Charakterisierung der genetischen Umgebung von ESBL

Aus der Abteilung für Medizinische Mikrobiologie
der Ruhr-Universität Bochum
Leiter: Prof. Dr. med. S. G. Gatermann
Charakterisierung der genetischen Umgebung von
ESBL-Genen
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Yvonne Peters
aus Duisburg
2012
Dekan: Prof. Dr. med. Klaus Überla
Referent: Prof. Dr. med. S. G. Gatermann
Korreferent: PD Dr. med. W. Cullmann
Tag der Mündlichen Prüfung: 30.01.2014
1
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung........................................................................................................7
1.1 ß-Laktamasen als Resistenzmechanismus...............................................7
1.2 Einteilung der ß-Laktamasen.................................................................11
1.2.1 Ambler-Klassifizierung der ß-Laktamasen....................................11
1.2.2 Bush-Jacoby-Medieros-Klassifizierung der ß-Laktamasen...........12
1.2.3 CTX-M-ß-Laktamasen...................................................................13
1.3 Genetische Umgebung von ESBL-Genen.............................................15
1.3.1 ISEcp1............................................................................................15
1.3.2 ORF477..........................................................................................16
1.3.3 OXA-1............................................................................................17
1.3.4 TEM...............................................................................................17
1.3.5 ISCR1.............................................................................................17
2 Zielsetzung....................................................................................................19
3 Material und Methoden.................................................................................20
3.1 Material..................................................................................................20
3.1.1 Chemikalien...................................................................................20
3.1.2 Puffer und Lösungen .....................................................................21
3.1.3 Stämme...........................................................................................22
3.1.4 Geräte.............................................................................................23
3.1.5 Antibiotika ....................................................................................23
3.1.6 Sonstige Materialien......................................................................24
3.2 Methoden...............................................................................................26
3.2.1 Präparation von genomischer DNA von Enterobacteriaceae.........26
3.2.2 DDST-Test zum Nachweis von ESBL bei Enterobacteriaceae.....27
3.2.3 Detektion der Resistenzgene..........................................................28
3.2.3.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR).........................................28
3.2.3.1.1 Allgemeine Verfahrensbeschreibung.............................28
3.2.3.1.2 Herstellung des Reaktionsansatzes.................................29
3.2.3.2 Gelelektrophorese...................................................................30
3.2.3.3 Dot Blot..................................................................................33
2
3.2.3.3.1 Sondenherstellung..........................................................33
3.2.3.3.2 Herstellung und Auswertung des Dot Blots...................34
4 Ergebnisse......................................................................................................38
4.1 Untersuchung auf ISEcp1B bei E. coli und K. pneumoniae.................38
4.2 Untersuchung auf ORF477 bei E. coli und K. pneumoniae..................41
4.3 Untersuchung auf OXA-1 bei E. coli und K. pneumoniae...................43
4.4 Untersuchung auf TEM bei E. coli und K. pneumoniae ......................43
4.5 Untersuchung auf ISCR1 bei E. coli und K. pneumoniae ....................45
4.6 Assoziation von genetischen Elementen und Resistenzgenen mit
ESBL-Typen bei E. coli ........................................................................46
4.7 Assoziation von genetischen Elementen und Resistenzgenen mit
ESBL-Typen bei K. pneumoniae............................................................46
5 Diskussion.....................................................................................................53
5.1 Genetische Umgebung von ESBL-Genen.............................................54
5.1.1 ISEcp1............................................................................................55
5.1.2 ISCR1.............................................................................................58
5.1.3 ORF477..........................................................................................60
5.2 Weitere ß-Laktamase-Gene...................................................................61
6 Zusammenfassung.........................................................................................68
7 Literatur.........................................................................................................70
3
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: CTX-M Hauptgruppen und Ursprünge...........................................14
Tabelle 2: Primer..............................................................................................25
Tabelle 3: Primer und Primerposition..............................................................25
Tabelle 4: Verwendete PCR-Profile.................................................................31
Tabelle 5: Reaktionsmix bei der DIG-Markierung von DNA-Sonden
(PCR DIG Probe Synthesis Kit)......................................................33
Tabelle 6: Dauer und Reihenfolge der verwendeten Lösungen.......................35
Tabelle 7: Dauer und Reihenfolge der verwendeten Puffer
und Waschlösungen........................................................................36
Tabelle 8: Übersicht der Ergebnisse bei E. coli...............................................47
Tabelle 9: Übersicht der Ergebnisse bei K. pneumoniae..................................48
4
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Funktionsweise der Serinproteasen..............................................8
Abbildung 2: Verlauf der Rate von 3.-Generation-Cephalosporinresistenten E. coli.......................................................................10
Abbildung 3: Schematische Darstellung der Ambler Klassifikation...............12
Abbildung 4: Assoziation zwischen CTX-M-Genen und ISEcp1 ...................16
Abbildung 5: ISCR1 assoziiert mit blaCTX-M (insbesondere blaCTX-M-9
und blaCTX-M-2) ............................................................................18
Abbildung 6: DDST-Test.................................................................................28
Abbildung 7: Prinzip der Sondenmarkierung mit DIG-markierten dUTP.......34
Abbildung 8: Prinzip des indirekten nicht-radioaktiven Nachweises von
gesuchten DNA-Abschnitten......................................................37
Abbildung 9: Verwendete Primer mit Bindungsstellen....................................38
Abbildung 10: PCR mit dem Primerpaar MA1_rev_eckert /
tnpA1_ISEcp1_eckert...............................................................40
Abbildung 11: Dot Blot Sonde ORF477 / CTX-M-1-540................................41
Abbildung 12: Dot Blot Sonde TEM_seq / TEM_rev ....................................44
Abbildung 13: PCR mit dem Primer ISCR1mFbae / CTX-M-9mRbae ..........45
Abbildung 14: ISEcp1-Sequenz.......................................................................50
Abbildung 15: ISCR1-Sequenz........................................................................52
Abbildung 16: Assoziation zwischen blaCTX-M-15 und blaTEM-1...........................62
5
Abkürzungsverzeichnis
AK
Antikörper
Bp
Basenpaare
bzw.
beziehungsweise
°C
Grad Celsius
cm
Centimeter
CR
Common regio
CSPD
Chemiluminescense substrate
CTX
Cefotaxim
DDST
Double Disc Synergy Test
d. h.
das heißt
DNA
Desoxyribonukleinacid
dNTP
Desoxynukleosidtriphosphat
DIG
Digoxigenin
E. coli
Escherichia coli
EDTA
Ethylendiaminotetraessigsäure
ESBL
Extended-spectrum-ß-Laktamase
g
Gravitation
IS
Insertion Sequence
kb
Kilobasenpaare (1.000 bp)
kDa
Kilodalton
M
Molar
MgCl
Magnesiumchlorid
µl
Mikroliter
µg
Mikrogramm
min
Minute
ml
Milliliter
NaCl
Natriumchlorid
NaOH
Natriumhydroxid
Neisseria spp.
Neisseria species
nm
Nanometer
ORF
Open reading frame
PCR
Polymerase-Kettenreaktion
6
pH
pH-Wert
pmol
Pikomol
rpm
Rotation pro Minute
SDS
Sodiumdodecylsulfat
SDS-PAGE
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
sog.
sogenannte
SSC
„Standard saline citrate“
TBE
Tris-Borat-EDTA
Tris
Tris(hydroxymethylaminomethan)
u.
und
ÜN
Übernacht
usw.
und so weiter
vgl.
vergleiche
z. B.
zum Beispiel
7
1 Einleitung
1.1 ß-Laktamasen als Resistenzmechanismus
Um die Bedeutung der Resistenz gegenüber ß-Laktamantibiotika bei
Enterobacteriaceae darzulegen, ist es erforderlich, sich im Folgenden mit den
ß-Laktamasen als Resistenzmechanismus gegen ß-Laktamantibiotika, der
Einteilung der ß-Laktamasen und insbesondere den CTX-M-ß-Laktamasen,
die die am weitesten verbreitete Gruppe unter den ß-Laktamasen darstellen,
auseinanderzusetzen.
Als Alexander Flemming im Jahr 1928 durch Zufall den Wirkstoff Penicillin
entdeckte, konnte er nicht abschätzen, dass er damit die Medizin
revolutionieren würde. Penicillin verfügt in seiner Struktur über einen ßLaktamring, und wird, wie viele andere Antibiotika (z.B.: Ampicillin,
Amoxicillin, Piperacillin, Cephalosporine), zu den ß-Laktamantibiotika
gezählt. ß-Laktamantibiotika können bei vielen bakteriellen Erkrankungen
eingesetzt werden, da ihre bakterizide Wirkung auf einer Störung der
bakteriellen Zellwandsynthese bei proliferierenden Zellen beruht. Dabei
werden insbesondere die Penicillinbindeproteine gehemmt, die für die
Quervernetzung des Mureins verantwortlich sind. Die Folge der Inaktivierung
dieser Enzyme ist eine Lyse der Zellen. Durch die vielfältigen Behandlungen
mit ß-Laktamantibiotika werden diejenigen Bakterienstämme selektiert, die
über Resistenzen gegen ß-Laktamantibiotika verfügen [18].
Die
häufigste
Ursache
der
bakteriellen
Resistenz
gegenüber
ß-
Laktamantibiotika ist die Produktion von ß-Laktamasen, die die größte
heterogene Gruppe unter den Resistenzenzymen darstellen und deren Struktur
aus α-Helices und ß-Faltblätter besteht. Obwohl die ß-Laktamasen eine
gemeinsame Topologie besitzen, unterscheiden sie sich durch eine signifikante
Variabilität der Aminosäurensequenzen [38].
Der Resistenzmechanismus verläuft in Falle von einigen ß-Laktamasen über
Zinkionen, welche den ß-Laktamring spalten. Die Mehrheit der ß-Laktamasen
8
verfügt aber über den sog. „Serin-Ester Mechanismus“ [12, 60]. Dieser
Mechanismus führt zu einer Spaltung der Amid-Bindung im ß-Laktamring,
was die ß-Laktamantibiotika wirkungslos gegenüber Bakterien macht (siehe
Abbildung 1).
Abbildung
1:
Funktionsweise
der
Serinproteasen. Die Serinprotease assoziiert
zuerst nicht kovalent an das Antibiotikum. Damit
wird ein nicht-kovalenter Michaelis-Komplex
gebildet. Anschließend wird der ß-Laktamring von
freien Hydroxylgruppen attackiert, welche sich an
einer Seitenkette eines Serinrestes im aktiven
Zentrum des Enzyms befinden. Diese binden
kovalent einen Acylester. Als Endprodukte der
Hydrolyse des Esters entstehen auf einer Seite das
aktive Enzym, auf der anderen Seite das inaktive
Hydrolisat. Nach diesem Mechanismus arbeiten die
ß-Laktamasen der Klassen A, C und D [31].
Konkrete Folgen der Resistenz gegenüber ß-Laktamantibiotika sind zum
Beispiel, dass Benzylpenicillin (Penicillin G) nicht gegen Staphylococcaceae
und Ampicillin nicht gegen Enterobacteriaceae, Haemophilus sowie Neisseria
9
spp. eingesetzt werden können. Die Gene, die für die ß-Laktamasen kodieren,
können sich auf dem bakteriellen Chromosom oder auf Plasmiden befinden.
Die Existenz von ß-Laktamasen bedeutet damit eine Herausforderung für die
antibakterielle Behandlung [31]. Insbesondere die ß-Laktamasen, die mittels
mobilen genetischen Elementen erworben werden, sind klinisch von
besonderer
Relevanz.
Die
ß-Laktamasen
mit
einem
erweiterten
Wirkungsspektrum (ESBL=Extended-spectrum Beta-Laktamase), die seit den
letzten Jahren weltweit auf dem Vormarsch sind (siehe Abbildung 2), bereiten
Ärzten
bereits
zum
gegenwärtigen
Schwierigkeiten
und
stellen
eine
Zeitpunkt
Gefahr
große
therapeutische
die
Krankenhäuser,
für
Pflegeeinrichtungen und die gesamte Gesellschaft dar [14, 32, 38].
Der Begriff „ESBL“ wird in verschiedenen Zusammenhängen angewendet.
Die am häufigsten verwendete Definition der ESBL sagt aus, dass diese ßLaktamasen eine Resistenz gegenüber Penicillinen (z. B. Ampicillin und
Piperacillin) und Cephalosporinen der ersten, zweiten und dritten Generation,
als auch gegen das Monobactam Aztreonam hervorrufen. Keine Resistenz
besteht gegen die Carbapeneme und die Cephamycine (z. B.Cefoxitin,
Cefotetan, Cefmetazol). Außerdem besteht eine große Empfindlichkeit
gegenüber Hemmsubstanzen, wie zum Beispiel Clavulansäure, Sulbactam
oder Tazobactam [27, 36, 37, 38].
Die ersten ESBL, die klinisch in Erscheinung traten, waren Variationen von ßLaktamasen [35]. Ihr erweitertes Wirkungsspektrum beruht auf einer
Veränderung
außerhalb
des
aktiven
Zentrums
durch
eine
einzige
Punktmutation in den ß-Laktamasegenen (bla-Genen), wodurch sich eine
veränderte dreidimensionale Struktur ergibt. Antibiotika mit einer veränderten
Seitenkette werden ebenfalls aufgrund dieser Mutation durch die ESBL
gespalten [36]. Früher konnte über die Inhibition mittels Hemmsubstanzen der
Schluss gezogen werden, dass es häufig TEM- und SHV-Penicillinasen waren,
die im Zuge der veränderten dreidimensionalen Struktur ein erweitertes
Wirkungsspektrum aufwiesen. Heutzutage kann über die Sequenzvergleiche
eindeutig aufgezeigt werden, woher die ESBL stammen.
10
Die ESBL können weiter klassifiziert werden in Ceftazidimasen, welche von
den ß-Laktamantibiotika Ceftazidim eher spalten als das Cefotaxim, und in
Cefotaximasen, die Cefotaxim mehr als Ceftazidim hydrolysieren [7].
Bis heute ist die Anzahl der ESBL deutlich angestiegen [7, 36]. Die ESBL
beinhalten neben den drei Hauptgruppen der TEM-, SHV- und CTX-M-ßLaktamasen auch noch andere Untergruppen. Klebsiella pneumoniae und
Escherichia coli gehören zu den am meisten ESBL-produzierenden
Organismen weltweit [24, 41, 42].
Abbildung 2: Verlauf der Rate von 3.-Generation-Cephalosporinresistenten E. coli. ESBL-bildende Stämme machen einen wachsenden Anteil
der E. coli-Isolate auf deutschen Intensivstationen aus. Ordinate: Prozent der
resistenten Erreger; Abszisse: Monat/Jahr [51]
11
1.2 Einteilung der ß-Laktamasen
Die Einteilung der ß-Laktamasen erfolgt hauptsächlich mit der Hilfe von zwei
allgemeinen Schemata: der Ambler- und der Bush–Jacoby-MedierosKlassifizierung.
1.2.1 Ambler-Klassifizierung der ß-Laktamasen
Ambler entwickelte seine Klassifizierung im Laufe seiner Forschungstätigkeit
[17]. Als Unterscheidungskriterium für die vier Hauptgruppen (A bis D)
verwendete er die Aminosäurensequenz. Er unterschied ferner zwischen ßLaktamasen mit Serin- oder Zink-Ionen im katalytischen Zentrum [2].
Ursprünglich unterteilte er die ß-Laktamasen in die Klassen A und B, die sich
wie folgt voneinander abgrenzten [17]:

Klasse A: die Serin-ß-Laktamasen

Klasse B: die Metallo-ß-Laktamasen, die ein Metallion, gewöhnlich
Zn2+, zur Hydrolyse der ß-Laktame benötigen. Die Metallo-ßLaktamasen besitzen einen unabhängigen Urspung von den Serin-ßLaktamasen, d. h. beide Gruppen haben keinen gemeinsamen
Vorfahren und sind nicht strukturell miteinander verwandt. Gängig ist
eine Verfeinerung der Klasse B in die Untergruppen B1, B2 und B3.
Dieser ursprünglichen Unterteilung fügte Ambler noch die Klassen C und D
hinzu [2]:
Die Klasse C der Serin-ß-Laktamasen weist nur kleine Sequenzähnlichkeiten
zu den bisher bekannten Klasse-A-Enzymen auf. Ihre Mitglieder sind in der
wissenschaftlichen Literatur auch unter dem Namen AmpC-ß-Laktamasen zu
finden.
12
Die Klasse D der Serin-ß-Laktamasen hat eine geringere Ähnlichkeit zu den
Klassen A und C. Sie werden in der Wissenschaft als OXA-ß-Laktamasen
bezeichnet.
Die meisten Bakterien weisen ß-Laktamasen der Klassen A, C und D auf
(siehe Abbildung 3) [2].
ß-Laktamasen
Serin-ß-Laktamasen
Metallo-ß-Laktamasen
(Klasse B)
Klasse A:
Serin-ß-Laktamasen
B1
B2
B3
Klasse C:
AmpC-ß-Laktamasen
Klasse D:
OXA-ß-Laktamasen
Abbildung 3: Schematische Darstellung der Ambler Klassifikation [2]
1.2.2 Bush-Jacoby-Medieros-Klassifizierung der ß-Laktamasen
Die Bush–Jacoby–Medieros-Klassifizierung unterscheidet nach funktionellen
Ähnlichkeiten der ß-Laktamasen und weist drei Hauptgruppen und diverse
Untergruppen auf.
Entscheidend für die Zuordnung zu einer Hauptgruppe sind das jeweils
bevorzugte Substrat und ihre Hemmbarkeit.
Dementsprechend
werden
die
Vertreter
der
Hauptgruppe
1,
die
Cephalosporinasen, nicht durch Clavulansäure gehemmt, während die
13
Penicillinasen,
Cephalosporinasen
und
ESBL
der
Gruppe
2
durch
Clavulansäure blockiert werden. Die Hauptgruppe 3 beinhaltet die Metallo-ßLaktamasen,
die
sowohl
Penicilline
und
Cephalosporine,
als
auch
Carbapeneme hydrolisieren können. Auffallend an dieser Gruppe ist die
schwache Hemmbarkeit, die lediglich durch EDTA erreicht werden kann [9].
Die Bush–Jacoby–Medieros-Klassifizierung ist aus zwei Gründen für Ärzte
und Mikrobiologen in diagnostischen Forschungseinrichtungen interessant.
Erstens verdeutlicht sie, gegen welche der Antibiotika ß-Laktamasen
bevorzugt wirken. Zweitens zeigt die Klassifikation die Hemmbarkeit der ßLaktamasen durch Clavulansäure bzw. EDTA [9].
1.2.3 CTX-M-ß-Laktamasen
Grundsätzlich lassen sich die ESBL in drei Gruppen unterteilen: TEM-, SHVund CTX-M-ß-Laktamasen.
Die ersten ESBL, die in den 1980`er Jahren in Deutschland entdeckt wurden,
waren TEM- und SHV-ß-Laktamasen. Während die TEM-ß-Laktamasen im
Kapitel 1.3.4 dargestellt werden, wird auf die SHV-ß-Laktamasen in dieser
Arbeit nicht näher eingegangen. Weltweit stellten die TEM- und SHV-ßLaktamasen für lange Zeit die größte Gruppe unter den ESBL dar, während
die CTX-M-ß-Laktamasen lediglich von einer geringen Anzahl von
Organismen produziert wurden.
Doch mittlerweile hat sich diese Entwicklung umgekehrt, denn die Anzahl der
CTX-M-Enzyme ist dramatisch angestiegen, und die CTX-M-Enzyme können
als die am weitesten verbreitete Untergruppe der ESBL angesehen werden [7,
11, 24, 29, 31, 37, 48].
CTX-M-ß-Laktamasen
unterscheiden
sich
nicht
nur hinsichtlich
der
Änderungen in ihrer Aminosäurensequenz von den anderen beiden ESBLGruppen, sondern auch durch ihre hydrolytische Aktivität. Die CTX-M-ßLaktamasen zeigen auch eine erhöhte Aktivität gegenüber Cephalosporinen
14
der dritten Generation. Cefotaxim wird effektiver durch die CTX-M-ßLaktamasen gespalten [11, 27, 43, 44]. Dies spiegelt sich auch in ihrer
Bezeichnung wider, da CTX eine Abkürzung für Cefotaxim ist.
Sowohl innerhalb wie auch außerhalb des Krankenhausumfeldes sind CTX-Mß-Laktamasen aufzufinden. K. pneumoniae fungiert als Hauptträger der ESBL
in den Krankenhäusern und E. coli analog dazu außerhalb des Krankenhauses
[11].
Im Zuge des Anstiegs der CTX-M-ß-Laktamasen traten immer neue
Untergruppen auf, so dass eine Aufteilung der CTX-M-ß-Laktamasen gemäß
der Aminosäurensequenz erfolgte. Unterschieden werden fünf Hauptgruppen
(CTX-M-1, -M-2, -M-8, -M-9, -M-25), die sich jeweils in zahlreiche
Enzymuntergruppen aufteilen.
Untersuchungen zeigten eine große genetische Übereinstimmung zwischen
den ß-Laktamasengenen von Kluyvera ascorbata (KLUA-1) und Kluyvera
georgiana (KLUG-1) zu den bereits gefundenen CTX-M-ß-Laktamasen [11,
41, 43]. Die Hauptgruppen CTX-M-1 und -M-2 stammen von Kluyvera
ascorbata ab, wohingegen die Hauptgruppen CTX-M-8 und -M-9 von
Kluyvera georgiana abstammen (siehe Tabelle 1) [11, 41].
Tabelle 1: CTX-M Hauptgruppen und Ursprünge [11]
CTX-M Hauptgruppen
CTX-M-1
Jahr
1989
CTX-M-2
1986
CTX-M-8
1996
CTX-M-9
1994
Enzyme CTX-M-1,-3, CTX-M-2,-4, CTX-M-40 CTX-M-9,
-10,-11,-12
-6,-7,-20,-31,
CTX-M-25
2000
CTX-M,-26,
-13,-14,-16, -25,-39,-41
-15,-22,-29, -44
-17,-18,-19,
-30,-32,-33,
-24,-27,-45,
-28,-36,-54
-46,-47,-48
-49,-50
Ursprung K.ascorbata K.ascorbata
K.georgiana K.georgiana nicht bekannt
15
1.3 Genetische Umgebung von ESBL-Genen
Durch den steigenden Anteil der ESBL unter den Krankheitserregern nehmen
bei Infektionen die Limitationen der therapeutischen Möglichkeiten zu. Die
Charakterisierung der genetischen Umgebung von ESBL mit besonderer
Berücksichtigung der Elemente ISEcp1 und ISCR1 sowie den Genen ORF477,
OXA-1 und TEM könnte auf die Herkunft der Resistenzmechanismen und auf
ihren wichtigsten Verbreitungsweg schließen lassen.
1.3.1 ISEcp1
ISEcp1 ist eine Insertionssequenz (IS), die sowohl bei der Expression, die
durch einen starken Promotor extrem gesteigert wird, als auch bei der
Mobilisierung von blaCTX-M-Genen hilfreich ist. Das Element ISEcp1 befindet
sich stromaufwärts der blaCTX-M-Gene und ist vielfach in weitere mobile
genetische Elemente eingebettet. Die Gensequenz des Elementes ISEcp1
beinhaltet einen Abschnitt, der für eine Transposase codiert (siehe
Abbildungen
9
und
14).
Die
Transposase
erkennt
bestimmte
Sequenzwiederholungen an den Enden der zu transponierenden Elemente
(engl.: terminal inverted repeats) und schneidet bzw. ligiert die DNA während
der Transposition. Mit Hilfe dieser Transposase kann die Mobilisierung
einerseits über extrachromosomale Elemente, den sog. Plasmiden, verlaufen,
die zwischen Bakterien ausgetauscht werden können oder andererseits über
Gensequenzen, die von dem Plasmid in das Genom übertragen werden. Die
weltweite Verbreitung der ß-Laktamasen und die daraus resultierende
wachsende Resistenz der Bakterien gegenüber den Cephalosporinen
Cefotaxim und Ceftazidim sind die Folgen der vermehrten Expression und
Mobilisierung der blaCTX-M-Gene. Seit einigen Jahren ist bekannt, dass eine
Assoziation zwischen IS-Elementen bzw. ISEcp1-ähnlichen Elementen und
blaCTX-M-15-Genen besteht, wobei die ISEcp1-ähnlichen Sequenzen den ßLaktamasegenen vorgelagert sind (siehe Abbildung 4) [6, 13, 41, 45, 53].
Nachdem Wissenschaftler die IS-Elemente näher untersucht hatten, wurden
analoge IS-Elemente beim blaCTX-M-19-Gen gesucht. Seitdem konnten bei einer
16
Vielzahl von CTX-M-Genen ISEcp1- oder ISEcp1-ähnliche Sequenzen
aufgefunden werden [7]. Das ISEcp1-Element ist vielfach in mobile
genetische Elemente eingebettet, sodass oft Teile des ISEcp1-Elementes
deletiert werden können.
Abbildung 4: Assoziation zwischen CTX-M-Genen und ISEcp1 [13]
1.3.2 ORF477
Der Begriff ORF steht für „offener Leserahmen“ (engl.: open reading frame)
[49]. Ein „offener Leserahmen“ bezeichnet den Abschnitt der DNA bzw.
mRNA, der von einem Start- bzw. einem Stopp-Signal eingerahmt wird und
die genetische Information zur Synthese von Peptiden oder Proteinen enthält.
Der Bezug zu der vorliegenden Arbeit ist dadurch gegeben, dass zur
genetischen Umgebung von blaCTX-M -Genen die Insertionssequenz ISEcp1, das
OXA-ß-Laktamase-Gen (blaOXA), das TEM-1-Gen sowie das ORF477-Gen
gehören. Bis heute gibt es zahlreiche ORF-Gene, die teilweise bestimmten
Funktionen zugeordnet werden können. Die Bedeutung des Gens ORF477 ist
bis zum heutigen Zeitpunkt jedoch noch nicht abschließend geklärt.
Herausgefunden wurde allerdings, dass das Gen ORF477 dem blaCTX-M-Gen
nachgelagert ist [6, 13, 19].
17
1.3.3 OXA-1
Heutzutage treten neben den ursprünglichen TEM- und SHV- zunehmend
OXA-1-ß-Laktamasen in den Vordergrund. Die OXA-ß-Laktamasen gehören
zur Klasse der Serin-ß-Laktamasen (Klasse D) und wurden zuerst bei Shigella
flexneri
beschrieben
Untersuchungen
über
[32,
das
52].
Mittlerweile
Vorkommen
der
existieren
auch
diverse
OXA-ß-Laktamasen
bei
Enterobacteriaecae. Beispiele dafür sind E. coli und K. pneumoniae. Im
Gegensatz zu den TEM- und SHV-ß-Laktamasen werden die OXA-ßLaktamasen nicht durch die üblichen ß-Laktamase-Inhibitoren gehemmt,
sondern es besteht eine Resistenz gegen Ampicillin / Sulbactam, Amoxicillin /
Clavulansäure sowie gegen Piperacillin / Tazobactam [47, 52].
1.3.4 TEM
Die TEM-ß-Laktamasen gehören zu denjenigen ß-Laktamasen, die zuerst
wissenschaftlich nachgewiesen werden konnten. Beispielsweise wurde die
TEM-1-ß-Laktamase im Jahre 1965 aus E. coli isoliert und ursprünglich als
Temoneira (TEM) bezeichnet [36]. Im Laufe der folgenden Jahre fand eine
große Verbreitung der TEM-ß-Laktamasen bei diversen Spezies statt. Zum
Beispiel wurde die TEM-ß-Laktamase bereits 1969 in Pseudomonas
aeruginosa, 1973 in Vibrio cholera und 1974 in verschiedenen Stämmen von
Haemophilus sowie Neisserien gefunden [31]. Allgemein kann die Aussage
aufgestellt werden, dass TEM-1 überwiegend in E. coli und SHV-1 bei K.
pneumoniae zu finden ist. In der Zwischenzeit sind über einhundert TEM-ßLaktamasen in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben. Die Mehrheit
sind ESBL [36].
1.3.5 ISCR1
Ein weiteres Element, welches im Zusammenhang mit der Mobilisierung von
Genen eine Rolle spielt, ist das sog. ISCR1-Element [11]. Wie bei der
Insertionssequenz ISEcp1, beinhaltet das ISCR1-Element einen Genabschnitt,
der für eine Transposase codiert (siehe Abbildung 15). Die Transposase
18
ermöglicht die Mobilisierung in der gleichen Art und Weise wie bei der
Insertionssequenz ISEcp1. Heutzutage sind verschiedene ISCR-Klassen (z. B.
ISCR1-11) sowie -Untergruppen bekannt. Eine Assoziation des Elementes
ISCR1 mit blaCTX-M-Genen, insbesondere bei blaCTX-M-9 , blaCTX-M-2 und blaCTX-M-20,
ist bereits durch andere Wissenschaftler beschrieben worden (siehe Abbildung
5). Das gemeinsame Auftreten von ISCR1-Elementen mit weiteren
verwandten Sequenzen, zahlreichen assoziierten Resistenzen und ORFs zeigt
eine gemeinsame Mobilisierung an [54].
Abbildung 5: ISCR1 assoziiert mit blaCTX-M (insbesondere blaCTX-M-9 und
blaCTX-M-2) a= Sequenzen mit einer hohen Übereinstimmung mit dem Kluyvera
Genom, b= weitere Gene des Klasse 1 Integron Komplexes [11]
19
2 Zielsetzung
In den letzten Jahren konnte eine Zunahme der Prävalenz von ExtendedSpectrum Beta-Laktamasen (ESBL) bei E. coli und K. pneumoniae sowohl
weltweit, als auch lokal im Raum Bochum beobachtet werden. Bei Infektionen
mit ESBL-Keimen kann es zu schwerwiegenden Krankheitsverläufen
kommen,
da
die
Multiresistenz
der
Keime
eine
Begrenzung
der
therapeutischen Behandlungsmöglichkeiten bewirkt.
In der vorliegenden Dissertation wird die genetische Umgebung von ESBLGenen vom Typ CTX-M in einer Stammsammlung aus dem Bochumer Raum
untersucht.
Die Zielsetzung der Dissertation besteht darin, zu überprüfen, ob die
genetische
Umgebung
der
untersuchten
Stämme
der
Bochumer
Stammsammlung ähnlich ist wie bei Stämmen aus anderen Teilen der Welt.
Bei einer Übereinstimmung der genetischen Umgebungen könnten auf diese
Weise Rückschlüsse auf die Herkunft der ESBL-Isolate bzw. ESBL-Plasmide
gezogen werden.
Um der Zielsetzung der Dissertation gerecht zu werden, wird im ersten Schritt
das Vorkommen der genetischen Elemente ISEcp1B und ISCR1 sowie der
Gene ORF477, OXA-1, TEM in den Bakterienarten E. coli und K.
pneumoniae mit einer ESBL vom CTX-M-Typ untersucht. Im zweiten Schritt
wird der Assoziation von genetischen Elementen mit ESBL-Typen und dem
parallelen Auftreten von Resistenzgenen in ESBL Rechnung getragen.
20
3 Material und Methoden
3.1 Material
3.1.1 Chemikalien
Agarose (Starpure)
Starlab (Ahrensberg)
Ammoniumacetat
Riedel-de-Haen (Seelze)
Blockierungsreagenz
Roche (Mannheim)
Bromphenolblau
Merck (Darmstadt)
CSPD (Chemiluminescense substrate)
Roche (Mannheim)
DIG Luminescent Detection Kit
Roche (Mannheim)
dNTP`s
GE Healthcare Europe GmbH
(Freiburg)
Ethidiumbromid
AppliChem (Darmstadt)
Formamid
J. T. Baker (Griesheim)
Glycerin
J. T. Baker (Griesheim)
Magnesiumchlorid (MgCl2)
J. T. Baker ( Griesheim)
Maleinsäure
Riedel-de-Haen (Seeze)
1 kb Marker
Invitrogen (Karlsruhe)
Mueller-Hinton-Platte
Merck ( Darmstadt)
Natriumchlorid (NaCl)
J. T. Baker (Griesheim)
Natriumcitrat
J. T. Baker (Griesheim)
Natriumdodecylsulfat (SDS)
Biomol (Hamburg)
Natriumhydroxid (NaOH)
J. T. Baker (Griesheim)
Natriumlaurylsarcosine
Sigma Aldrich (Seelze)
PCR DIG Probe Synthesis Kit
Roche (Mannheim)
PCR-Puffer
GE Healthcare Europe GmbH
(Freiburg)
QIAamp DNA Mini Kit
Qiagen (Hilden)
Taq-Polymerase
GE Healthcare Europe GmbH
(Freiburg)
Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris) Sigma Aldrich (Seelze)
Tween 20
Merck (Darmstadt)
21
3.1.2 Puffer und Lösungen
Hybridisierungslösung:
2 % Blockierungsreagenz
0,1 % Natriumlaurylsarcosine
0,02 % SDS
50 % Formamid (stringent)
in SSC (5x) gelöst
Blockierungslösung:
Blocking Reagent (DIG
Luminescent Detection Kit,
Roche)
in DIG-Maleatpuffer gelöst
SSC – Puffer (20x):
3 M NaCl
0,3 M Natriumcitrat
Aqua
pH 7,0 einstellen
DIG-Maleatpuffer:
0,1 M Maleinsäure
0,15 M NaCl
Aqua
pH 7,5 einstellen
DIG-Waschpuffer:
DIG-Waschpuffer
0,3 % Tween 20
DIG-AK-Lösung:
anti-Digoxigenin-AP-Konjugat
(DIG Luminescent Detection
Kit, Roche)
verdünnt in 1 % Blockierungsreagenz
Denaturierungslösung:
0,5 M NaOH
Neutralisierungslösung:
0,2 M NaOH
1 M Ammoniumacetat
22
Waschlösung (niedrig-stringent):
2 x SSC
0,1 % SDS
Aqua
Waschlösung (hoch-stringent):
0,5 % SSC
0,1 % SDS
Aqua
Stripping Solution:
0,2 M NaOH
0,1 % SDS
Aqua
Substratpuffer:
0,1 M Tris (pH 9,5)
0,1 M NaCl
0,05 M MgCl
Aqua
Substrat:
CSPD (DIG Luminescent
Detection Kit, Roche)
in Substratpuffer
Stopp-Mix (10x):
50 % Glycerin
0,25 % Bromphenolblau
10 x TBE – Puffer:
890 nM Tris pH 8,0
890 nM Borsäure
20 nM EDTA
Vor dem Gebrauch wurde der Puffer 1:10 mit Aqua bidest verdünnt.
3.1.3 Stämme
Die untersuchten 177 ESBL-Stämme wurden in dem Zeitraum von Januar
2006 bis November 2007 gesammelt. Davon zählen 102 Stämme zu E. coli
und 75 Stämme zu K. pneumoniae. Die verwendeten Isolate erhielt die
23
Abteilung für Medizinische Mikrobiologie der Ruhr-Universität Bochum aus
dem Institut für Medizinische Mikrobiologie. Diese Isolate waren bei
Patienten aus den Universitätskliniken Marienhospital in Herne und dem
Knappschaftskrankenhaus in Bochum-Langendreer isoliert worden. Beide
Krankenhäuser sind als Universitätskliniken Zentren der Maximalversorgung
und zeichnen sich durch eine hohe Patientenanzahl sowie durch ein breites
Spektrum an Grunderkrankungen aus. Die gesammelten Stämme wurden im
Vorfeld phänotypisch mittels eines Synergietestes mit Clavulansäure als ESBL
identifiziert.
Im
Rahmen
einer
anderen
Studie
war
bereits
durch
Sequenzierung der ESBL-Typ bestimmt worden.
3.1.4 Geräte
Biofuge 13
Heraeus Sepatech (Frankfurt)
Fluor-STM MultiImager
Bio-Rad
Gelelektrophoresekammer PEQLAB – Biotechnologie GmbH (Erlangen)
Hybridisierungsofen
GFL ( Gesellschaft für Labortechnik) (Hannover)
Inkubator
Heraeus Instruments (Frankfurt)
Mastercycler personal
Eppendorf AG (Hamburg)
Schüttler
GFL ( Gesellschaft für Labortechnik) (Hannover)
3.1.5 Antibiotika
Die verwendeten Antibiotikatestplättchen wurden von der Firma Oxoid
(Wesel) bezogen. Sie waren mit folgenden Antibiotika-Konzentrationen
beschickt:
Amoxycillin-Clavulansäure (AMC)
30 µg
Aztreonam (ATM)
30 µg
Cefepim (FEP)
30 µg
Cefotaxim (CTX)
30 µg
Cefpirom (CPO)
30 µg
Ceftazidim (CAZ)
30 µg
24
3.1.6 Sonstige Materialien
1-100µl Bevelled Filter Tips
Starlab (Ahrensberg)
0,1 – 10 µl Bevelled Filter Tips
Starlab (Ahrensberg)
Nylonmembran positiv geladen
Amersham Hyperfilm MP über GE
Healthcare Europe GmbH ( Freiburg)
Filterpapier
Schleicher & Schuell GmbH (Dassel)
alle Plastikwaren
Greiner Bio One ( Frickenhausen)
Autoradiographiefilm
Hyperfilm (Amersham über GE
Healthcare)
25
Tabelle 2: Primer
Primersequenz
Gen
CTX-M-1_540
CTX-M-9-mR_bae
ISCR1-F_bae
ISEcp1_5`_eckert
ISEcp1_A
ISEcp1_B
MA1_rev_eckert
ORF477_rev
OXA-1-
Primername
5`-GCG TGA TAC CAC TTC ACC TC-3`
5`-TCA ATT TGT TCA TGG CGG TA-3`
5`-GCG AGT CAA TCG CCC ACT-3`
5`-TTC AAA AAG CAT AAT CAA AGC C-3`
5`-GCA GGT CTT TTT CTG CTC C-3`
5`-TTT CCG CAG CAC CGT TTG C-3`
5`-ACY TTA CTG GTR CTG CAC AT-3`
5`-ACT TCA AAA ATT ATG CCA CC-3`
5`-GGA TAA AAC CCC CAA AGG AA-3`
blaCTX-M
ISCR1
ISCR1
ISEcp1
ISEcp1
ISEcp1
blaCTX-M
ORF477
bla OXA-1-like
like_fw_karisik
OXA-1-
5`-TGC ACC AGT TTT CCC ATA CA-3`
bla OXA-1-like
like_rev_karisik
tnpA1_ISEcp1_eckert
TEM_seq
TEM_rev
5`-AAT ACT ACC TTG CTT TCT GA-3`
5`-TCA ACA TTT CCG TGT CG-3`
5`-CTG ACA GTT ACC AAT GCT TA-3`
ISEcp1
bla TEM
blaTEM
Tabelle 3: Primer und Primerposition
Primername
GenBank Accession
Position
Nr.
Literaturquelle
CTX-M-1_540
AF550415: 3779 – 3798
3779–3798
Abt. med.
CTX-M-9-mR_bae
ISCR1-F_bae
ISEcp1_5`_eckert
ISEcp1_A
ISEcp1_B
MA1_rev_eckert
EF450247: 6212-6231
EF450247: 3940-5481
AF458080: 4761-4782
GQ385329: 176-196
GQ385329: 701 – 683 (rev.)
AF458080: 6668-6649
6212-6231
3940-5481
4761-4782
176-196
701-683
6668-6649
Mikrobiologie
[4]
[4]
[13]
[45]
[45]
[13]
ORF477_rev
(rev.)
AF550415: 4220–4239
4220–4239
Abt. med.
OXA-1-
(rev.)
RGNLACB:1643-1662
1643-1662
Mikrobiologie
[22]
like_fw_karisik
OXA-1-
RGNLACB:1993-2012
1993-2012
[22]
like_rev_karisik
tnpA1_ISEcp1_eckert
TEM_seq
(rev.)
AF458080: 5845-5864
CP000649: 21890-21906
5845-5864
21890
[13]
[50]
CP000649: 22730 –22749
-21906
22730-
[50]
(rev.)
22749
TEM_rev
Die in dieser Arbeit verwendeten Primer wurden bei MWG Biotech
(Ebersberg) mit der Reinheitsstufe HPSF synthetisiert.
26
3.2 Methoden
3.2.1 Präparation von genomischer DNA von Enterobacteriaceae
Um genomische Bakterien-DNA als Ausgangsmaterial für die weiteren
Untersuchungen zu erhalten, wurden zunächst 5 ml LB-Medium mit einer
Kolonie beimpft und für 16-18 Stunden bei 37°C geschüttelt. Aus der ÜNKultur wurde ein DDST (siehe Kapitel 3.2.2) angelegt, um nachzuweisen, dass
der Stamm immer noch ESBL-positiv war und kein Plasmidverlust
stattgefunden hatte. 1,5 ml der Übernachtschüttelkultur wurden für eine
Minute bei 12000 x g zentrifugiert und der Überstand verworfen.
Die genomische Bakterien-DNA wurde mit dem QiaAmp-DNA-Mini-Kit
hergestellt. Das verbleibende Pellet wurde in 180 µl ATL-Puffer suspendiert
und anschließend sowohl Proteinase K (20 µg), als auch RNase (20 µg) zur
Zelllyse hinzugegeben. Die Proteinase K wurde hierzu bei 56°C für 1530 Minuten und die RNase bei Raumtemperatur für 2 Minuten inkubiert.
Die nächsten Schritte dienten der Entfernung von Zellrückständen. Dazu
wurden dem Pellet sowohl 200 µl AL-Puffer (für 10 Minuten bei 70°C
inkubiert), als auch 200 µl Ethanol hinzugefügt, resuspendiert und
anschließend auf eine QIAamp spin Säule gegeben. Diese Säule wurde bei
6000 x g für 1 Minute zentrifugiert. Danach folgten die Waschschritte mit den
Waschpuffern AW1 (zentrifugiert bei 6000 x g für 1 Minute) und AW2
(zentrifugiert bei 12000 x g für 3 Minuten).
Zur Eluation der DNA wurde AE zugegeben und im Anschluss daran für
1 Minute bei 6000 x g zentrifugiert. Dieser Vorgang wurde einmal wiederholt,
um genügend DNA für die weiteren Untersuchungen zu erhalten.
27
3.2.2 DDST-Test zum Nachweis von ESBL bei Enterobacteriaceae
Zur Überprüfung, ob die verwendeten Stämme nach der Anzüchtung in der
ÜN-Kultur immer noch ESBL-positiv sind und kein Plasmidverlust
stattgefunden hat, wurde ein DDST-Test durchgeführt.
Dazu wurden die angezüchteten Bakterien in physiologischer Kochsalzlösung
suspendiert und die optische Dichte auf einen Standard gemäß McFarland 0,5
eingestellt. Ein Tupfer wurde in diese Keimsuspension getaucht und damit
eine
Mueller-Hinton-Agar-Platte
beimpft.
Anschließend
wurden
die
Antibiotikatestblättchen in einem Abstand von 2 cm zueinander aufgelegt
(siehe Abbildung 6) . Im Mittelpunkt dieser Anordnung befand sich das
Amoxycillin-Clavulansäure-Antibiotikatestplättchen (AMC). Die Resistenzplatte wurde im Anschluß daran 16-18 Stunden bei 35°C bebrütet. Als
positives
Ergebnis
im
Sinne
eines
ESBL-Nachweises
wurde
eine
Hemmhofvergrößerung bei den umliegenden Plättchen in Richtung auf das
Plättchen mit Amoxicillin-Clavulansäure gewertet.
28
Abbildung 6: DDST-Test
3.2.3 Detektion der Resistenzgene
Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion wurde die genetische Umgebung von
blaCTX-M-Genen untersucht sowie nach weiteren Resistenzgenen in den Isolaten
gesucht. Die Dot-Blot-Hybridisierung wurde als zusätzliche Methode zur
Detektion von Genen eingesetzt.
3.2.3.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
3.2.3.1.1 Allgemeine Verfahrensbeschreibung
Die Polymerase-Kettenreaktion (engl.: Polymerase Chain Reaction (PCR)) ist
eine als Standardverfahren etablierte Methode zur in vitro Amplifizierung
eines
spezifischen
DNA-Bereiches,
welcher
durch
zwei
Primer
(sequenzspezifische Startermoleküle, siehe Tabelle 2) festgelegt wird, die eine
gegenläufige Orientierung aufweisen. Das Ziel des Verfahrens ist, dass nur der
gewünschte DNA-Abschnitt exponentiell amplifiziert wird.
29
Die Synthese wird mit Hilfe einer thermostabilen DNA-Polymerase (TaqPolymerase) und Desoxyribonukleosidtriphosphaten durchgeführt, welche
einen sich ständig wiederholenden Reaktionszyklus durchlaufen:
Denaturierung:
Es findet eine Erhöhung der Temperatur auf etwa 94°C statt, damit sich
der DNA-Doppelstrang in seine beiden komplementären Einzelstränge
aufspaltet. Nur durch diese Trennung der Doppelstränge wird die
Anlagerung der Primer möglich gemacht.
Annealing:
Die anschließende Abkühlung auf eine bestimmte, von den Primern
verwendete spezifische Temperatur bewirkt die Hybridisierung der
Primer an ihre komplementären DNA-Strukturen auf den DNAEinzelsträngen.
Elongation:
Durch die thermostabile DNA-Polymerase werden die beiden
Einzelstränge
mit
Hilfe
der
zugesetzten
Desoxyribonukleosidtriphosphaten zu Doppelsträngen komplementiert.
Als Ansatzpunkte für die Polymerisation dienten die hybridisierten
Primer. Die Elongation erfolgte nahe dem Temperaturoptimum der
Taq-Polymerase bei 72°C. Die benötigte Phasenzeit ist abhängig von
der Länge des zu amplifizierenden Fragments.
Die verwendeten Amplifikationszyklen sind in einer separaten Tabelle
aufgeführt (siehe Tabelle 4). Die einzelnen Temperaturschritte wurden mit
Hilfe eines Thermocylcers von Mastercycler personal vorgenommen.
3.2.3.1.2 Herstellung des Reaktionsansatzes
Für die PCR wurde genomische DNA verwendet. Für einen 25 µl
Reaktionsansatz wurden 2,5 µl 10x PCR-Puffer, 5 pmol dNTP`s, 25 pmol von
30
jedem Primer
und 0,625 U Taq-Polymerase
in
ein
Reaktionsgefäß
zusammenpipertiert. Über eine Gelelektrophorese wurde die Konzentration
der zuvor gewonnenen genomischen DNA (siehe Kapitel 3.2.1) analysiert und
bewertet. Anschließend wurden je 5 µl genomische DNA pro Reaktionsgefäß
hinzugegeben, die in einer Verdünnung von 1:10 des ursprünglichen QiAamp
vorlagen. Als Negativkontrolle wurde für jede PCR ein Ansatz mit Aqua
bidest verwendet.
3.2.3.2 Gelelektrophorese
Das Prinzip der Gelelektrophorese beruht auf einer spannungsabhängigen
Auftrennung von DNA-Fragmenten nach ihrer Ladung und Größe. Die
gelelektrophoretische Auftrennung erfolgte in einem 0,8 %-igen Agarosegel in
einer horizontalen Elektrophoresekammer bei einer angelegten konstanten
Spannung von 10 V/cm. Dazu wurde die Agarose im TBE-Puffer kurz
aufgekocht und nach dem Abkühlen auf ca. 50°C in die Gelkammer gegossen.
Jeder Gesamtansatz der PCR wurde mit jeweils 5 µl Stopp-Mix versehen und
auf
das
gehärtete
Agarosegel
aufgetragen.
Weiterhin
wurde
zur
Größenbestimmung der Proben auf jedes Gel ein 1 kb-DNA-Leiter
aufgetragen, mit dessen Hilfe die Größe der Fragmente anhand ihrer Laufweite
abgeschätzt werden konnte. Nachdem dies geschehen war, konnte das Gel in
die mit 10 x TBE Puffer gefüllte Gelkammer eingesetzt werden.
Nach entsprechender Laufzeit konnte das Agarosegel aus der Gelkammer
entfernt und bei Raumtemperatur in einem Ethidiumbromidbad (250 µg / l) für
5-10 Minuten gefärbt werden, damit eine Detektion der DNA bzw. eine
Identifizierung der Banden unter UV-Licht (254 nm) möglich war. Mit Hilfe
des MultiImager (Bio Rad) wurden die gefärbten Agarosegele fotografiert.
31
Tabelle 4: Verwendete PCR-Profile
Primer:
MA1_rev_eckert /
Temperatur:
Zeit:
94°C
5 min
94° C
30 sec
3. Annealing ( Primerbindung)
56° C
15 sec
4. Annealing II
50° C
15 sec
mit einer
von 0,3°C / sec
1. Initial Denaturierung
tnpA1_ISEcp1_eckert 2. Denaturierung
Abkühlungsrate
5. Elongation
6. Amplifikation
72°C
60 sec
35 Zyklen
7. Final Elongation
72°C
7 min
MA1_rev_eckert /
1. Initial Denaturierung
94°C
5 min
ISEcp1_5`_eckert
2. Denaturierung
94° C
30 sec
3. Annealing ( Primerbindung)
55° C
30 sec
4. Elongation
68°C
2 min
10
Wiederholungen
der
Schritte 2-4
5. Denaturierung
94° C
30 sec
6. Annealing ( Primerbindung)
55° C
30 sec
7. Elongation
68°C
2 min + 0:05 min
pro Zyklus
OXA-1-
20
Wiederholungen
der
Schritte 5-7
8. Final Elongation
72°C
7 min
1. Initial Denaturierung
94°C
5 min
2. Denaturierung
94° C
25 sec
3. Annealing ( Primerbindung)
52° C
40 sec
4. Elongation
72°C
50 sec
like_fw_karisik /
OXA-1like_rev_karisik
CTX-M-1_540 /
5. Amplifizierung
30 Zyklen
6. Final Elongation
72°C
6 min
1. Initial Denaturierung
94°C
5 min
2. Denaturierung
94° C
30 sec
3. Annealing ( Primerbindung)
55° C
30 sec
4. Elongation
72°C
45 sec
OFR477_rev
5. Amplifizierung
30 Zyklen
32
6. Final Elongation
72°C
6 min
94°C
5 min
2. Denaturierung
94° C
30 sec
3. Annealing ( Primerbindung)
42° C
30 sec
4. Elongation
72°C
30 sec
TEM_seq / TEM_rev 1. Initial Denaturierung
5. Amplifizierung
30 Zyklen
6. Final Elongation
72°C
6 min
94°C
5 min
2. Denaturierung
94° C
30 sec
3. Annealing ( Primerbindung)
52° C
30 sec
4. Elongation
72°C
45 sec
ISEcp1A / ISEcp1B 1. Initial Denaturierung
ISCR1-F_bae /
CTX-M-9-mR_bae
5. Amplifizierung
30 Zyklen
6. Final Elongation
72°C
6 min
1. Initial Denaturierung
94°C
5 min
2. Denaturierung
94° C
30 sec
3. Annealing ( Primerbindung)
54° C
15 sec
4. Annealing II
50° C
15 sec
mit einer
von 0,3°C / sec
Abkühlungsrate
5. Elongation
6. Amplifikation
7. Final Elongation
72°C
90 sec
35 Zyklen
72°C
7 min
33
3.2.3.3 Dot Blot
Die Dot Blot-Hybridisierung stellt eine Analysemethode zum Nachweis
spezifischer DNA-Sequenzen dar. Eine Vielzahl von Proben können parallel
auf einer Membran aufgetragen und anschließend über eine nicht-radioaktive
Markierung mittels Lichtemission detektiert werden.
3.2.3.3.1 Sondenherstellung
Im Vorfeld musste zunächst eine nicht-radioaktive Sonde hergestellt werden.
Die Markierung erfolgte über eine PCR-Amplifikation, bei der man
(Digoxigenin-) markierte Nukleotide hinzufügte. Für diese PCR wurde der in
Tabelle 4 dargestellte Reaktionsmix in ein Reaktionsgefäß pipettiert.
Tabelle 5: Reaktionsmix bei der DIG-Markierung von DNA-Sonden
(PCR DIG Probe Synthesis Kit)
Reagenz
Bidest
PCR-Puffer x 10
µl pro Ansatz
33,5
5
Primer 1, 20 pmol / µl
2,5
Primer 2, 20 pmol / µl
2,5
Enzyme Mix
0,75
Während der Negativkontrolle zusätzlich 1 µl Aqua bidest hinzugefügt wurde,
wurde dem weiteren Reaktionsreagenz 1 µl genomische DNA beigemengt.
Zur Sondenherstellung wurden nur Stämme verwendet, bei denen das gesuchte
Gen bereits durch Sequenzierung nachgewiesen worden war.
Im Anschluss daran wurden 5 µl DIG Labeling Mix hinzupipettiert. Dieser
Mix enthielt die nicht-radioaktiv markierten Nukleotide, welche im Rahmen
der Amplifikation eingebaut wurden (siehe Abbildung 7). Die benutzen
Sonden mit den markierten Nukleotiden wurden von den verwendeten DIGAntikörpern erkannt und konnten bei der späteren Analyse detektiert werden.
34
Abbildung 7: Prinzip der Sondenmarkierung mit DIG-markierten dUTP
Aus der Zugabe der Nukleotide resultierte ein Gesamtvolumen von 50µl, das
jeweils durch das geeignete PCR-Profil in ausreichender Menge amplifiziert
wurde. Als Kontrolle wurde eine Gelelektrophorese mit 5 µl auf einem 0,8 %igen Agarosegel durchgeführt (siehe Kapitel 3.2.3.2).
3.2.3.3.2 Herstellung und Auswertung des Dot Blots
Zur
Durchführung
der
Chemilumineszenszdetektion
wurde
für
die
Hybridisierung eine positiv geladene Nylonmembran benutzt. Auf diese
Nylonmembran wurden 5 µl DNA sowohl der Proben, als auch der Positivund Negativkontrollen aufgetragen. Nachdem der Blot getrocknet war, wurde
er mit der DNA-Seite nach oben in verschiedene Lösungen äquibriliert und
danach auf Filterpapier gelegt (siehe Tabelle 6). Anschließend wurde der Blot
bei einer Temperatur von 120°C für 30 Minuten gebacken.
35
Tabelle 6: Dauer und Reihenfolge der verwendeten Lösungen
Denaturierungslösung:
5 min
Neutralisierungslösung:
1 min
Neutralisierungslösung:
1 min
Neutralisierungslösung:
1 min
Neutralisierungslösung:
5 min
Hybridisierung des Blots
Im weiteren Verlauf wurde der Blot, der sich in einem 50 ml Falcon Tube
befand, mit 10 ml der Hybridierungslösung für 30 Minuten im Inkubator bei
42°C vorhybridisiert. Diese Prähybridisierung diente dem Zweck, die
verbleibenden freien Bindungsstellen abzusättigen, d. h. diese zu blockieren.
Im nächsten Schritt wurde die Hybridisierungslösung durch die vorher
markierte Sondenlösung ersetzt, die zuvor für 10 Minuten bei 95° – 100°C
denaturiert wurde. Abschließend wurde der Falcon Tube über Nacht im
Inkubator bei 42°C belassen. Die Sonde lagerte sich während der
Hybridisierung nur an die komplementären Fragmente der genomischen DNA
an und konnte damit im späteren Verlauf über Antikörperbindung und
Chemilumineszensz sichtbar gemacht werden.
Entwicklung des Blots
Die weitere Bearbeitung des Blots verfolgte das Ziel, die Lichtemission
detektieren zu können. Wenn nicht anders beschrieben, erfolgten die Schritte
bei Raumtemperatur und auf einem Schüttler (siehe Tabelle 7).
36
Tabelle 7: Dauer und Reihenfolge der verwendeten Puffer und
Waschlösungen
5 min (2x)
15 min (2 x)
2 min
niedrig-stringente Waschlösung
hoch-stringente Waschlösung bei 65°C
DIG – Waschpuffer
30 min
Blockierungsreagenz 1 % ( in DIG-Maleat Puffer angesetzt)
30 min
DIG-AK-Lösung
15 min (2 x)
DIG – Waschpuffer
2 min
Detektionspuffer
Mit Hilfe der Waschlösungen sollten unspezifische DNA-Bindungen,
insbesondere die unspezifisch gebundene Sonde, gelöst werden. Durch das
zweimalige Äquilibrieren in DIG-Waschpuffer über jeweils 15 Minuten
wurden ungebundene Antikörper entfernt. Die verbleibenden Antikörper, die
an der markierten Sonde gebunden hatten, trugen ein Fab-Fragment, das mit
alkalischer Phosphatase konjugiert war.
Im Hinblick
auf
die Detektionsreaktion
wurde der
Blot in
eine
Einschweißfolie gelegt und mit einer 400 µl CSPD-Gebrauchslösung versetzt,
die gleichmäßig auf dem Blot verteilt sein sollte. Die CSPD-Gebrauchslösung
wurde enzymatisch dephosphorilisiert und führte zur Bildung eines
metastabilen Phenolat-Anions, welches bei Zerfall mit einem Maximum bei
477 nm emittiert (siehe Abbildung 8). Für die Lumineszenz-Reaktion erfolgte
eine zehnminütige Inkubation bei 37°C im Inkubator.
37
Abbildung 8: Prinzip des indirekten nicht-radioaktiven Nachweises von
gesuchten DNA-Abschnitten [34]
In
der
Dunkelkammer
Autoradiographiefilms
Expositionszeiten
90 Minuten).
wurde
(Hyperfilm,
detektiert
die
Lichtemission
Amersham)
(5 Minuten,
mit
15 Minuten,
mit
Hilfe
eines
unterschiedlichen
45 Minuten
und
Die Filme wurden mit einem Entwicklungsgerät für
Röntgenfilme (Kodak) entwickelt und anschließend zur Auswertung mit dem
BioRad MultiImager-System fotografiert.
38
4 Ergebnisse
4.1
Untersuchung
pneumoniae
auf
ISEcp1B
bei
E.
coli
und
K.
Die Untersuchung auf das vor dem Gen blaCTX-M gelagerte Insertionselement
ISEcp1B geschah mit Hilfe der PCR. Zur Identifizierung dieses Elementes
wurden die zwei Primerpaare MA1_rev_eckert / tnpA1_ISEcp1_eckert und
MA1_rev_eckert
/
ISEcp1_5`_eckert
verwendet,
die
sich
in
ihren
Bindungsstellen unterscheiden (siehe Abbildung 9).
Abbildung 9: Verwendete Primer mit Bindungsstellen tnpA= Transposase
Gen in der Insertionssequenz ISEcp1 gelegen, IRR bzw. IRL: inverted repeat
right bzw. left, Primer: 1= ORF 477rev 2= CTX-M-1_540 3= ISEcp1A 4=
ISEcp1B 5= ISEcp1_5` 6= Ma1rev 7= tnpA1_ISEcp1 Sonden: a=
Ma1_rev_eckert / ISEcp1_5_eckert` b= ORF477 rev / CTX-M-1_540 c=
ISEcp1A / ISEcp1B d= Ma1_rev_eckert / tnpA1_ISEcp1_eckert
Der Nachweis von ISEcp1B bei den insgesamt 102 E. coli-Stämmen gelang
mittels des Primerpaares MA1_rev_eckert / tnpA1_ISEcp1_eckert bei 70
Stämmen. Bei 32 Stämmen konnte mit diesen Primern kein Amplifikat erzielt
39
werden. Eine Amplifikation mit dem zweiten Primerpaar erfolgte bei 42
Stämmen. Kein Nachweis konnte bei 60 Stämmen erzielt werden.
Während mit den Primern MA1_rev_eckert und tnpA1_ISEcp1_eckert das
Amplifikat bei der Mehrzahl der Stämme bei 800 bp lag, ergab sich bei zwölf
Stämmen ein Amplifikat größer als 800 bp. Die Abbildung 10 zeigt Beispiele
für beide Varianten. Die anschließende PCR-Untersuchung der 75 K.
pneumoniae-Stämme
mit
dem
Primerpaar
MA1_rev_eckert
/
tnpA1_ISEcp1_eckert zeigte als Resultat 39 Stämme mit Amplifikat und 36
Stämme ohne Amplifikat. Die Überprüfung mittels des Primerpaares
MA1_rev_eckert / ISEcp1_5`_eckert ergab bei sieben Stämmen ein
Amplifikat. Kein Amplifikat konnte bei 68 Stämmen erzielt werden. Die
Ergebnisse sind in den Tabellen 8 und 9 verdeutlicht.
Eine weitere Untersuchung der 102 E. coli-Stämme auf ISEcp1B wurde mit
Hilfe des Dot Blots durch zwei Sonden, welche mit Hilfe der Primerpaare
Ma1_rev_eckert / ISEcp1B und ISEcp1B / ISEcp1A hergestellt wurden,
durchgeführt.
Die
Detektion
positiver
Signale
mittels
der
Sonde
Ma1_rev_eckert / ISEcp1B erfolgte bei 99 Stämmen, wobei bei drei Stämmen
kein positives Signal detektiert werden konnte.
Im Vergleich dazu konnte bei 90 Stämmen ein positives Hybridisierungssignal
mittels der Sonde ISEcp1B / ISEcp1A detektiert werden. Bei zehn Stämmen
konnte keine Detektion erfolgen.
Die gleiche Untersuchung auf das Gen ISEcp1B mittels Dot Blot wurde auch
bei den 75 K. pneumoniae-Stämmen vorgenommen. Mit der Sonde
Ma1_rev_eckert / ISEcp1B konnte das Gen ISEcp1B bei 74 Stämmen
gefunden werden, während es bei einem einzigen Stamm nicht zu
identifizieren war.
40
M
A B C D M K E F
1500
1000
800
500
Abbildung 10: PCR mit dem Primerpaar MA1_rev_eckert /
tnpA1_ISEcp1_eckert. Spur A: E. coli Stamm 5123, Spur B: E. coli Stamm
5123 1:10 verdünnt, Spur C: E. coli Stamm 5125, Spur D: E. coli Stamm 5125
1:10 verdünnt, Spur E: K. pneumoniae Stamm 3206, Spur F: K. pneumoniae
Stamm 2945, Spur M: Molekulargewichtsmarker 100bp, Spur K: Kontrolle
(Wasser)
Mit Hilfe der Sonde ISEcp1A / ISEcp1B ließ sich bei 73 Stämmen das
Element ISEcp1B detektieren, wohingegen bei zwei Stämmen kein Signal
detektiert werden konnte.
Wenn die PCR mit dem Primerpaar MA1_rev_eckert / tnpA1_ISEcp1_eckert
oder MA1_rev_eckert / ISEcp1_5`_eckert ein Amplifikat zeigte, wurde für die
weitergehende Auswertung davon ausgegangen, dass sich das Element ISEcp1
dem CTX-M-Gen vorgelagert befindet.
41
4.2 Untersuchung auf ORF477 bei E. coli und K. pneumoniae
Die Auswertung der 102 E. coli-Stämme mittels PCR ergab bei 91 Stämmen
einen positiven Nachweis des gesuchten Genabschnittes, welches dem Gen
blaCTX-M nachgelagert ist. Kein Nachweis konnte bei elf Stämmen erzielt
werden. Bei den anschließend untersuchten 75 K. pneumoniae-Stämmen
enthielten 45 Stämme das Gen, während 30 Stämme das nachgeschaltete Gen
blaCTX-M nicht aufwiesen.
Die Untersuchung der 102 E. coli-Stämme mittels Dot Blot ließ erkennen, dass
bei 87 Stämmen ein positives Hybridisierungssignal detektiert werden konnte,
wohingegen bei 15 Stämmen kein Signal aufgefunden werden konnte.
Bei der Untersuchung der 75 K. pneumoniae-Stämme fiel auf, dass 73 Stämme
ein positives Signal hatten. Lediglich bei zwei Stämmen konnte kein Signal
detektiert werden. Ein Ausschnitt der mittels Dot Blot untersuchten K.
pneumoniae Stämme ist in Abbildung 11 dargestellt.
Klpn Ecol Klpn Klpn Klpn Klpn Klpn
2934 2708 ATCC ATCC 4529 4530 4553
10031 25922
Klpn Klpn Klpn Klpn Klpn Klpn Klpn
4586 4601 4616 4669 4675 4680 4687
Klpn Klpn Klpn Klpn Klpn Klpn Klpn
4703 4707 4749 4770 4772 4800 4813
Klpn Klpn Klpn Klpn Klpn Klpn Klpn
4818 4821 4856 4866 4870 4882 4916
Klpn Klpn Klpn Klpn Klpn
4952 4953 5000 5013 5077 Frei
Klpn
2610
Klpn Klpn Klpn Klpn Klpn Klpn Klpn
3341 3470 3881 4018 4037 4045 4092
Abbildung 11: Dot Blot Sonde ORF477 / CTX-M-1-540, Negativkontrollen
sind grau hinterlegt; K. pneumoniae 2934 und E. coli 2708 sind die positiv
verwendeten Kontrollen.
42
Bei der Überprüfung auf das ORF477-Gen ergaben sich Unterschiede in den
Ergebnissen der PCR und des Dot Blots. Die Ergebnisse bei den diskordanten
Fällen stellten sich bei 15 Isolaten in der Weise dar, dass beim Dot Blot kein
Hybridisierungssignal detektiert werden konnte. In der PCR war jedoch ein
Amplifikat nachzuweisen.
Bei den K. pneumoniae-Stämmen ergab sich bei 28 Stämmen im Dot Blot ein
positives Signal. Im Gegensatz konnte in der PCR kein Amplifikat erzielt
werden. Aufgrund der problematischen Auswertung der Dot Blot-Ergebnisse
wurden für die weitere Auswertung die PCR-Ergebnisse herangezogen.
43
4.3 Untersuchung auf OXA-1 bei E. coli und K. pneumoniae
Die Überprüfung der 102 E. coli-Stämme mittels PCR ergab bei 54 Stämmen
eine positive Bande. Im Gegensatz dazu konnte bei 48 Stämmen kein Hinweis
auf ein Vorkommen des Gens gefunden werden.
Die durchgeführte PCR bei den 75 K. pneumoniae-Stämmen zeigte bei 36
Stämmen einen positiven Hinweis. Bei 39 Stämmen gab es keinen Hinweis
auf das Vorhandensein von OXA-1 (siehe Tabelle 9).
4.4 Untersuchung auf TEM bei E. coli und K. pneumoniae
Die bei E. coli durchgeführte PCR zeigte bei 84 Stämmen einen positiven
Nachweis und bei 18 Stämmen fand sich keine Bande. Bei den 75 K.
pneumoniae-Stämmen fanden sich bei 37 Stämmen eine Bande als Hinweis
auf das Vorkommen des Gens TEM, während bei 38 Stämmen kein Nachweis
gelang (siehe Tabellen 8 und 9).
Die Überprüfung der 102 E. coli-Stämme mittels Dot Blot ergab, dass 79
Stämme ein positives Signal bei der Suche nach dem Gen blaTEM und 23
Stämme kein Signal aufwiesen. Bei der anschließenden Untersuchung der
vorhandenen K. pneumoniae-Stämme (75 Stämme) kristallisierte sich heraus,
dass 40 Stämme über ein positives Hybridisierungssignal verfügten. Bei 35
Stämmen konnte kein Signal detektiert werden. Ein Ausschnitt der mittels Dot
Blot untersuchten E.coli-Stämme ist in Abbildung 12 dargestellt.
Bei der Untersuchung der vorhandenen E. coli-Stämme nach dem blaTEM -Gen
zeigten sich diskordante Ergebnisse in der PCR und dem Dot Blot. Bei fünf
Stämmen war die PCR negativ, aber beim Dot Blot konnte ein positives
Hybridisierungssignal detektiert werden. In sieben Fällen wurde die PCR als
fraglich positiv bewertet. Der Dot Blot verfügte bei diesen Stämmen über kein
Signal. Bei zehn Stämmen ergab die PCR ein positives Resultat, aber der Dot
Blot wies kein Signal auf.
44
Klpn Ecol Klpn Klpn Ecol Ecol Ecol
2934 2708 ATCC ATCC 2601 2673 2677
10031 25922
Ecol Ecol Ecol Ecol Ecol Ecol Ecol
2679 2708 2767 2768 2775 2793 2808
Ecol Ecol Ecol Ecol Ecol Ecol Ecol
2868 2874 2879 2882 2885 2915 2935
Ecol Ecol Ecol Ecol Ecol Ecol Ecol
2967 3012 3094 3095 3096 3123 3145
Ecol Ecol Ecol Ecol Ecol Ecol Ecol
3213 3215 3242 3289 3296 3299 3334
Ecol Ecol Ecol Ecol Ecol Ecol Ecol
3370 3385 3391 3393 3401 3420 3440
Ecol Ecol Ecol Ecol Ecol Ecol Ecol
3441 3540 3589 3616 3625 3639 3665
Abbildung 12: Dot Blot Sonde TEM_seq / TEM_rev, Negativkontrollen
sind grau hinterlegt; K. pneumoniae 2934 und E. coli 2708 sind die positiv
verwendeten Kontrollen.
Es zeigte sich weiterhin, dass von den insgesamt 21 K. pneumoniae-Stämmen,
die unterschiedliche Ergebnisse in der PCR und dem Dot Blot aufwiesen, drei
Stämme in der PCR als negativ erschienen. Allerdings konnte im Dot Blot ein
positives Signal detektiert werden. Bei zwei Stämmen zeigte die PCR ein
positives Ergebnis und beim Dot Blot war kein Signal auffindbar. In einem
Fall ergab die PCR kein positives Ergebnis, und der Dot Blot zeigte nur ein
schwaches Hybridisierungssignal. Bei der Mehrheit der Abweichungen wurde
das PCR-Ergebnis als fraglich positiv bewertet. Der Dot Blot hingegen fiel
negativ aus. Dies war bei 15 Stämmen der Fall.
Für die weitere Auswertung wurde das Ergebnis der PCR verwendet, weil die
Dot Blot-Ergebnisse nicht immer eindeutig ausgewertet werden konnten.
45
4.5 Untersuchung auf ISCR1 bei E. coli und K. pneumoniae
Die CTX-M-ß-Laktamasen wurden hinsichtlich der Existenz von ISCR1, das
dem Gen blaCTX-M vorgelagert ist, überprüft. Die insgesamt 102 E. coli-Stämme
wiesen zwei Stämme der Gruppe CTX-M-9 und neun Stämme der Gruppe
CTX-M-14 auf. Die PCR ergab, dass bei beiden CTX-M-9-Stämmen das
Element ISCR1 dem Gen blaCTX-M vorgelagert ist. Dieser Nachweis gelang
ebenfalls bei acht CTX-M-14-Stämmen.
Unter den isolierten 75 K. pneumoniae-Stämmen war lediglich ein Stamm der
Gruppe CTX-M-9 vorhanden. Die durchgeführte PCR bei diesem Stamm
zeigte einen positiven Nachweis von ISCR1. Die oben beschriebenen
Ergebnisse sind in den Tabellen 8 und 9 verdeutlicht. Die CTX-M-ßLaktamasegruppen CTX-M-1, -3 und -15 wurden nicht getestet, weil für diese
ß-Laktamasetypen in bisherigen Studien keine Assoziation mit ISCR1
beobachtet werden konnte.
MA B CDE F GH I J KLMNO PQ RS T UVK
Abbildung 13: PCR mit dem Primer ISCR1mFbae / CTX-M-9mRbae ;
Spur A: E. coli Stamm 2677, Spur B: E. coli Stamm 2677 1:10 verdünnt, Spur
C: E. coli Stamm 3299, Spur D: E. coli Stamm 3299 1:10verdünnt, Spur E: E.
coli Stamm 2884, Spur F: E. coli Stamm 2884 1:10 verdünnt, Spur G: E. coli
Stamm 3420, Spur H: E. coli Stamm 3420 1:10 verdünnt, Spur I: E. coli
Stamm 4081, Spur J: E. coli Stamm 4081 1:10 verdünnt, Spur K: E. coli
46
Stamm 4084, Spur L: E. coli Stamm 4084 1:10 verdünnt, Spur M: E. coli
Stamm 4129, Spur N: E. coli Stamm 4129 1:10 verdünnt, Spur O: E. coli
Stamm 4538, Spur P: E. coli Stamm 4538 1:10 verdünnt, Spur Q: E. coli
Stamm 4580, Spur R: E. coli Stamm 4580 1:10 verdünnt, Spur S: E. coli
Stamm 4583, Spur T: E. coli Stamm 4583 1:10 verdünnt, Spur U: E. coli
Stamm 5102, Spur V: E. coli Stamm 5102 1:10 verdünnt, Spur K: Kontrolle
(Wasser)
4.6 Assoziation von genetischen Elementen und Resistenzgenen
mit ESBL-Typen bei E. coli
Es wurde im weiteren Verlauf das gemeinsame Auftreten der Gene blaCTX-M-15
und blaOXA-1 beobachtet. Der Typ CTX-M-15 war bei 72 % der untersuchten
Stämme mit OXA-1 assoziiert, während OXA-1 bei Stämmen mit CTX-M-1
nur bei 25 % der Stämme auftrat. Ein weiteres Resistenzgen, das auf eine
Assoziation mit CTX-M-15-Genen geprüft wurde, war blaTEM . Der Typ CTXM-15 war bei 80 % der Stämme mit dem Gen blaTEM assoziiert, während
blaTEM bei Stämmen mit CTX-M-1 bei 90 % der Stämme auftrat. Es stellte sich
außerdem heraus, dass von den 61 Stämmen des CTX-M-15-Types 53 % der
Stämme sowohl über blaOXA-1 , als auch über blaTEM verfügten.
4.7 Assoziation von genetischen Elementen und Resistenzgenen
mit ESBL-Typen bei K. pneumoniae
Der Typ CTX-M-15 war bei K. pneumoniae bei 73 % der Stämme mit OXA-1
assoziiert, während OXA-1 bei Stämmen mit CTX-M-1 bei nur 21 % der
Stämme auftrat. Das weiter untersuchte Element TEM war bei 78 % der
Stämme mit dem Typ CTX-M-15 und bei 15 % der Stämme mit dem Typ
CTX-M-1 assoziiert.
Es stellte sich außerdem heraus, dass von den 37 Stämmen des CTX-M-15Types 70 % der Stämme sowohl über blaOXA-1 , als auch über blaTEM verfügten.
47
Tabelle 8: Übersicht der Ergebnisse bei E. coli
ß-Laktamase- GesamtTypen
anzahl
ISEcp1
CTX-M
ISEcp1
(länger als
Standardlänge)
ISCR1
ORF477
OXA-1
TEM
-1
20
14 (70 %)
10 (50 %)
ND
19 (95 %)
5 (25 %)
18 (90 %)
-3
2
2 (100 %)
1 (50 %)
ND
2 (100 %)
0 (0 %)
2 (100 %)
-15
61
53 (87 %)
1 (2 %)
ND
60 (98 %)
44 (72 %)
49 (80 %)
-9
2
0 (0 %)
0 (0 %)
2(100 %) 2 (100 %)
0 (0 %)
0 (0 %)
-14
9
1 (11 %)
0 (0 %)
8 (89 %) 8 (89 %)
2 (22 %)
8 (89 %)
SHV-2
1
ND
ND
ND
ND
0 (0 %)
0 (0 %)
SHV-12
1
ND
ND
ND
ND
0 (0 %)
1 (100 %)
TEM-52
1
ND
ND
ND
ND
0 (0 %)
1 (100 %)
unbekannt
5
ND
ND
ND
ND
3 (60 %)
5 (100 %)
Gesamt
positiv
getestet
102
NA
NA
NA
NA
54 (53 %)
84 (82 %)
94
70 (75 %)
12 (13 %)
NA
91 (97 %)
CTX-M
positiv
getestet
( ND nicht
berücksichtigt)
ND: nicht getestet, NA: nicht anwendbar
NA
NA
48
Tabelle 9: Übersicht der Ergebnisse bei K. pneumoniae
ß-Laktamase- GesamtTypen
anzahl
ISEcp1
CTX-M
ISEcp1
(länger als
Standardlänge)
ISCR1
ORF477
OXA-1
TEM
-1
34
5 (15 %)
0 (0 %)
ND
11 (32 %)
7 (21 %)
5 (15 %)
-3
1
0 (0 %)
0 (0 %)
ND
1 (100 %)
1 (100 %)
1 (100 %)
-15
37
34 (92 %)
1 (100 %)
ND
33 (89 %)
27 (73 %) 29 (78 %)
-9
1
0 (0 %)
0 (0 %)
1 (100 %)
0 (0 %)
0 (0 %)
0 (0 %)
SHV-12
1
ND
ND
ND
ND
1 (100 %)
1 (100 %)
unbekannt
1
ND
ND
ND
ND
0 (0 %)
1 (100 %)
Gesamt
positiv
getestet
75
NA
NA
NA
NA
73
39 (53 %)
1 (1 %)
NA
44 (60 %)
CTX-M
positiv
getestet
(ND nicht
berücksichtigt)
ND: nicht getestet, NA: nicht anwendbar
36 (48 %) 37 (49 %)
NA
NA
49
naatgcattccttcgaaattcagctttcacccattgggtgaaagaaaagtg
51
ctcaaaaatatgttaaattatcagcttttatgactcgatatatggtaaaat
102
aatagtaagaaaagtagtaaaaaggggttctaattatgattaataaaattg
153
atttcaaagctaagaatctaacatcaaatgcaggtctttttctgctccttg
204
agaatgcaaaaagcaatgggatttttgattttattgaaaatgacctcgtat
255
ttgataatgactcaacaaataaaatcaagatgaatcatataaagaccatgc
306
tctgcggtcacttcattggcattgataagttagaacgtctaaagctacttc
357
aaaatgatcccctcgtcaacgagtttgatatttccgtaaaagaacctgaaa
408
cagtgtcacggtttctaggaaacttcaacttcaagacaacccaaatgttta
459
gagacattaattttaaagtctttaaaaaactgctcactaaaagtaaattga
510
catccattacgattgatattgatagtagtgtaattaacgtagaaggtcatc
561
aagaaggtgcgtcaaaaggatataatcctaagaaactgggaaaccgatgct
612
acaatatccaatttgcattttgcgacgaattaaaagcatatgttaccggat
663
ttgtaagaagtggcaatacttacactgcaaacggtgctgcggaaatgatca
714
aagaaattgttgctaacatcaaatcagacgatttagaaattttatttcgaa
765
tggatagtggctactttgatgaaaaaattatcgaaacgatagaatctcttg
816
gatgcaaatatttaattaaagccaaaagttattctacactcacctcacaag
867
caacgaattcatcaattgtattcgttaaaggagaagaaggtagagaaacta
918
cagaactgtatacaaaattagttaaatgggaaaaagacagaagatttgtcg
969
tatctcgcgtactgaaaccagaaaaagaaagagcacaattatcacttttag
1020
aaggttccgaatacgactactttttctttgtaacaaatactaccttgcttt
1071
ctgaaaaagtagttatatactatgaaaagcgtggtaatgctgaaaactata
1122
tcaaagaagcccaaatacggacatggcgggtgggtcatctcttgctaaagt
1173
cattttgggcgaatgaagccgtgtttcaaatgatgatgctttcatataacc
1224
tatttttgttgttcaagtttgattccttggactcttcagaatacagacagc
1275
aaataaagacctttcgtttgaagtatgtatttcttgcagcaaaaataatca
1326
aaaccgcaagatatgtaatcatgaagttgtcggaaaactatccgtacaagg
1377
gagtgtatgaaaaatgtctggtataataagaatatcatcaataaaattgag
1428
tgttgctctgtggataacttgcagagtttattaagtatcattgcagcaaag
1479
50
atgaaatcaatgatttatcaaaaatgattgaaaggtggttgtaaataatgt
1530
tacaatgtgtgagaagcagtctaaattcttcgtgaaatagtgatttttgaa
1581
gctaataaaaaacacacgtggaatttagggactattcatgttgttgttatt
1632
tcgtatcttccagaataaggaatcccatggttaaaaaatcactgcgccagt
1683
tcacgctgatggcgacggcaaccgtcacgctgttgttaggaagtgtgccgc
1734
tgtatgcgcaaacggcggacgtacagcaaaaacttgccgaattagagcggc
1785
agtcgggaggcagactgggtgtggcattgattaacacagcagataattcgc
1836
aaacacattatcnnnnnnnnn
1857
Abbildung 14: ISEcp1-Sequenz; Nukleotidteilsequenz vom K. pneumoniaeStamm 2934. Das ISEcp1 Transposase Gen (tnpA) ist mit Pfeilen (
)
gekennzeichnet. Die Bindungsstelle des Primers tnpa1_ISEcp1_eckert ist grau
markiert. Das Element ISEcp1 ist unterstrichen. Die Pfeile (
) markieren
das blaCTX-M-15 Gen.
51
ggcgagcgatacgctgactcattacatggtgcttcggttacgtatcgcatt
51
gccgtcggcccccagcaagggcgcaaagtcttcaccctgcaaaccttgcca
102
gggcgtgaggataaagccgactcaagcagtcgagtagccaaccatgctggt
153
ttctcgctacacgccggtgtgatggccgaagcgcatcagcgggataagctt
204
gagcgcttgtgtcgctacattagtcggccagcggtttcagaaaaacgtctg
255
gcattaaccgccaatgggcaggtgcgttacgagctcaaaactccgtaccgc
306
aatggcaccacccatgtgatcttcgagccgctggacttcatcgccaaactc
357
gctgcgttggtacctaagccgcgagtcaacctcacacgcttccacggcgtc
408
tttgcaccgaacagcaaacaccgagttcaagtaacacccgccaagcggggc
459
aagaagcccgacaaatcggaaggtctcgatactaactggcgtgacaagagt
510
cctgcagagcgccaccgcgccatgacctggatgcaacgcctcaagcgagtc
561
ttcaatattgatattgaagtctgcgaacactgcggcggtcacgtcaaagtg
612
attgccagcatcgaagatccgaaggtcattgagcagattctcaagcatctg
663
aaacagaaaacagccaaggcgaatgccgccaagcagcgtgagctgccacca
714
gaacgagcgccgccactgactcccagcctgttcgatccatcacagagtcgt
765
ctctttgactgacgaccccaaatccaacactgctcaacactgccaactttt
816
aaacggggcggtggggcagtttgtatctctcgagctatcggctagagattt
867
taccgccaaatcgaaccttattagagcggtttaggctggaccggcagttaa
918
aattggggcttgagcggtaaacgagtgagggaatttcaggtaagatacttc
969
ggatgaggagcaaaaggtggtttatacttcctatacccgaggcggcgacag
1020
aaaaatcgcggcgtttgcttttcagttcgacttttatgatactgatgtaca
1071
cgaatgaccgtattgggagtttgagatggtgacaaagagagtgcaacggat
1122
gatgttcgcggcggcggcgtgcattccgctgctgctgggcagcgcgccgct
1173
ttatgcgcagacgagtgcggtgcagcaaaagctggcggcgctggagaaaag
1224
cagcggagggcggctgggcgtcgcgctcatcgataccgcagataatacgca
1275
ggtgctttatcgcggtgatgaacgctttccaatgtgcagtaccagtaaagt
1326
tatggcggccgcggcggtgcttaagcagagtgaaacgcaaaagcagctgct
1377
52
taatcagcctgtcgagatcaagcctgccgatctggttaactacaatccgat
1428
tgccgaaaaacacgtcaacggcacaatgacgctggcagagctagcgcgccg
1479
cg
1481
Abbildung 15: ISCR1-Sequenz; Nukleotidteilsequenz von E. coli Stamm
3299. Das Element ISCR1 wurde unterstrichen und das ISCR1 Transposase
Gen (ORF 513) wurde mit Pfeilen (
) gekennzeichnet. Das Gen blaCTX-M9b wurde grau markiert.
53
5 Diskussion
Multiresistente Bakterien stellen eine immer größer werdende Gefahr im
Klinikalltag dar. Der Anteil der mehrfachresistenten, gramnegativen Bakterien
an Infektionen steigt kontinuierlich an. Insbesondere Patienten mit einer
schweren Grunderkrankung, Patienten mit einer längeren Liegezeit oder
Patienten, die einem intensiveren Eingriff unterzogen werden, zeigen ein
höheres Risiko für die Besiedlung oder Infektion durch multiresistente,
gramnegative
Bakterien.
Wissenschaftler
konnten
nachweisen,
dass
gramnegative Erreger für zwei Drittel der Todesfälle bei nosokomialen
Infektionen verantwortlich sind [58]. Es kann daher angenommen werden,
dass die Bedeutung der multiresistenten Keime zukünftig noch mehr in den
Fokus des Klinikalltags treten wird. Multiresistenz bei gramnegativen
Bakterien ist größtenteils bedingt durch ß-Laktamasen mit einem erweiterten
Wirkungsspektrum (ESBL), die in den letzten Jahren weltweit in immer
größerem
Ausmaße
auftreten
[36].
Bedingt
durch
das
erweiterte
Wirkungsspektrum der ß-Laktamasen erweisen sich zahlreiche Antibiotika
(z. B. die Klassen der Penicilline, Cephalosporine und Monobactame) als
wirkungslos [27, 37, 38]. Des weiteren lassen sich zahlreiche zusätzliche
Resistenzen gegenüber anderen Antibiotikaklassen beobachten [3, 7, 11, 28,
37, 52]. Konkret könnte sich die zunehmende Bedeutung der multiresistenten
Bakterien in einer erhöhten Morbidität und Letalität aufgrund inadäquater
Antibiotikatherapie,
einer
längeren
Verweildauer
der
Patienten
in
Krankenhäusern, höheren Behandlungskosten durch den Einsatz von diversen
Antibiotika und demnach insgesamt in höheren Krankenhauskosten zeigen
[58].
Betrachtet man die weltweite Ausbreitung der ESBL kann man den folgenden
zeitlichen Verlauf erkennen: In den 1990`er Jahren waren die TEM- und SHVESBL vorherrschend. Im Gegensatz dazu waren die CTX-M-ESBL eher selten
anzutreffen. Dieses Verhältnis hat sich heute komplett umgekehrt. Die CTXM-ESBL haben in der Gruppe der ESBL-bildenden Stämme eine
vorherrschende Position eingenommen, so dass sie als die weitverbreiteste
54
ESBL-Untergruppe angesehen werden können. Diese CTX-M-ESBL lassen
sich in Europa, Asien, Afrika sowie Süd- und Nordamerika nachweisen. Die
Verteilung der einzelnen CTX-M-Typen ist regional unterschiedlich.
Beispielsweise dominieren die CTX-M-9- und CTX-M-14-ESBL vor allem in
Spanien, die CTX-M-2 in Südamerika und die CTX-M-3-ESBL in Polen. In
Großbritannien ist CTX-M-15 der häufigste ESBL-Typ. CTX-M-15 wurde
erstmals in Indien beschrieben und ist mittlerweile der häufigste CTX-M-Typ
weltweit. In Europa treten die CTX-M-Enzyme der Hauptgruppe 1 gefolgt von
denen der Hauptgruppe 9 auf [7, 11, 30, 37, 48]. Die Verbreitung der
Resistenzgene erfolgt hauptsächlich über Plasmide, die sowohl innerhalb als
auch zwischen den Spezies ausgetauscht werden können. Die vorliegende
Arbeit zeigt, dass die Mehrzahl der ESBL in der Stammsammlung zum CTXM-1-Cluster, nämlich zu CTX-M-15 (55,37 %) und CTX-M-1 (30,51 %)
gehören. Dies weist darauf hin, dass diese ESBL-Typen in der untersuchten
Bochumer Region dominieren.
5.1 Genetische Umgebung von ESBL-Genen
In der vorliegenden Arbeit wurde die direkte genetische Umgebung von CTXM-Genen mit besonderer Betonung auf mobile genetische Elemente
untersucht. Die ESBL-Stämme wurden bei Patienten aus zwei Bochumer
Kliniken der Maximalversorgung isoliert. Die Bochumer Stammsammlung
wurde außerdem auf OXA-1- und TEM-ß-Laktamasen untersucht, da für diese
ß-Laktamasen bereits in internationalen Studien eine Assoziation zu ESBL
nachgewiesen werden konnte.
Die genetische Umgebung der ESBL aus der Bochumer Stammsammlung
stellte sich ähnlich dar wie in anderen Teilen der Welt. Das Insertionselement
ISEcp1 fand sich in der Mehrzahl der Stämme dem CTX-M-Gen vorgelagert,
während die ORF477-Sequenz nachgelagert war. Aussagen über die
genetische Umgebung der ESBL können damit auch für Deutschland getroffen
werden, wo Daten dazu bislang sehr rar waren. Veranschaulichen läßt sich
dieser Sachverhalt durch die Abbildung 16. Die Ähnlichkeiten in der
55
genetischen Umgebung legen daher nahe, dass die in Deutschland gefundenen
CTX-M-ESBL epidemiologisch eng mit den ESBL aus anderen Teilen der
Welt zusammenhängen.
5.1.1 ISEcp1
Der vertikale und horizontale Transfer der CTX-M-ß-Laktamasen erfolgt über
mobile extrachromosomale Elemente, den Plasmiden. Die horizontale
Verbreitung erfolgt untereinander durch Zell-zu-Zell-Kontakt (Konjugation).
Plasmide können DNA sowohl innerhalb einer Bakterienart, jedoch auch auf
andere Spezies übertragen [11, 18]. Auf den Plasmiden befinden sich neben
Resistenzgenen auch sog. springende Gene (engl.: Transposons) über die
Gensequenzen innerhalb einer Bakterienzelle mobilisiert werden können, z. B.
von einem Plasmid auf ein anderes Plasmid oder von einem Plasmid auf das
Chromosom. Die Transposition wird begünstigt durch das Vorkommen
besonderer genetischer Elemente, wozu u. a. die Insertionssequenzen gehören.
Die Insertionssequenz ISEcp1 wurde den CTX-M-Genen vorgelagert
beobachtet (siehe Abbildung 4). Die in einem Abschnitt der Insertionssequenz
codierte Transposase (siehe Abbildung 9) schneidet und ligiert die DNA
während der Transposition an bestimmten Stellen des springenden Genes. Sie
spielt somit eine wichtige Rolle bei der Mobilisierung von blaCTX-M-Genen
mittels Transposition. Die Insertionssequenz verfügt ebenfalls über einen
starken Promotor, wodurch die Expression extrem gesteigert wird. Plasmide
und die Art ihrer Ausbreitung, die nicht nur innerhalb von Bakterienarten,
sondern auch zwischen den Spezies übertragen werden können, stellen eine
wichtige Ursache für schnell entstehende Resistenzen dar. Der Grund liegt
darin, dass z. B. auf den Plasmiden Antibiotikaresistenzen übertragen werden
können [7, 18, 26, 44, 45, 49]. Die Transposition ist - verglichen mit dem
Austausch von Plasmiden - ein seltenes Ereignis, das allerdings verdeutlicht,
wie z. B. die Resistenzgene auf die Plasmide gelangen können.
Im Laufe der Zeit wurden ISEcp1-Sequenzen oder ISEcp1-ähnliche
Sequenzen, die dem Gen CTX-M vorgelagert sind, bei einer Vielzahl von
56
CTX-M-Typen nachgewiesen: CTX-M-1, -M-2, -M-3, -M-9, -M-13, -M-14,
-M-15, -M-17, -M-19, -M-20, -M-21 [7]. Auch bei ganz anderen
Resistenzgenen wurden vorgelagerte ISEcp1-Elemente gefunden, wie z.B. bei
den 16S rRNA Methyltransferase-Genen rmtA, rmtB und rmtC, die
Resistenzen gegen die Aminoglykoside Kanamycin, Tobramycin, Gentamicin
und Amikacin bedingen. Dies trifft auch auf das Gen aac(6´)-Ib-cr zu, welches
für Aminoglykosid-modifizierende Enzyme codiert [6, 20, 22, 59].
Die genetische Umgebung der CTX-M-ß-Laktamasen wurde u. a. nach dem
Insertionselement ISEcp1 untersucht, um zu überprüfen, ob die genetische
Umgebung der Bochumer Stammsammlung ähnlich ist wie bei Stämmen aus
anderen Teilen der Welt. Die durchgeführten Bochumer Untersuchungen
zeigten, dass bei 75 % der untersuchten E. coli CTX-M-Stämme das Element
ISEcp1 dem CTX-M-Gen vorgelagert war. Bei K. pneumoniae konnte bei 53
% der CTX-M-Stämme das Element ISEcp1 nachgewiesen werden.
Vergleichbare Ergebnisse fanden sich in der Studie von Eckert et al. (2005).
In der Studie von Eckert et al. wiesen von den untersuchten 21 E. coli- und 5
K. pneumoniae-Stämmen 80 % der Stämme das Element ISEcp1 auf.
Sowohl die vorliegende Bochumer Arbeit als auch die Studie von Eckert et al.
zeigen identische Resultate bei der näheren Betrachtung der CTX-M-Typen
CTX-M-15 und CTX-M-9. Im Detail bedeutet diese Gemeinsamkeit, dass 90
% der E. coli-Stämme der Untergruppe CTX-M-15 über das Element ISEcp1
verfügten und kein Stamm der Untergruppe CTX-M-9 das Element ISEcp1
aufwies.
Während in der vorliegenden Bochumer Untersuchung das Element ISEcp1
bei CTX-M-1 bei ungefähr 70 % und bei CTX-M-14 bei ungefähr 11 % der
untersuchten Stämme aufgefunden werden konnte, verfügten die von Eckert et
al. untersuchten E. coli-Stämme der Gruppen CTX-M-1 und CTX-M-14 in
ihrer
Gesamtheit
über
das
gesuchte
Element
ISEcp1
[13].
Die
unterschiedlichen Ergebnisse der Bochumer Untersuchung und der Studie von
57
Eckert et al. lassen sich dadurch erklären, dass in der von Eckert et al.
durchgeführten Studie eine deutlich zahlenmäßig geringere Stammsammlung
vorlag, in der die Untergruppen CTX-M-1, CTX-M-14 und CTX-M-15
weniger vertreten waren. Die Bochumer Untersuchung basierte auf 102 E.
coli- und 73 K. pneumoniae-Stämmen, während die Studie von Eckert et al. 21
E. coli- und 5 K. pneumoniae-Stämme umfasste.
Die Ergebnisse der Bochumer Untersuchung werden u. a. unterstützt durch
weitere Studien von Abbassi et al., Brasme et al. und Lartigue et al., die
darlegen, dass von der jeweiligen Stammsammlung ein Anteil von 81% - 91 %
der Stämme das Element ISEcp1 enthielt [1, 10, 27]. Die zuletzt genannten
Studien belegen ebenfalls, dass das Element ISEcp1 bei den Genen blaCTX-M-2
und blaCTX-M-9 nicht nachgewiesen werden konnte und CTX-M-15, wie auch in
der Bochumer Untersuchung, die dominante Untergruppe war [10, 27].
Im Wesentlichen kristallisieren sich folgende Unterschiede zwischen den
Studien von Abbassi et al., Brasme et al., Lartigue et al. sowie der Bochumer
Untersuchung heraus. Brasme et al. und Lartigue et al. haben im Hinblick auf
die Untersuchung zum Vorkommen des ISEcp1 keine Unterteilung in die
CTX-M-Untergruppen vorgenommen. Die Konsequenz ist, dass keine
Vergleiche zur Bochumer Untersuchung in Bezug auf das Vorkommen von
ISEcp1 in den verschiedenen CTX-M-Untergruppen aufgestellt werden
können.
Brasme et al. und Lartigue et al. untersuchten auch Stämme der Untergruppe
CTX-M-2 auf das Element ISEcp1, was in der Bochumer Untersuchung
aufgrund von fehlenden CTX-M-2-Stämmen nicht gelang.
Im Gegensatz dazu lag der ausschließliche Fokus bei Abbassi et al. auf der
Untersuchung der CTX-M-15-Stämme. Eine Schlussfolgerung hinsichtlich des
Vorkommens von ISEcp1 in den weiteren CTX-M-Untergruppen kann daher
nicht gezogen werden.
58
Zum Nachweis des Insertionselementes mittels Dot Blot wurden zwei
unterschiedliche Sonden benutzt. Die verwendete Sonde, die mit Hilfe des
Primerpaares Ma1_rev_eckert / ISEcp1B hergestellt worden war, bindet
sowohl an der stromaufwärts gelegenen Insertionssequenz (ISEcp1B), als auch
an dem CTX-M-15-ß-Laktamase-Gen. Aus diesem Grund bindet die
Ma1_rev_eckert / ISEcp1B-Sonde unspezifischer als die aus dem Primerpaar
ISEcp1A / ISEcp1B hergestellte Sonde. Die ISEcp1A / ISEcp1B-Sonde bindet
nur an der Insertionssequenz. Auf diese Weise lassen sich die diskordanten
Ergebnisse bei den verwendeten Sonden erklären. Die Auswertung der
unterschiedlichen Ergebnisse richtete sich nach der Sonde, die spezifischer an
den gesuchten Genabschnitt gebunden hat ( ISEcp1A / ISEcp1B).
Bei dem Nachweis des Elementes ISEcp1 mittels PCR wurden zwei
Primerpaare verwendet, deren Bindungsstellen in Abbildung 9 dargestellt sind.
Sie binden sowohl an der Insertionssequenz, als auch in dem CTX-M-15-Gen.
Die Ergebnisse dieser Untersuchung verdeutlichen, dass das Element ISEcp1
ein hohes Vorkommen bei den CTX-M-ß-Laktamasen, insbesondere in der
Untergruppe CTX-M-15, aufweist. Es befand sich dem blaCTX-M-Gen
vorgelagert. Zusätzlich kann festgestellt werden, dass die Untergruppe CTXM-9 das Element ISEcp1 nicht aufweist. Aus diesem Grund wurde die
genetische Umgebung der Stämme dieser Untergruppe weiter nach ähnlichen
Elementen überprüft.
5.1.2 ISCR1
Ein weiteres Element, welches ebenfalls in Verbindung mit der Mobilisierung
von Genen gebracht wird, ist ISCR1 [11]. Das Element ISCR1, das weltweit in
klinischrelevanten, gramnegativen und auch in geringem Ausmaß in
grampositiven Bakterien gefunden wurde, befindet sich in einem Komplex,
der sich aus einem CR-Abschnitt, einem ORF-Gen, weiteren verwandten
Sequenzen und zahlreichen assoziierten Resistenzgenen zusammengesetzt
(siehe Abbildung 5). Es wird angenommen, dass die Mobilisierung über einen
59
„Rolling-Circle-Replikations-Mechanismus“ stattfindet. Die Verdopplung der
DNA (Replikation) geht von einem bestimmten Startpunkt aus und setzt sich
dann über die DNA bzw. das Plasmid weiter fort. Weiterhin wird vermutet,
dass ISCR1 bei der Mobilisierung von ß-Laktamasegenen eine wichtige Rolle
einnimmt, indem die zu mobilisierenden Gene zuerst an das Element ISCR1
mittels Transposition verlagert werden. Anschließend wird das transportierte
Gen auf ein Plasmid mobilisiert und kann nun mit Hilfe der Konjugation auf
andere Bakterienarten und Spezies übertragen werden [54]. Die Verbreitung
der Resistenzgene erfolgt größtenteils mittels Übertragung von Plasmiden und
im sehr geringeren Umfang über die Transposition. Die Bedeutung der
Transposition liegt darin, dass sie als Erklärungsmuster - genauso wie bei dem
Element ISEcp1 - fungiert, wie die Resistenzgene auf die Plasmide gelangen
und aufgrund dessen eine weltweite Verbreitung finden.
Eine Assoziation zwischen ISCR1 und den blaCTX-M -Genen der Untergruppen
CTX-M-2, CTX-M-9, CTX-M-20 ist bereits nachgewiesen worden. Die
assoziierten Gene befinden sich vor dem Element ISCR1 gelagert [4, 11, 13,
54, 61]. Resistenzgene gegen andere Antibiotikaklassen, beispielsweise
Folsäureantagonisten, Chinolone und Aminoglykoside, wurden ebenfalls in
der genetischen Umgebung von ISCR1 nachgewiesen [54].
Die Untersuchung auf ISCR1 wurde bei den Untergruppen CTX-M-9 und -M14 durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass von den zwei E. coli CTX-M-9Stämmen beide Stämme über das Element ISCR1 verfügten. 89 % der
untersuchten CTX-M-14-Stämme enthalten das gesuchte Element. Die bei K.
pneumoniae durchgeführte Untersuchung zeigte, dass der getestete Stamm der
Untergruppe CTX-M-9 ebenfalls über das Element ISCR1 verfügt. Anhand
dieser Ergebnisse wird deutlich, dass ISCR1 häufig bei CTX-M-9 und CTXM-14 aufzufinden ist.
Dieses Ergebnis steht im Einklang mit anderen Studien aus der Schweiz und
Frankreich. Sowohl die im Jahr 2007 veröffentlichte Schweizer Untersuchung
als auch eine Forschungsgruppe aus Frankreich konnten nachweisen, dass die
60
E. coli- und K. pneumoniae-Stämme der Untergruppe CTX-M-2 und CTX-M9 das Element ISCR1 aufwiesen [10, 27]. Das gehäufte Vorkommen des
Elementes ISCR1 bei der Untergruppe CTX-M-14, welche zur CTX-M-9Hauptgruppe gehört (siehe Tabelle 1), wurde von weiteren Forschungsgruppen
überprüft. Das Ergebnis belegte, dass das Element ISCR1 vorgelagert vor dem
Gen CTX-M nachweisbar ist [4, 57].
5.1.3 ORF477
Ein weiteres in der genetischen Umgebung von CTX-M-ESBL befindliche
Gen ist ORF477. Seine Bedeutung ist bis heute noch nicht eindeutig geklärt.
Es konnte jedoch beobachtet werden, dass die Insertionssequenzen 42-127 bp
dem ORF477-Gen vorgelagert sind. Dazwischen liegt das blaCTX-M-Gen (siehe
Abbildung 9 und 16). ORF477 befindet sich dem Gen blaCTX-M nachgelagert
[13, 18]. Aus diesem Grund wurde die Existenz von ORF477 in den zur
Verfügung stehenden Isolaten überprüft. Dabei ergab sich, dass 97 % der E.
coli-Stämme über dieses Gen verfügten. Bei der näheren Analyse des
ORF477-Gens und der verschiedenen CTX-M-Untergruppen stellte sich
heraus, dass die weitverbreiteste CTX-M-Gruppe, die CTX-M-15, auch am
häufigsten das ORF477-Gen (98 %) enthielt. Aber auch die anderen CTX-MGruppen, wie zum Beispiel CTX-M-1, -M-9 usw., tragen zu 95 % bis 100 %
das gesuchte Gen. Anhand der Ergebnisse lässt sich erkennen, dass nahezu alle
isolierten E. coli-Stämme, die eine ESBL enthalten, das ORF477-Gen
aufwiesen. Bei K. pneumoniae enthielten 60 % der Stämme das ORF477-Gen.
Ähnliche Ergebnisse zur vorliegenden Untersuchung ergab auch die Studie
von Eckert et al.. Dort wiesen von 26 Stämmen, die sich aus 21 E. coliStämme und 5 K. pneumoniae-Stämmen zusammensetzten, 17 Stämme das
gesuchte Gen auf (65 %). Die in der vorliegenden Untersuchung gezeigte
Verteilung von ORF477 in Bezug auf die CTX-M-Untergruppen (siehe
Tabelle 8) korreliert mit den Ergebnissen von Eckert et al. Lediglich die
Ergebnisse von CTX-M-14 unterscheiden sich. Während bei der Untersuchung
von Eckert et al. von vier getesteten E. coli-Stämmen keiner das Gen ORF477
61
trug, konnte es in der vorliegenden Arbeit in 89 % der untersuchten CTX-M14-Stämmen nachgewiesen werden (8 von 9 Stämmen) [13].
Obwohl die Funktion bestimmter Genabschnitte, wie ORF477, noch nicht
zweifelsfrei geklärt ist, weist das häufige Vorkommen von ORF477 auf eine
epidemiologische Verbindung der deutschen Isolate mit den weltweit
untersuchten ESBL hin.
5.2 Weitere ß-Laktamase-Gene
Andere Studien belegen in identischer Weise, dass sich TEM-1 und OXA-1
auf dem gleichen Plasmid wie CTX-M-15 befinden. In dieser Studie aus
Bochum wurde TEM und OXA-1 ebenfalls gehäuft in CTX-M-15-Stämmen
gefunden. Aufgrund der medizinisch wichtigen Assoziation zwischen blaCTX-M, blaTEM-1 und blaOXA-1 wurde das Vorkommen des Gens OXA-1 untersucht.
15
Von diesen untersuchten Stämmen verfügten 53 % der isolierten E. coli- und
48 % der vorhandenen K. pneumoniae-Stämme über das Gen OXA-1. Die
nähere Untersuchung ergab, dass die Mehrheit der ß-Laktamasen der
Untergruppen CTX-M-1, CTX-M-15 und CTX-M-14 über das Gen verfügen.
Es wiesen 72 % der E. coli-Stämme und 73 % der K. pneumoniae-Stämme der
Untergruppe CTX-M-15 das Gen blaOXA-1
auf. Dieser Ergebnisse
verdeutlichen, dass sowohl bei E. coli als auch bei K. pneumoniae das Gen
OXA-1 am häufigsten in der Untergruppe CTX-M-15 aufzufinden ist. Dies
trifft ebenfalls auf das Gen TEM zu. Die Untersuchungen bezüglich des
Vorkommens von blaTEM-1 zeigten, dass 82 % der vorhandenen E. coli- und 49
% der vorhandenen K. pneumoniae-Stämme über dieses Gen verfügten. Eine
weitere Differenzierung der CTX-M-Untergruppen zeigte, dass bei E. coli die
Gruppen CTX-M-1 und CTX-M-14 zu je ungefähr 90 % und CTX-M-15 zu je
80 % über ein TEM-ß-Laktamase-Gen verfügten (siehe Abbildung 16). Bei K.
pneumoniae hingegen verfügten nur 15 % der untersuchten Stämme mit CTXM-1-ß-Laktamase, jedoch 78 % der untersuchten Stämme mit CTX-M-15-ßLaktamase über das Gen blaTEM.
62
Abbildung 16: Assoziation zwischen blaCTX-M-15 und blaTEM-1 [13]
Weiterhin wurde untersucht, ob eine Assoziation zwischen den Genen blaCTX-M15
, blaOXA-1 und blaTEM nachgewiesen werden konnte. Es konnte bei E. coli
gezeigt werden, dass von den getesteten 61 CTX-M-15-Stämmen 32 Stämme
sowohl über
blaOXA-1, als auch über blaTEM verfügten (53 %). Bei K.
pneumoniae verfügten von den getesteten 37 CTX-M-15-Stämmen 26 Stämme
nachweislich über die Gene blaOXA-1 und blaTEM (70 %).
Andere Studien, wie z. B. die durchgeführte Untersuchung von Abbassi oder
die Untersuchung von Mendonca, zeigten TEM-1 und OXA-1 auf dem
gleichen Plasmid wie CTX-M-15 [1, 33]. In dieser Studie aus Bochum wurden
die Gene TEM und OXA-1 ebenfalls gehäuft in CTX-M-15-Stämmen
gefunden. Als ein Fazit kann angenommen, aber durch die vorliegende Arbeit
nicht eindeutig bewiesen werden, dass beide Gene auf dem CTX-M-15Plasmid liegen könnten. Damit wäre theoretisch eine Vereinbarkeit der
vorliegenden Daten mit der weltweiten Ausbreitung verwandter CTX-M-15Plasmide denkbar. Obwohl diese Studie nur an den ß-Laktamasegenen TEM
und
OXA-1
durchgeführt
wurde,
lassen
die
Daten
einerseits
die
Schlussfolgerung zu, dass in einem Stamm und oft auch auf dem gleichen
Plasmid mehrere Resistenzmechanismen gleichzeitig existieren könnten. Die
Konsequenz wäre die deutliche Zunahme der Multiresistenz gegenüber
Antibiotika. Eine andere theoretische Schlussfolgerung wäre, dass sich die
Gene TEM und OXA-1 gleichzeitig in einem CTX-M-15-Stamm auf einem
63
oder verschiedenen Chromosomen bzw. auf unterschiedlichen Plasmiden
befinden.
Eine
weitere
Problematik
ergibt
sich
aus
der
Behandlung
dieser
multiresistenten Bakterien. ESBL-Stämme sind häufig in vitro sensibel auf die
Antibiotikakombination Piperacillin / Tazobactam, da Tazobactam als ßLaktamase-Inhibitor
ESBL
adäquat
hemmen
kann.
Aufgrund
des
Inokulumeffektes ist der therapeutische Einsatz von Piperacillin / Tazobactam
dennoch bei Infektionen mit ESBL umstritten [55, 62]. Es wird allerdings
angenommen, dass durch ESBL-bedingte Harnwegsinfektionen in geeigneter
Weise durch Piperacillin / Tazobactam therapiert werden könnten [15, 39].
Die OXA-1-ß-Laktamasen gehören zu der Klasse D der ß-Laktamasen. Ihr
hydrolytisches Spektrum umfasst neben Penicillin, Ampicillin und Piperacillin
auch Oxacillin, welches effektiver als Benzylpenicilline hydrolisiert wird. Die
OXA-ß-Laktamasen zeichnen sich durch die fehlende Hemmung durch ßLaktamase-Inhibitoren aus, sodass sich die OXA-ß-Laktamasen nicht durch
die oft verwendete Kombination von Piperacillin und Tazobactam hemmen
lassen [47, 52]. Die klinische Bedeutung der OXA-1-ß-Laktamasen liegt darin,
dass sie nicht nur eine Resistenz gegen ß-Lakatamantibiotika, sondern auch
eine Resistenz gegen Antibiotikakombinationen mit ß-Laktamase-Inhibitoren,
wie z. B. Piperacillin / Tazobactam, bedingen. Es kann spekuliert werden, dass
durch den klinischen Einsatz von Piperacillin / Tazobactam die aktuellen
CTX-M-15-ESBL selektioniert werden, weil auf ihrem Plasmid gleichzeitig
OXA-1 liegt.
Ältere Studien, die zu dem Zeitpunkt entstanden, als CTX-M-15-ESBL noch
nicht zu der vorherrschenden Gruppe der ESBL gehörten, werteten den
Einsatz von Piperacillin / Tazobactam nicht als Risikofaktor [55].
Der Selektionsvorteil der OXA-1-ß-Laktamasen ergibt sich aus der Resistenz
gegen ß-Laktamase-Inhibitoren. Ein solcher Selektionsvorteil lässt sich
hingegen bei TEM-1 nicht auffinden, da das Gen blaTEM bei vorliegender
64
ESBL redundant erscheint. TEM-1 wirkt gegen kein einziges Antibiotikum
gegen das eine ESBL nicht ohnehin schon wirken würde.
Die TEM-ß-Laktamasen gehören zu den Serin-ß-Laktamasen und zählen nach
der Ambler-Klassifikation zu der Gruppe A. Die meisten TEM-ß-Laktamasen
können durch die üblichen ß-Laktamase-Inhibitoren, wie zum Beispiel
Clavulansäure, Sulbactam oder Tazobactam, gehemmt werden. Es sind bereits
über einhundert verschiedene TEM-ß-Laktamasen, von denen die Mehrheit
ESBL
sind,
beschrieben
worden.
TEM-1
ist
eine
der
häufigsten
Betalaktamasen bei Enterobacteriaceae. Die TEM-1-ß-Laktamase verfügt
über eine höhere hydrolytische Aktivität gegenüber Ampicillin
als
Carbenicillin und Oxacillin. Gegenüber den Cephalosporinen der dritten
Generation besteht eine kaum nachweisbare hydrolytische Aktivität.
Aminosäurensubstitutionen innerhalb der Gensequenz führen zu einer großen
Varianz an verschiedenen TEM-ß-Laktamasen [16]. Höchstwahrscheinlich
werden die ESBL-Gene der jüngeren Zeit durch die genannten mobilen
Elemente in ältere TEM-1-Plasmide inseriert.
Die gewonnenen Ergebnisse der vorliegenden Studie untermauern andere
Studien zu dieser Thematik, aber auch die Limitationen dieser Studie dürfen
nicht ungenannt bleiben. Im Einzelnen sind folgende Limitationen dieser
Studie anzuführen:
In der vorliegenden Studie wurde nicht untersucht, ob es sich bei blaTEM um
TEM-1 handelt. Die Bestätigung dafür, dass es sich bei einem positiven
Amplifikat in der PCR auf blaTEM um TEM-1 handelt, wäre lediglich durch
sehr kostspielige Sequenzierungen möglich gewesen. Da TEM-1 im Vergleich
zu anderen TEM-Varianten um ein Vielfaches häufiger auftritt, wurde in
dieser Arbeit darauf verzichtet. Weiterhin wurde im Rahmen dieser Studie das
Vorliegen von blaTEM und blaOXA-1 in den ESBL-Stämmen untersucht. Es wurde
jedoch nicht überprüft, ob die Gene auf dem ESBL-Plasmid oder auf einem
anderen
Plasmid
liegen.
Plasmidcharakterisierung
Eine
derartige
nach
Untersuchung
Konjugations-
hätte
eine
oder
65
Transformationsexperimenten erfordert und wurde aufgrund der großen
Anzahl der untersuchten Stämme unterlassen. Da andere Studien TEM-1 und
OXA-1 auf dem gleichen Plasmid wie CTX-M-15 nachwiesen und in dieser
Bochumer Studie die Gene TEM und OXA-1 ebenfalls gehäuft in CTX-M-15Stämmen gefunden wurden, liegt die Vermutung nahe, dass beide Gene auf
dem CTX-M-15-Plasmid liegen [1, 33]. Diese Annahme wurde durch die
vorliegende Arbeit jedoch nicht eindeutig bewiesen.
Der spezifischere Dot Blot wurde als Bestätigung der PCR durchgeführt.
Aufgrund der Auswertungsproblematik des Dot Blots wurde die PCR als
Ausgangswert angesehen, da durch die unterschiedlichen Farbintensitäten der
Dots die Auswertung nicht immer eindeutig vorgenommen werden konnte.
Die Ergebnisse bei E. coli, die im Dot Blot negativ oder nur sehr schwach
positiv, allerdings in der PCR positiv waren, wurden als positive Ergebnisse
gewertet. Ein weiterer Grund für Unterschiede in den beiden Verfahren ist,
dass die beim Dot Blot verwendete Sonde ISEcp1B / Ma1_rev - unabhängig
von der Entfernung zum CTX-M-15-Gen - an ISEcp1 bindet. Bei der PCR
hingegen kann ein negatives Ergebnis angezeigt werden, weil das gesuchte
Insertionselement ISEcp1 weiter entfernt vom CTX-M-Gen ist, als mit der
Elongationszeit zu erfassen ist. Abweichende Ergebnisse bei K. pneumoniae
können dadurch erklärt werden, dass positive Dot Blot-Ergebnisse z. B. auch
durch andere ORF-Genabschnitte verursacht werden können.
Diesen aufgeführten Limitationen stehen auf der anderen Seite wertvolle
Erkenntnisse gegenüber, die aus dieser Studie gewonnen werden können. Wie
in der Arbeit dargestellt, sind ESBL weltweit auf dem Vormarsch. Ferner
zeigen die Ergebnisse, dass die deutschen Isolate epidemiologisch mit den
weltweit untersuchten ESBL in Verbindung stehen. Mittels Plasmiden wird
die schnelle und weltweite Verbreitung von Resistenzgenen ermöglicht. Das
Vorkommen der Mobilisierungselemente (ISEcp1, ISCR1) zeigt, dass die
genetische Umgebung der Bochumer Isolate ähnlich ist wie bei Stämmen aus
anderen Teilen der Welt. Die gleichzeitige Existenz von mehreren
Resistenzgenen innerhalb eines Stammes (siehe Kapitel 4.6 und 4.7) konnte
66
ebenfalls nachgewiesen werden, woraus als Konsequenz die eingeschränkten
therapeutischen Behandlungsmöglichkeiten resultieren. Zur Eindämmung von
Infektionen mit ESBL-bildenden Stämmen, wie E. coli und K. pneumoniae,
gilt folgendes festzuhalten: Zu den krankenhaushygienischen Maßnahmen
zählen die „Kontaktisolierung“ des Patienten mit patientenbezogenem
Schutzkittel und Händedesinfektion zur Vermeidung von Erregerübertragung
durch direkten Kontakt [21, 51]. Auch ein rationaler Antibiotikaeinsatz ist
hilfreich bei der Eindämmung von ESBL-bildenden Stämmen. Eine große
klinische Relevanz liegt in dem gleichzeitigen Vorkommen von ESBL-ßLaktamasen (z.B. CTX-M-ß-Laktamasen) und OXA-1-ß-Laktamasen, die eine
Resistenz nicht nur gegen ß-Lakatamantibiotika, sondern auch eine Resistenz
gegen Antibiotikakombinationen mit ß-Laktamase-Inhibitoren bedingen.
Vermutet werden kann, dass der klinische Gebrauch von ß-LaktamaseInhibitoren (Piperacillin / Tazobactam) die Selektion zugunsten von CTX-M15-
und
OXA-1-ß-Laktamasen
ermöglicht.
Die
Therapie
gegenüber
Infektionen mit ESBL-bildenden Stämmen ist aufgrund der verschiedenen
Resistenzgene sehr begrenzt und unterschiedlich effizient. Da neben den
üblichen Resistenzen gegen Penicilline, Cephalosporine und Aztreonam
gleichzeitig auch
Resistenzen gegen Fluorchinolone und Aminoglykoside
vorkommen, scheiden diese Behandlungsmöglichkeiten in der Regel aus. Als
therapeutische Optionen kommen die Carbapeneme Imipenem, Meropenem
und Ertapenem sowie meistens das Glycylcyclin Tigecyclin in Frage. Im Falle
von Harnwegsinfekten können Nitrofurantoin oder Fosfomycin zur Therapie
verwendet werden [11, 15, 22, 39 ,55, 62].
Der unkritische Einsatz von Antibiotika und eine mangelnde Händehygiene
können als Hauptursachen für das Entstehen von multiresistenten Erregern
betrachtet werden. Als Konsequenz sollte jeder Antibiotikaeinsatz exakt
überlegt werden, um zukünftige Resistenzentwicklungen zu verhindern.
Andernfalls wird das ärztliche Personal zunehmend mit einem erfolglosen
Einsatz von antimikrobiellen Substanzen konfrontiert werden. Aufgrund des
67
zunehmenden Auftretens von multiresistenten Bakterien ist die Notwendigkeit
einer krankenhausweiten Überwachung von übergeordneter Bedeutung [23].
68
6 Zusammenfassung
Enterobacteriaceae, insbesondere K. pneumoniae und E. coli, gehören zu den
Organismen, welche weltweit als Hauptproduzenten von ESBL angesehen
werden
können.
Multiresistenz
Diese
besonders
ESBL-produzierenden
gegen
Penicilline,
Stämme
besitzen
eine
Cephalosporine
und
Monobactame, die zunehmend zum Therapieversagen bei schwerstkranken
Patienten führt. In der vorliegenden Arbeit wurde die genetische Umgebung
von ESBL-Genen vom Typ CTX-M mit besonderer Berücksichtigung der
mobilen
genetischen Elemente in einer Bochumer
Stammsammlung
untersucht. Weiterhin wurde das Vorkommen von weiteren ß-Laktamasegenen
überprüft für die bereits in anderen Studien eine Assoziation zu ESBL
nachgewiesen wurde. Es kristallisierten sich die folgenden Fragestellungen
heraus: Liegt eine Identität der genetischen Umgebung der untersuchten
Bochumer Stammsammlung mit der aus anderen Teilen der Welt vor? Ist das
gemeinsame Vorkommen von ESBL-ß-Laktamasen vom Typ CTX-M und
OXA-1-ß-Laktamasen genauso häufig wie in anderen Ländern?
Als Ergebnis kann festgehalten werden, dass die ESBL der CTX-M-1Untergruppe, insbesondere CTX-M-15, in der Bochumer Region dominieren.
Die genetische Umgebung der ESBL aus Bochum ist ähnlich mit denen aus
anderen Ländern, so dass gezeigt werden konnte, dass die untersuchten
Stämme epidemiologisch eng mit den Stämmen aus anderen Studien
zusammenhängen. Es fanden sich die genetischen Elemente ISEcp1 und
ORF477 dem bla-Gen vorgelagert und ISCR1 dem bla-Gen nachgelagert. Eine
Assoziation zwischen dem Gen blaCTX-M-15 und der Insertionssequenz ISEcp1
besteht ebenfalls. Weiterhin konnte ein gehäuftes Vorkommen von ISCR1 bei
CTX-M-9 und CTX-M-14 nachgewiesen werden. Ferner konnte gezeigt
werden, dass TEM-ß- und OXA-1-ß-Laktamasen gehäuft in CTX-M-15Stämmen auftreten. Diese Ergebnisse belegen einen epidemiologischen
Zusammenhang zwischen den untersuchten Stämmen und Stämmen aus
anderen Teilen der Welt. Sie stellen das Problem der Multiresistenz aufgrund
von gleichzeitigem Vorkommen von verschiedenen ß-Laktamasen dar. Der
69
klinische Einsatz von ß-Laktamase-Inhibitoren, wie z.B. Piperacillin /
Tazobactam, sollte genau abgewogen werden. Der Grund liegt darin, dass die
Selektion
zugunsten
wahrscheinlich
von
durch
CTX-M-15den
und
klinischen
OXA-1-ß-Laktamasen
Gebrauch
dieser
Antibiotikakombinationen gefördert wird. Durch die stetig wachsende Anzahl
der ESBL-produzierende Organismen entstehen zahlreiche therapeutische
Schwierigkeiten in der adäquaten Behandlung von Infektionen im klinischen
Alltag.
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Piperacillin-Tazobactam
during
Treatment
despite
Susceptibility.
Antimicrobial Agents and Chemotherapy 50, 3179–3182
Initial
Danksagung
Recht herzlich bedanken möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. med. S. G.
Gatermannn für die Überlassung des interessanten Themas mit aktuellem
Bezug und die hervorragende Betreuung.
Mein Dank gilt auch Herrn Dr. med. Martin Kaase für viele hilfreiche und
konstruktive Gespräche, Ratschläge, Gedankenanstöße und die investierte
Zeit.
Weiterhin gilt mein Dank allen Mitarbeitern der Abteilung für Medizinische
Mikrobiologie der Ruhr-Universität-Bochum für die herzliche Aufnahme, das
sehr gute Arbeitsklima und für Ihre Hilfe und Unterstützung. Ganz besonders
möchte ich mich bei Frau Susanne Friedrich für Ihre vielfältige Hilfe
bedanken.
Abschließend möchte ich mich bei Herrn Michael Mitschke für die
unermüdliche seelische und moralische Unterstützung sowie seinem
grenzenlosen Optimismus bei der Erstellung meiner Dissertation bedanken.
LEBENSLAUF
________________________________________________
PERSÖNLICHE DATEN
Name:
Yvonne Peters
Geboren am:
20.01.1985 in Duisburg
Staatsangehörigkeit: deutsch
SCHULAUSBILDUNG
08.1992–06.1996
Städtische Gemeinschaftsgrundschule, Duisburg
08.1996–07.2005
Städtisches Landfermann-Gymnasium, Duisburg
Abschluss: Allgemeine Hochschulreife durch Abitur
FREIWILLIGE SCHULPRAKTIKA
07.2003
Pädiatrie, Klinikum Duisburg Wedau Kliniken
07.2002 – 08.2002
Genetisch-diagnostisches Labor mit humangenetischer
Beratung C. Behrend, Düsseldorf
STUDIUM
10.2005–12.2011
Studium der Humanmedizin an der Ruhr-Universität
Bochum
09.2007
Erster Abschnitt der ärztlichen Prüfung
08.2010–12.2010
Erstes Tertial des Praktischen Jahres:
Viszeral- und Unfallchirurgie, Universitätsklinikum
Bergmannsheil, Bochum
12.2010–04.2011
Zweites Tertial des Praktischen Jahres:
Allgemeinmedizin, Praxis Rausch und Kollegen,
Recklinghausen
04.2011–08.2011
Drittes Tertial des Praktischen Jahres:
Innere Medizin, Universitätsklinikum Bergmannsheil,
Bochum
10.2011
Zweiter Abschnitt der ärztlichen Prüfung
Seit 02.2012
Ärztin in der Weiterbildung
Malteser Krankenhaus St. Anna, Abteilung für Innere
Medizin, Duisburg
FAMULATUREN
10.2009
Innere
Medizin,
Lukaskrankenhaus
Städtische
Kliniken Neuss
09.2009
Innere Medizin, Helios Klinikum Krefeld
03.2008
Internistische Praxis Dr. Wilhelm Peters, Duisburg
02.2008
Abteilung für Anatomie der Ruhr-Universität Bochum
EHRENAMT
Seit 06.1997
Ehrenmitglied im „Offenen Kulturkreis“ Duisburg–
Ungelsheim e. V.,
musikalische Gestaltung von
Kulturfesten
08.1999 – 07.2001
Schulpatin für die 5. Jahrgangsstufe des LandfermannGymnasiums
SONSTIGE KENNTNISSE
Sprachen:
Englisch: Fließend in Wort und Schrift,
Spanisch: Schulische Grundkenntnisse
EDV-Kenntnisse:
Anwenderkenntnisse in MS-Word, -Excel, -PowerPoint
HOBBYS
Natur- und Portraitphotographie,
Standard-
und
Formationstanz
lateinamerikanischer
Paar-
und