5 Zusammenfassung - Ruhr

5 Zusammenfassung
Die Dichten Granula sind neben den Mikronemen und den Rhoptrien charakteristische
membranumschlossene Organelltypen der Sporozoen. Sie sind in der apikalen Region von
Sporozoiten und Merozoiten lokalisiert. Obwohl über die Funktion dieser Organellen und die
Rolle ihrer Inhaltsstoffe bisher nur wenig bekannt ist, wird angenommen, daß sie bei der
Wirtszell-Parasit-Interaktion und der nachfolgenden intrazellulären Entwicklung des Parasiten
eine entscheidende Bedeutung haben.
In den Dichten Granula von S. muris Zystenmerozoiten (Bradyzoiten) sind drei
Hauptproteinbanden von 32, 26 und 21 kDa identifiziert worden. Während das 32 kDa-Protein
keinerlei enzymatische Aktivität besitzt, konnte das 26 kDa-Protein als Thiolproteinase
identifiziert werden. Für das 32 kDa-Protein wurde immunoelektronenmikroskopisch
nachgewiesen, daß es nach ca. 4 h eine durchgehende Schicht um den intrazellulären Parasiten
bildet. Diese Schicht verschwindet nach ca. 12 – 16 h wieder, und es wird vermutet, daß dies
durch den proteolytischen Abbau des 32 kDa-Proteins durch die 26 kDa-Thiolproteinase
verursacht wird.
Das Ziel dieser Arbeit war, durch die weiterführende molekularbiologische und
proteinchemische Charakterisierung der 26 kDa-Thiolproteinase aus den Dichten Granula von
S. muris Zystenmerozoiten, die Grundlage für die Entwicklung thiolproteinase-spezifischer
Inhibitoren zu schaffen, mit Hilfe derer die Interaktion von 32 kDa-Protein und 26 kDaThiolproteinase untersucht werden können. Ausgangspunkt der Untersuchungen war ein aus
dem Genom von S. muris amplifiziertes DNA-Fragment, welches für eine Thiolproteinase
kodiert.
In weiterführenden Experimenten wurden vollständige cDNA-Klone aus einer λ-ZAP-cDNABank von S. muris Zystenmerozoiten isoliert. Hierzu wurde die cDNA-Bank mit einer DNASonde durchmustert, die homolog zu dem bereits identifizierten Teilfragment einer
Thiolproteinase war. Aus 5*104 ausplattierten Phagen konnten zehn positiv reagierende Klone
isoliert werden, von denen einer (PH08) den vollständigen offenen Leserahmen für eine
Thiolproteinase enthielt. Das DNA-Insert des cDNA-Klon PH08 setzte sich aus einem 5´Nichtkodierungsbereich von 152 bp, einem offenen Leserahmen (orf SmTP1) von 1185 bp
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und einem 3´-Nichtkodierungsbereich von 357 bp zusammen. Der postulierte Leserahmen
kodierte für ein Polypeptid mit 395 Aminosäuren und einem theoretischen Molekulargewicht
von 44,48 kDa. Die Aminosäuresequenzanalyse ergab, daß eine aus 46 Aminosäuren
bestehende N-terminale Signalsequenz von einem Pro-Peptid mit einer Länge von 129
Aminosäuren gefolgt wird. Der enzymatisch aktive Teil des Polypeptids besitzt eine Länge von
219 Aminosäuren mit einer molaren Masse von 23,5 kDa. Der Molekulargewichtsunterschied
zum nativen Protein (ca. 26 kDa) wird durch Glykosylierung der einzigen, im reifen Enzym
vorhandenen N-Glykosylierungsstelle ausgeglichen. Der Hydrophobietest des hypothetischen
Translationsproduktes verdeutlichte einen überwiegend hydrophilen Charakter des Proteins. Es
konnten keine Bereiche identifiziert werden, die auf eine Insertion des Proteins in eine
Membran hindeuten. Die Suche in Proteindatenbanken ergab eine sehr starke Homologie zu
Cathepsin
L-ähnlichen
Proteinasen
vieles
Organismen.
Durch
den
Einsatz
von
Computerprogrammen konnte ein vorläufiges theoretischen dreidimensionales Proteinmodell
der 26 kDa-Thiolproteianse erstellt werden.
Durch die Durchführung von Southern-Blot-Hybridisierungsexperimenten konnte gezeigt
werden, daß das Gen, welches für die Thiolproteinase SmTP1 kodiert (smtp1),
höchstwahrscheinlich in nur einer Kopie im haploiden Genom von S. muris vorliegt.
Genomische DNA von S. muris wurde hierzu mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen
verdaut, gelelektrophoretisch aufgetrennt und anschließend auf eine Nylonmembran
transferiert. Im Anschluß an eine Hybridisierung mit einer DNA-Sonde, die homolog zum
offenen Leserahmen des cDNA-Klons PH08 war, konnten entweder nur einzelne Banden –
hier besaßen die Restriktionsenzyme keine Schnittstelle innerhalb des als Sonde eingesetzten
cDNA-Klons – oder Doppelbanden – das hier eingesetzte Restriktionsenzym besaß genau eine
Schnittstelle im als Sonde eingesetzten cDNA-Fragment – nachgewiesen werden.
Thiolproteinase-kodierende Gene, die homolog zum Gen smtp1 aus S. muris waren, konnten
durch PCR-Amplifikationen und Southern-Blot-Hybridisierungen in den Genomen von
Toxoplasma gondii und Babesia divergens nachgewiesen werden. In beiden Fällen waren die
aus den amplifizierten DNA-Fragmenten abgeleiteten Translationsprodukte Cathepsin Lähnliche Thiolproteinasen. Weiterhin konnten auch die für diese Proteinasen kodierenden Gene
in beiden Genomen in jeweils nur einer Kopie nachgewiesen werden.
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Um die intrazelluläre Lokalisation der 26 kDa-Thiolproteinase in den Zystenmerozoiten genau
zu bestimmen, wurde ein polyklonales Antiserum hergestellt, welches gegen ein stark
hydrophiles Teilpeptid der Thiolproteinase gerichtet war. Dieses polyklonale Antiserum wurde
anschließend bei immunoelektronenmikroskopischen Aufnahmen eingesetzt. Hier konnte
beobachtet werden, daß neben den Dichten Granula auch Strukturen innerhalb des
Zystenmerozoiten markiert wurden, die bei ähnlichen Untersuchungen anderer apikomplexer
Parasiten als Golgi-ähnliche Strukturen beschrieben wurden.
Die Voraussetzung für eine eingehende kristallographische Untersuchung der 26 kDaThiolproteinase ist die Aufreinigung der rekombinanten Thiolproteinase. Hierzu wurde der
offene Leserahmen orf SmTP1 in einen Expressionsvektor des Pichia pastorisÜberexpressionssystems
inseriert.
Im
Immunoblot
von
Gesamtzellextrakten
und
Expressionsüberständen transformierter P. pastoris X-33-Zellen wurden durch das gegen die
Thiolproteinase gerichtete Antiserum Fusionsproteine mit einem Molekulargewicht von ca.
27,5 kDa nachgewiesen. Unter Berücksichtigung der Größe des Fusionsanteils (ca. 1,5 kDa)
ergibt sich für das exprimierte Fremdprotein eine Größe von ca. 26 kDa, welches dem der
nativen Thiolproteinase aus den Dichten Granula entspricht.
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