Untersuchung von Bindungsstellen zur Aktivierung von Genen

Vingron, Martin | Untersuchung von Bindungsstellen zur Aktivierung von Genen
Tätigkeitsbericht 2005
Entwicklungs- und Evolutionsbiologie/Genetik
Untersuchung von Bindungsstellen zur Aktivierung von Genen
Vingron, Martin
Max-Planck-Institut für molekulare Genetik, Berlin
Abteilung - Bioinformatik
Korrespondierender Autor: Vingron, Martin
E-Mail: [email protected]
Zusammenfassung
Transkriptionsfaktoren spielen eine zentrale Rolle bei der Regulation von Genen. Die Abteilung
Bioinformatik am MPI für molekulare Genetik nutzt verschiedene mathematische Methoden, um die
Funktion und das Zusammenspiel von Transkriptionsfaktoren zu untersuchen und so weiterführende
Erkenntnisse über die Regulation von Genen zu erhalten.
Abstract
Transcription factors play a central role for the regulation of genes. The Department of Computational
Biology at the MPI for Molecular Genetics utilizes a panel of mathematical methods to analyze function and interaction of transcription factors in order to achieve new insights into gene regulation.
Nach der Sequenzierung des Humangenoms und zahlreicher weiterer Genome konzentrieren sich
heute wesentliche Forschungsanstrengungen auf die Analyse der gewonnenen Daten. Diese beschränkt
sich jedoch nicht auf die reine Annotation der Gene, d.h., ihre Identifizierung und Zuordnung zu bestimmten Funktionen. Die Kenntnis der gesamten DNA-Sequenz eines Organismus erlaubt vielmehr
eine Reihe von neuen Fragen, insbesondere nach den Mechanismen der Regulation von Genen. Heute
interessiert uns nicht nur, welche Funktion ein Gen bzw. das von ihm kodierte Protein besitzt, sondern
auch, welche Mechanismen dazu führen, dass das Gen überhaupt aktiviert, also abgelesen und in ein
Protein übersetzt wird.
Transkriptionsfaktoren als Regulatoren der Genexpression
Der menschliche Organismus besitzt ca. 25.000 Gene, die während seines gesamten Lebens in jeder
seiner Zellen vorhanden sind. In jeder Phase der Entwicklung und in jeder Zellart werden aber unterschiedliche Teilmengen dieses Genpools aktiviert. Heute kennen wir zumindest teilweise die biologischen Mechanismen, die für diese Aktivierung verantwortlich sind. Von besonderer Bedeutung ist
eine Gruppe von DNA-bindenden Proteinen, die so genannten Transkriptionsfaktoren. Sie bilden einen
Komplex mit dem Enzym RNA-Polymerase, das für das Ablesen der DNA verantwortlich ist und aktivieren es dadurch. Die Transkriptionsfaktoren erkennen bestimmte Sequenzmuster, die am Startpunkt
eines Gens auf der DNA angeordnet sind (Abb. 1). Das Interesse der Abteilung Bioinformatik am
Max-Planck-Institut für molekulare Genetik konzentriert sich auf die Identifikation solcher Sequenzmuster und die Frage, in welcher Kombination Transkriptionsfaktoren über Bindung an diese Muster
bestimmte Gene aktivieren.
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Abb. 1: Vereinfachtes Schema der Regulation von junB.
Molekularbiologen und Biochemiker beschäftigen sich schon seit Jahren mit Sequenzmustern, an welche Transkriptionsfaktoren binden können. Inzwischen wissen wir, dass viele Transkriptionsfaktoren
an jeweils mehrere unterschiedliche Muster im Genom binden. Der Transkriptionsfaktor SRF (serum
response factor) beispielsweise bindet an die Basenfolge CCTAATATGG vor dem Gen junB und trägt
dadurch zu dessen Aktivierung bei (Abb.1). SRF bindet aber auch an anderen Stellen im Genom, die
sich von der o.g. Sequenz in verschiedenen Positionen unterscheiden. Seine Bindungsstellen werden
daher allgemein durch die Abfolge der möglichen Basen oder Basenalternativen beschrieben. Abstrakter ist die Beschreibung einer Bindungsstelle durch so genannte „Gewichtsmatrizen“. Diese geben für
jede Position einer zu beschreibenden Bindungsstelle die mögliche Verteilung der Basen an (Abb. 2).
Abb. 2: Gewichtsmatrix einer SRF-Bindungsstelle. Die Größe der einzelnen Buchstaben ist ein Maß für die Häufigkeit, mit der die jeweiligen Basen an den entsprechenden Positionen der Bindungsstelle vorkommen.
Phylogenetic footprinting - Identifikation wichtiger biologischer Signale durch evolutionäre
Konservierung
Ein grundsätzliches Problem bei der Analyse von Bindungsstellen ist die Tatsache, dass eine definierte, kurze Abfolge von Basen innerhalb des Gesamtgenoms sehr oft vorkommt. Die Beschreibung der
Bindungsstelle als Abfolge von Basen reicht daher nicht aus, um vorherzusagen, an welcher Stelle im
Genom ein Transkriptionsfaktor tatsächlich bindet. Wichtige regulatorische Sequenzen sind allerdings
häufig evolutionär konserviert. Bioinformatiker versuchen daher, durch den Vergleich der Genomsequenzen verschiedener Organismen Hinweise auf die Bedeutung einer bestimmten Sequenz (=
potenziellen Bindungsstelle) zu erhalten. Umgekehrt stellen konservierte Sequenzen innerhalb regulatorischer Regionen primäre Kandidaten für die Suche nach neuen Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren dar; entsprechend werden sie intensiv in Hinblick auf Übereinstimmungen mit bekannten
Bindungsmustern untersucht. Die Sequenz der bereits erwähnten Bindungsstelle für SRF wäre wenig
informativ, wenn sie allein im Humangenom betrachtet wird. Die gleiche Sequenz tritt interessanterweise in vergleichbarer Position vor einem Gen auch im Genom der Maus auf. Der Vergleich beider
Genome ergibt so einen starken Hinweis darauf, dass es sich bei diesem Muster um ein wichtiges
biologisches Signal handeln könnte. Diese Herangehensweise wird als phylogenetic footprinting
bezeichnet. Die Wissenschaftler der Abteilung Bioinformatik am MPI für molekulare Genetik haben
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eine Reihe von Computerprogrammen entwickelt, um solche konservierten Bereiche vor orthologen
Genen von Mensch und Maus zu identifizieren und anschließend mit bereits bekannten Bindungsstellenmustern zu annotieren. Die Informationen sind in der Datenbank CORG (Comparative Regulatory
Genomics) gespeichert und unter http://corg.molgen.mpg.de/ öffentlich zugänglich.
Identifikation der Zielgene von Transkriptionsfaktoren
Die Vorhersage von evolutionär konservierten Bindestellen kann auch helfen, Zielgene von Transkriptionsfaktoren zu identifizieren. In einer Zusammenarbeit mit A. Nordheim von der Universität
Tübingen wurden zunächst mittels DNA-Chip-Experimenten (siehe unten) die putativen Zielgene von
SRF ermittelt. Unter diesen befanden sich sowohl solche Gene, die von SRF direkt reguliert wurden,
als auch diejenigen Gene, die erst in Folge der Aktivierung durch SRF aktiviert wurden. Aus dieser
Gesamtmenge konnten mithilfe der beschriebenen Methoden der Mustersuche und der Analyse der
evolutionären Konservierung diejenigen Gene herausgefiltert werden, die direkt von SRF beeinflusst
werden. Diese Information war hilfreich, um einen bislang unbekannten Mechanismus der Differenzierung von Muskelzellen aufzuklären [1].
Analyse von Aktivierungsmustern
Für komplexe biologische Abläufe ist aber nicht nur die Aktivierung von Einzelgenen, sondern insbesondere die aufeinander abgestimmte Aktivierung ganzer Gruppen von Genen von Bedeutung. Solche
„Aktivierungsmuster“ können mithilfe von DNA-Chips bestimmt werden (siehe von Heydebreck et
al., Genexpressionsanalyse komplexer klinischer Phänotypen mittels DNS-Arrays, MPG-Jahrbuch
2003). Aus diesen Experimenten kann man ablesen, welche Gene sich in definierten Zellarten unter
definierten Bedingungen ähnlich verhalten; sie werden als ko-exprimierte Cluster von Genen bezeichnet. Die Arbeitsgruppe beschäftigt sich unter anderem mit der Frage, ob eine solche Koexpression auf
gemeinsame regulatorische Mechanismen, beispielsweise gleiche Transkriptionsfaktoren, zurückzuführen ist. Mithilfe der CORG-Datenbank untersuchen die Wissenschaftler die regulatorischen Bereiche der koexprimierten Gene. In erster Näherung katalogisieren sie die evolutionär konservierten
Bindestellen innerhalb dieser Bereiche, weil diese auf eine regulatorische Funktion des jeweils bindenden Faktors hinweisen. Die evolutionär konservierten Bindungsstellen innerhalb der regulatorischen Bereiche sind aber immer noch zu zahlreich, als dass sie bereits Aufschluss über eine bestimmte
Funktion geben könnten. Daher vergleichen die Wissenschaftler die Häufigkeit des Auftretens einer
gewissen Bindestelle innerhalb eines koexprimierten Clusters mit der Wahrscheinlichkeit ihres zufälligen Auftretens. Eine solche Analyse wurde beispielsweise anhand von öffentlich verfügbaren DNAChip-Daten zum Zellzyklus in einer menschlichen Zelllinie durchgeführt. Die Koexpressionscluster
bestanden aus den Genen, die jeweils in einer bestimmten Phase des Zellzyklus stark exprimiert sind.
Die Analyse ihrer regulatorischen Muster ergab eine Reihe von Transkriptionsfaktoren, die nach der
beschriebenen statistischen Schlussweise eine wichtige Rolle für den Zellzyklus spielen (Abb. 3). Ein
Vergleich mit experimentellen Ergebnissen bestätigte dies [2].
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Abb. 3: Grauwertmatrix zur Darstellung von Bindungshäufigkeiten. Eine Spalte zeigt jeweils das Koexpressionscluster aller Gene, die während der jeweiligen Phase des Zellzyklus exprimiert werden. In den Zeilen sind
die verschiedenen Transkriptionsfaktorbindungsstellen aufgelistet. Der Grauwert der einzelnen Zellen gibt die
Anzahl der Gene an, die während der jeweiligen Phase des Zellzyklus als durch den betreffenden Transkriptionsfaktor reguliert vorhergesagt werden. Helle Einträge bedeuten ein große Anzahl von Zielgenen in der jeweiligen
Phase.
Interaktion von Transkriptionsfaktoren untereinander
Zurzeit arbeiten die Wissenschaftler der Abteilung Bioinformatik an der Entwicklung von Methoden,
um das Zusammenspiel der Transkriptionsfaktoren zu studieren. In dem im Vergleich zum Säugerorganismus einfacheren Fall der Genregulation in Hefe konnten sie zeigen, dass Transkriptionsfaktoren,
deren Bindungsstellen häufig in räumlicher Nähe zueinander auf einer Sequenz zu finden sind, oft
auch physikalisch miteinander in Interaktion treten [3]. Auf der Suche nach ähnlichen Prinzipien bei
Säugetieren suchen sie nun nach statistischen Tendenzen in der Kombination von Bindungsstellen auf
der DNA. Hier kommt den Forschern erneut die evolutionäre Konservierung zu Hilfe und ermöglicht
eine Reduktion der falsch positiven Vorhersagen. In einer auf diese Art reduzierten Liste von Transkriptionsfaktor-Paaren, deren Bindestellen häufig nahe beisammen auftreten, werden tatsächlich viele
bekannte, miteinander interagierende Faktoren gefunden [4].
Die beschriebenen Arbeiten beruhen auf einer detaillierten Aufarbeitung und mathematischen Durchdringung der vorhandenen, experimentell ermittelten Daten. Bekannte Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren müssen miteinander verglichen und gruppiert werden, um Doppelzählungen zu
vermeiden. Ihr Informationsgehalt wird berechnet und innerhalb der Arbeitsgruppe wurden neue
mathematische Verfahren entwickelt, um die zu erwartende Anzahl der falsch positiven Funde – mithin die statistische Signifikanz - vorherzusagen [5]. Ein häufig auftretendes Problem bei der Analyse
von Daten aus der funktionalen Genomforschung ist das multiple Testen: Aufgrund der großen Menge
an Daten kann eine Hypothese mit Hilfe vieler Fälle getestet werden. Dies führt aber nur scheinbar zu
beeindruckenden Signifikanzwerten. Um eine realistische Aussage zu erhalten, müssen die resultierenden Signifikanzwerte entsprechend der Anzahl der durchgeführten Tests korrigiert werden, um eine
adäquate Auswertung von biologischen Daten zu gewährleisten.
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Die Regulation der Ausprägung eines Gens wird nicht nur von Transkriptionsfaktoren bestimmt.
Trotzdem muss diese Ebene der Regulation studiert werden, um ein Gesamtbild der verschiedenen
regulatorischen Mechanismen einer Zelle aufzeigen zu können. Damit kommen wir dem umfassenden
Verständnis der Funktion einer lebenden Zelle einen wesentlichen Schritt näher.
Literaturhinweise
[ 1] U. Philippar, G. Schratt, C. Dieterich, J.M. Müller, P. Galgoczy, F.B. Engel, M.T. Keating,
F. Gertler, R. Schule, M. Vingron, A. Nordheim:
The SRF target gene Fhl2 antagonizes RhoA/MAL-dependent activation of SRF.
Mol Cell 2004; 16:867-880
[ 2] C. Dieterich, S. Rahmann, M. Vingron:
Functional inference from non-random distributions of conserved predicted transcription factor
binding sites.
Bioinformatics 2004; 20(Suppl 1):I109-I115.
[ 3] T. Manke, R. Bringas, M. Vingron:
Correlating Protein-DNA and Protein-Protein Interaction Networks.
J Mol Biol 2003; 333:75-85
[ 4] K. Rateitschak, T. Müller, M. Vingron:
Annotating significant pairs of transcription factor binding sites in regulatory DNA.
In Silico Biology 2004; 4:479-487
[ 5] S. Rahmann, T. Müller, M. Vingron:
On the power of profiles for transcription factor binding site detection.
Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology 2003; 2:Article 7
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