Versuch 4

VERSUCH 4: LICHTMIKROSKOPIE
THEORETISCHE GRUNDLAGEN
AUSBREITUNG
DES
LICHTS
Sofern Beugungs- und Interferenzerscheinungen keine Rolle spielen, kann man die Ausbreitung
des Lichts rein geometrisch darstellen.
Ein leuchtender Punkt L wird unmittelbar gesehen, wenn die von ihm ausgehenden Strahlen
ohne Änderung der Richtung in das Auge fallen.
Der Sinneseindruck beruht auf dem Einfall divergierender Strahlen in die Pupille, die auf der
Netzhaut fokussiert werden (Abb. 29).
© 2003 R einer Eckert
Abb. 29: Unmittelbares Sehen.
Wird der Gegenstand L durch eine Sammellinse als Bild B abgebildet, dann sehen wir den
Gegenstand dort, von wo aus die Strahlen zu divergieren scheinen. Dieses reelle Bild kann man
mit einem Schirm sichtbar machen (Abb. 30).
© 2003 Reiner Eckert
Abb. 30: Entstehung eines reellen Bildes.
Betrachtet man den Gegenstand L über einen Spiegel, dann existiert der Divergenzpunkt Bv nur
scheinbar, dieses virtuelle Bild kann nicht mit einem Schirm sichtbar gemacht werden ( Abb. 31).
© 2003 Reiner Eckert
Abb. 31: Entstehung eines virtuelleen Bildes.
59
VERSUCH 4: LICHTMIKROSKOPIE
SEHWINKEL
Um an einem Gegenstand feine Einzelheiten erkennen zu können, muss man nahe an ihn
herangehen. Eng nebeneinander liegende Details sind nur aus der Nähe voneinander zu
unterscheiden, während sie aus größerer Entfernung betrachtet scheinbar miteinander
verschmolzen sind (Beispiel: Text aus 25 cm bzw. 2 m Abstand). Nebeneinander liegende Punkte,
die getrennt wahrgenommen werden, bezeichnet man als aufgelöst.
σ1
σ2
© 2003 Reiner Eckert
Abb. 32: Sehwinkel σ in Abhängigkeit vom
Abstand zwischen Gegenstand und Auge
Die Auflösung wird umso besser, je näher das Objekt vor dem Auge liegt. Je geringer der Abstand
zwischen Gegenstand und Auge ist, desto größer wird der Sehwinkel σ , der also der Auflösung
direkt proportional ist. Den Sehwinkel σ erhält man, wenn man die beiden Enden des
beobachteten Gegenstandes mit der Mitte der Augenpupille verbindet (siehe Abb. 32). Durch die
begrenzte Akkomodationsfähigkeit des menschlichen Auges ist es aber nicht möglich, beliebig
feine Einzelheiten durch immer stärkere Annäherung aufzulösen.
BEZUGSSEHWEITE
UND
AUFLÖSUNG
DES MENSCHLICHEN
AUGES
Zur Entstehung eines scharfen Bildes muss man also eine bestimmte Mindestentfernung
zwischen Gegenstand und Auge einhalten. Diese Mindestentfernung ist aber nicht bei allen
Menschen gleich, sondern hängt von den Eigenschaften der Augen und vom Lebensalter ab. Bei
Kindern und Kurzsichtigen ist sie am kleinsten, nimmt im Laufe des Lebens zu und erreicht bei
Weitsichtigen ihr Maximum. Daraus ergibt sich eine Vielzahl von Mindestentfernungen, aus der
ein Durchschnittswert ermittelt wurde.
In einem Abstand von 25 cm ist die Mehrzahl der Erwachsenen in der Lage, ein Objekt längere
Zeit ohne besondere Anstrengung gerade noch scharf zu sehen. Diese Strecke wurde als kürzeste
durchschnittliche Betrachtungsentfernung festgelegt und wird als konventionelle Sehweite oder
Bezugssehweite bezeichnet. Das Auflösungsvermögen des menschlichen Auges beträgt bei
Betrachtung des Objektes aus konventioneller Sehweite 0,15 - 0,3 mm, d.h. Einzelheiten, die 0,15 0,3 mm auseinander liegen werden noch aufgelöst. Dies entspricht einem Sehwinkel σ von 2' - 4'
(physiologischer Grenzwinkel). Da man aus physiologischen Gründen mit dem bloßen Auge den
Sehwinkel nicht vergrößern kann, benutzt man Glaslinsen zur Steigerung der Vergrößerung
(s.u.).
BRECHUNGSINDEX
Ein Lichtstrahl, der zunächst in Luft verläuft, ändert beim Eindringen in ein Medium mit
anderem Brechungsindex, z.B. Glas, seine Verlaufsrichtung. Man sagt, er wird `gebrochen`.
60
PHYSIKALISCH-TECHNISCHE METHODEN IN DER BIOLOGIE
Diese Lichtbrechung lässt sich berechnen, wenn man senkrecht zur Glasoberfläche durch den
Punkt, in dem der Strahl ins Glas eindringt, eine Gerade zeichnet. Strahl und Lot bilden dann
einen Winkel (Einfallswinkel in der Luft), der größer ist als der Austrittswinkel im Glas. Für
gleichen Übertritt ist jedem Einfallswinkel ein bestimmter Austrittswinkel zugeordnet, der
Proportionalitätsfaktor n bleibt dabei stets gleich:
sin α
sin β
=
= n
sin α ′ sin β ′
nD = 1,33
α
nD = 1,515
α'
Abb. 33: Brechung in unterschiedlichen Medien
Die dimensionslose Zahl n wird als Brechungsindex oder Brechzahl bezeichnet, ihr Wert hängt ab
von der Art des Stoffes, in den das Licht aus der Luft kommend übertritt und von der
Wellenlänge des Lichtes (Dispersion, blaue Strahlen werden stärker gebrochen als rote). Will man
die Brechungsindizes verschiedener Stoffe miteinander vergleichen, muss man Licht gleicher
Wellenlänge benutzen, im allgemeinen die gelbe Strahlung von Natriumdampflampen, deren
Farbton mit dem Buchstaben D gekennzeichnet ist (nD : D = 580 nm).
Beispiel:
nD Wasser= 1,33
nD Luft= 1,00
nD Öl= 1,515
Die Brechungsindizes unterschiedlicher Stoffe sind verschieden, daher muss in Gleichung der
Brechungsindex n durch das Verhältnis der Brechungsindizes der beteiligten Stoffe ersetzt
werden. Wenn beispielsweise ein Lichtstrahl nicht aus der Luft, sondern aus Wasser kommend in
Glas eindringt, lautet die Formel:
nD Glas
sin α
=
sin α ′ nD Wasser
sin α nD Wasser = sin α ′ nD Glas
oder allgemein:
n sin α = n′ sin α ′
(Snelliussches Brechungsgesetz)
61
VERSUCH 4: LICHTMIKROSKOPIE
ABBILDUNG
DURCH SPHÄRISCHE
LINSEN
Die Brechung von Lichtstrahlen an Glas ermöglicht die vergrößernde oder verkleinernde
Abbildung von Gegenständen. Glaslinsen die entweder als Sammel- oder als Zerstreuungslinsen
geschliffen werden, können einzeln (Lupe = Sammellinse) oder in Kombination (Mikroskop,
Photoapparat) zur Abbildung benutzt werden.
SPHÄRISCHE LINSEN
1. Sammellinsen (sind in der Mitte dicker als am Rand)
Bikonvex
Plankonvex
Konkavkonvex
© 2003 Reiner Eckert
Abb. 34 Sammellinsen
2. Zerstreuungslinsen (sind in der Mitte dünner als am Rand)
Bikonkav
Plankonkav
Konvexkonkav
© 2003 Reiner Eckert
Abb. 35: Zerstreuungslinsen
KENNGRÖSSEN
SPHÄRISCHER
LINSEN
Mit rein geometrischer Behandlung der Lichtstrahlen lässt sich eine Abbildung durch
Sammellinsen konstruieren, wofür auf der einen Seite der Linse ein Gegenstandsraum und auf
der anderen Seite ein Bildraum definiert werden (Abb. 36). Auf jeder Seite einer ideal dünnen
(symmetrischen) Sammellinse liegt ein Brennpunkt (F und F') in gleicher Entfernung von der
Mittelebene (M) der Linse auf der optischen Achse. Diese Entfernung entspricht der Brennweite
(f = f') der Linse. Die beiden Hauptebenen H und H' der Linse sind für ideal dünne Linsen
identisch mit der Mittelebene.
62
PHYSIKALISCH-TECHNISCHE METHODEN IN DER BIOLOGIE
Gegenstandsraum
b
Bildraum
f'
Parallelstrahl
F
G
Mitte
lpunk
tstrah
l
Bre
nns
tra
hl
F'
B
f
g
H'
H
M
© 2003 Reiner Eckert
Abb. 36: Strahlengang durch eine Sammellinse
G EOMETRISCH- OPTISCHE BETRACHTUNG
Bei Sammellinsen verläuft die Brechung so, dass sich alle parallel zur optischen Achse
einfallenden Lichtstrahlen in einem Punkt, dem Brennpunkt, treffen. Für ideale, dünne Linsen
soll gelten:
H = H′ = M
n = n′
f = f′
Strahlen werden nur an M gebrochen. Bei Zerstreuungslinsen sind F und F' vertauscht; die
Brennweite erhält ein negatives Vorzeichen. Vernachlässigt man alle Linsenfehler (s.u.), so
besteht zwischen Bildweite b, Gegenstandsweite g und Brennweite f die Beziehung:
1 1 1
= +
f g b
Woraus sich für die Brennweite ergibt:
f=
gb
g+ b
Im Falle dünner Linsen stimmen g und b näherungsweise mit den Abständen von Gegenstand
und Bild von der Mittelebene überein. Berücksichtigt man, dass die Summe g + b = l (Abstand
Bild / Gegenstand) ist, dann erhält man für dünne Linsen die Beziehung:
f=
g ( l − g)
l
63
VERSUCH 4: LICHTMIKROSKOPIE
G
B'
F'
F
b
g
3f
2f
1f
© 2003 Reiner Eckert
Abb. 37: Abbildung durch eine Zerstreuungslinse
Der Abbildungsmaßstab m dünner Linsen ergibt sich aus dem Quotient von Bildgröße zu
Gegenstandsgröße und ist gleich dem Verhältnis von Bildweite zu Gegenstandsweite:
m=
B b
=
G g
Der Abbildungsmaßstab oder auch Maßstabszahl bezieht sich also auf die Abbildung reeller
Bilder. Die Vergrößerung dagegen hängt von der Sehweite ab: man spricht von x-facher
Vergrößerung, wenn die Linse als Lupe wirkt (s.u.). Der Kehrwert der Brennweite (1 / f) wird als
Brechkraft der Linse bezeichnet. Die zugehörige Einheit ist die Dioptrie (dptr). Es gilt: 1 dptr =
1 m-1. Ein positives Vorzeichen vor der Dioptriezahl deutet auf eine Sammellinse hin, ein
negatives Vorzeichen auf eine Zerstreuungslinse.
BILDKONSTRUKTION
Im Idealfall bewirkt eine Linse, dass alle Strahlen, die von einem Gegenstandspunkt P ausgehen
und durch sie hindurchtreten, sich im zugehörigen Bildpunkt P' schneiden. Aus der Vielzahl
dieser Strahlen greift man die heraus, deren Verlauf leicht zu konstruieren ist.
Parallelstrahl
verläuft von P bis M parallel zur optischen Achse; wird an M
durch F' gebrochen
Brennstrahl
verläuft bis M auf der Geraden PF; nach M ist er parallel zur
optischen Achse
Mittelpunktstrahl geht ungebrochen durch den Mittelpunkt der Linse
Der Schnittpunkt dieser drei Strahlen ist Schnittpunkt aller von P ausgehenden Strahlen und
somit der Bildpunkt P'. Entsteht das Bild in Richtung des abbildenden Lichtes hinter der Linse, so
lässt es sich auf einem Schirm auffangen und wird als reell bezeichnet. Liegt der Bildort vor der
Linse oder in einem Linsensystem, so entstehen so genannte virtuelle Bilder. Sie lassen sich nicht
auf einem Schirm auffangen. Die Bildweite erhält ein negatives Vorzeichen. Virtuelle Bilder
können einem reell abbildenden System als Gegenstand dienen (z.B. das Auge als reell
abbildendes System macht aus dem virtuellen Bild, das eine Lupe erzeugt, ein reelles Bild auf der
Netzhaut).
64
PHYSIKALISCH-TECHNISCHE METHODEN IN DER BIOLOGIE
Bei zusammengesetzten Linsensystemen erfolgt die grafische Bildkonstruktion sukzessiv. Das
Bild, das von der dem Gegenstand am nächsten stehenden Linse entworfen wird, dient der
nächsten Linse als Gegenstand; es wird als Zwischenbild bezeichnet. Für die Gesamtbrennweite
eines Systems aus 2 dünnen, idealen Linsen gilt:
1
1 1
d
=
+
+
fges f1 f2 f1 f2
d = Abstand der Mittelebene der beiden Linsen
ABBILDUNGEN
DURCH
S AMMELLINSEN
Sammellinsen sind zur Abbildung von Gegenständen geeignet, wobei die Entfernung zwischen
Gegenstand und Linse wichtig ist. Wenn man für diese Strecke die Brennweite der Linse als
Maßeinheit wählt, ergeben sich allgemein gültige Aussagen, wobei drei wichtige Fälle zu
unterscheiden sind.
B'3
F'
G1
3f
G2
2f
B1
B2
F G
3
1f
© 2003 Reiner Eckert
Abb. 38: Abbildung von Gegenständen durch
eine Sammellinse.
Die mit 1, 2 bzw. 3 gekennzeichneten Pfeile stellen die Gegenstände dar, die mit 1', 2' bzw. 3'
bezeichneten Pfeile die zugehörigen Bilder.
Liegt der Gegenstand in einem Abstand von mehr als zwei Brennweiten vor der Linse, wird er
verkleinert, seitenverkehrt und reell abgebildet. Dabei rückt sein Bild immer näher an die hintere
Brennebene heran, wenn sich der Gegenstand selbst weiter von der Linse entfernt. Diese
Eigenschaft der Sammellinsen wird bei Photoapparaten benutzt, um Gegenstände aus relativ
großer Distanz seitenverkehrt und verkleinert auf den Film abzubilden (Pfeil 1).
Ist der Gegenstand in einer Entfernung von mehr als einer und weniger als zwei Brennweiten vor
der Linse angeordnet, entsteht wiederum ein reelles und seitenverkehrtes, jetzt aber vergrößertes
Bild. Diesen Fall finden wir bei Projektoren und photographischen Vergrößerungsgeräten
verwirklicht (Pfeil 2).
Befindet sich der Gegenstand innerhalb der vorderen Brennweite der Linse, entsteht ein
vergrößertes und seitenrichtiges virtuelles Bild. Dazu kommt es, wenn eine Sammellinse als Lupe
benutzt wird (Pfeil 3).
65
VERSUCH 4: LICHTMIKROSKOPIE
LINSENFEHLER
Eine Sammellinse bildet Gegenstände in Wirklichkeit nicht so störungsfrei ab, wie es Abb. 38
zeigt, denn die einzelnen Spektralfarben werden verschieden stark abgelenkt (s. Brechung) und
die Lichtbrechung ist in den äußeren Zonen einer Sammellinse stärker als in der Mitte. Deswegen
wird ein Gegenstand von einer einzelnen Linse nicht naturgetreu, sondern mehr oder weniger
verzerrt abgebildet. Man spricht von Linsenfehlern, die zu charakteristischen Abbildungsfehlern
führen.

SPHÄRISCHE ABERRATION:
achsennahe und achsenferne Parallelstrahlen werden zu verschiedenen Brennpunkten
hin gebrochen.

CHROMATISCHE ABERRATION:
blaue Strahlen werden stärker gebrochen und schneiden die optische Achse eher als rote.

CHROMATISCHE VERGRÖSSERUNGSDIFFERENZ:
weil blaue Strahlen stärker gebrochen werden, bilden sie einen Gegenstand kleiner ab als
rote.

A STIGMATISMUS :
die Linse ist nicht achsensymmetrisch, sie hat in zwei zueinander senkrechten Richtungen
verschiedene Brennweiten.

BILDFELDWÖLBUNG:
das Bild eines ebenen Gegenstandes liegt nicht auf einer Ebene, sondern auf einer
gewölbten Fläche.

VERZEICHNUNG:
eine quadratische Fläche wird kissen- oder tonnenförmig abgebildet. Die Korrektur dieser
Linsenfehler gelingt teilweise durch Kombination mehrerer, verschieden geformter Linsen
aus unterschiedlichen Glassorten.
LUPE
Das einfachste Instrument zur Vergrößerung des Sehwinkels ist die Lupe. Sie besteht aus einer
Linse (oder einem Linsensystem), deren Brennweite kürzer als die Bezugssehweite ist. Der
Gegenstand muss sich zwischen der Sammellinse und ihrem vorderen Brennpunkt befinden
(Abb. 38 Pfeil 3), das Auge beobachtet in der hinteren Brennebene der Lupe. Damit das Auge
entspannt bleibt, benutzt man die Lupe sinnvollerweise so, dass das Bild im Unendlichen
entsteht. Dazu muss der Gegenstand genau in der vorderen Brennebene der Lupe liegen.
Um die Lupenvergrößerung zu bestimmen, nimmt man an, dass Gegenstand und Bild in
konventioneller Sehweite - also 250 mm vom Auge entfernt - liegen und bildet das Verhältnis aus
66
PHYSIKALISCH-TECHNISCHE METHODEN IN DER BIOLOGIE
den Tangenswerten der beiden Sehwinkel, unter denen Gegenstand und Bild gesehen werden.
Da die Lupe ein virtuelles Bild vom betrachteten Gegenstand entwirft, werden nicht Strecken,
sondern die Sehwinkel miteinander verglichen. Ihr Quotient ist auch dem Verhältnis von
scheinbarer Größe des Bildes B zu Gegenstandsgröße G gleich und heißt Lupenvergrößerung V:
B
250 mm
G
tan σ =
250 mm
B tan β
V=
=
G tan σ
tan β =
wenn g = f, dann gilt
tan β =
G
⇒
f
G
tan β
=
G
tan σ
f
250 mm
250 mm
V=
f
B tan β
V=
=
G tan σ
Man erhält also die Lupenvergrößerung V, indem man die konventionelle Sehweite durch die
Brennweite der Linse dividiert.
B
σ
G'
β
G
f
250
200
150
100
f
50
0 mm
Abb. 39: Sammellinse als Lupe.
EINFACHES,
ZUSAMMENGESETZTES
MIKROSKOP
Ein Mikroskop kann man als Kombination eines Diaprojektors mit einer Lupe beschreiben. Der
Diaprojektor entwirft von einem Diapositiv auf eine transparente Projektionswand ein
vergrößertes, umgekehrtes und seitenverkehrtes Bild. Dieser Teil der Abbildung entspricht der
ersten Vergrößerungsstufe im Mikroskop mit dem Projektionsschirm als Zwischenbildebene und
dem Diapositiv als Präparat. Dieses Bild auf der Projektionswand kann seinerseits noch
67
VERSUCH 4: LICHTMIKROSKOPIE
vergrößert werden, wenn man das durchscheinende Bild hinter der Projektionswand mit einer
Lupe betrachtet. Diese nochmalige Vergrößerung bezeichnet man als zweite Vergrößerungsstufe
im Mikroskop. Die Aufgabe der Lupe übernimmt im Mikroskop das Okular. Das Auge entwirft
schließlich auf der Netzhaut das endgültige Bild.
BAUTEILE
DES
MIKROSKOPS
Okulare
Stativ
Objektivrevolver
mit Objektiven
Objekt
Grobtrieb
Objekttisch
Feintrieb
Kondensor
Beleuchtungseinrichtung
Abb. 40: Durchlicht-Mikroskop
Je nach Grad, in dem bestimmte Abbildungsfehler herabgemildert sind, werden die
Mikroskopobjektive in fünf Klassen eingeteilt, die sowohl Trocken- als auch Immersionsobjektive
umfassen.
•
Achromate: Farbfehler Korrektur (rot und blau)
•
Apochromate: Farbfehler Korrektur für 3 Spektralfarben
•
Fluoritobjektive: Farbfehler Korrektur besser als für Achromate, aber schlechter als für
Apochromat
•
Planchromate: Korrektur der Bildfeldwölbung
•
Planapochromate: Korrektur von Bildfeldwölbung und für 3 Spektralfarben
Auf allen Mikroskopobjektiven sind zusätzlich Angaben zu physikalischen Parametern
angebracht. So bedeutet die Gravur
40 / 0.65
170 / 0,17
dass es sich um ein Trockenobjektiv mit der Maßstabszahl (Vergrößerung) M = 40× und der
numerischen Apertur 0.65 handelt. Ferner ist ersichtlich, dass es für eine mechanische Tubuslänge
von 170 mm und für ein Deckglas der Dicke 0,17 mm ausgelegt ist. Die mechanische Tubuslänge
gibt die Entfernung zwischen dem oberen Tubusrand und der Anschraubfläche des Objektivs an
68
PHYSIKALISCH-TECHNISCHE METHODEN IN DER BIOLOGIE
(immer konstant!). Die optische Tubuslänge gibt die Entfernung zwischen der hinteren
Brennebene des Objektivs und der vorderen Brennebene des Okulars an. Das Deckglas ist rein
rechnerisch ein Bestandteil des Objektivs. Bei Immersionsobjektiven (Abb. 41) werden die
Frontlinse und die Präparatoberfläche mit einem Medium verbunden, das einen höheren
Brechungsindex als Luft aufweist (Öl, Wasser, Glyzerin). Dadurch können Lichtstrahlen mit
einem größeren Einfallswinkel noch zur Abbildung beitragen (höhere numerische Apertur,
dadurch auch höheres Auflösungsvermögen).
Öl
Luft
n = 1,515
n = 1,00
Abb. 41: Wirkung einer Ölimmersion.
Der Kondensor enthält mehrere Linsensysteme und eine Irisblende (Apertur - oder
Kondensorblende), mit der sein Öffnungswinkel stufenlos reguliert werden kann. Dabei wird die
numerische Apertur des Kondensors so verändert, dass jedes Objektiv die seiner numerischen
Apertur entsprechende Lichtmenge erhält.
Die Leuchtfeldblende begrenzt die Öffnung des Kollektors, welcher aus einem Linsensystem
besteht, das die Lampenwendel in die Ebene der Aperturblende abbildet; eine Linse ist mattiert,
damit die Aperturblendenflächen gleichmäßig ausgeleuchtet sind.
Okulare besorgen die zweite Stufe der mikroskopischen Gesamtvergrößerung. Einfache Okulare
(Huygens-Okulare) bestehen aus zwei Linsen, der Augen- und der Feldlinse. Die dem Auge
zugewandte Linse (Augenlinse) wirkt als eigentliche Lupe, während die Feldlinse dafür sorgt,
dass das gesamte Zwischenbild mit der Augenlinse überschaubar wird. Im Tubus befindet sich
eine Lochblende, in deren Öffnung das vom Objektiv entworfene, reelle, vergrößerte
Zwischenbild liegt (Zwischenbildebene). Der Vergrößerungsfaktor des Okulars (V: 6x bis max.
20x) ist auf der Okularfassung eingraviert. Die Vergrößerung des Mikroskops berechnet man
nach:
VM = VObjektiv × VOkular
STRAHLENGANG
Zum genauen Verständnis des Strahlengangs muss auch die Beleuchtungsoptik miteinbezogen
werden. Würde man jedoch einen Projektor ohne diese Optik bauen, so könnte man weder die
Lichtquelle optimal nutzen, noch das Dia gleichmäßig ausleuchten. Das sind aber gerade die
unerlässlichen Voraussetzungen für ein gutes Projektionsbild. Man sammelt daher das
69
VERSUCH 4: LICHTMIKROSKOPIE
Beleuchtungslicht mit Hilfe einer zwischen Lichtquelle und Dia angeordneten
Beleuchtungsoptik. Sie hat die Aufgabe, die ganze leuchtende Fläche (oder die Wendel) der
Lichtquelle in das Objektiv hinein abzubilden. Auf diese Weise wird die Lichtquelle voll genutzt
und das Projektionsbild ist trotz der hellen und dunklen Zonen, die für Lichtquellen
charakteristisch sind, optimal hell und gleichmäßig ausgeleuchtet. Die Beleuchtungsoptik bewirkt
nämlich, dass jeder Punkt der Lichtquelle allein bereits das ganze Dia durchstrahlt, und dass
außerdem dieses Licht auch für die Abbildung voll genutzt wird. Bei dieser optischen Anordnung
"Beleuchtungsoptik-Objektiv" greifen zwei Abbildungen ineinander: die Abbildung des Dias auf
dem Projektionsschirm und die Abbildung der Lichtquelle in das Objektiv. Man spricht deshalb
von einem verflochtenen Strahlengang. Jede der beiden Gruppen konjugierter Ebenen hat also
eine eigene Funktion.
Wir betrachten zunächst den Beleuchtungsstrahlengang (Abb. 42). Dicht hinter der Lichtquelle
befindet sich der Kollektor, welcher meist mit der Lichtquelle zu einer Leuchte vereinigt ist. Der
Kollektor bildet die Lichtquelle in die vordere Brennebene des Kondensors ab. In dieser Ebene
liegt auch die Aperturblende. Die Lichtquelle wird dann weiter durch Kondensor und Objektiv in
dessen hintere Brennebene und schließlich in die Austrittspupille des Okulars abgebildet. Hier
befindet sich die Augenpupille des Beobachters. Diese drei Ebenen bezeichnet man als optisch
konjugiert, weil jede ein optisches Bild der vorhergehenden ist. Das zweite System optisch
konjugierter Ebenen erkennt man im Abbildungsstrahlengang (Abb. 42). Die Leuchtfeldblende
begrenzt die Öffnung des Kollektors. Diese Blende wird durch den Kondensor ins Präparat
abgebildet. Das Objektiv erzeugt in der Zwischenebene ein vergrößertes Bild des Präparates und
der Leuchtfeldblende, das durch das Okular nochmals vergrößert betrachtet wird. Das dritte Bild
der Leuchtfeldblende und das des Präparates entstehen auf der Netzhaut des Auges. Wir haben
damit zwei Gruppen von optisch konjugierten Ebenen, die regelmäßig abwechselnd einander
folgen. Man spricht daher von einem verflochtenen Strahlengang.
70
PHYSIKALISCH-TECHNISCHE METHODEN IN DER BIOLOGIE
Auge
Abbildungsstrahlengang
Beleuchtungsstrahlengang
Okular
Feldlinse
reeles
Zwischenbild
Feldlinse
Austrittspupille
des Objektivs
Objektiv
Objekt
Aperturblende
Leuchtfeldblende
Kollektorlinse
Lichtquelle
Abb. 42: Verflochtener Strahlengang
In diesem Strahlengang müssen auch die Blenden richtig eingestellt sein. Mit der Aperturblende
wird das Bild der Lichtquelle abgeblendet, so dass die von den Objektpunkten ausgehenden
Strahlenkegel breiter oder schlanker werden, was sich auf den Kontrast des Präparates auswirkt.
Die Leuchtfeldblende verändert den Strahlenquerschnitt in der Objektebene. Sie ist stets nur so
weit zu öffnen, dass nicht mehr als das Objektfeld ausgeleuchtet wird.
WELLENOPTIK, AUFLÖSUNG
UND NUMERISCHE
APERTUR
Bisher ist der Strahlengang im Mikroskop nach geometrischen Gesetzen konstruiert worden. Die
Wellennatur des Lichtes blieb bei dieser Betrachtungsweise unberücksichtigt. Da paralleles Licht,
welches eine feine Öffnung passiert, sich hinter dieser Öffnung nicht mehr geradlinig ausbreitet,
sondern gebeugt wird, muss dies auch für mikroskopische Objekte gelten, die aus sehr feinen
Strukturen mit kleinen Öffnungen bestehen. Legt man ein Gitter (z.B. Objektmikrometer) auf den
Objekttisch, fokusiert darauf und schließt die Aperturblende, dann sieht man nach
Herausnehmen des Okulars in der hinteren Brennebene des Objektivs in der Mitte als helles
Zentralbild das Bild der Aperturblende, links und rechts davon erkennt man eine Reihe
lichtschwächerer und farbig gesäumter, sich teilweise überdeckender Nebenbilder. Nimmt man
das Gitter aus dem Strahlengang, dann verschwinden die Nebenbilder, während das Zentralbild
bleibt. Dieses zentrale Hauptbild ist also nach geometrischen Gesetzen entstanden, während die
71
VERSUCH 4: LICHTMIKROSKOPIE
Nebenbilder auf Beugung des Lichtes am Gitter zurückzuführen sind. Die Intensitätsverteilung
des gebeugten Lichtes und damit die Lage der einzelnen Beugungsbilder ist durch Interferenz
bedingt.
Abb. 43 zeigt die Beugung in der Aufsicht. Es sind Wellenfronten und die
Ausbreitungsrichtungen gezeichnet. Die ebene Wellenfront des Beleuchtungslichtes trifft auf
einen Gitterspalt, der das Erregungszentrum von Elementarwellen (Beugung) ist. Interferenz
dieser Elementarwellen mit gleicher Phase führt zu Verstärkung (Maxima 0., 1., 2. Ordnung
usw.). Das übrige Gebiet bleibt dunkel, weil sich die Elementarwellen dort durch Interferenz
auslöschen.
0
1
1
α
d
Abb. 43: Beugung am Spalt
Aus der wellenoptischen Betrachtung ergibt sich unmittelbar die quantitative Beziehung für das
Auflösungsvermögen eines Objektivs. Ein Auflösungsvermögen von 1 mm bedeutet, dass zwei
punktförmige Teilchen im Abstand von 1 mm mit diesem Objektiv gerade noch getrennt
wahrgenommen werden können.
Abb. 44 zeigt einen Ausschnitt des Gitters sowie das 0. und 1. Interferenzmaximum, d ist der
Abstand von Gitterspalt zu Gitterspalt. Die Punkte A und B sind in gleicher Schwingungsphase,
weil mit kohärentem parallelem Licht beleuchtet wurde. C und B sind ebenfalls in Phase, weil AC
= l ist. Bei C liegt ein rechter Winkel, da die Wellenfront AC senkrecht zum gebeugten Bündel
verläuft. Daraus ergibt sich für das Bündel 1. Ordnung:
sin α =
λ
d
Zur Auflösung des Gitters muss das Objektiv also mindestens das abgebeugte Bündel 1. Ordnung
noch aufnehmen, damit in der Zwischenbildebene ein Bild durch Interferenz entstehen kann.
Entscheidend hierfür ist die numerische Apertur des Objektivs, die definiert ist durch:
NA = sin α für Trockenobjektive
NA = n sin α für Immersionen (n = Brechungsindex der Immersionsflüssigkeit)
72
PHYSIKALISCH-TECHNISCHE METHODEN IN DER BIOLOGIE
Hierbei ist α der größte Winkel, den ein Strahl mit der optischen Achse bilden kann, um vom
Objektiv gerade noch aufgenommen zu werden. Demnach löst ein Trockenobjektiv ein Gitter mit
dem Spaltabstand d noch auf, wenn seine Apertur NA = sin α mindestens die Größe λ / d hat.
Als Formel ausgedrückt :
NA =
λ
d
Diese Formel, sie gilt auch für Immersionen, stellt eine gute Näherung des Auflösungsvermögens
bei ausschließlich senkrechter Beleuchtung dar. Die Größe d kann hier auch interpretiert werden
als Abstand zweier benachbarter Objektpunkte, die gerade noch getrennt zu erkennen sind. In
der Praxis arbeitet man jedoch nie mit senkrechter Beleuchtung, also parallelem Licht, und
außerdem ist die Beleuchtungsapertur meist kleiner als die Objektivapertur. In diesem Fall gilt:
d=
λ
NAObjektiv + NAKondensor
Diese Formel sollte man als Faustregel nehmen. Sie gilt für Objekte mit üblichem Kontrast und
setzt normale Farbkontrastempfindlichkeit des Auges voraus.
Bei allen Formeln wurden weiterhin auch einwandfrei korrigierte Objektive vorausgesetzt.
Bildfehler würden das Auflösungsvermögen natürlich beeinträchtigen.
Die numerische Apertur ist aber auch maßgebend für die Lichtstärke und damit die Bildhelligkeit
eines Objektivs. Die Bildhelligkeit verändert sich nämlich unter sonst gleichbleibenden
Bedingungen proportional mit dem Quadrat der Apertur. Blendet man z.B. die Apertur eines
Objektivs auf etwa 70% ab, so sinkt die Bildhelligkeit auf die Hälfte. Dabei vergrößert sich zwar
die Schärfentiefe, gleichzeitig erscheinen jedoch Beugungssäume an allen Bilddetails, was das
Auflösungsvermögen beeinträchtigt.
73
VERSUCH 4: LICHTMIKROSKOPIE
-1. Ordnung
0. Ordnung
+1. Ordnung
Hintere Brennebene
imObkektiv
α
λ
α
α
d
Abb. 44: Bildentstehung durch Beugung
FÖRDERLICHE VERGRÖSSERUNG
Um eine Objektstruktur, z.B. zwei Punkte, im Mikroskop aufzulösen, d.h. sie auch als zwei
Punkte zu sehen, genügt es nicht, nur ein Objektiv entsprechender numerischer Apertur zu
verwenden. Das Bild dieser Objektstruktur muss dem Auge auch unter einem hinreichend
großen Winkel dargeboten werden. Dieser Winkel muss im Minimum etwas größer als das
Auflösungsvermögen des Auges selbst sein. Man muss also vorher ermitteln, wie weit zwei
Punkte in der Bezugssehweite von 250 mm voneinander entfernt sein dürfen, um vom bloßen
Auge aufgelöst zu werden. Bei guter Beleuchtung und entsprechendem Kontrast erhält man als
Abstand hierfür ca. 0.15 mm; das entspricht einem Winkel von 2′ .
Die Auflösungsgrenze des Auges und das wellenoptisch hergeleitete Auflösungsvermögen eines
Objektivs lassen sich miteinander verknüpfen. Sind zwei Punkte mit dem Abstand d gerade an
der Grenze des Auflösungsvermögens des Objektivs, so gilt bei gleicher Objektiv- und
Beleuchtungsapertur:
d≈
λ
2 NA
Dieser Abstand muss nun so viele Male vergrößert werden, bis die Punkte dem Auge mindestens
unter der Distanz von 0,15 mm (entsprechend 2′ ) erscheinen. Also gilt:
λ
= 0, 15 mm
2 NA
0, 15 mm 2 NA
V förderlich =
λ
Vförderlich
Für l = 550 nm = 0,00055 mm ergibt sich:
74
PHYSIKALISCH-TECHNISCHE METHODEN IN DER BIOLOGIE
0, 3 mm NA
0, 00055 mm
= 500 × NA
Vförderlich =
Bsp.:
500× 0,45 (Apertur eines 25× Objektivs) = 225×
●
●
25× Objektiv + 10× Okular → 250× d.h. dies ist mehr als die
förderliche Vergrößerung
25× Objektiv + 8× Okular → 200×
Diese Überlegungen gelten für Objekte mit mittlerem Kontrast. Bei hohem Kontrast kann man
durch entsprechend höhere Vergrößerung die beiden Punkte auch noch auflösen, wenn sie näher
beieinander liegen. Hierzu muss vorausgeschickt werden, dass grundsätzlich jeder Punkt des
Objektes infolge der Wellennatur des Lichtes als Beugungsscheibchen abgebildet wird. Je näher
nun zwei Punkte beieinander liegen, desto mehr überlappen sich die Beugungsscheibchen. Bei
hohem Kontrast heben sich die Beugungsscheibchen vom Umfeld natürlich besser ab. Das Auge
kann dann die Einschnürung an den beiden Überlappungsstellen besser erkennen und
dementsprechend besser auflösen.
Die Erfahrung hat gezeigt, dass man die Gesamtvergrößerung bei solchen Objekten etwa bis
1000×NA steigern kann. Bei Vergrößerungen über 1000×NA erscheinen die Bilder in der Regel
nur noch unscharf. Der Bereich von 500×NA und 1000×NA wird nutzbare oder förderliche
Vergrößerung genannt. Schwächere Vergrößerungen als 500×NA geben brilliantere Bilder, aber
das Auflösungsvermögen des Objektivs wird dabei nicht voll genutzt.
LEERE VERGRÖSSERUNG
Eine Nachvergrößerung des Zwischenbildes wird durch das Okular vorgenommen. Es muss
dafür sorgen, dass auch die feinsten, vom Objektiv eben noch aufgelösten Strukturen mindestens
unter einem Sehwinkel von 2′ erscheinen. Zu starke Okularvergrößerungen sind aber ebenso
schädlich, weil sie zu unscharfen Konturen und zu einem schlechten Bildkontrast führen. Man
spricht von leeren Vergrößerungen, da keine weiteren Einzelheiten mehr aufgelöst werden.
KÖHLERSCHE BELEUCHTUNG
Wie bereits oben beschrieben, wird bei richtiger Beleuchtung die Lichtquelle in die hintere
Brennebene des Objektivs abgebildet. Mit dieser Methode kann allein diejenige Fläche im
Präparat ausgeleuchtet werden, welche die Mikroskopoptik gerade überblickt. Dadurch werden
Überstrahlungen vermieden und Feinstrukturen fallen besser auf. Um diese so genannte
Köhlersche Beleuchtung einstellen zu können, benötigt man eine Mikroskopleuchte mit
Irisblende (Leuchtfeldblende) und einen in der Höhe verstellbaren Kondensor. Bei der
Einstellung geht man wie folgt vor:
●
Kondensor mit eingeklappter Hiflslinse (falls vorhanden) ganz nach oben stellen.
75
VERSUCH 4: LICHTMIKROSKOPIE
Abb. 45: Einstellung der Köhlerschen
Beleuchtung.
Scharfstellen
des
Präparats.
●
Präparat zunächst ohne Rücksichtnahme auf die Qualität der Beleuchtung mit einem 16x
Objektiv oder stärker scharf einstellen.
Abb. 46 Einstellung der Köhlerschen
Beleuchtung.
Leuchtfeldblende
schließen.
●
Leuchtfeldblende schließen; falls vorhanden Hilfslinse ausklappen
Abb. 47: Einstellung der Köhlerschen
Beleuchtung.
Scharfstellen
des
Leuchtfeldblende.
●
76
Kondensor heben und senken, bis das Bild der Leuchtfeldblende im sonst dunklen
Gesichtsfeld scharf umgrenzt ist (Blendenlamellen). Das tritt gewöhnlich dann ein, wenn
der Kondensor ziemlich hoch steht.
PHYSIKALISCH-TECHNISCHE METHODEN IN DER BIOLOGIE
Abb. 48: Einstellung der Köhlerschen
Beleuchtung.
Zentrieren
der
Leuchtfeldblende.
●
Bild der Leuchtfeldblende durch Zentrieren des Kondensors in die Mitte des
Gesichtsfeldes bringen. Hilfslinse wieder einklappen, Punkt 3 wiederholen und Bild der
Leuchfeldblende durch Zentrieren der Hilfslinse in die Mitte des Gesichtsfeldes bringen.
Abb. 49: Einstellung der Köhlerschen
Beleuchtung.
Öffnen
der
Leuchtfeldblende.
Leuchtfeldblende soweit öffnen, bis die Blendenlamellen gerade am Rande des Gesichtsfeldes
verschwinden.
Abb. 50: Einstellung der Köhlerschen
Beleuchtung.
Einstellen
der
Kondensorblende.
77
VERSUCH 4: LICHTMIKROSKOPIE
●
Kondensorblende so weit schließen, bis nur noch 3/4 der sichtbaren Objektivöffnung
ausgeleuchtet sind. Dies kann man überprüfen, wenn man das Okular aus dem Tubus
nimmt und direkt durch den Tubus blickt.
●
Die Bildhelligkeit durch
Lampenspannung anpassen.
●
Beim Wechseln des Objektivs muss (bei guten Mikroskopen) nicht mehr am Kondensor
nachjustiert sondern lediglich die Öffnung der Leuchtfeldblende an das veränderte
Sehfeld angepasst werden.
Einlegen
von
Neutralfiltern
oder
Änderung
der
DUNKELFELDMIKROSKOPIE
Beim Dunkelfeldverfahren sorgt man dafür, dass kein direktes Mikroskopierlicht ins Objektiv
eindringt, sondern an ihm vorbeistrahlt. Dazu ist ein spezieller Kondensor, der sog.
Dunkelfeldkondensor notwendig. Das Gesichtsfeld bleibt dann selbst bei eingeschalteter Lampe
dunkel. Bringt man aber auf den Objekttisch ein Präparat, so wird das Licht von diesem nach
allen Seiten gestreut. Ein Teil des Streulichtes gelangt ins Objektiv, so dass das Präparat hell auf
dunklem Untergrund erscheint. Die Dunkelfeldmethode ist besonders für die Darstellung aller
Arten von Linienstrukturen geeignet, z.B. Kanten, Risse und Geißeln.
Dunkelfeldkondensor mit
Ringblende
Abb. 51: Beugung im Dunkelfeld
PHASENKONTRASTMIKROSKOPIE
Dieses Verfahren erlaubt das Betrachten von ungefärbten Strukturen, die im Hellfeld nahezu
unsichtbar sind. Man unterscheidet in der Mikroskopie Amplituden- und Phasenobjekte. Bei den
ersteren wird die Amplitude der Lichtstrahlen beim Durchstrahlen eines Präparates durch
Absorption verringert, wodurch ein wahrnehmbarer Kontrast zu den Lichtstrahlen entsteht, die
nicht durch das Präparat gegangen sind. Bei dünnen biologischen Objekten wird jedoch kein
Licht absorbiert, dafür ist die optische Weglänge in den Präparaten unterschiedlich. Das aus dem
78
PHYSIKALISCH-TECHNISCHE METHODEN IN DER BIOLOGIE
Präparat austretende Licht ist daher gegenüber dem Vergleichslicht um etwa 90 
phasenverschoben. Man nennt diese Präparate daher Phasenobjekte.
Für Phasenverschiebungen besitzen wir jedoch weder im menschlichen Auge noch in der
photographischen Platte einen geeigneten Empfänger. Beide registrieren nur Unterschiede der
Intensität und der Wellenlänge, also Abstufungen in Helligkeit und Farbe, jedoch nicht
Wellenzüge mit unterschiedlicher Phase.
Ein Teil des Mikroskopierlichtes verläuft geradlinig durch das Objekt und bildet das
Hauptmaximum ("direktes Licht"). Der Rest des Mikroskopierlichtes wird bei
Amplitudenpräparaten durch Beugung am Präparat in neue Richtungen abgelenkt und bildet die
Nebenmaxima (= gebeugtes Licht). Das Zwischenbild kommt durch Interferenz des
Hauptmaximums mit dem gebeugten Licht zustande. Bei Amplitudenpräparaten ist das gebeugte
Licht gegenüber dem direkten Licht in der Zwischenbildebene um 180° phasenverschoben, was
zu guten Interferenzbedingungen führt.
Anders liegen die Verhältnisse bei Phasenobjekten: hier kommt es nur zu geringen
Phasenverschiebungen, die aber durch Eingriffe in den Strahlengang des Mikroskops zu einem
Amplitudenbild umgewandelt werden können. Man muss also das primäre Beugungsbild (es
enthält die gesamte Information über das Objekt) eines Phasenpräparates so ändern, dass es
einen Amplitudenkontrast liefert. Das gebeugte Licht läuft nur mit einer Verzögerung von einer
viertel Wellenlänge hinter dem Hauptmaximum her, daher wird das Licht des Hauptmaximums
zusätzlich so beeinflusst, dass eine Gesamtphasenverschiebung um 180° resultiert.
Beim negativen Phasenkontrast (Bildstrukturen heller als der Untergrund) wird das Licht des
Hauptmaximums so stark gebremst, dass das gebeugte Licht den Phasenvorsprung des
Hauptmaximums gerade einholen kann. Als Bremse wirkt ein Medium von höherem
Brechungsindex. Bei positivem Phasenkontrast muss das Hauptmaximum so beschleunigt
werden, dass es schließlich mit einer halben Wellenlänge (180°) vor dem gebeugten Licht hereilt.
In der Praxis wird es aber um 270° gebremst, so dass im Endeffekt die Phasen der Wellenzüge von
Hauptmaximum und gebeugtem Licht um 180° verschoben sind Abb. 52
Bei positivem wie negativem Phasenkontrast ist also eine strikte Trennung zwischen Haupt- und
Nebenmaxima erforderlich. Dies wird durch eine Ringblende im Kondensor erreicht, so dass das
Hauptmaximum ringförmige Gestalt annimmt, in der hinteren Brennebene des Objektivs auf
einen entsprechenden Phasenring trifft und dort um den gewünschten Betrag in der Phase
verschoben wird (Abb. 52).
Ein Phasenkontrastmikroskop besitzt daher einen mit Ringblende versehenen Kondensor, der
sich in der Höhe verstellen lässt und Objektive, die einen Phasenring enthalten (Kennzeichnung:
Objektiv Ph).
79
VERSUCH 4: LICHTMIKROSKOPIE
a)
2,0
1,5
1,0
E
0,5
0,0
-0,5
-1,0
Anregungslicht
gebeugte Welle
resultierende Welle nach Interferenz
-1,5
-2,0
0π
b)
1π
2π
3π
2,0
1,5
1,0
E
0,5
0,0
-0,5
-1,0
Anregungslicht
gebeugte Welle, phasenverschoben
resultierende Welle nach Interferenz
-1,5
-2,0
0π
c)
1π
2π
3π
2,0
1,5
1,0
E
0,5
0,0
-0,5
-1,0
Anregungslicht 270° phasenverschoben
gebeugte Welle, phasenverschoben
resultierende Welle nach Interferenz
-1,5
-2,0
0π
1π
2π
3π
Abb. 52: Bildentstehung durch Interferenz für a)
Amplitudenobjekt und Phasenobjekt b) ohne und
c) mit Phasenverschiebung des Referenzstrahls
durch eine λ/4-Platte
vom Präparat
gebeugter Strahl
(~90° phasenverschoben)
Phasenring
λ /4-Platte
Ringblende
Abb. 53: Aufbau des Phasenkontrastmikroskops.
80
PHYSIKALISCH-TECHNISCHE METHODEN IN DER BIOLOGIE
EINSTELLEN
DES
PHASENKONTRASTMIKROSKOPES PRÄPARAT
im Hellfeld scharf einstellen
KÖHLERN
●
Mit Phasenkontrast Objektiv und Phasenkondensor die Punkte 1 - 6 durchführen (siehe
Abschnitt Köhlersche Beleuchtung).
●
Am Kondensor die zum Objektiv passende Ringblende einschalten (Objektiv: Ph 2;
Kondensor: 2).
●
Okular gegen das Einstellfernrohr austauschen und auf Phasenring und Ringblende
fokussieren.
●
Ringblende im Kondensor so zentrieren, dass das helle Ringbild mit dem dunklen
Phasenring zur Deckung gebracht wird.
●
Einstellfernrohr wieder gegen das Okular austauschen.
POLARISATIONSMIKROSKOPIE
Bei einem Polarisationsmikroskop befindet sich unter dem Kondensor ein Polarisationsfilter, der
Polarisator. Über dem Objekt - meist zwischen Objektiv und Okular - ist ein weiteres
Polarisationsfilter - der Analysator - angebracht. Mit Hilfe des Polarisators wird linear polarisiertes
Licht erzeugt, mit dem man das Präparat beleuchtet. Polarisationsmikroskope werden zur
Untersuchung von doppelbrechenden Strukturen (Kristalle) verwendet.
INTERFERENZMIKROSKOPIE
Auch hier werden die Phasendifferenzen, die ein Phasenobjekt verursacht, durch Interferenz in
Amplitudenunterschiede umgewandelt. Da zur Interferenz stets zwei Wellenfronten gehören,
wird bei einem Interferenzmikroskop durch optische Bauelemente ein Teil des einfallenden
Lichtes vor dem Durchdringen des Objektes abgespalten und hinter dem Objekt der vom Objekt
deformierten "Objektwellenfront" wieder hinzugefügt. Man unterscheidet vier Grundtypen von
Interferenzmikroskopen:
1. Verfahren mit unbeeinflusster Vergleichswellenfront
2. Verfahren mit totaler Verdopplung
3. Differenzieller Interferenzkontrast (DIK)
4. Vielstrahl-Interferenzverfahren
Für die Betrachtung von Zellen und Gewebe wird meist mit dem DIK-Verfahren nach Nomarski
abgebildet (Abb. 55). Dazu wird das Beleuchtungslicht durch einen Polarisator linear polarisiert
und durch ein Wollastonprisma in zwei Teilwellen aufgespalten. Diese laufen um etwa 1 / 2
Winkelminute auseinander und stehen mit ihrer Schwingungsrichtung senkrecht aufeinander.
Als Spezialfall der Interferenzmikroskopie durchlaufen beide Wellenfronten das (Phasen-)
81
VERSUCH 4: LICHTMIKROSKOPIE
Objekt, in dem sie eine unterschiedliche Phasenverschiebung erfahren. Nach dem Durchtritt
durch das Objektiv werden beide Strahlen durch ein zweites Wollastonprisma zu einem
gemeinsamen Strahl vereinigt und durch den Analysator in eine gemeinsame Schwingungsebene
gebracht. Dadurch sind sie interferenzfähig geworden und erzeugen ein Interferenzkontrast-Bild
des Objekts. In der Objektebene haben die beiden Teilwellen nur einen sehr geringen Abstand
voneinander, daher entsteht ein Gangunterschied in der Phase nur an Kanten eines ebenen
Objektdetails. Gegenüberliegende Kanten der einzelnen Objektdetails können unterschiedliche
Saumeffekte erhalten, so dass plastische Abbildungseffekte zustande kommen.
Zwischenbild
Feldlinse
Analysator
Wolaston-Prisma
Objektiv
Präparat
Kondensor
Wollaston-Prisma
Polarisator
Abb. 54: Prinzip des Strahlengangs für den
differentiellen
Interferenzkontrast
nach
Nomarski.
FLUORESZENZMIKROSKOPIE
Fluoreszenz ist das durch Strahlung angeregte Leuchten eines Stoffes. Das ausgestrahlte
Fluoreszenzlicht hat dabei eine größere Wellenlänge als das eingestrahlte Licht (Stokessche
Regel). Man schickt also in eine Substanz eine relativ energiereiche Strahlung hinein, von deren
Energie ein gewisser (kleiner) Teil in der Substanz selbst absorbiert bzw. umgewandelt wird (z.B.
Wärme). Die nicht absorbierte Strahlungsenergie (welche den weitaus größeren Teil ausmacht)
wird "ungenutzt" von der Substanz wieder abgestrahlt oder "emittiert". Man sagt zu diesem
Vorgang: die Substanz "fluoresziert". Da diese Fluoreszenzstrahlung energieärmer ist als die
Anregungsstrahlung, besitzt sie auch eine größere Wellenlänge als diese. Wenn die Einstrahlung
(Anregung) im nahen UV-Bereich erfolgt, so kann eine Substanz dadurch sichtbar gemacht
werden.
82
PHYSIKALISCH-TECHNISCHE METHODEN IN DER BIOLOGIE
Angeregte
Zustände
Fluorescein
Absoprption
Emission
hν
hν
Grundzustand
λ
Abb. 55: Prinzip der Fluoreszenz; links) JablonskiSchema
der
Fluoreszenzanregung
rechts)
Spektrum eines Fluoreszenzfarbstoffes.
Voraussetzung für die Fluoreszenzmikroskopie ist also das Vorhandensein einer Substanz, die
sich zur Fluoreszenz anregen lässt. Es gibt Substanzen (z.B. Chlorophyll in Blättern, aber auch
einige Öle, Wachse u.a.m.) die natürlicherweise fluoreszieren, sie zeigen "Primärfluoreszenz".
Leider besitzen aber gerade diejenigen Objekte, die in der Mikroskopie untersucht werden
(Zellen, Gewebe, Zellkulturen usw.) außer einem allgemeinen weiß-blauen Leuchten des ganzen
Präparates (unspezifische Eigen- oder Autofluoreszenz, die besonders bei UV- und
Violettanregung auftritt und, da unspezifisch, eher stört als nützt), keine "typische" natürliche
Fluoreszenz. Will man bestimmte Objektstrukturen hervorheben, muss man eine spezifische
Fluoreszenz induzieren, welche an die Teile gekoppelt ist, die man analysieren möchte.
Dies geschieht mittels der sogenannten Fluorochrome (chroma = Farbe). Diese Farbstoffe werden
genauso appliziert wie dies für histologische Färbeverfahren üblich ist. Sie lagern sich dabei
entsprechend ihrer chemischen Eigenschaften und ihrer färberischen Charakteristik in ganz
bestimmten Objektbereichen ein und lassen andere ungefärbt. Der ganze Vorgang wird
"Fluorochromieren" genannt; die so erhaltene Fluoreszenz nennt man "Sekundärfluoreszenz".
Fluorochrome sind bereits in ganz geringen Konzentrationen wirksam; in der normalen
Durchlicht-Mikroskopie erscheinen deshalb fluorochromierte Präparate praktisch farblos.
Trotzdem leuchten diese Präparate hell auf, wenn sie mit dem Licht einer geeigneten
Wellenlänge "angeregt" werden.
Während man früher nur ganz wenige Fluorochrome benutzte (Acridinorange), gibt es
inzwischen eine reiche Auswahl mit verbesserten oder ganz neuen Spezifitäten (wobei man
inzwischen festgestellt hat, dass einige in der Histologie längst bekannte Farbstoffe gleichzeitig
sehr brauchbare Fluorochrome sein können, wenn man sie mit dem Licht geeigneter
Wellenlängen anregt).
APPARATIVE VORAUSSETZUNGEN:


Lichtquelle
Die Lichtquelle muss genügend Strahlung derjenigen Wellenlängen liefern, welche die
gewünschte Fluoreszenz anregen. In der Regel wird dies eine Quecksilber-Höchstdrucklampe
sein, aber auch Halogenlampen und Laser werden dafür eingesetzt.
Erregerfilter
Der Anregungsfilter, auch Erreger- oder Excitationsfilter genannt, darf nur die Strahlung
durchlassen, die für das benützte Verfahren brauchbar bzw. notwendig ist und muss die
83
VERSUCH 4: LICHTMIKROSKOPIE



Wellenlängen der von der Lichtquelle ausgehenden Strahlung zurückhalten, die nicht zur
Anregung beitragen (sollen).
Sperrfilter
Da überschüssiges, im Objekt nicht absorbiertes Erregerlicht die Fluoreszenz-Beobachtung
stören würde, muss es mit einem Sperrfilter am Eintritt in die Okulare gehindert werden.
Sperrfilter werden in der modernen Fluoreszenzmikroskopie auch benutzt, um bestimmte
Spektralbereiche aus der Fluoreszenz-Emission herauszufiltern.
Präparat
Das Präparat muss in der Regel fluorochromiert worden sein.
Strahlengang
Prinzipiell unterscheidet man drei Fluoreszenz-Techniken:
1. Durchlicht-Hellfelderregung
2. Durchlicht-Dunkelfelderregung
3. Auflicht-Hellfelderregung (Epifluoreszenz)
EPIFLUORESZENZBELEUCHTUNG
Für
biologische
Präparate
wird
zur
Fluoreszenzmikroskopie
Auflichtfluoreszenzanregung verwendet (Abb. 56).
vorwiegend
die
Auge
Fluoreszenzlicht
(längere Wellenlänge)
Okular
Anregungslicht
(kurze Wellenlänge)
Emissionsfilter
Dichroitischer
Teilerspiegel
Anregungsfilter
Quecksilberdampflampe
Objektiv
Objekt
Abb.
56:
Strahlengang
Fluoreszenzanregung.
bei
Auflicht-
Bei der Auflichterregung wird das Erregerlicht durch das Mikroskopobjektiv auf das Präparat
geschickt. Das Objektiv dient somit gleichzeitig als Kondensor. Dabei wird das Licht mit Hilfe
eines dichromatischen Teilerspiegels (auch Farbteiler genannt) in den Strahlengang gelenkt.
84
PHYSIKALISCH-TECHNISCHE METHODEN IN DER BIOLOGIE
Dieser Teilerspiegel sorgt für eine saubere Trennung zwischen Anregungs- und
Fluoreszenzstrahlung: die Anregungsstrahlung wird ungeschwächt in das Präparat gelenkt, die
nach der Stokesschen Regel längerwellige Fluoreszenzstrahlung des Präparats geht durch den
Strahlenteiler durch. Bei der Auflichtfluoreszenz trifft die Erregungsstrahlung auf die
Präparatoberseite. Hier entsteht also auch die stärkste Fluoreszenz. Dies ist besonders bei
dickeren Objekten von Vorteil. Durch die hohe Intensität der Erregungsstrahlung kommt es aber
oft zum schnellen "Verblassen" der Fluoreszenz.
EXPERIMENTELLER TEIL
BRENNWEITENBESTIMMUNG
VON
SAMMELLINSEN
Bauen Sie unter Anleitung durch Ihren Betreuer verschiedene Sammel- und Streulinsen auf der
optichen Bank auf und bestimmen Sie deren Brennweiten.
AUFBAU
EINES
MIKROSKOPS
AUF DER OPTISCHEN
BANK
Bauen Sie auf der optischen Bank ein einfaches zusammengesetztes Mikroskop mit Beleuchtung,
Konensorlinse, Objektiv- und Okularlinse auf.



Versuchen Sie damit das „Präparat“ (Dia mit Milimetergitter) auf einen Schirm
(Milchglassfolie) abzubilden. In welche Ebene(n) müssen Sie den Schirm plazieren?
In Welche Ebene(n) müssen Sie den Schirm stellen um die Glühwendel der Lampe
abzubilden?
Berechnen und Vermessen Sie die Vergrößerung Ihres Mikroskops!
ARBEITEN
AM
MIKROSKOP
KÖHLERSCHES BELEUCHTUNGSVERFAHREN
Stellen Sie sich ein einfaches Präparat aus Mundschleimhautzellen auf einem Objektträger her
und stellen Sie dieses im Mikroskop bei einfacher Durchlichtbeleuchtung scharf. Achten Sie beim
Mikroskopieren auch auf eine geeignete Körperhaltung sowie die korrekte Einstellung des
Augenabstandes und bei Brillenträgerokularen der Dioptrienzahl der Okularkorrektur.
Stellen Sie nun unter Anleitung durch Ihren Betreuer eine Köhlersche Beleuchtung ein.
Nachdem Sie dies unter Anleitung geübt haben, wird Ihr Betreuer Ihr Mikroskop dejustieren.
Stellen Sie nun selbständig die Köhlersche Beleuchtung wieder ein.
Weshalb ist dieses Beleuchtungsverfahren bei Durchlichtmikroskopie so wichtig?
VERSCHIEDENE MIKROSKOPIEVERFAHREN
Stellen Sie nun am Mikroskop verschiedene weitere Kontrastverfahren ein und bilden Sie Ihr
Mundschleimhautpräparat damit ab. Die Kursmikroskope verfügen über eine einfache
Dunkelfeldbeleuchtung
sowie
eine
Phasenkontrasteinrichtung.
Üben
Sie
bei
Phasenkontrastbeleuchtung das richtige Einstellen (Köhlern) der Phasenkontrasteinrichtung.
85
VERSUCH 4: LICHTMIKROSKOPIE
GRÖSSENBESTIMMUNG
EINES BIOLOGISCHEN
PRÄPARATES
Setzen Sie in eines Ihrer Kursmikroskope ein Messokular mit Strichplatte ein. Kalibrieren Sie die
Skala der Strichplatte für eine vorgegebene Vergrößerung anhand eines Objektmikrometers.
Bestimmen Sie dann die Größe ihrer Mundschleimhautzellen.
FLUORESZENZMIKROSKOPIE
Stellen Sie für die Fluoreszenzmikroskopie ein einfaches fluorochromiertes Präparat her, indem
Sie Zellen einer Zellkultur im Schälchen mit dem Fluoreszenzfarbstoff Calcein beladen. Geben Sie
dazu 5 µl einer Calcein-AM Stammlösung in DMSO zu einem Petrischälchen mit Zellen
(BICR/M1Rk- Brusttumorzellen der Marshal-Ratte in 36 mm Ø Petrischälchen). Calcein-AM ist
eine ungefärbte Form des Fluoreszenzfarbstoffes, die durch Veresterung an den
Carboxylgruppen lipidlöslich gemacht wurde. Diese Form des Farbstoffes kann somit durch die
Zellmembran ins Zytoplasma gelangen, wo von unspezifischen Esterasen die Esterbindungen
gespalten werden. Dadurch entsteht ein geladener und fluoreszierender Farbstoff, der nun (eine
intakte Plasmamembran vorausgesetzt) in den Zellen verbleibt und dort sichtbar gemacht werden
kann. Calcein fluoresziert bei Blauanregung (480 nm) leuchtend grün (max: 510 nm).
Beim Fluoreszenzmikroskop Zeiss IM35 erfolgt die Anregung im Auflichtfluoreszenzmodus
durch eine 100 W Quecksilberdampflampe (Achtung: das reine Anregungslicht hat einen sehr
hohen UV-Anteil und sollte nicht ins Auge gelangen!!!!). Anregungs und Emissionslicht werden
durch einen Filterblock mit geeigneten Filtern ausgewählt.
Betrachten Sie Ihr Präparat mit dem dafür geeigneten Filtersatz und notieren Sie sich die
Charakteristika von Anregungsfilter, Strahlteiler und Sperrfilter. Diskutieren Sie diese anhand des
Spektrums des Fluoreszenzfarbstoffes (aus dem Molecular Probes Katalog).
LITERATUR
1. Gerlach, D.: Das Lichtmikroskop, Thieme Verlag, Stuttgart, 1985
2. Göke, G.: Moderne Methoden in der Lichtmikroskopie, Kosmos-Wissenschaft,
Franckh'sche Verlagsbuchhandlung Stuttgart, 1988
3. Michel, K.: Die Grundzüge d. Theorie d. Mikroskops, Wiss. Verlag GmbH Stuttgart, 1981
4. Zeiss- und Leitz-Broschüren zu Mikroskop und Mikroskopverfahren
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