Untersuchung von Bindungsstellen zur Aktivierung von Genen

Jahrbuch 2004/2005 | Vingron, Martin | Untersuchung von Bindungsstellen zur Aktivierung von Genen
Untersuchung von Bindungsstellen zur Aktivierung von Genen
Analysis of binding sites for the activation of genes
Vingron, Martin
Max-Planck-Institut für molekulare Genetik, Berlin
Korrespondierender Autor
E-Mail: [email protected]
Zusammenfassung
Transkriptionsfaktoren spielen eine zentrale Rolle bei der Regulation von Genen. Die Abteilung Bioinformatik
am MPI für molekulare Genetik nutzt verschiedene mathematische Methoden, um die Funktion und das
Zusammenspiel von Transkriptionsfaktoren zu untersuchen und so w eiterführende Erkenntnisse über die
Regulation von Genen zu erhalten.
Summary
Transcription factors play a central role for the regulation of genes. The Department of Computational Biology
at the MPI for Molecular Genetics utilizes a panel of mathematical methods to analyze function and interaction
of transcription factors in order to achieve new insights into gene regulation.
Nach der Sequenzierung des Humangenoms und zahlreicher w eiterer Genome konzentrieren sich heute
w esentliche Forschungsanstrengungen auf die Analyse der gew onnenen Daten. Diese beschränkt sich jedoch
nicht auf die reine Annotation der Gene, d.h., ihre Identifizierung und Zuordnung zu bestimmten Funktionen.
Die Kenntnis der gesamten DNA-Sequenz eines Organismus erlaubt vielmehr eine Reihe von neuen Fragen,
insbesondere nach den Mechanismen der Regulation von Genen. Heute interessiert uns nicht nur, w elche
Funktion ein Gen bzw . das von ihm kodierte Protein besitzt, sondern auch, w elche Mechanismen dazu führen,
dass das Gen überhaupt aktiviert, also abgelesen und in ein Protein übersetzt w ird.
Transkriptionsfaktoren als Regulatoren der Genexpression
Der menschliche Organismus besitzt ca. 25.000 Gene, die w ährend seines gesamten Lebens in jeder seiner
Zellen vorhanden sind. In jeder Phase der Entw icklung und in jeder Zellart w erden aber unterschiedliche
Teilmengen dieses Genpools aktiviert. Heute kennen w ir zumindest teilw eise die biologischen Mechanismen,
die für diese Aktivierung verantw ortlich sind. Von besonderer Bedeutung ist eine Gruppe von DNA-bindenden
Proteinen, die so genannten Transkriptionsfaktoren. Sie bilden einen Komplex mit dem Enzym RNAPolymerase,
das
für
das
Ablesen
der
DNA
verantw ortlich
ist
und
aktivieren
es
dadurch.
Die
Transkriptionsfaktoren erkennen bestimmte Sequenzmuster, die am Startpunkt eines Gens auf der DNA
angeordnet sind (Abb. 1). Das Interesse der Abteilung Bioinformatik am Max-Planck-Institut für molekulare
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Genetik konzentriert sich auf die Identifikation solcher Sequenzmuster und die Frage, in w elcher Kombination
Transkriptionsfaktoren über Bindung an diese Muster bestimmte Gene aktivieren.
Ve re infa chte s Sche m a de r R e gula tion von junB.
©
Molekularbiologen und Biochemiker beschäftigen sich schon seit Jahren mit Sequenzmustern, an w elche
Transkriptionsfaktoren binden können. Inzw ischen w issen w ir, dass viele Transkriptionsfaktoren an jew eils
mehrere unterschiedliche Muster im Genom binden. Der Transkriptionsfaktor SRF (serum response factor)
beispielsw eise bindet an die Basenfolge CCTAATATGG vor dem Gen junB und trägt dadurch zu dessen
Aktivierung bei (Abb.1). SRF bindet aber auch an anderen Stellen im Genom, die sich von der o.g. Sequenz in
verschiedenen Positionen unterscheiden. Seine Bindungsstellen w erden daher allgemein durch die Abfolge der
möglichen Basen oder Basenalternativen beschrieben. Abstrakter ist die Beschreibung einer Bindungsstelle
durch so genannte „Gew ichtsmatrizen“. Diese geben für jede Position einer zu beschreibenden Bindungsstelle
die mögliche Verteilung der Basen an (Abb. 2).
Ge wichtsm a trix e ine r SR F-Bindungsste lle . Die Größe de r
e inze lne n Buchsta be n ist e in Ma ß für die Hä ufigk e it, m it de r
die je we ilige n Ba se n a n de n e ntspre che nde n P ositione n de r
Bindungsste lle vork om m e n.
©
Phylogenetic footprinting - Identifikation wichtiger biologischer Signale durch evolutionäre Konservierung
Ein grundsätzliches Problem bei der Analyse von Bindungsstellen ist die Tatsache, dass eine definierte, kurze
Abfolge von Basen innerhalb des Gesamtgenoms sehr oft vorkommt. Die Beschreibung der Bindungsstelle als
Abfolge
von
Basen
reicht
daher nicht
aus, um vorherzusagen, an
w elcher Stelle
im Genom ein
Transkriptionsfaktor tatsächlich bindet. W ichtige regulatorische Sequenzen sind allerdings häufig evolutionär
konserviert. Bioinformatiker versuchen daher, durch den Vergleich der Genomsequenzen verschiedener
Organismen Hinw eise auf die Bedeutung einer bestimmten Sequenz (= potenziellen Bindungsstelle) zu
erhalten. Umgekehrt stellen konservierte Sequenzen innerhalb regulatorischer Regionen primäre Kandidaten
für die Suche nach neuen Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren dar; entsprechend w erden sie intensiv in
Hinblick
auf Übereinstimmungen mit bekannten Bindungsmustern untersucht. Die Sequenz der bereits
erw ähnten Bindungsstelle für SRF w äre w enig informativ, w enn sie allein im Humangenom betrachtet w ird. Die
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gleiche Sequenz tritt interessanterw eise in vergleichbarer Position vor einem Gen auch im Genom der Maus
auf. Der Vergleich beider Genome ergibt so einen starken Hinw eis darauf, dass es sich bei diesem Muster um
ein w ichtiges biologisches Signal handeln könnte. Diese Herangehensw eise w ird als phylogenetic footprinting
bezeichnet. Die W issenschaftler der Abteilung Bioinformatik am MPI für molekulare Genetik haben eine Reihe
von Computerprogrammen entw ickelt, um solche konservierten Bereiche vor orthologen Genen von Mensch
und Maus zu identifizieren und anschließend mit bereits bekannten Bindungsstellenmustern zu annotieren. Die
Informationen sind in der Datenbank CORG (Comparative Regulatory Genomics) gespeichert und unter
http://corg.molgen.mpg.de/ öffentlich zugänglich.
Identifikation der Zielgene von Transkriptionsfaktoren
Die
Vorhersage
von
evolutionär
konservierten
Bindestellen
kann
auch
helfen,
Zielgene
von
Transkriptionsfaktoren zu identifizieren. In einer Zusammenarbeit mit A. Nordheim von der Universität
Tübingen w urden zunächst mittels DNA-Chip-Experimenten (siehe unten) die putativen Zielgene von SRF
ermittelt. Unter diesen befanden sich sow ohl solche Gene, die von SRF direkt reguliert w urden, als auch
diejenigen Gene, die erst in Folge der Aktivierung durch SRF aktiviert w urden. Aus dieser Gesamtmenge
konnten mithilfe
der beschriebenen Methoden der Mustersuche
und der Analyse
der evolutionären
Konservierung diejenigen Gene herausgefiltert w erden, die direkt von SRF beeinflusst w erden. Diese
Information w ar hilfreich, um einen bislang unbekannten Mechanismus der Differenzierung von Muskelzellen
aufzuklären [1].
Analyse von Aktivierungsmustern
Für komplexe biologische Abläufe ist aber nicht nur die Aktivierung von Einzelgenen, sondern insbesondere die
aufeinander abgestimmte Aktivierung ganzer Gruppen von Genen von Bedeutung. Solche „Aktivierungsmuster“
können mithilfe von DNA-Chips bestimmt w erden (siehe von Heydebreck et al., Genexpressionsanalyse
komplexer klinischer Phänotypen mittels DNS-Arrays, MPG-Jahrbuch 2003). Aus diesen Experimenten kann man
ablesen, w elche Gene sich in definierten Zellarten unter definierten Bedingungen ähnlich verhalten; sie
w erden als ko-exprimierte Cluster von Genen bezeichnet. Die Arbeitsgruppe beschäftigt sich unter anderem
mit der Frage, ob eine solche Koexpression auf gemeinsame regulatorische Mechanismen, beispielsw eise
gleiche
Transkriptionsfaktoren,
zurückzuführen
ist.
Mithilfe
der
CORG-Datenbank
untersuchen
die
W issenschaftler die regulatorischen Bereiche der koexprimierten Gene. In erster Näherung katalogisieren sie
die evolutionär konservierten Bindestellen innerhalb dieser Bereiche, w eil diese auf eine regulatorische
Funktion des jew eils bindenden Faktors hinw eisen. Die evolutionär konservierten Bindungsstellen innerhalb
der regulatorischen Bereiche sind aber immer noch zu zahlreich, als dass sie bereits Aufschluss über eine
bestimmte Funktion geben könnten. Daher vergleichen die W issenschaftler die Häufigkeit des Auftretens einer
gew issen Bindestelle innerhalb eines koexprimierten Clusters mit der Wahrscheinlichkeit ihres zufälligen
Auftretens. Eine solche Analyse w urde beispielsw eise anhand von öffentlich verfügbaren DNA-Chip-Daten zum
Zellzyklus in einer menschlichen Zelllinie durchgeführt. Die Koexpressionscluster bestanden aus den Genen,
die jew eils in einer bestimmten Phase des Zellzyklus stark exprimiert sind. Die Analyse ihrer regulatorischen
Muster ergab eine Reihe von Transkriptionsfaktoren, die nach der beschriebenen statistischen Schlussw eise
eine w ichtige Rolle für den Zellzyklus spielen (Abb. 3). Ein Vergleich mit experimentellen Ergebnissen
bestätigte dies [2].
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Gra uwe rtm a trix zur Da rste llung von Bindungshä ufigk e ite n.
Eine Spa lte ze igt je we ils da s Koe x pre ssionscluste r a lle r Ge ne ,
die wä hre nd de r je we ilige n P ha se de s Ze llzyk lus e x prim ie rt
we rde n. In de n Ze ile n sind die ve rschie de ne n
Tra nsk riptionsfa k torbindungsste lle n a ufge liste t. De r Gra uwe rt
de r e inze lne n Ze lle n gibt die Anza hl de r Ge ne a n, die wä hre nd
de r je we ilige n P ha se de s Ze llzyk lus a ls durch de n
be tre ffe nde n Tra nsk riptionsfa k tor re gulie rt vorhe rge sa gt
we rde n. He lle Einträ ge be de ute n e in große Anza hl von
Zie lge ne n in de r je we ilige n P ha se .
©
Interaktion von Transkriptionsfaktoren untereinander
Zurzeit arbeiten die W issenschaftler der Abteilung Bioinformatik an der Entw icklung von Methoden, um das
Zusammenspiel der Transkriptionsfaktoren zu studieren. In dem im Vergleich zum Säugerorganismus
einfacheren Fall der Genregulation in Hefe
konnten sie
zeigen, dass
Transkriptionsfaktoren, deren
Bindungsstellen häufig in räumlicher Nähe zueinander auf einer Sequenz zu finden sind, oft auch physikalisch
miteinander in Interaktion treten [3]. Auf der Suche nach ähnlichen Prinzipien bei Säugetieren suchen sie nun
nach statistischen Tendenzen in der Kombination von Bindungsstellen auf der DNA. Hier kommt den Forschern
erneut die
evolutionäre
Konservierung zu Hilfe
und ermöglicht eine
Reduktion der falsch positiven
Vorhersagen. In einer auf diese Art reduzierten Liste von Transkriptionsfaktor-Paaren, deren Bindestellen
häufig nahe beisammen auftreten, w erden tatsächlich viele bekannte, miteinander interagierende Faktoren
gefunden [4].
Die beschriebenen Arbeiten beruhen auf einer detaillierten Aufarbeitung und mathematischen Durchdringung
der vorhandenen, experimentell ermittelten Daten. Bekannte Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren
müssen
miteinander
verglichen
und
gruppiert
w erden,
um
Doppelzählungen
zu
vermeiden.
Ihr
Informationsgehalt w ird berechnet und innerhalb der Arbeitsgruppe w urden neue mathematische Verfahren
entw ickelt, um die zu erw artende Anzahl der falsch positiven Funde – mithin die statistische Signifikanz vorherzusagen [5]. Ein häufig auftretendes Problem bei der Analyse von Daten aus der funktionalen
Genomforschung ist das multiple Testen: Aufgrund der großen Menge an Daten kann eine Hypothese mit Hilfe
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vieler Fälle getestet w erden. Dies führt aber nur scheinbar zu beeindruckenden Signifikanzw erten. Um eine
realistische Aussage zu erhalten, müssen die resultierenden Signifikanzw erte entsprechend der Anzahl der
durchgeführten Tests korrigiert w erden, um eine
adäquate
Ausw ertung von biologischen Daten zu
gew ährleisten.
Die Regulation der Ausprägung eines Gens w ird nicht nur von Transkriptionsfaktoren bestimmt. Trotzdem muss
diese Ebene der Regulation studiert w erden, um ein Gesamtbild der verschiedenen regulatorischen
Mechanismen einer Zelle aufzeigen zu können. Damit kommen w ir dem umfassenden Verständnis der Funktion
einer lebenden Zelle einen w esentlichen Schritt näher.
Originalveröffentlichungen
Nach
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[1] U. Philippar, G. Schratt, C. Dieterich, J.M. Müller, P. Galgoczy, F.B. Engel, M.T. Keating, F. Gertler, R.
Schule, M. Vingron, A. Nordheim:
The SRF target gene Fhl2 antagonizes RhoA/MAL-dependent activation of SRF.
Mol Cell 2004; 16:867-880
[2] C. Dieterich, S. Rahmann, M. Vingron:
Functional inference from non-random distributions of conserved predicted transcription factor binding
sites.
Bioinformatics 2004; 20(Suppl 1):I109-I115.
[3] T. Manke, R. Bringas, M. Vingron:
Correlating Protein-DNA and Protein-Protein Interaction Networks.
J Mol Biol 2003; 333:75-85
[4] K. Rateitschak, T. Müller, M. Vingron:
Annotating significant pairs of transcription factor binding sites in regulatory DNA.
In Silico Biology 2004; 4:479-487
[5] S. Rahmann, T. Müller, M. Vingron:
On the power of profiles for transcription factor binding site detection.
Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology 2003; 2:Article 7
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