der Stute gibt, erfolgte die bakteriologische Untersuchung der Proben in der vorliegenden Arbeit nicht nur auf aerobe und mikroaerophile sondern auch auf anaerobe Bakterien. Im Fokus der vorliegenden Studie standen neben den anaeroben auch die apathogenen Bakterienarten, über die bei der Stute bisher kaum Informationen vorliegen (HUCHZERMEYER 2003). Die sehr sensitiven molekularbiologischen Untersuchungen der anaeroben und apathogenen Bakterien erfolgten von Kolonien der Bakterienisolate. Die dadurch zur Verfügung stehende große Menge an Ziel-DNA sowie die Durchführung der Laborarbeiten unter Sterilbänken, die nach jedem 107 Diskussion Arbeitsschritt mit UV-Licht behandelt wurden, verringerten das Kontaminationsrisiko (BORST et al. 2004). Im Zusammenhang mit den stets negativen Negativkontrollen der PCR und dem Abgleich der Eigenschaften der über die 16S rDNA bestimmten Bakterienarten mit den in der Mikrobiologie phänotypisch ermittelten Eigenschaften der Isolate konnten Kontaminationen faktisch ausgeschlossen werden. Die parallele Entnahme und Bewertung einer zytologischen Probe erlaubte die Diagnose eines reaktionsfreien oder eines entzündlichen Endometriums (POHL et al. 1977, WINGFIELD DIGBY und RICKETTS 1982, MATTOS et al. 1984, RIDDLE et al. 2007). Den Empfehlungen der Literatur entsprechend erfolgte die Entnahme der zytologischen Proben in dieser Studie mit einem doppelt geschützten System und einer Zytologiebürste (BOURKE et al. 1997, AGUILAR et al. 2006, NEUBERG 2009). Die anschließende Färbung mit der Diff-Quick®-Methode ermöglichte eine gute Zelldifferenzierung und Auswertung (WALTER et al. 2006). 5.2 Bakteriologische und zytologische Untersuchungen 5.2.1 Fohlen und Maidenstuten Bei der juvenilen Stute ist die Zervix von weicher Konsistenz und ihre arttypische Schleimhautfaltung noch zierlich und wenig deutlich ausgeprägt (SEIFERLE 1933). Auch das Vorkommen von Abwehrzellen ist im Uterus von juvenilen Stuten im Vergleich zum Uterus von adulten Stuten deutlich reduziert (WIDDERS et al. 1985). Trotz der noch nicht vollständig entwickelten uterinen Abwehrmechanismen bei juvenilen Stuten liegen keine Studienergebnisse über eine mögliche bakterielle Besiedlung des Uterus bei dieser Stutengruppe vor. In der vorliegenden Studie wurden daher Uteruskulturtupfer von Fohlen untersucht, um Hinweise auf eine physiologische bakterielle Besiedlung des juvenilen Uterus zu erhalten. In 10 (62,5 %) der 16 untersuchten Tupfer konnten Bakterien nachgewiesen werden. Es 108 Diskussion handelte sich sechsmal um den Nachweis als fakultativ pathogen und apathogen sowie viermal um den Nachweis als apathogen eingestufter Bakterien. Es konnten auch 7 anaerobe Bakterienisolate in den Tupfern der Fohlen nachgewiesen werden. Die parallel entnommenen zytologischen Proben fielen immer negativ aus. Das Endometrium war demnach bei allen Fohlen reaktionsfrei. Bakteriologische Untersuchungen können jedoch auch zu falsch positiven oder falsch negativen Ergebnissen führen. Falsch positive bakteriologische Ergebnisse entstehen vor allem durch Kontaminationen mit Umweltkeimen oder Bakterien aus den kaudalen Abschnitten der Genitalorgane (RICKETTS 1981). Mit hoher Wahrscheinlichkeit handelt es sich bei den in der vorliegenden Studie nachgewiesenen Bakterien allerdings nicht um Kontaminationen, da im Vorfeld sowohl die Tupfer als auch die Entnahme sowie der anschließende Transport der Proben auf mögliche Kontaminationen überprüft worden sind. Im Fall der 6 negativen Proben war der Uterus entweder tatsächlich steril oder es handelte sich um falsch negative Ergebnisse. Mögliche Ursachen hierfür könnten die fehlende Kultivierbarkeit von etwa 99 % aller Mikroorganismen (AMANN et al. 1995), ungeeignete Kultivierungsbedingungen, eine unzureichende Benetzung des Tupfers mit Untersuchungsmaterial, eine zu geringe Anzahl an Bakterien, um sie zu kultivieren (RICKETTS 1981), oder biofilmbildende Bakterien (LEBLANC 2010) sein. Auch wenn Kontaminationen nie ganz ausgeschlossen werden können, ist aufgrund der sterilen Vorgehensweise, der 10 positiven Proben und den stets negativen zytologischen Untersuchungen mit hoher Wahrscheinlichkeit davon auszugehen, dass es sich bei den nachgewiesenen Bakterien um ständige physiologische Besiedler des Uterus handelt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit führen demnach zu der Annahme, dass der Uterus von Fohlen eine permanente physiologische Mischflora aus aeroben und anaeroben Bakterien aufweisen kann. SCHULTHEISS et al. (1999) führten ihre Untersuchungen zum uterinen Keimgehalt an gesunden präpubertären Hunden durch. Die Probenentnahme erfolgte dabei im 109 Diskussion Anschluss an eine Hysterektomie. In 35 % der Proben konnten sie Bakterien nachweisen. SCHULTHEISS et al. (1999) interpretierten das Ergebnis ihrer Studie als einen Hinweis auf das Vorkommen einer uterinen bakteriellen Normalflora beim Hund. Um Aussagen über die uterine Keimflora zyklischer geschlechtsgesunder Stuten machen zu können, wurden in der vorliegenden Arbeit von 16 zwei- und dreijährigen geschlechtsgesunden Maidenstuten Uteruskulturtupfer und Endometriumzytologien untersucht, bei denen noch keinerlei uterine Manipulation in Form von Bedeckung, Besamung oder Probenentnahme stattgefunden hat. Während die zytologische Untersuchung bei allen Proben negativ ausfiel, zeigte eine bakteriologische Probe ein Wachstum apathogener und eine weitere bakteriologische Probe ein Wachstum apathogener und fakultativ pathogener Bakterien. In den beiden positiven Proben konnten auch 3 anaerobe Bakterienisolate nachgewiesen werden. Bei den Maidenstuten waren demzufolge 11,8 % der bakteriologischen Untersuchungen positiv. Im Vergleich zu den Fohlen wiesen die Maidenstuten signifikant weniger positive bakteriologische Befunde auf. Zum uterinen Keimgehalt von Maidenstuten liegen von RICKETTS und MACKINTOSH (1987) sowie von RIDDLE et al. (2007) Studien vor. Bei RICKETTS und MACKINTOSH (1987) erfolgten die Untersuchungen auf anaerobe Bakterien zum Teil mit geschützten und zum Teil mit ungeschützten Tupfern. Von den 41 untersuchten Maidenstuten wiesen in ihrer Studie mehr als 50 % der Proben ein positives bakteriologisches Ergebnis auf, während die zytologischen Untersuchungen stets negativ waren. Die aus der vorliegenden Studie ermittelten Ergebnisse der Maidenstuten, bei denen nur in 11,8 % der Proben Bakterien nachgewiesen wurden, können die Ergebnisse von RICKETTS und MACKINTOSH (1987) nicht bestätigen. Vermutlich ist der hohe Anteil positiver Proben bei RICKETTS und MACKINTOSH (1987) durch Kontaminationen mit Bakterien aus den kaudalen Abschnitten der Geschlechtsorgane entstanden, da es bei dem Einsatz von ungeschützten Tupfern leicht zu Kontaminationen kommen 110 Diskussion kann (ALLEN und NEWCOMBE 1979, BLANCHARD et al. 1981, RICKETTS 1981, HANDLER 2005). Bei den von RIDDLE et al. (2007) durchgeführten Untersuchungen wurden die Maidenstuten nicht auf ihre Geschlechtsgesundheit untersucht. Zwar konnten RIDDLE et al. (2007) in 5 (3 %) der 150 untersuchten Tupfer Bakterien nachweisen, da aber die parallel entnommenen zytologischen Proben bei diesen 5 Stuten auch positiv waren, vermuteten sie, dass diese Stuten eine Endometritis aus vorherigen Bedeckungen aufwiesen. Bei den anderen 145 Maidenstuten konnten weder Bakterien noch vermehrt neutrophile Granulozyten nachgewiesen werden. Verglichen mit den Ergebnissen von RIDDLE et al. (2007) wurden in der vorliegenden Arbeit bei den Maidenstuten häufiger Bakterien nachgewiesen. Mögliche Ursachen für die Divergenz der bakteriologischen Ergebnisse sind ein unterschiedliches Zuchtmanagement, unterschiedliche Haltungsbedingungen und die Untersuchung unterschiedlicher Pferderassen. Außerdem können auch die Untersuchungsverfahren im mikrobiologischen Labor die Ergebnisse beeinflussen (ALBIHIN et al. 2003). Zum uterinen Keimgehalt von geschlechtsgesunden Stuten aller Altersklassen, bei denen nicht zwischen Maidenstuten oder bereits zur Zucht eingesetzten Stuten unterschieden wurde, liegen mehrere Untersuchungen vor (MERKT et al. 1987, HINRICHS et al. 1988, HUCHZERMEYER 2003). MERKT et al. (1987) konnten in 22 % der 9 Proben von geschlechtsgesunden Stuten eine unbedenkliche Bakterienflora nachweisen. Die Probenentnahme erfolgte mit Spekulum, Zervixfasszange sowie einem geschützten Tupfersystem. Bei den Untersuchungen von HINRICHS et al. (1988) erfolgte die Entnahme von Uterustupferproben manuell transvaginal mit doppelt geschützten Tupfern. In 31 % der 48 untersuchten Tupfer geschlechtsgesunder Stuten konnte bakterielles Wachstum festgestellt werden. Es handelte sich ausschließlich um apathogene Bakterien. HUCHZERMEYER (2003) stellte bei 20 mit Hilfe eines Spekulums und mit geschützten Tupfern aus dem Uterus geschlechtsgesunder Stuten entnommener 111 Diskussion Proben in 35 % der Fälle bakterielles Wachstum fest. Es konnten sowohl fakultativ pathogene als auch apathogene Bakterien, von denen 1 Isolat zu den anaeroben Bakterien zählte, nachgewiesen werden. Verglichen mit den Untersuchungsergebnissen von geschlechtsgesunden Stuten aller Altersklassen, bei denen zwischen 22 und 35 % der Proben positiv waren (MERKT et al. 1987, HINRICHS et al. 1988, HUCHZERMEYER 2003), wiesen die Maidenstuten der vorliegenden Studie mit 11,8 % positiven Proben eine geringere Nachweisrate auf. Neben den bereits genannten möglichen Ursachen für divergierende bakteriologische Ergebnisse können aber auch das Alter oder vorangegangene Geburten die Ergebnisse beeinflussen. Beide Parameter können zu reduzierten anatomischen Abwehrmechanismen wie zum Beispiel einem verminderten Scham- oder Zervixschluss führen und somit das Eindringen von Bakterien in den Uterus erleichtern. Über die Interpretation der bakteriologischen Ergebnisse geschlechtsgesunder Stuten herrscht Uneinigkeit. Während einige Autoren den Nachweis von Bakterien aus dem Uterus ohne weitere Entzündungsanzeichen als Hinweis auf eine physiologische Keimflora ansehen (SCOTT et al. 1971, RICKETTS und MACKINTOSH 1987, NASH et al. 2010), gehen andere Autoren davon aus, dass der gesunde Uterus steril ist und interpretieren nachgewiesene Bakterien als transiente, kontaminationsbedingte Besiedler (LEIDL et al. 1976, WOOLCOCK 1980, TILLMANN et al. 1982, HINRICHS et al. 1988, HANDLER 2005). Auch in der Humanmedizin konnte die Frage der Sterilität des Uterus noch nicht beantwortet werden (BOLLINGER 1964, SPARKS et al. 1977, TEISELA 1987, HEMSELL et al. 1989, COWLING et al. 1992). Die Ergebnisse der vorliegenden Studie können die in der Literatur kontrovers diskutierte Frage, ob der gesunde Uterus zyklischer Stuten steril ist oder eine natürliche bakterielle Besiedlung aufweist, nicht endgültig beantworten. Es ist einerseits möglich, dass der gesunde Uterus normalerweise steril ist und es sich bei den in dieser Studie bei den Maidenstuten nachgewiesenen Bakterien aufgrund der 112 Diskussion wenigen positiven Proben um transiente kontaminationsbedingte Besiedler des Uterus handelt, die in der vorangegangenen Rosse in den Uterus gelangt sind. Andererseits besteht aber auch die Möglichkeit, dass die nachgewiesenen Bakterien permanente physiologische Besiedler des Uterus sind und es sich bei den Proben ohne bakteriellen Nachweis um falsch negative Ergebnisse handelte, da die Bakterien nicht kultivierbar waren, in einer Mischflora in zu geringer Anzahl vorkamen, in Biofilmen nicht nachweisbar waren oder die Tupfer nicht mit ausreichend Untersuchungsmaterial benetzt waren. Während in der Humanmedizin bei früheren kulturellen Untersuchungen der Lungenalveolen, der Nasen- nebenhöhlen und des Mittelohrs nur vereinzelt positive Ergebnisse vorkamen und man deshalb davon ausging, dass diese Kompartimente des Körpers steril sind (KAHN und JONES 1987, HOSEMAN und KÜHNEL 2001, WALKER 2004, PAETZ 2009), konnte in neueren kulturunabhängigen Untersuchungen gezeigt werden, dass sie eine physiologische Keimflora aufweisen (ROGERS et al. 2004, ARMOUGOM et al. 2009, TONNAER et al. 2009, HILTY et al. 2010, HUANG et al. 2010, MLADINA et al. 2010, ERB-DOWNWARD et al. 2011). Während die Ergebnisse der vorliegenden Studie beim Fohlen auf eine permanente physiologische bakterielle Besiedlung des Uterus mit aeroben und anaeroben Bakterien hindeuten, können sie bei der zyklischen Stute die Frage nach dem Vorkommen einer physiologischen Keimflora nicht beantworten. Vermutlich lässt sich die Abnahme der positiven bakteriologischen Proben bei den Maidenstuten im Vergleich zu den Fohlen durch die vollständige Entwicklung der Zervix und des Immunsystems bei adulten Stuten erklären. Auch das Einsetzen regelmäßiger Rossezyklen kann zur Reinigung des Uterus beitragen. 113 Diskussion 5.2.2 Anamnestisch auffällige Stuten Um nähere Informationen über die Keimflora anamnestisch auffälliger Stuten zu erhalten, wurden von güsten Stuten, umrossenden Stuten und Stuten, die resorbiert haben, bakteriologische und zytologische Proben untersucht. Von den güsten und den umrossenden Stuten zeigte jeweils eine bakteriologische Probe ein Wachstum apathogener und jeweils eine Probe ein Wachstum apathogener und fakultativ pathogener Bakterien, während in den übrigen Proben dieser Gruppen keine Bakterien festgestellt wurden. Bei den güsten Stuten waren demnach 2 (13,3 %) von 15 und bei den umrossenden Stuten 2 (14,3 %) von 14 Proben positiv. In 4 (36,4 %) von 11 Proben konnten bei den Stuten, die resorbiert haben, Bakterien nachgewiesen werden. Es handelte sich dreimal um den Nachweis apathogener und einmal um den Nachweis apathogener und fakultativ pathogener Bakterien. In keiner Probe der anamnestisch auffälligen Stuten konnten anaerobe Bakterien nachgewiesen werden. Während bei den Stuten, die resorbiert haben, und den umrossenden Stuten jeweils in einer Probe vermehrt neutrophile Granulozyten vorkamen, waren bei den güsten Stuten alle zytologischen Untersuchungen negativ. Mit 36,4 % waren bei den Stuten, die resorbiert haben, deutlich mehr bakteriologische Proben positiv als bei den güsten Stuten mit 13,3 % sowie den umrossenden Stuten mit 14,3 %. Aufgrund der geringen Fallzahlen konnte jedoch kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den bakteriologischen Ergebnissen der anamnestisch auffälligen Versuchsgruppen festgestellt werden. Die bakteriologischen Ergebnisse der anamnestisch auffälligen Stuten der vorliegenden Studie sind aufgrund der Unterschiede beim Vorbericht, der Geschlechtsgesundheit und der Probenentnahme schwer mit den bakteriologischen Ergebnissen infertiler Stuten anderer Autoren zu vergleichen. Bei FRONTOSO et al. (2008) fielen die bakteriologischen Untersuchungen von Uterustupfern infertiler Stuten in 49 % der Fälle und bei ALBIHIN et al. (2003) in 64 % der Fälle positiv aus. Die deutlich höheren Zahlen im Vergleich zu den Ergebnissen dieser Studie lassen sich zum einen durch die manuell transvaginale 114 Diskussion Entnahmetechnik und zum anderen durch Einbeziehung von Stuten mit klinischen Anzeichen einer Endometritis erklären. Während ALBIHIN et al. (2003) bei umrossenden Stuten ohne klinische Symptome vermehrt E. coli nachwiesen, konnten die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit das vermehrte Vorkommen von E. coli bei umrossenden Stuten nicht bestätigen. E. coli kam in der vorliegenden Studie bei den umrossenden Stuten nämlich lediglich einmal in Mischkultur mit weiteren apathogenen Bakterien sowie mit β-hämolysierenden Streptokokken vor. TILLMANN et al. (1982) wiesen in 51 % der Tupfer von 1521 untersuchten güsten Stuten Bakterien nach, wobei die β-hämolysierenden Streptokokken, gefolgt von E. coli, den größten Anteil ausmachten. Es wurden jedoch keine Angaben über die Entnahmetechnik oder die Geschlechtsgesundheit der Stuten gemacht. Es kann daher nur vermutet werden, dass der höhere Anteil an positiven bakteriologischen Befunden bei TILLMANN et al. (1982) unter anderem durch die Einbeziehung bakteriologischer Ergebnisse von Stuten mit klinischen Anzeichen einer Endometritis und durch Kontaminationen bei der Tupferentnahme bedingt ist. Des Weiteren können auch hier das Zuchtmanagement, die Haltungsbedingungen, die Untersuchung unterschiedlicher Pferderassen sowie das Untersuchungslabor für die divergierenden Ergebnisse bei den bakteriologischen Untersuchungen verantwortlich sein. LEBLANC et al. (2007) haben bei infertilen Stuten Uterusspülungen mit geringem Volumen durchgeführt. Sie konnten in 70 % der Proben Bakterien nachweisen, von denen aber lediglich 30 % auch in den zytologischen Untersuchungen positiv waren. Bei den Bakterien handelte es sich am häufigsten um E. coli, gefolgt von den βhämolysierenden Streptokokken. Vor der Probenentnahme erfolgte zwar eine gynäkologische Untersuchung der Stuten, aber es wurden keine Angaben gemacht, ob Stuten mit klinischen Anzeichen einer Endometritis mit in die Studie eingeschlossen wurden. LEBLANC et al. (2007) gingen davon aus, dass es sich bei der Uterusspülung mit geringem Volumen um ein sehr sensitives Verfahren handelt und daher verhältnismäßig viele Proben positiv waren. Vermutlich lässt sich ein Teil der positiven Proben aber auch durch Kontaminationen erklären, da es sich bei der 115 Diskussion Uterusspülung um ein ungeschütztes System handelt, bei dem der Katheter manuell transvaginal in den Uterus vorgeführt wird. RICKETTS und MCKINTOSH (1987) untersuchten die Uterustupfer von 89 güsten Stuten auf anaerobe Bakterien. Sie konnten in 49 % der Proben anaerobe Bakterien nachweisen. Da die Probenentnahme zum Teil mit ungeschützten Tupfern erfolgte, ist vermutlich auch hier ein Teil der positiven bakteriologischen Untersuchungen auf Kontaminationen mit Bakterien aus den kaudalen Abschnitten der Genitalorgane zurückzuführen. Das vermehrte Vorkommen von anaeroben Bakterien bei güsten Stuten konnte durch die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit nicht bestätigt werden, da in keiner Probe der anamnestisch auffälligen Stuten anaerobe Bakterien nachgewiesen wurden. Aufgrund der wenigen positiven bakteriologischen Proben bei den anamnestisch auffälligen Stuten der eigenen Studie sind keine Rückschlüsse auf mögliche gruppenspezifische Keimspektren möglich. Nach den vorliegenden Ergebnissen spielen jedoch anaerobe Bakterien, anders als bei der Studie von RICKETTS und MACKINTOSH (1987), bei anamnestisch auffälligen Stuten keine Rolle und auch E. coli ist, abweichend von den Ergebnissen von ALBIHIN et al. (2003), bei umrossenden Stuten nicht von besonderer Bedeutung. 5.2.3 Klinisch auffällige Stuten Um Informationen über das Vorkommen von Bakterien im Uterus klinisch auffälliger Stuten zu erhalten, wurden in der vorliegenden Studie bakteriologische und zytologische Proben von Stuten mit klinischen Anzeichen einer Endometritis untersucht. Alle 15 Proben hatten positive bakteriologische Befunde. Siebenmal konnten fakultativ pathogene, fünfmal apathogene und dreimal fakultativ pathogene und apathogene Bakterien nachgewiesen werden. Ausschließlich in dieser Versuchsgruppe gelang der Nachweis von fakultativ pathogenen Bakterien ohne apathogene Begleitflora. In 6 Proben wurden außerdem vermehrt neutrophile 116 Diskussion Granulozyten beobachtet. Erwartungsgemäß waren demnach bei den klinisch auffälligen Stuten die zytologischen Befunde häufiger positiv als bei den anderen Versuchsgruppen. Als fakultativ pathogene Bakterien konnten elfmal β- hämolysierende Streptokokken und einmal Klebsiella pneumoniae nachgewiesen werden. Bei den 2 Stuten mit hochgradigen intrauterinen Flüssigkeitsansammlungen konnte jeweils ein hochgradiges Wachstum von Streptococcus equi ssp. zooepidemicus festgestellt werden. Mit mittlerem Keimgehalt wurde jeweils einmal Klebsiella pneumoniae sowie Lactobacillus sp. und zweimal Streptococcus equi ssp. zooepidemicus nachgewiesen. Aus keiner Probe konnten anaerobe Bakterien isoliert werden. In der Literatur finden sich keine Angaben über den Anteil positiver bakteriologischer Proben bei Stuten mit klinischen Anzeichen einer Endometritis. Sie werden in der Regel gemeinsam mit den anamnestisch auffälligen Stuten betrachtet. Es liegt allerdings auf der Hand, dass klinisch auffällige Stuten häufiger positive bakteriologische Befunde aufweisen als anamnestisch auffällige Stuten. Nach Literarturangaben haben fakultativ pathogene Bakterien, die in dichten Reinkulturen wachsen, ein höheres Potenzial Endometritiden zu induzieren, als wenige Bakterien in Mischkulturen (TILLMANN et al. 1982, NIELSEN 2005). Dies kann durch die Ergebnisse der vorliegenden Studie, in denen nur bei Stuten mit klinischen Anzeichen einer Endometritis fakultativ pathogene Bakterien ohne apathogene Begleitflora sowie Bakterien mit hohem Keimgehalt nachgewiesen wurden, bestätigt werden. Außerdem konnte bei 3 klinisch auffälligen Stuten eine Mischkultur aus apathogenen und fakultativ pathogenen Bakterien festgestellt werden. Dies geht mit neueren Studienergebnissen konform, in denen mittlerweile auch ein Wachstum von Mischkulturen als relevant angesehen wird (ALBIHIN et al. 2003, RIDDLE et al. 2007, WITTENBRINK et al. 2008). Aus 5 Uterustupfern der klinisch auffälligen Stuten der vorliegenden Studie konnten lediglich apathogene Bakterien isoliert werden. Es ist möglich, dass andere Faktoren wie Pilzinfektionen, Hefeinfektionen, Urinansammlungen oder eine Pneumovagina zu den klinischen Symptomen bei diesen Stuten geführt haben oder dass fakultativ pathogene Bakterien nicht 117 Diskussion nachgewiesen werden konnten, da sie zum Beispiel vom Tupfer, der nur mit einem kleinen Teil der endometrialen Oberfläche in Berührung kommt, nicht erfasst wurden. Unter den fakultativ pathogenen Bakterien waren in der vorliegenden Studie die βhämolysierenden Streptokokken bei den klinisch auffälligen Stuten mit 11 Nachweisen vorherrschend. Während Klebsiella pneumoniae immerhin einmal isoliert wurde, konnten E. coli variatio hämolytica, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus sowie Taylorella equigenitalis in keiner Probe nachgewiesen werden. Die Dominanz der β-hämolysierenden Streptokokken bei den Stuten mit klinischen Anzeichen einer Endometritis bestätigt die einschlägige Fachliteratur, nach denen sie für mehr als 50 % der Uterusinfektionen verantwortlich sind (MERKT et al. 1987, NIELSEN 2005, FRONTOSO et al. 2008). Der fehlende Nachweis der anderen fakultativ pathogenen Bakterien ist vermutlich durch die geringe Fallzahl bedingt. Während einige Autoren auch nicht hämolysierende E. coli den fakultativ pathogenen Bakterien zuordnen und von einer klinischen Relevanz ausgehen, konnten nicht hämolysierende E. coli in der vorliegenden Studie lediglich bei 2 klinisch auffälligen Stuten in Mischkultur mit β-hämolysierenden Streptokokken bzw. koagulasenegativen Staphylokokken nachgewiesen werden. Das Keimspektrum der klinisch auffälligen Stuten unterscheidet sich erwartungsgemäß von den Keimspektren der anderen Versuchsgruppen. Es konnten signifikant häufiger fakultativ pathogene Bakterien isoliert werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie stehen jedoch im Widerspruch zu den Ergebnissen von RICKETTS und MACKINTOSH (1987), LANGONI et al. (1997) sowie SZEMERÉDI et al. (2003), die von einer klinischen Relevanz anaerober Bakterien ausgingen. In dieser Studie konnten bei keiner Stute mit klinischen Anzeichen einer Endometritis anaerobe Bakterien in den Tupferproben nachgewiesen werden. 118 Diskussion 5.3 Molekularbiologische Untersuchungen In der Literatur finden sich nur wenige Angaben über anaerobe oder apathogene Bakterien im Uterus der Stute. Studien, in denen molekularbiologische Methoden verwendet wurden, sind nicht publiziert. Um nähere Informationen über das Keimspektrum des Uterus zu erhalten, wurden daher die in der Mikrobiologie isolierten 40 apathogenen sowie anaeroben Bakterienisolate, die kulturell- biochemisch nicht bis zur Art bestimmt wurden, molekularbiologisch untersucht. Mit der vorliegenden Arbeit wurde auch ein Datensatz mit den DNA-Sequenzen dieser Bakterien für nachfolgende Untersuchungen aufgebaut. Von den 40 molekularbiologisch untersuchten Bakterienisolaten wurden 20 (50 %) Isolate aus den Tupfern der Fohlen, 8 (20 %) Isolate aus den Tupfern der Maidenstuten, 5 (12,5 %) Isolate aus den Tupfern der klinisch auffälligen Stuten, 4 (10 %) Isolate aus den Tupfern der Stuten, die resorbiert haben, 2 (5 %) Isolate aus den Tupfern der güsten Stuten sowie 1 (2,5 %) Isolat aus den Tupfern der umrossenden Stuten nachgewiesen. Die Fohlen wiesen demnach die meisten phänotypisch nicht differenzierten Bakterienisolate auf. Dies lässt sich dadurch erklären, dass aus ihren 10 positiven Tupfern ohnehin relativ viele apathogene und anaerobe Bakterien isoliert wurden und bisher keine Erkenntnisse über ihre uterine Keimflora vorliegen. Bei den Maidenstuten waren 2 Tupferproben bakteriologisch positiv und es gab 8 Bakterienisolate, die nicht bis zur Art bestimmt wurden. Aus den jeweils 2 positiven bakteriologischen Untersuchungen der güsten und der umrossenden Stuten wurden lediglich 1 bzw. 2 Bakterienisolate in der Mikrobiologie nicht bis zur Art bestimmt und bei den Stuten, die resorbiert haben, erfolgte bei 4 Bakterienisolaten, die aus 4 positiven Tupferproben nachgewiesen wurden, eine weiterführende molekularbiologische Untersuchung. Bei den klinisch auffälligen Stuten erfolgte zwar in jeder Tupferprobe ein Bakteriennachweis, aber nur 5 Bakterienisolate wurden molekularbiologisch untersucht. Dies lässt sich wahrscheinlich durch das kleine Spektrum an fakultativ pathogenen uterinen 119 Diskussion Bakterienarten bei der Stute erklären, die überdies auch gut erforscht und relativ leicht phänotypisch zu bestimmen sind. Bei den molekularbiologisch untersuchten Bakterienisolaten handelte es sich dreizehnmal um α-hämolysierende Streptokokken, achtmal um gramnegative anaerobe Stäbchen, siebenmal um coryneforme Bakterien, sechsmal um anhämolysierende Streptokokken, zweimal um grampositive anaerobe Kokken, zweimal um gramnegative aerobe Stäbchen sowie jeweils einmal um grampositive aerobe Stäbchen und Pasteurella sp. Die Häufigkeit der apathogenen Bakterien entspricht den Angaben in der Literatur, nach denen auch α-hämolysierende Streptokokken, coryneforme Bakterien sowie anhämolysierende Streptokokken zu den häufigsten apathogenen Bakterien zählen (HINRICHS et al. 1988, HUCHZERMEYER 2003, NEUBERG 2009). 22 (55 %) der molekularbiologisch untersuchten Bakterienisolate konnten über ihre 16S rDNA Sequenz und deren Abgleich mit Gendatenbanken bis zur Art identifiziert werden. Bei 11 (27,5 %) Isolaten erfolgte eine Bestimmung der Bakteriengattung und lediglich 7 (17,5 %) Isolate konnten auch über ihre 16S rDNA Sequenz nicht bestimmt werden. Retrospektiv betrachtet stimmen in der vorliegenden Studie die Eigenschaften der über die 16S rDNA bestimmten Bakterienarten und –gattungen bei allen Isolaten mit den in der Mikrobiologie ermittelten phänotypischen Eigenschaften überein. Da 82,5 % der uterinen Bakterien bis zur Art oder Gattung bestimmt werden konnten, ist anzunehmen, dass die Bakterien der equinen uterinen Flora größtenteils bekannt sind. Von den 13 Isolaten der α-hämolysierenden Streptokokken wurden 2 Isolate als Streptococcus equinus identifiziert. Streptococcus equinus gehört zu der apathogenen Normalflora im Darm von Pferden (SELBITZ 2002). Einmal handelte es sich außerdem um Enterococcus canis, der erstmals 2003 aus Analtupfern von Hunden isoliert wurde (DE GRAEF et al. 2003). Ein Isolat der α-hämolysierenden Streptokokken wurde außerdem als Streptococcus thoraltensis identifiziert. Streptococcus thoraltensis wurde bisher sowohl aus dem Genitaltrakt als auch aus 120 Diskussion dem Intestinaltrakt von Schweinen nachgewiesen (DEVRIESE et al. 1997). Bei den 4 identifizierten α-hämolysierenden Streptokokken der vorliegenden Studie handelte es sich demnach um physiologische Besiedler des Darmtraktes verschiedener Haussäugetiere. Von weiteren 6 Isolaten der α-hämolysierenden Streptokokken konnte lediglich eine Zugehörigkeit zu der Gattung der Streptokokken bestätigt werden und bei 3 Isolaten war weder eine Bestimmung der Art noch der Gattung möglich. Diese 3 Isolate wurden mit Hilfe eines phylogenetischen Stammbaumes taxonomisch eingeordnet. Aus dem Stammbaum wurde ersichtlich, dass es sich bei den 3 Isolaten um Bakterien der Gattung Streptococcus handelte, deren nächster Verwandter Streptococcus minor ist. Streptococcus minor wurde bisher aus Kotproben und von den Tonsillen von Hunden, Katzen und Kälbern nachgewiesen (VANCANNEYT et al. 2004). Von den 13 α-hämolysierenden Streptokokken der vorliegenden Studie konnte also von lediglich 4 (31 %) Isolaten die Art bestimmt werden. Die Bakterienarten der equinen uterinen α-hämolysierenden Streptokokken sind demzufolge heterogen und weitestgehend unbekannt. Bei den achtmal isolierten gramnegativen anaeroben Stäbchen konnte von 6 Isolaten die Art bestimmt werden. Es handelte sich zweimal um Bacteroides heparinolyticus, und jeweils einmal um Bacteroides vulgatus, Bacteroides fragilis, Bacteroides thetaiotaomicrom sowie Fusobacterium equinum. Bei einem weiteren Isolat konnte die Zugehörigkeit zu der Gattung Fusobacterium festgestellt werden und bei einem Isolat konnte weder die Art noch die Gattung bestimmt werden. Durch die Erstellung eines Stammbaumes wurde das nicht bestimmte Isolat als Fusobacterium identifiziert. Die am häufigsten nachgewiesenen anaeroben uterinen Bakterien waren, übereinstimmend mit den Ergebnissen von RICKETTS und MACKINTOSH (1987) sowie LANGONI et al. (1997), Bakterien der Gattungen Bacteroides und Fusobacterium. Beide Bakteriengattungen sind ein Bestandteil der physiologischen Haut-, Schleimhaut- und Darmflora (SELBITZ 2002). Während Fusobacterium equinum vor allem im Rahmen von Infektionen des Respirationstraktes bei Pferden festgestellt wurde (TADEPALLI et al. 2008), konnte Bacteroides fragilis auch aus dem Uterus von Stuten isoliert werden (RICKETTS und MACKINTOSH 1987, 121 Diskussion LANGONI et al. 1997). Bacteroides thetaiotaomicrom und Bacteroides vulgatus sind ein Teil der normalen Darmflora der meisten Säugetiere (COMSTOCK und COYNE 2003, XU et al. 2007). Bacteroides heparinolyticus wird synonym auch als Prevotella heparinolytica bezeichnet und konnte im Rahmen periodontaler Erkrankungen beim Menschen (ASHIMOTO et al. 1995) und beim Hund (RIGGIO et al. 2011) aus der Mundhöhle, beim Pferd im Rahmen respiratorischer Infektionen aus dem Pharynx und aus der Lunge (BAILEY und LOVE 1991, RACKLYEFT und LOVE 2000) sowie beim Menschen aus infizierten Katzen- und Hundebisswunden (ALEXANDER et al. 1997) nachgewiesen werden. Da in der vorliegenden Studie die gramnegativen anaeroben Stäbchen zu 75 % aus den Tupfern von Fohlen und zu 25 % aus den Tupfern von Maidenstuten isoliert wurden, ist davon auszugehen, dass sie ein häufiger Bestandteil der uterinen Bakterienflora von Fohlen sind. Von den 7 Isolaten der coryneformen Bakterien konnte von 4 Isolaten die Bakterienart bestimmt werden. Es handelte sich um Nocardia nova, Microbacterium foliorum, Corynebacterium jeikeium und Dietzia cinnamea. Des Weiteren wurde von einem Isolat die Zugehörigkeit zu der Gattung Corynebacterium und von einem Isolat zu der Gattung Brevibacterium festgestellt. Bei einem Isolat konnte über den phylogenetischen Stammbaum eine Zugehörigkeit zu der Gattung Corynebacterium festgestellt werden. Die in der vorliegenden Studie nachgewiesenen coryneformen Bakterien sind ubiquitär vorkommende Bakterien, die zum Teil auch im Rahmen opportunistischer Infektionen beim Menschen nachgewiesen wurden (BEHRENDT et al. 2001, TAUCH et al. 2005, YASSIN et al. 2006, ARORA et al. 2010). Es handelt sich bei den uterinen coryneformen Bakterien der Stute demzufolge um verschiedene, weitestgehend bekannte, ubiquitär vorkommende Bakterienarten. Die fünfmal aus der Gruppe der Fohlen und einmal aus der Gruppe der Maidenstuten nachgewiesenen anhämolysierenden Streptokokken wurden alle als Streptococcus uberis identifiziert. Streptococcus uberis ist vor allem als umweltassoziierter Mastitiserreger bei Kühen von Bedeutung (SELBITZ 2002, ODIERNO et al. 2006, 122 Diskussion PERSSON et al. 2011). Er wurde aber auch bereits bei Kühen aus dem Uterus nachgewiesen (MCDOUGALL 2005, MUSKENS et al. 2011). Bei den uterinen anhämolysierenden Streptokokken der Stute haben lediglich FRONTOSO et al. (2008) zum Teil weitere Differenzierungen vorgenommen und konnten daher auch einmal Streptococcus uberis nachweisen. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie lassen vermuten, dass Streptococcus uberis ein häufiger Bestandteil der bakteriellen Flora des Uterus von Fohlen ist. Während 1 Isolat der grampositiven anaeroben Kokken weder durch den Genbankabgleich der 16S rDNA Sequenz noch durch die Erstellung eines phylogenetischen Baumes bestimmt werden konnte, zeigte das zweite Isolat der grampositiven anaeroben Kokken eine Zugehörigkeit zu der Gattung Peptostreptococcus. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie bestätigen die Ergebnisse von RICKETTS und MACKINTOSH (1987), bei denen die Peptostreptokokken auch als dritthäufigste anaerobe Bakteriengattung aus dem Uterus von Stuten nachgewiesen wurden. Das Isolat der grampositiven aeroben Stäbchen konnte als Actinomyces hyovaginalis bestimmt werden. Actinomyces hyovaginalis wurde bisher beim Schwein aus eitrigem vaginalem Sekret sowie aus der Lunge und aus den Nasennebenhöhlen nachgewiesen (HOMMEZ et al. 1991, STORMS et al. 2002). Ein Isolat der gramnegativen aeroben Stäbchen zeigte eine Zugehörigkeit zu der Gattung Acidovorax und 1 Isolat konnte durch den phylogenetischen Baum der Gattung Flavobacterium zugeordnet werden. Bakterien dieser Gattungen kommen ubiquitär im Boden und in Gewässern vor (KHAN et al. 2002). In der Literatur finden sich keine Berichte über einen Nachweis von Actinomyces hyovaginalis oder Bakterien der Gattung Acidovorax oder Flavobacterium aus dem Uterus der Stute. Das Isolat der Gattung Pasteurella konnte als Pasteurella caballi identifiziert werden. Pasteurella caballi Respirationstrakts wurde beim im Pferd Rahmen und beim 123 infektiöser Schwein Erkrankungen sowie in des infizierten Diskussion Pferdebisswunden beim Menschen nachgewiesen (SCHLATER et al. 1989, CHRISTENSEN et al. 2006). FRONTOSO et al. (2008) wiesen Pasteurella caballi auch aus dem Uterus einer Stute nach. Während Bacteroides fragilis den fakultativ pathogenen Bakterien zugeordnet wird (RICKETTS und MACKINTOSH 1987, LANGONI et al. 1997), gehören die anderen anaeroben Bakterien der vorliegenden Studie zu den apathogenen Bakterien. Außerdem erfolgten alle Nachweise der anaeroben Bakterien aus den Tupfern von Fohlen und Maidenstuten und gingen mit negativen zytologischen Befunden einher. Demnach konnte in der vorliegenden Studie, im Widerspruch zu den Ergebnissen von RICKETTS und MACKINTOSH (1987) sowie LANGONI et al. (1997), keine klinische Relevanz anaerober Bakterien festgestellt werden. 5.4 Weitere Untersuchungen Bakteriologische Untersuchungen aller Probanden In der vorliegenden Studie waren insgesamt 39,8 % der bakteriologisch untersuchten Proben positiv. Dieser Wert liegt, verglichen mit den Ergebnissen von fertilen und infertilen Stuten anderer Autoren (LEIDL et al. 1976, WINGFIELD DIGBY und RICKETTS 1982, MERKT et al. 1987, NIELSEN 2005, RIDDLE et al. 2007, NEUBERG 2009), bei denen zwischen 11 % (RIDDLE et al. 2007) und 74 % (NEUBERG 2009) der Proben positiv waren, im mittleren Bereich. Neben den bereits genannten Schwierigkeiten beim Vergleich von bakteriologischen Studien beeinflusst bei Studien mit fertilen und infertilen Stuten zusätzlich der unbekannte Anteil gesunder, anamnestisch auffälliger oder kranker Tiere an der Gesamtfallzahl die Ergebnisse. Aufgrund der vielen Variablen ist ein Vergleich von Studien mit fertilen und infertilen Stuten in der Regel nicht besonders aussagekräftig. 124 Diskussion Nachweishäufigkeit der Bakterienarten In der vorliegenden Studie wurden am häufigsten Streptococcus equi ssp. zooepidemicus (17 %), gefolgt von α-hämolysierenden Streptokokken (15 %), E. coli (13 %) und koagulasenegativen Staphylokken (11 %), nachgewiesen. Alle anderen Bakterienarten kamen mit einer relativen Häufigkeit von weniger als 10 % vor. Neben Streptococcus equi ssp. zooepidemicus zählt auch Streptococcus dysgalactiae ssp. equisimilis zu den β-hämolysierenden Streptokokken. Zusammen kamen sie in der vorliegenden Studie mit einer Häufigkeit von 24 % vor. Dies bestätigt die Ergebnisse von LEIDL et al. (1976), TILLMANN et al. (1982), MERKT et al. (1987), NIELSEN (2005), RIDDLE et al. (2007) sowie FRONTOSO et al. (2008), bei denen auch die β-hämolysierenden Streptokokken die am häufigsten nachgewiesenen Bakterien waren. Während nach Literaturangaben das Verhältnis von Streptococcus equi ssp. zooepidemicus zu Streptococcus dysgalactiae ssp. equisimilis etwa 9 zu 1 beträgt (BOCKLISCH et al. 1988, PLAGEMANN 1988), lag es in der vorliegenden Arbeit bei 4 zu 1. In den meisten Studien wird allerdings nicht zwischen den verschiedenen β-hämolysierenden Streptokokken unterschieden (HUCHZERMEYER 2003, NIELSEN 2005, FRONTOSO et al. 2008, LEBLANC et al. 2007, RIDDLE et al. 2007, NEUBERG 2009). Lediglich ALBIHIN et al. (2003) haben in ihrer Studie 5 von 31 β-hämolysierenden Streptokokken weiter differenziert. Es handelte sich viermal um Streptococcus equi ssp. zooepidemicus und einmal um Streptococcus dysgalactiae ssp. equisimilis. Diese Werte entsprechen den Ergebnissen der vorliegenden Studie. Im Widerspruch dazu stehen allerdings die Ergebnisse von PROIETTI et al. (2011), in deren Studie das Verhältnis von Streptococcus equi ssp. zooepidemicus zu Streptococcus dysgalactiae ssp. equisimilis etwa 16 zu 1 betrug. Die α-hämolysierenden Streptokokken zählen zu den apathogenen Bakterien und wurden in dieser Arbeit mit 15 % am zweithäufigsten nachgewiesen. Dies stimmt mit den Ergebnissen von HINRICHS (1988) und NEUBERG (2009) überein, bei denen 125 Diskussion die α-hämolysierenden Streptokokken mit einer Häufigkeit von 14 bzw. 17 % vorkamen. Im Widerspruch dazu stehen allerdings die Ergebnisse der Studien von HUCHZERMEYER (2003) und ALBIHIN et al. (2003), bei denen der Nachweis αhämolysierender Streptokokken mit einer Häufigkeit von 5 bzw. 1 % erfolgte. Die Diskrepanz der Ergebnisse ist vermutlich durch unterschiedliche mikrobiologische Untersuchungsverfahren und Bewertungskriterien bedingt, da zum Teil das geringgradige Wachstum von apathogenen Bakterien als Kontamination angesehen und daher nicht bei den Ergebnissen aufgeführt wird (NIELSEN 2005, FRONTOSO et al.2008). Der Nachweis von E. coli erfolgte in der vorliegenden Studie mit einer Häufigkeit von 13 %. Während in den meisten Studien die β-hämolysierenden Streptokokken am häufigsten nachgewiesen wurden (TILLMANN et al. 1982, MERKT et al. 1987, NIELSEN 2005, FRONTOSO et al. 2008), erfolgte bei ALBIHIN et al. (2003), LEBLANC et al. (2007) sowie NEUBERG (2009) am häufigsten der Nachweis von E. coli. Die Nachweishäufigkeit lag insgesamt zwischen 0 % (HINRICHS et al. 1988, HUCHZERMEYER 2003) und 54 % (ALBIHIN et al. 2003). Vermutlich sind mehrere Faktoren wie beispielsweise unterschiedliche Entnahmetechniken, unterschiedliche mikrobiologische Untersuchungsverfahren und Bewertungskriterien sowie unterschiedliche Anteile fertiler und infertiler Stuten an der Fallzahl für die divergierenden Ergebnisse verantwortlich. Zu beachten ist außerdem, dass bei den Studien, in denen häufiger E. coli als β-hämolysierende Streptokokken nachgewiesen wurden (ALBIHIN et al. 2003, LEBLANC et al. 2007, NEUBERG 2009), die Probenentnahme so durchgeführt wurde, dass es vermehrt zu Kontaminationen kommen konnte. So erfolgte bei LEBLANC et al. (2007) die Probenentnahme durch Uterusspülungen mit geringem Volumen und bei ALBIHIN et al. (2003) sowie NEUBERG (2009) zwar mit doppelt geschützten Tupfern, aber manuell transvaginal. Bei den Untersuchungen von HINRICHS et al. (1988) an fertilen Stuten erfolgte die Probenentnahme allerdings auch manuell transvaginal mit doppelt geschützten Tupfern und E. coli wurde in keiner Probe nachgewiesen. Es wurden dabei jedoch keine Angaben gemacht, ob ein geringgradiges Wachstum von 126 Diskussion E. coli als Kontamination gewertet wurde, wie es zum Beispiel bei NIELSEN (2005) und FRONTOSO et al. (2008) der Fall war. NEUBERG (2009) geht davon aus, dass der häufigere Nachweis von E. coli im Vergleich zu β-hämolysierende Streptokokken in seiner Studie durch die zahlreichen Untersuchungen von Kontrolltupfern im Anschluss an antibiotische Behandlungen von β-hämolysierendem Streptokokken bedingt ist. Dies könnte zu einem reduzierten Nachweis von β-hämolysierenden Streptokokken geführt haben (NEUBERG 2009). Zu den koagulasenegativen Staphylokokken zählen unter anderem Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus saprophyticus sowie Staphylococcus hominis. Ihnen fehlt, wie der Name dieser Gruppe bereits verrät, die Koagulase, ein wichtiger Virulenzfaktor der Staphylokokken. Bisher konnte lediglich Staphylococcus epidermidis im Uterus von Stuten nachgewiesen werden (HINRICHS et al. 1988, HUCHZERMEYER 2003). In der vorliegenden Studie erfolgte der Nachweis von koagulasenegativen Staphylokokken mit einer Häufigkeit von 11 %. Dieser Wert liegt, verglichen mit den Ergebnissen anderer Studien (WINGFIELD DIGBY und RICKETTS 1982, HINRICHS et al. 1988, HUCHZER-MEYER 2003, FRONTOSO et al. 2008), in denen koagulasenegative Staphylokokken gar nicht (HUCHZERMEYER 2003) oder mit einer Häufigkeit bis 26 % (WINGFIELD DIGBY und RICKETTS 1982) nachgewiesen wurden, im mittleren Bereich. Vermutlich sind neben der Entnahmetechnik Untersuchungsverfahren und auch unterschiedliche Bewertungskriterien ein mikrobiologische Hauptgrund für die divergierenden Ergebnisse. Vulvabefunde Die Stellung und der Schluss der Vulva können in Befundkategorien eingeteilt werden. Stuten der Kategorie 1 weisen einen physiologischen Zustand der Vulva auf, während Stuten der Kategorie 2 mittelgradige und Stuten der Kategorie 3 hochgradige Abweichungen zum physiologischen Zustand zeigen (s. Kap. 3.3). 127 Diskussion Mit den Angaben in der Literatur übereinstimmend wiesen in der vorliegenden Studie Stuten mit zunehmendem Alter häufiger einen mangelhaften Schamschluss sowie eine mangelhafte Stellung der Vulva auf als jüngere Stuten (EASLEY 1993, HANDLER 2005, PASCOE 2006). Durch die schwächer werdende Muskulatur älterer Stuten sinkt der Anus weiter nach kranial und die Vulva geht von ihrer vertikalen in eine mehr horizontale Position über (EASLEY 1993, PASCOE 2006). Dies begründet die vermehrten Vulvabefunde der Kategorie 2 und 3 bei älteren Stuten. Erwartungsgemäß hatten in der vorliegenden Arbeit Stuten der Kategorie 2 und 3 häufiger positive bakteriologische Befunde als Stuten der Kategorie 1. Dies entspricht den Angaben in der Literatur und lässt sich durch Kontaminationen der kaudalen Abschnitte der Genitalorgane mit Bakterien aus der Außenwelt erklären. Die bakteriellen Kontaminationen resultieren dabei aus einer Beeinträchtigung der ersten schützenden Barriere des Genitaltraktes gegen die Außenwelt und können im Uterus zu aszendierenden Infektionen führen (EASLEY 1993, PASCOE 2006). Zyklusstand LEBLANC et al. (1989) gingen davon aus, dass sich die bakterielle Besiedlung des Uterus bei der Stute im Östrus von der im Diöstrus unterscheidet. Diese Annahme konnte durch die Ergebnisse von HINRICHS et al. (1988) und HUCHZERMEYER (2003) nicht bestätigt werden. Auch in der vorliegenden Arbeit konnte kein Unterschied in der bakteriellen Besiedlung des Uterus zwischen Östrus und Diöstrus festgestellt werden. 128 Diskussion 5.5 Ausblick und Fazit für die Praxis Die Ergebnisse der vorliegenden Studie führen zu der Annahme, dass der Uterus bei Fohlen eine physiologische bakterielle Mischflora aufweisen kann. Um die Frage zu beantworten, ob bei adulten Stuten der gesunde Uterus steril ist oder auch eine bakterielle Mischflora aufweist, müssen weitere Untersuchungen durchgeführt werden. Da mit den klassischen kulturellen Methoden eine eindeutige Beantwortung dieser Fragestellung jedoch nicht möglich scheint, sollten zusätzlich kulturunabhängige molekularbiologische Untersuchungsmethoden gewählt werden, mit denen auch geringe Anzahlen nicht kultivierbarer Bakterien nachgewiesen werden können. Bei den kulturunabhängigen Methoden wird die DNA direkt aus den Tupfern gewonnen. Zu beachten ist hierbei, dass DNA-freie Tupfer für die Probenentnahme verwendet werden müssen. Da es sich zum Teil um sehr geringe Mengen an Ausgangs-DNA handelt, muss sowohl die Nukleinsäure-Extraktion als auch die anschließende PCR bereits kleinste DNA-Mengen erfassen. Ein häufiges Problem ist dabei, dass die hochsensitive PCR dann auch kleinste Mengen kontaminierender DNA amplifiziert und anschließend eine Unterscheidung zwischen tatsächlichen Ergebnissen und Kontaminationen nicht mehr möglich ist (BORST et al. 2004). Derartige kulturunabhängige Untersuchungsmethoden lassen sich daher nur in speziell ausgestatteten Laboren mit erfahrenem Personal durchführen und sind nicht nur sehr aufwändig, sondern auch sehr teuer. Auch in bestimmten Kompartimenten des menschlichen Körpers, von denen früher angenommen wurde, dass sie steril seien, konnte erst mit kulturunabhängigen Untersuchungen eine physiologische bakterielle Besiedlung nachgewiesen werden (TONNAER et al. 2009, HUANG et al. 2010, MLADINA et al. 2010, ERBDOWNWARD et al. 2011). Auch für die kulturunabhängigen Untersuchungen sollte bei den Stuten vor der Probenentnahme ein Vorbericht aufgenommen und eine gynäkologische Untersuchung durchgeführt werden. Des Weiteren sollte auch parallel eine 129 Diskussion zytologische Untersuchung erfolgen, um ein reaktionsfreies oder ein entzündliches Endometrium festzustellen. Nur so können gezielte Aussagen über das Keimspektrum gesunder, anamnestisch auffälliger sowie klinisch auffälliger Stuten getroffen werden. Als Fazit für die Praxis ergibt sich aus der vorliegenden Studie, dass auch bei doppelt geschützten Uteruskulturtupfern die Probenentnahme mit Hilfe eines Spekulums und einer Zervixfasszange angezeigt ist, um Kontaminationen zu vermeiden. Differentialdiagnostisch müssen bei positiven bakteriologischen Befunden im Rahmen einer Untersuchung der Geschlechtsgesundheit jedoch immer Kontaminationen mit in Betracht gezogen werden. Daher sollte zur Beurteilung des Endometriums auch stets eine parallele zytologische Untersuchung erfolgen. 130 Zusammenfassung 6 Zusammenfassung Mareike Täte (2011): Kulturelle sowie 16S rDNA basierte Untersuchungen der aeroben und anaeroben Keimflora des equinen Uterus Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den equinen Uterus von Fohlen und gesunden adulten Stuten auf das Vorkommen einer physiologischen bakteriellen Besiedlung zu untersuchen. Des Weiteren wurde das bakterielle Keimspektrum anamnestisch sowie klinisch auffälliger Stuten analysiert und die apathogenen sowie anaeroben Bakterien des equinen Uterus näher bestimmt. Um aussagekräftige bakteriologische Ergebnisse zu gewährleisten, wurde der Vorgang der Probenentnahme Kontaminationsquellen geprüft. und Sowohl Probenverarbeitung bei der Prüfung der auf mögliche Sterilität der Uteruskulturtupfer als auch bei der Überführung des Tupfers in das Transportmedium und dem anschließenden Transport konnten keine Kontaminationsquellen aufgezeigt werden. Zusätzlich wurde die manuelle transvaginale Entnahmetechnik mit der Entnahme mit Spekulum und Zervixfasszange unter Verwendung von doppelt geschützten Tupfern miteinander verglichen. Bei der manuellen transvaginalen Entnahme konnten signifikant häufiger (p < 0,0001) Bakterien nachgewiesen werden als bei der Entnahme mit Spekulum und Zervixfasszange. Auch bei doppelt geschützten Uteruskulturtupfern ist demnach die Probenentnahme mit Hilfe eines Spekulums und einer Zervixfasszange angezeigt, um Kontaminationen zu vermeiden. Von 16 Fohlen, 17 zwei- und dreijährigen Maidenstuten, 15 güsten Stuten, 14 umrossenden Stuten, 11 Stuten, die resorbiert haben, sowie 15 klinisch auffälligen Stuten wurden Uterustupferproben auf aerobe, mikroaerophile und anaerobe Bakterien untersucht. Die parallele Entnahme und Bewertung einer zytologischen Probe erlaubte die sichere Feststellung eines reaktionsfreien bzw. entzündlichen 131 Zusammenfassung Endometriums. Von den apathogenen sowie anaeroben Bakterien, die in der Mikrobiologie nicht identifiziert wurden, erfolgte eine 16S rDNA basierte molekularbiologische Untersuchung. Die Bakterien, die auch über ihre 16S rDNA Sequenz nicht bestimmt werden konnten, wurden taxonomisch durch die Erstellung eines phylogenetischen Baumes eingeordnet. Während bei den Maidenstuten nur in 11,8 % der Proben Bakterien nachgewiesen werden konnten, waren bei den Fohlen 62,5 % der bakteriologischen Untersuchungen positiv. Diese Ergebnisse und die zugleich stets negative zytologische Untersuchung führen zu der Annahme, dass der Uterus von Fohlen eine permanente physiologische Mischflora aus aeroben und anaeroben Bakterien aufweisen kann. Bei gesunden adulten Stuten konnten keine neuen Erkenntnisse bezüglich des Vorkommens einer physiologischen Keimflora gewonnen werden. Die Gruppen der anamnestisch auffälligen Stuten wiesen in 13,3 % bis 36,4 % der Fälle einen positiven bakteriologischen Befund auf und lediglich in 2 Proben konnten vermehrt neutrophile Granulozyten nachgewiesen werden. Bei den klinisch auffälligen Stuten erfolgte aus jeder Probe ein Bakteriennachweis und 37,5 % der zytologischen Untersuchungen waren positiv. Erwartungsgemäß wurden in dieser Gruppe signifikant häufiger fakultativ pathogene Bakterien ohne apathogene Begleitflora nachgewiesen als in den anderen Versuchsgruppen. Die am häufigsten nachgewiesenen fakultativ pathogenen Bakterien waren, mit den Angaben in der Literatur übereinstimmend, die β-hämolysierenden Streptokokken. Die zehnmal nachgewiesenen anaeroben Bakterien stammten alle von den Tupfern der Fohlen und der Maidenstuten. Nach den Ergebnissen der vorliegenden Studie sind anaerobe Bakterien also weder bei anamnestisch noch bei klinisch auffälligen Stuten von Bedeutung. Bei den molekularbiologisch untersuchten Bakterien handelte es sich um ubiquitär vorkommende Bakterien, die zum Teil im Rahmen opportunistischer Infektionen erwähnt werden und häufig ein Bestandteil der Normalflora beim Menschen oder beim Tier sind. Mit der vorliegenden Arbeit wurde außerdem erstmalig ein Datensatz mit partiellen 16S rDNA Sequenzen equiner uteriner Bakterien aufgebaut. 132 Summary 7 Summary Mareike Täte (2011): Examinations of the aerobic and anaerobic bacterial flora of the equine uterus via cultures or based on 16S rDNA The aim of the present work was to examine the equine uterus of foals and healthy adult mares with regard to the existence of a physiological bacterial colony. A further aim was to analyse the range of bacterial germs in mares with a history of fertility problems or with clinical evidence of endometritis. In order to ensure meaningful bacteriological results the process of sample taking and sample processing was checked for potential contamination sources. Neither the sterility control of the endometrial swab nor the transfer of the swab into the transport medium and the subsequent transportation was able to disclose any contamination sources. In addition a comparison was made between the manual transvaginal sampling technique and the sampling with speculum and cervical forceps using double-guarded uterine swabs. With manual transvaginal sampling bacteria were identified significantly more often (p < 0.0001) than with sampling using speculum and cervical forceps. So even with double-guarded endometrial swabs it is advisable to sample using speculum and cervical forceps in order to avoid contamination. Endometrial swab samples of 16 foals, 17 two- or three-year-old maiden mares, 15 barren mares, 14 repeat-breeding mares, 11 mares that have resorbed as well as 15 mares with clinical evidence of endometritis were examined for aerobic, microaerophilic and anaerobic bacteria. Parallel sampling and assessment of a cytological smear allowed to safely conclude whether the endometrium was reactionfree or inflammatory. The apathogenic as well as the anaerobic bacteria that remained unidentified by microbiology underwent a 16S rDNA-based examination with molecular biology methods. The bacteria that could not be identified even by 133 Summary using their 16S rDNA sequence were classified taxonomically by creating a phylogenetic tree. While in the case of maiden mares bacteria were identified in only 11.8% of the samples, 62.5% of the bacteriologies of the foals were positive. These results along with the always negative cytology lead to the assumption that the uterus of foals may show a permanently physiological flora of a mix of aerobic and anaerobic bacteria. In the case of healthy adult mares no new knowledge was gained in terms of the existence of a physiological bacterial flora. In 13.3% to 36.4% of the cases, the groups of mares with a history of fertility problems showed a positive bacteriology and only 2 samples showed an increase of neutrophile granulocytes. For the mares with clinical evidence of endometritis bacteria were detected in every sample and 37.5% of the cytologies were positive. As was expected this group showed significantly more facultatively pathogenic bacteria without an accompanying apathogenic flora than did the other trial groups. The facultatively pathogenic bacteria that were detected the most often were, in accordance with information from the literature, β-haemolysing streptococci. The anaerobic bacteria that were detected ten times all originated from the swabs of the foals and maiden mares. According to the results of this study anaerobic bacteria are of no importance for either mares with a history of fertility problems or those with clinical evidence of endometritis. The bacteria examined with molecular biology methods were ubiquitously existing bacteria, some of which are mentioned in connection with opportunistic infections and are often part of the normal flora in humans or animals. This work also serves to establish for the first time a dataset with partial 16S rDNA sequences of equine uterine bacteria. 134 Literaturverzeichnis 8 Literaturverzeichnis AGUILAR, J., M. HANKS, D. J. SHAW, R. ELSE u. E. WATSON (2006): Importance of using guarded techniques for the preparation of endometrial cytology smears in mares Theriogenology 66, S. 423-430 ALBIHIN, A., V. BAVERUD u. U. MAGNUSSON (2003): Uterine microbiology and antimicrobial susceptibility in isolated bacteria from mares with fertility problems Acta Vet. Scand. 44, S. 121-128 ALEXANDER, C. J., D. M. CITRON, S. HUNT GERADO, M. C. CARLOS, D. TALAN u. E. J. GOLDSTEIN (1997): Characterization of saccharolytic Bacteroides and Prevotella isolates from infected dog and cat bite wounds in humans J. Clin. Microbiol. 35, S. 406-411 ALLEN, W.E. u. J. R. NEWCOMBE (1979): Aspects of genital infection and swabbing techniques in the mare Vet. Rec. 104, S. 228-231 AMANN, R.I., W. LUDWIG u. K. H. 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FORNEY (2004): Characterization of vaginal microbial communities in adult healthy women using cultivation-independent methods Microbiol. 150, S. 2565-2573 157 Anhang 9 Anhang 9.1 Laborgeräte ○ ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer, Applied Biosystems, Darmstadt ○ ABI PRISM® DNA Analysis Software Version 3.7, Applied Biosystems, Darmstadt ○ Elektrophorese Power Pack P25, Biometra, Göttingen ○ Extraktionsautomat, MicrolabStar, Hamilton, Bonaduz, Schweiz ○ Heizblock SBH 139 DC, Stuart, England ○ Kapillarsäule 500 bp, Applied Biosystems, Darmstadt ○ PCR-Sicherheitswerkbank, Kojair Tech Oy, Vilppula, Finnland ○ Pipetten ○ 0,1 - 2,5 μl PreCision, Biozym, Hess. Oldendorf ○ 0,5 - 10 μl Proline, Biohit, Helsinki, Finnland ○ 5 - 50 μl Proline, Biohit, Helsinki, Finnland ○ 50 - 200 μl PreCision, Biozym, Hess. Oldendorf ○ 100 - 1000 μl PreCision, Biozym, Hess. Oldendorf ○ Thermocycler T 3000, Biometra, Göttingen ○ Zentrifuge 5417C, Eppendorf, Hamburg 9.2 Verbrauchsmaterialien ○ BigDye®Terminator v3.1 Chemie, Applied Biosystems, Darmstadt ○ ExoSap-IT®, USB, Cleveland, Ohio, USA ○ MicroSeq® 500 16S rDNA PCR Kit, Applied Biosystems, Darmstadt ○ MicroSeq® 500 16S rDNA Seq Kit, Applied Biosystems, Darmstadt ○ NucleoSpin® 96 Tissue Kit, Macherey-Nagel, Düren ○ PCR Soft Tube 0,2 ml, Biozym, Hess. Oldendorf 158 Anhang ○ Performa® DTR Gel Filtration Cartridges, Edgebio, Gaithersburg, USA ○ Pipettenspitzen ○ 10 μl Safe Seal-Tips, Biozym, Hess. Oldendorf ○ 12,5 μl Tips, Matrix Technologies Corp., Hudson, USA ○ 50 μl nerbe plus, nerbe, Winsen/Luhe ○ 200 μl Safe Seal-Tips, Biozym, Hess. Oldendorf ○ 1250 μl Safe Seal Tips Professional, Biozym, Hess. Oldendorf ○ Reaktionsgefäße 2,0 ml, Biozym, Hess. Oldendorf ○ Reaktionsgefäße 1,5 ml, Edgebio, Gaithersburg, USA 9.3 Chemikalien ○ Agarose, Amresco, Solon, USA ○ Bindungs-Puffer, Macherey-Nagel, Düren ○ DNA-Größenmarker, Amresco, Solon, USA ○ E. coli DNA-Lösung, Applied Biosystems, Darmstadt ○ EDTA-Na2, Carl Roth GmbH & Co., Karlsruhe ○ Elutionspuffer, Macherey-Nagel, Düren ○ Essigsäure 1 %ig, Merck, Darmstadt ○ Exonuklease I, USB, Cleveland, Ohio, USA ○ Ethanol 96 %ig, Merck, Darmstadt ○ Ethidiumbromid, Sigma Chemical Co., St. Louis, USA ○ HPLC-Wasser, Merck, Darmstadt ○ Lyse-Puffer, Macherey-Nagel, Düren ○ Nukleasefreies Wasser, Applied Biosystems, Darmstadt ○ Probenpuffer, Amresco, Solon, USA ○ Proteinase K, Macherey-Nagel, Düren ○ Shrimp Alkaline Phosphatase, USB, Cleveland, Ohio, USA ○ Tris, AppliChem GmbH, Darmstadt ○ Wasch-Puffer, Macherey-Nagel, Düren 159 Anhang 9.4 Puffer und Lösungen ○ EDTA-Na2-Lsg- 0,5 mol/l (pH 8,0) ○ EDTA-Na2 186,1 g ○ Aqua dest. ad 800 ml ○ Auf pH 8,0 einstellen ○ Aqua dest. ad 1000 ml ○ 15 min bei 121°C autoklavieren. ○ Gel ○ Agarose 2,25 g ○ TAE-Laufpuffer 75 ml ○ TAE-Laufpuffer ○ TAE-Puffer 1 ml ○ Aqua dest. ad 50 ml ○ TAE-Puffer ○ Tris 242g ○ Essigsäure 57 ml 9.5 Nährmedien ○ Blutagar ○ Columbia-Blutagar mit Schafblut ○ Schaedler-Agar o Schaedler II Aqua dest. 1000 ml Schaedler-Agar 41,9 g Agar 1g 1%ige Vitamin K1-Lsg 1 ml Rinderblut 40 ml 160 Anhang o Schaedler IV Aqua dest. 1000 ml Schaedler-Agar 41,9 g Agar 1g 1 %ige Vitamin K1-Lsg 1 ml Rinderblut 50 ml Kanamycin-Lsg 4 ml 4 ml Vancomycin-Lsg 4 ml ○ Nährbouillon o Aqua dest: 1000 ml o NaCl 5g o Pepton 10 g o Fleischextrakt 10 g o NaOH 1,5 ml ○ Thioglycolatbouillon o Aqua dest: 1000 ml o Thioglycolat Nährboden 29,5 g ○ Agar, Oxoid Deutschland GmbH, Wesel ○ Columbia-Blutagar mit Schafblut, Oxoid Deutschland GmbH, Wesel ○ Fleischextrakt, Becton Dickinson GmbH, Heidelberg ○ Kanamycin-Lsg AppliChem GmbH, Darmstadt ○ Pepton, Difco, Kansas, USA ○ Rinderblut, WDT Wirtschaftsgenossenschaft Deutscher Tierärzte eG, Garbsen ○ Schaedler-Agar, Becton Dickinson GmbH, Heidelberg ○ Thioglycolat Nährboden, Oxoid Deutschland GmbH, Wesel ○ Vancomycin-Lsg AppliChem GmbH, Darmstadt ○ 1%ige Vit K1-Lsg, Carl Roth, Karlsruhe 161 Anhang 9.6 Tabellenverzeichnis Tab. 1: Untersuchungsparameter der gynäkologischen Untersuchung ............... 48 Tab. 2: Diff-Quick®-Färbung ................................................................................ 61 Tab. 3: PCR-Amplifikationsbedingungen ............................................................. 63 Tab. 4: Cycle-PCR-Amplifikationsbedingungen ................................................... 65 Tab. 5: Versuchsgruppen und Alter der Probanden (n = 88) ............................... 70 Tab. 6: Absolute und relative Häufigkeit der nachgewiesenen Bakterienarten in den Uterustupferproben (n = 93) .......................................................... 72 Tab. 7: Ergebnis der zytologischen Untersuchung in Bezug zu dem Ergebnis der bakteriologischen Untersuchung (n = 88) .......................................... 85 Tab. 8: Ergebnis der bakteriologischen Untersuchung in Bezug zur VulvaBefundkategorie (n = 57) ......................................................................... 87 Tab. 9: Ergebnis der zytologischen Untersuchung (ZU) in Bezug zur VulvaBefundkategorie (n = 57) ......................................................................... 88 Tab. 10: Ergebnis der bakteriologischen Untersuchung in Bezug zum Zyklusstand (n = 57) ................................................................................ 89 Tab. 11: Ergebnis der zytologischen Untersuchung (ZU) in Bezug zum Zyklusstand (n = 57) ................................................................................ 89 Tab. 12: Vulva-Befundkategorie in Bezug zum Alter (n = 57) ................................ 90 Tab. 13: Versuchsgruppen bei der Probenentnahme unter Handschutz (n = 27) .. 91 Tab. 14: Angaben zu den molekularbiologisch untersuchten Bakterien (n = 40) ... 93 Tab. 15: 16S rDNA basierte Bestimmung der Bakterienart (n = 22) ...................... 97 Tab. 16: 16S rDNA basierte Bestimmung der Bakteriengattung (n = 11) .............. 98 Tab. 17: Bakterienisolate, die nicht über ihre 16S rDNA bestimmt werden konnten (n = 7) ........................................................................................ 98 162 Anhang 9.7 Abbildungsverzeichnis Abb. 1: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus .................................... 45 Abb. 2: Uteruskulturtupfer für Stuten .................................................................... 51 Abb. 3: Zytologiebürste für Stuten ........................................................................ 52 Abb. 4: Röhrenspekulum...................................................................................... 52 Abb. 5: Gefensterter Uterus eines 1 Tag alten Fohlens in situ mit Tupfer sowie Spekulum nach Eröffnung der Bauchhöhle und Entnahme des Darmes .................................................................................................... 53 Abb. 6: Eröffneter Uterus eines 1 Tag alten Fohlens ........................................... 54 Abb. 7 Spreizspekulum nach Polansky und Zervixfasszange nach Götze .......... 55 Abb. 8: Ausschnitt aus einem mit der ABI PRISM® DNA Analysis Software geöffnetem Chromatogramm ................................................................... 66 Abb. 9: Ergebnis der bakteriologischen Untersuchung der Uterustupferproben (n = 88) .................................................................................................... 71 Abb. 10: Nachweis von fakultativ pathogenen Bakterienarten in Uterustupferproben und deren Verteilung (n = 20) .................................. 73 Abb. 11: Absolute Häufigkeit der in den Uterustupferproben nachgewiesenen apathogenen Bakterienarten [Sc. = Streptokokken, Staph. = Staphylokokken, sp. = spezies] (n = 71).................................... 74 Abb. 12: Absolute Häufigkeit der in Uterustupferproben nachgewiesenen Bakterienarten mit mittlerem und hohem Keimgehalt (n = 7) ................... 75 Abb. 13: Ergebnis der bakteriologischen Untersuchung der Uterustupferproben von den Fohlen (n = 16) .............................................................. 76 Abb. 14: Ergebnis der bakteriologischen Untersuchung der Uterustupferproben von Maidenstuten (n = 17) ........................................................... 77 Abb. 15: Ergebnis der bakteriologischen Untersuchung der Uterustupferproben von den Stuten, die resorbiert haben (n = 11), und den güsten (n = 15) sowie den umrossenden Stuten (n = 14) .................................... 78 Abb. 16: Ergebnis der bakteriologischen Untersuchung der Uterustupferproben von den klinisch auffälligen Stuten (n = 15) ................................. 79 163 Anhang Abb. 17: Ergebnis der Versuchsgruppen bei der bakteriologischen Untersuchung der Uterustupferproben (n = 88) ....................................... 80 Abb. 18: Verteilung der in den Uterustupferproben nachgewiesenen anaeroben Bakterien auf die Versuchsgruppen (n = 10) ........................................... 81 Abb. 19. Endometriumzytologie von einer Stute im Östrus. Dargestellt sind Endometriumzellen (1) und neutrophile Granulozyten (2) ....................... 82 Abb. 20: Endometriumzytologie von einer Stute im Östrus. Dargestellt ist eine Nesterbildung der Endometriumzellen ..................................................... 83 Abb. 21: Endometriumzytologie von einer Stute mit Endometritis. Dargestellt sind segmentkernige neutrophile Granulozyten ....................................... 83 Abb. 22: Verteilung der positiven zytologischen Untersuchungen auf die Versuchsgruppen (n = 8) ......................................................................... 84 Abb. 23: Anzahl positiver bakteriologischer (BU, n = 35) und zytologischer Untersuchungen (ZU, n = 8) in Bezug zu den Versuchsgruppen............. 86 Abb. 24: Ergebnis der bakteriologischen Untersuchung der Uterustupferproben, die mit Spekulum (n = 88) oder unter Handschutz genommen wurden (n = 27) .................................................................................................... 92 Abb. 25: Anzahl molekularbiologisch untersuchter Bakterienisolate pro Versuchsgruppe (n = 40) ......................................................................... 94 Abb. 26: Darstellung der Amplifikationsprodukte der partiellen 16S rDNA PCR in der Agarosegelelektrophorese [bp = Basenpaare] ............................... 95 Abb. 27: Distanzbasierter phylogenetischer Stammbaum der Isolate 3, 7 und 40. Vor den Artnamen sind die Zugangsnummern der NCBIDatenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) angegeben........................... 100 Abb. 28: Distanzbasierter phylogenetischer Stammbaum des Isolats 18. Vor den Artnamen sind die Zugangsnummern der NCBI-Datenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) angegeben. ............................................ 101 Abb. 29: Distanzbasierter phylogenetischer Stammbaum des Isolats 25. Vor den Artnamen sind die Zugangsnummern der NCBI-Datenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) angegeben. ............................................ 102 164 Anhang Abb. 30: Distanzbasierter phylogenetischer Stammbaum des Isolats 30. Vor den Artnamen sind die Zugangsnummern der NCBI-Datenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) angegeben. ............................................ 103 Abb. 31: Distanzbasierter phylogenetischer Stammbaum des Isolats 38. Vor den Artnamen sind die Zugangsnummern der NCBI-Datenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) angegeben. ............................................ 104 165 Anhang 9.8 DNA Sequenzen 1 forward/1 reverse Score = 920 bits (498), Expect = 0.0 Identities = 498/498 (100%), Gaps = 0/498 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 498 Query 61 Sbjct 438 Query 121 Sbjct 378 Query 181 Sbjct 318 Query 241 Sbjct 258 Query 301 Sbjct 198 Query 361 Sbjct 138 Query 421 Sbjct 78 Query 481 Sbjct 18 GAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTGGAACGCATTTATAACTACCGTAGCTTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTGGAACGCATTTATAACTACCGTAGCTTG 60 CTACAACTGCTATAAATGAGTCGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTTTAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTACAACTGCTATAAATGAGTCGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTTTAA 120 GCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAAAAGGAGCTAACCCATGTTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAAAAGGAGCTAACCCATGTTA 180 GCTTTTTAAAAGGTGCAACAGCATCACTTAAAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTTTTTAAAAGGTGCAACAGCATCACTTAAAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTG 240 GTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCTTCGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCTTCGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCAC 300 ACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAA 360 TGGGGGGAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGGGGGGAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGC 420 TCTGTTATAAGCGAAGAACAGGAGTAAGAGTGGAAAATTTACTCTATGACGGTAGCTTAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCTGTTATAAGCGAAGAACAGGAGTAAGAGTGGAAAATTTACTCTATGACGGTAGCTTAT 480 CAGAAAGGGACGGCTAAC |||||||||||||||||| CAGAAAGGGACGGCTAAC 439 379 319 259 199 139 79 19 498 1 2 forward/2 reverse Score = 924 bits (500), Expect = 0.0 Identities = 500/500 (100%), Gaps = 0/500 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 500 Query 61 Sbjct 440 Query 121 Sbjct 380 Query 181 Sbjct 320 Query 241 Sbjct 260 Query 301 Sbjct 200 Query 361 Sbjct 140 Query 421 Sbjct 80 Query 481 Sbjct 20 GAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGCTTCTTTTTCCACCGGAGCTTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGCTTCTTTTTCCACCGGAGCTTG 60 CTCCACCGGAAAAAGAGGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTCCACCGGAAAAAGAGGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATCA 120 GAAGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATAACAATCGACACCGCATGGTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAAGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATAACAATCGACACCGCATGGTG 180 TTGATTTGAAAGGCGCTTTCGGGTGTCGCTGATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTGATTTGAAAGGCGCTTTCGGGTGTCGCTGATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGT 240 TGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCCACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCCACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCC 300 ACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGC 360 AATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAA 420 ACTCTGTTGTTAGAGAAGAACAAGAGTGAGAGTAACTGTTCACTCCTTGACGGTATCTAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACTCTGTTGTTAGAGAAGAACAAGAGTGAGAGTAACTGTTCACTCCTTGACGGTATCTAA 480 CCAGAAAGCCACGGCTAACT |||||||||||||||||||| CCAGAAAGCCACGGCTAACT 500 1 166 441 381 321 261 201 141 81 21 Anhang 3 forward/3 reverse Score = 924 bits (500), Expect = 0.0 Identities = 500/500 (100%), Gaps = 0/500 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 500 Query 61 Sbjct 440 Query 121 Sbjct 380 Query 181 Sbjct 320 Query 241 Sbjct 260 Query 301 Sbjct 200 Query 361 Sbjct 140 Query 421 Sbjct 80 Query 481 Sbjct 20 CGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTGGAACGCAATTATTTCTACCGTAGCTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTGGAACGCAATTATTTCTACCGTAGCTT 60 GCTACACTTGAGATAATTGAGTCGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTTCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTACACTTGAGATAATTGAGTCGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTTCT 120 AGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAAGATTAGCTAACACATGTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAAGATTAGCTAACACATGTT 180 AGCTGATTAAAAGGGGCAACAGCTCCACTAGAAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGCTGATTAAAAGGGGCAACAGCTCCACTAGAAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTT 240 GGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCATCGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCATCGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCA 300 CACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCA 360 ATGGGGGGAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATGGGGGGAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAG 420 CTCTGTTATAAGCGAAGAACGGGAGTAAGAGTGGAAAATTTACTCTGTGACGGTAGCTTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTCTGTTATAAGCGAAGAACGGGAGTAAGAGTGGAAAATTTACTCTGTGACGGTAGCTTA 480 TCAGAAAGGGACGGCTAACT |||||||||||||||||||| TCAGAAAGGGACGGCTAACT 441 381 321 261 201 141 81 21 500 1 4 forward/4 reverse Score = 924 bits (500), Expect = 0.0 Identities = 500/500 (100%), Gaps = 0/500 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 500 Query 61 Sbjct 440 Query 121 Sbjct 380 Query 181 Sbjct 320 Query 241 Sbjct 260 Query 301 Sbjct 200 Query 361 Sbjct 140 Query 421 Sbjct 80 Query 481 Sbjct 20 GACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTGGAACGCAGTGAATTCACCGGAGCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTGGAACGCAGTGAATTCACCGGAGCT 60 TGCTCCACCGAATTGACTGAGTCGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTGCCTTGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGCTCCACCGAATTGACTGAGTCGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTGCCTTGT 120 AGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAACAACAGATGACACATGTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAACAACAGATGACACATGTT 180 AGCTGTTTGAAAGGAGCAATTGCTCCACTACGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGCTGTTTGAAAGGAGCAATTGCTCCACTACGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTT 240 GGTAGGGTAACGGCCTACCAAGGCTGCGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGTAGGGTAACGGCCTACCAAGGCTGCGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCA 300 CACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCA 360 ATGGGGGGAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATGGGGGGAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAG 420 CTCTGTTGTAAGAGAAGAACGTTAGTAAGAGTGGAAAGTTTACTAAGTGACGGTATCTTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTCTGTTGTAAGAGAAGAACGTTAGTAAGAGTGGAAAGTTTACTAAGTGACGGTATCTTA 480 CCAGAAAGGGACGGCTAACT |||||||||||||||||||| CCAGAAAGGGACGGCTAACT 500 1 167 441 381 321 261 201 141 81 21 Anhang 5 forward/5 reverse Score = 904 bits (489), Expect = 0.0 Identities = 489/489 (100%), Gaps = 0/489 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 489 Query 61 Sbjct 429 Query 121 Sbjct 369 Query 181 Sbjct 309 Query 241 Sbjct 249 Query 301 Sbjct 189 Query 361 Sbjct 129 Query 421 Sbjct 69 Query 481 Sbjct 9 GACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACGCTGAAGTCTGGTGCTTGCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACGCTGAAGTCTGGTGCTTGCA 60 CTAGACGGATGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTTATAGCGGGGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTAGACGGATGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTTATAGCGGGGG 120 ATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAACAGCTGTTAACACATGTTAATATGCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAACAGCTGTTAACACATGTTAATATGCT 180 TGAAAGGGACAACTGTCCCACTATAAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGAAAGGGACAACTGTCCCACTATAAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGG 240 TAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGG 300 ACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGG 360 GAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTT 420 GTAAGAGAAGAATGTTGGTGAGAGTGGAAAGTTCACCATGTGACGGTATCTTACCAGAAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTAAGAGAAGAATGTTGGTGAGAGTGGAAAGTTCACCATGTGACGGTATCTTACCAGAAA 480 GGGACGGCT ||||||||| GGGACGGCT 430 370 310 250 190 130 70 10 489 1 6 forward/6 reverse Score = 924 bits (500), Expect = 0.0 Identities = 500/500 (100%), Gaps = 0/500 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 500 Query 61 Sbjct 440 Query 121 Sbjct 380 Query 181 Sbjct 320 Query 241 Sbjct 260 Query 301 Sbjct 200 Query 361 Sbjct 140 Query 421 Sbjct 80 Query 481 Sbjct 20 GACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTGGAACGCAGTGAATTCACCGGAGCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTGGAACGCAGTGAATTCACCGGAGCT 60 TGCTCCACCGAATTGACTGAGTCGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTGCCTTGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGCTCCACCGAATTGACTGAGTCGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTGCCTTGT 120 AGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAACAACAGATGACACATGTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAACAACAGATGACACATGTT 180 AGCTGTTTGAAAGGAGCAATTGCTCCACTACGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGCTGTTTGAAAGGAGCAATTGCTCCACTACGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTT 240 GGTAGGGTAACGGCCTACCAAGGCTGCGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGTAGGGTAACGGCCTACCAAGGCTGCGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCA 300 CACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCA 360 ATGGGGGGAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATGGGGGGAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAG 420 CTCTGTTGTAAGAGAAGAACGTTAGTAAGAGTGGAAAGTTTACTAAGTGACGGTATCTTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTCTGTTGTAAGAGAAGAACGTTAGTAAGAGTGGAAAGTTTACTAAGTGACGGTATCTTA 480 CCAGAAAGGGACGGCTAACT |||||||||||||||||||| CCAGAAAGGGACGGCTAACT 500 1 168 441 381 321 261 201 141 81 21 Anhang 7 forward/7 reverse Score = 918 bits (497), Expect = 0.0 Identities = 497/497 (100%), Gaps = 0/497 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 497 Query 61 Sbjct 437 Query 121 Sbjct 377 Query 181 Sbjct 317 Query 241 Sbjct 257 Query 301 Sbjct 197 Query 361 Sbjct 137 Query 421 Sbjct 77 Query 481 Sbjct 17 GACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTGGAACGCTTGTTAATCACCGGAGCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTGGAACGCTTGTTAATCACCGGAGCT 60 TGCTCCATCGATTGACAAGAGTCGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTCTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGCTCCATCGATTGACAAGAGTCGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTCTT 120 AGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAACAATAGAGATCACATGAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAACAATAGAGATCACATGAA 180 CTTTATTTAAAAGGAGCAATTGCTTCACTAGGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTTTATTTAAAAGGAGCAATTGCTTCACTAGGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTA 240 GGTAGGGTAACGGCCTACCTAGGCTCCGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGTAGGGTAACGGCCTACCTAGGCTCCGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCA 300 CACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCA 360 ATGGGGGGAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATGGGGGGAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAG 420 CTCTGTTGTAAGAGAAGAATGTTGAGTAGAGTGGAAAGTTACTCAAGTGACGGTATCTTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTCTGTTGTAAGAGAAGAATGTTGAGTAGAGTGGAAAGTTACTCAAGTGACGGTATCTTA 480 CCAGAAAGGGACGGCTA ||||||||||||||||| CCAGAAAGGGACGGCTA 438 378 318 258 198 138 78 18 497 1 8 forward/8 reverse Score = 898 bits (486), Expect = 0.0 Identities = 486/486 (100%), Gaps = 0/486 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 486 Query 61 Sbjct 426 Query 121 Sbjct 366 Query 181 Sbjct 306 Query 241 Sbjct 246 Query 301 Sbjct 186 Query 361 Sbjct 126 Query 421 Sbjct 66 Query 481 Sbjct 6 GAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACGCTGAAGACTTTAGCTTGCTAAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACGCTGAAGACTTTAGCTTGCTAAA 60 GTTGGAAGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTGCCTACTAGCGGGGGATA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTTGGAAGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTGCCTACTAGCGGGGGATA 120 ACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAACAGCATTTAACACATGTTAGATGCTTGAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAACAGCATTTAACACATGTTAGATGCTTGAA 180 AGAAGCAATTGCTTCACTAGTAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGAAGCAATTGCTTCACTAGTAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAA 240 GGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTG 300 AGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGGCAAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGGCAAC 360 CCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTAA 420 GAGAAGAACGTGTGTGAGAGTGGAAAGTTCACACAGTGACGGTAACTTACCAGAAAGGGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAGAAGAACGTGTGTGAGAGTGGAAAGTTCACACAGTGACGGTAACTTACCAGAAAGGGA 480 CGGCTA |||||| CGGCTA 486 1 169 427 367 307 247 187 127 67 7 Anhang 9 forward/9 reverse Score = 902 bits (488), Expect = 0.0 Identities = 488/488 (100%), Gaps = 0/488 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 488 Query 61 Sbjct 428 Query 121 Sbjct 368 Query 181 Sbjct 308 Query 241 Sbjct 248 Query 301 Sbjct 188 Query 361 Sbjct 128 Query 421 Sbjct 68 Query 481 Sbjct 8 CGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACGCTGAAGACTTTAGCTTGCTAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACGCTGAAGACTTTAGCTTGCTAA 60 AGTTGGAAGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTGCCTACTAGCGGGGGAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGTTGGAAGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTGCCTACTAGCGGGGGAT 120 AACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAACAGCATTTAACACATGTTAGATGCTTGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAACAGCATTTAACACATGTTAGATGCTTGA 180 AAGAAGCAATTGCTTCACTAGTAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGAAGCAATTGCTTCACTAGTAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAA 240 CGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACT 300 GAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGGCAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGGCAA 360 CCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTA 420 AGAGAAGAACGTGTGTGAGAGTGGAAAGCTCACACAGTGACGGTAACTTACCAGAAAGGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGAGAAGAACGTGTGTGAGAGTGGAAAGCTCACACAGTGACGGTAACTTACCAGAAAGGG 480 ACGGCTAA |||||||| ACGGCTAA 429 369 309 249 189 129 69 9 488 1 10 forward/10 reverse Score = 922 bits (499), Expect = 0.0 Identities = 499/499 (100%), Gaps = 0/499 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 499 Query 61 Sbjct 439 Query 121 Sbjct 379 Query 181 Sbjct 319 Query 241 Sbjct 259 Query 301 Sbjct 199 Query 361 Sbjct 139 Query 421 Sbjct 79 Query 481 Sbjct 19 GACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTGGAACGCATTTATAACTACCGTAGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTGGAACGCATTTATAACTACCGTAGC 60 TTGCTACAACTGCTATAAATGAGTCGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTGCTACAACTGCTATAAATGAGTCGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTT 120 TAAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAAAAGGAGCTAACCCATG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TAAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAAAAGGAGCTAACCCATG 180 TTAGCTTTTTAAAAGGTGCAACAGCATCACTTAAAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTAGCTTTTTAAAAGGTGCAACAGCATCACTTAAAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAG 240 TTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCTTCGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCTTCGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGC 300 CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGG 360 CAATGGGGGGAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAATGGGGGGAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAA 420 AGCTCTGTTATAAGCGAAGAACAGGAGTAAGAGTGGAAAATTTACTCTATGACGGTAGCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGCTCTGTTATAAGCGAAGAACAGGAGTAAGAGTGGAAAATTTACTCTATGACGGTAGCT 480 TATCAGAAAGGGACGGCTA ||||||||||||||||||| TATCAGAAAGGGACGGCTA 499 1 170 440 380 320 260 200 140 80 20 Anhang 11 forward/11 reverse Score = 904 bits (489), Expect = 0.0 Identities = 489/489 (100%), Gaps = 0/489 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 489 Query 61 Sbjct 429 Query 121 Sbjct 369 Query 181 Sbjct 309 Query 241 Sbjct 249 Query 301 Sbjct 189 Query 361 Sbjct 129 Query 421 Sbjct 69 Query 481 Sbjct 9 CGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCACT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCACT 60 GGTCTAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGTCTAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGAT 120 AACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATGACAATAGGGTACACATGTACCCTATTTAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATGACAATAGGGTACACATGTACCCTATTTAA 180 AAGGGGCAAATGCTTCACTATGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTAAGGTAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGGGGCAAATGCTTCACTATGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTAAGGTAA 240 CGGCTTACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGGCTTACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACT 300 GAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGGGAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGGGAA 360 CCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTT 420 AGAGAAGAACGGTAATGGGAGTGGAAAATCCATTACGTGACGGTAACTAACCAGAAAGGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGAGAAGAACGGTAATGGGAGTGGAAAATCCATTACGTGACGGTAACTAACCAGAAAGGG 480 ACGGCTAAC ||||||||| ACGGCTAAC 430 370 310 250 190 130 70 10 489 1 12 forward/12 reverse Score = 902 bits (488), Expect = 0.0 Identities = 488/488 (100%), Gaps = 0/488 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 488 Query 61 Sbjct 428 Query 121 Sbjct 368 Query 181 Sbjct 308 Query 241 Sbjct 248 Query 301 Sbjct 188 Query 361 Sbjct 128 Query 421 Sbjct 68 Query 481 Sbjct 8 CGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCACT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCACT 60 GGTCTAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGTCTAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGAT 120 AACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATGACAATAGGGTACACATGTACCCTATTTAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATGACAATAGGGTACACATGTACCCTATTTAA 180 AAGGGGCAAATGCTTCACTATGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTAAGGTAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGGGGCAAATGCTTCACTATGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTAAGGTAA 240 CGGCTTACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGGCTTACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACT 300 GAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGGGAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGGGAA 360 CCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTT 420 AGAGAAGAACGGTAATGGGAGTGGAAAATCCATTACGTGACGGTAACTAACCAGAAAGGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGAGAAGAACGGTAATGGGAGTGGAAAATCCATTACGTGACGGTAACTAACCAGAAAGGG 480 ACGGCTAA |||||||| ACGGCTAA 488 1 171 429 369 309 249 189 129 69 9 Anhang 13 forward/13 reverse Score = 907 bits (491), Expect = 0.0 Identities = 491/491 (100%), Gaps = 0/491 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 491 Query 61 Sbjct 431 Query 121 Sbjct 371 Query 181 Sbjct 311 Query 241 Sbjct 251 Query 301 Sbjct 191 Query 361 Sbjct 131 Query 421 Sbjct 71 Query 481 Sbjct 11 GACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCA 60 CTGGTCTAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGGTCTAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGG 120 ATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATGACAATAGGGTACACATGTACCCTATTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATGACAATAGGGTACACATGTACCCTATTT 180 AAAAGGGGCAAATGCTTCACTATGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTAAGGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAAAGGGGCAAATGCTTCACTATGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTAAGGT 240 AACGGCTTACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AACGGCTTACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGA 300 CTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGGG 360 AACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTG 420 TTAGAGAAGAACGGTAATGGGAGTGGAAAATCCATTACGTGACGGTAACTAACCAGAAAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTAGAGAAGAACGGTAATGGGAGTGGAAAATCCATTACGTGACGGTAACTAACCAGAAAG 480 GGACGGCTAAC ||||||||||| GGACGGCTAAC 432 372 312 252 192 132 72 12 491 1 14 forward/14 reverse Score = 909 bits (492), Expect = 0.0 Identities = 492/492 (100%), Gaps = 0/492 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 492 Query 61 Sbjct 432 Query 121 Sbjct 372 Query 181 Sbjct 312 Query 241 Sbjct 252 Query 301 Sbjct 192 Query 361 Sbjct 132 Query 421 Sbjct 72 Query 481 Sbjct 12 GACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCA 60 CTGGTCTAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGGTCTAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGG 120 ATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATGACAATAGGGTACACATGTACCCTATTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATGACAATAGGGTACACATGTACCCTATTT 180 AAAAGGGGCAAATGCTTCACTATGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTAAGGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAAAGGGGCAAATGCTTCACTATGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTAAGGT 240 AACGGCTTACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AACGGCTTACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGA 300 CTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGGG 360 AACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTG 420 TTAGAGAAGAACGGTAATGGGAGTGGAAAATCCATTACGTGACGGTAACTAACCAGAAAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTAGAGAAGAACGGTAATGGGAGTGGAAAATCCATTACGTGACGGTAACTAACCAGAAAG 480 GGACGGCTAACT |||||||||||| GGACGGCTAACT 492 1 172 433 373 313 253 193 133 73 13 Anhang 15 forward/15 reverse Score = 922 bits (499), Expect = 0.0 Identities = 499/499 (100%), Gaps = 0/499 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 499 Query 61 Sbjct 439 Query 121 Sbjct 379 Query 181 Sbjct 319 Query 241 Sbjct 259 Query 301 Sbjct 199 Query 361 Sbjct 139 Query 421 Sbjct 79 Query 481 Sbjct 19 GAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTGGAACGCATTTATAACTACCGTAGCTTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTGGAACGCATTTATAACTACCGTAGCTTG 60 CTACAATTGGTATAAATGAGTCGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTTTAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTACAATTGGTATAAATGAGTCGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTTTAA 120 GCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAAAAGGAGCTAACCCATGTTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAAAAGGAGCTAACCCATGTTA 180 GCTTTTTAAAAGGTGCAACAGCATCACTTAAAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTTTTTAAAAGGTGCAACAGCATCACTTAAAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTG 240 GTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCTTCGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCTTCGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCAC 300 ACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAA 360 TGGGGGGAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGGGGGGAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGC 420 TCTGTTATAAGCGAAGAATAGGAGTAAGAGTGGAAAGTTTACTCTATGACGGTAGCTTAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCTGTTATAAGCGAAGAATAGGAGTAAGAGTGGAAAGTTTACTCTATGACGGTAGCTTAT 480 CAGAAAGGGACGGCTAACT ||||||||||||||||||| CAGAAAGGGACGGCTAACT 440 380 320 260 200 140 80 20 499 1 16 forward/16 reverse Score = 904 bits (489), Expect = 0.0 Identities = 489/489 (100%), Gaps = 0/489 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 489 Query 61 Sbjct 429 Query 121 Sbjct 369 Query 181 Sbjct 309 Query 241 Sbjct 249 Query 301 Sbjct 189 Query 361 Sbjct 129 Query 421 Sbjct 69 Query 481 Sbjct 9 GACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCA 60 CTGGTCTAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGGTCTAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGG 120 ATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATGACAATAGGGTACACATGTACCCTATTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATGACAATAGGGTACACATGTACCCTATTT 180 AAAAGGGGCAATTGCTTCACTATGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTAAGGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAAAGGGGCAATTGCTTCACTATGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTAAGGT 240 AACGGCTTACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AACGGCTTACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGA 300 CTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGGG 360 AACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTG 420 TTAGAGAAGAACGGTAATGGGAGTGGAAAATCCATTACGTGACGGTAACTAACCAGAAAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTAGAGAAGAACGGTAATGGGAGTGGAAAATCCATTACGTGACGGTAACTAACCAGAAAG 480 GGACGGCTA ||||||||| GGACGGCTA 489 1 173 430 370 310 250 190 130 70 10 Anhang 17 forward/17 reverse Score = 905 bits (490), Expect = 0.0 Identities = 490/490 (100%), Gaps = 0/490 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 490 Query 61 Sbjct 430 Query 121 Sbjct 370 Query 181 Sbjct 310 Query 241 Sbjct 250 Query 301 Sbjct 190 Query 361 Sbjct 130 Query 421 Sbjct 70 Query 481 Sbjct 10 CGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCACT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCACT 60 GGTCTAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGTCTAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGAT 120 AACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATGACAATAGGGTACACATGTACCCTATTTAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATGACAATAGGGTACACATGTACCCTATTTAA 180 AAGGGGCAAATGCTTCACTATGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTAAGGTAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGGGGCAAATGCTTCACTATGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTAAGGTAA 240 CGGCTTACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGGCTTACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACT 300 GAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGGGAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGGGAA 360 CCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTT 420 AGAGAAGAACGGTAATGGGAGTGGAAAATCCATTACGTGACGGTAACTAACCAGAAAGGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGAGAAGAACGGTAATGGGAGTGGAAAATCCATTACGTGACGGTAACTAACCAGAAAGGG 480 ACGGCTAACT |||||||||| ACGGCTAACT 431 371 311 251 191 131 71 11 490 1 18 forward/18 reverse Score = 845 bits (457), Expect = 0.0 Identities = 457/457 (100%), Gaps = 0/457 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 457 Query 61 Sbjct 397 Query 121 Sbjct 337 Query 181 Sbjct 277 Query 241 Sbjct 217 Query 301 Sbjct 157 Query 361 Sbjct 97 Query 421 Sbjct 37 AACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGAAAGGCCCTGCTTGCAGGGTAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGAAAGGCCCTGCTTGCAGGGTAC 60 TCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTGATCTGCCTTGTACTTCGGGATAAGCTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTGATCTGCCTTGTACTTCGGGATAAGCTT 120 GGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGACTGCACCGTGTGGGTGTGGTGGAAAGATGTTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGACTGCACCGTGTGGGTGTGGTGGAAAGATGTTT 180 TTTGGTGCAAGATGAGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTTGGTGCAAGATGAGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGG 240 CGTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGTACGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGTACGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCA 300 GACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCG 360 ACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACTCCTTTCGCTAGGGACGAAGCCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACTCCTTTCGCTAGGGACGAAGCCC 420 TTTGGGGTGACGGTACCTGGAGAAGAAGCACCGGCTA ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTTGGGGTGACGGTACCTGGAGAAGAAGCACCGGCTA 457 1 174 398 338 278 218 158 98 38 Anhang 19 forward/19 reverse Score = 846 bits (458), Expect = 0.0 Identities = 458/458 (100%), Gaps = 0/458 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 458 Query 61 Sbjct 398 Query 121 Sbjct 338 Query 181 Sbjct 278 Query 241 Sbjct 218 Query 301 Sbjct 158 Query 361 Sbjct 98 Query 421 Sbjct 38 AACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGTGAACACGGAGCTTGCTCTGTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGTGAACACGGAGCTTGCTCTGTG 60 GGATCAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGCAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGATCAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGCAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGC 120 GCTGGAAACGGCGTCTAATACTGGATACGAGTAGCGACCGCATGGTCAGTTACTGGAAAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTGGAAACGGCGTCTAATACTGGATACGAGTAGCGACCGCATGGTCAGTTACTGGAAAG 180 ATTTATTGGTTGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATTTATTGGTTGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACC 240 AAGGCGTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGGCGTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGG 300 CCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGC 360 AGCAACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTAGCAGGGAAGAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGCAACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTAGCAGGGAAGAA 420 GCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAAAAGCGCCGGCTAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAAAAGCGCCGGCTAA 399 339 279 219 159 99 39 458 1 20 forward/20 reverse Score = 852 bits (461), Expect = 0.0 Identities = 461/461 (100%), Gaps = 0/461 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 461 Query 61 Sbjct 401 Query 121 Sbjct 341 Query 181 Sbjct 281 Query 241 Sbjct 221 Query 301 Sbjct 161 Query 361 Sbjct 101 Query 421 Sbjct 41 GAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGAAAGGCCTGCAGCTTGCTGCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGAAAGGCCTGCAGCTTGCTGCG 60 GGTACTCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTCAACTTTGGGATA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGTACTCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTCAACTTTGGGATA 120 AGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCTTTCTTTAGTGTGGAAGGTGGAAAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCTTTCTTTAGTGTGGAAGGTGGAAAG 180 CTTTTGCGGTTGGGGATGAGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTTTTGCGGTTGGGGATGAGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACC 240 AAGGCGTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGTACGGCCACATTGGGACTGAGATACGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGGCGTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGTACGGCCACATTGGGACTGAGATACGG 300 CCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGGAAGCCTGATGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGGAAGCCTGATGC 360 AGCGACGCCGCGTGGGGGATGAAGGCCTTCGGGTTGTAAACTCCTTTCGACAGGGACGAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGCGACGCCGCGTGGGGGATGAAGGCCTTCGGGTTGTAAACTCCTTTCGACAGGGACGAA 420 GCTTTTTGTGACGGTACCTGTATAAGAAGCACCGGCTAACT ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTTTTTGTGACGGTACCTGTATAAGAAGCACCGGCTAACT 461 1 175 402 342 282 222 162 102 42 Anhang 21 forward/21 reverse Score = 850 bits (460), Expect = 0.0 Identities = 460/460 (100%), Gaps = 0/460 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 460 Query 61 Sbjct 400 Query 121 Sbjct 340 Query 181 Sbjct 280 Query 241 Sbjct 220 Query 301 Sbjct 160 Query 361 Sbjct 100 Query 421 Sbjct 40 GACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGAAAGGCCCTGCTTGCAGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGAAAGGCCCTGCTTGCAGG 60 GTACTCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCTTGCACTTCGGGATAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTACTCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCTTGCACTTCGGGATAA 120 GCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGACCATGCTTTAGTGTGTGTGGTGGAAAGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGACCATGCTTTAGTGTGTGTGGTGGAAAGT 180 TTTTCGGTGCAAGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTTTCGGTGCAAGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAA 240 GGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGTACGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGTACGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCC 300 CAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAG 360 CGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACTCCTTTCGCTAGGGAAGAAGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACTCCTTTCGCTAGGGAAGAAGC 420 CTTTTGGTGACGGTACCTGGATAAGAAGCACCGGCTAACT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTTTTGGTGACGGTACCTGGATAAGAAGCACCGGCTAACT 401 341 281 221 161 101 41 460 1 22 forward/22 reverse Score = 843 bits (456), Expect = 0.0 Identities = 456/456 (100%), Gaps = 0/456 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 456 Query 61 Sbjct 396 Query 121 Sbjct 336 Query 181 Sbjct 276 Query 241 Sbjct 216 Query 301 Sbjct 156 Query 361 Sbjct 96 Query 421 Sbjct 36 ACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGTAAGGCCCTTCGGGGTACA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGTAAGGCCCTTCGGGGTACA 60 CGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTG 120 GGAAACTGGGTCTAATACCGGATATTCAGCTTCTGCCGCATGGTGGGGGTTGGAAAGTTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGAAACTGGGTCTAATACCGGATATTCAGCTTCTGCCGCATGGTGGGGGTTGGAAAGTTT 180 TTCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGG 240 CGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCA 300 GACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCG 360 ACGCCGCGTGGGGGATGACGGTCTTCGGATTGTAAACCCCTTTCAGTAGGGACGAAGCGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACGCCGCGTGGGGGATGACGGTCTTCGGATTGTAAACCCCTTTCAGTAGGGACGAAGCGC 420 AAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCACCGGCCAACT |||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCACCGGCCAACT 456 1 176 397 337 277 217 157 97 37 Anhang 23 forward/23 reverse Score = 852 bits (461), Expect = 0.0 Identities = 461/461 (100%), Gaps = 0/461 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 461 Query 61 Sbjct 401 Query 121 Sbjct 341 Query 181 Sbjct 281 Query 241 Sbjct 221 Query 301 Sbjct 161 Query 361 Sbjct 101 Query 421 Sbjct 41 CGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAAGCCCTGCTTGCAGGGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAAGCCCTGCTTGCAGGGT 60 GGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACCTGCCCCTGACTGTGGGATAAGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACCTGCCCCTGACTGTGGGATAAGC 120 CCGGGAAACTGGGTCTAATACCGCATATGACACTTGGCCGCATGGTCTGAGTGTGGAAAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCGGGAAACTGGGTCTAATACCGCATATGACACTTGGCCGCATGGTCTGAGTGTGGAAAG 180 TTTTTTCGGTTGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTTTTTCGGTTGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACC 240 AAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGG 300 CCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGC 360 AGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGTAGGGAAGAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGTAGGGAAGAA 420 GCCTTCGGGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGTACCGGCTAAC ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCCTTCGGGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGTACCGGCTAAC 402 342 282 222 162 102 42 461 1 24 forward/24 reverse Score = 841 bits (455), Expect = 0.0 Identities = 455/455 (100%), Gaps = 0/455 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 455 Query 61 Sbjct 395 Query 121 Sbjct 335 Query 181 Sbjct 275 Query 241 Sbjct 215 Query 301 Sbjct 155 Query 361 Sbjct 95 Query 421 Sbjct 35 GACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAAGGCCCTTCGGGGTAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAAGGCCCTTCGGGGTAC 60 ACGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCTCGTACTCTGGGATAAGCCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCTCGTACTCTGGGATAAGCCT 120 GGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCACGAATCGCATGGTTTGTGGTGGAAAGATT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCACGAATCGCATGGTTTGTGGTGGAAAGATT 180 TATCGGTGCGAGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TATCGGTGCGAGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAG 240 GCGACGACGGGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCGACGACGGGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCC 300 AGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGGAAGCCTGATGCAGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGGAAGCCTGATGCAGC 360 GACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCGACAGGGACGAAGCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCGACAGGGACGAAGCG 420 AAAGTGACGGTACCTGTATAAGAAGCACCGGCCAA ||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAAGTGACGGTACCTGTATAAGAAGCACCGGCCAA 455 1 177 396 336 276 216 156 96 36 Anhang 25 forward/25 reverse Score = 872 bits (472), Expect = 0.0 Identities = 472/472 (100%), Gaps = 0/472 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 472 Query 61 Sbjct 412 Query 121 Sbjct 352 Query 181 Sbjct 292 Query 241 Sbjct 232 Query 301 Sbjct 172 Query 361 Sbjct 112 Query 421 Sbjct 52 GAACGCTAGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGGGGTAGAGACTAGCTTGCTGCTTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAACGCTAGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGGGGTAGAGACTAGCTTGCTGCTTT 60 GAGACCGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTATGCAATCTACCTTATACTAAGGGATAGCCCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAGACCGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTATGCAATCTACCTTATACTAAGGGATAGCCCG 120 GAGAAATCCGGATTAATACCTTATGGTTTTTATGAATAGCATTATTTATAGAATAAAGAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAGAAATCCGGATTAATACCTTATGGTTTTTATGAATAGCATTATTTATAGAATAAAGAT 180 TTATCGGTATAAGATGAGCATGCGTCCCATTAGTTAGTTGGTGTGGTAACGGCACACCAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTATCGGTATAAGATGAGCATGCGTCCCATTAGTTAGTTGGTGTGGTAACGGCACACCAA 240 GACGATGATGGGTAGGGGTCCTGAGAGGGAGATCCCCCACACTGGTACTGAGACACGGAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GACGATGATGGGTAGGGGTCCTGAGAGGGAGATCCCCCACACTGGTACTGAGACACGGAC 300 CAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGAGGCAACTCTGAACCAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGAGGCAACTCTGAACCAG 360 CCATGCCGCGTGCAGGATGACGGTCCTATGGATTGTAAACTGCTTTTGTACGGGAAGAAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCATGCCGCGTGCAGGATGACGGTCCTATGGATTGTAAACTGCTTTTGTACGGGAAGAAA 420 AAGAGCTACGTGTAGTTTATTGACGGTACCGTAAGAATAAGGATCGGCTAAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGAGCTACGTGTAGTTTATTGACGGTACCGTAAGAATAAGGATCGGCTAAC 413 353 293 233 173 113 53 472 1 26 forward/26 reverse Score = 878 bits (475), Expect = 0.0 Identities = 475/475 (100%), Gaps = 0/475 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 475 Query 61 Sbjct 415 Query 121 Sbjct 355 Query 181 Sbjct 295 Query 241 Sbjct 235 Query 301 Sbjct 175 Query 361 Sbjct 115 Query 421 Sbjct 55 CTAGCTACAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGGGGCAGCATGGTCTTAGCTTGCTAAGGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTAGCTACAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGGGGCAGCATGGTCTTAGCTTGCTAAGGCC 60 GATGGCGACCGGCGCACGGGTGAGTAACACGTATCCAACCTGCCGTCTACTCTTGGACAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GATGGCGACCGGCGCACGGGTGAGTAACACGTATCCAACCTGCCGTCTACTCTTGGACAG 120 CCTTCTGAAAGGAAGATTAATACAAGATGGCATCATGAGTCCGCATGTTCACATGATTAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCTTCTGAAAGGAAGATTAATACAAGATGGCATCATGAGTCCGCATGTTCACATGATTAA 180 AGGTATTCCGGTAGACGATGGGGATGCGTTCCATTAGATAGTAGGCGGGGTAACGGCCCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGGTATTCCGGTAGACGATGGGGATGCGTTCCATTAGATAGTAGGCGGGGTAACGGCCCA 240 CCTAGTCTTCGATGGATAGGGGTTCTGAGAGGAAGGTCCCCCACATTGGAACTGAGACAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCTAGTCTTCGATGGATAGGGGTTCTGAGAGGAAGGTCCCCCACATTGGAACTGAGACAC 300 GGTCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGGCGAGAGCCTGAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGTCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGGCGAGAGCCTGAA 360 CCAGCCAAGTAGCGTGAAGGATGACTGCCCTATGGGTTGTAAACTTCTTTTATAAAGGAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCAGCCAAGTAGCGTGAAGGATGACTGCCCTATGGGTTGTAAACTTCTTTTATAAAGGAA 420 TAAAGTCGGGTATGGATACCCGTTTGCATGTACTTTATGAATAAGGATCGGCTAA ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TAAAGTCGGGTATGGATACCCGTTTGCATGTACTTTATGAATAAGGATCGGCTAA 178 475 1 416 356 296 236 176 116 56 Anhang 27 forward/27 reverse Score = 885 bits (479), Expect = 0.0 Identities = 479/479 (100%), Gaps = 0/479 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 479 Query 61 Sbjct 419 Query 121 Sbjct 359 Query 181 Sbjct 299 Query 241 Sbjct 239 Query 301 Sbjct 179 Query 361 Sbjct 119 Query 421 Sbjct 59 AACGCTAGCTACAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGGGGCATCAGGAAGAAAGCTTGCTTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AACGCTAGCTACAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGGGGCATCAGGAAGAAAGCTTGCTTT 60 CTTTGCTGGCGACCGGCGCACGGGTGAGTAACACGTATCCAACCTGCCCTTTACTCGGGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTTTGCTGGCGACCGGCGCACGGGTGAGTAACACGTATCCAACCTGCCCTTTACTCGGGG 120 ATAGCCTTTCGAAAGAAAGATTAATACCCGATGGCATAATGATTCCGCATGGTTTCATTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATAGCCTTTCGAAAGAAAGATTAATACCCGATGGCATAATGATTCCGCATGGTTTCATTA 180 TTAAAGGATTCCGGTAAAGGATGGGGATGCGTTCCATTAGGTTGTTGGTGAGGTAACGGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTAAAGGATTCCGGTAAAGGATGGGGATGCGTTCCATTAGGTTGTTGGTGAGGTAACGGC 240 TCACCAAGCCTTCGATGGATAGGGGTTCTGAGAGGAAGGTCCCCCACATTGGAACTGAGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCACCAAGCCTTCGATGGATAGGGGTTCTGAGAGGAAGGTCCCCCACATTGGAACTGAGA 300 CACGGTCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGGCGCTAGCCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CACGGTCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGGCGCTAGCCT 360 GAACCAGCCAAGTAGCGTGAAGGATGAAGGCTCTATGGGTCGTAAACTTCTTTTATATAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAACCAGCCAAGTAGCGTGAAGGATGAAGGCTCTATGGGTCGTAAACTTCTTTTATATAA 420 GAATAAAGTGCAGTATGTATACTGTTTTGTATGTATTATATGAATAAGGATCGGCTAAC ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAATAAAGTGCAGTATGTATACTGTTTTGTATGTATTATATGAATAAGGATCGGCTAAC 420 360 300 240 180 120 60 479 1 28 forward/28 reverse Score = 832 bits (450), Expect = 0.0 Identities = 450/450 (100%), Gaps = 0/450 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 450 Query 61 Sbjct 390 Query 121 Sbjct 330 Query 181 Sbjct 270 Query 241 Sbjct 210 Query 301 Sbjct 150 Query 361 Sbjct 90 Query 421 Sbjct 30 AACGCTGACAGAATGCTTAACACATGCAAGTCAACTCGAGTCTTCGGACTTGGGTGGCGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AACGCTGACAGAATGCTTAACACATGCAAGTCAACTCGAGTCTTCGGACTTGGGTGGCGG 60 ACGGGTGAGTAACGCGTAAAGAACTTGCCTCTTAGTCTGGGACAACATCTGGAAACGGAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACGGGTGAGTAACGCGTAAAGAACTTGCCTCTTAGTCTGGGACAACATCTGGAAACGGAT 120 GCTAATACCGGATATTATGCTTTTTTCGCATGGAGAAAGCATGAAAGCTACATGCGCTAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTAATACCGGATATTATGCTTTTTTCGCATGGAGAAAGCATGAAAGCTACATGCGCTAA 180 GAGAGAGCTTTGCGTCCCATTAGCTCGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAATGATG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAGAGAGCTTTGCGTCCCATTAGCTCGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAATGATG 240 GGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGCCACAAGGGGACTGAGACACGGCCCTTACTCCTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGCCACAAGGGGACTGAGACACGGCCCTTACTCCTA 300 CGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGACCAAAAGTCTGATCCAGCAATTCTGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGACCAAAAGTCTGATCCAGCAATTCTGT 360 GTGCACGATGACGTTTTTCGGAATGTAAAGTGCTTTCAGTCGGGAAGAAGAAAGTGACGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGCACGATGACGTTTTTCGGAATGTAAAGTGCTTTCAGTCGGGAAGAAGAAAGTGACGG 420 TACCGACAGAAGAAGCGACGGCTAAATACG |||||||||||||||||||||||||||||| TACCGACAGAAGAAGCGACGGCTAAATACG 450 1 179 391 331 271 211 151 91 31 Anhang 29 forward/29 reverse Score = 880 bits (476), Expect = 0.0 Identities = 476/476 (100%), Gaps = 0/476 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 476 Query 61 Sbjct 416 Query 121 Sbjct 356 Query 181 Sbjct 296 Query 241 Sbjct 236 Query 301 Sbjct 176 Query 361 Sbjct 116 Query 421 Sbjct 56 ACGCTAGCTACAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGGGGCAGCATGGGCTTAGCTTGCTAAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACGCTAGCTACAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGGGGCAGCATGGGCTTAGCTTGCTAAG 60 CCCGATGGCGACCGGCGCACGGGTGAGTAACACGTATCCAACCTTCCGGTAACTCCGGTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCCGATGGCGACCGGCGCACGGGTGAGTAACACGTATCCAACCTTCCGGTAACTCCGGTA 120 TAGCCTTTCGAAAGAAAGATTAATCCCGGATAGTATGGTGATTCCGCATGGTTTTTCCAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TAGCCTTTCGAAAGAAAGATTAATCCCGGATAGTATGGTGATTCCGCATGGTTTTTCCAT 180 TAAAGGATTCCGGTTACCGATGGGGATGCGTTCCATTAGGCAGTTGGCGGGGTAACGGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TAAAGGATTCCGGTTACCGATGGGGATGCGTTCCATTAGGCAGTTGGCGGGGTAACGGCC 240 CACCAAACCTACGATGGATAGGGGTTCTGAGAGGAAGGTCCCCCACATTGGAACTGAGAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CACCAAACCTACGATGGATAGGGGTTCTGAGAGGAAGGTCCCCCACATTGGAACTGAGAC 300 ACGGTCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGGCGGAAGCCTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACGGTCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGGCGGAAGCCTG 360 AACCAGCCAAGTAGCGTGAAGGATGACTGCCCTATGGGTTGTAAACTTCTTTTATAAGGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AACCAGCCAAGTAGCGTGAAGGATGACTGCCCTATGGGTTGTAAACTTCTTTTATAAGGG 420 AATAAATGTGGGTACGCGTACCCGTTTGCATGTACCTTATGAATAAGGATCGGCTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AATAAATGTGGGTACGCGTACCCGTTTGCATGTACCTTATGAATAAGGATCGGCTA 417 357 297 237 177 117 57 476 1 30 forward/30 reverse Score = 821 bits (444), Expect = 0.0 Identities = 444/444 (100%), Gaps = 0/444 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 444 Query 61 Sbjct 384 Query 121 Sbjct 324 Query 181 Sbjct 264 Query 241 Sbjct 204 Query 301 Sbjct 144 Query 361 Sbjct 84 Query 421 Sbjct 24 GAACGCTGACAGAATGCTTAACACATGCAAGTCAACTCGAACTTCGGTTTGGGTGGCGGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAACGCTGACAGAATGCTTAACACATGCAAGTCAACTCGAACTTCGGTTTGGGTGGCGGA 60 CGGGTGAGTAACGCGTAAAGAACTTGCCTTACAGTCTGGGACAACATCTGGAAACGGATG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGGGTGAGTAACGCGTAAAGAACTTGCCTTACAGTCTGGGACAACATCTGGAAACGGATG 120 CTAATACTGGATATTATGTTTTTTCTGCATGGAAGAGACATGAAAGCTATATGCGCTGTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTAATACTGGATATTATGTTTTTTCTGCATGGAAGAGACATGAAAGCTATATGCGCTGTA 180 AGAGAGCTTTGCGTCCCATTAGCTAGTTGGAGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGATGATGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGAGAGCTTTGCGTCCCATTAGCTAGTTGGAGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGATGATGG 240 GTAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGCCACAAGGGGACTGAGACACGGCCCTTACTCCTAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGCCACAAGGGGACTGAGACACGGCCCTTACTCCTAC 300 GGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGACCAAGAGTCTGATCCAGCAATTCTGTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGACCAAGAGTCTGATCCAGCAATTCTGTG 360 TGCACGATGAAGTTTTTCGGAATGTAAAGTGCTTTCAGTTGGGAAGAAGAAAGTGACGGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGCACGATGAAGTTTTTCGGAATGTAAAGTGCTTTCAGTTGGGAAGAAGAAAGTGACGGT 420 ACCAACAGAAGAAGCGACGGCTAA |||||||||||||||||||||||| ACCAACAGAAGAAGCGACGGCTAA 444 1 180 385 325 265 205 145 85 25 Anhang 31 forward/31 reverse Score = 828 bits (448), Expect = 0.0 Identities = 448/448 (100%), Gaps = 0/448 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 448 Query 61 Sbjct 388 Query 121 Sbjct 328 Query 181 Sbjct 268 Query 241 Sbjct 208 Query 301 Sbjct 148 Query 361 Sbjct 88 Query 421 Sbjct 28 GAACGCTGACAGAATGCTTAACACATGCAAGTCGACTCGAGTCTTCGGACTTGGGTGGCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAACGCTGACAGAATGCTTAACACATGCAAGTCGACTCGAGTCTTCGGACTTGGGTGGCG 60 GACGGGTGAGTAACGCGTAAAGAACTTGCCTTTTAGCCTGGGACAACATCTGGAAACGGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GACGGGTGAGTAACGCGTAAAGAACTTGCCTTTTAGCCTGGGACAACATCTGGAAACGGA 120 TGCTAATACCGGATATTATGATTTCTTTGCATGAAGGAGTCATGAAAGCTATATGCGCTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGCTAATACCGGATATTATGATTTCTTTGCATGAAGGAGTCATGAAAGCTATATGCGCTA 180 GAAGAGAGCTTTGCGTCCCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCCCACCAAGGCGATGAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAAGAGAGCTTTGCGTCCCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCCCACCAAGGCGATGAT 240 GGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGCCACAAGGGGACTGAGACACGGCCCTTACTCCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGCCACAAGGGGACTGAGACACGGCCCTTACTCCT 300 ACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGACCGAAAGTCTGATCCAGCAATTCTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGACCGAAAGTCTGATCCAGCAATTCTG 360 TGTGCACGATGACGTTTTTCGGAATGTAAAGTGCTTTCAGTCGGGAAGAAGGAAGTGACG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGTGCACGATGACGTTTTTCGGAATGTAAAGTGCTTTCAGTCGGGAAGAAGGAAGTGACG 420 GTACCGACAGAAGAAGCGACGGCTAAAT |||||||||||||||||||||||||||| GTACCGACAGAAGAAGCGACGGCTAAAT 389 329 269 209 149 89 29 448 1 32 forward/32 reverse Score = 883 bits (478), Expect = 0.0 Identities = 478/478 (100%), Gaps = 0/478 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 478 Query 61 Sbjct 418 Query 121 Sbjct 358 Query 181 Sbjct 298 Query 241 Sbjct 238 Query 301 Sbjct 178 Query 361 Sbjct 118 Query 421 Sbjct 58 AACGCTAGCTACAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGGGGCAGCATGGGCTTAGCTTGCTAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AACGCTAGCTACAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGGGGCAGCATGGGCTTAGCTTGCTAA 60 GCCCGATGGCGACCGGCGCACGGGTGAGTAACACGTATCCAACCTTCCGGTAACTCCGGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCCCGATGGCGACCGGCGCACGGGTGAGTAACACGTATCCAACCTTCCGGTAACTCCGGT 120 ATAGCCTTTCGAAAGAAAGATTAATCCCGGATAGTATGGTGATTCCGCATGGTTTCTCCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATAGCCTTTCGAAAGAAAGATTAATCCCGGATAGTATGGTGATTCCGCATGGTTTCTCCA 180 TTAAAGGATTCCGGTTACCGATGGGGATGCGTTCCATTAGGCAGTTGGCGGGGTAACGGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTAAAGGATTCCGGTTACCGATGGGGATGCGTTCCATTAGGCAGTTGGCGGGGTAACGGC 240 CCACCAAACCTACGATGGATAGGGGTTCTGAGAGGAAGGTCCCCCACATTGGAACTGAGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCACCAAACCTACGATGGATAGGGGTTCTGAGAGGAAGGTCCCCCACATTGGAACTGAGA 300 CACGGTCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGGCGGAAGCCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CACGGTCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGGCGGAAGCCT 360 GAACCAGCCAAGTAGCGTGAAGGATGACTGCCCTATGGGTTGTAAACTTCTTTTATAAGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAACCAGCCAAGTAGCGTGAAGGATGACTGCCCTATGGGTTGTAAACTTCTTTTATAAGG 420 GAATAAATGTGGGTACGCGTACCCGTTTGCATGTACCTTATGAATAAGGATCGGCTAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAATAAATGTGGGTACGCGTACCCGTTTGCATGTACCTTATGAATAAGGATCGGCTAA 181 419 359 299 239 179 119 59 478 1 Anhang 33 forward/33 reverse Score = 887 bits (480), Expect = 0.0 Identities = 480/480 (100%), Gaps = 0/480 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 480 Query 61 Sbjct 420 Query 121 Sbjct 360 Query 181 Sbjct 300 Query 241 Sbjct 240 Query 301 Sbjct 180 Query 361 Sbjct 120 Query 421 Sbjct 60 AACGCTAGCTACAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGGGGCAGCATTTCAGTTTGCTTGCAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AACGCTAGCTACAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGGGGCAGCATTTCAGTTTGCTTGCAA 60 ACTGGAGATGGCGACCGGCGCACGGGTGAGTAACACGTATCCAACCTGCCGATAACTCGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACTGGAGATGGCGACCGGCGCACGGGTGAGTAACACGTATCCAACCTGCCGATAACTCGG 120 GGATAGCCTTTCGAAAGAAAGATTAATACCCGATGGTATAATCAGACCGCATGGTCTTGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGATAGCCTTTCGAAAGAAAGATTAATACCCGATGGTATAATCAGACCGCATGGTCTTGT 180 TATTAAAGAATTTCGGTTATCGATGGGGATGCGTTCCATTAGGCAGTTGGTGAGGTAACG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TATTAAAGAATTTCGGTTATCGATGGGGATGCGTTCCATTAGGCAGTTGGTGAGGTAACG 240 GCTCACCAAACCTTCGATGGATAGGGGTTCTGAGAGGAAGGTCCCCCACATTGGAACTGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTCACCAAACCTTCGATGGATAGGGGTTCTGAGAGGAAGGTCCCCCACATTGGAACTGA 300 GACACGGTCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGGCGCAGGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GACACGGTCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGGCGCAGGC 360 CTGAACCAGCCAAGTAGCGTGAAGGATGACTGCCCTATGGGTTGTAAACTTCTTTTATAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGAACCAGCCAAGTAGCGTGAAGGATGACTGCCCTATGGGTTGTAAACTTCTTTTATAT 420 GGGAATAAAGTTTTCCACGTGTGGAATTTTGTATGTACCATATGAATAAGGATCGGCTAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGGAATAAAGTTTTCCACGTGTGGAATTTTGTATGTACCATATGAATAAGGATCGGCTAA 480 421 361 301 241 181 121 61 1 34 forward/34 reverse Score = 876 bits (474), Expect = 0.0 Identities = 474/474 (100%), Gaps = 0/474 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 474 Query 61 Sbjct 414 Query 121 Sbjct 354 Query 181 Sbjct 294 Query 241 Sbjct 234 Query 301 Sbjct 174 Query 361 Sbjct 114 Query 421 Sbjct 54 ACGCTGGCGGCATGCCTTACACATGCAAGTCGAACGGCAGCACGGACTTCGGTCTGGTGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACGCTGGCGGCATGCCTTACACATGCAAGTCGAACGGCAGCACGGACTTCGGTCTGGTGG 60 CGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTGCCTAGTAGTGGGGGATAACTACTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTGCCTAGTAGTGGGGGATAACTACTC 120 GAAAGAGTAGCTAATACCGCATGAGATCTACGGATGAAAGCAGGGGATCGCAAGACCTTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAAAGAGTAGCTAATACCGCATGAGATCTACGGATGAAAGCAGGGGATCGCAAGACCTTG 180 TGCTACTGGAGCGGCCGATGGCAGATTAGGTAGTTGGTGGGATAAAAGCTTACCAAGCCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGCTACTGGAGCGGCCGATGGCAGATTAGGTAGTTGGTGGGATAAAAGCTTACCAAGCCG 240 ACGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGACGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGACGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGA 300 CTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAAT 360 GCCGCGTGCAGGATGAAGGCCTTCGGGTTGTAAACTGCTTTTGTACGGAACGAAAAGCTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCCGCGTGCAGGATGAAGGCCTTCGGGTTGTAAACTGCTTTTGTACGGAACGAAAAGCTT 420 TGGGTTAATACCCTGGAGTCATGACGGTACCGTAAGAATAAGCACCGGCTAACT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGGGTTAATACCCTGGAGTCATGACGGTACCGTAAGAATAAGCACCGGCTAACT 182 474 1 415 355 295 235 175 115 55 Anhang 35 forward/35 reverse Score = 928 bits (502), Expect = 0.0 Identities = 502/502 (100%), Gaps = 0/502 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 502 Query 61 Sbjct 442 Query 121 Sbjct 382 Query 181 Sbjct 322 Query 241 Sbjct 262 Query 301 Sbjct 202 Query 361 Sbjct 142 Query 421 Sbjct 82 Query 481 Sbjct 22 GACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTGGAACGCATTTATAACTACCGTAGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTGGAACGCATTTATAACTACCGTAGC 60 TTGCTACAACTGCTATAAATGAGTCGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTGCTACAACTGCTATAAATGAGTCGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTT 120 TAAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAAAAGGAGCTAACCCATG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TAAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAAAAGGAGCTAACCCATG 180 TTAGCTTTTTAAAAGGTGCAACAGCATCACTTAAAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTAGCTTTTTAAAAGGTGCAACAGCATCACTTAAAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAG 240 TTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCTTCGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCTTCGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGC 300 CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGG 360 CAATGGGGGGAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAATGGGGGGAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAA 420 AGCTCTGTTATAAGCGAAGAACAGGAGTAAGAGTGGAAAATTTACTCTATGACGGTAGCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGCTCTGTTATAAGCGAAGAACAGGAGTAAGAGTGGAAAATTTACTCTATGACGGTAGCT 480 TATCAGAAAGGGACGGCTAACT |||||||||||||||||||||| TATCAGAAAGGGACGGCTAACT 443 383 323 263 203 143 83 23 502 1 36 forward/36 reverse Score = 863 bits (467), Expect = 0.0 Identities = 467/467 (100%), Gaps = 0/467 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 467 Query 61 Sbjct 407 Query 121 Sbjct 347 Query 181 Sbjct 287 Query 241 Sbjct 227 Query 301 Sbjct 167 Query 361 Sbjct 107 Query 421 Sbjct 47 GACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGCACGGCCTTGGGGTTTTCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGCACGGCCTTGGGGTTTTCT 60 TGGGGTTGGTGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACCTGCCCCCTTCTTTGGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGGGGTTGGTGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACCTGCCCCCTTCTTTGGG 120 ATAACGGTCGGAAACGGCTGCTAATACTGGATATTCACACATTGTCGCATGGTGGTGTGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATAACGGTCGGAAACGGCTGCTAATACTGGATATTCACACATTGTCGCATGGTGGTGTGT 180 GGAAAGCTTTTGTGGTGGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGATGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGAAAGCTTTTGTGGTGGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGATGG 240 CTTACCAAGGCTTTGACGGGTAACCGGCCTGAGAGGGTGACCGGTCACATTGGGACTGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTTACCAAGGCTTTGACGGGTAACCGGCCTGAGAGGGTGACCGGTCACATTGGGACTGAG 300 ATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGCACAATGGACGCAAGTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGCACAATGGACGCAAGTC 360 TGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGGAGGCCTTCGGGTTGTGAACCTCTTTCGCTCAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGGAGGCCTTCGGGTTGTGAACCTCTTTCGCTCAT 420 GGTCAAGCCGCACGTGTGCGTGTGGTGAGGGTAGTGGGTAAAGAAGC ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGTCAAGCCGCACGTGTGCGTGTGGTGAGGGTAGTGGGTAAAGAAGC 467 1 183 408 348 288 228 168 108 48 Anhang 37 forward/37 reverse Score = 846 bits (458), Expect = 0.0 Identities = 458/458 (100%), Gaps = 0/458 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 458 Query 61 Sbjct 398 Query 121 Sbjct 338 Query 181 Sbjct 278 Query 241 Sbjct 218 Query 301 Sbjct 158 Query 361 Sbjct 98 Query 421 Sbjct 38 AACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGCGTCTTATCGGTGCTTGCACTGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGCGTCTTATCGGTGCTTGCACTGA 60 GAAAGATGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGTAACCTGCCCTATACACATGGATA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAAAGATGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGTAACCTGCCCTATACACATGGATA 120 ACATACTGAAAAGTTTACTAATACATGATAATATATATTTACGGCATCGTAGATATATCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACATACTGAAAAGTTTACTAATACATGATAATATATATTTACGGCATCGTAGATATATCA 180 AAGTGTTAGCGGTATAGGATGGACCCGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGAGATAACTGCCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGTGTTAGCGGTATAGGATGGACCCGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGAGATAACTGCCC 240 ACCAAGGCGACGATCAGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGAACTGAGACA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACCAAGGCGACGATCAGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGAACTGAGACA 300 CGGTCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGGTCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGA 360 TGCAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGGTCTTCGGATCGTAAAGTTCTGTTGCAGGGGAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGCAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGGTCTTCGGATCGTAAAGTTCTGTTGCAGGGGAA 420 GATAATGACGGTACCCTGTGAGGAAGCCCCGGCTAACT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GATAATGACGGTACCCTGTGAGGAAGCCCCGGCTAACT 399 339 279 219 159 99 39 458 1 38 forward/38 reverse Score = 869 bits (470), Expect = 0.0 Identities = 470/470 (100%), Gaps = 0/470 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 470 Query 61 Sbjct 410 Query 121 Sbjct 350 Query 181 Sbjct 290 Query 241 Sbjct 230 Query 301 Sbjct 170 Query 361 Sbjct 110 Query 421 Sbjct 50 AACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGAAGCAATAAAGACAGAAGTTTTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGAAGCAATAAAGACAGAAGTTTTC 60 GGACCGAAGTTTTTATTGACTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGCAACCTGCCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGACCGAAGTTTTTATTGACTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGCAACCTGCCT 120 CATACAGGGGGATAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAATACCGCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CATACAGGGGGATAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAATACCGCA 180 TGGTATGGTGTGAAAAACTTTGGTGGTATGAGATGGGCCCGCGTTAGATTAGCTAGTTGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGGTATGGTGTGAAAAACTTTGGTGGTATGAGATGGGCCCGCGTTAGATTAGCTAGTTGG 240 TGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTATAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTATAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACA 300 TTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAAT 360 GGGGGAAACCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAATGAAGAAGTATTTCGGTATGTAAAGTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGGGGAAACCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAATGAAGAAGTATTTCGGTATGTAAAGTT 420 CTATCAGCAGGGAAGAAAATGACGGTACCTGACTAAGAAGCACCGGCTAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTATCAGCAGGGAAGAAAATGACGGTACCTGACTAAGAAGCACCGGCTAA 470 1 184 411 351 291 231 171 111 51 Anhang 39 forward/39 reverse Score = 883 bits (478), Expect = 0.0 Identities = 478/478 (100%), Gaps = 0/478 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 478 Query 61 Sbjct 418 Query 121 Sbjct 358 Query 181 Sbjct 298 Query 241 Sbjct 238 Query 301 Sbjct 178 Query 361 Sbjct 118 Query 421 Sbjct 58 ACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGTAGCACAAAGGAGCTTGCTCCTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGTAGCACAAAGGAGCTTGCTCCTT 60 GGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTGGGAATCTGGCCTATGGAGGGGGATAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTGGGAATCTGGCCTATGGAGGGGGATAA 120 CTACGGGAAACTGTAGCTAATACCGCGTAAAATCTTCGGATTAAAGTGTGGGACCTTCGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTACGGGAAACTGTAGCTAATACCGCGTAAAATCTTCGGATTAAAGTGTGGGACCTTCGG 180 GCCACATGCCATAGGATGAGCCCAAGTGGGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCCACATGCCATAGGATGAGCCCAAGTGGGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACC 240 AAGCCGACGATCTCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGCCGACGATCTCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGG 300 TCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGGAACCCTGATGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGGAACCCTGATGC 360 AGCCATGCCGCGTGAATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTTCTTTCGGTGGTGAGGAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGCCATGCCGCGTGAATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTTCTTTCGGTGGTGAGGAA 420 GGTGGTTGTTTTAATAGAACAATCAATTGACGTTAACTACAGAAGAAGCACCGGCTAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGTGGTTGTTTTAATAGAACAATCAATTGACGTTAACTACAGAAGAAGCACCGGCTAA 419 359 299 239 179 119 59 478 1 40 forward/40 reverse Score = 928 bits (502), Expect = 0.0 Identities = 502/502 (100%), Gaps = 0/502 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 Sbjct 502 Query 61 Sbjct 442 Query 121 Sbjct 382 Query 181 Sbjct 322 Query 241 Sbjct 262 Query 301 Sbjct 202 Query 361 Sbjct 142 Query 421 Sbjct 82 Query 481 Sbjct 22 ACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTGGAACGCAATTATTTCTACCGTAGCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTGGAACGCAATTATTTCTACCGTAGCT 60 TGCTACACTTGAGATAATTGAGTCGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGCTACACTTGAGATAATTGAGTCGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTTC 120 TAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAAGATTAGTTAACACATGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAAGATTAGTTAACACATGT 180 TAGCTTGATTAAAAGGGGCAACAGCTCCACTAGAAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TAGCTTGATTAAAAGGGGCAACAGCTCCACTAGAAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAG 240 TTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCATCGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCATCGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGC 300 CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGG 360 CAATGGGGGGAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAATGGGGGGAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAA 420 AGCTCTGTTATAAGCGAAGAACGGGAGTAAGAGTGGAAAATTTACTCTGTGACGGTAGCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGCTCTGTTATAAGCGAAGAACGGGAGTAAGAGTGGAAAATTTACTCTGTGACGGTAGCT 480 TATCAGAAAGGGACGGCTAACT |||||||||||||||||||||| TATCAGAAAGGGACGGCTAACT 502 1 185 443 383 323 263 203 143 83 23 Danksagung Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Burkhard Meinecke, der mir nicht nur dieses interessante Thema überließ, sondern mir auch jederzeit freundliche Unterstützung und fachkompetente Anregungen zukommen ließ. Ein weiterer Dank gilt der Stiftung Gestüt Fährhof, die durch ihre finanzielle Unterstützung die Realisierung dieses Projektes ermöglichte. Herrn Prof. Dr. Harald Sieme danke ich für die Unterstützung bei der Entwicklung und Durchführung der Probenentnahme. Mein Dank gilt ebenfalls der Familie Vorwerk vom Gestüt Vorwerk und ihren Mitarbeitern, die mich sehr freundlich aufgenommen haben und mir sowohl ihre Stuten als auch ihre Fohlen zur Verfügung gestellt haben. Ein besonderer Dank gilt auch Herrn Priv.-Doz. Dr. Martin Runge, der mir mit großem Engagement stets freundlich zur Seite stand und ohne dessen Hilfe der gesamte molekularbiologische Abschnitt nicht zu Stande gekommen wäre. Vielen Dank auch für das tolle Korrekturlesen. Frau Dr. Thoms danke ich für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes beim LAVES. Einen großen Anteil zur Entstehung dieser Arbeit leistete Sabine Baumann, die mich im Labor mit sehr viel Fachwissen und sehr viel Geduld unterstützt hat. Aber auch den anderen Mitarbeitern der Molekularbiologie des LAVES danke ich für die lehrreiche und schöne Zeit bei ihnen. Weiterhin möchte ich Edita Podhajsky und den Mitarbeitern des Institutes für Reproduktionsbiologie der Tiho danken, dass sie mir jederzeit bei allen Problemen und Problemchen geholfen haben Corinna Linke und den Mitarbeitern der „Repro“ danke ich für die Hilfe bei der Probenentnahme und die aufmunternden Worte. Des Weiteren danke ich Frau Dr. Rohde, Frau Dr. Verspohl und Frau Dr. Sack aus der Mikrobiologie für ihre Unterstützung sowie für die Auswertung der Tupferproben. Herrn Dr. K. Rohn vom Institut für Statistik und Biometrie danke ich für die Unterstützung bei der statistischen Auswertung. Nicht zuletzt danke ich meiner Familie, meinem Freund und meinen Freunden, die mich bei der Anfertigung dieser Arbeit jederzeit unterstützt und geduldig ertragen haben. Danke!
