Immunreaktion nach transientem kutanem adenoviralem
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Immunreaktion nach transientem kutanem adenoviralem Gentransfer Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Biologie und Biotechnologie an der Internationalen Graduiertenschule Biowissenschaften der Ruhr-Universität Bochum angefertigt in der Arbeitsgruppe für Molekulare Onkologie und Wundheilung Universitätsklinik für Plastische Chirurgie und Schwerbrandverletzte, Handchirurgiezentrum, Operatives Referenzzentrum für Gliedmaßentumore BG Universitätskliniken Bergmannsheil vorgelegt von Matthias Schulte aus Haselünne Bochum Mai 2012 Immune Reaction after Transient Cutaneous Adenoviral Gene Delivery Dissertation to obtain the degree Doctor Rerum Naturalium (Dr. rer. nat.) at the Faculty of Biology and Biotechnology International Graduate School of Biosciences Ruhr-University Bochum in the Laboratory for Molecular Oncology and Wound Healing Department of Plastic Surgery, Burn Center BG University Hospital Bergmannsheil submitted by Matthias Schulte from Haseluenne Bochum Mai 2012 Referent: Prof. Dr. Lars Steinsträßer Ko-Referent: Prof. Dr. Günter A. Schaub ERKLÄRUNG Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbstständig verfasst und bei keiner anderen Fakultät eingereicht und dass ich keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel verwendet habe. Es handelt sich bei der heute von mir eingereichten Dissertation um sechs in Wort und Bild völlig übereinstimmende Exemplare. Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen nur die originalen Daten enthalten und in keinem Fall inhaltsverändernde Bildbearbeitung vorgenommen wurde. Bochum, den 10.05.2012 __________________________________ Matthias Schulte Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis I Abbildungsverzeichnis IV Tabellenverzeichnis VI Abkürzungsverzeichnis VII Danksagung XI 1 Einleitung 1 1.1 Die Haut 1 1.2 Gentransfer 4 1.2.1 Nicht virale Transfermethoden 1.2.2 Virale Vektoren 1.3 Gentherapie 4 5 10 1.4 Das Immunsystem 12 1.5 Toll-like Rezeptor Signalweg 13 1.5.1 Toll-like Rezeptoren 1.5.2 Zytokine 1.5.2.1 Interferone 1.5.2.2 Interleukine 1.5.2.3 Chemokine 1.5.2.4 Tumornekrosefaktoren 1.6 Alternative Signaltransduktion 13 16 16 17 18 19 20 1.6.1 RIG-like Rezeptoren 1.6.2 Inflammasomen 1.6.2.1 NOD-like Rezeptoren 1.6.2.2 HIN-200 Proteine 1.6.3 DAI (DLM-1/ZBP1) 1.7 Zielsetzung 20 22 22 23 25 27 2 Material und Methoden 2.1 2.1.1 2.1.2 2.1.3 28 Material 28 Herkunft der Zellkulturen Versuchstiere DNA, Marker und Enzyme 28 30 30 I Inhaltsverzeichnis 2.1.4 Chemikalien, Lösungsmittel und Inhibitoren 2.1.5 Fertige Versuchsansätze 2.1.6 Geräte und weitere Materialien 2.1.7 Zellkulturmedien 2.1.8 Oligonukleotide 2.2 Methoden 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4 2.2.5 2.2.6 2.2.7 2.2.8 2.2.9 2.2.10 2.2.11 2.2.12 2.2.13 Adenovirale Transduktion in einem in vivo Ansatz Isolierung und Kultivierung von primären humanen Keratinozyten Kultivierung der HaCaT-, HER911- und HEK293-Zelllinien Präparation der adenoviralen Vektoren Extraktion adenoviraler DNA Transfektion der Zellen Transduktion von Hautgewebe in einem ex vivo Modell RNA-Isolierung cDNA-Synthese Amplifikation von cDNA-Fragmenten Messung eines Expressionsverlauf inflammatorischer Faktoren Inhibierung von Signaltransduktionsmolekülen Statistik 3 Ergebnisse 31 32 33 35 36 38 38 39 41 41 42 42 43 45 45 45 47 48 48 49 3.1 Propagation adenoviraler Vektoren 49 3.2 Adenoviraler Gentransfer in einem in vivo Modell 50 3.3 Adenoviraler Gentransfer in epitheliale Zellen 56 3.3.1 Effizienz adenoviraler Vektoren 3.3.2 Eignung der Zellkulturen 3.3.3 Immunogenität adenoviraler DNA 3.3.4 Kinetik adenoviral induzierter Zytokinexpression 3.4 Adenoviraler kutaner Gentransfer 56 58 60 62 65 3.5 68 Signaltransduktion nach adenoviraler Infektion 3.5.1 Inhibierung von Signaltransduktionsmolekülen 3.5.2 Expressionsverhalten pathogenerkennender Rezeptoren 3.5.2.1 Expression von Toll-ähnlichen Rezeptoren (TLRs) 3.5.2.2 Expression von RIG-ähnlichen Rezeptoren (RLRs) 3.5.2.3 Expression von DAI (DLM-1/ZPB1) 3.5.2.4 Expression von Inflammasom-bildenden Komponenten 3.5.3 siRNA-vermittelte Inhibierung der Genexpression 3.5.4 Transgenexpression nach Inhibierung potentieller Rezeptoren II 68 71 71 73 74 74 78 81 Inhaltsverzeichnis 4 Diskussion 83 4.1 Immunantwort nach adenoviraler Transduktion in vivo 84 4.2 Immunreaktion nach adenoviraler Stimulation in vitro 85 4.2.1 Eignung der verwendeten Zellkulturen 4.2.2 Vergleich der adenoviralen Transduktion und Transfektion 4.3 Adenoviraler Gentransfer in einem ex vivo Hautspannmodell 85 88 91 4.4 94 Signaltransduktion nach adenoviraler Stimulation 5 Zusammenfassung 103 6 Summary 105 7 Literatur 107 Lebenslauf 122 Publikationsverzeichnis 123 III Abbildungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Abbildung 1.1: Schematischer Aufbau der Haut. 2 Abbildung 1.2: Schematische Darstellung eines Adenovirus. 6 Abbildung 1.3: Schematische Darstellung des adenoviralen Gentransfers. 7 Abbildung 1.4: Schematischer Ausbau des Genoms adenoviraler Vektoren. 9 Abbildung 1.5: In klinischen Studien verwendete Vektorsysteme. 10 Abbildung 1.6: Signaltransduktion von Toll-like Rezeptoren. 15 Abbildung 1.7: Signaltransduktion RIG-ähnlicher Rezeptoren. 21 Abbildung 1.8: Inflammasomabhängige Signaltransduktion. 24 Abbildung 1.9: DAI-induzierte Signaltransduktion. 26 Abbildung 2.1: Zeitachse der Versuchsdurchführung. 38 Abbildung 2.2: Transiente kutane adenovirale Transduktion. 39 Abbildung 2.3: Isolierung und Kultivierung primärer humaner Keratinozyten. 40 Abbildung 2.4: Aufbau der BO-Drum®. 44 Abbildung 2.5: Platzierung und Entnahme humaner Vollhaut in einer Bo-Drum®. 44 Abbildung 3.1: GFP-Expression in HEK-293-Zellen. 50 Abbildung 3.2: Zeitlicher Verlauf der GFP-Fluoreszenz in vivo. 52 Abbildung 3.3: Zeitlicher Verlauf der GFP-mRNA Expression in vivo. 53 Abbildung 3.4: Expression inflammatorischer Faktoren in vivo. 55 Abbildung 3.5: Effizienz adenoviraler Vektoren in Keratinozyten. 57 Abbildung 3.6: GFP-Expression in HaCaT- und HKC-Zellen. 58 Abbildung 3.7: Vergleichbarkeit von HaCaT- und HKC-Zellen. 59 Abbildung 3.8: Typ-I-Interferonexpression in Keratinozyten. 61 Abbildung 3.9: Zytokinexpression in Keratinozyten. 63 Abbildung 3.10: Induktion Interferon-regulierender Faktoren. 65 Abbildung 3.11: Tranduktionskontrolle der Bo-Drum®. 66 Abbildung 3.12: Zytokinexpression nach Transduktion von Bo-Drums®. 68 Abbildung 3.13: Zytokinexpression nach Inhibierung diverser Signaltransduktionswege. 70 IV Abbildungsverzeichnis Abbildung 3.14: Induktion von Toll-like Rezeptoren. 72 Abbildung 3.15: Induktion von RIG-like Rezeptoren. 73 Abbildung 3.16: Induktion der DAI-Expression. 74 Abbildung 3.17: Induktion von Inflammasomen. 76 Abbildung 3.18: Induktion von HIN-200-Proteinen. 77 Abbildung 3.19: Effizienz verwendeter siRNAs. 78 Abbildung 3.20: siRNA-vermittelte Inhibierung der mRNA-Expression potentieller DNA-Rezeptoren. 79 Abbildung 3.21: Transduktion nach Inhibierung potentieller Rezeptoren. 81 Abbildung 4.1: Toll-like und RIG-like Rezeptor abhängige Signaltransduktion. 96 Abbildung 4.2: HIN-200-Proteine. 97 Abbildung 4.3: Zusammenspiel unterschiedlicher Rezeptoren. V 101 Tabellenverzeichnis Tabellenverzeichnis Tabelle 1.1: Toll-like Rezeptoren. 14 Tabelle 2.1: Patientendaten zu den verwendeten primären Keratinozyten. 29 Tabelle 2.2: Charakteristik der Oligonukleotide. 36 Tabelle 2.3: Charakteristika der siRNAs. 43 Tabelle 2.4: Temperaturprofil der semiquantitativen Polymerasekettenreaktion. 46 Tabelle 2.5: Temperaturprofil der quantitativen Polymerasekettenreaktion. 47 Tabelle 2.6: Zielproteine der Inhibitoren. 48 Tabelle 3.1: Aufstellung der erreichten Virustiter. 49 Tabelle 3.2: Effekte der Inhibierung der mRNA-Expression potentieller Rezeptoren. 80 VI Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis °C Grad Celsius (degree Celsius) AdDNA Adenovirale DNA (adenoviral DNA) AdV Adenoviren (adenoviruses) AIM2 Fehlend in Melanomen 2 (absent in melanoma 2) AP-1 Adapterverwandter Proteinkomplex 1 (adaptor-related protein complex 1) APC Antigenpräsentierende Zellen (antigen presenting cells) ASC Apoptoseassoziiertes, Speck-ähnliches CARD-enthaltendes Protein (apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD) ATP Adenosintriphosphat (adenosine triphosphate) bp Basenpaare (base pairs) Ca Kalzium (calcium) CAR Coxsackie-Adenovirusrezeptor (coxsackie-adenovirus receptor) CARD Caspase-Aktivierungs- und Rekrutierungsdomäne (caspase activation and recruitment domain) Casp Caspase (caspase) Da Dalton (dalton) DAI DNA-abhängiger Aktivator von Interferon-regulierenden Faktoren (DNA-dependent activator of IFN regulatory factor) DNA Desoxyribonukleinsäure (deoxyribonucleic acid) Erk Extrazellulär regulierte Kinase (extracellular regulated kinase) FCS Fötales Kälberserum (fetal calf serum) g Gramm (gram) g Zentrifugalkraft (centrifugal force) GFP Grün-fluoreszierendes Protein (green fluorescent protein) HaCaT Humane adulte Keratinozyten unter niedrigen Calcium und erhöhter Temperatur (human adult keratinocytes under low calcium and increased temperature) VII Abkürzungsverzeichnis HDP Host Defense Peptides (host defense peptides) HIN-200 Hämatopoetische Interferon-induzierbare nukleäre Antigene mit Wiederholungen von 200 Aminosäuren (hematopoietic interferoninducible nuclear antigens with 200 amino acids repeats) HKC Primäre humane Keratinozyten (human primary keratinocytes) IF16 Interferon-gamma-induziertes Protein 16 (interferon gammainducible protein 16) IFIX Pyrin- und HIN-Domänen Familienmitglied 1 (pyrin and HIN domain family member 1) IFN Interferon (interferon) IFNR Interferonrezeptor (interferon receptor) IKK IκB-Kinase (IκB kinase) IL Interleukin (interleukin) IPS-1 IFN-beta Promotor Stimulator I (IFN-beta promotor stimulator I) IRAK IL-1R assoziierte Kinasen (IL-1R associated kinase) IRF Interferon-regulierender Faktor (Interferon-regulating factor) IU Infektiöse Einheiten (infectious units) JAK Januskinase (januskinase) JNK c-Jun N-terminale Kinase (c-Jun N-terminale kinase) kbp Kilobasenpaare (kilobase pairs) kDa Kilodalton (kilodalton) kV Kilovolt (kilovolt) LPG2 ATP abhängige RNA-Helikase DHX58 (ATP-dependent RNA helicase DHX58) LPS Lipopolysaccharid (lipopolysaccharide) LTA Lipoteichonsäure (lipoteichoic acid) m Meter (meter) M Molar (molar) MAPK Mitogen-aktivierte Proteinkinase (mitogen-activated protein kinase) VIII Abkürzungsverzeichnis mda5 Melanomdifferenzierung-assoziiertes Gen 5 (melanoma differentiation associated gene 5) MHC Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompatibility complex) MIP Makrophagen-inhibierendes Protein (macrophage inhibitory protein) ml Milliliter (milliliter) MNDA Antigen der Differenzierung von Zellkernen myeloider Zellen (myeloid cell nuclear differentiation antigen) MOI Multiplizität der Infektion (multiplicity of infection) MyD88 Myeloides Differenzierungsantwortgen 88 (myeloid differentiation response gene 88) NALP NLR-Familie, Pyrindomäne enthaltend 3 (NLR family, pyrin domain containing 3) NFκB Nukleärer Faktor κ B (nuclear factor κ B) NLR Nukleotid Bindungs- und Oligomerisierungsdomänen (NOD)haltiges Protein 1-ähnlicher Rezeptor (nucleotide binding and oligomerization domain (NOD)-containing protein 1 like receptor) nm Nanometer (nanometer) OD Optische Dichte (optical density) PAMP Pathogenassoziierte molekulare Muster (pathogen associated molecular pattern) PBS Phosphatpuffer (phosphate buffer) PCR Polymerase Kettenreaktion (polymerase chain reaction) PGN Peptidoglykan (peptidoglycane) PYD Pyrindomäne (pyrin domain) RANTES Reguliert bei Aktivierung, von normalen T-Zellen exprimiert und sezerniert (regulated upon activation, normal T-cell expressed, and secreted) RIG-I Retinolsäure-induziertes Gen 1 (retinoic acid inducible gene I) RIPK Rezeptorwechselwirkende Serin-/Threoninkinase (receptorinteracting serine/threonine kinase) RLH RIG-I-ähnliche Helikase (RIG-I like helicase) RLR RIG-ähnlicher Rezeptor (RIG-I like receptor) IX Abkürzungsverzeichnis RLU Relative Fluoreszenzeinheit (relative fluorescent unit) RNA Ribonukleinsäure (ribonucleic acid) rpm Umdrehungen pro Minute (rounds per minute) rRNA Ribosomale RNA (ribosomal RNA) RT Raumtemperatur (room temperature) RT-PCR Echtzeit-PCR (real-time PCR) SOCS Suppressor der Zytokinsignalwirkung (suppressor of cytokine signalling) STAT Signaltransduktoren und Aktivatoren der Transkription (signal transducers and activators of transcription) STING Transmembranprotein 173 (transmembrane protein 173) TACE TNFα konvertierendes Enzym (TNFα converting enzyme) TGF Transformierender Wachstumsfaktor (transforming growth factor) TLR Toll-ähnlicher Rezeptor (Toll-like receptor) TNF Tumornekrosefaktor (tumor necrosis factor) TNFR Tumornekrosefaktor Rezeptor (tumor necrosis factor receptor) X Danksagung Danksagung Besonderer Dank gilt zunächst Herrn Prof. Dr. Lars Steinstraesser für die Vergabe des interessanten Promotionsthemas, die zielgerichtete Betreuung meiner Arbeit sowie die Bereitstellung des Arbeitsplatzes. Ich danke Herrn Prof. Dr. Günter A. Schaub für sein Interesse an meiner Arbeit, die hilfreiche Unterstützung und die freundliche Übernahme des Korreferats. Herrn Dr. phil. nat. Frank Jacobsen danke ich für seine wertvollen Anregungen und Ratschläge bei der Planung und Durchführung der Experimente sowie für das Korrekturlesen meiner Arbeit. Ein großer Dank geht aber auch an meine Kollegen der Arbeitsgruppe für molekulare Onkologie und Wundheilung, denn die Zusammenarbeit mit Ihnen war ein Meilenstein bei der Erstellung meiner Doktorarbeit. Sie gaben mir mit Ihrem fundierten Fachwissen viele Anregungen für meine wissenschaftliche Arbeit. Insbesondere Andrea Rittig, Mustafa Becerikli und Dr. Jennifer Hauk bin ich zu besonderem Dank verpflichtet. Ohne ihr Wissen, ihre Ideen und ihre Kritik wäre mein Forschungsprojekt niemals soweit gekommen. Des Weiteren danke ich Stephan Winkelmann für die hilfreichen Ratschläge bei der Illustration von Signaltransduktionswegen und der Anwendung der dafür benötigten Grafiksoftware. Ganz besonders danke ich jedoch meinen Eltern für Ihr stetes Bestreben, mir meine Ausbildung und die Anfertigung der vorliegenden Arbeit zu ermöglichen. XI Einleitung 1 Einleitung 1.1 Die Haut Mit einer Anzahl von rund zwei Milliarden Zellen und einer Fläche von bis zu zwei Quadratmeter erreicht die Haut ein Gewicht von zehn bis zwölf Kilogramm und ist damit das größte Organ des Menschen [1, 2]. Als Grenzfläche steht sie in ständigem Kontakt mit ihrer Umwelt und ist dabei permanent äußeren Einflüssen ausgesetzt. Sie schützt vor Austrocknung des Körpers sowie vor chemischen, physikalischen und mechanischen Beanspruchungen durch die Außenwelt. Als erste Barriere zwischen Körper und Umwelt steht die Epidermis (Abbildung 1.1), welche aus vier beziehungsweise fünf Schichten besteht. Die Oberfläche wird aus Schichten terminal differenzierter, verhornter Zellen gebildet, dem Stratum corneum (Hornschicht). In besonders dicken Bereichen der Epidermis findet sich darunter als zusätzlicher Schutz vor mechanischer Beanspruchung die schmale, durchsichtige Glanzschicht (Stratum lucidum). Diese ist jedoch nur in stark verhornten Hautarealen, wie die Handfläche oder die Fußsohle, vorzufinden. Daran basal angrenzend folgt das Stratum granulosum (Körnerschicht), welches durch eine fortschreitende Verhornung und den Abbau von Zellen für den Erhalt des Stratum corneum sorgt. Darunter liegt als stabilisierende Schicht das Stratum spinosum, welche durch kubische, über Desmosomen verbundene Keratinozyten zu erkennen ist. Am Grund der Epidermis befinden sich basale Keratinozyten (Stratum basale), die durch Teilung und Differenzierung für den Erhalt der Epidermis sorgen. In dieser Schicht sind neben den Keratinozyten, welche ca. 90 % der epidermalen Zellen ausmachen, unter anderem auch „Langerhanszellen“ genannte, spezialisierte Zellen des Immunsystems vorzufinden. Diese antigenpräsentierenden Zellen (APC) werden den dendritischen Zellen zugeordnet und bilden eine effektive Barriere gegen pathogene Mikroorganismen [2, 3]. Darüber hinaus sind auch Merkelzellen (Mechanorezeptoren) und pigmentbildende Melanozyten vorzufinden. Unterhalb der Epidermis lokalisiert liegt die Basallamina, gefolgt von einem kollagenreichen Bindegewebe (Dermis). Die unterste Schicht der Haut bildet das subkutane Fettgewebe [2]. Zusätzliche Festigkeit der Haut wird durch die in den Zellzwischenräumen von der Transglutaminase erstellten Quervernetzungen verschiedener Struktur- 1 Einleitung proteine, wie kleine prolinreiche Proteine, Lorikrine, Zytokeratine, Filaggrine und Involukrine, erreicht [1, 2, 4]. Darüber hinaus werden Mikroorganismen durch kontinuierliche Desquamation von Hautschuppen abgeschieden [1]. Wie andere Epithelien des Körpers, ist auch die Haut von einer Vielzahl von Mikroorganismen, den Kommensalen, besiedelt (102 bis 107 Organismen pro Quadratzentimeter). Diese angepasste Bakterienflora schützt den Körper ebenfalls gegen eine Besiedlung durch neue Eindringlinge [2]. Einen zusätzlichen Schutz vor Erregern bietet die Haut zum Beispiel durch die Synthese antiviraler Faktoren, den Interferonen, und antimikrobieller Peptide, neuerdings aufgrund ihrer vielfältigen Funktionen auch „Host Defense Peptides“ (HDP) genannt [2, 5-9]. Diese zeigen neben der antimikrobiellen Wirkung noch eine Vielzahl anderer Funktionen wie Förderung der Wundheilung und Angiogenese sowie immunmodulatorische Wirkungen [10, 11]. Abbildung 1.1: Schematischer Aufbau der Haut. 2 Einleitung Eine Verletzung der epidermalen Barriere führt zu einer Einschränkung der kutanen Schutzfunktion. Kritisch sind dabei großflächige Beschädigungen bis hin zu der Zerstörung der Hautstruktur, wie es zum Beispiel bei schweren Verbrennungswunden der Fall ist. Schon eine Verbrennung von zehn Prozent der Körperoberfläche kann bei einem Erwachsenen zu einer Verbrennungskrankheit und einer damit verbundenen posttraumatischen Immunsuppression führen [12]. Dies hat eine gestörte Funktion der zellulären und humoralen Immunabwehr und somit auch eine fehlerhafte Erkennung und Elimination von Pathogenen zur Folge. Da das Wundgewebe einen idealen Nährboden für bakterielles Wachstum bietet, ebnet der Verlust der epithelialen Schutzfunktion den Weg für eine mikrobielle Invasion [13, 14]. Die dabei in 12 % der Fälle (ungefähr 700 Patienten pro Jahr in Deutschland) eintretende Sepsis gilt als Haupttodesursache bei Brandverletzungen [15, 16]. Auch bei chronischen Wunden ist die Immunabwehr stark reduziert und die Infektanfälligkeit sehr ausgeprägt [17]. Bei einer steigenden Prävalenz sind bereits heute zwischen zwei und vier Millionen Menschen allein in Deutschland aufgrund von chronischen Wunden oder Wundheilungsstörungen in Behandlung [18, 19]. Die jährlichen Gesamtkosten für das Gesundheitssystem belaufen sich dabei auf ein geschätztes Kostenvolumen von drei Milliarden Euro alleine für Deutschland [18]. Eine Infektionsausbreitung ist zwar durch die Verabreichung von Antibiotika behandelbar, doch durch die stark ansteigende Anzahl von antibiotikaresistenten Erregern wie Pseudomonas aeruginosa, Methillicin-resistenten Staphylokokken und Vancomycin-resistenten Enterokokken in Kliniken ist die erfolgreiche Antibiotikatherapie nicht mehr gewährleistet [20]. In Folge dessen führt eine adäquate Wundversorgung bei Patienten meist zu großflächigen Wundexzisionen und Amputationen [21]. Dies ist nur durch neue Therapieansätze, die vorbeugend vor Infektionen schützen, zu vermeiden. Ein solcher potenzieller Therapieansatz zur Förderung der Wundheilung und Infektionsprävention ist die topische Applikation von HDPs[18, 19]. Nachteilig bei dieser Applikationsform ist jedoch die durch proteolytischen Abbau bedingte, kurze Halbwertzeit von Peptiden im aggressiven Wundmilieu. Lediglich 1 bis 9 % der ursprünglich applizierten Metaboliten fanden sich nach sieben Tagen in einer Tiefe 3 Einleitung von bis zu drei Millimeter [22]. Zudem werden die antimikrobiellen Eigenschaften der kationischen Peptide durch physiologische Konzentrationen von divalenten Kationen, Serum und anionischen Makromolekülen wie Glucosaminoglykane deutlich gehemmt [6, 7]. 1.2 Gentransfer Eine mögliche Alternative zu der topischen Applikation von HDPs ist der transiente kutane Gentransfer in das Wundgewebe. Dabei werden mit Hilfe von geeigneten Transportvehikeln, sogenannte Vektoren, gewünschte Gene in die noch verbliebenen, gesunden Hautzellen effektiv eingeschleust und dort stabil oder extrachromosomal exprimiert [23, 24]. Die Vorteile eines kutanen Gentransfers liegen in der leichten Erreichbarkeit und Kontrollierbarkeit der Haut: Bei Nebenwirkungen können die modifizierten Zellen leicht entfernt werden. Darüber hinaus gelten Keratinozyten als sekretorische Zellen, welche Stoffe wie Zytokine, Enzyme oder Adhäsionsmoleküle mit autokrinen, parakrinen und endokrinen Funktionen sezernieren. Aus diesem Grund wäre ein Gentransfer in die Haut auch für die Behandlung systemischer Krankheiten geeignet [25]. Ein häufiger, für den Patienten oftmals traumatischer und schmerzhafter Verbandswechsel während der Reapplikation der Peptide würde durch einen transienten Gentransfer ebenfalls reduziert. Eine wichtige Vorraussetzung für einen erfolgreichen Gentransfer ist ein geeignetes Verfahren für den Transfer von DNA in eine Zelle. Grundsätzlich stehen hierbei zwei Verfahren zur Verfügung: der nicht virale Gentransfer mit Hilfe von Plasmiden sowie der virale Gentransfer mittels modifizierter Viren [26]. 1.2.1 Nicht virale Transfermethoden Nicht virale Transfermethoden werden überwiegend in der Grundlagenforschung für die Transfektion von eukaryotischen Zellen verwendet. Dabei wird die DNA, meistens in Form von Plasmiden bakteriellen Ursprungs, in die Zielzellen eingebracht. Hierfür stehen diverse Verfahren zur Verfügung: Bei der biolistischen Transfektion werden mittels einer Partikelkanone an Gold- oder Wolframpartikel gebundene DNA-Fragmente per Luftdruck durch die Zellwände und -membranen „geschossen“. Eine weitere Methode ist die rezeptor4 Einleitung vermittelte Aufnahme der Nukleinsäuren. Dabei wird DNA an ein Protein gebunden, welches über einen Oberflächenrezeptor erkannt und in die Zelle aufgenommen wird. Des Weiteren können Nukleinsäuren durch Elektroporation, bei der Zellmembranen durch einen elektrischen Impuls (>1 kV) für DNA-Fragmente permeabilisiert werden, in Zellen eingebracht werden. Die jedoch am häufigsten verwendete Methode ist die Lipofektion. Mit Hilfe von künstlich hergestellten Liposomen oder kationischen bzw. Phospholipidvesikeln, welche leicht mit der Zellmembran fusionieren, wird die DNA in die Zellen gebracht [27, 28]. Die Vorteile von Plasmidvektoren liegen in der einfachen Herstellung und Handhabung, jedoch sind diese Methoden in der Regel von geringer Effizienz und werden überwiegend in vitro und ex vivo angewendet. Dabei werden in der Literatur Transfektionseffizienzen von 20 bis 40 % beschrieben, welche in der Praxis jedoch meist deutlich geringer ausfallen. Bei Applikationen von Nukleinsäuren in vivo wird vorwiegend nackte Plasmid-DNA in das Zielgewebe injiziert [28]. 1.2.2 Virale Vektoren Für einen Gentransfer in Zellen höherer Eukaryoten werden dagegen primär virale Vektoren verwendet. Hierbei handelt es sich um modifizierte Viren, bei denen Teile des viralen Genoms durch eine gewünschte DNA-Sequenz ersetzt wurden. Es wird, je nachdem ob eine für die Replikation wichtige virale Gensequenz deletiert wurde, zwischen replikationskompetenten und -defizienten Vektoren unterschieden [29]. Mit deren Hilfe können Gene gezielt transient oder stabil in ein Gewebe eingebracht und dort exprimiert werden. Aufgrund ihrer Fähigkeit, ein breites Spektrum proliferierender und nichtproliferierender Zellen zu transduzieren, gelten Adenoviren als die derzeit effizientesten Vektoren für einen transienten Gentransfer [30-32]. Adenoviren sind hoch infektiöse Erreger milder Erkrankungen der Atemwege, des Gastrointestinaltraktes sowie der Bindehaut des Auges und lassen sich relativ leicht in einer Vielzahl von Zellen, unter anderem des Hals-, Nasen- und Rachenraumes, der Lunge sowie des Verdauungstraktes, der Leber und der Blutgefäße, einschleusen. Die Familie der Adenoviridae wird in vier Gattungen untergliedert: Mastadenoviren, Aviadenoviren, Siadenoviren und Atadenoviren. 5 Einleitung Humane Adenoviren (hAdV) sind mit sieben Spezies (hAdV-A bis -G) nur in der Gattung der Mastadenoviren vertreten [33]. Bisher wurden insgesamt über 52 verschiedene humanpathogene Serotypen beschrieben. In ihrem Wirt verursachen sie milde Atemwegserkrankungen und sind aufgrund ihres häufigen Vorkommens selbst in gesunden Individuen nachzuweisen [34]. Abbildung 1.2: Schematische Darstellung eines Adenovirus. Das Viruspartikel hat einen Durchmesser von ca. 80 bis 110 nm und ein Genom aus doppelsträngiger, linearer DNA mit einer Länge von circa 36 bis 38 kb. Die Partikel sind umgeben von einem ikosaedrisch strukturiertem Kapsid ohne Membranhülle (Abbildung 1.2). Dieses besteht aus insgesamt 252 Kapsomeren, darunter 240 Hexone, aufgeteilt auf zwanzig Seitenflächen und 12 Pentone als Eckpunkte der Seitenflächen. Die Pentone sind aus einem Pentonbasis- und einem Fiberproteinanteil aufgebaut. Bei dem Fiberprotein handelt es sich um einen bis zu 30 nm hervorstehenden, homotrimeren Komplex mit knopfförmigen Strukturen am Ende des Schaftes [35]. Im Falle der Infektion einer Zelle mit hAdVA, C, E und F binden diese Strukturen an den Coxsackie-Adenovirusrezeptor (CAR), ein Oberflächenprotein der Immunoglobulinsuperfamilie (Abbildung 1.3). 6 Einleitung Abbildung 1.3: Schematische Darstellung des adenoviralen Gentransfers. Adenovirus bindet an CAR auf der Zelloberfläche (A). Gebundenes Adenovirus bindet an Integrinrezeptor (B). Einstülpung der Zellmembran, Enstehung eines Endosoms (C). Ansäuerung des Endosoms (D). Zerstörung des Endosoms und der adenoviralen Kapsidhülle unter Freigabe adenoviraler DNA ins Zytoplasma (E - F). Transport der adenoviralen DNA in den Zellkern (G). Im Weiteren erfolgt eine Wechselwirkung zwischen den Pentonbasisproteinen und zelleigenen Adhäsionsmolekülen, den Integrinen. Die aktivierten Rezeptoren induzieren die Bildung eines Endosoms, welches die Viren in das Zytoplasma befördert. Dort bewirkt eine Ansäuerung des Endosoms die Freisetzung eines viralen Peptids (Protein VI) welches wiederum die Lyse des Endosoms induziert. Unter Freisetzung großer Teile des Viruskapsids (Fiberproteine, Pentonbasisproteine und Hexone) folgt die Freisetzung der viralen DNA ins Zytoplasma und von dort aus durch einen gerichteten Transport (Protein VII) in den Nukleus [35]. Im Zellkern wird die adenovirale DNA extrachromosomal 7 Einleitung exprimiert und nicht, wie zum Beispiel bei den Retroviren, in das Wirtsgenom integriert [29, 36]. Nach dem Eintritt der adenoviralen DNA in den Zellkern erfolgt die Transkription des viralen Genoms. Dieses besteht aus insgesamt fünf kodierenden Bereichen, den frühexprimierten (E; „early“) und spätexprimierten Regionen (L; „late“). Vier dieser Regionen (E1 bis E4) werden den frühexprimierten Genen zugeordnet und sind für die erfolgreiche Replikation des Virus essentiell. Die späten Regionen (L-Gene) kodieren für Struktur- und Kapsidproteine des Virus [33]. Die E1-Gene (E1A und E1B) werden sofort nach der Infektion exprimiert und sind dabei unabhängig von anderen viralen Proteinen. E1A dient als Transkiptionsaktivator für die anderen E-Regionen und darüber hinaus als Inhibitor des Retinoblastomproteins (Rb105 und Rb107) und des Tumorsupressorproteins p53. Dies führt zum Eintritt der Zelle in die S-Phase und somit zur Synthese von essentiellen Faktoren für die Replikation, welche sich das Virus zunutze macht [27]. Zeitgleich inhibiert das E1B-Protein durch Regulation von Cytochrom c aus dem Mitochondrium die Apoptoseinduktion [35]. Die für die Replikation des Virus benötigte DNA-Polymerase wird unter anderem von der E2-Region exprimiert. Bei den E3-Proteinen handelt es sich um eine Vielzahl kleiner Proteine, welche von einem für die Replikation des Virus nicht essentiellen Bereich des Genoms kodiert werden. Deren wichtigste Funktion beinhaltet die Unterdrückung der zellulären Immunantwort durch Regulation der Neusynthese von auf der Zelloberfläche lokalisierten MHC-Klasse-I Molekülen. E4-Proteine erfüllen, soweit bekannt, ähnliche Funktionen wie die E1B-Proteine und interagieren mit Protein p53 [33, 35]. Durch einen Austausch verschiedener früh exprimierter Regionen (E1, E2 oder E4) der viralen DNA gegen ein beliebiges Gen, ist es möglich, die Replikation des Virus und die damit verbundene Lyse der Wirtszelle zu unterbinden. Die Region E3 kann ebenfalls ausgetauscht werden, was jedoch nicht zu einer Inaktivierung der Replikation führt. Heute wird zwischen erster, zweiter und dritter Generation adenoviraler Vektoren unterschieden: Der Replikationsdefekt adenoviraler Vektoren der ersten Generation wurde durch die Deletion der E1A- und E1B-Gene erreicht. Deren Aufnahmekapazität wurde zusätzlich noch durch Deletion des E3-Gens auf insgesamt 8,3 kB erhöht. 8 Einleitung Alle weiteren früh und spät exprimierten viralen Gene sind in dieser Generation jedoch noch enthalten [37]. In Vektoren der zweiten Generation, die zusätzlich Deletionen der E2- und E4-Region aufweisen, sind nur die spät exprimierten Regionen noch vorhanden (Abbildung 1.4). Die Kapazität dieser Vektoren beträgt bis zu 14 kB. Die neueren Vektoren der 3. Generation, die „gutless-Vektoren“, besitzen keine Gene der E- und L-Regionen des Virus und können somit transgenes Material von insgesamt 38 kB aufnehmen. Im Genom dieser Vektoren sind vom Adenovirus nur die cis-aktiven Sequenzen für die Replikation und Verpackung des viralen Genoms verblieben [29, 35, 37]. Abbildung 1.4: Schematischer Ausbau des Genoms adenoviraler Vektoren. 9 Einleitung 1.3 Gentherapie Durch die Möglichkeiten zur gezielten Manipulation des viralen Erbguts sowie die Entschlüsselung des humanen Genoms bietet die Gentherapie eine innovative Methode zur alternativen Behandlung eines breiten Spektrums von Krankheitsbildern [38, 39]. Die in den letzten 22 Jahren häufigste klinische Anwendung war in 64,5 % der registrierten klinischen Studien die onkolytische Behandlung von malignen Tumorzellen. Abgesehen davon gab es bisher diverse gentherapeutische Studien über die Behandlung von Patienten mit Herz- und Gefäßkrankheiten, genetischen Defekten sowie Infektionskrankheiten. Insgesamt wurden seit 1989 mehr als 1700 klinische Studien zu gentherapeutischen Behandlungskonzepten registriert, davon 63,7 % in den USA, und 25 % in Europa. Die hierbei am häufigsten verwendeten Vektoren sind mit 24,1 % adenoviralen und 20,8 % retroviralen Ursprungs (Abbildung 1.5). Hierbei spielen neben den viralen Vektoren auch die nichtviralen Transfektionsmethoden mit Plasmid-DNA, welche in 18,7 % der Studien verwendet werden, eine erhebliche Rolle [38]. Abbildung 1.5: In klinischen Studien verwendete Vektorsysteme. Auswertung klinischer Studien seit 1989; modifiziert nach Edelstein et al. [38]. Aufgrund einer hohen Anzahl potenzieller Wirtszellen, der Transduktion von proliferierenden und nichtproliferierenden Zellen sowie ihrer hohen Effizienz sind adenovirale Konstrukte auch für die kutane Gentherapie von hohem Interesse [40]. Mithilfe des adenoviralen Gentransfers ist es möglich, gewünschte Proteine in den Hautzellen synthetisieren zu lassen und das Gewebe somit über einen vektorspezifischen Zeitraum von zwölf Tagen mit den entsprechenden Faktoren zu 10 Einleitung versorgen [41-44]. Weitere Vorteile liegen im Vergleich zu anderen viralen Vektoren in der leichten Handhabung der Adenoviren. Eine für andere Virusgattungen beschriebene Kanzerogenität im Menschen wurde für Adenoviren im Menschen bisher nicht gezeigt. Des Weiteren werden bei der Herstellung adenoviraler Vektoren Titer von mehr als 1012 Partikel/ml erreicht [27, 29, 33, 35]. Ein großer Nachteil der Verwendung adenoviraler Vektoren liegt in der Induktion einer humoralen und zellulären Immunreaktion [35]. Diese beinhaltet sowohl die Sekretion großer Mengen von Zytokinen als auch die Rekrutierung von Immunzellen wie Makrophagen/Monozyten, Natürliche Killer (NK) Zellen und Granulozyten [35, 45]. Durch die Präsentation adenoviraler Peptide durch MHCKlasse-I Moleküle an der Zelloberfläche transduzierter Zellen werden diese durch das adaptive Immunsystem erkannt und eliminiert [35]. Die Aktivierung einer adaptiven Immunantwort führt darüber hinaus zu einer beschleunigten Eliminierung der transduzierten Zellen nach mehrmaliger Applikation der Vektoren. In Folge dessen ist ein effektiver Gentransfer auf eine einmalige Anwendung beschränkt [46]. Das häufige Vorkommen von Adenoviren in der Umwelt führt zu einer großen Anzahl von seropositiven Menschen in der Bevölkerung, wodurch bereits eine Erstapplikation zu erheblich abweichenden Wirkungen führt [33, 34]. In einer Studie von Chirmule et al. wurden in nahezu allen Patienten Antikörper gegen Adenoviren nachgewiesen [47]. Ein erster großer Rückschlag für die Gentherapie erfolgte im Jahr 1999, als ein Patient an plötzlichem Organversagen verstarb. Nachdem ihm 3,8x1012 gentechnisch abgeschwächte Adenoviren als gentherapeutischer Vektor intravenös injiziert worden waren, löste die hohe Konzentration der Viren im Körper eine unerwartet starke Aktivierung des Immunsystems aus [48, 49]. Bisher publizierte Arbeiten zeigen eine Reaktion des angeborenen Immunsystems unabhängig von der Kapsidhülle des Adenovirus [50, 51]. Durch Deletion aller viral kodierenden Gene im Genom von gutless-Vektoren wurde die Immunantwort zwar vermindert, jedoch nicht umgangen [52]. Der Grund dafür sind in erster Linie Rezeptoren der angeborenen Immunabwehr, welche zytoplasmatisch lokalisierte Nukleinsäuren im Allgemeinen erkennen und infolgedessen eine Immunantwort induzieren [53-55]. 11 Einleitung 1.4 Das Immunsystem Das phylogenetisch älteste, sogenannte angeborene Immunsystem steht zeitlich und räumlich vor dem adaptiven Immunsystem und wird nach Kontakt mit einem Pathogen als erstes aktiv. Dieses oftmals auch unspezifisch genannte Immunsystem stützt sich auf phagozytierende Zellen und Proteine und wird daher in zelluläre und humorale Komponenten unterteilt. Beim Menschen gehören zum zellulären Teil neutrophile Granulozyten sowie mononukleäre und polymorphonukleäre Phagozyten und zum humoralen Teil unter anderem die Lysozyme, das Lipopolysaccharid-bindende Protein, Zytokine, das Komplementsystem und antimikrobielle Peptide [56]. Die angeborene Immunabwehr vermag konservierte Merkmale potenzieller Pathogene zu erkennen, fungiert bei Vertebraten aber neben ihrer Abwehrfunktion auch als Mittler der adaptiven Abwehr [57]. Die Systeme der spezifischen und unspezifischen Immunantwort stehen dabei unter anderem über die Interleukine, Chemokine und Interferone in engem Kontakt miteinander [58]. Das ausschließlich bei Vertebraten vorkommende adaptive Immunsystem hat sich erst vor rund 500 Millionen Jahren entwickelt. Mit Hilfe von B- und T-Lymphozyten werden bekannte Erreger durch das adaptive Immunsytem binnen kurzer Zeit hochspezifisch abgewehrt. Das adaptive Immunsystem wird, wie das angeborene Immunsystem, ebenfalls in humorale und zelluläre Komponenten unterteilt. Im Verlauf humoraler Immunreaktionen sezernieren B-Lymphozyten Immunglobuline, die Antigene potenzieller Erreger binden und damit Interaktionen mit Wirtszellen unterbinden. Im Laufe einer zellulären Immunantwort reagieren aktivierte T-Lymphozyten direkt gegen ein pathogenassoziiertes Antigen auf infizierten Wirtszellen und zerstören diese direkt oder veranlassen deren Phagozytose [35]. Darüber hinaus differenziert ein Teil der stimulierten B- und TLymphozyten zu Gedächtniszellen, die dem Organismus eine schützende Immunität gegen Re-Infektionen mit dem gleichen Erregertyp verleihen. Bei einem erstmaligem Kontakt des Körpers mit einem potentiellen Erreger setzen die Mechanismen des adaptiven Immunsystems mit einer Latenz von bis zu einer Woche ein [35, 59]. Aus diesem Grund werden im Zuge einer Primärinfektion bestimmte Erregerstrukturen über Rezeptoren des angeborenen Immunsystems erkannt, und eine entsprechende Abwehrreaktion wird eingeleitet 12 Einleitung [58]. In diesem Zusammenhang gilt eine Gruppe hoch konservierter Rezeptoren, die sogenannten Toll-like Rezeptoren, als wichtigste Gruppe für die Erkennung von Pathogenen [46, 60, 61]. 1.5 Toll-like Rezeptor Signalweg 1.5.1 Toll-like Rezeptoren Toll-like Rezeptoren (TLRs) sind Transmembranmoleküle, bestehend aus einer extrazellulären, Leucin-reichen Domäne und einem zytoplasmatischen Teil, welcher dem Interleukin-1 Rezeptor ähnelt. Bisher wurden im Menschen elf unterschiedliche Toll-like Rezeptoren und einige ihrer Liganden identifiziert und charakterisiert (Tabelle 1.1) [35, 58]. Diese Rezeptoren sind in der Zelle entweder auf der Plasmamembran (TLR-1, -2, -4, -5, -6, -10 und -11) oder endosomal (TLR-3, -7, -8 und -9) lokalisiert. TLR-10 wurde durch in silico Analysen charakterisiert und wird in lymphoiden Geweben exprimiert [35, 62-64]. Die genaue Lokalisation in der Zelle bzw. entsprechende Liganden sind bisher noch nicht bekannt. Mitglieder dieser Rezeptorfamilie sind in der Zelle für die Erkennung von pathogenassoziierten molekularen Mustern (pathogen associated molecular patterns; PAMP) essentiell [35]. Die von den TLRs erkannten PAMP umfassen verschiedene Liganden meist mikrobiellen Ursprungs (Tabelle 1.1). Für die Detektion von Adenoviren, genauer gesagt der adenoviralen DNA, wurde vor allem die Beteiligung von TLR-9 in der Vergangenheit intensiv diskutiert [45, 61, 65, 66]. Durch eine Wechselwirkung zwischen den unterschiedlichen Erreger-spezifischen Ligandenstrukturen und den extrazellulären beziehungsweise in das Endosomenlumen orientierten, Leucin-reichen Domänen der unterschiedlichen TLRs werden bei Kontakt mit einem PAMP intrazelluläre Signalkaskaden induziert. Einige der TLRs bilden auch heterodimere Komplexe, die dann in ihrer Ligandenbindung modifiziert sind oder einander überlappen. Als Folge der Ligandenbindung lagern sich an die ins Zytoplasma orientierten, konservierten TIR-Domänen (Toll/IL-1R-Domäne) der TLRs unterschiedliche, als Adaptoren wirkende TIR Domänenproteine wie MyD88 (myeloid differentiation response gene 88) an. 13 Einleitung Tabelle 1.1: Toll-like Rezeptoren. Auflistung humaner Toll-like Rezeptoren (TLR), entsprechender Liganden und Adaptermoleküle (Modifiziert nach Schütt et al. [58]. ZPM = Zytoplasmamembran; EM = Endosomenmembran). Rezeptor Lokalisation TLR 1/2 ZPM triacylierte Lipopeptide Liganden Adapter MyD88 TLR 2 ZPM Peptidoglycan, Lipoarabinomannan, Modulin, Zymosan, Glycosylphosphatidyl-Inositol, Hämagglutinin MyD88 TLR 2/6 ZPM diacylierte Lipopeptide MyD88 TLR 3 EM dsRNA TLR 4 ZPM Lipopolysaccharide, virale Membranproteine TLR 5 ZPM Flagellin MyD88 TLR 7 EM ssRNA MyD88 TLR 8 EM ssRNA MyD88 TLR 9 EM unmethylierte CpG-Motive in DNA MyD88 TLR 10 ZPM unbekannt unbekannt TLR 11 ZPM profilinähnliche Strukturen, Proteinkomponenten unbekannt TRIF MyD88 / TRIF Unter Beteiligung von IRAK-Kinasen (IL-1R assoziierte Kinasen) werden in einem mehrstufigen Vorgang Mitglieder der Proteinkinasefamilie IKK (IκB-Kinase) aktiviert, welche den Inhibitor IκB des Transkriptionsfaktors NFκB (nukleärer Faktor kappa B) phosphorylieren (Abbildung 1.6). In Folge dessen gelangt das aktivierte NFκB in den Zellkern und induziert dort die Expression verschiedener inflammatorischer Faktoren. Parallel dazu führt die Aktivierung der IRAK-Kinasen zu einer Phosphorylierung von Interferon-regulierenden Faktoren 3 und 7 (IRF-3 und -7), welche die Expression der für Interferon-(IFN)-α und IFN-β kodierenden Gene induzieren [35, 58]. Neben der IKK-abhängigen Aktivierung von NFκB spielen auch Faktoren aus der Gruppe der Mitogen aktivierten Proteinkinasen (MAPK) unter Beteiligung von p38 MAPK, MAPK Kinasen (MAPKK), extrazellulär regulierten Kinasen (Erk1/2) oder c-Jun N-terminalen Kinasen (JNK) eine wichtige Rolle bei der Induktion einer TLR vermittelten Immunreaktion. Deren Phosphorylierung (IKK- bzw. IRAK-abhängig) induziert c-Jun, auch als AP-1 (adaptor-related protein complex 1) bezeichnet. Dies ist ebenfalls ein Transkriptionsaktivator und für die Zytokinsynthese verantwortlich [30, 67, 68]. 14 Einleitung Abbildung 1.6: Signaltransduktion von Toll-like Rezeptoren. Eine Aktivierung von Toll-like Rezeptoren verläuft über die Adaptermoleküle MyD88 und TRIF und aktiviert die Transkriptionsfaktoren IRF-3, IRF-7, JNK, p38 MAPK, Erk und NFκB. Diese wiederum induzieren die Expression von Typ-I-Interferonen (IRF-3 und -7) und Zytokinen (JNK, p38 MAPK, Erk und NFκB). Über spezifische Zytokinrezeptoren wird darüber hinaus der JAK/STAT-Signalweg aktiviert, wodurch wiederum eine erneute Expression von Zytokinen eingeleitet wird. 15 Einleitung 1.5.2 Zytokine Bei einem Kontakt von Erregern mit dem Körper ist eine effektive Modulation und Koordination der zellulären und humoralen Immunantwort erforderlich. Die dazu notwendige Kommunikation zwischen den beteiligten Zellen erfolgt einerseits über Zell-Zell-Interaktionen, andererseits über spezifische Botenstoffe, den Zytokinen. Diese werden von den verschiedensten Zellarten produziert, insbesondere aber von Lymphozyten, Monozyten und Makrophagen. Zur Gruppe der Zytokine rechnet man heute neben den Interferonen (IFN), Interleukinen (IL) und Chemokinen auch die Tumornekrosefaktoren (TNF), die koloniestimulierenden Faktoren (CSF) und die transformierenden Wachstumsfaktoren (TGF) [35, 58]. 1.5.2.1 Interferone Die Gruppe der Interferone lässt sich in drei Subtypen untergliedern: Typ-I-, Typ-II- und Typ-III-Interferone. Typ-I-Interferone spielen im Falle einer Virusinfektion für das angeborene Immunsystem eine essentielle Rolle. Beim Menschen wurden bisher fünf Vertreter dieser Gruppe näher charakterisiert: IFN-α, -β-, -ε, -κ und -ω. Bei den wichtigsten Vertretern handelt es sich um IFN-α und -β (auch als Leukozyten- und Fibroblasteninterferon bezeichnet). Typ-I-Interferone weisen mit Ausnahme von IFN-ε eine deutliche antivirale Aktivität auf, indem sie in den umliegenden Zellen eine Ausschüttung der Proteinkinase R (PKR) induzieren. Diese wiederum phosphoryliert und inaktiviert den Translationselongationsfaktor 2α (elF2α) und stoppt somit den Translationsmechanismus der Zelle. Darüber hinaus führen Interferone zur Aktivierung von RNase L, welche zum Abbau von zytoplasmatischer RNA führt und somit die Proteinbiosynthese zusätzlich unterbindet [35]. Weitere Funktionen der Interferone liegen in dem Aufbau eines antiviralen Status in der Zelle, der Hemmung der Zellteilung, einer Konzentrationserhöhung von MHC-Klasse-I Antigenen sowie von anderen Oberflächenmarkern, der Expression proapoptotischer Proteine (beispielsweise Caspasen) bzw. Repression von antiapoptotisch wirkenden Faktoren (beispielsweise Bcl-2) sowie der Freisetzung von weiteren Zytokinen [35, 69]. Die Signaltransduktion erfolgt dabei über den IFN-α Rezeptor (IFNαR), wo eine Bindung von IFN zu einer Konformationsänderung des IFNαR führt. Dies wiederum induziert eine Phosphorylierung von 16 Einleitung Tyk2 (Tyrosinkinase 2) und Jak1- (Januskinase 1) Kinasen am zytoplasmatisch lokalisierten Teil des IFNαR. In Folge dessen werden die Faktoren Stat-1 und Stat-2 (signal transducers and activators of transcription-1 und -2) ebenfalls phosphoryliert und bilden einen Komplex mit dem Protein 48 (p48). Dieser Komplex aktiviert im Nukleus die interferonstimulierten regulatorischen Elemente (ISRE) und somit die Expression der interferonstimulierten Gene (ISG). Diese übernehmen Aufgaben in einer Vielzahl von zellulären Abläufen, wie Angiogenese, Antikörperprozessierung und -präsentation, Apoptose, Zellvitalität, Replikation, Expression und Translation, Zellmetabolismus und Zytokinexpression [35, 58]. Neben dem JAK/STAT Signalweg werden darüber hinaus noch MAPK abhängige Kaskaden durch Interferone aktiviert [5, 70]. Aus der Gruppe der Typ-II-Interferone wurde bisher nur ein Vertreter näher beschrieben, das IFN-γ. Die Sezernierung von IFN-γ führt in den umliegenden Zellen über den IFN-γ Rezeptor (IFNγR) zur Bildung von phosphorylierten Stat-1 Homodimeren. Im Zellkern binden diese an die IFN-γ-kontrollierten interferonstimulierten regulatorischen Elemente und bewirken darüber eine Expression von MHC-Klasse-II Proteinen und Zytokinen. Das IFN-γ gilt als eines der zentralen Zytokine bei der Induktion der spezifischen Immunantwort [35]. Die Typ-III-Interferone werden in drei Subtypen unterteilt: IFN-λ1, -λ2 und λ3, auch bekannt als IL29, -28A und -28B). Diese wirken auf ähnliche Weise wie Typ-I-Interferone über den JAK/STAT-Signalweg. Über den genauen Wirkmechanismus dieser Zytokine sind bisher jedoch nur verhältnismäßig wenige Details bekannt [35]. 1.5.2.2 Interleukine Die Bezeichnung „Interleukine“ leitet sich von der zuerst beschriebenen Funktion ab: „zwischen Leukozyten vermitteln“. Bisher sind mehr als 35 Interleukine bekannt. Sie sind schon in sehr geringen Konzentrationen (10-15 bis 10-10 mol/l) mit vielseitiger Funktion aktiv, wirken aber überwiegend als Regulatoren des Immunsystems. Aus der Gruppe der Interleukine sind über 35 Vertreter bekannt, sodass im Folgenden nur die wichtigsten Vertreter näher dargestellt werden [58]. IL-1 umfasst eine Gruppe von Zytokinen mit einem Molekulargewicht von ca. 18 kDa. Das Propeptid, welches durch Calpain (IL-1α) und Caspase-1 (IL-1β) 17 Einleitung proteolytisch in die aktive Form überführt wird, hat eine Größe von 31 kDa. Es wird vor allem von Makrophagen, Endothelzellen, Keratinozyten und Korneaepithelzellen gebildet und zählt zu den proinflammatorischen Zytokinen [71]. Zytokine dieser Gruppe aktivieren die Proliferation von Keratinozyten, Fibroblasten (IL-1α) und Endothelzellen (IL-1β), induzieren weiterere Zytokine und Akut-Phase-Proteine (IL-1α/β) und aktivieren neutrophile Granulozyten (IL-1α), Monozyten (IL-1β) und Lymphozyten (IL-1α/β) [35, 72]. IL-6 ist ein 26 kDa Glykoprotein, welches von den verschiedensten Zellen wie Monozyten, Makrophagen, Endothelzellen, Epithelzellen und Fibroblasten gebildet wird [71]. Es bewirkt unter anderem als proinflammatorischer Faktor die Induktion von Fieber, die Synthese von Akut-Phase-Proteinen, die Proliferation von B- und T-Lymphozyten sowie die Induktion anderer Zytokine [72]. IL-6 wird nach jeder Art von Gewebezerstörung freigesetzt; die höchsten Spiegel werden im septischen Schock erreicht [73]. IL-10 ist ein antiinflammatorisches Zytokin mit einem Molekulargewicht von 18 kDa. Es wird in erster Linie von Monozyten und Lymphozyten sezerniert und reduziert die Expression von Zytokinen und MHC-Klasse-II Antigenen. Darüber hinaus steuert es die Vitalität von B-Zellen, deren Proliferation und Antikörperproduktion [71, 72]. Zudem induziert IL-10 die Expression von SOCS1- (suppressor of cytokine signalling 1) und SOCS3 Molekülen, welche inhibitorisch auf den JAK/STAT Signalweg und NFκB wirken [74]. 1.5.2.3 Chemokine Bei der Gruppe der Chemokine handelt es sich um relativ kleine Proteine (6 bis 14 kDa) mit chemotaktischen Eigenschaften. Bisher wurden mehr als 50 verschiedene Chemokine beschrieben, welche in vier Untergruppen aufgeteilt werden können (CC-, CXC-, XC-, CX3C-Chemokine). CC-Chemokine besitzen an ihren aminoterminalen Enden zwei direkt nebeneinander liegende Cysteinreste, bei den CXC-Chemokinen sind die beiden Cysteinreste durch eine, bei den CX3C-Chemokinen durch drei andere beliebige Aminosäuren voneinander getrennt [75]. Ihre Hauptaufgabe ist die Rekrutierung zusätzlicher Monozyten, Makrophagen und neutrophile Granulozyten aus dem Blut in das entzündete Gewebe. Dabei wirken 18 Einleitung einige zusätzlich aktivierend auf die Immunzellen. Die CXC-Chemokine macrophage inhibitory protein 1α (MIP-1α), regulated upon activation, normal T-cell expressed, and secreted (RANTES) wirken dabei vor allem auf die neutrophilen Granulozyten, während die CC-Chemokine (IL-8, Interferon gamma-induced protein 10 (IP-10)) bevorzugt Monozyten und Makrophagen zur Einwanderung an den Entzündungsort stimulieren. Konstitutive Chemokine werden im Unterschied zu den inflammatorischen Chemokinen kontinuierlich in den lymphatischen Organen gebildet. Sie sind an der Organentwicklung, der Angiogenese und der Feinlokalisierung der Immunzellen in den Lymphknoten, im Thymus und anderen lymphatischen Organen beteiligt [75, 76]. 1.5.2.4 Tumornekrosefaktoren Tumornekrosefaktor (TNF) α und TNFβ sind die am längsten bekannten Vertreter der TNF/Tumornekrosefaktor Rezeptor (TNFR) Superfamilie. TNFα, auch bekannt unter der Bezeichnung „tumor necrosis factor ligand superfamily member 2“ (TNFSF2), wird primär von immunologisch aktiven Zellen synthetisiert und freigesetzt. Es handelt sich um ein in Trimeren zusammengelagertes, membranverankertes Protein, welches bei einem Pathogenkontakt durch die Metalloprotease TACE (TNFα converting enzyme) in seine aktive Form (51 kDa) überführt wird. Aktives TNFα ist ein multifunktionelles Zytokin bei lokalen und systemischen Entzündungen. In benachbarten Zellen binden TNFα und -β an TNFR1 und TNFR2 [58]. Eine Bindung an TNFR2 bewirkt eine TRAF2 (TNFR associated factor 2)-abhängige Aktivierung von NFκB, wohingegen die Bindung an TNFR1 zu einer Caspase-8 und -10 induzierten Apoptose führt. Darüber hinaus wird die Sekretion von Zytokinen, MHC-I Antigenen, Adhäsionsproteinen, Stickstoffmonoxid, Akut-Phase-Proteine durch TNF angeregt und die Stimulation der Phagozytose in Makrophagen induziert. Darüber hinaus wirkt TNFα migrationsfördernd auf Granulozyten und bewirkt die Immunoglobulinsynthese in Lymphozyten [30, 77, 78]. 19 Einleitung 1.6 Alternative Signaltransduktion Im Gegensatz zu der These einer übergeordneten Rolle von Toll-like Rezeptoren bei der Erkennung adenoviraler Vektoren ist eine TLR-unabhängige Induktion einer Immunantwort nicht auszuschließen [79]. In diesem Zusammenhang sind in den vergangenen Jahren immer mehr alternative Signaltransduktionswege des angeborenen Immunsystems ins Augenmerk der immunologischen Forschung gerückt [80-85]. 1.6.1 RIG-like Rezeptoren Eine der besser bekannten Signalkaskaden wirkt bei der Detektion von zytoplasmatischer RNA und basiert auf zwei Proteinen der RNA-Helikase Familie, RIG-I (retionic acid inducible gene I) und mda5 (melanoma differentiation associated gene 5), als zytosolische RNA Detektoren [86]. RIG-I agiert außerdem als Rezeptor für adenovirale DNA [87]. Zusammen mit den Proteinen LPG2 (ATP abhängige RNA-Helikase DHX58) und Dicer bilden sie die Familie der RIG-like Helikasen (RLH; retinoic acid-inducible gene I (RIG-I)-like helicases) [84, 88]. RIG-I und mda5 besitzen jeweils zwei aminoterminale CARD-Domänen (caspase activation and recruitment domain) sowie einen als RNA-Helikase fungierenden Abschnitt, welcher aufgrund eines konservierten Aminosäuremotivs auch als DExD/H-Box bezeichnet wird. Beide Rezeptoren binden an doppelsträngige (ds)RNA, RIG-I auch an 5’-triphosphorylierte einzelsträngige (ss)RNA [35]. In Folge der RNA-Bindung werden ihre ATP abhängige Helikase aktiviert, wodurch eine Bindung an die CARD-Domänen des auf der Mitochondrienmembran lokalisierten Proteins IPS-1 (IFN-β promotor stimulator I) ermöglicht wird (Abbildung 1.7) [35]. Die weitere Signaltransduktion verläuft einerseits über eine TRAF-2 und -6 (TNF-receptor-associated factor) vermittelte Aktivierung von NFκB sowie die JAK/STAT und p38 MAPK Signalwege. Darüber hinaus interagiert IPS-1 mit den Adapterproteinen TRADD (TNFR1-associated via death domain) und TRAF3. Die Aktivierung von TRAF3 bewirkt eine Transmembranprotein 173 (STING) abhängige Phosphorylierung von IRF-3 und -7, während TRADD eine Caspase-8 und -10 vermittelte Apoptose auslöst [30, 84]. Alternativ verläuft die Signaltransduktion von IPS-1 auch über eine FADD abhängige Aktivierung (Fasassociated death domain-containing protein) von NFκB [35]. 20 Einleitung Abbildung 1.7: Signaltransduktion RIG-ähnlicher Rezeptoren. Bei Aktivierung von RIG-like Rezeptoren erfolgt die Signaltransduktion über das Adaptermolekül IPS-1 und führt zu einer Aktivierung der Transkriptionsfaktoren IRF-3, IRF-7, JNK, p38 MAPK und NFκB. Diese wiederum induzieren die Expression von Typ-I-Interferonen (IRF-3 und -7) und Zytokinen (JNK, p38 MAPK und NFκB). 21 Einleitung 1.6.2 Inflammasomen Neben den TLRs und RLR spielt darüber hinaus eine weitere Gruppe von Rezeptoren der angeborenen Immunabwehr, die Inflammasomen, eine wichtige Rolle bei der Detektion der adenoviralen DNA [89-92]. Dabei handelt es sich um einen Caspase-1 aktivierenden Multiproteinkomplex bestehend aus einem Rezeptorprotein der NOD-like Rezeptoren (nucleotide binding and oligomerization domain (NOD)-containing protein 1 like receptor (NLR)) oder der HIN-200 Proteinfamilie (hematopoietic interferon-inducible nuclear antigens with 200 amino acids repeats) sowie dem Adaptermolekül ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing a card) und der IL-1β prozessierenden Caspase-1 [90, 93, 94]. 1.6.2.1 NOD-like Rezeptoren Eine essentielle Gruppe von Rezeptoren des angeborenen Immunsystems stellen die NOD-like Rezeptoren dar. Dabei handelt es sich um eine Gruppe von mehr als 20 verschiedenen zytoplasmatischen PRRs. Ebenso wie die TLRs sind auch die NLRs in der Lage, ein weites Spektrum pathogener Substrate zu erkennen (Flagellin, Lipopolysaccharide (LPS), Lipoteichonsäuren (LTA), Peptidoglykan (PGN), RNA, DNA, etc) [30, 95, 96]. Mitglieder dieser Gruppe werden anhand ihrer C-terminalen nucleotide oligomerization domain und leucine-rich repeat domain charakterisiert. Anhand ihres Aufbaus am N-terminus werden die NLRs in zwei Subfamilien unterteilt, die NLRCs und NLRPs. Die NLRCs besitzen eine Nterminale CARD-Domäne wohingegen die NLRPs mit einer Pyrin Domäne (PYD) ausgestattet sind [97]. Vertreter der NLRCs, wie zum Beispiel NOD1 und NOD2, induzieren mittels ihrer CARD-Domäne eine RIPK2 (receptor-interacting serine/threonine kinase 2) abhängige Aktivierung des MAPK Signalwegs und NFκB [95]. Die NLRPs hingegen bilden in der Zelle zusammen mit dem Adaptermolekül ASC und Caspase-1 einen Multiproteinkomplex, welches als Inflammasom bezeichnet wird [96, 98]. Das Adaptermolekül ASC besitzt ebenfalls ein Pyrin- und eine CARD-Domäne. Im Falle einer Aktivierung des Inflammasoms interagieren die PYD-Domänen des NLRPs und ASC und ermöglichen eine Aktivierung von Caspase-1 mittels der CARD-Domäne des ASC (Abbildung 1.8). Die Caspase-1 wiederum katalysiert 22 Einleitung die Spaltung von pro-IL-1β. pro-IL-18 und pro-IL-33 in deren aktiven Formen IL-1β, -18 und -33. Aus der Gruppe der NLRs wurde bisher nur ein einziger Rezeptor, NALP3 (NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3), für die Erkennung pathogener Nukleinsäuren näher charakterisiert [30, 95] . 1.6.2.2 HIN-200 Proteine Im Jahre 2009 wurde ein weiteres Protein, AIM2 (abscent in melanoma 2), erstmals näher als Bestandteil eines DNA erkennenden Inflammasom-Komplexes beschrieben [90]. AIM2 ist ein Protein der HIN-200-Familie, eine Familie interferoninduzierender Proteine mit N-terminaler PYD und C-terminaler HIN-200Domäne (PYHIN), die konservierte Sequenzwiederholungen mit einer Länge von 200 Aminosäuren enthält. Über die genauen Funktionen dieser Proteinfamilie ist bisher nur wenig bekannt. Beschrieben wurden bisher die Regulation des Zellwachstums, Funktionen als Transkriptionsregulator und Tumorsuppressor [99]. Mit Ausnahme von AIM2 sind die Mitglieder dieser Familie überwiegend im Zellkern lokalisiert [93]. Im Gegensatz zu NALP3 werden potentielle DNA-Liganden mittels der HIN-200-Domäne gebunden und somit eine Interaktion der PYD und der PYD des Adaptermoleküls ASC ermöglicht [93]. Die weitere Signalweiterleitung erfolgt ebenfalls über eine Caspase-1 vermittelte Aktivierung von IL-1β, -18 und -33 [93, 98]. Neben AIM2 wurden unlängst auch andere PYHIN Proteine der HIN-200 Proteinfamilie als potentiell an der Bildung von Inflammasomen beteiligte Proteine charakterisiert [90, 94, 100, 101]. Dabei spielen unter anderem IF16 (interferon gamma-inducible protein 16), IFIX (pyrin and HIN domain family member 1) und MNDA (myeloid cell nuclear differentiation antigen) eine besondere Rolle für die Erkennung von zytoplasmatisch lokalisierter DNA [90, 100, 102]. 23 Einleitung Abbildung 1.8: Inflammasomabhängige Signaltransduktion. Bei einer Inflammasomabhängigen Detektion von DNA erfolgt eine Erkennung der DNA durch die Proteine AIM2 und NALP3, welche einen Komplex (Inflammasom) mit dem Adaptermolekül ASC und Caspase-1 bilden. Das aktivierte Inflammasom katalysiert die Prozessierung von pro-IL-1β in dessen aktive Form IL-1β. 24 Einleitung 1.6.3 DAI (DLM-1/ZBP1) Neben den TLRs, RLRs und NLRs wurde mit dem Protein DAI (DNA-dependent activator of Interferon-regulatory factors) ein weiterer DNA erkennender Rezeptor beschrieben [83]. Unter dem Namen DLM-1 (tumor stroma and activated macrophage protein) wurde dieses überwiegend zytoplasmatisch lokalisierte Protein bereits von Fu et al. im Jahre 1999 erstmals erwähnt [103, 104]. Zwei Jahre darauf wurden zwei N-terminale Z-DNA-Bindedomänen beschrieben und das Protein als ZBP1 (Z-form DNA binding protein 1) bezeichnet [105, 106]. Takaoka et al. belegen darüber hinaus in einer Studie die eindeutige Rolle von DAI als Rezeptor für bakterielle und Kalbsthymus- sowie synthetische DNA (Poly(dA:T), poly(dG:C)) [83]. Des Weiteren ist DAI bei der zytosolischen Erkennung von doppelsträngiger DNA im Allgemeinen beteiligt [30]. Die Bindung von DAI durch einen DNA-Liganden induziert eine TBK1 abhängige Aktivierung von IRF-3 und -7 [30]. Außerdem erfolgt eine RIP-1 und -3 vermittelte Phosphorylierung von IκB und die damit verbundene Freisetzung von NFκB (Abbildung 1.9) [30, 107]. Genauere Details der DAI-vermittelten Signaltransduktion sind bisher jedoch noch unklar [108]. Die in der Literatur beschriebenen Mechanismen der Erkennung adenoviraler DNA beschäftigen sich überwiegend mit den molekularen Abläufen in spezialisierten Zellen der angeborenen Immunabwehr, wie zum Beispiel Dendritischen Zellen [65, 79, 109], Makrophagen [51, 85, 89, 109, 110] und weiteren antigenpräsentierenden Zellen [46, 47, 61, 111]. Zusätzlich wurden diese Mechanismen häufig basierend auf Viren mit RNA-Genom analysiert [112-116]. Außerdem liegt in Fibroblasten eine TLR-unabhängige Induktion von IRFs vor [51]. Darüber hinaus wurde die Rolle dieser Rezeptoren nach einer adenoviralen Transduktion von epidermalen Zellen, insbesondere von Keratinozyten, bisher nur unzureichend untersucht. Für die Etablierung eines adenoviralen Gentransfers in die Haut sind genaue Informationen über die molekularen Mechanismen nach Transduktion von Keratinozyten jedoch unabdingbar. 25 Einleitung Abbildung 1.9: DAI-induzierte Signaltransduktion. Eine Aktivierung von DAI führt zu einer Signaltransduktion über die Transkriptionsfaktoren IRF-3, -7 und NFκB. Diese wiederum induzieren die Expression von Zytokinen und Typ-IInterferonen im Zellkern. 26 Einleitung 1.7 Zielsetzung Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten die molekularen Mechanismen der angeborenen epithelialen Immunabwehr in Folge des transienten kutanen adenoviralen Gentransfers untersucht werden. Dabei sollten die Bestandteile der adenoviralen Vektoren, welche für die Immunogenität der adenoviralen Vektoren ursächlich sind, näher charakterisiert werden und darüber hinaus eine detaillierte Beschreibung der an der Induktion der Immunantwort beteiligten Rezeptoren und Signaltransduktionsmechanismen erfolgen. Für die Bestimmung der adenoviral induzierten Zytokinexpression wurden primäre humane Keratinozyten und HaCaT-Zellen mit adenoviraler DNA beziehungsweise adenoviralen Vektoren transfiziert bzw. transduziert. Daraufhin wurde die Zytokinexpression der Keratinozyten mittels qRT-PCR auf RNA-Ebene untersucht. Darüber hinaus wurden die in vitro generierten Daten in einem ex vivo Versuch mit Hilfe eines humanen Hautspannmodells (BO-Drum®) verifiziert. Die lokalen und systemischen Effekte des adenoviralen Gentransfers sollten darüber hinaus in einem murinen Modell untersucht werden. Dazu wurde immunkompetenten und athymischen, haarlosen Mäusen ein adenoviraler Vektor intradermal injiziert. Der Vektor trug das Transgen für das grün fluoreszierende Protein (GFP). Die Expression des Transgens wurde über einen Zeitraum von 19 Tagen in einer Kodak Imaging Station quantifiziert und darüber hinaus die Zytokinexpression mittels qRT-PCR quantifiziert. Für die Betrachtung der an der Immunreaktion beteiligten Signalkaskaden wurden in vitro Schlüsselproteine diverser Signalwege vor der Transfektion der Zellen inhibiert und die Wirkung auf die Zytokinexpression via qRT-PCR analysiert. 27 Material und Methoden 2 Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Herkunft der Zellkulturen HaCaT-Zellen wurden 1988 am Deutschen Krebsforschungszentrum aus primären Keratinozyten eines zweiundsechzigjährigen männlichen Patienten gewonnen [117]. Für die Herstellung einer Kultur von primären humanen Keratinozyten wurde Hautgewebe aus dem peripheren Bereich eines Melanoms auf dem Rücken des Patienten entnommen und von Fettgewebe und Dermisanteilen befreit. Daraufhin wurden die Zellen enzymatisch aus dem Zellverband gelöst und in modifiziertem „Minimum Essential Medium“ (MEM) mit hoher Ca2+-Konzentration (1,4 M) ausgesät. Anschließendes Langzeitwachstum bei geringer Ca2+-Konzentration (0,2 M) ohne Passagieren der primären Zellkulturen und die Erhöhung der Wachstumstemperatur auf 38,5 °C führte zu einer spontanen Immortalisierung der Zelllinie. Die Bezeichnung „HaCaT“ ist angelehnt an die Entstehung der Zelllinie und steht für „Human adult Keratinocytes under low Calcium and increased Temperature“. Die Zellen wurden freundlicherweise von Prof. Dr. Fusenig (Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg) zur Verfügung gestellt. Die primären humanen Keratinozyten (HKC) wurden aus Hautgewebe isoliert, welches aus dem Operationssaal der Klinik für Plastische Chirurgie und Schwerbrandverletzte des Klinikums Bergmannsheil bezogen wurde. Die Probenentnahme wurde autorisiert durch die Ethikkommission der Ruhr Universität Bochum (Register-Nr. 2501). Angaben bezüglich Alter, Geschlecht und genaue Herkunft der HKC-Zellen sind in Tabelle 2.1 dargestellt. Die für die Adenovirusherstellung verwendeten Zelllinien HER-911 (human embryonic retinoblast cell line) und HEK-293 (human embryonic kidney cell line) wurden von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ GmbH, Braunschweig, Deutschland) bezogen. 28 Material und Methoden Tabelle 2.1: Patientendaten zu den verwendeten primären Keratinozyten. Nummer Geschlecht 200 201 202 203 204 205 206 207 214 220 222 223 224 225 226 227 231 232 234 235 241 242 243 244 246 247 248 249 254 255 257 262 263 264 265 267 268 w w w w m w w w m w w w w m w m w w w w m w w w w w w w m w w m w w m w w Geb.-Jahr 1982 1988 1976 1959 1970 1972 1959 1987 1983 1943 1979 1955 1965 1962 1952 1977 1954 1967 1966 1986 1947 1957 1962 1943 1959 1971 1989 1957 1924 1966 1949 1953 1948 1941 1946 1972 1950 29 Operation Abdominoplastik Mammareduktion Mammareduktion Mammareduktion Abdominoplastik Abdominoplastik Facelift Abdominoplastik Spalthaut Abdominoplastik Abdominoplastik Abdominoplastik Abdominoplastik Daumenamputation Mammaamputation Abdominoplastik Abdominoplastik Abdominoplastik Abdominoplastik Mammareduktion Nachresektion Tumor Hüfte Brustvergrößerung Abdominoplastik Gesichtsplastik Abdominoplastik Beinstraffung Mammareduktion Abdominoplastik Oberschenkelamputation Oberschenkelstraffung Mammareduktion Abdominoplastik Mammareduktion Abdominoplastik Abdominoplastik Abdominoplastik Mammareduktion Material und Methoden 2.1.2 Versuchstiere Foxn1Nu SKH-1Hrhr (athymisch) Harlan, Horst (Niederlande) (immunkompetent) Charles River, Sulzfeld (Deutschland) Die haarlose Maus (SKH-1/Hrhr) wurde 1926 zufällig in einem Londoner Zoo entdeckt. Ihr genetischer Defekt beschränkt sich auf ihr Erscheinungsbild. Bei Jungtieren setzt ab dem zehnten Tag nach der Geburt der Ausfall der ursprünglich normal anmutenden Behaarung ein. Innerhalb der darauf folgenden Tage verlieren sie ihr Haarkleid völlig. Die Mäuse sind euthymisch und immunkompetent [118]. Bei der athymischen Maus Foxn1Nu/Nu handelt es sich um eine 1966 erstmals von Flanagan et al. beschriebene Mäuserasse, welche aufgrund einer Spontanmutation kein Fellwachstum aufwies [119]. Zwei Jahre später berichteten Pantelouris et al. über das Fehlen des Thymus in dieser Spezies [120]. Dies führt zu einem Mangel an T-Zellen und somit zu einer stark dezimierten, nur aus BZellen bestehenden Population von Lymphozyten in den Tieren. 2.1.3 DNA, Marker und Enzyme Dispase DNA Marker (100 bp) DNase I Proteinase K Rat Tail Collagen, Typ I Invitrogen, Heidelberg (Deutschland) Invitrogen, Heidelberg (Deutschland) Qiagen, Hilden (Deutschland) Qiagen, Hilden (Deutschland) BD Biosciences, Heidelberg (Deutschland) Invitrogen, Heidelberg (Deutschland) Qiagen, Hilden (Deutschland) PAA Laboratories, Coelbe (Deutschland) SuperscriptTM II Reverse Transkriptase Taq-Polymerase Trypsin-EDTA 30 Material und Methoden 2.1.4 Chemikalien, Lösungsmittel und Inhibitoren Adenin Calbiochem, Bad Soden (Deutschland) Roth, Karlsruhe (Deutschland) PAA Laboratories, Coelbe (Deutschland) Bode Chemie, Hamburg (Deutschland) Sigma, Steinheim (Deutschland) Sigma, Steinheim (Deutschland) Sigma, Steinheim (Deutschland) Schärfe System, Reutlingen (Deutschland) Sigma, Steinheim (Deutschland) Sigma, Steinheim (Deutschland) Invitrogen, Heidelberg (Deutschland) PAA Laboratories, Coelbe (Deutschland) PAA Laboratories, Coelbe (Deutschland) Merck, Darmstadt (Deutschland) AppliChem, Darmstadt (Deutschland) Merck, Darmstadt (Deutschland) Perbio, Bonn (Deutschland) Roche, Mannheim (Deutschland) Biozym, Oldendorf (Deutschland) AppliChem, Darmstadt (Deutschland) PAA Laboratories, Coelbe (Deutschland) Sigma, Steinheim (Deutschland) Agarose NEEO Ultra-Qualität Amphotericin B Fungizone Bacillol AF Bay 11-7085 Bromphenolblau Caesium Chlorid CASY®ton Diethylpyrocarbonat (DEPC) Dimethylsulfoxid (DMSO) Deoxyribonukleosid-triphosphat (dNTP) Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Ethanol Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Formaldehyd Fötales Kälberserum (FCS) FuGENE® HD Transfection Reagent GelStar® Nucleic Acid Stain Glycerol Ham F-12 humaner epidermaler Wachstumsfaktor (hEGF) Hydrocortison Insulin Isoproterenol Isofluran (Forene) Kaliumchlorid Kaliumdihydrogenphosphat Lachgas (N2O) Sigma, Steinheim (Deutschland) Sigma, Steinheim (Deutschland) Sigma, Steinheim (Deutschland) Abbott, Ludwigshafen (Deutschland) Merck, Darmstadt (Deutschland) Merck, Darmstadt (Deutschland) Air Products, Hattingen (Deutschland) PAA Laboratories, Coelbe (Deutschland) Sigma, Steinheim (Deutschland) AppliChem, Darmstadt (Deutschland) Merck, Darmstadt (Deutschland) AppliChem, Darmstadt (Deutschland) TIB MolBiol, Berlin (Deutschland) Roche, Mannheim (Deutschland) Sigma, Steinheim (Deutschland) L-Glutamin LY 294002 Natriumchlorid Natriumdihydrogenphosphat Natriumhydrogenphosphat Oligonukleotidprimer PCR-Wasser PD 98,059 31 Material und Methoden Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) PAA Laboratories, Coelbe (Deutschland) Vector Labs, Burlingame (USA) Bergmannsheil, Bochum (Deutschland) Qiagen, Hilden (Deutschland) Air Products, Hattingen (Deutschland) Sigma, Steinheim (Deutschland) Eurofins MWG Operon, Ebersberg (Deutschland) Sigma, Steinheim (Deutschland) Air Products, Hattingen (Deutschland) Calbiochem, Bad Soden (Deutschland) Merck, Darmstadt (Deutschland) Sigma, Steinheim (Deutschland) Merck, Darmstadt (Deutschland) Roche, Mannheim (Deutschland) Pferdeserum Reinstwasser RNAlater RNA Stabilization Reagent Sauerstoff (O2) SB 203580 siRNA SP 600125 Stickstoff, flüssig (N2) T3 (Trijodthyronin) Tris-HCl Tyrphostin AG490 Wasserstoffperoxid (H2O2) X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent Xylol β-Mercaptoethanol Sigma, Steinheim (Deutschland) Sigma, Steinheim (Deutschland) 2.1.5 Fertige Versuchsansätze HotStar Taq-DNA Polymerase Kit LightCycler® 480 SYBR Green I Master Proteome Profiler Mouse Cytokine Array Kit, Panel A QIAamp DNA Mini Kit RNase Free DNase Set RNeasy Mini Kit SuperScript™ First-Strand Synthesis System for RT-PCR 32 Qiagen, Hilden (Deutschland) Roche, Mannheim (Deutschland) R&D Systems, Wiesbaden (Deutschland) Qiagen, Hilden (Deutschland) Qiagen, Hilden (Deutschland) Qiagen, Hilden (Deutschland) Invitrogen, Heidelberg (Deutschland) Material und Methoden 2.1.6 Geräte und weitere Materialien Analysewaage BL600 Aura PCR-Werkbank Sartorius, Göttingen (Deutschland) Nalge Nunc, Wiesbaden (Deutschland) Eppendorf, Hamburg (Deutschland) Bergmannsheil, Bochum (Deutschland) Schärfe System, Reutlingen (Deutschland) Schärfe System, Reutlingen (Deutschland) BD Biosciences, Heidelberg (Deutschland) Eppendorf, Hamburg (Deutschland) Eppendorf, Hamburg (Deutschland) Omnilab, Bremen (Deutschland) Braun, Melsungen (Deutschland) Servoprax, Wesel (Deutschland) TPP, Trasadingen (Schweiz) Braun, Melsungen (Deutschland) Braun, Melsungen (Deutschland) Ziegra, Isemhagen (Deutschland) Consort, Turnhout (Belgien) Hartmann, Heidenheim (Deutschland) Sartorius, Göttingen (Deutschland) TPP, Trasadingen (Schweiz) Bio-Rad, München (Deutschland) Neolab, Heidelberg (Deutschland) Sempermed, Neuwied (Deutschland) Sempermed, Neuwied (Deutschland) Kinematica, Littau-Luzern (Schweiz) Braun, Melsungen (Deutschland) Biostep, Jahnsdorf (Deutschland) Hartmann, Heidenheim (Deutschland) Eppendorf, Hamburg (Deutschland) Roche, Mannheim (Deutschland) BIOplastics, Landgraaf (Niederlande) Eppendorf, Hamburg (Deutschland) Zeiss, Jena (Deutschland) Roth, Karlsruhe (Deutschland) Sarstedt, Nümbrecht (Deutschland) Neolab, Heidelberg (Deutschland) Biozym, Oldendorf (Deutschland) Eppendorf, Hamburg (Deutschland) Millipore, Schwalbach (Deutschland) Roth, Karlsruhe (Deutschland) Biophotometer BO-Drum® Hautkammern CASY® Cell Counter CASY®cups Cell Strainer (100 μm) Combitips plus 10ml Combitips plus 5ml Cryotubes Nalgene Typ 5000 Einmalkanülen Sterican, Gr. 1 Einmalpinzetten Einmalpipetten (5 ml, 10 ml, 25 ml) Einmalskalpelle Nr. 23 Einmalspritzen (5 ml, 20 ml) Eismaschine Elektrophorese Power Supply E861 ES-Kompressen, steril, 10x10cm Feinwaage RC210D Filtrationssystem PES, 0,2 µm (500 ml) Gelelektrophoresekammer Glas-Pasteurpipetten Handschuhe Sempermed Gr. 7 steril Handschuhe Sempermed Gr. 8 steril Homogenisator Polytron PT3100 Insulinspritzen U40 Kodak Imaging Station 4000MM Kompressen unsteril, 10x10cm Kühlzentrifuge 5415R LightCycler® 480 LightCycler® 96-well PCR-Plate MasterCycler® Gradient Mikroskop (Axioskop 2 plus) Parafilm M Petrischalen Pipetten Pipettenspitzen mit Filter Pipettierhilfe Easypet Reinstwasseranlage MilliQ-Plus Rotilabo Spritzenaufsatzfilter, 0.22µm 33 Material und Methoden Safe Seal Tips Premium Safe-Lock Eppendorf Tubes PCR Clean Slide-A-Lyzer Cassettes 3-12ml Biozym, Oldendorf (Deutschland) Eppendorf, Hamburg (Deutschland) Thermo Fisher, Schwerte (Deutschland) Sarstedt, Nümbrecht (Deutschland) Sarstedt, Nümbrecht (Deutschland) Braun, Melsungen (Deutschland) Heraeus, Tuttlingen (Deutschland) TPP, Trasadingen (Schweiz) Heraeus, Langenselbold (Deutschland) Eppendorf, Hamburg (Deutschland) Roth, Karlsruhe (Deutschland) Heraeus, Tuttlingen (Deutschland) GFL, Burgwedel (Deutschland) TPP, Trasadingen (Schweiz) TPP, Trasadingen (Schweiz) TPP, Trasadingen (Schweiz) TPP, Trasadingen (Schweiz) TPP, Trasadingen (Schweiz) TPP, Trasadingen (Schweiz) TPP, Trasadingen (Schweiz) S-Monovetten EDTA 2,7ml S-Monovetten Serum 7,5ml Sterican Kanülen Sterilbank HS12 TPP-Filtrationssystem, 500ml Ultrazentrifuge (Suprafuge 22) UV-Küvetten Uvette Vortex-Genie® 2 Wärmeschrank Kelvitron® Wasserbad Zellkulturflaschen mit Filter Zellkulturschalen Zellkulturtestplatten, 12-well Zellkulturtestplatten, 6-well Zellschaber Zentrifugenröhrchen, flach Zentrifugenröhrchen, konisch 34 Material und Methoden 2.1.7 Zellkulturmedien Standard-Zellkulturmedium (pro 1000ml): Komplettmedium (10% FCS): 890 ml DMEM 100 ml FCS 10 ml Pen/Strep (10 %)* (1 U/ml)* Serumreduziertes Standardmedium (2% FCS): 970 ml DMEM 20 ml FCS (2 %)* 10 ml Pen/Strep (1 U/ml)* Keratinozyten Primärkulturmedium (pro 1000 ml) Komplettmedium (10% FCS): 536 ml DMEM 300 ml Ham´s F-12 100 ml FCS 20 ml L-Glutamin 10 ml Pen/Strep 10 ml Adenin 10 ml Isoproterenol 10 ml Insulin 2 ml Hydrocortison 1 ml hEGF 1 ml T3 (10 %)* (4 mM)* (1 U/ml)* (5 µg/ml)* (1 µM)* (24,3 µg/ml)* (0,8 µg/ml)* (20 ng/ml)* (1,346 ng/ml)* Serumreduziertes Keratinozytenmedium (2% FCS): 616 ml DMEM 300 ml Ham´s F-12 20 ml FCS (2 %)* 20 ml L-Glutamin (4 mM)* 10 ml Pen/Strep (1 U/ml)* 10 ml Adenin (5 µg/ml)* 10 ml Isoproterenol (1 µM)* 10 ml Insulin (24,3 µg/ml)* 2 ml Hydrocortison (0,8 µg/ml)* 1 ml hEGF (20 ng/ml)* 1 ml T3 (1,346 ng/ml)* ® Bo-Drum Medium (pro 1000 ml) 880 ml DMEM 100 ml FCS 10 ml Pen/Strep 10 ml Amphotericin B (10 %)* (1 U/ml)*,1 (2,5 µg/ml)* *Endkonzentration 1 Bei der Analyse von Wundinfektionen wurde dieser Bestandteil nicht hinzugefügt 35 Material und Methoden 2.1.8 Oligonukleotide Tabelle 2.2a: Charakteristik der Oligonukleotide. (Abkürzungen: f = forward primer, r = rever-se primer, AT = annealing temperature; m = murin, h = human) Zielgen 18S ribosomale RNA (human) h18S 18S ribosomale RNA (murin) m18S Abscent In Melanoma 2 (human) hAIM2 Caspase-1 (human) hCASP-1 DNA-Dependent Activator of IFNRegulatory Factors (human) hDAI Grün Fluoreszierendes Protein GFP Interferon Regulatory Factor 3 (human) hIRF-3 Interferon Regulatory Faktor 7 (human) hIRF-7 Interferon α (human) hIFN-α1 Interferon α (murin) mIFN-α Interferon β (human) hIFN-β Interferon β (murin) mIFN-β Interferon gamma-inducible Protein 16 (human) hIF16 Interferon-beta Promoter Stimulator 1 (human) hIPS-1 Interleukin 1α (human) hIL-1α Interleukin 1α (murin) mIL-1α Interleukin 1β (human) hIL-1β Interleukin 6 (human) hIL-6 Interleukin 6 (murin) mIL-6 Interleukin 8 (human) hIL-8 Melanoma Differentiation-Associated Gene 5 (human) hMda-5 Myeloid Cell Nuclear Differentiation Antigen (human) hMNDA Myeloid Differentiation Primary Response Gene 88 (human) hMyD88 f: r: f: r: f: r: f: r: f: r: f: r: f: r: f: r: f: r: f: r: f: r: f: r: f: r: f: r: f: r: f: r: f: r: f: r: f: r: f: r: f: r: f: r: f: r: 36 Sequenz [5´ - 3´] AT [°C] gaaactgcgaatggctcattaaa cacagttatccaagtaggagagg cgcggttctattttgttggt agtcggcatcgtttatggtc gctgcaccaaaagtctctcc tcaaacgtgaagggcttctt gaaggcatttgtgggaagaa ggtgtggaagagcagaaagc aaagcatggacgatttaccg atgatgttcccgtgtccaat acgtaaacggccacaagttc aagtcgtgctgcttcatgtg gaggtgacagccttctaccg tgcctcacgtagctcatcac taccatctacctgggcttcg gctccataaggaagcactcg acccacagcctggataacag ctctcctcctgcatcacaca tcaatgacctgcaagctgtc agcaattggcagaggaagac actgcctcaaggacaggatg agccaggaggttctcaacaa ccctatggagatgacggaga ctgtctgctggtggagttca gctgaccgaaacatggagat cagatctcaactccccggta ataagtccgagggcaccttt gtgactaccagcacccctgt aatgacgccctcaatcaaag tgggtatctcaggcatctcc gcaacgggaagattctgaag tgacaaacttctgcctgacg ttcgacacatgggataacga tctttcaacacgcaggacag caatgaggagacttgcctgg gcacagctctggcttgttcc ccggagaggagacttcacag tccacgatttcccagagaac tctgcagctctgtgtgaagg aatttctgtgttggcgcagt ggggcatggagaataactca tgcccatgttgctgttatgt caagcaagcatctggaacaa ttttcttggccttgatgacc tgcagagcaaggaatgtgac aggatgctggggaactcttt 60 60 60 60 60 60 60 60 60 62 60 60 60 60 60 62 60 63 60 63 60 60 60 Material und Methoden Tabelle 2.2b: Charakteristik der Oligonukleotide. (Abkürzungen: f = forward primer, r = reverse primer, AT = annealing temperature; m = murin, h = human) Zielgen NACHT, LRR and PYD DomainsContaining Protein 3 (human) hNALP3 Pyrin and HIN Domain Family Member 1 (human) hIFIX Retinoic Acid Inducible Gene 1 (human) hRIG-I Stimulator of Interferon Genes (human) TIR-Domain-containing Adapter-inducing Interferon-β (human) hSTING hTRIF Toll-like Rezeptor 3 (human) hTLR-3 Toll-like Rezeptor 7 (human) hTLR-7 Toll-like Rezeptor 8 (human) hTLR-8 Toll-like Rezeptor 9 (human) hTLR-9 Tumor Nekrose Faktor α (human) hTNFα f: r: f: r: f: r: f: r: f: r: f: r: f: r: f: r: f: r: f: r: 37 Sequenz [5´ - 3´] AT [°C] cttctctgatgaggcccaag gcagcaaactggaaaggaag gtcacgcaactgccagtaaa gcgtagccactgtagcatga gcaacagtgcagaggtgaaa caaaagagcatccagcaaca tcaaggatcgggtttacagc tggcaaacaaagtctgcaag caggagcctgaggagatgag ctgggtagttggtgctggtt agccttcaacgactgatgct tttccagagccgtgctaagt ccacaaccaactgaccactg ccaccagacaaaccacacag gtttcctcgtctcgagttgc tcaaaggggtttccgtgtag cctattcatggacggcaact gagtgacaggtgggtgaggt aacctcctctctgccatcaa ggaagacccctcccagatag 60 60 60 60 60 60 60 60 60 62 Material und Methoden 2.2 Methoden 2.2.1 Adenovirale Transduktion in einem in vivo Ansatz Achtzehn weibliche SKH-1Hrhr- und Foxn-1Nu-Mäuse in einem Alter von sechs Wochen wurden zu Beginn der Versuche eingestallt, täglich visitiert und betreut. Die Tiere hatten freien Zugang zu Wasser und Futter und wurden bei 22°C, 65 % Luftfeuchtigkeit und einem kontinuierlichen zwölf Stunden Tag/Nacht Rhythmus gehalten. Alle Tierversuche wurden gemäß den Tierschutzrichtlinien der Bundesrepublik Deutschland sowie der Genehmigung von Versuchsvorhaben gemäß §8 Abs.1 Tierschutzgesetz (Aktenzeichen: 50.8735.1 Nr. 112/6; Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen) durchgeführt. Vor Versuchsbeginn wurden die Tiere für zwei Wochen in Gruppen zu je fünf Mäusen gehalten. Sie wurden täglich auf ihr Sozialverhalten sowie auf ihre Gesundheit hin untersucht. Zu Beginn der Versuche wurden die Tiere in sechs Gruppen mit jeweils n = 3 Mäusen eingeteilt und durch Inhalationsnarkose sediert. Auf dem Rücken eines jeden Tieres wurden jeweils vier Areale mit einer Fläche von einem Quadratzentimeter markiert. An Tag 0 (Abbildung 2.1) wurden jedem Tier 1x1010 infektiöse Einheiten (IU) Ad-GFP (in 50 μl PBS) in jeweils zwei Areale intrakutan injiziert. In die beiden verbliebenen Areale wurden 50 μl PBS injiziert. An Tag 14 erfolgte eine Reapplikation derselben Virusdosierung in alle vier Areale (Abbildung 2.2). Abbildung 2.1: Zeitachse der Versuchsdurchführung. In Zeitabständen von 1, 6, 24, 48, 72 und 120 Stunden nach Reapplikation des Vektors wurden die Tiere eingeschläfert, die transduzierten Areale entnommen und für eine RNA-Isolierung asserviert. Darüber hinaus wurde über den 38 Material und Methoden gesamten Versuchszeitraum die Transgenexpression via Kodak Life-Imaging Station detektiert und quantifiziert [121]. Dafür wurden die Tiere in Zeitabständen von zwei Tagen erneut durch Inhalationsnarkose sediert und auf der Life-Imaging Station positioniert. Es folgte eine Ablichtung der transduzierten Areale bei einer Belichtungszeit von 0,5 Sekunden (Durchlichtaufnahmen) und zehn Minuten (Fluoreszenzaufnahmen). Die Auswertung der generierten Daten wurde mit Hilfe der Kodak Imaging Software durchgeführt. Abbildung 2.2: Transiente kutane adenovirale Transduktion. Applikationsareale nach Transduktion einer haarlosen Maus. AdV+AdV: Doppelte Injektion von 1010 infektiösen Einheiten (IU) eines adenoviralen Vektors (Tag 0 und 14); PBS+AdV: Applikation der Trägerkontrolle (PBS) an Tag 0 gefolgt von Adenovirusinjektion an Tag 14 (A). Makroaufnahme einer Injektionsstelle bei intrakutaner Injektion (B). 2.2.2 Isolierung und Kultivierung von primären humanen Keratinozyten Zur Gewinnung der HKC-Zellen wurde das Hautgewebe weitestgehend von Fettanteilen befreit und mit PBS gereinigt. Das gereinigte Gewebe wurde in 0,25 bis 0,5 cm2 große Vierecke zerteilt und - mit der Epidermis nach oben orientiert - in einer sterilen Petrischale mit 0,2 % (4,7 U/ml) Dispase in PBS über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach der Separation der Epidermis von der Dermis (Abbildung 2.3) 39 Material und Methoden wurde die Epidermis mit einer sterilen Schere in 10 ml Trypsin (0,05 %)/EDTA (0,02 %)-Lösung in PBS zerkleinert. Es folgte eine Inkubation von 20 Minuten bei 37 °C im Schüttelwasserbad. Daraufhin wurde die Trypsinaktivität durch die Zugabe von 10 ml FCS inhibiert. Nach Filtration der Zellsuspension folgte eine Zentrifugation bei 400xg für fünf Minuten, gefolgt von einer Resuspension der Zellen in 5 ml Keratinozytenmedium. Zur Zellzahlbestimmung im CASY®-Zellzähler wurden 10 µl der Suspension in 10 ml CASY®ton pipettiert. Vor Aussaat der Zellen wurden Zellkulturflaschen entsprechender Größe nach den Angaben des Herstellers mit Kollagen I (50 µg/ml Stock-Lösung in Essigsäure) beschichtet. Die Zellen wurden in einer Dichte von 50.000 bis 100.000 Zellen/cm2 in HKC-Medium ausgesät. Es folgte eine Inkubation bei 37°C und 5 % CO2 bis zu einer Dichte von 90 % Konfluenz. Zum Passagieren wurde das Kulturmedium aus den Zellkulturflaschen entfernt und die Zellen wurden mit PBS gewaschen. Zum Lösen der Zellen vom Flaschenboden wurden diese mit 10 ml Trypsin/EDTA-Lösung für 15 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die Trypsinaktivität wurde durch die Zugabe von 10 ml FCS inhibiert. Daraufhin wurden die Zellen wurden bei 400xg für fünf Minuten bei RT abzentrifugiert und in 5 ml HKC-Medium resuspendiert. Nach Bestimmung der Anzahl wurden die Keratinozyten in der ursprünglichen Dichte von 50.000 bis 100.000 Zellen/cm2 in Zellkulturflaschen entsprechender Größe in HKC-Medium eingesät. Abbildung 2.3: Isolierung und Kultivierung primärer humaner Keratinozyten. Trennung von Epidermis und Dermis (A); isolierte humane primäre Keratinozyten in Zellkultur (B). 40 Material und Methoden 2.2.3 Kultivierung der HaCaT-, HER911- und HEK293-Zelllinien Die in flüssigem Stickstoff eingefrorenen Zellen wurden auf Eis aufgetaut, vorsichtig resuspendiert und tropfenweise 5 ml kaltes Standard-Zellkulturmedium hinzugegeben. Nach Zentrifugation von fünf Minuten bei 400xg und 4 °C wurde das Zellpellet in 5 ml Standard-Zellkulturmedium resuspendiert und die Zellanzahl bestimmt. Die Zellen wurden mit einer Dichte von 15.000 Zellen/cm2 in entsprechenden Zellkulturflaschen in Standard-Zellkulturmedium ausgesät und bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Das Passagieren der Zellen wurde wie in Kapitel 2.2.1 beschrieben durchgeführt. 2.2.4 Präparation der adenoviralen Vektoren Das replikationsdefiziente (E1-Deletion), adenovirale Vektorkonstrukt Ad5CMV-GFP wurden freundlicherweise vom Gene Vector Core der Division of Medical Genetics, Department of Medicine der University of Pennsylvania zur Verfügung gestellt. Für jede Virus-Charge wurde eine Zellkultur von 40 Zellkulturflaschen (150 cm2) humaner embryonaler Retinoblasten (HER-911) in Standard-Zellkulturmedium kultiviert. Bei einer Konfluenz von 85 bis 90 % wurde das Medium gegen serumreduziertes Medium ausgetauscht. Das Virus wurde dem Medium mit einer MOI (multiplicity of infection) von 5 zugesetzt. Nach einer weiteren Inkubationszeit von 44 Stunden wurden die Zellen mit Hilfe eines Zellschabers vom Boden der Zellkulturflasche gelöst und in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen überführt. Es folgte eine Sedimentierung der Zellen bei 400xg für fünf Minuten. Das Pellet wurde in 20 mM Tris-HCl pH 8,0 und 2 mM MgCl2 resuspendiert. Durch mehrmaliges Einfrieren in flüssigem Stickstoff erfolgte eine Zerstörung der Zellmembranen und eine Freisetzung des Virus in den Puffer. Durch Zentrifugation bei 3000xg für 10 Minuten wurden Zellreste sedimentiert und verworfen. Zur Aufreinigung des Virus wurde die Lösung durch Zugabe von Caesiumchlorid (CsCl) auf ein spezifisches Gewicht von 1,1 g/ml eingestellt und auf einen Dichtegradienten aus 1,4 g/ml und 1,3 g/ml CsCl-Lösungen pipettiert. Der Gradient wurde anschließend bei 80000xg für vier Stunden bei 20°C im Ausschwingrotor einer Ultrazentrifuge zentrifugiert. Nach der Zentrifugation erschien das Virus in 41 Material und Methoden Form einer trüben Bande direkt an der Grenze zwischen der 1,3 und der 1,4 g/ml Lösung. Die Bande wurde vorsichtig mit Hilfe einer Glaskapillare und Peristaltikpumpe abgezogen. Anschließend wurde eine Dialyse für 24h bei 4°C gegen 20 mM Tris-HCl pH 8,0 und 2 mM MgCl2 durchgeführt, um das verbliebene CsCl aus der Virussuspension zu entfernen. Nach Zugabe von 10 % Glycerol wurde die Lösung aliquotiert und bei -80°C gelagert. Zur Bestimmung des Virustiters wurden HEK-293 in einer Dichte von 95000 Zellen/cm2 in 12-well Zellkulturschalen in 0,9 ml Standard-Zellkulturmedium ausgesät und nach 24 Stunden mit 100 μl unterschiedlicher Verdünnungsstufen (10-2 bis 10-7) infiziert. Nach weiteren 24 Stunden wurden die GFP-positiven Zellen unter dem Mikroskop ausgezählt und die Gesamtvirusmenge in der unverdünnten Lösung berechnet. 2.2.5 Extraktion adenoviraler DNA Die für die Stimulationsversuche verwendete adenovirale DNA wurde mit Hilfe des QIAamp DNA Mini Kit aus dem adenoviralen Konstrukt Ad-GFP nach den Angaben des Herstellers („Blood and Body Fluid Spin Protocol“) isoliert. Es wurde zweimal mit 200 μl H2O eluiert, wobei das erste Eluat auf die Säule zurückpipettiert und erneut eluiert wurde. Die Messung der DNA-Konzentration des Eluats erfolgte im Eppendorf Biophotometer bei einer Wellenlänge von 260 nm. Die Reinheit der DNA wurde über das Verhältnis der OD260nm/OD280nm kontrolliert. Die DNA wurde bei -20 °C gelagert. 2.2.6 Transfektion der Zellen Für die Stimulationsversuche wurden die Zellen (HaCaT-Zellen oder primäre Keratinozyten) in einer Zelldichte von 80.000 Zellen/cm2 (HaCaT-Zellen) bzw. 95.000 Zellen/cm2 (primäre Keratinozyten) in 12-well Zellkulturplatten eingesät und bei 37 °C und 5 % CO2-Gehalt im Wärmeschrank inkubiert. Nach 24 Stunden erfolgte ein Mediumwechsel (0,5 ml) gegen serumreduziertes Zellkulturmedium. Die Transfektion von Keratinozyten mit DNA erfolgte mit Hilfe des Transfektionsreagenz FuGENE® HD nach Angaben des Herstellers. Der Transfektionskomplex wurde in PCR-Wasser im Verhältnis FuGENE® HD zu DNA von 5:2 hergestellt und auf die Zellen gegeben. Die Stimulation der Zellen erfolgte bei 42 Material und Methoden 37 °C und 5 % CO2 im Wärmeschrank. Pro Gruppe wurde, falls nicht abweichend gekennzeichnet, eine Anzahl von n = 3 wells transfiziert. Für die Transfektion von Zellen mit siRNA wurden Keratinozyten in einer Zelldichte von 15000 Zellen/cm2 (HaCaT) bzw. 35000 Zellen/cm2 (HKC) in 12-well Zellkulturplatten mit Standardmedium eingesät. Nach 24 Stunden erfolgte ein Mediumwechsel gegen 400 μl serumreduziertes Medium. Der Transfektionsansatz wurde mit X-tremeGENE® siRNA Transfektionsreagenz nach Herstellerangaben (Verhältnis X-tremeGENE®: siRNA = 1:0,2) erzeugt. Vor der DNA-Transfektion wurden die Zellen weitere 48 Stunden unter den oben genanten Bedingungen kultiviert. Die entsprechenden siRNA-Sequenzen sind in Tabelle 2.3 dargestellt. Tabelle 2.3: Charakteristika der siRNAs. Gen AIM2 NALP3 mda5 DAI Kontrolle siRNA - Sequenz 5´ 5´ 5´ 5´ 5´ - GCACCAUAAAGGUUAUUAA GCUUUGUCCUCGGUACUCA GGAAUAAUCUUUACAAAAA CAAAAGAUGUGAACCGAGA AGGUAGUGUAAUCGCCUUG - 3´ 3´ 3´ 3´ 3´ Für die Bestimmung der Transfektionseffizienz wurden die GFP-positiven Zellen nach 48 Stunden unter dem Mikroskop bei 200-facher Vergrößerung ausgezählt (jeweils 5 Areale). Für entsprechende Bildaufnahmen der Zellen wurde für Durchlichtaufnahmen eine Belichtungszeit von 0,15 Sekunden gewählt. Bei Fluoreszenzaufnahmen betrug die Belichtungszeit 10 Sekunden für transduzierte Zellen und 30 Sekunden für transfizierte Zellen bzw. Kontrollen. 2.2.7 Transduktion von Hautgewebe in einem ex vivo Modell Für die Untersuchung des Einflusses der Transduktion durch Adenoviren (Ad5-GFP) auf die angeborene Immunabwehr in einem ex vivo Versuch wurde aus dem Operationssaal der Plastischen Chirurgie asserviertes Hautgewebe weitestgehend von Fettanteilen befreit und in PBS gewaschen. Daraufhin wurde die Haut in Dreiecke mit einer Seitenlänge von ca. 3 cm zerteilt und in spezielle Kammern (Bo-Drum® [122], vgl. Abbildung 2.4) für ex vivo Versuche mit Hautgewebe eingespannt (Abbildung 2.5). Die Hautkammern wurden in 6-well Zellkulturplatten platziert und in 5,5 ml Bo-Drum®-Medium bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. 43 Material und Methoden Abbildung 2.4: Aufbau der BO-Drum®. Diese Abbildung wurde bereits in Steinstraesser et al. [122] veröffentlicht. Bei der Transduktion der Hautkammern wurde die jeweilige Dosis Adenoviren (in 50 μl PBS) mit Hilfe einer Insulinspritze in den sichtbaren Teil der in der BoDrum® fixierten Haut injiziert. Nach einer versuchsspezifischen Inkubationszeit im CO2-Inkubator wurde das Gewebe aus den Kammern entnommen und mit Hilfe des RNeasy Mini Kit nach Herstellerangaben („Lipid Tissue Protocol“) die GesamtRNA isoliert. Abbildung 2.5: Platzierung und Entnahme humaner Vollhaut in einer Bo-Drum®. 44 Material und Methoden 2.2.8 RNA-Isolierung Die Isolierung der Gesamt-RNA aus den Zellen erfolgte mit Hilfe des RNeasy Mini Kit, indem das Transfektionsmedium aus den Zellkulturplatten entfernt und die Zellen durch Zugabe von 600 μl Puffer RLT (+ 0,1 % β-Mercaptoethanol) für fünf Minuten lysiert wurden. Das Lysat wurde in 1,5 ml Eppendorfreaktionsgefäße überführt. Die weitere Aufarbeitung der Zellen erfolgte nach Herstellerangaben („RNeasy Mini Protokoll für die Isolierung von GesamtRNA aus tierischen Zellen“). Die RNA wurde in RNase-freiem Wasser doppelt eluiert und bei -80 °C gelagert. Der DNase-Verdau wurde während der RNA-Isolierung nach Herstellerangaben durchgeführt. Für die photometrische Bestimmung der Konzentration des Eluats wurde je 1 µl der Proben mit 49 µl RNase-freiem Diethylpyrocarbonat (DEPC)-Wasser versetzt. Die Messung der RNA-Konzentration erfolgte im Biophotometer bei einer Wellenlänge von 260 nm. Die Reinheit der RNA wurde über das Verhältnis der OD260/OD280 geprüft (≥1,8). 2.2.9 cDNA-Synthese Die Synthese der cDNA aus der isolierten Gesamt-RNA wurde mit Hilfe des SuperScript™ First-Strand Synthesis Systems für RT-PCR nach Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Als Primer für die Reverse-Transkriptase-Reaktion wurden „Random Hexamers“ eingesetzt, da es sich bei dem Referenzgen in der später durchgeführten quantitativen Real-time-PCR um ribosomale RNA (18S rRNA) und nicht um mRNA handelte. Pro Syntheseansatz wurde 1 μg RNA eingesetzt. Die synthetisierte cDNA wurde bei -20 °C gelagert. 2.2.10 Amplifikation von cDNA-Fragmenten In der semiquantitativen PCR wurde ein Gesamtvolumen von 100 μl eingesetzt, wobei die bei der Zusammenstellung der Ansätze entstehende Volumendifferenz mit PCR-Wasser ausgeglichen wurde. Pro Ansatz wurden 10 μl 10x Puffer des HotStar Taq-DNA Polymerase Kits zugefügt. Für die Synthese neuer DNA-Stränge wurden 2 μl dNTP-Mix (10 mM, dATP / dTTP / dGTP / dCTP) und 0,5 µl HotStar Taq-DNA-Polymerase (2,5 Units) verwendet. Der für die Polymerase essentielle Kofaktor MgCl2 war in dem 10x PCR-Puffer bereits enthalten 45 Material und Methoden und hatte eine Endkonzentration von 1,5 mM. Als Startermoleküle für die PCRReaktion wurden dem Ansatz die in Tabelle 2.2 aufgeführten Oligonukleotide in einer Endkonzentration von 1 μM zugegeben. Als Matrize für die PCR wurden pro Ansatz 2 μl cDNA verwendet. Die PCR wurde mit Hilfe des MasterCycler® Gradient nach dem in Tabelle 2.4 dargestelltem Temperaturprofil durchgeführt. Die entsprechenden Anlagerungstemperaturen der verschiedenen Starteroligonukleotide sind in Tabelle 2.2 aufgeführt. Tabelle 2.4: Temperaturprofil der semiquantitativen Polymerasekettenreaktion. PCR-Schritt Temperatur [°C] Zeit [s] Anzahl d. Zyklen Aktivierung d. Polymerase Denaturierung Anlagerung Elongation finale Elongation 95 94 variabel 72 72 900 60 60 30 600 1 35 1 Zur Analyse der PCR-Produkte wurden diese per Gelelektrophorese auf einem Agarosegel (1 %) aufgetrennt. Zur Herstellung des Gels wurden 0,5 g Agarose (Standard) in 50 ml 1x TAE-Puffer (40 mM Tris, 20 mM Natriumacetat, 1 mM EDTA; pH 8,3) in der Mikrowelle aufgekocht, mit 5 µl GelStar® (10000x Konzentrat) versetzt und in die Gelkammer gegeben. Aus jedem PCR-Ansatz wurden 10 µl des PCR-Produkts mit 2 µl 6x DNA-Ladungspuffer (0,25 % (w/v) Bromphenolblau, 0,25 % (w/v) Xylencyanol, 40 % (w/v) Saccharose) aufgetragen. Von dem 100 bp DNA Marker wurden 0,1 µl pro Milliliter Taschenbreite aufgetragen. Nach gelelektrophoretischer Auftrennung für 60 min bei 2,17 V/cm2 wurde das Gel zur Auswertung auf dem UV-Belichtungstisch fotografiert. In der quantitativen Real-time PCR (qRT-PCR) wurde ein Gesamtvolumen von 20 μl eingesetzt, wobei die bei der Zusammenstellung der Ansätze entstehende Volumendifferenz mit PCR-Wasser des LightCycler® 480 SYBR Green I Master Kits ausgeglichen wurde. Jedem Ansatz wurden 10 μl der 2x Master Mix Lösung und 6 μl PCR-Wasser zugegeben. Als Startermoleküle für die PCR-Reaktion wurden dem Ansatz die in Tabelle 2.2 aufgeführten Oligonukleotide in einer Endkonzentration von 0,5 μM zugefügt. Als Matrize für die PCR wurden pro Ansatz 2 μl cDNA verwendet. Die PCR wurde mit Hilfe des LightCycler® 480 nach dem in Tabelle 2.5 dargestellten Temperaturprofil durchgeführt. 46 Material und Methoden Tabelle 2.5: Temperaturprofil der quantitativen Polymerasekettenreaktion. PCR-Schritt Temperatur [°C] Zeit [s] Anzahl d. Zyklen Aktivierung d. Polymerase Denaturierung Anlagerung Elongation Schmelzkurve 95 95 variabel 72 65 - 95 600 15 10 10 200 1 40 - 60 1 Nach quantitativer Amplifikation wurden die für die einzelnen Amplifikate erhaltenen relativen Messwerte mit einem Referenzgen in Relation gesetzt. Hierfür wurde das konstitutiv exprimierte 18S rRNA kodierende Gen verwendet. Anschließend wurden die erhaltenen Messwerte ins Verhältnis zu der aus denselben cDNA-Matrizen quantifizierten 18S rRNA gesetzt. Dazu wurde pro Bestimmung der Quotient aus der Quantifizierung des jeweiligen Zielgens und der 18S rRNAQuantifizierung gebildet. Aus den Quotienten der drei in den Versuchen jeweils gleich behandelten Proben wurden das arithmetische Mittel und der Standardfehler des Durchschnitts (SEM) berechnet. Die Darstellung der Werte erfolgte in Bezug auf eine unbehandelte Kontrolle (x-fache Expression). 2.2.11 Messung eines Expressionsverlauf inflammatorischer Faktoren Nach Einstellung der optimalen Transfektions- und PCR-Bedingungen wurden zur Untersuchung der Rezeptorexpression sowie der Expression inflammatorischer Zytokine in Zellen der HaCaT-Zelllinie sowie primären humanen Keratinozyten (HKC) in einem dreifach-Ansatz mit adenoviraler DNA in einer Konzentration von 1 und 5 μg DNA/ml Medium über einen Zeitraum von 3, 6, 9, 12, 15 oder 24 Stunden stimuliert. Nach Ablauf der Stimulationszeit wurden die Zellen lysiert und die Gesamt-RNA extrahiert. Aus den Eluaten wurden cDNAProben synthetisiert und im LightCycler® 480 die Expression der in Tabelle 2.2 dargestellten Gene gemessen. Die Ergebnisse wurden gegen eine unbehandelte Negativkontrolle des gleichen Zeitpunktes normalisiert. 47 Material und Methoden 2.2.12 Inhibierung von Signaltransduktionsmolekülen Zur Inhibierung von Proteinen verschiedener Signaltransduktionskaskaden von HaCaT- und HKC-Zellen wurden jeweils 10 μl der in Tabelle 2.6 aufgelisteten Inhibitoren (1 mM) auf die Zellen gegeben. Die Endkonzentration der Inhibitoren im Medium betrug 10 μM. Tabelle 2.6: Zielproteine der Inhibitoren. Bezeichnung Zielprotein Bay11-7085 Nukleärer Faktor κB (NFkB) PD 98,059 Extrazellulär regulierte Kinase 2 (Erk2); Mitogen-aktivierte Protein Kinase Kinase (MAPKK) SB203580 p38 Mitogen-aktivierte Protein Kinase (p38 MAPK) Tyrphostin AG 490 Januskinase / Signal Transduktor und Aktivator der Transkription (JAK/STAT) SP600125 c-Jun N-terminale Kinase (JNK) Nach einer Inkubationszeit von einer Stunde bei 37 °C und 5 % CO2 wurden die Zellen mit adenoviraler DNA in einer Konzentration von 5 μg/ml Medium für 15 Stunden (HaCaT-Zellen) bzw. sechs Stunden (HKC-Zellen) stimuliert. Nach Ablauf der Stimulationszeit wurden die Zellen lysiert und die Gesamt-RNA extrahiert. Aus den Eluaten wurden cDNA-Proben synthetisiert und mit Hilfe des LightCycler® 480 die Zytokinexpression untersucht. Die Ergebnisse wurden gegen eine Negativkontrolle des gleichen Zeitpunktes normalisiert. Des Weiteren wurden die normalisierten Werte in einem prozentualen Verhältnis bezogen auf die Positivkontrolle (nicht-inhibierte, mit adenoviraler DNA stimulierte Zellen) dargestellt. 2.2.13 Statistik Für alle statistischen Auswertungen wurden die Unterschiede zwischen den verschiedenen Gruppen und verschiedenen Zelltypen mit dem Student t-Test untersucht. Alle Tests wurden zweiseitig durchgeführt. Irrtumswahrscheinlichkeiten von unter 5 % (p < 0,05) wurden als statistisch signifikant definiert. Für die Auswertung der Daten wurde Microsoft Excel Software verwendet. 48 Ergebnisse 3 Ergebnisse 3.1 Propagation adenoviraler Vektoren Aufgrund der leichten Nachweisbarkeit wurde in dieser Studie mit einem für das Grün-fluoreszierende Protein kodierenden, adenoviralen Vektor vom Serotyp 5 (Ad5-GFP) gearbeitet. Bei der Anzüchtung der Viruschargen nach der in Kapitel 2.2.4 beschriebenen Methode wurden Titer von bis zu 6,44x1011 infektiöse Einheiten (IU) pro Milliliter Trägerlösung erzielt (Tabelle 3.1). Tabelle 3.1: Aufstellung der erreichten Virustiter. Ansatz-Nr. Konzentration [IU/ml] Volumen [ml] Gesamtmenge [IU] 1 6,44x10 11 1,8 1,16x10 12 2 2,76x10 11 2,4 6,62x10 11 3 2,54x10 11 2,1 5,33x10 11 4 1,15x10 11 1,7 1,96x10 11 5 1,29x10 11 2,3 2,97x10 11 6 1,45x10 9 4,2 6,09x10 7 2,66x10 11 2,6 5,92x10 11 8 1,40x10 10 3,4 4,76x10 10 9 6,11x10 11 1,9 1,16x10 12 10 2,74x10 10 3,2 8,77x10 10 9 Für eine Überprüfung der Funktionalität des verwendeten Vektors wurden HEK-293 Zellen in unterschiedlichen Verdünnungsstufen (10-3 bis 10-7) der Ausgangslösung in dreifacher Anzahl transduziert. Eine Negativkontrolle wurde mit einem entsprechenden Volumen der Trägerlösung behandelt. Nach 24 Stunden erfolgte eine Analyse der Zellen via Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Fluoreszenzmikroskopie. Das Transgen fand sich sowohl auf mRNA-Ebene (Abbildung 3.1A) als auch auf Proteinebene (Abbildung 3.1B). 49 Ergebnisse Abbildung 3.1: GFP-Expression in HEK-293-Zellen. Die Expression von GFP wurde auf mRNA-Ebene mittels PCR (A) sowie auf Proteinebene mittels GFP-Fluoreszenz (B) dargestellt. 3.2 Adenoviraler Gentransfer in einem in vivo Modell Bisherige systemische Applikationen adenoviraler Vektoren führten zu starken Reaktionen der angeborenen und adaptiven Immunabwehr im Wirtsorganismus [45, 50, 51, 123, 124]. Im Zuge einer Reaktion des angeborenen Immunsystems werden eine Vielzahl von Zytokinen sezerniert, welche zum einen eine direkte antivirale Wirkung (Typ-I-IFN) zeigen, zum anderen aber auch eine aktivierende Funktion auf die adaptive Immunantwort aufweisen. Während einer adaptiven Immunreaktion werden die infizierten Zellen durch Antigenpräsentation auf der Zelloberfläche durch T-Lymphozyten erkannt und deren Zerstörung eingeleitet. Zu Beginn der vorliegenden Arbeit wurden zunächst die Auswirkungen einer intrakutanen Applikation adenoviraler Vektoren in haarlosen, immunkompetenten Mäusen (SKH-1Hr) analysiert. Eine lokale Applikation der Adenoviren könnte, im Gegensatz zu der systemischen Anwendung, zu einer geringeren Immunreaktion im Wirtsorganismus führen und somit eine effizientere Transgenexpression zur Folge haben. Aufgrund der in der Literatur beschriebenen T-Zell abhängigen Reduktion der Transgenexpression nach adenoviralem Gentransfer [124-126] wurden neben den immunkompetenten Mäusen auch athymische Tiere (Foxn1Nu) in diesen Versuch einbezogen. Anhand der in diesem Versuchsteil generierten Daten sollte zusätzlich die Relevanz T-Zell-unabhängiger Mechanismen zur Eliminierung der Vektoren dargestellt werden. 50 Ergebnisse Für die Durchführung des Versuches wurden insgesamt vier Areale auf dem Rücken der Tiere (jeweils n=18) markiert, wovon zwei Areale mit 1x1010 IU Ad5GFP intradermal transduziert wurden. Zwei weiteren Arealen wurde eine Trägerkontrolle (PBS) injiziert. Nach 14 Tagen erfolgte zur Bestimmung der systemischen Effekte des Gentransfers eine Reapplikation derselben Vektordosis in alle vier Areale [121]. Beim Life-Imaging (Abbildung 3.2) lag nach einer maximalen GFP-Fluoreszenz an Tag 2 (1,25x109 relative Fluoreszenzeinheiten (RLU); p = 0,0031) eine signifikante Reduktion der Werte auf 7,62x104 RLU an Tag 5 (p = 0,0031) vor. Das Transgen wurde über einen Zeitraum von 12 Tagen in rückläufiger Tendenz nachgewiesen. Eine erneute Transduktion mit derselben Vektordosis führte zu einer in Dauer und Intensität deutlich eingeschränkten Nachweisbarkeit des Transgens. Das Expressionsmaximum fand sich in diesem Fall mit einer Intensität von 2,44x104 RLU bereits 24 Stunden nach Reapplikation des Vektors (p = 0,0071). An Tag 5 nach Reapplikation war die GFP-Fluoreszenz von der Hintergrundfluoreszenz nicht mehr zu unterscheiden (AdV+AdV: 3,17x102 RLU; PBS+AdV: 6,58x102 RLU). Ein mit dem der retransduzierten Areale vergleichbaren Verlauf der Transgenfluoreszenz wurde in den zu Beginn des Versuches mit einer Trägerkontrolle behandelten Arealen detektiert. Dies weist auf einen systemischen Effekt der adenoviral induzierten Immunantwort hin. Bei Analyse der Transgenfluoreszenz in athymischen Mäusen lagen ebenfalls ein Maximum an Tag 2 (4,02x108 RLU; p = 0,0277) und ein signifikanter Abfall der Transgenfluoreszenz auf 6,01x103 RLU (p = 0,0278) an Tag 5 vor. In Folge dessen fand sich, im Gegensatz zu den immunkompetenten Mäusen, ein nahezu konstantes GFP Signal über den gesamten Versuchszeitraum (Abbildung 3.2). Die dabei detektierten Werte lagen in einem Bereich zwischen 5,69x103 RLU (Tag 19; p = 3x10-4) und 1,40x104 RLU (Tag 14; p = 0,0014). In den zu Beginn des Versuches mit einer Trägerkontrolle behandelten Arealen trat ebenfalls eine konstante GFP-Fluoreszenz auf. Die Intensität betrug jedoch nur 42,4 % (± 7,6 %) der zweifach tranduzierten Bereiche. Die Intensität des detektierten GFP-Signals lag dabei zwischen 2,84x103 RLU (Tag 19; p = 0,0027) und 7,55x103 RLU (Tag 15; p = 0,0064). 51 Ergebnisse Abbildung 3.2: Zeitlicher Verlauf der GFP-Fluoreszenz in vivo. Qualitative (A + B) und quantitative (C) Darstellung der GFP-Fluoreszenz in immunkompetenten (A) und athymischen (B), haarlosen Mäusen (n = 18) nach Transduktion mit 1x1010 IU Ad5-GFP. An Tag 0 erfolgte eine Erstapplikation des Vektors in zwei separaten Arealen auf dem Rücken der Tiere. Zwei weitere Areale wurden mit der Trägerkontrolle (PBS) behandelt. Nach 14 Tagen erfolgte eine Reapplikation des Vektors in alle vier Areale. Dargestellt sind repräsentative Aufnahmen der mit Hilfe einer Life-Imaging Station generierten GFP-Signale an Tag 2, 5, 7, 9 und 14 nach Erstapplikation sowie 6, 24, 48, 72 oder 120 Stunden nach der Reapplikation des Vektors. (* = p<0,05; # = p<0,005). Dieses Resultat wurde bereits in BMC Immunology veröffentlicht [121]. 52 Ergebnisse Die konstante Transgenfluoreszenz in athymischen Mäusen deutet auf eine T-Lymphozyten-abhängige Reduktion der Transgenfluoreszenz in immunkompetenten Mäusen hin. Die starke Reduktion der Transgenfluoreszenz zwischen Tag 2 und Tag 5, welche sowohl in immunkompetenten als auch in athymischen Tieren vorlag, lässt auf einen weiteren, T-Zell unabhängigen Mechanismus für die Inhibierung der Transgenexpression bzw. -translation schließen. Eine mögliche Erklärung dafür wäre eine starke Induktion der angeborenen Immunantwort, welche mit Hilfe von Zytokinen die Transgenexpression inhibiert. Aus diesem Grund wurden im Folgenden die entnommenen, transduzierten Hautareale auf die Zytokinexpression, insbesondere von Typ-I-IFN, untersucht. Abbildung 3.3: Zeitlicher Verlauf der GFP-mRNA Expression in vivo. Die Analyse erfolgte via qRT-PCR in Gewebeproben aus immunkompetenten Mäusen nach intradermaler Transduktion mit 1010 infektiösen Einheiten eines GFP-kodierenden, adenoviralen Vektors (** = p<0,005)). Die Daten wurden gegen 18S ribosomale RNA normalisiert (Verhältnis: Zielgen / Housekeeping-Gen). Dieses Resultat wurde bereits in BMC Immunology veröffentlicht [121]. 53 Ergebnisse Der Verlauf der GFP-mRNA Expression in immunkompetenten Mäusen in einem Zeitraum bis 120 Stunden nach Transduktion der Tiere ist in Abbildung 3.3 dargestellt. Nach einer signifikanten Induktion der GFP-Expression auf einem Level von 6,0x106 bis 7,3x106 relative Expressionseinheiten erfolgte 48 Stunden nach Injektion der Vektoren eine Reduktion der mRNA Synthese. 72 bis 120 Stunden nach Transduktion betrug die mRNA Konzentration lediglich 4 bis 7,3 relative Expressionseinheiten. Demnach greift der Mechanismus zur Reduktion der Transgenfluoreszenz bereits auf Transkriptionsebene in die Transgenexpression ein. In den transduzierten Hautarealen athymischer Mäuse war die Zytokinexpression deutlich geringer (max. 2 % der Expression immunkompetenter Mäuse). Mit Ausnahme von IL-1α (1,68-fach; p = 0,0006) fand sich in den retransduzierten Arealen keine Induktion der Zytokinexpression (Abbildung 3.4). In den zuvor mit der Trägerkontrolle behandelten Arealen führte eine Applikation des Vektors zu einer Zytokinexpression mit einem Maximum nach sechs Stunden. Zu diesem Zeitpunkt war die Induktion von IFN-α und IFN-β 5,0-fach höher. Darüber hinaus wurden auch erhöhte Syntheseraten von IL-6 (4,74-fach) und TNFα (8,96fach) detektiert. Für IL-1α hingegen trat eine 1,87-fach gesteigerte Expressionsrate nach 72 Stunden auf. Eine deutliche Induktion der Zytokinexpression fand sich 24 Stunden nach Transduktion und Retransduktion von immunkompetenten Mäusen. Zu diesem Zeitpunkt wurde ebenfalls ein Rückgang der Transgenfluoreszenz beobachtet. In athymischen Tieren hingegen lag eine stabile Transgenfluoreszenz zusammen mit einer stark verringerten Zytokinexpression vor. 54 Ergebnisse Abbildung 3.4: Expression inflammatorischer Faktoren in vivo. Die Analyse der Zytokinexpression in immunkompetenten (SKH-1) bzw. athymischen (Foxn1), haarlosen Mäusen (n = 3 pro Zeitpunkt) nach Applikation (schwarz) bzw. Reapplikation (rot) von 1x1010 IU eines GFP-kodierenden, adenoviralen Vektors erfolgte mittels qRT-PCR. Dargestellt ist die Zytokinexpression der behandelten Areale in Bezug auf entsprechend unbehandelte Kontrollareale (* = p<0,05; ** = p<0,005) in einem Zeitverlauf von 3 bis 120 Stunden nach Reapplikation des Vektors. 55 Ergebnisse 3.3 Adenoviraler Gentransfer in epitheliale Zellen 3.3.1 Effizienz adenoviraler Vektoren Um die Rolle von nicht primär immunologisch aktiven Zellen wie Keratinozyten in der Zytokininduktion zu klären, wurden primäre humane Keratinozyten (HKC) und Zellen der HaCaT-Keratinozytenzelllinie in einem in vitro Modell mit dem adenoviralen Vektor (Ad5-GFP) transduziert. In diversen Studien wurde die adenovirale DNA als Hauptursache für die Immuninduktion beschrieben [50, 51]. Aus diesem Grund wurden in diesem Versuch eine zusätzliche Gruppe von Keratinozyten mit einer äquivalenten Dosis adenoviraler DNA transfiziert und die Auswirkungen mit den transduzierten Proben verglichen. Um die Transfektionsfähigkeit des adenoviralen Vektors zu bestimmen, wurden HaCaT-Zellen und primäre humane Keratinozyten (HKC) mit unterschiedlichen Virusmengen von 1,1x109 (= 0,5 μg DNA) und 1,1x1010 IU (= 5 μg DNA) transduziert. Als Vergleich dazu erfolgte eine Transfektion einer weiteren Versuchsgruppe mit aus dem Vektor isolierter DNA (5 μg DNA, entspricht 1010 IU). Eine Negativkontrolle wurde mit einem entsprechenden Volumen der Trägerlösung behandelt. Das Mediumvolumen der Ansätze betrug einen Milliliter. Zu Beginn des Versuches lag die Dichte der Zellen bei einer Konfluenz von 85 % ± 5 %. Eine lichtmikroskopische Untersuchung der Versuchsansätze zur Bestimmung der Transfektions- und Transduktionseffizienzen erfolgte nach 40 Stunden. Eine repräsentative Übersicht von Fluoreszenzaufnahmen der behandelten Zellen im Vergleich zur Mediumkontrolle ist in Abbildung 3.5A dargestellt. Bei der quantitativen Auswertung der GFP-positiven Zellen (Abbildung 3.5B) wurde eine Transfektionseffizienz von 15 % in HaCaT-Zellen (p = 0,0121) und 9 % in HKC (p = 0,0226) belegt. Bei den mit 1,1x109 IU (= 0,5 μg DNA) viraler Vektoren transduzierten Zellen wurde eine signifikant höhere Effizienz im Vergleich zur Transfektion der Zellen mit 5 μg DNA erzielt (HaCaT: 56 %; p = 0,0002, HKC: 51 %; p = 0,0032). Darüber hinaus wurde nach Transduktion der Keratinozyten mit 1,1x1010 IU Ad5-GFP (= 5 μg DNA) eine Transduktionseffizienz von 84 % (HaCaT; p = 0,0138) und 92 % (HKC; p = 0,0055) detektiert. 56 Ergebnisse Abbildung 3.5: Effizienz adenoviraler Vektoren in Keratinozyten. GFP-Fluoreszenz (A) und quantitative Auswertung GFP-positiver Zellen (B) 48 Stunden nach Transfektion bzw. Transduktion von HaCaT- und HKC-Zellen mit 5 μg adenoviraler DNA (AdDNA[5μg]) oder 1,1x109 IU (AdV[0,5μg]) bzw. 1,1x1010 IU (AdV[5μg]) adenoviraler Vektoren. (* = p<0,05; ** = p<0,005). Die bei der Auszählung GFP-positiver Zellen generierten Ergebnisse werden durch die Analyse der GFP-mRNA Expression mittels qRT-PCR noch stärker verdeutlicht. In allen behandelten Proben lag eine GFP-Expression vor (Abbildung 3.6). Die mit adenoviraler DNA transfizierten Zellen beinhalteten eine GFP-mRNA-Konzentration von 3,2 μg/g 18S rRNA (HaCaT; p = 0,0009) und 0,7 μg/g 18S rRNA (HKC; p = 0,0100). Im Gegensatz dazu enthielten Keratinozyten, welche mit 1,1x109 IU adenoviraler Vektoren transduziert wurden, 1758,27 μg GFP-mRNA/g 18S rRNA (HaCaT; p = 0,0295) bzw. 92,79 μg/g 18S rRNA (HKC; p = 0,0070). Nach Transduktion der Zellen mit 1,1x1010 IU Adenoviren fand sich überdies eine GFP-mRNA-Konzentration von 8246,55 μg/g 57 Ergebnisse 18S rRNA (HaCaT; p = 0,0402) bzw. 280,38 μg/g 18S rRNA (HKC; p = 0,0018). Des Weiteren wurde hier ebenfalls eine signifikant höhere GFP-mRNAKonzentration nach Transduktion der Keratinozyten mit 1,1x1010 IU Ad5-GFP im Vergleich zur niedrigeren Viruskonzentration (HaCaT: p = 0,0296; HKC: p = 0,0071) detektiert. Abbildung 3.6: GFP-Expression in HaCaT- und HKC-Zellen. Die spezifische Transkriptkonzentration wurde 48 Stunden nach der Transfektion mit 5 μg/ml Medium isolierter adenoviraler DNA (AdDNA[5μg]) bestimmt und zur Transduktion mit 1,1x109 IU (AdV[0,5μg]) bzw. 1,1x1010 IU (AdV[5μg]) eines GFP-kodierenden adenoviralen Vektors (AdV) verglichen. (* = p<0,05; ** = p<0,005). 3.3.2 Eignung der Zellkulturen Nach Bestimmung der Transduktionseffizienz adenoviraler Vektoren an Keratinozyten sollte im Folgenden die adenoviral induzierte Immunreaktion in den Zellen dargestellt werden. Zunächst wurde jedoch die Eignung der verwendeten Zellkulturen überprüft. In verschiedenen Studien berichteten Boukamp et al. über genetische Aberrationen in der HaCaT-Zelllinie. Dabei traten in Abhängigkeit von der Passagenanzahl der Zellkulturen diverse Verdopplungen sowie Deletionen einzelner Chromosomen beziehungsweise Chromosomenabschnitte auf [127, 128]. Aufgrund dieser Daten war eine von Primärzellen abweichende Induktion essentieller Faktoren der angeborenen Immunantwort nicht auszuschließen. Gravierender wäre darüber hinaus eine Deletion von Rezeptor- oder Zytokinkodierenden Chromosomenabschnitten, wodurch die HaCaT-Zellen für 58 Ergebnisse eine Analyse der adenoviral induzierten Immunreaktion nicht mehr geeignet wären. Aus diesem Grund wurde vor Beginn der folgenden Versuche zunächst ein vergleichendes Expressionsprofil der basalen Expression der Rezeptorsysteme (TLRs, RLRs, Inflammasomen und DAI) sowie Transkriptionsfaktoren (IRFs) und Zytokine (Typ-I-IFN, Interleukine) erstellt. Abbildung 3.7: Vergleichbarkeit von HaCaT- und HKC-Zellen. Die basale Expression der in der vorliegenden Arbeit untersuchten Faktoren unbehandelter HaCaT-Zellen und primären humanen Keratinozyten (HKC) wurde mittel qRT-PCR bestimmt und in ng/g 18S rRNA angegeben. (* = p<0,05; ** = p<0,005). Die Expression von Typ-I-Interferonen (IFN-α und -β), Interleukinen (IL-1α, -1β und -6), Chemokinen (IL-8), Tumornekrosefaktoren (TNFα) und Interferonregulierenden Faktoren (IRF-3 und -7) in HaCaT- und HKC-Zellen war deutlich nachweisbar (Abbildung 3.7). Auch Mitglieder der Toll-like Rezeptorfamilie (TLR-3, -7, -9, MyD88 und TRIF), der RIG-like Rezeptoren (RIG-I, mda5, IPS-1 und STING) und NOD-like Rezeptoren (NALP3, AIM2 und Caspase-1) sowie das DNA bindende Protein DAI wurden in beiden Zelltypen nachgewiesen. Da die in dieser Studie untersuchten Faktoren in HaCaT- und HKC-Zellen exprimiert wurden, 59 Ergebnisse waren die Keratinozyten grundsätzlich für die folgenden Versuche verwendbar. Bis auf einige Ausnahmen (IFN-α, IL-6, IRF-3, IRF-7, AIM2 und DAI) fanden sich zwischen den HaCaT- und HKC-Zellen jedoch signifikante Unterschiede in der mRNA-Konzentration einer Vielzahl von Rezeptoren und Zytokinen, welche in den nachfolgenden Versuchen Abweichungen in den Reaktionen nach adenoviraler Stimulation der unterschiedlichen Zelltypen zur Folge haben könnte. 3.3.3 Immunogenität adenoviraler DNA Typ-I-Interferone spielen eine zentrale Rolle in der Induktion einer Immunantwort nach viraler Infektion. Sie werden unmittelbar in Folge einer Bindung viraler Bestandteile durch Rezeptoren des angeborenen Immunsystems induziert [35]. Neben ihrer direkten antiviralen Funktion übernehmen Typ-IInterferone wichtige Funktionen bei der para- und autokrinen Induktion der Zytokinexpression [129]. Aus diesem Grund sind Typ-I-Interferone auch von zentraler Bedeutung bei einer Applikation von adenoviralen Vektoren und möglicherweise unter anderem ursächlich für die rapide, T-Zell-unabhängige Reduktion der Transgenexpression nach adenoviralem Gentransfer in vivo. In diesem Fall sollten auch Keratinozyten, der dominante Zelltyp der Epidermis, nach adenoviralem Gentransfer eine deutliche Induktion von Typ-I-IFN in vitro aufweisen. Im folgenden Versuch sollten daher die in den in vivo Versuchen generierten Daten der Induktion des angeborenen Immunsystems nach adenoviraler Stimulation auch in vitro in Keratinozyten dargestellt werden. Die in der Literatur beschriebenen Rolle der adenoviralen DNA sollte darüber hinaus durch eine Gegenüberstellung einer adenoviralen Transduktion und der Transfektion adenoviraler DNA in Keratinozyten überprüft werden. Aus diesem Grund wurde die Expression von Typ-I-IFN nach adenoviraler Transfektion und Transduktion untersucht. Die Tendenz der Expression von IFN-α sowohl in HaCaT- als auch in HKCZellen stimmte überein (Abbildung 3.8). Die Transduktion der Zellen mit 1,1x1010 IU Ad5-GFP führte zum größten Effekt bei der Zytokinexpression (HaCaT: 1,4fach; HKC: 1,6-fach), die Transfektion der Zellen mit adenoviraler DNA zu einer 60 Ergebnisse leicht geringeren Expression von IFN-α (HaCaT: 1,3-fach; HKC: 1,1-fach). Bei der Stimulation der Zellen mit 1,1x109 IU Ad5-GFP wurde in keiner der Proben eine Induktion von IFN-α detektiert. Die stärkste Induktion von IFN-β wurde in mit adenoviraler DNA transfizierten HaCaT-Zellen nachgewiesen (6,4-fach; p = 0,0005). Die Transduktion der HaCaT-Zellen mit 1,1x1010 IU Ad5-GFP hingegen erbrachte eine 4,7-fache Induktion von IFN-β (p = 0,0275). Im Vergleich zur Transfektion (2,4-fach; p = 0,0004) führte eine Transduktion von HKC-Zellen mit 1,1x1010 IU Ad5-GFP (2,8-fach; p = 0,0231) zu einer signifikant höheren Expression von IFN-β (p = 0,0121 im Vergleich zur Transfektion). Ein Anstieg von IFN-β nach Transduktion mit 1,3x109 IU Ad5-GFP fand sich in diesem Versuchsansatz nur in den HKC-Zellen (1,3-fach; p = 0,2827). Abbildung 3.8: Typ-I-Interferonexpression in Keratinozyten. Die spezifische Transkriptkonzentration wurde 6 Stunden nach der Transfektion mit 5 μg/ml Medium isolierter adenoviraler DNA (AdDNA[5μg]) bestimmt und zur Transduktion mit 1,1x109 IU (AdV[0,5μg]) bzw. 1,1x1010 IU (AdV[5μg]) eines GFP-kodierenden adenoviralen Vektors (AdV) verglichen. Die angegebenen Werte wurden gegen eine unbehandelte Negativkontrolle normalisiert. (* = p<0,05; ** = p<0,005). 61 Ergebnisse Die in diesem Versuch dargestellte Induktion von Typ-I-IFN stellt somit die Fähigkeit von Keratinozyten dar, ebenfalls in Form einer Induktion der Interferonsynthese auf die Adenoviren zu reagieren. Die Intensität der Interferonexpression in transduzierten und mit äquivalenter Dosis transfizierten Zellen verdeutlicht das hohe immunogene Potential der adenoviralen DNA. 3.3.4 Kinetik adenoviral induzierter Zytokinexpression Im vorangehenden Versuch wurde eine Abhängigkeit der Zytokinexpression von der eingesetzten Menge der Vektoren dargestellt und die hohe Immunogenität adenoviraler DNA demonstriert. Die Ergebnisse der in vivo Versuche verdeutlichen eine reduzierte Zytokinexpression in athymischen Mäusen. Daher ist ein Hauptanteil der Zytokinexpression in immunkompetenten Tieren den immunologisch aktiven Zellen zuzuordnen. Die geringere Zytokinexpression und stabilere Transgenexpression in athymischen Tieren lassen einen Zusammenhang zwischen der Zytokinexpression und der Reduktion der Transgenexpression vermuten. Darüber hinaus lässt der Mangel an T-Zellen zusammen mit der geringeren Zytokinexpression in athymischen Mäusen ein bezüglich der Intensität den athymischen Tieren vergleichbares Expressionsprofil in primären Keratinozyten in vitro erwarten. Um einen Einblick in die frühe Phase der adenoviral induzierten Immunreaktion zu bekommen, wurde eine Kinetik der Zytokinexpression nach Stimulation mit adenoviraler DNA erstellt. Mit Hilfe des Zeitverlaufes sollten essentielle Zytokine charakterisiert und anhand der Expressionsmaxima ein Profil der adenoviral induzierten Immunreaktion in Keratinozyten dargestellt werden. Sollten Typ-I-IFN eine zentrale Rolle in der antiviralen Abwehr des angeborenen Immunsystems spielen, würden diese unmittelbar nach Infektion der Keratinozyten, noch vor den anderen Zytokinen, exprimiert werden. Die Transfektion der HaCaT- und HKC-Zellen erfolgte mit verschiedenen Konzentrationen adenoviraler DNA (1 und 5 μg) für unterschiedliche Zeiträume von drei bis 24 Stunden. 62 Ergebnisse Abbildung 3.9: Zytokinexpression in Keratinozyten. Die spezifische Transkriptkonzentration wurde in einem Zeitraum von 24 Stunden nach Transfektion mit 1 (rot) und 5 (schwarz) μg/ml Medium isolierter adenoviraler DNA bestimmt. (+,* = p<0,05; ++,** = p<0,005). 63 Ergebnisse In HaCaT-Zellen lag eine deutlich höhere Induktion der Zytokinexpression vor. Hierbei war der Expressionsverlauf gestaffelt (Abbildung 3.9). Die Expression von IFN-α erreichte ihr Maximum zwölf Stunden nach Transfektion der Zellen gefolgt von einem Maximum der IFN-β-Expression nach 15 Stunden. Die Induktion der Interleukinsynthese erreichte nach 24 Stunden ihr Maximum. In den primären Keratinozyten trat, mit Ausnahme von IL-6, eine mit den HaCaT-Zellen übereinstimmende Kinetik auf, wobei die maximale Induktion von IFN-α bereits nach drei Stunden, von IFN-β und der Interleukine nach sechs Stunden vorlag (Diese Daten wurden bereits publiziert [121, 130]). Zum Zeitpunkt der jeweils maximalen Zytokinexpression fand sich nach Transfektion von HaCaT-Zellen mit 5 μg adenoviraler DNA ein 5,4-facher Anstieg von IFN-α (p = 0,0048). Daran gemessen lag die Expression von IFN-β (130-fach; p = 0,0020), IL-1α (70,7-fach; p = 0,0088), IL-6 (93,8-fach; p = 0,0011), IL-8 (36,8fach; p = 0,0594) und TNFα (49,2-fach; p = 0,0474) auf einem deutlich höheren Niveau. Die Analyse der Zytokinexpression in HKC-Zellen verdeutlichte zum Zeitpunkt der maximalen Induktion nach Transfektion von 5 μg DNA eine ähnlich starke Induktion von IFN-α (3,4-fach) wie bei HaCaT-Zellen. Im Vergleich zu den HaCaT-Zellen fiel die Induktion von IFN-β (2,3-fach; p = 0,2938), IL-1α (1,8-fach; p = 0,2407), IL-6 (4,6-fach; p = 0,0006), IL-8 (2,7-fach; p = 0,0019) und TNFα (2,9fach; p = 0,0210) deutlich geringer aus. Das anti-inflammatorische Zytokin IL-10 wurde weder in HaCaT- noch in HKC-Zellen nachgewiesen. Bei einem Vergleich zwischen der Transfektion mit 5 µg und 1 µg adenovirale DNA trat für beide Zelltypen eine Konzentrationsabhängigkeit der Intensität der Zytokinexpression auf. Darüber hinaus wurde in primären Keratinozyten, wie erwartet, eine mit den Daten der athymischen Mäuse in vivo generierten Daten vergleichbare Intensität der Zytokinexpression detektiert. Für die nachfolgenden in vitro Stimulationsversuche wurden Inkubationszeiten von 15 Stunden (HaCaT) und sechs Stunden (HKC) gewählt, da zu diesen Zeitpunkten in den Keratinozyten die jeweils höchste Typ-IInterferonexpression detektiert wurde. Neben der Induktion von Typ-I-IFN wurde ebenfalls eine Expressionskinetik Interferon-regulierender Faktoren (IRF-3 und -7) erstellt. Diese spielen eine wichtige Rolle bei der Induktion von Typ-I-IFN. Die 64 Ergebnisse Induktion der Expression von IRF-3 wurde weder in HaCaT- noch in HKC-Zellen nachgewiesen (Abbildung 3.10). Die Expression der IRF-7-Gene war in HaCaTZellen zwölf Stunden nach Transfektion signifikant erhöht (5,34-fach; p = 0,0180). Mit einer 1,51-fachen Expression fand sich IRF-7-mRNA bereits drei Stunden nach Transfektion in HKC-Zellen. Abbildung 3.10: Induktion Interferon-regulierender Faktoren. Expression (x-fach in Bezug auf Vesikelkontrolle) der Interferon-regulierenden Faktoren 3 und 7 (IRF-3 und -7) nach Transfektion von HaCaT- und HKC-Zellen mit 5 µg/ml adenoviraler DNA über einen Zeitraum von 15 Stunden (HaCaT) bzw. sechs Stunden (HKC). (* = p<0,05). 3.4 Adenoviraler kutaner Gentransfer Die bisherigen Versuche wurden mit Hilfe eines zweidimensionalen Modells für die Kultivierung und Transfektion von Keratinozyten analysiert. Diese Modelle berücksichtigen jedoch nicht die komplexen Prozesse der zellulären Interaktionen in einem dreidimensionalen Gewebeverband. Darüber hinaus sind in einer intakten Vollhaut neben den Keratinozyten auch andere Zellen wie z.B. Melanozyten, Merkelzellen und Fibroblasten 65 präsent. Zudem sind auch Ergebnisse spezialisierte Zellen des Immunsystems, die Langerhans-Zellen, in der Haut vorhanden. Daher war eine abweichende Reaktion der Zellen im Zellverband der Haut im Vergleich zu einer Zellkultur nicht auszuschließen. Aus diesem Grund lag der nächste Schritt dieser Studie in der Untersuchung der Übertragbarkeit der in vivo Versuche auf humanes Gewebe. Um ein möglichst realitätsnahes Modell mit einem hohen Maß an Reproduzierbarkeit zu schaffen, wurden humane Hautexplantate mit Hilfe eines ex vivo Hautspannmodells, der Bo-Drum®, kultiviert [122, 131]. Die Verwendung der Bo-Drum® vernachlässigt zwar die systemischen Auswirkungen eines adenoviralen Gentransfers, sollte sich aber mit den Reaktionen der athymischen Mäuse in vivo vergleichen lassen. Humane Hautexplantate wurden mit 1x1010 IU Ad5-GFP intradermal transduziert und in einem Zeitverlauf von drei bis 96 Stunden aufgearbeitet. Das Experiment wurde im identischen Aufbau mit der Haut eines weiteren Patienten wiederholt, sodass letztlich n=6 Proben je Zeitpunkt aus zwei unabhängigen Experimenten in die Auswertung einflossen. Bei einer repräsentativen Darstellung einer transduzierten Bo-Drum® (Abbildung 3.11) ist in der Überlagerung der Durchlicht- und der Fluoreszenzaufnahme (Abbildung 3.11B) der Bo-Drum® ein deutliches GFP-Signal zu erkennen, welches nicht nur auf den inneren Bereich (Injektionsareal) der Hautkammer begrenzt, sondern in allen sichtbaren Bereichen der Haut erkennbar ist. Abbildung 3.11: Tranduktionskontrolle der Bo-Drum®. Repräsentative Darstellung einer Bo-Drum® 48 Stunden nach Transduktion der Hautkammern mit 1x1010 IU eines GFP-kodierenden, adenoviralen Vektor (A: Durchlichtaufnahme, B: Fluoreszenzaufnahme, C: Überlagerung von Durchlicht- und Fluoreszenzaufnahme der Basisplatte). 66 Ergebnisse Die Zytokinexpression in den behandelten Proben war zwölf Stunden nach der Transduktion des Gewebes am höchsten (Abbildung 3.12). In den transduzierten Arealen wurde zu diesem Zeitpunkt eine 10,9-fache (IFN-α) bzw. 9,0-fache (IFN-β) Induktion von Typ-I-Interferon festgestellt. Auf einem vergleichbaren Niveau lagen auch die Werte für die Expression von Interleukinen (IL-1α: 7,2-fach; p = 0,1665, IL-6: 8,9-fach; p = 0,0013). Neben der Induktion von Interferonen und Interleukinen lag auch hier ein deutlicher Anstieg von IL-8 (12,5fach; p = 0,0758) und TNFα (9,7-fach; p = 0,1329) vor. Auffällig bei der Auswertung war die frühe Induktion der IL-6- und IL-8-mRNA-Synthese, welche bereits sechs Stunden nach Transduktion der Haut einen signifikanten Anstieg (IL6: 2,0-fach; p = 0,0314, IL-8: 2,6-fach; p = 0,0437) aufwiesen. Nach einer rückläufigen Expression trat bei allen Zytokinen ein erneuter, unterschiedlich stark ausgeprägter Anstieg der mRNA-Synthese auf. Besonders deutlich zu erkennen war dieser nach 96 Stunden bei der Synthese von IFN-β (4,5-fach; p = 0,0531) und IL-1 α (7,8-fach; p = 0,4857). Im Vergleich zu den in vitro kultivierten primären Keratinozyten war die Zytokinexpression in den Bo-Drums® 3,5-fach stärker. Aufgrund der im Gewebe vorhandenen immunologisch aktiven Zellen, wie Langerhans-Zellen, lag dieses Ergebnis innerhalb der Erwartungen. Mit Hilfe dieses Versuches wurde das Potential von Keratinozyten in der Induktion einer antiviralen Immunreaktion verdeutlicht. Für eine erfolgreiche Anwendung der Adenoviren für therapeutische Zwecke in der Haut ist eine tiefergehende Beschreibung der molekularen Mechanismen der Viruserkennung in der Haut von großem Interesse. Eine Identifizierung der an der Erkennung der Adenoviren beteiligten Signalkaskaden und Rezeptoren erfolgte in den folgenden Versuchen. 67 Ergebnisse Abbildung 3.12: Zytokinexpression nach Transduktion von Bo-Drums®. Zeitverlauf (3 bis 96 Stunden) der Zytokin-mRNA-Expression (x-fach in Bezug auf eine Trägerkontrolle) nach Transduktion von humaner Vollhaut in einem ex vivo Hautspannmodell (Bo-Drum®) in Bezug zur Trägerkontrolle (PBS-Injektion). Pro Zeitpunkt wurden jeweils drei Proben aus zwei unterschiedlichen Patienten (insgesamt n = 6) mit 1010 IU eines GFP-kodierenden, adenoviralen Vektors transduziert. (** = p<0,005). 3.5 Signaltransduktion nach adenoviraler Infektion 3.5.1 Inhibierung von Signaltransduktionsmolekülen Eine Induktion der angeborenen Immunabwehr verläuft über unterschiedliche Signalwege, welche jeweils ein charakteristisches Profil von Schlüsselmolekülen einbeziehen [35]. Darunter befinden sich Proteine MAPK-abhängiger Signalwege (Erk2, MAPKK, p38 MAPK), der JNK- und JAK/STAT-Kaskaden sowie der Transkriptionsfaktor NFκB. Diese Faktoren spielen eine essentielle Rolle bei der Toll-like Rezeptor-abhängigen Signaltransduktion. Mit Ausnahme von Erk2 stellen diese Proteine jedoch auch wichtige Interaktionspartner in der RIG-like Rezeptor Signalkaskade dar [30]. Durch die Inhibierung dieser Schlüsselmoleküle sollte 68 Ergebnisse unter besonderer Berücksichtigung der Auswirkung einer Blockierung Erk2abhängiger Signaltransduktion ein Einblick in die Rolle von Toll-like und RIG-like Rezeptoren in der adenoviral induzierten Immunantwort gewonnen werden. Dies erfolgte durch eine einstündige Inkubation von Keratinozyten mit verschiedenen Inhibitoren und anschließender Transfektion mit adenoviraler DNA. Mittels qRT-PCR fand sich überwiegend eine signifikante Reduktion der Zytokinexpression nach Inhibierung von NFκB, p38 MAPK JNK und JAK/STAT in HaCaT- und HKC-Zellen (Abbildung 3.13). Die Restzytokinexpression in NFκBinhibierten Proben lag zwischen 23,68 % und 61,86 % der Zytokinexpression nicht-inhibierter Kontrollen in HaCaT-Zellen und zwischen 6,96 % und 73,08 % in HKC-Zellen. Nach Behandlung der Zellen mit Inhibitoren für p38 MAPK, JNK und JAK/STAT stimmten die Expressionsprofile der NFκB-inhibierten Proben tendenziell überein. Nach Verwendung eines Inhibitors für p38 MAPK wurde eine Restexpression von 36,88 - 63,32 % in HaCaT-Zellen und 33,69 - 83,92 % in HKC-Zellen detektiert. Die Inhibierung von JNK führte zu einer Restexpression von 17,86 - 53,22 % in HaCaT-Zellen und 55,84 - 86,83 % in HKC-Zellen. Die Behandlung der Zellen mit einem JAK/STAT Inhibitor führte zu einer Restexpression von 27,48 - 70,08 % in HaCaT-Zellen und 43,55 - 83,73 % in HKC-Zellen. Auf die Expression von IL-1α in HaCaT- und HKC-Zellen sowie auf IFN-α in HKC-Zellen wirkten sich die Inhibitoren nicht aus. Für die Expression von TNFα, MIP-3α und IP-10 fand sich keine signifikante Reduktion der Zytokinexpression nach Behandlung der HKC-Zellen mit einem Inhibitor für JNK und JAK/STAT. In diesem Fall führte die Inhibierung zu einer Hochregulation der genannten Faktoren, welche mit Ausnahme von IP-10 auch nach Inhibierung von p38 MAPK gemessen wurde. Übereinstimmend lag auch nach Inhibierung von JAK/STAT in HaCaT-Zellen kein Effekt auf die Expression von IP-10 vor. Bei Erk2 lag im Gegensatz zu den oben genannten Inhibitoren keine signifikante Reduktion der Zytokinexpression vor. Tendenziell führte die Behandlung der Zellen zu einer teils signifikanten Induktion von IFN-α (HaCaT: 128,56 %; p=0,0233) und IFN-β (HKC: 135,88 %; p=0,0011) und IP-10 (HKC: 170,35 %; p=0,0055). Diese Unabhängigkeit der Signaltransduktion von Erk2 stützt die These einer RLRabhängigen Signaltransduktion nach Detektion der Adenoviren. 69 Ergebnisse Abbildung 3.13: Zytokinexpression nach Inhibierung diverser Signaltransduktionswege. Die Expression von Typ-I-IFN nach Transfektion von HaCaT- und HKC-Zellen mit 5 µg/ml adenoviraler DNA über einen Zeitraum von 15 Stunden (HaCaT) bzw. sechs Stunden (HKC) wurde mittel qRT-PCR bestimmt. Eine Stunde vor Transfektion wurden dem Zellkulturmedium Inhibitoren für Proteine unterschiedlicher Signalkaskaden in einer Endkonzentration von 10 μM zugegeben. Dargestellt ist die prozentuale Expression von IFNα und IFN-β in Bezug auf eine nicht inhibierte Positivkontrolle. (* = p<0,05; ** = p<0,005). 70 Ergebnisse 3.5.2 Expressionsverhalten pathogenerkennender Rezeptoren Im vorangehenden Kapitel wurden Indizien für die Beteiligung von RIG-like Rezeptoren an der Induktion einer Immunantwort demonstriert. Jedoch wird eine Aktivierung der oben aufgeführten Transkriptionsfaktoren durch unterschiedliche Signalwege und Rezeptorsysteme ausgelöst. So zum Beispiel ist eine Erk2 unabhängige Beteiligung von TLRs bei der Induktion der Zytokinexpression nicht auszuschließen. Darüber hinaus wäre eine Aktivierung von NFκB auch in Abhängigkeit des DNA-bindenden Proteins DAI möglich [30]. Für die Untersuchung einer Beteiligung von Rezeptoren der TLR- und RLR-Familie sowie des DNA-bindenden Proteins DAI erfolgte eine Analyse der Expressionsprofile dieser Rezeptoren und spezifischer Adaptermoleküle mittels qRT-PCR. Hierfür erfolgte eine Transfektion von HaCaT- und HKC-Zellen mit 5 μg DNA adenoviraler DNA über 15 bzw. sechs Stunden. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach Transfektion der Zellen (3, 6, 9, 12, 15 oder 24 Stunden) erfolgte die Aufarbeitung der Zellen. 3.5.2.1 Expression von Toll-ähnlichen Rezeptoren (TLRs) Die Familie der TLRs galt in den vergangenen Jahren als eine der Hauptfaktoren bei der Erkennung viraler Bestandteile [33, 47, 79]. Auch die bisherigen Ergebnisse der vorliegenden Untersuchungen schlossen eine Beteiligung der TLRs an der adenoviral induzierten Immunreaktion nicht aus. Für die Erkennung von Nukleinsäuren wurden TLR-3, -7 und -8 (RNA) sowie TLR-9 (DNA) beschrieben (Abbildung 1.6). TLR-3 war zwölf Stunden nach Transfektion von HaCaT-Zellen signifikant 5,28-fach stärker exprimiert (p = 0,0360) (Abbildung 3.14). In HKC-Zellen lag ein Expressionsmaximum (1,38-fach) bereits nach neun Stunden vor. Eine Induktion von TLR-7 trat in den HaCaT-Zellen nicht auf, wohingegen HKC-Zellen bereits nach neun Stunden eine 1,83-fache Regulation des Rezeptors aufwiesen. Die Gene von TLR-8 wurden in Keratinozyten nicht exprimiert. Für TLR-9 wurde 15 Stunden nach Transfektion eine geringe Zunahme (1,25-fach) in HaCaT-Zellen verzeichnet. In primären Keratinozyten traten zwei Expressionsmaxima nach 6 Stunden (1,41-fach) und nach 24 Stunden (1,87-fach; p = 0,0718) auf. Bei der 71 Ergebnisse Analyse der Expression der TLR-spezifischen Adaptermoleküle MyD88 und TRIF lag eine signifikante Induktion von MyD88 (5,56-fach; p = 0,0471) zwölf Stunden nach Transfektion von HaCaT-Zellen vor. In HKC-Zellen wurde bereits nach drei Stunden eine leichte Induktion von MyD88 festgestellt (1,30-fach). Das Adaptermolekül TRIF fand sich nur in HaCaT-Zellen nach 24 Stunden mit 1,21facher Expression. Die verhältnismäßig geringe Induktion von TLRs, insbesondere des DNAerkennenden Rezeptors TLR-9, und deren Adaptermoleküle MyD88 und TRIF deutet auf einen anderen Faktor für die Erkennung der viralen DNA in der Zelle hin. Unter zur Hilfenahme der Ergebnisse der Inhibierung von Erk2 sollte im Folgenden die Rolle der RLRs an der Induktion der Immunreaktion untersucht werden. Abbildung 3.14: Induktion von Toll-like Rezeptoren. Expression (x-fach in Bezug auf Vesikelkontrolle) von Toll-like Rezeptoren (TLR) -3, -7, -8 und -9 sowie der TLR-abhängigen Adaptermoleküle MyD88 und TRIF nach Transfektion von HaCaT- und HKC-Zellen mit 5 µg/ml adenoviraler DNA über einen Zeitraum von 15 Stunden (HaCaT) bzw. sechs Stunden (HKC). (* = p<0,05). 72 Ergebnisse 3.5.2.2 Expression von RIG-ähnlichen Rezeptoren (RLRs) Zwölf Stunden nach Transfektion wurde eine signifikante Induktion der RIGähnlichen Rezeptoren RIG-I (8,10-fach; p = 0,0291) und mda5 (52,08-fach; p = 0,0267) in HaCaT-Zellen beobachtet (Abbildung 1.7). Dieser enorme Anstieg der Expression von mda5 in HaCaT-Zellen bekräftigt die Annahme der RLRvermittelten Induktion der antiadenoviralen Immunantwort. Im Vergleich zu den HaCaT Zellen lag in HKC-Zellen mit einem 1,42-fachen (RIG-I) bzw. 1,34-fachen (mda5; p = 0,0819) Anstieg eine eher geringe Induktion vor (Abbildung 3.15). Ein Expressionsanstieg des Adaptermoleküls IPS-1 fand sich nur in HKCZellen (9h; 1,23-fach). Ein signifikanter Anstieg der STING-mRNA-Konzentration lag bereits drei Stunden (2,23-fach; p = 0,0060) nach Stimulation von HaCaTZellen vor. In HKC-Zellen hingegen trat eine STING-Expression mit maximaler Expression (1,23-fach) neun Stunden nach Transfektion auf. Abbildung 3.15: Induktion von RIG-like Rezeptoren. Expression (x-fach in Bezug auf Vesikelkontrolle) von RIG-like Rezeptoren (RLR) RIG-I und mda5 sowie deren Adaptermoleküle IPS-1 und STING nach Transfektion von HaCaT- und HKC-Zellen mit 5 µg/ml adenoviraler DNA über einen Zeitraum von 15 Stunden (HaCaT) bzw. sechs Stunden (HKC). (* = p<0,05; ** = p<0,005). 73 Ergebnisse 3.5.2.3 Expression von DAI (DLM-1/ZPB1) Aufgrund der essentiellen Rolle von NFκB bei der Induktion der Zytokinexpression ist, neben TLRs und RLRs, eine Beteiligung des DNAbindenden Proteins DAI ebenfalls nicht auszuschließen. Bei einer Untersuchung der Expression dieses Rezeptors (Abbildung 3.16) lag eine signifikante Induktion nach zwölf Stunden (15,69-fach; p = 0,0317) in HaCaT-Zellen vor. Nach 15 Stunden wurde mit einer 23,86-fachen Expression das Maximum erreicht. In HKCZellen fand sich nur eine leichte Induktion (1,85-fach) nach zwölf Stunden. Bei einem Vergleich der Induktionsintensität von DAI und mda5 mit der Expression von TLR-3, -7 und -9 wird die Rolle von DAI und mda5 aufgrund der bis zu 10-fach höheren Induktion (TLR-3: 5,3-fach; mda5: 52,04-fach) in der adenoviral induzierten Immunreaktion wahrscheinlicher. Abbildung 3.16: Induktion der DAI-Expression. Expression (x-fach in Bezug auf Vesikelkontrolle) des DNA-Bindeproteins DAI nach Transfektion von HaCaT- und HKC-Zellen mit 5 µg/ml adenoviraler DNA über einen Zeitraum von 15 Stunden (HaCaT) bzw. sechs Stunden (HKC). (* = p<0,05). 3.5.2.4 Expression von Inflammasom-bildenden Komponenten Die bisher publizierten Daten über die Beteiligung der oben beschriebenen Rezeptoren in der Pathogenerkennung deuten auf eine simultane Beteiligung unterschiedlicher Rezeptorsysteme der angeborenen Immunabwehr hin. Ein Beispiel hierfür ist eine erst in den letzten Jahren näher charakterisierte Familie von Rezeptoren, die sogenannten Inflammasomen [85]. Dabei handelt es sich um Mitglieder der NLR- und HIN-200-Proteinfamilien, welche mit Hilfe einer 74 Ergebnisse Pyrindomäne mit dem Adaptermolekül ASC (Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD) interagieren. Dies wiederum katalysiert eine Caspase1-abhängige Prozessierung von pro-IL-1β (Abbildung 1.8) [30, 89, 90]. Dieser Komplex, das sogenannte Inflammasom, wirkt jedoch nicht direkt auf die Genexpression ein. Aus diesem Grund ist ein Zusammenspiel von pro-IL-1β induzierenden Signalwegen und der durch das Inflammasom katalysierten Prozessierung von pro-IL-1β in der Zelle essentiell. Aufgrund der bisher in der vorliegenden Arbeit beschriebenen NFκB-Abhängigkeit der angeborenen Immunantwort ist auch eine Beteiligung der Inflammasomen wahrscheinlich. In HaCaT-Zellen fand sich bei der Analyse der Expression der oben dargestellten Komponenten der Inflammasomen (Abbildung 3.17) keine Induktion von NALP3. Im Gegensatz dazu lag in HKC-Zellen ein signifikanter Anstieg der NALP3-mRNA (2,29-fach; p = 0,0243) bereits drei Stunden nach Transfektion der Zellen vor. Die mRNA des DNA-bindenden Proteins AIM2 trat in HaCaT-Zellen nach sechs Stunden mit einem 2,64-fach erhöhtem Level auf (p = 0,0228). Zwölf Stunden nach Beginn des Versuchs hatte die Expression mit 36,81-facher Expression ihr Maximum erreicht (p = 0,0421). Die höchste Konzentration von AIM2-mRNA lag in HKC-Zellen mit 1,43-facher Expression zwölf Stunden nach der Transfektion vor. Bei Analyse der Expression der durch AIM2 und NALP3 aktivierten Caspase-1 fand sich eine 4,6-fache Induktion (p = 0,0164) nach zwölf Stunden in HaCaT-Zellen. In primären Keratinozyten lag jeweils eine 1,25-fache Induktion nach drei und zwölf Stunden vor. Die Expression des Interleukins-1β lag in HaCaT-Zellen sechs Stunden nach Transfektion der Zellen auf einem 2,1-fach erhöhtem Level vor. Nach einem temporären Abfall der mRNA Synthese fand sich nach 24 Stunden eine 6,33-fache Expression des Zytokins. Ein mit den HaCaT-Zellen übereinstimmender Verlauf der IL-1β-Expression trat auch in den primären Keratinozyten auf. Dabei fand sich nach sechs Stunden eine 1,41-fache Syntheserate (p = 0,0439). Nach 24 Stunden lag in diesen Zellen eine 1,66-fache Induktion vor (p = 0,0833). 75 Ergebnisse Abbildung 3.17: Induktion von Inflammasomen. Expression (x-fach in Bezug auf Vesikelkontrolle) von verschiedenen, Inflammasombildenden (NALP3, AIM2) sowie deren Interaktionspartner Caspase-1 und Interleukin 1β (IL1β) nach Transfektion von HaCaT- und HKC-Zellen mit 5 µg/ml adenoviraler DNA über einen Zeitraum von 15 Stunden (HaCaT) bzw. sechs Stunden (HKC). (* = p<0,05). Die Expressionsdaten von AIM2 in HaCaT-Zellen deuten aufgrund der starken Induktion dieses Proteins ebenfalls auf eine Beteiligung dieses Rezeptors an der adenoviral induzierten Immunreaktion hin. Auch die Expression von NALP3 in HKC-Zellen verzeichnete einen für Primärzellen ausgeprägten Anstieg und könnte somit eine Rolle bei der Detektion adenoviraler DNA spielen. In der Literatur wurden unlängst durch einen Abgleich funktioneller Domänen drei weitere Mitglieder der DNA-bindenden HIN-200-Proteinfamilie, welche mit dem Adaptermolekül ASC interagieren können, beschrieben. Dabei handelt es sich um die Proteine MNDA (Myeloid cell nuclear differentiation antigen), IF16 (Interferon gamma-inducible protein 16) und IFIX (Pyrin and HIN domain family member 1) [90]. Aus diesem Grund sollten im Rahmen dieser Studie auch entsprechende Expressionsprofile dieser Faktoren erstellt werden, um eine potentielle Beteiligung an der Immunreaktion nach adenoviraler Infektion zu klären. Bei der Analyse der Expression dieser Faktoren fand sich bereits nach drei Stunden eine 2,09-fache 76 Ergebnisse Induktion (p = 0,0120) von IF16 in HaCaT-Zellen (Abbildung 3.18). Zwölf Stunden nach der Transfektion lag ein weiterhin eine erhöhte Expression vor (4,75-fach; p = 0,0143), welche auch nach 24 Stunden 5,33-fach erhöht war. In HKC-Zellen trat keine Regulation von IF16 auf. IFIX hingegen fand sich in beiden Zelltypen. Dabei lag in HaCaT-Zellen eine 3,47-fache Expression nach 24 Stunden (p = 0,0082) und in primären Keratinozyten bereits nach zwölf Stunden eine maximale Expression (1,45-fach) vor. MNDA hingegen trat nur in HKC-Zellen auf (1,72fach). Anhand der vorliegenden Daten wurde eine Beteiligung von IF16 bei der Induktion der Immunreaktion nicht ausgeschlossen. Aufgrund der vergleichsweise eher geringen Regulation dieses Rezeptors (bis zu 4,75-fach) wurde das Hauptaugenmerk der weiteren Analysen auf die Faktoren AIM2, NALP3, mda5 und DAI (bis zu 52,08-fach erhöht) gelegt. Abbildung 3.18: Induktion von HIN-200-Proteinen. Expression (x-fach in Bezug auf Vesikelkontrolle) von Mitgliedern der HIN-200-Proteinfamilie (IF16, IFIX und MNDA) nach Transfektion von HaCaT- und HKC-Zellen mit 5 µg/ml adenoviraler DNA über einen Zeitraum von 15 Stunden (HaCaT) bzw. sechs Stunden (HKC). (* = p<0,05; ** = p<0,005). 77 Ergebnisse 3.5.3 siRNA-vermittelte Inhibierung der Genexpression Für eine genauere Aussage über die Beteiligung spezifischer Rezeptoren an der adenoviral induzierten Immunreaktion wurde die Expression der Rezeptoren AIM2, NALP3, mda5 und DAI in einem weiteren Versuch mit Hilfe von siRNA über einen Zeitraum von 48 Stunden inhibiert. Infolgedessen wurden die Zellen mit adenoviraler DNA (5 μg/ml Medium) transfiziert und die Auswirkungen auf die Interferonexpression mittels qRT-PCR näher betrachtet. Zur Kontrolle der Effizienz der verwendeten siRNA wurden die behandelten Zellen zunächst bezüglich der Expression der inhibierten Rezeptoren analysiert. Dabei wiesen alle siRNAbehandelten Proben eine Reduktion der entsprechenden mRNA-Konzentrationen auf. Bei anti-AIM2-siRNA wurde im Vergleich eine Restexpression der mRNA von 71,89 % in HaCaT-Zellen und 63,79 % zu einer Kontrolle in HKC-Zellen ermittelt (Abbildung 3.19). Die Inhibierung von NALP3 führte zu einer Restexpression von 74,54 % (HaCaT) bzw. 64,25 % (HKC). Die höchste Effizienz trat bei der in diesem Versuch verwendeten anti-mda5-siRNA mit einer signifikanten Reduktion der mRNA auf 43,72 % (p = 0,0035) in HaCaT-Zellen und 27,48 % (p = 0,0572) in HKC-Zellen auf. In anti-DAI-siRNA-behandelten Proben lag eine Rest-mRNAExpression von 81,38 % in HaCaT-Zellen und 67,75 % in HKC-Zellen vor. Abbildung 3.19: Effizienz verwendeter siRNAs. Expression von AIM2-, NALP3-, mda5- und DAI-mRNA 48 Stunden nach Transfektion von anti-Rzeptor-siRNA in HaCaT- und HKC-Zellen. (** = p<0,005). 78 Ergebnisse Bei der Analyse der Interferonexpression in anti-mda5-siRNA-behandelten Proben fand sich eine signifikante Reduktion der Expression von IFN-α und IFN-β sowohl in HaCaT- und HKC-Zellen (Abbildung 3.20). Der größte Effekt auf die Interferonexpression lag in primären Keratinozyten vor (IFN-α: 38,31 % Restexpression; p = 0,0333, IFN-β: 33,47 %; p = 0,0569). In HaCaT-Zellen trat eine Restexpression von 54,11 % (IFN-α; p = 0,0180) und 72,99 % (IFN-β; p = 0,0262) auf. Bei den AIM2- und NALP3-inhibierten Proben wiesen HaCaT-Zellen und HKC-Zellen eine übereinstimmende Tendenz auf. Dabei stellte sich in anti-AIM2siRNA-behandelte Zellen eine deutlich stärkere Reduktion von IFN-β (HaCaT: 73,11 %; p = 0,0355, HKC: 50,23 %) im Vergleich zu IFN-α dar (HaCaT: 90,57 %; HKC: 85,30 %). In Proben mit reduzierter NALP3-Expression fand sich im Gegensatz dazu eine stärkere Reduktion von IFN-α (HaCaT: 57,58 %; p = 0,0586, HKC: 73,36 %) im Vergleich zu IFN-β (HaCaT: 103,99 %; HKC: 92,03 %). Die Behandlung von Keratinozyten mit anti-DAI-mRNA führte zu einer ebenfalls für beide Zelltypen übereinstimmenden Expression von IFN-α und IFN-β nach Transfektion der Zellen mit adenoviraler DNA. Dabei lag in HaCaT-Zellen eine Restexpression von 71,22 % (IFN-α; p = 0,0690) bzw. 76,15 % (IFN-β; p = 0,0546) vor. In HKC-Zellen fand sich eine Expression von 73,56 % (IFN-α) bzw. 81,54 % (IFN-β). Abbildung 3.20: siRNA-vermittelte Inhibierung der mRNA-Expression potentieller DNARezeptoren. Typ-I-Interferoninduktion (x-fach in Bezug auf Vesikelkontrolle) nach siRNA-vermittelter Blockierung der für diesen Rezeptor kodierenden mRNA und Transfektion von HaCaT- und HKC-Zellen mit 5 µg/ml adenoviraler DNA über einen Zeitraum von 15 Stunden (HaCaT) bzw. sechs Stunden (HKC) (* = p<0,05). 79 Ergebnisse Für eine genaue Interpretation der Ergebnisse wurden die Daten der Interferonexpression mit der Ergebnissen der siRNA-Effizienzen in Relation gesetzt. Die in Tabelle 3.2 dargestellten Quotienten aus siRNA-Effizienz und IFNExpression verdeutlichen den Zusammenhang der Inhibierung der RezeptormRNA Expression mit der Reduktion der Typ-I-IFN Expression. Dabei steht ein Wert von x=1 für eine (lineare) Proportionalität der genannten Faktoren, ein Wert von x<1 und x>1 für eine Unter- und Überproportionalität zwischen siRNAEffizienz und Typ-I-IFN Expression. Tabelle 3.2: Effekte der Inhibierung der mRNA-Expression potentieller Rezeptoren. Normalisierte Darstellung der Expression von Typ-I-Interferonen nach siRNA-vermittelter Inhibierung der Genexpression potentieller Rezeptoren für adenovirale DNA (siRNAEffizienz / IFN-Expression). Aufgrund der unterschiedlichen siRNA-Effizienzen wurden die in diesem Versuch ermittelten Daten in Proportionalitätsfaktoren dargestellt. Dabei gilt für Auswirkung der Inhibierung der Rezeptorexpression auf die Typ-I-Interferonexpression: x<1: unterproportional, x=1: proportional und x>1: überproportional. AIM2 IFN-α IFN-β NALP3 mda5 DAI HaCaT HKC HaCaT HKC HaCaT HKC HaCaT HKC 0,79 0,98 0,75 1,27 1,29 0,72 0,88 0,70 0,81 0,60 0,71 0,82 1,14 1,07 0,92 0,83 Die Darstellung der Relationen zwischen der Restexpression der jeweiligen Rezeptoren und der Reduktion der Typ-I-IFN Expression verdeutlicht einen proportionalen bis überproportionalen Zusammenhang zwischen der Expression von IFN-β und der Expression von AIM2 in HaCaT- und HKC-Zellen. Ein ebenfalls überproportionaler Zusammenhang zwischen der Expression von IFN-α und NALP3 sowie der Expression von IFN-α und IFN-β und der Expression des Rezeptors DAI wurde für HaCaT-Zellen dargestellt. Entgegen den Erwartungen wiesen die Typ-I-IFN- und mda5-Expression in HaCaT- und HKC-Zellen einen unterproportionalen Zusammenhang auf. Aus diesem Grund sollten in einem weiteren Versuch die Auswirkungen der siRNA-vermittelten Inhibierung der Rezeptorexpression auf die Transgenexpression nach Keratinozyten mit einem Ad5-GFP Vektor untersucht werden. 80 Transduktion von Ergebnisse 3.5.4 Transgenexpression nach Inhibierung potentieller Rezeptoren Die siRNA-vermittelte Inhibierung der Genexpression eines der oben charakterisierten Rezeptoren sollte eine Herabsenkung der Konzentration des jeweiligen Rezeptors in der Zelle zur Folge haben. Dementsprechend sollte eine Transduktion der siRNA-behandelten Zellen zu einer verminderten Immunreaktion führen, was mitunter zu einer erhöhten Transgenexpression in den Zellen führt. Zur Überprüfung dieser Hypothese wurden HaCaT-Zellen über einen Zeitraum von 48 Stunden mit oben genannten siRNAs inkubiert und daraufhin mit 108 IU Ad5GFP transduziert. Nach weiteren 48 Stunden wurde die Reporterfluoreszenz mittels einer Kodak Life-Imaging Station quantifiziert. Abbildung 3.21: Transduktion nach Inhibierung potentieller Rezeptoren. Quantitative (A) und qualitative (B) Darstellung der GFP-Expression in HaCaT-Zellen 48 Stunden nach siRNA-vermittelter Inhibierung von AIM2, NALP3, mda5 und DAI und darauffolgender Transduktion mit 1x108 IU Ad5-GFP oder PBS (Kontrolle). Die Analyse der Proben erfolgte mittels Life-Imaging Station. (* = p<0,05; ** = p<0,005). Bereits in der qualitativen Darstellung der transduzierten Keratinozyten (Abbildung 3.21A) war in Bezug auf die Kontrollen ein stärkeres Signal nach Inhibierung von AIM2, NALP3, mda5 und DAI erkennenbar. Die quantitative Analyse der GFP-Fluoreszenz (Abbildung 3.21B) verdeutlichte eine 2,24-fache, signifikante Steigerung nach Inhibierung von NALP3 (p = 0,0018). Eine 81 Ergebnisse Vorinkubation in anti-AIM2 und anti-mda5-siRNA führte ebenfalls zu einer signifikanten Steigerung der Reporterfluoreszenz um den Faktor 1,77 (AIM2; p = 0,0186) und 1,59 (mda5; p = 0,0244). Mit einer 1,34-fach verstärkten Signalintensität fand sich nach Verwendung eines DAI-Inhibitors keine signifikante Veränderung in den Proben (p = 0,0902). Die in diesem Versuch generierten Daten zeigen somit eine primäre Beteiligung der Rezeptoren AIM2, NALP3 und mda5 an der Induktion der angeborenen Immunantwort nach adenoviralem Gentransfer in Keratinozyten. 82 Diskussion 4 Diskussion Eine zur Behandlung von Hautdefekten übliche, topische Applikation von therapeutischen Proteinen wird in ihrem grundsätzlichen Potential deutlich eingeschränkt. Die dabei wichtigsten limitierenden Faktoren sind die kostenintensive Herstellung der Proteine sowie die, durch proteolytischen Abbau bedingten, kurzen Halbwertszeiten dieser Proteine [132]. Eine interessante Alternative zur topischen Applikation von therapeutischen Peptiden ist die genetische Modifikation körpereigener Zellen mit Hilfe eines Gentransfers in das Gewebe. Die Verwendung adenoviraler Vektoren stellt die bisher vorteilhafteste Technik für einen Gentransfer dar [38]. Sie zeigen gegenüber anderen Vektoren die höchsten Transfektionsraten bei einer transienten, extrachromosomalen Expression im Zielgewebe [35, 133]. Darüber hinaus werden bei der vergleichsweise simplen Herstellung der Viren hohe Titer von mehr als 1010 infektiöse Einheiten (IU) erreicht [35, 134, 135]. Für die im Rahmen der vorliegenden Arbeit hergestellten Viruschargen fanden sich Titer von bis zu 6,44x1011 IU/ml. Die bisher größte Hürde für eine erfolgreiche und repetitive Applikation adenoviraler Vektoren ist deren hohe Immunogenität [133]. Ein potentieller Ansatz für die Optimierung des adenoviralen Gentransfers wäre ein gezielter Eingriff in die molekularen Abläufe der adenoviral induzierten Immunantwort. Jedoch sind diese Mechanismen in der Literatur bisher nur unzureichend beschrieben und viele Aspekte dieser Thematik noch unklar. Bislang wurden diverse Arbeiten im Bereich molekularer Mechanismen des angeborenen Immunsystems veröffentlicht, in deren Vordergrund Untersuchungen zu Mechanismen der Nukleinsäureerkennung und die Expressionsregulation inflammatorischer Zytokine in verschiedenen Organismen wie Mäusen, Primaten und Menschen stehen [109, 111, 123, 136, 137]. Die meisten Arbeiten beschäftigen sich allerdings überwiegend mit den molekularen Abläufen in spezialisierten Zellen der Immunabwehr, wie zum Beispiel Dendritischen Zellen und Makrophagen [51, 79, 111, 137]. Zusätzlich wurden diese Mechanismen häufig basierend auf Viren mit RNA-Genom untersucht [112114]. Die Rolle immunologisch nicht spezialisierter Zellen, wie zum Beispiel Keratinozyten, wurde in diesem Zusammenhang eher vernachlässigt. 83 Diskussion Keratinozyten, der prädominante Zelltyp der Epidermis, sollten aufgrund ihrer Barrierefunktion des Körpers ein Potential zur Beteiligung an einer antiadenoviralen Immunreaktion aufweisen. 4.1 Immunantwort nach adenoviraler Transduktion in vivo In bisherigen Studien erfolgte meist eine systemische Applikation adenoviraler Vektoren. Im Gegensatz dazu war eine verminderte Immunreaktion nach lokaler Applikation der Viren nicht auszuschließen. Anhand eines adenoviralen Gentransfers in einem murinen Transduktionsmodell sollten erste Rückschlüsse über den Verlauf der Transgenexpression nach einer intrakutanen Lokalapplikation der Vektoren gezogen werden. Dabei wurde auch nach einer lokalen, intrakutanen Applikation adenoviraler Vektoren eine Reduktion der Transgenexpression in immunkompetenten Tieren nachgewiesen. Nach erstmaliger Applikation der Viren war eine GFP-Fluoreszenz über einem Zeitraum von zwölf Tagen detektierbar. Eine Reapplikation des Vektors an Tag 14 führte außerdem zu einer deutlich in der Zeitdauer (5 Tage) und Intensität eingeschränkten Nachweisbarkeit des Reporters. In den an Tag 0 mit einer Kontrolle behandelten Areale trat ein mit dem der retransduzierten Areale übereinstimmender Verlauf der Reporterfluoreszenz auf. Darüber hinaus wurde in Vorarbeiten ein deutlicher Anstieg der Anzahl von Granulozyten, Lymphozyten und Monozyten [121, 130] in den behandelten Tieren festgestellt, was auf eine systemische Immunreaktion nach lokaler Injektion der Vektoren hindeutet. Dieser Befund deckt sich mit den Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen für die Applikation von Adenoviren in anderen Zielgewebe [51, 79, 138, 139]. Als Konsequenz für die in der Zeitdauer und Intensität eingeschränkte Expression des Transgens erscheint eine Reapplikation des Vektors für therapeutische Zwecke somit nicht sinnvoll. Im Gegensatz zu den immunkompetenten Tieren wurde in T-Zell-defizienten, athymischen Mäusen ein nahezu konstantes GFP-Signal über den gesamten Versuchszeitraum nach Reapplikation der Viren festgestellt. Der zwischen den einfach und doppelt tranduzierten Arealen gemessene Unterschied in der Intensität der Reporterfluoreszenz (42,4 ±7,6 %) zeigte einen proportionalen Zusammenhang der Reporterfluoreszenz und der Vektordosis. In Übereinstimmung mit der Literatur fand sich somit auch in diesem Versuch eine deutliche T-Zell-Abhängig- 84 Diskussion keit der antiadenoviralen Immunreaktion. Interessanterweise wurde sowohl in immunkompetenten als auch in athymischen Tieren eine Reduktion der Reporterfluoreszenz in der frühen Phase der Infektion (Tag 2 bis 5) festgestellt. Ein ähnlicher Verlauf wurde in der Literatur bereits beschrieben [123]. Diese Reduktion der GFP-Konzentration stellt ein wichtiges Indiz für einen weiteren, T-Zell-unabhängigen Mechanismus der Inhibierung der Reporterfluoreszenz dar. Als mögliche Ursache wurde in den transduzierten Hautarealen eine starke Induktion inflammatorischer Zytokine an Tag 2 nach Transduktion und Retransduktion immunkompetenter Tiere detektiert. Diese trat in athymischen Tieren nur in einer stark verminderten Intensität (circa 2 % in Bezug auf immunkompetente Tiere) auf. Verbunden mit der in den athymischen Tieren detektierten, stabilen Reporterfluoreszenz erscheint somit eine lokale Immunsuppression für eine Optimierung des adenoviralen Gentransfers sinnvoll. Die nach Transduktion athymischer Tiere vorliegende Zytokinexpression belegt darüber hinaus ein Potential epidermaler Zellen in der Induktion einer antiviralen Immunabwehr. Dies sollte anhand von in vitro und ex vivo Modellen näher untersucht werden. 4.2 Immunreaktion nach adenoviraler Stimulation in vitro 4.2.1 Eignung der verwendeten Zellkulturen Bestimmte Zellarten, unter anderem von Nagetieren, können sich in vitro unter bestimmten Bedingungen oder bei Behandlung mit verschiedenen Agenzien spontanen Veränderungen unterziehen [140]. Humane Zellen zeigen sich dagegen weitgehend inert [141, 142]. Da das Auftreten von solchen Veränderungen in verschiedenen Spezies mit der Häufigkeit spontaner chromosomaler Aberrationen zu korrelieren scheint, wird der Mangel kompletter Transformation humaner Zellen in Kultur hauptsächlich der höheren Stabilität des humanen Genoms zugeschrieben [143, 144]. Veränderte Wachstumseigenschaften humaner Zellen können jedoch beispielsweise durch eine Infektion mit dem Polyomavirus SV40 (Simianes Virus 40) hervorgerufen werden [145, 146] oder aber durch geänderte Wachstumsbedingungen zufällig induziert werden [117]. Unter veränderten Wachstumsbedingungen, wie zum Beispiel geringe Kalziumkonzentrationen und eine erhöhte Wachstumstemperatur, kam es gegen Ende der 80er Jahre in dem Labor einer Arbeitsgruppe um Boukamp aus Heidelberg zu einer spontanen 85 Diskussion Immortalisierung einer Zellkultur humaner Keratinozyten (HaCaT) [117]. Aufgrund der leichten Kultivierbarkeit dieser Zelllinie und der Reproduzierbarkeit der generierten Daten in vitro wurden diese Zellen in die Versuche der vorliegenden Arbeit mit einbezogen. Durch die Transformation und die lange in vitro-Kultur der HaCaT-Zelllinie sind Abweichungen im Stoffwechsel der Zellen im Vergleich zu primären Keratinozyten nicht auszuschliessen. Das zu Beginn dieser Studie angefertigte Profil der basalen Expression inflammatorischer Zytokine bestätigte zwar die Expression aller untersuchten Zytokine, Rezeptoren und Adaptermoleküle in HaCaT-Zellen und primären Keratinozyten, wies darüber hinaus jedoch auch signifikante Unterschiede in der mRNA Expression auf. Eine mögliche Erklärung dafür sind die von Boukamp et al. beschriebenen, chromosomalen Aberrationen in Abhängigkeit von der Passagenanzahl in HaCaT-Zellen [117, 127, 128]. Im Falle einer Verdopplung bzw. Deletion diverser Chromosomensätze wäre auch eine Abweichung in der Expression inflammatorischer Faktoren wahrscheinlich. Obwohl in der vorliegenden Studie nur mit Zellen der maximal 15. Passage gearbeitet wurde, sind auch hier entsprechende Veränderungen in der Genexpression der Zellen im Vergleich zu primären Keratinozyten nicht auszuschließen. Der Nachteil bei der Verwendung von primären humanen Keratinozyten liegt in der begrenzten Verfügbarkeit der Zellen, da diese nur aus frisch asserviertem humanem Hautgewebe isoliert werden können. Je nach Entnahmeposition, Alter und Gesundheitszustand des Patienten können diese frisch von verschiedenen Patienten gewonnenen Zellen untereinander hohe Abweichungen aufweisen. Jedoch zeichnet sich der Gebrauch von primären Keratinozyten, trotz der großen Variabilität der Ergebnisse, für den menschlichen Organismus als deutlich repräsentativer aus als die HaCaT-Zelllinie. Um einen möglichst genauen Einblick in die Reaktion von Keratinozyten auf die Einbringung von DNA in die Zellen zu erhalten, wurden die Versuche der vorliegenden Arbeit an HaCaT-Zellen und primären humanen Keratinozyten durchgeführt. Die Ergebnisse der Analyse der Grundexpression inflammatorischer Zytokine und Rezeptoren der angeborenen Immunabwehr repräsentiert eine grundsätzliche Verwendbarkeit beider Zellkulturen für die Untersuchung der molekularen Abläufe bei der Detektion adenoviraler DNA. 86 Diskussion Die Verwendung der HaCaT-Zelllinie erwies sich jedoch aufgrund der stärkeren Immunantwort sowie der geringeren Variabilität der Ergebnisse als vorteilhafter gegenüber dem Gebrauch von primären Keratinozyten. Im Gegensatz zu der Verwendung von Zelllinien besitzt der Gebrauch von Primärzellen eine deutlich stärkere klinische Relevanz. Diese Befunde wurden auch in einer Studie von Köllisch et al. beschrieben: In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit wurde in Folge einer LPS-Stimulation von HaCaT-Zellen ebenfalls eine im Vergleich zu primären Keratinozyten deutlich stärker ausgeprägte Immunantwort beobachtet [147]. In dem zu Beginn der vorliegenden Studie generierten Profil der basalen Expression von Zytokinen lag eine konstitutive Expression von IFN-α und -β, IL1α, -1β, -6, -8 und TNFα sowohl in HaCaT Zellen als auch in primären Keratinozyten vor. Bei einem Vergleich der gewonnenen Daten mit der Literatur stellte eine sich eine ebenfalls überwiegend an immunologisch spezialisierten Zellen beschriebene Expression dieser Faktoren dar. Bezüglich der Zytokinsynthese in Keratinozyten beschrieben Arlian et al. ebenfalls die Expression von IL-1α, -1β, -6 und -8 in primären humanen Keratinozyten auf Proteinebene. TNFα wurde im Gegensatz zu den hier vorliegenden Ergebnissen nicht detektiert [148]. Eine Expression von IFN-α und -β sowie IRF-3 und -7 in primären Keratinozyten wurde durch Oldak et al. beschrieben [149]. Darüber hinaus wurden auch die Expression von Mitgliedern der RLR-Familie (RIG-I, mda5) sowie Inflammasom-bildende Komponenten (NALP3, AIM2, Caspase-1) in Keratinozyten nachgewiesen [150154]. Die Gruppe der TLRs ist die in der Literatur am umfangreichsten beschriebene Gruppe von PRRs. Die Expression von TLRs in Keratinozyten wurde von verschiedenen Arbeitsgruppen analysiert. Mit Ausnahme von TLR-8 wurden alle DNA- und RNA-detektierenden TLRs (TLR-3, -7, -8, und -9) sowohl in vorherigen als auch in der vorliegenden Studie nachgewiesen [155-157]. Im Gegensatz dazu war in der Literatur keine Angabe über die in der vorliegenden Studie belegte Expression des DNA-Rezeptors DAI (DLM-1/ZBP1) zu finden. In Übereinstimmung mit der bisher publizierten Literatur zeigen die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Keratinozyten ein den spezialisierten Zellen der Immunabwehr vergleichbar ausgeprägtes Netzwerk an Rezeptoren und Signalwegen für die Erkennung von Nukleinsäuren diverser pathogener Mikroorganismen. 87 Diskussion 4.2.2 Vergleich der adenoviralen Transduktion und Transfektion Unterschiedliche Studien diskutierten bislang die adenovirale DNA als einen der Hauptfaktoren bei der Induktion einer adenoviral induzierten Immunreaktion [61]. Selbst gutless-Vektoren, bei denen alle viralen Gene deletiert wurden, zeigen eine vergleichsweise hohe Immunogenität [35]. Dies deutet auf eine Induktion der Immunreaktion durch zytoplasmatische Lokalisation von DNA in der Zelle hin. Dieser Sachverhalt wurde bisher jedoch nicht an Keratinozyten untersucht. Daher sollte im Rahmen der vorliegenden Studie eine vergleichende Untersuchung der Auswirkung einer Transfektion von Keratinozyten mit nackter, adenoviraler DNA sowie eine Transduktion dieser Zellen mittels eines adenoviralen Vektors erfolgen. Bei einem Vergleich der adenoviralen Transduktion und Transfektion von Keratinozyten lag eine signifikant höhere Effizienz der Transduktion vor. Nach Infektion der Zellen mit 1010 IU adenoviraler Vektoren fand sich der Reporter in nahezu allen in der Kultur vorhandenen Zellen (83 % (HaCaT) bzw. 92 % (HKC)). Im Gegensatz dazu lag bei Transfektion der Zellen mit einer äquivalenten Dosis adenoviraler DNA eine signifikant geringere Anzahl GFP-positiver Zellen vor. Die quantitative Analyse der GFP-mRNA-Expression in den Zellen verzeichnete eine ebenfalls signifikant höhere Expression des Reporters. Dabei fand sich nach Transduktion der Zellen eine 2580-fach (HaCaT) bzw. 398-fach (HKC) höhere Konzentration von GFP-mRNA im Vergleich zu einer Transfektion. Im Hinblick auf die Analyse der Zytokinexpression lag nach Transfektion der Keratinozyten eine lediglich 15 - 30 % geringere Expression von Typ-I-Interferonen im Vergleich zur Transduktion der Zellen mit 1,1x1010 IU vor, in primären Keratinozyten sogar eine um 36 % höhere Expression von IFN-β. Unter Berücksichtigung der Transfektionseffizienzen fand sich eine vergleichsweise starke Auswirkung auf die Expression von Typ-I-IFN nach Stimulation der Zellen mit adenoviraler DNA. Dies wiederum bestätigt die bereits durch Nociari et al. nach adenoviraler Stimulation von Makrophagen beschriebene Immunogenität der adenoviralen DNA [51]. Ausgehend von den vorherigen Ergebnissen sowie der in der Literatur dargestellten Immunogenität der adenoviralen DNA [51, 80, 158] wurde in der vorliegenden Studie im Weiteren die Auswirkung der adenoviralen DNA auf die Immunreaktion in Keratinozyten untersucht. Dafür wurde zunächst ein zeitlicher Verlauf der Zytokinexpression nach Transfektion adenoviraler DNA in 88 Diskussion Keratinozyten erstellt. Dabei fand sich ein interessanter Verlauf der Zytokinexpression. In der HaCaT-Zelllinie wurde nach zwölf Stunden eine maximale Expression von IFN-α gefolgt von einem Maximum der IFN-β Expression nach 15 Stunden detektiert. 24 Stunden nach Transfektion erfolgte die Induktion von Interleukin-1α, -6, -8 und TNFα. In primären Keratinozyten lag die gleiche Abfolge jedoch in kürzeren Zeitabständen vor. Die maximale Expression von IFN-α wurde hier bereits nach drei Stunden detektiert, gefolgt von IFN-β, IL-1α, -6, -8 und TNFα nach sechs Stunden. Dieser Verlauf bestätigt die besondere Rolle von Typ-I-IFN in der antiviralen Immunabwehr. Aufgrund der passiven und aktiven Rolle dieser Zytokine bei der Bekämpfung der Adenoviren in der Zelle ist deren frühe Induktion ein bedeutender Bestandteil der angeborenen Immunantwort gegen die Adenoviren [35]. Demzufolge wurde der Schwerpunkt der Untersuchungen in der vorliegenden Arbeit auf die Induktion von Typ-I-Interferonen gelegt. Die Induktion von IFN-β war im Vergleich zu der Expression von IFN-α signifikant höher ausgeprägt. Für die Versuche der vorliegenden Arbeit wurden daher entsprechende Inkubationszeiten korrelierend zu dem Zeitpunkt der maximalen Induktion von IFN-β gewählt (HaCaT: 15 Stunden; HKC: 6 Stunden). Im Gegensatz zu Dendritischen Zellen und Makrophagen ist die IFN-α/β Expression in Keratinozyten weniger stark ausgeprägt. Nociari et al. berichten von einem 25fachen Expressionsanstieg von IFN-α und einem 4000-fachen Anstieg von IFN-β in Makrophagen, wobei eine hohe DNA-Konzentration von 10 μg/ml Medium eingesetzt wurde [51]. In der vorliegenden Arbeit lag die maximale Induktion von IFN-β in HaCaT-Zellen bei 129,75-facher Induktion, in primären Keratinozyten bei 2,07-facher Induktion. Auch die in diesen Versuchen generierten Daten der IL-6 Expression in HaCaT-Zellen (93,83-fach) liegen deutlich über dem 50-fachen Anstieg in Makrophagen [51]. In primären Keratinozyten (4,60-fach) fand sich dies im Gegensatz dazu jedoch nicht. Verglichen mit den Unterschieden zwischen den Expressionswerten der Typ-I-Interferone deutet dies gegenüber den Makrophagen auf eine starke Expression von IL-6 in HaCaT-Zellen hin. Jedoch handelt es sich bei den transfizierten Makrophagen um Primärzellen, wohingegen in der HaCaT-Zellkultur überwiegend stark proliferierende Zellen mit hoher Stoffwechselrate vorhanden sind. Im Vergleich mit der IL-6 Expression primärer Keratinozyten fiel die Induktion 89 Diskussion dieses Zytokins in Makrophagen deutlich stärker aus. In einer Studie von Wu et al. wurde eine 1,8-fache Induktion von IL-6 in humanem Lungengewebe nachgewiesen [110]. Jedoch erfolgte hier eine Infektion ganzer Gewebestücke mit 109 IU Adenoviren (entspricht circa 0,45 μg DNA). Daher können diese Daten nicht direkt auf die Ergebnisse der Infektion von Zellkulturen übertragen werden. In derselben Studie wurde ebenfalls ein 2-facher Anstieg von IL-8 nach Adenovirusstimulation beschrieben. Dieser Wert liegt deutlich unter dem in der vorliegenden Arbeit erhobenen 36,8-fachen Anstieg in HaCaT-Zellen, war jedoch durchaus mit der Expression von Primärzellen (2,7-fach) zu vergleichen. Das Zytokin TNFα, in der vorliegenden Studie auf 49,2-fach (HaCaT) und 7,5-fach (HKC) induziertem Level nachgewiesen, war in Makrophagen 10-fach erhöht exprimiert [51]. Leider war keine Literatur anderer Arbeitsgruppen über die Expression von IL-1α nach Transfektion von Zellkulturen mit adenoviraler DNA aufzufinden. Die meisten vergleichbaren Publikationen beschrieben die Analyse dieser Zellen nur auf Proteinebene, welche keine Rückschlüsse auf die genaue Transkriptionsrate erlaubte. Um eine Aussage über die Expression antiinflammatorischer Zytokine machen zu können, wurde versucht, die Expression von IL-10 in Keratinozyten zu bestimmen. Dieses wurde jedoch weder in HaCaTnoch in HKC-Zellen spezifisch nachgewiesen. Demnach ruft in das Zytoplasma von Keratinozyten übertragene DNA sowohl in vitro als auch in vivo eine deutliche Entzündungsreaktion hervor. Diese ist mit der Reaktion von spezialisierten Zellen der Immunabwehr vergleichbar, unterscheidet sich jedoch deutlich in der Stärke der Expression inflammatorischer Faktoren. Bei einem Vergleich der in vivo und in vitro Versuche der vorliegenden Arbeite lag die Zytokinexpression in Keratinozyten in vitro auf einem vergleichbaren Niveau wie die Expressionsdaten der in den athymischen Tieren generierten Daten vor. Die Expressionswerte der immunkompetenten Tiere in vivo verdeutlichen darüber hinaus die Bedeutung der T-Zellen bei der Bekämpfung der adenoviralen Infektion. Dennoch legen die bisherigen Daten dieser Studie die Befähigung von Keratinozyten zur Induktion einer angeborenen Immunantwort in Folge eines adenoviralen Gentransfers dar. 90 Diskussion 4.3 Adenoviraler Gentransfer in einem ex vivo Hautspannmodell Zweidimensionale Modelle für die Kultivierung und Transfektion von Keratinozyten bieten diverse Vorteile bei der Untersuchung der Auswirkungen eines adenoviralen Gentransfers. Dazu gehören die leichte und kontrollierte Handhabung der Zellen, die Möglichkeiten der Verwendung von in der Fachliteratur definierten Zelllinien sowie die hohe Reproduzierbarkeit der Versuche. Bei der Verwendung dieser Modelle werden Faktoren wie die Interaktionen von Zellen in einem dreidimensionalen Gewebeverband jedoch nicht berücksichtigt. Des Weiteren sind in gesunder Vollhaut neben den Keratinozyten auch andere Zellen wie zum Beispiel Melanozyten, Merkelzellen, Fibroblasten und spezialisierte Zellen des Immunsystems, die Langerhans-Zellen, vorzufinden [159]. Insbesondere die Anwesenheit der Langerhans-Zellen könnte zu deutlichen Abweichungen der Reaktionen humaner Vollhaut auf einen Gentransfer führen [58]. Aufgrund der daraus resultierenden geringen Übertragbarkeit von Ergebnissen zweidimensionaler Zellkulturmodelle auf die Reaktion von Zellen in einem dreidimensionalen Gewebeverband war ein geeignetes Modell für die Untersuchungen der vorliegenden Studie erforderlich. Bereits 1998 wurde von Moll et al. die Organkultur als optimales System für die Untersuchung komplexer biologischer Aspekte unter Ausschluss systemischer Einwirkungen beschrieben [160]. Die Kultur humaner Vollhaut ist vielleicht die einzige Technik, um die Komplexität der Physiologie des Hautgewebes ex vivo zu untersuchen und somit die Kluft zwischen Anwendungen in Labor und Klinik zu überwinden. In bisherigen Modellen wurden Hautexplantate überwiegend in kleine Stücke geschnitten, um eine übermäßige Kontraktion des Gewebes zu verhindern [160-162]. Diese wurden daraufhin ohne jede Spannung in entsprechende Kulturmedien gegeben [160-162]. Dieser Ansatz minimierte jedoch aufgrund der geringen Größe der Explantate die Möglichkeiten für die Durchführung interventioneller Studien. Neben der Verwendung von Hautexplantaten wurden auch zahlreiche Studien an rekonstruierten Hautäquivalenten durchgeführt [163-165]. Die wichtigsten Nachteile für die Verwendung von diesen künstlich hergestellten Hautpräparaten liegen in den enormen Kosten der Produktion. Darüber hinaus ermöglichen native Hautpräparate einen repräsentativeren Einblick in den zu untersuchenden Sachverhalt. Aus diesen Gründen wurde im Laufe der vorliegen- 91 Diskussion den Arbeit ein Modell für die ex vivo Kultivierung von humaner Vollhaut entwickelt. Dieses sollte eine standardisierte Analyse der Auswirkungen eines Gentransfers in gesunder und infizierter humaner Vollhaut ermöglichen. Für die ex vivo Kultivierung der Haut wurde auf ein in der Arbeitsgruppe etabliertes Modell zurückgegriffen [131]. Dabei handelt es sich um eine Edelstahlkammer, welche eine Kontraktion der darin fixierten Haut verhindert. Des Weiteren werden die physiologischen Bedingungen der Haut durch eine Phasengrenze von Umgebungsluft an der epidermalen und Flüssigkeit an der dermalen Seite des fixierten Gewebes repräsentiert. Die Phasengrenze unterstützt die Ausdifferenzierung von Keratinozyten und trägt zu der Erhaltung einer intakten Barrierefunktion der Explantate bei [166]. Daher ist es, im Gegensatz zu anderen Ansätzen der ex vivo Kultivierung, mit Hilfe dieses Modells möglich, humane Vollhaut ex vivo über einen längeren Zeitraum zu kultivieren. In einer Studie von Steinstraesser et al. wurde nach einer Inkubation von 28 Tagen eine intakte Hautstruktur mit proliferierenden Zellen nachgewiesen [131]. Das ex vivo Vollhaut-Transduktionsmodells wurde für die Untersuchung der adenoviral induzierten Immunreaktion in humaner Vollhaut herangezogen. Dazu erfolgte eine Transduktion der Explantate mit 1x1010 IU Ad-GFP gefolgt von einer Inkubation über einen Zeitraum von drei bis 96 Stunden. Nach der Aufarbeitung der Explantate fand sich zwölf Stunden nach Transduktion eine 7,2-fache bis 12,5fache Induktion der Zytokinexpression. Im Vergleich zu den in vitro Versuchen lag hier eine leicht höhere Intensität der Zytokinexpression vor. Diese höhere Induktion ist durch eine hohe Wahrscheinlichkeit des Vorhandenseins spezialisierter Immunzellen, wie zum Beispiel Dendritische Zellen, zu erklären. Interessanterweise trat bei allen Zytokinen 96 Stunden nach Transduktion des Gewebes ein zweiter Anstieg der Zytokinexpression auf. Dieser Verlauf der erneuten Induktion wurde auch bei der Messung des Zeitverlaufes der Zytokinexpression in vitro detektiert [121, 130]. Eine Erklärung für diese Daten wäre die auto- und parakrine Wirkung der Zytokine. Dabei erfolgt eine Rückkopplung der Zytokininduktion über eine Reihe membranständiger Rezeptoren. Die im Verlauf der Immunreaktion sezernierten Zytokine interagieren mit spezifischen, in der Zellmembran umliegender Zellen lokalisierten Zytokinrezeptoren. Dies wiederum aktiviert eine JAK/STAT-abhängige Signaltransduktion in dieser Zelle und führt somit zu einer 92 Diskussion erneuten Induktion der Zytokinexpression im Zellkern (Abbildung 1.6) [59, 167, 168]. Bei einem Vergleich mit der Fachliteratur waren keine vergleichbaren Arbeiten vorzufinden. Die wenigen Publikationen bezüglich der Transduktion humaner Vollhaut ex vivo beschäftigen sich überwiegend mit der Expression therapeutischer Peptide und weniger mit der vektorinduzierten Immunreaktion des Gewebes [169-171]. Grundsätzlich wurde in den bisherigen Versuchsteilen ein erster Einblick in die adenoviral induzierte Induktion der angeborenen Immunantwort im Zuge eines adenoviralen Gentransfers gewonnen. Die Daten verdeutlichen das Potential von Keratinozyten Adenoviren zu erkennen und eine Immunantwort zu induzieren. Sowohl ex vivo als auch in vitro fand sich infolge einer Transfektion der Zellen eine Induktion der Zytokinexpression. Besonders die beschriebene Zytokininduktion in Verbindung mit einer T-Zell-unabhängigen Reduktion der Reporterkonzentration in athymischen Mäusen untermauern diese Aussage. Der in den in vitro Versuchen generierte Zeitverlauf stellt eine Untergliederung der angeborenen Immunreaktion in zwei unterschiedliche Phasen nach Eintritt der viralen Vektoren in die Zellen dar. Die erste wird durch eine frühe Expression von Typ-I-Interferonen repräsentiert, welche auf der einen Seite in Form einer Proteinkinase R (PKR)-induzierten Phosphorylierung des Translationselongationsfaktor 2α (elF2α) und dadurch bedingter Inhibierung des Translationsmechanismus der Zelle direkt gegen die virale Infektion wirken und außerdem auch an der Induktion weiterer Zytokine beteiligt sind [35]. Darüber hinaus erfolgt eine Induktion eines breiten Spektrums von inflammatorischen Interleukinen und Chemokinen, welche eine wichtige Rolle bei der Induktion der angeborenen, aber auch bei der systemischen Aktivierung der adaptiven Immunreaktion spielen. Im Vergleich zu der durch spezialisierte Zellen des Immunsystems induzierten Expression dieser Zytokine spielen Keratinozyten eine eher geringere Rolle. In der Gesamtheit der Barrierefunktion dieses Zelltyps sind die Keratinozyten im Falle eines Kontaktes mit invasiven Pathogenen jedoch von enormer Bedeutung und können direkt gegen diese wirken. Diese Funktion stellt auch bei der Evaluation eines adenoviralen Gentransfers einen limitierenden Faktor für die erfolgreiche Applikation adenoviraler Vektoren dar. Die genauere Beschreibung molekularer Abläufe bei der Detektion adenoviraler Nukleinsäuren 93 Diskussion in Keratinozyten sind somit von großer Bedeutung für die erfolgreiche Anwendung eines kutanen Gentransfers. Jedoch waren die an der Immunantwort beteiligten Signaltransduktionsmechanismen weitgehend unbekannt und wurden deshalb in der vorliegenden Arbeit näher untersucht. 4.4 Signaltransduktion nach adenoviraler Stimulation Zahlreiche Studien bezüglich der Stimulation unterschiedlicher Zelltypen mit DNA diverser Mikroorganismen wurden bisher durchgeführt. So zum Beispiel diskutieren verschiedene Arbeitsgruppen eine besondere Rolle von TLRs, RLRs, dem DNA-bindenden Protein DAI sowie Inflammasom-bildenden Rezeptoren AIM2 und NALP3 in Makrophagen, Dendritischen Zellen und Fibroblasten [51, 65, 79, 84, 89, 100, 172-175]. Hinsichtlich der Signaltransduktion nach adenoviraler Transduktion oder Transfektion von Keratinozyten waren in der Literatur keine Daten auffindbar. In bisherigen Studien bezüglich der Signaltransduktion von Keratinozyten wurde überwiegend die TLR-abhängige Induktion der Immunantwort infolge einer Infektion mit Bakterien oder Pilzen untersucht [176-178]. Durch die Verwendung von chemischen Inhibitoren für die verschiedenen Signalwege wurden im Zuge der vorliegenden Arbeit die molekularen Abläufe der Signaltransduktion des angeborenen Immunsystems nach adenoviraler Infektion dargestellt. Hierbei wurde eine signifikante Reduktion der Zytokinexpression sowohl in HaCaT-Zellen als auch in HKC-Zellen nach Inhibierung des JAK/STATSignalweges registriert. Die Beteiligung des JAK/STAT-Signalwegs lässt sich durch dessen zytokininduzierte Aktivierung erklären. Dabei erfolgt eine auto- und parakrine Interaktion von Zytokinen mit in der Membran der Zellen lokalisierten Zytokinrezeptoren über den JAK/STAT-Signalweg [30, 167, 168, 179]. Des Weiteren wurde ebenfalls eine signifikante Reduktion der Zytokinexpression nach der Blockierung von NFκB nachgewiesen. Die Behandlung der Zellen mit dem Inhibitor für NFκB führte zu einer Reduktion der Zytokinexpression von bis zu 93,04 % (6,96 % Restexpression) und stellt daher eine essentielle Rolle dieses Schlüsselmoleküls in der adenoviral induzierten Immunantwort dar. Dies lag aufgrund der bisher beschriebenen Rolle von NFκB im Rahmen der Erwartungen zu diesem Versuchsteil, denn dieser Transkriptionsfaktor nimmt eine Schlüsselrolle bei Induktion der Genexpression inflammatorischer Zytokine in nahezu allen für die 94 Diskussion Erkennung von Nukleinsäuren beschriebenen Signaltransduktionswegen ein. Hierzu gehören die TLR- und RLR-abhängigen Signalswege und der DNA-bindende Rezeptor DAI [30]. Der interessanteste Befund dieses Versuchsteils bezieht sich jedoch auf die Zytokinexpression nach Blockade von p38 MAPK, JNK und Erk2. Die Aktivierung der Proteine p38 MAPK und JNK wird sowohl durch den TLR-Signalweg als auch durch RLR-induzierte Signaltransduktion ausgelöst. Der Faktor Erk2 hingegen wird nur durch die TLR-vermittelte Signalweiterleitung aktiviert [30]. Eine Interaktion dieses Schlüsselmoleküls mit dem RLR-Signalweg wurde bisher noch nicht beschrieben (Abbildung 4.1). Nach Inhibierung der oben genannten Schlüsselmoleküle lag eine signifikante Reduktion der Zytokinexpression in JNKund p38 MAPK-inhibierten Proben vor. Im Gegensatz dazu führte die Blockierung von Erk2 zu keinem Effekt auf die untersuchten Faktoren. Eher fand sich eine Induktion der Genexpression von IFN-α, IFN-β und IP-10. Diese Erk2-unabhängige Zytokininduktion deutet auf eine RLR-vermittelte Induktion der angeborenen Immunantwort nach Kontakt mit der adenoviralen DNA hin [30]. Im Gegensatz dazu scheint der TLR-Signalweg, welche in der Vergangenheit als einer der wichtigsten Signalwege für die Erkennung von Pathogenen diskutiert wurde, aufgrund der mangelnden Aktivierung von Erk2 eine eher untergeordnete Rolle zu spielen [45, 51, 81, 82, 85, 123, 180]. Bestätigt wird dies durch die Expressionsprofile der TLRs und RLRs in HaCaT-Zellen. Bei der Analyse der RLRs fand sich eine signifikante Induktion von RIG-I (8fach), mda5 (52-fach) sowie dem RLR-abhängigen Adaptermolekül STING (2,23fach). In Bezug auf die Induktion der TLRs (maximal 5,3-fache Induktion in HaCaT-Zellen) lag bei mda5 eine zehnfach stärkere Expression (52-fache Induktion) vor. Dies unterstützt auch die mittels chemischer Inhibitoren generierten Daten der Erk2-unabhängigen Induktion der Zytokinexpression. In primären Keratinozyten hingegen trat jedoch keine signifikante Induktion dieser Faktoren auf. Aufgrund der hohen Variabilität der in HKC-Zellen generierten Ergebnisse war es jedoch schwierig, signifikante Daten der Zytokinexpression darzustellen. Um mit Hilfe der Primärzellen signifikante Versuchsergebnisse zu erlangen, wäre eine deutlich größere Probenanzahl nötig, was jedoch im Rahmen der vorliegenden Studie aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit dieser Zellen nicht möglich war. 95 Diskussion Abbildung 4.1: Toll-like und RIG-like Rezeptor abhängige Signaltransduktion. Sowohl TLRs (links) und RLRs (rechts) zeigen eine Interaktion mit den Faktoren p38 MAPK, JNK, JAK/STAT, IRF-3 und IRF-7. Eine Aktivierung von Erk2 (rot) hingegen wurde bisher nur für TLRs beschrieben. Die im Gegensatz zu der Induktion des RLRs mda5 in HaCaT-Zellen eher moderate Expression von TLRs wies eine Induktion von TLR-3 in HaCaT- und HKC-Zellen auf. Das TLR-3-abhängige Adaptermolekül TRIF [67] wurde weder in HaCaT- noch in HKC-Zellen induziert, was jedoch gegen eine TLR-3-abhängige Induktion der Zytokinexpression spricht. Außerdem handelt es sich bei TLR-3 um einen RNA-detektierenden Rezeptor. Für die Erkennung von adenoviraler DNA sollte lediglich TLR-9 einer deutliche Regulation aufweisen. Eine Expression von TLR-9 fand sich zwar in HKC-Zellen, jedoch nicht HaCaT-Zellen. Eine Induktion des TLR-abhängigen Adaptermolekül MyD88 wurde darüber hinaus in HaCaTZellen und in HKC-Zellen dargestellt. Jedoch ist die Induktion in HKC-Zellen verhältnismäßig gering, sodass nicht von einer Aktivierung dieses Adaptermolekül auszugehen ist. Auch diese Daten stimmen somit nicht mit der These der TLRabhängigen Zytokininduktion überein. Neben einer Induktion des RLRs mda5 fand 96 Diskussion sich des Weiteren auch für das DNA-bindende Protein DAI eine, im Gegensatz zu den TLRs, starke Induktion der Genexpression (24-fach) in HaCaT-Zellen. Dies würde die Bedeutung von NFκB als Schlüsselfaktor der Immunreaktion zusätzlich verdeutlichen. Ein weiteres Rezeptorsystem, die Inflammasomen, wurde in der vorliegenden Arbeit bisher jedoch noch außer Acht gelassen. Dabei handelt es sich um einen Komplex spezifischer Rezeptoren wie NALP3 oder AIM2, welche zusammen mit einem Adaptermolekül ASC und Caspase-1 eine Prozessierung von pro-IL-1β und pro-IL-18 in deren aktiven Formen katalysieren. Die Inflammasomen haben jedoch keinen direkten Einfluss auf die Genexpression und sind lediglich an der Prozessierung von Zytokinen beteiligt. Daher wurde mittels der chemischen Inhibitoren keine direkte Aussage über deren Beteiligung an der Immuninduktion gemacht. Primäre Keratinozyten wiesen in dieser Studie eine verhältnismäßig starke Induktion von NALP3 auf. Mit einer 2,3-fachen Induktion wurde für NALP3 die für diesen Zelltyp höchste Induktion ermittelt. Außerdem wurden auch der Rezeptor AIM2 und IL-1β in diesen Zellen deutlich reguliert. Noch stärker traten diese Effekte in HaCaT-Zellen zum Vorschein. Für AIM2 lag hier ebenfalls eine signifikante Induktion (36,8-fach) vor. Auch für Caspase-1 fanden sich in diesen Zellen signifikant erhöhte Werte. Fernerhin lag IL-1β, welches durch die Caspase-1 prozessiert wird, ebenfalls messbar induziert vor. Abbildung 4.2: HIN-200-Proteine. Vergleich funktioneller Domänen von Proteinen der HIN-200-Proteinfamilie (nach Hornung et al. [90]). In einer Studie von Hornung et al. wurden in silico weitere Proteine, welche ebenfalls wie AIM2 eine DNA-bindende HIN-200-Domäne aufweisen, charakterisiert (Abbildung 4.2). In den potentiellen Zielproteinen sollte auch eine für die 97 Diskussion Aktivierung des Inflammasomen-abhängigen Adaptermoleküls ASC essentielle Pyrin-Domäne in den gesuchten Proteinen vorhanden sein. Mit Hilfe der vorliegenden Studie wurden somit drei weitere, potentielle DNA-Rezeptoren identifiziert (IFIX, IF16 und MNDA) [90]. Aufgrund dieser strukturellen Eigenschaften wurde eine Beteiligung dieser Proteine bei der Bildung von Inflammasomenkomplexen nicht ausgeschlossen. Daher wurden diese Proteine ebenfalls als potentielle DNARezeptoren im Verlauf der vorliegenden Arbeit untersucht. Dabei fand sich 24 Stunden nach Transfektion der Zellen auch für zwei dieser Proteine eine leichte Induktion, eine bis zu 5-fach höhere Expression. Aufgrund der späten Induktion der Genexpression dieser Faktoren sowie der geringen Intensität der Induktion hinsichtlich der starken Regulation von AIM2, mda5 und DAI wurden diese Proteine nicht weiter untersucht. Jedoch wäre dies ein weiterer, interessanter Ansatzpunkt für nachfolgende Studien. Eine Analyse der aus den Keratinozyten gewonnenen Expressionsprofile erlaubt zwar eine tendenzielle Einschätzung der molekularen Mechanismen der Immuninduktion, eine feste Aussage über die Beteiligung der oben dargestellten Rezeptoren kann jedoch nur durch eine gezielte Inhibierung dieser Faktoren getroffen werden. Eine siRNA-vermittelte Inhibierung der Genexpression von AIM2, NALP3, mda5 und DAI führte, unter Berücksichtigung der ermittelten Effizienzen der siRNA, zu einer reduzierten Expression von Typ-I-IFN in allen Proben. Die anhand dieser Daten stärkste Reduktion wird durch die Inhibierung Inflammasomen-bildender Komponenten AIM2 und NALP3 sowie des Rezeptors DAI ausgelöst. Der Rezeptor mda5 spielt, daran gemessen, eine weniger starke Rolle bei der Induktion einer Immunantwort. Die Transduktion von zuvor mit siRNA behandelten HaCaT-Zellen resultierte in einer signifikanten Verstärkung der GFP-Fluoreszenz in zuvor mit AIM2-, NALP3- und mda5-siRNA behandelten Proben. Mit einer Signifikanz von p=0.0902 wurde auch durch die Inhibierung des Rezeptors DAI eine nicht zu vernachlässigende Wirkung auf die Transgenexpression nach Transduktion der Zellen erzielt. Besonders in Anbetracht der vergleichsweise geringen Effizienz der anti-DAI-siRNA deuten die vorliegenden Daten auf eine Beteiligung dieses Rezeptors bei der Erkennung der adenoviralen DNA hin. Anhand der Daten der vorliegenden Arbeit können somit konkrete Aussagen über die Immunreaktion in Keratinozyten nach adenoviraler Stimulation ge- 98 Diskussion troffen werden. Unter Berücksichtigung der zu diesem Thema publizierten Literatur deuten die Daten auf einen multifaktoriellen Prozess bei der Induktion der Immunreaktion hin. Mittels siRNA-vermittelter Inhibierung der Genexpression von AIM2 und NALP3 fand sich eine eindeutige Funktion der Inflammasomen in der Immunreaktion. In einer aktuelle Studie von Unterholzner et al. [101] wurde die Rolle des IF16, IFIX und MNDA diskutiert. Eine Beteiligung dieser Faktoren, insbesondere IF16, wurde in der vorliegenden Arbeit nicht ausgeschlossen. Im Vergleich zu der Induktion der Genexpression von mda5 und DAI wurde diesen Faktoren jedoch nur eine geringe Beteiligung an der Detektion der adenoviralen DNA zugesprochen. Da Inflammasomen keine direkte Einwirkung auf die Genexpression haben, sondern nur an der Prozessierung von IL-1β und IL-18 beteiligt sind, ist ein Zusammenspiel dieser Rezeptoren mit weiteren Rezeptoren, welche wiederum die Expression von IL-1β und IL-18 auslösen, sehr wahrscheinlich. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit belegen eine Beteiligung von mda5 und DAI, welche wiederum bei der Induktion einer Zytokinexpression über den NFκB Signalweg eine bedeutende Rolle spielen. Die von Takaoka et al. [83] beschriebene Rolle von DAI als Rezeptor für bakterielle, Kalbsthymus- und synthetische DNA (Poly(dA:T), poly(dG:C)) in Fibroblasten wurde auch in der vorliegenden Studie für die Transfektion adenoviraler DNA in Keratinozyten dargestellt. Laut Literatur führt die Aktivierung von DAI einerseits zu einer TBK-1-abhängigen Aktivierung von IRF-3 und -7 und darüber hinaus zu einer Aktivierung von NFκB durch RIP-1 und RIP-3 [83, 107]. Die Daten der erhöhten Expression von DAI sowie die Auswirkung auf die Expression von Typ-I-Interferonen nach Inhibierung von NFκB und DAI deuten ebenfalls auf die Aktivierung dieser Signalkaskade nach adenoviraler Infektion hin. Interessanterweise lag in den durchgeführten Experimenten eine Beteiligung der RLRs, insbesondere von mda5, vor. Eine Aktivierung der RLR-Kaskade wird durch die mittels chemischer Inhibierung der Signaltransduktion generierten Daten deutlich unterstützt. Der Grund hierfür ist die Interaktion der RLRs mit Schlüsselfaktoren wie p38 MAPK, JNK und NFκB, nicht aber mit Erk2 [30]. Ein dieser These widersprechender Aspekt ist die bisher diskutierte Rolle der RLRs in der angeborenen Immunabwehr. Im Gegensatz zu DAI oder AIM2 und NALP3 handelt es sich bei den RLRs um RNA-detektierende Rezeptoren [35, 84, 174], 99 Diskussion welche prinzipiell nicht durch DNA aktiviert werden. Diese Daten deuten auf eine weitere, über der Detektion von RNA hinausgehende Rolle dieses Rezeptorsystems hin. Dies wurde bisher nur in einer weiteren Publikation beschrieben. Dalaloye et al. berichten in diesem Zusammenhang von einer mda5-abhängigen Induktion einer Immunreaktion nach Infektion von Monozyten mit einem DNA-Virus (modifizierter Vaccinavirus Ankara, MVA) [175]. Zudem beschrieben Choi et al. ebenfalls eine RLR-vermittelte Induktion von Typ-I-IFN in murinen Fibroblasten [181]. Der genaue Mechanismus der mda5-induzierten Immunreaktion wurde jedoch auch in dieser Studie nicht geklärt. Daher ist es dringend notwendig, die Rolle dieses Rezeptors bei der Detektion von DNA näher zu untersuchen. Bauernfeind et al. beschreiben als mögliche Erklärung die Erkennung der Transkripte A-T-reicher DNA-Sequenzen im Zytoplasma der Zelle [182]. Dies wäre jedoch aufgrund der geringen Zeitrahmens der Zytokininduktion in der Zelle eher unwahrscheinlich. Eine weitere mögliche Ursache für die mda5-vermittelte Immunreaktion könnten kleine, nicht für Proteine kodierende RNA-Moleküle sein. Diese sind in den Bereichen der spät exprimierten Regionen des adenoviralen Genoms lokalisiert, für die Hemmung der Aktivität der Proteinkinase R nach Infektion einer Zelle verantwortlich und werden in Mengen von bis zu 108 Kopien pro Zelle produziert [35]. Des Weiteren wurde eine Blockierung der durch RNA-Interferenz ausgelösten Regulationsmechanismen in der späten Phase der Replikation von Adenoviren durch diese RNA-Moleküle beschrieben. Diese Moleküle interagieren laut Literatur mit dem Protein Dicer, einem weiteren Mitglied der RLR-Familie [35, 84, 88]. Dieser Sachverhalt untermauert ebenfalls die These der RLR-induzierten Induktion der Immunantwort. Eine weitere Gruppe um Chiu et al. postuliert hingegen eine RNA-Polymerase III-abhängigen Mechanismus der Aktivierung von RLRs durch DNA [183]. Aufgrund der wenigen vorliegenden Informationen ist eine Analyse der genauen Mechanismen der mda5-vermittelten Erkennung adenoviraler DNA notwendig und wäre ein interessanter Ansatz für eine anschließende Studie. 100 Diskussion Abbildung 4.3: Zusammenspiel unterschiedlicher Rezeptoren. Die Aktivierung der Nukleinsäurerezeptoren mda5 und DAI bewirkt eine Induktion von proinflammatorischen Zytokinen und Typ-I-Interferonen. Diese wiederum lösen über spezifische Interferon- (IFNαR) und Zytokinrezeptoren eine auto- und parakrine Ausschüttung weiterer pro-inflammatorischer Faktoren aus (feedback-loop). Im Weiteren interagieren NALP3- und AIM2-Inflammasomen durch Prozessierung der pro-Formen bestimmter Interleukine (IL-1, IL-18) in deren aktive Formen in den inflammatorischen Prozess. Die Mechanismen und Reaktionen des angeborenen Immunsystem erstrecken sich über einer Vielzahl vernetzter Signalwege und Rezeptoren. Abbildung 4.3 zeigt eine mit Hilfe der vorliegenden Daten generierte Übersicht der Signaltransduktion nach adenoviraler Infektion von Keratinozyten. Dabei wird das enge Zusammenspiel der einzelnen Signalwege in der Zelle verdeutlicht. Die Erkennung der Adenoviren erfolgt über diverse Rezeptoren, wobei jeder einzelne eine bestimmte Rolle im Gesamtnetzwerk der Signalwege übernimmt. Eine Detektion über mda5 und DAI induziert unter anderem die Aktivierung von NFκB. Dies wiederum löst eine Zytokinexpression in der Zelle aus, wobei auch erhebliche Mengen von pro-IL-1β freigesetzt werden. Parallel dazu erfolgt eine Aktivierung der IL-1β prozessierenden AIM2- und NALP3-Inflammasomen [84, 91, 184]. Eine 101 Diskussion weitere Interaktion verläuft mittels Zytokine über entsprechende Zytokinrezeptoren. Dabei erfolgt eine Aktivierung sekundärer Signalwege wie JAK/STAT und infolgedessen eine Weitergabe der Signale an die umliegenden Zellen [30]. Anhand der vorliegenden Daten erscheint eine Optimierung des adenoviralen Gentransfers durch die Konstruktion von adenoviralen Vektoren, welche neben dem gewünschten Transgen ebenfalls ein entsprechendes siRNA-kodierendes Gen enthalten, als sinnvoll. Dabei wäre eine gezielte, siRNA-vermittelte Inhibierung von einem oder mehreren der in dieser Studie beschriebenen Rezeptoren AIM2, NALP3, mda5 oder DAI möglich. Die Stärke der siRNA-Expression könnte zusätzlich noch durch die Auswahl eines geeigneten Promoters oder der Bestückung des Vektors mit unterschiedlichen siRNAs gesteuert werden. Des Weiteren wäre eine gezielte Interaktion in die Expression von Typ-I-IFN denkbar, wodurch die antiadenovirale Immunreaktion potentiell vermindert werden könnte. 102 Zusammenfassung 5 Zusammenfassung Die menschliche Haut bildet einen hochspezialisierten Schutzwall gegenüber der Außenwelt und spielt eine wichtige Rolle als Barriere gegen pathogene Mikroorganismen. In Zeiten steigender Zahlen von antibiotikaresistenten Mikroorganismen sind großflächige Verletzungen der Hautstruktur aufgrund des Verlustes der Barrierefunktion mit einer hohen Morbidität und Mortalität verknüpft. Die Lokaltherapie mit wundheilungsfördernden Proteinen ist schwierig, da deren Herstellung kostenintensiv und die biologische Verfügbarkeit in der Wunde stark begrenzt ist. Eine innovative Alternative für die topische Applikation stellt der transiente kutane Gentransfer dar. Dabei werden die körpereigenen Zellen mittels genetisch modifizierter Adenoviren für die Überexpression des gewünschten Proteins umprogrammiert. Die bisher größte Hürde für eine erfolgreiche Anwendung dieser Vektoren ist deren hohe Immunogenität. In der Vergangenheit wurde die pro-inflammatorische Kapazität von Adenoviren kontrovers diskutiert und überwiegend an spezialisierten Zellen der Immunabwehr beschrieben. Im Gegensatz dazu war die Immunantwort nach kutanem Gentransfer bisher noch nicht im Detail untersucht worden. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Beschreibung der für die Reduktion der Transgenexpression verantwortlichen molekularen Mechanismen der angeborenen epithelialen Immunabwehr nach einem adenoviralen Gentransfer sowie die Bestimmung der Rolle von Keratinozyten bei diesem Prozess. Nach Transduktion immunkompetenter Mäuse mit einem für das Grünfluoreszierende Protein kodierenden adenoviralen Vektor wurde das Transgenprodukt über einen Zeitraum von 12 Tagen nachgewiesen. Eine Reapplikation derselben Vektordosis sowie eine Transduktion weiterer Areale führte zu einer in der Zeitdauer und Intensität deutlich eingeschränkten Nachweisbarkeit des Reporters. Dies deutet auf eine lokale und systemische Auswirkung der antiadenoviralen Immunreaktion hin. Die nahezu konstante Reporterfluoreszenz ab Tag 5 nach Retransduktion athymischer Mäuse verdeutlicht die Abhängigkeit der Immunreaktion vom T-Zellsystem der Tiere. Ein T-Zell-unabhängige, frühe Reduktion der Reporterfluoreszenz korrelierte mit einer Induktion der angeborenen Immunabwehr in Form einer Expression 103 Zusammenfassung von Zytokinen. Infolgedessen wurde eine deutliche Reduktion der GFP-mRNAKonzentration detektiert. Die Induktion der Zytokinexpression wurde sowohl in vivo als auch in vitro und ex vivo dargestellt. Ein Vergleich der Transduktion und Transfektion von Keratinozyten in vitro verdeutlichte das immunogene Potential der adenoviralen Nukleinsäuren und die Fähigkeit von Keratinozyten zur Induktion der angeborenen Immunabwehr. Die daran beteiligte Signaltransduktion war abhängig von NFκB und JAK/STAT. Die Zytokininduktion durch den p38 MAPKund JNK-Signalweg bei fehlender Involvierung von Erk2 deutet auf eine Beteiligung von RIG-like Rezeptoren bei der Zytokininduktion hin. Dies wurde mit Hilfe von siRNA-vermittelter Inhibierung der mRNA-Expression des RLRs mda5 bestätigt. Des Weiteren waren der DNA-Rezeptor DAI sowie die AIM2- und NALP3Inflammasomen involviert. Eine gezielte Regulation der mRNA-Expression von AIM2-, NALP3-, und mda5 führte zu einer signifikanten Induktion der Reporterfluoreszenz und könnte somit eine potentielle Strategie für die Optimierung des kutanen adenoviralen Gentransfers darstellen. 104 Summary 6 Summary Human skin forms a highly specialized protective shield against the outside environment and plays an important role as a physical barrier against pathogenic microorganisms. In times of rising numbers of antibiotic-resistant microorganisms, wide injuries of the skin structure are associated with high morbidity and mortality due to the loss of the barrier function. Local therapy with proteins that promote wound-healing is difficult, because their production is cost intensive, and the bioavailability in the wound is very limited. Transient cutaneous gene transfer may be an innovative alternative for the topic application of proteins. Thereby, the host cells are reprogrammed for an overexpression of such proteins using genetically modified episomal adenoviral vector systems. A major disadvantage for a successful clinical application of these vectors is their high immunogenicity. In the past, the pro-inflammatory capacity of adenoviral vectors was controversially discussed and predominantly attributed to specialized cells of the immune defense. However, the role of epidermal cells in immune response after cutaneous gene delivery remained unclear. The aim of this work was to evaluate the molecular mechanisms underlying transgene silencing after transient cutaneous adenoviral gene delivery and to determine the role of cutaneous cells in this process. After transduction of immunocompetent mice with an adenoviral vector encoding the green fluorescent protein, the transgene expression occurred over a period of 12 days. A reapplication of the same vector dose as well as a transduction of a distant location led to a decrease in duration and intensity of transgene expression. These findings indicate not only a local but also a systemic immune response against adenoviral vectors. In contrast, transduction of immunodeficient nude mice led to a consistent reporter transgene expression for over 20 days even after re-application, indicating a T-cell dependent mechanism of late adenoviral transgene silencing in wild-type mice. A T-cell independent, early reduction of reporter fluorescence starting from day 5 correlated with an induction of the innate immune defense in form of secretion of proinflammatory cytokines. The induction of the cytokine expression was demonstrated in vitro, ex vivo and in vivo. A comparison of transduction and transfection of keratinocytes in vitro 105 Summary clarified the enormous immunogenic potential of adenoviral nucleic acids. Moreover, a role of keratinocytes in inducing the innate immune defense through cytokine secretion was verified in this study. An investigation of signalling pathways potentially involved in adenoviral recognition revealed a participation of NFκB and JAK/STAT. Furthermore, cytokine induction was dependent on p38 MAPK and JNK activation, but was independent of Erk2. This indicates an involvement of RIG-like receptors (RLRs), which could be confirmed using siRNA-mediated inhibition of RLR mda5. An analysis of other receptor systems showed an involvement of DNA receptors DAI as well as the AIM2- and NALP3-inflammasomes in detection of adenoviral DNA. The data generated in this study establishes a clear association between DNA internalisation and induction of innate immunity in keratinocytes, resulting in a decreased efficacy of adenoviral gene delivery. These results encourage potential for a more effective gene delivery through modified interaction of adenoviral nucleic acids with cellular recognition sites. 106 Literatur 7 Literatur 1. Arndt, K.A., Cutaneous medicine and surgery: an integrated program in dermatology. (1996) Philadelphia: Saunders. 2. Braun-Falco, O., Dermatologie und Venerologie. 5. Auflage. (2005) Heidelberg: Springer. 3. Nemes, Z. and P.M. Steinert, Bricks and mortar of the epidermal barrier. Exp Mol Med. (1999) 31(1): p. 5-19. 4. Nemes, Z., B. Devreese, P.M. Steinert, J. Van Beeumen and L. Fesus, Crosslinking of ubiquitin, HSP27, parkin, and alpha-synuclein by gamma-glutamylepsilon-lysine bonds in Alzheimer's neurofibrillary tangles. FASEB J. (2004) 18(10): p. 1135-7. 5. Fensterl, V. and G.C. Sen, Interferons and viral infections. Biofactors. (2009) 35(1): p. 14-20. 6. Harder, J. and J.M. Schröder, Antimicrobial peptides in human skin. Chem Immunol Allergy. (2005) 86: p. 22-41. 7. Schröder, J.M. and J. 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Mikrobiologie 2. Molekulare Genetik 3. Biochemie 09/2001 – 09/2002: Lehrkraft der Schülerhilfe Meppen in den Fächern Mathematik, Physik, Chemie, Biologie 06/2001: Erlangung der allgemeinen Hochschulreife am Windhorst-Gymnasium Meppen 122 Publikationsverzeichnis Publikationsverzeichnis Originalarbeiten: Eigenanteile der für diese Promotionsarbeit relevanten Veröffentlichungen: A B C = Design der Studie; = Durchführung der Versuche; = Analyse und Interpretation der Daten Jacobsen F, Hirsch T, Mittler D, Schulte M, Lehnhardt M, Druecke D, Homann HH, Steinau HU, Steinstraesser L, Polybrene improves transfection efficacy of recombinant replication-deficient adenovirus in cutaneous cells and burned skin. J Gene Med. (2006) 8(2): p. 138-46. Kesting MR, Wolff KD, Mücke T, Demtroeder C, Kreutzer K, Schulte M, Jacobsen F, Hirsch T, Loeffelbein DJ, Steinstraesser L, A bioartificial surgical patch from multilayered human amniotic membrane - In vivo investigations in a rat model. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. (2009) 90(2): p. 930-8. Kesting MR, Loeffelbein DJ, Hasler RJ, Wolff KD, Rittig A, Schulte M, Hirsch T, Wagenpfeil S, Jacobsen F, Steinstraesser L, Expression profile of human beta-defensin 3 in oral squamous cell carcinoma. Cancer Invest. (2009) 27(5): p. 575-81. Steinstraesser L, Sorkin M, Niederbichler AD, Becerikli M, Stupka J, Daigeler A, Kesting MR, Stricker I, Jacobsen F, Schulte M, A novel human skin chamber model to study wound infection ex vivo. Arch Dermatol Res. (2010) 302(5): p. 357-65. A, B, C (100%) Steinstraesser L, Sorkin M, Jacobsen F, Al-Benna S, Kesting MR, Niederbichler AD, Otte JM, Hirsch T, Stupka J, Steinau HU, Schulte M, Evaluation of signal transduction pathways after transient cutaneous adenoviral gene delivery. BMC Immunol. (2011) 12: p. 8. A (100%), B (80%), C (100%) (d.h. alles ausgenommen Versuche zu Abbildung 5A und 5B) Loeffelbein DJ, Steinstraesser L. Rohleder NH, Hasler RJ, Jacobsen F, Schulte M, Schnorrenberg J, Hölzle F, Wolff KD, Kesting MR, Expression of host defence peptides in the lip vermillion mucosa during early infancy. J Oral Pathol Med. (2011) 40(8): p. 598-603. Kesting MR, Mueller C, Wagenpfeil S, Stoeckelhuber M, Steiner T, Bauer F, Teichmann J, Baumann CM, Barthel LC, Satanovskij, Muecke T, Schulte M, Schuetz K, Wolff KD, Rohleder NH, Quantitative comparison of the expression of antimicrobial peptides between the oral mucosa and extra-oral skin. Br J Oral Maxillofac Surg. (2012) 50(5): p. 447-53 Steinstraesser L, Hirsch T, Schulte M, Kueckelhaus M, Jacobsen F, Mersch EA, Al-Benna S, Stricker I, Afacan N, Jenssen H, Hancock REW, Kindrachuk J, Innate Defense Regulator Peptide 1018 in wound healing and wound infection. PLOS One. (2012) Artikel im Druck. Abstracts: Jacobsen F, Sorkin M, Schulte M, Daigeler A, Langer S, Gevers K, Rittig A, Steinau HU, Steinstraesser L, Immune reaction after adenoviral gene delivery into skin. 11th Annual Meeting on Surgical Research, Langenbeck´s Archives of Surgery, page 825 (2008). ISSN 1435-2443 Schulte M, Jacobsen F, Otte JM, Hirsch T, Daigeler A, Goertz O, Steinau HU, Steinstraesser L, Untersuchungen zur Signaltransduktion bei adenoviral induzierter Immunreaktion der Haut. German Medical Science GMS Publishing House; (2009). DOI: 10.3205/09dgch022 123 Publikationsverzeichnis Schulte M, Jacobsen F, Otte JM, Hirsch T, Al-Benna S, Stupka J, Daigeler A, Goertz O, Steinau HU, Steinstraesser L, Signal transduction of the innate and adaptive immune system after transient cutaneous adenoviral gene delivery. Plastic and Reconstructive Surgery. (2009) 124(2): p.685. Schulte M, Sorkin M, Stupka J, Becerikli M, Al-Benna S, Jacobsen F, Steinstraesser L, A novel human skin chamber model to study wound infection ex vivo. Plastic and Reconstructive Surgery. (2009) 124(2): p.685. Schulte M, Sorkin M, Stupka J, Becerikli M, Al-Benna S, Jacobsen F, Steinstraesser L, A novel human skin chamber model to study wound infection ex vivo. Burns. (2009) 35(Suppl. 1): p.43. Schulte M, Jacobsen F, Otte JM, Hirsch T, Al-Benna S, Stupka J, Daigeler A, Goertz O, Steinau HU, Steinstraesser L, Signal transduction of the innate and adaptive immune system after transient cutaneous adenoviral gene delivery. Burns. (2009) 35(Suppl. 1): p.43. Schulte M, Jacobsen F, Sorkin M, Otte JM, Hirsch T, Al-Benna S, Stupka J, Daigeler A, Goertz O, Steinau H-U, Steinstraesser L, Untersuchungen zur Signaltransduktion bei adenoviral induzierter Immunreaktion der Haut. Plastische Chirurgie. (2009) 9(Suppl. 1): p.1. Schulte M, Jacobsen F, Sorkin M, Hirsch T, Al-Benna S, Goertz O, Steinau HU, Steinstraesser L.: Immunreaktion nach adenoviralem kutanem Gentransfer. Plastische Chirurgie. (2009) 9(Suppl. 1): p.1. Schulte M, Sorkin M, Stupka J, Becerikli M, Al-Benna S, Jacobsen F, Steinstraesser L, BO Drum® - Neues Modell zur ex vivo Untersuchung von Wundinfektionen. Plastische Chirurgie. (2009) 9(Suppl. 1): p.1. Kueckelhaus M, Schulte M, Jacobsen F, Al-Benna S, Steinau HU, Steinstraesser L, Promotion of wound-healing by regulator proteins of the innate immune system. Plastic and Reconstructive Surgery. (2010) 126(2S): p.724-725. Kückelhaus M, Schulte M, Jacobsen F, Hirsch T, Steinau HU, Steinstraesser L, Förderung der Wundheilung durch Regulatorproteine des angeborenen Immunsystems. Plastische Chirurgie. (2010) 10 (Suppl. 1): p.20. Kueckelhaus M, Schulte M, Jacobsen F, Hirsch T, Stricker I, Al-Benna S, Goertz O, Steinau HU, Hancock REW, Kindrachuk J, Steinstraesser L, Regulatorproteine des angeborenen Immunsystems fördern die Wundheilung bei akuten und infizierten Wunden. German Medical Science GMS Publishing House; (2011). DOI: 10.3205/11dgch133 Beiträge auf Kongressen: Vorträge: Hirsch T, Mittler D, Jacobsen F, Lehnhardt M, Homann HH, Schulte M, Steinau, HU, Steinstraesser L, Feasibility of adenoviral gene delivery in unburned and burned skin. American Society of Plastic Surgery (ASPS), Philadelphia, USA, 09. - 13.10.2004. Hirsch T, Mittler D, Jacobsen F, Schulte M, Druecke D, Lehnhardt M, Steinau HU, Steinstraesser L, Transienter adenoviraler Gentransfer in Verbrennungswunden - eine Studie am Tiermodell. 35. Jahrestagung der Vereinigung der Plastischen Chirurgen (VDPC), Düsseldorf, Deutschland, 22. 25.10.2004. 124 Publikationsverzeichnis Hirsch T, Mittler D, Jacobsen F, Lehnhardt M, Homann HH, Schulte M, Steinau HU, Steinstraesser L, Feasibility of adenoviral gene delivery in unburned and burned skin. Plastic Surgery Research Council, 49th Annual Meeting, Univeristy of Michigan, Ann Arbor, USA, 06. - 09.06.2004. Kesting MR, Loeffelbein DJ, Hasler RJ, Wolff K-D, Rittig A, Schulte M, Hirsch T, Wagenpfeil S, Jacobsen F, Steinstraesser L, Expression profile of human beta-defensin 3 in oral squamous cell carcinoma. Gordon Research Conference, Ventura, USA, 01.- 06.03.2009. Schulte M, Jacobsen F, Otte JM, Hirsch T, Daigeler A, Goertz O, Steinau HU, Steinstraesser L, Untersuchungen zur Signaltransduktion bei adenoviral induzierter Immunreaktion der Haut. 126. Kongress der Deutschen Gesellschaft für Chirurgie, München, Deutschland, 28.04. - 01.05.2009. Hasler RJ, Kesting MR, Jacobsen F, Schulte M, Stricker I, Wolff KD, Steinau HU, Al Benna S, Steinstraesser L, Überexpression von Host Defense Peptiden bei Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle. 126. Kongress Deutsche Gesellschaft für Chirurgie, München, Deutschland, 28.04. 01.05.2009. Schulte M, Jacobsen F, Sorkin M, Hirsch T, Al-Benna S, Stupka J, Daigeler A, Steinau HU, Steinstraesser L, Immune response after adenoviral gene delivery into skin. The Plastic Surgery Research Council, 54th Annual Meeting, Pittsburgh, Pennsylvania, USA, 27. - 30.05.2009. Schulte M, Jacobsen F, Sorkin M, Otte JM, Hirsch T, Daigeler A, Goertz O, Steinau HU, Steinstraesser L, Signal transduction of the innate and adaptive immune system after transient cutaneous adenoviral gene delivery. The Plastic Surgery Research Council, 54th Annual Meeting, Pittsburgh, Pennsylvania, USA, 27. - 30.05.2009. Schulte M, Jacobsen F, Sorkin M, Otte JM, Hirsch T, Daigeler A, Goertz O, Steinau HU, Steinstraesser L, Untersuchungen zur Signaltransduktion bei adenoviral induzierter Immunreaktion der Haut. 12. Jahreskongress der Deutschen Gesellschaft für Wundheilung und Wundbehandlung e.V., Kassel, Deutschland, 25. - 27.06.2009. (Viktor von Bruns-Preis) Schulte M, Jacobsen F, Sorkin M, Hirsch T, Al-Benna S, Goertz O, Steinau HU, Steinstraesser L, Immunreaktion nach adenoviralen kutanen Gentransfer. 12. Jahreskongress der Deutschen Gesellschaft für Wundheilung und Wundbehandlung e.V., Kassel, Deutschland, 25. - 27.06.2009. Schulte M, Jacobsen F, Sorkin M, Otte JM, Hirsch T, Daigeler A, Goertz O, Steinau HU, Steinstraesser L, Signal transduction of the innate and adaptive immune system after transient cutaneous gene delivery. 1st European Plastic Surgery Research Council (EPSRC), Hamburg, Deutschland, 20. - 23.08.2010. Schulte M, Sorkin M, Stupka J, Becerikli M, Al-Benna S, Jacobsen F, Steinstraesser L, A novel human skin chamber model to study wound infection ex vivo. 1st European Plastic Surgery Research Council (EPSRC), Hamburg, Deutschland, 20. - 23.08.2010. Schulte M, Jacobsen F, Sorkin M, Otte JM, Hirsch T, Al-Benna S, Stupka J, Daigeler A, Goertz O, Steinau H-U, Steinstraesser L, Untersuchungen zur Signaltransduktion bei adenoviral induzierter Immunreaktion der Haut. 40. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft der Plastischen, Ästhetischen und Rekonstruktiven Chirurgen e.V. (DGPRÄC), Hannover, Deutschland, 10. - 12. September 2009. Schulte M, Jacobsen F, Sorkin M, Hirsch T, Al-Benna S, Goertz O, Steinau HU, Steinstraesser L, Immunreaktion nach adenoviralem kutanem Gentransfer. 40. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft der Plastischen, Ästhetischen und Rekonstruktiven Chirurgen e.V. (DGPRÄC), Hannover, Deutschland, 10. - 12. September 2009. 125 Publikationsverzeichnis Kueckelhaus M, Schulte M, Jacobsen F, Al-Benna S, Steinau HU, Steinstraesser L, Promotion of wound-healing by regulator proteins of the innate immune system. 2nd European Plastic Surgery Research Council (EPSRC), Hamburg, Deutschland, 26. - 29. 08.2010. Kückelhaus M, Schulte M, Jacobsen F, Hirsch T, Steinau HU, Steinstraesser L, Förderung der Wundheilung durch Regulatorproteine des angeborenen Immunsystems. 41. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft der Plastischen, Rekonstruktiven und Ästhetischen Chirurgen (DGPRÄC), Dresden, Deutschland 15. - 18.09.2010. Pfaffe S, Mikhail BD, Jacobsen F, Schulte M, Guettsches AK, Rittig A, Steinau HU, Steinstraesser L, Signaling of human beta-defensin-3 on the human skin. 3rd European Plastic Surgery Research Council (EPSRC), Hamburg, Deutschland, 25. - 28.08.2011. Tsoukas R, Becerikli M, Jacobsen F, Mikhail BD, Schulte M, Stricker I, Rittig A, Steinau HU, Steinstraesser L, Role of Ephrin-B4 in wound repair. 3rd European Plastic Surgery Research Council (EPSRC), Hamburg, Deutschland, 25. - 28.08.2011. Kueckelhaus M, Schulte M, Jacobsen F, Kindrachuk J, Hirsch T, Hancock R, Steinstraesser L, Promotion of wound healing by regulator proteins of the innate immune system. 129. Kongress der Deutschen Gesellschaft für Chirurgie, Berlin, Deutschland, 24. - 27.04.2012. Pfaffe S, Mikhail BD, Jacobsen F, Schulte M, Guettsches A, Steinau HU, Steinstraesser L, Human β-defensin 3 – immunological effects on cutaneous full-thickness wounds. 129. Kongress der Deutschen Gesellschaft für Chirurgie, Berlin, Deutschland, 24. - 27.04.2012. Poster: Hirsch T, Mittler D, Jacobsen F, Lehnhardt M, Homann HH, Schulte M, Steinau HU, Steinstraesser L, Feasibility of adenoviral gene delivery in unburned and burned skin. Plastic Surgery Research Council, 49th Annual Meeting, Ann Arbor, USA, 06. - 09.06.2004. Jacobsen F, Sorkin M, Schulte M, Daigeler A, Langer S, Gevers K, Rittig A, Steinau HU, Steinstraesser L, Die Immunantwort der Haut nach adenoviralem Gentransfer. 125. Kongress Deutsche Gesellschaft für Chirurgie, Berlin, Deutschland, 22. - 25.04.2008. Schulte M, Sorkin M, Stupka J, Becerikli M, Al-Benna S, Jacobsen F, Steinstraesser L, A novel human skin chamber model to study wound infection ex vivo. European Burns Association Congress, Lausanne, Schweiz, 02. - 05.09.2009. Schulte M, Sorkin M, Al-Benna S, Hirsch T, Jacobsen F, Steinau HU, Steinstraesser L, Immune reaction after cutaneous adenoviral gene delivery. European Burns Association Congress, Lausanne, Schweiz, 02. - 05.09.2009. Schulte M, Jacobsen F, Otte JM, Hirsch T, Al-Benna S, Stupka J, Daigeler A, Goertz O, Steinau HU, Steinstraesser L, Signal transduction of the innate and adaptive immune system after transient cutaneous adenoviral gene delivery. European Burns Association Congress, Lausanne, Schweiz, 02. - 05.09.2009. Schulte M, Sorkin M, Stupka J, Becerikli M, Al-Benna S, Jacobsen F, Steinstraesser L, BO-Drum® - Neues Modell zur ex vivo Untersuchung von Wundinfektionen. 40. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft der Plastischen, Ästhetischen und Rekonstruktiven Chirurgen e.V. (DGPRÄC), Hannover, Deutschland, 10. - 12.09.2009. 126 Publikationsverzeichnis Kueckelhaus M, Schulte M, Jacobsen F, Hirsch T, Stricker I, Al-Benna S, Goertz O, Steinau HU, Hancock REW, Kindrachuk J, Steinstraesser L, Regulatorproteine des angeborenen Immunsystems fördern die Wundheilung bei akuten und infizierten Wunden. 128. Kongress Deutsche Gesellschaft für Chirurgie, München, Deutschland, 03. - 06.05.2011. Preise/Auszeichnungen: Viktor von Bruns-Preis für die beste Arbeit im Bereich der Grundlagenforschung 12. Jahreskongress der Deutschen Gesellschaft für Wundheilung und Wundbehandlung e.V., Kassel, Deutschland, 25. - 27.06.2009. 127
