Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie

Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
Übersicht
Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie
Sprecherin: Prof. Dr. med. Margot Zöller (kommissarisch)
Zelluläre und Molekulare Pathologie (D0100)
Prof. Dr. med. Hermann-Josef Gröne
06221 42-3243, FAX 06221 42-3262
e-mail: [email protected]
Pharmakologie und Tumortherapie (D0200)
Prof. Dr. med. Jens W. Zeller
06221 42-3312, FAX 06221 42-3346
e-mail: [email protected]
Experimentelle Therapie (D0300)
N.N.
06221 42-3350
Rekombinante Antikörper (D0500)
Prof. Dr. Melvyn Little
06221 42-3450, FAX 06221 42-3462
e-mail: [email protected]
Tumorprogression und Tumorabwehr (D0600)
Prof. Dr. med. Margot Zöller
06221 42-2454, FAX 06221 42-4760
e-mail: [email protected]
Klinische Kooperationseinheit Molekulare Hämatologie / Onkologie (D0700)
Prof. Dr. med. Radek Skoda (02/00-12/01)
06221 42-3351, FAX 06221 42-3352
Klinische Kooperationseinheit Pädiatrische Onkologie
(D0800)
Prof. Dr. med. Klaus-Michael Debatin
06221 42-3363, FAX 06221 42-3362
0731 502-7700, FAX 0731 502-6681 (Ulm)
e-mail: [email protected]
Klinische Kooperationseinheit Dermato-Onkologie
(D0900)
Prof. Dr. med. Dirk Schadendorf
0621 383-2127, FAX 0621 383-2163
e-mail: [email protected]
Der Forschungsschwerpunkt stellt sich die Aufgabe, in der
Zusammenführung von grundlagen- und klinisch orientierten Arbeitsgruppen Voraussetzungen für die Entwicklung
neuer therapeutischer und diagnostischer Verfahren zu
schaffen. Dies soll über eine intensive Kooperation zwischen den grundlagenorientierten Abteilungen des Forschungsschwerpunktes und den klinischen Kooperationseinheiten erzielt werden. Da ein einzelner Forschungsschwerpunkt nicht das gesamte Spektrum der Tumordiagnostik und experimentellen Therapie abdecken kann, ist
darüber hinaus in Absprache zwischen den Grundlagenorientierten und den klinischen Kooperationseinheiten
eine Zentrierung auf bestimmte Fragestellungen erforderlich, wobei z. Zt. die Erarbeitung immuntherapeutischer
Konzepte als eine der zentralen Fragestellungen aufgegriffen wurde. Aufgrund der Fluktuation im Bereich der klinischen Kooperationseinheiten ist darüber hinaus in diesem Schwerpunkt ein hohes Maß an Flexibilität erforderlich. Es sei abschließend vermerkt, dass eine der zentralen Einheiten des FS leider im Berichtszeitraum nicht
wiederbesetzt werden konnte.
Die Arbeiten der Abteilung Zelluläre und Molekulare
Pathologie (D0100) befassen sich mit Mechanismen der
Abstoßung von Tumorgewebe und allogen-transplantierter
Organe. Eine Arbeitsgruppe der Abteilung beschäftigt sich
mit der detaillierten histomorphologischen Analyse von
transgenen Tieren mit modernen morphologischen Verfahren. Eine weitere Arbeitsgruppe der Abteilung betreibt eine
spezielle Diagnostik an humanen Gewebsproben. In die
Abteilung integriert ist die zentrale Tumorbank des DKFZ.
Im Zentrum der Aktivitäten der Arbeitsgruppe Pharmakologie und Tumortherapie (D0200) stehen Untersuchungen zum retroviralen Transfer des Multidrug-Resistenzgens in hämatopoetische Stammzellen. Daneben werden
Verfahren zur Verbesserung des Adenovirus-assoziierten
Transfers in hämatopoetische Stammzellen untersucht.
Die Arbeitsgruppe Rekombinante Antikörper (D0500)
befasst sich zum einen mit Fragen der Methodik zur Verbesserung der Herstellung rekombinanter Antikörper.
Daneben wird die Möglichkeit eines therapeutischen Einsatzes z. B. über zytolytische Konjugate erprobt.
Im Focus der Forschung der Abteilung Tumorprogression
und Tumorabwehr (D0600) steht die Suche nach Molekülen, die für die Tumorprogression verantwortlich sind, sowie die Klärung der dem Phänomen der Metastasierung
zugrunde liegenden Mechanismen. Eine therapeutische
Nutzung der erzielten Ergebnisse wird vornehmlich über
die Etablierung neuer Vakzinierungsverfahren angestrebt.
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
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Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
Übersicht
Die klinische Kooperationseinheit Molekulare Hämatologie / Onkologie (D0700) hat sich zum einen auf immuntherapeutische Ansätze im Kontext allogener Stammzelltransplantation konzentriert. Im Zentrum der Arbeiten stehen vor allem Genomanalysen bei malignen hämatologischen Erkrankungen sowie Untersuchungen zur Stammzellbiologie. Der Leiter Prof. Skoda hat einen Ruf nach Basel angenommen.
Die klinische Kooperationseinheit Pädiatrische Onkologie (D0800) wurde im Berichtszeitraum nach Berufung
des Abteilungsleiters an die Universitätskinderklinik Ulm
von diesem weiterhin kommissarisch geleitet. Die Abteilung befasst sich mit der Regulation des physiologischen
Zelltodes (Apoptose) bei hämatologischen Erkrankungen
und dem Transfer der erzielten Ergebnisse in die
Leukämietherapie bei Kindern.
Die klinische Kooperationseinheit Dermato-Onkologie
(D0900) untersucht schwerpunktmäßig Fragen der
Chemoresistenz und erarbeitet neue Vakzinierungsstrategien beim malignen Melanom. Daneben werden
Möglichkeiten eines in vivo Gentransfers untersucht.
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Die Abteilung Experimentelle Therapie (D0300) ist vakant und im Berichtszeitraum leider nicht wiederbesetzt
worden. Die am DKFZ verbliebene Arbeitsgruppe Toxikologie und Chemotherapie befasst sich vornehmlich mit den
Wirkmechanismen von Zytostatika.
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
Abteilung D0100
Zelluläre und Molekulare Pathologie
Abteilung Zelluläre und Molekulare Pathologie (D0100)
Leiter: Prof. Dr. med. Hermann-Josef Gröne
Wissenschaftliche Mitarbeiter:
Richard Jennemann
Dr. sc. hum. Yanhua Li
Dr. rer. nat. Roger Sandhoff Dr. rer. nat. Qiang Sun
Dr. med. David Trick
Doktoranden:
Zhen Li
Shijun Wang
Ärzte im Praktikum:
Jeannette Bachmann
Thomas Büch
Gastwissenschaftler:
Prof. Dr. rer. nat. Herbert. Wiegandt, Universität Marburg,
(01/00 - )
Technisches Personal:
Mahnaz Bonrouhi
Sylvia Kaden
Ursula Naab
Claudia Schmidt
Martina Volz
Sekretariat:
Anita Meeske-Ferrai
Rebekka Hauck
Iris Moll
Ulrike Rothermel
Benita von Tümpling-Radosta
Christine Zesch
Tumorbank (D0101)
Dr. med. dent. Elisabeth F. Gröne
Technisches Personal:
Mariana Enulescu
Sebastian Ronellenfitsch
Histopathologische Spezialdiagnostik
Prof. Dr. med. H.-J. Gröne
Technisches Personal:
Elisabeth Röbel
Gabriele Schmidt
Die Abteilung fungiert als Bindeglied zwischen Grundlagen-orientierter Forschung im DKFZ und der klinischen
Diagnostik und Therapie.
Die Abteilung versucht dieser Aufgabe Rechnung zu tragen, indem sie
1. kliniknahe wissenschaftliche Fragestellungen bearbeitet,
2. in der histopathologischen Analyse von Tierexperimenten, insbesondere transgenen Tieren mit Arbeitsgruppen
des DKFZ kooperiert,
3. selbst eine spezielle humane histopathologische Diagnostik durchführt und
4. humanes Material Abteilungen des DKFZ zur genomischen und proteomischen Aufarbeitung zur Verfügung
stellt (Tumorbank).
Der wissenschaftliche Schwerpunkt der Abteilung ist die
Aufklärung der Mechanismen der Abstoßung von Tumorgewebe und allogentransplantierten Organen. Hierbei wird
die Rejektion allogen-transplantierter Organe als Modellsystem für die Rejektion eines malignen Tumors angesehen. Im Mittelpunkt dieser Untersuchungen steht die
Analyse der Interaktion von Monozyten/ Makrophagen mit
Endothelzellen und Tumorzellen.
Rolle immunkompetenter Zellen insbesondere von Monozyten/Makrophagen bei der
Rejektion von Gewebe
Ein Ziel unserer Arbeiten ist die Aufklärung von zellulären
und molekularen Mechanismen, die zur Abstoßung von
Geweben führen. Experimentelle allogene Transplantationen solider Organe werden hierbei als relevante Modellsysteme angesehen, da der Beginn einer Rejektion,die
Qualität und die Schwere des Abstoßungsvorgangs bei experimentellen allogenen Transplantationen genau definiert
werden können. Im Vordergrund unseres Interesses steht
hierbei die Interaktion von Monozyten mit Endothelzellen
und Tumorzellen. Monozyten sind immunkompetente Zellen, die zur Synthese zahlreicher Substanzen befähigt
sind, die die Abstoßung eines Gewebes bewirken. Monozyten werden deshalb von uns als die wesentlichen Effektorzellen einer Rejektion angesehen. Endothelzellen sind
in soliden transplantierten Organen die primär vom Rejektionsprozess betroffenen Zielzellen. Sie sind als erste Zellen des abgestoßenen Organs einer humoralen und zellulären Abstoßungsantwort ausgesetzt. Wir erhoffen uns von
der Analyse der Interaktion von Monozyten und Endothel
in allogen-transplantierten Organen Erkenntnisse, die zu
diagnostischen und therapeutischen Anwendungen führen
könnten.
Chemokine als wesentliche Modulatoren der
Frühphase einer allogenen Rejektion
H.-J. Gröne, Z. Li, Q. Sun, S. Wang
In Kooperation mit: Peter Nelson Ph.D., Medizinische Poliklinik,
Arbeitsgruppe Klinische Biochemie der LMU München und Amanda Proudfoot, Ph.D, Serono Genf, Schweiz
Die Transplantation allogener solider Organe in der Ratte
ist ein geeignetes System um die Mechanismen, die für
die Generation und die Aufrechterhaltung einer Rejektion
oder Toleranz gegenüber einem immunologischen Prozess notwendig sind, zu erarbeiten. Die bekannten Unterschiede der MHC-Loci von Spender und Empfänger ermöglichen es, die Schwere der Allograft-Rejektion festzulegen; der Beginn und der Verlauf der Transplantat-Rejektion wie auch ihre morphologischen Phänomene sind gut
definiert. Eine Toleranzinduktion bei allogener Organtransplantation oder eine Rejektionsinduktion bei malignem Tumorwachstum wären von großem klinischen Nutzen. Tierexperimente und klinische Daten weisen darauf hin, daß
eine kurzfristige, frühe Inhibition der vaskulären Alloreaktivität wesentlich zur langfristigen Allograftakzeptanz beitragen könnte. Durch die Inhibition der Arretierung von T-Zellen und Monozyten an das Endothel mit Hilfe der Blockade
von Chemokinrezeptoren im Transplantat konnten Chemokine von unserer Arbeitsgruppe als wichtige pathogenetische Faktoren bei der Transplantatrejektion erkannt werden. Chemokine sind chemotaktische Peptide mit einem
Molekulargewicht zwischen 6 und 15 k/Da, die wie ihre zugehörigen Rezeptoren von zahlreichen Zellen, unter anderem von Endothelzellen, Leukozyten und Fibroblasten syn-
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
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Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
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thetisiert werden. Das ß-Chemokin-RANTES ist ein potentes Chemokin für die Chemotaxie von Monozyten, dendritischen Zellen und T-Zellen. Aufgrund des Nachweises
einer Expression des ß-Chemokin-RANTES in tubulären
Epithelien abstoßender Nierentransplantate und atherosklerotischen Plaques von Coronararterien transplantierter
Herzen wurde begonnen, die Rolle des Chemokin:
RANTES bei der akuten Abstoßung allogener Transplantate funktionell zu untersuchen. Die intravenöse Gabe des
antagonistischen Chemokin-Analogs Met-RANTES bewirkte eine Reduktion der akuten Entzündung und eine
Abnahme der Abstoßung im allogenen Nierentransplantat.
Durch Met-RANTES konnte in allogen transplantiertem
Dünndarm die Mikrozirkulation weitgehend normalisiert
werden. Ein nicht peptiderger Antagonist für einen Rezeptor von RANTES: CCR1 bewirkte mit niedrig dosiertem
Cyclosporin eine erhebliche Verlängerung der Überlebenszeit eines allogenen Herztransplantates in der Ratte. In
vitro Untersuchungen zum möglichen Mechanismus dieser
CCR1-Antagonismus-Wirkung ergaben, daß unter physiologischen Flußbedingungen die Arretierung von Monozyten an aktiviertes mikrovaskuläres Endothel durch eine
Blockade RANTES-zugehöriger Chemokinrezeptoren
unterdrückt wurde. Diese Untersuchungen demonstrierten
die funktionelle Bedeutung von Chemokinen für die Rejektion eines allogenen transplantierten Organs. Neue Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe haben sich mit der Expression und Wirkung von Chemokinen in nicht hämatopoetischen Zellen beschäftigt. Da die Expression von Proteinen in embryonalem Gewebe, in entzündeten und tumorösem Gewebe wieder auftreten kann, wurde die Expression von Chemokinen bei der Entwicklung der
menschlichen Niere analysiert. Chemokine, die proliferative und angiogenetische Effekte besitzen und ihre Rezeptoren wurden zellspezifisch bei der Ontogenese der Niere
nachgewiesen. Für das Chemokin SLC und den zugehörigen Rezeptor CCR7 konnte eine antiapoptotische Wirkung dokumentiert werden.
Die Transkription mehrerer Chemokine kann durch den
Transkriptionsfaktor NFkB gesteigert werden. NFkB reguliert zusätzlich die Expression von Adhäsionsmolekülen.
Durch die Perfusion einer Niere vor allogener Transplantation mit einem NFkB-Decoy Oligodeoxynucleotid in kationischen Liposomen, die bevorzugt von hypoxischem peritubulärem Endothel aufgenommen wurden, wurde die frühe postischämische Endothelialitis eines Transplantates
signifikant gemindert. Es wurde insbesondere die Adhäsion von Monozyten an das mikrovaskuläre Endothel und
die monozytäre Infiltration in der Niere gehemmt, sowie
die interstitielle Rejektion reduziert. Diese Experimente unterstützen insgesamt die Annahme, daß Chemokine die Interaktion von Endothel und immunkompetenten Zellen in
einer Alloreaktivitätsreaktion wesentlich beeinflussen. Weitere Analysen zur Rolle von Chemokinen in der Frühphase
der Abstoßung eines allogenen Transplantates sind geplant
1. in Chemokinrezeptor knock-out Mäusen und
2. in Experimenten, die weitere, teils von Viren spezifisch
synthetisierte, teils synthetisch gewonnene Chemokinrezeptoranaloga einsetzen.
Abteilung D0100
Zelluläre und Molekulare Pathologie
Analyse der Rolle von Sauerstoff-reaktiven
Spezies und endothelialen Wachstumsfaktoren bei der Gewebsrejektion
K. Sun, Y. Li, H.-J. Gröne
In Kooperation mit: Dr. med. Tomislav Stojanovic, Chirurgische
Klinik der Universität Göttingen, Prof. Dr. rer. nat. Ernst Malle, Klinische Biochemie der Universität Graz, Österreich, Dr. med. Ton
J. Rabelink, Innere Medizin Universität Utrecht, Niederlande
In der Interaktion von Endothel und Monozyten und T-Zellen bei der akuten vaskulären Rejektion kommt dem Aktivierungszustand der Endothelzellen eine wesentliche Rolle zu.
Ein wichtiger Modulator der endothelialen Funktion ist das
Radikal NO. Das durch die endotheliale NO-Synthase konstitutiv synthetisierte NO besitzt mehrere Endothel-zytoprotektive Eigenschaften (Hemmung der Thrombozytenadhäsion/aggregation, Verminderung der Endothelpermeabilität, Hemmung der Proliferation glatter Muskelzellen und
Vasodilatation). In einem allogenen Rattennieren-Transplantationsmodell konnten wir belegen, daß die Inhibition
der konstitutiven endothelialen NO-Synthese zu einer
deutlichen Verschlechterung der Transplantatfunktion und
zu einer ausgeprägten vaskulären Abstoßung des Organs
führt. Es gelang somit einen nicht-immunologischen Einfluß auf die Alloreaktivität des Nierentransplantates zu
nehmen. Dieser tierexperimentelle Befund könnte durchaus klinische Bedeutung besitzen, da Inhibitoren der NOSynthase (L-ADMA, L-NMMA) beim akuten Nierenversagen, das direkt nach Transplantation bei einem nicht geringen Prozentsatz allogen Transplantierter vorliegt, akkumulieren können und über eine Inhibition der endothelialen NO-Synthase frühe Rejektionsphänomene verstärken
könnten. In Erweiterung dieser Untersuchungen konnten
wir durch die selektive Hemmung der induzierbaren NOSynthase, die bei Rejektion überwiegend von immunkompetenten Zellen (z.B. Monozyten/Makrophagen) exprimiert
wird und wegen hoher generierter NO-und O2-Mengen
zytotoxische Effekte auslöst, eine Reduktion interstitieller
Rejektionsphänomene erreichen. Supplementierung von
L-Arginin und Tetrahydrobiopterin als Vorstufen und Cofaktoren der NO-Synthese reduzierten die Superoxidanion
Generation und erhöhten die NO-Synthese durch die
endotheliale NO-Synthase. Es wurde eine wesentliche
funktionelle und strukturelle Verbesserung im allogenen
Nierentransplantat erreicht. NO spielt somit eine konzentrations- und zeitabhängige, bimodale Rolle bei der Rejektion von Geweben. Wir haben durch weitere Untersuchungen die Relevanz der O2- Synthese im allogenen Nierentransplantat analysiert. Durch eine Inhibition der O2--produzierenden Xanthinoxidoreduktase und eine Überexpression dieses Enzyms konnten wir bereits die Bedeutung
dieses oxidativen Enzyms bei der akuten Rejektion von
allogenen Geweben belegen.
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
Rolle von Glycosphingolipiden (GSL) in
Tumoren und bei immunlogischen
Prozessen
R. Sandhoff, R. Jennemann, B. von TümplingRadosta, H. Wiegandt, H.-J. Gröne
Unter den Glykokonjungaten, Glykoproteine und Glykolipide, die auf der Oberfläche eukaryotischer Zellen exprimiert
werden, sind Glykolipide strukturell gut charakterisiert.
Glykosphingolipide (GSL) lokalisieren mit Cholesterin in
„Rafts“, Membrandomänen, die zur Signalübertragung
wichtig sind. GSL stellen essentielle Bindungspartner für
virale und bakterielle Strukturen dar. Wir haben zeigen
können, dass GSL ihr Expressionsprofil in Tumoren (Nierenzellkarzinom) ändern und zur Charakterisierung von
Tumoren dienen können. In Experimenten an für spezifische GSL mutierten Mäusen wurde der Degradationsmechanismus für komplexe sulfatierte GSL (Sulfatide) aufgeklärt. Da wir belegten, dass Sulfatide bei der Differenzierung von Monozyten differentiell exprimiert werden, werden weitere Untersuchungen zur Funktion von GSL in immunkompetenten Zellen an knockout Mäusen durchgeführt.
Histopathologische Analyse transgener Tiere
I. Berger,F.Amelung., H.-J. Gröne
Die Abteilung hat eine Arbeitsgruppe, die sich speziell mit
der konsultativen histopathologischen Diagnostik transgener Tiere beschäftigt. Die umfassende morphologische
Analyse transgener und knock-out Tiere ist für die Interpretation der Bedeutung eines überexprimierten oder
nicht-exprimierten Gens entscheidend. In der morphologischen Analyse werden neben einer konventionell-morphologischen Aufarbeitung moderne Verfahren der Pathomorphologie eingesetzt: Immunhistologie, In situ Hybridisierung, ultrastrukturelle Untersuchung am Transmissionselektronenmikroskop.
Histopathologische Spezialdiagnostik
H.-J. Gröne
Es wurde eine Arbeitsgruppe für histopathologische
Spezialdiagnostik eingerichtet, die in ausgewählten Gebieten der Pathologie eine wissenschaftlich orientierte Diagnostik durchführt. Es wird so erreicht, dass (1) die in der
Abteilung tätigen Pathologen die für die Beratung anderer
Abteilungen des DKFZ und für ihre eigene wissenschaftliche Arbeit notwendige humanpathologische Expertise behalten, (2) humanes Material verschiedenen Abteilungen
des DKFZ zur Verfügung gestellt werden kann (3) die Abteilung selbst, das humane Material in korrelativen Untersuchungen zu experimentellen Befunden einsetzen kann
und (4) das Deutsche Krebsforschungszentrum seit Gründung der Abteilung, eine von der Deutschen Ärztekammer
anerkannte Ausbildungsstätte für Pathologie ist. Im Bestreben, objektivierbare supplementäre Techniken in die humane histopathologische Diagnostik einzuführen, haben
wir am Beispiel des Prostatakarzinoms, des häufigsten
malignen Tumors des Mannes, Gen-Expressionsanalysen
Abteilung D0100
Zelluläre und Molekulare Pathologie
mit cDNA Chips durchgeführt. Es wurde eine hohe spezifische Detektionsrate von malignen Prostatatumoren mit
dieser Methode gefunden. Unsere zukünftigen Bemühungen werden auf die Etablierung von Genexpressionsanalysen an präcancerösen Läsionen im Biopsiematerial gerichtet sein.
Tumorbank
E. Gröne, M. Enulescu, S. Ronellenfitsch
In Kooperation mit: Klinikum Aschaffenburg, Klinik für Gynäkologie und Geburtshilfe (Prof. Dr. Teichmann), Klinikum Göppingen,
Institut für Pathologie (Frau Prof. Dr. Sorger), Universitätskliniken
Heidelberg: Urologische Klinik Prof. Dr. Stähler
Die Tumorbank der Abteilung ist eine Serviceeinrichtung
für das DKFZ um primäre immortalisierte Zellkulturen und
seit Anfang 1999 nicht fixiertes, gefrorenes, nicht tumoröses und tumoröses humanes Material zur Verfügung zu
stellen. Die Arbeitsgruppe bemüht sich, durch engen Kontakt mit den koopierierenden Kliniken Gewebe fachgerecht
diagnostiziert zu sammeln und zu katalogisieren, um der
Abteilung selbst und anderen Abteilungen des DKFZ
genomische und proteomische Untersuchungen an diesem Material zu ermöglichen.
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DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
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Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
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Abteilung D0100
Zelluläre und Molekulare Pathologie
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Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
Abteilung D0100
Zelluläre und Molekulare Pathologie
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DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
169
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
D0200
Pharmakologie der Krebsbehandlung
Arbeitseinheit Pharmakologie der Krebsbehandlung (D0200)
Leiter: Prof. Dr. med. W. Jens Zeller
Wissenschaftler
Dr. Rüdiger Port
Dr. Renate Port
Dr. Stephanie Laufs
Ioulian Topaly *
Chemoprotektion von humanen
mobilisierten peripheren Blutvorläuferzellen
nach retroviralem Transfer des humanen
Multidrug-Resistenzgens (MDR1) und
Transplantation in NOD/SCID-Mäuse
Studenten/Doktoranden
cand.med. Simone Berlinghoff
cand.med. Thomas Büch
cand.med. Eike Buß
cand.med. Bernhard Gentner
cand.med. Moritz Schad
Zsuzsanna Nagy (med.biol.)
Marlon Romano Veldwijk (med.biol.)
Technische Assistenten
Bernhard Berkus
Hans-Jürgen Engel
Sigrid Heil (1/2)
Sekretärin
Brigitte Pétillon (1/3, 01/02 -)
170
* Finanzierung extern
Die Arbeitseinheit „Pharmakologie der Krebsbehandlung“
besteht aus den Arbeitsgruppen von W. Jens Zeller und
Rüdiger Port.
Die Forschungsarbeit von W.J. Zeller konzentriert sich vor
allem auf sensibilisierende und protektive Ansätze in der
Krebschemotherapie. R. Port’s Forschungsarbeit befaßt
sich mit pharmakokinetischen und pharmakodynamischen
Modellen.
Die Gruppe von W.J. Zeller kooperiert mit PD Dr. S.
Fruehauf und Prof. Dr. A.D. Ho, Abt. Innere Medizin V der
Universität Heidelberg; Ziel dieser Kooperation ist die Optimierung der Hochdosis-Chemotherapie mit Blutstammzellsupport unter Einsatz präklinischer Modelle (Stammzellexpansion, Zytostatikaresistenz-Gentransfer), die experimentelle Therapie der chronischen myeloischen Leukämie sowie die Entwicklung neuer Strategien für die Behandlung von Sarkomen.
S. Laufs, B. Gentner, K.Z. Nagy, B. Schiedlmeier*,
A.J. Schilz**, K. Kühlcke**, C. Baum***,
H.G. Eckert**, S. Fruehauf****, W.J. Zeller
*Heinrich-Pette-Institut, Hamburg; **EUFETS GmbH, Idar-Oberstein; ***Medizinische Hochschule, Hannover; ****Medizinische
Klinik und Poliklinik V, Universität Heidelberg
Humane periphere Blutvorläuferzellen wurden mit dem
neuen retroviralen SF91m3-Vektor, der das humane
MDR1-Gen enthält, transduziert und anschließend in
NOD/SCID-Mäuse transplantiert. Mit diesem Versuchsansatz konnten wir zeigen, daß der retrovirale Transfer des
MDR1-Gens in humane mobilisierte periphere Blutvorläuferzellen diesen Zellen einen Schutz gegenüber MDR1abhängiger Chemotherapie in vivo vermittelt. Weiterhin
konnte eine Expansion der MDR1-transduzierten, im NOD/
SCID-Modell angegangenen Zellen mit hoher P-Glykoprotein-Expression nach Chemotherapie gezeigt werden.
Der durchschnittliche Anteil humaner Leukozyten im chimären NOD/SCID-Mausknochenmark lag zwischen 56%78%. Das Angehen der humanen Zellen in Mäusen, die
mit MDR1-transduzierten Zellen transplantiert wurden, war
genauso hoch wie bei den Mäusen, die mit Mock-transduzierten Zellen transplantiert wurden. Dies zeigt, daß mit
dem verwendeten Transduktionsprotokoll und dem verbesserten SF91m3-Vektor während des 6-7 wöchigen Beobachtungszeitraums die Hämatopoese regelrecht verläuft.
Mit Hilfe von MDR1-provirusspezifischer quantitativer PCR
konnte eine durchschnittliche Gentransferrate der im NOD/
SCID-Mausmodell repopulierenden humanen Zellen von
9.4%-12.3% festgestellt werden.
Ein Anteil von 59% (33%-92%) SF91m3-transduzierter
repopulierender Zellen zeigte einen Rh-123 dull Phänotyp.
Diese Daten legen nahe, daß eine Vektorintegration pro
MDR1-transduzierter Zelle mit dem hier verwendeten
Trasnduktionsprotokoll stattgefunden hat, was das Risiko
der Insertionsmutagenese soweit als möglich minimiert.
Das gute „Angehen“ der Zellen in den Mäusen, die hohe
Gentransferrate, sowie die starke Genexpression ermöglichten nun die Untersuchung einer Chemoprotektion in
vivo.
Den chimären Mäusen wurde eine subletale Dosis an
Paclitaxel verabreicht. Anschließend konnte festgestellt
werden, daß die Zahl humaner Zellen in Mäusen, die mit
MDR1-transduzierten Zellen transplantiert wurden, signifikant weniger abfiel, als in Mäusen, die mit Mock-transduzierten Zellen transplantiert wurden (p<0.05), woraus der
Schluß der Chemoprotektion MDR1-transduzierter Zellen
gezogen werden kann. Ein Vergleich mit transduzierten,
unbehandelten Mäusen zeigt eine signifikante 1.4-1.8-fa-
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
che Erhöhung in der Zahl der genmarkierten (p<0.05-0.01)
oder P-Glykoprotein-exprimierenden (p<0.01) humanen
Zellen in transduzierten, Paclitaxel-behandelten Mäusen.
Eine immer wieder auftauchende Frage im Zusammenhang mit der Transplantation retroviral transduzierter hämatopoetischer Stammzellen ist, ob und wieviele solche(r)
Stammzellen erfolgreich transduziert wurden. Durch klonale Analyse dieser Zellen mittels ligationsmediierter PCR
(LM-PCR) konnte eine hohe Zahl gleichzeitig aktiver humaner Stammzellklone acht Wochen nach Transplantation
analysiert werden. Es ist nun von Interesse, ob durch die
Chemotherapie bestimmte Klone selektiert werden und es
zu einer oligoklonalen Hämatopoese kommt, oder ob die
Myeloprotektion polyklonal getragen wird.
Publikationen (* = externe Koautoren)
Schiedlmeier B.*, Schilz A.J.*, Kuehlcke K.*, Laufs S., Baum C.*,
Zeller W.J., Eckert H.G.*, Fruehauf S.*: Multidrug resistance 1
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Neue Strategien für die Behandlung von
Sarkomen mittels Gen-Transfer von
Suizidgen-enthaltenden „Rekombinante
Adeno-Assoziiertes-Virus-2-Vektoren“
M.R. Veldwijk, S. Berlinghoff,J. Topaly*, S. Laufs,
S. Fruehauf* and W.J. Zeller
*Medizinische Klinik und Poliklinik V, Universität Heidelberg.
Rekombinante Adeno-assoziiertes-Virus-2 (rAAV-2)-Vektoren werden sowohl für die klinische Gentherapie bei Erbkrankheiten als auch präklinisch zur Behandlung von
Krebs eingesetzt. In diesem Projekt konnten wir mit einem
rAAV-2-Vektor, welcher das “green fluorescent protein“
(GFP) enthält, eine hohe Infektionsrate von verschiedenen
soliden Tumoren gegenüber erreichen. Aus einer Reihe
von 8 soliden Tumorzelllinien und primären peripheren
Blutstammzellen (PBSZ), die mit rAAV-2-Überständen infi-
D0200
Pharmakologie der Krebsbehandlung
ziert worden sind (funktionaler Titer: 200 IU/Zelle), erhielten wir die höchste Infektionsraten bei einer Weichteilsarkom-Zelllinie (HS1; Mittelwert: 96% GFP+ Zellen) und bei
Brustkrebszellen (T47D; Mittelwert: 83%, MCF-7; Mittelwert: 85%); bei 5 weiteren Zelllinien (1 Ovarialtumor,
1 Keimzelltumor, 1 Osteosarkom und 2 kleinzellige Bronchialkarzinome) wurden niedrigere Infektionsraten erreicht
(3%-12%); die niedrigste Infektionsrate zeigte sich bei
PBSZ (max. 4%). Diese Resultate zeigen, daß Sarkome
und Brustkrebszellen die geeignetsten Zielzellen für rAAV2-vermittelte Suizid-Gentherapie sind. Die erste Anforderung, um diese Vektoren in Zell-kill-Experimenten zu verwenden, ist die Klonierung von neuen rAAV-2-Vektoren,
welche ein geeignetes Suizidgen enthalten. Deshalb wurde das Thymidinkinase (TK)-Gen in Kombination mit dem
Prodrug Ganciclovir gewählt. Drei neue TK-rAAV-2-Vektoren wurden kloniert. Da einige dieser neuen Vektoren kein
Markergen (GFP) enthielten und deshalb auch nicht mit
dem Fluoreszenz-abhängigen funktionalen Titrierungsverfahren titriert werden konnten, wurde ein optimiertes Titrierungsverfahren entwickelt, welches auf einer „real-time
quantitative“ Polymerase-Ketten-Reaktion (RQ-PCR), die
Markergen-unabhängig ist, basiert. Vier Sarkomzelllinien
wurden ausgewählt (HS-1, HT1080, RDES und SK-N-MC)
und eine komplette Abtötung aller Tumorzellen nach Infektion mit einem rAAV-TK/eGFP-Vektor und Behandlung dieser Zellen mit Ganciclovir (2,5 µg/ml) konnte nachgewiesen werden, wobei in der Kontrollgruppe über 95% der
Zellen überlebten. Für diese Zelllinien sind weiterhin
Xenotransplantationsmodelle etabliert worden. In „proof of
principle“-Experimenten sind Mäuse mit rAAV-TK/eGFPtransduzierten und Ganciclovir behandelten Tumorzellen
transplantiert worden. Diese Tiere überlebten das Experiment (>5 Monate), während die Tiere, die nicht-transduzierte Zellen bekamen, innerhalb eines Monats verstarben.
Diese Daten zeigen das vielversprechende Potential von
rAAV-2-bassierten Suizidvektoren für die zukünftige klinische Anwendung.
Publikationen (* = externe Koautoren)
Veldwijk MR, Topaly J*, Laufs S, Zeller WJ and Fruehauf S*
(2002). Rapid determination of adeno-associated virus 2 vector
titers using an optimized real-time quantitative polymerase chain
reaction-based titration assay that meets clinical laboratory
standards. Mol Ther, Accepted for publication.
Fruehauf S*, Veldwijk MR, Berlinghoff S, Basara N, Baum C*,
Flasshove M, Hegewisch-Becker S, Kröger N, Licht T, Moritz T,
Zeller WJ and Laufs S (2002). Gene therapy for sarcoma. Cells
Tissues Organs, Accepted for publication.
Veldwijk MR, Fruehauf S*, Schiedlmeier B, Kleinschmidt JA and
Zeller WJ (2000). Differential expression of a recombinant adenoassociated virus 2 vector in human CD34+ cells and breast
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Veldwijk MR, Schiedlmeier B, Kleinschmidt JA, Zeller WJ and
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helpervirus-free adeno-associated viral vector stocks. Eur J
Cancer 35: 1136-1142.
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
171
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
Experimentelle Kombinationstherapie der
chronischen myeloischen Leukämie unter
Einschluß des Tyrosinkinaseinhibitors
STI571.
Publikationen (* = externe Koautoren)
J. Topaly*, M. Schad, S. Fruehauf*, W.J. Zeller
Topaly J.*, Zeller W.J., Fruehauf S.* : Synergistic activity of the
new ABL-specific tyrosine kinase inhibitor STI571 and
chemotherapeutic drugs on BCR-ABL-positive chronic
myelogenous leukemia cells.Leukemia 15: 342-347, 2001.
*Med. Klinik und Poliklinik V, Universität Heidelberg
Die chronische myeloische Leukämie (CML) wird durch
die reziproke Translokation zwischen den Chromosomen 9
und 22 verursacht, bei der das BCR-ABL-Fusionsgen entsteht, das eine erhöhte Tyrosinkinase (TK)-Aktivität aufweist. Durch die Entwicklung des TK-Inhibitors STI571
(Novartis Pharma) ist es zu einem Durchbruch in der Therapie dieser Erkrankung gekommen. Je nach Erkrankungsstadium sprechen bis zu 90% der CML-Patienten mit
einer Normalisierung des Blutbildes und ca. 50% der Patienten mit weitgehenden zytogenetischen Remissionen auf
eine Behandlung mit STI571 an. Nichtsdestotrotz kommt
es bei einem Teil der Patienten unter STI571-Therapie zu
einem Rezidiv der Erkrankung.
172
D0200
Pharmakologie der Krebsbehandlung
Topaly J.*, Fruehauf S.*, Ho A.D.*, Zeller W.J.: Rationale for
combination therapy of chronic myelogenous leukemia with
imatinib and irradiation or alkylating agents: implications for
pretransplant conditioning. Br J Cancer 86: 1487-1493, 2002.
Eine weitere Verbesserung der Behandlung ist durch eine
Kombinationstherapie zu erwarten. In dieser Arbeit wurde
systematisch untersucht, welche Substanzen in Kombination mit STI571 CML-Zellen synergistisch abtöten. Für die
quantitative Auswertung der Kombinationseffekte wurde
die Median-Effect-Methode von Chou und Talalay angewendet. Nach dieser Methode wird ein Kombinationsindex
(CI) berechnet, der bei Werten <1 auf Synergismus, >1 auf
Antagonismus und =1 auf Additivität hindeutet. Es hat sich
gezeigt, dass CI-Werte meistens mit steigender Wachstumshemmung abnehmen, was einem verstärkten Synergismus entspricht. Die Auswertung der CI-Werte bei IC75
(75% Wachstumshemmung) ergab einen signifikanten
Synergismus in der CML-Zelllinie BV173 für die STI571Kombinationen mit Cytarabin, Etoposid, Mitoxantron,
Treosulfan, Mafosfamid, Idarubicin, Carboplatin, Thiotepa,
Dexamethason und g-Bestrahlung. Ein Teil dieser Kombinationen wurde auch in anderen CML-Zelllinien getestet
und führte zu ähnlichen Ergebnissen. CI-Werte der Kombinationen mit Gemcitabin, Busulfan, Hydroxyurea, Docetaxel, Fludarabin, Methotrexat, Cladribin, Nimustin und
Topotecan unterschieden sich nicht signifikant von 1 (rein
additiver Effekt). Ergebnisse aus dem Colony-FormingAssay mit primärem CML-Material entsprachen tendenziell
den Beobachtungen im MTT-Assay. Untersuchungen mit
BCR-ABL-negativen Zelllinien und primären Zellen zeigten
keine Verstärkung der zytostatischen Wirkung chemotherapeutischer Substanzen oder der g-Bestrahlung durch
STI571. Demzufolge führt STI571 zu einer Erweiterung
des therapeutischen Index zytostatischer Substanzen und
der g-Bestrahlung.
Aufgrund unserer Daten ist eine klinische Studie entstanden, welche die Effektivität und Verträglichkeit einer
STI571-basierten Kombinationstherapie in der myeloischen Blastenkrise der CML testen soll.
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
Es wurden pharmakokinetische Modelle für Signal-ZeitDaten entwickelt, die gleichzeitig im Tumor und im Kreislauf erhoben wurden, und es wurde gezeigt, dass wegen
der Variabilität der Kinetik im Kreislauf gleichzeitige Messungen im Tumor und im Kreislauf erforderlich sind, wenn
man quantitative Aussagen über die Kinetik des Kontrastmittels im individuellen Tumor machen will [1].
Pharmakokinetische und pharmakodynamische Daten aus
der Klinik und der Arzneimittelentwicklung werden mit Populationsmodellen ausgewertet [Sheiner et al., J. Pharmacokin. Biopharm. 19 (1991), 11S - 24S]. Schwerpunkt war
die Untersuchung der Dosis- und Zeit-Wirkungs-Beziehung von Erythropoetin bei Kindern mit renaler Anämie.
Die Dosierung ist in diesem Fall schwierig, da die Wirkung
sehr variabel ist und über mehrere Monate anhält. Bei geringer Überdosierung treten ernste Nebenwirkungen auf.
Ziel der Untersuchung ist, die Grundlage für ein Computer-gestütztes Verfahren zur individuellen Dosisoptimierung zu schaffen.
6
relative Signalintensitaet
2
3
4
5
Eines der Hauptprobleme bei der Behandlung solider maligner Tumoren mit Arzneistoffen ist die Erzielung ausreichend hoher Wirkstoffkonzentrationen im Tumor für ausreichend lange Zeit. Über die Arzneistoffkonzentrationen,
die tatsächlich in menschlichen Tumoren zustandekommen, ist wenig bekannt. Die dynamische KernresonanzTomographie (“dynamic magnetic resonance imaging”,
dMRI) erlaubt es, Konzentrationsverläufe von Kontrastmitteln nichtinvasiv im Gewebe zu verfolgen. Mögliche Anwendungen liegen in der Differentialdiagnose maligner
und benigner Tumoren und in einer frühen Erfassung von
therapeutischen Effekten. Bei den meisten Tumoruntersuchungen wird nicht der gleichzeitige Verlauf der Konzentration des Kontrastmittels im Kreislauf berücksichtigt.
173
1
Kooperationen mit: M.V. Knopp, Onkologische Diagnostik und
Therapie, DKFZ; W.E. Hull, AG Zentrale Spektroskopie, DKFZ; O.
Mehls, Universitäts-Kinderklinik Heidelberg; R.W. Jelliffe, School
of Medicine, University of Southern California, Los Angeles, USA.
Zusatzfinanzierung: DFG (Pharmakodynamik von Erythropoetin)
0
5
10
6
R.E. Port
Abb.: Dynamische NMR-Tomographie, Signal-Zeit-Verlauf in der
Aorta nach Kurzinfusion des Kontrastmittels Gadopentetat
(0,1 mmol/kg) bei zwei verschiedenen Patientinnen. Senkrechte
gestrichelte Geraden: Beginn und Ende der Infusion. Durchgezogene Kurven: Modellvorhersage auf Grund der mittleren Populationsparameter, des Körpergewichts und des ersten Messwerts.
Gestrichelte Kurven: Modellvorhersage auf Grund individueller
Bayes-Parameter. Bei der ersten Patientin entsprechen die Messwerte etwa dem, was auf Grund der mittleren Populationsparameter, des Körpergewichts und des ersten Messwerts zu erwarten
ist. Damit sind die individuellen Bayes-Parameter ähnlich den
mittleren Populationsparametern und beide Modellkurven sind nahezu gleich (obere Abbildung). Bei der zweiten Patientin weichen
die Messwerte erheblich von der Erwartung ab. Dies wird überwiegend als Folge zufälliger interindividueller Variation gedeutet.
Das Ergebnis sind stark abweichende individuelle Bayes-Parameter und damit ein Auseinanderklaffen der beiden Modellkurven
(untere Abbildung).
relative Signalintensitaet
2
3
4
5
Pharmakokinetik/Pharmakodynamik (D0201)
D0200
Pharmakologie der Krebsbehandlung
1
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
0
Publikationen (* = externer Koautor):
[1] Port RE, Knopp MV, Brix G*: Dynamic contrast-enhanced MRI
using Gd-DTPA: Interindividual variability of the arterial input
function and consequences for the assessment of kinetics in
tumors. Magn Reson Med 45, 1030 - 1038, 2001
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
5
Zeit (min)
10
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
D0301
Arbeitsgruppe Toxikologie und Chemotherapie
Arbeitsgruppe Toxikologie und Chemotherapie (D0301)
Leiter: Prof. Dr. med. Martin R. Berger 06221 42-3310, FAX: 06221 42-3313, E-mail: [email protected]
Gastwissenschaftler
Dr. Spiro M. Konstantinov (09 - 11/00, 05 - 08/01, Sofia,
Bulgarien)
Dr. Milka Georgieva (03 - 06/00, 10 - 12/00, 03 - 05/01,
Sofia, Bulgarien)
Prof. Dr. Iana Tsoneva (10 - 11/01, Sofia, Bulgarien)
Doktoranden
Cristina Voß ( - 12/01)
Hassan Adwan (10/99 - )
Michael Conzelmann ( - 09/01)
Christoph Dieterle ( - 09/01)
Maike Leible (10/00 - )
Jan Sänger (10/00 - )
Tobias Bäuerle (09/01 - )
Technisches Personal
Aysen Danisman-Marsch ( - 03/01)
Helmut Opitz ( - 09/00)
Birgit Kaiser (1/2 Stelle, 10/00 - )
Gerd Braun (02/01 - )
174
Ziele und Aufgaben der Arbeitsgruppe sind eng an den
verbesserten Nachweis geringer Mengen von Tumorzellen
und an die Entwicklung und toxikologische Beurteilung
von Substanzen gekoppelt, die Krebswachstum hemmen.
Der Nachweis von wenigen Tumorzellen ist durch molekularbiologische Techniken prinzipiell möglich geworden,
muss für jede Tumorart in der Praxis aber erst etabliert
werden. Diese Arbeit ist sinnvoll, weil geringe Mengen an
Tumorzellen therapeutisch leichter positiv beeinflussbar
sind. In diesem Zusammenhang ist die Detektion von Tumorzellen zu sehen, die mit Hilfe von Mutationen des Kras Gens oder mittels epithelialer Marker (Cytokeratin 20,
Guanylylcyclase C) nachgewiesen wurden.
Neue, mehr selektiv antineoplastisch wirksame Verbindungen beeinflussen häufig die Signaltransduktion der
Zelle. Alkylphosphocholine, eine neue Gruppe membranwirksamer Verbindungen, hemmen das Krebswachstum
konzentrationsabhängig (sowohl zytotoxisch als auch
Apoptose- auslösend und differenzierend). Die Identifizierung der molekularen Wirkungen ist ein weiteres mittelfristiges Forschungsziel. Die Wirkung auf Metastasen im
Knochen und in der Leber wird an spezifischen Modellen
untersucht, die pathophysiologisch den klinischen Vorbildern möglichst nahe kommen.
Nachweis von disseminierten Kolonkarzinomzellen (D0301-1)
M.R. Berger, C. Dieterle, M. Conzelmann
In Zusammenarbeit mit Dr. U. Linnemann, Städtisches Klinikum
Nord, Nürnberg
Kolonkarzinome weisen in der Hälfte aller Fälle Mutationen des K-ras Gens auf. Der sensitive Nachweis dieser
Mutation mittels PCR-RFLP wurde ausgenutzt, um geringe
Mengen derartig mutierter Kolonkarzinomzellen am Resektatrand und in der Leber von Patienten nachzuweisen,
die wegen eines Kolonkarzinoms operiert wurden. Die
Sensitivität des K-ras Nachweises ist durch molekularbiologische Methoden gegenüber der Histologie deutlich verbessert. Eine Ausweitung der Diagnostik auf weitere Gewebe wie Lymphknoten und Knochenmark ist geplant. Das
Vorhandensein von disseminierten Tumorzellen in der Leber erlaubt eine genauere Klassifizierung der Patienten [13].
Alkylphosphocholine (D0301-2)
M.R. Berger, S.M. Konstantinov
In Zusammenarbeit mit Prof. Dr. H. Eibl, Max Planck Institut für
Biophysikalische Chemie, Göttingen; Prof. Dr. C. Unger, Klinik für
Tumorbiologie, Freiburg
Alkylphosphocholine sind Verbindungen, die sich - wegen
ihrer hohen Ähnlichkeit mit natürlichen Membranbestandteilen - in Zellmembranen anreichern und dort Wirkungen
auslösen, die als antineoplastisch, antiviral und antileishmanial charakterisiert werden können. Der Mechanismus
der antineoplastischen Wirkung beruht - zumindest teilweise - auf der Auslösung von Apoptose in den exponierten Krebszellen. Untersuchungen zu Struktur-Wirkungsbeziehungen haben gezeigt, daß Alkylphosphocholine mit einer Kettenlänge von 22 Kohlenstoff-Atomen sowie einer
Doppelbindung in der Alkoholkette intravenös applizierbar
werden und deshalb als eigene Untergruppe gewertet
werden können. Insgesamt ist diese Gruppe von antineoplastischen Verbindungen arm an schädlichen Nebenwirkungen und weist Eigenwirkungen auf, wie die Stimulation
von hämatopoetischen Zellen, die diese Gruppe als Bestandteil einer Kombinationschemotherapie besonders geeignet erscheinen lassen [4-6].
Tiermodelle zur Metastasierung (D0301-3)
M.R. Berger,H. Adwan, M. Leible, J. Sänger
In Zusammenarbeit mit Prof. Dr. G. Golomb, Hebrew University of
Jerusalem, Israel; Dr. M. Seelig, Abteilung für Chirurgie, Städtisches Klinikum, Ludwigshafen
Da der Primärtumor meist therapeutisch beherrscht werden kann, ist das Auftreten von Metastasen oft die finale
Etappe einer Krebserkrankung. Tiermodelle, die diese
Krankheitsstufe modellieren sollen, sind technisch aufwendiger und können nur jeweils besondere Aspekte der
Metastasierung darstellen. Ein Rattenmodell zur Metastasierung von kolorektalen Tumoren in die Leber wurde
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
D0301
Arbeitsgruppe Toxikologie und Chemotherapie
dazu so modifiziert, daß ein Markergen die Quantifizierung
der Tumorzellen nach intraportaler Injektion in die Leber
auch bei diffuser Metastasierung ermöglicht [7]. Ein weiteres Rattenmodell stellt die Metastasierung in den Knochen
nach. Dazu werden ebenfalls mit einem Markergen versehene Mammakarzinomzellen in einen Seitenast der A.
femoralis injiziert und bilden danach im Bereich des distalen Ober- und proximalen Unterschenkels lytische Metastasen (Abb. 1).
Derzeit laufende Therapiestudien mit diesen Modellen
werden dazu beitragen, verbesserte Therapiemöglichkeiten zu entwickeln.
Publikationen (* = externe Koautoren)
[1] Schimanski, C.C.; *Sutter, C.; *Linnemann, U., Berger, M.R.:
Sampling technique influences the detection of K-ras mutations in
normal appearing mucosa of colorectal cancer patients. Int. J.
Oncol. 15, 391-398 (1999)
[2] Schimanski, C.C.; *Linnemann, U., Berger, M.R.: Sensitive
detection of K-ras mutations augments diagnosis of colorectal
cancer metastases in the liver. Cancer Res. 59, 5169-5175 (1999)
Abb. 1: Darstellung einer osteolytischen Metastase von
MDA-MB231 Zellen in der Tibia einer Ratte.
[3] Schimanski, C.C., *Linnemann, U., *Arbogast, R., Berger,
M.R.: Extended staging results from the detection of isolated
tumor cells in the liver of colorectal cancer patients Oncol. Rep 8:
185-188 (2001)
[4] Berger, M.R., Sobottka, S., Konstantinov, S.M., *Eibl, H.:
Erucylphosphocholine is the prototype of i.v. injectable
alkylphosphocholines. Drugs of Today, 34 (Suppl. F), 73-81 (1998)
[5] Konstantinov, S.M., *Eibl, H., Berger M.R.: BCR-ABL
influences the antileukaemic efficacy of alkylphosphocholines. Br.
J. Haematol., 107 365-374 (1999)
[6] Konstantinov, S.M., Berger M.R.: Human urinary bladder
carcinoma cell lines respond to treatment with
alkylphosphocholines. Cancer Lett. 144, 153-160 (1999)
[7] Wittmer, A., *Khazaie, K., Berger, M.R.: Quantitative detection
of lac-Z-transfected CC531 colon carcinoma cells in an orthotopic
rat liver metastasis model. Clin. Exp. Metastas. 17, 369-376
(1999)
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
175
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
D0302 Kooperation mit der Abteilung für Molekulare
Pathologie des Universitätsklinikums Heidelberg
Kooperation des DKFZ mit der Abteilung für Molekulare Pathologie des
Universitätsklinikums Heidelberg (D0302)
Leiter: Prof. Dr. med. Magnus von Knebel-Doeberitz : 06221 562876, Fax -5981, E-mail: [email protected]
Differentielle Genexpression in soliden Tumoren
(insb. Kolonkarzinom)
Wissenschaftliche Mitarbeiter
Dr. Robert Kösters
Dr. Johannes Gebert
Dr. med. Matthias Kloor
Dr. med. Nicolas Wentzensen
Dr. Svetlana Vinokourova
Dr. Michael Linnebacher
Dr. Jeannine Lacroix
Dr. Susanne Dihlmann
Dr. med. Stefan Wörner
Dr. med. Peter Findeisen
Im Projektbereich 1 werden mit Hilfe differentieller Analyseverfahren der Genexpression Gene identifiziert, die in
Tumorzellen exprimiert werden, in normalen, nicht transformierten Geweben jedoch nicht. Wir nutzen hierbei einen „evidence basierten“ Ansatz. Diese Gene dienen als
Ansätze für die Entwicklung neuer Verfahren für die Krebsfrüherkennung, den Nachweis disseminierter Tumorzellen
in verschiedenen klinischen Proben, wie beispielsweise
Lymphknoten, Knochenmark, peripherem Blut etc. Ferner
werden diese differentiell exprimierten Gene auch für die
Entwicklung neuer Tumorvakzine verwendet (siehe Projektbereich 6). Es konnten etwa 30 neue Gene identifiziert
und validiert werden. U.a. konnten gänzliche neue, bisher
nicht bekannte Sequenzen mit hoher differentieller Expression vor allem in koloektalen Karzinomen isoliert und charakterisiert werden, die sich sowohl als Diagnostikum wie
auch als Angriff für eine gezielte Immuntherapie eignen.
Gastwissenschaftler
Carmen Gurrola Diaz
Doktoranden
Anja Germann
Christine Fallsehr
Corina Ziegert
Eva Geiger
176
Technische Assistenten
Özlem Mutluer
Irina Voehringer
Simone Klein*
Gabriele Russell
Beate Kuchenbuch
Heike Sartor
Kooperationen: Prof.Dr. M. Büchler, Chir. Univ. Klinik, Heidelberg;
Prof.Dr. M. Wiesel, Urolog. Univ.-Klinik, Heidelberg; Prof.Dr. P.
Drings, Thoraxklinik, Heidelberg; Dr.F. Bosch, Univ.-HNO-Klinik,
Heidelberg; Prof.Dr. W. Dippolt, St. Vincenz- u. Elisabeth-Hospital, Mainz; Dr. J. Hoheisel, Prof.Dr. M. Little, DKFZ; Prof.Dr. W.
Ansorge, Dr. P. Bork, EMBL, Heidelberg; Dr. J. Coy, MTMLaboratories AG, Heidelberg
Drittmittel: BMBF-Fortsetzungsantrag 2002: 1 BAT IIa, 1 BAT Vc,
Sachmittel Euro 160.000; Forschungsförderung der Univ.: 1 BAT
Vb, Sachmittel DM 19.996
* DKFZ finanziert
Die Abteilung für „Molekulare Pathologie“ ist im Oktober
2001 neu eingerichtet worden. Sie ging aus der ehemaligen Sektion für Molekulare Diagnostik und Therapie der
Chirurgischen Universitätsklinik Heidelberg hervor und
stellt eine Kooperationseinheit zwischen dem DKFZ und
dem Institut für Pathologie des Universitätsklinikums Heidelberg dar. Hauptfokus der Abteilung ist die Entwicklung
neuer Verfahren für die Krebsfrüherkennung, die Krebsdiagnostik und Prävention solider Tumoren. Die Arbeiten
werden vom DKFZ durch die Bereitstellung von Laborkapazität und anderen Unterstützungen gefördert. Die wissenschaftliche Arbeitsschwerpunkte der Abteilung gliedern
sich in 7 Hauptprojekte:
· Projekt 1: Differentielle Genexpression in soliden Tumoren (insb. Kolonkarzinom)
· Projekt 2: Molekulare Pathogenese mikrosatelliten instabiler Tumore
· Projekt 3: Neue Diagnostika für die Krebsfrüherkennung und den Nachweis disseminierter Tumorzellen
· Projekt 4: Karzinogenese durch humane Papillomviren, Aspekte für Diagnostik und Früherkennung
· Projekt 5: konditionelle (transgene) Tiermodelle der
Krebsentstehung
· Projekt 6: Tumorimmunologie und Vakzineentwicklung
· Projekt 7: Tumorzellsensitivierung und Krebsprävention
Publikationen
Dihlmann et al., Cancer Res. 59: 1857-1860, 1999
Klaes et al., Eur. J. Cancer 35: 733-737, 1999
Koesters et al., Genomics 61: 210-218, 1999
Gebert et al., Int.J.Oncol. 16:169-179, 2000
Dihlmann et al., Oncogene 20: 645-653, 2001
Molekulare Pathogenese mikrosatelliten
instabiler Tumore
Im Projektbereich 2 werden vor allem Gene identifiziert,
die in mikrosatelliten instabilen Tumoren (MSI+) spezifische Mutationen aufweisen (sog. frame shift-Mutationen)
(Wörner et al., 2001). Diese Frameshiftmutationen führen
zu neuen Peptidsequenzen in den Tumorzellen, die sich
sowohl für die Diagnostik als auch die immunologische
Prävention und Therapie dieser Tumoren sehr gut nutzen
lassen. Im Rahmen dieses Projektes arbeiten wir insbesondere intensiv an der Entwicklung eines präventiven
Impfstoffes für das hereditäre nicht-kolorektale Karzinom
(Linnebacher et al., 2001). Im Projektbereich 2 wurde ferner ein interdisziplinäres Zentrum für den erblichen Dickdarmkrebs (HNPCC) durch Unterstützung der Deutschen
Krebshilfe aufgebaut, in dessen Rahmen ein sehr umfangreiches Diagnostik und Beratungsprogramm für Patienten
mit erblichen Formen des kolorekalen Karzinoms unterhalten wird (siehe hierzu auch die Homepage des Programms www.hnpcc.de).
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
Kooperationspartner: Dr. P. Bork, EMBL, Heidelberg; Prof.Dr. CM
Becker, Inst. für Biochemie der Univ. Erlangen; Prof. Dr. J.
Rüschoff, Inst. für Pathologie, Städt. Kliniken, Kassel; Prof.Dr. H.
Vogelsang Techn. Universität, München; Dr. R. Ridder, MTMLaboratories, Heidelberg
Drittmittel : Krebshilfe HNPCC (1999-2002): 1 BAT IIa, 1 BAT Vc,
Verbrauch Euro 1.35 Mio für 6 Jahre, Tumorzentrum HD/MA
(1997-2001): 1 BAT IIa/4, Sachmittel p.a. DM 10.000
Publikationen:
Sutter et al., Molecular and Cellular Probes 13: 157-165, 1999
Wörner et al., Int. J. Cancer 93, 1: 12-19, 2000
Wüllenweber et al., Dis. Colon and Rectum 44: 1281-1289, 2000
Grips et al., Nervenarzt 73: 177-182, 2002
Neue Diagnostika für die Krebsfrüherkennung
und den Nachweis disseminierter Tumorzellen
Im Projektbereich 3 wurden neue Verfahren zum Nachweis disseminierter Tumorzellen in verschiedenen Organsystemen, wie beispielsweise Lymphknoten, peripherem
Blut, Knochenmark und anderen mehr entwickelt und im
Rahmen breitangelegter klinische Studien evaluiert. Dem
Nachweis disseminierter Tumorzellen in den verschiedenen Organsystemen konnte eine erhebliche prognostische
Bedeutung zugemessen werden.
Kooperationspartner: Prof. Dr. K. Pantel, Univ.-Krankenhaus
Eppendorf, Hamburg; Dr. J. Weitz, Sloane-Kettering-MemorialHospital, New York, USA; Dr. P. Kienle, Dr. M. Koch, Chir. Univ.
Klinik Heidelberg; MTM-Laboratories, Heidelberg
Drittmittel: Tumorzentrum HD/MA (1997-2001): 1 BAT IIa/2 1 BAT
Vc, Sachmittel p. a. DM 15.000; Tumorzentrum HD/MA (20022006): 1 BAT IIa/2 1 BAT Vib, Sachmittel p.a. DM 20.000
D0302 Kooperation mit der Abteilung für Molekulare
Pathologie des Universitätsklinikums Heidelberg
ser Marker derzeit evaluiert. Die bisherigen Daten weisen
daraufhin, dass durch diesen neuen Marker das bisherige
Verfahren des Pap-Abstrichs sehr sinnvoll ergänzt und wesentlich genauer durchgeführt werden kann. Ferner konnte im Rahmen dieses Projektbereichs durch den Nachweis
der Integration von humanen Papillomviren ein neues Verfahren für den Nachweis der Progression von Vorstufen
des Zervixkarzinoms zum invasiven Karzinom entwickelt
und validiert werden. Beide Verfahren wurden umfangreich durch Patentanmeldungen geschützt und an ein mit
dem DKFZ neugegründetes Unternehmen, die MTMlaboratories AG in Heidelberg auslizensiert.
Kooperationspartner: Dr. H. Hoffmann, MTM-Laboratories, Heidelberg; Prof.Dr. U. Petry, Univ.-Frauenklinik, Hannover; Prof.Dr.
P. Melsheimer, Univ.-Frauenklinik, Heidelberg; Prof.Dr. A. Schneider, Univ.-Frauenklinik, Jena; Prof.Dr. V. Schneider, Inst. für Pathologie, Freiburg; Dr. V. Heilmann, Univ.-Frauenklinik, Ulm;
Prof.Dr. K. Shah, Johns-Hopkins-Medical-School, Dept. of Molecular Microbiology and Immunology, Baltimore, USA; Prof.Dr. R.
Kurman, Johns Hopkins Medical School, Dept. of Pathology, Baltimore, USA; Prof.Dr. D. Jenkins, Queen’s Medical Center, Dept. of
Pathology, Nottingham, UK; Prof.Dr. T. Rajkumar, Institute of
Pathology, Madras, Indien
Drittmittel : Krebshilfe (Folgeantrag) (1999-2002): 1 BAT IIa/2 1
BAT Vc/2, Sachmittel p.a. DM 20.000; Krebshilfe 2000-2001 : 1
BAT IIa/2, Sachmittel p.a. DM 25.000; Tumorzentrum HD/MA
(2002-2006): 1 BAT IIa/2 1 BAT VIb
177
Publikationen :
Nindl. et al., Int. J. Cancer 81: 666-668, 1999
Snijders et al., J. Clin. Pathol. 52: 498-503, 1999
Klaes et al., Cancer Research 59 (24): 6132-6136, 1999
Klaes et al., Int. J. Cancer 92 (2): 276-284, 2000
Publikationen
Luft et al., Int. J. Cancer 92 (1): 9-17, 2000
Weitz et al., Clin. Cancer Research 5: 1830-1836, 1999
v. Knebel Doeberitz, Zentralbl. Gynaekol. 123: 186-191, 2001
Weber et al., British Journal of Cancer 82 (1): 157-60, 2000
v. Knebel Doeberitz, Disease Markers 17: 123-128, 2001
Weitz et al., Annals of Surgery 232 (1): 66-72, 2000
Wentzensen et al., Oncogene 21: 419-426, 2002
v. Knebel Doeberitz et al., Zentralbl. Chir. 125 Suppl. 1:16-20,
2000
Preise:
2000 Christoph-Wilhelm-Hufeland-Preis
Güdemann et al., Journal of Urology 164: 532-536, 2000
Koch et al., Arch Surg. 136: 85-89, 2001
Lacroix et al., Int. J. Cancer 92 (1): 1-8
Weitz et al., Langenbecks Arch Chir. Forumsband 29: 149-152,
2000
Weitz et al., Dtsch. Ges. f. Chir., Chir. Forum 30: 109-111, 2001
Lacroix et al., Semin. Surg. Oncol. 20: 252-264, 2001
Weber et al., World. J. Surg. 26: 148-152, 2002
Karzinogenese durch humane Papillomviren,
Aspekte für Diagnostik und Früherkennung
Im Projektbereich 4 entwickeln wir vor allem Verfahren,
durch die dysplastische Zellveränderungen an der Zervix
uteri spezifischer und mit höherer Genauigkeit nachgewiesen werden können. Durch die detaillierte Analyse der
Transformationsmechanismen, durch die humane Papillomviren zur Karzinogenese der Anogenitalkarzinome (insbesondere Zervixkarzinom) beitragen, konnten wir Marker
ableiten, die sowohl als spezifische Früherkennungsmarker als auch als Progressionsmarker klinisch von Bedeutung sind. So konnten wir zeigen, dass das p16ink4a-Protein ein hochspezifischer Marker für auftretende Dysplasien der Zervix uteri ist. In interanionalen Studien wird die-
Konditionelle (transgene) Tiermodelle der
Krebsentstehung
Im Projektbereich 5 entwickeln wir transgene und nicht
transgene Tiemodelle der Krebsentstehung, durch die Tumoren konditionell in Nagern hervorgerufen werden können. In diesen Modellen konnten ebenfalls differentiell
exprimierte Gene nachgewiesen werden, gegen die spezifische Vakzinierungsverfahren entwickelt werden. Ziel dieses Projektbereiches ist es vor allem zu prüfen, ob durch
präventive Vakzinierungsverfahren gegenüber differentiell
exprimierten Tumorantigenen ein präventiver Impfschutz
und Immunität gegenüber in vivo induzierbaren Tumoren
hervorgerufen werden kann.
Kooperationspartner: Prof.Dr. Bujard, ZMBH, Heidelberg; Prof.Dr.
Groene, DKFZ
Drittmittel: Tumorzentrum HD/MA (1997-2001): 1 BAT IIa/2 1 BAT
Vc, Sachmittel p. a. DM 15.000
Publikationen:
Kösters et al., Cancer Research 59 (16): 3880-3882, 1999
Kösters et al., Carcinogenesis 22 (11): 1885-1890, 2001
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
D0302 Kooperation mit der Abteilung für Molekulare
Pathologie des Universitätsklinikums Heidelberg
Tumorimmunologie und Vakzineentwicklung
Tumorzellsensitivierung und Krebsprävention
Im Projektbereich 6 werden mögliche induzierbare
Immunmechansimen gegenüber differentiell exprimierten
Antigenen (siehe Projekt 1,2,4) überprüft Ziel dieses Projektes ist es, optimierte Vakzinierungsverfahren zu entwikkeln, die vor allem für die immunbasierte Krebsprävention
Verwendung finden sollen. Ferner werden im Rahmen diese Verfahren Immunmechanismen bei Tumorpatienten
überprüft, die sich gegen die differentiell exprimierten Antigene richten.
Im Projektbereich 7 werden Mechanismen untersucht,
die zum einen Tumorzellen gegenüber genotoxischen
Agentien resistenter machen, bzw. den gegenteiligen Effekt hervorrufen, in dem sie die Wirksamkeit der antineoplastischen Therapie verstärken. So konnte insbesondere
in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Jörg
Schlehofer (ATV / DKFZ) nachgewiesen werden, dass die
Infektion von Tumoren durch Adeno-assoziierte Viren zu
einer erheblichen Steigerung des Effektes einer Chemooder Strahlentherapie führt. Beobachtungen im Tierexperiment zeigten ferner, dass die Nebenwirkungen der Chemotherapie durch eine begleitende Infektion durch AAV erheblich reduziert werden kann. Molekulare Mechanismen,
durch die diese Effekte auftreten werden gegenwertig umfangreich charakterisiert.
Kooperationspartner: Prof.Dr. G. Gaudernack, Radium-Hospital,
Oslo, Norwegen; Prof.Dr. H.G. Rammensee, Interfakultäres Inst.
für Zellbiologie der Univ., Abt. Immunologie, Tübingen; Prof.Dr. M.
Büchler, Chir. Univ. Klinik, Heidelberg
Drittmittel : Verein zur Förderung der Krebsforschung: 1 BAT IIa;1
BAT IIa/2,1 BAT Vb, Sachmittel DM 360.000; Forschungsförderung der Univ.: 1 BAT Vb ¾, Sachmittel DM 35.000
Publikationen:
Haack et al., Cancer Gene Therapy 7 (10): 1357-1364, 2000
Linnebacher et al., Int. J. Cancer 93 (1): 6-11, 2001
Kooperationspartner: Prof.Dr. J. Schlehofer, ATV, DKFZ
Drittmittel: 1 BAT IIa, 1 BAT IIa 1/2, 1 BAT Vc Verbrauchsmittel;
Forschungsförderung der Univ.: 1 BAT Vb
Publikationen:
Hillgenberg et al., Eur. J. Cancer 35 (1): 106-110, 1999
Eisold et al., Int. J. Cancer, in press
Schwarzbach et al., International Journal of Oncology, in press
178
Patente
Titel
Land Anmeldungs Nr
Patent Nr
Method for Early diagnosis of carcinomas
DE DE 198 29 473.5-52
DE 19829473C2
Method for Early diagnosis of carcinomas
PCT PCT/DE99/02094
WO0001845A2
Method for Early diagnosis of carcinomas
US
Method for Early diagnosis of carcinomas
AU 58487/99
Method for Early diagnosis of carcinomas
BR
Method for Early diagnosis of carcinomas
BY a20010082
Method for Early diagnosis of carcinomas
CA 2336153
Method for Early diagnosis of carcinomas
CN 99807911.1
Method for Early diagnosis of carcinomas
CZ PV 2000-4922
Method for Early diagnosis of carcinomas
EP 99 945 931.6
EP1092155
Method for Early diagnosis of carcinomas
HU
Method for Early diagnosis of carcinomas
IL
140338
Method for Early diagnosis of carcinomas
IN
Method for Early diagnosis of carcinomas
JP
2000-558235
Method for Early diagnosis of carcinomas
KR 10-2001-700026
Method for Early diagnosis of carcinomas
MX 012852
Method for Early diagnosis of carcinomas
NO 2000 6681
Method for Early diagnosis of carcinomas
PL
Method for Early diagnosis of carcinomas
RU 2001 102 598
Method for Early diagnosis of carcinomas
SK
Method for Early diagnosis of carcinomas
SG 200007667-9
Method for Early diagnosis of carcinomas
TR
Method for Early diagnosis of carcinomas
‘HK’
Für mikrosattelliteninstabile (MSI+)-Tumore DE 10032608.0
relevante Gene und ihre Genprodukte
Für mikrosattelliteninstabile (MSI+)-Tumore PCT PCT/DE01/02510
relevante Gene und ihre Genprodukte
Verfahren zur Früherkennung von HPV-as- DE 19506561
DE19506561
soziierten Karzinomen bzw. von hochgradigen durch HPV verursachten Dysplasien
Method of early detection of HPV-associated US
US6027891
carcinomas and extreme dysplasias caused by HPV
Early recognition process of HPV-asEP 96 904 706.7
EP0811079
sociated carcinomas or High-grade HPV-caused dysplasias
Early recognition process of HPV-assoc..... PCT
WO9626293A2
Early recognition process of HPV-assoc..... JP
8-525305
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
Status
granted
pending
pending
pending
pending
pending
pending
pending
pending
pending
pending
pending
pending
pending
pending
pending
pending
pending
pending
pending
pending
pending
pending
pending
Erfinder
von Knebel-Doeberitz, M.
von Knebel-Doeberitz, M.
von Knebel-Doeberitz, M.
von Knebel-Doeberitz, M.
von Knebel-Doeberitz, M.
von Knebel-Doeberitz, M.
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von Knebel-Doeberitz, M.
von Knebel-Doeberitz, M.
von Knebel-Doeberitz, M.
von Knebel-Doeberitz, M.
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von Knebel-Doeberitz, M.
von Knebel-Doeberitz, M.
von Knebel-Doeberitz, M.
von Knebel-Doeberitz, M.
von Knebel-Doeberitz, M.
von Knebel-Doeberitz, M.
von Knebel-Doeberitz, M.
von Knebel-Doeberitz, M.
pending von Knebel-Doeberitz, M.
granted
von Knebel-Doeberitz, M.
granted
von Knebel-Doeberitz, M.
granted
von Knebel-Doeberitz, M.
pending von Knebel-Doeberitz, M.
pending von Knebel-Doeberitz, M.
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
D0500
Rekombinante Antikörper
Rekombinante Antikörper (D0500)
Leiter: Prof. Dr. Melvyn Little
Postdocs
Dr. Sergey Kipriyanov (- 30.4.00)
Dr. Michael Hoffmann (- 31.3.00)
Dr. Monika Zewe-Welschof (- 31.3.01)
Dr. Peter Röttgen (- 31.12.00)
Dr. Fabrice Le Gall (- 30.8.00)
Dr. Timo Kürschner (1.2.00-31.3.00)
Dr. Jürgen Recktenwald (1.9.01-)
Dr. Björn Cochlovius
Doktoranden
Petra Rohrbach (- 31.3.00)
Timo Kürschner (- 31.1.00)
Wolfgang Schmitt (-31.10.01)
Ingrid Choi (- 31.7.01).
Die Arbeitsgruppe Rekombinante Antikörper untersucht
die Erstellung hochkomplexer Immunglobulin-Genbanken,
wobei mittels spezieller Expressionsvektoren eine klonale
Selektion spezifisch bindender Antikörper im Prokaryotensystem vorgenommen werden kann. Ziel ist es, humane
monoklonale Antikörper in vitro zu generieren, um Fragmente dieser Antikörper klinisch einzusetzen. Hierzu werden Konjugate von Fv-Fragmenten der Antikörper mit
Effektormolekülen oder Toxinen hergestellt. Über die Herstellung multivalenter und multispezifischer Antikörper
kann die Avidität erhöht werden und es bieten sich weitere
Konjugationsmöglichkeiten. Bei der Kopplung der Antikörperfragmente an Effektormoleküle stehen menschliche
RNAsen im Vordergrund. Die Überprüfung der Wirksamkeit im Tiermodell ist bereits erfolgt. In der Therapie von
humanen Lymphomen sollen speziell rekombinante bispezifische Antkörper (Diabodies und Tandem-Diabodies) mit
Spezifität für CD16 x CD30 und CD3 x CD19 eingesetzt
werden. Präklinische Studien konnten bereits erfolgreich
abgeschlossen werden. In weiteren präklinischen Studien
sollen Kombinationstherapien aus aktiver Vakzinierung,
z.B. mittels Antigen-beladener dendritischer Zellen und
dem Einsatz von Diabodies /Tandem-Diabodies erprobt
werden.
Im Mai 2000 wurde die Firma Affimed Therapeutics AG als
Spin-off der AG Rekombinante Antikörper von Prof.
Melvyn Little gegründet. Ziel ist die Entwicklung von neuen
therapeutischen Reagenzien auf der Basis von rekombinanten Antikörpern. Hierfür wurden umfangreiche synthetische und native Antikörperbibliotheken etabliert, um humane Antikörper mit geringen Nebenwirkungen zu isolieren.
Experimentelle Therapie mit rekombinanten
Antikörpern
1) Herstellung und Screening von Antikörperbibliotheken
P. Rohrbach, T. Kürschner,P. Röttgen, M. Little
Wir haben Methoden und Vektoren entwickelt, die es ermöglichen, die grundlegenden Prinzipien der humanen
Antikörper-Immunantwort in Bakterien zu imitieren. Unsere
aus menschlichem Blut hergestellten hochkomplexen
Immunglobulin-Genbanken oder „synthetische“ humane
Immunglobulin-Genbanken mit Zufallssequenzen an der
Antigenbindungsstelle dienen als Repertoir für die Isolation klinisch relevanter Antikörper. Spezifische Antikörper
werden mit der Phage-Display-Technologie aus der Bibliothek selektioniert. Wir haben damit die Möglichkeit, humane monoklonale Antikörper in vitro, d.h. ohne die Notwendigkeit zur Immunisierung, herzustellen.
2) Diabodies für die Lyse von Tumorzellen
S. Kipriyanov, B. Cochlovius, F. Le Gall, M. Little
In Zusammenarbeit mit: Dr. Gerd Moldenhauer, Dr. Gudrun
Strauss, Dr. Jochen Schumacher, Dr. Claus-Wilhelm von der
Lieth, Dr. E. Ronald Matys, DKFZ.
Wir haben mehrere bispezifische Antikörper in einer sogenannten “Diabody”-Form konstruiert, die nur aus den variablen Domänen von vorhandenen Mausantikörpern bestehen. Diese sehr kompakten und rigiden Moleküle sind
weniger immunogen als die viel größeren parentalen Antikörper und erlauben eine bessere Penetration des Tumorgewebes. In vitro Assays mit Zellkulturen zeigten, daß die
Diabodies eine effiziente Lyse von malignen B-Zellen ermöglichen.
3) Mulitivalente rekombinante Antikörper
F. Le Gall, S. Kipriyanov, B. Cochlovius, M. Little
In Zusammenarbeit mit: Dr. Gerd Moldenhauer, DKFZ
Um eine höhere Avidität und eine längere in vivo Retentionszeit zu erreichen, haben wir einen tetravalenten bispezifischen „Tandem Diabody“ konstruiert. In vivo Versuche mit dieser innovativen Form eines rekombinanten Antikörpers zeigten klarer Vorteile gegenüber den kleineren
herkömmlichen Diabodys. Wir konnten z.B. eine komplette
Heilung eines menschlichen Burkitt Lymphoms in einem
SCID Mausmodell erreichen.
4) Targeting von Thrombosen mit rekombinanten
Antikörpern
M. Zewe-Welschof, S. Kipriyanov, M. Little
In Zusammenarbeit mit: Prof. Dr. Christof Bode, Dr. Karl-Heinz
Peter und Justin Gräber (Ludolf Krehl Klinik, Univ. Heidelberg)
In einer Zusammenarbeit mit der Gruppe von Prof. Dr.
Bode wurden rekombinante Antikörper gegen Fibrin und
gegen aktivierte Blutplättchen hergestellt. Der Antikörper
gegen Fibrin wurden aus vorhanden Hybridomzellen iso-
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
179
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
liert.. Der Fibrin-Antikörper wurde mit Hirudin fusioniert.
Eine Faktor Xa Spaltstelle zwischen dem Antikörper und
Hirudin ermöglicht, dass das Hirudinmolekül an einer
Thrombose abgespalten wird. Nur das freigesetzte Hirudin
und nicht das Fusionsprotein kann Thrombin inhibieren.
Ein künstlich erzeugter Blutpfropfen konnte mit diesem
Fusionsprotein aufgelöst werden.
[11] Cochlovius, B., Kipriyanov, S.M., Schäfer, H., Moldenhauer,
G., Bähre, A., LeGall, F., Knackmuss, S. and Little, M.: Therapy of
Burkitt’s lymphoma in SCID mice by human PBL in combination
with bispecific CD19xCD3 and CD19xCD16 diabodies. J.
Immunol. In press.
5) Herstellung von menschlichen Immuntoxinen
[13] Kipriyanov, S.M., Cochlovius, B., Moldenhauer, G., Little, M.:
Der bispezifische CD3xCD19 Diabody für die Therapie von B-ZellLymphomen und -Leukämien. In: Kneba, Dreger, Pantel (eds)
Antikörpertherapie in der Hämatologie und Onkologie, Springer
Verlag, Heidelberg (2001).
M. Zewe-Welschof, B. Cochlovius, W. Schmitt,
M. Little
Um nicht-immunogene Immuntoxinen herzustellen, wurde
das Gen für eine humane pankreatische RNase isoliert.
Ein Fusionsprotein des Genprodukts mit einem rekombinanten Antikörper gegen ein internalisierendes Antigen
konnte maligne B-Zellen bei relativ niedrigen Konzentrationen effizient lysieren.
Zusatzfinanzierung: BMBF (1 Wissenschaftler), Mildred Scheel
Stiftung (1 Wissenschaftler), EU (1 Wissenschaftler), Sander Stiftung (1 Wissenschaftler).
Publikationen (* = externe Koautoren)
180
D0500
Rekombinante Antikörper
[1] Schmidt, S., Arndt, M., Braunagel, M., Moldenhauer, G. and
Little, M.: Construction and purification of a single-chain Fv
antibody binding to the T-cell differentiation antigen CD28. J. Int.
Soc. Tumor Targeting 1, 82-89 (2000).
[2] *Peter, K., *Graeber, J., Kipriyanov, S., Zewe-Welschof, M.,
*Runge, M.S., *Kübler, W., Little, M. and *Bode, C.: Construction
and functional evaluation of a single chain antibody fusion protein
with fibrin-targeting and thrombin inhibition after activation by
factor Xa. Circulation 101, 1158-1164 (2000).
[12] Kipriyanov, S.M., Cochlovius, B., LeGall, F., Little, M.:
Recombinant antibody technology for developing diagnostic and
therapeutic products. In: Kieber-Emmons et al (eds) Therapeutic
antibody technology, Marcel Dekker Inc., New York, N.Y. (2000).
[14] Zewe-Welschof, M., Kipriyanov, S.M., Moldenhauer, G.,
Zhang, H., Little, M. and Cochlovius, B.: A recombinant anti-CD5/
human pancreatic ribonuclease immunotoxin for the therapy of Bcell chronic lymphocytic leukemia: evaluation in a preclinical
model.
[15] Stassar, M.J.J.G., Schmitt, W.E., Schlenzka, J., Kipriyanov,
S.M. and Cochlovius, B.: Combined treatment of Burkitt’s
lymphoma with doxorubicin and a CD3xCD19 diabody.
[16] Moehler, T.M., Schlenzka, J., Kipriyanov, S.M., Benner, A.,
Bähre, A., Stassar, M.J.J.G., Schäfer, H.J., Little, M., Ho, A.D.,
Goldschmidt, H. and Cochlovius B.: Synergistic effect of a
recombinant CD3xCD19 diabody and the angiogenesis inhibitor
thalidomide in a preclinical model of B-cell lymphoma.
[17] Schmitt, W.E., Little, M. and Cochlovius, B.: Membraneanchored recombinant anti-phOx single-chain antibodies for
customized cellular tumor vaccines.
[18] Stassar, M.J.J.G., Belharazem, D., Schlenzka, J., Schmitt,
W.E., Beckmann, I., Bähre, A. and Cochlovius, B.: CD40 Ligandactivated BDCA-2+/BDCA-4+ plasmacytoid dendritic cells display
cytotoxic activity against tumor cells involving Granzyme B.
[3] Cochlovius, B., Kipriyanov, S.M., Stassar, M.J.J.G., Christ, O.,
Schuhmacher, J., Strauß, G., Moldenhauer, G. und Little, M.:
Cure of Burkitt´s lymphoma in SCID mice by T cells, tetravalent
CD3 x CD19 tandem diabody and CD28 costimulation. J.
Immunology 165, 888-895 (2000)
[4] Little, M., Kipriyanov, S.M., F. Le Gall and G. Moldenhauer: Of
mice and men: hybridoma and recombinant antibodies.
Immunology Today 21, 364-370 (2000).
[5] Cochlovius, B., Kipriyanov, S.M., Stassar, M.J.J.G., Schuhmacher, J., Benner, A., Moldenhauer, G. and Little, M.: Cure of
Burkitt´s Lymphoma in severe combined immunodeficiency mice
by T cells, tetravalent CD3 x CD19 tandem diabody, and CD28
costimulation. Cancer Research 60, 4336-4341 (2000)
[6] De Ines, C., Cochlovius, B., Schmidt, S. and Little, M.: A cell
surface-displayed anti c-myc single chain antibody: new
perspectives for the genetic improvement of cellular tumor
vaccines. Cancer Gene Therapy, 1257-1262 (2000).
[7] Schmitt, W.E., Stassar, M.J.J.G., Schmitt, W., Little, M.,
Cochlovius, B.: In vitro induction of a bladder cancer-specific Tcell response by mRNA-transfected dendritic cells. J. Cancer Res.
Clin. Oncol. 127, 203-206 (2001).
[8] Choi, I., de Ines, C., Kürschner, T., Cochlovius, B., Sörensen,
V., Olafsen, T., Sandlie, I and Little, M.: Recombinant chimeric
OKT3 scFv IgM antibodies mediate immune suppression while
reducing T cell activation in vitro. Eur. J. Immunology 31, 94-106
(2001).
[9] Cochlovius, B., Stassar, M.J.J.G., Schreurs, M.W., Benner, A.,
Little, M., and Adema, G.J.: Oral DNA vaccination: antigen uptake
and presentation by dendritic cells elicits protective immunity.
Immunol Letters 80: 89-96 (2002).
[10] Cochlovius, B., Stassar, M.J.J.G., Schreurs, M.W., Benner,
A., Little, M., and Adema, G.J.: Oral DNA vaccination: antigen
uptake and presentation by dendritic cells elicits protective
immunity. Immunol Letters 80: 89-96 (2002).
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
Abteilung D0600
Tumorprogression und Tumorabwehr
Abteilung Tumorprogression und Tumorabwehr (D0600)
Leiterin: Prof. Dr. med. Margot Zöller
Metastasierung
Wissenschaftliche Mitarbeiter
Dr. Eberhard Amtmann
Dr. Margot Brosius (05/00 - 03/01)
Dr. Andreas Claas (05/01 - 12/01)
Dr. Christoph Claas (02/01 - )
Dr. Wolfgang Friebolin (11/01 - )
Dr. Rachid Marhaba
I. Metastasierung-assoziierte
Oberflächenmoleküle auf einem
Pankreaskarzinom der Ratte
M. Herlevsen, M. Zöller
Doktoranden
Mehdi Bourouba (09/00 - )
Peter Engel ( - 09/01)
Mikael Herlevsen ( - 02/01)
Dirk-Steffen Schmidt
Nicole Stroh (02/01 - )
Robert Weth ( - 04/00)
Gerard Devitt (07/00 - )
Frank Fries (09/01 - )
Thibaud Jegou (10/00 - )
Marike Stassar ( - 10/00)
Joachim Wahl (07/01 - )
Daniela Wilms (01/01 - 12/01
Technische Assistenten
Waltraud Baader
Susanne Hummel
Elke Grünewald
Mario Vitacolonna
Sekretariat
Angelika Manz
Das Programm der Abteilung zentriert sich um die Frage
der Tumorprogression. Wir gehen davon aus, dass Metastasierung vornehmlich durch die Aufnahme physiologischer Programme durch maligne transformierte Zellen in
Gang gesetzt wird. Basierend auf dieser Arbeitshypothese
konzentrieren wir uns auf die Identifizierung neuer Metastasierung-assoziierter Moleküle, ihre physiologische Funktion, ihre Involvierung in Programmabläufe und insbesondere ihre Konnektivität und wechselseitige Einflussnahme.
Funktionelle Studien orientieren sich vornehmlich an Programmen der Lymphozytenreifung und -aktivierung. Wir
erwarten, dass die Klärung physiologischer Funktionen
Metastasierung-assoziierter Moleküle neue therapeutische
Möglichkeiten in der Tumortherapie, aber auch bei Knochenmarktransplantation und Autoimmunerkrankungen eröffnet.
Neben diesem Grundlagen-orientierten Programm befassen wir uns mit zwei Therapieoptionen, dem therapeutischen Einsatz Tumor-assoziierter Antigene und der Optimierung einer neuen Platinverbindung. Die immuntherapeutischen Studien, hauptsächlich am Nierenzellkarzinom,
konzentrieren sich auf die Identifikation neuer Nierenzellkarzinom-assoziierter Antigene, auf eine Optimierung von
Vakzinierungsstrategien und auf geeignete Targetierungsprinzipien, die den Aufbau bzw. die Aufrechterhaltung einer effizienten Immunabwehr unterstützen. Um gegebenenfalls einen raschen Transfer in die Klinik zu erleichtern,
werden die Untersuchungen nicht nur in syngenen Tiermodellen sondern auch in der “humanisierten” SCID-Maus
durchgeführt. Darüber hinaus haben wir eine neue Thioplatinverbindung entwickelt, die sich durch eine signifikant
gesteigerte Effizienz bei gleichzeitiger Reduktion der Nebenwirkungen auszeichnet.
In Kooperation mit Dr. M. Schnölzer, Zentrale Proteinanalytik,
DKFZ, Prof. Dr. M. Schwab, Abteilung für Zytogenetik, DKFZ
Zusatzfinanzierung: Tumorzentrum HD/MA
Ausgehend von der Beobachtung, dass ein metastasierendes Pankreaskarzinom der Ratte eine Reihe von Oberflächenmolekülen exprimiert, die zwar auf weiteren metastasierenden Tumoren, nicht aber auf nicht-metastasierenden Tumoren beobachtet werden, haben wir über monoklonale Antikörper neben den bereits bekannten varianten
CD44 Molekülen (CD44v), dem Tetraspanin D6.1A (Homolog von CO-029), einem Urokinase-Rezeptor verwandten
Molekül (C4.4A) und D5.7A, dem Rattenhomolog von EpCAM, inzwischen ein weiteres, auf metastasierenden Tumoren stark überexprimiertes Molekül, B5.5A, kloniert [1].
B5.5A wurde aus Membranpräparationen über Immunadsorption gereinigt und massenspektrometrisch als a6b4
Integrin identifiziert. Wenngleich eine Korrelation zwischen
Überexpression von a6b4 und Metastasierung wiederholt
beschrieben wurde, konnte wir eine solche in unserem
Rattenmodell nicht feststellen. Allerdings beobachteten wir
bei intraperitonealem Tumorwachstum eine massive
Metastasierung in die Leber, sofern die Tumoren neben
a6b4 das Tetraspanin D6.1A überexprimierten. Die Co-Expression von D6.1A und B5.5A war darüber hinaus von
signifikanten Veränderungen des Phänotyps der Zellen
begleitet und von einer gesteigerten Fähigkeit zur Migration [1].
II. Funktionelle Charakterisierung
Metastasierung-assoziierter Moleküle
Variante CD44 Isoformen: Expression und
Funktion
M. Bourouba, P. Engel, R. Marhaba, M. Zöller
In Kooperation mit Prof. P. Herrlich, Institut für Genetik, Universität Karlsruhe, PD Dr. U. Günthert, Basel Institut für Immunologie,
Basel, Schweiz
Zusatzfinanzierung: DFG, Sander-Stiftung, Tumorzentrum HD/MA
In den letzten Jahren haben wir uns mit Untersuchungen
zur physiologischen Funktionen von CD44v3, -v6, -v7 und
-v10 im Kontext von Lymphozytenreifung, -aktivierung und
-migration befasst, da diese Isoformen offensichtlich unterschiedliche Funktionen erfüllen.
CD44v3
Im Kontext mit der Tumorprogression konnte eine Korrelation zwischen der Metastasierungstendenz maligner Melanome und der Expression von CD44v3 beobachtet werden [2]. Auf hämatopoetischen Zellen wird CD44v3 auf einem Subset CD4+ T-Zellen, auf Monozyten, B-Zellen und
dendritischen Zellen (DC), aber auch auf aktivierten
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
181
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
Endothelzellen exprimiert. Wir haben Evidenzen, dass
CD44v3 auf Monozyten als kostimulatorisches Molekül
agieren kann [3]. Daneben ist CD44v3 hautsächlich in die
Leukozytenwanderung, vornehmlich in die Haut, involviert
[4]. Dem entspricht eine hohe Expressionsdichte von
CD44v3 auf allergisch- und autoimmun-bedingten Leukozyteninfiltraten sowie der Befund, dass bei einer experimentel-induzierten allergischen Reaktion vom verzögerten
Typ (DTH) die Extravasation von Leukozyten durch einen
CD44v3-spezifischen Antikörper nahezu vollständig unterbunden werden konnte [5]. CD44v3 ist die einzige CD44
Isoform mit einer Heparinseitenkette und es wurde beschrieben, dass CD44v3 als membranständiges Proteoglykan als Fängermolekül für eine Reihe von Zytokinen
und Chemokinen agiert. Da sich die Bedeutung von
CD44v3 für die Extravasation von Leukozyten sehr wohl
über eine lokale, CD44v3-vermittelte Konzentrierung von
Chemokinen erklären liesse, untersuchen wir z.Zt. mittels
eines CD44v3-Rezeptorglobulins mögliche CD44v3
Liganden zu identifizieren (P.Engel et al., in Vorb.).
182
CD44v10
CD44v10 ist eine weitere CD44 Isoform die vornehmlich
auf Makrophagen und DC exprimiert wird. Es gibt Hinweise für eine Involvierung von CD44v10 in den Prozess
der B-Zellreifung und -Aktivierung [6,7]. Daneben und
hauptsächlich ist CD44v10 für die Anreicherung von
Makrophagen in DTH Reaktionen von Bedeutung. Entsprechend können diese pathologischen Reaktionen
durch anti-CD44v10 Antikörper effizient unterbunden werden. Dies gilt auch für die Induktion einer Alopecia areata,
die als eine dermatologische Autoimmunerkrankung eingestuft wird [8,9]. Eine mögliche Erklärung für diese Befunde bietet die Bindung von CD44v10 an Osteopontin.
Osteopontin wurde bereits vor einigen Jahren als Ligand
von CD44 beschrieben. Wir konnten nun nachweisen,
dass Osteopontin ausschliesslich an CD44v10 bindet Daneben haben wir Hinweise, dass CD44v10 auch einen
membranständigen Liganden erkennt, der auf Monozyten
und Stromazellen im Knochenmark exprimiert wird. Die
Identifizierung dieses membranständigen Liganden ist z.
Zt. in Bearbeitung (P.Engel et al., in Vorb.).
CD44v6 and CD44v7
Wie bereits erwähnt beruht unser Interesse an varianten
CD44 Isoformen auf der Beobachtung, dass durch die
Transfektion von CD44v cDNA Metastasierung induziert
und Metastasierung durch CD44v6-spezifische Antikörper
blockiert werden kann. Die Tatsache, dass CD44v6 und
CD44v7 auch transient während der Hämatopoese und
während der Lymphozytenaktivierung exprimiert werden,
bot uns ein physiologisches Modell um das Wirkrpinzip
dieser CD44 Isoformen zu untersuchen. Neben der Etablierung von Antikörpern und Rezeptorglobulinen, hat die
Bereitstellung von transgenen Mäusen, die Ratten
CD44v4-v7 ausschliesslich auf Thymozyten und reifen TZellen exprimieren (P. Herrlich, Institut für Genetik, Universität Karlsruhe) und von Mäusen mit einer targetierten
Deletion von CD44v7 bzw. von CD44v6 und CD44v7 (U.
Günthert, Basel Institut für Immunologie) unsere Arbeiten
wesentlich erleichtert.
Abteilung D0600
Tumorprogression und Tumorabwehr
CD44v6 wird auf frühen hämatopoetischen Progenitorzellen, wobei wir noch nicht sicher wissen, ob dies die eigentliche Stammzelle einschliesst, und auf frühen Thymozyten
exprimiert [10]. Untersuchungen zum Homing von Stammzellen haben gezeigt, dass CD44v6, im Gegensatz zur
Standardform von CD44, an diesem Prozess nicht beteiligt
ist [11]. Hingegen ist CD44v6 an der Thymozytenreifung
beteiligt. Dies konnte durch Antikörperblockade und den
Einsatz CD44v4-v7 transgener bzw. CD44v6/v7 defizienter Mäuse gezeigt werden. CD44v6 unterstützt und beschleunigt den Prozess der Thymozytenreifung und damit
den Prozess der Induktion von Toleranz. Die funktionelle
Relevanz dieser Beobachtung liess sich insbesondere bei
einer allogenen Knochenmarkrekonstitution im nichtmyeloablativ konditionierten Wirt belegen [11]. Um die
supportive Funktion von CD44v6 bei der T-Zellreifung weiter abzuklären untersuchen wir z. Zt. welche Signaltransduzierenden Moleküle über CD44v6 aktiviert werden
und worauf die unterschiedliche Aktivierung Signal-transduzierender Moleküle über CD44s und CD44v6 beruht,
obgleich sich die intrazytoplasmatischen Anteile dieser
beiden CD44 Isoformen nicht unterscheiden (R.Marhaba
et al., in Vorb.).
CD44v7 wird auf Subpopulationen von Knochemarkzellen,
die wir noch nicht genau definieren konnten, und auf Stromazellen des Knochenmark exprimiert [10]. Unsere Untersuchungen ergaben jedoch keinen Hinweis für eine aktive
Beteiligung von CD44v7 an der Reifung hämatopoetischer
Zellen. Hingegen ist CD44v7 massgeblich an der Adhäsion von Progenitorzellen am Knochenmarkstroma und am
Homing von Stammzellen ins Knochenmark beteiligt. Dies
konnte mittels Antikörperblockade und Mäusen mit einer
targetierten Deletion von CD44v7 nachgewiesen werden
[10]. Hinzukommt, dass sich CD44v7-spezifische Antikörper aufgrund dieser Funktion von CD44v7 in ganz besonderer Weise zur Mobilisation von Stammzellen eignen und
bei einer Mobilisation über anti-CD44v7 keiner der Nachteile beobachtet wird, die beim Transfer von G-CSF mobilisierten Stammzellen beschrieben wurden, z.B. ist die
Wiedererlangung von Immunkompetenz nach dem Transfer über anti-CD44v7 mobilisierter Stammzellen deutlich
kürzer als nach dem Transfer G-CSF mobilisierter Stammzellen [12].
Auf reifen Lymphozyten stellen CD44v6 und CD44v7
Aktivierungsmarker einer Subpopulation von CD8+
(CD44v6) und CD4+ (CD44v7) T-Zellen dar [13]. Wenngleich die Expression von CD44v6 und CD44v7 auf aktivierten Lymphozyten schwach erscheint, konnte die funktionelle Bedeutung dieser Expression überzeugend demonstriert werden. So konnten über CD44v6-spezifische
Antikörper vom T-Helferzell-Typ-1 (TH1)-mediierte DTH
Reaktionen mitigiert werden [13] und der Abstossungsprozess bei einer allogenen Hauttransplantation wurde
durch anti-CD44v6 zusammen mit einer niedrigen Dosis
an Cyclosporin unterbunden. Wir haben keinen Hinweis,
dass über dieses Protokoll Toleranz induziert wurde, da
nach Beendigung der Medikation das Transplantat
abgestossen wurde. Unsere Daten weisen vielmehr darauf
hin, dass über anti-CD44v6 die Phosphorylierung von
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
ZAP70 blockiert wurde und damit die Aktivierung Alloantigen-spezifischer T-Zellen zwar nicht unterbunden aber
signifikant reduziert werden konnte.
Auch anti-CD44v7 interferiert mit dem Aufbau TH1-mediierter DTH Reaktionen. Im Unterschied zu CD44v6 ist
CD44v7 allerdings auch in die Induktion von TH2-mediierten DTH Reaktionen involviert [13]. Am nachhaltigsten
konnte die funktionelle Bedeutung von CD44v7 bei der
Lymphozytenaktivierung jedoch im Modell einer TNBS-induzierten Colitis belegt werden. Die Induktion der in über
90% der Tiere tödlich verlaufenden Erkrankung konnte
durch anti-CD44v7 blockiert werden und eine florierende
Colitis konnte durch anti-CD44v7 geheilt weren. Untersuchungen mit CD44v7 ko Tieren belegten, dass diese Tiere
sich gegenüber der Induktion einer Colitis resistent verhalten und dass Tiere mit einer targetierten Deletion von IL10, die spontan eine Colitis entwickeln, nicht erkrankten,
sofern neben IL-10 auch CD44v7 deletiert war [12]. Aufgrund dieser Befunde bietet sich das Modell der induzierten Colitis an, um das Funktionsprinzip von CD44v7 aufzuklären. Unsere bisherigen Untersuchungen weisen darauf hin, dass CD44v7 auf Monozyten und auf T-Zellen unterschiedliche Funktionen erfüllt. Quervernetzung von
CD44v7 auf Monozyten initiiert die Sekretion von Zytokinen, hauptsächlich von IL-10. Wenn über anti-CD44v7
eine Interaktion zwischen CD44v7 (auf T-Zellen) und Antigen-präsentierenden Zellen (APC) unterbunden wird, geht
dies mit einer Blockade der Aktivierung regulatorischer TZellen einher. Diese Beobachtungen konnten in CD44v7
ko Mäusen bestätigt werden, wobei die Untersuchungen
an den ko Tieren noch einen weiteren Hinweis auf das
Funktionsprinzip von CD44v7 lieferten. In Entzündungsherden von CD44v7 ko Tieren fand sich eine signifiakant
höhere Anzahl apoptotischer Zellen als in Entzündungsherden CD44v7 kompetenter Tiere [14]. Wir interpretieren
diesen Befund in dem Sinne, dass CD44v7 entweder die
Aktivierung apoptotischer Signale inhibiert oder anti-apoptotische Moleküle aktiviert. Inzwischen konnten wir auch
die klinische Relevanz dieses Befundes durch eine Studie
an peripheren Blutlymphozyten (PBL) von Patienten mit
Autoimmunerkrankungen belegen. PBL von Patienten mit
Autoimmunerkrankungen, speziell Morbus Crohn und Colitis ulcerosa, zeigen eine signifikante Erhöhung der
CD44v7 Expression und reagieren bei in vitro Aktivierung
entsprechend den im Mausmodell geschilderten Befunden
[3].
CD44-mediierte Signaltransduktion
Aufbauend auf den geschilderten Befunden haben wir mit
der Analyse CD44-mediierter Signaltransduktion begonnen, wobei wir bei unseren einleitenden Studien mit Antikörpern gearbeitet haben, die alle CD44 Isoformen erkennen. Sobald wir potentielle Liganden für CD44v6 und
CD44v7 identifiziert haben, werden sich Untersuchungen
anschliessen, die es uns erlauben Isoformen-spezifische
Funktionen aufzudecken.
Die Aktivierung von T-Zellen erfordert zwei Signale, wobei
das erste Signal über die Interaktion des T-Zellrezeptor
(TCR) mit dem MHC-Peptidkomplex initiiert wird. Zur Bereitstellung des zweiten Signals bedarf es der Interaktion
Abteilung D0600
Tumorprogression und Tumorabwehr
ko-stimulatorischer Moleküle auf APC (z.B. CD40) mit ihren Liganden auf T-Zellen (z.B. CD40L). In jüngster Zekt
wurde die durch experimentelle Befunde gestützte Hypothese formuliert, dass über die Interaktion der kostimulatorischen Moleküle CD80 / CD86 mit ihrem Liganden,
CD28, keine selektive Signaltransduktionskette aktiviert
wird, vielmehr durch Apposition von Phosphotyrosinkinasen die Aktivierungskaskade, die über die Bindung des
TCR initiiert wird, nachhaltig unterstütz wird und damit der
Schwellenwert an Signalen, der zur Aktivierung benötigt
wird, deutlich sinkt. Wir konnten diesen Befund für CD44
bestätigen und gleichzeitig nachweisen, dass CD44 auf TZellen als Ligand eines kostimulatorischen Moleküls
agiert. CD44 ist konstitutiv mit den Phosphotyrosinkinasen
lck und fyn assoziiert. Während der T-Zellaktivierung wird
es in den Bereich der immunologischen Synapse rekrutiert, so dass bereits bei einer Besetzung nur weniger TCR
Moleküle ZAP70 rekrutiert wird und in der Folge die bekannte Signaltransduktionskaskade in Gang gesetzt wird,
die Proliferation und Sekretion von Zytokinen einleitet [15].
Wir konnten auch zeigen, dass dieses Wirkprinzip nicht
nur bei der Aktivierung von T-Zellen zum Tragen kommt,
vielmehr über einen entsprechenden Mechanismus Aktivierung-induzierter Zelltod eingeleitet werden kann [15].
Wie bereits erwähnt, erfordert dieses Funktionsprinzip von
CD44, dass eine Umverteilung von CD44 in der Zellmembran stattfindet, die zu einer selektiven Anreicherung im
Bereich von Glykolipid-reichen Mikrodomänen, den sog.
“rafts” führt. Wir konnten dies experimentell bestätigen und
zeigen, dass die Anreicherung von CD44 in “rafts” von einer Polymerisierung des Aktinzytoskeletts begleitet wird,
wobei Rac als Linkerprotein benötigt wird [16]. Wie bereits
erwähnt, untersuchen wir nun, welche dieser Prozesse für
alle CD44 Isoformen Gültigkeit haben bzw. CD44 Isoformen-spezifisch sind. Wir haben erste Hinweise, dass sich
das Phosphorylisierungsmuster nach Quervernetzung von
CD44v6 von dem nach Quervernetzung von CD44s unterscheidet. Wir haben auch Hinweise, dass dies möglicherweise über eine Assoziation mit unterschiedlichen Linkerproteinen erklärt werden kann (R.Marhaba et al., in Vorb.).
Zwei Aspekte haben in jüngster Zeit wesentlich zum Verständnis der Lymphozytenaktivierung beigetragen, die Klärung des Funktionsprinzips von kostimulatorischen Molekülen und die Definition und Charakterisierung von Membranmikrodomänen. Mit den aufgezeigten Experiment
konnten wir zum einen die akzessorische Funktion von
CD44 bei der T-Zellaktivierung nachweisen, zum anderen
ist es gelungen zumindest einen Pathway aufzuzeigen,
der einen Konnex zwischen der Reorganisation des Zytoskeletts und der Rekrutierung akzessorischer Moleküle im
Bereich der immunologischen Synapse herstellt. Letztlich
haben wir erste Hinweise wie die Selektivität CD44 Isoformen-spezifischer Signaltransduktion zustande kommen
kann. Inwieweit aus diesen Untersuchungen Hinweise für
eine therapeutische Interferenz mit Autoimmunerkrankungen bzw. mit der Metastasierung von Tumoren durch die
Blockade selektiver CD44 Isoformen oder der durch diese
Isoformen aktivierten Signal-transduzierenden Moleküle
abgeleitet werden können, bleibt in weiterführenden Experimenten zu beantworten.
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
183
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
B5.5A (=6>4 Integrin),C4.4A, D5.7A (EpCAM),
D6.1A (CO 029)
A. Claas, F. Fries, T. Jegou, J. Wahl, M. Zöller
In Kooperation mit Dr. M. Schnölzer, Zentrale Proteinanalytik,
DKFZ, Prof. M. Schwab, Abteilung für Zytogenetik, DKFZ, Prof.
Dr. M. von Knebel-Döberitz, Sektion Experimentelle Chriurgie,
Universität Heidelberg, Prof. Dr. W. Tilgen. Dermatologische Klinik
der Universität des Saarland, Prof. U. Weidle, Roche Diagnostics,
Penzberg, Prof. Dr. K. Dano und Prof. Dr. M. Ploug, Finsen Laboratorien, Kopenhagen, Dänemark
Zusatzfinanzierung: DFG, Krebshilfe, Roche Diagnostics, TZ H/M
Unsere Untersuchungen zum Funktionsprinzip dieser vier
Metastasierung-assoziierten Moleküle wurden erst im letzten Jahr begonnen. Das bedeutet, wir sind z. Zt. vornehmlich mit der Etablierung der benötigten Reagenzien
befasst.
184
Das a6b4 Integrin, eine Komponente der Hemidesmosomen, ist als Laminin-Rezeptor bekannt. Man weiss auch,
dass Spleißvarianten der intrazellulären Domänen zur
Phosphorylierung von Signal-transduzierenden Molekülen
beitragen, die Rezeptorlokalisation beeinflussen und Zellproliferation und Migration regulieren. In unserem Modell
erscheint es von besonderer Bedeutung, dass a6b4 mit
Tetraspaninen assoziieren kann [1]. Wir haben Hinweise,
dass diese Komplexe internalisiert werden können und
wesentlich zur Migration der metastasierenden Tumorzellen beitragen (M.Herlevsen, C.Claas et al., in Vorb.).
Inziwschen haben wir das humane Homolog des “neuen”
Metastasierung-assoziierten C4.4A Moleküls kloniert [17].
Das Expressionsprofil im Menschen entspricht dem für die
Ratte beschriebenen. Von den bisher getesteten humane
Tumorlinien haben etwa 50% C4.4A exprimiert. Wichtig erscheint uns auch die Beobachtung, dass Tumorprogression von einer verstärkten Expression von C4.4A begleitet
wird [18]. Da C4.4A auf gesundem Gewebe kaum exprimiert wird, könnte dieses Molekül sowohl diagnostisch als
auch therapeutisch von Interesse sein. Um die Funktionen
des C4.4A Moleküls zu erfassen werden z. Zt. entsprechende Rezeptorglobuline erstellt, die zur Identifikation
des/der Liganden benötigt werden. Da C4.4A auch während der Implantation des Morula hoch exprimiert wird, erwarten wir von einer targetierten Deletion des Moleküls
weiter Information zum Funktionsprinzip. Die entsprechenden Vorarbeiten sind im Gange. Dies gilt auch für Untersuchungen zur Regulation der Expression von C4.4A.
Wenngleich EpCAM bereits in den 80iger Jahren beschrieben wurde, ist die Funktion des Moleküls bisher weitgehend ungeklärt. Unser Interesse basiert vor allem auf der
Beobachtung, dass EpCAM / D5.7A mit weiteren Metastasierung-assoziierten Molekülen assoziiert (siehe folgenden
Abschnitt). Um diese Assoziation genauer zu definieren,
werden z. Zt. Deletionsmutanten der einzelnen Domänen
dieses Moleküls erstellt.
Neben varianten CD44 Isoformen ist für den Metastasierungsprozess mit hoher Wahrscheinlichkeit vor allem das
Tetraspanin D6.1A von essentieller Bedeutung. Tetraspanine sind wichtig für Adhäsion, Migration, Proliferation, Aktivierung, Differenzierung und Metastasierung. Man geht
Abteilung D0600
Tumorprogression und Tumorabwehr
davon aus, dass diese vielfältigen Funktionen auf der Fähigkeit der Tetraspanine beruht, Molekül-Cluster zu bilden,
die neben weiteren Tetraspaninen vor allem Integrine einschließen. Für D6.1A konnten wir bisher neben einer Assoziation mit dem Tetraspanin CD9, eine Assoziation mit
a6b1, a3, und möglicherweise mit a6b4 Integrinen, sowie
eine schwache Assoziation mit D5.7A und CD44 beobachten. Die Identifikation weiterer assoziierender Moleküle erfolgt in Kooperation mit der zentralen Einheit für Proteinanalytik (J.Wahl et al., in Vorb.). Von besonderem Interesse für die Funktion von Tetraspaninkomplexen ist ihre
Lokalisation in bestimmten Membransubdomänen, den
sog. “Lubrol rafts”. Die Phosphatidyl-Inositol-4-Kinase ist
eine Komponente von Tetraspaninkomplexen. Wenngleich
Tetraspaninkomplexe auch ausserhalb von “Lubrol rafts”
gefunden werden, wird die enzymatische Aktivität Tetraspaninkomplex-assoziierter Phosphatidyl-Inositol-4-Kinase
essentiell vom Membranmikroenvironment bestimmt [19].
Da die Phosphatidyl-Inositol-4-Kinase die Produktion von
Phosphatidylinositol-4,5-biphosphat katalysiert, das seinerseits ein Substrat einer Reihe von Signal-transduzierenden Molekülen darstellt, erfordert dieser Befund unsere
weitere Beachtung.
III. Konnektivität Metastasierung-assoziierter
Moleküle
C. Claas, D-S. Schmidt, M. Zöller
Zusatzfinanzierung: DFG
Die Überexpression der 5 beschriebenen Metastasierungassoziierten Moleküle wurde auf einer Reihe metastasierender Tumoren unterschiedlichen Ursprungs beobachtet.
Es gibt zumindest zwei Möglichkeiten diese konzertierte
Expression zu erklären: i. Die Expression dieser Moleküle
wird über ein Gen reguliert; ii. Die Koexpression dieser
Moleküle ist erforderlich, damit eine Tumorzelle alle Schritte der Metastasierungskaskade durchlaufen kann. Unabhängig davon, ob die konzertierte Expression dieser Moleküle auf die Aktivierung eines „Master-Gens“ zurückzuführen ist oder auf einem Selektionsprozess beruht, besteht
die Möglichkgit einer wechselseitigen Einflussnahme der
funktionellen Aktivitäten dieser 5 Moleküle in dem Sinne,
daß die Funktion der einzelnen Moleküle durch die Assoziation mit den weiteren Molekülen verändert wird. Wir haben eine Reihe von Evidenzen, die diese Arbeitshypothese unterstützen. Das Tetraspanin D6.1A assoziiert mit dem
Tetraspanin CD9, den Integrinen a6b1 und a3b1, mit
D5.7A (EpCAM), CD44 und weiteren noch zu identifizierenden Membranmolekülen; C4.4A kann mit Integrinen assoziieren; variante CD44 Isoformen assoziieren mit den
Tetraspaninen CD9 und D6.1A sowie mit D5.7A (D-S.
Schmidt et al., in Vorb.); Nur in Assoziation mit Tetraspaninen nimmt a6b4 Einfluss auf die Zellmigration; Eine Assoziation dieser Moleküle wird vornehmlich in „Lubrol rafts“
beobachtet (C. Claas et al., in Vorb.), die als Plattform für
die Signaltransduktion angesehen werden; Im Hinblick auf
die Metastasierung unterscheiden sich die funktionellen
Aktivitäten von C4.4A, D6.1A und insbesondere von a6b4
sofern diese Moleküle im Kontext mit bzw. unabhängig von
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
weiteren Metastasierung-assoziierten Molekülen exprimiert werden.
Wir haben 5 Membranmoleküle definiert, die in den
Prozess der lymphatischen Metastasierung involviert sind:
Ein Zell-Zell-Adhäsionsmolekül (D5.7A), zwei Zell-MatrixAdhäsionsmoleküle (CD44v und a6b4), C4.4A, das möglicherweise in die Gruppe der Matrix-degradierenden Enzymsysteme einzureihen ist, und ein Tetraspanin. Von allen diesen Molekülfamilien ist bekannt, dass sie am Prozess der Metastasierung beteiligt sein können. Wir gehen
davon aus, dass es nicht die einzelnen Moleküle sind, die
dabei einen wesentlichen Beitrag leisten, sondern vielmehr ihre konzertierte Aktion und wechselseitige Einflussnahme. Wir prüfen daher, inwieweit diese Moleküle miteinander interagieren und inwieweit durch eine solche Interaktion das Funktionsprinzip der einzelnen Moleküle moduliert wird. Wir erwarten, dass die Aufschlüsselung konzertierter Aktivitäten dieser Moleküle massgeblich zum Verständnis der Mechanismen der Tumorprogression beitragen wird.
Tumor Diagnostik und Tumortherapie
I. Eine neue Thioplatinverbindung
E. Amtmann, W. Fribolin
In Kooperation mit G. Schilling, Chemisches Institut, Universität
Heidelberg
Zusatzfinanzierung: Antisoma
Wenngleich seit Jahrzehnten in der Klinik etabliert, konnte
das molekularen Wirkprinzip von Zytostatika häufig noch
nicht voll aufgeklärt werden. Unsere Erfindung einer neuen Platinverbindung basiert auf unseren Arbeiten zur
Funktion von Phospholipase C sowie einer neutralen
Sphinomyelinase, deren Blockade sich in der Therapie
des septischen Schocks als hoch effizient erwies [20]. Bei
einer Klasse der eingesetzten Inhibitoren, Dithiokarbonsäuren, beobachteten wir eine explizite Abhängigkeit funktioneller Aktivität von einem sauren Milieu. Basierend auf
diesen Befunden haben wir eine antitumoral wirksame
Platinverbindung mit Schwefelkomplexbindung hergestellt
(Thioplatin) [21]. Diese Verbindungen werden pH abhängig aktiviert. Da solide Tumoren ein leicht saures Milieu
aufweisen, ist Thioplatin im Tumor 5-10 mal wirksamer als
im Normalgewebe. Dies hat zur Folge, dass Thioplatin nur
sehr geringe Nebenwirkungen aufweist, insbesondere wird
die bei Cisplatin gefürchtete Knochenmarkdepression
nicht beobachtet. Das DKFZ hat inzwischen mit Antisoma,
London, einen Kooperationsvertrag zur klinischen Weiterentwicklung von Thioplatinverbindungen abgeschlossen.
Mit den klinischen Studien soll im Sommer 2002 begonnen werden. Unser Ziel ist die molekulare Definition der
pH-Abhängigkeit von Thioplatinverbindungen. Darüber
hinaus werden wir die selektiven DNA-Bindungsstellen
von Thioplatin charakterisieren. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen werden eine gezielte Optimierung von
Thioplatinverbindungen erlauben.
Abteilung D0600
Tumorprogression und Tumorabwehr
II. Immuntherapie
Nierenzellkarzinom-assoziierte Antigene
G. Dewitt, M. Zöller
In Kooperation mit Prof. Dr. Richard Hautmann, Urologische Klinik, Universität Ulm
Zusatzfinanzierung: Krebshilfe
Nierenzellkarzinome (RCC) verhalten sich in aller Regel
resistent gegen Chemo- und Strahlentherapie. Da sie in
frühen Stadien weitgehend symptomlos sind, werden sie
häufig erst in fortgeschrittenem Zustand detektiert. Dem
entspricht eine 5 Jahresüberlebensrate von unter 5%.
Immuntherapeutische Ansätze würden eine Alternative
darstellen, zumal man davon ausgehen kann, dass es sich
beim RCC um einen immunogenen Tumor handelt, bei
dem auch - wenngleich selten - Spontanremissionen beobachtet werden. Bisher sind jedoch nur sehr wenige
RCC-assoziierte Antigene bekannt. Wir haben daher in
den letzten Jahren versucht, über suppressive subtraktive
Hybridisierung (SSH) und serologisch nach rekombinanter
Expressionsklonierung (SEREX) weitere immunogene
RCC-assoziierte Antigene zu identifizieren.
Für die SSH wurde normales Nierengewebe und Nierenzellkarzinomgewebe vom gleichen Patienten bzw. einer
Gruppe von Patienten eingesetzt. In einem ersten Screening konnte die differentielle Expression von 9 Genen im
Northernblot verifiziert werden, 7 Gene, u.a. MAGE-9 waren bekannt. Mit einer weiteren Probe von Tumor- / Normalgewebe konnte die Überexpression von weiteren 17
Genen im Tumorgewebe nachgewiesen werden. Die Untersuchung von 35 Paaren an Normal- und Tumorgewebe,
um die Frequenz einer de novo Expression bzw einer signifikanten Erhöhung der Expression dieser RCC-assoziierten Gene nachzuweisen, ergab, dass 14 Gene in einem
nennenswerten Prozentsatz bzw. in bis zu über 90% von
RCC überexprimiert werden. Das Screening eines Filterarrays mit bekannten Tumor-assoziierten Genen bestätigte die Überexpression von 3 Genen und ergab darüberhinaus eine Überexpression von 3 weiteren Genen. Die
Expression einiger Gene korreliert mit dem histologischen
Typ. Eine Korrelation zum Differenzierungsgrad konnte
nicht beobachtet werden [22,23]. Insgesamt lässt sich jedoch feststellen, dass mit Ausnahme von MAGE-9 und
möglicherweise von Semaphorin G die Expression dieser
Gene eher in Bezug zur Tumorprogression als zur Immunogenität des Tumors steht. Wir haben daher begonnen
die Seren von Patienten mit RCC mittels der SEREX Methode auf die Präsenz hoch-avider Antikörper mit Spezifität
für RCC-assoziierte Antigene zu analysieren.
Das Antikörper-Screening einer Phagenexpressionsbibliothek ergab bisher 5 Klone, von denen einer Homologien
zu EBV aufweist. Zwei weitere Klone zeigen Homologien
zum DNA J-Domänenprotein, das zu den molekularen
Chaperonen zählt, bzw. zu einem Aktin-assoziierten Filamentprotein. Bei einem dritten Klon haben wir Hinweise
für eine Translokation zwischen Chromosom 3 und 12, die
bei RCC bereits wiederholt beschrieben wurde. Wir erwarten, dass insbesondere dieser Klon für ein immunogenes
RCC-assoziiertes Antigen kodiert. Ein zweites SEREX
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
185
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
Screening einer Expressionsbibliothek eines weiteren
RCC ist in Bearbeitung [24, G.Dewitt et al., in Vorb.].
Parallel mit diesen Untersuchungen laufen die Arbeiten
zur Klonierung der beschriebenen neu definierten Gene
sowie erste Untersuchungen zum Nachweis der Immunogenität dieser RCC-assoziierten Moleküle (siehe nachfolgendes Kapitel).
Optimierung von Vakzinierungsstrategien in
der Therapie solider Tumoren
(Nierenzellkarzinom)
N. Stroh, D. Wilms, M. Zöller
In Kooperation mit Dr. M. Görner und Dr. T. Luft, Medizinische Klinik V, Universität Heidelberg, Prof. R. Haas, Klinik für Hämatologie und Onkologie, Universität Düsseldorf, Prof. S. Matzku,
Merck AG, Darmstadt, Dr. S. Stevanovic, Institut für Zellbiologie,
Universität Tübingen, Dr. J. Hammer, La Roche Inc, Nutley, NJ,
USA
Zusatzfinanzierung: Krebshilfe, Israel-Kooperation, TZ H/M
Modelle zur aktiven Vakzinierung
186
Die Induktion einer Tumor-spezifischen Immunantwort erfordert die Präsentation von Peptiden eines Tumorantigens im Kontext mit MHC Klasse I oder II Molekülen und
ein zweites Signal, das in der Regel über kostimulatorische Moleküle auf Antigen-präsentierenden Zellen initiiert
wird. Die Verfügbarkeit weiterer Mediatoren, z.B. von Zytokinen erleichert und verstärkt den Prozess der T-Zellaktivierung und deren Effektorfunktionen. Die Summe dieser
Voraussetzungen wird in aller Regel von Tumoren und
vom Tumor-tragenden Wirt nicht erfüllt. Deshalb sind supportive Massnahmen, um eine effiziente Anti-Tumor-Immunantwort zu induzieren, unumgänglich. Dies erfolgt entweder über die Modulation der Tumorzelle, um sie mit
Eigenschaften einer Antigen-präsentierenden Zelle auszustatten, den passiven Transfer aktivierter Effektorzellen
oder mittels aktiver Vakzinierung. Zur Vakzinierung können
RNS, DNS, Protein oder Peptide eingesetzt werden, die in
“nativer” Form oder “verpackt” appliziert werden. Als Trägersysteme eigenen sich insbesondere dendritische Zellen
(DC) oder - beim Einsatz von DNS - transformierte und
attenuierte Bakterien, z.B. Salmonellen. Da die klinischen
Erfolge bisher weit hinter den Erwartungen zurückbleiben,
ist es keine Frage, dass weitere experimentelle Studien
notwendig sind, um Vakzinierungsprotokolle in der Tumortherapie zu verbessern [25,26]. Wir haben uns auf Modelle
der aktiven Vakzinierung mittels DC und attenuierter Salmonellen (SL) konzentriert und dabei insbesondere die
Vor- und Nachteile einer Helfer-T-Zell (TH)-orientierten
Vakzinierung untersucht. Als Adjuvantien wurden Antikörper-Zytokin-Fusionsproteine eingesetzt. In jüngster Zeit
widmen wir uns insbesondere der Verbesserung von Verfahren der allogenen Knochenmarktransplantation nach
nicht-myeloablativer Konditionierung, da wir davon ausgehen, dass die allogene Rekonstitution eine optimale
Plattform für aktive Vakzinierung bei Tumorpatienten darstellt.
In ersten Vakzinierungsstudien haben wir uns mit der Vakzinierung mit transformierten Tumorzellen, die entweder
Abteilung D0600
Tumorprogression und Tumorabwehr
ein Surrogat-Tumorantigen [27] oder MHC Klasse II Moleküle und B7 als kostimulatorisches Molekül [28] exprimierten befaßt. Bei den letztgenannten Untersuchungen wurde
die murine Nierenzellkarzinomlinie RENCA eingesetzt.
Wenngleich wir in eingeschränkter Form eine Protektion
durch die Vakzinierung erzielen konnten, war die Effizienz
dieser Vakzinierungsstrategie durch Tumor-mediierte Suppression deutlich eingeschränkt. Wir konnten zeigen, dass
RENCA Zellen nicht direkt suppressiv sind, aber die Aktivierung einer Population von NK1.1+/CD3+ Lymphozyten
in Gang setzen, die die Induktion einer Immunantwort, vornehmlich über die Depletion von TH Zellen, unterdrückt
[28]. Die Aktivierung dieser immunsuppressiven T-Zellen
konnte verhindert werden, wenn das Immunsystem zuerst
mit RENCA Zellen konfrontiert wurde, die MHC Klasse II
und B7 exprimierten. Eine Vakzinierung mit diesen transformierten Tumorzellen nach Applikation nativer RENCA
Zellen, der Situation wie sie in der Kliik angetroffen wird,
war ineffektiv. Es sei an dieser Stelle, auch für die im folgenden skizzierten Studien, vermerkt, dass wir neben diesem Prozess einer aktiven Immunsuppression häufig die
Aktivierung von Tumoreskapemechanismen, wie z.B. den
Verlust von Tumorantigenen oder von MHC Molekülen, beobachteten. Tumoreskape stellt eines der Probleme dar,
von denen bei Tumor-immuntherapeutischen Ansätzen
häufig berichtet wird. Hingegen haben wir, auch wenn
Selbstantigene wie das Melanom-assoziierte Antigen
gp100 eingesetzt wurden, keine schweren Formen von
Autoimmunität beobachtet.
Wie bereits erwähnt, befaßte sich die Mehrzahl unsere
Vakzinierungsstudien mit dem Transfer Protein- oder
Peptid-beladener DC und der oralen Vakzinierung mit
transformierten SL.
Die therapeutische Effizienz einer Vakzinierung mit DC
umfaßte Untersuchungen bei denen die DC mit Protein
oder Peptiden beladen wurden, wobei letztere entweder
an MHC Klasse I oder II Moleküle binden. Da Algorithmen,
die Aussagen über die Bindung von Peptiden in MHC
Klasse II Molekülen erlauben, erst in jüngster Zeit zu
Verfügung stehen, sind bisher kaum experimentelle Daten
verfügbar. Der Einschluß dieses Aspektes war jedoch
wichtig, da in aller Regel die Aktivierung von TH-Zellen
erforderlich ist, um alle Elemente des Immunsystems zu
aktivieren. Da die Effizienz der Induktion einer CTL Antwort bei einer Vakzinierung mit dem Melanom-assoziierten
Antigen gp100 gut charakterisiert ist, bot sich gp100 für
unsere weiterführenden Studien an. Mit dem gp100 Protein beladene DC induzieren in vitro und in vivo vor allem
eine TH-1 Antwort [29]. In der Folge wurden gp100 Peptide untersucht, die mit Wahrscheinlichkeit an MHC II Moleküle binden. Aus einem Panel von 7 Peptiden wurde in
der Regel 1-3 Peptide selektioniert, die zur Aktivierung von
TH-Zellen geeignet erschienen. Dies galt sowohl für PBL
von gesunden Spendern als auch für PBL von Melanompatienten, so dass wir davon ausgehen können, dass der
Tumor keine Toleranz induziert hat. Da zudem die Reaktivität von PBL individueller Probanden mit einem bestimmten Peptid sich als konstanter Faktor erwies und die Selektivität der Bindung definierter Peptide durch in vivo Studien
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
Peritonealzellen
Abteilung D0600
Tumorprogression und Tumorabwehr
phagozytierende Zellen
in der Darmwand
mesenteriale
Lymphknotenzellen
Abb. 1: Expression eines grünen Fluoreszenzproteins auf phagozytierenden Zellen nach oraler Vakzinierung mit transformierten
Salmonellen
in der SCID Maus bestätigt werden konnte, bietet sich ein
in vitro Screening an, das relativ rasch durchgeführt werden kann, um die Peptide für eine Vakzinierung zu selektionieren, die optimal für die Induktion einer TH-Antwort
des individuellen Patienten geeignet erscheinen [30]. Die
mit gp100 erhobenen Befunde konnten mit RAGE-1, einem Nierenzellkarzinom-spezifischen Antigen bestätigt
werden, wenngleich TH-Zellen mit einer niedrigeren Frequenz auf RAGE-1 im Vergleich zu gp100 Peptiden reagieren [31]. In den bisher beschriebenen in vivo Studien
wurden humane PBL und humane Tumoren im SCIDMaus-Modell getestet, das sich in besonderer Weise für
Screeninguntersuchungen eignet. Aufgrund nicht zu vermeidender graft vs host (GvH) Reaktionen bei Langzeitvakzinierungsstudien in der humanisierten SCID Maus,
haben wir in weiterführenden Experimenten zur Optimierung von Vakzinierungsprotokollen auf syngene Maustumormodelle zurückgegriffen.
Die Form des Antigens, das als DNA, RNA oder Protein /
Peptid angeboten werden kann, stellt einen wesentlichen
Faktor der Vakzinierung dar. Alle 3 Formen haben Vorund Nachteile. So bietet sich eine DNA Vazinierung aufgrund der leichten Verfügbarkeit an, ist aber mit dem
Nachteil einer häufig ineffizienten Transkriptionsrate versehen. Das Problem kann durch die Verpackung in geeignete „Trägersysteme vermieden werden, wobei sich u.a.
attenuierte Bakterien anbieten. Es ist bekannt, dass Salmonellen die Darmwand durchwandern und im Peritoneum von Makrophagen phagozytiert werden. Attenuierte
Salmonellen werden auf diese Weise in kürzester Zeit
komplett eliminiert. Wenn diese Bakterien mit einem eukaryotischen Expressionsvektor transformiert wurden, der
z.B. die DNA eines Tumorantigens enthält, wird die DNA
ausschließlich in eukaryotischen Wirtzellen transkribiert
[Darji et al, Cell 91 (1997) 765] (Abb. 1). Wir haben in diesem Kontext 3 Fragen gestellt: i. Stellt die Verpackung von
DNA in attenuierten Salmonellen einen Vorteil bei der
Vakzinierung im Vergleich zu nackter DNA dar? ii. Ist eine
DNA oder eine Protein Vakzinierung effizienter? iii. Ist
auch bei einer DNA Vakzinierung eine Präsentation durch
MHC II Moleküle effizienter und wie kann bei einer DNA
Vakzinierung das translatierte Protein in den MHC II
Präsentationsweg eingeschleust werden?
Der Vergleich einer Vakzinierung mit nackter DNA und
DNA, die in Form transformierter Salmonellen angeboten
wurde, ergab, dass beide Vakzinierungsschemata geeignet erschienen, um das Tumorwachstum zu verzögern. Allerdings zeichnete sich die Vakzinierung mit transformierten Salmonellen durch eine signifikant gesteigerte Effizienz aus, die durch eine überwiegende Aktivierung von
CTL charakterisiert war. Die Vakzinierung mit nackter DNA
war hauptsächlich von einer unspezifischen Aktivierung,
vermutlich aufgrund von DNA Sequenzen mit bekanntem
adjuvantem Effekt, begleitet. Die Effizienz einer Vakzinierung mit Protein-beladenen DC übertraf jedoch die Effizienz der Vakzinierung mit transformierten Salmonellen [32].
Ex vivo Untersuchungen wiesen darauf hin, dass der Vorteil der Proteinvakzinierung auf die präferentielle Aktivierung von TH-Zellen zurückzuführen war. Deshalb wurden
in einer weiteren Studie Salmonellen mit einem eukaryotischen Expressionsvektor transformiert, in den die DNA
des Tumorantigens mit der DNA eines Fragmentes der invarianten Kette als Fusionsprodukt integriert war. Die invariante Kette ist wesentlich an der Einschleusung von Proteinen in den MHC II Präsentationsweg beteiligt. Wir konnten in der Tat zeigen, dass eine Vakzinierung mit diesen
Zahl der überlebenden Tiere
12
Kontrolle
SL Vakzinierung
SL-gp100 Vakzinierung
SL-gp100/Ii Vakzinierung
10
8
6
4
2
0
20
40
60
80
100
120
140
Tage nach subkutaner Tumorzellapplikation
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
Abb. 2: Protektion und Verlängerung der Überlebenszeit durch Vakzinierung mit
transformierten Samonellen
SL: SL transformiert mit leerem Vektor,
SL-gp100: SL transformiert
mit der cDNS des
Melanomantigens gp100,
SL-gp100/Ii: SL transformiert mit chimärer DNS aus
gp100 und einem Bruchstück der invarianten Kette
187
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
Salmonellen zur Aktivierung von TH-Zellen geeignet ist. Im
Hinblick auf Überlebenszeit und Abstossungsrate lieferte
dieses Vakzinierungsprotokoll die bisher überzeugendsten
Ergebnisse [33] (Abb. 2). Wir konnten die Effizienz dieses
Vakzinierungsverfahrens in einer Reihe von Tumormodellen wiederholen, wobei allerdings vermerkt werden sollte,
dass wir in einem Leukämiemodell mit der Induktion von
Toleranz konfrontiert wurden. Inwieweit dieser Befund Modell-bezogen oder generell bei Leukämien zu beobachten
ist, bleibt zu untersuchen [32-34]. Davon unabhängig erscheint uns im Augenblick eine Tumorvakzinierung mit
transformierten Salmonellen als äußerst vielversprechend.
Adjuvante Tumortherapie
188
Aufgrund der speziellen Eigenschaften der Mehrzahl von
Tumoren sowie des Immunstatus im Tumorpatienten ist es
nicht nur notwendig, über eine Vakzinierung die Induktion
einer Immunantwort in Gang zu setzen, vielmehr ist es
häufig erforderlich durch ein geeignetes Adjuvant den Aktivierungsstatus von Immuneffektorzellen aufrecht zu erhalten. Die Targetierung von Effektorzellen in den Tumor stellt
einen weiteren Problemkreis dar, der selektiv unterstützt
werden sollte. Antikörper, Antikörper-Zytokin-Fusionsproteine und Antikörper-Chemokin-Fusionsproteine werden
häufig eingesetzt, um diese Probleme in der Tumortherapie zu beheben. Wir haben uns in der Berichtsperiode vornehmlich mit dem Einsatz von Antikörper-Zytokin-Fusionsproteinen befaßt, wobei zwei Zytokine, IL-2 und TNF, zum
Einsatz kamen, die beide als Fusionsprodukt mit einem
anti-EGFR-Antikörper vorlagen. Als Modell diente wiederum die humanisierte SCID Maus, der ein humanes Melanom implantiert wurde. Wir konnten zeigen, dass mittels
der Zytokin-Antikörper-Fusionsproteine eine äußerst effiziente Targetierung der humanen Effektorzellen erzielt
werden kann. Darüberhinaus gelang es mittels des IL-2
Fusionsproteins eine Aktivierung von TH-Zellen in Gang
zu setzen, die ausreichte um sowohl zytotoxische T-Zellen
als auch Elemente der natürlichen Immunabwehr zu rekrutieren. Das TNF-Antikörper-Fusionsprotein war speziell bei
intratumoraler Applikation therapeutisch effektiv. Dies ließ
sich durch den Wirkmechanismus, d.h. eine in loco Aktivierung zytotoxischer T-Zellen erklären [35,36]. Diese Ergebnisse sind vielversprechend und wir werden diesen adjuvanten Therapieansatz im Kontext einer aktiven Vakzinierung weiter verfolgen.
Allogene Stammzelltransplantation in der
Therapie solider Tumoren
Die allogene Stammzelltransplantation wird als ein potentiell kuratives Verfahren nach Ausschöpfung aller konventionellen Therapiestrategien erachtet. Aufgrund der hohen
Toxizität der myeloablativen Konditionierung konnte dieses
Verfahren über lange Zeit nur sehr begrenzt eingesetzt
werden. Erst seit wenigen Jahren ist bekannt, dass eine
allogene Knochenmarktransplantation auch nach nicht
myeloablativer Konditionierung vorgenommen werden
kann. Dies erweitert in ganz erheblichem Maße das mögliche Patientenkollektiv. Das Problem der „graft vs host“ Reaktionen (GvHD) bleibt allerdings bestehen. Weiterhin
muss die Frage geklärt werden, wie eine „graft vs tumor“
(GvT) Reaktion bei einer Reduktion von GvHD aufrechterhalten werden kann. Letztlich ist bei einer nicht-myelo-
Abteilung D0600
Tumorprogression und Tumorabwehr
ablativen Vorbehandlung auch mit „host vs graft“ Reaktionen (HvGD) zu rechnen. Es ist bekannt, dass sowohl
zytotoxische T-Zellen (CTL) als auch NK-Zellen an GvHD
und HvGD beteiligt sind.
Unsere früheren Studien zur allogenen Knochenmarktransplantation haben sich vornehmlich mit der Modulation
von CTL Reaktionen über die Blockade kostimulatorischer
Moleküle, u.a. CD44v6, befaßt. Über diese Untersuchungen wurde bereits im Kontext der Metastasierung-assoziierten Moleküle berichtet. An dieser Stelle sei nur auf zur
Zeit laufende Untersuchungen verwiesen, in denen wir die
Möglichkeit einer aktiven Vakzinierung nach allogener
Stammzelltransplantation des nicht-myeloablativ konditionierten Wirts untersuchen. Bislang konnten wir zeigen,
dass durch eine NK-Zell-Depletion des Wirts die Angehrate eines T-Zell-depletierten Transplantates signifikant
verbessert werden kann. Wenngleich dieses Vorgehen mit
einer verlängerten Phase der Immuninkompetenz belastet
ist, konnte so GvHD deutlich abgeschwächt werden.
Wesentlich ist vor allem, dass bei diesem Protokoll DonorT-Zellen im Wirt reifen und damit tolerant gegen den Wirt
sind. Unsere Befunde weisen darauf hin, dass - ungeachtet der Induktion von Toleranz gegenüber dem Wirt - diese
T-Zellen den Tumor als fremd erkennen. Die Weiterführung dieser Studien ist z.Zt. eines unserer zentralen Anliegen. Wenn wir bestätigen können, dass allogene T-Zellen
nach Etablierung von Chimerismus Tumor-assoziierte Antigene als fremd erkennen, bietet eine allogene Stammzelltransplantation unter den genannten Konditionierungsbedingungen die optimale Plattform für aktive Vakzinierung
in der Tumortherapie [37,38].
Ich möchte die Folgerungen aus unseren bisherigen Vakzinierungsstudien kurz zusammenfassen: i. Es erscheint
wesentlich, dass das Antigen in einer Form angeboten
wird, die zur Präsentation im Kontext mit MHC II geeignet
ist; ii. Eine Vakzinierung mit attenuierten Salmonellen führt
zu einer sehr effizienten Präsentation des Tumorantigens
durch Makrophagen und DC und ist zudem vergleichsweise leicht zu handhaben und kostengünstig; iii. Antikörper-Zytokin-Fusionsproteine erweisen sich sowohl für die
Targetierung von Effektorzellen als auch zur Aufrechterhaltung des Aktivitätszustandes als geeignet; iv. Eine allogene Stammzelltransplantation nach nicht-myeloablativer
Konditionierung stellt möglicherweise die optimale Voraussetzung für eine aktive Tumorvakzinierung dar, da die im
Wirt gereiften und somit gegenüber dem Wirt toleranten TZellen Tumorantigene weiterhin als fremd erkennen; v. Leider wurden wir bei allen Vakzinierungsprotokollen entweder mit Tumoreskapemechanismen oder Gegenattacken
durch den Tumor konfrontiert. Wenngleich wir einige Möglichkeiten sehen, den Tumoreskape zu umgehen, haben
wir bisher noch keine Anhaltspunkte, wie Gegenattacken
des Tumors zu vermeiden sind.
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
Publikationen (* = externer Koautor)
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Abteilung D0600
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vaccination in cancer immunotherapy. Arch Imm Ther Exper, in
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DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
189
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
Klinische Kooperationseinheit D0700
Molekulare Hämatologie / Onkologie
Klinische Kooperationseinheit Molekulare Hämatologie / Onkologie (D0700)
Leiter: Prof. Dr. med. Radek Skoda (02/00 - 12/01)
Das Ziel der Klinischen Kooperationseinheit Molekulare
Hämatologie/Onkologie ist eine Verbesserung der Diagnostik und Therapie maligner Erkrankungen durch einen
schnellen Transfer von Ergebnissen aus der Grundlagenforschung in die klinische Anwendung.
Ein Schwerpunkt der Abteilung beschäftigte sich unter
Prof. Haas mit der Hemmung fehlgesteuerter zellulärer
Genexpression bei hämatologischen und onkologischen
Erkrankungen durch Antisense-Nukleinsäuren und Ribozyme. Antisense-Oligonukleotide werden nun in einer klinischen Pilotstudie zur Behandlung von Patienten mit chronischer myeloischer Leukämie eingesetzt. Um inhibitorische Gene in hämatopoetische Vorläuferzellen einschleusen zu können, wird das Adeno-assoziierte Virus-Vektorsystem (AAV-2) verwendet. Ein weiterer Schwerpunkt besteht in der Gewinnung, Anreicherung und immunologischen sowie molekularbiologischen Charakterisierung
blutbildender Vorläuferzellen. Außerdem sind experimentelle Therapieansätze für die Behandlung maligner B-Zellerkrankungen mit bispezifischen Antikörpern in der Entwicklung.
190
Der Nachfolger von Prof. Haas (1999 Ruf an die Universität Düsseldorf) Prof. Skoda hat einen Ruf an die Universität Basel angenommen.
Die Kooperationseinheit wird seit März 2002 kommissarisch durch Oberarzt Dr. Martin Görner (Abt. Hämatologische Onkologie und Rheumatologie der Medizinischen
Universitätsklinik und Poliklinik Heidelberg) geleitet.
Publikationen (2000) (* = externe Koautoren)
*Lichterfeld, M.; *Martin, S.; *Burkly, L.; Haas, R.; Kronenwett, R.:
Mobilization of CD34(+) hematopoietic stem-cells is associated
with a functional inactivation of the integrin very late antigen-4.
British Journal of Haematology 110 (2000) 71-81.
*Neben, K.; Hohaus, S.; *Goldschmidt, H.; *Egerer, G.; Voso,
M.T.; *Ho, A.D.; Haas, R.: High-dose therapy with peripheralblood stem-cell transplantation for patients with relapsed or
refractory Hodgkins disease - Long-term outcome and prognostic
factors. Annals of Hematology 79 (2000) 547-555.
Steidl, U.; Haas, R.; Kronenwett, R.: Intercellular adhesion
molecule 1 on monocytes mediates adhesion as well as transendothelial migration and can be down-regulated using antisense
oligonucleotides. Annals of Hematology 79 (2000) 414-423.
Voso, M.T.; Martin, S.; Hohaus, S.; *Abdallah, A.; *Schlenk, R.F.;
*Ho, A.D.; Haas, R.: Prognostic factors for the clinical outcome of
patients with follicular lymphoma following high-dose therapy and
peripheral blood stem cell transplantation (PBSCT). Bone Marrow
Transplantation 25 (2000) 957-964.
309.
Voso, M.T.; *Pantel, G.; Weis, M.; Schmidt, P.; Martin, S.;
*Moos, M.; *Ho, A.D.; Haas, R.; Hohaus, S.: In-vivo depletion of
B-cells using a combination of high-dose cytosine arabinoside/
mitoxantrone and rituximab for autografting in patients with nonHodgkins-lymphoma. British Journal of Haematology 109 (2000)
729-735.
*Wenzel, V.; Padosch, S.A.; *Voelckel, W.G.; *Idris, A.H.;
*Krismer, A.C.; *Bettschartwolfensberger, R.; *Lindner, K.H.:
Survey of effects of anesthesia protocols on hemodynamic variables in porcine cardiopulmonary-resuscitation laboratory models
before induction of cardiac arrest. Comparative Medicine Vol 50,
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*Wiestner, A.; Padosch, S.A.; *Ghilardi, N.; *Cesar, J.M.;
*Odriozola, J.; *Shapiro, A.; Skoda, R.C.: Hereditary
thrombocythaemia is a genetically heterogenous disorder:
exclusion of TPO and MPL in two families with hereditary
thrombocythaemia. British Journal of Haematology 110 (2000)
104-109.
Patente
Haas, R.; Kronenwett, R.; *Lichterfeld, M.: AntisenseOligonukleotid zur Hemmung der Expression des Adhäsionsmoleküls very late antigen 4 (VLA-4) in menschlichen Zellen.
DE 198 60 642.7; PCT/EP 99/10387; 2000
Haas, R.; Kronenwett, R.; Patzel, V.; *Steidl, U.; Sczakiel, G.:
Antisens-Nukleinsäuren für die Hemmung der Expression des
Adhäsionsmoleküls ICAM-1. DE 198 44 111.8; PCT/EP 99/
06972;
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
Klinische Kooperationseinheit D0800
Pädiatrische Onkologie
Klinische Kooperationseinheit Pädiatrische Onkologie (D0800)
Leiter: Prof. Dr. med. Klaus-Michael Debatin
Wissenschaftliche Mitarbeiter
Dr. Ingrid Herr1
Dr. Simone Fulda2
Dr. Christian Beltinger2
Dr. Silke Henrich3
Dr. Thomas Böhler2 (- 2000)
Dr. Karsten Stahnke2
Dr. Claudia Friesen3
Dr. Christian Scheuerpflug3
Doktoranden (Medizin und Biologie)
Markus Dechant
Eva Pauly
Eric Meyer3
Anke Schroth3
Stella Okonoyo3
Till Wenger3
Carsten Posovszky2 (- 2000)
MTA
Melanie Motsch1
Tanja Dravits3
Helgard Knauß3
1 = DKFZ
2 = Universitätskinderklinik Ulm
3 = Drittmittel
Die Klinische Kooperationseinheit Molekulare Onkologie/
Pädiatrie hat seit ihrer Etablierung erfolgreich an der Umsetzung molekularer Konzepte der Apoptoseregulation klinischer Orientierung in der pädiatrischen Onkologie und
Hämatologie gearbeitet. Die Forschungsschwerpunkte befassen sich mit Störung von Apoptosesignalwegen bei
lymphoproliferativen Erkrankungen und HIV-Infektion, sowie vor allem mit der Rolle von Apoptosesignalwegen bei
der Chemo- bzw. Radiotherapie-induzierten Apoptose.
Diese Untersuchungen werden jetzt erstmalig in klinische
Studien (Kompetenznetz Pädiatrische Onkologie des
BMBF) zur Analyse von Chemoresistenzmechanismen
eingeführt.
Das Forschungsprogramm der Klinischen Kooperationseinheit konzentriert sich auf die klinischen Implikationen
grundlegender Erkenntnisse zur Regulation von Zelltod
durch Rezeptor-abhängige Signalwege und/oder mitochondriale Faktoren. Die Entwicklung des Forschungsprogramms in den vergangenen Jahren hat gezeigt, dass
Erkenntnisse der Apoptoseforschung in Zellsystemen bei
der Diagnose und Behandlung von Tumorerkrankungen
von Bedeutung sind. Ähnlich wie bei der zellzerstörenden
Wirkung von Zytostatika und Strahlentherapie, sind auch
bei der Ischämie-bedingten Gewebsschädigung Apoptosesignalwege entscheidend für den Zelltod verantwortlich.
Gestörte Apoptosesensitivität oder Apoptoseresistenz
spielt weiterhin eine Rolle bei lymphoproliferativen Erkrankungen, bei der HIV-Infektion, bei Autoimmunerkrankungen und schweren immunologischen Komplikationen im
Rahmen allogener Knochenmarktransplantation.
Kooperationspartner
Intern: Dr. P. Angel, Prof. Dr. P. Krammer, Prof. Dr. M. von
Knebel-Doeberitz, Prof. Dr. Peter Lichter, Dr. J. Mattern, Dr. G.
Moldenhauer, Dr. M. Peter, Dr. R. Ridder, Prof. Dr. M. Schwab, Dr.
H. Walczak, Prof. Dr. M. Wießler.
Extern national: Dr. B. Baumann, Ulm; Prof. Dr. Berthold, Köln;
Prof. Dr. H. Döhner, Ulm; Prof. Dr. V. Ewerbeck, Heidelberg; Dr. J.
Fellenberg, Heidelberg; Prof. Dr. W. Friedrich, Ulm; Prof. Dr. T.
Gress, Ulm; Prof. Dr. T. Herdegen, Kiel; Prof. Dr. G. JankaSchaub, Hamburg; Dr. I. Jeremias, München, Dr. C. Kupatt, München; Prof. Dr. W-D Ludwig, Berlin; Dr. A. Martin-Villalba, Heidelberg; Dr. S. Müller, Ulm; Dr. J. Schenkel, Heidelberg; Dr. A.
Schulz, Ulm; Prof. Dr. M. Weller, Tübingen; Prof. Dr. T. Wirth, Ulm.
Extern international: Prof. Dr. G. Brodeur, Philadelphia, USA;
Prof. Dr. A. Fischer, Paris, Frannkreich; Dr. M. L. Gougeon, Paris,
Frannkreich; Prof. Dr. J. Hickman, Paris, Frannkreich; Dr. G.
Kroemer, Villejuif, Frannkreich, Prof. Dr. G. Melino, Rom, Italien;
Dr. L. Di Marzio, L´Aquila, Italien; Dr. G. Nunez, Ann Arbor, USA;
Prof. Dr. M. Piacentini, Rom, Italien; Prof. Dr. X. Wang, Texas,
USA.
Charakterisierung der Rolle von Apoptosesignalwegen für Sensitivität oder Resistenz
in der Tumortherapie
I. Herr, C. Friesen, E. Meyer, S. Fulda, C. Beltinger,
C. Posovszky, E. Ucur, K. Stahnke
Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe in den letzten Jahren
haben gezeigt, dass die Aktivierung von Apoptosesignal-
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
191
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
192
wegen entscheidend an der Sensitivität oder Resistenz
von Tumorzellen für Chemotherapie oder Radiotherapie
beteiligt ist. Durch zytotoxische Therapie kann Mitochondrien-abhängige Apoptose oder Zelltod durch Todesrezeptor-Signalwege induziert werden. Wir haben verschiedene
Aspekte der Aktivierung solcher Zelltodessignalwege bei
Zytostatika-induzierter Apoptose untersucht. Dabei konnten zelltypspezifische Einflüsse des mitochondrialen und/
oder des Todesrezeptor-Signalwegs identifiziert werden.
Zytotoxische Therapie aktiviert zunächst „zelluläre Stressprogramme“, die, vermittelt z. B. über Jun-Kinasen, zur Aktivierung von Transkriptionsfaktoren und zur Genexpression führen. Die gesteigerte Expression Apoptose-induzierender Gene ist ein wichtiger Faktor für Apoptosesensitivität. Durch zellulären „Stress“ induzierte Todesliganden
können an ihre Rezeptoren binden und pro-apoptotische
Moleküle können die Freisetzung apoptogener Faktoren
aus Mitochondrien induzieren. In den meisten Fällen Zytostatika-induzierter Apoptose findet sich eine parallele Aktivierung von Todesrezeptor und mitochondrialen Signalwegen. In ähnlicher Weise wie zytotoxische Therapie durch
Zytostatika führt auch die Suizidgentherapie zur Apoptose.
Defizienzen in Apoptosesignalwegen reduzieren den Effekt eines Suizidgentransfersystems wie Herpes simplex
Thymidinkinase/Gancyclovir. Dies könnte eine Erklärung
für das gegenwärtige generelle Versagen der Suizidgentherapie z. B. in der Behandlung von Hirntumoren sein.
Eine detaillierte Analyse des Zusammenspiels von mitochondrialen und Zelltodesrezeptor-Signalwegen zeigte
darüber hinaus, dass beide Signalwege sich gegenseitig
beeinflussen können. So führt Stimulation von Todesrezeptoren wie CD95 zu einem „auto amplification loop“, der
durch Aktivierung des Stresssignalwegs die verstärkte Produktion von CD95 Ligand und anderen pro-apoptotischen
Faktoren induziert.
Sensitivierung für Zytostatika-induzierte
Apoptose durch mitochondriotrope
Zytostatika (Betulinsäure) und Gentransfer
S. Fulda, C. Friesen, E. Meyer, I. Herr, E. Ucur,
S. Okonoyo
Veränderungen mitochondrialer Funktionen sind entscheidend für die Apoptose-Auslösung. Wir haben in Tumorzellen, in denen Zelltodessignalwege inhibiert sind, neue
Substanzen identifiziert, die über den mitochondrialen
Signalweg Zytotoxizität vermitteln können. Betulinsäure
und ihre Derivate sind in der Lage, auch Zellen mit mutiertem p53 in vitro zu eliminieren. Die Untersuchungen zur
Betulinsäure-vermittelten Apoptose-Induktion wurden zwischenzeitlich an Primärmaterial von Patienten mit Hirntumor durchgeführt und zeigen eine gute in vitro Aktivität gegen ein breites Spektrum von neuroektodermalen Tumoren. Vorläufige in vivo Experimente in Xenotransplantatmodellen zeigen darüber hinaus eine in vivo Wirksamkeit
bei tolerabler Toxizität.
Die Untersuchungen zur Überwindung von Apoptoseresistenz konzentrieren sich insbesondere auf neuroektodermale Tumoren, bei denen ein grosser Anteil eine primäre
Klinische Kooperationseinheit D0800
Pädiatrische Onkologie
Apoptoseresistenz, z. B. für Apoptoseinduktion über den
Todesliganden TRAIL zeigt. Dabei zeigte sich, dass ein
Teil der resistenten Tumoren eine deutlich reduzierte Caspase-8 Expression durch Hypermethylierung des Caspase-8 Promoters aufweist. Gentransferstrategien mit retroviralen Caspase-8 Konstrukten oder Demethylierung der
regulatorischen Sequenzen des Caspase-8 Gens durch
Azacytidin konnte die Apoptoseresistenz dieser Zellen
überwinden. Die Untersuchungen wurden primär an Zelllinien von Patienten mit neuroektodermalen Tumoren
durchgeführt, dann jedoch auch an Tumorproben überprüft, die von Patienten mit neuroektodermalen Tumoren
stammen, die im Rahmen multizentrischer Studien behandelt werden. Auch dabei zeigte sich ein hoher Prozentsatz
an reduzierter Caspase-8 Expression durch Hypermethylierung regulatorischer Promotersequenzen. Weiterhin
konnten Defekte in Apoptosesignalwegen durch gesteigerte Expression von inhibitorischen Molekülen, wie c-FLIP
identifiziert werden.
Da in vielen der resistenten Tumoren die Expression
apoptosefördernder Moleküle, wie Todesliganden oder
Caspasen, inhibiert ist, haben wir Strategien entwickelt,
um die defiziente Expression pro-apoptotischer Moleküle
in Tumoren in Modellsystemen zu überkommen. Hierzu
wurden verschiedene Vektorkonstrukte, z. T. konditionell
reguliert (Tetracyclinsystem), entwickelt, die in Tumorzellen eingebracht werden können. Mit Hilfe dieser Konstrukte konnte die Zytostatikaresistenz Caspase-8 defizienter
Tumorzellen überwunden werden. Die Restauration des
defizienten Stresssignalwegs in Tumorzellen konnte ebenfalls durch Transfer Apoptose-induzierender Gene ausgeglichen werden. Durch konditionelle Expression von TRAIL
konnten Effektorzellen hergestellt werden, die u. U. spezifisch Tumorzellen erkennen und durch Tetracyclin-induzierte Expression von TRAIL diese dann in vivo abtöten
können. Mit dieser Strategie kann das Problem umgangen
werden, dass der Gentransfer von Todesliganden in vivo
wahrscheinlich nicht in einem ausreichenden Prozentsatz
von Tumorzellen gelingen wird.
CD95 Mutationen bei akuter lymphatischer
Leukämie (ALL) und autoimmunlymphoproliferativem Syndrom (ALPS)
C. Scheuerpflug, C. Beltinger,T. Böhler,
C. Posovszky, M. Dechant, E. Pauly
In Vorarbeiten haben wir Mutationen im CD95 Rezeptor
bei T lineage ALL und B lineage ALL bei pädiatrischen Patienten untersucht. Die Frequenz dieser Mutationen war,
verglichen mit publizierten Frequenzen z. B. bei nonHodgkin-Lymphomen des Erwachsenen, relativ gering.
Zum Mutationsscreening wurde eine SSCP Methode entwickelt, die jedoch nur 90% der Mutationen entdecken
konnte. Mit direkter Sequenzierung des CD95 Gens über
genomische DNA wurden auch Mutationen bei Patienten
mit ALPS identifiziert. Bei diesen Patienten mit autoimmunlymphoproliferativem Syndrom kommt es zur Akkumulation doppelt negativer (CD4-/CD8-) T-Zellen und zur Bildung von Autoantikörpern. Im Gegensatz zu den ALL Pati-
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
enten, bei denen die Mutationen über das gesamte Gen
zu finden sind, finden sich bei Patienten mit ALPS prädominant Mutationen in exon 9, das den intrazellulären Anteil
des Moleküls kodiert. Patienten mit exon 9 Mutationen zeigen jedoch eine variable Ausprägung von Apoptosesensitivität und eine heterogene Funktion des CD95 Rezeptors,
z. B. bei der Bildung des CD95 death inducing signaling
complex, die nicht alleine aus der Lokalisation der Mutation erklärt werden kann. Wir haben weiterhin Mutationen
für andere Apoptose-induzierende und Apoptose-modulierende Moleküle, wie CD95 Ligand, FADD, Caspase-8 und
TRADD untersucht. Dabei fanden sich neue Mutationen im
Adapterprotein TRADD bei Patienten mit Leukämien und
ALPS.
CD95 vermittelte Apoptose bei der
HIV-Infektion
T. Böhler, I. Herr
Klinische Kooperationseinheit D0800
Pädiatrische Onkologie
ben in vitro Kulturbedingungen etabliert, die Zellen kontrolliert Hypoxie, Glukosedepletion und „Reperfusion“ aussetzen. Dabei kommt es zur Aktivierung von zellulären Signalwegen die über den hypoxiesensiblen Transkriptionsfaktor HIF 1a gesteuert werden. HIF 1a scheint dabei allerdings, ähnlich wie NFkB, sowohl Zelltod als auch Protektion vermitteln zu können.
Publikationen (* = externe Koautoren)
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Die HIV-1-Infektion ist durch eine im Krankheitsverlauf zunehmende Depletion von T Helfer Zellen charakterisiert,
die durch verstärkte Apoptose verursacht zu sein scheint.
In früheren Arbeiten fanden wir eine verstärkte Expression
von CD95 und CD95 Ligand in frisch isolierten Lymphozyten von Patienten mit HIV-Infektion im Rahmen einer multizentrischen Studie zur pädiatrischen HIV-Infektion. In
Längsschnittuntersuchungen konnten wir nun zeigen, daß
die initial verstärkte Expression von CD95 Ligand nach effektiver antiretroviraler Therapie deutlich zurückgeht. Diese Veränderung ist unabhängig von aktueller Viruslast,
korreliert allerdings direkt mit dem Wiederauftauchen naiver CD4+ T Zellen, die CD95 genuin nur schwach exprimieren. Die Analyse der Aktivität des CD95 Systems kann
bei der HIV-Infektion von prognostischer Bedeutung sein
und wird gegenwärtig als Surrogatmarker für Krankheitsprogression und Therapieansprechen evaluiert.
[4] *Beltinger C, Fulda S, *Kammertoens T, *Uckert W, Debatin KM, 2000. Mitochondrial amplification of death signals determines
thymidine kinase/ganciclovir-triggered activation of apoptosis.
Cancer Research 60 (12):3212-3217
Apoptosesignalwege bei Ischämie
induzierter Apoptose
[10] Fulda S, *Meyer E, Debatin K-M, 2000. Metabolic inhibitors
sensitize for CD95 (APO-1/Fas)-induced apoptosis by
downregulating Fas-associated death domain-like Interleukin 1converting enzyme inhibitory protein expression. Cancer
Research 60: 3947-3956
I. Herr, I. Jeremias, S. Henrich, K.-M. Debatin
Gewebsischämie führt nicht nur zum nekrotischen Zelltod
sondern in weiten Bereichen des hypoxischen Gewebes
zur Apoptose. In tierexperimentellen Untersuchungen fanden wir in hypoxischen Gewebsarealen bei zerebraler
Ischämie eine verstärkte Expression des Transkriptionsfaktors c-jun sowie CD95L und TRAIL. Inhibition der Expression von CD95L und TRAIL durch FK 506 führte zur
Reduktion des Infarktareals bei der zerebralen Ischämie.
In Mäusen, bei denen durch Rezeptormutationen der
CD95 Signalweg blockiert ist (lpr-Mäuse), waren die
Infarktareale in Herz und Gehirn deutlich reduziert. In vitro
führen hypoxische Kulturbedingungen zur Sensibilisierung
für Liganden vermittelte Apoptose. Die zellulären Signalwege, die zur Aktivierung der Apoptosesysteme führen sowie deren mögliche pharmakologische Beeinflussung werden gegenwärtig in in vitro Zellsystemen untersucht. Hypoxiebedingungen sind auch an der Regulation von Apoptosesensitivität und -resistenz in Tumoren beteiligt. Wir ha-
[5] Herr I, Posovszky C, *Di Marzio L, *Cifone MG, *Böhler T,
Debatin K-M, 2000. Autoamplification of apoptosis following
ligation of CD95L, TRAIL- and TNF-a. Oncogene 19 (37): 42554262
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[11] *Van Valen F, Fulda S, *Truckenbrod B, *Eckervogt V,
*Sonnemann J, *Hillmann A, *Roedl R, *Hoffmann C, *Winkelmann W, *Schaefer L, *Dockhorn-Dworniczak B, *Wessel T, *Boos
J, Debatin K-M, *Juergens H, 2000. Apoptotic responsiveness of
Ewing’s sarcoma family of tumours to tumour necrosis factorrelated apoptosis-inducing ligand (TRAIL). Int. J. Cancer 88: 252259
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DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
193
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
Klinische Kooperationseinheit D0800
Pädiatrische Onkologie
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DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
Klinische Kooperationseinheit D0900
Dermato-Onkologie
Klinische Kooperationseinheit Dermato-Onkologie des DKFZ an der Klinik für Dermatologie
des Klinikum Mannheim (D0900)
Leiter: Prof. Dr. med. Dirk Schadendorf
Wissenschaftliche Mitarbeiter
Dr. rer. nat. Stefan Eichmüller
Dr. rer. nat. Jan Müller-Berghaus (05/02 - )
Dr. rer. nat. Wolfram Osen (03/02 - )
Dr. rer. nat. Annette Paschen
Dr. med. Wolfram Fink, AiP
Dr. med. Heike Röckmann (geb. Helmbach)
Dr. med. Mingxia Song
Dr. med. Selma Ugurel (03/02 - )
Dr. med. Udo Hofmann (- 10/01)
Dr. med. Daniela Lang ( - 12/00)
Dr. med. Angelika Stein ( - 01/02)
Dr. med. Yuansheng Sun ( - 05/01)
Dr. med. Christine Zimpfer-Rechner (06/00 - 06/02)
Dipl. Biol. Friederike Fellenburg
Dipl. Chem. Ebil-Lun Gelen
Dipl. Biol. Tanja Hartmann
Dipl. Biol. Annette Reitz (04/02 -)
Dipl. Biol. Daniela Thomas
Dipl. Biol. Dirk Usener
Dipl. Biol. Evelyn Rossmann ( - 02/02)
Dipl. Biol. Heike Rothfels ( - 04/02)
Dipl. Biol. Birgit Wasser (08/00 - 09/01)
Stipendiaten:
Weiqing Jing (Shandong, China) (04/01 - )
Studienassistenten im Prüfzentrum:
Sr. Annette Novak
Technische Mitarbeiter:
Antje Sucker (MTA)
Judith Bartels (MTA)
Willi Eickelbaum (MTLA)
Brigitte Gschwendt (CTA) ( - 08/02)
Ricarda Heber (BTA)
Anita Jochim (MTA)
Magdalena Pföhler (CTA) (04/02 - )
Claudia Sterzik (MTA)
Sandra Christmann (MTA) (02/00 - 01/02)
Konstanze Kolmsee (MTA) (04/01 - 04/02)
Christine Schleicher (BTA) (09/00 - 01/01)
Yvonne Nowak (Laborassistentin)
Sekretariat:
Margaret Vazansky
Die Klinische Kooperationseinheit für Dermato-Onkologie
ist eine Abteilung des Deutschen Krebsforschungszentrum
(DKFZ) an der Hautklinik des Klinikum Mannheim.
Dermato-Onkologie befaßt sich mit der Prävention, Diagnose und Therapie von Tumoren der Haut. Dazu zählen
Plattenepithelkarzinome der Haut und Hautanhangsorgane, Lymphome der Haut sowie das maligne Melanom, das
für ¾ der hautkrebsbedingten Todesfälle verantwortlich ist.
Die optimale Betreuung von Tumorpatienten ist eine interdisziplinäre Aufgabe, die guten Kontakt und Kooperation
zu anderen Abteilungen wie Chirurgie, Pathologie, Radiologie, Hämatologie/Onkologie benötigt. Für die klinische
Betreuung dieser Patienten im Haus sind spezielle Nachsorgesprechstunden eingerichtet. Die Klinische Kooperationseinheit für Dermatoonkologie besteht seit April 1997
und umfaßt Labore im DKFZ und in Mannheim. Dazu zählen ein großzügiger Laborbereich und eine spezielle dermatoonkologische Ambulanz in Mannheim mit der Möglichkeit auch ambulante Chemotherapien und Lymphknoten-Ultraschalluntersuchungen durchzuführen. Darüber
hinaus stehen durch den Kooperationsvertrag zwischen
dem DKFZ, der Universität Heidelberg und dem Klinikum
Mannheim 4 Betten zur stationären Versorgung von Hautkrebspatienten zur Verfügung.
Das Ziel der Klinischen Kooperationseinheit ist die enge
Verzahnung von Klinik mit aktuellen, experimentellen Fortschritten im Labor. Im Zentrum der Bemühungen stehen
Patienten mit malignen Melanomen in allen Stadien, jedoch auch fortgeschrittene Plattenepithelkarzinome und
Lymphome der Haut werden umfassend stationär und ambulant versorgt. Es besteht die Möglichkeit Patienten bei
den regelmäßig stattfindenden Dermatoonkologischen
Konferenzen (mittwochs nachmittags, Anmeldung erbeten)
vorzustellen.
Homepage: http://www.dkfz-heidelberg.de/melanom
Hintergrund
Das maligne Melanom ist ein bösartiger Tumor, der seinen
Ausgang von den pigmentproduzierenden Melanozyten
nimmt. Es ist der bedeutendste Tumor der dermatologischen Onkologie, nicht wegen seiner Häufigkeit, sondern
aufgrund seines aggressiven biologischen Wachstumsverhaltens und seiner ausgeprägten Therapieresistenz bei
eingetretener Metastasierung. Die Häufigkeit des malignen Melanoms unterliegt starken geographischen
Schwankungen. Die weltweit höchste Inzidenz findet sich
in Australien und in den Südstaaten der Vereinigten Staaten, mit bis zu 40 Neuerkrankungen je 100.000 Einwohner
pro Jahr. In Mitteleuropa und der Bundesrepublik beträgt
die Inzidenzrate zwischen 6 bis 10 Fälle je 100.000 Einwohner pro Jahr in Abhängigkeit des Geschlechtes.
Die Metastasierung des malignen Melanoms erfolgt entweder lymphogen oder hämatogen. Mit eingetretener
Disseminierung der malignen Erkrankung sinkt die Überlebenserwartung dramatisch. Das Maligne Melanom ist im
fortgeschrittenen Krankheitsstadium durch seine ausgeprägte Therapieresistenz gekennzeichnet. Konventionelle
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
195
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
196
Behandlungsstrategien einschließlich der Chirurgie,
Radiatio oder der Chemotherapie hatten bislang keinen
wesentlichen Einfluß auf die Heilungserfolge bei betroffenen Patienten. Fortschritte in der Tumorimmunologie im
allgemeinen und beim Melanom im besonderen haben
dazu geführt, daß jetzt eine Reihe von Melanom-assoziierten Tumorantigenen, die durch spezifische T-Lymphozyten
erkannt werden, identifiziert wurden. Darüber hinaus sind
die immunologischen Mechanismen der spezifischen
Tumorzell-Erkennung und -Vernichtung gut untersucht.
Aus diesen neuen Erkenntnissen entwickeln sich jetzt eine
Reihe interessanter, experimenteller Therapieansätze für
das Melanom, die z.T. bereits in der klinischen Erprobung
sind.
Die Klinische Kooperationseinheit für Dermato-Onkologie
(DKFZ) am Klinikum Mannheim hat sich weiterhin zum Ziel
gesetzt, die der hohen Chemoresistenz beim Melanom zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen, um
durch ein verbessertes Verständnis die Therapie verbessern zu können. Durch Identifikation derartiger Mechanismen und Moleküle verspricht man sich Angriffspunkte für
eine gezielte pharmakologische oder auch zellbiologisch/
gentherapeutische Beeinflussung zu identifizieren, um
letztendlich die klinische Therapieresistenz zu modulieren
bzw. zu überwinden.
Klinische Kooperationseinheit D0900
Dermato-Onkologie
Chemoresistenz:
H. (Helmbach) Röckmann, B. Gschwendt,
S. Englisch
In Zusammenarbeit mit: PD Dr. Hermann Lage, Prof. Manfred
Dietel (Charité, Pathologie Berlin) und Prof. Dr. Pranav Sinha
(Charité, Klinische Chemie, Berlin), Prof. Dr. Annemarie Poustka
(DKFZ, Abt. H0600), Prof. Peter Krammer (DKFZ, Abt. G0300),
Prof. Dr. Peter Lichter (DKFZ, Abt. H 0700).
Im fortgeschrittenen Stadium hat das Melanom eine
schlechte Prognose, hauptsächlich aufgrund der Ineffektivität von Chemotherapie. Aus bisher ungeklärten Gründen
sind Melanomzellen weitgehend resistent gegen systemische Behandlung mit antineoplastischen Substanzen.
Verschiedene Mechanismen, die für die beobachtete Chemoresistenz verantwortlich sein könnten, sind in Bezug auf
der spezifischen Wirkungsweise bestimmter Zytostatika
und auf die Vorgänge, die zum Zelltod führen, untersucht
worden (Übersicht in Helmbach et al., 2001). Einige Studien haben gezeigt, daß die Mechanismen, die zur Chemoresistenz von hämatologischen Tumoren führen, bei soliden Tumoren wie dem Melanom nicht wirksam sind. Aus
diesem Grund müssen die Mechanismen, die mit Chemoresistenz bei Melanomerkrankungen in Zusammenhang
stehen könnten, durch breitgefächerte Studienansätze
analysiert werden. Die Auslösung von Apoptosis wird als
einer der wichtigsten Mechanismen angesehen, durch die
zytostatische Substanzen Tumorzellen töten. Infolgedessen könnten Defekte oder Veränderungen in der Apoptosiskaskade bei Melanomzellen die Wirksamkeit von Chemotherapeutika einschränken und zur Chemoresistenz
führen. Die spezifischen Wirkmechanismen und molekularen Pfade der zellulären Apoptosis werden schon länger
intensiv erforscht während Untersuchungen zu dem Zusammenhang zwischen Störungen in den apoptotischen
Abläufen und Chemoresistenz von Tumorzellen jetzt erst
in Gang kommen. Es ist anzunehmen, daß es noch andere unbekannte Mechanismen auf der molekularen Ebene
gibt, die zu Chemoresistenz führen, die jetzt mittels molekularbiologischen Untersuchungen gesucht werden [6, 9].
Da experimentelle Beobachtungen zu Chemoresistenz in
der Regel nicht direkt an Patienten vorgenommen werden
können, haben wir ein in-vitro Modellsystem entwickelt,
um sehr spezifische und reproduzierbare Analysen chemoresistenter Mechanismen ausführen zu können (Kern et
al., 1997, Anticancer Res (1997) 17: 4359-4370.):
I.Cisplatin:
DNS-Schädigung, induziert DNS-Kreuzvernetzung
II. Etoposid:
Inhibiert DNS-Topoisomerase II, induziert
Brüche in dem DNS-Strang
III. Fotemustin: DNS-alkylisierende Substanz, induziert
Brüche in dem DNS-Strang
IV. Vindesin:
Mitosis-Inhibitor, inhibiert Polymerisierung
der Mikrotubuli.
Bei der Analyse der Varianten hat es sich herausgestellt,
daß eine breite Kreuz-Resistenz vorlag, die nicht durch die
bekannten Transporterproteine erklärlich war. Dies führt zu
der Annahme, daß es bestimmte, bis jetzt unbekannte, allgemeine Resistenzmechanismen gibt, die für Chemoresistenz beim Malignen Melanom verantwortlich sind.
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
A. Apoptosis-Defizienz
Apoptosis (programmierter Zelltod) wurde als wichtigster
Mechanismus erkannt, durch den Zytostatika anfällige
(sensitive) Tumorzellen töten. Verschiedene Studien lassen vermuten, daß Resistenz gegen antineoplastische
Substanzen durch Inhibition oder Dysregulation der Apoptosis verursacht wird. Untersuchungen an anderen Tumorsystemen haben ergeben, daß die Induktion von Apoptosis
durch einige Zytostatika entweder durch TodesrezeptorLigand-Interaktionen, wie z. B. beim CD95-System, oder
durch mitochondriale Prozesse vermittelt wird. Für das humane Melanom ist wenig über die Induktion von Apoptosis
durch Chemotherapeutika oder über Störungen der apoptotischen Kaskaden, die Chemoresistenz bewirken, bekannt.
Wir haben den apoptotischen Pfad analysiert, über den
Cisplatin und Etoposid den Zelltod in chemo-sensitiven
MeWo Zellen herbeiführen, und ihn mit den zum Zelltod
führenden Pfaden bei chemoresistenten MeWo Zellen verglichen (Kern et al., 1997, Anticancer Res (1997) 17:
4359-4370.). Der durch Etoposid und Cisplatin induzierte
apoptotische Zelltod wird durch mitochondriale Prozesse
vermittelt. Eine analog durchgeführte Analyse an Etoposid-resistenten Zellen zeigte ein anderes Muster. Defizient
ablaufende apoptotische Prozesse wurden durch eine reduzierte Freisetzung von Cytochrom c durch die Mitochondrien sowie eine verminderte stromabwärts laufende Signaltransduktion charakterisiert. Der Zelltod in Cisplatin-resistenten Zellen kommt auch über veränderte Pfade (im
Vergleich zu den Pfaden bei sensitiven Zellen) zustande,
wenngleich andere Mechanismen tangiert werden [9].
B. Wirkungspezifische Mechanismen: DNS-Reparatur
und Topoisomerase
Durch Zytostatika verursachte DNS-Schädigungen werden
durch entsprechende kompensierende Veränderungen in
den DNS-Reparaturmechanismen teilweise behoben. In
den letzten Jahren haben Untersuchungen gezeigt, daß
DNS - Mismatch Repair (MMR)-Defizienz sowie vermehrte
DNS-Reparatur zur Chemoresistenz führen.
Ein weiterer Mechanismus, der der zellschädigenden Wirkung von Zytostatika entgegenwirkt, ist die Regulierung
der Zielmoleküle. Topoisomerase II ist ein nukleares Enzym, das für die Transkription und Rekombination der
DNS sowie die Segregation der Chromatide während Mitose unentbehrlich ist. Topoisomerase II stellt eine primäre
intrazelluläre Zielscheibe für viele antineoplastische Substanzen dar. Nur wenige Studien haben sich mit der Rolle
von Topoisomerase II in Chemoresistenz beim malignen
Melanom befasst.
Wir konnten zeigen, daß in Zellen, die gegen Cisplatin,
Etoposid und Vindesin resistent sind, die Menge einiger im
Zellkern enthaltenen DNA-MMR-Proteine (hMLHI, hMSH2
und hMSH6) reduziert war. In Melanomzellen, die Resistenz gegen Fotemustin aufzeigten, war die Menge der
nuklearen MMR-Proteine fast unverändert, während die
Aktivität von O6-Methylguanine-DNA-methyltransferase
(MGMT) beträchtlich erhöht war [1]. In einer Kooperationsarbeit mit der Gruppe von Prof. Wießler im DKFZ wurden
Klinische Kooperationseinheit D0900
Dermato-Onkologie
MGMT-Inhibitoren entwickelt, die in der Lage sind, Chemoresistenz in Fotemustin-resistenten MeWo-Zellen teilweise zu überwinden [8].
Topoisomerase IIa- and IIb-Expression war in allen Etoposid-resistenten Zellen auf der mRNS- sowie auf der
Proteinebene reduziert. Bei Cisplatin-resistenten und
Fotemustin-resistenten Zellen war die Expression von
Topoisomerase IIa nur auf der mRNS-Ebene erniedrigt.
Verminderte Expression in Etoposid-resistenten Zellen
wurde von einer Abnahme in Topoisomerase-Aktivität begleitet und führte zu einer entsprechend höheren Grad der
Resistenz [3].
C. Identifikation differentiell exprimierter Moleküle
Es ist davon auszugehen, daß es noch weitere bisher unentdeckte Resistenz-vermittelnde Mechanismen gibt. Um
hier zu einem tieferen Verständnis zu gelangen, haben wir
mittels differential display reverse transcription-polymerase
(DDRT-PCR) sowie complex cDNA hybridisation (CCH)
MeWo-Zellvarianten charakterisiert. Dieser Ansatz wurde
durch eine Analyse der globalen Proteinexpression (Proteomanalyse) unter Verwendung einer zweidimensionalen
Gelelektrophorese ergänzt, um weiteren noch unbekannten Mechanismen der Chemoresistenz beim humanen Melanom auf die Spur zu kommen [5].
Mittels DDRT-PCR und Northern Blot Analysen konnten 11
cDNS Klone als differentiell exprimierte Gene identifiziert
werden. Diese cDNS Klone DSM-1-DSM-11 (DrugResistance- associated Sequence in Melanoma) beinhalten 4 Gene (DSM-1, DSM-3, DSM-5, DSM-7), deren Funktion bekannt ist, 3 Gene (DSM-2, DSM-4, DSM-6), die
schon sequenziert wurden, ohne daß die Funktion charakterisiert wurde, und 4 neue Gene (DSM-8 - DSM-11) ohne
Übereinstimmung mit einem Gen in der Genbank (Grottke
et al., 2000). Funktionelle Analysen haben gezeigt, daß
DSM-2 (ICERE) eine Rolle in der Resistenz gegen Etoposid spielt [7]. Mittels complex cDNA-hybridisation konnten weitere 120 differentiell exprimierte Gene identifiziert
werden [11].
Durch 2-D-Gel Analyse konnten wir mehr als 70 differentiell exprimierte Proteine (pH 2,8-pH 10) identifizieren und
in sensitiven und resistenten MeWo Melanomzelllinien vergleichen [5, 10].
Ausblick
· Da ein in vitro Modell schon zur Verfügung steht und erste Protein-biochemische und molekularbiologische Untersuchungen bereits laufen, sollte es möglich sein in
Zusammenarbeit mit anderen Forschungsgruppen im
DKFZ, die über Expertise in diesem Gebiet verfügen,
DNS- und Proteinchips mit Resistenz-assoziierten Genen/Proteinen zu entwickeln, um mit diesem Werkzeug
mehr über diese Moleküle zu erfahren.
· Zusammen mit den Mitgliedern unserer Einheit, die an
experimentellen Therapien arbeiten, werden wir eine
umfassende Sammlung von verschiedenen chemoresistenten Zelllinien sowie frischem Tumorgewebe von
zahlreichen Patienten, für die ausführliche Daten und
Dokumentation vorliegt, zusammentragen.
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
197
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
·
Die auf diese Weise gesammelten Daten werden verwendet, um einen „Resistenzprofil“ für individuelle
Melanompatienten zu erstellen, mit dem die potentielle
Reaktion auf neoplastische Substanzen vorhergesagt
und ein entsprechend optimiertes Therapieschema ausgewählt werden kann.
Sobald genauer bekannt ist, durch welche Moleküle Chemoresistenz bewerkstelligt wird, können diese gezielt manipuliert werden, um die erwünschte Wirkung von pharmazeutischen Substanzen zu erreichen. Die entsprechenden Veränderungen könnten möglicherweise durch molekularbiologische oder gentherapeutische Strategien (z. B.
Ribozyme, Antisense) sowie chemotherapeutische Ansätze herbeigeführt werden.
Immuntherapie und Vakzinentwicklung
A. Paschen, W. Osen, W. Jing, D. Thomas, E. Gelen,
A. Reitz, A. Sucker, C. Sterzik, R. Heber,
J. Müller-Berghaus
198
In Zusammenarbeit mit: Prof. Pierre Coulie (Ludwig Institut, Brüssel, Belgien); Prof. Georgio Parmiani (National Cancer Institute,
Mailand, Italien), Prof. Dr. Marcus Maeurer (Mikrobiologie, Mainz),
Prof. Dr. G. Rammensee (Tübingen), Prof. Dr. Reinhard Dummer,
PD Dr. Carmen Scheibenbogen (FU Berlin), Prof. Frederico
Garrido (Granada, Spanien), PD Dr. Gerd Sutter & Dr. Ingo
Drexler (Virologie, GSF München), Prof. Lutz Gissmann (DKFZ,
Abt. F0200), Prof. Dr. Harald Klüter & Dr. X D. Nguyen (Transfusionsmedizin, Mannheim), Dr. Siegfried Weiss (GBF Braunschweig) Prof. T. Chakraborty & PD Dr. E. Domann (Mikrobiologie, Gießen), PD Dr. Harald Kropshofer und PD Dr. Anne Vogt
(Roche Institut für Molecular Genetics, Basel, Schweiz).
Die zunehmende Anzahl der experimentellen Belege dafür, daß tumorassoziierte Antigene (tumor-associated
antigens = TAA) durch das Immunsystem spezifisch erkannt werden, ließen das Konzept der Tumorvakzinierung
aussichtsreich erscheinen und führte zu der Entwicklung
verschiedener Tumor-spezifischer Vakzinierungsstrategien
(Sun et al., 1999). Die Anwendung solcher Behandlungsstrategien in klinischen Phase I/II Studien führte jedoch zu
therapeutischem Erfolg in nur einer kleinen Anzahl von
Krebspatienten (Möller et al. 2000). Dieses Ergebnis ist
zum Teil darauf zurückzuführen, daß die Patienten in diesen Studien schon in fortgeschrittenen Krankheitsstadien
waren, aber möglicherweise auch darauf, daß die meisten
Vazinierungsstrategien ausschließlich auf die Induktion einer tumorspezifischen CD8+-T-Zell (CTL) Immunreaktion
ausgerichtet waren. Obwohl CTL die Fähigkeit besitzen,
Tumorzellen unmittelbar zu töten, hängen die Induktion
und Erhaltung ihrer Effektorfunktion sehr stark von der
Teilnahme antigenspezifischer CD4+ T-Helferzellen an der
Immunreaktion ab. Aus diesem Grund muß eine Immuntherapie für Krebserkrankungen auf die Mobilisierung von
sowohl CD8+ wie auch CD4+ T-Zellen hinsteuern. Um dieses Ziel zu erreichen, müssen zuerst die von den Tumorzellen präsentierten immunogenen TAA-spezifischen TZellepitopen identifiziert werden.
Die Arbeitsgruppe “Immuntherapie und Vakzinentwicklung”
verfolgt daher zwei Hauptzielen: (I) die Identifizierung
antigenspezifischer T-Zellepitopen als eine Voraussetzung
Klinische Kooperationseinheit D0900
Dermato-Onkologie
für (II) die Entwicklung wirksamer antigenspezifischer, auf
T-Zellen gerichteter Immuntherapien.
Bisher haben die von unserer Gruppe durchgeführten Untersuchungen sich hauptsächlich mit der Charakterisierung
immunogener HLA-Klasse I restriktivierter Peptiden, die
aus Melanom-assoziierten Antigenen (melanoma associated antigens = MAA) stammen, befaßt. Das experimentelle Verfahren für die Identifizierung dieser Peptide basierte auf einer immunologischen “Umkehrstrategie”, d. h.
die in vitro Stimulierung von T-Lymphozyten durch CTLEpitopen, für die eine bestimmte Wirkung vorausgesagt
wurde. Auf diese Weise konnten wir die immunogenen
Peptidepitopen identifizieren, die für die qualitativ unterschiedliche Prozessierung der Antigenen in Tumorzellen
verantwortlich sind [13, 16]. Neben diesem Umkehrverfahren werden wir jetzt direkte Strategien zur Identifizierung von Epitopen unter Anwendung globaler Tumorantigenen in vitro und in vivo einsetzen. Dendritische Zellen
(DC) werden mit Antigen-kodierender RNS oder rekombiniertem Protein geladen und HLA-transgene Mäuse werden mittels rekombinanter DNS, Protein oder rekombinanter mikrobiellen Vektorvakzinen immunisiert. Wir setzen direkte und Umkehrstrategien nebeneinander ein, um der
Tatsache Rechnung zu tragen, daß Tumorzellen und antigenpräsentierende Zellen (antigen-presenting cells =
APC) Unterschiede hinsichtlich des Spektrums der immunogener Peptide, die von einem gegebenen Tumorantigen
generiert werden, aufzeigen könnten. Kenntnisse über beide Gruppen von Peptiden ist für die Entwicklung von
Krebsvakzinen potentiell von Bedeutung. Im Bewußtsein
der entscheidenden Rolle, die CD4+ T-Helferzellen in der
Induktion und Erhaltung CTL-vermittelter Immunität spielen, haben wir unseren Ansatz mit einer Analyse der immunogenen TAA-derivierten Peptide, die von HLA-Klasse
II Molekülen präsentiert werden, erweitert. Analog zu dem
Verfahren beim HLA-Klasse I-System werden beide experimentelle Strategien (Umkehr- und direkt, in vitro/in vivo)
angewendet. Die Versuche zur Identifikation von Epitopen
werden auch die neuen TAA-spezifischen Antigene einschließen, die von der Arbeitsgruppe “Identifikation und
Charakterisierung neuer Tumorantigene” in Laborversuchen identifiziert wurden.
Die Charakterisierung der oben beschriebenen TAA bildet
das Fundament für die zweite wichtige Zielsetzung der Arbeitsgruppe, die Entwicklung wirksamer, T-Zell aktivierender Krebsvakzine. Um dieses Ziel zu erreichen, schlagen
wir zwei Wege ein: (I) Optimierung der schon entwickelten
Vakzine und (II) Entwicklung neuer alternativer Vakzine.
Wir glauben, daß auf dendritischen Zellen basierende
Impfstoffe ein immunologisches Werkzeug mit beträchtlichem Potential für die Prophylaxe und Therapie darstellen, und die beeindruckende therapeutische Wirkung, die
mit der Behandlung von Melanompatienten mit Peptid-beladenen autologen dendritischen Zellen schon erzielt werden konnte, bestätigt dieses Urteil (Nestle et al., 1998, .
Nature Medicine 4: 328-332). Dieses Vakzin wollen wir
noch weiter verbessern, in dem dendritische Zellen mit
den antigenspezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellepitopen
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
geladen werden, die in den oben beschrieben experimentellen Arbeiten identifiziert wurden.
Da aber die Herstellung autologer DC-Vakzine sehr kostspielig ist, suchen wir nach alternativen Vakzin-Vektorensystemen, die solche Antigene in vivo direkt in die dendritischen Zellen bringen können. Zu diesem Zweck benutzen
wir das fakultative intrazelluläre Bakterium Listeria monocytogenes um die TAA zu transportieren. Von uns durchgeführte Untersuchungen haben gezeigt, daß dieses Bakterium in der Lage ist, humane dendritische Zellen effektiv
zu infizieren und dadurch phänotypische DC-Maturation
und die Freisetzung entzündungsfördernder Zytokine auszulösen [15].
Neben diesem bakteriellen System werden wir den modifizierten Vaccinia Virus Ankara (MVA) als virales Vektorensystem einsetzen. Für beide Vektorensysteme sind rekombinante Variante verfügbar, die Melanomantigene (melanoma differentiation antigens = MDA) transportieren können. Da MDA als Zielstrukturen für zelluläre Immunreaktionen in Melanompatienten schon bekannt und ausführlich in Tiermodellen untersucht worden sind, haben wir sie
für die Evaluierung unserer Vakzinierungsstrategien gewählt. Die Effizienz dieser neuen Vakzinvektoren wird
dementsprechend in humanen Zellkultursystemen und in
Tierexperimenten, basierend auf dem B16 MelanomMausmodell und HLA-transgenen Mäusen, getestet. Die
Ergebnisse dieser Untersuchung sollen dann in die Entwicklung von neuen experimentellen klinischen Therapien
durch unsere Einheit einfließen.
Identifikation und Charakterisierung neuer
Tumorantigene
S. Eichmüller, J. Zeng, D. Usener,F. Fellenberg,
T. Hartmann, A. Jochim, J. Bartels
In Zusammenarbeit mit: PD Dr. Michael Pawlita (DKFZ, Abt.
F0200), Prof. Reinhard Dummer (Dermatologie, Zürich, Schweiz),
PD Dr. Edgar Dippel (Dermatologie, Mannheim), PD Dr. Stefan
Dübel (Universität Heidelberg).
Mittelpunkt der Arbeit dieser Gruppe ist die Identifizierung
tumorassoziierter Antigene (TAA) und die Einschätzung ihrer möglichen Anwendbarkeit für Diagnostik und Therapie.
Die verschiedenen Projekte beziehen sich auf drei Hauptthemen: (1) die Suche nach Tumorantigenen mittels
Screening, (2) Evaluierung der neu entdeckten TAA,
cTAGE-1 und GBP-TA, und (3) die Entwicklung diagnostischer Werkzeuge.
Wir verwenden verschiedene Screening-Verfahren wie das
SEREX-Verfahren, eine serologische Screeningmethode
von Phagenbanken, um neue tumorassoziierte Antigene
oder Homologe von schon vorher entdeckten TAA zu identifizieren. Die Screeningversuche haben sich initial hauptsächlich auf das Kutane T-Zell Lymphom (CTCL) bezogen,
eine lymphoproliferative Erkrankung der Haut, für die nur
eine begrenzte Anzahl tumorspezifischer Antigene bekannt
sind [19], und konzentrieren sich jetzt auch auf des Melanom. Zusätzlich zu der Suche nach neuen Antigenen wurde die Expression bekannter tumorassoziierter Antigene,
Klinische Kooperationseinheit D0900
Dermato-Onkologie
insbesondere derjenigen, die der “cancer-germline-antigen” Gruppe angehören, in verschiedenen Geweben und
Zelllinien (CTCL, Melanom) untersucht. Das wichtigste Ergebnis dieser Arbeit war, daß in diesen CTCL-Proben das
Antigen LAGE-1 und die Antigengruppe GAGE reichlich
exprimiert wurden und deswegen vielversprechende Ansatzpunkte für therapeutische und diagnostische Maßnahmen darbieten könnten [20]. In der letzten Zeit haben wir
angefangen nach Testis-Antigenen, die in malignen Melanomen exprimiert werden, zu suchen [21].
In einer Reihe von Versuchen neue CTCL-Antigene zu
detektieren, konnten wir einige tumorassoziierte Antigene
identifizieren, die ein interessantes serologisches Reaktionsmuster zeigten. Darüber hinaus konnten wir demonstrieren, daß eines der tumorassoziierten Antigene, die
schon bekannt waren (SCP-1) und zwei neu entdeckte
TAA (cTAGE-1 und GBP-TA) ein differentielles Expressionsmuster aufzeigen, das sie als wichtige potentielle Ziele für Immuntherapie erscheinen läßt [18, 19, 22]. Solche
tumorspezifische Antigene könnten für Zell-basierten Immuntherapien oder - wenn sie auf der Zelloberfläche exprimiert werden - für Behandlungen, die auf Antikörpern basieren, verwendet werden. Aus diesem Grund bilden die
Bemühungen um eine vollständige Analyse der neu identifizierten Tumorantigene mittels Expressionsanalyse (RNS
und Protein) und Immunhistologie sowie die Überprüfung
der Antikörperreaktivität in Patientenseren wichtige
Schwerpunkte der Forschung unserer Gruppe. Was
cTAGE-1, das erste beim CTCL detektierte TAA, betrifft,
konnten wir inzwischen zeigen, daß dieses Antigen Mitglied einer größeren Familie ist, zu der sogar ein zweites
tumorspezifisches Mitglied gehört (cTAGE-5A) [22].
Sämtliche neue tumorassoziierte Antigene, die im Verlauf
der beschriebenen Screeningverfahren sich zumindest in
ihrer serologischen Reaktivität als tumorspezifisch darstellten, werden jetzt weiteren Untersuchungen auf der Proteinebene unterzogen. Das Ziel dieses Unternehmens ist
es, neue diagnostische Werkzeuge durch das Generieren
antigenspezifischer Antikörper und die Entwicklung eines
ELISA-Systems bereitzustellen, um Patientenseren auf die
Anwesenheit tumorspezifischer Antikörper überprüfen zu
können.
Experimentelle Therapie
S. Ugurel, C. Zimpfer-Rechner, W. Fink, A. Novak,
A. Zimpfer, W. Eickelbaum, M. Pföhler
In Zusammenarbeit mit: Prof. Alexander Enk (Mainz), Prof. Gerold
Schuler (Erlangen), Dr. Eckehard Kämpgen (Würzburg), Prof. Stefan Grabbe (Münster), PD Dr. Frank Nestle (Zürich, Schweiz),
Prof. Dr. Ulrich Keilholz (Berlin), Prof. Dr. Claus Garbe (Tübingen,
PD Dr. Axel Hauschild (Kiel), Prof. Graham Pawlec (Tübingen),
Dr. Vera Rebmann & Prof. Dr. Grosse-Wilde (Essen).
Eine Hauptzielsetzung der Arbeit der Gruppe ist eine möglichst direkte und effektive Übertragung neuer Ergebnisse
aus dem Labor in erste klinische Anwendungen, sowohl im
diagnostischen Bereich, z. B. durch den Einsatz neu entdeckter Serummarker, wie auch im therapeutischen Bereich, z. B. durch die Anwendung innovativer Vakzinie-
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
199
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
rungsstrategien. Die Erreichung diese Ziels setzt eine
enge Zusammenarbeit mit allen Projektgruppen der Einheit voraus und wird durch die räumliche Unterbringung eines Forschungslabors, eines GMP-Labors und der Ambulanz der dermatologischen Klinik im gleichen Haus besonders begünstigt.
200
Die Mitglieder der Arbeitsgruppe “Experimentelle Therapie” unter der Anleitung einer Fachärztin für Dermatologie
sind in der ambulanten und stationären Patientenversorgung der Universitätsklinik für Dermatologie, Venerologie
und Allergologie des Klinikum Mannheim voll integriert.
Um den Patienten eine breitgefächerte, fachkundige Beratung über die aktuellsten und vielversprechendsten diagnostischen und therapeutischen Maßnahmen bieten zu
können, nehmen die Mitglieder der Gruppe regelmäßig an
wissenschaftlichen Konferenzen und medizinischer Fortbildung über die neuesten Entwicklungen in der dermatologischen Onkologie teil. Neben klinikinternen Fortbildungsveranstaltungen gibt es jede Woche eine “Onkologierunde”, um über die anliegenden onkologischen Fällen mit
den anderen ärztlichen Kollegen in der dermatologischen
Klinik zu beraten. Durch diese günstige Konstellation und
ein Netzwerk von nationalen und internationalen Verbindungen zu anderen Forschungsgruppen und Kliniken können wir v. a. Melanompatienten die Teilnahme an einer
großen Anzahl klinischer Studien anbieten, die die höchsten internationalen Qualitätsstandards erfüllen, und die
experimentelle Therapie aussuchen, die dem Krankheitsstand und den individuellen Bedürfnissen des jeweiligen
Patienten am besten entsprechen. Die wachsende klinische und wissenschaftliche Reputation der Einheit zeugt
von dem Erfolg dieses Konzepts.
Da es immer noch keine anerkannte Standardtherapie für
Melanom im fortgeschrittenen Stadium gibt, spielen klinische Studien eine entscheidende Rolle in der Überprüfung
der Durchführbarkeit und therapeutische Wirksamkeit von
neuen therapeutischen Ansätzen (Balch et al., 1998; [30]).
Einem Großteil der Patienten mit kutanen Neoplasien werden innovative Therapien unter konstanter und sorgfältiger
Überwachung angeboten, die zuvor in vitro oder in Tiermodellen erprobt worden sind. Das Ansprechen auf die
therapeutischen Maßnahmen sowie alle negative Auswirkungen werden genau und ausführlich nach den strengen
Kriterien für “good clinical practice” (GCP) dokumentiert.
Die Ausführung der Studienprotokolle und Dokumentation
der klinischen Daten werden periodisch durch eine externe Gruppe von Experten begutachtet.
Die Klinische Kooperationseinheit für Dermato-Onkologie
hat seit ihrem Entstehen an einer großen Anzahl verschiedenartiger klinischer Studien teilgenommen. Die schon abgeschlossenen und die noch laufenden Studien schließen
große randomisierte multizentrische Studien auf nationaler
sowie internationaler Ebene, die unter der Schirmherrschaft von anerkannten Gremien wie der Dermatologischen Onkologischen Arbeitsgruppe (ADO der Deutschen
Krebsgesellschaft oder der “European Organization for
Research and Treatment of Cancer (EORTC) ein, aber
auch kleine kooperative Projekte mit 2 bis 4 anderen Kliniken.
Klinische Kooperationseinheit D0900
Dermato-Onkologie
Das GMP-Labor der Einheit, in der z. B. Humanvakzine
unter streng hygienisch kontrollierten Bedingungen hergestellt werden können, ermöglicht eine schnelle Umsetzung
von experimentellen Strategien in die klinische Anwendung. Dieser Vorteil kam zur besonderen Geltung in der
ersten Pilotstudie zur Vakzination mit autologen dendritischen Zellen in Patienten mit metastasiertem malignem
Melanom (Nestle et al., 1998, Nature Medicine 4: 328332.; [36]) und führte zu der Initiierung einer multizentrischen Phase-III Studie zur Prüfung der Wirksamkeit dieser
Vakzinationstherapie im Vergleich mit einer zytostatischen
Therapie an einer großen Zahl von Patienten. Während
der Vorbereitungsphase dieser Studie kamen medizinische und labortechnische Mitarbeiter der anderen Prüfzentren zu unserer Einheit in Mannheim, um die notwendigen Verfahren unter Einhaltung der strengen GCP und
GMP Vorschriften zu erlernen. Eine weitere Vakzinierungsstrategie unter Verwendung Peptidepitopen aus den Melanom-assoziierten Antigenen Tyrosinase and GM-CSF wurde in einer Phase-II Studie an Patienten mit einer fortgeschrittenen metastasierten Melanomerkrankung untersucht [27, 31]. ELISPOT Analysen zeigten eine spezifische
Induktion Tyrosinase-reaktiver T Zellen in nur 4 von 16 Patienten. Ausgehend von diesen vorläufigen Ergebnissen
wurde ein zweites Studienprotokoll initiiert, um verschiedene zusätzlich verabreichte Adjuvantien hinsichtlich ihrer
Fähigkeit Tyrosinase-spezifische T-Zell Reaktionen zu verstärken, zu vergleichen.
Verschiedene experimentelle Arbeiten in der Grundlagenforschung, die von den Wissenschaftlern und technischen
Assistenten in unserem Labor durchgeführt wurden, haben
jetzt den Punkt erreicht, da sie in klinischen Phase I/II Studien als therapeutische Ansätze angewendet werden können. Große Fortschritte, die in der Identifizierung und Charakterisierung neuer Antigenen für das kutane T-Zell Lymphom erreicht wurden [18], werden jetzt in Hinsicht auf
ihre Anwendbarkeit für Immuntherapie überprüft. Darüber
hinaus konnten durch eine andere Gruppe neue tumorassoziierte Antigene für das Melanom identifiziert und charakterisiert werden [17], die möglicherweise für Vazinierungsstrategien geeignet sind. Spezifische T-Zellepitopen
für beide maligne Erkrankungen werden letzten Analysen
und Prüfungen im Labor unterzogen, bevor sie in der
nächsten Zukunft zum Einsatz in klinischen Studien kommen. Da unsere Einheit über ein eigenes GMP-Labor verfügt, kann der Transfer vom Labor zur klinischen Anwendung unmittelbar und ohne unnötige Verzögerungen stattfinden.
Die von unserer Einheit geleisteten Forschungsarbeiten zu
schon bekannten prognostischen Markern und zu den
durch eigene Arbeiten neu entdeckten serologischen
Markern werden in einem nächsten Schritt in größeren
Patientengruppen erprobt und analysiert. Diese Untersuchungen stehen im Zusammenhang mit einem kooperativen Forschungsprojekt (in Kooperation mit 6 externen Forschungsgruppen und finanziert durch Förderungsmittel der
EU) mit dem Ziel, Untersuchungsmaterial von Melanompatienten für genomische und proteomische Analysen zu
sammeln. Ein weiteres kooperatives Projekt (in Kooperati-
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
on mit Prof. C. Garbe und PD A. Hauschild) befaßt sich mit
der Evaluierung der Nachsorge des Malignen Melanoms.
Die aus diesen drei Projekten gewonnenen Daten werden
in einer hochleistungsfähigen, Computer-unterstützen Datenbank zusammengefaßt, so daß klinische und Laborergebnisse schnell und akkurat abgerufen und verglichen
werden können. Damit werden die Voraussetzungen dafür
geschaffen, daß neue serologische und an Gewebe gebundenen Markerproteine in groß angelegten Studien mit
größeren Teilnehmerzahlen hinsichtlich ihrer Tauglichkeit,
das Ansprechen auf eine bestimmte Therapie oder die voraussichtliche Lebenserwartung eines Patienten zu prognostizieren.
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Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
R0200
Zentrales Tierlabor
Zentrales Tierlabor (ZTL, R0200)
Leiter: Dr. med. vet. Uwe Zillmann
Stellvertreter: Dr. med. vet. Werner Nicklas
Wissenschaftliche Mitarbeiterin (Post-doc)
Fr. med. vet. Rita Sanchez-Brandelik
(Fortbildung zur Fachtierärztin, 09/01 -)
Ausgewählte Mitarbeiter (von insgesamt 58)
Petra Mauter, Biologielaborantin
Andrea Erles-Kemna, Biologielaborantin
Klaus Vogel, Biologielaborant
Robert LeCorre, Biologielaborant
Klaus Meister, Desinfektor/Hygieneleiter
Angelika Frenznick, Versuchstierpflegemeisterin
Heidi Oberst, Versuchstierpflegerin
Walter Henrich, Versuchstierpfleger
Michael Gehring, Versuchstierpfleger
Beate Hilscher, Versuchstierpflegerin
Silke Nord, Versuchstierpflegerin
Ruth Wittmann, Versuchstierpflegerin
Manuela Jaster, Versuchstierpflegerin
Sigrid Thomas-Hack,Versuchstierpflegerin
Ilona Daute, Versuchstierpflegerin
Udo Hoesch, BTA
Martin Friedel, Versuchstierpfleger
Bernd Lehr, Biologielaborant
Daniela Frey-Walter, Versuchstierpflegerin
Stefan Fössel, Versuchstierpfleger
Horst Baron, Versuchstierpfleger
Gerhard Scherhaufer, Desinfektor
Stefan Pieper, Desinfektor
Sekretariat Allgemeinverwaltung/Tiereinkauf
Nadine Stein ( 7/00 -)
Sekretariat Tierschutz/Tierschutzbeauftragte
Manuela Schulz
Tierexperimente haben im DKFZ - trotz der zunehmenden
Entwicklung von Ersatzmethoden - ihren festen Stellenwert. Hinweise auf die Verwendung von tierischen Zellen
und Versuchstieren finden sich in über 30 % der Publikationen. Die Versuchsvorhaben sind häufig auf den Gebieten der Grundlagenforschung, Erforschung oder Erprobung von Methoden zur Diagnostik, Prophylaxe oder Therapie onkologischer Erkrankungen angesiedelt.
Zu den Hauptaufgaben unserer zentralen Dienstleistung
gehören die Beschaffung sowie die Haltung von Versuchstieren verschiedener Spezies unter definierten Bedingungen. Eine weitere Aufgabe besteht in der Unterstützung
tierexperimenteller Versuchsvorhaben, wie auch die Sanierung von Mauslinien mit unerwünschtem Hygienestatus
mittels Embryotransfers . Zur Zeit (Stand 26.02.02) werden 115 genehmigte und 73 angezeigte Versuchsvorhaben unterstützt. Das ZTL hat daneben eigene wissenschaftliche Projekte oder Projektbeteiligungen, die nachfolgend oder an anderer Stelle beschrieben sind.
Unsere Einrichtung wird von zwei Tierärzten geleitet, die
sich u.a. auf den Gebieten der Versuchstierkunde und
Mikrobiologie qualifiziert haben. Eine dritte Tierarztstelle
dient der Unterstützung des ZTL-Managements und ermöglicht die Weiterbildung zum Fachtierarzt für Versuchstierkunde und/oder Mikrobiologie. Im Bereich der
technischen Mitarbeiter finden sich u.a. Berufsbilder wie
Versuchstierpfleger, Biologielaboranten und BTA. Der
Hauptanteil der angestellten Versuchstierpfleger hat bereits seine Lehrzeit im ZTL absolviert.
Im Gegensatz zu vielen anderen Versuchstierhaltungen
erfolgt der Bezug unserer Versuchstiere von wenigen
nationalen und internationalen Anbietern. Der Anteil
selbstgezüchteter Tiere besteht fast ausschließlich aus
transgenen Mäusen. Der Tierbestand im ZTL beträgt im
Jahresdurchschnitt ca. 27.000 Tiere. An der Gesamtpopulation beträgt der Anteil von Mäusen ca. 97 % (davon etwa
50 % transgene) und von Ratten 2 %. Ein wesentlich geringeres Aufkommen haben Amphibien, Mastomys, Meerschweinchen, Kaninchen und Hühner. Die Haltung der
Versuchstiere erfolgt in 5 Barrieren, 3 Containereinheiten,
in geringerem Maße in Isolatoren, zwangsbelüfteten Käfigregalsystemen (IVC‘s) und in konventioneller Haltung.
Unsere Versuchstiere besitzen einen sogenannten SPFStatus („spezifiziert-pathogen-frei“), sind also frei von tierartspezifischen pathogenen Viren, Bakterien und Parasiten. Die mikrobiologische Routinekontrolle der eigenen
Bestände (im Vorfeld aber auch bei Tierlieferanten) erfolgt
duch das ZTL-eigene Mikrobiologische Labor.
Zur weiteren Vermittlung versuchstierkundlicher wie tierexperimenteller Sach- und Fachkunde bietet das ZTL - unterstützt durch mehrere engagierte Kollegen des DKFZ und
externen Referenten - einen 40stündigen „Einführungskurs zum tierexperimentellen Arbeiten“ an (1mal im Jahr,
max. je 30 Teilnehmer: Diplomanden, Doktoranden und
interessierte Mitarbeiter). Inhaltlich werden dabei die Vorgaben der Federation of European Laboratory Animal
Science Associations (FELASA) Kategorie B abgedeckt.
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
203
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
Mikrobiologische Diagnostik bei Versuchstieren
und Beeinflussung von Tierversuchen durch
Infektionserreger (R02002)
W . Nicklas
In Zusammenarbeit mit: Prof. Angel Alonso, ATV, Axel Benner,
Biostatistik, DKFZ; Dr. Hans-Jürgen Busse, Universität Wien,
Österreich; Dr. Martin Ryll, Tierärztliche Hochschule Hannover
204
Entsprechend der Aufgabe der Arbeitsgruppe lag der
Schwerpunkt der Tätigkeit bei der mikrobiologischen Qualitätskontrolle von Versuchstieren (fast ausschließlich Ratten und Mäuse) und biologischen Materialien. Ziel der
Untersuchungen ist es, in mikrobiologischer Hinsicht standardisierte Versuchstiere für Tierversuche einsetzen zu
können und Beeinflussungen von Versuchsergebnissen
durch Mikroorganismen zu vermeiden. Zu diesem Zweck
werden in regelmäßigen Abständen sowohl aus unserer
eigenen Tierhaltung als auch von externen Quellen stammende Tiere bakteriologisch, parasitologisch und serologisch (auf mehr als 15 Erreger) untersucht. Für die Mehrzahl der serologisch nachweisbaren Erreger stehen uns
mindestens 2 unterschiedliche Testverfahren zur Verfügung, mit deren Hilfe das Risiko von falsch-positiven Reaktionen deutlich reduziert werden kann. Seit Jahren setzen wir auch molekularbiologische Tests für Routineuntersuchungen ein. Wir verwenden diese Tests zum Ausschluß
bzw. zum Nachweis von nicht oder nur schwer kultivierbaren Mikroorganismen (Clostridium piliforme, Helicobacter
sp., Pneumocystis carinii, Pasteurellaceen) und bei bestimmten Indikationen auch für Virusnachweise (z. B.
Maus Hepatitis Virus MHV).
Für die Barrierenbereiche werden Tiere aus Zuchten beschafft, die ebenfalls durch unser eigenes Labor regelmäßig kontrolliert werden. Tiere von kommerziellen Züchtern entsprechen in der Regel unseren Anforderungen. Die
Eingangsuntersuchungen von transgenen Tieren, die aus
experimentellen Tierhaltungen stammen, erbringen häufig
Nachweise von nagerrelevanten Mikroorganismen und
zeigen deutlich, dass von solchen Tieren ein sehr großes
Risiko der Einschleppung von Erregern ausgeht.
Der häufige Austausch von gentechnisch veränderten Tieren zwischen Wissenschaftlern führt zu einem zunehmenden Infektionsdruck, und deshalb muss auch bei unseren
Versuchstieren mit dem Auftreten von Infektionen oder mit
Parasitenbefall gerechnet werden. Während unsere Barrierenbereiche über Jahre frei waren von Virusinfektionen,
wurde 2000 erstmals eine Infektion mit Rotaviren bei Mäusen diagnostiziert. Mehrmals konnten wir Befall mit Würmern nachweisen, wiederholt kam es sogar zur Einschleppung in Barriereneinheiten. Weitere Probleme wurden verursacht durch das Maus Hepatitis Virus (MHV) sowie
durch Pneumocystis carinii bei immundefizienten Tieren.
In der letzten Zeit wurden in unserem Labor nur noch wenige Transplantationstumoren auf Kontamination mit nagerpathogenen Viren untersucht. Stattdessen haben wir
eine größere Zahl von etablierten ES-Zell-Linien von Mäusen auf Viruskontamination überprüft, um das Risiko der
Erregereinschleppung in Tierhaltungen abschätzen zu
können. Auch wenn in unserem Untersuchungsmaterial
R0200
Zentrales Tierlabor
kontaminierte Proben nicht vorkamen, so muss doch von
einem deutlichen Risiko ausgegangen werden, dass bei
Bezug solcher Zellen von externen Institutionen Nagerviren eingeschleppt werden [1].
Bakteriologische Kontrolluntersuchungen an Ratten und
Mäusen zeigen, dass Pasteurellen sehr weit verbreitet
sind. Um den Nachweis dieser z. T. schwer anzüchtbaren
Keime zu vereinfachen und um mit vertretbarem Aufwand
größere Tierzahlen untersuchen zu können, haben wir für
bisher 3 Arten serologische Tests (ELISA) mit hoher Spezifität entwickelt. Diese Tests sollen es uns besonders bei
zugekauften Tieren ermöglichen, durch die Untersuchung
größerer Tierzahlen die Aussagesicherheit zu erhöhen und
damit das Risiko der Einschleppung dieser Mikroorganismen zu verringern.
Wegen widersprüchlicher Angaben in der Literatur wurden
anhand eigenen Datenmaterials biochemische Eigenschaften der bei Nagern vorkommenden Wachstumsfaktor-unabhängigen Pasteurellaceen untersucht. Anhand der
Überprüfung von über 2500 Feldisolaten wurde mittels
statistischer Methoden eine Gruppenbildung vorgenommen. Wir haben mit diesem Datenmaterial eindeutige Kriterien erarbeitet, die uns eine zuverlässige Identifizierung
der bei Maus und Ratte vorkommenden Pasteurellaceen
ermöglichen. Zusätzlich erhielten wir deutliche Hinweise
auf eine Spezies-Spezifität der meisten dieser Keime für
Ratte bzw. Maus. Außerdem ergaben unsere Untersuchungen, daß neben den bekannten Arten weitere noch
nicht ausreichend charakterisierte Pasteurellaceen bei Nagern existieren. Als ersten Erreger haben wir mittlerweile
den in der Literatur bisher nur einmal erwähnten ‘Haemophilus influenzaemurium’ näher charakterisiert. Es handelt
sich dabei um einen mäusespezifischen Keim, den wir unter anderem aus transgenen Mäusen verschiedener Herkünfte isoliert haben.
Von unserem Labor wird seit 1991 ein Ringversuch für Labors, die sich mit der mikrobiologischen Überwachung von
Versuchstieren beschäftigen, organisiert. Gegenwärtig
nehmen mehr als 30 Labors aus 10 europäischen Ländern
teil. Dieses Programm wurde ursprünglich von der Rockefeller University (New York) initiiert und wird heute von
unserem Labor weitergeführt. Im Rahmen dieses Programms werden in regelmäßigen Abständen Bakterienkulturen an die teilnehmenden Labors verschickt. Die innerhalb einer festgesetzten Frist eingehenden Befunde
werden ausgewertet und später in anonymisierter Form
den Teilnehmern mitgeteilt. Dieser Ringversuch dient der
Selbstkontrolle der teilnehmenden Labors und soll insgesamt zur Verbesserung der mikrobiologischen Überwachung und damit letztendlich der Qualität der Versuchstiere beitragen.
Publikation (* = externe Koautoren)
[1] Nicklas, W. *Weiss, J.: Survey of embryonic stem cells for
murine infective agents. Comparative Medicine 50 (2000) 410411.
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
Die Darstellung von Lymphbahnen und
Lymphknoten mit fluoreszenzmarkiertem
humanem Serumalbumin und Gadolinium
gebundenem humanem Serumalbumin (R02003)
P. Kremer*, U. Zillmann
* Neurochirurgische Universitätsklinik Heidelberg
In Zusammenarbeit mit: Th. Egelhof, Neuroradiologische Abteilung Universitätsklinikum Essen; S. Heiland, Neuroradiologische
Abteilung, Universitätsklinikum Heidelberg; H. Sinn, H. H.
Schrenk, Th. Haase, U. Bauder-Wüst, W. Dähmel, DKFZ
Das Konzept des primären Wächterlymphknotens (= sentinal lymph node, SLN) basiert auf der Hypothese, daß
sich ein primär lymphogen metastasierender Tumor, wie z.
B. Mammakarzinom oder malignes Melanom, zunächst
über den ersten im Lymphabstromgebiet des Tumors drainierenden Lymphknoten ausbreitet. Seinem Aufsuchen
und seiner Entfernung kommt daher bei primär lymphogen
metastasierenden Tumoren besondere Bedeutung zu. Verschiedene Methoden der Darstellung des SLN und der
drainierenden Lymphabflußwege finden sich in Anwendung:
· radioaktiv markierter Kolloide, wie z. B. 99Tc-Albumin
(Lymphabflußszintigraphie, intraoperative Gammasondenmessung)
· Patentblau zur direkten intraoperativen Darstellung von
Lymphbahn und SLN.
Nachdem die im DKFZ entwickelten Albuminkonjugate
Methotrexat-Albumin (MTX-HSA) und 5-AminofluoresceinAlbumin (AFLc-HSA) bereits in klinischen Phase-I/II-Studien untersucht werden, galt das Interesse der Entwicklung weiterer Albuminkonjugate auf dem Gebiet der
Lymphdiagnostik. Untersucht werden sollte die Darstellung
von drainierenden Lymphbahnen und Wächterlymphknoten durch fluoreszenz- und Gadolinium-markiertes HSA.
Fluoreszenzdiagnostik
Zur Fluoreszenzdiagnostik wurde Tetra-CarboxyphenylChlorin-HSA (TCPC-HSA) und Tetra-CarboxyphenylPorphyrin-HSA (TCPP-HSA) in einer 1:1 molaren Beladung verwendet. Die Fluoreszenzfarbstoffe wurden durch
eine Xenonlampe (D-light, Storz, Tuttlingen) angeregt und
die Fluoreszenzemission unter Zuhilfenahme von
Langwellenfilter beobachtet.
Nach intrakutaner Injektion von 0,1 ml TCPC-HSA konnten
bei der Sprague-Dawley Ratten bereits 30 Minuten später
sämtliche retoperitoneale Lymphbahnen dargestellt werden. Um dem Modell des primär drainierenden Lymphknotens aber näher zu kommen, wurde bei Chinchilla Kaninchen Freund’sches Adjuvant intrakutan injiziert, um dadurch eine reaktive Vergrößer-ung drainierender Lymphknoten zu erreichen. Wenige Tage danach erfolgte eine intrakutane Injektion von 0,2 ml TCPP-HSA am gleichen
Applikationsort an der Hinterpfote. Bereits 30 Minuten später war ein reaktiv veränderte poplitealer Lympkknoten erkennbar. Unter Fluoreszenzaktivierung war eine weitere
Lymphdissektion möglich, so daß auch reaktiv veränderte
inguinale und iliacale Lymphknoten und Lymphbahnen
dargestellt werden konnten.
R0200
Zentrales Tierlabor
Kernspindiagnostik:
Das Modell des reaktiv durch Freund’sches Adjuvans veränderten Lymphknoten diente am Kaninchen auch zur
kernspintomographischen Detektion des SLN und drainierender Lymphbahnen. Nach intrakutaner Injektion von 0,5
ml Gd-HSA wurden die Tiere im Kernspintomogramm
untersucht (T1-Wichtung mit Fettunterdrückung). Bereits
30 Minuten nach intrakutaner Injektion waren sowohl die
primär drainierende Lymphbahn wie auch der SNL in Höhe
der Fossa poplitea kernspintomographisch erkennbar.
Eine danach vorgenommene MR-Sequenz nach abdominal zeigte dann die weitere abführende Lymphbahn nach
peritoneal sowie weitere reaktiv veränderte Lymphknoten.
Das Konzept des primär drainierenden Lymphknotens und
der abführenden Lymphbahnen gelang in dem dargelegten Versuchsvorhaben sowohl kernspintomographisch im
Sinne einer präoperativen Diagnostik wie auch fluoreszenzoptisch als intraoperative Diagnostik zur Lymphdissektion. Im weiteren sollen beide Albuminkonjugate im
Tiermodell bei primär lymphogen metastasierenden Tumoren untersucht werden.
Publikation (* = externe Koautoren)
[1] *Kremer, P., *Egelhof, T., *Heiland, S., Haase, T., Zillmann ,U.,
Sinn, H.: Direct lymphatic mapping using fluorescence and
Gadolinium labeled albumin. Cancer Research and Clinical
Oncology, Suppl, (2002) 137.
Photodynamische Therapie des im Mundrachenbereich auftretenden Plattenepithelkarzinoms
am Mausmodell (R02004)
A. Kübler*, U. Zillmann, T. Reuther*, Ch. Staff
*
*Klinik für Mund-, Kiefer-, Gesichtschirurgie der Universität Heidelberg
In Zusammenarbeit mit: H.-J. Sinn, T. Haase, M. Rheinwald, H.
Löhrke, U. Bauder-Wüst, H. Eskerski, DKFZ; C. Flechtenmacher,
Pathologisches Institut der Universität Heidelberg
Zweck des Versuchsvorhabens war die Untersuchung
neuer, makromolekular gekoppelter Photosensibilisatoren
für die klinische Anwendung insbesondere auf dem Gebiet
der Mund-, Kiefer-, Gesichtschirurgie. Dies wurde an einem experimentellen Tiermodell durchgeführt.
Die häufigste maligne Neoplasie im Bereich des Oropharynx des Menschen stellt mit über 95% das Plattenepithelkarzinom dar. Seit 1983 wurde, neben den klassischen
Konzepten operative Therapie, Strahlen- und Chemotherapie, auch die Photodynamische Therapie bei der Behandlung dieser Tumoren in die Klinik eingeführt. Alle bisherigen Studien zeigen, daß der Therapieerfolg dieses
Verfahrens vorwiegend von der Tumorselektivität der verwendeten photosensiblen Substanzen abhängig ist. Dies
gilt für den Einsatz der Photodynamischen Therapie als
Primärtherapie, für die palliative Therapie fortgeschrittener
Karzinome und für den intraoperativen Einsatz zur Verringerung der Rezidivrate.
Ziel des dreijährigen Projektes war die Einführung neuer,
makromolekular gekoppelter Photosensitizer (PS) für den
klinischen Einsatz bei der Therapie des humanen Plattenepithelkarzinoms der Mundhöhle. Dies macht tierexperi-
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
205
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
mentelle Studien zur Wirksamkeit neuer Photosensitizer
im Vergleich zu bereits bekannten Photosensibilisatoren
(Photofrin II, m-THPC) notwendig.
Als Tiermodell wurde die Maus (transgener Stamm : RAG
II) gewählt. Die Tumorinokulation erfolgt durch subkutane
Injektion von zuvor in vitro vermehrten humanen Plattenepithelkarzinomzellen ( Zell-Linie: XF 354) am Hinterlauf
von insgesamt 180 Mäusen.
Innerhalb 2-6 Wochen entwickelte sich ein Tumor ausreichender Größe (0,03-0,3 cm3) ohne Metastasierung. Als
photosensible Agentien wurden PS der 1., 2. und 3. Generation gewählt: Photofrin II, m-THPC, m-THPC-PEG,
TCPP-HSA und Bacteriochlorin-PEG [1]. Durch die Kopplung der PS an Makromoleküle sollte einerseits eine Verlangsamung des Metabolismus (PEG), andererseits eine
verbesserte Tumorselektivität durch erhöhten Uptake
(HSA) erzielt werden. Um einen möglicherweise kopplungsbedingten Wirkungsverlust des PS m-THPC-PEG zu
untersuchen, wurde außerdem der neuartig gekoppelte
PS m-THPCnPEG (Radiochemische Abteilung des DKFZ,
Dr. H. Sinn) erstmals im Tierexperiment eingesetzt [2].
206
Die PS wurden nach ausreichender Progression des Tumors intraperitoneal in 2 unterschiedlichen Konzentrationen verabreicht. Anschließend wurden die Tumoren nach
verschiedenen Inkubationszeiten (24 h -5 d) mit Laserlicht
einer für den jeweiligen Sensitizer charakteristischen Wellenlänge bestrahlt (Argon-Dye-Laser oder Argon-Titan:Saphir-Laser).
Die Tiere wurden insgesamt über 6 Wochen auf den Effekt
der photodynamischen Therapie (Tumornekrose, -stagnation, -remission, oder -progression) untersucht. Dazu wurden die Tiere mindestens jeden zweiten Tag inspiziert und
das Tumorvolumen bestimmt. Zur Dokumentation der
Tumornekrose wurde ein Tumorscore verwendet. Bei eindeutiger Tumorprogression oder nach einem Beobachtungszeitraum von 6 Wochen wurden die Tiere durch eine
Überdosis CO2 eingeschläfert. Aus dem Tumor bzw. dem
ehemaligen Tumorbett wurden Proben zur histologischen
Aufarbeitung gewonnen.
Als Therapieerfolg wurde eine makroskopische und mikroskopische Tumorfreiheit bzw. eine eindeutige Tumorvolumenreduktion im Verhältnis zum Ausgangsbefund angesehen.
Nach Etablierung des neu eingeführten Mausmodells [3]
mit mehr als 90%iger Tumorangehrate zeigten die PS
Photofrin II und mTHPC einen maximalen Therapieeffekt
(vollständige Remisson), der bei Photofrin II ausgeprägter
als bei m-THPC war. Allerdings zeigte m-THPC geringere
Nebenwirkungen und ein besseres therapeutisches Ergebnis (geringere Narbenbildung) als Photofrin II. Die hohen
Erwartungen an die gekoppelten PS m-THPC-PEG,
TCPP-HSA und Bacteriochlorin-PEG konnten nicht bestätigt werden, da sich hier nur nicht signifikante Unterschiede zur Kontrollgruppe ergaben. Bei dem PS m-THPCnPEG aber zeigten sich Remissionen sogar schneller als
bei Photofrin II und m-THPC, wobei ihre Dauer kürzer war.
Die Gründe für die enttäuschenden Ergebnisse mit
R0200
Zentrales Tierlabor
m-THPC-PEG, TCPP-HSA und Bacteriochlorin-PEG liegen somit möglicherweise in der Kopplung selbst (Behinderung der Interaktion Licht-PS). Außerdem kommt
eine schlechte Vaskularisation des verwendeten Tumormodells (geringer Uptake) bzw. eine ungünstige intrazelluläre Lokalisation der makromolekular gekoppelten PS in
Frage. Diese Ergebnisse müssen zur Optimierung der
Bestrahlungsprotokolle (v.a. mTHPCnPEG) in weiteren
Tierversuchen überprüft werden. Das Projekt wurde in
2000 zunächst abgeschlossen.
Publikationen: (* = externe Koautoren)
[1] *Reuther, T., *Kübler, A. C., Zillmann, U., Benner, A., *Staff, C.,
Haase, T., *Flechtenmacher, C., Sinn, H.-J.: Comparison of the
clinical efficiency of Photofrin-II-, mTHPC-, mTHPC-PEG- and
mTHPCnPEG-mediated PDT in a human xenografted head and
neck carcinoma. Lasers Surg. Med. 29 (2001) 314-322.
[2] *Kübler, A. C., *Reuther, T., *Staff, C., Haase, T., *Flechtenmacher, C., Benner, A., *Scheer, M., Zillmann, U.: Klinische Wirksamkeit von m-THPC-PEG in einem neuen xenogenen TumorTiermodell für humane Plattenepithelkarzinome.
MundKieferGesichtschir. 5 (2001) 105-113.
[3] *Reuther, T., *Kübler, A. C., *Staff, C., *Flechtenmacher, C.,
Haase, T., Zillmann, U.: The RAG 2 Mouse Model for Xenografted
Human Oral Squamous Cell Carcinoma. Contemp. Topics Lab.
Anim. Sci. (2002), März (zur Publ. angenommen 12/01)
Additive intraoperative Photodynamische
Therapie kolorektaler Karzinome und
Weichteilsarkome am Mausmodell (R02004)
Ein Vergleich verschiedener Photosensitizer in
der Photodynamischen Therapie (PDT)
J. Gahlen*, U. Zillmann
*Chirurgische Universitätsklinik Heidelberg
In Zusammenarbeit mit (siehe auch FNr. R02004A): H.-J. Sinn, T.
Haase (FS E, E0300), DKFZ, Tumorzentrum Heidelberg/Mannheim; Ch. Flechtenmacher, Institut für Pathologie, Universität Heidelberg
Die klinische Problematik in der Behandlung kolorektaler
Karzinome und Weichteilsarkome sind die hohen Lokalrezidivraten der Karzinome in Abhängigkeit vom Tumortyp, staging und -grading. Radikale Tumorresektionen, kombiniert mit adjuvanten und additiven Therapieverfahren sind
notwendig, um die Lokalrezidivraten zu senken und das
rezidivfreie Überleben der Patienten zu verlängern. Herkömmliche adjuvante Therapieverfahren wie die Chemotherapie und die intraoperative Strahlentherapie (IORT)
sind jedoch mit erheblichen Nebenwirkungen behaftet und
Langzeitergebnisse klinischer Studien liegen noch nicht
vor. In dieser tierexperimentellen Studie wurde die additive
intraoperative Photodynamische Therapie (AIOPDT) als
ein mögliches und erfolgversprechendes Therapiekonzept
zur Behandlung kolorektaler Karzinome und Weichteilsarkome am Mausmodell überprüft [1,2]. Das Ziel dieser
Studie war die rezidivfreie Überlebenszeit tumortragender
Nacktmäuse nach subtotaler Tumorresektion und Durchführung einer AIOPDT mit verschiedenen Photosensitizern
(PS) zu verlängern und die unterschiedlichen PS auf ihre
Effektivität in der AIOPDT zu überprüfen [3].
Die Photodynamische Therapie basiert auf einer selektiven PS-Anreicherung in den Tumorzellen und führt, in
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
Kombination mit Laserlichtanregung einer PS-spezifischen
Wellenlänge, unter Bildung von Sauerstoff-Singulet zur
Destruktion der Tumorzellen.
In dieser experimentellen Studie wurde das Tumorwachstum durch subkutane Inokulation von 4x106 CC531 Zellen
(Kolonkarzinom), bzw. durch subkutane Inokulation von
6x106 S117 Zellen (Weichteilsarkom) in den Bereich des
linken Hinterlaufes immundefizienter, weilblicher SWISS
CD 1 Nacktmäuse induziert. Nach Erreichen einer Tumorgröße von ca. 10 mm wurden die Tiere durch intraperitoneale Injektion der verschiedenen PS photosensibilisiert.
Der PS mTHPC (meso-tetrahydroxyphenylchlorin), sowie
das makrogekoppelte NPC-mTHPC-PEG (Nitrophenylcarbonat-meso-tetrahydroxyphenylchlorin-Polyethylenglykol)
wurden in einer Konzentration von 0,3 mg/kg KG appliziert. Weiter wurde 5-ALA (5-Aminolävulinsäure:200 mg/kg
KG) und Photofrin II (0,3 mg/kg KG) auf ihre Wirksamkeit
in der AIOPDT überprüft. Nach einer PS-spezifischen
Expositionszeit wurde eine subtotale Tumorresektion zur
Simulation einer R1/R2 Situation (mikroskopischer/makroskopischer Tumorrest in vivo) an den narkotisierten Tieren
durchgeführt. Zur histologischen Tumorsicherung wurden
Tumorproben entnommen.
Zur Erfassung der gewebespezifischen PS-Anreicherung
wurden punktspektrometrische Messungen im Tumorbett,
der Tumormitte, sowie in der Tierhaut durchgeführt und mit
dem Muskelgewebe als Referenzgewebe verglichen [3].
Die gewebsspezifische Fluoreszenzintensität wurde am jeweiligen maximalen Emissionspeak der PS gemessen
(mTHPC und NPC-mTHPC-PEG: 652 nm, 5-ALA: 635 nm,
Photofrin II: 630 nm). Anschließend wurde im Tumorbett
die AIOPDT mit einer Laserenergie von 100 mW/cm2 unter
Verwendung eines Argon-Dye-Lasers durchgeführt. Die
Bestrahlungszeiten und -intensitäten wurden den verwendeten PS entsprechend angepasst (mTHPC und NPCmTHPC-PEG: 50 sec., 5 Joule; 5-ALA und Photofrin II:
250 sec., 25 Joule). Der Erfolg der AIOPDT wurde anhand
der rezidivfreien Überlebenszeiten der Tiere nach AIOPDT
über einen Zeitraum von 6 Monaten erfasst und mit den
entsprechenden Kontrollgruppen (konventionelle Resektion ohne AIOPDT) für das kolorektale Karzinom, bzw. das
Weichteilsarkom verglichen.
Die punktspektrometrischen Messungen zeigten ein homogenes intratumorales Anreicherungsverhalten für alle
PS. Die höchste Anreicherung im Tumorbett wurde nach
Photosensibilisierung mit NPC-mTHPC-PEG beobachtet.
Das mediane rezidivfreie Überleben der Tiere mit kolorektalen Karzinomen war signifikant (Logrank-test) verlängert
nach Durchführung der AIOPDT mit mTHPC (18 Tage),
NPC-mTHPC-PEG (18 Tage) und 5-ALA (16 Tage) im Vergleich zur Kontrollgruppe. Nach AIOPDT mit Photofrin II
konnte jedoch keine signifikante Verlängerung des rezidivfreien Überlebens beobachtet werden (9 Tage).
Erste Ergebnisse nach AIOPDT mit mTHPC bei Weichteilsarkomen zeigten ebenfalls ein signifikant (Logrank-Test)
verlängertes rezidivfreies Überleben (103 Tage) im Vergleich zur Kontrollgruppe (20 Tage). Höhere Tierzahlen
sind jedoch essentiell, um unsere ersten Ergebnisse zur
R0200
Zentrales Tierlabor
AIOPDT in der Behandlung von Weichteilsarkomen unter
Verwendung verschiedener PS zu bestätigen.
Die Hauptziele dieser Studie, lokale Tumorkontrolle und
Verlängerung der rezidivfreien Überlebenszeiten der Tiere
nach AIOPDT wurden erreicht. Zusammenfassend ist die
AIOPDT eine erfolgversprechende additive Therapiemethode zur Behandlung kolorektaler Karzinome und Weichteilsarkome mit dem Vorteil einer hohen Tumorselektivität,
geringen Nebenwirkungen und der Möglichkeit zur repetitiven Durchführung der Methode. Die tierexperimentellen
Ergebnisse stellen die Basis für folgende klinische Studien
zur AIOPDT nach Tumorresektion dar.
Publikationen: (* = externe Koautoren)
[1] *Gahlen, J., *Winkler, S., *Proßt, R., *Rheinwald, M., Haase,
Th., *Herfarth, Ch.: Adjuvante intraoperative Photodynamische
Therapie (PDT) nach Photosensibilisierung mit mTHPC im CC531
Kolonkarzinom Modell der Nacktmaus. Chirurgisches Forum 29
(2001) 139-142.
[2] *Winkler, S., *Proßt, R., *Stern, J., *Rheinwald, M., Haase, Th.,
*Herfarth, Ch., *Gahlen, J.: Adjuvant intraoperative photodynamic
therapy (AIOPDT) after photosensitization with mTHPC in a
CC531 colon carcinoma model in mice. Clinical Lasers and
Diagnostics, Proceeding of SPIE Vol. 4156 (2001) 287-292.
[3] *Winkler, S., *Proßt, R., *Pressmar, J., *Laubach, H.-H.,
*Rheinwald, M., Haase, Th., Sinn, H., *Gahlen, J.: Spektrometrische Untersuchungen zum Anreicherungsverhalten von ALA,
mTHPC und Photofrin im Kolonkarzinom Tumormodell (CC531).
Lasermedizin 15 (2000) 19-23.
Aktivität von antineoplastisch wirksamen
Verbindungen gegen Trypanosoma brucei
Subspecies (R02005-D0301)
U. Zillmann, M.R. Berger, S.M. Konstantinov*
*Medizinische Universität Sofia, Bulgarien
In Zusammenarbeit mit: Sinn, H. J., DKFZ; Brun, R., Protozoologische Abteilung/WHO-Drug-Screen-Center, Tropeninstitut Basel, Schweiz; Kaminsky, R., Novartis Animal Health, 1566 St.
Aubin, Schweiz
Die gezielte Entwicklung von Verbindungen, die gegen
drei Subspecies der Erreger der afrikanischen Schlafkrankheit wirksam sind, stagniert seit geraumer Zeit. In
neuerer Zeit wurden deshalb vermehrt solche Pharmaka
auf eine mögliche trypanozide Wirkung untersucht, von
denen bereits eine antineoplastische Wirkung bekannt
war. Wir konnten in diesem Zusammenhang an einem
akuten Mausmodell (NMRI, T.b. brucei, STIB 920) eine geringe aber signifikante Wirkung von Alkylphosphocholinen
af die Überlebenszeit infizierter Mäuse nachweisen
[*Konstantinov, S. et al., Acta tropica 64 (1997) 145-154].
Die hierbei beobachtete Wirkung war mäßig und entsprach nicht derjenigen, die bei den taxonomisch verwandten Leishmanien zur Heilung führte [A. Kuhlencord et
al., Antimicrob. Agents Chemother. 36 (1992) 1630; D.T.
Herwaldt, The New England Journal of Medicine. 341
(1999) 1840].
Da Trypanosomen gegenüber bestimmten Metallkomplexen, wie denen des Arsens, eine hohe Empfindlichkeit zeigen, haben wir als zweite Gruppe von Pharmaka antineoplastisch wirksame Metallkomplexe untersucht. Die klinisch gebräuchlichsten Verbindungen sind Derivate von
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001
207
Forschungsschwerpunkt D
Diagnostik und Experimentelle Therapie
R0200
Zentrales Tierlabor
Platin, die seit mehr als 10 Jahren in der antineoplastischen Chemotherapie breit eingesetzt werden. Als Leitsubstanz dieser Gruppe haben wir cis-Platin eingesetzt
und seine trypanozide Wirkung in vivo nach alleiniger
Gabe oder nach Kombination mit Hexadecylphosphocholin
in dem gleichen, oben beschriebenen akuten Mausmodell
untersucht [Berger, M. R., Zillmann, U.: Jahrestagung der
DTG, Heidelberg (1997) Tagungband, P28].
Eine Monotherapie mit cis-Platin (cP) war hochwirksam,
da bis 50% der Tiere länger als 90 Tage überlebten und
daher als „geheilt“ anzusehen wurden konnten. Die Kombinationstherapie mit HPC und cP war demgegenüber
nicht erfolgreicher als die Monotherapie mit cP.
In weiteren Untersuchungen wurde die Wirkung von zytotoxischen Verbindungen untersucht, die an humanes Serumalbumin (HSA) oder Zucker kovalent/adhärent gebunden waren (Synthese: H. J. Sinn). Von 9 Komplexen war
nur das HSA-1,4 - Diaminoanthrachinon (0.3 mg/ml; 1 ml
i.p. auf 30 g Maus, Appl. ein Tag vor Infektion) prophylaktisch wirksam.
208
Danach wurden weitere zytotoxisch wirksame Verbindungen untersucht, wie das HSA- und Glucosamin-gebundene Rivanol (Acridine Orange). In vitro entfaltete nur das
ungebundene, untoxische Rivanol eine minimale inhibitorische Aktivität. In vivo (T.b. brucei) wirkten die gebundenen Einzelkomponenten lebensverlängernd und die physikalische Mischung (1:1) bei 13/13 NMRI-Mäusen heilend
(Überlebenszeit < 90 Tage).
Zukünftig ist geplant, Inhibitoren von Nucleosidtransportern, wie z. B. Flavinoide, allein oder an HSA gekoppelt in
vitro und in vivo auf ihre trypanozide oder -statische Wirkung hin zu untersuchen [Mäser et al., J. Mol. Med., 79
(2001) 121-127].
DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001