Mycoplasma bovis - TiHo Bibliothek elib

M. bovis ISH
Aus dem Institut für Pathologie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
ISBN 3-939902-10-1
Verlag: DVG-Service GmbH
Frankfurter Straße 89 · 35392 Gießen
Telefon (06 41) 2 44 66 · Telefax (06 41) 2 53 75 · E-mail: [email protected] · http://www.dvg.net
Björn Jacobsen 2006
Nachweis von
Mycoplasma bovis
in der Lunge von
experimentell infizierten Kälbern
mittels in situ-Hybridisierung
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Veterinärmedizin
Björn Jacobsen
Hannover 2006
Bibliografische Informationen der Deutschen Bibliothek
Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie;
Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.
1. Auflage 2006
© 2006 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen
Printed in Germany
ISBN 3-939902-10-1
Verlag: DVG Service GmbH
Frankfurter Straße 89
35392 Gießen
0641/24466
[email protected]
www.dvg.net
Aus dem Institut für Pathologie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Nachweis von Mycoplasma bovis in der Lunge
von experimentell infizierten Kälbern
mittels in situ-Hybridisierung
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Björn Andreas Jacobsen
aus Husum/Nordsee
Hannover 2006
2
Inhaltsverzeichnis
Wissenschaftliche Betreuung:
Univ.-Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein
1. Gutachter:
Univ.-Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein
2. Gutachter:
Univ.-Prof. Dr. Peter Valentin-Weigand
Tag der mündlichen Prüfung:
15.11.2006
Diese Arbeit wurde gefördert durch ein Stipendium
der Friedrich-Ebert-Stiftung e. V., Bonn
Eigentlich ist alles gleichgültig,
wenn man Menschen hat, die man liebt.
Peter Iljitsch Tschaikowsky
Meiner Familie
6
Inhaltsverzeichnis
Teile der hier vorliegenden Arbeit wurden bereits als Kongressbeitrag präsentiert:
B. Jacobsen, W. Jechlinger, M. Zimmermann, J. Spergser, R. Rosengarten,
M. Hewicker-Trautwein (2006):
Detection and Localisation of Mycoplasma bovis in Lungs of Experimentally Infected
Calves by in situ-Hybridization.
16. internationaler Kongress der IOM (International Organization for
Mycoplasmology), 09.-14.06.2006, Cambridge, UK
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung............................................................................................................1
2
Literaturübersicht ..............................................................................................3
2.1
2.1.1
Charakteristika und Taxonomie .............................................................3
2.1.2
Pathogenitätsmechanismen bei Mykoplasmen ......................................5
2.1.3
Mykoplasmen als Krankheitserreger......................................................6
2.2
Mykoplasmosen des Rindes .........................................................................8
2.2.1
Lungenseuche .......................................................................................8
2.2.2
Mycoplasma bovis .................................................................................8
2.2.3
Sonstige Infektionen mit Mykoplasmen beim Rind.................................8
2.3
Mycoplasma bovis.........................................................................................9
2.3.1
Verbreitung ............................................................................................9
2.3.2
Erkrankung des Respirationstraktes ....................................................10
2.3.3
Weitere Erkrankungen durch Mycoplasma bovis .................................15
2.3.4
Immunantwort ......................................................................................17
2.3.5
Antigen- und Phasenvariation ..............................................................17
2.3.6
Immunprophylaxe ................................................................................19
2.3.7
Therapie...............................................................................................19
2.3.8
Diagnostik zum Erregernachweis.........................................................20
2.4
3
Mykoplasmen ................................................................................................3
In situ-Hybridisierung ..................................................................................20
2.4.1
Methode...............................................................................................20
2.4.2
Anwendung ..........................................................................................21
Material und Methoden ....................................................................................23
3.1
Kälber..........................................................................................................23
3.1.1
Gruppe 1 (Kontrollgruppe) ...................................................................23
3.1.2
Gruppe 2..............................................................................................23
3.1.3
Gruppe 3..............................................................................................25
3.1.4
Gruppe 4..............................................................................................27
3.2
Pathologisch-anatomische Untersuchung der Lungen................................28
3.3
Lungengewebeproben ................................................................................29
3.4
Histochemische Färbemethoden ................................................................30
3.4.1
Übersichtsfärbung mit Hämatoxylin und Eosin.....................................30
3.4.2
Azanfärbung nach Heidenhain.............................................................31
II
Inhaltsverzeichnis
3.4.3
3.5
In situ-Hybridisierung.................................................................................. 32
3.5.1
Sondensynthese.................................................................................. 32
3.5.2
Primer.................................................................................................. 33
3.5.3
PCR..................................................................................................... 33
3.5.4
Sondentests ........................................................................................ 34
3.5.5
Durchführung der in situ-Hybridisierung .............................................. 35
3.5.6
Chromogen.......................................................................................... 35
3.5.7
Kontrollmaterial ................................................................................... 36
3.5.8
Protokoll für die in situ-Hybridisierung ................................................. 36
3.5.9
Kontrolle der endogenen Peroxidasen ................................................ 38
3.5.10
Auswertung ......................................................................................... 38
3.6
Immunhistochemie ..................................................................................... 38
3.6.1
Antikörper ............................................................................................ 38
3.6.2
Chromogen.......................................................................................... 39
3.6.3
Kontrollen ............................................................................................ 39
3.6.4
Protokoll für die Immunhistochemie mit MAB970 ................................ 39
3.6.5
Auswertung ......................................................................................... 41
3.7
4
Siriusrot-Färbung F3B Technik............................................................ 32
Befunderhebung und Auswertung der Daten ............................................. 41
Ergebnisse ....................................................................................................... 43
4.1
Ergebnisse der Sondentestung .................................................................. 43
4.1.1
Nachweis von Mycoplasma bovis-DNA im Southern Blot ................... 43
4.1.2
Spezifitätstest ...................................................................................... 44
4.2
Histopathologische Ergebnisse .................................................................. 44
4.2.1
Gruppe 1 (Kontrollgruppe)................................................................... 44
4.2.2
Gruppe 2 ............................................................................................. 45
4.2.3
Gruppe 3 ............................................................................................. 45
4.2.4
Gruppe 4 ............................................................................................. 47
4.2.5
Zusammenfassung.............................................................................. 48
4.3
Ergebnisse der in situ-Hybridisierung ......................................................... 48
4.3.1
Gruppe 1 (Kontrollgruppe)................................................................... 48
4.3.2
Gruppe 2 ............................................................................................. 49
4.3.3
Gruppe 3 ............................................................................................. 49
Inhaltsverzeichnis
4.3.4
Gruppe 4..............................................................................................51
4.3.5
Zusammenfassung ..............................................................................53
4.4
Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchung ..............................53
4.4.1
Gruppe 1 (Kontrollgruppe) ...................................................................53
4.4.2
Gruppe 2..............................................................................................54
4.4.3
Gruppe 3..............................................................................................54
4.4.4
Gruppe 4..............................................................................................56
4.4.5
Zusammenfassung ..............................................................................58
4.5
5
III
Fotographische Dokumentation ..................................................................58
Diskussion ........................................................................................................67
5.1
Histopathologische Befunde .......................................................................67
5.2
Die Methode der in situ-Hybridisierung .......................................................72
5.3
Ergebnisse der in situ-Hybridisierung..........................................................74
5.4
Persistenz von Mycoplasma bovis ..............................................................77
5.5
Immunhistochemie ......................................................................................79
5.6
Diagnostik ...................................................................................................81
5.7
Schlussfolgerung ........................................................................................82
6
Zusammenfassung ..........................................................................................83
7
Summary...........................................................................................................87
8
Literaturverzeichnis .........................................................................................89
9
Anhang............................................................................................................107
9.1
Ergebnisse der Gruppen 1 bis 4 in tabellarischer Form ............................107
9.2
Lösungen für die Azanfärbung nach Heidenhain ......................................109
9.3
Siriusrot-Farblösung..................................................................................110
9.4
Lösungen für die Sondensynthese und- spezifizierung.............................110
9.5
Lösungen für die in situ-Hybridisierung .....................................................111
9.6
Lösungen für die Immunhistochemie ........................................................115
9.7
Bezugsquellen für Chemikalien.................................................................115
9.8
Bezugsquellen für Geräte und Einmalartikel .............................................118
Abkürzungsverzeichnis
I
Abkürzungsverzeichnis
A
Abb.
AP
Aqua bidest.
Aqua dest.
Adenin
Abbildung
alkalische Phosphatase
Aqua bidestillata
Aqua destillata
BALF
BALT
bronchioalveoläre Lavage-Flüssigkeit
engl. bronchus-associated lymphoid tissue (Bronchusassoziiertes lymphatisches Gewebe)
5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphat
Bestellnummer
engl. basepairs (Basenpaare)
bovines respiratorisches Synzytialvirus
bovines Serumalbumin
bovines Virusdiarrhoe-Virus
beziehungsweise
BCIP
Best. Nr.
bp
BRSV
BSA
BVDV
bzw.
ca.
C
°C
CD
CFU
circa
Cytosin
Grad Celsius
engl. cluster of differentiation (System zur Bezeichnung
von Leukozytendifferenzierungsantigenen)
engl. colony forming units (koloniebildende Einheiten)
d
DAB
d. h.
DIG
DNA
lat. dies (Tage)
3,3’-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid
das heißt
Digoxigenin
engl. deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)
EDTA
ELISA
engl.
et al.
Ethylendiamintetraessigsäure
engl. enzyme-linked immunosorbent assay (Enzym
gekoppeltes, immunologisch-adsorbierendes
Nachweisverfahren)
englisch
lat. et alii (= und andere)
Fa.
Firma
g
G
grie.
Gramm
Guanin
griechisch
HE
Hämatoxylin-Eosin
IHC
Immunhistochemie
II
Abkürzungsverzeichnis
ISH
in situ-Hybridisierung
kbp
kDa
Kilobasenpaare
Kilo Dalton
lat.
lateinisch
M
mg
ml
mm
µl
µm
M.
Min.
Molarität
Milligramm
Milliliter
Millimeter
Mikroliter
Mikrometer
Mycoplasma
Minuten
n
N
N. N.
Nr.
Anzahl
Normalität
lat. nomen nescio (nicht bekannt)
Nummer
p. a.
p. i.
PBS
lat. pro analysis (für analytische Zwecke)
lat. post infectionem
engl. phosphate-buffered saline (Phosphat-gepufferte
Kochsalzlösung)
engl. polymerase chain reaction (PolymeraseKettenreaktion)
PCR
RNA
engl. ribonucleic acid (Ribonukleinsäure)
SC
SPF
spp.
subsp.
small colony
spezifiziert pathogenfrei
lat. species
Subspezies
T
Tab.
Tris
Thymin
Tabelle
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
U
u.
Uracil
und
Vlp
Vsa
engl. variable lipoprotein (variables Lipoprotein)
engl. variable surface antigen (variables
Oberflächenantigen)
engl. variable surface protein (variables
Oberflächenprotein)
Vsp
z. B.
zum Beispiel
Einleitung
1
1 Einleitung
Mycoplasma (M.) bovis ist neben M. mycoides subsp. mycoides die wichtigste
pathogene Mykoplasmenart des Rindes, die weltweit auftritt und zunehmend an
Bedeutung gewinnt. Die häufigsten Erkrankungen durch M. bovis sind hierbei
Pneumonien und Arthritiden bei Kälbern und Mastitiden bei Kühen. Durch die
Erkrankungen entstehen Verluste, die gerade bei der Pneumonie der Kälber zu
großen wirtschaftlichen Schäden führen. Meist handelt es sich um therapieresistente
Erkrankungen des Respirationstraktes, für die zur Zeit noch kein zufrieden stellender
Impfschutz erhältlich ist.
Ziel dieser Arbeit war es, neben der histopathologischen Beschreibung von
Lungenveränderungen bei experimentell infizierten Kälbern die Methode der in situHybridisierung für M. bovis an Formalin-fixiertem und Paraffin-eingebettetem
Lungengewebe von diesen Kälbern zu etablieren. Dabei sollten die Verteilung und
die Lokalisation der DNA analysiert und mit immunhistochemischen Befunden
korreliert werden. Hierfür wurden Paraffinschnitte aus den Lungen experimentell
infizierter Kälber untersucht. Die verwendeten spezifischen Sonden detektierten die
Sequenz des Gens von VspA, einem variablen Oberflächenprotein (engl. variable
surface protein) von M. bovis. Frühere Untersuchungen zeigten, dass M. bovis
diverse variable Oberflächenproteine exprimiert. Es wird diskutiert, ob diese durch
eine Antigenvariation an der Persistenz des Erregers im Respirationstrakt beteiligt
bzw. für die fehlende Elimination desselben mitverantwortlich sind. Dabei war es von
besonderem Interesse, ob in den verschiedenen Gewebelokalisationen, in denen
immunhistochemisch Vsp-Antigene nachweisbar waren, auch die genomische
Sequenz des VspA von M. bovis aufgefunden werden kann.
Literaturübersicht
3
2 Literaturübersicht
2.1 Mykoplasmen
2.1.1 Charakteristika und Taxonomie
Die erste Mykoplasmenspezies wurde 1896 von NOCARD und ROUX (1896)
beschrieben. Hierbei handelte es sich um Mycoplasma (M.) mycoides subsp.
mycoides small colony (SC), dem Erreger der kontagiösen Pleuropneumonie beim
Rind. Seither wurden über 100 Mykoplasmenarten dokumentiert, welche sowohl aus
warm- und kaltblütigen Wirbeltieren als auch aus Insekten und Pflanzen sowie
Abwässern isoliert wurden (BOONE et al. 2001). Taxonomisch werden die
Mykoplasmen in die Klasse der Mollicutes (lat. mollis – weich, cutis – Haut)
eingeordnet. Hier werden vier Ordnungen unterschieden (Tabelle 1). Im Gegensatz
zu anderen Bakterien besitzen die Mykoplasmen keine Zellwand (RAZIN 1992).
Dieses führt zum einen zu einer pleomorphen Gestalt der 0,3 bis 0,8 µm großen
Bakterien (RAZIN 1978). Zum anderen bedingt sich dadurch eine natürliche
Resistenz gegenüber Antibiotika, die in die Zellwandsynthese eingreifen, wie
beispielsweise β-Laktam-Antibiotika. Auf Grund ihrer geringen Größe und der
Pleomorphie sind Mykoplasmen in der Lage, Bakterienfilter mit einer Porengröße von
0,45 µm zu passieren. Hierauf basierte die ursprüngliche Annahme zu Beginn des
20. Jahrhunderts, es handele sich um Viren (MASOVER u. HAYFLICK 1985; RAZIN
1992). Mykoplasmen sind unter bestimmten Bedingungen in der Lage, verzweigte
und unverzweigte, bis 150 µm lange Filamente auszubilden. Dieses pilzartige
Wachstum führte zu der Namensgebung (grie. myco – Pilz, plasma – Form) (RAZIN
1981). Ihrer geringen Größe entsprechend, besitzen Mykoplasmen das kleinste
Genom prokaryotischer Bakterien mit 600 bis 1350 kbp je nach Spezies und Stamm.
Daraus resultiert eine im Vergleich zu beispielsweise Escherichia coli auf ein Fünftel
verminderte Genausstattung (RAZIN 1992). Eine Besonderheit der Mykoplasmen ist
es, dass das Genom einen erstaunlich geringen Anteil an Guanin und Cytosin
aufweist
(DYBVIG
u.
VOELKER
1996).
4
Literaturübersicht
Tabelle 1: Taxonomie und Eigenschaften der Klasse Mollicutis (modifiziert nach
TULLY et al. 1993 und BOONE et al. 2001)
G/CGehalt
(in mol%)
Genomgröße
(in kbp)
Vorkommen
1. Gattung: Mycoplasma (112)
23-40
600-1350
Mensch, Tier
2. Gattung: Ureaplasma (7)
27-30
760-1170
Mensch, Tier
1. Gattung: Entomoplasma (6)
27-29
790-1140
Insekten, Pflanzen
2. Gattung: Mesoplasma (12)
27-30
870-1100
Insekten, Pflanzen
25-30
940-2200
Insekten, Pflanzen
Klassifizierung
(Anzahl bekannter Spezies)
1. Ordnung: Mycoplasmatales
Familie: Mycoplasmataceae
2. Ordnung: Entomoplasmatales
1. Familie: Entomoplasmataceae
2. Familie: Spiroplasmataceae
Gattung: Spiroplasma (34)
3. Ordnung: Acholeplasmatales
Familie: Acholeplasmataceae
Gattung: Acholeplasma (14)
Tiere, Pflanzen,
Insekten
26-30
1500-1650
1. Gattung: Anaeroplasma (4)
29-30
1500-1600
Pansen Rd. & Schf.
2. Gattung: Asteroleplasma (1)
40
1500
Pansen Rd. & Schf.
4. Ordnung: Anaeroplasmatales
Familie: Anaeroplasmataceae
G: Guanin, C: Cytosin, kbp: Kilobasenpaare, Rd.: Rind, Schf.: Schaf
Das Genom entstand während der Evolution wahrscheinlich aus einer Reduktion
ehemals Gram-positiver Bakterien (WOESE 1987). Dadurch haben Mykoplasmen
eingeschränkte
Stoffwechsel-
und
Biosynthesewege,
die
eine
überwiegend
parasitäre Lebensform bedingen (RAZIN 1992). Diese führt auch zu einigen
Problemen bei der Kultivierung der anspruchsvollen Mykoplasmen, die nur durch
Literaturübersicht
5
spezielle Nährmedien gewährleistet werden kann (RAZIN 1978). Auf festen
Nährböden zeigen Mykoplasmen ein charakteristisches Wachstum in Form von
Spiegelei-förmigen Kolonien von bis zu 600 µm Durchmesser, deren Zentrum durch
das Einwachsen der Zellen in den Agar dunkler als die Peripherie erscheint
(HAYFLICK 1969). Die meisten Mykoplasmenspezies sind unbeweglich. Bei einigen
Arten konnte jedoch eine aktive, gleitende Bewegung nachgewiesen werden
(KIRCHHOFF 1982).
2.1.2 Pathogenitätsmechanismen bei Mykoplasmen
Mykoplasmen besitzen als anspruchsvolle Mikroorganismen eine ausgesprochene
Wirts- und Speziesspezifität (BREDT 1976a). Sie besiedeln als Kommensale oder
Parasit
überwiegend
Schleimhautoberflächen
des
Respirations-
und
Urogenitaltraktes, aber auch Augen, Gelenke, Milchdrüse und andere Organe.
Hierbei nutzen sie Kapsel- und Adhärenzstrukturen, die zu einer engen Anlagerung
der Mykoplasmen zur Wirtszellmembran führt (RAZIN u. JACOBS 1992; SACHSE et
al. 1996). Einige Mykoplasmen des Menschen und der Tiere sind auch in der Lage,
in die Wirtszelle einzudringen (LO et al. 1992), wie es schon länger für die
Mykoplasmen der Insekten und Pflanzen bekannt war. Diese Eigenschaft findet sich
zum Teil auch in den Namen neu dokumentierter Arten wie M. penetrans des
Menschen wieder. Da sie keine Zellwand besitzen, sind sie durch gegen Bakterien
gerichtete lysosomale Enzyme des Wirtes nicht angreifbar (BREDT 1976a). Des
Weiteren vermögen sie durch Nährstoffentzug und Stoffwechselprodukte wie
Wasserstoffperoxid und Ammoniak zu einer Schädigung des Wirtes zu führen
(RAZIN 1981). Eine weitere Besonderheit ist die Fähigkeit der Mykoplasmen, die
wirtseigene Abwehr zu unterlaufen. Hierzu zählt zum einen die Hemmung ziliarer
Aktivitäten im Respirationstrakt (GABRIDGE et al. 1985). Zum anderen sind einige
Mykoplasmen in der Lage, in Form einer molekularen Mimikry eine Angleichung der
antigenen Strukturen an den Wirt zu erlangen, so dass bei einer Abwehrreaktion des
Wirtes
eine
Autoimmunreaktion
hervorgerufen
werden
kann
(TANGEN
u.
KIRCHHOFF 1995). Zudem zeigen einige Mykoplasmen eine ausgeprägte
Variabilität in den Oberflächenproteinen, die zu einer ständigen Änderung der
6
Literaturübersicht
antigenen Strukturen führt, wie sie beispielsweise für M. hyorhinis und M. bovis
beschrieben sind (ROSENGARTEN u. WISE 1991; ROSENGARTEN et al. 1994).
Zusätzlich ist für einige Mykoplasmenspezies eine Suppression von neutrophilen
Granulozyten, Lymphozyten und Makrophagen beschrieben (ALMEIDA et al. 1992;
BENNET u. JASPER 1977; THOMAS et al. 1991). Die im Rahmen einer Infektion mit
Mykoplasmen entstehenden Läsionen werden möglicherweise eher durch die
Abwehrmechanismen des Wirtes verursacht, als durch eine Mykoplasmen-vermittelte
Zerstörung von Gewebe (BREDT 1976b).
2.1.3 Mykoplasmen als Krankheitserreger
Mykoplasmen treten bei fast allen Spezies meist als Kommensalen auf. Es sind aber
auch verschiedene pathogene Arten beschrieben, wobei der Schweregrad der
Erkrankung von zahlreichen äußeren Einflüssen abhängt. Dadurch werden viele
Mykoplasmosen zu den so genannten Faktorenerkrankungen gezählt (KIRCHHOFF
u. RUNGE 1998). Ursprünglich ging man von einer extremen Wirtsspezifität der
Mykoplasmen aus. Doch gibt es zunehmend Beschreibungen von Isolierungen aus
„wirtsfremden“ Tieren. Dieses als „crossing“ bezeichnete Wechseln der Wirte hat
eine besondere Bedeutung bei Fällen von immunsupprimierten Patienten (PITCHER
u. NICHOLAS 2005).
In der Schweinehaltung ist M. hyopneumoniae weit verbreitet. Dieser führt als
alleiniger Erreger zu einer interstitiellen meist subklinisch verlaufenden Pneumonie
mit
Vermehrung
des
Bronchus-assoziierten
lymphatischen
Gewebes
(engl.
bronchus-associated lymphatic tissue, BALT). Durch die hierdurch beeinträchtigte
Abwehrleistung der Lunge kommt es in der Regel zu einer sekundären bakteriellen
Infektion, meist mit Bordetellen, Pasteurellen, aber auch Streptokokken und
Hämophilus parasuis. Daraus ergibt sich das Bild der enzootischen Pneumonie
(MAES et al. 1996; KIRCHHOFF u. RUNGE 1998).
Als weitere pathogene Mykoplasmenart beim Schwein wäre M. hyorhinis als Erreger
von respiratorischen Erkrankungen, Polyserositiden und Arthritiden zu nennen.
Arthritiden werden auch durch Infektionen mit M. hyosynoviae hervorgerufen
(KIRCHHOFF
u.
RUNGE
1998).
Eperythrozoon
suis,
der
Erreger
einer
Literaturübersicht
7
hämolytischen Anämie beim Schwein, wurde als M. haemosuis nachträglich in das
Genus der Mykoplasmen eingruppiert (NEIMARK et al. 2001).
Schafe und Ziegen entwickeln nach einer Infektion mit M. mycoides subsp. capri eine
kontagiöse Pleuropneumonie mit ähnlichem Krankheitsbild wie beim Rind.
Respiratorische Entzündungen werden ebenfalls durch M. ovipneumoniae und M.
capricolum subsp. capripneumoniae verursacht (KIRCHHOFF u. RUNGE 1998). M.
agalactiae führt zu dem Krankheitsbild der kontagiösen Agalaktie, ist aber auch in
der Lage, entzündliche Veränderungen an Gelenken, Augen und Urogenitaltrakt zu
verursachen (KIRCHHOFF u. RUNGE 1998).
An Ratten und Mäusen konnten durch experimentelle Infektionen mit M. arthritidis
wertvolle Erkenntnisse über die Entwicklung von Polyarthritiden, wie sie auch beim
Menschen vorkommen, gewonnen werden. Wie bei den oben genannten Tieren gibt
es auch bei Ratte und Maus mit M. pulmonis eine Spezies, die zu einer Infektion des
Respirationstraktes führt, wobei auch Arthritiden, Otitiden und Genitalinfektionen
möglich sind (KIRCHHOFF u. RUNGE 1998).
Eine Besonderheit stellt die bei Mäusen durch M. neurolyticum verursachte
Rollkrankheit dar. Hierbei werden die neuronalen Veränderungen durch ein Exotoxin
des Erregers hervorgerufen (KIRCHHOFF u. RUNGE 1998).
Für die bei Katzen (M. felis), Hunden (M. canis und M. cynos) und Pferden (M.
equirhinis und M. equigenitalis) isolierten Arten ist die definitive pathogene
Bedeutung noch unklar (KIRCHHOFF u. RUNGE 1998). Durch Neueingruppierung
von Haemobartonella felis als M. haemofelis in die Art der Mykoplasmen findet sich
eine für Katzen pathogene Art, welche zu einer hämolytischen Anämie führen kann
(NEIMARK et al. 2001).
Beim
Menschen
haben
Infektionen
mit
M.
pneumoniae
als
Erreger
von
respiratorischen Erkrankungen große Bedeutung. Die ebenfalls beim Menschen
nachgewiesenen Mykoplasmen M. genitalium, M. penetrans und M. fermentans
führen zunehmend, vor allem bei Patienten mit Immunschwäche wie bei Infektionen
mit dem humanen Immundefizienzvirus (HIV), zu ernst zu nehmenden Erkrankungen
(DOMINGUES et al. 2005).
8
Literaturübersicht
2.2 Mykoplasmosen des Rindes
2.2.1 Lungenseuche
Das Krankheitsbild der kontagiösen Pleuropneumonie (Lungenseuche), ist seit dem
18. Jahrhundert bekannt, allerdings gelang erst 1896 NOCARD und ROUX (1896)
die
Isolierung
des
Erregers
und
damit
auch
die
Isolierung
der
ersten
Mykoplasmenart. Der Erreger M. mycoides subsp. mycoides SC wurde 1929 das
letzte Mal in Deutschland nachgewiesen. In West- und Südeuropa kommt es
sporadisch zu Ausbrüchen, während die Erkrankung in Afrika und Asien trotz
Impfmaßnahmen noch sehr verbreitet ist und zu hohen wirtschaftlichen Verlusten
führt (KIRCHHOFF u. RUNGE 1998). Klinisch treten vor allem bei adulten Tieren
respiratorische Symptome auf, wobei Kälber eher Arthritiden, Endokarditiden und
Myokarditiden aufweisen. Es sind auch chronische, klinisch meist unauffällige
Erkrankungen möglich, die für die Epidemiologie des Erregers von großer Bedeutung
sind (KIRCHHOFF u. RUNGE 1998).
2.2.2 Mycoplasma bovis
Nach der Erstisolierung aus Milch Mitte der fünfziger Jahre in Schweden (ALSTRØM
1955) und der erstmaligen Beschreibung im Zusammenhang mit entzündlichen
Veränderungen bei einem Mastitisausbruch in Connecticut/USA 1961 (HALE et al.
1962) konnte M. bovis im Laufe der Jahre in nahezu allen Ländern der Erde
nachgewiesen werden. Wegen der Beteiligung an Mastitiden wurde der Erreger
zunächst
M.
agalactiae
var.
bovis
genannt.
Auf
Grund
phänotypischer
Charakterisierung und Nukleinsäure-Hybridisierung erfolgte eine Einteilung in eine
eigene Spezies (ASKAA u. ERNØ 1976). Auf die Eigenschaften und die durch M.
bovis verursachten Erkrankungen wird in Kapitel 2.3 näher eingegangen.
2.2.3 Sonstige Infektionen mit Mykoplasmen beim Rind
Neben M. bovis werden auch M. dispar und M. bovirhinis aus den Lungen gesunder
und
erkrankter
Rinder
isoliert.
Hierbei
sind
allerdings
die
beobachteten
Veränderungen weniger stark ausgeprägt als bei Infektionen mit M. bovis
(DUNGWORTH 1993). Da M. bovirhinis bei bis zu 40% gesunder Kälber
Literaturübersicht
9
beispielsweise in Norddeutschland aus dem Nasenraum isoliert werden konnte,
handelt es sich hierbei möglicherweise um eine apathogene Mykoplasmenart
(KIRCHHOFF u. BINDER 1986). Zusätzlich konnten experimentell Pneumonien mit
M. bovigenitalium verursacht werden; diese Spezies wird allerdings selten aus
pneumonischem Lungengewebe isoliert (DUNGWORTH 1993).
Mastitiden können durch eine Vielzahl von Mykoplasmen beim Rind verursacht
werden. Zu der ersten mit einer Entzündung des Euters in Zusammenhang
gebrachten Art gehört M. bovigenitalium (STUART et al. 1963), wobei der Erreger
auch zu Entzündungen im Genitaltrakt führen kann (KIRCHHOFF 1982). Ebenfalls
zu den Erregern von Mastitiden werden M. canadense, M. alkalescens, M. arginini,
M. dispar und M. californicum genannt (GONZALES u. WILSON 2003). Letztere Art
wird auch im Zusammenhang mit Arthritiden beschrieben (HEWICKER-TRAUTWEIN
et al. 2002). Da M. californicum auch Pneumonien verursachen kann, hat diese Art
neben M. bovis eine große Bedeutung bei dem so genannten „Pneumonie-ArthritisSyndrom“ der Kälber (SPERGSER et al. 2001; HEWICKER-TRAUTWEIN et al.
2002).
Bei der Infektiösen Bovinen Keratokonjunktivitis (IBK) wird M. bovoculi eine
ätiologische Rolle zugesprochen, möglicherweise als Wegbereiter für eine Infektion
mit Moraxella bovis (ERNØ u. PERREAU 1985).
2.3 Mycoplasma bovis
2.3.1 Verbreitung
M. bovis ist neben dem Erreger der Lungenseuche M. mycoides subsp. mycoides SC
die für das Rind pathogenste Mykoplasmenart. M. bovis gilt als streng
wirtsspezifisch, wobei allerdings neben dem Rind natürliche Infektionen bei Schafen
beschrieben sind (PFÜTZNER u. SACHSE 1996). Experimentell können zudem
Ziegen mit M. bovis infiziert werden (RODRÍGUEZ et al. 2000). Nach der
Erstisolierung aus einem Mastitisfall 1961 (HALE et al. 1962) folgte ein Nachweis des
Erregers, mutmaßlich verstärkt durch internationale Tiertransporte in vielen Staaten
unter anderem auch in Deutschland im Jahr 1975 (WEHNERT et al. 1977). In
einzelnen Regionen findet sich eine sehr unterschiedliche Prävalenz (NICOLET
10
Literaturübersicht
1994), wobei zu berücksichtigen ist, dass M. bovis nicht bei allen Untersuchungen
routinemäßig erfasst wird. Gerade bei den Lungenveränderungen treten sekundär
Keime wie Mannheimia haemolytica, Pasteurella multocida und Histophilus somni
(ehemals Haemophilus somnus, ANGEN et al. 2003) auf, die eine Infektion mit M.
bovis in den Hintergrund drängen (NICHOLAS u. AYLING 2003). Neuere
Untersuchungen in verschiedenen Ländern Europas zeigen, dass eine zunehmende
M. bovis-Prävalenz zu verzeichnen ist. So konnten KUSILUKA et al. (2000) in
Dänemark einen Anstieg der M. bovis-Prävalenz innerhalb von fünf Jahren von 2%
auf 24% feststellen. In Irland und Nordirland, die bis Anfang der 90er Jahre des
letzten Jahrhunderts als M. bovis frei galten (REILLY et al. 1993), konnten bei 18%
bzw. 15% der pneumonischen Kälberlungen M. bovis isoliert werden (BRICE et al.
2000; BYRNE et al. 2001). Untersuchungen von VOGEL et al. (2001) ergaben sogar
eine M. bovis-Prävalenz von 69% in pneumonisch veränderten Lungen von Kälbern
in der Schweiz. LE GRAND et al. (2001) konnten zeigen, dass in Frankreich 2% bis
13% der Tiere serologisch positiv für M. bovis waren. In Australien wiesen sogar 60%
der Tiere Antikörper gegen M. bovis auf (GHADERSOHI et al. 2005). Auf Grund
jüngster Untersuchungen in den Niederlanden ist zu vermuten, dass 25% bis 30%
der Pneumonien beim Kalb primär durch M. bovis verursacht werden und dass
daraus ein wirtschaftlicher Schaden von 45 bis 55 Euro pro Kalb in einem
Milchviehbetrieb und sogar bis zu 117,50 Euro pro Kalb in einem Mastbetrieb
entstehen (GEVAERT 2006). REEVE-JOHNSON (1999) schätzt den jährlichen
Schaden durch M. bovis bedingte Pneumonien und damit einhergehende Verluste
auf bis zu 576 Millionen Euro für den europäischen Raum. Epidemiologischen
Untersuchungen zu Folge war der wesentliche Risikofaktor für eine Einschleppung
von M. bovis in Milchviehbestände der Zukauf von Kälbern wie auch von Milchkühen
(BURNENS et al. 1999). Trotz einer wachsenden Bedeutung wäre eine Eradikation
möglich, solange wenige Tiere positiv sind, womit allerdings eine ständige
serologische Kontrolle unabdingbar wäre (TER LAAK et al. 1992).
2.3.2 Erkrankung des Respirationstraktes
Die in der Lunge von Kälbern nach spontaner oder experimenteller Infektion mit M.
bovis beschriebenen Läsionen variieren zwischen interstitiellen pneumonischen
Literaturübersicht
Veränderungen,
11
katarrhalisch-eitrigen
Bronchopneumonien
unterschiedlichen
Ausmaßes bis hin zu schwerwiegenden Pneumonien, bei denen multiple
Nekroseherde und obliterierende Bronchiolitiden im Lungenparenchym auftreten
(THOMAS et al. 1975; GOURLAY et al. 1989; ADEGBOYE et al. 1995a;
RODRÍGUEZ et al. 1996a; HEWICKER-TRAUTWEIN et al. 2002; BUCHENAU
2003).
Bei M. bovis handelt es sich um einen Keim, der Infektionen mit anderen bakteriellen
wie viralen Erregern durch eine Beeinträchtigung der Abwehrlage des Wirtes
begünstigt (POUMARAT et al. 2001). BUCHVAROVA und VESSILINOVA (1989)
zeigten durch Untersuchungen von Lungen an Pneumonie verendeter Kälber, dass
ein Drittel eine alleinige Infektion mit M. bovis aufwies, während die verbliebenen
zwei Drittel eine Kombination von M. bovis mit Pasteurella multocida und/oder
Histophilus somni zeigten.
2.3.2.1 Spontaninfektionen
Kälber unterschiedlichen Alters sind empfänglich für eine respiratorische M. bovisInfektion. Meist tritt diese in den betroffenen Betrieben enzootisch auf, wobei häufig
zeitnah ein Auftreten von Mykoplasmenmastitiden bei Kühen zu beobachten ist
(BOCKLISCH et al. 1983). Nach einer primär respiratorischen Infektion kann eine
hämatogene Ausbreitung stattfinden (BOCKLISCH et al. 1983). Meist kommt es
zwischen der ersten und dritten Lebenswoche zu den ersten Anzeichen einer
respiratorischen Erkrankung in Form von Dyspnoe, Husten und Nasenausfluss.
Begleitend tritt häufig Fieber bis 41°C, Inappetenz und allgemeine Schwäche auf.
Das zeitnahe Auftreten von Gelenksentzündungen wurde von ROMVÁRY et al.
(1979) als „Pneumonie-Arthritis-Syndrom“ bezeichnet. Vereinzelt kommt es zu
Todesfällen, in der Regel allerdings zu einer verminderten Gewichtszunahme
(STIPKOVITS et al. 2000b). Die pathologisch-anatomischen Veränderungen
variieren
zwischen
geringgradigen
lobulär
begrenzten
katarrhalisch-eitrigen
Bronchopneumonien in den Spitzenlappen, vorwiegend bei alleiniger Isolierung von
M. bovis, bis hin zu schweren fibrinös-nekrotisierenden Pleuropneumonien, die große
Teile der Lunge bis hin zu den kranioventralen Anteilen der Zwerchfellslappen
betreffen (BOCKLISCH et al. 1983; STIPKOVITS et al. 2000b). Die interlobulären
12
Literaturübersicht
Septen sind verdickt und weisen ein fibrinreiches Ödem auf, und aus den Bronchien
ist ein muköses bis eitriges Exsudat abpressbar (STIPKOVITS et al. 2000b).
Schwere Infektionen sind meist Folge einer Mischinfektion mit beispielsweise
Pasteurellen (BOCKLISCH et al. 1983). Bei der histologischen Untersuchung des
Lungengewebes zeigt sich das Bild einer exsudativen Bronchopneumonie mit z. T.
zerfallenden neutrophilen Granulozyten, mononukleären Entzündungszellen und
fibrinreicher Ödemflüssigkeit in Alveolen und Bronchioli. Durch Zellinfiltrate und
Ödeme sind auch die alveolären Septen erweitert und verdickt (THOMAS et al. 1975;
GOURLAY et al. 1989; RODRÍGUEZ et al. 1996a; STIPKOVITS et al. 2000b).
Verschiedene Autoren beschrieben eine nekrotisierende Bronchiolitis sowie fokale
Koagulationsnekrosen mit amorphem eosinophilen Material im Zentrum, umgeben
von einem schmalen Saum pyknotischer Zellkerne (meist von neutrophilen
Granulozyten)
und
einer
breiten
Schicht
aus
überwiegend
mononukleären
Entzündungszellen (GOURLAY et al. 1989; ADEGBOYE et al. 1995a; RODRÍGUEZ
et al. 1996a). KHODAKARAM-TAFTI und LÓPEZ (2004) beschrieben zwei
unterschiedliche Formen von Nekrosen, die sie bei Kälbern mit natürlicher Infektion
fanden. Zum einen fand sich eine Koagulationsnekrose mit noch erkennbaren
alveolären Strukturen mit Massen von neutrophilen Granulozyten und Fibrin. Zum
anderen war eine verkäsende Form der Nekrose ohne erkennbare Lungenstruktur
mit umgebendem Granulationsgewebe nachweisbar, wobei beide Nekroseformen
zeitgleich in der Lunge eines Tieres vorkamen.
2.3.2.2 Experimentelle Infektionen
Durch die endobronchiale bzw. intratracheale Infektion drei bis sieben Wochen alter
gnotobiotischer Kälber mit einem bei einem Ausbruch respiratorischer Erkrankungen
in England isolierten Stamm bewiesen GOURLAY et al. (1976) die Pathogenität von
M. bovis im Lungengewebe. Seitdem wurde eine Vielzahl von Infektionsversuchen
durchgeführt, welche die Pathogenität und deren Mechanismen von M. bovis
erhellen sollten. Hierbei gab es zum einen Arbeitsgruppen, die Versuche an
gnotobiotisch gehaltenen Kälbern durchführten (THOMAS et al. 1986; HOWARD et
al. 1987a). Andere Gruppen griffen auf konventionell gehaltene Kälber zurück
(MARTIN et al. 1983; PFÜTZNER et al. 1983; BRYS et al. 1989; STIPKOVITS et al.
Literaturübersicht
13
2000a). Für die Versuche wurden jeweils aus natürlichen Infektionen stammende
Feldisolate verwendet. Diese wurden entweder intratracheal, endobronchial,
intranasal oder mittels eines Sprays im Abstand von 10 cm vor der Nase appliziert.
Die Tötung der Tiere erfolgte nach 10 bis 14 Tagen bzw. 21 Tagen nach der
Infektion. Trotz des unterschiedlichen Versuchsaufbaus wurden ähnliche Ergebnisse
erlangt.
Wenige
der
Kälber
zeigten
klinische
Symptome.
Diese
waren
vorübergehende Pyrexie, Tachypnoe, Husten, Apathie und Lahmheit (GOURLAY et
al. 1976; RODRÍGUEZ et al. 1996a). Meist blieben seröser, zum Teil auch
mukopurolenter (BRYS et al. 1989) Nasenausfluss oder vorübergehendes Fieber das
einzige Symptom (PFÜTZNER et al. 1983; RODRÍGUEZ et al. 1996a). Lediglich in
den von STIPKOVITS et al. (2000a) durchgeführten Versuchen kam es zu einzelnen
Todesfällen, die auf eine Sekundärinfektion mit Pasteurella multocida und damit
einhergehender
verstärkter
Entzündungsreaktion
zurückzuführen
waren.
Die
anschließende Sektion der Tiere ergab auch bei klinisch gesunden Tieren eine
Verfestigung des Lungenparenchyms, die bis zu 25% des Gewebes ausmachte.
Diese fand sich in der Regel in den Spitzen- und Mittellappen sowie im Lobus
accessorius und wies nur bei stark veränderten Lungen eine Ausbreitung in die
kranioventralen Bereiche der Hauptlappen auf (MARTIN et al. 1983). Histologisch
zeigten Kälber mit geringen makroskopischen Veränderungen ein überwiegend aus
neutrophilen Granulozyten zusammengesetztes entzündliches Exsudat in den
Lumina von Bronchiolen. Um die Bronchien akzentuiert fand sich eine interstitielle
Pneumonie sowie eine Proliferation der Lymphfollikel des BALT (MARTIN et al.
1983). Mit Zunahme der Entzündungsprozesse bei Tieren mit makroskopischen
Veränderungen
zeigten
sich
katarrhalische
bis
katarrhalisch-eitrige
Bronchopneumonien, die durch Einbeziehung von Nachbarläppchen konfluierend
auftraten. Bei den Tieren mit den ausgeprägtesten Lungenveränderungen wurden
lobuläre eitrige Bronchopneumonien mit Tendenz zur Einschmelzung, fibrinöse
Exsudationen und Abszessbildung gefunden (MARTIN et al. 1983). Meist wurden in
diesen Fällen außer M. bovis noch weitere Bakterien wie Mannheimia haemolytica
aus den veränderten Arealen isoliert. Auch HOWARD et al. (1987a) und
STIPKOVITS et al. (2000a) konnten bei den experimentell infizierten Kälbern
14
Literaturübersicht
Koagulationsnekrosen unterschiedlicher Ausprägung nachweisen. Die zentralen
Nekrosen wurden von einem schmalen Saum untergehender Zellen sowie einer sich
daran anschließenden breite Schicht aus mononukleären Entzündungszellen
umgeben. Gleichartige Nekrosen wurden auch von THOMAS et al. (1986)
beschrieben, wobei hier in größeren Nekrosearealen Überreste von Alveolen und
kleinen Bronchioli gefunden wurden, die als „ghost lung structures“ bezeichnet
wurden. Eine Proliferation des peribronchiolären lymphatischen Gewebes wurde von
allen Autoren in unterschiedlicher Ausprägung beschrieben. Diese führt zum Teil zu
einer vollständig die Bronchien umgebenden Lymphozytenscheide, welche auch als
„cuff“-Bildung bezeichnet wird (BRYS et al. 1989). STIPKOVITS et al. (2000a)
stellten zudem mikroskopisch Zilienverluste und degenerative Veränderungen
zilientragender Zellen des Epithels der mit M. bovis infizierten Kälber fest.
2.3.2.3 Immunhistologische Befunde
In mehreren Untersuchungen wurde mittels immunhistochemischer Methoden M.
bovis-Antigen mit polyklonalen und monoklonalen Antikörpern nachgewiesen
(THOMAS et al. 1986; HOWARD et al. 1987a; GOURLAY et al. 1989; ADEGBOYE
et al. 1995a; RODRÍGUEZ et al. 1996a; LINKNER et al. 2000; BUCHENAU 2003;
KHODAKARAM-TAFTI u. LÓPEZ 2004). Gerade im Randbereich nekrotischer
Veränderungen wurde mittels Immunperoxidase-Technik mit gegen M. bovis
gerichtetem Kaninchenserum als primärer Antikörper Antigen nachgewiesen. Dieses
lag in Assoziation zu den untergehenden Zellen oder extrazellulär (THOMAS et al.
1986; HOWARD et al. 1987a; GOURLAY et al. 1989; RODRÍGUEZ et al. 1996a). Die
Darstellung von M. bovis-Antigen in der Umgebung von Nekrosearealen gelingt
RODRÍGUEZ et al. (1996a, b) zudem mit einem monoklonalen Antikörper der
Bezeichnung 5A10 sowie ADEGBOYE et al. (1995a) mit einem Antikörperpool aus
drei monoklonalen Antikörpern aus Mäuseaszitesflüssigkeit (Bezeichnung der Klone:
MYB57, MYB87, MYB163), die mit dem M. bovis-Stamm M23 erzeugt wurden. Auch
im Zentrum von Nekrosen konnten RODRÍGUEZ et al. (1996a) und HOWARD et al.
(1987a) M. bovis-Antigen darstellen. In den beiden Nekroseformen, die von
KHODAKARAM-TAFTI und LÓPEZ (2004) beschrieben wurden, fanden sich in allen
Bereichen der Nekrosen M. bovis-Antigen, wobei in der Koagulationsnekrose eine
Literaturübersicht
15
deutliche Akzentuierung im Randbereich vorhanden war. Im Bereich der Luftwege
konnte M. bovis-Antigen im Exsudat im Bronchiallumen nachgewiesen werden
(THOMAS et al. 1986; HOWARD et al. 1987a; GOURLAY et al. 1989; RODRÍGUEZ
et al. 1996a). Aber auch Antigen in Form granulärer Strukturen in Bronchial- und
Bronchiolarepithelzellen
fanden
ADEGBOYE
et
al.
(1995a,
b)
mit
einem
monoklonalen Antikörperpool gegen M. bovis, GOURLAY et al. (1989) mit
Kaninchenantiserum und RODRÍGUEZ et al. (1996a) mit einem monoklonalen
Antikörper (Klon 5A10). RODRÍGUEZ et al. (1996a) konnten zudem bei experimentell
infizierten Kälbern an der Oberfläche von Epithelzellen kleinerer Bronchien und
Bronchiolen Antigen nachweisen. LINKNER et al. (2000) sowie BUCHENAU (2003)
fanden in ihren Untersuchungen ähnliche Verteilungen von Antigen. Zusätzlich
konnte hier M. bovis-Antigen im Bereich der Alveolarwände mittels monoklonaler
Antikörper (1E5, 1A1, 4D7) nachgewiesen werden.
2.3.3 Weitere Erkrankungen durch Mycoplasma bovis
Durch eine hämatogene Streuung treten bei Kälbern im Gefolge von Pneumonien
häufig
Polyarthritiden
Gelenkkapselgewebes
auf,
die
mit
zum
durch
schwerwiegende
Nekrosen
des
destruierenden
Knorpel-
und
Teil
Knochenveränderungen gekennzeichnet sind (ROMVÁRY et al. 1979; CORBOZ et
al. 1980; HEWICKER-TRAUTWEIN et al. 2003). Diesem Krankheitsbild wurde der
Begriff „Pneumonie-Arthritis-Syndrom“ gegeben (ROMVÁRY et al. 1979). Die
Veränderungen von meist fibrinopurulentem Charakter können sich auch auf die die
Gelenke
umgebenden
Strukturen
ausweiten
und
somit
beispielsweise
zu
Tendovaginitiden führen (ADEGBOYE et al. 1996). GAGEA et al. (2006)
diagnostizierten in einer Studie an natürlich mit M. bovis infizierten Kälbern bei 46%
der Tiere mit pneumonischen Lungen zusätzlich eine Arthritis. Einige Autoren
beschreiben bei Kälbern mit entzündlichen Lungenveränderungen mit Nachweis von
M. bovis eitrige Otitiden, aus denen ebenfalls M. bovis isoliert werden konnte (WALZ
et al. 1997; MAEDA et al. 2003). STIPKOVITS et al. (1993) und AYLING et al. (2005)
beschreiben den Nachweis von M. bovis aus entzündlich verändertem Gehirn bei
Kälbern, und KINDE et al. (1993) wiesen M. bovis aus Dekubitalabszessen bei
16
Literaturübersicht
Kälbern nach. Eine Keratokonjunktivitis kann ebenfalls Folge einer Infektion mit M.
bovis sein (KIRBY u. NICHOLAS 1996).
Bei Kühen kommt es durch eine aufsteigende Infektion durch den Zitzenkanal zu der
enzootischen Mastitis, wobei subklinische Infektionen mit der Tendenz zur Persistenz
relativ häufig auftreten (GONZALEZ u. WILSON 2003). Diese sind epidemiologisch
ein kritischer Faktor, zumal durch den Melkvorgang als auch über mit kontaminierter
Milch verschmutzte Liegeflächen ein Infektionsrisiko für die restlichen Tiere der
Herde gegeben ist (PFÜTZNER u. SACHSE 1996). Die Mykoplasmenmastitis, die zu
jedem Zeitpunkt der Laktation, allerdings gehäuft zum Zeitpunkt des Abkalbens
auftreten kann, beginnt meist akut (PFÜTZNER u. SACHSE 1996). Die verhärteten
und vergrößerten Viertel sind nicht schmerzempfindlich, und der Milchcharakter ist
stark verändert. Die Milchleistung nimmt stark ab, wobei es auch zum völligen
Sistieren der Milchproduktion kommen kann (PFÜTZNER 1990). Durch die
Ausscheidung von M. bovis über die Milch ist auch eine mögliche Infektionsquelle für
Kälber bei der Aufnahme der Kolostralmilch bzw. bei der Aufzucht mit Vollmilch
gegeben. GHADERSOHI et al. (1999) untersuchten die Prävalenz von M. bovis in
Milchviehbeständen in Australien. Bei 77% der Kühe mit hoher Zellzahl konnte M.
bovis nachgewiesen werden. Ob durch eine hämatogene Streuung von einer Mastitis
eine Besiedelung des Genitaltraktes möglich ist, oder ob es sich hierbei um
aszendierende Infektionen handelt, ist unklar (PFÜTZNER u. SACHSE 1996).
Infektionen des Genitaltraktes führen zu Endometritis und Salpingitis (HARTMANN et
al. 1964; KIRCHHOFF 1982). Eine Infektion des Uterus kann zudem zu einer
verschlechterten Fertilisation (EAGLESOME u. GARCIA 1990) und verlängerten
Rast- und Zwischenkalbezeit führen (UHAA et al. 1990a, b). Ebenfalls beschrieben
sind Spätaborte mit Nachweis von M. bovis (BOCKLISCH et al. 1986) sowie die
Geburt lebensschwacher Kälber und Nachgeburtsverhaltung (GRUNERT et al.
1992). GRUNERT et al. (1992) beschrieben auch das Auftreten von Arthritiden,
Tendovaginitiden, Gliedmaßenverkrümmung und Pneumonie bei in utero infizierten
Kälbern. Bei Bullen führt eine aufsteigende Infektion im Genitaltrakt zu einer
seminalen Vesikulitis, Epididymitis, Periorchitis und Ampullitis (KIRCHHOFF 1982).
Literaturübersicht
17
Über das kontaminierte Sperma ergibt sich eine mögliche Route für die
Einschleppung des Erregers in einen Bestand.
2.3.4 Immunantwort
Mehrere Untersuchungen zeigen, dass der Wirtsorganismus nach einer Infektion mit
M. bovis mit einer humoralen Immunantwort, das heißt mit der Bildung von
Immunglobulinen reagiert. Diese sind in der Tracheobronchialflüssigkeit und im
Zytoplasma von Immunzellen nachweisbar, die im Lungengewebe akkumulieren
(HOWARD et al. 1986, 1987a). Des Weiteren kommt es im Lungengewebe zu einer
Proliferation des peribronchialen und –bronchiolären lymphatischen Gewebes (so
genanntes bronchus-associated lymphoid tissue, BALT) (GOURLAY et al. 1976;
MARTIN et al. 1983; RODRÍGUEZ et al. 1996a; HEWICKER-TRAUTWEIN et al.
2002; BUCHENAU 2003). Trotz dieser sich bei infizierten Tieren entwickelnden
Immunantwort ist der Erreger bzw. das Erregerantigen noch mehrere Wochen nach
der Infektion in den Lungen der Tiere nachweisbar. Bislang ist der Mechanismus, der
es M. bovis ermöglicht, im Respirationstrakt des Wirtes zu persistieren, unklar. Es
wird jedoch angenommen, dass eine in der Lunge des Wirtes erfolgende
Antigenvariation des Erregers an der Persistenz beteiligt bzw. für die fehlende
Elimination
desselben
mitverantwortlich
ist
(NICHOLAS
u.
AYLING
2003;
ROSENGARTEN et al. 2000). Zudem gibt es Untersuchungen von beispielsweise
M. dispar, die zeigen, dass Kapselbestandteile einen inhibitorischen Effekt auf bovine
Alveolarmakrophagen haben und somit für die Ausbreitung während der Infektion
von Bedeutung sind (ALMEIDA et al. 1992). VANDEN BUSH u. ROSENBUSCH
(2004) konnten ein die Lymphozyten hemmendes Peptid nachweisen, welches von
M. bovis synthetisiert wird.
2.3.5 Antigen- und Phasenvariation
Bei dem auch als „Phasenvariation“ oder „Switching“ bezeichneten Phänomen der
Antigenvariation kommt es durch spontanes An- und Abschalten der Synthese von
Membranproteinen zur ständigen Änderung der antigenen und strukturellen
Eigenschaften
der
Membranoberfläche
des
Erregers.
Die
variablen
Oberflächenproteinantigene von M. bovis, bei denen es sich um Lipoproteine
handelt, werden als „variable surface proteins“ (Vsps) bezeichnet (BEHRENS et al.
18
Literaturübersicht
1994). Bislang kennt man die Nukleotidsequenzen von 13 verschiedenen Genen, die
jeweils ein Vsp exprimieren (LYSNYANSKY et al. 2001b). Darüber hinaus besitzt
M. bovis ein weiteres, nicht mit den Vsps verwandtes Oberflächenprotein, welches
die Bezeichnung pMB67 trägt (BEHRENS et al. 1996). Untersuchungen an natürlich
und experimentell mit M. bovis infizierten Kälbern zeigen, dass drei Mitglieder der
Vsp-Familie, nämlich VspA, VspB und VspC, stark immunogen sind und die
humorale Immunantwort stimulieren, wobei Antikörper produziert werden, die
spezifisch mit den Vsps von M. bovis reagieren (BRANK et al. 1999). Die bislang zur
Antigenvariation von M. bovis existierenden Erkenntnisse sprechen dafür, dass die
Vsps nicht nur beim Vorgang der Adhärenz an Wirtszellen beteiligt sind, sondern
dass es dem Erreger aufgrund des Phänomens der Antigenvariation gelingt, sich
trotz der Immunantwort des Wirtes der Elimination aus dem Respirationstrakt zu
entziehen (SACHSE et al. 1996, 2000; LYSNYANSKY et al. 2001b).
Die zur Antigenvariation von M. bovis bislang vorliegenden Erkenntnisse beruhen im
Wesentlichen auf Untersuchungen an kultivierten Mikroorganismen, d. h. auf in vitro
durchgeführten
Experimenten.
Immunhistochemische
Untersuchungsergebnisse
sprechen jedoch dafür, dass es auch in vivo, also im Wirtsgewebe, zur Expression
variabler
Oberflächenproteinantigene
von
M.
bovis
kommt.
In
diesen
immunhistochemischen Untersuchungen konnten in Paraffin- bzw. Gefrierschnitten
aus Lungen experimentell infizierter Kälber Vsp-Antigene und pMB67-Antigen von M.
bovis mit verschiedenen monoklonalen Antikörpern (Klone 1E5, 1A1, 4D7, I2)
nachgewiesen werden (LINKNER et al. 2000; BUCHENAU 2003). Die verwendeten
monoklonalen Antikörper besitzen Spezifitäten für VspA, B und C (Klone 1E5 und
4D7), für VspA, C und andere, noch nicht definierte Vsps (Klon 1A1) oder für pMB67
(Klon I2) (ROSENGARTEN et al. 1994; LE GRAND et al. 1996; BEIER et al. 1998).
So wurde in Lungengewebe experimentell infizierter Kälber mit den genannten
monoklonalen Antikörpern eine immunhistochemische Reaktivität für Vsp-Antigene
an der Bronchialepitheloberfläche, im Bronchialexsudat, auf der Alveolaroberfläche,
in interalveolären Septen, im Randbereich von Nekrosen und im Zytoplasma von
Makrophagen und neutrophilen Granulozyten festgestellt (LINKNER et al. 2000;
BUCHENAU
2003).
Des
Weiteren
wurde
in
diesen
Untersuchungen
ein
Literaturübersicht
Reaktionsprodukt
Basalmembran
19
auch
des
im
Zytoplasma
Bronchialepithels
von
und
Bronchialepithelzellen,
im
Bereich
des
an
der
proliferierten
peribronchiolären Gewebes gefunden.
2.3.6 Immunprophylaxe
Zur Zeit ist keine kommerzielle Vakzine gegen M. bovis verfügbar, die einen
vollständigen Schutz vor einer Infektion geben würde. Bei den im Schrifttum
beschriebenen Vakzinationsversuchen, in denen mit Formaldehyd oder Saponin
inaktivierte M. bovis-Stämme eingesetzt wurden, war zwar eine deutliche Reduktion
des Ausmaßes der Lungenveränderungen und der Todesfälle zu verzeichnen, ein
vollständiger Infektionsschutz wurde jedoch nicht erzielt (HOWARD et al. 1987a;
BRYSON et al. 1999; NICHOLAS et al. 2002).
2.3.7 Therapie
Die Behandlung mit M. bovis infizierter Kälber ist in der Regel erfolglos, da bei vielen
europäischen
Stämmen
eine
zunehmende
Resistenz
gegenüber
Antibiotika
festgestellt wurde (AYLING et al. 2000). Die antibiotische Therapie hat allerdings ihre
Berechtigung zur Eindämmung sekundärer Infektionen. Fluoroquinolone wie
beispielsweise das Danofloxacin und Tylosin zeigten sich 1993 in vitro noch gegen
M. bovis antimikrobiell wirksam (COOPER et al. 1993), wobei sich gegen Tylosin
mittlerweile Resistenzen ausgebildet haben, welche auch für Oxytetracyclin und
Tetracykline auftreten (THOMAS et al. 2003). Gentamycin, Lincomycin und
Spectinomycin haben sich als wenig effektiv bei der Behandlung bzw. Vorbeuge von
M. bovis bedingter Erkrankungen erwiesen (THOMAS et al. 2003; VISSER et al.
1999). Somit zeigt zur Zeit nur Danofloxacin einen befriedigenden Therapieansatz
zur Bekämpfung von M. bovis. Vorbeugende Maßnahmen bei M. bovis-Infektionen
umfassen
allgemeine
Beachtung
technischer,
hygienischer
und
anderer
Managementfaktoren, regelmäßige Bestandskontrollen, die schnelle und sichere
Erkennung erkrankter Tiere sowie die rasche und konsequente Merzung positiver
Rinder (BAUMGÄRTNER 1999).
20
Literaturübersicht
2.3.8 Diagnostik zum Erregernachweis
Auf Grund der Schwierigkeiten der Therapie und der Prophylaxe gegen Infektionen
durch M. bovis kommt der bestandsumfassenden Diagnostik eine besondere
Bedeutung zu. Die Anzüchtung der anspruchsvollen Keime erweist sich oft als
langwierig und schwierig und ist somit nicht das Mittel der Wahl für ein zügiges
Ergebnis. In den frühen 90er Jahren wurden Enzym-gekoppelte, immunologischadsorbierende Nachweisverfahren (engl. enzyme-linked immunosorbent assay,
ELISA) entwickelt, die gerade bei der Diagnostik von Milchproben sehr erfolgreich
sind (HELLER et al. 1993). Zum Nachweis von M. bovis-Antigen ist auf dem Markt
ein kommerzielles Kit erhältlich, welches von BALL und FINLEY (1998) entwickelt
wurde (Bio X, Luxemburg). In den 90ern kam zunehmend die PolymeraseKettenreaktion (engl. polymerase chain reaction, PCR) zum Einsatz (GHADERSOHI
et al. 1997). HOTZEL et al. (1999) beschreiben sogar ein kombiniertes Verfahren, bei
dem durch monoklonale Antikörper eine Aufkonzentrierung von M. bovis für eine
PCR erreicht werden konnte. Bei der Diagnostik der respiratorischen Mykoplasmose
ist zu berücksichtigen, dass sich ein Nasentupfer zwar als die bequemere Art der
Probensammlung erweist, allerdings eine deutlich geringere Sensitivität aufweist wie
die zurückgewonnene Flüssigkeit einer bronchioalveoläre Lavage (bronchioalveoläre
Lavage-Flüssigkeit, BALF) (THOMAS et al. 2002).
2.4 In situ-Hybridisierung
Die Methode der in situ-Hybridisierung (ISH) hat sich als ein wertvolles Instrument
zur Lokalisierung von Erregernukleinsäuren im infizierten Wirtsgewebe erwiesen
(LEITCH et al. 1994).
2.4.1 Methode
Bei der ISH kann man genomische DNA im histologischen Schnitt nachweisen,
indem man die Fähigkeit von Nukleotidsträngen nutzt, sich komplementär
aneinander zu legen. Die Methode wurde 1969 von PARDUE und GALL (1969)
sowie JOHN et al. (1969) unabhängig voneinander entwickelt. Am Anfang war es
lediglich möglich, die Sonden mittels Einbau radioaktiver Moleküle in Nukleotide
Literaturübersicht
(Phosphor
32
21
P, Schwefel
35
S, Jod
125
I und Wasserstoff 3H) zu markieren. Das
Problem bei diesen radioaktiven Sonden ist zum einen die durch die Strahlung
bedingte mögliche Belastung der damit hantierenden Personen. Zum anderen
werden für radioaktive Stoffe bestimmte Anforderungen an die Räume gestellt, in
denen gearbeitet wird. Ein weiterer Nachteil ist der relativ schnelle Aktivitätsverlust
dieser Sonden (LEITCH et al. 1994). Dieses führte zu der Entwicklung nicht
radioaktiv markierter Sonden, wobei direkte und indirekte Verfahren unterschieden
werden. Zu den direkten Verfahren gehört beispielsweise der Einbau von
Fluoreszenzfarbstoffen
wie
Tetramethylrhodaminisothiocyanat.
Die
indirekten
Verfahren arbeiten mit Markermolekülen wie Biotin und Digoxigenin, die in
Nukleinsäuren
eingebaut
werden.
Diese
werden
anschließend
mittels
immunhistochemischer Verfahren mit enzymgekoppelten Antikörpern detektiert
(LEITCH et al. 1994). Als Sonden können sowohl DNA- als auch RNA-Abschnitte - je
nach zu suchender Sequenz - verwendet werden, die zudem in unterschiedlichen
Längen eingesetzt werden können (WILKINSON 1999).
2.4.2 Anwendung
Die ISH wurde schon in vielen Untersuchungen zur Detektion bestimmter
Organismen im Gewebe verwendet. So findet sie ihre Anwendung bei Viren wie
beispielsweise bei dem porzinen Circovirus Typ 2 (KIM u. CHAE 2001), Bakterien
wie beispielsweise bei Neorickettsia risticii (CHAE et al. 2002) und Pilzen wie
beispielsweise bei Aspergillus fumigatus (HANAZAWA et al. 2000). Bislang gibt es
nur wenige Arbeiten, in denen Gensonden zur Darstellung von Mykoplasmen-DNA
im Gewebe eingesetzt wurden. So gelang es einigen Autoren (KWON u. CHAE
1999; BOYE et al. 2001; KWON et al. 2002), im Lungengewebe von natürlich oder
experimentell infizierten Schweinen erregerspezifische DNA von M. hyopneumoniae
und anderen pathogenen Mykoplasmenspezies des Schweines nachzuweisen. Über
den Nachweis von M. bovis-DNA in Gewebeproben infizierter Kälber mittels der
Methode der ISH gibt es bislang keine Untersuchungen. MC CULLY und BROCK
(1992) veröffentlichten 1992 eine DNA-Hybridisierung im Southern Blot mit einer mit
radioaktivem Phosphor markierten Sonde an extrahierter M. bovis-DNA. Diese
22
Literaturübersicht
Sonde wies eine Länge von 1150 bp auf und fand keine weitere Verwendung in einer
ISH.
Material und Methoden
23
3 Material und Methoden
3.1 Kälber
Zur Untersuchung lagen Lungengewebeproben von insgesamt 35 Kälbern vor. Diese
stammten aus verschiedenen Infektionsversuchen und wurden je nach verwendetem
M. bovis-Stamm, Sektionszeitpunkt und eventuelle Vorbehandlung in drei Gruppen
sowie eine Kontrollgruppe eingeteilt.
3.1.1 Gruppe 1 (Kontrollgruppe)
In Gruppe 1 fanden sich fünf Kälber, die in den nachfolgend angeführten
Infektionsversuchen als negative Kontrolltiere dienten. Diese waren in der
bakteriologischen Untersuchung (BU) mittels kultureller Nachweisverfahren und in
der PCR frei von M. bovis. Andere Mykoplasmen und weitere Bakterien konnten
ebenfalls nicht nachgewiesen werden. Die Daten der Kälber sind in Tabelle 2
wiedergegeben.
Tabelle 2:
Daten der Kälber aus Gruppe 1 (Kontrollgruppe)
Lfd.
Nr.
TierNr.
E-Nr.
1
3444
2934/00
60
Kontrolle
2
4835
2935/00
81
3
307
1504/99
4
4261
5
N. N.
Alter in M. bovis- Sektion p. i.
Tagen
Stamm
in Tagen
BU Lunge
M. bovis
BU Lunge
and. M.
BU and.
Bakt.
21
n
n
n
Kontrolle
21
n
n
n
28
Kontrolle
21
n
n
n
1505/99
28
Kontrolle
21
n
n
n
1650/99
28
Kontrolle
21
n
n
n
Lfd. Nr.: laufende Nummer; Tier-Nr.: Tiernummer (während der Infektionsversuche);
N. N.: nicht bekannt, E-Nr.: Einsendungsnummer; p. i.: post infectionem; BU:
bakteriologische Untersuchung; M. bovis: Mycoplasma bovis; and. M.: andere
Mykoplasmen; and. Bakt.: andere Bakterien; n: nicht nachgewiesen
3.1.2 Gruppe 2
In Gruppe 2 fanden sich acht Kälber, die aus einem Infektionsversuch stammten, der
am damaligen Centre National d´Études Vétérinaires et Alimentaires (CNEVA, jetzt
24
Material und Methoden
Agence Française de Sécurité des Aliments, AFSSA) in Lyon, Frankreich, im Januar
1997 durchgeführt worden war. Die Kälber wiesen zum Zeitpunkt der Infektion ein
Alter
von
21
Tagen
auf.
Für
die
Infektion
wurden
20
bis
40
ml
Mykoplasmensuspension verwendet, die aus einer klonalen Variante des TypStammes PG45 bestand. Diese klonale Variante exprimiert ausschließlich das
variable Oberflächenprotein VspA 64 kDa. Es wurde eine Suspension mit einem Titer
von ca. 4 x 1010 CFU/ml intratracheal inokuliert. Die Kälber stammten aus Herden
seronegativer Kühe, deren Kälber im vorangegangenen Jahr weder Symptome von
Pneumonie noch von Arthritis gezeigt hatten. Die Tiere waren serologisch negativ,
und es wurde sichergestellt, dass keine der Kühe im vorangegangenen Jahr
Anzeichen einer Mastitis gezeigt hatte. Vor Versuchsbeginn wurden alle Tiere auf
eine bereits bestehende Infektion mit M. bovis oder andere Mykoplasmen durch
Bronchialwaschungen und serologische Tests untersucht. Die Tiere wurden zu
unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Infektion getötet und anschließend seziert.
Bei vier der acht Kälber konnte eine Infektion mit M. bovis postmortal nachgewiesen
werden. Bei drei Tieren konnten zum Teil zusätzlich andere Mykoplasmen
festgestellt werden. Je ein Tier wies des Weiteren eine Infektion mit Pasteurella
multocida bzw. Mannheimia haemolytica auf. Bei einem Kalb wurden nicht genauer
bestimmte Bacillus-Spezies nachgewiesen. Die Daten der Tiere sowie die
Ergebnisse der Rückisolierung von bakteriellen Keimen aus der Lunge sind in
Tabelle 3 wiedergegeben.
Material und Methoden
25
Tabelle 3:
Daten der Kälber aus Gruppe 2
Lfd.
Nr.
E-Nr.
Alter in
Tagen
M. bovisStamm
Dosis
(CFU/ml)
Sektion p. i.
in Tagen
BU Lunge
M. bovis
BU Lunge
and. M.
BU and.
Bakt.
6
2
21
PG45
4 x 1010
10
n
n
n
7
5
21
PG45
4 x 1010
4
j
j
M. h.
8
7
21
PG45
4 x 1010
2
n
n
n
9
8
21
PG45
4 x 1010
10
n
n
n
10
9
21
PG45
4 x 1010
6
j
n
n
11
10
21
PG45
4 x 1010
6
j
j
Bac.
12
12
21
PG45
4 x 1010
2
j
n
n
13
13
21
PG45
4 x 1010
4
n
j
P. m.
Lfd. Nr.: laufende Nummer; E-Nr.: Einsendungsnummer; CFU: koloniebildende
Einheiten (engl.: colony forming units); p. i.: post infectionem; BU: bakteriologische
Untersuchung; M. bovis: Mycoplasma bovis; and. M.: andere Mykoplasmen; and.
Bakt.: andere Bakterien; n: nicht nachgewiesen j: nachgewiesen; M. h.: Mannheimia
haemolytica; Bac.: Bacillus-Spezies; P. m.: Pasteurella multocida
3.1.3 Gruppe 3
In Gruppe 3 wurden Kälber zusammengefasst, die aus Infektionsversuchen eines
gemeinsamen Forschungsprojektes der Arbeitsgruppen von Prof. Dr. Renate
Rosengarten
(Institut
für
Bakteriologie,
Mykologie
und
Hygiene,
Veterinärmedizinische Universität Wien, Österreich) und Prof. Dr. Marion HewickerTrautwein (Institut für Pathologie, Tierärztliche Hochschule Hannover) entstammten.
Die Versuche wurden im April 1999 und Juli 2000 durchgeführt. Es handelte sich
zum einen um Tiere, die mit 30 ml einer bakteriellen Suspension des M. bovisStammes 1067 inokuliert wurden. Als Inokulationsroute wurde die Trachea gewählt.
Vier Tiere erhielten die Suspension mit einem Titer von 7,4 x 109 CFU/ml, je zwei
Tiere mit einem Titer von 108 bzw. 1010 CFU/ml. Zum anderen wurden vier weitere
Tiere mit einem französischen Feldstamm infiziert, der aus einem Bestand in
Frankreich isoliert wurde. Dieser wurde je zwei Kälbern mit einem Titer von 108 bzw.
1010 CFU/ml intratracheal inokuliert. Die aus Niederösterreich stammenden Tiere
gehörten
alle
der
Rasse
Simmentaler
an.
Während
einer
zweiwöchigen
Akklimatisationsphase zu Beginn des Versuches wurde durch Untersuchungen
26
Material und Methoden
mittels bronchioalveolärer Lavage und serologischer Tests wie der Western Blot
Technik sichergestellt, dass bei den Kälbern keine natürliche M. bovis-Infektion
vorlag. 18 Tage später wurden die Tiere mit der oben beschriebenen M. bovis-Kultur
infiziert und 21 Tage nach der Infektion getötet und seziert.
Tabelle 4:
Lfd. TierNr. Nr.
Daten der Kälber aus Gruppe 3
E-Nr.
Alter in
Tagen
M. bovisStamm
Dosis
(CFU/ml)
Sektion p. i.
in Tagen
BU
Lunge
M. bovis
BU
Lunge
and. M.
BU
and.
Bakt.
14
176 2936/00
57
1067
7,4 x 109
21
j
n
Arc.
15
998 2937/00
57
1067
7,4 x 109
21
j
n
Arc.
16 4838 2938/00
67
1067
7,4 x 109
21
j
n
n
17
341 2939/00
63
1067
7,4 x 109
21
j
n
n
18 7701 1506/99
28
1067
1 x 108
21
j
n
n
19 3688 1507/99
28
1067
1 x 1010
21
j
n
P. m.
20 3051 1508/99
28
1067
1 x 108
21
j
n
n
21
353 1509/99
28
1067
1 x 1010
21
j
n
P. m.
22 7393 1510/99
28
franz.
Feldstamm
1 x 1010
21
j
n
P. m.
23 6079 1511/99
28
franz.
Feldstamm
1 x 108
21
j
n
n
24 7672 1512/99
28
franz.
Feldstamm
1 x 1010
21
j
n
P.m.
25 7102 1513/99
28
franz.
Feldstamm
1 x 108
21
j
n
n
Lfd. Nr.: laufende Nummer; Tier-Nr.: Tiernummer (während der Infektionsversuche);
E-Nr.: Einsendungsnummer; franz. Feldstamm: französischer Feldstamm; CFU:
koloniebildende Einheiten (engl.: colony forming units); p. i.: post infectionem; BU:
bakteriologische Untersuchung; M. bovis: Mycoplasma bovis; and. M.: andere
Mykoplasmen; and. Bakt.: andere Bakterien; n: nicht nachgewiesen; j:
nachgewiesen; Arc.: Arcanobacterium pyogenes; P. m.: Pasteurella multocida
Bei allen zwölf Tieren wurde postmortal M. bovis in der Lunge nachgewiesen. Andere
Mykoplasmen konnten nicht festgestellt werden. Zwei Tiere wiesen eine Infektion mit
Arcanobacterium pyogenes und vier andere Kälber eine Infektion mit Pasteurella
Material und Methoden
27
multocida auf. Die Daten der Tiere sowie die Ergebnisse der Reisolierung von
bakteriellen Keimen aus der Lunge sind in Tabelle 4 dargestellt.
3.1.4 Gruppe 4
In der letzten Gruppe wurden zehn Kälber zusammengefasst, die ebenfalls aus dem
Infektionsversuch des gemeinsamen Forschungsprojektes von Prof. Dr. Rosengarten
und Prof. Dr. Hewicker-Trautwein stammten. Diesen Tieren wurde im Alter von ca. 21
bis 35 Tagen ein aufgereinigtes, rekombinantes M. bovis-VspA-Fusionsprotein
verabreicht. So wurde zum einen eine 2 ml umfassende Dosis von 1 mg
aufgereinigtem M. bovis-VspA-Fusionsprotein, welches mit dem Montanide® IMS
1314 adjuviert wurde, verwendet. Hierbei handelt es sich um wasserlösliche,
immunologisch aktive organische Komponenten. Einer anderen Gruppe wurde
zweimal im Abstand von 21 Tagen eine 2 ml umfassende Dosis von 1 mg
aufgereinigtem M. bovis-VspA-Fusionsprotein verabreicht, welches in diesem Fall mit
2%igem Alum/HS adjuviert wurde. 18 Tage später wurde diesen Tieren 30 ml einer
Bakteriensuspension von M. bovis 1067 mit einem Titer von 7,4 x 109 CFU/ml
intratracheal inokuliert. Auch hierbei handelte es sich um Kälber der Rasse
Simmentaler, in deren Serum weder Antikörper gegen Mycoplasma bovis
nachgewiesen noch Mykoplasmen aus der bronchioalveolären Lavage isoliert
werden konnten. Alle Tiere dieser Gruppe wurden 21 Tage nach der Infektion getötet
und anschließend seziert. Bei neun der zehn Kälber wurde postmortal M. bovis in der
Lunge nachgewiesen. Andere Mykoplasmen konnten nicht festgestellt werden.
Sieben Tiere wiesen eine Infektion mit Arcanobacterium pyogenes auf, ein Kalb
zusätzlich mit Pasteurella multocida. Die Daten der Kälber sowie die Ergebnisse der
Rückisolierung von bakteriellen Keimen aus der Lunge sind in Tabelle 5
zusammengestellt.
28
Material und Methoden
Tabelle 5:
Daten der Kälber aus Gruppe 4
BU
and.
Bakt.
M. bovisStamm
26 4812 2940/00
67
1067
2x VspA/
7,4 x 109 IMS 1314
21
j
n
n
27
192 2941/00
60
1067
7,4 x 109
VspA/2%
Alum/HS
21
j
n
Arc.
28 6004 2942/00
74
1067
2x VspA/
7,4 x 109 IMS 1314
21
j
n
Arc.
29
2943/00
57
1067
2x VspA/
7,4 x 109 IMS 1314
21
j
n
n
30
342 2944/00
60
1067
2x VspA/
7,4 x 109 IMS 1314
21
j
n
Arc.
31
657 2945/00
67
1067
2x VspA/
7,4 x 109 IMS 1314
21
j
n
n
32
16
2946/00
67
1067
7,4 x 109
VspA/2%
Alum/HS
21
j
n
Arc.
33 6006 2947/00
60
1067
7,4 x 109
VspA/2%
Alum/HS
21
j
n
P. m.
Arc.
34 4813 2948/00
67
1067
7,4 x 109
VspA/2%
Alum/HS
21
n
n
Arc.
35 3443 2949/00
60
1067
7,4 x 109
VspA/2%
Alum/HS
21
j
n
Arc.
0
E-Nr.
Dosis
(CFU/ml)
Sektion
BU
BU
p. i. in
Lunge
Lunge
Tagen M. bovis and. M.
Alter in
Tagen
Lfd. TierNr. Nr.
Vakz.
Lfd. Nr.: laufende Nummer; Tier-Nr.: Tiernummer (während der Infektionsversuche);
E-Nr.: Einsendungsnummer; CFU: koloniebildende Einheiten (engl.: colony forming
units); Vakz.: Vakzinierung; p. i.: post infectionem; BU: bakteriologische
Untersuchung; M. bovis: Mycoplasma bovis; and. M.: andere Mykoplasmen; and.
Bakt.: andere Bakterien; n: nicht nachgewiesen; j: nachgewiesen; Arc.:
Arcanobacterium pyogenes; P. m.: Pasteurella multocida
3.2 Pathologisch-anatomische Untersuchung der Lungen
Die makroskopische Beurteilung der bei den Kälbern der vier Gruppen festgestellten
Lungenveränderungen erfolgte durch eine Pathologin der Ecole Nationale Vétérinaire
de Lyon (Dr. D. Le Grand, Gruppe 2) bzw. durch Prof. Dr. Hewicker-Trautwein,
Tierärztliche Hochschule Hannover (Gruppe 1, 3 und 4). Makroskopisch wies Tier
E2936/00 hochgradige Lungenveränderungen mit atelektatischen Bezirken und
Material und Methoden
29
multiplen Abszessen auf, von denen ca. 40% der Lunge betroffen waren. Alle
anderen Tiere zeigten nur geringggradige Veränderungen, von denen maximal 20%
der Lunge betroffen waren. Auch hier traten gelegentlich Abszesse auf. Entzündliche
Veränderungen der Pleura wurden nur zwischen einzelnen Lappen gefunden. Diese
traten allerdings nicht bei allen Kälbern auf.
3.3 Lungengewebeproben
Es lagen von allen Tieren der vier Gruppen mehrere Lungengewebeproben vor.
Diese wurden während der pathologisch-anatomischen Untersuchung aus sechs
vorher definierten Lokalisationen der linken und rechten Lunge gewonnen. Hierbei
handelte es sich in der linken Lunge um je eine Probe des Lobus cranialis pars
cranialis (Lokalisation 1), des Lobus cranialis pars caudalis (Lokalisation 2) und des
Lobus caudalis (Lokalisation 3). In der rechten Lunge wurde je eine Probe des Lobus
caudalis (Lokalisation 4), des Lobus medius (Lokalisation 5) und des Lobus cranialis
pars caudalis (Lokalisation 6) entnommen (Abbildung 1). Die Proben der Gruppe 2
wurden für 24 Stunden in 4%igem gepufferten Formalin (pH 7,4 bis 7,6) fixiert. Die
Fixierung der Proben aus den Gruppen 1, 3 und 4 erfolgte über 72 Stunden ebenfalls
in neutralem, gepufferten 4%igem Formalin. Anschließend wurden die Proben
routinemäßig in Paraffin eingebettet, wobei pro Lungenlokalisation zwei bis drei
Paraffinblöcke hergestellt wurden. Auf einem Schlittenmikrotom (HM 400, Fa. Microm
International GmbH, Walldorf) wurden Schnitte von einer Dicke von ca. 5 µm
angefertigt. Die Schnitte wurden in einem Wasserbad bei 40°C gestreckt und auf
Superfrost Plus®-Objektträger (Fa. Gerhard Menzel Glasbearbeitungswerk GmbH &
Co. KG, Braunschweig) aufgezogen. Anschließend folgte eine Trocknung für 60 Min.
in einem Wärmeschrank bei 70°C (Fa. Heraeus Sepatech GmbH, Osterode) und
eine weitere mögliche Lagerung bei Raumtemperatur.
30
Material und Methoden
Abbildung 1:
Entnahmelokalisationen der Lungengewebsproben (Schema der
Rinderlunge, Dorsalansicht, modifiziert nach NICKEL et al. 1999)
3.4 Histochemische Färbemethoden
3.4.1 Übersichtsfärbung mit Hämatoxylin und Eosin
Jeweils ein Schnitt jeder untersuchten Lokalisation wurde in einem automatisierten
Färbecenter (Leica ST 4040, Leica Mikrosystems Nussloch GmbH, Nussloch) nach
einem standardisierten Laborprotokoll mit Hämatoxylin und Eosin (HE) gefärbt. Diese
Schnitte
dienten
zur
Auswertung
und
Beschreibung
der
histologischen
Veränderungen und zur Orientierung der Untersuchung mittels in situ-Hybridisierung
und Immunhistochemie.
Material und Methoden
1.
31
Entparaffinieren der Schnitte in absteigender Alkoholreihe (dreimal 5 Min. in
Roti®-Histol, 5 Min. in Isopropanol, 2 bis 3 Min. in 96%igem Ethanol,
2 bis 3 Min. in 70%igem Ethanol, anschließend in Aqua dest.;
2.
15 Min. Hämalaun nach Mayer (Fa. Roth GmbH, Karlsruhe);
3.
10 Min. Bläuen in Leitungswasser;
4.
1 Min in Eosin 1%ig (Zugabe von 1 Tropfen Eisessig pro Küvette);
5.
Spülen in Aqua dest.;
6.
Entwässern der Schnitte in aufsteigender Alkoholreihe (2 bis 3 Min. in
70%igem Ethanol, 2 bis 3 Min. in 96%igem Ethanol, 5 Min. in Isopropanol,
dreimal 5 Min. in Roti®-Histol);
7.
Eindecken mit Corbit-Balsam (Fa. Hecht, Kiel).
3.4.2 Azanfärbung nach Heidenhain
Zur Darstellung von kollagenem und retikulärem Bindegewebe wurden einzelne
Schnitte
mittels
Azanfärbung
nach
Heidenhain
gefärbt.
Hierbei
färbt
sich
extrazelluläres Kollagen intensiv blau.
1.
Entparaffinieren der Schnitte in absteigender Alkoholreihe (dreimal 5 Min. in
Roti®-Histol, 5 Min. in Isopropanol, 2 bis 3 Min. in 96%igem Ethanol,
2 bis 3 Min. in 70%igem Ethanol, anschließend in Aqua dest.;
2.
30 Min. Azokarmin bei 60°C im Brutschrank (Lösung gut vorwärmen);
3.
Spülen in Aqua dest.;
4.
3 Min. in alkalischer 0,1%iger Anilinlösung;
5.
1 Min. in essigsaurem 15%igem Alkohol;
6.
bis zu 20 Min. in 5%iger Phosphorwolframsäure (Kontrolle nach 10 Min.);
7.
kurz Spülen in Aqua dest.;
8.
20 Min. in Anilinblau-Orange-Essigsäure-Gebrauchslösung;
9.
kurz Spülen in Aqua dest.;
10.
kurz in 96%igem Alkohol;
11.
2 Min. in Propanol;
12.
5 Min. in Essigsäurebutylester (EBE);
13.
Eindecken mit Corbit-Balsam (Fa. Hecht, Kiel).
32
Material und Methoden
3.4.3 Siriusrot-Färbung F3B Technik
Um
eine
Unterscheidung
von
neutrophilen
Granulozyten
von
eosinophilen
Granulozyten zu gewährleisten, wurden unklare Fälle mit der Siriusrot-Färbung F3B
Technik nach BOGOMOLETZ (1980) gefärbt. Hierbei stellen sich die Granula der
eosinophilen Granulozyten intensiv rot dar.
1.
Entparaffinieren der Schnitte in absteigender Alkoholreihe (dreimal 5 Min. in
Roti®-Histol, 5 Min. in Isopropanol, 2 bis 3 Min. in 96%igem Ethanol,
2 bis 3 Min. in 70%igem Ethanol, anschließend in Aqua dest.;
2.
5 Min. in Aqua dest. Spülen;
3.
ca. dreimal in 70%igem Ethanol tauchen bis keine Schlieren mehr auf dem
Objektträger sichtbar sind;
4.
24 Stunden Siriusrot-Farblösung bei Raumtemperatur;
5.
10 Min. Spülen in Aqua dest.;
6.
einmal in frisches Hämalaun nach Mayer (Fa. Roth GmbH, Karlsruhe)
tauchen;
7.
ca. 5 Min. Wässern unter Leitungswasser bis der Schnitt leicht bläulich ist;
8.
einmal in 70%iges Ethanol tauchen;
9.
2 Min in 80%iges Ethanol;
10.
30 Sek. in 96%iges Ethanol;
11.
30 Sek. in Isopropanol;
12.
5 Min. in Essigsäurebutylester (EBE);
13.
Eindecken mit Corbit-Balsam (Fa. Hecht, Kiel).
3.5 In situ-Hybridisierung
3.5.1 Sondensynthese
Für die Untersuchung mittels in situ-Hybridisierung wurde in Zusammenarbeit mit
dem Institut für Bakteriologie, Mykologie und Hygiene der Veterinärmedizinischen
Universität in Wien eine Digoxigenin (DIG)-markierte Sonde zum Nachweis von M.
bovis-DNA synthetisiert. Hierfür wurde die von LYSNYANSKY et al. (1996, 2001a)
veröffentlichte Sequenz des VspA-Gens des M. bovis-Stammes PG45 zu Grunde
gelegt.
Material und Methoden
33
3.5.2 Primer
Es wurden Primer mit folgender Sequenz produziert:
Zunächst wurde ein vorwärts gerichteter Primer (3´ nach 5´) mit der Bezeichnung
vsp-69/26m synthetisiert. Dieser kodiert in der vis-box, der Region der vsp inversion
sequence, (Position ab -69 N-terminales Ende nach LYSNYANSKY et al. 2001a) und
besitzt die Sequenz GATATTTATTGATAGATTTATAAAGC.
Als zweites wurde ein vorwärts gerichteter Primer (3´ nach 5´) mit der Bezeichnung
ON25m hergestellt. Dieser kodiert in der Region vor der vis-box (sofern ein Vsp
angeschaltet ist, Position -115 nach LYSNYANSKY et al. 2001a) und besitzt die
Sequenz GTTTGATTAAGCTTTTATTTAGTTC.
Als rückwärts gerichteter Primer (5´ nach 3´) wurde ein Primer mit der Bezeichnung
Vsp+100/24m synthetisiert. Dieser kodiert am Ende der Signalsequenz ab der
Position +102 nach LYSNYANSKY et al. (2001a) bzw. ab der Position +162 nach
LYSNYANSKY
et
al.
(1996)
und
trägt
die
Sequenz
TGGTTTATTTTCTTCTTTGGTCTC.
Daraus entstanden zwei unterschiedlich große mögliche Sonden: Zum einen ergab
die Primerkombination vsp-69/26m und vsp+100/24m eine Sonde von 171bp Größe
(bezeichnet mit VspAI) zum anderen die Primerkombination ON25m und
vsp+100/24m eine Sonde von 217bp Größe (bezeichnet mit VspAII). Während VspAI
lediglich
Anteile
der
Sequenz
nachwies,
die
für
Proteinstrukturen
des
Oberflächenantigens codieren, detektierte VspAII zusätzlich die vorgeschaltete
Sequenz des vspA-Gens, welche benötigt wird, wenn das VspA auf der Oberfläche
von M. bovis exprimiert werden soll, also „eingeschaltet“ ist.
3.5.3 PCR
Die Bedingungen für die PCR mit den jeweiligen Primerpaaren für spezifische
Banden aus M. bovis-DNA lagen bei 94°C für 2 Min. mit anschließend 30 Zyklen mit
einer Denaturierungstemperatur von 94°C für 1 Min., einer Anlagerungstemperatur
34
Material und Methoden
von 56°C für 70 Sek. und einer Verlängerungstemperatur von 72°C für 20 Sek. Die
Konzentration von Magnesium lag bei 2,5 mM.
Während der PCR wurden die regulären Nukleotide desoxy-Adenin-Tri-Phosphat
(dATP), desoxy-Cytosin-Tri-Phosphat (dCTP) und desoxy-Guanin-Tri-Phosphat
(dGTP) in der Konzentration von 1 mM und desoxy-Thymin-Tri-Phosphat (dTTP) in
der Konzentration von 0,65 mM zugegeben. Zusätzlich wurde Digoxigenin-11desoxy-Uracil-Tri-Phosphat (Digoxigenin-dUTP) in der Konzentration von 0,35 mM
zugefügt. Dieses wird teilweise an Stelle der Pyrimidinbase dTTP in den neu
synthetisierten DNA-Strang eingebaut.
3.5.4 Sondentests
3.5.4.1 Hybridisierung im Southern Blot
Für eine Hybridisierung im Southern Blot wurde M. bovis-DNA isoliert, enzymatisch
mit HindIII gespalten und in einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Die
aufgetrennte DNA wurde anschließend auf eine Nitrozellulosemembran übertragen
(geblottet). Die Nitrozellulosemembran wurde für 16 Stunden in 10 ml eines 4 µl
VspAI-Sonde enthaltenden Church-Puffers bei 50°C hybridisiert. Anschließend
wurde die Membran 2 x 5 Min. bei Raumtemperatur in 0,1%iger SDS in 2 x SSC
gewaschen. Es folgten zwei weitere Waschschritte für 20 Min. in 0,1%iger SDS in
0,5 x SSC bei 50°C. Die Visualisierung der hybridisierten Sonde erfolgte analog zu
dem Protokoll der in situ-Hybridisierung (siehe dort) mit alkalischer Phosphatasegekoppelten, gegen Digoxigenin gerichteten Antikörpern.
3.5.4.2 Ausschluss von Kreuzreaktionen
Um auch mögliche Kreuzreaktivitäten der Sonden mit anderen Bakterien, speziell
den bei einigen Kälbern nachgewiesenen Keimen der Spezies Arcanobacterium
pyogenes, Pasteurella multocida und M. bovirhinis ausschließen zu können, wurde
von diesen Bakterien sowie von weiteren nachgewiesenen Keimen ebenfalls DNA
extrahiert, mittels HindIII enzymatisch verdaut und einer Hybridisierung mit den
Sonden VspAI und VspAII in einem Southern Blot-Verfahren unterzogen. Um
sicherzustellen, dass sich DNA dieser Bakterien im Blot befanden, wurde mit einer
DIG-markierten Sonde hybridisiert, welche die bei allen Bakterien vorhandene
Material und Methoden
35
eubakterische 16S rDNA nachweist („universal eubacterial“ 16S rDNA). Diese Sonde
wurde nach LANE (1991) mit den Primern 27f und 1492r synthetisiert.
3.5.5 Durchführung der in situ-Hybridisierung
Die Durchführung der in situ-Hybridisierung erfolgte nach einem speziell für den
Nachweis von M. bovis-DNA mittels der erwähnten VspA-Sonden modifizierten
Protokoll der von KWON und CHAE (1999) beschriebenen Methode. Alle Lösungen
und Puffer wurden vor Gebrauch autoklaviert und die Glaswaren mit Heißluft
sterilisiert. Während der Durchführung wurden Einmal-Handschuhe getragen. Die
Inkubation erfolgte bei Raumtemperatur in Standküvetten mit bis zu 16 Schnitten. Bei
von der Raumtemperatur abweichenden Temperaturen wurden die entsprechenden
Lösungen im Wasserbad vorgewärmt und die Inkubation in diesem durchgeführt. Die
Herstellung aller verwendeten Puffer und Lösungen ist im Anhang beschrieben.
3.5.6 Chromogen
Als Chromogen wurde Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (NTB) eingesetzt. Es wurden
eine NBT-Stammlösung aus 1 g Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (NBT; Fa. SigmaAldrich Chemie GmbH, Taufkirchen) und 13 ml 70%igem Dimethylformamid (30 ml
Aqua bidest. + 70 ml Dimethylformamid, Fa. Merck KGaA, Darmstadt), sowie eine 5Brom-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphat- (X-Phosphat, BCIP) Stammlösung aus 500 mg XPhosphat (Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen) und 10 ml 100%igem
Dimethylformamid hergestellt. Beide Lösungen wurden nicht autoklaviert und
während der in situ-Hybridisierung wie folgt weiterverarbeitet: 270 µl NBT und 210 µl
BCIP sowie 15 mg Levamisol (Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen)
werden mit Puffer 3 auf 60 ml aufgefüllt. Durch die an dem gegen Digoxigenin
gerichteten Antikörper gekoppelte alkalische Phosphatase (Anti-Digoxigenin-AP, Fa.
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) wird das Gemisch NBT/BCIP zu einem
violetten Reaktionsprodukt umgewandelt. Dieser Farbniederschlag ist sehr stabil und
lagert sich in unmittelbarer Nähe des Entstehungsortes ab.
36
Material und Methoden
3.5.7 Kontrollmaterial
Als positives Kontrollmaterial wurde zum Nachweis der M. bovis-DNA unverändertes
bovines Lungengewebe vom Schlachthof (Fa. Vossding, Gleidingen) verwendet.
Dieses stammte von einem männlichen, lungengesunden Rind mit einem Alter von
23 Monaten. Hiervon wurden in Anlehnung an BOYE et al. (2001) Lungenproben mit
konzentrierter M. bovis-Suspension injiziert. Die Mykoplasmensuspension wurde
freundlicherweise von dem Institut für Bakteriologie, Mykologie und Hygiene,
Veterinärmedizinische Universität Wien, zur Verfügung gestellt. Diese wurde zuvor
mehrmals zentrifugiert und mit 1 x PBS gewaschen, um eine möglichst konzentrierte
Mykoplasmensuspension zu erhalten. Anschließend wurden die Lungenproben
routinemäßig in Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Als Negativkontrolle
wurde
von
jeder
Gewebelokalisation
zusätzlich
ein
Kontrollschnitt
mit
Hybridisierungspuffer ohne Sondenzusatz inkubiert.
3.5.8 Protokoll für die in situ-Hybridisierung
1.
Paraffinschnitte auf Superfrost® plus Objektträger aufziehen und im
Wärmeschrank bei 70°C 60 Min. trocknen lassen;
2.
Entparaffinierung der Schnitte, dreimal für 5 Min. in Roti®-Histol und je
5 Min. in Isopropanol, 96%igem und 70%igem Ethanol, anschließend für
5 Min. und dann 1 Min. in Aqua bidest. (ab Aqua bidest. in Standküvette
verbringen);
3.
Spülen der Schnitte, einmal für 5 Min. in 1 x PBS;
4.
zum Aufschluss der Zellmembranen Inkubation für 20 Min. in 0,2 M HCl;
5.
Spülen der Schnitte, zweimal für 30 Min. mit 2 x SSC + 5 mM EDTA-Na2 bei
50°C;
6.
Proteolyse mit 7,5 µg/ml Proteinase K für 15 Min. bei 37°C (1 ml 1 M Tris,
pH 8,0 + 1 ml 0,1 M CaCl2 + 22,5 µl Proteinase K ad 60 ml Aqua bidest.);
7.
Abstoppen der Proteolyse durch Inkubation in 0,2%igem Glycin-PBS für
5 Min.;
8.
Nachfixierung der Schnitte in 4%igem Paraformaldehyd für 4 Min.;
9.
Spülen der Schnitte, zweimal für 1 Min. in 1 x PBS;
Material und Methoden
10.
37
Spülen der Schnitte für 15 Min. mit 1 x PBS + 5 mM MgCl2 (frisch
herstellen);
11.
Azetylierung in 0,25%igem Azetanhydrid in 0,1 M Triethanolamin, pH 7,5, für
10 Min. (frisch herstellen);
12.
Spülen der Schnitte, zweimal für 1 Min. und anschließend für 15 Min. in
1 x PBS;
13.
Prähybridisierung für mindestens 60 Min. bei 37°C im
Prähybridisierungspuffer (unter Verwendung einer eingefrorenen
Stammlösung frisch herstellen);
14.
Hybridisierungspuffer herstellen (unter Verwendung einer eingefrorenen
Stammlösung, frisch) mit bzw. ohne den Zusatz der spezifischen Sonde und
Überschichten der Schnitte mit 35 µl; mit Gel-bond®-Film (Fa. FMCR®
bioproducts, Göttingen) abdecken und mit Fix-O-Gum® (Fa. Marabuwerke
GmbH & Co KG, Tamm) gut abdichten;
15.
Denaturieren für 10 Min. waagrecht auf einer Heizplatte mit 95°C;
16.
Hybridisierung für 16 Stunden bei 37°C im Wärmeschrank und feuchter
Kammer;
17.
Posthybridisierungswaschung (nach Abheben des Gel-bond®-Films und des
Fix-O-Gum® mit einer Pinzette) zweimal für 15 Min. bei 42°C mit
6 x SSC+45%iges Formamid (frisch herstellen);
18.
Spülen der Schnitte, zweimal für 5 Min. mit 2 x SSC;
19.
Spülen der Schnitte, zweimal für 15 Min. mit 0,2 x SSC bei 42°C;
20.
Spülen der Schnitte, für 1 Min. mit Puffer 1;
21.
Inkubation für 30 Min. mit Block-Lösung (Puffer 2, frisch herstellen);
22.
Inkubation der Schnitte für 2 Stunden mit Anti-DIG-Antikörper (Fa. Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim; alkalische Phosphatase-konjugiert) 1:200
verdünnt in Antikörperpuffer (frisch herstellen);
23.
Spülen der Schnitte, zweimal für 15 Min. mit Puffer 1;
24.
Spülen der Schnitte, zweimal für 5 Min. mit Puffer 3;
25.
Inkubation der Schnitte mit der Färbelösung (s. Abschnitt 3.5.6) für ca.
16 Stunden im Dunkeln (Färbelösung frisch herstellen aus Stammlösung);
38
Material und Methoden
26.
Abstoppen der enzymatischen Reaktion in Puffer 4, zweimal für 10 Min.;
27.
Spülen der Schnitte für zweimal 2 Min. in Aqua bidest. und anschließend
unter fließendem Leitungswasser;
28.
Gegenfärben mit Hämalaun nach Mayer (Fa. Roth GmbH, Karlsruhe) für
15 Sekunden;
29.
Wässern und Bläuen unter fließendem Leitungswasser für 15 Min.;
30.
Eindecken mit auf 50°C vorgewärmtem Glycergel® (Fa. DakoCytomation
GmbH, Hamburg).
3.5.9 Kontrolle der endogenen Peroxidasen
Um sicherzustellen, dass das nachgewiesene Präzipitat des durch alkalische
Phosphatase
katalysierten
Chromogens
NBT/BCIP
nicht
durch
endogene
Peroxidasen katalysiert wurde, wurde während der Etablierung der Methode
versuchsweise
eine
Vorbehandlung
der
Schnitte
mit
einer
0,5%igen
Wasserstoffperoxidlösung durchgeführt. Diese führt zu einer Hemmung der
vorhandenen Peroxidasen. Hierfür wurden die Schnitte zunächst entparaffiniert und
dann für 30 Min. in 85%igem Ethanol und 0,5%iger Wasserstoffperoxidlösung
inkubiert und anschließend mit 1 x PBS gespült. Es folgte das Protokoll der ISH wie
oben aufgeführt ab Punkt 4.
3.5.10
Auswertung
Als positiv gewertet wurden NBT-Präzipitate, die sich in derselben Ebene wie der
Schnitt befanden und in den nur mit Hybridisierungspuffer inkubierten, negativen
Kontrollen nicht vorhanden waren.
3.6 Immunhistochemie
3.6.1 Antikörper
Für
die
immunhistologische
Darstellung
von
M.
bovis-Antigen
wurde
ein
monoklonaler Maus-anti-Mycoplasma bovis-Antikörper verwendet. Dieser wurde
erstmalig von ADEGBOYE et al. (1995a) beschrieben und ist unter der Bezeichnung
MAB970 kommerziell erhältlich (Fa. Chemicon international, Temecula, USA). Der
Antikörper der Subklasse IgG wurde mit dem M. bovis-Stamm M23 produziert und
Material und Methoden
39
richtet sich gegen nicht genauer definierte Epitope von M. bovis (ADEGBOYE et al.
(1995a). Das Protokoll für die Verwendung am Formalin-fixierten und Paraffineingebetteten Material wurde in Anlehnung an die von ADEGBOYE et al. (1995b)
beschriebene Methode als Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex-Methode modifiziert.
Die Verdünnung des Antikörpers betrug 1:1000.
3.6.2 Chromogen
Als
Chromogen
für
die
immunhistochemische
Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid
(DAB,
Fa.
Untersuchung
Sigma-Aldrich
diente
Chemie
3,3’-
GmbH,
Taufkirchen) in PBS-Puffer. Dieses wird durch die an den sekundären Antikörper
angelagerte Peroxidase des Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplexes unter Zusatz von
Wasserstoffperoxid (H2O2, Fa. Sigma-Aldrich) zu einem braunen Reaktionsprodukt
umgewandelt. Dieser Farbniederschlag ist sehr stabil und lagert sich in unmittelbarer
Nähe des Entstehungsortes ab.
3.6.3 Kontrollen
Als positives Kontrollmaterial wurde zum Nachweis von M. bovis-Antigen analog zu
der ISH Lungenmaterial vom Schlachthof (Fa. Vossding, Gleidingen) verwendet.
Hiervon wurden Lungenproben mit konzentrierter M. bovis-Suspension injiziert. Die
Mykoplasmensuspension wurde freundlicherweise von dem Institut für Bakteriologie,
Mykologie und Hygiene, Veterinärmedizinische Universität Wien zur Verfügung
gestellt. Von jedem Gewebe wurde als Negativkontrolle zusätzlich ein Kontrollschnitt
nach gleichem Protokoll behandelt, indem anstelle des primären Antikörpers mit
Aszitesflüssigkeit von nicht-immunisierten Balb/C Mäusen (Balb/C-Serum, Fa.
Biologo, Kronshagen) in einer Konzentration von 1:10000 inkubiert wurde.
3.6.4 Protokoll für die Immunhistochemie mit MAB970
1.
Entparaffinierung der Schnitte, dreimal für 5 Min. in Roti®-Histol und je
5 Min. in Isopropanol, 96%igem und 70%igem Ethanol;
2.
Hemmung der endogenen Peroxidase in 0,5%igem H2O2 in 85%igem
Alkohol für 30 Min. bei Raumtemperatur auf einem Magnetrührer;
3.
dreimaliges Waschen der Schnitte in 1 x PBS für je 5 Min.;
40
Material und Methoden
4.
Demaskierung: Proteolytische Vorbehandlung in 0,05%iger Protease XIVLösung in vorgewärmter 1 x PBS (Protease XIV, Fa. Merck KGaA,
Darmstadt) mit 0,02% CaCl2, pH 7,4;
5.
dreimaliges Waschen der Schnitte in 1 x PBS für je 5 Min.;
6.
Verbringen der Schnitte in CoverplatesTM und Sequenza®-Einsätze (Thermo
Electron GmbH, Dreieich);
7.
Überschichten mit 1:5 verdünntem inaktiviertem Ziegen-Normalserum
(normal goat serum, NGS) in 1 x PBS für 20 Min.;
8.
Auftragen des Primärantikörpers Maus-anti-Mycolasma bovis monoklonaler
Antikörper MAB970 (Fa. Chemicon international, Temecula, USA) verdünnt
1:1000 in 1 x PBS mit 1%igem bovinem Serumalbumin (BSA) und
Inkubation der Schnitte für 16 Stunden bei 4°C im Kühlschrank;
9.
dreimaliges Waschen der Schnitte in 1 x PBS mit 0,05% Tween 20 für je
5 Min.;
10.
Auftragen des Sekundärantikörpers biotiniliertes Ziege-anti-Maus-Serum
(GAM-b, BA-9200, Fa. Vector, Burlingame, USA) 1:200 verdünnt in 1 x PBS
und Inkubation für 30 Min.;
11.
dreimaliges Waschen der Schnitte in 1 x PBS mit 0,05% Tween 20 für je
5 Min., anschließend noch einmal in reinem 1 x PBS für 5 Min.;
12.
Inkubation der Schnitte mit dem Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex
Vectastain Elite ABC Kit (PK-6100, Fa. Vector, Burlingame, USA) für 30 Min.
bei Raumtemperatur (Herstellung des ABC-Komplexes mindestens 30 Min.
vor Gebrauch);
13.
dreimaliges Waschen der Schnitte in 1 x PBS für je 5 Min.;
14.
Inkubation der Schnitte mit 0,05% 3,3’-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid
(DAB) in 1 x PBS, pH 7,2, mit Zusatz von 3%iger H2O2-Lösung
(Endkonzentration 0,03%) für 5 Min. auf dem Magnetrührer bei
Raumtemperatur;
15.
dreimaliges Waschen der Schnitte in 1 x PBS für je 5 Min.;
16.
Spülen der Schnitte unter fließendem Leitungswasser;
Material und Methoden
17.
41
Färben der Schnitte für einige Sekunden (ca. 15 bis 20 Sekunden) bis zur
gewünschten Farbintensität in Hämalaun nach Mayer (Fa. Roth GmbH,
Karlsruhe);
18.
Bläuen der Schnitte unter fließendem Leitungswasser für 15 Min.;
19.
Entwässern der Schnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe: 50%iger,
70%iger, 96%iger Alkohol für jeweils 3 Min., Isopropylalkohol (5 Min.),
Roti®-Histol dreimal je 5 Min.;
20.
Eindecken mit Corbit-Balsam (Fa. Hecht, Kiel).;
3.6.5 Auswertung
Als positiv gewertet wurden braune Pigmentablagerungen, die sich in derselben
Ebene wie der Schnitt befanden und in den nur mit Balb/C inkubierten negativen
Kontrollen nicht vorhanden waren.
3.7 Befunderhebung und Auswertung der Daten
Die Schnittpräparate der Untersuchungen mittels HE-Färbung, Azan-Färbung, ISH
und IHC wurden mit Hilfe eines Standard-Binokular-Lichtmikroskops (Fa. Carl Zeiss
AG,
Oberkochen)
lichtmikroskopisch
ausgewertet.
Die
Schnitte
wurden
mäanderförmig abgefahren und die histopathologischen Veränderungen bzw.
positiven Signale semiquantitativ nach ihrem geschätzten Schweregrad (0 = keine,
1 = vereinzelt, 2 = geringgradige, 3 = mittelgradige, 4 = hochgradige Veränderungen)
bzw. nach ihrem Vorhandensein (j = Signal vorhanden, n = kein Signal detektierbar)
ausgewertet. Vorhandene Nekrosen wurden zur besseren Orientierung im Schnitt
nach ihrer Ausdehnung eingeteilt, gezählt und jeweils durchnummeriert. Zwecks
Einteilung nach Größe wurden unter 5 mm Durchmesser, 5 bis 10 mm Durchmesser
und über 10 mm Durchmesser festgelegt.
Die fotographische Dokumentation erfolgte mit einem Mikroskop Axiophot (Fa. Carl
Zeiss AG, Oberkochen) und mit Elite Chrome 160 T Diafilmen (Fa. Kodak GmbH,
Stuttgart).
Ergebnisse
43
4 Ergebnisse
4.1 Ergebnisse der Sondentestung
4.1.1 Nachweis von Mycoplasma bovis-DNA im Southern Blot
Die mittels HindIII gespaltene DNA von M. bovis PG45 wurde einem Southern Blot
Verfahren unterzogen und anschließend mit in Church-Puffer zugefügten VspAIbzw. VspAII-Sonden hybridisiert. Hierbei konnten positive Signale in einzelnen
Banden der aufgetrennten M. bovis-DNA nachgewiesen werden. Somit konnte
gezeigt werden, dass die Sonde spezifisch mit M. bovis-DNA hybridisierte. Das
Ergebnis des Southern Blots für die Sonde VspAI ist in Abbildung 2b Spur 10
dargestellt.
Genomische DNA von
1: Histophilus somni
2: Arcanobacterium
pyogenes
3: Acholeplasma laidlawii
4: Enterococcus sp.
5: M. bovirhinis
6: Pasteurella multocida
7: α-hämolysierende
Streptococcus spp.
8: Staphylococcus spp.
9: Mannheimia haemolytica
10: M. bovis PG45
Abbildung 2:
Southern Blot (DNA verdaut mit HindIII):
a) DIG-markierte Sonde für „universal eubacterial“ 16S rDNA,
b) VspAI-Sonde
DIG: Digoxigenin; M.: Mycoplasma; spp.: species;
44
Ergebnisse
4.1.2 Spezifitätstest
Ebenfalls mittels HindIII wurde die DNA von allen sonstigen in den Proben von den
Tieren der Gruppen 3 und 4 nachgewiesenen Keimen enzymatisch gespalten und
ebenfalls im Southern Blot Verfahren untersucht. Hierzu gehörten unter anderem
Arcanobacterium pyogenes, Mannheimia haemolytica, Pasteurella multocida und M.
bovirhinis. Mit der Sonde für „universal eubacterial“ 16S rDNA konnte gezeigt
werden, dass sich aufgetrennte DNA im Blot befand. Mit der Sonde VspAI konnten
nur bei der parallel erfolgten Kontrolle von aufgetrennter M. bovis-DNA Signale
detektiert werden. Die Ergebnisse der jeweiligen Southern Blots sind in Abbildung 2a
und b zu sehen.
4.2 Histopathologische Ergebnisse
Für die Auswertung der histopathologischen Ergebnisse dienten HE-gefärbte
Schnitte sowie mit Spezialfärbungen in Form von Azan- und Siriusrot-Färbung
behandelte Schnitte. Die Anzahl der untersuchten Blöcke, sowie die Anzahl der
Blöcke mit Lungenveränderungen in Form von Nekrosen, katarrhalisch-eitriger
Bronchopneumonie und obliterierender Bronchiolitis der einzelnen Kälber sind in den
Tabelle 6 bis Tabelle 9 im Anhang zusammengefasst.
4.2.1 Gruppe 1 (Kontrollgruppe)
In der Kontrollgruppe zeigten zwei Tiere (E2934/00 und E2935/00) keine
histopathologischen Veränderungen. Die Tiere E1504/99, E1505/99 und E1650/99
wiesen vereinzelte bis geringgradige, in einem Fall (E1650/99) auch mittelgradige,
katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonien in mehreren Lokalisationen auf. Des
Weiteren fand sich in allen untersuchten Lokalisationen eine geringgradige,
interstitielle Pneumonie. Bei Tier E1505/99 konnten zudem in einer Lokalisation
obliterierende Bronchiolitiden nachgewiesen werden. Hierbei wird das Lumen des
Bronchiolus durch Bindegewebszubildungen nach Alteration des Epithels verlegt
(Abbildung 28, Kap. 4.5). Der Nachweis des neu gebildeten Bindegewebes erfolgte
mit der Azanfärbung. Diese führt zu einer blauen Färbung des extrazellulär
gelegenen Kollagens (Abbildung 29, Kap. 4.5). Zusätzlich fand sich bei Tier
E1505/99 in einer Lokalisation eine über 10 mm im Durchmesser messende
Nekrose. Diese zeigte ein wolkiges Erscheinungsbild, deren einzelne Unterregionen
Ergebnisse
45
durch dünne Bindegewebssepten abgeteilt wurden. Dadurch ergab sich eine
Formation, die an ehemalige Alveolen erinnerte. An der Peripherie der nekrotischen
Areale fanden sich wenige Bindegewebsfasern mit einzelnen Makrophagen und
neutrophilen Granulozyten. Die gesamte Nekrose war sehr fibrinreich, welches
besonders an den Grenzen zu gesundem Gewebe zu beobachten war. Dieses
entspricht dem Bild einer fibrinösen Pneumonie (siehe Abbildung 9, Kap.4.5).
4.2.2 Gruppe 2
Bei den Tieren der Gruppe 2 wies das Tier mit der Nummer 5 in mehreren
Lokalisationen nekrotische Areale auf (5 von 10) (Abbildung 9, Kap. 4.5). Diese
zeigten ein wolkiges Erscheinungsbild, deren einzelnen Unterregionen durch dünne
Bindegewebssepten abgeteilt wurden. Dadurch ergab sich eine Formation, die an
ehemalige Alveolen erinnerte (Abbildung 10 und Abbildung 11, Kap. 4.5). An der
Peripherie der nekrotischen Areale fanden sich wenige Bindegewebsfasern mit
einzelnen Makrophagen und neutrophilen Granulozyten. Fünf Tiere (2, 5, 10, 12 und
13) zeigten in mehreren Lokalisationen eine bis zu mittelgradige, katarrhalisch-eitrige
Bronchopneumonie. Eine interstitielle Pneumonie fand sich in nahezu allen
untersuchten Lokalisationen. Hierbei war diese zum Teil mittelgradig, wobei bei
Tier 5 einmal eine hochgradige, interstitielle Pneumonie diagnostiziert wurde.
Obliterierende Bronchiolitiden konnten bei keinem der Tiere nachgewiesen werden.
4.2.3 Gruppe 3
Die Tiere dieser Gruppe wiesen ein sehr heterogenes histopathologisches Bild auf.
Zum einen zeigte Tier Nummer E2936/00 Nekrosen (Abbildung 15, Kap. 4.5) in
mehreren Blöcken verschiedener Lokalisationen (10 von 18). Die Nekrosen zeigten
eine deutliche bindegewebige Kapsel (Abbildung 16 und Abbildung 14, Kap. 4.5),
umgeben von einem Wall von Makrophagen, der von Lymphozyten und
Plasmazellen infiltriert wurde (Abbildung 13, Kap. 4.5). Die nächste Schicht wurde
durch zahlreiche neutrophile Granulozyten gebildet, die sich zum Teil im Untergang
befanden. Zentral zeigte sich eine amorphe, in der HE-Färbung eosinophile Masse
(Abbildung 12, Kap. 4.5). Gleichartige Nekrosen fanden sich auch bei den Tieren
E1507/99 und E1512/99, die mit einer hohen Dosis einer Mykoplasmensuspension
infiziert wurden (1010 CFU/ml). Von den Tieren, die mit einer niedrigeren Dosis an
46
Ergebnisse
Mykoplasmensuspension infiziert wurden (108 CFU /ml), konnte nur bei Tier 1511/99
in einer Lokalisation eine Nekrose nachgewiesen werden. Am häufigsten wurden
Nekrosen unter 5 mm gefunden (88 von 135), gefolgt von Nekrosen zwischen 5 und
10 mm (37 von 135). Am wenigsten waren über 10 mm große Nekrosen vorhanden
(10 von 135). Die meisten Nekrosen fanden sich mit 85 von 135 in den mittleren
Lungenabschnitten (Lokalisation 2 und 5). Die prozentuale Verteilung der Nekrosen
bezogen auf die einzelnen Lokalisationen und Nekrosengrößen ist in Abbildung 3
dargestellt.
70.00%
60.00%
50.00%
40.00%
Lok. 3/4
30.00%
Lok. 2/5
20.00%
Lok. 1/6
10.00%
0.00%
< 5 mm 5 -10
mm
10 mm
Summe
Abbildung 3: Prozentuale Verteilung der Nekrosen (n = 135) in Gruppe 3.
Lok.: Lungenlokalisationen (vergleiche Abbildung 1)
Eine katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie zeigte sich bei allen Tieren in mehreren
Lokalisationen. Diese war meist gering- bis mittelgradig, vereinzelt auch hochgradig,
wobei zum einen die vorderen Lokalisationen (Lokalisation 1 und 6 sowie 2 und 5)
häufiger betroffen waren als die kaudalen (Lokalisation 3 und 4). Zum anderen
wiesen
die
Tiere
mit
der
höheren
Infektionsdosis
häufiger
und
stärkere
Veränderungen auf, als die Tiere der geringeren Infektionsdosis. Bei einem Tier
(E2937/00) konnte mittels der Siriusrot-Färbung eine interstitielle Pneumonie mit
hochgradiger
Infiltration
eosinophilen
Granulozyten
nachgewiesen
werden.
Obliterierende Bronchiolitiden fanden sich bei sechs dieser zwölf Tiere in meist
mehreren Lokalisationen (Abbildung 28 und Abbildung 29, Kap. 4.5), wobei alle Tiere
der höheren Infektionsdosis diese aufwiesen, während sie bei den Tieren der
Ergebnisse
47
geringeren Infektionsdosis in keiner Lokalisation gefunden wurden. Alle Tiere wiesen
in nahezu allen Lokalisationen eine meist geringgradige, vereinzelt mittelgradige,
interstitielle Pneumonie auf.
4.2.4 Gruppe 4
Von den zehn vakzinierten Tieren der Gruppe 4 wiesen sechs in einzelnen
Lokalisationen Nekrosen auf. Auch hier erfolgte die Einteilung in drei Größen. Die
Verteilung der 31 Nekrosen auf die drei Größen war mit 15-mal unter 5 mm,
siebenmal zwischen 5 und 10 mm und neunmal über 10 mm relativ ausgeglichen.
Diese waren hauptsächlich in den mittleren (Lokalisation 2 und 5) und hinteren
(Lokalisation 3 und 4) Lungenabschnitten zu finden. In Abbildung 4 ist die
prozentuale Verteilung der Nekrosen bezogen auf die einzelnen Lokalisationen und
Nekrosegrößen graphisch dargestellt ist.
80.00%
70.00%
60.00%
50.00%
40.00%
30.00%
20.00%
10.00%
0.00%
Lok. 1/6
Lok. 2/5
Lok. 3/4
< 5 mm 5 -10
mm
10 mm
Summe
Abbildung 4: Prozentuale Verteilung der Nekrosen (n = 31) in Gruppe 4.
Lok: Lungenlokalisationen (vergleiche Abbildung 1)
Alle Tiere zeigten in der Mehrzahl der Lokalisationen eine gering- bis mittelgradige,
katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie (Abbildung 25, Kap. 4.5). Obliterierende
Bronchiolitiden fanden sich bei sieben der zehn Kälber in einzelnen Lokalisationen.
Hierbei wurden diese bei Tier E2941/00 mit acht von 18 Blöcken in mehreren
Lokalisationen am häufigsten festgestellt. Die Tiere E2940/00 und E2941/00 wiesen
eine mittel- bis hochgradige, interstitielle Pneumonie in nahezu allen Lokalisationen
auf. Bei den anderen Tieren war diese nur geringgradig ausgeprägt.
48
Ergebnisse
4.2.5 Zusammenfassung
Zusammenfassend zeigten sich in allen vier Gruppen Tiere mit histopathologischen
Veränderungen in Form von Nekrosen, katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonie,
obliterierenden Bronchiolitiden und interstitieller Pneumonie. Diese Veränderungen
fanden sich bei den Tieren der Kontrollgruppe (Gruppe 1) und der Gruppe mit einer
kurzen Infektionsdauer von unter 10 Tagen (Gruppe 2) nur vereinzelt und wiesen
maximal eine mittelgradige Ausprägung auf. Bei fast allen Tieren, die 21 Tage nach
der Infektion getötet und seziert wurden (Gruppe 3 und Gruppe 4), konnten in den
meisten
Lokalisationen
Veränderungen
wie
Nekrosen,
katarrhalisch-eitrige
Bronchopneumonien, obliterierende Bronchiolitiden und interstitielle Pneumonien
gefunden werden. Diese waren zum Teil auch von hochgradiger Ausprägung.
4.3 Ergebnisse der in situ-Hybridisierung
Die durch Injektion von M. bovis-Suspension in gesundes Lungengewebe erstellte
Positivkotrolle zeigte sowohl mit der Sonde VspAI als auch mit der Sonde VspAII
deutliche Signale, die in den verbreiterten, interlobulären Interstitien hochgradig
auftraten. Diese violetten Signale lagen bei mit reinem Hybridisierungspuffer
behandelten Schnitten nicht vor.
Für die im Versuchsmaterial nachgewiesenen Hybridisierungssignale konnten
zwischen den beiden verwendeten Sonden (VspAI und VspAII) hinsichtlich
Lokalisation und Ausprägung keine Unterschiede festgestellt werden. Vereinzelt
zeigte sich im direkten Vergleich ein geringgradig stärkeres Signal bei der kürzeren
Sonde VspAI.
Eine Behandlung der Schnitte mit Wasserstoffperoxid zur Hemmung der endogenen
Peroxidasen vor der ISH hatte keinen Einfluss auf Lokalisation und Ausprägung der
Signale.
4.3.1 Gruppe 1 (Kontrollgruppe)
Bei den Lungen der Tiere der Kontrollgruppe konnte weder in unveränderten noch in
Lungenarealen
mit
Nekrosen,
katarrhalisch-eitriger
Bronchopneumonie,
obliterierender Bronchiolitis oder interstitieller Pneumonie ein positives ISH-Signal
detektiert werden. Die Ergebnisse der ISH für die einzelnen Kälber der Gruppe 1 sind
in Tabelle 6 im Anhang zusammengefasst.
Ergebnisse
49
4.3.2 Gruppe 2
Bei den Lungen der Tiere der Gruppe 2 konnte weder in unveränderten noch in
Lungenarealen
mit
Nekrosen,
katarrhalisch-eitriger
Bronchopneumonie
oder
interstitieller Pneumonie ein positives ISH-Signal detektiert werden. Die Ergebnisse
der ISH für die einzelnen Kälber der Gruppe 2 sind in Tabelle 7 im Anhang
zusammengefasst.
4.3.3 Gruppe 3
Von den zwölf Tieren der Gruppe 3 wiesen sechs Tiere sowohl in den Nekrosen als
auch in Arealen mit katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonie positive ISH-Signale
auf. In letzteren waren die Signale im Exsudat in den Lumina von Bronchien zu
beobachten. Der prozentuale Anteil der Nekrosen (n = 135) sowie der Blöcke mit
katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonie (n = 72) und mit obliterierender Bronchiolitis
(n = 31) mit ISH-Signalen sind als zusammenfassende Graphik in Abbildung 5
dargestellt; die Ergebnisse der ISH für die einzelnen Kälber der Gruppe 3 sind in
Tabelle 8 im Anhang aufgeführt.
4.3.3.1 Nekrosen
Vier Tiere dieser Gruppe (E2936/00, E1507/99, E1511/99 und E1512/99) wiesen
zum Teil in mehreren Lokalisationen Nekrosen auf. Hierbei wurden drei
Verteilungsmuster für das Auftreten von ISH-Signalen unterschieden: Erstens gab es
eine Akzentuierung von Signalen im Randbereich der Nekrose in Höhe des Walls
aus neutrophilen Granulozyten (Abbildung 19, Kap. 4.5). Bei anderen Formen
wurden zentral in der Nekrose Signale in Form von wolkigen Akkumulationen
gefunden (Abbildung 20, Kap. 4.5). Das dritte Verteilungsmuster war ein diffus über
die ganze Nekrose verteiltes Auftreten von Signalen (Abbildung 21, Kap. 4.5).
Mischformen sowie unterschiedliche Ausprägungen waren vorhanden.
Das Tier E2936/00 zeigte die meisten Nekrosen (84), welche alle ein positives ISHSignal aufwiesen. Hier gab es zum Teil auch hochgradige Ansammlungen von
Signalen im Randbereich. In den anderen Nekrosen konnten zumeist gering- bis
mittelgradige Konzentrationen von Signalen im Randbereich, wie auch zentral und
diffus
festgestellt
werden,
wobei
am
häufigsten
gering-
bis
mittelgradige
Ansammlungen von Signalen gefunden wurden (Abbildung 17, Kap. 4.5).
50
Ergebnisse
100.0%
90.0%
80.0%
70.0%
60.0%
50.0%
40.0%
30.0%
20.0%
10.0%
0.0%
Nekrosen
Katarrhalisch-eitrige
Bronchopneumonie
obliterierende
Bronchiolitiden
Abbildung 5: Prozentualer Anteil positiver Nekrosen bzw. positiver Gewebeproben
in der ISH in Gruppe 3
Von den 16 Nekrosen, die bei Tier E1507/99 in vier Lokalisationen gefunden wurden,
wiesen sieben kein Hybridisierungssignal auf. Bei den verbleibenden neun, verteilt
auf alle vier Lokalisationen, traten meist gering- bis mittelgradige Ansammlungen von
Signalen in allen drei Verteilungsmustern auf.
Das Tier E1511/99 wies in den beiden Nekrosen, welche in einer Lokalisation
gefunden wurden, keine ISH-Signale auf. Somit zeigte keines der Kälber, die mit
einer geringeren Dosis einer Mykoplasmensuspension infiziert wurden, positive
Signale mit der ISH in einer Nekrose.
Bei dem Tier E1512/99 konnten in 31 der 33 Nekrosen aus sieben verschiedenen
Lokalisationen gering- bis mittelgradige Hybridisierungssignale fast ausschließlich im
Randbereich der Nekrosen nachgewiesen werden (Abbildung 22, Abbildung 23 und
Abbildung 24, Kap. 4.5). Zwei Nekrosen wiesen kein Signal auf.
Von den insgesamt 135 Nekrosen bei den Tieren dieser Gruppe konnten in 124
Nekrosen
positive
ISH-Signale
detektiert
werden.
Dieses
entspricht
einem
Prozentsatz von 91,8%.
Wie schon bei der histopathologischen Untersuchung fanden sich die meisten
Nekrosen, die auch positive ISH-Signale aufwiesen, überwiegend in den mittleren
Lungenabschnitten (Lokalisation 2 und 5).
Ergebnisse
51
4.3.3.2 Katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie
Die
bei
allen
Tieren
dieser
Gruppe
auftretenden
katarrhalisch-eitrigen
Bronchopneumonien wiesen bei sechs Tieren positive Signale im eitrigen Exsudat in
einigen Lokalisationen auf. Hierbei wurden überwiegend Signale geringgradiger
Ausprägung gefunden. Die meisten positiven Blöcke fanden sich bei Tier E2936/00
und E1512/99. Insgesamt waren von 72 untersuchten Blöcken 23 positiv in der ISH,
welches einem Prozentsatz von 31,9% entspricht. In zwei Lokalisationen von Tier
E2937/00, bei dem eine eosinophile Pneumonie diagnostiziert wurde, wurden
ebenfalls positive ISH-Signale gefunden. Bei den Tieren, die mit einer geringen Dosis
einer Mykoplasmensuspension infiziert wurden, konnten keine positiven Signale mit
der ISH im Bereich der katarrhalisch-eitrigen Bronchopneumonie festgestellt werden.
4.3.3.3 Obliterierende Bronchiolitiden
Von den sechs Tieren, bei denen in insgesamt 31 Blöcken obliterierende
Bronchiolitiden gefunden wurden, konnten nur bei Tier E2936/00 in zwei Blöcken
einzelne
positive
ISH-Signale
gefunden
werden.
Dieses
entspricht
einem
Prozentsatz von 6,5%. In den anderen gefundenen obliterierenden Bronchiolitiden
konnte kein ISH-Signal detektiert werden (Abbildung 31, Kap. 4.5).
4.3.3.4 Interstitielle Pneumonie
In den verbreiterten Interstitien der untersuchten Lungengewebeproben, in denen
eine interstitielle Pneumonie vorlag, konnten keine positiven ISH-Signale gefunden
werden.
4.3.4 Gruppe 4
Alle Tiere der Gruppe 4 wiesen positive ISH-Signale auf. Diese fanden sich sowohl in
Nekrosen als auch im Exsudat katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonien. Der
prozentuale Anteil der Nekrosen (n = 31) sowie der Blöcke mit katarrhalisch-eitriger
Bronchopneumonie (n = 128) und mit obliterierender Bronchiolitis (n = 18) mit ISHSignalen sind als zusammenfassende Graphik ist in Abbildung 6 dargestellt, die
Ergebnisse der ISH für die einzelnen Kälber der Gruppe 4 sind in Tabelle 9 im
Anhang aufgeführt.
52
Ergebnisse
100.0%
90.0%
80.0%
70.0%
60.0%
50.0%
40.0%
30.0%
20.0%
10.0%
0.0%
Nekrosen
Katarrhalisch-eitrige
Bronchopneumonie
obliterierende
Bronchiolitiden
Abbildung 6: Prozentualer Anteil positiver Nekrosen bzw. positiver Gewebeproben
in der ISH in Gruppe 4
4.3.4.1 Nekrosen
Sechs der zehn Tiere wiesen Nekrosen unterschiedlicher Größe in jeweils einigen
Lokalisationen auf. In allen Nekrosen (n = 31) konnten zumeist mittelgradige
Ansammlungen
von
in
situ-Hybridisierungssignalen
im
Randbereich
sowie
geringgradig Signale zentral in der Nekrose festgestellt werden. Bei den meisten
Nekrosen waren gemischte Verteilungsformen vorhanden.
4.3.4.2 Katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie
Alle Kälber wiesen katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonien in nahezu allen
untersuchten Lungenlokalisationen auf. Bei allen Tieren konnten positive in situHybridisierungssignale im Exsudat von Bronchien und größeren Bronchioli gefunden
werden (Abbildung 26, Kap. 4.5). Die meisten Lokalisationen (85 von 128) wiesen
allerdings im Exsudat kein positives Signal auf. Dieses entspricht einem Prozentsatz
von
66,4%.
Somit
waren
33,6%
der
Blöcke
mit
katarrhalisch-eitriger
Bronchopneumonie positiv in der ISH.
4.3.4.3 Obliterierende Bronchiolitiden
Von den sieben Tieren, bei denen in insgesamt 18 Blöcken obliterierende
Bronchiolitiden gefunden wurden, konnten nur bei Tier E2941/00 in einem Block
Ergebnisse
53
einzelne positive in situ-Hybridisierungssignale gefunden werden. Dieses entspricht
einem Prozentsatz von 5,6%.
4.3.4.4 Interstitielle Pneumonie
In den verbreiterten Interstitien der untersuchten Lungengewebeproben, in denen
eine
interstitielle
Pneumonie
vorlag,
konnten
keine
positiven
in
situ-
Hybridisierungssignale gefunden werden.
4.3.5 Zusammenfassung
Sowohl in der Kontrollgruppe als auch in der Gruppe 2 mit Kälbern, welche
spätestens zehn Tage nach der Infektion seziert wurden, konnten keine positiven
ISH-Signale nachgewiesen werden. Die Kälber der Gruppen 3 und 4 wiesen nahezu
in allen vorhandenen Nekrosen positive Signale auf (91,8% in Gruppe 3 und 100% in
Gruppe 4). Hierbei ergaben sich mit randständig, zentral und diffus drei
Verteilungsmuster, die meist in Mischformen auftraten.
Die bei allen Tieren dieser Gruppen nachgewiesenen katarrhalisch-eitrigen
Bronchopneumonien zeigten nur in 31,9% (Gruppe 3) bzw. 33,6% (Gruppe 4) der
Blöcke ein positives Signal im Exsudat. Bei obliterierenden Bronchiolitiden konnten
nur bei zwei Tieren in insgesamt drei Blöcken vereinzelt positive Signale gefunden
werden. Das entspricht einem Prozentsatz von 6,1%.
In den verbreiterten Interstitien der untersuchten Lungenlokalisationen, in denen eine
interstitielle Pneumonie vorlag, wurden keine ISH-Signale nachgewiesen.
4.4 Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchung
Die durch Injektion von M. bovis-Suspension in gesundes Lungengewebe
gewonnene Positivkontrolle zeigte nach Behandlung mit dem Antikörper MAB970
schwache Signale, die in den verbreiterten interlobulären Interstitien auftraten. Diese
braunen und granulären Signale lagen bei mit Balb/C behandelten Schnitten nicht
vor. Im Zytoplasma der Epithelzellen von Bronchioli und Bronchien fanden sich
schwache, braune Ablagerungen.
4.4.1 Gruppe 1 (Kontrollgruppe)
Das Tier E1505/99 wies im Randbereich der Nekrose, die sich in einer Lokalisation
befand, geringgradig positive Reaktionen auf. Andere veränderte Bereiche zeigten
54
Ergebnisse
keine positiven Reaktionen. In den Lungen der anderen Kälber der Kontrollgruppe
wurden in Arealen mit katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonie, obliterierender
Bronchiolitis und interstitieller Pneumonie keine positiven Signale mit dem Antikörper
MAB970 detektiert. Im Zytoplasma des Epithels von Bronchioli und Bronchien fanden
sich schwache, braune Ablagerungen. Die Ergebnisse für die IHC der einzelnen
Kälber der Gruppe 1 sind in Tabelle 6 im Anhang zusammengefasst.
4.4.2 Gruppe 2
In den Lungen der Kälber der Gruppe 2 wurden in Arealen mit Nekrosen,
katarrhalisch-eitriger
Bronchopneumonie
und
interstitieller
Pneumonie
keine
positiven Signale mit dem Antikörper MAB970 detektiert. Im Zytoplasma des Epithels
von Bronchioli und Bronchien fanden sich schwache, braune Ablagerungen. Die
Ergebnisse der IHC für die einzelnen Kälber der Gruppe 2 sind in Tabelle 7 im
Anhang zusammengefasst.
4.4.3 Gruppe 3
Von den zwölf Tieren der Gruppe 3 wiesen sieben Tiere, die auch schon bei der
Untersuchung mittels ISH positive Signale aufwiesen, positive Reaktionen mit dem
Antikörper MAB970 auf. Diese waren sowohl in Nekrosen, in Arealen mit
katarrhalisch-eitriger
Bronchopneumonie
als
auch
in
obliterierten
Bronchioli
nachweisbar. Im Zytoplasma des Epithels von Bronchioli und Bronchien fanden sich
schwache, braune Ablagerungen. Der prozentuale Anteil der Nekrosen (n = 135)
sowie der Blöcke mit katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonie (n = 56) und mit
obliterierender Bronchiolitis (n = 26) mit IHC-Signalen sind als zusammenfassende
Graphik ist in Abbildung 7 dargestellt, die Ergebnisse der IHC für die einzelnen
Kälber der Gruppe 3 sind in Tabelle 8 im Anhang aufgeführt.
Ergebnisse
55
100.0%
90.0%
80.0%
70.0%
60.0%
50.0%
40.0%
30.0%
20.0%
10.0%
0.0%
Nekrosen
Katarrhalischeitrige Bronchopneumonie
obliterierende
Bronchiolitiden
Epithelien von
Bronchien und
Bonchioli
Abbildung 7: Prozentualer Anteil positiver Nekrosen bzw. positiver Gewebeproben
in der IHC mit dem monoklonalen Antikörper MAB970 in Gruppe 3
4.4.3.1 Nekrosen
Vier Tiere dieser Gruppe (E2936/00, E1507/99, E1511/99 und E1512/99) wiesen
zum Teil in mehreren Lokalisationen Nekrosen auf. Bis auf die Nekrosen in einer
Lokalisation bei Tier E1507/99 konnten in allen anderen Lokalisationen schwache
positive Reaktionen im Randbereich der nekrotischen Areale unterhalb des Walls
aus Makrophagen gefunden werden (Abbildung 18, Kap. 4.5). Diese traten in der
Regel geringgradig auf, in wenigen Nekrosen kam es nur vereinzelt zu Reaktionen.
Insgesamt waren 71,85% der Nekrosen (97 von 135) in der immunhistochemischen
Untersuchung mit MAB970 positiv.
4.4.3.2 Katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie
Die
bei
allen
Tieren
dieser
Gruppe
auftretenden
katarrhalisch-eitrigen
Bronchopneumonien wiesen bei sechs Tieren positive Reaktionen in einigen
Lokalisationen auf. Die Reaktionen traten in der Regel vereinzelt auf. Allerdings
wiesen 53,6% der Blöcke (30 von 56) keine positiven Reaktionen im eitrigen Exsudat
auf. Bei den Tieren, die mit einer geringeren Dosis einer Mykoplasmensuspension
infiziert wurden, konnte keine positive immunhistochemische Reaktion nachgewiesen
werden.
56
Ergebnisse
4.4.3.3 Obliterierende Bronchiolitiden
Von den sechs Tieren, bei denen in einigen Lokalisationen obliterierende
Bronchiolitiden gefunden wurden, konnten nur bei Tier E2936/00 und Tier E2939/00
positive Reaktionen mit MAB970 nachgewiesen werden (Abbildung 30, Kap. 4.5).
Insgesamt waren 38,5% der untersuchten Blöcke (10 von 26) mit obliterierender
Bronchiolitis in der immunhistologischen Untersuchung positiv.
4.4.3.4 Interstitielle Pneumonie
In den verbreiterten Interstitien der untersuchten Lungengewebeproben, in denen
eine interstitielle Pneumonie vorlag, konnten keine positiven Reaktionen mit MAB970
gefunden werden.
4.4.4 Gruppe 4
Bis auf Tier E2943/00 wiesen alle Tiere der Gruppe 4 positive Reaktionen in der
immunhistochemischen Untersuchung mit MAB970 auf. Diese fanden sich sowohl in
Nekrosen und obliterierenden Bronchiolitiden als auch im Exsudat katarrhalischeitriger Bronchopneumonien. Im Zytoplasma des Epithels von Bronchioli und
Bronchien fanden sich schwache, braune Ablagerungen. Der prozentuale Anteil der
Nekrosen (n = 31) sowie der Blöcke mit katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonie
(n = 50) und mit obliterierender Bronchiolitis (n = 8) mit IHC-Signalen sind als
zusammenfassende Graphik ist in Abbildung 8 dargestellt, die Ergebnisse der IHC
für die einzelnen Kälber der Gruppe 4 sind in Tabelle 9 im Anhang aufgeführt.
4.4.4.1 Nekrosen
Sechs der zehn Tiere wiesen Nekrosen unterschiedlicher Größe in einigen
Lokalisationen auf. Bis auf fünf Nekrosen konnten in allen übrigen positive Signale
detektiert werden. Das entspricht einem Prozentsatz von 83,87% (26 von 31). Diese
waren in der Regel geringgradig ausgeprägt und im Randbereich der Nekrose
unterhalb des Walls aus Makrophagen lokalisiert. Vereinzelt konnten auch zentrale
(vier Nekrosen) und diffuse (vier Nekrosen) Verteilungsmuster gefunden werden.
Ergebnisse
57
100.0%
90.0%
80.0%
70.0%
60.0%
50.0%
40.0%
30.0%
20.0%
10.0%
0.0%
Nekrosen
Katarrhalischeitrige Bronchopneumonie
obliterierende
Bronchiolitiden
Epithelien von
Bronchien und
Bonchioli
Abbildung 8: Prozentualer Anteil positiver Nekrosen bzw. positiver Gewebeproben
in der IHC mit dem monoklonalem Antikörper MAB970 in Gruppe 4
4.4.4.2 Katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie
Die bei allen Tieren dieser Gruppe in nahezu allen Lungenlokalisationen
auftretenden katarrhalisch-eitrigen Bronchopneumonien wiesen bei neun Tieren
positive Reaktionen im eitrigen Exsudat in einigen Lokalisationen auf (Abbildung 27,
Kap. 4.5). Nur bei Tier E2943/00 konnten keine positiven Reaktionen detektiert
werden. Die Reaktionen traten in der Regel vereinzelt auf. Allerdings wiesen 36,0%
der Blöcke keine positiven Reaktionen im eitrigen Exsudat auf. Somit waren 64% der
Blöcke mit katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonie (32 von 50) positiv in der IHC.
4.4.4.3 Obliterierende Bronchiolitiden
Von den sieben Tieren, bei denen in einigen Lokalisationen obliterierende
Bronchiolitiden gefunden wurden, konnten nur bei Tier E2941/00 positive Reaktionen
mit MAB970 nachgewiesen werden. Insgesamt waren 25,0% der untersuchten
Blöcke mit obliterierender Bronchiolitis (2 von 8) positiv in der immunhistologischen
Untersuchung.
4.4.4.4 Interstitielle Pneumonie
In den verbreiterten Interstitien der untersuchten Lungengewebeproben mit
interstitieller Pneumonie konnten keine positiven Reaktionen mit MAB970 gefunden
werden.
58
Ergebnisse
4.4.5 Zusammenfassung
Sowohl in der Kontrollgruppe als auch in der Gruppe 2 mit Kälbern, welche
spätestens zehn Tage nach Infektion seziert wurden, konnten keine positiven
Reaktionen mit MAB970 nachgewiesen werden. Eine Ausnahme bildete das Tier
E1505/99, bei dem in einer Lokalisation eine Nekrose gefunden wurde. Diese zeigte
im Randbereich geringgradige Ablagerung von Reaktionsprodukt. Die Kälber der
Gruppen 3 und 4 wiesen in nahezu allen vorhandenen Nekrosen positive Reaktionen
auf. Hierbei waren allerdings nicht alle bei der ISH positiv reagierenden Nekrosen
auch in der IHC positiv. In der Regel war das Reaktionsprodukt randständig
unterhalb des Walls aus Makrophagen lokalisiert. Die bei allen Tieren dieser
Gruppen nachgewiesene katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie zeigte in 46,4%
(Gruppe 3) bzw. 64,0% (Gruppe 4) der Blöcke eine positive Reaktion im Exsudat. Bei
obliterierenden Bronchiolitiden konnten nur bei drei Tieren in insgesamt zwölf
Blöcken vereinzelt positive Signale gefunden werden. Das entspricht einem
Prozentsatz von 35,3%. Im Zytoplasma des Epithels von Bronchioli und Bronchien
fanden sich bei allen Tieren in allen untersuchten Lokalisationen schwache, braune
Ablagerungen. In den verbreiterten Interstitien bei Tieren mit interstitieller Pneumonie
wurden keine positiven immunhistochemischen Reaktionen nachgewiesen.
4.5 Fotographische Dokumentation
Auf den folgenden Seiten finden sich die Abbildung 9 bis Abbildung 31, welche die
beschriebenen histopathologischen Veränderungen der Kälberlungen sowie die
Ergebnisse der ISH und IHC fotographisch dokumentieren.
Ergebnisse
59
Abbildung 9:
Lunge, Mannheimia
haemolytica-Infektion
Tier 5 aus Gruppe 2
Lokalisation 6
Fibrinöse Pneumonie mit
Nekrose
N: zentrale Nekrose
HE-Färbung
Balken: 200 µm
Abbildung 10:
Lunge, Mannheimia
haemolytica-Infektion
Tier 5 aus Gruppe 2
Lokalisation 6
Randbereich der Nekrose aus
Abbildung 9
N: nekrotisches Material
NG: Ansammlung
neutrophiler Granulozyten
Pfeile: ehemalige
Alveolarwand
HE-Färbung
Balken = 25 µm
Abbildung 11:
Lunge, Mannheimia
haemolytica-Infektion
Tier 5 aus Gruppe 2
Lokalisation 6
selber Bereich wie in
Abbildung 10
Pfeile: ehemalige
Alveolarwand
Azan-Färbung
Balken = 25 µm
60
Ergebnisse
Abbildung 12:
Lunge, M. bovis-Infektion
Tier E2936/00
Lokalisation 3
Randbereich einer Nekrose
N: zentrale Nekrose
NG: Demarkationslinie aus
überwiegend neutrophilen
Granulozyten
M: Makrophagenwall
HE-Färbung
Balken = 25 µm
Abbildung 13:
Lunge, M. bovis-Infektion
Tier E2936/00
Lokalisation 3
Randbereich einer Nekrose
mit ausgeprägter
bindegewebiger Kapsel
M: Makrophagenwall mit
Infiltration von Lymphozyten
und Plasmazellen
BG: umgebendes
Bindegewebe
HE-Färbung
Balken = 25 µm
Abbildung 14:
Lunge, M. bovis-Infektion
Tier E2936/00
Lokalisation 3
Randbereich einer Nekrose
NG: Demarkationslinie aus
überwiegend neutrophilen
Granulozyten
M: Makrophagenwall
BG: umgebendes
Bindegewebe
Azan-Färbung
Balken = 25 µm
Ergebnisse
61
Abbildung 15:
Lunge, M. bovis-Infektion
Tier E2936/00, Lokalisation 3, Nekrose
N: zentrale Nekrose
NG: Demarkationslinie aus überwiegend
neutrophilen Granulozyten
M: Makrophagenwall
BG: umgebendes Bindegewebe
HE-Färbung
Balken = 200 µm
Abbildung 16:
Lunge, M. bovis-Infektion
Tier E2936/00, Lokalisation 3
selbe Nekrose wie in Abbildung 15
in der Azan-Färbung blaues Kollagen des
Bindegewebes als Abgrenzung der Nekrose
(Pfeile)
N: zentrale Nekrose
Azan-Färbung
Balken = 200 µm
Abbildung 17:
Lunge, M. bovis-Infektion
Tier E2936/00, Lokalisation 3
selbe Nekrose wie in Abbildung 15
M. bovis-DNA-Nachweis in Form eines violettbraunen Präzipitats innerhalb der Nekrose
(Stern)
N: zentrale Nekrose
VspAI-ISH
Balken = 200 µm
Abbildung 18:
Lunge, M. bovis-Infektion
Tier E2936/00, Lokalisation 3
selbe Nekrose wie in Abbildung 15
M. bovis-Antigen-Nachweis im Randbereich
der Nekrose (Pfeile)
N: zentrale Nekrose
MAB970-Immunhistologie (DAB)
Balken = 200 µm
62
Ergebnisse
Abbildung 19:
Lunge, M. bovis-Infektion
Tier E2936/00
Lokalisation 5
M. bovis-DNA-Nachweis in
Form eines violett-braunen
Präzipitats im Randbereich
der Nekrose (Pfeile)
N: zentrale Nekrose
VspAI-ISH
Balken = 100 µm
Abbildung 20:
Lunge, M. bovis-Infektion
Tier E2936/00
Lokalisation 3
M. bovis-DNA-Nachweis in
Form eines violett-braunen
Präzipitats im Zentrum der
Nekrose
N: zentrale Nekrose
VspAI-ISH
Balken = 100 µm
Abbildung 21:
Lunge, M. bovis-Infektion
Tier E2936/00
Lokalisation 3
M. bovis-DNA-Nachweis in
Form eines violett-braunen
Präzipitats über die gesamte
Fläche der Nekrose verteilt
N: zentrale Nekrose
VspAI-ISH
Balken = 100 µm
Ergebnisse
63
Abbildung 22:
Lunge, M. bovis-Infektion
Tier E1512/99
Lokalisation 2
M. bovis-DNA-Nachweis in
Form eines violett-braunen
Präzipitats im Randbereich
der Nekrose (Pfeile)
N: zentrale Nekrose
VspAI-ISH
Balken = 200 µm
Abbildung 23:
Lunge, M. bovis-Infektion
Tier E1512/99
Lokalisation 2
selber Bereich wie in
Abbildung 22
M. bovis-DNA-Nachweis in
Form eines violett-braunen
Präzipitats im Randbereich
der Nekrose (Pfeile)
N: zentrale Nekrose
VspAI-ISH
Balken = 50 µm
Abbildung 24:
Lunge, M. bovis-Infektion
Tier E1512/99
Lokalisation 2
selber Bereich wie in
Abbildung 22
M. bovis-DNA-Nachweis in
Form eines violett-braunen
Präzipitats im Randbereich
der Nekrose (Pfeile)
N: zentrale Nekrose
VspAI-ISH
Balken = 25 µm
64
Ergebnisse
Abbildung 25:
Lunge, M. bovis-Infektion
Tier E2941/00
Lokalisation 4
hochgradig eitriges Exsudat
im Lumen (L) eines Bronchus
HE-Färbung
Balken = 100 µm
Abbildung 26:
Lunge, M. bovis-Infektion
Tier E2941/00
Lokalisation 4
selber Bronchus wie in
Abbildung 25
M. bovis-DNA-Nachweis in
Form eines violett-braunen
Präzipitats (Stern) im eitrigen
Exsudat im Lumen (L) des
Bronchus
VspAI-ISH
Balken = 100 µm
Abbildung 27:
Lunge, M. bovis-Infektion
Tier E2941/00
Lokalisation 4
selber Bronchus wie in
Abbildung 25
M. bovis-Antigen-Nachweis
im Randbereich (Pfeile) und
innerhalb des eitrigen
Exsudats (Stern) im Lumen
(L) des Bronchus
MAB970-Immunhistologie
(DAB)
Balken = 100 µm
Ergebnisse
65
Abbildung 28:
Lunge, M. bovis-Infektion
Tier E2936/00, Lokalisation 3
durch obliterierende Bronchiolitis (oB)
verschlossener Bronchiolus mit Vakuolisierung
der Epithelzellen (Pfeile)
HE-Färbung
Balken = 25 µm
Abbildung 29:
Lunge, M. bovis-Infektion
Tier E2936/00, Lokalisation 3
selber Bronchiolus wie in Abbildung 28
durch obliterierende Bronchiolitis (oB)
verschlossener Bronchiolus mit in der AzanFärbung blauen kollagenen Fasern und
Vakuolisierung der Epithelzellen (Pfeile)
Azan-Färbung
Balken = 25 µm
Abbildung 30:
Lunge, M. bovis-Infektion
Tier E2936/00, Lokalisation 3
selber Bronchiolus wie in Abbildung 28
durch obliterierende Bronchiolitis (oB)
verschlossener Bronchiolus mit positiver
Reaktion im Epithel (Pfeile)
MAB970-Immunhistologie (DAB)
Balken = 25 µm
Abbildung 31:
Lunge, M. bovis-Infektion
Tier E2936/00, Lokalisation 3
selber Bronchiolus wie in Abbildung 28
durch obliterierende Bronchiolitis (oB)
verschlossener Bronchiolus ohne
Hybridisierungssignale
VspAI-ISH
Balken = 25 µm
Diskussion
67
5 Diskussion
Ziel dieser Arbeit war es, neben der histopathologischen Beschreibung von
Lungenveränderungen bei experimentell infizierten Kälbern die Methode der in situHybridisierung für M. bovis an Formalin-fixiertem und Paraffin-eingebettetem
Lungengewebe von diesen Kälbern zu etablieren. Dabei sollten die Verteilung und
die Lokalisation der DNA analysiert und mit immunhistochemischen Befunden
korreliert werden.
5.1 Histopathologische Befunde
Die histopathologischen Befunde an den in der vorliegenden Arbeit verwendeten
Lungenproben von 35 Kälbern wurden in Teilen bereits von BUCHENAU (2003)
beschrieben. Die Tiere wiesen Veränderungen auf, wie sie auch von anderen
Autoren für experimentell mit M. bovis infizierte Kälber aufgeführt wurden (MARTIN
et al. 1983; RODRÍGUEZ et al. 1996a; STIPKOVITS et al. 2000a). So wurden
Infiltrationen
der
Alveolarsepten
mit
Entzündungszellen,
katarrhalisch-eitrige
Entzündungsprozesse in Bronchien, Bronchiolen und Alveolen, eine Hyperplasie des
peribronchiolären
lymphatischen
Gewebes
sowie
nekrotische
Areale
im
Lungenparenchym gefunden.
Für die Infektionsversuche wurden verschiedene M. bovis-Stämme verwendet.
Hierbei handelte es sich um M. bovis PG45 (Gruppe 1), M. bovis 1067 (ein Teil der
Tiere aus Gruppe 3 und Gruppe 4) sowie um einen französischen Feldstamm (Teile
der Gruppe 3).
Von den 30 untersuchten Kälbern, die mit M. bovis infiziert wurden, wiesen 16
(53,3%) eine Infektion mit weiteren bakteriellen Erregern wie Mannheimia
haemolytica, Arcanobacterium pyogenes und Pasteurella multocida auf. Besonders
auffällig ist hierbei die Gruppe 4, deren Kälbern 18 Tage vor der Inokulation von M.
bovis ein aufgereinigtes M. bovis-VspA-Fusionsprotein verabreicht wurde. Hier wurde
bei sieben von zehn Tieren (70%) Arcanobacterium pyogenes nachgewiesen.
HOUGHTON und GOURLAY (1983) wiesen schon auf das Zusammenspiel von
Infektionen mit Mannheimia haemolytica und M. bovis hin. M. bovis ist demnach in
der Lage, Infektionen mit anderen bakteriellen Erregern zu begünstigen. Mit viralen
68
Diskussion
Erregern wie dem Virus der bovinen Virusdiarrhoe (BVD) konnte ebenfalls ein
Synergismus festgestellt werden (SHAHRIAR et al. 2002). Über den virologischen
Status der Kälber für die vorliegenden Untersuchungen lagen allerdings keine Daten
vor.
Bei Tier E1505/99 der Kontrollgruppe (Gruppe 1) sowie Tier 5 aus Gruppe 2,
welches nach vier Tagen p. i. getötet wurde, fanden sich Nekrosen in den kranialen
Anteilen der Lunge (Lokalisation 1 und 6), die zudem das Bild einer fibrinösen
Pneumonie zeigten. Bei E1505/99 konnte in der bakteriologischen Untersuchung der
Lunge M. bovis nicht nachgewiesen werden. Bei Tier 5 konnte bakteriologisch M.
bovis nachgewiesen werden, allerdings war in der ISH keine M. bovis-DNA
darstellbar. Fibrinöse Pneumonien mit Nekrosen werden in der Literatur im Rahmen
einer Pasteurellose beschrieben (DUNGWORTH 1993). Bei Tier 5 aus Gruppe 2
wurde Mannheimia haemolytica (ehemals Pasteurella haemolytica) nachgewiesen.
Bei dem anderen Tier blieb die Ätiologie für die nekrotischen Veränderungen unklar.
Bei drei Kälbern der Gruppe 1 (E1504/99, E1505/99 und E1650/99) konnte zudem
eine interstitielle Pneumonie und eine katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie
festgestellt werden. Da bei diesen Tieren bakteriologisch weder Mykoplasmen noch
andere Erreger nachgewiesen werden konnten, blieb die Ursache dieser
Veränderungen unklar. Eventuell sind sie Folge mechanischer Irritationen durch die
intratracheale Inokulation der Mykoplasmensuspension bzw. der durchgeführten
bronchioalveolären Lavage. So zeigten in einer Studie von PRINGLE et al. (1988)
lungengesunde
Kälber
zehn
Tage
nach
einer
bronchioalveolären
Lavage
geringgradige Infiltrationen von Entzündungszellen in Alveolen und Interstitien.
Die Kälber der Gruppe 2 wiesen bereits wenige Tage nach der Infektion
geringgradige Veränderungen im Lungenparenchym auf. Diese reichten von milden
interstitiellen Infiltrationen bis zu mittelgradigen katarrhalisch-eitrigen Pneumonien.
Bei den Kälbern mit den stärksten Veränderungen in Form einer katarrhalischeitrigen Bronchopneumonie wurden als mögliche Erreger Mannheimia haemolytica,
Pasteurella multocida und Bacillus-Spezies isoliert. M. bovis konnte nur bei vier der
acht Tiere bakteriologisch nachgewiesen werden. In Fällen, in denen nur M. bovis
Diskussion
69
aus der Lunge isolierte wurde, fanden sich nur milde entzündliche Infiltrate. M. bovisDNA konnte mittels ISH bei keinem der Tiere der Gruppe 2 nachgewiesen werden.
Die Tiere der Gruppe 3 wiesen ein sehr heterogenes histopathologisches Bild auf.
Zum einen fand sich hier mit Tier E2936/00 das Kalb mit den stärksten
Lungenveränderungen, die hauptsächlich durch Nekrosen gekennzeichnet waren.
Diese Nekrosen zeigten einen regelmäßigen Aufbau aus einer bindegewebigen
Kapsel, gefolgt von einem Wall aus Makrophagen mit Infiltration von Lymphozyten
und Plasmazellen. Die nächste Schicht wurde durch eine Ansammlung zum Teil
untergehender neutrophiler Granulozyten gebildet, die um eine zentrale amorphe
Masse lagen. Gleichartige Nekrosen wurden auch von anderen Autoren beschrieben
(GOURLAY u. HOWARD 1982; RODRÍGUEZ et al. 1996b). Nekrosen mit
identischem Aufbau wiesen auch die Tiere E1507/99, E1511/99 und E1512/99 auf,
wenn auch in deutlich geringerer Anzahl. Die Nekrosen fanden sich überwiegend in
den mittleren Lungenlokalisationen (Lokalisation 2 und 5). Dieses entspricht dem
Verteilungsmuster der Lungenveränderungen, die in der Regel im Rahmen einer M.
bovis-Infektion gefunden werden, wie es auch von anderen Autoren beschrieben
wurde (GOURLAY u. HOWARD 1982; RODRÍGUEZ et al. 1996b).
Vier Kälber dieser Gruppe (E1507/99, E1509/99, E1510/99, E1512/99) wurden mit
einer höheren Dosis einer M. bovis-Kultur (1010 CFU/ml) infiziert. Alle diese Tiere
wiesen eine zusätzliche Infektion mit Pasteurella multocida auf. Bei allen Tieren
wurden mittel- bis hochgradige katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonien sowie bei
zwei Kälbern Nekrosen in kranialen und mittleren Lungenabschnitten gefunden. Im
Lungengewebe der vier Kälber (E1506/99, E1508/99, E1511/99, E1513/99), die mit
einer geringeren Dosis (108 CFU/ml) einer M. bovis-Kultur infiziert wurden, wurden
keine anderen Keime nachgewiesen. Bei diesen Tieren waren die histologischen
Veränderungen deutlich weniger stark ausgeprägt. Somit wies nur ein Tier in einer
Lokalisation eine Nekrose auf, und die katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie war
nur geringgradig ausgeprägt. Eine Infektion mit M. bovis führt demzufolge mit einer
höheren Infektionsdosis zu ausgeprägteren Veränderungen in der Lunge als bei
einer
geringeren
Infektionsdosis.
Gleichzeitig
wird
die
Ansiedlung
anderer
pathogener Keime begünstigt, die nachfolgend oder synergistisch zu stärker
70
Diskussion
ausgeprägten Pneumonien führen, wie es auch von anderen Autoren beschrieben
wurde (HOUGHTON u. GOURLAY 1983; SHAHRIAR et al. 2002).
Bei den eben erwähnten Kälbern E1506/99 bis E1513/99 wurden zwei verschiedene
M. bovis-Stämme verwendet. Vier Tiere wurden mit M. bovis 1067 infiziert, die vier
anderen Kälber wurden mit einem französischen Feldstamm inokuliert. Ein
Unterschied in der Ausprägung, Lokalisation und Verbreitung der gefunden
Lungenveränderungen konnte zwischen diesen beiden Stämmen nicht festgestellt
werden.
Bei dem Tier E2937/00 wurde eine interstitielle Pneumonie mit Infiltration
eosinophiler Granulozyten gefunden. Während die interstitielle Pneumonie auf die
Infektion mit M. bovis zurückzuführen war, blieb die genaue Ätiologie der Infiltration
mit
eosinophilen
Granulozyten
unklar.
In
der
Regel
werden
eosinophile
Entzündungsprozesse in der Lunge im Zusammenhang mit einer Infektion mit
Parasiten gefunden. Beim Rind kämen Dictylocauliden und Protostrongyliden in
Betracht (BÜRGER 1992). Allerdings konnten in den vorhandenen Gewebeproben
keine Larven oder Eier der jeweiligen Parasiten nachgewiesen werden, die in der
Regel
gefunden
werden.
Eosinophile
Granulozyten
treten
auch
bei
Überempfindlichkeitsreaktionen vom anaphylaktischen Typ auf (MESSOW u.
HERMANNS 1990). THOMASMEYER (2006) konnte zeigen, dass in den Lungen
von Jungtieren und von lungengesunden Schlachttieren regelmäßig eosinophile
Granulozyten vorkommen. Somit stellt diese Veränderung bei dem Kalb E2937/00
möglicherweise einen Nebenbefund ohne bedeutende Relevanz dar.
Die Tiere der Gruppe 4 zeigten ein relativ einheitliches pathohistologisches Bild mit
einzelnen
Nekrosen
und
zum
Teil
ausgeprägten
katarrhalisch-eitrigen
Bronchopneumonien. Entgegen der Verteilung der Nekrosen bei Gruppe 3 fanden
sich diese verstärkt auch in den kaudalen Lokalisationen der Lunge (Lokalisation 3
und 4). Hierbei handelt es um untypische Bereiche für Lungenveränderungen bei
einer Infektion mit M. bovis, welcher aus nahezu allen Lungen der Kälber postmortal
isoliert wurde. Die überwiegende Zahl der Tiere wies, wie oben erwähnt, zusätzlich
eine Infektion mit Arcanobacterium pyogenes auf. Auch dieser Erreger wird nicht in
Zusammenhang
mit
nekrotischen
Veränderungen
in
den
kaudalen
Diskussion
71
Lungenabschnitten gebracht. Somit ist unklar, worauf die ungewöhnliche Häufung
auf die kaudalen Abschnitte zurückzuführen ist. MARTIN et al. (1983) führt auf, dass
bei starken Veränderungen in den kranialen und mittleren Lungenabschnitten sich
diese im weiteren Krankheitsverlauf auf die kaudalen Lokalisationen ausbreiten.
Allerdings wiesen Kälber aus der Gruppe 3 zum Teil umfangreichere Veränderungen
in den kranialen Abschnitten der Lunge auf, welche nur vereinzelt in den kaudalen
Lokalisationen der Lunge zu finden waren. In wie weit die vorherige Eingabe von
aufgereinigtem, rekombinanten M. bovis-VspA-Fusionsprotein einen Einfluss auf die
veränderte Ausbreitung der Läsionen in der Lunge hatte, konnte nicht abschließend
geklärt werden.
KHODAKARAM-TAFTI und LÓPEZ (2004) fanden in ihrer Untersuchung zwei Arten
von Nekrosen, die durch M. bovis verursacht werden. Zum einen eine
Koagulationsnekrose (in 33,3% der Fälle) mit vielen neutrophilen Granulozyten und
einer fibrinopurulenten Bronchopneumonie. Zum anderen verkäsende Nekrosen (in
100% der Fälle), die von Granulationsgewebe umgeben sind. Bei den untersuchten
Kälbern waren zum Teil Infektionen mit weiteren bakteriellen Erregern vorhanden. So
wurden Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica und Arcanobacterium
pyogenes regelmäßig isoliert. Die gefundenen Nekrosen der Kälber, die in dieser
Arbeit untersucht wurden, entsprechen von ihrem Erscheinungsbild eher dem einer
verkäsenden Nekrose mit eosinophilem, azellulärem Zentrum, umgeben von
untergehenden Leukozyten und einem Band aus Fibroblasten gemischt mit
Makrophagen. Bei anderen Autoren (ADEGBOYE et al. 1995b; RODRÍGUEZ et al.
1996a) wird diese Art der Nekrose Koagulationsnekrose genannt. Die von
KHODAKARAM-TAFTI und LÓPEZ (2004) beschriebenen Koagulationsnekrosen
entsprechen eher dem Bild, wie es bei dem Tier E1505/99 aus der Kontrollgruppe
und Tier Nr. 5 aus Gruppe 2 in Folge einer Infektion mit Mannheimia haemolytica
gefunden wurde. Allerdings konnten KHODAKARAM-TAFTI und LÓPEZ (2004) in
diesen Nekrosen M. bovis-Antigen nachweisen, was bei den Fällen der vorliegenden
Untersuchung immunhistochemisch nicht möglich war. Lediglich das Kontrolltier
E1505/99 wies am Rand einer Nekrose geringgradige Ablagerungen von
Reaktionsprodukt auf, wobei bei diesem Tier keine Infektion mit M. bovis erfolgte, der
72
Diskussion
Erreger nicht isoliert werden konnte und auch sonst nicht nachgewiesen wurde.
Möglicherweise handelte es sich hierbei um eine Kreuzreaktion des Antikörpers mit
wirtseigenen Strukturen. Mittels ISH konnte ebenfalls keine M. bovis-DNA bei diesem
Tier wie auch bei Tier Nr. 5 aus Gruppe 2 nachgewiesen werden.
Obliterierende Bronchiolitiden fanden sich bei mehreren Tieren aus den Gruppen 3
und 4 in einzelnen Lungenlokalisationen. Diese Veränderung wurde in der Literatur
bisher nicht im Zusammenhang mit einer M. bovis-Infektion aufgeführt. STIPKOVITS
et
al.
(2000a,
b)
beschrieben
Zerstörungen
und
Degenerationen
des
Bronchialepithels bei natürlich und experimentell mit M. bovis infizierten Kälbern.
RODRÍGUEZ et al. (1996a) wiesen zudem nekrotisierende Bronchiolitiden bei
Kälbern nach. Hierbei handelte es sich möglicherweise um Vorstufen einer
obliterierenden Bronchiolitis. Obliterierende Bronchiolitiden werden beim Rind
üblicherweise im Zusammenhang mit Infektionen mit dem bovinen respiratorischen
Synzytialvirus (PIRIE et al. 1981; PHILIPPOU et al. 2000), mit Mannheimia
haemolytica (FRIEND et al. 1977; HAZIROGLU et al. 1997) sowie mit M. dispar
(BRYSON et al. 1978) beschrieben. Mannheimia haemolytica konnte nur bei Tier 5
aus Gruppe 2 nachgewiesen werden. Bei diesem Tier wurde allerdings keine
obliterierende Bronchiolitis festgestellt. Somit ist die obliterierende Bronchiolitis
wahrscheinlich Folge der M. bovis-Infektion.
5.2 Die Methode der in situ-Hybridisierung
Mit der ISH sollten genomische Sequenzen von M. bovis nachgewiesen werden. Für
den Nachweis von RNA ist entweder Gefriermaterial oder nach bestimmten
Protokollen für nur einen kurzen Zeitraum von max. 3 Stunden in Formalin-fixiertes
und Paraffin-eingebettetes Material notwendig (LEITCH et al. 1994). Ansonsten
kommt es schnell zu einem Abbau der RNA durch ubiquitäre RNAsen. DNA ist im
Gegensatz dazu weniger anfällig und wird zu einem geringeren Prozentsatz
enzymatisch abgebaut (LEITCH et al. 1994). Für die hier durchgeführten
Untersuchungen stand für nur 24 bzw. 72 Stunden in Formalin-fixiertes und Paraffineingebettetes
Material
aus
dem
Archiv
zu
Verfügung.
Damit
war
die
Wahrscheinlichkeit, in dem Probenmaterial DNA zu detektieren deutlich größer als
für einen RNA-Nachweis. DNA hybridisiert allerdings nur mit einer DNA-Sonde stabil.
Diskussion
73
Die optimale Länge einer Sonde beträgt 100 bis 300 Basenpaare (bp). Kürzere
Sonden bilden nicht so stabile Nukleinsäurepaare, längere Sonden (insbesondere
solche, die länger als 1 kbp sind) dringen dagegen unter Umständen nur schlecht in
das Gewebe ein (LEITCH et al. 1994). So wurde im Rahmen dieser Untersuchung
zunächst eine Sonde mit einer Länge von ca. 1 kbp aus dem Genombereich des
vspA-Gens verwendet. Mit dieser Sonde war es trotz Variation der meisten
Parameter des ISH-Protokolls nicht möglich, ein positives Signal zu erhalten.
MC CULLY und BROCK (1992) synthetisierten eine Sonde mit 1150 bp, mit der sie
M. bovis in einem Southern Blot nachwiesen. Diese Sonde fand jedoch trotz
Ankündigung in der Veröffentlichung keine weitere Benutzung in einer ISH, was an
der Länge gelegen haben könnte. Von der Verwendung einer Oligonukleotidsonde
wurde in der vorliegenden Arbeit abgesehen, da diese den Nachteil haben, dass nur
eine begrenzte Anzahl an Markermolekülen eingebaut wird. Somit können zum einen
bei geringer Anzahl an Zielsequenzen unter Umständen nur wenige Signale
detektiert werden, was eine geringere Sensitivität der Methode zur Folge hat. Zum
anderen können bereits wenige fehlgepaarte Nukleotide die Stabilität der
entstehenden Doppelhelix erheblich beinträchtigen (LEITCH et al. 1994). Somit
wurden für die hier vorgelegte Untersuchung zwei Sonden synthetisiert, die mit 171
bzw. 217 bp im optimalen Längenbereich liegen. In der Literatur wurde bis jetzt keine
ISH für M. bovis beschrieben, somit handelt es sich bei der vorliegenden Arbeit um
die Erstbeschreibung dieser Methode für den Nachweis von M. bovis-DNA.
Es wurde mit Digoxigenin eine nicht radioaktive, indirekte Markierung der Sonde
gewählt. Der Vorteil nichtradioaktiv markierter Sonden ist die längere Haltbarkeit.
Radioaktive Elemente, die in die genomische Sequenz eingebaut werden, haben
Halbwertzeiten von einigen Wochen. Zum anderen ist die Expositionszeit auf Grund
ihrer schwachen Strahlung mehrere Tage bis zu Wochen lang, weshalb sie ebenfalls
wenig praktikabel ist. Zusätzlich besteht auf Grund der Emission radioaktiver
Strahlung ein erhöhter räumlicher und sicherheitstechnischer Aufwand (LEITCH et al.
1994). Im Gegensatz zu anderen Markermolekülen wie beispielsweise Biotin kommt
Digoxigenin als antigene Struktur nicht natürlich im tierischen Gewebe vor, so dass
falsch positive Ergebnisse durch Bindung des mit alkalischer Phosphatase
74
Diskussion
gekoppelten Antikörpers gegen Digoxigenin an wirtseigenes Gewebe vermieden
werden können (HERRINGTON et al. 1989).
Die Methode der ISH für M. bovis-DNA wurde mittels einer DIG-markierter DNASonde etabliert. Um während der Etablierung sicher zu stellen, dass die einzelnen
Arbeitsschritte korrekt getätigt wurden, wurde zu Beginn eine ISH für porzines
Circovirus Typ 2 (PCV-2) mit positiver und negativer Kontrolle parallel durchgeführt.
Diese wurde im Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
entwickelt (KRÜGER 2005). Die Sonden VspAI und VspAII wurden zunächst an
unverändertem Lungengewebe getestet, welches mit einer konzentrierten M. bovisSuspension injiziert worden war. Als negative Kontrolle dienten zum einen gleich
behandelte, allerdings nicht mit Sonde inkubierte Schnitte (nicht mit Sonde versetzter
Hybridisierungspuffer),
sowie
Lungengewebe,
welches
nur
mit
dem
Suspensionsmedium (ohne M. bovis) injiziert wurde. Nach Optimierung der einzelnen
Arbeitsschritte und Prozeduren erfolgte die Untersuchung der 35 Kälber mit dem in
Kapitel 3.5.8 aufgeführten Protokoll. Eine Entstehung des durch alkalische
Phosphatase katalysierten farbigen Niederschlags durch endogene Peroxidasen
wurde mittels Hemmung derselbigen durch Wasserstoffperoxid getestet. Zudem
wiesen die ohne Sonde inkubierten Schnitte keine Signale auf, so dass in diesen
Kontrollen die inaktive endogene Peroxidase regelmäßig mitgetestet wurde.
5.3 Ergebnisse der in situ-Hybridisierung
Bei den untersuchten Kälbern konnte mittels der ISH mit den Sonden VspAI und
VspAII M. bovis-DNA in den Nekrosen und im Exsudat bei katarrhalisch-eitrigen
Bronchopneumonien nachgewiesen werden. Es konnten hinsichtlich Lokalisation und
Verbreitung von M. bovis-DNA keine Unterschiede zwischen den beiden Sonden
festgestellt werden. Mit dem hier vorgelegten Protokoll sind somit beide Sonden in
der Lage, in das Zielgewebe einzudringen und mit M. bovis-DNA zu hybridisieren.
Demzufolge besitzen der M. bovis-Stamm 1067 und der französische Feldstamm, die
zur Infektion der Kälber aus Gruppe 3 und 4 verwendet wurden, ein vspA-Gen
(detektierbar mit der Sonde VspAI) sowie auch die vorgeschaltete Sequenz, die zum
Anschalten und damit zur Expression des VspA-Proteins notwendig ist (detektierbar
mit der Sonde VspAII). Die Sonden wurden anhand der Sequenz des M. bovis-
Diskussion
75
Stammes PG45 nach den von LYSNYANSKY et al. (1996, 2001a) veröffentlichten
Sequenzen
synthetisiert.
Von
den
zur
Untersuchung
vorliegenden
Lungengewebeproben der Kälber waren die Tiere der Gruppe 2 mit einer klonalen
Variante des M. bovis-Stammes PG45 infiziert worden. Bei keinem dieser Tiere
konnte ein Hybridisierungssignal detektiert werden. Möglicherweise war die Methode
der ISH in diesem Fall nicht sensitiv genug, wobei die Sensitivität der Sonden an
infiziertem Gewebe nicht ermittelt wurde. Die Probengewinnung innerhalb von
maximal 10 Tagen p. i. hatte wahrscheinlich noch nicht dazu geführt, dass M. bovis
sich stärker vermehrt und in bestimmten Arealen der Lunge im Zusammenhang mit
hochgradigen Gewebealterationen persistiert. Im Gegensatz dazu konnten bei den
Kälbern der Gruppen 3 und 4 zum Teil hochgradige Hybridisierungssignale
nachgewiesen werden. Diese Kälber waren mit dem Stamm M. bovis 1067 bzw.
einem nicht genauer bezeichneten französischen Feldstamm infiziert worden. Diese
Stämme besitzen somit auf Grund der hier vorliegenden Hybridisierungsergebnisse
das vspA-Gen. BUCHENAU (2003) konnte in ihrer Untersuchung an einem Teil der
Kälber der Gruppe 3 und 4 mittels Antikörpern, die speziell gegen die variablen
Oberflächenproteine VspA, VspB und VspC gerichtet sind, diese Antigene im
infizierten Lungengewebe nachweisen. Somit exprimieren ein Teil der hier
untersuchten Kälber VspA in vivo, wie es BUCHENAU (2003) mit spezifischen
Antikörpern nachgewiesen hatte, und auch die dazugehörige Gensequenz von vspA
konnte mittels der ISH detektiert werden.
BUCHENAU (2003) fand in ihrer immunhistochemischen Untersuchung mit
spezifischen
Antikörpern
gegen
variable
Oberflächenproteine
zudem
Reaktionsprodukte, welche ein lineares Ablagerungsmuster an der Oberfläche der
Alveolen zeigten. Es wurde hier diskutiert, dass es sich in diesem Fall
möglicherweise um Kreuzreaktionen der Antikörper mit Surfaktant handeln könnte.
Es konnte in der hier vorliegenden Untersuchung mit der ISH keine M. bovis-DNA in
diesen Bereichen detektiert werden. Somit liegt nahe, dass es sich um Surfaktant
handelt, auch wenn dieses nicht bewiesen wurde. Eine andere Möglichkeit, dass
keine Hybridisierungssignale nachgewiesen wurden, könnte auch eine zu geringe
76
Diskussion
Sensitivität der Sonden sein, welche allerdings nicht an infiziertem Gewebe getestet
wurde.
Mittels der ISH konnten in der Gruppe 3 und 4 in nahezu allen vorhandenen
Nekrosearealen Hybridisierungssignale detektiert werden (91,8% bzw. 100%). Diese
fanden sich hauptsächlich randständig, wobei allerdings zentrale und diffuse
Verteilungen,
meist
in
Mischformen,
auftraten.
Somit
entspricht
das
Verteilungsmuster für M. bovis-DNA dem, wie es auch KHODAKARAM-TAFTI und
LÓPEZ (2004) mittels Immunhistochemie für M. bovis-Antigen beschrieben haben.
Auch RODRÍGUEZ et al. (1996a) konnten mittels Immunhistochemie M. bovisAntigen verstärkt in den Randzonen und auch im Zentrum der Nekrosen nachweisen.
Die von RODRÍGUEZ et al. (1996a) und BUCHENAU (2003) nachgewiesenen
Antigene von M. bovis im Bereich der Oberflächen von Bronchiolen und Bronchioli
konnten mittels der ISH nicht nachvollzogen werden. Entweder waren in diesen
Bereichen zu wenige Mykoplasmen vorhanden, so dass die Sonde nur einzelne
Möglichkeiten hatte, mit M. bovis-DNA zu hybridisieren. Andererseits könnte es sich
bei den von RODRÍGUEZ et al. (1996a) und BUCHENAU (2003) gefundenen
Ergebnissen um Kreuzreaktionen der jeweiligen Antikörper mit Surfaktant oder
Wirtsgewebe handeln.
KWON und CHAE (1999) sowie KWON et al. (2002) untersuchten natürlich und
experimentell mit M. hyopneumoniae infizierte Schweinelungen mit der ISH. Sie
konnten M. hyopneumoniae-DNA massenhaft am Epithel der Bronchien und
Bronchioli nachweisen, aber nie im Epithel. Des Weiteren fanden sie Signale in
Alveolar- und interstitiellen Makrophagen sowie Pneumozyten Typ I. In der
vorliegenden Untersuchung konnte keine M. bovis-DNA in Assoziation zum Epithel
nachgewiesen werden. Zu gleichen Ergebnissen kamen THOMAS et al. (1987), die
mit M. bovis infizierte, bovine Trachealkulturen mit Immunperoxidasefärbung und
Elektronenmikroskopie untersuchten. Sie konnten bei dieser Untersuchung zudem
keine Schädigung des Epithels feststellen, allerdings war das darunter liegende
Gewebe zum Teil nekrotisch. GEARY et al. (1981) beschrieben ein von M. bovis
produziertes Toxin, welches möglicherweise für die Veränderungen in der Lunge
verantwortlich war (HOWARD et al. 1987b). Allerdings wurde bis jetzt bei keinem M.
Diskussion
77
bovis-Stamm die genetische Ausstattung für die Produktion eines Toxins gefunden
(ROSENGARTEN, persönliche Mitteilung).
Bei Schweinen kommt es ähnlich der M. bovis-Infektion beim Rind zu einer
Hyperplasie des BALT (MAES et al. 1996). Innerhalb des hyperplastischen
peribronchiolären lymphatischen Gewebe konnten KWON und CHAE (1999) sowie
KWON et al. (2002) keine Hybridisierungssignale nachweisen. Dadurch ergibt sich,
dass die BALT-Hyperplasie nicht direkt durch den Erreger verursacht wird, sondern
durch mitogene Effekte, wie sie MESSIER und ROSS (1991) mit M. hyopneumoniae
Membranen nachweisen konnten. Auch in der vorliegenden Untersuchung konnte
innerhalb des hyperplastischen peribronchiolären lymphatischen Gewebes keine M.
bovis-DNA nachgewiesen werden. Analog zu M. hyopneumoniae konnten VANDEN
BUSH und ROSENBUSCH (2003) für M. bovis zeigen, dass abgetötete Erreger die
Aktivierung von CD4+ und CD8+ Zellen stimulieren. Möglicherweise kam es auch in
den vorliegenden Fällen durch eine ständige Prozessierung von M. bovis-Antigen
durch Makrophagen und deren Präsentation im lymphatischen Gewebe zu dessen
Hyperplasie und „Cuff“-Bildung.
HOWARD et al. (1976) und THOMAS et al. (1991) beschrieben, dass es in vitro zur
Adhärenz von M. bovis an die Oberfläche boviner neutrophiler Granulozyten kommt.
In vorliegender Untersuchung konnte in der Randzone der Nekrosen, die
überwiegend von neutrophilen Granulozyten gebildet wird, und im Exsudat
katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonien M. bovis-DNA mit der ISH nachgewiesen
werden. Dieses lässt vermuten, dass auch in vivo eine Adhärenz von M. bovis an
neutrophile Granulozyten auftritt.
5.4 Persistenz von Mycoplasma bovis
Regelmäßig wurde mittel- bis hochgradig M. bovis-DNA innerhalb der durch
Bindegewebe und Makrophagen demarkierten Nekrosen sowie gering- bis
mittelgradig im Exsudat katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonien der 21 Tage p. i.
getöteten Kälber nachgewiesen. Im chronischen Krankheitsgeschehen zeigt sich
somit eine Persistenz des Erregers, der zudem im Exsudat vorhanden ist und
dadurch wahrscheinlich weiterhin von den infizierten Kälbern ausgeschieden werden
78
Diskussion
kann. Dieses ist für die Epidemiologie von M. bovis auch gerade innerhalb eines
Bestandes von Bedeutung.
Seit der Entdeckung der variablen Oberflächenproteine von M. bovis (BEHRENS et
al. 1994) wird diesen eine Rolle an der Persistenz des Erregers im Respirationstrakt
zugesprochen. Diese bilden als Lipoproteine immunogene Oberflächenstrukturen,
die beim Wirt zur Bildung von Antikörpern führen (SACHSE et al. 2000). Innerhalb
eines Stammes können diese Oberflächenstrukturen während einer Infektion stark
variieren. Durch eine ständige Änderung dieser kommt es beim Wirt zu einer
Immunmodulation, die es M. bovis ermöglicht, sich der Elimination aus dem
Respirationstrakt zu entziehen, wobei der genaue Vorgang noch nicht bekannt ist
(ROSENGARTEN et al. 2000).
Jüngste Untersuchungen haben gezeigt, dass einige Mykoplasmen, darunter auch
M. bovis, in der Lage sind, Biofilme zu produzieren (MC AULIFFE et al. 2006). Bei
Biofilmen handelt es sich um strukturierte Gemeinschaften von bakteriellen Zellen in
einer selbst produzierten Matrix aus polymeren Substanzen, meist Polysaccharide,
auf einer inerten oder belebten Oberfläche (COSTERTON et al. 1999). So konnten
MC AULIFFE et al. (2006) zeigen, dass M. bovis in der Lage ist, einen Biofilm zu
produzieren und innerhalb dessen eine große Resistenz gegen Stressoren wie
Trockenheit und Hitze aufwies. Eine erhöhte Resistenz gegen Antibiotika, wie sie von
anderen Autoren für Keime innerhalb eines Biofilms beschrieben wird (MELCHIOR et
al. 2006), konnte bei M. bovis nicht festgestellt werden. Innerhalb der M. bovisStämme konnten Unterschiede hinsichtlich der Fähigkeit, Biofilme zu produzieren,
gefunden werden. So waren Stämme, die an der Oberfläche VspO und VspB
exprimierten deutlich besser in der Lage, Biofilme zu produzieren als Stämme, die
beispielsweise VspF exprimierten (MC AULIFFE et al. 2006). Möglicherweise findet
M. bovis innerhalb der Nekrosen ein Milieu vor, welches -ähnlich dem eines
Biofilmes- die Eliminierung durch den Wirt verhindert und gleichzeitig die
Vermehrung sicherstellt. In diesem Fall wäre es interessant, die Zusammensetzung
der extrazellulären Substanzen innerhalb der Nekrosen zu bestimmen und die
Ergebnisse mit denen normaler Biofilme zu vergleichen. Eine Beteiligung von VspA
an der Entwicklung von Biofilmen ist noch unklar. Weiterführende Untersuchungen
Diskussion
79
müssten die immunhistochemische Detektion andere Mitglieder der Vsp-Familie
mittels spezieller Antikörper beinhalten. Eine weitere Möglichkeit stellt die ISH dar,
mit der sich die Sequenzen der einzelnen vsp-Gene, wie im vorliegenden Fall mit
vspA, nachweisen lassen.
5.5 Immunhistochemie
Mit dem monoklonalen Antikörper MAB970 konnte in den gleichen Lokalisationen, in
denen mit der ISH M. bovis-DNA detektiert wurde, M. bovis-Antigen nachgewiesen
werden. In den Nekrosen war dieses jedoch meist im Randbereich angesiedelt. Auch
im Exsudat der katarrhalisch-eitrigen Bronchopneumonien wurde regelmäßig M.
bovis-Antigen detektiert. Während im Exsudat deutlich häufiger positive Reaktionen
(46,4% bzw. 64,0%) als in der ISH (31,9% bzw. 33,6%) gefunden wurden, zeigten
die Nekrosen in geringfügig weniger Fällen eine positive Reaktion (71,85% bzw.
83,87% in der IHC positiv, 91,8% bzw. 100,0% in der ISH positiv). Allerdings wurde
mit dem Antikörper regelmäßig Zytoplasma von Epithelzellen in Form feingranulärer,
brauner Ablagerungen angefärbt. Diese positive Reaktion fand sich nicht nur bei den
infizierten Kälbern der Gruppen 2, 3 und 4, sondern auch bei den nicht infizierten
Kälbern der Kontrollgruppe, bei denen kein M. bovis aus den Lungen isoliert wurde.
Auch BUCHENAU (2003) fand im Bronchial- und Bronchiolarepithel positive
Reaktionen mit den für Vsps spezifischen Antikörpern. ADEGBOYE et al. (1995a, b)
fanden braune Ablagerungen von Reaktionsprodukt in Epithelzellen von Bronchien
und Bronchiolen, die bei den Kontrolltieren allerdings nicht auftraten. Somit
schlussfolgerten diese Autoren, dass M. bovis intraepithelial vorhanden sei.
Die Entstehung der Nekrosen im Rahmen einer M. bovis-Infektion wurde in fünf
Stadien unterteilt (ADEGBOYE et al. 1995b). Im ersten Stadium finden sich
Makrophagen und neutrophile Granulozyten im Lumen von kleinen Bronchiolen, in
deren
Epithel
M.
bovis-Antigen
nachgewiesen
werden.
Darauf
folgt
eine
Akkumulation von Entzündungszellen sowie eine peribronchioläre, mononukleäre
Zellansammlung („Cuffing“). Das nächste Stadium besteht aus einer beginnenden
Degeneration und Zusammenhangstrennung des Epithels durch infiltrierende
Makrophagen und neutrophile Granulozyten. Danach kommt es zu einem Verlust des
Bronchialepithels mit Ausbildung einer Koagulationsnekrose, in deren Randbereich
80
Diskussion
hochgradig M. bovis-Antigen nachgewiesen werden kann. Abschließend entsteht
eine Koagulationsnekrose mit einem schwachen positiven Signal für M. bovisAntigen (ADEGBOYE et al. 1995b).
Die einzelnen Stadien der Nekroseentstehung konnten in der vorliegenden
Untersuchung nicht nachvollzogen werden. In wie weit es sich bei den
obliterierenden Bronchiolitiden um Vorstufen von Nekrosen handelt, ist noch unklar.
Mit der IHC wurden mit 35,3% der untersuchten Lokalisationen deutlich mehr positive
Reaktionen in obliterierenden Bronchiolitiden detektiert als mit der ISH M. bovis-DNA
nachgewiesen wurde (6,1%). Dieses Ergebnis ist auf das im Epithel von Bronchien
und Bronchioli falsch positive Reaktionsprodukt mit dem Antikörper MAB970
zurückzuführen.
Für
die
Untersuchungen
von
ADEGBOYE
et
al.
(1995b)
wurden
Lungengewebeproben von natürlich infizierten Kälbern verwendet, die verschieden
lange
an
chronischer
Pneumonie
litten.
Somit
wurden
in
diesen
Fällen
unterschiedliche Stadien der Infektion erfasst, wobei sich die Kälber wahrscheinlich
mit individuellen Erregermengen infizierten. In der vorliegenden Untersuchung waren
die Tiere, die Nekrosen mit Nachweis von M. bovis-DNA und -Antigen aufwiesen,
einheitlich 21 Tage nach der experimentellen Infektion getötet worden, wobei bis auf
einige Tiere aus Gruppe 3 einheitliche Infektionsdosen eingesetzt wurden. Somit
wäre es von besonderem Interesse, bei natürlich infizierten Kälbern bzw. Kälbern,
die zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Infektion getötet wurden, das
Vorkommen von M. bovis-DNA mit der ISH zu analysieren.
Um pathomorphologische Veränderungen im Rahmen einer Infektion mit M. bovis
ohne die Beteiligung von sekundären Erregern zu untersuchen, benötigt man
Tiermaterial aus spezifiziert pathogenfreien Haltungen (SPF-Haltung). Dieses ist
jedoch mit einem hohen Material- und somit auch Kostenaufwand verbunden.
GOURLAY et al. (1976) bewiesen zwar in Infektionsversuch mit gnotobiotischen
Kälbern die Pathogenität von M. bovis für Lungengewebe, allerdings kam es hier zu
nicht genauer beschriebenen bakteriellen Kontaminationen der Kälber. HOWARD et
al. (1987a) untersuchten ebenfalls gnotobiotische Kälber nach experimenteller M.
bovis-Infektion. Allerdings wurden hier nur vier Tiere untersucht. Die Autoren führten
Diskussion
81
auch immunhistochemische Untersuchungen durch, die M. bovis-Antigen in den
Randbereichen nekrotischer Areale nachwiesen. Eine Untersuchung zur Verteilung
von M. bovis-DNA, wie sie mit der ISH möglich ist, wurde nicht durchgeführt.
KHODAKARAM-TAFTI und LÓPEZ (2004) fanden innerhalb des Zytoplasmas von
mononukleären Zellen in den lymphatischen Follikeln geringe Mengen von M. bovisAntigen. RODRÍGUEZ et al. (1996a) beschrieben allerdings in dieser Region keine
Signale. Zu gleichen Ergebnissen kommt die vorliegende Untersuchung, in der mit
dem Antikörper MAB970 wie auch mit der ISH kein positives Signal nachgewiesen
werden konnte. Somit ist die Hyperplasie des BALT wahrscheinlich nur eine Folge
der immunologischen Abwehr und nicht einer direkten Infektion mit dem Erreger.
5.6 Diagnostik
Für die Routinediagnostik ist dem Nachweis von M. bovis mittels ISH kein
bedeutender
Stellenwert
beizumessen,
da
es
sich
um
eine
zeit-
und
materialintensive Methode handelt. So dauert der Vorgang nach dem hier
vorgestellten Protokoll drei Tage, während die IHC maximal zwei Tage in Anspruch
nimmt. Da die ISH an Formalin-fixiertem und Paraffin-eingebettetem Material
durchgeführt wird, können keine Proben von lebenden Tieren untersucht werden.
Ausnahmen würden hier Lungenbioptate bilden, die allerdings in der Praxis am
sedierten Rind auf Grund des hohen Aufwandes selten entnommen werden. Die ISH
ist allerdings ein gutes Werkzeug zur Lokalisation von Erregern oder bestimmter
genomischer Sequenzen und hat somit bei der Erforschung der Pathogenese von
Krankheiten einen hohen Stellenwert (LEITCH et al. 1994).
Für die intravitale und postmortale Diagnostik einer M. bovis-Infektion stehen
mehrere Möglichkeiten zur Auswahl. Zum einen kann der Erregernachweis mittels
PCR erbracht werden, was im Gegensatz zur kulturellen Anzüchtung des Erregers
deutlich weniger Zeit in Anspruch nimmt (FREY et al. 1999). Zur Identifizierung von
mit M. bovis infizierten Tieren innerhalb eines Bestandes werden serologische Tests
angeboten, die mittels ELISA den Antikörpertiter aus dem Blut bestimmen
(NICHOLAS et al. 2000).
82
Diskussion
5.7 Schlussfolgerung
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass mit einer DIG-markierten Sonde für
VspA in der ISH M. bovis-DNA nachgewiesen werden kann. Vor allem in Nekrosen
sowie zum Teil im Exsudat katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonien von Kälbern,
die 21 Tage p. i. getötet wurden, konnte diese detektiert werden. Die Mechanismen,
die es M. bovis ermöglichen, in den Nekrosen zu persistieren, bedürfen
weitergehender Untersuchungen. Bei Kälbern, die in der frühen Phase der Infektion
(bis maximal 10 Tage p. i.) untersucht wurden, konnte kein Hybridisierungssignal
detektiert werden.
Mit der IHC mit dem Antikörper MAB970, welcher gegen nicht genauer definierte
Epitope von M. bovis gerichtet ist, konnte in den gleichen veränderten
Lungenbereichen M. bovis-Antigen nachgewiesen werden, in denen auch M. bovisDNA detektierbar war. Allerdings kommt es mit dem monoklonalen Antikörper
MAB970 auch im Epithel von Bronchien und Bronchiolen zu Ablagerungen von
Reaktionsprodukt, die mit der ISH nicht bestätigt werden konnten. Hierbei handelt es
sich wahrscheinlich um falsch positive Reaktionen, da sie auch bei nicht infizierten
Kälbern auftraten.
Zusammenfassung
83
6 Zusammenfassung
Björn Jacobsen (2006):
Nachweis von Mycoplasma bovis in der Lunge von experimentell infizierten
Kälbern mittels in situ-Hybridisierung
Mycoplasma (M.) bovis ist neben M. mycoides subsp. mycoides small colony (SC),
dem Erreger der kontagiösen bovinen Pleuropneumonie, einer der bedeutendsten
Erreger boviner Mykoplasmosen. Erkrankungen treten hauptsächlich in Form von
Pneumonien und Arthritiden speziell bei Kälbern und Mastitiden bei Kühen auf und
verursachen weltweit erhebliche wirtschaftliche Verluste. Bislang ist kein wirksamer,
kommerziell erhältlicher Impfstoff vorhanden, und es treten zunehmend Resistenzen
gegenüber Antibiotika auf. Die Kenntnisse über Pathogenese und Persistenz von M.
bovis speziell im Respirationstrakt sind zum Teil noch unzureichend.
Ziel dieser Arbeit war es, neben der histopathologischen Beschreibung von
Lungenveränderungen bei experimentell infizierten Kälbern die Methode der in situHybridisierung für M. bovis an Formalin-fixiertem und Paraffin-eingebettetem
Lungengewebe von diesen Kälbern zu etablieren. Dabei sollten die Verteilung und
die Lokalisation der DNA analysiert und mit immunhistochemischen Befunden
korreliert werden.
Frühere Untersuchungen von BUCHENAU (2003) haben gezeigt, dass M. bovis im
Respirationstrakt
experimentell
infizierter
Kälber
verschiedene
variable
Oberflächenproteine (engl.: variable surface proteins, Vsps) exprimiert, welche
mittels verschiedener monoklonaler Antikörper nachgewiesen werden konnten.
Allerdings wurden mit diesen Antikörpern Reaktionsprodukte unter anderem an
Alveolen, Bronchiolen und Bronchioli nachgewiesen, wobei es unklar blieb, ob es
sich um mögliche Kreuzreaktionen der Antikörper mit wirtseigenen Strukturen
handelte.
Die Sequenz des Gens, welches für VspA codiert, diente zur Herstellung zweier
Digoxigenin markierter DNA-Sonden für die Hybridisierung mit M. bovis-DNA im
experimentell infizierten Lungengewebe.
84
Als
Zusammenfassung
Material
standen
Formalin-fixierte
und
Paraffin-eingebettete
Lungengewebeproben von fünf nicht infizierten Kontrollkälbern (Gruppe 1) sowie von
30 Kälbern aus verschiedenen Infektionsversuchen (Gruppe 2 bis 4) zur Verfügung.
Die Kälber aus Gruppe 2 wurden innerhalb von zwei bis maximal zehn Tagen nach
der Infektion getötet. Histopathologisch wiesen diese wie auch die Kontrollkälber nur
geringgradige Veränderungen auf. M. bovis-DNA konnte bei keinem dieser Tiere
detektiert werden.
Die Kälber aus den Gruppen 3 und 4, die 21 Tage nach einer Infektion mit M. bovis
getötet wurden, wiesen zum Teil hochgradige histopathologische Veränderungen in
Form von Nekrosen, katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonie, obliterierender
Bronchiolitis und interstitieller Pneumonie auf. Häufig wurden neben M. bovis noch
weitere bakterielle Erreger aus dem Lungengewebe isoliert, so dass eine in der
Literatur beschriebene Begünstigung von sekundären bakteriellen Infektionen durch
M. bovis nachvollzogen werden konnte. Die Veränderungen entsprachen im
Wesentlichen den in der Literatur beschriebenen Läsionen. Innerhalb der Nekrosen
und im Exsudat der katarrhalisch-eitrigen Bronchopneumonien konnte zum Teil
hochgradig M. bovis-DNA mittels der für vorliegende Untersuchung etablierten
Methode der in situ-Hybridisierung mit den Sonden VspAI und VspAII nachgewiesen
werden. In Alveolen, Interstitien, peribronchiolärem lymphatischen Gewebe und
Epithelien konnte keine M. bovis-DNA detektiert werden, wie es von BUCHENAU
(2003) mittels spezifisch gegen variable Oberflächenproteine gerichteten Antikörpern
beschrieben wurde.
Bei einer Untersuchung der Lungenproben mit einem kommerziell erhältlichen,
monoklonalen Antikörper (MAB970) konnte in vergleichbaren Arealen wie auch bei
der ISH M. bovis-Antigen detektiert werden. Allerdings wurden auch regelmäßig
positive Signale im Epithel von Bronchien und Bronchiolen gefunden, die auch bei
den M. bovis-negativen Kontrollkälbern auftraten. Hierbei handelte es sich
wahrscheinlich um Kreuzreaktionen des Antikörpers mit wirtseigenen Strukturen.
Es konnte gezeigt werden, dass M. bovis innerhalb von Nekrosen und im Exsudat
katarrhalisch-eitriger
Bronchopneumonien
im
Respirationstrakt
experimentell
infizierter Kälber persistiert. Dieses lässt die Vermutung zu, dass M. bovis über das
Zusammenfassung
85
Exsudat bei katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonie mindestens noch 21 Tage
ausgeschieden werden kann.
Die Faktoren, die eine Persistenz von M. bovis in der Lunge von infizierten Rindern
ermöglichen, sind bislang unvollständig geklärt. Mit der in situ-Hybridisierung für M.
bovis-DNA wurde ein weiteres Werkzeug etabliert, mit der neben vspA auch weitere
Gensequenzen im Lungengewebe des Wirtes untersucht werden können. Künftige
Untersuchungen sollten auch die mögliche Beteiligung variabler Oberflächenproteine
an der Fähigkeit von M. bovis zur Produktion von Biofilmen berücksichtigen.
Summary
87
7 Summary
Björn Jacobsen (2006):
Detection of Mycoplasma bovis in the lung of experimentally infected calves by
in situ-hybridization
Mycoplasma (M.) bovis, beside M. mycoides subsp. mycoides small colony (SC), the
agent of contagious bovine pleuropneumonia, is one of the most important
pathogens of bovine mycoplasmosis. The disease includes pneumonia and arthritis
especially in calves, and mastitis in dairy cows resulting in extensive losses for the
cattle industry. Commercial vaccines are presently not available and increasing
numbers of M. bovis strains are developing resistance to antibiotics. Knowledge of
pathogenesis and persistence of M. bovis especially in the respiratory tract is still
insufficient.
The aim of this study was to describe the histopathological lesions in lungs of
experimentally infected calves and to establish the in situ-hybridization (ISH) method
for M. bovis in formalin-fixed and paraffin-embedded lung tissues of these calves. A
further aim was to analyse the distribution and localisation of M. bovis-DNA and
correlate these findings with immunohistochemical results.
Earlier investigations of BUCHENAU (2003) revealed expression of several variable
surface proteins (Vsp) of M. bovis in the respiratory tract of experimentally infected
calves detected by different monoclonal antibodies. With these antibodies,
immunohistochemical staining was also found in alveoli, bronchi and bronchioli,
raising the question, if this was due to cross reactions of the antibodies with host
structures.
The sequence of the gene coding for VspA was used to synthesise two digoxigeninlabelled DNA probes for hybridization of M. bovis-DNA in lung tissue.
Formalin-fixed and paraffin-embedded lung samples of five non-infected control
calves (group 1) as well as 30 calves originating from different infection experiments
(group 2 to group 4) were used.
Calves from group 2 euthanised two to ten days post infection showed mild
histopathological changes like calves of the control group. M. bovis-DNA was not
detectable in any of these animals.
88
Histopathology
Summary
revealed
partly
severe
lesions
with
necrosis,
suppurative
bronchopneumonia, obliterative bronchiolitis and interstitial pneumonia in calves of
group 3 and 4 euthanised 21 days post infection with M. bovis. The lesions were
consistent with those described in literature. Beside M. bovis, other bacterial agents
were detected in lung tissues indicating promotion of secondary bacterial infections
due to M. bovis as described in literature.
Partly, abundant M. bovis-DNA could be found within necrotic areas and in the
exudate of suppurative bronchopneumonia by the in situ-hybridization method
established for this investigation. M. bovis-DNA was not detectable in the alveoli,
interstitial tissue, peribronchiolar lymphatic tissue and epithelium of the air ways as
described by BUCHENAU (2003) with specific antibodies directed against variable
surface proteins.
The investigation of the lung samples with a commercial monoclonal antibody
(MAB970), directed against not defined epitops of M. bovis, revealed M. bovisantigen in similar areas as M. bovis-DNA detected by ISH. However, positive
reactions were found within the epithelium of bronchi and bronchioli also seen in M.
bovis negative control animals. These are possibly cross reactions of the antibody
with host structures.
It can be postulated, that M. bovis persists in the respiratory tract of experimentally
infected calves and is possibly excreted with the exudate in cases of suppurative
bronchopneumonia.
The factors, which enable M. bovis to persist in the lungs of infected cattle, are poorly
understood. With the in situ-hybridization another tool was established to investigate,
beside vspA, other gene sequences. Further investigations should also include the
possible participation of variable surface proteins in the ability of M. bovis to produce
biofilms.
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Anhang
107
9 Anhang
9.1 Ergebnisse der Gruppen 1 bis 4 in tabellarischer Form
Tabelle 6:
Ergebnisse der Kälber aus Gruppe 1 (Kontrollgruppe)
Katarrhalisch-eitrige
Bronchopneumonie
Nekrosen
Lfd.
Nr.
E-Nr.
ISH
IHC
Anzahl positiv positiv
ISH
IHC
positiv positiv
Obliterierende
Bronchiolitis
ISH
IHC
positiv positiv
n
n
1
2934/00 18
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2
2935/00 18
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
3
1504/99 12
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
4
1505/99 12
1
1
0
1
8
0
0
1
0
0
5
1650/99 12
0
0
0
0
4
0
0
0
0
0
n
n
Lfd. Nr.: laufende Nummer; E-Nr.: Einsendungsnummer; n: Anzahl der Blöcke, ISH:
in situ-Hybridisierung; IHC: Immunhistochemie mit MAB970
Tabelle 7:
Ergebnisse der Kälber aus Gruppe 2
Katarrhalisch-eitrige
Bronchopneumonie
Nekrosen
Obliterierende
Bronchiolitis
Lfd.
Nr.
E-Nr.
n
n
6
2
12
0
0
0
0
4
0
0
0
0
0
7
5
10
5
9
0
0
6
0
0
0
0
0
8
7
12
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
9
8
12
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
10
9
12
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
11
10
12
0
0
0
0
6
0
0
0
0
0
12
12
12
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
13
13
12
0
0
0
0
9
0
0
0
0
0
ISH
IHC
Anzahl positiv positiv
n
ISH
IHC
positiv positiv
n
ISH
IHC
positiv positiv
Lfd. Nr.: laufende Nummer; E-Nr.: Einsendungsnummer; n: Anzahl der Blöcke, ISH:
in situ-Hybridisierung; IHC: Immunhistochemie mit MAB970
108
Anhang
Tabelle 8:
Ergebnisse der Kälber aus Gruppe 3
Katarrhalisch-eitrige
Bronchopneumonie
Nekrosen
Lfd.
Nr.
E-Nr.
ISH
IHC
Anzahl positiv positiv
ISH
IHC
positiv positiv
Obliterierende
Bronchiolitis
ISH
IHC
positiv positiv
n
n
14 2936/00 18
10
84
84
60
14
8
5
13
2
9
15 2937/00 18
0
0
0
0
2
2
1
0
0
0
16 2938/00 18
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
17 2939/00 18
0
0
0
0
17
3
5
3
0
1
18 1506/99 12
0
0
0
0
3
0
0
0
0
0
19 1507/99 12
4
16
9
6
8
2
6
4
0
0
20 1508/99 12
0
0
0
0
4
0
0
0
0
0
21 1509/99 12
0
0
0
0
3
0
0
1
0
0
22 1510/99 12
0
0
0
0
7
2
2
2
0
0
23 1511/99 12
1
2
0
2
7
0
0
0
0
0
24 1512/99 12
7
33
31
29
11
6
7
8
0
0
25 1513/99 12
0
0
0
0
3
0
0
0
0
0
n
n
Lfd. Nr.: laufende Nummer; E-Nr.: Einsendungsnummer; n: Anzahl der Blöcke, ISH:
in situ-Hybridisierung; IHC: Immunhistochemie mit MAB970
Anhang
Tabelle 9:
109
Ergebnisse der Kälber aus Gruppe 4
Katarrhalisch-eitrige
Bronchopneumonie
Nekrosen
Lfd.
Nr.
E-Nr.
ISH
IHC
Anzahl positiv positiv
ISH
IHC
positiv positiv
Obliterierende
Bronchiolitis
ISH
IHC
positiv positiv
n
n
26 2940/00 18
0
0
0
0
13
3
1
1
0
0
27 2941/00 18
3
9
9
9
17
13
4
8
1
2
28 2942/00 18
0
0
0
0
15
5
2
0
0
0
29 2943/00 18
0
0
0
0
15
2
0
0
0
0
30 2944/00 18
1
5
5
2
10
2
1
1
0
0
31 2945/00 18
1
3
3
3
5
2
2
2
0
0
32 2946/00 18
4
10
10
8
13
2
3
3
0
0
33 2947/00 18
2
3
3
3
13
2
2
2
0
0
34 2948/00 18
1
1
1
1
10
3
3
1
0
0
35 2949/00 18
0
0
0
0
17
9
8
0
0
0
n
n
Lfd. Nr.: laufende Nummer; E-Nr.: Einsendungsnummer; n: Anzahl der Blöcke, ISH:
in situ-Hybridisierung; IHC: Immunhistochemie mit MAB970
9.2 Lösungen für die Azanfärbung nach Heidenhain
Azokarminlösung:
0,1 g Azokarmin G in 100 ml Aqua dest. kurz aufkochen
abkühlen lassen
1 ml Eisessig dazugeben
Anilinblau-Orange-Essigsäure-Stammlösung:
0,5 g wasserlösliches Anilinblau
2 g Orange G
100 ml Aqua dest. zusammengeben und erkalten lassen
8 ml Eisessig dazugeben und filtrieren
Anilinblau-Orange-Essigsäure-Gebrauchslösung:
Stammlösung mit der doppelten Menge Aqua dest. verdünnen
Alkoholische Anilinlösung (Vorratslösung):
1 ml Anilinöl ad 1000 ml 96%iger Alkohol
110
Anhang
Essigsaurer Alkohol (Vorratslösung):
10 ml Eisessig ad 1000 ml 96%iger Alkohol
9.3 Siriusrot-Farblösung
1.
0,5 g Siriusrot F3B in 45 ml Aqua bidest. lösen;
2.
50 ml Ethanol hinzufügen;
3.
1 ml 1%ige NaOH (1 g NaOH ad 100 ml Aqua dest.) hinzufügen;
4.
20%ige NaCl-Lösung (20 g ad 100 ml Aqua dest.) tropfenweise hinzufügen,
bis es zu einer leichten Präzipitation kommt, die auch nach wiederholtem
Schwenken nicht mehr auflösbar ist (ca. 1,5 bis 3,5 ml);
5.
Lagerung der Lösung bei Raumtemperatur über 24 Stunden mit
anschließender Filtrierung
9.4 Lösungen für die Sondensynthese und- spezifizierung
Church Puffer:
500 ml Natrium-Phosphat-Puffer (0,5 M pH 7.2)
2 ml EDTA (0,5 M)
10 g Bovine Serum Albumine Fraction V
70 g SDS
ad 1000 ml Aqua bidest.
Phosphat Puffer (0,5 M pH 7,2):
Lösung A:
177,9 g Na2HPO4, 2H2O
ad 1000 ml Aqua bidest.
Lösung B:
137,99 g NaH2PO4, H2O
ad 1000 ml Aqua bidest.
Zur Herstellung von 1000 ml Natrium-Phosphat-Puffer (0,5 M pH 7,2):
342 ml Lösung A
158 ml Lösung B
ad 1000 ml Aqua bidest.
Kontrolle des pH-Wertes (pH 7,2)
Anhang
111
9.5 Lösungen für die in situ-Hybridisierung
Aqua bidest. DEPC (Diethylpyrokarbonat):
1 ml DEPC-Reinsubstanz
ad 1000 ml Aqua bidest.
autoklavieren
TRIS HCl (Trishydroxymethylammoniumethan):
MW 121,14, 1 M, pH 8,0
12,11 g/100ml Aqua bidest.
pH 8,0 mit konzentrierter HCL einstellen
CaCl2 (CaCl2 x H2O):
MW 147,02
für Proteinase K: 0,1 M = 1,47 g/100 ml Aqua bidest.
MgCl2 (MgCl2 x H2O):
MW 203,30
für PBS/5 mM MgCl2: 1 M = 20,33 g/100 ml Aqua bidest.
NaCl:
MW 58,44
für Hybridisierungssalze: 5 M = 29,22 g/100 ml Aqua bidest.
2 N (= 2 M) HCl:
für 0,2 N HCl: 50 ml 2 N HCl
ad 500 ml Aqua bidest.
5 N (= 5 M) NaOH:
MW 40,0
für EDTA-Na2-Lösung: 20 g NaOH-Plätzchen/100 ml Aqua bidest.
EDTA:
MW 372,3
Für 0,5 M EDTA, pH 8,0: 18,6 g di-Natrium-EDTA-di-Hydrat (= 14,6 g EDTA)
60 ml Aqua bidest. DEPC
pH mit 5 M NaOH (ca. 10 ml) auf 8,0 einstellen
ad 100 ml Aqua bidest. DPEC auffüllen und autoklavieren
112
Anhang
PIPES (Piperazin-N,N´bis[2-ethansulfat]-Säure):
MW 346,3
für Hybridisierungssalze: 0,5 M = 17,315 g/100 ml Aqua bidest.
10 x PBS (Phosphate buffered saline = Phosphat gepuffertes Natrium):
80,0 g NaCl
2,0 g KCl
14,4 g Na2HPO4
2,4 g KH2PO4
ad 1000 ml Aqua bidest., autoklavieren
1 x PBS:
16,0 g NaCl
0,4 g KCl
2,88 g Na2HPO4
0,48 g KH2PO4
ad 2000 ml Aqua bidest.
pH 7,4 einstellen mit NaOH, autoklavieren
20 x SSC (standard saline citrate):
175,3 g NaCl
88,2 g Na-Citrat
ad 800 ml Aqua bidest.
pH mit 1 N HCl auf 7,0 einstellen
auf 1000 ml mit Aqua bidest. auffüllen, autoklavieren
Puffer 1:
12,11 g TRIS (wird 100 mM, MW 121,14)
8,77 g NaCl (wird 150 mM, MW 58,44)
ad 1000 ml Aqua bidest.
pH 7,5 einstellen mit konzentrierter HCl (37%ig), Feineinstellung mit 1 N HCl
Anhang
Puffer 3:
12,11 g TRIS (wird 100 mM, MW 121,14)
5,84 g NaCl (wird 100 mM, MW 58,44)
ad 1000 ml Aqua bidest.
pH 9,5 mit 1 N HCl einstellen, autoklavieren
vor Gebrauch Zugabe von MgCl2+6H2O (MW 203,3)
1,2204 g/120 ml (wird 50 mM)
Puffer 4:
1,21 g TRIS (wird 10 mM)
0,37 g EDTA (wird 1 mM, MW 372,3)
ad 1000 ml Aqua bidest.
pH 8,0 mit 2 N HCl einstellen, autoklavieren
1 x PBS + 5 mM MgCl2:
100 ml 10 x PBS
5 ml 1 M MgCl2
ad 1000 ml Aqua bidest.
frisch zum Gebrauch ansetzten
2 x SSC + 5 mM EDTA-Na2:
200 ml Aqua bidest. Vorlegen
5 ml 0,5 M EDTA-Na2
50 ml 20 x SSC
ad 500 ml Aqua bidest.
0,2%iges Glycin in 1 x PBS:
1 g Glycin
500 ml 1 x PBS pH 7,4
autoklavieren
4%iges Paraformaldehyd (PFA):
20 g Paraformaldehyd
zunächst in 400 ml 1 x PBS lösen bei 60°C auf dem Magnetrührer
pH auf 7,35-7,40 einstellen mit 1 N HCl
auffüllen mit 1 x PBS auf 500 ml
113
114
Anhang
50 x Denhardts:
5 g Ficoll
5 g Polyvinylpyrolidone
5 g BSA
ad 500 ml Aqua bidest./steril
50 ml Aliquots lagern bei –20°C
20 x Hybridisierungssalze:
10 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 (wird 0,1 M)
10 ml 0,5 M PIPES pH 7,0 (wird 0,1 M)
30 ml 5 M NaCl
lagern bei –20°C
Prähybridisierungs-Mix:
450 ml 20 x SSC
675 ml 100%iges Formamid, deionisiert
150 ml 50 x Denhardts
210 ml Aqua bidest. DEPC
macht 1485 ml = 30 Aliquots á 49,5 ml, lagern bei –20°C
Hybridisierungs-Mix:
16 ml 100%iges Formamid, deionisiert
8 ml Hybridisierungssalze
3,2 ml 50 x Denhardts
320 µl Heparin
320 µl 10%iges Triton-X-100 (autoklaviert und verdünnt!)
macht 27,84 ml = 40 Aliquots á 696 µl, lagern bei –20°C
ssDNA:
lösen in Puffer 4, pH 8,0 auf 10 mg/ml Endkonzentration
Proteinase K:
Lösen in 10 mM TRIS-HCl, pH 7,5 (Konzentration je Stocklösung
14 bis 22 mg/ml)
RNA:
Stammlösung mit Aqua bidest. DEPC herstellen: 10 mg/ml
Anhang
115
Farblösung:
Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT):
1 g NBT ad 13,3 ml 70%iges Dimethylformamid (Stammlösung mit 75 mg/ml
Endkonzentration
5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphat (X-Phosphat, BCIP):
500 mg X-Phosphat ad 10 ml 100%iges Dimethylformamid (Stammlösung)
Dimethylformamid (DMF):
70%ig: 14 ml DMF plus 6 ml Aqua bidest.
9.6 Lösungen für die Immunhistochemie
1 x PBS (Phosphate buffered saline = Phosphat gepuffertes Natrium):
40,0 g NaCl
7,8 g NaH2PO4
ad 5000 ml Aqua dest.
pH 7,1 einstellen mt NaOH
ABC-Gebrauchslösung:
1 ml 1 x PBS
20 µl Lösung A, gut mischen
20 µl Lösung B, gut mischen
30 Min. vor Gebrauch ansetzen
DAB-Stammlösung:
100 mg DAB in 50 ml 1 x PBS
Lagerung bei -20°C
vor Gebrauch im Dunkeln auftauen lassen
DAB-Gebrauchslösung:
50 ml Stammlösung in 150 ml 1 x PBS
Lösung filtrieren
Zugabe von 3 ml 3%gem H2O2
9.7 Bezugsquellen für Chemikalien
Biologo, Kronshagen
Aszitesflüssigkeit von nicht-immunisierten Balb/C Mäusen, Best. Nr. CL8100
116
Anhang
Chemicon international, Temecula (California, USA)
Maus anti-Mycoplasma bovis monoklonaler Antikörper MAB970, Best. Nr.
23040988
Merck KGaA, Darmstadt
CaCl2 (CaCl2 x 2H2O) (Calciumchloriddihydrat) p. a., Best. Nr. 1-0 2382.0500
Dimethylformamid (DMF), Best. Nr. 1.03034.1000
Eisessig, Best. Nr. 1.00056.2500
Eosin (gelblich), Best. Nr. 1.15935.0100
Foramid p. a., Best. Nr. 1.09684.2500
Formaldehydlösung, mind. 37%., Best. Nr. 1.03999.2500
Glycin p. a., Best. Nr. 1.04201.1000
2 N HCl (Salzsäure), Best. Nr. 1.09970.1000
Isopropanol reinst., Best. Nr. 1.00995
KCl (Kaliumchlorid), Best. Nr. 1.04936.0500
KH2PO4 (Kaliumhydrogenphosphat), Best. Nr. 1.04873.0250
MgCl2 (MgCl2 x 6H2O) (Magnesiumchlorid-Hexahydrat) p.a., Best. Nr.
1.05833.0250
N,N-Dimethylformamid, Best. Nr. 3034
NaCl (Natriumchlorid), Best. Nr. 1.06400.2500
NaOH (Natriumhydroxidplätzchen) p.a., Best. Nr. 1.06498.0500
Orange G, Best. Nr. 1.15925.0025
Pyridin p.a., Best. Nr. 1.09728.0500
Salzsäure (HCl) 25%ig reinst., Best. Nr. 1.00312.2500
Triethanolamin (TEA) p. a., Best. Nr. 1.08379.0250
TRIS HCl (Trishydroxymethylamoniumethan), Best. Nr. 1.08386.1000
Triton X 100 p. a., Best. Nr. 1.08603.1000
Wasserstoffperoxid 30% H2O2 (Perhydrol®) p.a., Best. Nr. 1.07209.0250
MADI Dyes and Indicators, Dülmen
Siriusrot F3B, Best. Nr. 10-280
QBIOgene, Heidelberg
Formamid deionisiert, Best. Nr. FORMID003
Anhang
117
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
Anti-DIG-AK-AP: Anti-Digoxigenin-Antikörper, konjugiert mit Alkalischer
Phosphatase, Best. Nr. 1 093 277
Heparin: Liquemin N 25.000, Best. Nr. G-067 741
Proteinase K, Best. Nr. 1 373 196
Roth C. GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Essigsäurebutylester (EBE), Best. Nr. 4600.7
Ethanol, vergällt, Best. Nr. K928.2
Hämalaunlösung sauer nach Mayer, Best. Nr. T865.2
Natriumchlorid (NaCl), Best. Nr. P029.2
Na2HPO4, Best. Best. Nr. 4984.1
2-Propanol (Isopropanol), Best. Nr. 9866.4
Roti®-Histol, Best. Nr. 6640.01
Roti®-Plast, Gewebeeinbettungsmedium, Best. Nr. 6642.6
Rotiprotect®-Nitrilhandschuhe, Best. Nr. P777.1
Salzsäure Rotipuran® 25% p.a., Best. Nr. 6331.3
SDS, Best. Nr. 4360,1
Tri-Natrium-Di-Hydrat p. a., Best. Nr. 3580
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, TRIS Ultra Qualität, Best. Nr. 5429.3
Serva Feinbiochemica GmbH und Co Kg, Heidelberg
Bovine Serum Albumine Fraction V, Best. Nr. 11927
EDTA (Etylendiamintetraessigsäure-Disodium) p. a., Best. Nr. 11280
Glycin p. a., Best. Nr. 23390
Sigma-Aldrich Chemie GmbH (ehemals Sigma, Fluka, Riedel de Haën),
Taufkirchen
Acetanhydrid, Best. Nr. 45830
Anilinblau, Best. Nr. 61335
5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphat (X-Phosphat, BCIP), Best. Nr. B-6777
BSA (bovines Serum-Albumin), Best. Nr. A-2153
3,3’-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid Dihydrat purum (DAB) p.a., Best. Nr.
32750
118
Anhang
Diethylpyrokarbonat (DEPC-Reinsubstanz), Best. Nr. 32490
Dextransulfat, Best. Nr. 31403
Ficoll, Best. Nr. F-2637
Levamisol, Best. Nr. L-9756
Na2HPO4, Best. Nr. 71642
Neutrales Schafserum (NSS), Sheep Serum steril filtered, Best. Nr. S-2263
Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (NBT), Best. Nr. N-6639
Paraformaldehyd, Best. Nr. 76240
PIPES (Piperazin-N,N´bis[2-ethansulfat]-Säure), Best. Nr. P-3768
Polyvinylpyrolidone, Best. Nr. P-5288
RNA, „ribonucleic acid type IV from calf liver“, Best. Nr. R-7250
ssDNA (Deoxyribonucleic acid Sodium Salt Type XIV from Herring Testes),
Best. Nr. D-6898
TRIS HCl (Trishydroxymethylammoniumethan), Best. Nr. 93352Azokarmin G,
Best. Nr. S-581305
Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA, über Biologo, Kronshagen
Vectastain Elite ABC-Kit, Best. Nr. PK-6100
9.8 Bezugsquellen für Geräte und Einmalartikel
Gerhard Menzel Glasbearbeitungswerk GmbH & Co. KG, Braunschweig
SuperFrost®Plus Objektträger, Best. Nr. 041300
Carl Zeiss AG, Oberkochen
Standard-Binokular-Lichtmikroskops
Mikroskop Axiophot
DakoCytomation GmbH (ehemals Dako® Diagnostika GmbH), Hamburg
Glycergel, Eindeckmedium, Best. Nr. C 0563 DAKOPATTS
DakoCytomation Pen, Best. Nr. S2002
FMC® bioproducts, Göttingen
Gel-Bond®-Film, Best. Nr. 53748
Hecht, Kiel-Hassee
Corbit-Balsam, Eukitt®
Anhang
Heraeus Sepatech GmbH, Osterode
Zentrifuge Labofuge®A, 2500
Wärmeschrank ST 6200
Kodak GmbH, Stuttgart
Elite Chrome 160 T Diafilmen
Leica Microsystems Nussloch GmbH, Nussloch
Färbegerät Leica ST 4040
Marabuwerke GmbH & Co KG, Tamm
Fix-O-Gum®, Best. Nr. 290117000
Medite Medizintechnik, Burgdorf
Objektträger-Eindeckautomat Promounter RCM 2000
Memmert GmbH & Co. KG, Braunschweig
Wasserbad WB 22
Wasserbad WB 45
Microm International GmbH, Walldorf
Schlittenmikrotom HM 400
Olympus Deutschland GmbH, Hamburg
Mikroskop IX 70
Polaroid, Massachusetts, USA
Kamera MP 4
Sartorius AG, Göttingen
Elektronische Präzisionswaage L310, WL-6006-m88091
Papierfaltenfilter 270 mm Durchmesser, FT-4-303-270
Systec GmbH, Wettenberg
Autoklav 3850 ELC
Thermo Electron GmbH, Dreieich
Shandon CoverplatesTM, 72110013
Shandon Sequenza® Slide Racks (Einsätze für Coverplates), 7331017
Pathcentre (Gewebeeinbettungsapparat)
Vogel GmbH & Co. Kg, Gießen
Tissue-Tec® TECTM 5, Einbettsystem
119
120
Anhang
W. Knittel Glasbearbeitungs GmbH, Braunschweig
Deckgläser (24 x 50 mm)
Ziegra-Eismaschinen GmbH, Isernhagen
Eismaschine ZBE 70-35
Zu guter letzt bedanke ich mich bei
…Frau Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein für die Überlassung des Themas und die
jederzeit gewährte Hilfe und Unterstützung bei der Durchführung und Ausarbeitung
dieser Arbeit, sowie die zügige und kooperative Durchsicht des Manuskriptes.
…der Arbeitsgruppe von Frau Prof. Dr. Renate Rosengarten aus dem Institut für
Bakteriologie, Mykologie und Hygiene der Veterinärmedizinischen Universität in
Wien, namentlich Dr. Wolfgang Jechlinger, Dr. Joachim Spergser und Martina
Zimmermann, für die Zusammenarbeit bei der Synthese und Spezifizierung der
Sonden.
…Frau Danuta Waschke für die Einweisung in die Geheimnisse der in situHybridisierung.
…Herrn Klaus-Peter Kuhlmann für die Unterstützung bei der Beschaffung aller
Materialien sowie die Einarbeitung in die Immunhistochemie.
…meinen alten und neuen Mitbewohnern und Nachbarn im „Großraumbüro“ Dirk,
Doris, Evi, Frauke, Katharina und Verena für den notwendigen Spaß bei der Arbeit.
…Frauke für die kritische Durchsicht des Manuskripts.
…der Arbeitsgruppe Immunpathologie für das unkomplizierte Miteinander.
…allen weiteren Mitarbeitern des Instituts für Pathologie für das angenehme
Zusammenarbeiten.
…der Friedrich-Ebert-Stiftung für die finanzielle Unterstützung im Rahmen eines
Promotionsstipendiums und die interessanten Seminare auf dem Venusberg.
…meinen Eltern und Frank, die mich doch immer wieder alles tun lassen, was ich mir
so überlege, und ich trotzdem mit ihrer Unterstützung rechnen darf.
M. bovis ISH
Aus dem Institut für Pathologie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
ISBN 3-939902-10-1
Verlag: DVG-Service GmbH
Frankfurter Straße 89 · 35392 Gießen
Telefon (06 41) 2 44 66 · Telefax (06 41) 2 53 75 · E-mail: [email protected] · http://www.dvg.net
Björn Jacobsen 2006
Nachweis von
Mycoplasma bovis
in der Lunge von
experimentell infizierten Kälbern
mittels in situ-Hybridisierung
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Veterinärmedizin
Björn Jacobsen
Hannover 2006