Synthese asymmetrischer N-heterozyklischer Carbenkomplexe und

Zusammenfassung
8. Zusammenfassung
In dieser Arbeit sollte die Synthese von N-heterozyklischen Carbenkomplexen und den
entsprechenden Biokonjugaten etabliert werden. Desweiteren sollten erste Untersuchungen
zur Eignung von N-heterozyklischen Carbenkomplexen als biologisch aktive Substanzen
durchgeführt werden. Es wurden vor allem Komplexe analoger Phosphanverbindungen
hergestellt, um den Einfluss des isolobalen Ligandenaustauschs zu beurteilen.[153] Als
Ligandenvorstufe wurden Imidazoliumsalze ausgewählt, die in ihrer Struktur der Aminosäure
Histidin ähneln, ebenso wie Thiazolylalanin als Seitenketten-funktionalisierbare Aminosäure.
Als Biomolekül-Modellverbindungen wurden entweder einzelnen Aminosäuren oder [Leu]Enkephalin-Tyr gewählt, mit der Sequenz H-Gly-Gly-Phe-Leu-OH.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden unterschiedliche Ligandenvorstufen hergestellt, die alle
eine funktionelle Gruppe für weitere Kopplungen beinhalten. Des Weiteren wurden
Thiazolium-Salze von Thiazolylalanin hergestellt, die direkt an ihrer freien Carboxyl-Gruppe
funktionalisiert wurden. Zusätzlich wurden Imidazoliumpeptid-Salze in Lösung und an der
festen Phase (SPPS) synthetisiert, so dass eine spätere Funktionalisierung mit einem
Biomolekül
unnötig
wird.
Ein
Charakteristikum
ist
der
[M-Halogen]+-Peak
im
Massenspektrum (ESI, pos. Modus), der unabhängig von funktionellen Gruppen oder
Heterozyklus (Thiazol, Imidazol) für alle hergestellten Salze gefunden wurde.
Die Herstellung funktionalisierter Carbenkomplexe durch in situ Deprotonierung zum freien
Carben
war
nur
im Falle
Wolframcarbonylkomplex
ließ
von
sich
Verbindung
jedoch
22
nicht
erfolgreich.
weiter
zu
Der
einem
so
erhaltene
Biokonjugat
funktionalisieren.
Daher wurden zur Komplexsynthese NHC-Silber-Komplexe aus den Imidazolium- oder
Thiazoliumsalzen mittels Ag2O hergestellt. Da die Silber-Carbenkohlenstoffbindung durch
ihre Labilität ein ideales Carben-Transferreagenz darstellt, wurden Metallkomplexe von
Ruthenium(II), Rhodium(I, III) und Gold(I, III) durch Transmetallierung dargestellt. Der
Vorteil dieser Methode ist die Toleranz vieler funktioneller Gruppen (Ausnahme
Dreifachbindungen und Carboxylgruppen).
93
Zusammenfassung
Die Imidazoliumsalze ohne Aminosäuren als Reste am Imidazolring ließen sich alle zum
Silbercarben, bzw. zum gewünschten Metallkomplex umsetzen. Wurden im Falle der
Imidazoliumsalze Peptidketten als Seitengruppe am Stickstoffatom eingeführt, so wurde
festgestellt, dass ab einer Peptidlänge von drei Aminosäuren keine Umsetzung mehr zum
gewünschten Komplex auftrat. Problemlos in Lösung darstellbar war z.B. Verbindung 26, die
mit einer Aminosäure an der Seitenkette funktionalisiert ist.
Um längerkettige Peptidkomplexe mittels SPPS herzustellen, wurde in NMR-Studien die
Toleranz
der
Metall-Carben-Kohlenstoffbindung
gegenüber
verschiedenen
TFA-
Konzentrationen bestimmt (Abspaltreagenz), um das geeignete Harz zu ermitteln. Die
Ruthenium-Carbene stellten sich als stabil genug heraus, um an ein Festphasen-gebundenes
Peptid gekoppelt zu werden und anschließend unter leicht sauren Bedingungen abgespalten zu
werden.
Verbindung
wurde
29
daher
mittels
SPPS
hergestellt
und
vollständig
charakterisiert.[123]
N
Ru
N
O
Cl
N
Cl
N
N
Ru Cl
Cl
HN
N
H
N
O
H3CO
O
O
N
H
H
N
O
O
Rh
Cl
N
H
Cl
OH
H
N
O
O
26
29
O
N
H
OCH3
O
30
Abbildung 8.1: Strukturen der Verbindungen 26, 29 und 30.
Für Rhodium-Carbenbiokonjugate wurde auf Kopplung in Lösung zurückgegriffen und
Verbindung 30 als Modellverbindung hergestellt.
Von kationischen NHC-Gold-Komplexen ist hinlänglich bekannt, dass sie antimitochondriale
Eigenschaften aufweisen, und somit großes Potential als Antitumortherapeutikum besitzen.[90,
92, 95]
Die Eignung als Zytostatika wurde in dieser Arbeit für lineare Gold(I, III)-
Carbenkomplexe untersucht.
94
Zusammenfassung
Um den sterischen Anspruch der Imidazolium-Ligandenvorstufen zu erhöhen, wurden Tertbutyl- und Diphenylmethylgruppen eingeführt, wodurch exklusiv lineare NHC-GoldKomplexe hergestellt werden konnten. Alle in dieser Arbeit diskutierten Gold-Carbene sind
vollständig analysiert worden und weisen insbesondere im
13
C NMR charakteristische
chemische Verschiebungen für die Metall-Carbenkohlenstoffbindung auf. Je nach ancillaren
Ligand (S-R, Cl, Br) und Oxidationsstufe des Goldatoms (I, III) wurden typische
Verschiebungen gefunden.
Biologische
Eigenschaften
wie
z.B.
die
Membrandurchlässigkeit
sind
wichtige
physikochemische Parameter, die relevant für die Eignung als potentieller Wirkstoff sind.
Daher wurde auch die Lipophilie, als ein solcher Parameter, von den Rutheniumverbindungen
29 und 32a untersucht. Allerdings konnte der Wasser/n-Octanol-Verteilungskoeffizient logP
nicht bestimmt werden, da die Bildung einer neuen hydrophileren Spezies bei Verwendung
der HPLC-Methode beobachtet wurde. Diese wurde mittels HPLC-Untersuchungen und ESIMassenspektren als Hydrat-Komplexe identifiziert. Anstelle der Metall-Chloridbindung
konnte ein vollständiger Austausch mit Wassermolekülen als wahrscheinlich bestimmt
werden. Dieses Verhalten ist analog bekannter Ruthenium-Aren-Verbindungen (RAPTAKomplexe).[154-156]
Der logP-Wert der Gold-Carbene konnte nur anhand des Löslichkeitverhaltens abgeschätzt
werden, da bei Zugabe von Wasser zu organischen Lösemitteln, teilweise oder vollständige
Präzipitation auftrat (vgl. Abschnitt 6). Die Goldverbindungen werden mit wachsender Größe
der Seitenketten am Stickstoffatom des Imidazolrings immer lipophiler.
Zytotoxische
Untersuchungen
wurden
von
den
Ruthenium-Carbenen
und
den
Goldverbindungen auf den humanen Zelllinien HeLa, HepG2 und HT-29 durchgeführt. Im
Falle der Rutheniumverbindungen wurde keine Wachstumsinhibierung gefunden (IC50 > 500
µM). Daher wurden ihre antimetastatischen Eigenschaften untersucht (s.u.).
Im Falle der lipophilen Gold-Verbindungen konnten für alle getesteten Substanzen IC50Werte bestimmt werden. Der Einfluss der Oxidationsstufe auf die zytotoxischen
Eigenschaften, z.B. durch Reduktion der Gold(III)-Verbindung zu einer Gold(I)-Verbindung
unter Freisetzung von zellschädigendem Brom, konnte nicht gefunden werden.[157]
Auffallend war, dass die unfunktionalisierten Verbindungen (40a-40c) die größte Aktivität
auf diesen Zelllinien aufwiesen, vergleichbar mit Cisplatin. Es ist bekannt, dass NHC-AuFragmente bevorzugt an Schwefel binden. Um den Einfluss der Biokonjugation am Goldatom
95
Zusammenfassung
direkt zu untersuchen, wurden von der Verbindung 40a durch Austausch des ancillaren
Chloridligandens Thiol-Peptidkonjugate hergestellt. Da bei dem Dipeptidkonjugat 42 die
Aktivität bereits stark nachlässt, kann das [NHC-Au]+-Fragment, das in allen Verbindungen
vorhanden ist, nicht alleine ausschlaggebend für die biologische Aktivität sein.
N
Au S
N
N
NHBoc
N
AuCl
Au S
HN
N
O
O
OH
O
O
40a
IC50 :
3.3
NHBoc
N
42
43
17.3
3.4
Abbildung 8.2: IC50- Werte von 40a, 42 und 43 auf HeLa-Zellen (Kristallviolett-Assay).
Die bisher durchgeführten Tests auf antimetastatische Aktivität lassen auf eine
dosisabhängige Inhibierung der Zellablösung der untersuchten humanen, hoch-invasiven
Brustkrebszelllinie MDA-MB-231 schließen. Die Aktivität ist umgekehrt proportional der
Länge des Restes am Imidazolstickstoff und der zunehmenden Komplexität der Seitenkette.
Anscheinend sind kleine unfunktionalisierte Ruthenium-Komplexe, oder RutheniumEthylesterkomplexe besonders geeignet. Im Vergleich mit der antimetastatisch wirkenden
Verbindung NAMI-A zeigten die Verbindungen 31a und 33 gleich gute Eigenschaften. Um
die Eignung der Verbindungen besser zu verstehen, werden aktuell Tests mit anderen
Zelllinien mit unterschiedlich starken invasiven Charakteristika durchgeführt.
Anhand der erhaltenen Ergebnisse für die Ruthenium- und Goldcarbene scheinen zu große
biologische Reste die Aktivität als Zytostatika oder Antimetastatika zu verringern. Dies kann
entweder durch zu hohe Lipophilie der Verbindungen hervorgerufen werden, oder durch eine
Inaktivierung
des
Organometallfragmentes.
Bei
der
Untersuchung
der
Rutheniumverbindungen konnten ähnliche Eigenschaften in Bezug auf biologische Aktivität
und Hydrolyse wie für die Phosphan-Analoga (RAPTA) festgestellt werden. Zukünftig sollten
96
Zusammenfassung
weitere Tests durchgeführt werden, um einen möglichen Wirkmechanismus für das
antimetastatische Verhalten zu finden.
Für weitere Untersuchungen sollte versucht werden, besser wasserlösliche lineare NHC-GoldVerbindungen herzustellen, beispielsweise durch Funktionalisierung am Gold durch gut
wasserlösliche Peptide. Des Weiteren wäre es interessant, die Rhodium(III)-Verbindungen
ebenfalls auf antimetastatisches Verhalten zu untersuchen.
Abschließend bleibt festzuhalten, dass NHC-Komplexe nur bedingt für die Fmoc-SPPS
geeignet sind, da die Metall-Carbenkohlenstoffbindung nur Abspaltbedingungen für extrem
säurelabile Linker toleriert, was die Auswahl an Peptiden stark einschränkt, da viele
Aminosäuren Schutzgruppen tragen, die nur im stark sauren Milieu abgespalten werden
können.
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