Bewegungsanalyse von Bacillus amyloliquefaciens

Bewegungsanalyse von Bacillus amyloliquefaciens durch OnlineMikroskopie mit automatisierter Wegverfolgung
vorgelegt von
Andreas Ziegler (M.Sc.)
geb. in Ludwigshafen am Rhein
Von der Fakultät III – Prozesswissenschaften –
der Technischen Universität Berlin
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Ingenieurwissenschaften
- Dr.-Ing. genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss:
Vorsitzender: Prof. Dr. Peter Neubauer
Gutachter: Prof. Dr. Ulf Stahl
Gutachter: Prof. Dr. Matthias Rädle
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 12. Februar 2015
Berlin 2015
D83
Danksagung
Die vorliegende Arbeit entstand in Kooperation des Fachbereichs Angewandte und
Molekulare Mikrobiologie der Technischen Universität Berlin mit dem Institut für
Prozessmesstechnik und innovative Energiesysteme der Hochschule Mannheim im Zeitraum
von August 2010 bis Februar 2015.
Mein besonderer Dank gilt meinen Betreuern Prof. Dr. Ulf Stahl und Prof. Dr. Matthias Rädle
für die Vergabe des Themas, das entgegengebrachte Vertrauen, die Betreuung über den
gesamten Zeitraum, die konstruktiven Diskussionen in zahlreichen Projekttreffen, die stets
hilfreichen Vorschläge und für die intensive Unterstützung.
Prof. Dr. Peter Neubauer danke ich für die Übernahme des Vorsitzes der wissenschaftlichen
Aussprache.
Meinen Kollegen vom Institut für Prozessmesstechnik und innovative Energiesysteme danke
ich für das ausgezeichnete Arbeitsklima im Institut. Die hohe Hilfsbereitschaft in fachlichen
Belangen wie auch der Umgang im privaten gab mir das nötige Umfeld für die lange und
angenehme Zusammenarbeit. Besonders hervorheben möchte ich: Patrick Dörnhofer, Viktoria
Kapoustina, Alexander Kron, Isabel Medina, Florian Ries, Lukas Schmitt, Daniel SchockKusch und Tobias Teumer.
Den Mitarbeitern des Fachbereichs Angewandte und Molekulare Mikrobiologie der
Technischen Universität Berlin, im besonderen Sandra Dounia, danke ich für die gute
Zusammenarbeit. Weiterhin gilt den zahlreichen Studenten, die an der Durchführung und
Auswertung der Fermentationen beteiligt waren, ebenso mein Dank.
Neben den hilfreichen Informationen möchte ich mich bei der Firma ABiTEP GmbH vor
allem für die Bereitstellung des Produktionsmediums und der Bakteriensporen bedanken.
Bei meinem Schwiegervater Eberhard möchte ich mich für das Korrekturlesen bedanken.
Ich danke meinen Eltern für die Unterstützung in all meinen Vorhaben. Meiner Frau AnneMarie danke ich besonders für den liebevollen Rückhalt die ganze Zeit über und meinem
Sohn Fjonn für die Bereicherung, die er mir brachte.
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
I
Bestimmung der Vitalität von Mikroorganismen durch Online-Mikroskopie .......... 1
1
Einführung ........................................................................................................................ 1
2
Online-Mikroskopie ......................................................................................................... 6
2.1
In-Situ-Mikroskopie .................................................................................................... 6
2.2
Durchfluss-Mikroskope: ............................................................................................ 11
2.3
Bildverarbeitung ........................................................................................................ 12
3
Bewegung von Bakterien ............................................................................................... 14
II
Bewegungsanalyse von Bacillus amyloliquefaciens ..................................................... 18
4
Einleitung ........................................................................................................................ 18
5
Zielsetzung ...................................................................................................................... 23
6
Material und Methoden ................................................................................................. 24
6.1
Verwendeter Stamm und verwendete Medien........................................................... 24
6.2
Bioreaktor .................................................................................................................. 25
6.3
Versuchsdurchführung............................................................................................... 28
6.4
Online-Mikroskopie mit automatisierter Serienbildaufnahme .................................. 29
6.4.1
Durchflussküvette mit flexibler Schichtdicke .................................................... 30
6.4.2
Messsystem zur Bestimmung der kritischen Scherkräften ................................ 34
6.4.3
Peripherie für den automatisierten Betrieb......................................................... 34
6.4.4
Kamera und Mikroskop ...................................................................................... 37
6.4.5
Auflösungsvermögen der gewählten Komponenten .......................................... 37
6.4.6
Bewegungsunschärfe .......................................................................................... 40
6.4.7
Bildspeicherung .................................................................................................. 41
6.5
Automatisierte Bildserienanalyse .............................................................................. 41
6.5.1
Bildanalyse ......................................................................................................... 41
6.5.2
Bildserie laden .................................................................................................... 42
6.5.3
Indizierte Seriensubtraktion ............................................................................... 43
6.5.4
Bestimmung der Partikelkenndaten ................................................................... 44
6.5.5
Zuordnung der Bakterien zu den Kenndaten...................................................... 45
6.5.6
Nachbearbeitung der Zuordnung ........................................................................ 47
6.5.7
Bereitstellung des Ergebnisses ........................................................................... 47
6.6
Programm zur interaktiven Erfassung der Bewegungsmuster .................................. 48
6.7
Statistische Auswertung ............................................................................................ 49
I
Inhaltsverzeichnis
7
Ergebnisse ....................................................................................................................... 51
7.1
7.1.1
Vermessung der Medien..................................................................................... 51
7.1.2
Bestimmung der Scherkräfte .............................................................................. 52
7.1.3
Auslegung der Optik .......................................................................................... 55
7.1.4
Auslegung der Bildanalyse................................................................................. 56
7.1.5
Integration des Gesamtsystems .......................................................................... 57
7.2
8
Technische Ergebnisse .............................................................................................. 51
Ergebnisse aus den Beispielfermentationen .............................................................. 59
7.2.1
Validierung der automatischen Bildanalyse ....................................................... 59
7.2.2
Geschwindigkeit und Anzahl beweglicher Bakterien ........................................ 60
7.2.3
Bewegungsmuster der beweglichen Bakterien .................................................. 73
Diskussion ....................................................................................................................... 78
8.1
Verlauf der Fermentationen ....................................................................................... 78
8.2
Bewegungsanalyse von Bacillus amyloliquefaciens FZB42 ..................................... 82
8.3
Praxistauglichkeit des Online-Mikroskopie-Systems ................................................ 87
9
Ausblick ........................................................................................................................... 90
10
Zusammenfassung .......................................................................................................... 93
11
Verzeichnisse................................................................................................................... 94
11.1
Abkürzungen und Formelzeichen .............................................................................. 94
11.2
Tabellenverzeichnis ................................................................................................... 95
11.3
Abbildungsverzeichnis .............................................................................................. 96
11.4
Literaturverzeichnis ................................................................................................... 97
Anhang .................................................................................................................................. 108
LabVIEW-Unterprogramm „Wegverfolgung“ ................................................................... 108
Statistische Analyse von Fermentation 1............................................................................ 110
Statistische Analyse von Fermentation 2............................................................................ 111
Statistische Analyse von Fermentation 3............................................................................ 112
Statistische Analyse von Fermentation 4............................................................................ 113
Statistische Analyse von Fermentation 5............................................................................ 114
Statistische Analyse von Fermentation 6............................................................................ 115
Fermentation 6 – Verteilung der Bewegungsmuster .......................................................... 116
Fermentation 7 – Verteilung der Bewegungsmuster .......................................................... 116
Vergleich der Wandlung in Grauwerte ............................................................................... 117
II
Einführung
I
1
Bestimmung der Vitalität von Mikroorganismen durch
Online-Mikroskopie
Einführung
Die Zelldichte und Zellvitalität sind zwei Kernparameter in der Kultivierung von
Mikroorganismen. Während die Zelldichte verhältnismäßig einfach zu definieren ist und
meist in Anzahl an Zellen pro Volumeneinheit oder pro Gewichtseinheit angegeben wird, ist
die Vitalität einer Kultur ein abstrakter Parameter (Kell et al. 1990). Häufig wird als Vitalität
die Fähigkeit der einzelnen Zelle verstanden, eine Kolonie auf Nährboden zu bilden. Es sind
jedoch Zustände von Bakterien bekannt, in denen keine Koloniebildung auf Nährboden
erfolgt, jedoch weiterhin eine Zellenaktivität nachweisbar ist. Der Begriff der Vitalität von
Mikroorganismen wird von verschiedenen Quellen unterschiedlich verwendet (Davey 2011).
Viele Parameter, angefangen bei der Fähigkeit zur Zellteilung über den Nachweis von
Stoffwechselaktivitäten, den Zustand der Zellwand bis hin zur Fähigkeit der aktiven
Bewegung oder der Zellform, können zur Bewertung der Vitalität herangezogen werden. Kell
et al. (1998) differenzierten in diesem Zusammenhang die verschiedenen physiologischen
Stadien von Bakterien. Es werden zwei Modelle vorgeschlagen. In Abbildung 1 werden die
beiden Modelle veranschaulicht.
Abbildung 1: Physiologische Stadien einer Bakterienzelle
Das Kreisdiagramm (links) veranschaulicht vier wichtige physiologische Stadien von
Bakterien. Die Pfeile zeigen mögliche Übergänge zwischen den Stadien. Es gibt im
Kreisdiagramm kein Feld für nicht tödlich verletzte Zellen. Diese sind mit den vitalen
Zellen unter aktiv und kultivierbar zusammengefasst. Das Baumdiagramm (rechts) zeigt
eine experimentelle Vorgehensweise zur Einteilung der Zellen in ihre wichtigsten Stadien.
Unter selektivem Medium ist ein Medium zu verstehen, welches das Wachstum der
meisten Zellen hemmt, z.B. durch Antibiotika oder Gallensalze. Nur unverletzte Zellen
sollten sich in diesem Medium vermehren können. Der wachstumshemmende Stoff des
selektiven Mediums muss je nach Gattung gewählt werden, da einige wenige Gattungen
z.B. durch Antibiotika kaum bis nicht gehemmt werden (Kell et al. 1990) (modifiziert).
1
Einführung
Entsprechend der dargestellten Modelle werden zum einen die Zellen nach zwei
unabhängigen Parametern beurteilt: aktiv und inaktiv, sowie kultivierbar bzw. nicht
kultivierbar. Daraus ergeben sich vier Stadien, in denen sich die Zelle befinden kann. Zum
anderen können die Bakterien in fünf Kategorien eingeteilt werden: vital und unverletzt (1),
verletzt (2), ruhend (3), aktiv, aber nicht kultivierbar (4) und tot (5). Durch eine
experimentelle Vorgehensweise ist eine Einteilung der Bakterien in die fünf wichtigsten
physiologischen Stadien möglich. Zunächst wird beurteilt, ob die Zellen morphologisch intakt
erscheinen. Ist dies nicht der Fall, werden sie als tot klassifiziert. In der nächsten
Untersuchung wird die Kultivierbarkeit unter Normalbedingungen getestet. Ist eine
Vermehrung unter Normalbedingungen nicht möglich, werden die Zellen, je nachdem ob
Stoffwechselaktivität nachgewiesen wird, als „aktiv, aber nicht kultivierbar“ oder als „tot“
bestimmt. War die Kultivierung unter Normalbedingungen erfolgreich, es konnte aber keine
Stoffwechselaktivität nachgewiesen werden, wird die Zelle als „ruhend“ bezeichnet.
Ansonsten erfolgt der Versuch, die Zellen auf einem wachstumshemmenden Medium (z.B.
durch Zugabe von Gallensalzen oder Antibiotika) zu kultivieren. Ist die Kultivierung dort
erfolgreich, sind die Zellen vital und unverletzt. Ist die Vermehrung nicht möglich, werden
die Zellen als verletzt eingeordnet (Kell et al. 1990).
Über Online-Mikroskopie und automatische Bildauswertung können viele dieser Parameter in
Echtzeit erfasst werden. Bei Prozesszeiten von einigen Stunden oder Tagen können auch
Systeme mit Messintervallen von einigen Minuten als Echtzeit-Systeme bezeichnet werden.
Vor allem die Morphologie (Größe, Form) der Zellen wird unter Verwendung der
Mikroskopie häufig zur Beurteilung der Vitalität herangezogen (Pearson et al. 2003; Guez et
al. 2010). Auch die Beweglichkeit der Zellen gibt eine Aussage zur Vitalität (Grossart et al.
2001).
Häufig wird Ausplattieren und späteres Auszählen der entstandenen Kolonien zum Nachweis
und zur Quantifizierung vitaler Bakterien verwendet. Die Methode liefert jedoch erst Stunden
oder Tage nach der Probenentnahme Ergebnisse und ist damit nicht zur OnlineProzesskontrolle geeignet (Müller und Nebe-von-Caron 2010; Davey 2011).
Die Beurteilung der Vitalität ist auch mit Hilfe der Durchflusszytometrie (Enfors et al. 2001;
Davey 2011) möglich. Hierbei wird die zu untersuchende Kulturflüssigkeit bei hoher
Geschwindigkeit durch eine enge Messstelle gepumpt. An dieser Engstelle werden die Zellen
einzeln von fokussiertem Laserlicht getroffen. Je nach Messprinzip des Durchflusszytometers
wird von einem optischen Empfänger das Streulicht oder das Fluoreszenzsignal der Zelle
detektiert. Die Signale können so von etwa 1.000 Zellen s-1 erfasst werden (Abu-Absi et al.
2003). Die Intensität des Fluoreszenzsignals bzw. des Streulichtes wird für die Auswertung
des Zellzustandes herangezogen. Die Anzahl an Einzelsignalen über eine definierte Zeit lässt
Rückschlüsse auf die Zelldichte zu (Hewitt et al. 1999b; Müller und Nebe-von-Caron 2010).
Die Ergebnisse aus dem Durchflusszytometer stehen etwa 20 min nach der Probenentnahme
zur Verfügung. Der Zeitraum von Probenentnahme bis zum Messergebnis wird vor allem
durch die Probenvorbereitung bestimmt. Häufig müssen zur Bestimmung der Vitalität die
Bakterien angefärbt werden. Die Färbung kann eine Aussage über den Status der Zelle liefern.
2
Einführung
Zur Etablierung dieser Methoden sind z.B. Farbstoffe nötig, die in intakte Zellwände nicht
eindringen können. Zellen mit defekter Membran fluoreszieren daher anders als Zellen mit
funktionsfähiger Membran. Diese Marker benötigen jedoch eine definierte Einwirkdauer, was
eine längere Probenvorbereitung zur Folge hat. Zwei gängige Färbemethoden sind die
Vitalfluoreszenzmethode und die 4‘,6-Diamidino-2-phenylindol(DAPI)-Färbung (Hewitt et
al. 1999a; Abu-Absi et al. 2003; Müller und Nebe-von-Caron 2010).
Bei der Vitalfluoreszenzmethode werden die Farbstoffe Fluorescein-Diacetat (FDA) und
Ethidiumbromid verwendet. Lebende Organismen nehmen das FDA auf und wandeln es
enzymatisch zu grün fluoreszierendem Fluorescein um. Dieses reichert sich daraufhin in den
Zellen an. Bakterien mit beschädigter Zellmembran werden durch das Färbemittel
Ethidiumbromid rot eingefärbt (Netuschil 1983; Rehmer 2008). Ein anderer
Fluoreszenzmarker wird bei der DAPI-Färbung angewendet. Der Farbstoff reichert sich an
Adenin- und Thymin-reichen Regionen der Desoxyribonukleinsäure (DNA) an. Für die
Anregung wird ultraviolettes Licht (UV) verwendet. Häufig wird auch Propidiumiodid
verwendet, um tote Bakterien zu kennzeichnen. Bei UV-Anregung fluoreszieren die vitalen
Bakterien blau, während die nicht vitalen Bakterien gelb fluoreszieren (Ross et al. 1996;
Knöfel 2002; Rehmer 2008).
Zur Vitalitätsbestimmung sind durch die meist aufwändigen Probenvorbereitungen kaum
kürzere Messintervalle als 15 - 30 min realisierbar. Neben den beschriebenen optischen
Durchflusszytometern kann an der Messstelle anstelle eines Laserstrahls und eines optischen
Empfängers auch eine elektrische Spannung zum Einsatz kommen. Das Messsignal stellt in
diesem Fall die Änderung der Leitfähigkeit oder der Kapazität dar. Da sich die Leitfähigkeit
bzw. die Kapazität der Zellen von der der Kulturflüssigkeit unterscheiden, kann auf diese
Weise ebenfalls die Zelldichte ermittelt werden (Gawad et al. 2001).
Eine weitere Methode zur Bestimmung der Vitalität von Bakterien ist die elektrooptische
Messung. Der Einfluss eines elektrischen Feldes auf eine Bakteriensuspension hängt von der
Polarisierbarkeit der Zellen ab. Zusammensetzung und Struktur der Zellen haben einen
messbaren Einfluss auf ihre Polarisierbarkeit (Bunin et al. 2004). Vitale Zellen tendieren zu
einer erhöhten Polarisierbarkeit (Dalton et al. 2001). An der Messkammer wird ein
elektrisches Feld zwischen 190 und 2100 kHz angelegt und die optische Dichte bei 620 nm
gemessen. Das elektrische Feld richtet die polarisierbaren Bakterien aus. Die optische Dichte
der Suspension ändert sich je nach Ausrichtung der Bakterien. Die Änderung der optischen
Dichte ist abhängig von der Frequenz des elektrischen Feldes und liefert eine Aussage über
die Vitalität der Zellen (Junne et al. 2008; Junne et al. 2010).
Weiterhin kommen Methoden wie die Messung fokussierter Laserrückstreuung (FBRM)
(Pearson et al. 2003; Kougoulos et al. 2005; Höpfner et al. 2010) und die 3-Fold Dynamical
Optical Reflectance Measurement (3D-ORM) (Brognaux et al. 2013) für die
Qualitätskontrolle in Frage. Beide Methoden sind In-Line-Messungen in Echtzeit.
3
Einführung
FBRM liefert eine Partikelgrößenverteilung und kann Partikel ab 0,25 µm detektieren. Das
Messverfahren nutzt hierfür die Erfassung von rückwärtigem Laser-Streulicht. Hierzu wird
der Laserstrahl über eine rotierende Optik in die Suspension gestrahlt und dort reflektiert
sobald er auf einen Partikel trifft. Der Fokuspunkt bewegt sich kreisförmig durch das
Medium, das reflektierte Rückstreulicht wird von der Messsonde detektiert (Rudolph et al.
2007). Ausgewertet wird die zeitliche Länge des Reflexes bei bekannter
Bewegungsgeschwindigkeit des Lichtfleckes durch die Suspension. Durch dieses Verfahren
ist es ebenso möglich bei Bakterien eine Aussage über die Morphologie von Zellverbänden zu
treffen. Die Morphologie von einzelnen Bakterien ist jedoch nicht detektierbar (Pearson et al.
2003).
3D-ORM arbeitet ebenso wie FBRM über optische Rückstreuung. Jedoch verfügt die
verwendete Optik über eine dynamische Regulierung der Brennweite. Mit Hilfe der
rotierenden Optik sowie der dynamischen Brennweite bewegt sich der Fokuspunkt des Lasers
wie eine Spirale, nicht kreisförmig, durch das Medium (Brognaux et al. 2013). In Abbildung 2
ist der Aufbau der 3D-ORM-Sonde schematisch dargestellt.
Abbildung 2: 3-Fold Dynamical Optical Reflectance Measurement (3D-ORM)
Die 3D-ORM-Sonde erzeugt über das rotierende optische System und die dynamische
Brennweite einen spiralförmigen Fokuspunkt im Medium. Der Laser und die optische
Rückstreuung werden über einen Faserkoppler getrennt. Über einen Photomultiplier als
Detektor wird das Signal erfasst. Die Sonde wird über einen DN25-Bioreaktor-Port in das
Kulturgefäß eingebracht (Brognaux et al. 2013) (modifiziert).
Das reflektierte Signal der 3D-ORM-Sonde wird als Anzahl von Pulsen im zeitlichen
Messintervall erfasst. Aus diesem Signal kann die Zelldichte bestimmt sowie Rückschlüsse
auf die Vitalität gezogen werden. Die 3D-ORM-Sonde lässt sich über einen DN25Bioreaktor-Port in den Reaktor einführen und ist in-situ autoklavierbar (Brognaux et al.
2013).
Durch die Analyse mikroskopischer Aufnahmen ist ebenso eine Auswertung der Vitalität von
Bakterien möglich (Singh et al. 1989; Höpfner et al. 2010; Mesquita et al. 2011; Zotta et al.
2012). Etabliert sind z.B. Methoden durch Anfärben der Probe, die durch
4
Einführung
Auflichtfluoreszenzmikroskopie untersucht und bildanalytisch ausgewertet werden (Mesquita
et al. 2011; Zotta et al. 2012). Die Färbetechniken zur mikroskopischen Untersuchung
entsprechen denen der Durchflusszytometrie. Eine zum Teil aufwändige Probenvorbereitung
ist somit auch hier erforderlich.
Neben der Färbung kann die Beweglichkeit von Bakterien ein Kriterium für die Vitalität sein,
da bewegliche Bakterien weder tot noch inaktiv sind (Grossart et al. 2001). Weiterhin können
mit Hilfe der Mikroskopie zusätzliche morphologische Parameter bestimmt und für eine
genauere Untersuchung herangezogen werden. Die Bestimmung der Vitalität über
mikroskopische Aufnahmen ist oft anschaulicher und dadurch weniger abstrakt. Im Fall der
Vitalitätsbestimmung über die Beweglichkeit der Bakterien kann eine aufwändige und durch
die Farbstoffe zum Teil teure Probenvorbereitung ausbleiben.
Durchflusszytometer können z.B. von Becton Dickinson BD Biosciences (Heidelberg,
Deutschland), Beckman Coulter (Krefeld, Deutschland) und Partec (Münster, Deutschland)
bezogen werden. Eine vollautomatisierte elektrooptische Messung von Bakterienkulturen ist
mit dem Messsystem EloTrace von EloSystems (Berlin, Deutschland) durchführbar. Die
FBRM-Sonden werden von Mettler-Toledo AutoChem, Inc. (Columbia, USA) und die 3DORM-Sonden von Sequip S+E GmbH (Düsseldorf, Deutschland) vertrieben.
5
Online-Mikroskopie
2
Online-Mikroskopie
Ein Messsystem kann als „online“ bezeichnet werden, wenn das Messergebnis schon während
hinreichend kleiner Änderungen des Prozesses zur Verfügung steht und somit zur
Prozesssteuerung eingesetzt werden kann. Dies wird häufig auch als Echtzeit bezeichnet.
Weiterhin werden unter dem Begriff Online-Messsysteme vollautomatisierte Messsysteme
verstanden (MacLennan und Kowalski 1996). Mikroskopie-Systeme mit automatisierter
Probenentnahme können daher als Online-Messsysteme bezeichnet werden, sobald sie über
eine zeitnahe automatische Bildauswertung verfügen. Bei einem In-Situ-Messsystem sind
keine Probenentnahmen notwendig, sondern die Messung erfolgt direkt im Medium.
2.1
In-Situ-Mikroskopie
Die In-Situ-Mikroskopie ist eine Methode zur direkten Aufnahme mikroskopischer Bilder aus
dem Inneren des Bioreaktors (Thomas und Paul 1996; Bluma et al. 2010; Höpfner et al.
2010). Da keine Probenentnahmen notwendig sind, wird die sterile Barriere des Bioreaktors
zu keiner Zeit durchbrochen. Die Möglichkeit, den Reaktor mit allen nötigen Einbauten zu
autoklavieren, ist ebenso gegeben. Es sind zwei verschiedene Verfahren der In-SituMikroskopie beschrieben, einmal mit theoretischem Probevolumen (Suhr et al. 1995) und
einmal mit mechanisch definiertem Probevolumen (Bittner et al. 1998). In der ersten Variante
wird über den Fokus des Mikroskops ein theoretisches Probevolumen errechnet und nur
Zellen erkannt, die sich in einem definierten Schärfebereich befinden (Suhr et al. 1995;
Camisard et al. 2002). Die Variante mit mechanisch definiertem Probevolumen benötigt meist
ein mechanisch bewegtes Teil innerhalb der Konstruktion. Beispielsweise wird die
Beleuchtung des In-Situ-Mikroskops bewegt, um ein Probevolumen zwischen Beleuchtung
und Objektiv zu fixieren (Bittner et al. 1998).
Ein Beispiel für ein In-Situ-Mikroskop mit theoretischem Probevolumen ist das In-SituAuflichtfluoreszenzmikroskop von Suhr et al. (1995) (siehe Abbildung 3). Hier findet als
Beleuchtung ein gepulster Laser mit einer Wellenlänge von 337 nm Anwendung. Er wird
durch einen 45°-Interferenzspiegel reflektiert. Für das Fluoreszenzsignal bei 450 nm ist der
Spiegel durchlässig (dichroitischer Spiegel). Mit einem solchen Mikroskop kann
interzelluläres NADH und NADPH sichtbar gemacht werden. Das Fluoreszenzsignal ergibt
sich aus der Summe beider Stoffe, da diese im selben Bereich angeregt werden (Chance
1979). Ein definiertes Probevolumen ist nötig, um die Zellkonzentration zu bestimmen.
Hierzu wird die Schärfeebene des Mikroskops genutzt. Die Bildverarbeitung rechnet
unscharfe Objekte heraus, was zu einem theoretisch definierten Probevolumen führt. Eine
Kalibrierung mit Standard-Suspensionen ist notwendig (Suhr et al. 1995).
6
Online-Mikroskopie
Abbildung 3: In-Situ-Auflichtfluoreszenzmikroskop mit theoretischem Probevolumen
Das dargestellte In-Situ-Auflichtfluoreszenzmikroskop (Fluoreszenz-Absorptionswellenlänge(ex): 337 nm, Fluoreszenz-Emissionswellenlänge(em): 450 nm) arbeitet mit einem
theoretischen Probevolumen. Über einen Interferenzspiegel wird die Beleuchtung
eingekoppelt. Das von der Probe emittierte Licht passiert in die entgegengesetzte Richtung
den Interferenzspiegel und wird über einen weiteren Spiegel und einen Bandpassfilter auf
die CCD-Kamera abgebildet. Der Fokus kann mit einer Mikrometerschraube manuell
justiert werden (Suhr et al. 1995; Bluma et al. 2010) (modifiziert).
Ein mechanisch definiertes Probevolumen erfordert einen komplexeren Aufbau des
Mikroskops sowie einen tieferen Einbau in den Behälter. In Abbildung 4 ist die Skizze des InSitu-Mikroskops von Bittner et al. (1998) dargestellt. Die Beleuchtungseinheit ist hierbei
beweglich und fixiert über eine Silikonmembran das Probevolumen unter dem Deckglas. Die
Schärfeebene kann auch hier manuell mit einer Mikrometerschraube eingestellt werden.
Für längere Fermentationen ist es sinnvoll, eine Reinigungsmöglichkeit für das Mikroskop
vorzusehen. Besonders bei In-Situ-Mikroskopen mit mechanisch definiertem Probevolumen
kann eine starke Verschmutzung der Deckgläser zu Störungen führen. Frerichs (2000)
integrierte in seiner Arbeit das Intrac®-System von Mettler-Toledo (Gießen) in ein In-SituMikroskop. Mit dieser Technik ist die Reinigung des Proberaums des Mikroskops während
des Prozesses möglich. Bei sachgemäßer Verwendung wird die sterile Barriere des
Bioreaktors zu keiner Zeit verletzt. Die Reinigungsmöglichkeit erlaubt somit den
durchgängigen Betrieb des In-Situ-Mikroskops.
7
Online-Mikroskopie
Abbildung 4: In-Situ-Mikroskop mit mechanisch definiertem Probevolumen
Die Beleuchtungseinheit mit Kondensor ist bei diesem In-Situ-Mikroskop beweglich. Zur
Bildaufnahme fährt der Kondensor nach oben. An dessen Rand befindet sich eine
Silikonmembran. Bei der Aufwärtsbewegung des Kondensors wird das Probevolumen
zwischen Kondensor und Deckglas eingeschlossen. Die Probe ist somit nicht mehr der
Strömung ausgesetzt und kann ruhend aufgenommen werden. Über einen Spiegel wird die
Objektebene auf die CCD-Kamera abgebildet. Der Fokus kann über eine
Mikrometerschraube manuell eingestellt werden (Bittner et al. 1998; Bluma et al. 2010)
(modifiziert).
Eine Weiterentwicklung dieses Mikroskops wird von Frerichs (2002) und Joeris (2002)
beschrieben. Neben der automatischen Reinigungsmöglichkeit verfügt dieses In-SituMikroskop über eine mittels Motor verstellbare Schärfeebene. Weiterhin lässt sich die
Schichtdicke des Proberaums mit Hilfe eines weiteren Motors verstellen (Höpfner et al.
2010). Eine weitere Optimierung dieses Mikroskops wird in der Arbeit von Prediger (2013)
präsentiert. Die Genauigkeit der Motoren sowie die Abbildungstreue wurden hier verbessert.
Kommerziell erhältliche In-Situ-Mikroskope sind das Particle Vision Microscope (PVM
V819) von Mettler-Toledo (Columbia, USA), Particle Image Analysis (PIA) von Sequip S+E
GmbH (Düsseldorf, Deutschland) und EnviroCam von EnviroCam Inc. (Colmar, USA) (siehe
Tabelle 1).
8
Online-Mikroskopie
Tabelle 1: Übersicht von kommerziell verfügbaren In-Situ-Mikroskopen
Die Tabelle zeigt eine Übersicht über die kommerziell verfügbaren In-Situ-Mikroskope.
PVM V819 von Mettler-Toledo (Columbia, USA), EnviroCam von EnviroCam Inc.
(Colmar, USA) und PIA von Sequip S+E GmbH (Düsseldorf, Deutschland). Bei allen drei
In-Situ-Mikroskopen kann der Sondenkopf durch Dampf sterilisiert werden. Weiterhin ist
bei keinem eine manuelle Fokussierung der Schärfeebene notwendig.
PVM V819
Beleuchtung
Auflösungsgrenze
Bildbereich
veröffentlichte
Anwendungen
Auflicht
2 µm
1075 x 825 µm
Kristallisation
(Barrett und
Glennon 2002;
Duffy et al. 2012)
Umkristallisation
(O'Sullivan et al.
2003; O'Sullivan
und Glennon
2005)
EnviroCam
Durchlicht oder
Auflicht
4 bis 30 µm
2048 x 2048 µm
bis 15 x 15 mm
Größenverteilung
von Luftblasen im
Fermenter (Junker
et al. 2007)
PIA
Durchlicht
1 bis 10 µm
3586 x 2690 µm
Kristallisation
(Qu et al. 2006)
Die genannten In-Situ-Mikroskope werden alle über einen Standard-Stutzen in den Bioreaktor
eingebracht, ähnlich einer pH-Sonde. Weiterhin ist es möglich, durch ein Sichtfenster die
Flüssigkeit in einem Reaktor mit einem In-Situ-Mikroskop zu untersuchen, ohne eine
zusätzliche Sonde einzubringen. Kougoulos et al. (2005) stellen in ihrer Arbeit eine
Möglichkeit des „Process Video Imaging“ (PVI) vor. Hierbei wird mit einem
Videomikroskop durch ein Sichtfenster das Innere des Reaktors beobachtet. Die Beleuchtung
findet durch ein Stroboskop ebenso von außen statt. Da die verhältnismäßig großen
Sichtfenster stabiler sein müssen als die Saphirscheiben der eingebauten In-Situ-Mikroskope
ist nur eine geringe Vergrößerung möglich.
Die von Voss et al. (2012) entwickelte Immersions-Optik für die horizontale OnlineMikroskopie kann ebenso an einem Sichtfenster eines Bioreaktors integriert werden. Durch
die Wasserimmersion ist eine höhere Vergrößerung möglich. Die Immersions-Optik sorgt für
einen durchgehenden Wasserfilm zwischen Scheibe und Objektiv. Eine vereinfachte
Darstellung der Immersions-Optik ist in Abbildung 5 gegeben.
9
Online-Mikroskopie
Abbildung 5: Immersions-Optik für die horizontale Online-Mikroskopie
Ein Wasserfilm wird durch die Injektion kleiner Mengen an Wasser zwischen einem
Sichtfenster eines Bioreaktors und einem Mikroskop-Objektiv erzeugt. Die überschüssige
Menge an Wasser wird kontinuierlich abgesaugt (Voss et al. 2012) (modifiziert).
Durch den Wasserfilm kommt es zu einer geringeren Brechung als an der Glas-Luft-GlasGrenze (𝑛𝐺𝐺𝐺𝐺 = 1,46, 𝑛𝐿𝐿𝐿𝐿 = 1,00), da die Differenz der Brechungsindizes an einer GlasWasser-Glas-Grenze (𝑛𝑊𝑊𝑊𝑊𝑊𝑊 = 1,33) deutlich geringer ist. Hierdurch kann eine größere
Apertur und damit eine bessere Auflösung bei großem Objektabstand, der durch das dicke
Sichtfenster bedingt ist, erlangt werden.
Die In-Situ-Mikroskopie hat erhebliche Vorteile gegenüber einer Online-Mikroskopie, die
eine Probenentnahme erfordert. Jedoch sieht die Variante mit theoretischem Probevolumen
keine Fixierung des Mediums vor. Somit ist keine Nachverfolgung von aktiven Bewegungen
der einzelnen Organismen möglich. Außerdem wird über den theoretischen Schärfebereich
eine hohe Schichtdicke von etwa 7 – 10 µm (Suhr et al. 1995; Camisard et al. 2002)
notwendig. Die Variante mit mechanisch definiertem Probevolumen sieht zwar eine Fixierung
der Probe vor, die Schichtdicke bei der beschriebenen Ausführung (Bittner et al. 1998) ist
jedoch mit 10 µm ebenso zu hoch für eine exakte Verfolgung von kleinen beweglichen
Mikroorganismen wie Bakterien.
In der Literatur sind Anwendungen der In-Situ-Mikroskope bei Hefezellen (Suhr et al. 1998;
Belini et al. 2013), mikroskopischen Partikeln (z.B. Gipskristalle) (Suhr 2004; Qu et al.
2006), Luftblasen (Junker et al. 2007) sowie tierischen Zellen (Joeris et al. 2002; Guez et al.
2004; Guez et al. 2010; Wiedemann et al. 2011) beschrieben. Die bisherigen Anwendungen
mit In-Situ-Mikroskopen zeigen passiv strömende Partikel. Eine aktive Eigenbewegung wird
nicht verfolgt. Aussagen zur Vitalität können somit lediglich aus der Morphologie, jedoch
nicht aus der Beweglichkeit gezogen werden.
10
Online-Mikroskopie
2.2
Durchfluss-Mikroskope:
Neben der In-Situ-Mikroskopie gibt es Verfahren der Online-Mikroskopie mit automatischer
Probenentnahme (Ren et al. 1994) oder im Bypass-Betrieb. Die Durchflussküvetten stellen für
diese Anwendungen das Kernstück dar und haben Schichtdicken zwischen 20 und 400 µm
(Berg und Block 1984; Ren et al. 1994; Gast et al. 2006).
Durchflussküvetten für Mikroskope finden Anwendung bei Lebendpräparaten von Geweben
und Biofilmen. Hierbei ist das Gewebe oder der Biofilm an der Durchflusskammer fixiert und
wird ständig von Nährmedium überspült. Das Nährmedium wird mit einer Peristaltikpumpe
durch die Durchflusskammer gefördert. Die Online-Mikroskopie der Gewebeprobe oder des
Biofilms ist durch dieses System über einen längeren Zeitraum möglich.
Systeme mit automatisierter Probenentnahme bieten häufig zusätzlich die Möglichkeit zur
automatisierten Probenvorbereitung, z.B. zum Verdünnen oder Anfärben der Probe (Ren et al.
1994; Zalewski und Buchholz 1996; Akin et al. 2011). Die Kernkomponenten sind
schematisch in Abbildung 6 dargestellt.
Abbildung 6: Schema eines Systems zur Online-Mikroskopie mit Durchflussküvette
Vereinfachtes Schema eines typischen Systems zur Online-Mikroskopie mit einer
Durchflussküvette. Die Kernkomponenten sind: automatische Probenentnahme,
Probenvorbereitung, Durchflussküvette und Mikroskop. Zu einem Online-MikroskopieSystem gehört zudem die nachgeschaltete automatische Bildauswertung, die hier jedoch
nicht dargestellt ist.
In der Arbeit von Rehbock et al. (2010) wird die Entwicklung einer Durchflussküvette für ein
In-Situ-Mikroskop erläutert. Durch diese Küvette ist das beschriebene In-Situ-Mikroskop
nicht nur für den In-Situ-Betrieb an einem 25 mm Stutzen, sondern auch für den BypassBetrieb mit einer Durchflussküvette geeignet. Viele Durchflussküvetten sind jedoch zum
Einsatz auf einem herkömmlichen Mikroskop konzipiert (Berg und Block 1984; Ren et al.
1994; Meinhart et al. 1999; Gast et al. 2006).
Durchflusssysteme für Lebendpräparate können z.B. von IBI SCIENTIFIC (Peosta, USA)
und Bioptechs Inc. (Butler, USA) bezogen werden. Durchflussküvetten zur Untersuchung von
11
Online-Mikroskopie
Suspensionen werden z.B. von GeSiM Gesellschaft für Silizium-Mikrosysteme mbH
(Großerkmannsdorf, Deutschland) vertrieben (Gast et al. 2006). Weiterhin gibt es einige
kommerziell erhältliche Partikelanalysatoren, die Komplettsysteme aus Durchflussküvette,
Probenentnahmesystem, Bildaufnahme und Bildanalyse anbieten z.B. Particle Metrix GmbH
(Meerbusch, Deutschland), Sympatec GmbH (Clausthal-Zellerfeld, Deutschland) und Occhio
SA (Angleur, Belgien).
2.3
Bildverarbeitung
Sowohl die In-Situ-Mikroskope als auch die Durchfluss-Mikroskope werden erst durch eine
automatische Bildverarbeitung zu einem Online-Mikroskop. Die Bildverarbeitung kann
hierbei entweder im Computer, in speziellen Parallelrechnern (Transputer) oder direkt in
intelligenten Kameras ausgeführt werden. Durch die Leistungsfähigkeit moderner Computer
wird die Bildverarbeitung heute häufig direkt im Computer ausgeführt. Sowohl Programme
als auch Hardware zur Entwicklung von Bildverarbeitungsalgorithmen sind in vielfacher
Ausführung am Markt erhältlich.
Die Bildverarbeitungslösungen im Bereich der Partikelanalyse laufen meist nach einem
ähnlichen Schema ab. Zunächst werden die Bilder in einer Vorverarbeitung optimiert. Hierbei
werden z.B. Bildrauschen und Hintergrund eliminiert. Anschließend werden die
interessierenden Details hervorgehoben, bevor eine Binarisierung der Bilder durchgeführt
wird. Die Merkmalsextraktion wie z.B. Partikelgröße, Homogenität und Form findet
anschließend aus dem Binärbild statt.
Zalewski und Buchholz (1996) beschreiben ein System, in dem die Zellkonzentration und die
Morphologie von Hefe ermittelt werden. Die erfassten Klassen im Sinne der Morphologie
beinhalten: Einzelzellen, Doppelzellen, Tetrade sowie Zellhaufen jeweils mit und ohne
Einschlüsse (z.B. Vakuolen). Es handelt sich um eine Anwendung eines DurchflussMikroskops. Die Bildverarbeitung wird auf einem Transputer durchgeführt und das Ergebnis
wird an einen Computer übermittelt. Als Vorverarbeitung kommt eine Kantenschärfung zum
Einsatz und über einen Filter werden kleine Lücken in den Kanten geschlossen. Anschließend
werden geschlossene Objekte aufgefüllt und eine Binarisierung des Bildes wird
vorgenommen. Aus dem entstandenen Binärbild werden die Merkmale extrahiert. Auch bei
anderen Bildverarbeitungsanwendungen mit Hefen kommen zur Vorverarbeitung häufig
Algorithmen zur Kantenschärfung zum Einsatz (Rehbock et al. 2010; Akin et al. 2011), z.B.
Canny-Algorithmus (Canny 1986).
Es sind eine ganze Reihe weiterer Online-Mikroskopieanwendungen für Hefen veröffentlicht.
Die Ermittlung der Zelldichte steht hierbei oftmals im Vordergrund (Suhr et al. 1995; Akin et
al. 2011). Untersucht wird aber auch die Größenverteilung (Camisard et al. 2002; Belini et al.
2013) und die Morphologie (Zalewski und Buchholz 1996; Bittner et al. 1998; Rehbock et al.
2010). Auf die Vitalität der Hefen kann man aus der Größenverteilung, vitale Zellen sind
größer (Belini et al. 2013), und aus der Morphologie (Pons et al. 1993) schließen.
12
Online-Mikroskopie
Die Online-Bestimmung der Zellkonzentration während der Kultivierung von Säugerzellen
wird von Guez et al. (2004) beschrieben. Es wird hier ein In-Situ-Mikroskop mit
Durchlichtbeleuchtung eingesetzt. Die Bildverarbeitung wird direkt auf dem Computer
ausgeführt. Auch in dieser Anwendung werden zunächst die Kanten hervorgehoben, bevor
eine Binarisierung durchgeführt wird. Nach der Binarisierung sucht ein spezieller
Algorithmus (Hough-Transformation nach Hough (1962)) nach runden Objekten, die
anschließend gezählt und vermessen werden. In weiterführenden Arbeiten wird neben der
Zelldichte auch die Messung der Vitalität der Zellen über Online-Mikroskopie diskutiert
(Guez et al. 2010; Wiedemann et al. 2011). Eine vollautomatische Bildanalyse zur
Bestimmung der Vitalität von Säugerzellen wurde bereits von Tucker et al. (1994) präsentiert.
Die Probenentnahme und Vorbereitung wurde hier jedoch noch manuell vorgenommen.
Junker et al. (2007) beschreiben einen Bildverarbeitungsalgorithmus zur Online-Bestimmung
einer Größenverteilung von Luftblasen. Zum Einsatz kommt hier ein In-Situ-Mikroskop von
EnviroCam Inc. (Colmar, USA). Häufig wird zur Elimination des Hintergrundes vor der
Bestimmung der Objekte eine Aufnahme ohne Partikel durchgeführt und diese vom
aufgenommenen Βild subtrahiert. Die Beleuchtungsbedingungen (Fremdlicht), der
Verschmutzungsgrad und der Fokus (leichte Vibrationen) können während der Messdauer
variieren. Daher ist es bei längeren Messungen schwer, ein durchgehend gutes Ergebnis mit
der Subtraktion eines Hintergrundbildes zu erhalten. Aus diesem Grund wird hier das
Hintergrundbild aus dem Durchschnitt von 500 Aufnahmen immer wieder neu generiert. Dies
ermöglicht eine stabile Subtraktion vom aktuellen Durchschnittshintergrund. Der weitere
Ablauf der Bildverarbeitung ist dem der bereits beschriebenen Anwendungen ähnlich: nach
der Kantenschärfung findet die Binarisierung mit anschließender Merkmalsextraktion statt.
13
Bewegung von Bakterien
3
Bewegung von Bakterien
Neben der Morphologie und dem Zustand der Zellwand (Anfärben) ist auch durch die
Eigenbewegung der Zellen eine Aussage zur Vitalität möglich. Eine Vielzahl von
beweglichen Bakterienstämmen wie z.B. Escherichia coli und Bacillus subtilis haben eine
hohe Relevanz als Produktionsstämme in Industrie und Forschung, wodurch eine Aussage zur
Vitalität von eminenter Bedeutung ist.
Durch Vermehrung ist grundsätzlich allen Bakterien eine verhältnismäßig langsame
Fortbewegung möglich. Es werden sechs Fortbewegungsarten von Bakterien unterschieden:
Verbreiten (sliding, spreading), Stechen (darting), Gleiten (gliding), Kriechen (twitching),
Schwimmen (swimming) und Schwärmen (swarming) (Henrichsen 1972; Mattick 2002;
Harshey 2003) Verbreiten (sliding, spreading) ist keine aktive Bewegung der einzelnen Zelle,
sondern ein Schieben der Koloniefront. Die Ausbreitungsgeschwindigkeiten liegen zwischen
0,03 und 6 µm s-1 (Harshey 2003). Beim Stechen (darting) breitet sich die Kolonie ähnlich
wie beim Verbreiten aus, es gibt jedoch keine geschlossene Kolonie, sondern immer wieder
sind zufällig verteilte freie Flächen zwischen der Ausbreitungsfläche der Kolonie (Henrichsen
1972). Unter Gleiten (gliding) versteht man eine gleichmäßige axiale Bewegung der Zelle.
Typische Geschwindigkeiten bewegen sich zwischen 0,025 und 0,1 µm s-1, Spitzenwerte bis
zu 10 µm s-1 erreichen Cyanobakterien (Blaualgen) (Harshey 2003). Beim Kriechen
(twitching) handelt es sich um ein ruckartiges Gleiten. Die Bakterien bewegen sich hier mit
Hilfe von Fimbrien: es sind dünne Fädchen, die etwa einen Durchmesser von 6 nm aufweisen
und bis zu 4 µm lang sein können (Harshey 2003). Die Geschwindigkeit beträgt zwischen
0,06 und 0,3 µm s-1 (Mattick 2002). Schwimmen (swimming) und Schwärmen (schwarming)
sind nur bei begeißelten Bakterien zu beobachten. Schwärmen ist eine kollektive
Gruppenbewegung. Typische Ausbreitungsgeschwindigkeiten liegen bei 2 bis 10 µm s-1
(Harshey 2003). Schwimmen und Schwärmen existieren nebeneinander.
Online kann die Vitalität der Bakterienkultur nur aus der schnellen und aktiven
Bewegungsform des Schwimmens geschlossen werden. Betrachtet man die Geschwindigkeit
des individuellen Bakteriums, ist Schwimmen die schnellste Fortbewegungsform.
Geschwindigkeiten über 40 µm s-1 sind hier leicht möglich (Harshey 2003).
Die Fortbewegung beim Schwimmen der Bakterien wird durch Geißeln (Flagellen)
ermöglicht (Berg und Anderson 1973). Die Menge und Anordnung der Geißeln unterscheidet
sich zum Teil erheblich (Schmitt 1972). Die Geißel stellt im Prinzip einen Mikromotor dar,
wobei sie selbst den Rotor, die Zellwand samt Membran den Stator bildet (Silverman und
Simon 1974; Berg 2003)
Das Geißelfilament ist etwa 5 – 10 µm lang und sein Durchmesser beträgt 18 – 20 nm. Die
Filamente sind flexibel und bilden die Form einer Helix. Für die Bakterien stellen sie somit
einen schraubenförmigen Propeller dar (Jarosch 1967; Schmitt 1997; Macnab 2003). Die
Frequenz eines Geißelbündels von Streptococcus wurde von Lowe et al. (1987) gemessen.
Hierbei wurden sowohl eine Temperatur- als auch eine Viskositätsabhängigkeit der Drehzahl
14
Bewegung von Bakterien
festgestellt. Die Frequenz des Bündels beträgt bei Streptococcus etwa 3.000 U min-1 bei 10 °C
und steigt linear auf etwa 12.000 U min-1 bei 42 °C an.
Beim Bewegungsablauf einiger peritrich begeißelten Bakterien wie Salmonella, Escherichia
und Bacillus wurde ein ähnliches Bewegungsmuster erkannt. Phasen des axialen GeradeausSchwimmens werden immer wieder unterbrochen durch Taumeln (tumbles) der Zellen. Durch
dieses Taumeln kann eine Richtungsänderung vorgenommen werden (Berg und Brown 1972;
Macnab und Ornston 1977). In Abbildung 7 ist ein typischer Bewegungsablauf dargestellt.
Abbildung 7: Wechsel zwischen Bewegungsphasen von peritrich begeißelten Bakterien
Die folgenden Bewegungsphasen wurden bei Salmonella beobachtet. Das Bakterium
schwimmt mithilfe eines Geißelbündels zunächst geradeaus (a). Durch Umkehren der
Drehrichtung der Geißeln kann das Bündel aufgelöst werden und die Bakterie taumelt (b,
c). Nach dem Richtungswechsel der Zelle orientieren sich die Geißeln neu (d) und
schließlich stellt sich wieder ein Bündel ein (e) (Macnab und Ornston 1977) (modifiziert).
In den Bewegungsabläufen von Bakterien sind sich regelmäßig wiederholende Muster zu
erkennen. Bei 2D-Wegverfolgungs-Experimenten von Salmonella konnten von Macnab und
Ornston (1977) typische Abstände zwischen Taumeln und Schwimmen ermittelt werden.
Weiterhin wurden signifikante Unterschiede in den Bewegungsmustern verschiedener
Stämme festgestellt und der Einfluss der Viskosität auf die Geschwindigkeit und die
Bewegungsmuster untersucht. In hochviskosen Medien kommt das Taumeln erheblich
seltener vor. Charakteristische Schwimmmuster konnten weiterhin bei vielen anderen
beweglichen Bakterienstämmen beobachtet werden, z.B. Vibrio alginolyticus (Kudo et al.
2005), B. subtilis (Mendelson et al. 1999) und E. coli (Ping 2012).
In 3D-Wegverfolgungs-Experimenten von Pseudomonas aeruginosa fanden Vater et al.
(2014) wiederholende Bewegungsabläufe im dreidimensionalen Raum. Eine Klassifikation in
fünf charakteristische Schwimmmuster war damit möglich. In 3D-Wegverfolgungen von E.
coli unterschieden Wu et al. (2006) die charakteristischen Schwimmmuster von drei Stämmen
15
Bewegung von Bakterien
(RP437, RP9535, RP1616). Ebenso wurde der Einfluss von Oberflächen auf die 3DSchwimmmuster von E. coli gezeigt (Frymier et al. 1995; Vigeant und Ford 1997).
Bakterien mit der Fähigkeit zu schwimmen haben die Möglichkeit, sich schneller
auszubreiten und neue Nährstoffregionen zu erschließen als unbewegliche Bakterien. Hierbei
können sie sich nicht nur zufällig durch das Medium bewegen, sondern verfügen unter
anderem über die Fähigkeit, Nährstoffgradienten bzw. Nährstoffquellen zu folgen (Berg und
Brown 1972; Miller und Koshland 1977; Barbara und Mitchell 2003). Der Nachteil des hohen
Energieverbrauchs durch die Bewegung (Grossart et al. 2001) wird in vielen Umgebungen
durch den Vorteil der Erschließung neuer Nährstoffquellen ausgeglichen.
In Tabelle 2 ist eine Übersicht über typische Schwimmgeschwindigkeiten beweglicher
Bakterien zu sehen. Die Geschwindigkeiten liegen meist zwischen 20 µm s-1 und 80 µm s-1.
Tabelle 2: Bekannte Schwimmgeschwindigkeiten von Bakterien
Angegeben sind eine Reihe bekannter Schwimmgeschwindigkeiten von beweglichen
Bakterien in flüssigen Medien. Es werden Quellen, untersuchte Bakterienart und der
ermittelte Geschwindigkeitsbereich aufgezeigt. Trotz großer Abweichungen in den
Versuchsdurchführungen (z.B. Medium, Temperaturbereich) lässt sich in den Ergebnissen
gut die Größenordnung der Schwimmgeschwindigkeiten von Bakterien erkennen.
Quelle
Bakterienart
Geschwindigkeit [µm s-1]
(Grossart et al. 2001)
Meerwasserbakterien
10 bis 500 , typisch 100
(Schmitt 1972)
Vibrio comma
Bacillus, Proteus und
Enterobakterien
Bacillus brevis
Escherichia coli und
Salmonella typhimurium
Bacillus subtilis
bis 200
(Schmitt 1972)
(Shoesmith 1960)
(Harshey 2003)
(Mendelson et al. 1999)
typisch 50
6 bis 32
bis 40
76 bis 116
(Lowe et al. 1987).
Streptococcus
(Magariyama et al. 1994;
Vibrio alginolyticus
Magariyama et al. 2005)
Shewanella putrefaciens
(Barbara und Mitchell
und Pseudoalteromonas
2003)
haloplanktis
(Shigematsu et al. 1995) Vibrio cholerae
10 bis 30
(Shigematsu et al. 1995)
Pseudomonas aeruginosa
51 ± 8
(Harwood et al. 1989)
Pseudomonas putida
bis 75, typisch 44
(Karim et al. 1998)
Campylobacter jejuni
29 bis 53
(Karim et al. 1998)
Heliobacter pylori
12 bis 29
(Karim et al. 1998)
Escherichia coli
8 bis 18
50 bis 160
bis 440, typisch 100
75 ± 9
16
Bewegung von Bakterien
Chemotaxis, speziell Aerotaxis (Folgen von Sauerstoffgradienten) von Bakterien wurde
erstmals 1881 beschrieben und in den vergangenen Jahrzehnten ausgiebig untersucht. Neben
der Chemotaxis wies Maeda et al. (1976) bei Bakterien auch Thermotaxis (Folgen von
Temperaturgradienten) nach. Phototaxis (Folgen von Lichtgradienten) konnte Glagolev
(1980) nachweisen. Viele Bakterien können sich somit durch aktive Bewegung in ein Gebiet
mit besseren Umweltbedingungen bewegen bzw. von Gebieten mit schlechteren Bedingungen
wegbewegen (Adler 1966; Berg 1975).
Erst durch diese Fähigkeit bringt die Beweglichkeit von Bakterien einen evolutionären
Vorteil, da in einem homogenen Medium die Energieaufnahme von Bakterien durch eine
aktive Bewegung nicht signifikant verbessert wird (Berg und Purcell 1977). Die Fähigkeit,
Reizen wie Lockmitteln zu folgen bzw. vor Schreckmitteln (Repellent) zurückzuweichen,
zeigt die Wahrnehmungsfähigkeit von Bakterien. Die Rezeptoren der Bakterien und ihr
Einfluss auf den Geißelmotor ist Schwerpunkt vieler Untersuchungen (Macnab und Koshland
1972; Berg und Purcell 1977; Miller und Koshland 1977; Glagolev 1980; Zhang und Phillips
2003).
Durch Chemotaxis, Thermotaxis und Phototaxis ist es den beweglichen Bakterien möglich,
die Umgebung mit der für sie besten Energieversorgung zu finden und sich dort anzusammeln
(Adler 1966; Berg und Purcell 1977). In homogen gemischten Medien zeigen die Bakterien
kein gerichtetes Bewegungsmuster. Geradeaus-Schwimmen wird immer wieder von einem
Wechsel der Richtung unterbrochen (Macnab und Koshland 1972).
Die Bewegung von Bakterien wurde in zahlreichen Studien untersucht. Häufig werden die
Bewegungen der Bakterien in speziellen Küvetten unter dem Mikroskop zweidimensional
verfolgt. Barbara und Mitchell (2003) veröffentlichten in einer Studie, wie Shewanella
putrefaciens und Pseudoalteromonas haloplanktis eine bewegliche Alge (Pavlova lutheri)
verfolgen. Ähnliche Systeme kamen zum Einsatz zur Bewegungs- und
Geschwindigkeitsanalyse von Pseudomonas putida (Harwood et al. 1989), Vibrio cholerae
und Pseudomonas aeruginosa (Shigematsu et al. 1995), Vibrio alginolyticus (Magariyama et
al. 2005) und auch anderer Mikroorganismen wie z.B. von Protisten (Beveridge et al. 2010).
Weiterhin wurden zahlreiche 3D-Wegverfolgungssysteme entwickelt. Ein Messsystem zur
3D-Verfolgung einer einzelnen Zelle wurde bereits von Berg (1971) veröffentlicht. Andere
Systeme zur parallelen Verfolgung mehrere Zellen im dreidimensionalen Raum folgten z.B.
von E. coli (Wu et al. 2006) und Pseudomonas aeruginosa (Vater et al. 2014).
Jedoch ist keines der genannten Systeme geeignet, die Bewegungsgeschwindigkeit online
auszuwerten, um diese als Vitalitätsparameter zur Prozessverfolgung einzusetzen. Ein solches
System benötigt eine automatisierte Probenentnahme und Probenvorbereitung sowie eine
daran angeschlossene Durchflussküvette. Weiterhin ist eine automatische Bildaufnahme und
Bewegungsverfolgung der Zellen notwendig. Mit Messintervallen von etwa 15 min könnte
die Bewegung von Bakterien so als Parameter der Vitalität während des Prozesses zum
Monitoring herangezogen werden.
17
Einleitung
II Bewegungsanalyse von Bacillus amyloliquefaciens
4
Einleitung
Hersteller biotechnologischer Produkte sehen sich immer stärker unter Druck, Qualität und
Sicherheit ihrer Produkte nachzuweisen. Zum einen fordern die Kunden häufiger ein
ausführliches Qualitätsmanagement, zum anderen gilt es, die Verordnungen wie z.B. die der
U.S. Food and Drug Administration (FDA) zu erfüllen. Aus diesem Grund besteht großes
Interesse an neuartigen Überwachungsmöglichkeiten der Zellvitalität und Zelldichte. In den
letzten Jahren kam es daher zu diversen Entwicklungen in diesem Bereich (Brognaux et al.
2013; Höpfner et al. 2010; Müller und Nebe-von-Caron 2010). Die großtechnische
Kultivierung von Bacillus amyloliquefaciens FZB42 (ABiTEP GmbH, Berlin) ist von dieser
Entwicklung ebenso betroffen wie viele andere Bioprozesse. Die Kunden der ABiTEP GmbH
erwarten eine gleichbleibende Qualität der Produkte. Vitalität und Zelldichte der Bakterien im
Verlauf der Fermentation sind hierfür von entscheidender Bedeutung.
Entdeckt wurde B. amyloliquefaciens 1943 von Fukomoto (1943a; 1943b). Zunächst galt es
jedoch meist als Unterart von B. subtilis. 1987 konnten Priest et al. (1987) das Bakterium
unter der Bezeichnung B. amyloliquefaciens sp. nov. nom. rev. als eigenständige Spezies
identifizieren. Der Name stammt von seiner starken α-Amylase-Produktion ab. Er setzt sich
zusammen aus den Worten „amylo“ (Amylose / Stärke) und „liequefaciens“ (verflüssigend).
Näher betrachtet wird hier B. amyloliquefaciens FZB42, das als Unterart B. amyloliquefaciens
subsp. plantarum subsp. nov. klassifiziert ist (Borriss et al. 2011). Der Stamm wurde aus einer
mit Pflanzenschädlingen infizierten Bodenprobe isoliert (Krebs et al. 1998). Die ABiTEP
GmbH stellt die Sporen von B. amyloliquefaciens FZB42 großtechnisch her und verwendet
diese in ihrem biologischen Bodenhilfsstoff RhizoVital® 42. Die für Pflanzen
wachstumsfördernden Eigenschaften sowie die Unterdrückung von pflanzenschädigenden
Organismen durch B. amyloliquefaciens wurden in mehreren Studien nachgewiesen (Krebs et
al. 1998; Idriss et al. 2002; Idris et al. 2007; Chen et al. 2009). B. amyloliquefaciens FZB42
ist peritrich begeißelt und dadurch in der Lage, frei zu schwimmen. Da nur lebende Bakterien
in der Lage sind zu schwimmen, ist die Analyse der Bewegungsfähigkeit in Hinblick auf die
Vitalität und Aktivität von großem Interesse.
Es sind verschiedene Bewegungsabläufe von Bakterien bekannt. Das Random-Walk-Model
(Berg und Brown 1972), das vor allem bei peritrich begeißelten Bakterien vorherrscht sowie
die Run-and-Revers-Strategy (Barbara und Mitchell 2003), die vor allem bei polar
begeißelten Meerwasserbakterien nachgewiesen wurde.
Das Random-Walk-Model für Bakterienbewegungen wurde von Berg und Brown (1972) am
Beispiel von E. coli untersucht und beschrieben. Durch diese Strategie bewegen sich die
Zellen langsam auf den Lockstoff zu und sammeln sich nach einiger Zeit um die Quelle an.
Berg (1971) entwickelte hierfür ein automatisches Mikroskop zur 3D-Bewegungsverfolgung
von Bakterien. Das Mikroskop hat drei bewegliche Achsen mit einer Reichweite von jeweils
18
Einleitung
1 mm. Zur Bewegungsverfolgung wird eine Bakterie in x,y,z-Achse im Fokus gehalten. Die
Koordinaten der Achsen können elektronisch ausgelesen werden. Das Mikroskop eignet sich
zur Verfolgung einer einzelnen Bakterie im 3D-Raum. Die Bewegungsverfolgung erfolgt
automatisch. Eine automatische Probenentnahme sowie die Beobachtung mehrerer Bakterien
sind jedoch nicht vorgesehen.
Müssen die Bakterien beweglichen Nährstoffquellen folgen, erweist sich diese Strategie als zu
langsam. Daher zeigen vor allem Meerwasserbakterien eine andere Strategie, um den
Lockstoffen zu folgen. Die Run-and-Revers-Strategy wurde von Barbara und Mitchell (2003)
untersucht. Hierzu wurde beobachtet, wie Shewanella putrefaciens und Pseudoalteromonas
haloplanktis einer beweglichen Alge (Pavlova lutheri) folgen. Meerwasserbakterien bewegen
sich um eine Größenordnung schneller (bis ca. 400 µm s-1) als z.B. E. coli (bis ca. 40 µm s-1),
was auf die ständige Bewegung des Meeres zurückzuführen ist. Die Run-and-Revers-Strategy
ermöglicht es den Bakterien, sich trotz der Unruhe auf See in Schwärmen in unmittelbarer
Nähe (näher als 20 µm) zu Lockstoffen wie Luftblasen oder Nährstoffquellen aufzuhalten. In
Abbildung 8 sind Beispieldiagramme zur Run-and-Revers-Strategy dargestellt. Es ist zu
sehen, dass es den Bakterien gelingt, den Weg der Alge durch schnelle Richtungswechsel und
hohe Geschwindigkeiten gut zu verfolgen.
Abbildung 8: Beispiel für Run-and-Revers-Strategy
Die Diagramme zeigen je die Wege von einer Bakterie Pseudoalteromonas haloplanktis,
die einer beweglichen Alge Pavlova lutheri folgt. Die dargestellten Diagramme zeigen gute
Beispiele für die Run-and-Revers-Strategy (aus Barbara und Mitchell 2003).
Die Versuche von Barbara und Mitchell (2003) wurden in einer 100 µm tiefen MikroskopieKammer auf einem Labormikroskop mit 200facher Vergrößerung im Dunkelfeld
durchgeführt. Die Aufnahmen für das 2D-Tracking erfolgten mit einer Video-Kamera und
wurden mit 24 fps aufgezeichnet. Die Wegverfolgung und Geschwindigkeitsanalyse wurden
manuell durchgeführt. Eine bekannte Fehlerquelle ist die langsame Aufnahmerate von 24 fps.
Die Bakterien können bis zu 20 Richtungswechsel pro Sekunde durchführen, bei 24 fps ist die
Abtastung zu gering und Teile der Bewegungen werden nicht erfasst. Geschwindigkeit und
zurückgelegte Strecke werden daher tendenziell etwas zu langsam angegeben. Ein weiteres
Problem stellt die 100 µm tiefe Mikroskopie-Kammer dar. Zum einen wird nur der mittlere
Bereich vom Mikroskop scharf erfasst, zum anderen werden Bewegungen in z-Richtung
vernachlässigt.
19
Einleitung
Ein ähnliches System wurde zur Bewegungs- und Geschwindigkeitsanalyse von
Pseudomonas putida in Abhängigkeit der Zugabe von Benzoesäure verwendet (Harwood et
al. 1989). Auch Shigematsu et al. (1995) werten die Schwimmgeschwindigkeiten manuell
aus, indem der Pfad der Bakterie mit einer Computermaus auf dem Bildschirm nachverfolgt
wird. Die Schwimmgeschwindigkeiten von Vibrio cholerae und Pseudomonas aeruginosa
wurden so ermittelt. Die Probenentnahme erfolgt ebenso manuell. Die Messzelle besteht aus
einem Objektträger mit einem Deckglas. Der Rand um das Deckglas wurde mit Nagellack
abgedichtet. Die Bewegung von Vibrio alginolyticus wurde von Magariyama et al. (2005)
untersucht. Auch hier wurde die eigentliche Wegverfolgung manuell durchgeführt. Die
Bewegung anderer Mikroorganismen wie z.B. von Protisten wurde mit ähnlichen Systemen
untersucht (Beveridge et al. 2010).
Durch die „quantitative defocusing method“ konnten Wu et al. (2005) das Problem der
Ungenauigkeiten durch Bewegungen in z-Richtung lösen. Die Bakterien können in einer
Küvette auf einem herkömmlichen Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskop untersucht werden. Unter
dem Fluoreszenz-Mikroskop bilden die Partikel außerhalb des Fokus einen Ring um die
Partikel aus. Durch den Durchmesser des Rings und des Partikels lässt sich berechnen, wie
weit der Partikel außerhalb des Fokus ist. Mit dieser Methode lässt sich ein Volumen von
418 x 335 x 75 µm abbilden. So konnten 3D-Tracking-Experimente mit E. coli durchgeführt
werden. Eine Behandlung zur Steigerung der Fluoreszenz ist jedoch notwendig. Die
Probenentnahme, Probenvorbereitung und Wegverfolgung erfolgen bei diesem System
manuell. Das System wurde bereits zur Bewegungsanalyse verschiedener E. coli Stämme
eingesetzt (Wu et al. 2006).
Vater et al. (2014) haben in einem 3D-Tracking-Experiment die Bewegung der Bakterien
Pseudomonas aeruginosa untersucht. In einem Raum von 480 x 480 x 830 µm wurden die
Bewegungen der Bakterien mit Hilfe eines holographischen Mikroskops aufgenommen.
Durch die holographische Aufnahme ist vor allem in z-Richtung ein wesentlich größerer
Raum abbildbar. Die Aufnahmen erfolgten über 10 min mit einer Abtastrate von 5 fps. Damit
sind Bewegungen mit mehr als zwei Richtungswechseln pro Sekunde kaum zu verfolgen. Es
werden alle Bakterien im Sichtfeld erfasst, die Bewegungsverfolgung der einzelnen Wege
wird jedoch manuell vorgenommen. Eine automatische Probenentnahme ist nicht vorgesehen.
Häder und Vogel (1991) haben einen 2D-Tracking Algorithmus zur parallelen
Wegverfolgung von mehreren Mikroorganismen entwickelt. Die Mikroorganismen wurden in
einer 60 x 14 x 0,5 mm Küvette auf einem Video-Mikroskop kultiviert und beobachtet. Die
Bildverarbeitung erfolgte nicht in Echtzeit, jedoch ist die Auswertung bereits vollautomatisch.
Ein weiterer automatischer 2D-Tracking Algorithmus wurde von Kang Li et al. (2006)
beschrieben. Dieser Bildverarbeitungsalgorithmus eignet sich zur Wegverfolgung mehrerer
Zellen in einer Bildserie. Erprobt wurde der Algorithmus an humanen Osteosarkom Zellen.
Die Aufnahmen wurden über 10 h mit einem Aufnahmeintervall von 4 min bzw. über 43,5 h
mit einem Aufnahmeintervall von 15 min durchgeführt. Beobachtet wurden unter anderem
Bewegung, Zellteilung und Sterben der Zellen. Eine Validierung mit manueller
Wegverfolgung ergab eine Genauigkeit von 86,4% bis 91,2%. Der Algorithmus besteht aus
20
Einleitung
vier Kernmodulen (Cell Detector, Cell Tracker, Cell Arbitrator, Motion Filter), diese sind in
Abbildung 9 dargestellt.
Abbildung 9: Kommunikation der Kernmodule eines 2D-Tracking Systems
Der Cell Detector fügt erkannten Zellen aus den Eingangsbildern eine Beschriftung hinzu.
Der Cell Tracker verfolgt die Zellen zwischen den einzelnen Bildern und der Motion Filter
unterstützt den Cell Tracker und Cell Arbitrator mit Bewegungsvorhersagen. Der Cell
Arbitrator übernimmt die Nachbearbeitung der Zellen. Z.B. werden tote Zellen aussortiert,
Zellen, die sich teilen, neu beschriftet und Zellen, die aus dem Sichtbereich verschwinden,
ausgetragen (nach Kang Li et al. 2006).
Die Eingangsbilder werden an die Module Cell Detector und Cell Tracker übergeben. Die
einzelnen erkannten Zellen werden durch den Cell Detector beschriftet. Der Cell Tracker
verfolgt die Zellen zwischen den einzelnen Bildern. Die Daten zu den einzelnen beschrifteten
Zellen werden zwischen dem Cell Tracker und dem Cell Arbitrator ausgetauscht. Der Cell
Arbitrator übernimmt eine Nachbearbeitung der Zuordnungen. Die Nachbearbeitung
beinhaltet unter anderem das Zusammenführen unterbrochener Wegverfolgungen, das
Aussortieren verschwundener Zellen und die Neubeschriftung nach Zellteilung. Der Motion
Filter unterstützt den Cell Tracker und den Cell Arbitrator mit Bewegungsvorhersagen und
Bewegungskorrekturen. Das System wurde zur Beobachtung der Zellteilung und der passiven
Bewegung von Zellen über mehrere Stunden eingesetzt. Der erfolgreiche Einsatz des
Algorithmus für schnell bewegliche Zellen, die mehrere Richtungswechsel vollziehen, wäre
zu testen.
Karim et al. (1998) untersuchten die Bewegungsgeschwindigkeit und die Form der Bewegung
von verschiedenen Bakterien (Helicobacter pylori, Campylobacter jejuni und E. coli). Die
Bildserien wurden mit einem Video-Mikroskop aufgenommen. Die Proben befanden sich
hierfür in einer Mikroskopie-Kammer mit einer Schichtdicke von 100 µm. Das Programm
Hobson BacTracker filtert die bewegten Teile aus den Bildserien und gibt die Koordinaten zu
jedem beweglichen Objekt heraus. Diese Koordinaten werden in Echtzeit erfasst. Die
Probenentnahme und Probenvorbereitung erfolgen manuell. Das System ist in der Lage, die
Bewegungsform und Geschwindigkeiten vieler Bakterien in zwei Dimensionen zu erfassen.
21
Einleitung
Die verhältnismäßig hohe Schichtdicke kann bei Bewegungen der Bakterien in z-Richtung zu
Fehlern führen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass zur vollautomatischen Messung der aktiven
Bewegungen und Geschwindigkeiten von Bakterien bislang kein Online-Mikroskopie-System
zur Bioprozesskontrolle publiziert wurde. Den beschriebenen Systemen fehlt mindestens eine
der Komponenten, die für Online-Mikroskopie-Systeme notwendig sind, nämlich die
vollautomatische Probenentnahme, Probenvorbereitung, Bildaufnahme oder die
Bildverarbeitung.
22
Zielsetzung
5
Zielsetzung
Es soll ermittelt werden, ob mittels der Bewegungsgeschwindigkeit des Beispielorganismus
B. amyloliquefaciens FZB42 eine Aussage über dessen Vitalität getroffen werden kann.
Hierfür wird ein Messsystem zur automatisierten Messung der Bewegungsgeschwindigkeit
mittels Online-Mikroskopie entwickelt. Die Probenentnahme, Probenvorbereitung und
Messung sollen weitgehend automatisch erfolgen. Während des gesamten Prozesses von
Probenentnahme bis zur Messung dürfen die Bakterien keinem erhöhten Zellstress, vor allem
keinen erhöhten Scherkräften, ausgesetzt werden. Durch Scherung können begeißelte
Mikroorganismen ihre Bewegungsfähigkeit verlieren, schon lange bevor eine
Beeinträchtigung ihrer Fähigkeit zur Zellteilung eintritt (DePamphilis und Adler 1971; Rosu
und Hughes 2006). Die Geißeln sind zwar in der Lage, sich zu regenerieren, dies nimmt zur
vollständigen Regeneration jedoch einen Zeitraum von über 60 min in Anspruch und ist damit
länger als die angedachte Messzeit (Stocker und Campbell 1959). Es sind Messzyklen
(Probenentnahme bis Ergebnis) von etwa 15 min geplant. Das System soll möglichst
kompatibel mit verbreiteter Laborausstattung in biotechnologischen Laboren wie
Bioreaktoren, Labormikroskopen, Schlauchpumpen usw. betrieben werden. So werden
geringe Etablierungskosten ermöglicht. Die Reinigung des Messsystems muss möglichst
schnell und unkompliziert erfolgen, ebenso wie die Sterilisierung (z.B. autoklavierbar).
Die erhaltenen Daten sollen zum einen als Rohdaten (Bilder) vorliegen und zum anderen auch
automatisch ausgewertet werden. Durch die vorliegenden Rohdaten wird das System
transparent und überprüfbar. Zudem können die Bilder später auch per Hand auf andere
Parameter untersucht werden, sollte es z.B. zu unerwarteten Prozessverläufen kommen.
Manuelle Auswertungen von Bilddaten einer ganzen Fermentation dauern jedoch viele
Stunden bis zu wenigen Tagen und sind somit nicht durchgängig durchführbar. Zudem stehen
die Daten für mögliche Prozesseingriffe nicht zur Verfügung. Ziel für die automatische
Bildauswertung sind daher Berechnungszeiten, die kleiner sind als die Dauer eines
Messzyklus.
An mehreren Beispielfermentationen mit B. amyloliquefaciens FZB42 soll die
Funktionsfähigkeit des Messsystems gezeigt werden. Die Prozessführung für die
Beispielfermentationen ist auf die Gegebenheiten im Labor anzupassen, welche wiederum so
nahe wie möglich an den realen Produktionsbedingungen bei der ABiTEP GmbH liegen
sollen. Die in den Beispielfermentationen mit dem Bildanalyse-Messsystem gemessenen
Parameter werden anschließend beurteilt und validiert. Hierfür ist es notwendig, weitere
Prozessparameter zu messen, um diese als Grundlage zur Beurteilung einsetzen zu können.
Auswahl und Implementierung der zusätzlichen Messtechnik ist ebenso Ziel dieser Arbeit.
Die Möglichkeit, das automatische Bildanalyse-Messsystem später zur Sicherung der
Prozessqualität und somit zum Nachweis der Produktqualität einzusetzen, soll untersucht
werden.
23
Material und Methoden
6
6.1
Material und Methoden
Verwendeter Stamm und verwendete Medien
Als Beispielorganismus findet Bacillus amyloliquefaciens FZB42 (ABiTEP GmbH, Berlin)
mit den Chargennummern 20130419 42 2.02 (Fermentation 1 – 4) und 20140310 42 2.02
(Fermentation 5 – 7) Anwendung. Der Stamm FZB42 wird von dem Leibniz Institut DSMZDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH unter der DSM Nr.:
23117 geführt. Die Bakterien liegen als Sporen in 4 × 1011 cfu g-1 vor. B. amyloliquefaciens
subsp. plantarum subsp. nov. sind stäbchenförmige bewegliche Zellen. Das Bakterium ist
grampositiv, 0,6 bis 0,9 µm breit und 1,8 – 4 µm lang. Es ist in der Lage, zylindrische Sporen
zentral oder parazentral auszubilden. Die Kultivierung erfolgt streng aerob. Optimale
Wachstumsbedingungen liegen zwischen 30 und 40 °C, unter 15 °C und über 50 °C findet
kein Wachstum statt. Es verfügt über die Fähigkeit, lösliche Cellulose zu metabolisieren und
Stärke durch verzuckernde Amylase zu verarbeiten (Borriss et al. 2011).
Die Fermentationen 1 – 3 und 7 wurden mit dem Produktionsmedium der ABiTEP GmbH
durchgeführt. Das Nährmedium wurde von der ABiTEP GmbH in Pulverform zur Verfügung
gestellt. In diesem Medium wird der Stamm auch für die großtechnische Produktion
kultiviert. Es handelt sich um ein komplexes Medium auf Stärkebasis und ist stark trüb
(partikelbehaftet). Weitere Einzelheiten zur Zusammensetzung des Produktionsmediums
dürfen an dieser Stelle nicht veröffentlicht werden. Die Fermentationsbrühe wurde mit
9,5 g l-1 des Produktionsmediums angesetzt, das entspricht einem Viertel der
Produktionskonzentration. Die Konzentration wurde auf ein Viertel reduziert, um die
Fermentationsdauer im Laborbetrieb auf unter 10 h zu verkürzen. Die Fermentationsbrühe
wurde vor Versuchsbeginn mit fünfprozentiger Kalilauge (KOH) auf pH 7,2 eingestellt und
im Bioreaktor 30 min autoklaviert. Vor dem Autoklavieren musste der Fermentationsbrühe 1
ml Aspumit AP (Thor GmbH, Speyer) als Antischaummittel zugegeben werden. Dieses
Medium wird im Weiteren als ABiTEP-Medium-¼ bezeichnet.
Die Fermentationen 4 – 6 wurden mit dem Standard-Nährmedium I (Charge: 503207757, Carl
Roth GmbH + Co. KG) durchgeführt. Die Fermentationsbrühe wurde mit 6,25 g l-1 angesetzt.
Dies entspricht einem Viertel der vom Hersteller empfohlenen Konzentration. Das Medium
wird im Fermenter 15 min autoklaviert. Wie beim für die Fermentationen 1 – 3 und 7
verwendeten Medium wurde die Konzentration reduziert, um die Fermentationszeit auf unter
10 h zu verkürzen. Analog zum ABiTEP-Medium-¼ wird im weiteren Verlauf der Arbeit die
Bezeichnung Standard-Nährmedium-I-¼ genutzt.
24
Material und Methoden
Dichte und Viskosität der Medien
Für spätere Berechnungen wurde die Dichte der Medien ermittelt. Die Messung der Dichte
erfolgte mit einem Pyknometer, das vor der Messung im Wasserbad temperiert wurde.
Ebenso wie die Dichte wurde auch die Viskosität der beiden Medien ermittelt. Zur Messung
wurde ein Kapillarviskosimeter Typ 530 10 / I (SI Analytics GmbH) verwendet. Das
Viskosimeter wurde zur Temperierung im Wasserbad betrieben.
Zur Bestimmung des Fließverhaltens der beiden Medien kam ein Scherrheometer des Typs
Physica UDS 200 (Anton Paar, Österreich) zum Einsatz. Gemessen wurde bei 35 °C mit
einem Doppel-Spalt-Zylinder-Messsystem Z1 DIN (double gap). Die Viskosität wurde in
Abhängigkeit der Scherrate gemessen. Zur Kalibrierung und Validierung der Messung wurde
Wasser bei 35 °C verwendet.
6.2
Bioreaktor
Beim verwendeten Bioreaktor handelt es sich um einen 14 l Fermenter (Chemap AG, Typ: 92703). Der Original-Schaltschrank wurde vollständig durch einen neuen ersetzt, welcher die
Messdatenerfassung sowie Ansteuerung durch ein eigens für die Anwendung geschriebenes
LabVIEW-Programm (National Instruments LabVIEW 2013) ermöglicht. Ein vereinfachtes
Fließbild des Bioreaktors ist in Abbildung 10 dargestellt.
Die Zuluft (Strom 1) zum Fermenter kann über den Massendurchflussregler FIRC 1.01
(Brooks, Mass-Flow-Controller 5850E) im Bereich von 0 – 2500 mln min-1 geregelt werden.
Nach dem Massendurchflussregler befindet sich ein Sterilluftfilter (Midisart 2000, 0,2 µm
PTFE, sartorius stedim), um mögliche Kontaminationen aus dem Zuluftsystem zu vermeiden.
Dieser Filter ist im vereinfachten Fließbild nicht zu sehen. Der Fermenter B1.1 ist für 3 bar
Überdruck und eine Temperatur von 130 °C ausgelegt und kann somit autoklaviert werden.
Die Rührerdrehzahl SIRC 1.02 wird erfasst und ist in einem Bereich von 0 – 1200 rpm
regelbar. Der Gelöstsauerstoff im Bioreaktor wird durch einen Gelöstsauerstoff-Sensor QIRC
1.03 (InPro 6820/12/320 Mettler Toledo) erfasst und ist über die Zuluftmenge und
Rührerdrehzahl regelbar.
25
Material und Methoden
Abbildung 10: Vereinfachtes Fließbild des Bioreaktors
Der Fermenter B1.1 wird durch einen Doppelmantel temperiert. Temperaturen bis 130 °C
sowie ein Überdruck von bis zu 3 bar sind im Behälter zugelassen. Der Fermenter ist somit
voll autoklavierbar. Neben der Temperatur (TIRC 1.05) werden der pH-Wert (QIR 1.04)
sowie der pO2-Wert (QIRC 1.03) im Bioreaktor gemessen. Weiterhin werden die
Rührerdrehzahl (SIRC 1.02) und der Luftvolumenstrom (FIRC 1.01) gemessen. Unter
Strom 2 ist die Probenentnahme und Übergabe an die Probenvorbereitung vereinfacht
dargestellt.
Ebenso werden der pH-Wert QIR 1.04 (405-DPAS-SC-K82/325, Mettler Toledo) und die
Temperatur TIRC 1.05 im Bioreaktor erfasst. Dem Abluftstrom (Strom 3) sind nach dem
Abluftkühler ein Schaumabscheider und eine Gaswaschflasche zur Abluftbehandlung
nachgeschaltet. Das Wasser im Doppelmantel (Strom 4 und 5) wird durch die
Temperaturreglung TIC 3.01 temperiert, die Sollwertvorgabe erhält die Regelung durch die
Temperaturregelung des Fermenters TIRC 1.05. Die Probe (Strom 2) wird über eine
Schlauchpumpe im Bypass befördert und über ein Ventil an die Probenvorbereitung
übergeben. Der Bypass und die Entnahme über das Ventil sind im vereinfachten Fließbild des
Bioreaktors nicht dargestellt. Die Probenvorbereitung wird in Kapitel 6.4.3 näher erläutert.
Die entwickelte Ansteuersoftware erlaubt die Einstellung und Beobachtung der wichtigsten
Parameter für die Prozessführung und Probenvorbereitung. Alle Messdaten können in einem
Diagramm angezeigt und als Datei (.csv) exportiert werden. Die Bedienoberfläche für den
Bioreaktor ist in Abbildung 11 dargestellt.
26
Material und Methoden
Abbildung 11: Software Bedienoberfläche des Bioreaktors
Die Benutzeroberfläche erlaubt es, die Sollwerte für Temperatur und für den pO2-Wert
festzulegen. Die Temperatur- und pO2-Regelungen lassen sich auch in den Handbetrieb
schalten. Probenentnahme und –vorbereitung können ebenso von der Oberfläche aus
gesteuert werden. Die wichtigsten Prozessparameter können hier überwacht werden.
Die Temperatur im Bioreaktor kann über die Temperatur im Doppelmantel geregelt werden.
Zur Temperaturregelung wird ein modifizierter PI-Regler eingesetzt. Liegt die Temperatur in
einem Bereich von ± 1 K, ist der Regler aktiv, außerhalb dieses Bereichs wird entweder voll
gekühlt oder voll geheizt. In jedem Fall wird die Temperaturdifferenz zwischen Doppelmantel
und Bioreaktor auf 10 K gehalten. Durch die Begrenzung der Temperaturdifferenz und das
Deaktivieren des Reglers außerhalb des Arbeitspunktes wird ein schnelles Ansprechverhalten
bzw. ein geringes Überschwingen gewährleistet. Die Stellgröße des Reglers deckt einen
Bereich von ± 100 % ab. Im positiven Bereich wird die Heizung mit einer
Pulsweitenmodulation (PWM) angesteuert und im negativen die Kühlung. Als
Regelparameter haben sich ein Proportionalwert (P-Wert) von 15 und eine Integrationszeit
(Ti) von 10 min als optimal erwiesen. Da der Regler nur nahe um den Arbeitspunkt aktiv ist
konnten die Parameter auf einen schwingungsarmen Verlauf optimiert werden. Bei größeren
Sollwertänderungen sorgen der deaktivierte Regler und das vollständige Heizen bzw. Kühlen
für ein schnelles Erreichen des Arbeitspunktes.
Die pO2-Regelung wurde ebenso mit einem modifizierten PI-Regler realisiert. Der Regler hat
einen Bereich von 0 – 100 % in der Stellgröße. Er wirkt sich auf die Rührerdrehzahl sowie die
Zuluftmenge aus. Die Rührerdrehzahl wird je nach Stellgröße in einem Bereich von 250 –
27
Material und Methoden
1200 rpm und die Zuluftmenge mit 100 – 2500 mln min-1 geregelt. Der P-Wert des Reglers
beträgt 1,5 und die Integrationszeit (Ti) 10 min. Die Rührerdrehzahl wird selbst bei einem
pO2-Wert über dem Sollwert nicht auf 0 gefahren, da eine Mindestdrehzahl des Rührers für
die homogene Durchmischung notwendig ist. Die Zuluft bleibt ebenso auf einem Mindestwert
von 100, da der leichte Überdruck im System vor Kontamination schützt und ein
Zurückziehen der Abluft verhindert.
Über die Benutzeroberfläche kann weiterhin die gesamte Probenentnahme und
Probenvorbereitung gesteuert werden. Die gesamte Benutzeroberfläche und Programmierung
wurde speziell auf die Anforderungen zur Erprobung des Online-Mikroskops optimiert.
6.3
Versuchsdurchführung
Im zuvor gereinigten und sterilisierten Βioreaktor wird das Nährmedium (siehe 6.1) mit 8 –
10 l VE-Wasser (vollentsalztes Wasser) angesetzt. Nach dem Autoklavieren und Zuschalten
der Belüftung mit 100 mln min-1 erfolgt ein Abkühlen auf 80 °C. Die B. amyloliquefaciens
FZB42 Sporen werden zu 150 mg l-1 bei 80 °C zugegeben. Die Temperatur wird nach der
Zugabe 30 min auf 80 °C gehalten und anschließend auf 35 °C abgekühlt. Der
Temperaturschock begünstigt die spätere Auskeimung der Sporen (vgl. Stewart und
Halvorson 1953; Foster und Johnstone 1990). Bei Erreichen der 35 °C wird die pO2-Regelung
mit einem Sollwert von 50% gestartet und die Versuchsaufzeichnung beginnt mit 0 min. Der
Verfahrensablauf der Versuchsdurchführung ist in Abbildung 12 dargestellt.
Während der Versuchsdurchführung werden regelmäßig (Messintervall: 15 – 30 min) Proben
in die Probenvorbereitung gepumpt und ggf. verdünnt. Die optische Dichte wird bei einer
Wellenlänge von 600 nm (OD600) bestimmt (siehe 6.4.3). Während der Versuchsdurchführung
wird ein Probenentnahmeintervall von 15 min angestrebt. Die vorbereiteten Proben werden
durch die Durchflussküvette gepumpt, um die Bildstrecken zur automatischen Bildauswertung
aufzunehmen. Es wurden zur Geschwindigkeitsmessung zu jedem Probezeitpunkt 10
Bildstrecken mit je 30 Bildern aufgenommen. Dies entspricht jeweils einer Sekunde
Aufnahmezeit. Zusätzlich wurde für die Fermentationen 4 – 7 zu jeder Probenentnahme eine
Bildstrecke mit 150 Aufnahmen, dies entspricht fünf Sekunden, zur Analyse der
Bewegungsmuster aufgenommen.
28
Material und Methoden
Abbildung 12: Vereinfachtes Verfahrensfließbild der Versuchsdurchführungen
Verfahrensablauf mit ABiTEP-Medium-¼ (links) und mit Standard-Nährmedium-I-¼
(rechts). Der Übergang der einzelnen Verfahrensschritte ist mit Pfeilen von oben nach
unten gekennzeichnet. Zu- und Abgänge sind mit Pfeilen von rechts nach links bzw. von
links nach rechts gekennzeichnet.
Neben der diskontinuierlichen Messung des OD600 und der Bildaufnahme werden
kontinuierlich der pH-Wert, die Temperatur, der pO2-Wert, die Rührerdrehzahl und die
Begasungsrate gemessen (siehe 6.2). Während Fermentation 4 und 5 wurde zusätzlich nach
Bedarf Antischaummittel zugegeben: Dow Corning Antifoam RD Emulsion Charge:
0007473410 (VWR International Ltd.).
6.4
Online-Mikroskopie mit automatisierter Serienbildaufnahme
Unter Online-Mikroskopie wird hier die automatische Aufnahme, Darstellung und
Auswertung von mikroskopischen Bildern während der Laufzeit des Prozesses verstanden.
Die Daten stehen somit für die Prozessführung zur Verfügung. Das Kernstück der OnlineMikroskopie mit automatisierter Serienbildaufnahme stellt eine Durchflussküvette mit
flexibler Schichtdicke dar. Die Durchflussküvette wird mit einer Probe aus dem Bioreaktor
beschickt. Diese Probe wird durch Wasserzugabe auf eine definierte optische Dichte
eingestellt. Die Schichtdicke der Durchflussküvette sollte für die Serienbildaufnahme nicht
mehr als 5 µm betragen. Die Küvette kann auf dem Objekttisch eines Labormikroskops (z.B.
Olympus CX31) befestigt werden. Die gesamte Probenentnahme mit Bildaufnahme kann
voll- und halbautomatisch erfolgen.
29
Material und Methoden
6.4.1
Durchflussküvette mit flexibler Schichtdicke
Die Durchflussküvette mit flexibler Schichtdicke wurde von Dipl.-Ing. (FH) Dominik Bopp,
Hochschule Mannheim konstruiert. Im Zentrum der Durchflussküvette (siehe Abbildung 13)
befindet sich eine Silikonmembran mit eingearbeitetem Polycarbonat-Objektträger
(Durchmesser 16 mm, Stärke 2 mm). Oberhalb der Membran wird ein Deckglas
(Durchmesser 20 mm, Stärke ca. 0,15 mm) zwischen zwei Silikondichtungen geklemmt. Wird
die Probe durch die Küvette gepumpt, liegt die Membran an dem unteren Gehäuse an und
eine Durchströmung mit neuer Probe ist möglich.
Abbildung 13: Konstruktionszeichnung der Durchflussküvette mit flexibler Schichtdicke
Als Vollschnitt (links) und in isometrischer Darstellung (rechts) (konstruiert von Dipl.-Ing.
(FH) Dominik Bopp, Hochschule Mannheim).
Die Küvette besteht aus fünfzehn Bauteilen:
-
dreiteiliger Edelstahlküvettenkörper (oben, mittig, unten),
Silikonmembran mit eingearbeitetem Polycarbonat-Objektträger,
Deckglas (20 mm, Stärke 0,15 mm),
zwei Silikondichtringe für das Deckglas,
zwei Edelstahlschlauchtüllen,
zwei Silikondichtringe für die Schlauchtüllen,
vier Edelstahlschrauben.
Die Küvette kann zum Reinigen leicht zerlegt und wieder montiert werden. Zwischen fünf
und zehn min sind für eine komplette Reinigung inkl. Zerlegen und Montieren nötig. Zum
Zusammenbau wird die Silikonmembran auf das Küvettenkörperunterteil gelegt und
anschließend der Mittelteil aufgelegt. Die beiden Schlauchtüllen werden zusammen mit den
Dichtringen in die passenden Vertiefungen eingesetzt. Ebenso wird das Deckglas mit beiden
Silikondichtringen in die vorgesehene Nut platziert. Anschließend wird das Oberteil des
Küvettenkörpers aufgelegt und mit den vier Schrauben befestigt.
Alle Teile sind geklemmt oder geschraubt und leicht austauschbar. Die verwendeten
Materialien sind gegen die gängigen Reinigungs- und Desinfektionsmittel beständig und
somit auch im Aufbau zu reinigen und sterilisieren. Weiterhin ist die Küvette autoklavierbar.
Bei hoher Schichtdicke kann die Probe mit geringem Druck durch die Küvette gepumpt
werden. Durch den verhältnismäßig großen Durchmesser der Zuleitung und des Proberaums
sind die Strömungsgeschwindigkeit und somit die Scherkräfte gering. Es ist wichtig, dass die
Bakterien möglichst ohne großen Zellstress in den Proberaum gefördert werden. Die
30
Material und Methoden
Fähigkeit, sich selbstständig zu bewegen, geht den Bakterien bei großen Scherkräften
verloren. Der Verlust der Bewegungsfähigkeit ist auf das Abscheren der Geißeln
zurückzuführen. Diese gehen schon bei Scherkräften verloren, die für die Zellen selbst
unproblematisch sind. Die Geißeln können sich zwar regenerieren, jedoch nimmt dies eine
längere Zeit in Anspruch (DePamphilis und Adler 1971; Witman 1975; Grossart et al. 2001;
Näther 2007). Das Abscheren der Geißeln muss für eine exakte Messung auf jeden Fall
vermieden werden. In Abbildung 14 ist die Funktion der Durchflussküvette vereinfacht
dargestellt.
Abbildung 14: Schema der Durchflussküvette mit flexibler Schichtdicke
I: p1 < p2, δI < 5 µm, bereit für die Bildaufnahme. II: p1 > p2, δII > 1,2 mm, bereit für die
Probenentnahme. 1: Edelstahlgehäuse, 2: Deckglas, 3: Objektträger, 4: Membran, 5:
Bildaufnahme, 6: Beleuchtung.
Nachdem die Küvette mit Probe beschickt ist, kann durch Unterdruck die Membran an das
Deckglas gezogen (p1 < p2) werden. Sobald die gewünschte Schichtdicke (δI < 5 µm) erreicht
ist, kann die Serienbildaufnahme gestartet werden. Beim Durchfluten mit neuer Probe steigt
der Druck in der Küvette über den Umgebungsdruck (p1 > p2) und die Schichtdicke wird
vergrößert (δII > 1,2 mm).
31
Material und Methoden
Um eine Beschädigung der Geißeln und somit die Bewegungsunfähigkeit der Bakterien
auszuschließen, sollte eine Berechnung der Scherkräfte in der Küvette erfolgen. Zur
Berechnung der Scherkräfte wird eine vereinfachte Geometrie herangezogen. Der
Flüssigkeitsraum in der Küvette wird als Scheibe mit 36 mm Durchmesser und 1 mm Höhe
angenommen. Nahe am Rand, mit 1 mm Abstand, befindet sich der Zu- und Ablauf mit je
2 mm Durchmesser. Der vereinfachte Strömungsraum der Küvette ist in Abbildung 15 zu
sehen.
Abbildung 15: Strömungsraum in der Küvette (vereinfachte Darstellung)
Der Strömungsraum in der Küvette wird vereinfacht als durchströmte Scheibe mit 1 mm
Höhe und 36 mm Durchmesser betrachtet. Zu- und Ablauf haben einen Durchmesser von
2 mm.
Die Scherkräfte werden unter der Annahme von schlanken Kanälen berechnet. Ein Kanal gilt
als schlank, wenn die durchströmte Strecke wesentlich länger ist als die Breite und/oder Höhe
des Kanals (Herwig 2008). Weiterhin wird für die Berechnung eine laminare Strömung
angenommen und eine ausreichende Einlauflänge zur Ausbildung der Strömung vorausgesetzt
(Surek und Stempin 2007). Die Berechnung erfolgt für den Zu- bzw. Abfluss sowie für einen
Spalt mit der Breite der Küvette kurz nach dem Einlass und an der breitesten Stelle der
Küvette. Die herangezogenen Geometrien sind in Abbildung 16 verdeutlicht. Die
Berechnungen der beiden Spalten erfolgt in vereinfachter Form. Die Randeffekte an den
beiden schmalen Kanten der Spalte werden vernachlässigt.
32
Material und Methoden
Abbildung 16: Geometrie der berechneten schlanken Kanäle
Die Scherkräfte werden exemplarisch an drei schlanken Kanälen berechnet: einer Leitung
mit 2 mm Innendurchmesser für Zu- und Abfluss, einem Spalt mit der Breite des
Durchmessers der Küvette und einem Spalt mit der Breite der Küvette kurz nach dem
Einlass.
Die folgenden Gleichungen (6.1) bis (6.6) stammen aus Surek und Stempin (2007) und
𝑢
Herwig (2008). Das Geschwindigkeitsprofil 𝑢 , wobei 𝑢 die Geschwindigkeit an der Stelle ℎ
𝑚
bzw. 𝑟 und 𝑢𝑚 die querschnittsgemittelte Geschwindigkeit darstellen, ist für einen Spalt mit
gegebener Höhe 𝐻 wie folgt definiert:
2
(6.1)
2
(6.2)
𝑢(ℎ) 3
ℎ
= �1 − �
� �
𝐻�
𝑢𝑚
2
2
Für ein Rohr mit gegebenem Durchmesser 𝐷 folgt:
𝑢(𝑟)
𝑟
= 2 �1 − �
� �
𝐷�
𝑢𝑚
2
Der Geschwindigkeitsgradient 𝛾̇ ergibt sich aus der Geschwindigkeitsänderung (∆𝑢)
senkrecht zur Bewegungsrichtung (∆𝑦) .
𝛾̇ =
∆𝑢 d𝑢
=
∆𝑦 d𝑦
(6.3)
33
Material und Methoden
Die Schubspannung 𝜏 ergibt sich aus der Scherkraft 𝐹 pro Fläche 𝐴. Die dynamische
Viskosität 𝜂 multipliziert mit dem Geschwindigkeitsgradienten ergibt ebenso die
Schubspannung.
𝜏=
𝐹
= 𝜂 ∙ 𝛾̇
𝐴
(6.4)
Die Reynoldszahl 𝑅𝑅 ist eine dimensionslose Kennzahl, die eine Aussage über das
Turbulenzverhalten der Strömung zulässt. Mit der kinematischen Viskosität 𝜈 gilt für einen
Spalt:
Die Definition für ein Rohr lautet:
𝑅𝑅 =
𝑢𝑚 𝐻
𝜈
(6.5)
𝑢𝑚 𝐷
(6.6)
𝜈
Liegt die Reynoldszahl unter einem kritischen Wert, kann von einer laminaren Strömung
ausgegangen werden. Da der Übergang zwischen stark turbulenter und laminarer Strömung
nicht abrupt erfolgt, sondern ein großer Übergangsbereich existiert und die kritische
Reynoldszahl von vielen Parametern abhängt, muss dieser Wert als Richtwert angesehen
werden. Es wird hier eine kritische Reynoldszahl von 2300 angenommen (Surek und Stempin
2007). Ist die Reynoldszahl kleiner als 2300 können die oben eingeführten Gleichungen für
laminare Strömungen zur Anwendung kommen.
𝑅𝑅 =
6.4.2
Messsystem zur Bestimmung der kritischen Scherkräften
Um die kritischen Scherkräfte bzw. Schubspannungen für B. amyloliquefaciens FZB42 zu
ermitteln, wurden mehrere Versuchsreihen durchgeführt. Die Bakterien wurden hierzu im
Standard-Nährmedium-I-¼ kultiviert und in der Wachstumsphase werden pro Versuch durch
drei 20 ml Spritzen Bakteriensuspension entnommen. Mit einer Spritzenpumpe (Fusion 400,
Chemyx Inc., USA) wurde die entnommene Suspension mit 4 ml min-1 durch eine
Referenzkapillare mit 1 mm Durchmesser und 0,6 m Länge sowie durch zwei Messkapillaren
mit 0,25 mm sowie 0,5 mm Durchmesser und je 0,6 m Länge gepumpt. Die behandelten
Proben wurden anschließend mehrmals abwechselnd unter dem Mikroskop untersucht und je
das Verhältnis von beweglichen zu unbeweglichen Bakterien ermittelt.
6.4.3
Peripherie für den automatisierten Betrieb
Für einen reibungslosen automatischen Betrieb der Durchflussküvette über den gesamten
Zeitraum der Fermentation sind Peripheriegeräte notwendig. Der Verfahrensablauf von
Probenentnahme bis zur Bildaufnahme ist vereinfacht in Abbildung 17 dargestellt.
Da die Zelldichte während der Wachstumsphase stark ansteigt, wird die Probe vor der
Zuführung auf eine konstante optische Dichte eingestellt. Die Messung der optischen Dichte
erfolgt kontinuierlich während der Probenentnahme sowie der Verdünnung mit VE-Wasser.
Die Anzahl an Bakterien pro Aufnahme kann somit reduziert werden.
34
Material und Methoden
Abbildung 17: Vereinfachtes Verfahrensfließbild der Bildaufnahme mit Peripherie
Die Probe wird je nach Fermentationsstadium mit VE-Wasser verdünnt. Die verdünnte
Probe wird schließlich zur Durchflussküvette gepumpt, wo die Bildaufnahme durchgeführt
wird. Zum Einstellen der Schichtdicke wird Vakuum benötigt. Eine anschließende
Belüftung sowie die Entsorgung von Abwasser sind für den Dauerbetrieb ebenso
notwendig.
Die Möglichkeit, die Probe zu verdünnen, erlaubt es, die Anzahl der Bakterien im Sichtfeld
der Kamera für die Bewegungsverfolgung optimal einzustellen.
Um die optimale Anzahl an Bakterien pro Bild zu ermitteln, wurde der zu erwartende Fehler
der Durchschnittsgeschwindigkeit 𝑆𝑆𝑆𝑣𝑣 abgeschätzt.
𝑆𝑆𝑆𝑣𝑣 =
𝑆𝑆𝑣𝑣 (𝑛𝑣𝑣 − 𝑛𝑒𝑒 ) + 𝑆𝑆𝐹 𝑛𝑒𝑒
𝑛𝑣𝑣 �𝑛𝑣𝑣
(6.7)
Der erwartete Fehler (6.7) kann mit der erwarteten Standardabweichung 𝑆𝑆𝑣𝑣 , der erwarteten
Anzahl an Einzelgeschwindigkeiten 𝑛𝑣𝑣 , der erwarteten Anzahl an fehlerhaften Sprüngen
zwischen nahen Bakterien 𝑛𝑒𝑒 und der Standardabweichung für die Berechnung auf
Grundlage von fehlerhaften Sprüngen 𝑆𝑆𝐹 abgeschätzt werden. Kommen sich zwei Bakterien
zu nahe, besteht die Möglichkeit, dass die automatische Wegverfolgung die beiden Bakterien
während der Indizierung vertauscht. Somit kann es zu einem Fehler in der Bestimmung der
Durchschnittsgeschwindigkeit bei beiden Wegstrecken kommen.
Die erwartete Anzahl an Einzelgeschwindigkeiten 𝑛𝑣𝑣 ergibt sich aus der Anzahl an Bakterien
pro Bild 𝑛, der Anzahl an Bildern pro Bildserie 𝑓𝑛 , der Anzahl an Bildserien pro
Messpunkt 𝑏𝑛 , der erwarteten Anzahl an Berührungen zwischen den Bakterien 𝑛𝑒𝑒 sowie der
Wahrscheinlichkeit für das Auftreten von kleinen Strecken 𝑝𝑘𝑘 . Durch eine Berührung zweier
Bakterien während ihrer Bewegung werden beide Wege mit der Länge (𝑏𝑛 𝑓𝑛 − 1) getrennt
und es entstehen vier kürzere Wege. Hierdurch gehen vier Einzelgeschwindigkeiten verloren.
Ist einer der vier Wege durch die Trennung nun kürzer als die Mindestlänge fällt dieser für die
Auswertung komplett weg.
𝑛𝑣𝑣 = 𝑛 (𝑏𝑛 𝑓𝑛 − 1) − 4 𝑛𝑒𝑒 𝑝𝑘𝑘
(6.8)
Die erwartete Anzahl an Berührungen zwischen den Bakterien 𝑛𝑒𝑒 wird aus der
eingenommenen Fläche aller Bakterien 𝐴𝑖𝑖𝑖 , der Anzahl an Bakterien pro Bild 𝑛 und der
Fläche des Bildes 𝐴𝐵 berechnet.
35
Material und Methoden
𝑛
4 𝐴𝑖𝑖𝑖
𝐴𝐵
(6.9)
5 𝑝𝑒𝑒 𝐴𝑖𝑖𝑖
𝐴𝐵
(6.10)
𝑛𝐵 = �
𝑖=0
Die erwartete Anzahl an fehlerhaften Sprüngen ergibt sich aus der Wahrscheinlichkeit für
einen fehlerhaften Sprung zwischen nahen Bakterien 𝑝𝑒𝑒 , der eingenommenen Fläche aller
Bakterien 𝐴𝑖𝑖𝑖 , der Fläche des Bildes 𝐴𝐵 sowie der Anzahl an Bakterien pro Bild 𝑛.
𝑛
𝑛𝑒𝑒 = �
𝑖=0
Ebenso wird das Gewicht der Probe während des gesamten Prozesses protokolliert, wodurch
das Verdünnungsverhältnis zu jeder einzelnen Probe festgelegt ist. Die Probenentnahme
beträgt ca. 40 ml bei etwa 0,4 ml Totvolumen, die Größe des Totvolumens beträgt somit etwa
1% der Probenentnahme. In Abbildung 18 ist das vereinfachte Fließbild der
Probenvorbereitung und der Messung zu sehen.
Abbildung 18: Vereinfachtes Fließbild der Probenvorbereitung
Die Probenvorbereitung wird benötigt, um bei hohen Zelldichten die Probe zu verdünnen.
Der OD600 (QIRC 2.02) wird bei der Verdünnung auf einen definierten Wert eingestellt.
Der Grad der Verdünnung wird hierbei über die Gewichtsmessung (WIR 2.03) erfasst.
Weiterhin sind die Durchflussküvette sowie die Vakuum- und Abwasserbehandlung zu
sehen. Das Vakuum ist notwendig, um die Schichtdicke der Durchflussküvette
einzustellen.
Während die neue Probe durch die Küvette gespült wird, muss ein geringer Gegendruck
herrschen, um die Küvette komplett zu öffnen und rückstandsfrei zu durchströmen. Der
Durchfluss durch die Küvette während der Durchspülung beträgt etwa 30 ml min-1. Nachdem
die Küvette mit neuer Probe vollständig durchströmt wurde, wird Unterdruck angelegt, um
die Schichtdicke zu minimieren. Anschließend kann die Aufnahme der Bildserie erfolgen.
36
Material und Methoden
6.4.4
Kamera und Mikroskop
Für die Analyse der Bakterienbewegung wurde die Küvette auf einem herkömmlichen
Labormikroskop vom Typ CX31 (Olympus Corporation, Japan) eingesetzt. Die Bildaufnahme
erfolgte im Durchlicht mit einem 40x-Objektiv des Typs PLCN40XPH (Olympus
Corporation, Japan). Bei der eingesetzten Kamera handelt es sich um eine GigE Farb-Kamera
des Typs DFK 23G445 (The Imaging Source Europe GmbH). Die Auflösung der Kamera
beträgt 1280 x 960 Pixel bei einer Bildrate bis zu 30 fps. Jedes Pixel besteht aus drei 8 bit
Werten mit jeweils 8 bit Werten für Rot, Grün und Blau. Es ist ein 1/3“ Sensor in der Kamera
verbaut. Die Lichtverstärkung der Kamera, die Belichtungszeit (1 µs – 30 s) sowie das
Farbverhältnis sind online im System parametrierbar.
Um die reale Größe eines Pixels bestimmen zu können, wurde ein Objektmikrometer (2 mm
in 200 Skalenteile, 10008.04.005, POG Präzisionsoptik Gera GmbH) zur Kalibrierung
verwendet. Das Objektmikrometer besitzt eine Miniaturskala mit 2 mm Länge in 200
Skalenteilen. Der Abstand zweier Skalenteile beträgt somit 10 µm.
Das Objektmikrometer wurde auf das Mikroskop aufgebracht und scharf gestellt.
Anschließend wurde manuell ein Bild mit der verwendeten Kamera aufgenommen. Das Bild
wurde mit dem Programm Vision Assistant Version 2013 (National Instruments) geöffnet und
die Strecken von Skalenteil zu Skalenteil vermessen, um anschließend den Mittelwert zu
bilden. Der Mittelpunkt der Linien von den Skalenteilen wird automatisch vom Programm
ermittelt. Da der Mittelpunkt der Linie aus dem grafischen Schwerpunkt ermittelt wird,
können sich Komastellen ergeben, obwohl Pixel eine diskrete Einheit darstellen.
6.4.5
Auflösungsvermögen der gewählten Komponenten
Das maximale Auflösungsvermögen eines Lichtmikroskops ist durch die Wellennatur des
Lichtes begrenzt. Die Gleichungen eines Gauß-Strahls, der als transversales Profil einer
Gauß-Kurve beschrieben wird, sollen hier als Berechnungsgrundlage dienen. In Abbildung 19
ist die Ausbreitung eines Gauß-Strahls dargestellt.
Folgend sei der Strahlradius als 𝑤(𝑧) definiert. Die Strahltaille stellt den gewünschten
Fokuspunkt des Mikroskops dar. Der Strahlradius wird durch die 𝑒 −2 –Begrenzung der GaußKurve bestimmt. An dieser Begrenzung ist die Amplitude der Gauß-Kurve auf 𝑒 −1 gefallen.
Da die Lichtintensität aus der Amplitude zum Quadrat berechnet wird, beträgt die
Lichtintensität an dieser Stelle 𝑒 −2 . Der Strahlradius an dieser Stelle wird als 𝑤0 bezeichnet
(Pedrotti et al. 2005).
37
Material und Methoden
Abbildung 19: Gauß-Strahl, der sich in z-Richtung ausbreitet
Die Strahltaille des Gauß-Strahls entspricht dem Fokuspunkt des Mikroskops. Die
1/e2-Begrenzung der Gaußkurve bestimmt den Strahlradius w(z) (Pedrotti et al. 2005, S.
649) (modifiziert).
Die folgenden Gleichungen (6.11) bis (6.18) stammen aus Pedrotti et al. (2005). Nach der
Schärfentiefe (𝑧𝑅 ) ist der Strahlradius um den Faktor √2 vergrößert. Die Schärfentiefe wird
häufig auch Rayleighlänge genannt.
𝜋 𝑤0 2
𝑧𝑅 =
𝜆
(6.11)
Wie in (6.11) zu sehen wird die Schärfentiefe durch den Strahlradius an der Strahltaille sowie
durch die Wellenlänge des Lichts (λ) bestimmt.
𝑤0
𝜆
𝜃0 = 𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎 � � = 𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎 �
�
𝑧𝑅
𝜋 𝑤0
(6.12)
Aus der Gleichung (6.12) geht hervor, dass der Tangens des halben Strahlöffnungswinkels
(𝜃0 ) dem Verhältnis von Strahlradius an der Strahltaille zur Schärfentiefe entspricht.
Weiterhin ist er aus Wellenlänge und Strahlradius an der Strahltaille berechenbar.
Die Auflösungsgrenze (𝑦𝑚𝑚𝑚 ) kann durch den Mindestabstand zweier Punkte bestimmt
werden, welche in der Abbildung getrennt auflösbar sind. Für die folgende Betrachtung wird
der Strahlradius als Abgrenzung herangezogen. Die mit diesem Kriterium berechnete
Auflösungsgrenze wird hier mit 𝑦min 𝑒 −2 benannt. Hierbei ist nicht der kleinste Strahlradius
an der Strahltaille (𝑤0 ) heranzuziehen, sondern die Schärfentiefe zu berücksichtigen. Der
dortige Strahlradius (𝑤(𝑧𝑅 )) muss für die Berechnung verwendet werden.
38
Material und Methoden
𝑦𝑚𝑚𝑚 1 = 2 𝑤(𝑧𝑅 ) = 2 √2 𝑤0
𝑒2
(6.13)
Stellt man (6.12) nach w0 um und setzt in (6.13) ein, ergibt sich folgende Abhängigkeit:
𝑦𝑚𝑚𝑚 1 =
𝑒2
2 √2 𝜆
𝜋 𝑡𝑡𝑡(𝜃0 )
(6.14)
Das Auflösungsvermögen ist nach (6.14) somit nur vom Strahlöffnungswinkel und der
Wellenlänge abhängig. Je kürzer die Wellenlänge ist, desto kleinere Strukturen sind auflösbar.
Der Öffnungswinkel verhält sich umgekehrt proportional, je größer der Öffnungswinkel ist,
desto besser die Auflösung. Wie in (6.12) zu sehen ist, hat ein hoher Öffnungswinkel jedoch
eine geringe Schärfentiefe zur Folge. Je weiter der Öffnungswinkel ist, desto größer wird das
Verhältnis von kleinstem Strahlradius an der Strahltaille zu der Schärfentiefe.
Der maximal erreichbare Strahlöffnungswinkel ist eine charakteristische Größe bei
Mikroskopobjektiven und wird meist als numerische Apertur (𝐴𝑁 ) angegeben.
𝐴𝑁 = 𝑛𝑖 𝑠𝑠𝑠(𝜃0 )
(6.15)
Die numerische Apertur wird als Produkt aus dem Brechungsindex des Immersionsmediums
(𝑛𝑖 ) und dem halben objektseitigen Strahlöffnungswinkel (𝜃0 ) definiert. Aus (6.14) und (6.15)
ergibt sich folgender Zusammenhang:
𝑦𝑚𝑚𝑚 1 =
𝑒2
2 √2 𝜆
𝐴
𝜋 𝑡𝑡𝑡 �𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑛 𝑛𝑁 �
𝑖
(6.16)
Die elektrische Feldstärkenverteilung zweier Punkte mit dem Abstand 𝑦min 𝑒 −2 sowie die
daraus resultierende Intensitätsverteilung sind in Abbildung 20 dargestellt.
Die Verteilung der elektrischen Feldstärke erweckt zunächst den Eindruck, dass die
Lichtpunkte schwer als getrennte Punkte wahrnehmbar sind. Die Intensität verhält sich jedoch
proportional zur quadrierten Amplitude der Feldstärke. Dadurch ist ein deutlicher Kontrast
der beiden Maxima zum Minimum zwischen den Punkten zu erkennen.
𝐼 ∝ 𝐸2
(6.17)
39
Material und Methoden
Abbildung 20: Verteilung der elektrischen Feldamplitude zweier Lichtpunkte
Oben: Verteilung der elektrischen Feldamplitude (E) von zwei Lichtpunkten an den
Positionen (y1, y2) mit dem Abstand ymin1/e². Die Verteilung wird an den charakteristischen
Stellen z0 und zR abgebildet. Mit EØ wird die resultierende Verteilung der elektrischen
Feldamplitude (EØ1 + EØ2) ermittelt. Unten: Verteilung der normierten
Feldamplitudenverteilung (EØ1 + EØ2) sowie die daraus resultierende Intensitätsverteilung
(IØ1 + IØ2).
In den vorangegangen Erläuterungen wurde gezeigt, dass die Verwendung eines Objektivs
mit hoher numerischer Apertur sowie der Einsatz von kurzwelligem Licht die Auflösung
positiv beeinflussen.
6.4.6
Bewegungsunschärfe
Einen weiteren schärfebeeinflussenden Faktor stellt die Bewegungsunschärfe dar. Die
Belichtungszeit der Kamera CCD-Sensoren kann nicht unendlich klein sein, daher bewegt
sich der Partikel während der Aufnahmezeit weiter fort. Somit ist eine Bewegungsunschärfe
im Bild zu beobachten. Die Bewegungsunschärfe (𝑈𝐵 ) ergibt sich aus dem Produkt der
Objektgeschwindigkeit (𝑣𝑂 ) und der Belichtungszeit (𝑡𝐵 ).
𝑈𝐵 = 𝑣𝑂 ∙ 𝑡𝐵
(6.18)
Als nicht sichtbarer Schärfeverlust wird hier eine Unschärfe von halber Seitenlänge eines
Pixels definiert.
40
Material und Methoden
6.4.7
Bildspeicherung
Die Bildaufnahmefunktion ist in der Kontrollsoftware des Fermenters integriert. In den
Grundeinstellungen besteht eine Bildserie aus 30 Aufnahmen. Mit einer Bildrate von 30 fps
stellt dies ein Zeitfenster von einer Sekunde dar.
Die aufgenommene Bildserie wird nicht direkt ausgewertet, sondern zunächst im PNGFormat auf die Festplatte des Kontrollrechners gespeichert. Die Bildserien sind so
dokumentiert und können später jederzeit begutachtet werden. Das PNG-Format ist ein weit
verbreitetes Datenformat für Grafiken. Es verfügt über eine verlustfreie Komprimierung und
ist lizenzfrei. Die Abspeicherung von RGB-Grafiken mit 8 bit pro Farbkanal ist problemlos
möglich.
Die automatisierte Bildserienauswertung lädt die Bildserien und wertet die Kenndaten
automatisch aus. Die Bildserienauswertung kann von der Fermenter-Kontrollsoftware direkt
nach der Messung gestartet werden, eine nachträgliche Auswertung einer beliebigen,
gespeicherten Bildserie kann jedoch auch jederzeit manuell gestartet werden.
Für manuelle Analysen, z.B. der Bewegungsmuster, können ebenso Bildserien über längere
Zeitfenster aufgenommen werden. Die Obergrenze wird hierbei hauptsächlich vom
Arbeitsspeicher und der Festplattengeschwindigkeit gesetzt. Bildserien über fünf Sekunden
(150 Aufnahmen pro Bildserien) stellen auch für Standard Labor- oder Bürorechner (Pentium
Dual-Core 2,6 GHz, 4 GB-Arbeitsspeicher, Windows 7) kein Problem dar.
6.5
Automatisierte Bildserienanalyse
Durch die Bildauswertung werden die Anzahl der beweglichen Bakterien sowie deren
Bewegungsgeschwindigkeit erfasst. Weiterhin können Aussagen über die Form (Länge,
Breite) und das Bewegungsmuster der Bakterien aus den Daten getroffen werden.
6.5.1
Bildanalyse
Unschärfe, wechselnde Belichtung, leicht schwankende Schichtdicken, Partikel aus dem
Nährmedium und nicht voraussagbares Verhalten der Bakterien stellen große
Herausforderungen an eine automatisierte Bildauswertung. Die automatisierte Bildauswertung
wurde in NI LabVIEW 2013 mit NI LabVIEW Vision Development Module (National
Instruments) programmiert. Die vereinfachte Softwarestruktur der Bildserienauswertung ist in
Abbildung 21 dargestellt.
41
Material und Methoden
Abbildung 21: Schematischer Programmablauf der Bildauswertung
Zunächst wird eine Bildserie, bestehend aus 30 Aufnahmen, geladen. Nach Vorfilterung
und indizierter Seriensubtraktion werden die Partikelkenndaten bestimmt. Aus den
Partikelkenndaten der einzelnen Aufnahmen können die Bakterien zugeordnet und verfolgt
werden. Bevor das Ergebnis bereitgestellt wird, muss eine Nachbearbeitung vorgenommen
werden. Außerdem müssen die Daten aus dem Pixelraum in den metrischen Raum
transformiert werden.
Im ersten Schritt wird die Bildserie geladen und die beweglichen Partikel werden in jedem
einzelnen Bild durch die indizierte Seriensubtraktion hervorgehoben. Dies ist ähnlich dem
Vorgehen von Junker et al. (2007), die aus den laufenden Aufnahmen stetig ein
Durchschnittshintergrundbild generieren und dieses von der aktuellen Aufnahme abziehen. In
den nächsten Schritten werden die Partikelkenndaten bestimmt und den Bakterien zugeordnet.
Diese Zuordnung muss gegebenenfalls mehrmals überarbeitet werden, bevor das Ergebnis auf
den metrischen Raum transformiert und bereitgestellt wird. Das Programm zur automatischen
Auswertung der Bildserien inkl. Benutzeroberfläche kann autark arbeiten oder als
Unterprogramm von überlagerten Programmen aufgerufen werden. Dies ermöglicht zum
einen die Untersuchung ausgewählter Bildserien oder das Ausführen direkt aus dem
Steuerungsprogramm des Fermenters, wie auch das Ausführen aus übergeordneten
Programmen, die z.B. mehrere Bildserien ganzer Fermentationsverläufe abarbeiten.
6.5.2
Bildserie laden
Die Bildanalyse ist auf die Auswertung von digitalen Bildern im PNG-Format mit den
Abmessungen 1280 x 960 Pixel optimiert. Der Programmstart mit dem Laden der Bildserie
kann manuell auf eine beliebige, gespeicherte Bildserie angewandt werden oder direkt
automatisch, z.B. nach der Bildaufnahmefunktion, ausgeführt werden. In jedem Fall bleiben
die gespeicherten Bilder im Original erhalten und werden nicht durch die Bildauswertung
manipuliert.
42
Material und Methoden
6.5.3
Indizierte Seriensubtraktion
Vor der indizierten Seriensubtraktion werden die Farbbilder in Grauwertbilder gewandelt. Es
wird hierfür die integrierte LabVIEW-Funktion „IMAQ ExtractSingleColorPlane“ genutzt.
Mit der Funktion ist es möglich, die Werte verschiedener Farbebenen zu extrahieren und in
ein Grauwertbild zu wandeln. Hierzu wird dem zur gewählten Ebene gehörenden Wert der
einzelnen Pixel ein Grauwert von 0 (schwarz) bis 255 (weiß) zugeordnet. In Tabelle 3 sind die
verschiedenen Ebenen, die aus dem Farbbild extrahiert werden können, angegeben.
Tabelle 3: Wandlungsmöglichkeiten von einem Farb- zu einem Grauwertbild
Die Einstellmöglichkeiten zur Wandlung eines RGB-Bildes in ein Grauwertbild der
LabVIEW-Funktion „IMAQ ExtractSingleColorPlane“.
Red
Der Rot-Wert des Pixels wird extrahiert (RGB-Farbraum)
Green
Der Grün-Wert des Pixels wird extrahiert (RGB-Farbraum)
Blue
Der Blau-Wert des Pixels wird extrahiert (RGB-Farbraum)
Hue
Der Farbwert des Pixels wird extrahiert (HSL-Farbraum)
Saturation
Die Farbsättigung des Pixels wird extrahiert (HSL-Farbraum)
Luminance
Die Farbhelligkeit des Pixels wird extrahiert (HSL-Farbraum)
Value
Die Helligkeit des Pixels wird extrahiert (HSV-Farbraum)
Intensity
Die Lichtintensität des Pixels wird extrahiert (HSI-Farbraum)
Zum näheren Verständnis der weiteren Operationen sind folgende Definitionen notwendig:
Der Matrizenraum bestehe aus dem Tripel [ℳ, +,∙] über dem Körper ℝ𝑚×𝑛 , mit der Menge
ℳ, der Abbildung der komponentenweisen Addition
⟨+⟩ ∶ ℳ × ℳ → ℳ
(𝐴, 𝐵) ↦ 𝐴 + 𝐵 = (𝑎𝑖𝑖 + 𝑏𝑖𝑖 )
und der Abbildung der komponentenweisen skalaren Multiplikation.
⟨∙⟩ ∶ ℝ × ℳ → ℳ
(𝜆, 𝐴) ↦ 𝜆 ∙ 𝐴 = (𝜆 ∙ 𝑎𝑖𝑖 ).
Zusätzlich ist der komponentenweise Absolutwert definiert durch
⟨𝑎𝑎𝑎⟩ ∶ ℳ → ℳ
(𝐴) ↦ 𝑎𝑎𝑎(𝐴) = (�𝑎𝑖𝑖 �).
Seien nun die digitalen Bilder (Matrizen) 𝐴, 𝐵 ∈ ℳ mit der Auflösung (Dimensionen) 𝑚 × 𝑛,
bestehend aus Bildpunkten (Komponenten) 𝑎𝑖𝑖 , 𝑏𝑖𝑖 , so kann die indizierte Seriensubtraktion
wie folgt ausgedrückt werden:
43
Material und Methoden
𝑙−1
30
𝑘=1
𝑘=𝑙+1
𝐵𝑙 = � 𝑎𝑎𝑎(𝐴𝑘 − 𝐴𝑙 ) + � 𝑎𝑎𝑎(𝐴𝑘 − 𝐴𝑙 )
(6.19)
Aus den 30 Aufnahmen einer Bildserie 𝐴 werden über die indizierte Seriensubtraktion (6.19)
30 Summen-Differenzbilder 𝐵 erstellt. Die aktuell indizierte Aufnahme 𝐴𝑙 wird hierbei von
allen anderen Bildern der Serie 𝐴𝑘 komponentenweise subtrahiert und der komponentenweise
Absolutwert (Pixel = Komponenten) wird gebildet. Aus den einzelnen Ergebnissen wird ein
Summen-Differenzbild 𝐵𝑙 über eine komponentenweise Addition erzeugt.
Anschließend wird aus dem Summen-Differenzbild das Bildrauschen reduziert sowie der
Kontrast erhöht. Alleine durch die Erstellung eines Summenbildes über 30 Aufnahmen wird
das Rauschen minimiert. Da das Rauschen von Bild zu Bild in einem Bereich um den wahren
Wert schwankt, mitteln sich die positiven und negativen Ausschläge weitgehend heraus. Da
es sich jedoch um Differenzbilder handelt, sind auch kleine Differenzen, die durch das
Rauschen zurückbleiben, störend.
Zur Unterdrückung des verbleibenden Rauschens kommt die Anwendung eines Tiefpassfilters
in Frage. Dadurch verliert das Bild aber an Schärfe. Da das Rauschen vor allem dort stört, wo
keine Bewegung stattgefunden hat, das Bild somit schwarz sein sollte (Pixelwert 0), ist es
auch möglich, von der Bildmatrix einen konstanten Wert abzuziehen, oder aber Pixel
unterhalb eines Schwellwerts auf 0 zu setzen. Weiterhin wird durch die Differenzbildung der
Dynamikbereich des Bildes nicht voll ausgenutzt. Haben sich z.B. nur Werte zwischen 0 –
100 aus der Differenzbildung ergeben, können diese durch die Multiplikation mit 2,55 auf
einen Bereich von 0 – 255 gespreizt werden, um den Kontrast in den Bildern zu erhöhen. In
der gegebenen Anwendung wurden durch folgende Berechnung das Rauschen eliminiert und
der Kontrast erhöht:
𝐵𝑙 = (𝐵𝑙 − 2
𝑛
∑𝑚
𝑖=0 ∑𝑗=0 𝑏𝑖𝑖
𝑚+𝑛
)
255
max max 𝑏𝑖𝑖
(6.20)
𝑖→𝑚 𝑗→𝑛
Der zweifache Mittelwert über die Pixel wird abgezogen, um kleine Differenzen, die aufgrund
von Bildrauschen entstehen, zu entfernen. Der Kontrast wird anschließend durch eine
Multiplikation auf den Wertebereich von 0 – 255 gespreizt. Gleichung (6.20) würde
mathematisch auch negative Pixelwerte erzeugen. Aufgrund der internen Datentypwandlung
im LabVIEW-Programm werden an dieser Stelle jedoch negative Werte auf Null gesetzt.
6.5.4
Bestimmung der Partikelkenndaten
Die Funktion der Partikelkenndatenbestimmung basiert auf der Grundlage des
Unterprogramms „IMAQ Particle Analysis“ aus dem LabVIEW NI Vision Development
Module. Hier werden für jedes Summen-Differenzbild mehrere gefundene Partikel mit
zugehörigen Partikelmerkmalen (z.B. Schwerpunkt in X,Y-Bildkoordinaten, Durchmesser,
Fläche, Orientierung, etc.) in einer Partikelmatrix 𝐷 gespeichert.
44
Material und Methoden
Vor der Bestimmung der Partikelmerkmale werden sehr kleine Partikel herausgefiltert. Dies
ist ein gängiges Vorgehen in Arbeiten mit dem Schwerpunkt der Bildanalyse aus
Mikroskopie-Aufnahmen (Pons et al. 1993; Tucker et al. 1994).
Um kleine Objekte (Bildstörungen, Kleinstpartikel im Medium) aus den Bildern zu
eliminieren, ist es zum einen möglich, die Grauwertbilder vor der Binarisierung mit einem
Tiefpassfilter (z.B. Mittelwertfilter) oder einem morphologischen Filter (Erosion) zu
behandeln. Eine weitere Möglichkeit bietet die Anwendung der Erosion direkt auf das
Binärbild. Durch die Filter werden jedoch auch die größeren Objekte in ihrer Erscheinung
verändert. Die Anwendung eines gegensätzlich wirkenden Filters, nachdem die kleinen
Objekte eliminiert wurden, kann die verbleibenden großen Objekte wieder an ihre
ursprüngliche Erscheinung angleichen, jedoch bleibt das Ergebnis nur eine Annäherung an
das Original. Die Dilatation, nach der Erosion auf ein Binärbild angewendet, führt zu der
beschriebenen annäherungsweisen Wiederherstellung der ursprünglichen Größe.
Soll eine Veränderung der großen Partikel durch das Programm vermieden werden sind
komplexere Algorithmen notwendig. Im LabVIEW NI Vision Development Module steht
hierfür eine eigene Funktion zur Verfügung („IMAQ RemoveParticle“). In diesem
Unterprogramm wird eine zweifache Erosion des Bildes durchgeführt. Partikel, die durch die
Erosion verschwinden, werden zur Partikelkenndatenbestimmung nicht herangezogen. Im
Gegensatz zur Anwendung einer gewöhnlichen zweifachen Erosion werden die Partikel, die
nicht verschwinden, durch die Funktion jedoch nicht in Größe und Form verändert.
6.5.5
Zuordnung der Bakterien zu den Kenndaten
Um die Bakterien den verschiedenen Kenndaten zuzuordnen, wird zunächst die Fehlermatrix
𝐸 gebildet.
6
𝑒𝑙𝑙𝑙 = � 𝑤𝑞 ∙ �𝑑𝑙𝑙𝑙 − 𝑑𝑙+1𝑟𝑟 �
(6.21)
𝑞=1
In (6.21) wird die Summe der Merkmalsdifferenzen aller gefundener Partikel in Bild 𝑙 zu
allen gefundenen Partikeln in Bild 𝑙 + 1 berechnet. 𝑒𝑙𝑙𝑙 ist hier eine Komponente der
dreidimensionalen Fehlermatrix 𝐸, wobei der Index 𝑙 die Nummer des Bildes, 𝑝 die Nummer
des Partikels in Bild 𝑙 und 𝑟 die Nummer des Partikels in Bild 𝑙 + 1 darstellt. Ebenso ist 𝑤
eine Komponente des Gewichtungsarrays 𝑊 und 𝑑 eine Komponente der Partikelmatrix 𝐷.
Der Index 𝑞 steht hier für die Nummer des indizierten Merkmals (z.B. Schwerpunkt, Fläche,
etc.). Zum besseren Verständnis ist die Berechnung in Abbildung 22 in einem vereinfachten
Programmablaufplan gezeigt.
45
Material und Methoden
Abbildung 22: Vereinfachter Programmablaufplan für die Zuordnung der Kenndaten
Die Fehlermatrix wird in einer dreifachen Schleife erzeugt. Es wird die Summe der
gewichteten Merkmalsdifferenzen zwischen jedem Partikel aus Bild 𝑙 und jedem Partikel
aus Bild 𝑙+1 gebildet.
Es ist zu sehen, dass die dreidimensionale Fehlermatrix 𝐸 in einer dreifachen Schleife erzeugt
wird. Die Summe der gewichteten Merkmalsdifferenzen aller gefundenen Partikel in je zwei
aufeinanderfolgenden Bildern wird in der Fehlermatrix 𝐸 gespeichert.
Auf Grundlage der Fehlermatrix 𝐸 und der Partikelmatrix 𝐷 wird die Zuordnung der
einzelnen Partikel zueinander realisiert. Dies geschieht in einem komplexen
Zuordnungsalgorithmus, der über die kleinsten Merkmalsdifferenzen die zueinander
gehörenden Partikel findet und in einer Bakterienmatrix 𝐶 speichert. Hier findet die
Wegverfolgung der einzelnen Bakterien statt. Der Algorithmus verhindert
Mehrfachzuweisungen, wenn sich mehrere Bakterien kreuzen oder nahe beieinander
schwimmen. Weiterhin registriert der Algorithmus das Herausschwimmen von Bakterien aus
dem Aufnahmebereich sowie das Hineinschwimmen in den Aufnahmebereich. Sobald kein
Partikel im folgenden Bild gefunden wird, dessen Merkmalsdifferenz kleiner als ein
Schwellenwert ist, wird dem Bakterium kein weiterer Punkt zugeordnet. Das LabVIEWUnterprogramm „Wegverfolgung“ ist im Anhang (Seite 108) dargestellt.
46
Material und Methoden
Es ist möglich, dass sich die Partikelmerkmale eines Bakteriums von einem Bild zum
nächsten stark unterscheiden. Ist die Summe der Merkmalsdifferenz größer als die zulässige
Schwelle, wird der Weg des Bakteriums beendet und das Bakterium wird im nächsten Bild als
ein neues Bakterium geführt. Die möglichen Ursachen für große Merkmalsdifferenzen werden
in Kapitel 8.3 diskutiert.
6.5.6
Nachbearbeitung der Zuordnung
Wie in der Arbeit zur 2D-Wegverfolgung von Kang Li et al. (2006), bei der im Modul „Cell
Arbitrator“ eine Nachbearbeitung der Zuordnungen durchgeführt wird, ist auch hier eine
Nachbearbeitung der Zuordnung nötig. Ähnlich dem Modul des „Cell Arbitrator“ wurde ein
eigenes Unterprogramm zur Nachbearbeitung der Zuordnung erstellt.
In diesem Unterprogramm der Bildanalysesoftware werden zunächst mögliche
Unterbrechungen in der Wegverfolgung einzelner Bakterien zusammengeführt. Hierfür
werden für gefundene Wege, die mitten in der Bildserie enden, passende Wege gesucht, die
mit dem folgenden Bild beginnen. Die identifizierten Teilwege, die zu dem vorzeitig
beendeten Weg passen könnten, werden anhand einiger Kriterien auf Übereinstimmung zu
dem vorangegangenen Teilweg überprüft. Hierfür werden Richtung und Geschwindigkeit der
ersten Teilstrecke berechnet. Anschließend überprüft das Programm, ob einer der möglichen
Anknüpfungspunkte sich in der Nähe des nächsten erwarteten Wegpunktes befindet. Passt der
Anfangspunkt einer der Teilstrecken, werden noch morphologische Merkmale (z.B. Länge,
Fläche) der Bakterien miteinander verglichen. Sind auch diese Merkmale ausreichend ähnlich,
werden die beiden passenden Teilstrecken zu einem neuen Weg zusammengeführt. Dieser
Vorgang wird solange ausgeführt, bis keine Teilstrecken mehr zueinander passen.
Im nächsten Schritt werden kurze Wege, die nur in wenigen Bildern gefunden wurden, aus
der Zuordnung gelöscht. Zuordnungen von sehr kurzen Wegen stellen häufig falsch erkannte
Partikel dar, oder aber Bakterien, die nur kurz den Bildaufnahmebereich gestreift haben.
Warum Partikel mit kurzen Wegstrecken im Ergebnis nicht als bewegliches Bakterium
gewertet werden sollten, wird in Kapitel 8.3 erörtert.
6.5.7
Bereitstellung des Ergebnisses
Die Daten liegen nach der Nachbereitung der Zuordnung als dreidimensionales Array im
Pixelraum vor. Der erste Index des dreidimensionalen Arrays entspricht der Nummer der
erkannten Bakterien. Für jedes Bakterium ist eine Spalte pro Aufnahme, in der das Bakterium
erkannt wurde, vorhanden. In den Zeilen sind die x,y-Koordinaten, die Orientierung, der
Umfang, die Fläche, die Länge und die Breite, die im jeweiligen Bild ermittelt wurden,
aufgetragen. Im ersten Schritt der Ergebnisbereitstellung werden diese dreidimensionalen
Arrays in ein Array aus Datenclustern gewandelt. Hierfür wird für jedes Bakterium jeweils
der Durchschnitt aus den Werten für Umfang, Fläche, Länge und Breite berechnet. Weiterhin
werden die einzelnen x,y-Koordinaten mit Orientierung im Cluster gespeichert. Neben dem
Datenclusterarray wird ein Array aus den Einzelgeschwindigkeiten erstellt. Alle Daten
befinden sich hier zunächst noch im Pixelraum (siehe Abbildung 23).
47
Material und Methoden
Abbildung 23: Ablauf der Ergebnisbereitstellung
Zunächst stehen die reinen Pixeldaten der Wegverfolgung der einzelnen Bakterien in einem
dreidimensionalen Array zur Verfügung. Aus diesem wird ein Array aus
Einzelgeschwindigkeiten gebildet sowie ein Array aus Datenclustern. Anschließend
werden die Daten aus dem Pixelraum in das metrische System umgerechnet.
Im letzten Schritt werden die Daten aus dem Pixelraum in das metrische System skaliert. Die
Pixel werden in µm umgerechnet und die Geschwindigkeiten, die zunächst in Pixeldifferenzen zwischen zwei Bildern ausgedrückt wurden, werden in µm s-1 umgerechnet.
Als Ergebnis stehen schließlich ein Array aus Datenclustern sowie ein Array aus
Einzelgeschwindigkeiten bereit. Im Datencluster sind für jedes Bakterium die
Durchschnittswerte der morphologischen Daten (Umfang, Fläche, Länge, Breite) aus den
einzelnen Aufnahmen, die Durchschnittsgeschwindigkeiten sowie die einzelnen Koordinaten
und Orientierungen eingetragen. Im Array aus Einzelgeschwindigkeiten sind die
Einzelgeschwindigkeiten in µm s-1 angegeben. Die Daten können zum einen in verschiedene
Dateiformate (.txt, .csv, .xls) exportiert werden, um diese mit beliebigen Programmen
auszuwerten, oder direkt an ein überlagertes Programm übergeben werden.
6.6
Programm zur interaktiven Erfassung der Bewegungsmuster
Zur Verfolgung und Analyse der Bewegungsmuster der Bakterien wurde ein interaktives
Auswerteprogramm entwickelt. Dieses Programm wurde ebenso mit NI LabVIEW 2013 inkl.
NI LabVIEW Vision Development Module (National Instruments) programmiert. Im
Programm können die Aufnahmen einer Bildserie nacheinander aufgerufen werden. Die
Länge der Bildserie ist variabel. Je länger der Aufnahmezeitraum ist, desto genauer können
die Bewegungsformen erfasst werden. Auf der linken Seite des Programms werden die
Aufnahmen der gewählten Bildserie dargestellt. Bakterien, deren Bewegung nachverfolgt
wird, werden dort mit einer Nummer versehen. Der Verlauf der Mikroorganismen wird
interaktiv von Bild zu Bild mit Hilfe des Mauszeigers und der Eingabetaste dokumentiert.
Damit ist die Bewegung des Bakteriums in jeder Aufnahme durch die x- und y-Koordinate
festgelegt. Diese Daten können für jedes Bakterium exportiert werden (z.B. Excel). In
Abbildung 24 ist ein Beispielbild aus dem Programm zur interaktiven Erfassung der
Bewegungsmuster dargestellt.
48
Material und Methoden
Abbildung 24: Aufnahme aus dem Programm zur Erfassung der Bewegungsmuster
Exemplarisches Bild von Minute 225 aus Fermentation 4 (B. amyloliquefaciens FZB42 in
Standard-Nährmedium-I-¼), dargestellt im Programm zur interaktiven Erfassung der
Bewegungsmuster. Zu sehen sind die Bakterien mit Nummer und die Nachverfolgung der
Bewegungen. Die Stelle, an der die Nummer steht, ist der Startpunkt bei Bild 0. Mit dem
interaktiven Programm sollen charakteristische Bewegungsmuster identifiziert und die
Anzahl des Auftretens der einzelnen Muster ermittelt werden.
Zusätzlich zur Erfassung der Bewegungsmuster gibt es die Möglichkeit, die zurückgelegte
Strecke und die Geschwindigkeit von Punkt zu Punkt zu erfassen. Dies ist für die Auswertung
der Bewegungsformen nicht von Bedeutung, jedoch konnte das interaktive Programm so auch
für die Validierung der Geschwindigkeitsbestimmung aus der automatischen Bildanalyse
verwendet werden.
Den einzelnen charakteristischen Bewegungsmustern wurden dann Kategorien zugewiesen
und nach Anzahl der Beobachtungen ausgewertet. Aus der Anzahl der Beobachtungen
wurden Kreisdiagramme erstellt, um das Auftreten der einzelnen Bewegungsmuster zu
visualisieren.
6.7
Statistische Auswertung
Die Einzelgeschwindigkeitsverteilung der vier charakteristischen Fermentationszeitpunkte
(exponentielle Wachstumsphase durch Kohlenhydratverbrauch und Säurebildung,
Diauxiestufe, Wachstum durch Säureverbrauch und Sporulation) aus Fermentation 1 – 3
wurde auf Normalverteilung überprüft. Die Überprüfung wurde mit Shapiro-Wilk-,
Anderson-Darlingund
Cramér-von-Mises-Test
durchgeführt.
Nachdem
die
Einzelgeschwindigkeitsverteilung als nicht normalverteilt befunden wurde, konnte der
49
Material und Methoden
Wilcoxon-Rangsummentest (auch Mann-Whitney-U-Test) (Wilcoxon 1945; Mann und
Whitney 1947)
zur
Überprüfung
auf
signifikante
Unterschiede
in
den
Einzelgeschwindigkeitsverteilungen
eingesetzt
werden.
Hierzu
wurde
die
Einzelgeschwindigkeitsverteilung zur Diauxiestufe gegen die Verteilung der anderen drei
charakteristischen Fermentationszeitpunkte getestet. Beim Wilcoxon-Rangsummentest wird
überprüft, ob zwei Messreihen der gleichen Grundgesamtheit angehören. Kann die
Nullhypothese abgelehnt werden, kann eine signifikante Differenz zwischen den Messreihen
angenommen werden. Als Ergebnis aus dem Wilcoxon-Rangsummentest erhält man den pWert. Der p-Wert ist ein Wahrscheinlichkeitswert und kann Werte zwischen 0 und 1
annehmen. Je kleiner der p-Wert, desto eher kann die Nullhypothese verworfen werden. Die
Grenze, um die Nullhypothese sicher abzulehnen, wurde auf 0,05 gesetzt. Die Tests auf
Normalverteilung sowie der Wilcoxon-Rangsummentest wurden mit dem Statistikprogramm
R durchgeführt.
Ebenso wurden die Einzelgeschwindigkeitsverteilungen der sechs charakteristischen
Fermentationszeitpunkte (exponentielles Wachstum durch Glukoseverbrauch und
Säurebildung, Diauxiestufe I, exponentielles Wachstum durch Stickstoff- und
Säureverbrauch, Diauxiestufe II, Wachstum durch reinen Säureverbrauch, Sporulation) aus
Fermentation 4 – 6 statistisch untersucht. Die nicht normalverteilten Einzelgeschwindigkeitsverteilungen wurden wie bei Fermentation 1 – 3 mit dem Wilcoxon-Rangsummentest auf
signifikante Unterschiede untersucht. Es wurden jeweils die beiden Diauxiestufen gegen die
fünf anderen Geschwindigkeitsverteilungen getestet.
Die Messdaten aus dem Experiment zur Ermittlung des Einflusses der Scherkraft auf die
Beweglichkeit der Bakterien wurden ebenso mit dem Statistikprogramm R ausgewertet. Mit
Hilfe des Shapiro-Wilk-, Anderson-Darling- und Cramér-von-Mises-Tests wurden die Daten
auf Normalverteilung überprüft. Liegt das Ergebnis aller drei Tests über 0,05, können die
Daten als normalverteilt angenommen werden. Signifikate Unterschiede der Mittelwerte
wurden mit dem Zweistichproben-t-Test und der Varianzen mit dem F-Test untersucht. Auch
bei diesen Tests wurde ein Signifikanzniveau von 0,05 gewählt, liegt der Wert über 0,05 kann
nicht von signifikanten Unterschieden ausgegangen werden.
50
Ergebnisse
7
Ergebnisse
Die Ergebnisse sind in zwei Unterkapitel gegliedert. Zunächst werden die technischen
Ergebnisse, die zur Entwicklung des Messsystems notwendig waren erläutert. Zum anderen
werden die mit dem entwickelten Messsystem erhaltenen Messergebnisse aus den
Beispielanwendungen gezeigt.
7.1
Technische Ergebnisse
Die Ergebnisse, die zur Entwicklung und Optimierung des in Kapitel 6 beschriebenen
Messsystems geführt haben, sind im Folgenden aufgeführt.
7.1.1
Vermessung der Medien
Die Dichte, kinematische und dynamische Viskosität des Standard-Nährmediums-I-¼ und
des ABiTEP-Mediums-¼ bei 35 °C sind in Tabelle 4 zu sehen.
Tabelle 4: Eigenschaften des Standard-Nährmediums-I-¼ und ABiTEP-Mediums-¼
Viskosität und Dichte der verwendeten Medien bei 35 °C.
Dichte [g l-1]
kinematische Viskosität [mm2 s-1]
dynamische Viskosität [Pa s]
StandardNährmedium-I-¼
996,5
0,785
0,7818
ABiTEP-Medium-¼
997,9
0,805
0,8028
Das Fließverhalten der beiden Medien ist in Abbildung 25 dargestellt.
Abbildung 25: Fließverhalten von Standard-Nährmedium-I-¼ und ABiTEP-Medium-¼
Das Fließverhalten des Standard-Nährmediums-I-¼ (gestrichelte Linie) und des ABiTEPMediums-¼ (durchgezogen Linie) bei 35 °C wurden mit dem Rheometer Physica UDS 200
(Anton Paar, Österreich) mit dem Messsystem Z1 DIN gemessen. Zur Kalibrierung der
Messung wurde Wasser bei 35 °C verwendet.
51
Ergebnisse
Das Kapillarviskosimeter liefert genauere Viskositätswerte als das Scherrheometer. Daher
werden die Fließkurven der Medien nur zur Beurteilung des Fließverhaltens und nicht zur
Bestimmung der absoluten Viskosität herangezogen. Die dynamische Viskosität bleibt bei
steigender Scherrate annähernd konstant, daher kann für beide Medien newtonsches
Fließverhalten angenommen werden.
7.1.2
Bestimmung der Scherkräfte
Der Durchfluss durch die Küvette beträgt etwa 30 𝑚𝑚 𝑚𝑚𝑚−1 (siehe Kapitel 6.4.3). Nach (6.6)
ergeben sich für das ABiTEP-¼-Medium (𝜈 = 0,805 𝑚𝑚2 𝑠 −1 ) und das StandardNährmedium-I-¼ (𝜈 = 0,785 𝑚𝑚2 𝑠 −1 ) die in Tabelle 5 gezeigten Strömungsverhältnisse.
Tabelle 5: Strömungsverhältnisse im Messsystem
Die Strömungsverhältnisse (querschnittgemittelte Strömungsgeschwindigkeit (um) und
Reynoldszahl (Re)) im Messsystem mit Standard-Nährmedium-I-¼ und ABiTEP-Medium¼ bei 35 °C und einem Durchfluss von 30 ml min-1.
StandardNährmedium-I-¼
ABiTEPMedium-¼
Rohr D = 2 mm
Spalte 24 x 1 mm
Spalte 36 x 1 mm
Rohr D = 2 mm
Spalte 24 x 1 mm
Spalte 36 x 1 mm
um [mm s-1]
159
20,8
13,9
159
20,8
13,9
Re
405,5
26,5
17,7
395,4
25,9
17,3
Damit liegen die Reynoldszahlen weit unter der kritischen Reynoldszahl von 2300 und die
Gleichungen für laminare Strömungen sind gültig. Bei bekanntem Durchfluss (30 𝑚𝑚 𝑚𝑚𝑚−1 )
und bekannter Geometrie (Rohr 𝐷 = 2 𝑚𝑚 , Spalt 𝐻 = 1 𝑚𝑚, 𝐵 = 24 𝑚𝑚 und Spalt
𝐻 = 1 𝑚𝑚, 𝐵 = 36 𝑚𝑚) können mit Hilfe der Gleichungen (6.1) bzw. (6.2) die
Geschwindigkeitsprofile im Rohr und in den Spalten berechnet werden. Unter
Berücksichtigung der kinematischen Viskosität des ABiTEP-Mediums-¼ (𝜂 =
0,8028 𝑃𝑃 𝑠) und des Standard-Nährmediums-I-¼ (𝜂 = 0,7818 𝑃𝑃 𝑠) sowie der Gleichungen
(6.3) und (6.4) sind die Schubspannungen berechenbar. In Abbildung 26 sind die
Geschwindigkeiten und die Schubspannungen in Abhängigkeit vom Durchmesser bzw. von
der Höhe dargestellt. Es ist jeweils nur der halbe Durchmesser bzw. Höhe dargestellt, die
andere Hälfte verhält sich symmetrisch.
Die höchsten Schubspannungen treten mit 500 Pa am Rand der Zu- und Ableitungen auf. Die
Scherkräfte sind proportional zu den Schubspannungen.
52
Ergebnisse
Abbildung 26: Geschwindigkeiten und Schubspannungen von Standard-Nährmedium-I¼ und ABiTEP-Medium-¼ in der Durchflussküvette
Dargestellt sind die Geschwindigkeitsprofile für eine laminare Strömung bei einem
Durchfluss von 30 ml min-1 in einem Rohr mit 2 mm Durchmesser (links oben), in einem
Spalt mit 1 mm Höhe und 24 mm Breite (links Mitte) und einem Spalt mit 1 mm Höhe und
36 mm Breite (links unten). Das Geschwindigkeitsprofil bildet sich bei dem ABiTEPMedium-¼ (durchgezogene Linie) und Standard-Nährmedium-I-¼ (gestrichelte Linie)
jeweils gleich aus. Weiterhin sind die Schubspannungen mit zwei unterschiedlichen
Flüssigkeiten ABiTEP-Medium-¼ (η = 0,803 Pa s) und Standard-Nährmedium-I-¼ (η =
0,782 Pa s) für das Rohr (rechts oben), den 24 mm-Spalt (rechts mitte) und den 36 mmSpalt (rechts unten) berechnet.
Die Strömungsverhältnisse im Referenzsystem zur Bestimmung der kritischen
Schubspannungen (siehe Kapitel 6.4.2) sind in Tabelle 6 gezeigt. Zu jeder Kapillare wurden
fünfzehn Proben vermessen. Der prozentuale Anteil an beweglichen Bakterien pro Bildstrecke
in Abhängigkeit des Kapillarinnendurchmessers wurde ermittelt.
53
Ergebnisse
Tabelle 6: Strömungsverhältnisse in den Messkapillaren bei Standard-Nährmedium-I-¼
Die wichtigsten Kennwerte zu den Strömungsverhältnissen mit Standard-Nährmedium-I-¼
bei 35 °C (η = 0,782 Pa s, 𝜈 = 0,785 𝑚𝑚2 𝑠 −1) in den Kapillaren im Messsystem zur
Bestimmung der kritischen Schubspannungen von B. amyloliquefaciens FZB42.
Kapillarinnendurchmesser [mm]
1,0
0,5
0,25
Reynoldszahl
108
216
432
Mittlere Geschwindigkeit um [mm s-1]
84,8
339,5
1.358
Maximale Geschwindigkeit umax [mm s-1]
169,8
679
2.716
Maximale Schubspannung 𝜏max [Pa]
525,5
4.161,8
33.294
Die Mittelwerte des Anteils der beweglichen Zellen betragen 28,46% ± 13,66% bei 0,25 mm
Kapillarinnendurchmesser, 28,14% ± 11,34% bei 0,5 mm und 28,88% ± 12,70% bei 1 mm. In
Tabelle 7 sind die Ergebnisse aus der statistischen Auswertung zusammengefasst.
Tabelle 7: Statistische Auswertung des Anteils der beweglichen Bakterien von Bacillus
amyloliquefaciens FZB42 nach Durchströmung der Messkapilaren
Die Messreihen mit verschiedenen Kapillarinnendurchmessern wurden mit dem
Statistikprogramm R auf Normalverteilung (Shapiro-Wilk-Test, Anderson-Darling-Test
und Cramér-von-Mises-Test) geprüft. Weiterhin wurden die Mittelwerte (Zweistichprobent-Test) und Varianzen (F-Test) auf signifikante Unterschiede geprüft. In der ersten Spalte
ist die Testmethode angegeben und in den folgenden Spalten die p-Werte für die einzelnen
Datensätze. Liegt das Ergebnis aller drei Tests auf Normalverteilung über 0,05, können die
Daten als normalverteilt angenommen werden. Liegt der Wert des Zweistichproben-t-Tests
und des F-Tests über 0,05 sind signifikante Unterschiede in den Messreihen nicht
nachweisbar.
p-Wert
D = 1 mm
D = 0,5 mm
D = 0,25 mm
Shapiro-Wilk-Test
0,08746
0,6425
0,2445
Anderson-Darling-Test
0,2243
0,5279
0,1717
Cramér-von-Mises-Test
0,4548
0,4001
0,143
D = 1 mm vs D = 1 mm vs D = 0,5 mm vs
D = 0,5 mm
D = 0,25 mm D = 0,25 mm
Zweistichproben-t-Test
0,9479
0,9337
0,8734
F-Test
0,4947
0,7863
0,6796
54
Ergebnisse
7.1.3
Auslegung der Optik
Die reale Größe eines Pixels wurde mit ein Objektmikrometer (2 mm in 200 Skalenteilen,
10008.04.005, POG Präzisionsoptik Gera GmbH) unter Verwendung des Vision Assistant
Version 2013 (National Instruments) bestimmt. Die Messung ergab, dass 10 µm der
Skaleneinteilungen durchschnittlich 106,05 Pixel entsprechen, die Standardabweichung
beträgt 1,00 Pixel. Da die Linienmittelpunkte vom Vision Assistant Version 2013 (National
Instruments) mathematisch bestimmt werden, kommen bei den Distanzen Kommazahlen als
Abstände zustande. Mit den gewählten Komponenten entspricht ein Pixel im digitalen Bild
somit einem Quadrat von 94,3 nm Seitenlänge (± 0,9 nm) in der Objektebene. Bei einer
Bildauflösung von 1280 x 960 Pixel wird eine Fläche von 120,7 μm x 90,5 μm in der
Aufnahme abgebildet.
Die numerische Apertur des eingesetzten Objektivs beträgt 0,65 und wird für die folgende
Berechnung herangezogen. Als Wellenlänge wird grünes Licht bei 550 nm gewählt. Aus
(6.16) ergibt sich eine theoretische Auflösung (𝑦𝑚𝑚𝑚, 𝑒 −2 ) von 579 nm. Daraus ergibt sich mit
(6.13) und (6.11) eine Schärfentiefe (𝑧𝑅 ) von 239 nm. Die Dicke der Schärfeebene beträgt
damit 478 nm, da der Bereich über und unter dem Fokuspunkt (±𝑧𝑅 ) betrachtet wird.
Ein Quadrat mit der Seitenlänge von 94,3 nm in der Objektebene wird auf einen Pixel
abgebildet. In Abbildung 27 ist die Pixel-Auflösung in Bezug auf die resultierende
Intensitätsverteilung bei 550 nm dargestellt (vgl. Abbildung 20).
Abbildung 27: Pixel-Auflösung in Bezug auf die Intensitätsverteilung
Dargestellt ist die Pixel-Auflösung der Kamera in der Objektebene in Bezug auf die
Intensitätsverteilung zweier Lichtpunkte bei 550 nm mit dem Abstand der definierten
Auflösungsgrenze ymin,e-². Je dunkler die Pixel eingefärbt sind, desto höher ist die
Beleuchtungsintensität auf diesem Bildpunkt.
Bei der gewählten Konstellation liegen etwa sechs Pixel zwischen zwei Maxima mit dem
Abstand der definierten Auflösungsgrenze 𝑦min, 𝑒 −2 . Der Kompromiss zwischen Kontrast und
resultierende Größe des Bildausschnittes ist hiermit gut auf die theoretische Auflösungsgrenze
angepasst.
55
Ergebnisse
Aus (6.18) geht hervor, dass Bakterien mit Geschwindigkeiten bis zu 50 μm s-1, ohne
sichtbaren Schärfeverlust mit einer maximalen Belichtungszeit von 0,942 ms zu visualisieren
sind. Wird eine höhere Belichtungszeit gewählt, wird die Bewegungsunschärfe sichtbar. Je
höher die Belichtungszeit ist, desto stärker ist die Bewegungsunschärfe.
7.1.4
Auslegung der Bildanalyse
Die optimale Anzahl an Bakterien pro Bild für die Bildanalyse wurde mit Hilfe von (6.7),
(6.8), (6.9) und (6.10) abgeschätzt. Folgende Werte wurden zur Berechnung herangezogen:
-
erwartete Standardabweichung (𝑆𝑆𝑣𝑣 ) = 25 µ𝑚 𝑠 −1 ,
Standardabweichung bei fehlerhaften Sprüngen (𝑆𝑆𝐹 ) = 66 µ𝑚 𝑠 −1 ,
Anzahl an Bildern pro Bildserie (𝑓𝑛 ) = 30,
Anzahl an Bildserien pro Messpunkt (𝑏𝑛 ) = 10,
Wahrscheinlichkeit für das Auftreten von kleinen Strecken (𝑝𝑘𝑘 ) = 1,153,
Fläche eines Bakteriums (𝐴𝐵𝐵 ) = 884,53 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝,
Fläche des Bildes (𝐴𝐵 ) = 1.228.800 𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝,
Wahrscheinlichkeit für einen fehlerhaften Sprung naher Bakterien (𝑝𝑒𝑒 ) = 0,33.
Der erwartete Fehler der Durchschnittsgeschwindigkeit in Abhängigkeit der Anzahl an
Bakterien pro Bild ist in Abbildung 28 aufgetragen.
Abbildung 28: Standardfehler in Abhängigkeit der Anzahl an Bakterien pro Bild
Die Abschätzung des erwarteten Standardfehlers der mittleren Geschwindigkeit ist über der
Anzahl an Bakterien pro Bild aufgetragen. Der optimale Bereich liegt zwischen fünf und
fünfzehn Bakterien pro Bild. Davor wirkt sich die statistische Streuung stark aus, danach
häufen sich die Berührungen zwischen den Bakterien.
Für die Bildanalyse ist eine Anzahl von fünf bis fünfzehn vitalen Bakterien pro Bild optimal.
Bei mehr als fünfzehn Bakterien pro Bild neigt die automatische Bewegungsverfolgung zu
56
Ergebnisse
Fehlern und das Ergebnis wird ungenauer. Bei weniger als fünf Bakterien pro Bild wird durch
die starke Streuung die statistische Betrachtung ungenauer. Dies entspricht einer Dichte an
beweglichen Zellen von 1,45 1011 𝑙 −1 bis 4,35 1011 𝑙 −1.
Die Ergebnisse der verschiedenen Grauwertwandlungen sind in Abbildung 29 dargestellt.
Abbildung 29: Vergleich der Grauwertwandlungen bei einer Mikroskopaufnahme von
Bacillus amyloliquefaciens FZB42
Vergleich der Grauwertwandlungen mit Beispielbild und zugehörigem Linienhistogramm
längs durch das Bakterium (B. amyloliquefaciens FZB42).
Die Grauwertwandlung wurde anhand der Luminance (Farbhelligkeit eines Pixels im HSLFarbraum) durchgeführt. Hierbei wurden über mehrere Bildstrecken die besten Ergebnisse
erzielt. Im Anhang (S. 117) sind die Ergebnisse der Grauwertwandlung noch einmal
detaillierter dargestellt.
7.1.5
Integration des Gesamtsystems
Die Durchflussküvette mit flexibler Schichtdicke wurde wie geplant gefertigt (siehe
Kapitel 6.4.1) und konnte erfolgreich auf dem Mikroskop getestet werden. Die entwickelte
Durchflussküvette ist in Abbildung 30 zu sehen.
57
Ergebnisse
Abbildung 30: Entwickelte Durchflussküvette
Die entwickelte Durchflussküvette mit flexibler Schichtdicke einzeln (links) und auf dem
Mikroskop (rechts).
Das Gesamtsystem mit Bioreaktor, Probenentnahme, Probenaufbereitung, Mikroskop und
Steuerungssoftware ist in Abbildung 31 dargestellt.
Abbildung 31: Gesamtsystem für die Beispielfermentationen
Das Gesamtsystem zur Durchführung der Beispielfermentationen mit den Modulen:
Bioreaktor, Probenentnahme, Probenaufbereitung, Mikroskop, Durchflussküvette und
Steuerungssoftware.
Das System wurde speziell für die Anwendung angepasst und optimiert, das gesamte System
ist durch die entwickelte Steuerungssoftware regelbar. Um die vollständige Fernsteuerung
und Datenerfassung zu ermöglichen, musste ein neuer Schaltschrank geplant und ausgestattet
58
Ergebnisse
werden. Mit dem Gesamtsystem war die Durchführung der geplanten Beispielfermentationen
möglich.
7.2
Ergebnisse aus den Beispielfermentationen
Durch die automatisierte Bildanalyse können Geschwindigkeit und Bewegungsmuster der
Bakterien erfasst werden. Neben der Durchschnittsgeschwindigkeit der Bakterien wird die
Anzahl der beweglichen Bakterien pro Bild ermittelt. Ebenso wurden Bewegungsmuster der
einzelnen Bakterien charakterisiert.
7.2.1
Validierung der automatischen Bildanalyse
Für die Validierung der automatischen Bildanalyse in Bezug auf die Bewegungsgeschwindigkeit wurden die Bildserien der vier charakteristischen Fermentationszeitpunkte
(Exponentielles Wachstum durch Kohlenhydratverbrauch und Säurebildung (1), Diauxiestufe,
Umstellung von Kohlenhydrat- auf Säureverstoffwechselung (2), Wachstum durch
Säureverbrauch (3) und Sporulation (4)) von Fermentation 1 herangezogen. Hierzu wurden
7.922 Einzelgeschwindigkeiten in 930 Bildern manuell ermittelt und die Ergebnisse mit den
Werten aus der automatischen Bildauswertung verglichen. Die Durchschnittsgeschwindigkeit
mit Standardfehler aus automatischer und manueller Auswertung ist in Abbildung 32 zu
sehen.
Abbildung 32: Validierung der automatischen Bildauswertung bei Bacillus
amyloliquefaciens FZB42 in ABiTEP-Medium-¼
Die Bestimmung der Bewegungsgeschwindigkeiten aus der automatischen Bildauswertung
wurde an den vier charakteristischen Fermentationszeitpunkten (Exponentielles Wachstum
durch Kohlenhydratverbrauch und Säurebildung (232 min), Diauxiestufe, Umstellung von
Kohlenhydrat- auf Säureverstoffwechselung (292 min), Wachstum durch Säureverbrauch
(352 min) und Sporulation (382 min)) von Fermentation 1 (ABiTEP-Medium-¼, B.
amyloliquefaciens FZB42) durch manuelle Messung validiert. Die Mittelwerte der Einzelgeschwindigkeiten mit Standardfehler sind für die automatische Auswertung und für die
manuelle Auswertung aufgetragen. Insgesamt wurden 930 Bilder mit 7.922
Einzelgeschwindigkeiten manuell ausgewertet.
59
Ergebnisse
Die manuelle Messung wurde mit dem Programm zur interaktiven Erfassung der
Bewegungsmuster durchgeführt (siehe Kapitel 6.6). Die Geschwindigkeits-Mittelwerte an
allen vier Messpunkten der automatischen und der manuellen Auswertung liegen im Bereich
von 45 – 52 µm s-1. An den vier Messpunkten liegt die Differenz zwischen manueller
Messung und automatischer Messung im Bereich von 0,1 - 0,55 µm s-1. Wie in Abbildung 32
gezeigt, gibt es an jedem Messpunkt eine große Überschneidung der Fehlerindikatoren des
Standardfehlers. Der Vertrauensbereich der manuellen Auswertung überschneidet sich
komplett mit dem der automatischen Auswertung. Der Standardfehler der manuellen
Auswertung liegt zwischen ± 0,28 und ± 0,83 µm s-1, die automatische Bildserienauswertung
erreicht Standardfehler von ± 0,37 bis ± 1,34 µm s-1.
7.2.2
Geschwindigkeit und Anzahl beweglicher Bakterien
In den Fermentationen 1 – 3 waren bezüglich Durchschnittsgeschwindigkeit und Anzahl der
beweglichen Bakterien jeweils charakteristische Verläufe zu beobachten. Die Anzahl der
beweglichen Bakterien nimmt mit fortschreitender Fermentationsdauer zu bis zu einem Abfall
bei Beginn der Sporulation. Ähnliches ist bei der optischen Dichte (OD600) zu beobachten,
jedoch nicht so spezifisch, da zu Beginn der Feststoffanteil des Mediums und später die
Sporen die Absorption des Lichtes beeinflussen. Die Durchschnittsgeschwindigkeit der
Bakterien in den Fermentationen 1 – 3 bewegt sich über den gesamten Fermentationsverlauf
im Bereich von 20 – 60 µm s-1. Im Zeitraum zwischen den charakteristischen Fermentationszeitpunkten vor der Diauxiestufe bis zum Beginn der Sporulation liegt die
Durchschnittsgeschwindigkeit in einem Bereich von 40 – 60 µm s-1. An den vier
charakteristischen Fermentationszeitpunkten ist ein charakteristischer Verlauf zu erkennen.
Während der Diauxiestufe ist die Durchschnittsgeschwindigkeit geringer als davor und
danach und mit Beginn der Sporulation fällt die Durchschnittsgeschwindigkeit ab. In
Abbildung 33 ist der Fermentationsverlauf von Fermentation 3 als Beispiel dargestellt. Es ist
zu sehen, dass mit zunehmender Zelldichte die Gelöstsauerstoffsättigung (pO2) abnimmt. Die
Belüftung (100 mln min-1) und die Rührerdrehzahl (225 rpm) sind hierbei jeweils auf ihrem
Minimalwert. Nach ca. 250 min Fermentationsdauer erreicht die pO2-Sättigung 50%. Ab
diesem Punkt greift die Regelung des pO2 auf einen Sollwert von 50%, Belüftung und
Rührerdrehzahl werden über ihren Minimalwert erhöht und der pO2 bei 50% gehalten.
60
Ergebnisse
Abbildung 33: Kultivierung von Bacillus amyloliquefaciens FZB42 in ABiTEP-Medium¼ bei 35 °C
Daten aus Fermentation 3: 180 min bis 480 min. A) Verlauf der Gelöstsauerstoffsättigung
sowie der Belüftung und Rührerdrehzahl. B) pH-Wert Kurve und Durchschnittsgeschwindigkeiten der beweglichen Bakterien mit Standardfehler (SEM). Als zusätzliche
Angabe ist die Anzahl der ermittelten Einzelgeschwindigkeiten an jedem Messpunkt zu
sehen. Zur Ermittlung der Durchschnittsgeschwindigkeit wurden insgesamt 18.484
Einzelgeschwindigkeiten herangezogen. C) Optischen Dichte bei 600 nm (OD600) und
Anzahl der beweglichen Bakterien pro Bild mit Standardabweichung (SD).
Zu diesem Zeitpunkt steigen auch die Anzahl der beweglichen Bakterien sowie die optische
Dichte (OD600). Die Durchschnittsgeschwindigkeit der Bakterien liegt bei etwa 58 µm s-1. Der
pH-Wert fällt über diesen Zeitraum immer weiter ab. Bei ca. 315 min ist der minimale pHWert (ca. 6,8) erreicht. Hier ist der Zeitpunkt der Diauxiestufe. Danach steigt der pH-Wert
wieder an. Zum Zeitpunkt der Diauxiestufe ist ein lokales Minimum der
Durchschnittsgeschwindigkeit der Bakterien zu sehen (ca. 50 µm s-1). Bei etwa 400 min ist
die höchste Zelldichte erreicht. Die Anzahl an beweglichen Bakterien pro Bild (etwa 17) und
die OD600 haben hier ihren jeweiligen Maximalwert. Kurz vor diesem Punkt zeigt die
Durchschnittsgeschwindigkeit der Bakterien ein lokales Maximum (ca. 52 µm s-1). Nach
Erreichen der maximalen Zelldichte werden die Bakterien immer unbeweglicher. Die Anzahl
der beweglichen Bakterien und die OD600 sowie auch die Durchschnittsgeschwindigkeit
nehmen ab. Erste Sporen sind bei manueller Sichtung der Aufnahmen zu sehen. Sowohl
Rührerdrehzahl als auch Belüftung steigen nicht weiter an bzw. fallen minimal ab. Für die
Fermentationen 1 – 3 sind die Ergebnisse der vier charakteristischen Fermentationszeitpunkte
in Tabelle 8 zusammengefasst.
61
Ergebnisse
Tabelle 8: Charakteristische Fermentationszeitpunkte von Bacillus amyloliquefaciens
FZB42 in ABiTEP-Medium-¼
Übersicht über die Durchschnittsgeschwindigkeit (vØ) von B. amyloliquefaciens FZB42 mit
Standardfehler (SEM), die Anzahl an beweglichen Bakterien pro Bild (nmB) und den pHWert in den vier charakteristischen Fermentationsphasen aus den Fermentationen 1 – 3.
Die jeweils dazugehörigen Fermentationszeitpunkte (tp) sind in Minuten angegeben
Exponentielles
Wachstum;
Kohlenhydratverbrauch und
Säurebildung
Diauxiestufe;
Kohlenhydrat- auf
Säureverbrauch
(min. pH)
Wachstum durch
Säureverbrauch
Sporulation
Ferm. 1
Ferm. 2
Ferm. 3
tp [min]
vØ ± SEM
[µm s-1]
nmB
232
304
305
50,74 ± 1,34
51,03 ± 2,11
58,04 ± 2,92
1,07
2,43
3,31
pH-Wert
6,85
6,78
6,79
tp [min]
vØ ± SEM
[µm s-1]
nmB
292
338
335
47,71 ± 0,64
46,17 ± 0,82
50,17 ± 1,01
5,95
2,9
7,53
pH-Wert
6,68
6,77
6,79
tp [min]
vØ ± SEM
[µm s-1]
nmB
352
360
365
51,88 ± 0,37
59,56 ± 0,39
52,39 ± 1,26
13,69
14,57
8,8
pH-Wert
6,75
6,80
6,81
tp [min]
vØ ± SEM
[µm s-1]
nmB
382
391
425
46,16 ± 0,44
44,95 ± 0,38
40,76 ± 0,41
9,41
13,62
10,43
pH-Wert
6,82
6,84
6,85
Mit der Umstellung von Kohlenhydrat- auf Säureverbrauch geht ein globales Minimum des
pH-Werts einher. Die steigende Anzahl an beweglichen Bakterien pro Bild ist ebenso in jeder
der drei Fermentationen aufgezeigt. Zur besseren Visualisierung sind die
Durchschnittsgeschwindigkeiten und pH-Werte aus Tabelle 8 in Abbildung 34 grafisch über
die vier charakteristischen Fermentationszeitpunkte aufgetragen.
62
Ergebnisse
Abbildung 34: Charakteristische Fermentationszeitpunkte von Bacillus
amyloliquefaciens FZB42 in ABiTEP-Medium-¼
Übersicht über die Durchschnittsgeschwindigkeit (vØ) von B. amyloliquefaciens FZB42
und den pH-Wert an den vier charakteristischen Fermentationszeitpunkten (Exponentielles
Wachstum durch Kohlenhydratverbrauch und Säurebildung (I), Diauxiestufe;
Kohlenhydrat- auf Säureverstoffwechselung (II), Wachstum durch Säureverbrauch (III)
und Sporulation (IV)) aus den Fermentationen 1 – 3. Im Minimum des pH-Werts ist jeweils
ein lokales Minimum der Durchschnittsgeschwindigkeit zu beobachten. Die
Durchschnittsgeschwindigkeiten sind als durchgehende Linie mit schräggestellten
Quadraten und der pH-Wert als gestrichelte Linie mit Dreiecken dargestellt.
Die OD600 in Abhängigkeit der Anzahl der beweglichen Bakterien für die Fermentationen 1 –
3 mit ABiTEP-Medium-¼ ist in Abbildung 35 dargestellt. Durch den Feststoffanteil im
ABiTEP-Medium-¼ beginnt die OD600 bereits mit einem Wert über 1 und zeigt im Verlauf
der Fermentation nur eine Änderung von 0,2 bis 0,3. Mit steigender OD600 ist in den drei
Fermentationen ein Anstieg in der Anzahl der beweglichen Bakterien zu beobachten, bis die
Sporulation einsetzt. Mit Einsetzen der Sporulation nimmt die Anzahl der beweglichen
Bakterien ab, die OD600 bleibt jedoch auf hohem Niveau.
63
Ergebnisse
Abbildung 35: OD600 in Abhängigkeit der Anzahl der beweglichen Bakterien (Bacillus
amyloliquefaciens FZB42) pro Bild in ABiTEP-Medium-¼
Die OD600 ist aufgetragen in Abhängigkeit der ermittelten Anzahl an beweglichen
Bakterien pro Bild für die Fermentationen 1 – 3 (B. amyloliquefaciens FZB42) mit dem
ABiTEP-Medium-¼. Alle Messpunkte vom Start der Fermentation bis zum Beginn der
Sporulation werden verwendet. Das Bestimmtheitsmaß (R2) und die lineare Näherung sind
im Diagramm angegeben. Daten nach Beginn der Sporulation wurden nicht berücksichtigt.
Für die Fermentationen 1 – 3 werde die Einzelgeschwindigkeitsverteilung zur Diauxiestufe
jeweils den Einzelgeschwindigkeitsverteilungen der drei anderen charakteristischen
Fermentationszeitpunkte gegenübergestellt. Die Überprüfung erfolgt durch den WilcoxonRangsummentest. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 aufgetragen.
Tabelle 9: Vergleich der Geschwindigkeitsverteilungen für Bacillus amyloliquefaciens
FZB42 in ABiTEP-Medium-¼
Die Einzelgeschwindigkeitsverteilung bei der Diauxiestufe (Kohlenhydrat- auf
Säureverstoffwechselung) wird mit den Einzelgeschwindigkeitsverteilungen der drei
anderen charakteristischen Fermentationszeitpunkte verglichen. Dies wird mit dem
Wilcoxon-Rangsummentest für die Fermentationen 1 – 3 (B. amyloliquefaciens FZB42,
ABiTEP-Medium-¼) durchgeführt. Es soll bewiesen werden, dass die beiden verglichenen
Verteilungen signifikant unterschiedlich sind. Bei p-Werten unter 0,05 ist die Aussage mit
hoher Wahrscheinlichkeit (über 95%) richtig.
Vergleich der Geschwindigkeitsverteilungen von zwei definierten
Fermentationszeitpunkten
Diauxiestufe gegen exponentielles
Wachstum durch Kohlenhydratverbrauch und Säurebildung
Diauxiestufe gegen Wachstum
durch Säureverbrauch
Diauxiestufe gegen Beginn der
Sporulation
p-Werte
Ferm. 1
Ferm. 2
Ferm. 3
0,1120 *
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
0,0068
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
* p-Wert > 0,05; signifikanter Unterschied konnte nicht bewiesen werden
64
Ergebnisse
In acht von neun Vergleichen ergibt der Wilcoxon-Rangsummentest p-Werte unter 0,05.
Damit existiert mit hoher Wahrscheinlichkeit (über 95%) ein signifikanter Unterschied
zwischen den ermittelten Einzelgeschwindigkeitsverteilungen. Lediglich in Fermentation 1
ergibt die Gegenüberstellung der Messdaten der Diauxiestufe zu den Daten der exponentiellen
Wachstumsphase (Kohlenhydratverbrauch und Säurebildung) einen p-Wert von 0,1120. Die
detaillierten Ergebnisse der statistischen Auswertung von Fermentation 1 – 3 sind im Anhang
(Seite 110) beigefügt. Die Verteilungen der Einzelgeschwindigkeiten an den vier
charakteristischen Fermentationszeitpunkten von Fermentation 1 sind in Abbildung 36
dargestellt.
Abbildung 36: Histogramme der Einzelgeschwindigkeiten von Bacillus amyloliquefaciens
FZB42 aus Fermentation 1 mit ABiTEP-Medium-¼
Die Histogramme zeigen die Geschwindigkeitsverteilung der Einzelgeschwindigkeiten an
den vier charakteristischen Fermentationszeitpunkten von Fermentation 1. Exponentieller
Wachstum durch Kohlenhydratverbrauch und Säurebildung (links oben), Diauxiestufe;
Kohlenhydrat- auf Säureverstoffwechselung (rechts oben), Wachstum durch
Säureverbrauch (links unten) und Sporulation (rechts unten). Die Daten wurden mit der
automatischen Bildanalyse ermittelt. Die Einzelgeschwindigkeiten liegen, mit Ausnahme
weniger Ausreißer, in einem Bereich von 5 – 100 µm s-1. Die Balken zeigen die absolute
Häufigkeit der Geschwindigkeitsbereiche und die Linie kennzeichnet die kumulierte
Häufigkeit in %.
65
Ergebnisse
Die Verteilungen sind unimodal (ein Gipfel) mit einem positiven Exzess (steilgipflig). Mit
Ausnahme weniger Ausreißer bewegen sich die Einzelgeschwindigkeiten in einem Bereich
von 5 – 100 µm s-1.
Die Fermentationen 4 – 6 mit Standard-Nährmedium-I-¼ zeigen ebenso bezüglich
Durchschnittsgeschwindigkeit und Anzahl der beweglichen Bakterien charakteristische
Verläufe. Die Durchschnittsgeschwindigkeit der Bakterien nimmt zu, während sich die Kultur
in der exponentiellen Wachstumsphase befindet. Dies geht einher mit einem Anstieg des
OD600 sowie mit steigendem Sauerstoffbedarf der Kultur, was an steigender Zuluftrate und
Rührerdrehzahl zu erkennen ist. In dieser Fermentationsphase ist ein Abfallen des pH-Werts
(von ca. 7,2 auf ca. 6,1) zu erkennen. Im Minimum des pH-Werts ist ein Einbruch der
Durchschnittsgeschwindigkeit wie auch im Sauerstoffbedarf (Rührerdrehzahl und Zuluftrate
bricht ein) zu beobachten. Die Steigung des OD600–Verlaufs wird flacher. Dieser Zeitpunkt ist
als Diauxiestufe I (Umstellung von Glukose- auf Säureverstoffwechselung mit
Stickstoffverbrauch) definiert. Hier können in allen drei Fermentationen ähnliche
charakteristische Verläufe gezeigt werden. Danach steigt der pH-Wert langsam an, der
Sauerstoffbedarf
nimmt
nach
dem
Einbruch
ebenso
wieder
zu.
Die
Durchschnittsgeschwindigkeit der Bakterien nimmt in dieser Phase ebenso zu. Dieser
charakteristische
Fermentationszeitpunkt
(Diauxiestufe
II;
Umstellung
von
Stickstoffverbrauch auf reine Säureverstoffwechselung) ist an einem Knick in der Steigung
des pH-Wertverlaufs deutlich zu erkennen. Der zunächst langsame Anstieg des pH-Werts
nimmt nun rasant zu. An dieser Stelle ist ein leichter Abfall des Sauerstoffbedarfs zu
beobachten, die Durchschnittsgeschwindigkeit bricht hier, wie bei der Diauxiestufe I, ein.
Nach der Diauxiestufe II steigt der pH-Wert rasant an, der Sauerstoffbedarf steigt nochmals
ein wenig und der OD600 erreicht seinen Höchstwert. Die Durchschnittsgeschwindigkeit
steigt nochmals etwas an. Nach Erreichen des Maximums der OD600 sinken die
Durchschnittsgeschwindigkeit und der Sauerstoffbedarf. Die Sporulation der Kultur setzt ein.
Der Anstieg des pH-Werts verlangsamt sich mit einsetzender Sporulation. In Abbildung 37 ist
der Fermentationsverlauf von Fermentation 6 dargestellt.
66
Ergebnisse
Abbildung 37: Kultivierung von Bacillus amyloliquefaciens FZB42 in StandardNährmedium-I-¼
Daten aus Fermentation 6: 60 min bis 330 min. A) Verlauf der Gelöstsauerstoffsättigung
sowie
der
Belüftung
und
Rührerdrehzahl.
B)
pH-Wert
und
die
Durchschnittsgeschwindigkeiten der beweglichen Bakterien mit Standardfehler (SEM). Der
Ermittlung
der
Durchschnittsgeschwindigkeiten
liegen
insgesamt
7.493
Einzelgeschwindigkeiten zu Grunde. C) Optischen Dichte bei 600 nm (OD600) und der
Anzahl beweglichen Bakterien pro Bild. Gut zu sehen ist der Einbruch der
Durchschnittsgeschwindigkeiten zum Zeitpunkt der beiden Diauxiestufen (Umstellung von
Glukose- auf Säureverbrauch mit Stickstoffverbrauch (pH-Minimum) sowie die
Umstellung auf reinen Säureverbrauch (rasanter Anstieg des pH-Werts)).
Eine Zusammenfassung der charakteristischen Fermentationszeitpunkte ist in Tabelle 10 zu
sehen. Bei Fermentation 4 und 5 wurde in der Endphase Antischaummittel zugesetzt. Die
Verläufe nach Zusatz des Antischaummittels zeigen Unterschiede zu den charakteristischen
Verläufen. In Fermentation 4 stimmt der Zeitpunkt der Diauxiestufe I nicht mit dem Zeitpunkt
einer Probenentnahme überein. Die betroffenen Messungen sind in Tabelle 10 markiert.
67
Ergebnisse
Tabelle 10: Charakteristische Fermentationszeitpunkte von Bacillus amyloliquefaciens
FZB42 in Standard-Nährmedium-I-¼
Übersicht über die Durchschnittsgeschwindigkeit (vØ) mit Standardfehler (SEM), die
Anzahl an beweglichen Bakterien pro Bild (nmB) und den pH-Wert in den sechs
charakteristischen Fermentationszeitpunkten aus den Fermentationen 4 – 6. Die jeweils
dazugehörigen Fermentationszeitpunkte (tp) sind in Minuten angegeben. Messungen, die
nach der ersten Zugabe von Antischaummittel durchgeführt wurden, sind markiert. Bei
Fermentation 4 lag die Diauxiestufe I (pH-Minimum) zwischen zwei Probenentnahmen.
Daher wird dieser Fermentationszeitpunkt nicht gut in der Tabelle repräsentiert. Die
betroffene Stelle ist in der Tabelle markiert.
Ferm. 4
Ferm. 5
Ferm. 6
142
165
165
46,03 ± 2,82
58,32 ± 2,89
53,39 ± 1,98
nmB
0,4
0,27
0,92
Exponentielles
Wachstum durch
Glukose- und
Stickstoffverbrauch
und Säurebildung
tp [min]
pH-Wert
6,62
6,34
6,22
Diauxiestufe I;
Glukose- auf
Stickstoff- und
Säureverbrauch
(pH-Minimum)
tp [min]
162
180
180
42,95 ± 2
50,16 ± 1,62
39,26 ± 1,32
0,97
3,65
6,02
6,09
Exponentielles
Wachstum durch
Stickstoff- und
Säureverbrauch
Diauxiestufe II;
Stickstoff- auf
reinen
Säureverbrauch
(pH-Knick)
vØ ± SEM [µm s-1]
vØ ± SEM [µm s-1]
1,4
nmB
pH-Wert
6,21
tp [min]
185
210
195
46,06 ± 0,69
54,57 ± 1,11
55,1 ± 1,25
nmB
3,12
1,05
2,8
pH-Wert
6,08
6,13
6,13
205
225
210
39,28 ± 0,64
47,63 ± 0,67
44,1 ± 0,88
nmB
8,11
3,24
2,64
pH-Wert
6,17
6,3
6,19
245
255
225
46,19 ± 1,02
45,06 ± 0,62
47,44 ± 0,65
nmB
15,77
3,86
5,09
pH-Wert
6,76
6,76
325
315
305
38,37 ± 1,55
36,91 ± 1,54
36,93 ± 0,95
4,23
1,64
0,83
vØ ± SEM [µm s-1]
tp [min]
-1
vØ ± SEM [µm s ]
tp [min]
Wachstum durch
Säureverbrauch
-1
vØ ± SEM [µm s ]
tp [min]
Beginn der
Sporulation
*1
-1
vØ ± SEM [µm s ]
nmB
*2
6,38
7,27 *2
7,13 *2
7,05
*1
Diauxiestufe I (pH-Minimum) liegt zwischen zwei Probenentnahmen. Das
tatsächliche pH-Minimum bei Fermentation 4 beträgt pH 6,03 in der 171. Minute.
*2
Messungen nach Zugabe von Antischaummittel
pH-Wert
68
Ergebnisse
Alle drei Fermentationen zeigen die beschriebenen charakteristischen Verläufe. Diese sind für
den pH-Wert und die Durchschnittsgeschwindigkeit in Abbildung 38 dargestellt. Der
Zeitpunkt der Zugabe von Antischaummittel bei Fermentation 4 und 5 ist in Abbildung 38
markiert, da bei Zugabe des Antischaummittels schlagartige Einbrüche des pO2-Werts und
auch Einbrüche der Durchschnittsgeschwindigkeit zu beobachten sind.
Abbildung 38: Charakteristische Fermentationszeitpunkte von Bacillus
amyloliquefaciens FZB42 mit Standard-Nährmedium-I-¼
Übersicht über die Durchschnittsgeschwindigkeit (vØ) von B. amyloliquefaciens FZB42
und den pH-Wert an den sechs charakteristischen Fermentationszeitpunkten aus den
Fermentationen 4 – 6. Im Minimum des pH-Werts ist jeweils ein lokales Minimum der
Durchschnittsgeschwindigkeit zu beobachten. An der Stelle des pH-Knicks (Steigung des
pH-Werts ändert sich erheblich) ist ein zweites lokales Minimum der
Durchschnittsgeschwindigkeit zu sehen. Bei Fermentation 4 lag die Diauxiestufe I (pHMinimum) zwischen zwei Probenentnahmen. Daher ist hier ein zusätzlicher Messwert im
pH-Wert angegeben (nicht ausgefülltes Dreieck). Bei den Fermentationen 4 und 5 ist
zusätzlich der Bereich ab Zugabe von Antischaummittel markiert. Die
Durchschnittsgeschwindigkeiten sind als durchgehende Linie mit schräggestellten
Quadraten und der pH-Wert als gestrichelte Linie mit Dreiecken dargestellt.
69
Ergebnisse
Das Minimum des pH-Werts wurde bei Fermentation 4 als zusätzlicher Messpunkt
hinzugefügt, da der Zeitpunkt der Diauxiestufe I nicht gut von einer Probenentnahme erfasst
wurde.
Die OD600 in Abhängigkeit der Anzahl der beweglichen Bakterien für die Fermentationen 4 –
6 mit Standard-Nährmedium-I-¼ ist in Abbildung 39 dargestellt.
Abbildung 39: OD600 in Abhängigkeit der Anzahl der beweglichen Bakterien (Bacillus
amyloliquefaciens FZB42) in Standard-Nährmedium-I-¼
Die OD600 ist aufgetragen in Abhängigkeit der ermittelten Anzahl an beweglichen
Bakterien (B. amyloliquefaciens FZB42) pro Bild für die Fermentationen 4 – 6 mit dem
Standard-Nährmedium-I-¼. Alle Messpunkte vom Start der Fermentation bis zum Beginn
der Sporulation werden verwendet. Das Bestimmtheitsmaß (R2) und die lineare Näherung
sind im Diagramm angegeben. Daten nach Beginn der Sporulation sind nicht
berücksichtigt.
Die OD600 beginnt mit einem Wert von ca. 0,4 und zeigt im Verlauf der Fermentation eine
Änderung von 0,4 bis 0,6. Mit steigender OD600 ist in den drei Fermentationen ein Anstieg in
der Anzahl der beweglichen Bakterien zu beobachten. Mit Einsetzen der Sporulation nimmt
die Anzahl der beweglichen Bakterien ab, die OD600 bleibt jedoch auf hohem Niveau.
Für die Fermentationen 4 – 6 werden die Einzelgeschwindigkeitsverteilungen zu den
Diauxiestufen jeweils den Einzelgeschwindigkeitsverteilungen der fünf anderen charakteristischen Fermentationszeitpunkte gegenübergestellt. Die Überprüfung erfolgt durch den
Wilcoxon-Rangsummentest. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 aufgetragen.
In 23 von 27 Vergleichen ergibt der Wilcoxon-Rangsummentest p-Werte unter 0,05. Die pWerte der Gegenüberstellung zwischen den Diauxiestufen, sowie zwischen der Diauxiestufen
und der Sporulation sind in einigen Fällen erhöht. Erhöhte p-Werte zeigen Ähnlichkeiten in
den Einzelgeschwindigkeitsverteilungen. Die detaillierten Ergebnisse der statistischen
Auswertung der Fermentationen 4 – 6 sind im Anhang (S. 113) beigefügt.
70
Ergebnisse
Tabelle 11: Vergleich der Geschwindigkeitsverteilungen von Bacillus amyloliquefaciens
FZB42 in Standard-Nährmedium-I-¼
Die Einzelgeschwindigkeitsverteilung bei beiden Diauxiestufen (Umstellung Glukose- auf
Säureverstoffwechselung und Stickstoffverbrauch (I) und Umstellung Stickstoff- auf reinen
Säureverbrauch(II)) wird je mit den Einzelgeschwindigkeitsverteilungen der fünf anderen
charakteristischen Fermentationszeitpunkten verglichen. Dies wird mit dem WilcoxonRangsummentest für die Fermentationen 4 – 6 (B. amyloliquefaciens FZB42, StandardNährmedium-I-¼) durchgeführt. Es soll bewiesen werden, dass die beiden verglichenen
Verteilungen signifikant unterschiedlich sind. Bei p-Werten unter 0,05 ist die Aussage mit
hoher Wahrscheinlichkeit (über 95%) richtig. Erhöhte p-Werte zeigen Ähnlichkeiten in den
Einzelgeschwindigkeitsverteilungen.
Vergleich der Geschwindigkeitsverteilungen von zwei definierten
Fermentationszeitpunkten
Diauxiestufe I gegen exponentielles
Wachstum durch Glukose- und
Stickstoffverbrauch und Säurebildung
Diauxiestufe I gegen exponentielles
Wachstum durch Stickstoffverbrauch und
Säureverbrauch
Diauxiestufe I gegen Diauxiestufe II
Diauxiestufe I gegen Wachstum durch
Säureverbrauch
Diauxiestufe I gegen Beginn der
Sporulation
Diauxiestufe II gegen exponentielles
Wachstum durch Glukose- und
Stickstoffverbrauch und Säurebildung
p-Werte
Ferm. 4
Ferm. 5
Ferm. 6
0,0028
0,0002
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
0,0524 *
0,3676 *
< 0,0001
0,0004
0,0008
< 0,0001
0,5754 *
< 0,0001
0,0921 *
0,0168
< 0,0001
< 0,0001
Diauxiestufe II gegen Diauxiestufe I
0,0524 *
0,3676 * < 0,0001
Diauxiestufe II gegen exponentielles
Wachstum durch Stickstoffverbrauch und
< 0,0001
< 0,0001 < 0,0001
Säureverbrauch
Diauxiestufe I gegen Wachstum durch
0,0290
0,0002
< 0,0001
Säureverbrauch
Diauxiestufe I gegen Beginn der
0,0138
< 0,0001 < 0,0001
Sporulation
* p-Wert > 0,05; signifikanter Unterschied kann nicht bewiesen werden
Die Histogramme der Geschwindigkeitsverteilung an den sechs charakteristischen
Fermentationszeitpunkten aus Fermentation 6 sind in Abbildung 40 dargestellt. Die
Verteilungen für Fermentation 6 sind in Näherung ebenso unimodal (ein Gipfel) wie die
Verteilungen von Fermentation 3. Zur Kurtosis und Schiefe kann keine allgemeingültige
Aussage getroffen werden, da diese zwischen den einzelnen Histogrammen variieren. Mit
Ausnahme weniger Ausreißer bewegen sich die Einzelgeschwindigkeiten in einem Bereich
von 5 – 100 µm s-1.
71
Ergebnisse
Abbildung 40: Histogramme der Einzelgeschwindigkeiten von Bacillus amyloliquefaciens
FZB42 aus Fermentation 6 mit Standard-Nährmedium-I-¼
Die Histogramme zeigen die Geschwindigkeitsverteilung der Einzelgeschwindigkeiten an
den sechs charakteristischen Fermentationszeitpunkten von Fermentation 6: Exponentielles
Wachstum durch Glukose- und Stickstoffverbrauch und Säurebildung (links oben),
Diauxiestufe I; Glukose- auf Säureverstoffwechselung und Stickstoffverbrauch (rechts
oben), exponentielles Wachstum durch Stickstoff- und Säureverbrauch (links Mitte),
Diauxiestufe II; Stickstoff- auf reine Säureverstoffwechselung (rechts Mitte), Wachstum
durch Säureverbrauch (links unten), Beginn der Sporulation (rechts unten). Die Daten
wurden mit der automatischen Bildanalyse ermittelt. Die Einzelgeschwindigkeiten liegen
mit Ausnahme weniger Ausreißer in einem Bereich von 5 – 100 µm s-1. Die Balken zeigen
die absolute Häufigkeit der Geschwindigkeitsbereiche und die Linie kennzeichnet die
kumulierte Häufigkeit in %.
72
Ergebnisse
Die Fermentationen 1 – 3 und Fermentationen 4 – 6 zeigen einen grundsätzlich ähnlichen
Verlauf. Im Standard-Nährmedium-I-¼ der Fermentationen 4 – 6 kann neben dem pHMinimum jedoch ein weiterer Knick in der Steigung des pH-Wert-Verlaufs beobachtet
werden. Die Geschwindigkeiten bewegen sich über die Fermentationen etwa in derselben
Größenordnung. In Abbildung 41 ist ein Vergleich der Durchschnittsgeschwindigkeiten über
den gesamten Fermentationsverlauf mit zugehöriger Standardabweichung angegeben.
Abbildung 41: Vergleich der Geschwindigkeiten von Bacillus amyloliquefaciens FZB42
im ABiTEP-Medium-¼ und Standard-Nährmedium-I-¼
Die Fermentationen 1 – 3 werden mit ABiTEP-Medium-¼ und die Fermentationen 4 – 6
mit Standard-Nährmedium-I-¼ durchgeführt. Die Durchschnittsgeschwindigkeiten (vØ)
werden jeweils über alle Einzelgeschwindigkeiten im Zeitraum zwischen dem
exponentiellen Wachstum mit Säurebildung und dem Beginn der Sporulation gebildet. Die
Standardabweichungen der Durchschnittsgeschwindigkeit sind als Fehlerbalken
angegeben.
Die Durchschnittsgeschwindigkeiten werden aus den Einzelgeschwindigkeiten von jeweils
drei Fermentationen (Ferm. 1 – 3 und 4 – 6) gebildet. Es wird jedoch nur der Zeitraum
zwischen dem exponentiellen Wachstum mit Säurebildung bis zum Beginn der Sporulation
berücksichtigt. Für die Fermentationen 1 – 3 werden 42.268 Einzelgeschwindigkeiten und für
die Fermentationen 4 – 6 werden 19.273 Einzelgeschwindigkeiten berücksichtigt. Der
Durchschnittswert liegt bei den Fermentationen 1 – 3 bei 48,5 µm s-1 und bei den
Fermentationen 4 – 6 bei 44 µm s-1, die Standardabweichung ist bei beiden ähnlich und
beträgt ± 28 bei den Fermentationen 1 – 3 und ± 29,5 bei den Fermentationen 4 – 6.
7.2.3
Bewegungsmuster der beweglichen Bakterien
In Anlehnung an die Definitionen verschiedener 3D-Bewegungsmuster aus der Arbeit von
Vater (2014) werden acht Kategorien zur Einteilung der Bewegungsmuster festgelegt:
Richtungsänderung ohne Stoppphasen (Orientation), wellenförmige Bewegungen
(Undulation), gerade Strecken (Straight path), Richtungsänderung mit längeren
Schwimmbewegungen und kurzen Taumelphasen (Tumble), Richtungswechsel mit kurzen
Schwimmbewegungen und längeren Stoppphasen ohne Eigenbewegung (Orientation and
73
Ergebnisse
Stop), bogenförmige Strecken (Curve), Richtungsänderung aufgrund von Zusammenstößen
(Collision) und sonstige Bewegungen (Another). In Abbildung 42 sind Beispiele für die
charakteristischen Bewegungsmuster dargestellt. Diese Beispiele wurden aus dem
interaktiven Programm zur Erfassung der Bewegungsmuster exportiert (siehe Kapitel 6.6).
Abbildung 42: Typische Bewegungsmuster von Bacillus amyloliquefaciens FZB42
Beispiele typischer Bewegungsmuster von B. amyloliquefaciens FZB42 im StandardNährmedium-I-¼. Die Bewegungen wurden fünf Sekunden lang mit 30 fps aufgenommen.
Der Startpunkt jeder Wegstrecke ist hervorgehoben. Es sind Beispiele für folgende typische
Bewegungsmuster dargestellt: Richtungsänderung ohne Stoppphasen (Orientation),
wellenförmige Bewegungen (Undulation), gerade Strecken (Straight path),
Richtungsänderung mit längeren Schwimmbewegungen und kurzen Taumelphasen
(Tumble), Richtungswechsel mit kurzen Schwimmbewegungen und längeren Stoppphasen
ohne Eigenbewegung (Orientation and Stop), bogenförmige Strecken (Curve). Die Daten
wurden aus dem Programm zur interaktiven Erfassung der Bewegungsmuster exportiert.
74
Ergebnisse
Die Bewegungsmuster für die Fermentationen 4 – 7 wurden auch auf charakteristische
Bewegungsmuster hin untersucht. Die Aufnahme einer zusätzlichen Bildstrecke über 150
Aufnahmen, dies entspricht fünf Sekunden, zu jedem Probezeitpunkt ermöglicht diese
Auswertung. Die Fermentationen 4 – 6 wurden mit dem Standard-Nährmedium-I-¼ und
Fermentation 7 mit dem ABiTEP-Medium-¼ durchgeführt. Die Auswertung erfolgte über die
Summe der Probenentnahmen der einzelnen Fermentationen. Die Daten, in Kreisdiagramme
überführt, sind in Abbildung 43 dargestellt.
Abbildung 43: Summarische Verteilung der Bewegungsmuster von Bacillus
amyloliquefaciens FZB42 über den gesamten Probezeitraum
Ferm. 4 – 6 wurden mit Standard-Nährmedium-I-¼ und Ferm. 7 mit ABiTEP-Medium-¼
durchgeführt. Die Bewegungsmuster sind in acht Kategorien eingeteilt: Richtungsänderung
ohne Stoppphasen (Orientation), wellenförmige Bewegungen (Undulation), gerade
Strecken (Straight path), Richtungsänderung mit längeren Schwimmbewegungen und
kurzen Taumelphasen (Tumble), Richtungswechsel mit kurzen Schwimmbewegungen und
längeren Stoppphasen ohne Eigenbewegung (Orientation and Stop), bogenförmige
Strecken (Curve), Richtungsänderung aufgrund von Zusammenstößen (Collision) und
sonstige Bewegungen (Another). Die summarischen Verteilungen sind über den gesamten
Probezeitraum ermittelt. Die Bakterien wurden je über 150 Bilder bei 30 fps beobachtet (5
s). Insgesamt werden für die vier Fermentationen 912 Wegstrecken kategorisiert: Ferm. 4:
267, Ferm. 5: 290, Ferm. 6: 186, Ferm. 7: 169.
75
Ergebnisse
Die Kreisdiagramme der Fermentationen 4 – 6 zeigen eine ähnliche Verteilung. Etwa die
Hälfte der Bakterien (51%, 52% und 56%) bewegen sich geradlinig (Straight path). Eine
Richtungsänderung ohne Stoppphase (Orientation) wird bei 9%, 12% und 13% vollzogen.
Das Taumeln (Tumble) wird bei 7%, 8% und 10% der Beobachtungen erkannt. Eine Kurve
(Curve) haben 4%, 5% und 8% der Zellen zurückgelegt. Ein Richtungswechsel nach einer
Stoppphase, jedoch ohne Taumeln, (Orientation and Stop) wurde bei 1%, 4% und 5%
beobachtet. Selten (1%, 2% und 3%) konnte eine wellenförmige Bewegung (Undulation)
erkannt werden. Aufgrund von Kollisionen (Collision) einzelner Bakterien können 9%, 12%
und 19% der Beobachtungen keinem der Muster zugewiesen werden. Weiterhin ist es bei
wenigen (1%, 4% und 4%) Beobachtungen nicht möglich, diese einem der charakteristischen
Muster zuzuordnen (Another).
Die Verteilung der beobachteten Bewegungsmuster aus Fermentation 7 mit ABiTEPMedium-¼ unterscheidet sich an einigen Punkten signifikant von denen aus den
Fermentationen 4 – 6. So ist nur bei 37% der Beobachtungen eine geradlinige Bewegung
(Straight path) zu erkennen. Das Taumeln (Tumble) tritt mit 21% im Gegensatz dazu mehr als
doppelt so häufig auf. Alle anderen Bewegungsmuster bewegen sich in einer ähnlichen
Größenordnung wie bei Fermentation 4 – 6: Orientation 6%, Curve 5%, Orientation and Stop
4%, Undulation 2%, Collision 19% und Another 6%.
Das Auftreten der Bewegungsmuster im zeitlichen Verlauf von Fermentation 6 ist in
Abbildung 44 aufgetragen. Die Werte sind im Anhang (Seite 116) tabellarisch aufgetragen.
Abbildung 44: Zeitliche Verteilung der Bewegungsmuster von Bacillus amyloliquefaciens
FZB42 in Fermentation 6 (Standard-Nährmedium-I-¼)
Die Sichtung der verschiedenen Bewegungsformen (Richtungsänderung ohne Stoppphasen
(Orientation), wellenförmige Bewegungen (Undulation), gerade Strecken (Straight path),
Taumeln (Tumble), Richtungswechsel mit kurzen Schwimmbewegungen und längeren
Stoppphasen ohne Eigenbewegung (Orientation and Stop), bogenförmige Strecken
(Curve), Richtungsänderung aufgrund von Zusammenstößen (Collision) und sonstige
Bewegungen (Another)) im zeitlichen Verlauf der Fermentation 6. Die Bakterien wurden in
150 Bildern mit einer Auflösung von 30 fps beobachtet (Beobachtungszeitraum: 5 s).
76
Ergebnisse
Mit Zunahme der Biomasse über die Zeit nimmt die Anzahl der beweglichen Bakterien zu.
Vor allem das Bewegungsmuster gerade Strecken (Straight path) nimmt zu Beginn stark zu.
Bei Minute 225 sind Bewegungen der Kategorie Richtungsänderung ohne Stoppphasen
(Orientation) in einem relevanten Anteil vertreten, Taumeln ist vor allem bei Minute 260 zu
beobachten. Die Kollisionen sind bei Minute 225 besonders hoch.
Die Verteilung der einzelnen Bewegungsmuster im zeitlichen Verlauf der Fermentation 7 ist
in Abbildung 45 dargestellt. Die Werte sind im Anhang (S. 116) tabellarischer aufgetragen.
Abbildung 45: Zeitliche Verteilung der Bewegungsmuster von Bacillus amyloliquefaciens
FZB42 in Fermentation 7 (ABiTEP-Medium-¼)
Die Sichtung der verschiedenen Bewegungsformen (Richtungsänderung ohne Stoppphasen
(Orientation), wellenförmige Bewegungen (Undulation), gerade Strecken (Straight path),
Richtungsänderung mit längeren Schwimmbewegungen und kurzen Taumelphasen
(Tumble), Richtungswechsel mit kurzen Schwimmbewegungen und längeren Stoppphasen
ohne Eigenbewegung (Orientation and Stop), bogenförmige Strecken
(Curve),
Richtungsänderung aufgrund von Zusammenstößen (Collision) und sonstige Bewegungen
(Another)) im zeitlichen Verlauf der Fermentation 7. Die Bakterien wurden in 150 Bildern
mit einer Auflösung von 30 fps beobachtet (Beobachtungszeitraum: 5 s).
Bei Fermentation 7 sind vor allem Bewegungen der Kategorien Taumeln (Tumble) und
gerade Strecken (Straight path) in der Wachstumsphase der Fermentation zu sehen. In Minute
305 übersteigt der Wert der taumelnden Bakterien sogar den der geradlinigen Bewegung,
ansonsten liegt das Taumeln immer hinter den Bewegungen der Kategorie gerade Strecken
(Straight path).
77
Diskussion
8
Diskussion
Die Fermentationsverläufe werden zunächst anhand der Daten der kommerziell verfügbaren
Sensoren (Temperatur, pH-Wert und pO2) diskutiert. Anschließend erfolgt die Interpretation
der Ergebnisse aus der Bewegungsanalyse. Weiterhin wird die Praxistauglichkeit des
entwickelten Messsystems bewertet.
8.1
Verlauf der Fermentationen
Bei der Kultivierung von sporenbildenden Bakterien der Gattung Bacillus durchlaufen diese
stets ähnliche Veränderungen im Metabolismus. Nach der Auskeimung werden zunächst
Glukose oder andere Kohlenhydrate verbraucht und es kommt zu einer exponentiellen
Wachstumsphase. In dieser Wachstumsphase werden organische Säuren produziert, was sich
durch eine Absenkung des pH-Werts bemerkbar macht. Nachdem die Kohlenhydrate
aufgebraucht sind, werden die organischen Säuren metabolisiert (Diauxie). Dies ist durch
einen Anstieg des pH-Werts nachvollziehbar. In dieser Phase wächst die Kultur weiter, jedoch
setzt bald danach die Sporulation ein (Nakata und Halvorson 1960; Deutscher und Kornberg
1968).
Bakterien sind in der Lage, durch Katabolitrepression in einem komplexen Medium zunächst
die Nährstoffquellen zu verarbeiten, welche das stärkste Wachstum ermöglichen. Es ist
bekannt, dass grampositive Bakterien wie Bacillus Glukose und andere Zucker als
Kohlenstoffquelle bevorzugen. Solange Zucker vorhanden sind, werden von den Bakterien
nur die Enzyme produziert, die notwendig sind, um diese zu verarbeiten (Stülke und Hillen
1999). Der typische Verlauf des pH-Werts während der Kultivierung von Bacillus wird
hierdurch verständlich und entspricht dem charakteristischen Fermentationsverlauf mit dem
ABiTEP-Medium-¼ (Fermentationen 1 – 3 und 7). In Abbildung 46 ist ein typischer Verlauf
von Glukose, organischen Säuren, pH-Wert und Wachstum dargestellt, hier vom
sporenbildenden Bacillus cereus.
78
Diskussion
Abbildung 46: Diauxischer Kultivierungsverlauf von Bacillus cereus
Kultivierung von B. cereus bei 30 °C in einem komplexen Medium (siehe Nakata und
Halvorson 1960). A) Die verbleibende Glukose im Medium sowie der Verlauf der
Konzentration von Essig- und Brenztraubensäure in Abhängigkeit der Zeit. B) Der pHWert, die Gesamtkonzentration an Essig- und Brenztraubensäure und die Zelldichte in
Abhängigkeit der Zeit. (aus Nakata und Halvorson 1960) (modifiziert).
Der Abbau der Glukose und die gleichzeitige Bildung der organischen Säuren - hier wurde
die Essig- und die Brenztraubensäurekonzentration ermittelt - ist deutlich zu sehen. Auch das
gleichzeitige Absinken des pH-Werts ist dargestellt. Im Tal des pH-Werts zum Ende des
Glukoseverbrauchs ist auch eine kurze Stagnation des Zellwachstums zu beobachten. Nach
der Umstellung von Glukose- auf Säureverbrauch, hier nach vier Stunden
Fermentationsdauer, ist der Beginn der Sporenbildung zu beobachten (Nakata und Halvorson
1960). Einen vergleichbaren Verlauf konnten auch Hageman et al. (1984) bei B. subtilis in
einem chemisch definierten Medium aufzeigen. Die Fermentationen werden bis zum Ende der
Sporenbildung durchgeführt. Im Anschluss des pH-Wert-Anstiegs ist eine Stagnation und ein
leichtes Abfallen des pH-Werts zu beobachten. Dieser Verlauf der Kultivierung kann auch
beim verwendeten B. amyloliquefaciens FZB42 unter dem Einsatz des ABiTEP-Medium-¼
beobachtet werden. Die Messwerte der konventionellen Sensoren (Rührerdrehzahl, pO2, pHWert und OD600) sind in Abbildung 47 zu sehen. Die beschriebenen Fermentationsstadien
lassen sich anhand dieser Messwerte gut erkennen.
79
Diskussion
Abbildung 47: Zeitlicher Kultivierungsverlauf von Bacillus amyloliquefaciens FZB42
auf ABiTEP-Medium-¼
Fermentation 1 zeigt den typischen Verlauf einer Kultivierung mit ABiTEP-Medium-¼. Es
sind die Messwerte von Rührerdrehzahl, pO2, pH-Wert und OD600 im zeitlichen Verlauf
aufgetragen. Die Fermentation ist in fünf Stadien eingeteilt: Auskeimung und Latenzphase
(I), exponentielles Wachstum durch Kohlenhydratverbrauch und Säurebildung (II),
Diauxiestufe; Kohlenhydrat- auf Säureverstoffwechselung (III), Wachstum durch
Säureverbrauch (IV), Sporulation (V).
Zunächst erfolgt die Auskeimung (I) der Sporen. Hierbei ist kaum Aktivität der Kultur zu
beobachten. Daher steigt bei konstanter Rührerdrehzahl die Gelöstsauerstoffsättigung (pO2)
an. Da das ABiTEP-Medium-¼ trüb ist, liegt die OD600 bereits oberhalb des Werts 1. Nach
der Auskeimung beginnt die exponentielle Wachstumsphase (II), die Sauerstoffkonzentration
fällt ab und während die Kohlenhydrate verbraucht werden, sinkt der pH-Wert langsam,
während die OD600 ansteigt. Die stärkste Wachstumsphase ist geprägt durch einen rasanten
Abfall der Sauerstoffsättigung und des pH-Werts, ebenso steigt die OD600 nun deutlich. Die
Rührerdrehzahl ist inzwischen gestiegen und die pO2 wird dadurch stabil auf 50% geregelt.
Der pH-Wert erreicht nun seinen Tiefpunkt und steigt ab hier wieder zügig an. Die
Rührerdrehzahl ist bis dahin stetig gestiegen, stagniert jedoch in dieser Phase. Die OD600
steigt weiter an. Diese Phase stellt eine Stoffwechselumstellung von Kohlenhydrat- auf
Säureverbrauch (III) dar. An dieser Stelle sind die Kohlenhydrate im Medium. Während
dieser Stoffwechselumstellung steigt der Sauerstoffbedarf nicht weiter an. Die nachfolgende
Phase des Wachstums durch Säureverbrauch (IV) ist von einem rasanten Anstieg des pHWerts und des Sauerstoffbedarfs geprägt. Die OD600 steigt noch einmal deutlich an. Sobald
die Nährstoffquellen aufgebraucht sind, sinkt der Sauerstoffbedarf schlagartig, der pH-Wert
steigt weniger schnell. Weiterhin fällt nun die OD600 rasch ab. Dies stellt den Beginn der
Sporulation (V) dar. Die Beobachtungen aus den Fermentationen mit ABiTEP-Medium-¼
decken sich somit mit den Erkenntnissen aus der Literatur.
80
Diskussion
Der typische Verlauf mit Standard-Nährmedium-I-¼ (Fermentationen 4 – 6) zeigt eine
ähnliche Charakteristik wie mit ABiTEP-Medium-¼. Bei genauer Beurteilung des
Fermentationsverlaufs muss hier jedoch eine feinere Untergliederung der Fermentationsphasen vorgenommen werden. Der pH-Wert wechselt weniger parabelförmig seine Richtung
und zeigt weiterhin einen deutlichen Knick in der Steigung. Auch die pO2 zeigt hier eine
stärkere Änderung. Anstelle einer Stagnation bricht beim pH-Minimum der Sauerstoffbedarf
stark ein. Beim Knick in der Steigung des pH-Werts ist wiederum eine Stagnation zu
beobachten, ähnlich wie beim Minimum bei der Fermentation mit ABiTEPProduktionsmedium. In Abbildung 48 ist der Verlauf der Kultivierung aus Fermentation 6 zu
sehen. Dies ist ein typischer Verlauf für die Kultivierung von B. amyloliquefaciens FZB42 in
diesem Medium.
Abbildung 48: Zeitlicher Kultivierungsverlauf von Bacillus amyloliquefaciens FZB42
auf Standard-Nährmedium-I-¼
Fermentation 6 zeigt den typischen Verlauf einer Kultivierung mit Standard-NährmediumI-¼. Es sind die Messwerte von Rührerdrehzahl, pO2, pH-Wert und OD600 im zeitlichen
Verlauf aufgetragen. Die Fermentation ist in sieben Stadien eingeteilt: Auskeimung und
Latenzphase (I), exponentielles Wachstum durch Glukose- und Stickstoffverbrauch und
Säurebildung (II), Diauxiestufe I; Glukose- auf Säureverstoffwechselung und
Stickstoffverbrauch (III), exponentielles Wachstum durch Stickstoff- und Säureverbrauch
(IV), Diauxiestufe II; Stickstoff- auf reine Säureverstoffwechselung (V), Wachstum durch
Säureverbrauch (VI), Sporulation (VII).
Da das Standard-Nährmedium-I-¼ klar ist, beginnt die OD600 bei deutlich niedrigen Werten
als bei den Fermentationen mit dem ABiTEP-Medium-¼. Die Phase der Auskeimung (I)
verläuft ähnlich, jedoch findet die Auskeimung schneller statt. Nach der Auskeimung und
Latenzphase beginnt die exponentielle Wachstumsphase durch Glukose- und
Stickstoffverbrauch mit Säurebildung (II). Der Abfall des pH-Werts (pH 7,3 zu
Fermentationsbeginn auf 6,1 im pH-Tiefpunkt) ist stärker als beim ABiTEP-Medium-¼ (pH 7
bei Fermentationsbeginn auf 6,8 im pH-Tiefpunkt). Die anderen Fermentationen des
jeweiligen Mediums verhalten sich vergleichbar. Ebenso ist der Sauerstoffverbrauch höher,
81
Diskussion
der Rührer wird schon in der Wachstumsphase stark hochgeregelt. Die OD600 steigt deutlich
an. Die erste Diauxiestufe (IV) wird vom Minimum des pH-Werts geprägt, die Umkehrung
der Steigung im pH-Wert-Verlauf erfolgt sehr plötzlich. Die Glukose- wird hier auf
Säureverstoffwechselung umgestellt. Zu diesem Zeitpunkt kommt es auch zu einem
deutlichen Einbruch des Sauerstoffbedarfs. Die OD600 steigt weiter an. Die exponentielle
Wachstumsphase mit Stickstoff- und Säureverbrauch (IV) zeigt einen langsamen Anstieg des
pH-Werts. Die OD600 und der Sauerstoffbedarf steigen hier an. Ein Knick in der Steigung des
pH-Wert-Verlaufs sowie eine Stagnation des Sauerstoffbedarfs sind die Anzeichen für die
zweite Diauxiestufe (V). Eine Umstellung zum reinen Säureverbrauch findet statt. Die OD600
steigt hier weiter an, jedoch mit deutlich geringerer Steigung. Während des Wachstums durch
Säureverbrauch (VI) erreicht die OD600 ihr Maximum, der pH-Wert steigt stark an, der
Sauerstoffbedarf steigt leicht. Das Absinken des Sauerstoffbedarfs sowie der schnelle Abfall
der OD600 zeigen den Beginn der Sporulation (VII). Der pH-Wert steigt hier weiter an.
Die Fermentationen mit dem ABiTEP-Medium-¼ dauern von Fermentationsbeginn bis zum
Einsetzen der Sporulation etwa 1,5 h länger als im Standard-Nährmedium-I-¼ (Ferm. 1: 382
min, Ferm. 2: 391 min, Ferm. 3: 425 min, Ferm. 4: 325 min, Ferm. 5: 315 min, Ferm. 6: 305
min). Im ABiTEP-Medium-¼ liegen die Kohlenhydrate zum Teil als Stärke vor, die erst in
Glukose gespalten werden muss. Durch das Aufspalten der Stärke ist die Steigungsänderung
im pH-Minimum nicht so plötzlich wie im Standard-Nährmedium-I-¼. Dort liegen die
Kohlenhydrate als reine Glukose vor. Ist diese aufgebraucht, wird die starke pHWertänderung beobachtet. Parallel zur Glukose werden im Standard-Nährmedium-I-¼
Stickstoffquellen verarbeitet.
8.2
Bewegungsanalyse von Bacillus amyloliquefaciens FZB42
Die Vitalität von Mikroorganismen während ihrer Kultivierung ist ein bedeutender
Fermentationsparameter. Wie Grossart et al. (2001) schon formuliert haben, kann die
Beweglichkeit von Bakterien ein Kriterium für ihre Vitalität sein, da Bakterien, die sich aktiv
bewegen, weder tot noch inaktiv sind. Durch das entwickelte System kann die Beweglichkeit
begeißelter Bakterien beobachtet und ausgewertet werden.
Der Abstand der einzelnen Probenentnahmen beträgt bei allen Versuchen zwischen 10 und
max. 30 min (typisch 15 – 20 min). Bei Prozessen mit Fermentationsdauern von mehreren
Stunden sind Prozesseingriffe aufgrund der in dieser Messfrequenz erhaltenen Ergebnisse
möglich. Vor allem im Hinblick auf Optimierungsmöglichkeiten, die eine Messfrequenz von
5 min ermöglichen, kann das entwickelte System als onlinefähig angesehen werden. Die
Optimierung der Probenentnahme wird in Kapitel 8.3 näher diskutiert.
Da nur Partikel erfasst werden, die sich aktiv bewegen, kann das Messsystem auch in
partikelbehafteten Medien Anwendung finden. Trübe Medien stellen vor allem für elektrooptische Messsysteme ein Problem dar (Junne et al. 2008; Junne et al. 2010). Die Trübung
durch Stärke stellt einen Offset für die optische Dichte dar, der im Laufe der Fermentation
abnimmt. Diese Einschränkung ist mit dem entwickelten Messsystem nicht gegeben, da
unbewegliche Partikel nicht berücksichtigt werden. Voraussetzung ist, dass Partikelgröße und
82
Diskussion
Beschaffenheit nicht hinderlich bei der Minimierung der Schichtdicke sind. Starre Partikel in
der Suspension, die größer als 3 µm sind, führen zu einer erhöhten Schichtdicke.
Die Funktionsfähigkeit wurde mit B. amyloliquefaciens FZB42 im Produktionsmedium für
die industrielle Kultivierung (ABiTEP GmbH) in ¼-Konzentration und mit StandardNährmedium-I (Carl Roth GmbH + Co. KG) in ¼-Konzentration gezeigt. In allen Versuchen
wurde ein ähnlicher Verlauf der durchschnittlichen Bewegungsgeschwindigkeit während der
verschiedenen Fermentationsphasen beobachtet. Dem Abfall der Geschwindigkeit während
der Diauxiestufen folgt ein Anstieg nach abgeschlossener Stoffwechselumstellung. Im
ABiTEP-Medium-¼ kam es zu einer Diauxiestufe (Umstellung von Kohlenhydrat- auf
Säureverstoffwechselung), im Standard-Nährmedium-I-¼ kam es zu zwei Diauxiestufen
(Umstellung von Glukose- auf Säure- und Stickstoffverbrauch (I) und Umstellung von
Stickstoff- auf reine Säureverstoffwechselung (II)). Nachdem die maximale Zelldichte
erreicht ist, fällt die Durchschnittsgeschwindigkeit erneut ab, bis keine beweglichen Bakterien
mehr detektierbar sind.
Bei den Fermentationen 1 – 3 (ABiTEP-Medium-¼) beträgt die durchschnittliche
Bewegungsgeschwindigkeit in der exponentiellen Wachstumsphase zwischen 50,7 und
58 µm s-1. In der Diauxiestufe (pH-Minimum) wird der Stoffwechsel von Kohlenhydrat- auf
Säureverbrauch umgestellt. Der Verlauf der berechneten Bewegungsgeschwindigkeit zeigt an
dieser Stelle ebenso ein lokales Minimum, welches zwischen 47,7 und 50,2 µm s-1 liegt. Es
wird vermutet, dass die Bewegungsgeschwindigkeit aufgrund des Wechsels der
Energiegewinnung (von Kohlenhydrat- auf Säureverbrauch) reduziert ist, da zu diesem
Zeitpunkt weniger Energie für den Geißelantrieb zur Verfügung steht. Nach der Diauxiestufe,
während des Wachstums durch Säureverbrauch, zeigt die Bewegungsgeschwindigkeit bei den
Fermentationen 1 – 3 jeweils einen Aufwärtstrend mit Durchschnittsgeschwindigkeiten von
51,9 bis 59,6 µm s-1. Der pH-Wert steigt weiter an während Rührerdrehzahl und Belüftung bei
konstantem pO2 stagnieren bzw. leicht abfallen. Die Bewegungsgeschwindigkeit liegt
zwischen 40,8 und 46,2 µm s-1 und sinkt anschließend ab, da die Nährstoffquellen
aufgebraucht sind. Dieser Punkt zeigt den Beginn der Sporulation an.
Bei den Fermentationen 4 – 6 (Standard-Nährmedium-I-¼) ist ein ähnlicher Verlauf der
Bewegungsgeschwindigkeiten zu sehen. In der exponentiellen Wachstumsphase mit
Glukoseverbrauch und Säurebildung sind die Bakterien am schnellsten mit
Durchschnittsgeschwindigkeiten zwischen 46,03 und 58,32 µm s-1. Da die Glukose im
Standard-Nährmedium-I-¼ am effektivsten zu verarbeiten ist, steht hier für den Geißelantrieb
und die Bewegung die meiste Energie zur Verfügung. Während der ersten Diauxiestufe, wenn
die Glukose aufgebraucht ist (im pH-Minimum), sinkt die Durchschnittsbewegungsgeschwindigkeit in den drei Fermentationen auf einen Bereich zwischen 39,26 und
50,16 µm s-1 ab. Die Bakterien verwenden während der Umstellung von Säurebildung auf
Säureverbrauch vermutlich weniger Energie für die Bewegung. In der darauffolgenden
exponentiellen Wachstumsphase ist ein erneuter Anstieg der Bewegungsgeschwindigkeit zu
beobachten (46,06 bis 55,1 µm s-1), bevor sie während der zweiten Diauxiestufe wieder abfällt
(39,28 bis 47,63 µm s-1). Die Bakterien versuchen stets, die optimale Energieversorgung zu
83
Diskussion
erreichen. Sinkt die Konzentration des Nährstoffs, der zu dieser Zeit zur hauptsächlichen
Energieversorgung dient, unter ein kritisches Niveau, ist der Verbrauch einer alternativen
Energiequelle sinnvoll. Anstelle durch Bewegung die optimale Konzentration des Nährstoffs
zu finden, wird der Metabolismus umgestellt. Daher sinkt die Bewegungsgeschwindigkeit in
diesen Phasen und steigt anschließend wieder an. Dieser Anstieg nach der zweiten
Diauxiestufe erreicht bei den Fermentationen 4 – 6 nochmal Werte zwischen 45,06 und
47,44 µm s-1. Zu Beginn der Sporulation, wenn die Nährstoffe aufgebraucht sind, liegt die
durchschnittliche Bewegungsgeschwindigkeit noch zwischen 36,91 und 38,37 µm s-1 und
sinkt stetig bis zur vollständigen Sporulation. Bei den Fermentationen 4 und 5 wurde gegen
Ende der Fermentation Antischaummittel zugegeben. Es ist nach jeder Zugabe von
Antischaummittel zu einem Absinken der Durchschnittsgeschwindigkeit gekommen. Daher
wurde in Fermentation 6 kein Antischaummittel zugegeben. Das Absinken der
Durchschnittsgeschwindigkeit durch die Zugabe von Antischaummittel wird später diskutiert
(S. 85).
Die gemessenen durchschnittlichen Bewegungsgeschwindigkeiten liegen an allen
Messpunkten zwischen 35 und 60 µm s-1 mit Höchstgeschwindigkeiten bis ca. 100 µm s-1.
Dieser Bereich passt gut zu den Literaturwerten gemessener Bakteriengeschwindigkeiten
(siehe Tabelle 2). Die Durchschnittsgeschwindigkeit im ABiTEP-Medium-¼ (Fermentationen
1 – 3) beträgt 48,5 µm s-1. Im Standard-Nährmedium-I-¼ (Fermentationen 4 – 6) ist die
berechnete Durchschnittsgeschwindigkeit mit 44 µm s-1 etwas geringer. Da das StandardNährmedium-I-¼ im Gegensatz zum ABiTEP-Medium-¼ keine Partikel (Stärke) beinhaltet,
sind die Nährstoffe homogener im Medium verteilt. Vermutlich regt die inhomogene
Verteilung im ABiTEP-Medium-¼ die Bakterien zu einer höheren Beweglichkeit an. Die
Geschwindigkeitsverteilung um die Mittelwerte ist in beiden Medien vergleichbar. Die
Standardabweichung beträgt 28 µm s-1 beim ABiTEP-Medium-¼ und 29,5 µm s-1 beim
Standard-Nährmedium-I-¼. Die geringen Unterschiede könnten aus der unterschiedlichen
Dauer der Fermentationsphasen und den Unterschieden im Fermentationsverlauf resultieren.
Die statistische Auswertung der Fermentationen 1 – 3 zeigt für die charakteristischen
Fermentationszeitpunkte signifikante Unterschiede in den Bewegungsgeschwindigkeiten.
Acht von neun statistischen Vergleichen zeigen p-Werte unterhalb des Signifikanzniveaus
von 0,05. Lediglich in Fermentation 1 ergibt die Gegenüberstellung der Daten bei einem
Vergleich einen p-Wert von 0,1120. Bei Fermentation 1 sind die Messintervalle von max.
30 min länger als bei den Fermentationen 2 und 3 (Fermentation 2: max. 20 min,
Fermentation 3: max. 15 min). Es ist daher wahrscheinlich, dass die Probenentnahme nicht
genau den Punkt der Diauxiestufe getroffen hat. Dies könnte den p-Wert oberhalb des
Signifikanzniveaus erklären. Da die acht anderen Untersuchungen jedoch p-Werte deutlich
unter 0,05 ergeben, kann davon ausgegangen werden, dass signifikante Unterschiede
zwischen den Messdaten vorliegen. Neben dem statistischen Beweis über die Signifikanz der
Messdaten zeigt die Untersuchung, dass unter den untersuchten Kultivierungsbedingungen
einige Fermentationsphasen (z.B. die Diauxiestufe) nicht mit einem Messintervall von 30 min
darstellbar sind. Die Zeit zwischen zwei Messungen sollte daher deutlich unter 30 min liegen.
84
Diskussion
Die p-Werte der statistischen Untersuchung von Fermentation 4 – 6 zeigen zum größten Teil
(23 von 27 Vergleichen) Werte unterhalb des Signifikanzniveaus von 0,05. Der Vergleich der
ersten und zweiten Diauxiestufe bei Fermentation 4 und 5 ergeben p-Werte von 0,0524 bzw.
0,3676. Die Vergleichbarkeit der Ergebnisse der beiden Diauxiestufen und damit verbunden
die hohen p-Werte zeigen, dass ähnliche Gründe für die Reduktion der
Durchschnittsgeschwindigkeit vorliegen, nämlich die Umstellung des Metabolismus auf eine
andere Nährstoffquelle (z.B. von Glukose- auf Säureverbrauch und von Stickstoff- auf reinen
Säureverbrauch). Bei den Fermentationen 4 und 6 überschreitet der p-Wert für den Vergleich
der ersten Diauxiestufe gegen den Beginn der Sporulation den Grenzwert von 0,05. Die pWerte liegen bei 0,5754 bei Fermentation 4 und bei 0,0921 für Fermentation 6. Da auch zu
Beginn der Sporulation ein Rückgang der Durchschnittsgeschwindigkeit aufgrund der
Verknappung von Nährstoffen stattfindet, ist die Ähnlichkeit zwischen den Messwerten
gegeben. Die Messintervalle von Fermentation 4 liegen bei 20 min, die bei den
Fermentationen 5 und 6 bei jeweils 15 min. Die Ursachen für unterschiedliche Messintervalle
werden in Kapitel 8.3 diskutiert.
Das entwickelte Messsystem kann somit die Änderungen der Bewegungsgeschwindigkeit von
B. amyloliquefaciens FZB42 während einer Batch-Fermentation verfolgen. Die Änderungen
der Geschwindigkeit korrelieren mit bekannten Veränderungen im Stoffwechsel der Bakterien
(Nakata und Halvorson 1960; Deutscher und Kornberg 1968), die durch pH-Wert, pO2 und
OD600 validiert wurden. Das System eignet sich somit zur Online-Erfassung der Vitalität von
beweglichen
Bakterien.
Untersuchungen
weiterer
Stressfaktoren
neben
der
Nährstofflimitierung (z.B. Temperaturschwankungen, Sauerstoffmangel oder Infektionen mit
Bakteriophagen) sind zum Beweis jedoch nötig. Bevor eine allgemeingültige Aussage
getroffen werden kann, sind ebenso weitere Untersuchungen anderer beweglicher
Bakterienstämme notwendig.
Bei den Fermentationen 4 und 5 ist ein Absinken der Beweglichkeit nach Zugabe von
Antischaummittel aufgetreten. Da das Antischaummittel einen Einfluss auf die
Sauerstoffsättigung im Medium hat, ist der beobachtete Einfluss auf die
Bewegungsgeschwindigkeit möglicherweise hierauf zurückzuführen. Ein weiterer Grund für
das Absinken der Geschwindigkeit könnte die Änderung der Oberflächenspannung sein. Der
Grund für das Absinken der Geschwindigkeit nach Zugabe von Antischaummittel muss in
weiteren Messreihen separat untersucht werden.
Neben der durchschnittlichen Geschwindigkeit lässt sich über die Anzahl der beweglichen
Bakterien eine Aussage über die Zelldichte (beweglicher Bakterien) der Kultur treffen.
Anders als beim OD600 werden tote, inaktive und unbewegliche Bakterien sowie Sporen und
Trübstoffe nicht ermittelt. Aus der ermittelten Zelldichte beweglicher Bakterien könnten
Trends in der Entwicklung der Kultur somit schneller als durch die OD600 erkennbar sein. Die
Ergebnisse der Versuchsfermentationen diesbezüglich sind vielversprechend. Besonders in
trüben Medien zeigen die Kurven der Anzahl beweglicher Bakterien spezifischere Verläufe
als die OD600 (siehe Abbildung 33). Die Verläufe der beweglichen Bakterien zeigen in den
Fermentationen 1 – 3 mit dem ABiTEP-Medium-¼ trotz der Trübung eine gute Korrelation
85
Diskussion
zur OD600 (siehe Abbildung 35). Nach Einsetzen der Sporulation bleibt die OD600 hoch, die
Anzahl der beweglichen Bakterien sinkt jedoch. Ein vergleichbares Verhalten nach Einsetzen
der Sporulation kann auch im Standard-Nährmedium-I-¼ gezeigt werden. Vor der
Sporulation ist die Korrelation zwischen der OD600 und die der Anzahl der beweglichen
Bakterien ebenso gut (siehe Abbildung 39). Versuche in weiteren Medien, Fed-BatchFermentationen, die Kultivierung mit anderen Bakterienstämmen sowie das parallele
Ausplattieren von Proben als Referenz sind noch notwendig, um die Aussagekraft des
Parameters (Anzahl an beweglichen Bakterien pro Bild) zu beweisen.
Neben der automatischen Erfassung der Bewegungsgeschwindigkeit und der Anzahl der
beweglichen Bakterien konnten durch eine interaktive Auswertung von Bildserien
charakteristische Bewegungsmuster identifiziert werden. Die Bildstrecken zur Auswertung
der Bewegungsmuster haben eine Länge von 150 Aufnahmen, dies entspricht fünf Sekunden.
Bei den Fermentationen 4 – 6 (Standard-Nährmedium-I-¼) schwammen 53% der Bakterien
geradeaus, 5% schwammen eine Kurve und nur 2% der Bakterien bewegten sich
wellenförmig vorwärts. Die wellenförmige Bewegung konnte hauptsächlich bei Ketten aus
zwei Zellen beobachtet werden. Einen Richtungswechsel vollzogen etwas mehr als 20% der
Bakterien, davon knapp 10% durch Taumeln, knapp 5% nach einem Stopp ohne
Taumelbewegung und ungefähr 10% ohne Taumel- und Stopp-Phase. Etwa 15% der
Beobachtungen konnten keinem der Bewegungsmuster zugewiesen werden, ein Großteil
davon aufgrund von Kollisionen.
In Fermentation 7 (ABiTEP-Medium-¼) wurden ebenso die Bewegungsmuster ausgewertet.
Im Gegensatz zu den Fermentationen 4 – 6 schwammen nur etwa ein Drittel (37%) der Zellen
geradeaus, eine Kurve schwammen etwa 5% und 2% in einer wellenförmigen Bewegung.
Auch hier handelte es sich bei den wellenförmigen Bewegungen vornehmlich um die
Bewegung zweier Ketten. Etwa ein weiteres Drittel (31%) wechselte in den beobachteten
Bildserien die Richtung, 21% durch Taumeln, 4% nach einer Stopp-Phase und 6% ohne
Stopp- und Taumel-Phase. 25% der Beobachtungen konnten keinem charakteristischen
Bewegungsmuster zugewiesen werden, 19% davon wegen Kollisionen. Die Anzahl der
Kollisionen steigt durch den Feststoffanteil im Medium. Während bei Standard-NährmediumI-¼ die Kollisionen ausschließlich zwischen Bakterien stattfanden, kam es hier auch zu
Kollisionen zwischen Bakterien und Partikeln aus dem Medium.
Neben den Kollisionen liegen die Unterschiede in der Verteilung der Bewegungsmuster
zwischen Standard-Nährmedium-I-¼ und ABiTEP-Medium-¼ hauptsächlich bei den Mustern
geradeaus Schwimmen (Straight path) und Taumeln (Tumble). Die Ursache hierfür könnte die
Verteilung der Nährstoffe im Nährmedium sein. Während beim Standard-Nährmedium-I-¼
die Nährstoffe gelöst und gut verteilt sein dürften, könnten durch die Feststoffe im ABiTEPMedium-¼ Nährstoffgradienten durch den Stärkeabbau entstehen. Da Bakterien die Fähigkeit
besitzen, Nährstoffgradienten zu folgen (Adler 1966; Macnab und Koshland 1972; Berg
1975) wird vermutlich im ABiTEP-Medium-¼ häufiger ein Taumeln beobachtet, um einer
erhöhten Nährstoffkonzentration entgegen zu schwimmen. Dies ist ein weiterer Hinweis, dass
sich die Durchschnittsgeschwindigkeit im Verlauf der Fermentation im ABiTEP-Medium-¼
86
Diskussion
durch das Auftreten von Nährstoffgradienten erhöht. Bakterien könnten während der
gerichteten Nahrungssuche schneller sein als bei der Bewegung im homogenen Medium.
Die zeitliche Abhängigkeit der Verteilung der Bewegungsmuster zu beurteilen, ist mit der
Anzahl der erhobenen Daten nur schwer zu realisieren. Natürlich nehmen die Kollisionen mit
steigender Bakterienkonzentration und Aktivität zu. Um weitere Abhängigkeiten zu den
einzelnen Fermentationsphasen eindeutig nachzuweisen, sind weitergehende und
ausführlichere Messungen notwendig. Die gewonnenen Messwerte lassen jedoch vermuten,
dass sich die Richtungsänderungen im Bereich der Diauxiestufen häufen. Da bei einer
Nahrungsknappheit das aktive Suchen nach neuen Nahrungsquellen notwendig ist, erscheint
diese Tendenz plausibel.
8.3
Praxistauglichkeit des Online-Mikroskopie-Systems
Um die Ergebnisse der automatischen Bildauswertung in Bezug auf die
Durchschnittsgeschwindigkeit auf Plausibilität zu überprüfen, wurde eine manuelle
Wegverfolgung zu den vier charakteristischen Fermentationszeitpunkten von Fermentation 1
durchgeführt. Wie in Kapitel 7.2.1 gezeigt, konnte eine gute Übereinstimmung der
Messergebnisse erreicht werden.
Eine geringfügig zu hohe Schichtdicke kann dazu führen, dass die Bakterien sich leicht in
Richtung z-Achse drehen können, oder etwas außerhalb des Fokus schwimmen. Die
Veränderung in den Merkmalen der betreffenden Bakterien kann zu einer Unterbrechung der
Wegverfolgung führen. Diese Unterbrechungen werden zum Teil durch eine spätere
Nachbearbeitung zusammengeführt, dies ist dem Algorithmus jedoch nicht immer möglich.
Der entstehende Fehler ist jedoch gering, da alle Durchschnittsgeschwindigkeiten über die
Anzahl der erkannten Aufnahmen gewichtet sind. Durch den beschriebenen Fehler kann aus
einem Bakterium, das manuell über 30 Aufnahmen verfolgt wird, zwei Bakterien (z.B. ein
Bakterium über 10 Aufnahmen und eines über 19 Aufnahmen) werden. Die Ergebnisse der
Durchschnittsgeschwindigkeit sind in diesen Fällen jedoch nahezu identisch. Bakterien, die
nur über wenige Aufnahmen verfolgt werden konnten werden vom System nicht gewertet, da
die Messwerte in der Regel nicht repräsentativ sind, da z.B. das Bakterium nur an einer Ecke
den Bildausschnitt streift und in zwei von vier Aufnahmen nicht vollständig auf dem Bild
dargestellt wird. Starke Änderungen der Merkmale der einzelnen Bakterien können neben
erhöhter Schichtdicke auch auf Kollisionen mit anderen Bakterien oder Partikeln
zurückgeführt werden. Diese Ungenauigkeiten können in der manuellen Wegverfolgung
ausgeglichen werden, daher sind die Standardfehler der manuellen Wegverfolgung
geringfügig kleiner.
Diese potentiell höhere Genauigkeit der manuellen Wegverfolgung muss jedoch vor dem
Hintergrund der Zeitersparnis sowie der Online-Tauglichkeit des automatischen Systems
betrachtet werden. Wenige Minuten Berechnungszeit stehen vielen Arbeitsstunden
bzw. -tagen manueller Auswertung gegenüber. Die Validierung gegenüber der manuellen
Auswertung
konnte
somit
die
Plausibilität
der
automatisch
ermittelten
Durchschnittsgeschwindigkeiten zeigen.
87
Diskussion
Die Stabilität des Messsystems steigt mit der Bildqualität. Angestrebte Optimierungen im
Messsystem könnten dies erreichen. Mit einer steigenden Stabilität wäre neben der
Durchschnittsgeschwindigkeit auch eine Beurteilung der verschiedenen Bewegungsmuster
möglich. Dies könnte als weiterer Parameter eine Aussage über den Status der Bakterien
ermöglichen. Viele Richtungswechsel könnten z.B. auf eine intensive Nahrungssuche und
bevorstehende Stoffwechseländerung hinweisen.
Hohe Scherkräfte können zum Abriss von Geißeln führen. Dadurch können Bakterien, die
hohen Scherkräften ausgesetzt wurden, sich nicht mehr bewegen. Die Fähigkeit zur
Regeneration der Geißeln und auch zur Zellteilung muss dadurch nicht verloren gehen
(Grossart et al. 2001). Um die Geißeln während der Probenentnahme und der Vermessung
nicht zu beschädigen, müssen die Scherkräfte minimiert werden. Daraus resultierte die
Notwendigkeit einer Küvette mit variabler Schichtdicke. Bei gegebenem Durchfluss werden
die Strömungsgeschwindigkeiten und somit die Scherkräfte durch eine hohe Schichtdicke
minimiert. Es konnte gezeigt werden, dass in der Wachstumsphase ein hoher Anteil an
Bakterien beweglich war. Der Einfluss der Scherkräfte bei der Probenentnahme und Messung
scheint daher keine offensichtliche Beschädigung der Geißeln zu verursachen trotz schneller
Durchspülung der Messzelle. Zudem wurden die Schubspannungen in der Küvette
näherungsweise berechnet. Die höchsten Schubspannungen treten demnach mit ca. 500 Pa in
der Zuleitung auf. Durch Versuche mit vielfach höheren Schubspannungen (bis ca. 33.000 Pa)
konnte gezeigt werden, dass keine Beschädigung der Geißeln zu befürchten ist. Der Anteil der
beweglichen Bakterien, nachdem sie mit 4 ml min-1 durch Kapillaren mit verschiedenen
Innendurchmessern (0,25 mm, 0,5 mm und 1 mm) gepumpt wurden, erwies sich in der
mikroskopischen Untersuchung als unabhängig vom Innendurchmesser. Die beweglichen
Bakterien machten im Mittel einen Anteil von 28 % ± 12 % aus. Da schon die
Probenentnahme aus dem Fermenter etwa die Schubspannung der 1 mm dicken Kapillare
erzeugt (die Entnahme erfolgt ebenso über einen dünnen Schlauch), dient diese Messung als
Referenz. Eine Referenzmessung ganz ohne Schubspannung wurde nicht durchgeführt. Da
auch die Entnahme über eine Pipette Schubspannungen erzeugt, wurde die definierte
Schubspannung in der 1 mm Kapillare als Referenz vorgezogen. Da kein Unterschied in der
Anzahl an beweglichen Bakterien nach den drei unterschiedlichen Behandlungen gefunden
wurde, ist davon auszugehen, dass die verwendeten Schubspannungen keinen Einfluss auf die
Bewegungsfähigkeit von B. amyloliquefaciens FZB42 haben. Für andere Mikroorganismen
sollte vor Verwendung des Messsystems ebenso der Einfluss von Schubspannungen auf die
Bewegungsfähigkeit untersucht werden.
In seltenen Fällen wurde die Verschmutzung der Küvette während der Fermentation zu stark,
um eine ausreichend kleine Schichtdicke in der Küvette zu erreichen. Gerade durch die
verhältnismäßig großen Partikel im ABiTEP-Medium-¼ konnten in diesen Fällen Probleme
auftreten. Die Reinigung erfolgte während der Fermentation nur bei Bedarf und wird manuell
durchgeführt. Durch diese nötigen, außerplanmäßigen Reinigungen konnten die
Probeintervalle von z.B. 15 min nicht immer eingehalten werden. Dies erklärt die
Uneinheitlichkeit der Messintervalle bei manchen Fermentationen.
88
Diskussion
Die aktuell umgesetzte Probenentnahme und Probenvorbereitung benötigen aufgrund ihrer
Ausführung im Prototyp eine große Menge an Probe pro Messung. Dies ist einer der Gründe,
weshalb die Anzahl der Probenentnahme mit dem aktuellen Aufbau nicht wesentlich erhöht
werden kann. Um den Einfluss der Probenentnahme auf die Fermentation gering zu halten,
wurden für Versuchsmaßstäbe relativ große Fermentationsvolumen (8 – 10 l) gewählt.
Weiterhin sind bei geringen Zelldichten kaum ausreichend viele bewegliche Bakterien zu
erfassen, um eine stabile Durchschnittsbildung der Geschwindigkeit zu ermöglichen. Neben
dem Verdünnen der Probe wäre es daher sinnvoll, eine Erhöhung der Konzentration, z.B.
durch Filterung, zu ermöglichen.
Trotz der aufgezeigten Einschränkungen des Prototyps konnte die Praxistauglichkeit und das
Potential des Messsystems, der Durchflussküvette mit flexibler Schichtdicke und der
automatisierten Probenentnahme und Auswertung aufgezeigt werden. Nötige und empfohlene
Optimierungen für den Einsatz des Messsystems folgen im Ausblick (Kapitel 9). Eine
Aussage über die Aktivität und Vitalität der Zellen ist durch das entwickelte Messsystem
möglich. Je höher die Durchschnittsgeschwindigkeit ist, desto höher ist die Aktivität der
Zelle. Bei Nahrungsknappheit bzw. Stoffwechseländerungen nimmt die Durchschnittsgeschwindigkeit ab. Der Einfluss anderer Fermentationsparameter auf die Durchschnittsgeschwindigkeit ist wahrscheinlich. Beim Einsatz von Antischaummittel konnte dies bereits
beobachtet werden.
89
Ausblick
9
Ausblick
Mit dem Prototyp konnte die Abhängigkeit der Durchschnittsgeschwindigkeit von den
verschiedenen Fermentationsstadien (Diauxie) von B. amyloliquefaciens FZB42 gezeigt
werden.
Nach den Erfahrungen mit dem Prototyp der Durchflussküvette gibt es an dieser Stelle
mehrere Ansätze für Verbesserungsmöglichkeiten. Im aktuellen Prototyp kommt, wie in
Kapitel 6.4.1 beschrieben ist, ein Polycarbonat-Objektträger zum Einsatz. Dieser kreisförmige
Objektträger hat einen Durchmesser von 16 mm und eine Stärke von 2 mm. Durch eine Kerbe
im Objektträger kann dieser zwischen eine Silikonmembran gespannt werden (siehe
Abbildung 13). Anstelle des Polycarbonats sollte Quarzglas oder besser Saphirglas für den
Objektträger zum Einsatz kommen. Quarzglas oder Saphirglas sind zum einen beständiger
gegen Chemikalien und zum anderen kratzfest. Eine bessere Oberflächengüte verhindert das
Anhaften von Bakterien und Schmutz. Durch die bessere Chemikalienbeständigkeit sind
weitere Reinigungsschritte möglich, z.B. der Einsatz von Natronlauge, Methanol oder
Kalilauge. Tabelle 12 zeigt die Beständigkeit von Polycarbonat, hier Makrolon (Bayer
MaterialScience AG, Leverkusen), gegen einige Chemikalien.
Tabelle 12: Beständigkeit von Makrolon gegen einige Chemikalien
Die Beständigkeit von Polycarbonat, hier Makrolon, gegen einige Chemikalien.
+ = beständig, - = nicht beständig (aus Makrolon Technische Information, Datei-Nr.:
KU28057-0409, Ausgabe 2004-09-28). Quarz- und Saphirglas sind gegenüber allen den in
der Tabelle genannte Chemikalien beständig.
6 Tage / 23 °C
Aceton
Benzin (aromatenfrei)
Chloroform
quillt an
+
löst
Essigsäure, 10%ig in Wasser
+
Ethanol (rein)
+
Isopropanol (rein)
+
Kaliumhydroxid (Kalilauge), 1%ig in Wasser
-
Methanol
-
Natriumhydroxid (Natronlauge), 1%ig in Wasser
-
Phosphorsäure, 1%ig in Wasser
+
Wasserstoffperoxid, 30%ig in Wasser
+
Zitronensäure, 10%ig in Wasser
+
Weiterhin wäre eine Verkleinerung des Durchmessers von Objektträger und Deckglas
sinnvoll, da damit das Volumen der Küvette reduziert wird, was ein schnelleres Einstellen der
90
Ausblick
erwünschten Schichtdicke, sowie ein geringeres Probevolumen zur Folge hätte. Bei einer
Verkleinerung des Objektträgers und des Deckglases und somit der gesamten Geometrie muss
weiterhin die Kompatibilität mit gängigen Labormikroskopen berücksichtigt werden.
Es wäre ebenfalls sinnvoll, die Schlauchtüllen durch Anschlüsse für Kapillaren, sowie die
Schläuche durch dünne Edelstahlkapillaren zu ersetzen. In diesem Zuge müsste auch die
Schlauchpumpe durch z.B. eine Spritzenpumpe ersetzt werden. Die Schläuche sind flexibel
und wirken sich beim Anlegen des Unterdrucks negativ auf die nötige Zeit, bis die
erwünschte Schichtdicke erreicht wird, aus. Zudem wirkt sich die starke Flexibilität auch
negativ auf die Stabilität der Schichtdicke aus und die Strömung in der Probe dauert länger
an. Bei einem Wechsel von Schlauch auf Kapillare sollte auch der Innendurchmesser
reduziert werden, da ein geringeres Probevolumen beim Anlegen des Unterdrucks schneller
zur Ruhe kommt und auch die erwünschte Schichtdicke sich schneller einstellt. Ein geringeres
Probevolumen ermöglicht ebenso Optimierungen und Verkleinerungen bei der
Probenentnahme und der Probenvorbereitung.
Eine Möglichkeit, die Durchflussküvette zu temperieren, sollte in einer überarbeiteten
Version ebenso vorgesehen werden. Hierzu können z.B. Peltierelemente oder
Heizwiderstände zum Einsatz kommen.
Die automatische Probeentnahmeeinheit sollte im nächsten Schritt überarbeitet werden. Das
Totvolumen bei der Entnahme und die nötige Probenmenge sollten reduziert werden. Eine
Möglichkeit, die Probe aufzukonzentrieren und nicht nur zu verdünnen, würde eine stabile
Messung schon bei kleinen Zelldichten ermöglichen. Es sollten dann auch Funktionen zur
Reinigung der Probenvorbereitungseinheit und der Küvette integriert werden. Eine Spülung
der Küvette mit einer Reinigungslösung nach jedem Messvorgang würde die Bildqualität wie
auch die Stabilität der Schichtdicke positiv beeinflussen.
Weiterhin sollte für zukünftige Anwendungen die Probenvorbereitung temperiert erfolgen.
Gerade durch die Reduktion der Probenmenge, was die Anwendung des Systems auch bei
kleineren Fermentationsvolumina möglich macht, ist ein stärkerer Einfluss der
Umgebungstemperatur zu erwarten. Die Temperierung der Probenvorbereitungseinheit
zusammen mit der angedachten Temperierung der Durchflussküvette eliminiert den
Temperatureinfluss auf die gemessenen Geschwindigkeiten der Bakterien.
Die aktuell eingesetzte Kamera DFK 23G445 (The Imaging Source Europe GmbH) ist eine
Industriekamera im Niedrigpreissegment. Durch den Einsatz einer hochwertigen Kamera für
den Mikroskopie-Einsatz wie z.B. die ZEISS Axiocam 503 color (Carl Zeiss Microscopy
GmbH) könnten die Ergebnisse und die Stabilität des Messsystems erheblich verbessert
werden. In Tabelle 13 ist ein Vergleich der Kernspezifikationen der beiden genannten
Kameras aufgeführt.
91
Ausblick
Tabelle 13: Vergleich Kamera DFK 23G445 und ZEISS Axiocam 503 color
Die Kernspezifikationen der momentan eingesetzten Industriekamera DFK 23G445 (The
Imaging Source Europe GmbH) aus dem Niedrigpreissegment im Vergleich mit der ZEISS
Axiocam 503 color (Carl Zeiss Microscopy GmbH).
DFK 23G445
Axiocam 503 color
Belichtungszeit
1 µs – 30 s
250 µs – 60 s
Sensor
1/3 “
2/3 “
Auflösung
1280 x 960 Pixel
1936 x 1460 Pixel
Dynamikbereich
8 bit
14 bit
Bildrate
30 fps
38 fps
Kühlung
keine
Peltierkühler
Eine integrierte Kühlung vermindert das Bildrauschen. Nur dann ist auch eine Erhöhung des
Dynamikbereichs sinnvoll. Bei hohem Rauschen kann ein großer Dynamikbereich nicht
ausgenutzt werden. Je höher der effektive Dynamikbereich ist, desto besser können später die
feinen Kontraste wahrgenommen werden. Je höher die Sensorfläche ist, desto größer ist der
Bildausschnitt, was die Verfolgung einer größeren Anzahl an Bakterien je Bild ermöglicht.
Ebenso können die Bakterien über eine längere Strecke verfolgt werden. Bei einer höheren
Auflösung können Bildfilter besser angewandt werden. Durch eine höhere Bildrate sind die
Bakterien von Bild zu Bild näher aneinander und die Wegverfolgung kann stabiler
funktionieren. Der zukünftige Einsatz einer besseren Kamera ist empfehlenswert.
Ebenso wie die Kamera steckt auch in der Verwendung eines besseren Mikroskops
erhebliches Potential. Das verwendete Labormikroskop CX31 (Olympus) ist für die Lehre
und für Routineanwendungen konzipiert. Mikroskope, die für Forschungsaufgaben konzipiert
wurden, können durch eine bessere und robustere Optik kontrast- und detailreichere
Abbildungen erzeugen. Für weitere Untersuchungen und zur Weiterentwicklung des Systems
ist daher die Verwendung eines besseren Mikroskops empfehlenswert.
Neben der Anwendung zur Untersuchung von B. amyloliquefaciens FZB42 kommen alle
beweglichen Bakterienstämme für die Analyse in Frage. Mit E. coli und B. subtilis sind zwei
für die Industrie und die Forschung hochinteressante Arten potentielle Kandidaten für das
entwickelte Messsystem. Die Möglichkeit der Analyse anderer beweglicher Mikroorganismen
wie z.B. bewegliche Algen (z.B. Chlamydomonas), Archaeen (z.B. Pyrococcus furiosus) oder
Ciliata (z.B. Coleps sp.) ist ebenso denkbar.
92
Zusammenfassung
10 Zusammenfassung
Im Rahmen der Arbeit wurde ein neuartiges, automatisiertes Messsystem zur Bestimmung der
Durchschnittsgeschwindigkeit von sich aktiv bewegenden Mikroorganismen entwickelt. Die
Probenentnahme, -vorbereitung und Messung sowie die Auswertung können vollautomatisch
erfolgen. Als Beispielorganismus wird Bacillus amyloliquefaciens FZB42 in zwei
verschiedenen Medien untersucht. Die Durchschnittsgeschwindigkeit der Bakterien wird in
Intervallen von 15 bis 30 min während mehrerer Beispielfermentationen bestimmt. Das
Messsystem arbeitet mit Hilfe einer eigens entwickelten Mikroskop-Durchflussküvette mit
flexibler Schichtdicke. Dadurch ist es möglich, einen extrem geringen Fluidfilm von etwa
5 µm während der Bildaufnahme zu realisieren, um alle Mikroorganismen im
Tiefenschärfebereich zu halten und eine Seitenansicht der einzelnen Bakterien zu garantieren.
Da bei sehr engen Kanälen, wie hier der Fall, die Scherkräfte bei Durchströmung sehr hoch
sind, muss die Schichtdicke während der Probenentnahme erheblich erweiterbar sein. Die
auftretenden Kräfte bei Durchspülung der Küvette wurden berechnet und über Vergleich
sichergestellt, dass die Geißeln nicht abreißen und das Bakterium dadurch geschädigt wird.
Die mikroskopischen Aufnahmen werden anschließend in den programmierten
Bildverarbeitungsalgorithmen automatisch ausgewertet. Neben der durchschnittlichen
Geschwindigkeit der Bakterien kann auch die Anzahl der beweglichen Bakterien pro
Bildserie bestimmt werden. Ein Monitoring von Durchschnittsgeschwindigkeit und Anzahl
der beweglichen Bakterien pro Bild wird neben den gängigen Parametern pO2, pH-Wert,
Temperatur und optische Dichte an den Beispielfermentationen durchgeführt. Weiterhin ist es
mit dem Messsystem möglich, weitere mikroskopische Untersuchungen durchzuführen. Als
Beispiel hierfür werden die typischen Bewegungsmuster von Bacillus amyloliquefaciens
FZB42 in zwei verschiedenen Medien halbautomatisch ausgewertet.
Erstmals liefert das neue Verfahren damit die Möglichkeit, die über die Geschwindigkeit
korrelierte Aktivitäten von Bakterien zu monitoren und wertvolle Hinweise für einen optimal
zu betreibenden Fermentationsprozess zu liefern.
93
Verzeichnisse
11 Verzeichnisse
11.1 Abkürzungen und Formelzeichen
OD600
pO2
SEM
𝑆𝑆𝑆𝑣𝑣
SD
𝑆𝑆𝑣𝑣
𝑆𝑆𝐹
𝑛𝑣𝑣
𝑛𝑒𝑒
𝑓𝑛
𝑏𝑛
𝑝𝑘𝑘
𝑝𝑒𝑒
𝐴𝐵𝐵
𝐴𝐵
fps
DNA
DAPI
FDA
ex
em
UV
CCD
2D
3D
RGB
HSL
HSV
HSI
rpm
cfu
VE-Wasser
𝑢
𝑢𝑚
̇ )
𝛾̇ (Gamma
𝜏 (Tau)
Optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm
Sauerstoffsättigung in Prozent
Standardfehler des arithmetischen Mittelwerts
erwarteter Standardfehler der mittleren Geschwindigkeiten
Standardabweichung
erwartete Standardabweichung der mittleren Geschwindigkeiten
erwartete Standardabweichung bei Fehlern in der Bildverarbeitung
erwartete Anzahl an Einzelgeschwindigkeiten
erwartete Anzahl fehlerhafter Zuweisungen zwischen nahen Bakterien
Anzahl der Bilder pro Bildserie
Anzahl an Bildserien pro Messpunkt
Wahrscheinlichkeit für das Auftreten kleiner Strecken
Wahrscheinlichkeit fehlerhafter Zuweisungen zwischen nahen Bakterien
Fläche eines Bakteriums
Fläche eines Bildes
frames per second / Bilder pro Sekunde
Desoxyribonukleinsäure
4‘,6-Diamidin-2-phenylindol
Fluorescein-Diacetat
Fluoreszenz-Absorptionswellenlänge
Fluoreszenz-Emissionswellenlänge
Ultraviolett
charge-coupled device / ladungsgekoppeltes Bauteil
zweidimensional
dreidimensional
Rot-Grün-Blau
Hue(Farbwert)–Saturation(Farbsättigung)–Luminance(Farbhelligkeit)
Hue-Saturation-Value(Helligkeit)
Hue-Saturation-Intensity(Lichtintensität)
revolutions per minute / Umdrehungen pro Minute
colony forming unit / koloniebildende Einheit
vollentsalztes Wasser
Strömungsgeschwindigkeit [mm s-1]
querschnittgemittelte Strömungsgeschwindigkeit [mm s-1]
Strömungsgeschwindigkeitsgradient [mm s-1 mm-1]
Schubspannung [Pa]
94
Verzeichnisse
𝐹
η (Eta)
𝑅𝑅
𝜈 (Ny)
𝑤(𝑧)
𝑧𝑅
𝜆 (Lambda)
𝜃0 (Theta0)
𝐴𝑁
𝑛𝑖
R2
𝑈𝐵
𝑣𝑂
𝑡𝐵
v
vØ
tp
nmB
E
EØ
I
IØ
∝
𝐴, 𝐵, …
𝑎𝑖𝑖 , 𝑏𝑖𝑖 , …
(Scher)Kraft [N]
dynamische Viskosität [Pa s]
Reynolds-Zahl
kinematischen Viskosität [mm2 s-1]
Strahlradius [nm]
Schärfentiefe [nm]
Wellenlänge des Lichts [nm]
halber Strahlöffnungswinkel [Grad]
numerische Apertur
Brechungsindex des Immersionsmediums
Bestimmtheitsmaß
Bewegungsunschärfe [µm s-1]
Objektgeschwindigkeit [µm s-1]
Belichtungszeit [ms]
(Bakterien)Geschwindigkeit [µm s-1]
Durchschnittsgeschwindigkeit (der Bakterien) [µm s-1]
Fermentationszeitpunkt [min]
Anzahl beweglicher Bakterien pro Bild
elektrische Feldamplitude [V m-1]
resultierende elektrische Feldamplitude [V m-1]
Intensität
resultierende Intensität
proportional zu
Matrix oder Array
Element der Matrix A bzw. B an der Stelle i,j
11.2 Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Übersicht von kommerziell verfügbaren In-Situ-Mikroskopen ................................ 9
Tabelle 2: Bekannte Schwimmgeschwindigkeiten von Bakterien ........................................... 16
Tabelle 3: Wandlungsmöglichkeiten von einem Farb- zu einem Grauwertbild ...................... 43
Tabelle 4: Eigenschaften des Standard-Nährmediums-I-¼ und ABiTEP-Mediums-¼ ........... 51
Tabelle 5: Strömungsverhältnisse im Messsystem................................................................... 52
Tabelle 6: Strömungsverhältnisse in den Messkapillaren bei Standard-Nährmedium-I-¼ ..... 54
Tabelle 7: Statistische Auswertung des Anteils der beweglichen Bakterien von Bacillus
amyloliquefaciens FZB42 nach Durchströmung der Messkapilaren .............................. 54
Tabelle 8: Charakteristische Fermentationszeitpunkte von Bacillus amyloliquefaciens FZB42
in ABiTEP-Medium-¼ ................................................................................................... 62
Tabelle 9: Vergleich der Geschwindigkeitsverteilungen für Bacillus amyloliquefaciens FZB42
in ABiTEP-Medium-¼ ................................................................................................... 64
Tabelle 10: Charakteristische Fermentationszeitpunkte von Bacillus amyloliquefaciens FZB42
in Standard-Nährmedium-I-¼ ......................................................................................... 68
95
Verzeichnisse
Tabelle 11: Vergleich der Geschwindigkeitsverteilungen von Bacillus amyloliquefaciens
FZB42 in Standard-Nährmedium-I-¼ ............................................................................ 71
Tabelle 12: Beständigkeit von Makrolon gegen einige Chemikalien ...................................... 90
Tabelle 13: Vergleich Kamera DFK 23G445 und ZEISS Axiocam 503 color ........................ 92
11.3 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Physiologische Stadien einer Bakterienzelle ....................................................... 1
Abbildung 2: 3-Fold Dynamical Optical Reflectance Measurement (3D-ORM) ...................... 4
Abbildung 3: In-Situ-Auflichtfluoreszenzmikroskop mit theoretischem Probevolumen .......... 7
Abbildung 4: In-Situ-Mikroskop mit mechanisch definiertem Probevolumen .......................... 8
Abbildung 5: Immersions-Optik für die horizontale Online-Mikroskopie .............................. 10
Abbildung 6: Schema eines Systems zur Online-Mikroskopie mit Durchflussküvette ........... 11
Abbildung 7: Wechsel zwischen Bewegungsphasen von peritrich begeißelten Bakterien ...... 15
Abbildung 8: Beispiel für Run-and-Revers-Strategy ............................................................... 19
Abbildung 9: Kommunikation der Kernmodule eines 2D-Tracking Systems ......................... 21
Abbildung 10: Vereinfachtes Fließbild des Bioreaktors .......................................................... 26
Abbildung 11: Software Bedienoberfläche des Bioreaktors .................................................... 27
Abbildung 12: Vereinfachtes Verfahrensfließbild der Versuchsdurchführungen .................... 29
Abbildung 13: Konstruktionszeichnung der Durchflussküvette mit flexibler Schichtdicke.... 30
Abbildung 14: Schema der Durchflussküvette mit flexibler Schichtdicke .............................. 31
Abbildung 15: Strömungsraum in der Küvette (vereinfachte Darstellung) ............................. 32
Abbildung 16: Geometrie der berechneten schlanken Kanäle ................................................. 33
Abbildung 17: Vereinfachtes Verfahrensfließbild der Bildaufnahme mit Peripherie.............. 35
Abbildung 18: Vereinfachtes Fließbild der Probenvorbereitung ............................................. 36
Abbildung 19: Gauß-Strahl, der sich in z-Richtung ausbreitet ................................................ 38
Abbildung 20: Verteilung der elektrischen Feldamplitude zweier Lichtpunkte ...................... 40
Abbildung 21: Schematischer Programmablauf der Bildauswertung ...................................... 42
Abbildung 22: Vereinfachter Programmablaufplan für die Zuordnung der Kenndaten .......... 46
Abbildung 23: Ablauf der Ergebnisbereitstellung ................................................................... 48
Abbildung 24: Aufnahme aus dem Programm zur Erfassung der Bewegungsmuster ............. 49
Abbildung 25: Fließverhalten von Standard-Nährmedium-I-¼ und ABiTEP-Medium-¼ ...... 51
Abbildung 26: Geschwindigkeiten und Schubspannungen von Standard-Nährmedium-I-¼ und
ABiTEP-Medium-¼ in der Durchflussküvette ............................................................... 53
Abbildung 27: Pixel-Auflösung in Bezug auf die Intensitätsverteilung .................................. 55
Abbildung 28: Standardfehler in Abhängigkeit der Anzahl an Bakterien pro Bild ................. 56
Abbildung 29: Vergleich der Grauwertwandlungen bei einer Mikroskopaufnahme von
Bacillus amyloliquefaciens FZB42 ................................................................................. 57
Abbildung 30: Entwickelte Durchflussküvette ........................................................................ 58
Abbildung 31: Gesamtsystem für die Beispielfermentationen ................................................ 58
Abbildung 32: Validierung der automatischen Bildauswertung bei Bacillus amyloliquefaciens
FZB42 in ABiTEP-Medium-¼ ....................................................................................... 59
96
Verzeichnisse
Abbildung 33: Kultivierung von Bacillus amyloliquefaciens FZB42 in ABiTEP-Medium-¼
bei 35 °C ......................................................................................................................... 61
Abbildung 34: Charakteristische Fermentationszeitpunkte von Bacillus amyloliquefaciens
FZB42 in ABiTEP-Medium-¼ ....................................................................................... 63
Abbildung 35: OD600 in Abhängigkeit der Anzahl der beweglichen Bakterien (Bacillus
amyloliquefaciens FZB42) pro Bild in ABiTEP-Medium-¼ ......................................... 64
Abbildung 36: Histogramme der Einzelgeschwindigkeiten von Bacillus amyloliquefaciens
FZB42 aus Fermentation 1 mit ABiTEP-Medium-¼ ..................................................... 65
Abbildung 37: Kultivierung von Bacillus amyloliquefaciens FZB42 in StandardNährmedium-I-¼ ............................................................................................................ 67
Abbildung 38: Charakteristische Fermentationszeitpunkte von Bacillus amyloliquefaciens
FZB42 mit Standard-Nährmedium-I-¼ .......................................................................... 69
Abbildung 39: OD600 in Abhängigkeit der Anzahl der beweglichen Bakterien (Bacillus
amyloliquefaciens FZB42) in Standard-Nährmedium-I-¼ ............................................. 70
Abbildung 40: Histogramme der Einzelgeschwindigkeiten von Bacillus amyloliquefaciens
FZB42 aus Fermentation 6 mit Standard-Nährmedium-I-¼ .......................................... 72
Abbildung 41: Vergleich der Geschwindigkeiten von Bacillus amyloliquefaciens FZB42 im
ABiTEP-Medium-¼ und Standard-Nährmedium-I-¼ .................................................... 73
Abbildung 42: Typische Bewegungsmuster von Bacillus amyloliquefaciens FZB42 ............. 74
Abbildung 43: Summarische Verteilung der Bewegungsmuster von Bacillus
amyloliquefaciens FZB42 über den gesamten Probezeitraum ........................................ 75
Abbildung 44: Zeitliche Verteilung der Bewegungsmuster von Bacillus amyloliquefaciens
FZB42 in Fermentation 6 (Standard-Nährmedium-I-¼) ................................................ 76
Abbildung 45: Zeitliche Verteilung der Bewegungsmuster von Bacillus amyloliquefaciens
FZB42 in Fermentation 7 (ABiTEP-Medium-¼) ........................................................... 77
Abbildung 46: Diauxischer Kultivierungsverlauf von Bacillus cereus ................................... 79
Abbildung 47: Zeitlicher Kultivierungsverlauf von Bacillus amyloliquefaciens FZB42 auf
ABiTEP-Medium-¼ ....................................................................................................... 80
Abbildung 48: Zeitlicher Kultivierungsverlauf von Bacillus amyloliquefaciens FZB42 auf
Standard-Nährmedium-I-¼ ............................................................................................. 81
11.4 Literaturverzeichnis
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107
Anhang
Anhang
LabVIEW-Unterprogramm „Wegverfolgung“
108
Anhang
109
Anhang
Statistische Analyse von Fermentation 1
110
Anhang
Statistische Analyse von Fermentation 2
111
Anhang
Statistische Analyse von Fermentation 3
112
Anhang
Statistische Analyse von Fermentation 4
113
Anhang
Statistische Analyse von Fermentation 5
114
Anhang
Statistische Analyse von Fermentation 6
115
Anhang
Fermentation 6 – Verteilung der Bewegungsmuster
Minut
e
120
135
150
165
195
210
225
240
260
275
290
305
320
Orientatio Undulatio Straigh Tumbl Orientatio Curv Collisio Anothe
n
n
t path
e
n and Stop e
n
r
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1
0
0
0
1
1
6
1
0
0
0
0
1
0
1
1
1
0
0
0
1
1
15
1
2
1
1
3
2
2
18
2
1
2
1
0
7
0
16
2
0
3
7
2
2
0
8
1
0
0
1
0
2
1
17
6
2
0
4
2
3
0
5
0
0
0
1
0
1
0
4
0
0
1
1
1
1
0
3
0
0
2
0
0
1
0
10
0
0
0
0
0
Fermentation 7 – Verteilung der Bewegungsmuster
Minut
e
210
225
240
255
270
285
305
325
345
380
405
425
445
Orientatio
n
0
0
0
0
2
0
0
2
2
4
0
0
0
Undulatio
n
0
0
0
0
0
0
1
1
0
1
0
0
0
Straigh
t path
0
2
4
3
7
8
7
9
11
8
2
2
0
Tumbl
e
1
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3
1
1
6
8
7
6
2
0
0
0
Orientatio
n and Stop
0
0
1
1
0
2
1
0
0
1
0
0
0
Curv
e
0
0
0
0
1
0
1
3
4
0
0
0
0
Collisio
n
1
1
0
2
3
7
3
1
4
7
1
1
1
Anothe
r
0
0
0
0
0
1
0
0
6
2
2
0
0
116
Anhang
Vergleich der Wandlung in Grauwerte
117
Anhang
118
Anhang
119