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Aus dem Institut für Klinische und Molekulare Virologie der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. B. Fleckenstein Mutagenese von Herpesvirus Saimiri Bacmiden und nähere Charakterisierung einer orf51 Insertionsmutante Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg vorgelegt von Christian Grillhösl aus Passau Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Dekan: Prof. Dr. J. Schüttler Referent: Prof. Dr. A. Ensser Korreferent: Prof. Dr. B. Fleckenstein Tag der mündlichen Prüfung: 13. Oktober 2010 Für meine Eltern Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung 1.1 Zusammenfassung deutsch …………………………………… 7 1.2 Zusammenfassung englisch (Abstract) ……………………… 8 …………………………………………………………… 9 2 Einleitung 2.1 Herpesviridae ………………………………………………… 9 2.2 Herpesvirus saimiri …………………………………………… 9 2.3 HVS in Forschung und Medizin ……………………………… 11 2.4 Virusgenom als BAC ………………………………………… 13 2.5 Glykoprotein ORF51 ………………………………………… 14 …………………………………………………… 15 …………………………………………………………… 16 ………………………………………………………… 16 3 Aufgabenstellung 4 Material 4.1 Zellen 4.2 Bakterien und Viren 4.3 Enzyme ………………………………………… 16 ……………………………………………………… 16 4.4 Oligonukleotide ……………………………………………… 17 4.5 Größenmarker ……………………………………………… 17 ………………………………………………… 18 4.6 Nährmedien 4.7 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien 5 Methoden …………………… 18 …………………………………………………………… 20 5.1 Rekombinante Viren ………………………………………… 20 5.2 Transposon-Mutagenese ……………………………………… 20 5.3 Erstellung einer BAC-Bibliothek …………………………… 21 ……………………………………………… 22 5.5 Präparation von BAC-DNA aus Bakterien …………………… 22 5.6 Restriktionsverdau 22 5.4 PCR-Screening …………………………………………… 5.7 Pulsfeld-Gelelektrophorese ………………………………… 23 5.8 DNA-Sequenzanalyse ………………………………………… 23 Inhaltsverzeichnis 5.9 Proteinisolierung und -quantifizierung …………………… 23 5.10 SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese und Westernblot …… 24 5.11 Virustitration ……………………………………………… 25 5.12 Aufreinigung viraler DNA aus Zellkulturüberständen ……… 26 5.13 Quantitative PCR 26 …………………………………………… 5.14 Charakterisierung der Infektionsausbreitung in Zellkultur 6 Ergebnisse … 27 ………………………………………………………… 28 6.1 Insertionsmutanten und BAC-Bibliothek …………………… 28 6.2 Identifizierung spezifischer Insertionsmutanten durch PCR ..… 30 6.3 Exemplarische Identifizierung einer orf51 Insertionsmutante … 32 6.4 Herstellung rekombinanter Viren und Nachweis der Proteinexpression …………………………………………… 33 6.5 Verändertes Wachstumsverhalten der orf51 Insertionsmutante .. 35 7 Diskussion ………………………………………………………… 8 Literaturverzeichnis 38 ……………………………………………… 45 9 Abkürzungsverzeichnis …………………………………………… 50 10 Vorveröffentlichungen …………………………………………… 53 ……………………………………………………… 55 11 Danksagung Zusammenfassung 1 Zusammenfassung 1.1 Zusammenfassung deutsch Herpesvirus saimiri (HVS) ist ein lymphotropes Virus aus der Familie der GammaHerpesviren und gehört zur Untergruppe der Rhadinoviren. In seinem natürlichen Wirt, dem Totenkopfäffchen (Saimiri sciureus), ist es apathogen, verursacht aber in anderen Neuwelt-Primaten rasch wachsende, polyklonale T-Zell-Lymphome. Im Gegensatz zu den Subtypen A und B ist HVS der Subgruppe C – wie auch das hier verwendete Isolat C488 – in der Lage, primäre humane T-Zellen zu einem stabilen, antigen-unabhängigen Wachstum in Zellkultur zu transformieren. In der vorliegenden Arbeit berichte ich über die Transposon-Mutagenese einer transformations-kompetenten Variante des Virusgenoms von HVS C488, vorliegend als Bacterial Artificial Chromosome in E. coli. Dazu wurde mit einem auf einem Tn5Transposon basierenden System eine Zufalls-Mutagenese durchgeführt. Die hiermit generierte große Anzahl an Mutanten mit jeweils einer Insertion an einer zufälligen Position im Genom wurden geordnet asserviert und mittels eines PCR-ScreeningVerfahrens die gewünschte Mutante identifiziert. Exemplarisch soll hier die Inaktivierung des Gens von orf51 (Open Reading Frame 51) durch Insertion beschrieben werden. Es kodiert für ein virales Glykoprotein, das sich zwischen den einzelnen Virus-Untergruppen deutlich unterscheidet und dadurch als möglicher Grund für die phänotypischen Unterschiede in Frage kommt. Beim Humanen Herpesvirus Typ 8 (HHV-8 oder Kaposi’s Sarcoma associated Herpesvirus, KSHV) steht an homologer Stelle das Gen K8.1, welches für ein immunologisch entscheidendes Glykoprotein in der Virushülle kodiert. Auch andere GammaHerpesviren besitzen dort entsprechende Gene, wie gp350/220 beim Epstein-BarrVirus (EBV) oder gp150 beim Murinen Herpesvirus 68 (MHV-68). Wir können zeigen, dass orf51 für ein Glykoprotein mit etwa 55 kDa Größe kodiert, die Expression durch eine Unterbrechung dieses Gens durch Insertion eines Transposon-Elements inaktiviert, nach Rekonstitution mittels homologer Rekombination jedoch wieder aktiviert werden kann. Die Inaktivierung von orf51 bewirkt einen Rückgang der Effizienz der Zell-zu-Zell Ausbreitung der Infektion in Zellkultur um 1 bis 2 Log-Stufen. Deshalb halten wir orf51 für einen entscheidenden aber nicht essentiellen Faktor für die Ausbreitung des Virus von Zelle zu Zelle. – 7 – Zusammenfassung (englisch) 1.2 Abstract Herpesvirus saimiri (HVS), the rhadinovirus prototype, is apathogenic in the persistently infected natural host, the squirrel monkey, but causes acute T-cell lymphoma in other new world primate species. In contrast to subgroups A and B, only strains of HVS subgroup C such as C488 are capable of transforming primary human T cells to stable antigen-independent growth in culture. Here, we report the manipulation of the genome of HVS, available as a bacterial artificial chromosome (BAC) by transposon mutagenesis, demonstrated by the insertional inactivation of the orf51 gene that encodes a virus glycoprotein. The ORF51 glycoprotein is one of only a few genes that are highly divergent and may account for phenotypic differences between viruses of different subgroups. At the homologous genomic location, an immunodominant envelope glycoprotein is encoded by the k8.1 gene of the Kaposi’s sarcoma associated human herpesvirus (KSHV, HHV-8). Other related gamma-herpesviruses also have glycoproteins at the homologous position of their genomes, like gp350/220 in EBV or the gp150 in MHV-68. We show that orf51 encodes a glycoprotein of approximately 55 kDa molecular weight, that interruption of the orf51 by insertion of a Tn5 transposable element is associated with loss of ORF51 glycoprotein expression, and that ORF51 protein expression is reinstituted after repair by homologous recombination. Inactivation of orf51 was associated with decrease of virus titer by 1-2 logs, with decreased cell-to-cell spread and plaque size. Thus, orf51 is important for cell-to-cell spread and efficient production of infectious particles but not essential. – 8 – Einleitung 2 Einleitung 2.1 Herpesviridae Die Familie der Herpesviridae umfasst eine Gruppe behüllter Viren mit linearer, als Doppelstrang vorliegender DNA. Der Name leitet sich vom griechischen Wort herpein mit der Bedeutung kriechen oder schleichen ab und beschreibt die Fähigkeit dieser Viren, eine dauerhafte Infektion des Wirtes mit schleichendem Krankheitsverlauf zu verursachen. Sie bestehen aus einem Kapsid von etwa 100 nm Durchmesser, welches von einer Lipid-Hülle umgeben ist. Herpesviren haben die Eigenschaft, nach einer Infektion ihres Wirtes stumm in der Wirtszelle vorhanden zu bleiben, was man als Latenz bezeichnet. In Phasen einer geschwächten Immunabwehr des Wirtes ist eine Reaktivierung mit VirusReplikation und -Freisetzung jederzeit möglich. Die Einteilung der Herpesviren in Alpha-, Beta- und Gamma-Herpesviren erfolgte ursprünglich nach dem spezifischen Wirtsspektrum und der Replikationsgeschwindigkeit (Roizman et al, 1981), später jedoch nach Sequenzhomologien, wobei speziell die Struktur der viralen DNA-Polymerase eine Rolle spielte (Roizman et al, 1991). Vertreter der Alpha-Herpesviren sind die Herpes simplex Viren Typ 1 und 2 (HSV1 und HSV2), sowie das Varizella-Zoster-Virus (VZV). Das Cytomegalie-Virus (CMV) stellt den bekanntesten Vertreter der Beta-Herpesviren dar. Die dritte Gruppe, die der Gamma-Herpesviren, wird wiederum in zwei Untergruppen eingeteilt, die der Lymphocryptoviren (oder auch Gamma-1-Herpesviren) mit dem Epstein-BarrVirus (EBV) als Vertreter und die der Rhadinoviren (Gamma-2-Herpesviren) mit dem Humanen Herpesvirus Typ 8 (HHV-8, auch Kaposi’s Sarcoma associated Herpesvirus, KSHV) als humanpathogenen Vetreter. Das Murine Herpesvirus 4/Stamm 68 (MHV-68) sowie das in der folgenden Arbeit genauer besprochene Herpesvirus saimiri (HVS) gehören als tierpathogene Vertreter ebenfalls in diese Gruppe. 2.2 Herpesvirus saimiri Bei Herpesvirus saimiri (HVS) handelt es sich, wie bereits erwähnt, um ein lymphotropes Virus aus der Familie der Gamma-Herpesviren. Es gilt als Prototyp eines Rhadinovirus (Gamma-2 Herpesvirus). In seinem natürlichen Wirt, dem Toten- – 9 – Einleitung kopfäffchen (Saimiri sciureus, Abbildung 1), ist es apathogen, weit verbreitet und kann aus peripheren Blutlymphozyten isoliert werden (Falk et al, 1972). In anderen Neuwelt-Primaten wie Weißbüschel-Äffchen (Callithrix jacchus) oder Liszt-Äffchen (Sanguinus oedipus) verursacht HVS jedoch rasch wachsende, polyklonale T-ZellLymphome (Fickenscher et al, 2001). Abbildung 1: Totenkopfäffchen (Saimiri sciureus) als natürlicher Wirt von Herpesvirus saimiri (Wikimedia commons, Luc Viatour) Das Virusgenom von HVS ist doppelsträngig und linear aufgebaut und umfasst etwa 155 Kilobasen (Ensser et al, 2003). Es enthält einen kodierenden, zentralen Bereich und flankierende, nicht kodierende Regionen an den Rändern (Abbildung 2). Da der nicht kodierende Bereich an den Rändern des Genoms einen sehr hohen Gehalt an Cytosin (C) und Guanin (G) besitzt und in der isopyknischen CaesiumchloridGradientenzentrifugation eine höhere Dichte als der kodierende Teil aufweist, werden diese Ränder auch als H-DNA bezeichnet (für high density). Den kodierenden, C und G armen Teil der DNA nennt man entsprechend L-DNA (für low density), (Bornkamm et al, 1976; Bankier et al, 1985). Abbildung 2: Lineares Genom von HVS-C488 (155kb) HVS-Isolate werden in die drei Untergruppen A, B und C eingeteilt (Medveczky et al, 1984), wobei sich die Gruppen vor allem in den transformierenden Genen am linken Ende des Genoms im Bereich der L-DNA unterscheiden. Diese Region ist – 10 – Einleitung entscheidend für das onkogene Potential der verschiedenen Viren. Je nach Gruppe finden sich dort die Gene stpA, stpB oder – bei Gruppe C – stpC und tip (Saimiri transforming protein of subgroup A, B, C; Tyrosin kinase interacting protein). Im Gegensatz zu den Subtypen A und B ist HVS der Subgruppe C – wie das hier verwendete Isolat C488 – in der Lage, primäre humane T-Zellen zu einem stabilen, antigen-unabhängigen Wachstum in Zellkultur zu transformieren (Biesinger et al, 1992), wobei hierzu die Onkogene stpC und tip essentiell sind (Duboise et al, 1998). Für HVS existiert außerdem ein gut charakterisiertes permissives Zellkultursystem, welches die Herstellung und Untersuchung von Virusmutanten deutlich vereinfacht. Die genauere Charakterisierung von HVS erscheint neben dem primären wissenschaftlichen Interesse an diesem Virus aus weiteren Gründen interessant. So besitzt HVS große Homologien zum humanpathogenen Herpesvirus Typ 8 (HHV-8, Kaposi’s Sarcoma associated Herpesvirus, KSHV), welches im Menschen onkogenes Potential entfalten kann. Eine Infektion mit HHV-8 ist assoziiert mit der Entstehung des Kaposi Sarkoms, einer Erkrankung mit angio-proliferativen Tumoren, die vom Gefäßendothel ausgehen. Weitere mit HHV-8 Infektion assoziierte Erkrankungen sind die multizentrische Form des Morbus Castleman (Multicentric Castleman’s Disease) und das primäre B-Zell Effusionslymphom. Diese Erkrankungen treten vor allem bei immunsupprimierten Patienten auf, wobei die Immunsuppression sowohl iatrogen (z.B. nach Organtransplantation) als auch durch eine Erkrankung verursacht sein kann (allen voran HIV/Aids) (Sunil et al, 2010). Bisher gibt es zur Untersuchung von HHV-8 kein gutes permissives Zellkultursystem. Aufgrund der großen Analogien zwischen HVS und HHV-8 wird deshalb versucht, die bei HVS gewonnenen Erkenntnisse auf den humanpathogenen Vertreter zu übertragen und dadurch eventuell Rückschlüsse auf die Funktionsweise von HHV-8 ziehen zu können. 2.3 HVS in Forschung und Medizin In den vergangenen Jahren haben sich mehrere interessante Anwendungsbereiche entwickelt, die HVS für Forschungsvorhaben interessant machen. Zum einen ist dies die bereits angesprochene Fähigkeit von HVS (C488), humane T-Lymphozyten in Zellkultur zu einem stabilen, antigen-unabhängigen Wachstum zu transformieren (Biesinger et al, 1992; Fleckenstein et al, 2004). Da sich diese primären Zellen normalerweise nur sehr schwer kultivieren lassen und bei der Transformation viele der – 11 – Einleitung normalen T-Zell Charakteristika und Funktionen erhalten bleiben, ist dies ein mächtiges Werkzeug zur Untersuchung humaner T-Zellen und ihrer Funktionen. Aus neueren Untersuchungen zur Transformation EBV-spezifischer cytotoxischer TZellen ergeben sich Hinweise, dass es sich bei diesem Transformationsvorgang um eine überschaubare Anzahl einzelner Ereignisse mit anschließender klonaler Expansionen handelt (Lehner et al, 2009). Die Erforschung dieser Transformationsvorgänge in Zellkultur kann zum weiteren Verständnis der durch Onkoviren vermittelten Tumorgenese beitragen. Herpesviren sind mit ihrer Eigenschaft der lebenslangen Persistenz in Zellen seit längerer Zeit als mögliche Kandidaten für virale Vektoren für gentherapeutische Anwendungen im Gespräch. Unter Gentherapie verstand man ursprünglich den Ersatz eines defekt vererbten Gens bei monogenetischen Erbkrankheiten (Friedmann et al, 1972). Heute wird der Begriff der Gentherapie deutlich weiter gefasst und beschreibt alle Therapien, die das Einbringen fremder DNA in den Zellkern einer Zelle beinhalten. Dies kann nach klassischem Ansatz der Ersatz eines defekten Gens sein, oder aber auch das Einbringen eines fremdes Gens, dessen Expression in der Zielzelle therapeutisch gewünscht wird. Darüber hinaus unterscheiden sich die unterschiedlichen Wege und Möglichkeiten, eine genetische Information in die Zielzelle zu bringen, sowohl in ihrer Effizienz als auch in der Dauer der zu erwartenden Wirkung. Abhängig vom therapeutischen Ziel werden unterschiedliche Wege gewählt. Da Viren von Natur aus die Fähigkeit besitzen, ihr Genom in eine Wirtszelle einzuschleusen und dort exprimieren zu lassen, sind sie – zumindest theoretisch – ideal als Vehikel für die Gen-Einschleusung in eine Zielzelle geeignet. Erste Ansätze einer Anwendung von HVS als viralen Vektor wurden bereits 1985 von Desrosiers et al. gemacht. Es wurden hier T-Zellen von Neuwelt-Primaten mit Virusmutanten von HVS infiziert, welche das Gen für bovines Wachstumshormon (bGH) enthielten (Desrosiers et al, 1985). Die Expression des Hormons konnte daraufhin in den infizierten Zellen nachgewiesen werden. Weitere Studien bestätigten die grundsätzliche Eignung von HVS als viralen Vektor (Desrosiers et al, 1984; Grassmann et al, 1989). Die genauere Untersuchung möglicher anderer Zielzellen zeigte neben dem Tropismus für hämatopoetische Zellen eine breite Palette weiterer Zellen, die HVS infizieren und in ihnen episomal persistieren kann (Simmer et al, 1991). Im Vergleich zu – 12 – Einleitung weiter verbreiteten retroviralen Vektoren bietet HVS den Vorteil einer deutlich höheren Klonierungskapazität. Ein auf HVS basierender Vektor bietet damit die Möglichkeit, mehrere oder deutlich größere DNA-Fragmente integrieren zu können. Außerdem ist die Fähigkeit von Herpesviren zu lebenslanger episomaler Persistenz in unterschiedlichen Zielzellen bei vielen gentherapeutischen Anwendungen explizit erwünscht (z.B. Genersatz bei monogenen Erbkrankheiten). Für HVS konnte gezeigt werden, dass z.B. in transformierten humanen T-Zellen jeweils mehrere Kopien des HVS-Genoms in episomaler Form ohne Integration ins Wirtsgenom vorliegen (Fickenscher et al, 2001). Das im Vergleich zu anderen Viren recht große Genom von Herpesviren mit seiner Vielzahl an Genen mit bisher nicht oder nur teilweise geklärter Funktion hat dazu geführt, dass es aktuell noch keine konkreten Versuche mit herpesviralen Vektoren am Menschen gibt. Die weitere Charakterisierung einzelner Gene von HVS könnte mit dazu beitragen, dass sich dies in Zukunft vielleicht ändert. 2.4 Virusgenom als BAC Bakterielle artifizielle Chromosomen (BAC, Bacmid) sind große, ringförmige Moleküle aus doppelsträngiger DNA. Sie leiten sich aus dem F-Plasmid des Bakteriums Escherichia coli ab und werden auch als künstliches Chromosom bezeichnet. Sie liegen in nur wenigen Kopien in E. coli vor (low copy Plasmid). BACs haben im Vergleich zu Plasmiden und Cosmiden den Vorteil, dass sie sich für die Klonierung auch größerer Genomabschnitte von 100 bis 300 kb wie auch kompletten Herepsvirusgenomen (Messerle et al, 1997) eignen. In unserem Fall wurde das komplette Genom von HVS als BAC kloniert und für die weitere Manipulation verwendet (Abbildung 3). – 13 – Einleitung Abbildung 3: HVS-C488 Genom als Bacterial artificial Chromosome (BAC) 2.5 Glykoprotein ORF51 Bei ORF51 handelt es sich um ein Glykoprotein, das analog bei allen GammaHerpesviren vorhanden ist, welches sich im Detail zwischen den einzelnen Gruppen jedoch deutlich unterscheidet. Es wird deshalb für die Unterschiede im Phänotyp der Viren mitverantwortlich gemacht. Glykoproteine in der Virushülle spielen eine entscheidende Rolle bei der Anheftung der Viren an ihre Zielzelle (Means, 2004). Die genaue physiologische Funktion des Glykoproteins ORF51 bei HVS ist bisher jedoch unklar. Das entsprechende Gen beim eng verwandten HHV-8 ist k8.1. Das davon kodierte Glykoprotein bindet an Heparansulfat an Zelloberflächen und spielt damit vermutlich eine Rolle bei der Anheftung der Viren an die Wirtszelle (Birkmann et al, 2001). Auch die anderen Vertreter der Gamma-Herpesviren haben mit gp350/220 beim Epstein-Barr-Virus (EBV) und gp150 beim Murinen Herpesvirus 68 (MHV-68) ein entsprechendes positions-homologes Gen (Stewart et al, 1996). Das ORF51-Glykoprotein von HVS ist in vivo als Antigen wirksam, es lassen sich sowohl beim natürlichen Wirt (Totenkopfäffchen), als auch bei artifiziell infizierten Neuwelt-Pprimaten hohe Spiegel an neutralisierenden Antikörpern im Serum nachweisen (Means, 2004). – 14 – Aufgabenstellung 3 Aufgabenstellung Das Genom von HVS besitzt mindestens 77 offene Leserahmen (Ensser et al, 2003), von denen zahlreiche in ihrer Funktion und biologischen Bedeutung nicht oder nur teilweise bekannt sind. Zur Untersuchung der Funktion einzelner Gene sollen hier HVS-Mutanten dienen, bei denen jeweils ein bestimmtes Gen durch Insertion einer Transposon-Sequenz unterbrochen wurde, wodurch die Expression des entsprechenden Proteins ausfällt. Die Aufgabe der Glykoproteine von Rhadinoviren ist nicht vollständig geklärt. In der vorliegenden Arbeit werden mit Hilfe eines Transposon-Mutagenese Verfahrens Insertions-Mutanten von HVS hergestellt, die jeweils an zufälliger Stelle im Genom eine einzelne Insertion tragen. Liegt eine solche Insertion in einem codierenden Bereich, so sollte die Expression des betreffenden Gens gestört sein bzw. ganz fehlen. Aus dem so erzeugten Pool von Mutanten wird dann mittels eines PCRScreening-Verfahrens der gewünschte Klon identifiziert und die daraus generierten Viren charakterisiert. Exemplarisch soll in dieser Arbeit eine Virusmutante identifiziert und isoliert werden, dessen Genom einen durch Insertion inaktivierten offenen Leserahmen 51 trägt. Die daraus erzeugten Viren sollen anschließend hinsichtlich ihres Wachstums- und Infektionsverhaltens in Zellkultur charakterisiert werden. – 15 – Material 4 Material 4.1 Zellen Als permissives Zellkultursystem für HVS wurde die Nierenepithelzellline OMK (owl monkey kidney cells) verwendet, welche aus Nachtaffen (Aotus trivirgatus) stammt (Daniel, 1976). Es handelt sich dabei um adhäsiv wachsende Zellen, die unter Zusatz von Glutamin (350 µg/ml), Gentamycin (100 µg/ml) und 10% (v/v) hitzeinaktiviertem (56 °C, 30 min) fötalem Kälberserum in DMEM-Medium (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) gehalten wurden. Einmal pro Woche erfolgte die Behandlung der Zellen mit Trypsin mit anschließender Verdünnung im Verhältnis 1:3. Die Lagerung der Zellen erfolgte im Brutschrank (Steri-Cult 200, Labotect, Göttingen) bei 37°C und 5% CO2-Gehalt sowie einer relativen Luftfeuchtigkeit von 80%. 4.2 Bakterien und Viren E. coli DH10B: Für die Transformation des Transposon-Mutagenese-Ansatzes in Bakterien wurden elektrokompetente E. coli verwendet. (Invitrogen, Karlsruhe) Genotyp: F¯ mcrA D(mrr-hsdRMS-mcrBC) f80lacZDM15 DlacX74 recA1 endA1 araD139 D(ara, leu)7697 galU galK lλ¯ rpsL nupG BAC 44 Herpesvirus saimiri bacterial artificial chromosome 44 C488-EGFP; F-Plasmid mit Chloramphenicol-Resistenz-Gen sowie EGFP-Expressions-Kassette (Institut für Virologie, Erlangen) 4.3 Enzyme − Restriktionsenzym für die Testung der BAC-DNA: Sal-I (New England Biolabs, Schwalbach) − Linearisierung der Cosmide vor Transfektion zur Virusgenerierung: Not-I (New England Biolabs, Schwalbach) − Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm (MBI Fermentas, St. Leon-Rot) − Taq-Polymerase (Institut für Virologie, Erlangen) – 16 – Material 4.4 Oligonukleotide Screening nach orf51-Insertionsmutante: Primer Nr. 207610 5'- GTTTCTTCTGTTGTCTGCC -3' KAN2-FP1 5'- ACCTACAACAAAGCTCTCATCAACC -3' KAN2-RP1 5'- GCAATGTAACATCAGAGATTTTGAG -3' orf51-PCR-Fragment: AR49R 5'- TTCAAATCTACGATTAATTAAG -3' AR52F 5'- ATGGCTTCTAAAAAACCTAG -3' Test der rekombinanten Viren: 51-FP 5'- CAAGCACATAGCATTGACTTTGACG -3' 51-RP 5'- TTATGGGGGCTTTAAGTGTTTGG -3' Quantitative PCR (Taqman) zur Bestimmung der Kopienzahl im Überstand MCP-FP: 5'- CCATTTGCCTGTGTTGAGAGTTAA -3' MCP-RP: 5'- CTCATTACCAGACCCATGTTATGAA -3' MCP-Sonde: 5'-6-Fam-CTCCGAGAGAGCCTATCTGAGATGCCC-Tamra-3' 4.5 Größenmarker DNA Größenmarker: GeneRuler 1kb DNA Ladder (MBI-Fermentas, St. Leon-Rot) MidRange I PFG Marker (NEB, Frankfurt/Main) Protein-Größenmarker: Benchmark Prestained Protein Ladder (Invitrogen) Proteinmarker biotinyliert (Cell-Signaling, Beverly, USA) – 17 – Material 4.6 Nährmedien Medium für die Zellkultur: DMEM-Medium (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) mit Zusatz von FKS (10%) Glutamin (350 µg/ml) und Gentamycin (100 µg/ml); Bezug über Invitrogen/GIBCO, Karlsruhe Medien für die Bakterienkultur: LB-Medium: 10g Casein, 5g Bacto-Hefe-Extrakt, 2,5mM NaCl, 2,5mM KCl, 10mM MgCl2, 20mM Glucose auf 1 Liter H2O; pH 7,0 (Luris-Bertani-Medium) LB-Agar: 15g Bacto-Agar in 1 Liter LB-Medium SOC Medium: 20g/l Bacto-Trypton, 5g/l Hefe-Extrakt , 10mM NaCl, 2.5mM KCl; 10mM MgCl2, 10mM MgSO4; 20mM Glucose 4.7 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien Bezugsquellen verwendeter Chemikalien und Verbrauchsmaterialien: Acrylamid/Bisacrylamid (29:1) BioRad, München Adenosintriphosphat (ATP) Roche Diagnostik, Mannheim Agarose Life Technologies, München Alkalische Phosphatase (CIP) Roche Diagnostik, Mannheim Ammoniumpersulfat (APS) Life Technologies, München Bromphenolblau (BPB) Serva, Heidelberg Coomassie-Blau (Serva-Blau R) Serva, Heidelberg Desoxyribonucleosidtriphosphate (dNTPs) Pharmacia, Freiburg Dimethylsulfoxid (DMSO) Life Technologies, München Dithiothreitol (DTT) Roche Diagnostik, Mannheim Elektroporationsküvetten (2mm) GeneZapper, IBI Eppendorf-Reaktionsgefäße 0,2 ml, dünnwandig Biozym, Oldendorf Eppendorf-Reaktionsgefäße 1,5 und 0,5 ml Sarstedt, Nümbrecht Ethidiumbromid (EtBr) Life Technologies, München Ethylendiamin-Tetraacetat (EDTA) Merck, Darmstadt – 18 – Material Fötales Kälberserum (FKS) Pansystems, Aidenbuch Isopropylthiogalactosid (IPTG) Biomol, Hamburg Lipofectamine ® Gibco/BRL ß-Mercaptoethanol Fluka, Ulm Nylonmembran Schleicher und Schuell, Dassel Protran® Nitrozellulose 0,2µm Schleicher und Schuell, Dassel Panserin 401 Pansystems, Aidenbuch Phenolröhrchen Greiner, Nürtingen Phytohämagglutinin (PHA) Murex Diagnostica, Burgwedel Schraubdeckelröhrchen 15 ml Sarstedt, Nümbrecht Schraubdeckelröhrchen 50 ml Becton-Dickinson, Heidelberg N,N,N’,N’ Tetramethylendiamin (TEMED) Life Technologies, München Triton X-100 Life Technologies, München Tween 20 Life Technologies, München 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-D-Galactosid (X-Gal) Biomol, Hamburg Zellkulturflaschen Nunc Int., Denmark Alle weiteren Chemikalien wurden von den Firmen Biomol, Fluka, Merck, Serva und Pharmacia bezogen. Zusätze für Bakterienkulturmedien wurden von der Firma Difco Laboratories, Detroit, bezogen. – 19 – Methoden 5 Methoden 5.1 Rekombinante Viren Die Herstellung rekombinanter Viren erfolgte über das Einbringen der Virus-DNA in OMK-Zellen, welche ein permissives Zellkultursystem für HVS darstellen. Das HVS-Genom lag in Form von fünf sich überlappenden Cosmiden bereits vor (Ensser et al, 1999). Vor der Transfektion wurde jeweils 0,6 µg der Cosmid-DNA durch einen Not-I Verdau linearisiert und vom Cosmid-Vektor getrennt. Es erfolgte die Zugabe von 15 µl Lipofectamine® und die Inkubation in serumfreiem Medium (OPTI MEM®) für 30 bis 45 Minuten bei Raumtemperatur. Danach wurden OMKZellen, welche am Vortag in kleine Zellkulturflaschen (25cm2) passagiert wurden und zum Transfektionszeitpunkt eine Konfluenz von etwa 80% hatten, mit dieser Mischung überschichtet. Nach vier Stunden Einwirkzeit wurde der Überstand durch normales Medium ersetzt. Durch homologe Rekombination in den OMK-Zellen entstanden auf diesem Weg replikations-kompetente rekombinante Viren. Diesen Vorgang konnte man nach etwa 5 bis 10 Tagen an kleinen Löchern im Zellrasen, sogenannten Cytopathogenen Effekten (CPEs) erkennen. Nach vollständiger Ablösung der Zellen vom Flaschenboden wurde der Überstand entnommen und durch Zentrifugation (1500rpm, 10min) von Zellresten befreit. Die längerfristige Lagerung des Überstandes erfolgte in kleinen Aliquots bei -80°C. Die Virusherstellung aus BAC-DNA erfolgte analog zur oben beschriebenen Cosmid-Methode, wobei der Linearisierungsschritt per Restriktionsverdau hier entfallen konnte. Es wurden dazu 2 µg der BAC-DNA und 10 µl Lipofectamine® in serumfreiem Medium gemischt und der Ansatz für 30 bis 45 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Überschichten von OMK-Zellen mit dieser Mischung für vier Stunden konnte man hier ebenfalls nach 5 bis 10 Tagen mit dem Auftreten eines CPEs rechnen. 5.2 Transposon-Mutagenese Die HVS-Bacmid-DNA wurde per Qiagen-Maxi-Kit nach dem Protokoll für Low Copy-Plasmide aus E. coli Kulturen aufgereinigt. Für die Mutagenese-Reaktion wurden 0,6µg der DNA 4nmol des Tn5-Transposon-Konstruktes versetzt – 20 – Methoden (EZ::TNTM<KAN-2>Insertion Kit, Epicentre), welches ein Kanamycin-ResistenzGen enthält. Es erfolgte die Inkubation für 2h bei 37°C, dann die Zugabe der „StopLösung“ und wiederum eine Inkubation für 10 min bei 70°C. Per Tropfendialyse über eine Stunde wurde der Salzgehalt im Ansatz verringert. Danach erfolgte die Transformation des Ansatzes in kompetente E. coli DH10B per Elektroporation (2 kV, 379 Ω, 25 µF in 2mm Küvetten). Die Bakteriensuspension wurde 40 Minuten in SOC Medium inkubiert und dann auf LB-Agar-Platten ausgestrichen, welche Kanamycin (30µg/ml) und Chloramphenicol (15µg/ml) zur Selektion der gewünschten Klone enthielten. Etwa ein bis eineinhalb Tage später konnten von den Platten Klone entnommen und weiter untersucht werden. 5.3 Erstellung einer BAC-Bibliothek Die erhaltenen E. coli Klone wurden in 96-well-Platten mit Flachboden überführt, als Nährmedium dienten jeweils 100µl LB-Medium unter Zusatz von Chloramphenicol (15µg/ml) und Kanamycin (30µg/ml). Es wurden dabei in 2 Ansätzen jeweils 8 Platten mit je 96 Klonen gefüllt. Nach 48 h Inkubation bei Raumtemperatur unter vorsichtiger Bewegung der Platten auf einem Schüttler erfolgte die Anlage von Replika-Platten: Mit Hilfe eines Stempels mit 96 Metallstiften im Muster einer 96well-Platte wurden von jeder Masterplatte jeweils 3 Replikaplatten angelegt und diese wiederum 48 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Originalplatten wurden nach Zugabe von jeweils 100µl LB-Medium/Glycerin-Mischung (50:50) pro well der Platte bei –80°C archiviert. Die Bakterienkulturen aus den Replikaplatten wurden wie folgt weiterverarbeitet: Es wurden 8 Plattenpools angefertigt, also der Inhalt aller Proben einer Platte fusioniert (Zahlenangaben bezogen auf einen der beiden Ansätze). Analog dazu wurden 12 Spaltenpools und 8 Reihenpools angelegt (also z.B. die Inhalte jeweils der Spalte 1 aller Platten zusammengeführt. usw.) Aus diesen Bakteriensuspensions-Mischungen wurde nun nach der Methode von Zagursky (Zagursky, 1985) DNA präpariert, in 50µl-Aliquots aufgeteilt und bei -20°C für ein späteres Screening nach gewünschten Klonen archiviert. – 21 – Methoden 5.4 PCR-Screening Um aus der Vielzahl von BAC-Klonen mit jeweils einer Insertion genau denjenigen auszuwählen, der die Insertion in einem bestimmten gewünschten Gen trägt, wurde ein PCR-Verfahren angewandt. Hierbei wurden die Primer so gewählt, dass eines der beiden Oligonukleotide am inserierten Transposon bindet, das andere im oder in der unmittelbaren Nähe des gewünschten Gens. Nur wenn diese beiden Bindungsstellen nahe genug beieinander liegen, erhält man in diesem Ansatz überhaupt ein PCRProdukt. Kann man hier nun ein PCR-Produkt definierter Länge in einem der Ansätze nachweisen, so erwartet man dieses Fragment gleichzeitig in je einem der Platten-, Reihen- und Spaltenpools. Aus der Lokalisation dieser Banden kann nun auf die Position des gesuchten Klons in der BAC-Bibliothek geschlossen werden. Für den PCR-Ansatz wurden jeweils 3µl der Pool-DNAs verwendet (Konzentration nicht bestimmt), dazu 5µl 10-fach-PCR-Puffer, 0,5µl Taq-Polymerase und jeweils 1µl der Primer KAN2-FP1 bzw. KAN2-RP1 (Insertion des Transposon-Elements in beiden Orientierungen möglich), sowie Primer Nr. 207610 (Bindung im Bereich von orf51 des Virusgenoms. PCR-Programm: 1 min 94°C, dann 35 bis 40 Zyklen jeweils 1min 50°C, 15s 94°C Anschließend wurden die PCR-Produkte im Agarosel (1%) elektrophoretisch aufgetrennt und analysiert. 5.5 Präparation von BAC-DNA aus Bakterien Die Präparation von Bacmid-DNA im analytischen Maßstab erfolgte nach Zagursky (Zagursky, 1985). Größere DNA-Mengen wurden nach dem Protokoll des MachereyNagel Nucleobond AX Plasmid Mini/Maxi Kits isoliert. Basierend auf der alkalischen Lyse der Bakterien wurde die Plasmid-DNA an einer siliciumdioxidhaltigen Matrix unter Hochsalz-Bedingungen gebunden, gewaschen und unter NiedrigsalzBedingungen eluiert. 5.6 Restriktionsverdau Zum Testen der erhaltenen Insertionsmutanten auf Plausibilität und zum Ausschluss von Mehrfachinsertionen wurde die isolierte BAC-DNA einem Restriktionsverdau unterzogen und die erhaltenen Produkte elektrophoretisch aufgetrennt. Hierzu wurden 300 – 500 ng DNA in einem Gesamtvolumen von 20 µl mit der Restriktionsen- – 22 – Methoden donuklease Sal-I gespalten. Der Ansatz enthielt dabei außerdem 10 % (v/v) des empfohlenen 10-fach Puffers und 5-10 U des Enzyms. Die Ansätze wurden für 90 min bei 37°C inkubiert, die danach erhaltenen Fragmente in der PulsfeldGelelektrophorese analysiert. 5.7 Pulsfeld-Gelelektrophorese Um die ungefähre Lage der inserierten Transposon-DNA abzuschätzen und die Plausibilität einer einzelnen Insertion an gewünschter Stelle zu überprüfen, wurde die mit Sal-I gespaltene Bacmid-DNA im Pulsfeldgel elektrophoretisch aufgetrennt. Verwendet wurde dazu ein Gel aus Fast Lane Agarose (1%) in 0,5 x TBE. Der verwendete DNA-Marker (MidRange I PFG Marker, New England Biolabs, Schwalbach) wurde in fester Form in die betreffende Tasche des Pulsfeldgels eingefügt und mit etwas flüssiger Agarose darin fixiert. Die Elektrophorese erfolgte bei 14°C über 17 h mit Anordnung der Elektroden in einem Winkel von 120° (CHEF-DR III System, Biorad, München). Der Spannungsabfall betrug 6 V/cm, die Umschaltdauer des elektrischen Felds betrug initial 1 s und wurde während der ersten 3 h auf 2 s und während der nächsten 14 h kontinuierlich bis auf 20 s erhöht. Nach Beendigung des Laufs erfolgte die Färbung über 20 min in 500 ml Laufpuffer mit 10 µl 1% (w/v) EtBr sowie die Analyse im UV-Licht. 5.8 DNA-Sequenzanalyse Die DNA-Sequenzanalyse zur genauen Bestimmung und Bestätigung der Insertionsstelle des Transposon-Elements wurde mittels eines automatischen ABI3100 Kapillarsequenzers (ABI, Weiterstadt) durchgeführt. Zur Verwendung kam der BigDye®Terminator-Kit (Applied Biosystems), die Anwendung wurde nach den angegeben Vorschriften durchgeführt. 5.9 Proteinisolierung und -quantifizierung Zum Nachweis von Proteinen durch spezifische Antikörper im Westernblot wurden die entsprechenden Zellen (OMK) mit den unterschiedlichen Virusmutanten infiziert und nach 3 Tagen per Zellschaber geerntet. Die Zellen wurden in PBS gewaschen und das Zellpellet danach in 300 µl RIPA-Puffer für 20 min auf Eis lysiert. Nach – 23 – Methoden einer Ultraschallbehandlung zur Zerkleinerung der DNA-Fragmente folgte ein Zentrifugationsschritt bei 14.000 rpm für 20 Minuten. Die Proteinkonzentration im Überstand wurde mit Hilfe eines BCA-Assays bestimmt (Pierce, Bonn, Germany). Diese Methode funktioniert nach dem BichinosäurePrinzip (Bichinonic Acid, BCA-Assay, Pierce). Dabei werden Cu2+-Ionen durch Reaktion mit Proteinen zu einwertigem Kupfer reduziert. Je ein Cu+-Ion reagiert daraufhin mit zwei Molekülen BCA zu einem Komplex mit violetter Farbe, der sein Absorptionsmaximum bei 562 nm hat. Die Durchführung des Tests erfolgte mit Duplikaten und einer Verdünnungsreihe. Als Standard diente bovines SerumAlbumin (BSA) in PBS in bekannten, aufsteigenden Konzentrationen (0, 0,025, 0,125, 0,25, 0,5, 0,75, 1,0, 1,5 2,0 [µg/µl]). Nach Zugabe von 200 µl der BCAArbeitslösung pro Ansatz und Inkubation bei 37°C für 30 min erfolgte die Bestimmung der Lichtabsorption bei 560 nm und die Berechnung der Proteinkonzentrationen. 5.10 SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese und Westernblot Die Auftrennung von Proteinen entsprechend ihrer Größe erfolgte in diskontinuierlichen SDS-Polyacrylamid-Gelen (Laemmli, 1970). Zur Denaturierung der Proteine wurden jeweils 20 µg der Proteinlysate vor dem Auftragen mit 2x SDS-Probenpuffer versetzt und 5 min bei 95°C inkubiert. Als Größenstandard diente ein Gemisch aus Proteinen bekannter Größe (biotinylierter Protein-Marker; New England Biolabs). Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte bei einer Spannung von 200 V über 50 min. Anschließend wurden die Proteine für Westernblot-Experimente durch Anlegen eines elektrischen Feldes in einer Elektroblotkammer (Hoefer TE77, Amersham Biosciences) auf Polyvinylidenfluorid-Membranen (Millipore, Bedford, USA) transferiert (0,8 mA/cm2, 75 min). Zur Absättigung freier Bindungsstellen wurde die Membran für mindestens 1h oder über Nacht in Blockierlösung geschwenkt, anschließend erfolgte die Zugabe eines spezifischen polyklonalen Kaninchenserums gegen das ORF51-Protein in einer Verdünnung von 1:500 (A. Birkmann, Labor F. Neipel, Virologie Erlangen). Es folgten drei Waschschritte mit Waschpuffer für jeweils 10 min. Der Nachweis gebundener Immunglobuline erfolgte mit Peroxidase-gekoppeltem Anti-Kaninchen- – 24 – Methoden IgG (Dako, Hamburg, Verdünnung 1:5000) für 1h. Nach erneutem Waschen erfolgte der Nachweis gebundener Immunglobuline mit Hilfe des „Enhanced Chemoluminescence“ Systems (ECL; Amersham, Freiburg) mittels Fotodokumentation über das Kamerasystem Fuji LAS-1000 (Raytest, Straubenhart). Verwendete Puffer: RIPA-Puffer: 10 mM Tris-CL (pH8), 150 mM NaCl, 1% NP-40, Na-desoxycholate, 0,1% SDS, und 1% Aprotinine / Leupeptine Auftragspuffer für Proteine (2-fach): 62,5 mM Tris/HCl pH 6.8, 1 mM EDTA, 10 % Glycerol, 2 % SDS, 5 % BetaMercaptoethanol, 0,005 %, Bromphenolblau Laufpuffer: 25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1% SDS Transferpuffer: 25 mM Tris, 200 mM Glycin, 20% Methanol. Waschpuffer: PBS/0,1% Tween20 Blockierlösung: PBS/0,1% Tween20, 5% Magermilchpulver 5.11 Virustitration Um den Virusgehalt im Überstand einer lytischen OMK-Zellkultur quantitativ zu erfassen, wurden Verdünnungsreihen der virushaltigen Zellkulturüberstände hergestellt (Verdünnungsfaktor 103 bis 108). Es erfolgte eine Verteilung der verdünnten Überstände auf die Kavitäten von 96-well-Platten, welche am Vortag mit OMKZellen bestückten worden waren. Die Platten wurden für die folgenden Tage im – 25 – Methoden Brutschrank inkubiert (37°C, 80% relative Luftfeuchtigkeit, 5% CO2), der Zellrasen täglich lichtmikroskopisch auf das Entstehen eines CPE hin kontrolliert. Nach etwa 7 bis 14 Tagen erfolgte die Ablesung des Ergebnisses durch Bestimmung des Anteils CPE-positiver Ansätze für die jeweilige Verdünnungsstufe. Als Titer bezeichnet man schließlich den dekadischen Logarithmus derjenigen Verdünnung, bei der statistisch noch die Hälfte der jeweiligen Ansätze infiziert wird und einen CPE zeigt. Errechnet wird dieser Wert nach dem Schätzverfahren von Spearman (1908) und Kärber (1931), (Mayr et al, 1974). 5.12 Aufreinigung viraler DNA aus Zellkulturüberständen Aus den Überständen infizierter OMK-Zellkulturen wurden 1–2 ml entnommen und die Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 1500 rpm für 10 min entfernt. Anschließend erfolgte eine Pelletierung der Viruspartikel durch Zentrifugation (20.000 rpm, 2h, 4°C) mit darauf folgender Lyse in 100 µl K-Puffer (1 x TE pH 8,5, 2% NatriumN-Lauroylsarkosin) mit 10 µg Proteinase K und Inkubation bei 56 °C für 45 Minuten. Durch eine zweimalige Phenol-Chloroform-Behandlung wurden die Enzymaktivitäten inaktiviert, es folgte eine Fällung mit Ethanol, Lufttrocknung des DNAPellets und die Wiederaufnahme der DNA in H2O. 5.13 Quantitative PCR Die Bestimmung der Kopienzahl von Virusgenomen im Zellkultur-Überstand erfolgte mittels quantitativer Real-time-PCR (Taqman®, ABI Prism 7700 Sequence Detection System, Applied Biosystems, Darmstadt). Es wurden Primer für das Gen des Major Capsid Proteins MCP (auch orf25) verwendet. Als Referenz diente die Verdünnungsreihe eines Cosmids, welches ebenfalls das MCP Gen enthält. Über mehrfache DNA-Konzentrationsbestimmung und entsprechende Verdünnung ist hier die absolute Anzahl der Kopien pro Volumeneinheit bekannt. Die 50µl Reaktionsansätze enthielten je 5 µl Template, 5 µl Taq-Puffer (10fach), 5 nM MgCl2, 0,1 µl 6-ROX (100µM in DMF), 0,5 µl Taq (Institut für Virologie, Erlangen), 0,2 mM dNTPs, 300 nM Primer MCP-F, 300 nM Primer MCP-R und 100nM der MCP-Sonde. – 26 – Methoden Als PCR-Programm kam zum Einsatz: 10min 95°C, dann 40 Zyklen mit jeweils 15s auf 95°C und 1min auf 60°C. Die Kopienzahl konnte nun mit den probenspezifischen CT-Werten über die CTWerte der Standards errechnet werden (Auswertungs-Software: Sequence Detection System Software, Version 1.6.3). 5.14 Charakterisierung der Infektionsausbreitung in Zellkultur Die Erstellung der Zellbilder für die zeitliche Dokumentation der Entstehung eines Cytopathogenen Effekts (CPE) bei den unterschiedlichen Virusvarianten wurde mit OMK-Zellen durchgeführt. Dazu wurden die Zellen 1:3 verdünnt und am Folgetag bei einer Konfluenz von etwa 80% mit den unterschiedlichen Viren in entsprechenden Konzentrationen infiziert. Die nach einigen Tagen entstehenden CPEs wurden täglich mit Hilfe eine Fluoreszenzmikroskopes (Zeiss Axiovert 200) bildlich dokumentiert. – 27 – Ergebnisse 6 Ergebnisse 6.1 Insertionsmutanten und BAC-Bibliothek Ausgangspunkt für die Herstellung der Insertionsmutanten war ein Bacterial Artificial Chromosome (BAC), welches die gesamte DNA von HVS sowie ein Gen für eine Chloramphenicol-Resistenz und eine EGFP-Expressionskassette enthält. Es wurde bereits im Vorfeld durch Co-Transfektion von Cosmiden mit der überlappenden Gensequenz von HVS, einem F-Plasmid-Vektor sowie Linker-Oligonukleotiden generiert. Für die Herstellung der Insertionsmutanten wurde das auf einem Tn5Transposon basierende Transposon-Insertion-Kit der Firma Epicentre verwendet, mit dem weitgehend zufällige Insertionen in einem beliebigen Genom geschaffen werden können In der Mehrzahl der Fälle sollte das verwendete Protokoll zu genau einer einzigen Insertion pro BAC führen. BAC-DNA und Transposon DNA wurden mit rekombinanter Transposase versetzt; nach Inkubation erfolgte die Transformation in E. coli. Das Transposon-Konstrukt enthielt neben den flankierenden Transposon-Sequenzen ein Kanamycin-ResistenzGen, welches eine einfache Selektion der gewünschten Klone auf Agar-Platten mit Kanamycinzusatz möglich machte (schematische Darstellung Abbildung 4). – 28 – Ergebnisse Abbildung 4: Schematische Darstellung des beschriebenen Tn5-Transposon-Mutagenese-Verfahrens Die erhaltenen E. coli Klone wurden in 96-well-Platten überführt. Bei zwei seperaten Ansätzen entstand hierbei eine Bibliothek von 2 mal 8 Platten mit jeweils 96 Klonen, die für die weitere Suche nach spezifischen Insertionsmutanten zur Verfügung stand. Durch das beschriebene Zufalls-Mutagenese-Verfahren erhielt man eine Vielzahl an bakteriellen Klonen, die jeweils ein BAC mit einer Transposon-Insertion an zufälliger Stelle besaßen. Um Material für das folgende Screening-Verfahren zu schaffen, mussten von den angelegten Bibliotheks-Platten, wie beschrieben, Replikate hergestellt werden. Aus diesen Replikaplatten wurden Pools für Spalten, Reihen und Platten gebildet und die Bacmid-DNA daraus aufgereinigt (Abbildung 5). – 29 – Ergebnisse Abbildung 5: Erstellung der DNA-Pools als Grundlage für die Möglichkeit eines systematischen PCRScreenings auf spezifische Insertionsmutanten in der BAC-Bibliothek (Schematische Darstellung) Diese so erhaltenen Pool-DNAs enthielten nun jeweils eine Mischung aller Bacmide einer Platte (bzw. einer Reihe oder einer Spalte). Sie wurde aliquotiert und bei –20°C bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt. 6.2 Identifizierung spezifischer Insertionsmutanten durch PCR Aus den erstellten DNA-Pools war es nun mit überschaubarem Aufwand möglich, mit Hilfe eines PCR-Verfahrens genau den Klon zu identifizieren, der eine Insertion nahe einer gewünschten Position besitzt. Als Primer wurden dazu zwei Oligonukleotide gewählt, von denen eines nahe der gewünschten Insertionsstelle am BAC bindet, das andere am inserierten Transposon-Konstrukt. Dieser PCR-Ansatz wurde mit allen Spalten-, Reihen- und Plattenpools durchgeführt. Ein nachweisbares PCRProdukt erhält man hierbei nur, wenn in dem betreffenden Ansatz die DNA eines Bacmids vorhanden ist, dessen Insertion sich nahe der gewünschten Stelle befindet, die zwei Primer also einen relativ geringen Abstand voneinander haben. Befindet sich die Insertion weiter vom gewünschten Gen entfernt, erhält man durch die Wahl einer relativ kurzen Elongationszeit wenig oder kein PCR-Produkt (Abbildung 6). – 30 – Ergebnisse Abbildung 6: Schematische Darstellung des beschriebenen PCR Screening-Verfahrens. Befinden sich der gewählte Such-Primer und das inserierte Transposon-Element in unmittelbarer Nähe zueinander, so lässt sich ein PCR-Produkt nachweisen (Fall A). Eine Insertion an anderer Stelle mit größerem Abstand zwischen Transposon-Element und Such-Primer führt dazu, dass sich kein PCR-Produkt definierter Länge nachweisen lässt (Fall B). Durch die Lokalisation einer Bande ganz bestimmter Größe sowohl in einem bestimmten Spalten-, Reihen- als auch Plattenpool kann man auf die Koordinaten des betreffenden Klons in der Bibliothek schließen (Abbildung 7). Abbildung 7: Gelelektrophoretische Analyse der PCR-Produkte aus dem Screening-Ansatz. Im vorliegenden Fall befindet sich ein aussichtsreicher Kandidat für eine Insertion in orf51 in Platte 7 / Reihe D / Spalte 5 der BAC-Bibliothek. – 31 – Ergebnisse 6.3 Exemplarische Identifizierung einer orf51 Insertionsmutante Über die beim Screening erhaltenen Koordinaten wurden die in Frage kommenden Klone angezüchtet und die Bacmid-DNA aus den E. coli Kulturen präpariert. Zur Bestätigung der genauen Insertionsstelle und zum Ausschluss von Doppelinsertionen wurde die BAC-DNA nach einem Testverdau mit Sal-I auf einem Pulsfeldgel elektrophoretisch aufgetrennt (Abbildung 8). Abbildung 8: Pulsfeld-Gelelektrophorese der erhaltenen BAC-DNAs nach Testverdau mit Sal-I zur Kontrolle der Gesamtlänge sowie zur Elimination von Klonen mit Doppelinsertion. Bei einer einzelnen Insertion des Transposon-Elementes werden zwei DNA-Fragmente erwartet, welche in Summe die Länge von BAC plus Transposon ergeben sollten. Im gezeigten Beispiel befindet sich der gesuchte Klon (mit Insertion in orf51) in Spur 11. Durch die Spaltung mit Sal-I entstehen hier aus dem Bacmid zwei Fragmente mit einer Länge von 73,5 bzw. 84,5 kb. Die definitive Bestätigung der genauen Insertion wurde durch eine Sequenzierung der Proben ermittelt. Als Startsequenz für die Sequenzier-Reaktion diente dabei ein Oligonukleotid, welches im inserierten Transposon-Konstrukt bindet. Durch Vergleich der erhaltenen Nukleotidsequenz mit der BAC-Sequenz kann so die exakte Insertionsstelle ermittelt werden. In unserem Beispiel wurde orf51 im ersten Drittel des Gens durch die Insertion unterbrochen (Abbildung 9). Abbildung 9: Genaue Position der Insertion in orf51, bestimmt durch DNA-Sequenzierung – 32 – Ergebnisse 6.4 Herstellung rekombinanter Viren und Nachweis der Proteinexpression Durch Transfektion von OMK-Zellen mit der isolierten BAC-DNA konnten nun Viren produziert werden. Als Kontrollen wurden hierbei zum einen das unveränderte BAC 44 sowie ein entsprechendes Virus, dessen DNA in Form von fünf sich überlappenden Cosmiden vorlag, verwendet (bezeichnet als Wildtyp). Außerdem wurde einem Ansatz, der die Insertionsmutante enthielt, ein PCR-Fragment zugesetzt, welches den Bereich um orf51 enthielt (Abbildung 10). Sollten Defektmutanten einen Nachteil hinsichtlich der Replikationsgeschwindigkeit haben, so erwartet man hier durch homologe Rekombination ein rasches Rückmutieren zum Wildtyp. Abbildung 10: Generierung einer Revertante durch homologe Rekombination nach Zugabe eines orf51 enthaltenden PCR-Fragments zum Transfektionsansatz (Schematische Darstellung) Wenige Tage nach Transfektion von OMK-Zellen mit der Virus-DNA wird in der adhärenten Zellkultur an einzelnen Stellen als Zeichen der lytischen Virusreplikation ein sogenannter Cytopathogener Effekt sichtbar (CPE). Die Insertion des Transposon-Elements im entstandenen Virus sowie die Rückmutation nach Zugabe eines PCR-Fragments konnten durch PCR bestätigt werden (Abbildung 11). – 33 – Ergebnisse Abbildung 11: Kontrolle der erzeugten Viren mittels PCR: 1: Virus aus BAC mit Insertion in orf51, 2: Virus aus BAC mit Insertion in orf51 plus PCR-Fragment von orf51 (Revertante), 3: Wildtyp-Virus aus BAC-DNA Zum Nachweis des exprimierten Proteins wurden aus frisch infizierten OMK-Zellen Lysate hergestellt und diese im Westernblot mit einem Antikörper gegen das ORF51Glykoprotein analysiert. Das ORF51 Protein ließ sich hier mit einer Größe von etwa 55 kDa nachweisen. Wie erwartet zeigte sich ein völliges Fehlen dieses Proteins bei dem Ansatz mit der Insertion im entsprechenden Gen (Abbildung 12). Durch Zugabe eines PCR-Fragments zum Transfektionsansatz konnte jedoch die ursprüngliche Funktion des Gens durch homologe Rekombination wieder hergestellt werden (Abbildung 12, Spur 2). Abbildung 12: Westernblot-Analyse mit einem Antikörper gegen das ORF51-Glykoprotein. ZellLysate von OMK-Zellen nach Infektion mit folgenden Viren: 1: orf51 Insertions-Mutante, 2: orf51 Insertions-Mutante plus PCR-Fragment von orf51 (Revertante), 3: Wildtyp-Virus aus BAC, 4: Negativkontrolle ohne Virus – 34 – Ergebnisse 6.5 Verändertes Wachstumsverhalten der orf51 Insertionsmutante Zur Beurteilung von eventuellen Unterschieden im Wachstumsverhalten wurden die Virusüberstände titriert und damit die Anzahl infektiöser Partikel pro Volumen bestimmt. Es erfolgte eine Infektion von OMK-Zellen mit den unterschiedlichen Virusmutanten mit identischer Virusmenge. An den Tagen 4, 6 und 8 nach Infektion wurde jeweils Zellkultur-Überstand entnommen und dieser ebenfalls titriert (Wachstumskurve siehe Abbildung 13). Abbildung 13: Zeitverlauf des infektiösen Titers verschiedener Virusvarianten im Zellkulturüberstand. Mix24: HVS-C488 aus Cosmiden; BAC44: HVS-C488 aus BAC44; BAC44d51: HVS-C488 aus BAC44 mit inaktiviertem orf51; BAC44d51Rev: Revertante aus HVS-C488/BAC44d51 und PCRFragment mit orf51. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen zweier Messungen. Es zeigte sich ein verminderter infektiöser Virustiter bei der Variante mit inaktiviertem orf51 mit einem maximalen Unterschied von 1 bis 2 Log-Stufen am Tag 6 nach Infektion. Der Titerverlauf der Kontrollviren zeigte sich sehr ähnlich, unabhängig von der Art der Virusgenerierung (aus Cosmiden / BAC / Revertante). Ferner wurde mittels quantitativer PCR (Taqman) die Kopienzahl der Virus-DNA im Überstand bestimmt (Abbildung 14). – 35 – Ergebnisse Abbildung 14: Bestimmung der Virus-DNA Kopienzahl durch quantitative PCR aus ZellkulturÜberstand. Mix24: HVS-C488 aus Cosmiden; BAC44: HVS-C488 aus BAC44; BAC44d51: HVSC488 aus BAC44 mit inaktiviertem orf51; BAC44d51Rev: Revertante aus HVS-C488/BAC44d51 und PCR-Fragment mit orf51. Dargestellt sind die Mittelwerte der Mehrfachansätze der quantitativen PCR. Analog zum Virustiter zeigte sich hier ebenfalls eine Verminderung der Kopienzahl im Überstand für die Variante mit defektem orf51 im Vergleich zu den Kontrollviren. Das Aussehen und die Ausbreitung der Cytopathogenen Effekte (CPEs), welche nach Infektion von OMK-Zellen mit HVS entstehen, wurde außerdem in Bildern dokumentiert. Da hier mit Virusvarianten gearbeitet wurde, welche ein EGFP-Gen beinhalten, war die Darstellung im Fluoreszenzmikroskop unter UV-Licht sehr gut möglich. Es zeigte sich eine deutlich langsamer voranschreitende Ausbreitung der CPEs sowie eine reduzierte Plaque-Größe bei der Virus-Variante mit fehlendem ORF51 Protein im Vergleich zu den Kontrollen. Dieser Effekt war bei der durch homologe Rekombination rückmutierten Revertante jedoch wieder vollständig aufgehoben (Abbildung 15). – 36 – Ergebnisse Abbildung 15: Exemplarische Bilder von Cytopathogenen Effekten (CPEs) in OMK-Zellen, jeweils am Tag 5 bis Tag 8 nach Infektion mit den verschiedenen Virusvarianten. BAC44: HVS-C488 aus BAC44; Mix24: HVS-C488 aus Cosmiden; BAC44d51Rev: Revertante aus HVS-C488/BAC44d51 und PCR-Fragment mit orf51; BAC44d51: HVS-C488 aus BAC44 mit inaktiviertem orf51. – 37 – Diskussion 7 Diskussion Herpesvirus saimiri gilt als Prototyp eines Rhadinovirus, welches in seinem natürlichen Wirt, dem Totenkopfäffchen, weit verbreitet vorkommt und dort apathogen ist. In diversen Neuwelt-Primaten löst es jedoch innerhalb weniger Wochen T-ZellLymphome aus (Fickenscher et al, 2001). Am Menschen wurde bisher keine pathogene Wirkung beobachtet. Aufgrund des großen Genoms von HVS mit mindestens 77 offenen Leserahmen ist bisher nur ein Teil der Gene in ihrer Funktion geklärt. Zur weiteren Charakterisierung einzelner Genfunktionen sowie zur genaueren Eingrenzung der für HVS essentiellen Gene ist es notwendig, in einzelnen Genen deletierte oder defekte Viren zu generieren und diese näher zu untersuchen. Zur Generierung solcher Virusmutanten gibt es unterschiedliche Möglichkeiten. Ein in unserer Arbeitsgruppe angewandtes Verfahren ist die gezielte Klonierung in Cosmiden und die anschließende Virusgenerierung durch homologe Rekombination der überlappenden, linearisierten Cosmide nach Transfektion in OMK-Zellen (Ensser et al, 1999). Zur Untersuchung einer größeren Anzahl an Deletionsmutanten ist dieser Ansatz jedoch aufwändig und zeitintensiv. In dieser Arbeit wurde deshalb ein System verwendet, mit dessen Hilfe in kurzer Zeit eine hohe Anzahl von Virusmutanten erzeugt werden kann. Es beruht auf einem aus E. Coli isolierten Tn5-Transposon-Element, welches in leicht veränderter Form zusammen mit einer in ihrer biologischen Aktivität verstärkten Transposase arbeitet (Goryshin et al, 1998). Hierbei erfolgt die Insertion eines DNA-Stückes (Transposon-Element) an zufälliger Stelle in der zugesetzten Bacmid-DNA (HVSGenom) in einem in vitro Ansatz. Die Verwendung des Virusgenoms in Form eines einzigen Bacmids bringt den Vorteil einer effizienteren Virusgenerierung nach Transfektion der entsprechenden DNA in OMK-Zellen im Vergleich zur Virusgenerierung aus einzelnen Cosmiden mit sich, da der Vorgang der homologen Rekombination der fünf einzelnen Cosmide hier entfällt. Über die im Transposon-Element enthaltene Kanamycin-Resistenz konnten die Insertionsmutanten des HVS-Bacmids in E. coli selektioniert und isoliert und wie beschrieben als DNA-Bibliothek asserviert werden. Eine ausreichende Anzahl von Klonen in der Bibliothek und zufällig inserierte Transposon-Elemente vorausgesetzt, – 38 – Diskussion sollte ein beliebiger gewünschter Klon in der Bibliothek enthalten und leicht zu identifizieren sein. Konkret wurden hierbei 1536 Einzelklone isoliert und asserviert (2 x 8 Platten mit jeweils 96 Einzelklonen). Setzt man eine völlig zufällige Insertion des Transposon-Elements sowie ausschließlich Einzel-Insertionen in den Bacmiden voraus, so ergibt sich bei einer Bacmidgröße von 158 kb rechnerisch etwa 1 Insertion pro 100 Basenpaaren Virus-DNA. Es sollte also mit hoher Wahrscheinlichkeit eine Variante mit Insertion in einem beliebigen gewünschten Gen enthalten und zu identifizieren sein. In der Praxis zeigte sich, dass diese Annahmen nicht ganz zutreffend waren. So konnten mit der beschriebenen PCR-Screening-Methode zwar elegant einige interessante Insertionsvarianten identifiziert werden (orf17, orf45, orf51), für einige andere, ebenfalls interessierende Genlokalisationen verlief die Suche jedoch ergebnislos. Dies könnte dafür sprechen, dass trotz der in der Literatur beschriebenen völlig zufällig zu erwartenden Insertionen (Goryshin et al, 1998) im vorliegenden System Bereiche im Virus-Bacmid bestehen, in denen eine Insertion wahrscheinlicher ist als an anderen Stellen (so genannte „hot spots“). Außerdem zeigte sich, dass beim gewählten Verfahren trotz Optimierungsbemühungen eine relevante Anzahl von Doppelinsertionen auftrat. Dazu wurde eine Testspaltung der Bacmid-DNA mit dem Restriktionsenzym Sal-I durchgführt, welches eine Schnittstelle in der inserierten Transposonkassette, sowie eine weitere im Bacmid besitzt. Bei einer singulären Insertion sind die entstehenden zwei Fragmente in der Pulsfeld-Gelelektrophorese gut zu beurteilen. Varianten mit zwei sehr nahe beieinander liegenden Insertionen können damit aber möglicherweise nicht als solche erkannt werden. Deshalb erfolgte zusätzlich eine DNA-Sequenzierung der identifizierten Klone, ausgehend vom inserierten DNA-Fragment, um die Insertionsposition zweifelsfrei zu identifizieren und Mehrfachinsertionen auszuschließen. Durch Variation der Reaktionszeiten sowie der Mengenverhältnisse von Bacmid-DNA zu Transposon-DNA wurde versucht, ein Optimum hinsichtlich eines möglichst geringen Anteils an Mehrfachinsertionen zu erreichen. Trotzdem fanden wir in unseren Ansätzen in etwa 10 Prozent der isolierten Bacmid-Klone mehr als eine Insertion vor. Von Brune et al. wurde ein ähnliches Mutageneseverfahren anhand eines Cytomegalovirus-Bacmids beschrieben (Brune et al, 1999). Im Gegensatz zu dem bei uns – 39 – Diskussion angewendeten System findet die Insertion des Transposon-Elements hier nicht in vitro, vermittelt durch eine rekombinant hergestellte Transposase statt. Die erforderlichen Enzyme sowie das eigentliche Transposon werden bei diesem Verfahren als Plasmid zusätzlich zum Virus-Bacmid in E. coli eingebracht. Über den temperatursensitiven Replikationsursprung dieses Plasmids, welcher bei höheren Temperaturen inaktiv ist, erfolgt bei einer Temperatur von 42°C eine Selektion auf genau die E. coli. Klone, welche das entsprechende Transposon-Element (inkl. enthaltener Antibiotikaresistenz) in das BAC integriert haben. Die Erfolgsraten bei beiden Systemen sind als ähnlich gut beschrieben, ein Test dieses Systems bei HVS als mögliche Alternative ergab jedoch nahezu ausschließliche Insertionen in die repetitive H-DNA und in das bakterielle Genom (Ensser, pers. Mitteilung). Die exemplarisch identifizierte und isolierte orf51 Insertionsmutante zeigte sich in der Pulsfeld-Gelelektrophorese mit genau einer Insertion. Durch Sequenzierung konnte dies bestätigt und die exakte Position der Transposon-Insertion bestimmt werden. Durch Transfektion der entsprechenden Bacmid-DNA in OMK-Zellen ließen sich problemlos Viren generieren. Beim beschriebenen Mutagenese-Verfahren erfolgt keine echte Deletion von Genen, es wird vielmehr eine Inaktivierung bestimmter Gene durch Insertion angestrebt. Um zu zeigen, dass dadurch auch die Expression des entsprechenden Proteins vollständig ausbleibt, führt man Westernblot-Analysen durch. Dieser Nachweis einer fehlenden Proteinexpression ist nicht ganz unproblematisch. So ist es denkbar, dass durch die Insertion ein c-terminal verkürztes Protein entsteht, welches von dem im Westernblot verwendeten Antikörper nicht mehr erkannt wird. Durch die per Sequenzierung gewonnene genaue Insertionsposition kann man zum Teil jedoch Rückschlüsse auf eine zu erwartende Rest-Expression ziehen. Bei ORF51 zum Beispiel liegt die angenommene Transmembrandomäne im hinteren Teil des Proteins, im Bereich der Aminosäuren 265 bis 287 (abgeschätzt nach TMHMM) (Sonnhammer et al, 1998; Krogh et al, 2001). Die Insertion des Transposons bei unserer isolierten Mutante befindet sich im Gen an Position 211, also im Bereich der Aminosäure 71. Man kann – 40 – Diskussion hier davon ausgehen, dass ein eventuell entstehendes verkürztes Protein keine Transmembrandomäne besitzt und damit als Membranprotein nicht funktionell ist. Im vorliegenden Beispiel konnte die fehlende Expression eines normalen Genproduktes von orf51 per Westernblot-Analyse nachgewiesen werden. Die mit Kontrollviren infizierten OMK-Zellen hingegen exprimierten das ORF51-Glykoprotein mit der erwarteten Größe von etwa 55 kDa. Außerdem konnte durch Co-Transfektion eines den Insertionsbereich überspannenden PCR-Fragments eine Rückmutation des Virusgenoms zum Wildtyp mit dann wieder unauffälliger ORF51-Expression erreicht werden. Daraus lässt sich schließen, dass es sich bei orf51 von HVS um ein für das Virus nicht essentielles Gen handelt. Diese Erkenntnis war nicht überraschend, da ähnliche Ergebnisse bereits für andere Gamma-Herpesviren mit positionshomologen Glykoproteinen vorlagen. Herpesviren stellen ihren Kontakt zu ihrem Wirt meist über die Bindung von Glykoproteinen der Virushülle an Glykosaminoglykane, meist Heparansulfat, auf der Zelloberfläche der Zielzelle her (Spear et al, 2003). Bei HHV-8 spielt hier das Glykoprotein K8.1 eine entscheidende Rolle. Es bindet an Heparansulfat an der Zelloberfläche und spielt damit eine wichtige Rolle bei der Zellanheftung von HHV-8 an die Wirtszelle (Birkmann et al, 2001). Es konnte jedoch auch gezeigt werden, dass K8.1 nicht essentiell für den Viruseintritt in die Wirtszelle ist. Im Zellkultursystem erfolgt eine Infektion von 293-Zellen auch mit k8.1-defizienten HHV-8-Virusmutanten (Luna et al, 2004). Das entsprechende Glykoprotein beim Epstein-Barr Virus ist GP350/220. Es handelt sich hierbei um das in der Virushülle am häufigsten anzutreffende Glykoprotein. In vivo stellt es das Haupt-Antigen des Virus dar und bindet an den KomplementRezeptor 2 (CR2 oder auch CD21) von B-Zellen (Nemerow et al, 1987). Es konnte jedoch gezeigt werden, dass sich einerseits auch CD21-negative Zellen mit EBV infizieren lassen und andererseits Virusmutanten, denen dieses Glykoprotein fehlt, trotzdem in der Lage sind, in Zellkultur 293-Zellen zu infizieren (Janz et al, 2000). Auch das Murine Herpesvirus 68 (MHV-68) besitzt ein entsprechendes Glykoprotein, GP150. Analog zu EBV und HHV-8 zeigten sich auch hier gp150-deletierte Viren in Zellkultur infektiös, es wurde jedoch eine etwas verminderte ViruspartikelFreisetzung beobachtet (Stewart et al, 2004). Bei in vivo Versuchen in Mäusen zeigte sich eine veränderte Ausbreitung der Infektion mit MHV-68 nach intranasaler Inoku- – 41 – Diskussion lation. So war die in der Lunge beobachtete produktive Replikation des gp150defizienten Virus zunächst vergleichbar mit jener der Wildtyp-Kontrolle. Die in diesem Versuchsmodell normalerweise auftretende Monozytenproliferation in der Milz blieb bei der gp150-deletierten Mutante jedoch aus; die Zahl der latent infizierten Milzzellen war signifikant niedriger als bei der Kontrolle (Stewart et al, 2004). Zur weiteren Untersuchung des bei uns erzeugten orf51-inaktivierten HVS wurden OMK-Zellen infiziert und die sich im Überstand entwickelnde Virusmenge im Zeitverlauf quantifiziert. Die hierzu erfolgte Bestimmung der Kopienzahl an Virus-DNA zeigte verminderte Werte für die orf51-defiziente Variante im Vergleich zu den Wildtyp-Viren; statistische Aussagen lassen sich aufgrund der geringen Fallzahl hiermit jedoch leider nicht machen. Bei der Bestimmung der Kopienzahl über ein PCR-Verfahren werden jedoch auch defekte, nicht infektiöse Viruspartikel mit erfasst, sofern sie DNA erhalten. Dies wäre im Rahmen einer ineffektiven Virusproduktion bzw. Freisetzung durchaus als relevant vorstellbar. Um dieser Tatsache Rechnung zu tragen, wurde zusätzlich eine Virustitration durchgeführt. Bei diesem Verfahren werden im Gegensatz zur DNA-Kopienzahl-Bestimmung nur infektiöse Viruspartikel erfasst. Es zeigte sich hier ein ähnliches Bild mit einem um 1–2 LogStufen niedrigeren infektiösen Titer der orf51-defizienten Virusvariante, eine Woche nach Infektion der OMK-Zellen. Dieser Virustiter lässt methodenbedingt jedoch nur Aussagen über die Infektiosität gegenüber OMK-Zellen zu. Ob der Tropismus zu anderen Zellarten durch die Inaktivierung von orf51 beeinflusst wird, war bisher nicht Gegenstand von Untersuchungen. Zur Visualisierung des Wachstumsverhaltens der Virusvarianten sowie zur Beurteilung der Zell-zu-Zell-Ausbreitung der Infektion wurden OMK-Zellen mit identischen Virusmengen infiziert und die sich entwickelnden Cytopathogenen Effekte (CPEs) fotografisch im Zeitverlauf dokumentiert. Die exemplarisch gezeigten Bilder (Abbildung 15) zeigen eine im Vergleich zu den Kontrollen verlangsamte Ausbreitung des CPE bei der orf51-defizienten Variante sowie eine deutlich kleinere Ausdehnung der einzelnen Plaques. Betrachtet man die Kontrollen, so zeigt sich kein Unterschied im Ausbreitungsverhalten der lytischen Virusinfektion im Vergleich der aus Cosmiden bzw. aus Bacmid-DNA generierten Viren sowie der Revertante. – 42 – Diskussion Durch die beschriebene Co-Transfektion eines den jeweiligen Insertionsbereich überspannenden PCR-Fragments kann – sofern die ursprüngliche Variante einen Selektionsvorteil bei der Replikation aufweist – eine Rückmutation zum normalen Virusgenom (Revertante) erzeugt werden. Dies kann zum Nachweis der Reversibilität einer singulären Insertion bei sonst nicht beeinträchtigtem Virusgenom herangezogen werden. Man benutzt diese Methode aber auch dazu, um Insertionen in essentiellen Genen und die damit verbundene Inaktivierung zu bestätigen. Im Falle eines BAC mit gesicherter Insertion in einem bestimmten Gen, aus welchem sich in Zellkultur kein Virus erzeugen lässt, stellt sich immer die Frage, ob das betreffende Gen tatsächlich essentiell ist oder ob sonstige methodische Probleme die Ursache des negativen Versuchsergebnisses sind. Durch Zugabe eines den betreffenden Bereich überspannenden PCR-Fragmentes lassen sich diese beiden Fälle voneinander differenzieren. Handelt es sich um ein tatsächlich essentielles Gen, so wird nach Zugabe des PCR-Fragments mit hoher Wahrscheinlichkeit eine Rückmutation zum Ausgangsvirus erfolgen. Es soll noch erwähnt werden, dass zwischenzeitlich auch effiziente Verfahren zur gezielten Mutagenese und anschließenden Herstellung von markerlosen Revertanten in E.coli zur Verfügung stehen (Tischer et al, 2006). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es sich bei dem vorgestellten Verfahren – innerhalb der beschriebenen Grenzen – um eine effiziente und schnelle Methode handelt, eine große Anzahl von Virusmutanten mit jeweils einem singulären durch Insertion inaktivierten Gen herzustellen. Durch das beschriebene PCR-ScreeningVerfahren lassen sich ohne großen Aufwand die gewünschten Klone identifizieren. Untersuchungen zur Unterscheidung zwischen essentiellen und nicht-essentiellen Genen sind hiermit genauso möglich wie die nähere Charakterisierung einer bestimmten Insertionsmutante. Unsere Ergebnisse zur Funktion von orf51 von HVS stehen im Einklang mit bereits bekannten Beobachtungen bei anderen Herpesviren. orf51 ist für HVS nicht essentiell, scheint aber bei der Infektion von OMK-Zellen zu einer Verminderung der Virusfreisetzung und damit des infektiösen Titers zu führen. Darüber hinaus ist orf51 für die Ausbreitung von Zelle zu Zelle im OMK-Zellkultursystem von Bedeutung, jedoch auch dafür nicht essentiell. – 43 – Diskussion Die gezeigte Identifizierung und Isolierung der orf51-inaktivierten Variante erfolgte hier exemplarisch; mit der vorhandenen BAC-Bibliothek ist die Identifizierung weiterer Insertionsmutanten möglich und sinnvoll. Die dabei zu erreichenden Erkenntnisse können dazu beitragen, Gamma-Herpesviren in ihren unterschiedlichen Aspekten und Anwendungsbereichen besser zu verstehen. – 44 – Literaturverzeichnis 8 Literaturverzeichnis 1. Bankier, A. T., W. Dietrich, R. Baer, B. G. Barrell, F. Colbere-Garapin, B. Fleckenstein and W. Bodemer (1985). Terminal repetitive sequences in herpesvirus saimiri virion DNA. J Virol 55(1): 133-9. 2. Biesinger, B., I. Muller-Fleckenstein, B. Simmer, G. Lang, S. Wittmann, E. Platzer, R. C. Desrosiers and B. Fleckenstein (1992). Stable growth transformation of human T lymphocytes by herpesvirus saimiri. 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J Virol 49(2): 343-8. – 45 – Literaturverzeichnis 8. Desrosiers, R. C., J. Kamine, A. Bakker, D. Silva, R. P. Woychik, D. D. Sakai and F. M. Rottman (1985). Synthesis of bovine growth hormone in primates by using a herpesvirus vector. Mol Cell Biol 5(10): 2796-803. 9. Duboise, S. M., J. Guo, S. Czajak, R. C. Desrosiers and J. U. Jung (1998). STP and Tip are essential for herpesvirus saimiri oncogenicity. J Virol 72(2): 130813. 10. Ensser, A., A. Pfinder, I. Muller-Fleckenstein and B. Fleckenstein (1999). The URNA genes of herpesvirus saimiri (strain C488) are dispensable for transformation of human T cells in vitro. J Virol 73(12): 10551-5. 11. Ensser, A., M. Thurau, S. Wittmann and H. Fickenscher (2003). The genome of herpesvirus saimiri C488 which is capable of transforming human T cells. Virology 314(2): 471-87. 12. Falk, L. A., L. G. Wolfe and F. Deinhardt (1972). Isolation of Herpesvirus saimiri from blood of squirrel monkeys (Saimiri sciureus). 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Tech. 1: 89-94. – 49 – Abkürzungsverzeichnis 9 Abkürzungsverzeichnis bp Basenpaare BSA bovines Serum-Albumin CMV Cytomegalovirus CO2 Kohlendiaxid CPE Cytopathogener Effekt d Tage DMEM Dulbecco´s modified Eagle medium DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxy-Nukleotidtriphosphat E. coli Escherichia coli EBV Epstein-Barr-Virus EDTA Ethylendiamintetraacetat EGFP enhanced green fluorescent protein EtBr Ethidiumbromid FKS Fötales Kälberserum h Stunden HHV-8 Humanes Herpesvirus Typ 8 HIV Humanes Immundefizienz-Virus HRP horseradish peroxidase (Meerrettichperoxidase) HSV Herpes simplex Virus HVS Herpesvirus saimiri kb Kilobase kDa Kilodalton KSHV Kaposi’s Sarcoma associated Herpesvirus, HHV-8 MHV-68 Murines Herpesvirus 68 min Minute moi multiplicity of infection OMK Owl monkey kidney cells; Nachtaffen-Nierenepithel-Zelllinie ORF open reading frame, Offener Leserahmen – 50 – Abkürzungsverzeichnis PBS Phosphat gepufferte Salzlösung PBSo Phosphat gepufferte Salzlösung ohne Magnesiumchlorid PCR Polymerase-Kettenreaktion RNA Ribonukleinsäure rpm Umdrehungen pro Minute RT Raumtemperatur SDS Natriumdodecylsulfat StpC Saimiri transformation associated protein of subgroup C Tip Tyrosin kinase interacting protein TMHMM TransMembran (Prediction) Hidden-Markov-Model (Methode zur Vorhersage von Transmembrandomänen in Proteinen) U Unit UV ultraviolett V Volt VZV Varizella Zoster Virus – 51 – – 52 – Vorveröffentlichungen 10 Vorveröffentlichungen Lehner, M., Grillhösl, C., Full, F., Vogel, B., Weller, P., Müller-Fleckenstein, I., Schmidt, M., Fleckenstein, B., Holter, W. and Ensser, A. (2009). "Transformation efficiency by Herpesvirus saimiri is not a limiting factor in clonal CD8pos T cell outgrowth." Virology 388(1): 15-20. Wieser, C., Stumpf, D., Grillhösl, C., Lengenfelder, D., Gay, S., Fleckenstein, B. and Ensser, A. (2005). "Regulated and constitutive expression of anti-inflammatory cytokines by nontransforming herpesvirus saimiri Vektors." Gene Ther 12(5): 395406. Schäfer, A., Lengenfelder, D., Grillhösl, C., Wieser, C., Fleckenstein, B. and Ensser, A. (2003). "The latency-associated nuclear antigen homolog of herpesvirus saimiri inhibits lytic virus replication." J Virol 77(10): 5911-25. – 53 – – 54 – Danksagung 11 Danksagung Während der Zeit dieser Doktorarbeit gab es zahlreiche Menschen, die mich in unterschiedlichster Art und Weise unterstützt haben. Dafür möchte ich mich bei allen – insbesondere auch bei allen hier nicht im Einzelnen Genannten – ganz herzlich bedanken! Herrn Professor Fleckenstein danke ich für die Möglichkeit, diese Arbeit an seinem Institut machen zu können, für das gute Arbeitsklima am gesamten Virologischen Institut und die vielfältigen Möglichkeiten zu wissenschaftlicher Diskussion und Weiterbildung. Herzlich bedanken möchte ich mich vor allem auch bei Herrn Professor Armin Ensser für seine persönliche Betreuung, sein stets offenes Ohr bei Problemen jeglicher Art und nicht zuletzt für die vielen guten Ideen und Lösungsansätze. Mein ausgesprochener Dank gilt außerdem allen ehemaligen und aktuellen Mitgliedern der Arbeitsgruppe Ensser sowie allen Kolleginnen und Kollegen am Virologischen Institut für die angenehme und oft auch sehr heitere Zusammenarbeit. Uneingeschränkte Unterstützung auf meinem Weg habe ich immer durch meine Eltern erfahren – seit ich denken kann. Dafür danke ich Ihnen von ganzem Herzen. Ein ganz besonderer Dank gilt meiner Partnerin, die durch Ihre Unterstützung und ihr grenzenloses Verständnis einen großen Teil zur Fertigstellung dieser Arbeit beigetragen hat. Danke Heidi! – 55 –
