IMAGEN Adenovirus [DE]

IMAGEN™ Adenovirus
DE
K610011-2...................50 Tests
1. ZWECKBESTIMMUNG
Der IMAGEN™ Adenovirus-Test ist ein qualitativer, direkter
Immunfluoreszenztest zum Nachweis von Adenovirus Antigen
in klinischen Proben und dient zum Adenovirus Nachweis in
Zellkulturen.
2. EINFÜHRUNG
Adenoviren sind hüllenlose, ikosaedrische DNA Viren. Die
Familie der Adenovien umfaßt 2 Gattungen, Adenoviren
der Säuger (Mastadenoviren) und Adenoviren der Vögel
(Aviaadenoviren).1 Mindestens 47 bekannte Serotypen humaner
Adenoviren wurden nachgewiesen und mit Verfahren wie der
Hämagglutination, Neutralisation, DNA Hybridisierung sowie
Restriktionsendonuklease Analyse der adenoviralen DNA
beschrieben.1,2,3,4
Humane Adenoviren sind mit einer Vielzahl klinischer
Erkrankungen, sowohl bei immunkompetenten als auch
abwehrgeschwächten Patienten assoziiert; dazu gehören
Infektionen des Respirationstrakts, der Konjunktiva und des
Gastrointestinaltrakts.3,5 Infektionen kommen häufig bei Kindern
vor und können sporadisch oder als Ausbrüche auftreten.
Circa 5% der akuten Atemwegserkrankungen bei Kindern
und 10% der fieberhaften Erkrankungen und Pneumonien im
Kindesalter sind mit Adenovirus Infektionen in Zusammenhang
gebracht worden.3,6,7
Adenovirus
Infektionen
des
Auges
können
zu
Pharyngokonjunktivalfieber, Conjunctivitis folicularis oder
epidemischer Keratokonjunktivitis führen.3,8
Die Adenovirus Serotypen 40 und 41 sind häufig mit
Virusgastroenteritis bei Kleinkindern verbunden und sind
für 4 15% der nosokomialen Infektionen auf Kinderstationen
verantwortlich.3,9,10 Bei abwehrgeschwächten Patienten (z. B. nach
Transplantationen oder bei AIDS Patienten) können ernsthafte
systemische Infektionen auftreten, die lebensbedrohlich sein
können.3
Die Labordiagnose der Adenovirus Infektion spielt eine wichtige
Rolle für die Behandlung der Patienten und ermöglicht eine
wirksame Kontrolle von Ausbrüchen. Zu den diagnostischen
Methoden zählen der direkte Nachweis des Virus oder der
Virusproteine in klinischen Proben (z. B. nasopharyngealen
Absaugsekreten), die Isolierung des lebensfähigen Virus auf
Einschicht Zellkulturen, die mit Atemwegs , Konjunktival
oder Stuhlproben inokuliert wurden und der Nachweis
adenovirusspezifischer Immunglobuline.3,5
Die Isolierung der Adenoviren aus klinischen Proben erfolgt mit
kontinuierlichen Zelllinien hauptsächlich epithelialen Ursprungs,
wie HeLa , HEp 2 , KB und 293 Zelllinien, bei denen Adenoviren
den charakteristischen zytopathischen Effekt zeigen können.3,5
Die Identifikation von Adenovirus-Isolaten ist mit Hilfe
verschiedener Techniken bestätigt worden; zu ihnen gehören
Neutralisationstests, Radioimmunoassay, DNA Hybridisierung,
Elektronenmikroskopie und DNA Elektrophorese.11,12,13,14,15 Diese
Verfahren sind kompliziert, arbeitsaufwendig und meist für die
routinemäßige Anwendung ungeeignet.
Kürzlich wurden indirekte Immunfluoreszenztests oder
Enzymimmunoassays (z. B. IDEIA™ Adenovirus) zum direkten
Nachweis von Adenoviren in klinischen Proben oder auf EinschichtZellkulturen beschrieben, bei denen gattungsspezifische monooder polyklonale Antikörper eingesetzt werden.15,16,17
Direkte Immunfluoreszenztests, bei denen spezifische
monoklonale Antikörper zur Anwendung gelangen, bieten
eine schnelle, empfindliche und spezifische Methode zum
direkten Nachweis von Adenoviren in klinischen Proben wie
nasopharyngealen Absaugsekreten und Konjunktivalabstrichen
oder zur Bestätigung isolierter Adenoviren auf EinschichtZellkulturen.
IMAGEN Adenovirus ist ein direkter Immunfluoreszenztest zum
Nachweis und zur Identifikation humaner Adenovirus Serotypen
in klinischen Proben oder Zellkulturen. Im Test gelangt ein
gattungsspezifischer monoklonaler Antikörper zur Anwendung,
der ein Epitop des Adenovirus-Hexonproteins nachweist, das
in allen bekannten humanen Adenovirus Serotypen exprimiert
wird.18
3. TESTPRINZIP
Der IMAGEN Adenovirus Test enthält Fluoresceinisothiocyanat(FITC-) konjugierte monoklonale Antikörper. Das konjugierte
Reagenz bindet spezifisch an ein Epitop, das dem Hexonprotein
aller Serotypen humaner Adenoviren gemein ist. Das Reagenz
wird in einem direkten Einschritt Immunfluoreszenztest
eingesetzt. Die Proben werden mit dem FITC konjugierten
Antikörper 15 Minuten inkubiert und anschließend wird
überflüssiges Reagenz durch Waschen mit phosphatgepufferter
Kochsalzlösung (PBS) entfernt. Die gefärbten Flächen werden
eingedeckt und anhand der Epifluoreszenz-Mikroskopie
ausgewertet. Falls Adenoviren vorliegen, ist im Zytoplasma
und/oder Zellkern infizierter Zellen eine charakteristische helle,
apfelgrüne Fluoreszenz zu beobachten, die im Kontrast zur roten
Hintergrundfärbung nicht infizierter Zellen steht.
5.
GELIEFERTE REAGENZIEN
N 50 - Jeder Testkit enthält ausreichend Reagenzien für
die Durchführung des Tests an 50 Patientenproben oder an 50
Zellkulturpräparationen.
- Die Haltbarkeit des Testkits ist auf dem äußeren
Verpackungsetikett vermerkt.
5.1. IMAGEN ADENOVIRUS REAGENZ
Bestellnummer
N
in
der
5.2.3
REAGENZ -
Gebrauchsfertig. Das Reagenz bei 2 8°C im Dunkeln aufbewahren
und vor Gebrauch 5 Minuten lang auf Raumtemperatur (15 30°C)
bringen.
REAGENZIEN
UND
Frisches Azeton (zur Fixierung).
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,5, zum Waschen
der gefärbten Proben und zur Probenvorbereitung.
x als Positivkontrolle vorgesehene
2
Objektträger mit 1 Vertiefung
und Azeton fixierten humanen
Epithelzellen (HEp 2), die mit
Adenovirus infiziert sind.
6.2. ZUBEHÖR UND GERÄTE
Die folgenden Produkte sind für die Anwendung zusammen mit
IMAGEN Adenovirus bestimmt. Weitere Informationen können
vom zuständigen Händler angefordert werden.
Jeweils ein Fläschchen der folgenden Reagenzien:
Von der zuständigen vom zuständigen Händler können Teflonbeschichtete Glasobjektträger mit einer einzelnen Vertiefung
mit einem Durchmesser von 6mm bezogen werden (100
S611430-6).
Objektträger pro Gebinde;
Ein
Fläschchen
mit
3mL
Eindeckmedium. Das Eindeckmedium
enthält eine Hemmsubstanz gegen
lichtbedingtes Ausbleichen in einer
Glyzerinlösung (pH 10,0) und ist bei 2
8°C aufzubewahren.
Positiver Kontrollobjektträger (
Präzisionspipette und Einmal-Pipettenspitzen, 25µL.
Waschtrog.
Deckgläser zum Eindecken einer Vertiefung mit 6mm
Durchmesser.
Nicht fluoreszierendes Immersionsöl.
Epifluoreszenz Mikroskop mit einem Filtersystem für
FITC (maximale Anregungswellenlänge 490nm, mittlere
Emissionswellenlänge 520nm) und 200 500facher Vergrößerung.
Inkubator für 37°C.
Niedertourige Zentrifuge.
5.2. ANSETZEN,
LAGERUNG
UND
VERWENDUNG DER KIT-KOMPONENTEN
S611330-2).
7. AUSSTATTUNGEN
Es werden folgende Ausstattungen benötigt:
E in Fläschchen mit 1,4mL IMAGEN
Adenovirus Testreagenz. Das Reagenz
enthält
gereinigten,
murinen,
monoklonalen Antikörper, spezifisch
gegen ein gemeinsames Epitop
am Adenovirus-Hexonprotein und
mit FITC konjugiert. Das Konjugat
wurde in einer proteinstabilisierten
Pufferlösung (pH 7,5) angesetzt,
enthält
Evans-Blau
als
Gegenfärbemittel und 15mmol/L
Natriumazid als Konservierungsmittel.
Der in diesem Test verwendete monoklonale Antikörper stammt
aus der Division of Microbiological Reagents and Quality
Control, Central Public Health Laboratory, Colindale, London,
Großbritannien.
überall
EINDECKMEDIUM -
Gebrauchsfertig. Bei 2 8°C lagern. Das Eindeckmedium vor
Gebrauch 5 Minuten auf Raumtemperatur (15 30°C) bringen.
6. ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE
ERFORDERLICHES ZUBEHÖR
6.1. REAGENZIEN
Eine Gebrauchsanleitung.
Anerkennung
4. DEFINITIONEN
Die nachfolgenden Symbole wurden
Produktbeschreibung angewandt:
5.2.2
ERNEUTE
Für direkte Proben
Sterile Tupfer.
Gebrauchsanweisung beachten
Um optimale Leistung der Kit-Komponenten sicherzustellen,
müssen alle nicht genutzten Komponenten in Übereinstimmung
mit den folgenden Anleitungen gelagert werden:
Schleim Extraktor (nur für nasopharyngeale Proben).
Inhalt ausreichend für ‚n’ Ansätze
5.2.1
–
Sterile Tupfer und Virus Transportmedium (VTM) und Behälter,
geeignet für Gewinnung und Transport von Adenoviren.
Als Positivkontrolle dienende Objektträger werden einzeln
in versiegelten und mit Stickstoff gefüllten Kunststoffbeuteln
geliefert. Nicht verwendete Objektträger bei 2 8°C lagern. Vor
dem Öffnen den Objektträger 5 Minuten lang Raumtemperatur
(15-30°C) annehmen lassen.
Für das Anlegen einer Kultur und für die Isolierung von
Adenoviren geeignete Zelllinien.
Hersteller
In-Vitro-Diagnostikum
Verwendbar bis
Chargenbezeichnung
Zulässiger Temperaturbereich
POSITIVE
KONTROLLOBJEKTTRÄGER
Die Objektträger müssen unmittelbar nach dem Öffnen der
Folienhüllen angefärbt werden.
Zur Zellkultur Bestätigung
8. VORSICHTSMASSNAHMEN
- In vitro Diagnostikum. Personen, die Tests mit diesem
Produkt durchführen, müssen in die Durchführung eingewiesen
sein und über entsprechende Laborerfahrung verfügen.
8.1. SICHERHEITSMASSNAHMEN
8.1.1
Das IMAGEN Adenovirus-Testreagenz enthält <0.1%.
Natriumazid. Natriumazid ist ein Gift, das mit Blei
und Kupferleitungen reagieren und hochexplosive
Metallazide bilden kann. Beim Entsorgen der
azidhaltigen Materialien immer mit reichlich Wasser
spülen.
8.1.2
8.1.3
8.1.4
denoviren auf den positiven Kontrollobjektträgern
A
haben sich in Zellkulturen nachweislich als nicht
infektiös erwiesen; trotzdem sind sie als potentiell
infektiös zu handhaben und zu entsorgen.
Das Reagenz enthält Evans-Blau. Obwohl die in dem
Produkt vorhandene Konzentration zu gering ist, um als
karzinogen klassifiziert zu werden, sollte Hautkontakt
vermieden werden.
ei Verwendung des Eindeckmediums muss vorsichtig
B
vorgegangen werden, da es Hautirritationen
verursachen kann. Falls es zu einem Kontakt kommt,
muss die Haut mit Wasser abgewaschen werden.
8.1.5
E ssen, Trinken, Rauchen, Aufbewahren und Zubereiten
von Speisen sowie Schminken sind im für Arbeiten
vorgesehenen Bereich (Labor) verboten.
8.1.6
eagenzien dürfen nicht mit dem Mund pipettiert
R
werden.
8.1.7
eim Handhaben von klinischen Proben und infizierten
B
Zellen sind immer Einweghandschuhe zu tragen und
nach dem Umgang mit infektiösen Stoffen sind immer
die Hände zu waschen.
8.1.8
lle klinischen Proben entsprechend den geltenden
A
gesetzlichen Vorschriften entsorgen.
8.1.9
on fachlich qualifizierten Anwendern kann ein
V
Sicherheitsdatenblatt angefordert werden.
8.2. TECHNISCHE VORSICHTSMASSNAHMEN
8.2.1
8.2.2
8.2.3
8.2.4
it-Komponenten dürfen nach Ablauf des auf den
K
Etiketten vermerkten Verfalldatums (Verwendbar
bis:) nicht mehr verwendet werden. Reagenzien aus
verschiedenen Chargen dürfen nicht vermischt oder
gegeneinander ausgetauscht werden.
ie
D
Reagenzien
werden
in
festgelegten
Arbeitskonzentrationen geliefert. Die Testleistung
wird beeinträchtigt, falls Reagenzien modifiziert oder
unter anderen als den in Abschnitt 5 spezifizierten
Bedingungen gelagert werden.
ie erforderliche Menge phosphatgepufferter
D
Kochsalzlösung (PBS) ist am Tag der Anwendung frisch
anzusetzen.
aschschritte müssen mit PBS durchgeführt werden.
W
Die Verwendung anderer Waschlösungen, wie z.B:
Leitungswasser oder destilliertes Wasser, beeinträchtigt
die Testergebnisse.
8.2.5
ikrobielle Kontamination der Reagenzien muss
M
vermieden werden.
8.2.6
Die Reagenzien dürfen nicht tiefgekühlt werden.
9. GEWINNUNG UND VORBEREITUNG DER
PROBEN19
Gewinnung und Vorbereitung der Proben sind bei der Diagnose
von Adenoviren mittels direkter Immunfluoreszenz und Zellkultur
Methoden von grundlegender Bedeutung. Proben müssen vom
Infektionsort zum Zeitpunkt der maximalen Freisetzung von
Viren („viral shedding“) gewonnen werden, damit sie so viel
infiziertes Material als möglich enthalten.
Außerdem müssen Proben so vorbereitet werden, dass entweder
intakte Zellen erhalten bleiben, die von anhaftendem Mukus
usw. frei sind und eine direkte mikroskopische Untersuchung
ermöglichen oder dass die Lebensfähigkeit der Viren in Proben
erhalten bleibt, anhand derer eine Kultur angelegt werden soll.
9.1. KLINISCHE PROBEN
9.1.1
Ophthalmische Proben
Gewinnung
Das Auge lokal betäuben, anschließend die obere und untere
Konjunktiva freilegen. Ein Stäbchen mit einer Watte oder
Dacron™ Spitze kräftig über die Flächen der oberen und unteren
Konjunktiva streichen und das Stäbchen während dieses
Prozesses rotieren, um sicherzustellen, dass die Probe von der
gesamten Fläche der Konjunktiva gewonnen wird.
Vorbereitung der Objektträger
Das zur Probengewinnung genutzte Wattestäbchen mit leichtem
Druck innerhalb der 6mm Vertiefung auf dem Objektträger
hin und her rollen. Sicherstellen, dass zum Vorbereiten des
Objektträgers die gesamte Stäbchenspitze verwendet wird.
Probe bei Raumtemperatur (15-30°C) an der Luft trocknen
lassen und daraufhin 10 Minuten lang mit frischem Azeton
fixieren. Objektträger an der Luft trocknen lassen. Falls der
Objektträger nicht sofort angefärbt wird, kann er über Nacht bei
4°C aufbewahrt werden.
9.1.2
Nasopharyngeale Sekrete/Absaugsekrete
Gewinnung
Proben aus dem nasopharyngealen Bereich durch eine Sonde
(Größe 8) in einen Mukusextraktor gewinnen. Mukusextraktor
und Schlauchmaterial müssen bei Temperaturen 2-8°C
gehalten und so schnell als möglich zur Verarbeitung ans Labor
weitergeleitet werden.
Zellseparation
Falls notwendig, der Probe vor Zentrifugation 2mL
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) zugeben, um die
Viskosität zu verringern und den Schleim zu verdünnen. Den
Schleim Extraktor bei Raumtemperatur (15 - 30°C) 10 Minuten
bei 380g zentrifugieren. Den Überstand, der für Zellkulturen
verwendet werden kann, entfernen. Das Zellsediment in
2mL PBS resuspendieren und die Zellen mit einer Weitschaft
Pipette vorsichtig auf und ab pipettieren oder in einem Vortex
Gerät vorsichtig mischen, bis der Schleim separiert und das
Zellmaterial freigegeben wird. Heftiges Pipettieren/Mischen ist
zu vermeiden, um eine Beschädigung der Zellen zu verhindern.
Sobald sich eine gleichmäßige Suspension gebildet hat, je nach
Bedarf weitere PBS zugeben und nach Zugabe der zusätzlichen
PBS wieder pipettieren oder in einem Vortex Gerät mischen, um
die Zellen weiter zu waschen. Jegliche sichtbaren, bis zu diesem
Stadium noch verbliebenen Schleimteilchen entfernen und
entsorgen. Überschüssiger Schleim muss entfernt werden, weil
sonst eine adäquate Penetration des Reagenzes verhindert wird,
was zu einer unspezifischen Fluoreszenz führen kann.
Falls das ganze Sekret in der Ernährungssonde verbleibt und
nichts davon den Schleim Extraktor erreicht, das gesamte
Sekret aus der Sonde in PBS herauswaschen. Das wird am
besten erreicht, indem eine Pasteur Pipette in das Sondenende
eingeführt wird, das sich am Schleim Extraktor befand. Die
entsprechende Flüssigkeit in die Sonde saugen und wiederholt
hinausdrücken, bis sich das an der Sondenwand befindliche
Sekret gelöst hat. Die so erhaltene Suspension wird solange auf
und ab pipettiert, bis der Schleim adäquat aufgebrochen ist.
Vorbereitung der Objektträger
Nach der Separation wird die Zellsuspension bei Raumtemperatur
(15 - 30°C) 10 Minuten bei 380g zentrifugiert und der Überstand
entsorgt. Das Zellsediment in ausreichend PBS resuspendieren,
um jegliche verbliebenen Schleimreste zu verdünnen und
gleichzeitig eine hohe Zelldichte beizubehalten. 25µL des
resuspendierten Zellsediments in die 6mm große Vertiefung
eines teflonbeschichteten Mikroskopobjektträgers geben.
Die Probe bei Raumtemperatur (15 - 30°C) gründlich trocknen
lassen und in frischem Azeton bei Raumtemperatur (15 - 30°C)
10 Minuten fixieren. Wird die Probe nicht sofort gefärbt, ist
sie über Nacht bei 4°C aufzubewahren oder für eine längere
Aufbewahrungszeit bei –20°C einzugefrieren.
9.2. ZELLKULTUR
Beimpfung von Zellkulturen
Zur Diagnose von Adenovirus Infektionen gewonnene
Proben werden auf Zelllinien inokuliert, die in Laboratorien
routinemäßig und nach etablierten Labormethoden zur
Anwendung gelangen. Zellkulturen sind regelmäßig auf das
Auftreten zytopathischer Effekte (cytopathic effect, CPE) zu
untersuchen und es sind regelmäßige Hämadsorptionstests
durchzuführen. Im Hämadsorptionstest positive Kulturen oder
CPE aufweisende Zellkulturen können geerntet und auf das
Vorliegen des Adenovirus getestet werden.
Vorbereitung der Objektträger
Wird mit einer Adenovirus Infektion konsistente Hämadsorption
oder CPE beobachtet, dann kann die Monolayer-Kultur geerntet
werden, wenn mindestens 50% der Zellen betroffen sind.
Die Zellschicht mit einer sterilen Pipette in das flüssige
Kulturmedium schaben. Die Zellen durch 10 minütige
Zentrifugation bei 200g und Raumtemperatur (15-30°C)
sedimentieren und den Überstand entsorgen.
Die Zellen durch Resuspension des Zellsediments in
phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, siehe Abschnitt 8.2)
waschen und die Zentrifugation wiederholen. Den Überstand
entsorgen und das Zellsediment in einer kleinen Menge frischer
PBS resuspendieren, um eine hohe Zelldichte beizubehalten.
Je 25µL der Suspension in die Vertiefungen der Objektträger
geben. Gründlich an der Luft trocknen lassen und in frischem
Azeton 10 Minuten bei Raumtemperatur (15-30°C) fixieren.
Wird die Probe nicht sofort angefärbt, ist sie über Nacht bei
4°C aufzubewahren oder, falls eine längere Aufbewahrung
vorgesehen ist, bei –20°C einzufrieren.
10. TESTVERFAHREN
VOR DURCHFÜHRUNG DES TESTVERFAHRENS SIND
DIE IN ABSCHNITT 8.2 AUFGEFÜHRTEN TECHNISCHEN
VORSICHTSMASSNAHMEN ZU BEACHTEN.
10.1.ZUSETZEN DES REAGENZES
25µL Reagenz in jede 6mm Vertiefung geben. Dafür sorgen, dass
das Reagenz den gesamten Bereich der Vertiefung bedeckt.
10.2.ERSTE INKUBATION
Die Objektträger 15 Minuten bei 37°C in einer feuchten Kammer
inkubieren. Das Reagenz darf nicht auf der Probe eintrocknen,
da dies zu unspezifischer Anfärbung führt.
10.3.WASCHEN DES OBJEKTTRÄGERS
Überschüssiges Reagenz mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung
(PBS) abwaschen und den Objektträger anschließend in einem
Schüttelbad, das PBS enthält, 5 Minuten vorsichtig waschen. Die
PBS vom Objektträger abfließen lassen und bei Raumtemperatur
(15-30°C) lufttrocknen.
10.4.ZUSETZEN VON EINDECKMEDIUM
Einen Tropfen IMAGEN Adenovirus Eindeckmedium in die Mitte
jeder Vertiefung geben und mit einem Deckglas eindecken;
sicherstellen, dass dabei keine Luftblasen entstehen.
10.5.ABLESEN DES OBJEKTTRÄGERS
Die gesamte 6mm große Testfläche, auf der sich die gefärbte Probe
befindet, mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop untersuchen. Wie
in Abschnitt 9 beschrieben, sollte die Fluoreszenz bei 200 500
facher Vergrößerung sichtbar sein.
(Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn die Proben
unmittelbar nach dem Anfärben abgelesen werden; Proben
können aber auch bis zu 24 Stunden bei 2-8°C im Dunkeln
aufbewahrt werden).
11. INTERPRETATION DER TESTERGEBNISSE
11.1.KONTROLLEN
11.1.1 Positive Kontrollobjektträger
Beim positiven Kontrollobjektträger, der gemäß Abschnitt 10
angefärbt und abgelesen wurde, sollten Zellen mit intrazellulärer
nukleärer
und/oder
zytoplasmatischer
apfelgrüner
Fluoreszenz sichtbar werden, die mit einem roten Hintergrund
gegengefärbten Materials kontrastiert. Diese Zellen sind etwas
größer als Epithelzellen der Atemwege oder Konjunktiva, weisen
aber bei Infektion mit Adenovirus ähnliche intrazelluläre,
nukleäre und/oder zytoplasmatische Fluoreszenz auf. Positive
Kontrollobjektträger müssen verwendet werden, um überprüfen
zu können, dass das Testverfahren ordnungsgemäß durchgeführt
wurde.
11.1.2 Negative Kontrolle
Falls eine negative Kontrolle erwünscht ist, empfiehlt sich die
Verwendung von nicht infizierten, intakten Zellen des Typs,
der zur Kultur und Isolierung von Adenoviren verwendet wird.
Die Zellen sind wie in Abschnitt 9.2 beschrieben zu präparieren
und zu fixieren und anschließend gemäß der Beschreibung in
Abschnitt 10 anzufärben.
11.2.KLINISCHE PROBEN
11.2.1 Erscheinungsbild Adenovirus infizierter Zellen
Intrazelluläre, nukleäre und/oder zytoplasmatische, granuläre
apfelgrüne Fluoreszenz wird bei mit Adenovirus befallenen
Epithelzellen der Atemwege oder Konjunktiva sichtbar.
Nicht infizierte Zellen sind bei Gegenfärbung mit Evans Blau rot
angefärbt.
11.2.2 Interpretation der Ergebnisse
Eine positive Diagnose wird gestellt, wenn eine oder mehrere
Zellen der fixierten angefärbten Probe die typische, in Abschnitt
11.2.1 beschriebene Fluoreszenz aufweisen.
Eine negative Diagnose wird gestellt, wenn die fixierten Proben
nach Anfärbung mit dem Reagenz keine Fluoreszenz aufweisen.
Bei direkt angefärbtem nasopharyngealem Absaugsekret
oder bei ophthalmischen Proben müssen mindestens 20 nicht
infizierte Epithelzellen der Atemwege oder Konjunktiva sichtbar
sein, um ein negatives Ergebnis zu rechtfertigen. Siehe Abschnitt
11.2.3, wenn zu wenig Zellen vorliegen.
11.2.3 beschriebene Fluoreszenz aufweisen.
Falls auf dem Objektträger zu wenig Zellen vorhanden sind,
wird der Rest der klinischen Probe 10 Minuten bei 380g und
Raumtemperatur (15 30°C) zentrifugiert. Die Zellen werden
in einer kleineren Menge PBS resuspendiert (25µL), bevor sie
wieder in der Vertiefung des Objektträgers aufgebracht werden.
Alternativ hierzu sollte eine neue klinische Probe angefordert
werden.
11.3.BESTÄTIGUNG IN DER ZELLKULTUR
11.3.1 Erscheinungsbild Adenovirus infizierter Zellen
Infizierte Zellen weisen eine intrazelluläre, nukleäre und/oder
zytoplasmatische apfelgrüne Fluoreszenz auf und werden als
Adenovirus-positiv registriert.
Nicht infizierte Zellen werden durch Evans-Blau rot gegengefärbt.
11.3.2 Interpretation der Ergebnisse
Eine positive Diagnose wird gestellt, wenn mindestens eine
fixierte Zelle nach der Anfärbung das in Abschnitt 11.3.1
beschriebene Fluoreszenzmuster aufweist.
Ein negatives Ergebnis sollte erst dann registriert werden, wenn
in der untersuchten Zellkultur mindestens 50 nicht infizierte
Zellen vorliegen. Sollten zu wenig Zellen vorhanden sein, siehe
Abschnitt 11.3.3.
11.3.3 Zu wenig Zellen
Falls auf dem Objektträger zu wenig Zellen vorhanden sind,
wird der Rest der klinischen Probe 10 Minuten bei 200g und
Raumtemperatur (15-30°C) zentrifugiert. Die Zellen werden
in einer kleineren Menge PBS resuspendiert (25µL), bevor sie
wieder in der Vertiefung des Objektträgers aufgebracht werden.
Alternativ hierzu werden frische Monolayer mit einer neu
gewonnenen Probe beimpft und die Zellkultur wird erneut
angelegt.
12. BEGRENZUNGEN DER METHODE
12.1.Nur das mit dem IMAGEN Adenovirus Test gelieferte
Eindeckmedium verwenden.
12.2.Das Erscheinungsbild der erzielten Fluoreszenz kann
abhängig vom Typ des Mikroskops und der benutzten
Lichtquelle unterschiedlich sein.
12.3.Es empfiehlt sich, zum Abdecken des gesamten 6mm
großen Testareals 25µL Reagenz zu verwenden. Eine
Reduzierung dieses Volumens kann zu Schwierigkeiten
beim Abdecken der von der Probe eingenommenen Fläche
führen und die Testempfindlichkeit herabsetzen.
12.4.Alle
Reagenzien
werden
in
festgelegten
Arbeitskonzentrationen geliefert. Die Testleistung kann
beeinträchtigt werden, falls Reagenzien modifiziert
oder unter anderen als den in Abschnitt 5 spezifizierten
Bedingungen gelagert werden.
12.5.Faktoren wie unangemessene Probengewinnung, falsche
Probennahme und/oder Probenhandhabung, Versagen der
Zellkultur usw. können dazu führen, dass Adenoviren nicht
nachgewiesen werden. Ein negatives Resultat schließt die
Möglichkeit des Vorliegens einer Adenovirus-Infektion
nicht aus.
12.6.Das Vorliegen von Adenoviren in nasopharyngealen
Sekreten schließt nicht notwendigerweise die Möglichkeit
einer begleitenden Infektion mit anderen Pathogenen
aus. Alle positiven Ergebnisse müssen immer vorsichtig
bewertet werden, da Adenoviren zu Latenz und
Rekrudeszenz neigen. Asymptomatische Freisetzung der
Viren (viral shedding) kann bis zu 18 Monate nach erfolgter
Infektion stattfinden.20 Die Testergebnisse sind zusammen
mit verfügbaren Informationen aus epidemiologischen
Untersuchungen, der klinischen Diagnose des Patienten
und anderen diagnostischen Verfahren zu interpretieren.
12.7.Die Ergebnisse sollten im Zusammenhang mit
epidemiologischen Informationen, dem klinischen
Erscheinungsbild und anderen diagnostischen Verfahren
interpretiert werden.
13. ERWARTETE WERTE
Die verschiedenen Mitglieder der Adenovirus Subgattungen
weisen eindeutig unterschiedliche Organtropismen auf;
trotzdem manifestieren sich die Erkrankungen hauptsächlich
als Infektionen des Respirationstrakts, der Augen und als
enterische Infektionen. Der Anteil positiver Isolierungen hängt
vom benutzten Test, einer adäquaten Probengewinnung und
der Altersgruppe der getesteten Population ab, und davon,
ob die untersuchten Proben aus Gegenden mit beengten
Lebensverhältnissen stammen.
Die Häufigkeit der Isolierung wird zum einen von der
Ernsthaftigkeit virusbedingter Erkrankungen und zum anderen
von der Tendenz der Virusstämme beeinflußt, andauernde
Infektionen, mit Freisetzung (shedding) infizierender Viren über
längere Zeiträume, zu verursachen.
Bei Kindern unter 4 Jahren sind Adenoviren zu 5% für akute
Infektionen des Respirationstraktes verantwortlich; in 10% aller
Fälle, in denen Kinder dieser Altersgruppe im Krankenhaus auf
Respirationstraktinfektionen behandelt werden, sind Adenoviren
die Ursache.3,6,7 Bei Kindern kann akute hämorrhagische Zystitis
durch Adenoviren verursacht werden. Es wurde nachgewiesen,
dass enterische Adenoviren an 4% bis 15% der Fälle aller
hospitalisierten Kinder mit viraler Gastroenteritis beteiligt sind
und besonders bei Kindern unter 3 Jahren vorherrschen.3,11,12
Augeninfektionen
mit
Adenoviren
(epidemische
Keratokonjunktivitis und Schwimmbadkonjunktivitis) können
in allen Altersgruppen vorkommen, genau wie Adenovirus
Infektionen bei immungeschwächten Patienten.3,8 Bei
Erwachsenen, insbesondere Angehörigen der Streitkräfte,
wurden Adenoviren aus der Zervix und aus Penisläsionen sowie
bei akuten Respirationstraktinfektionen isoliert.
14. SPEZIFISCHE LEISTUNGSKRITERIEN
14.1.REAKTIVITÄT DES MONOKLONALEN ANTIKÖRPERS MIT
ADENOVIRUS SEROTYPEN
Der in diesem Test verwendete monoklonale Antikörper reagiert
nachweislich mit einem gattungsspezifischen Epitop des
Adenovirus Hexonproteins, das in allen bekannten Serotypen
beim Menschen vorhanden ist.
14.2.KLINISCHE STUDIEN
Der IMAGEN Adenovirus-Test wurde in zwei klinischen
Prüfzentren auf seine Eignung zum Direktnachweis untersucht;
getestet wurden nasopharyngeale Sekrete von Kindern und
Erwachsenen, die wegen Atemwegsinfektionen stationär
behandelt wurden. Der Test wurde auch in einer führenden
Augenklinik an Konjunktivalabstrichen von Patienten mit
Konjunktivitis ausgewertet. Drei Prüfzentren bewerteten den
IMAGEN Adenovirus Test zum Nachweis von Adenoviren in
Zellkulturen.
In den Prüfzentren wurden 474 klinische Proben des
Respirationstrakts und 179 Konjunktivalabstriche im
direkten Verfahren ausgetestet und 296 Proben zur
Bestätigung in der Zellkultur. Bei den Standardtests zum
Direktnachweis an Proben handelte es sich um Zellkulturen
mit oder ohne indirekte Immunfluoreszenz, und bei den
Standardtests zur Zellkulturbestätigung waren es der indirekte
Immunfluoreszenztest mit einem polyklonalen Antikörper oder
ein spezifischer Neutralisationstest.
Bei allen Berechnungen wurde von einer 100%igen Sensitivität
und Empfindlichkeit der Standardmethoden ausgegangen.
Empfindlichkeit, Spezifizität und Vorhersagewert wurden wie
zuvor beschrieben21 berechnet.
14.3.KLINISCHE LEISTUNGSFÄHIGKEIT
14.3.1 Direkte Probe
Nasopharyngeale Sekrete
Im Winter 1988/89 wurden frische klinische Proben und
eingefrorene Proben, die zwischen 1978 und 1988 gewonnen
worden waren, getestet. Die zwei Prüfzentren verglichen
den IMAGEN Adenovirus-Test mit Referenzverfahren. Ein
mit der Referenzmethode erhaltenes Ergebnis wurde als
positiv bewertet, wenn entweder Zellkultur oder indirekte
Immunfluoreszenz positiv ausfielen. Auf diese Weise war es
möglich, nicht lebensfähige Viren durch Fluoreszenz oder
zellfreie Viren durch die Zellkultur nachzuweisen.
Mit dem IMAGEN Adenovirus Test wurde eine Probe als
positiv betrachtet, wenn eine oder mehrere fluoreszierende
Epithelzellen sichtbar waren (siehe Abschnitt 11.2).
Tabelle 14.1 zeigt die Ergebnisse des IMAGEN Adenovirus
Testreagenzes. Die Gesamtzahl der Adenovirusfälle in
diesen Populationen betrug 9,1% (43/47). Diese Ergebnisse
korrelierten in 468 Fällen mit den Standardmethoden (98,7%).
Die Empfindlichkeit des IMAGEN Adenovirus Tests betrug
86,0% (37/43) und die Spezifität lag bei 100% (431/431). Die
Vorhersagewerte für positive und negative Ergebnisse betrugen
100% (37/37) bzw. 98,6% (431/437).
Tabelle 14.1 Vergleich der Testergebnisse von IMAGEN
Adenovirus Test und Zellkultur in 2 Prüfzentren – Durchführung
an naso-pharyngealen Proben
TEST
ERGEBNIS
Z ellkultur IMAGEN
Adenovirus
Anzahl der Proben (474)
Neg
Pos
Pos
Neg
Neg
Pos
Neg
Pos
431
37
6*
0
*1)Von diesen 6 Proben brauchten 4 länger als 10 Tage bis zur
Entwicklung des charakteristischen zytopathischen Effekts in
der Zellkultur. Dies kann auf einen sehr niedrigen Antigenspiegel
hinweisen.
2)2 von diesen 6 Proben waren in der indirekten
Immunfluoreszenz negativ.
Ophthalmische Proben
Der IMAGEN Adenovirus Test wurde gegen ein etabliertes
Zellkultursystem ausgewertet. Die Konjunktivalabstriche wurden
von 179 Patienten mit einer Konjunktivitis gewonnen, die in einer
Augenklinik behandelt wurden. Die Inzidenz von Adenovirus
Infektionen in der getesteten Populationsgruppe betrug 19,6%
(35/179).
Die Ausstriche wurden mit den im Krankenhaus entnommenen
Probenabstrichen hergestellt, die anschließend in ein
Transportmedium gegeben wurden, um sie in der Zellkultur
auszutesten. Eine Probe wurde im IMAGEN Adenovirus Test
als positiv bewertet, wenn eine oder mehrere fluoreszierende
Epithelzellen sichtbar waren (siehe Abschnitt 11.2). In der
Zellkultur wurde eine Probe als positiv bewertet, wenn der
charakteristische zytopathische Effekt durch die indirekte
Immunfluoreszenz bestätigt wurde. Die Ergebnisse dieser
Untersuchung sind in Tabelle 2 dargestellt. Von den 179
getesteten Proben wurde in 174 Fällen mit beiden Methoden ein
übereinstimmendes Ergebnis erzielt, was einer Korrelation von
97,2% entspricht. Empfindlichkeit und Spezifität des IMAGEN
Adenovirus Tests betrugen 91,4% (32/35) bzw. 98,6% (142/144).
Die Vorhersagewerte für positive und negative Tests betrugen
94,1% (32/34) bzw. 97,9% (142/145).
Tabelle 14.2 Vergleich der Testergebnisse von IMAGEN
Adenovirus Test und Zellkultur - humane ophthalmische Proben
TEST
ERGEBNIS
Zellkultur
Neg
Pos
IMAGEN Adenovirus
Neg
Pos
Neg
Pos
Anzahl der Proben
(179)
142
32
3*
Neg
Pos
2**
*Bei einer Probe konnte keine Wiederholung durchgeführt
werden.
**Beide Proben wurden nur 2 Tage kultiviert.
14.3.2 Bestätigung der Zellkultur
In drei Prüfzentren wurde der IMAGEN Adenovirus Test
an Zellkulturen klinischer Proben getestet. Die Ergebnisse
wurden mit der indirekten Immunfluoreszenz und/oder
Neutralisationstests zur Zellkulturbestätigung verglichen. Die
Isolierungen wurden auf routinemäßig verwendeten Zelllinien
zur Adenovirus Zellkultur durchgeführt.
Die Zellkulturen wurden in PBS gewaschen bevor sie
entfernt und auf die Objektträger aufgebracht wurden. Die
Objektträger wurden in Azeton fixiert und anschließend mit
den Testreagenzien des IMAGEN Adenovirus Tests getestet. Zu
dieser Bewertung wurden sowohl frisch isolierte als auch zuvor
eingefrorene klinische Proben herangezogen. Insgesamt wurden
296 Kulturen ausgewertet. In der Zellkultur positiv ausgefallene
Proben wurden entweder durch Immunfluoreszenz oder
Neutralisationstests bestätigt.
Die Ergebnisse (Tabelle 14.3) zeigen, dass mit dem IMAGEN
Adenovirus Test alle positiven Adenovirus Isolierungen mit einer
Empfindlichkeit von 100% (162/162) nachgewiesen wurden. Die
Spezifizität betrug 100% (134/134).
Tabelle
14.3
Vergleich
der
Testergebnisse
von
IMAGEN Adenovirus Test und Standardverfahren zur
Zellkulturbestätigung in 3 Prüfzentren durchgeführt
TEST
Standardbestätigungsverfahren
ERGEBNIS
Neg
Pos
Pos
Neg
IMAGEN Adenovirus
Neg
Pos
Neg
Pos
Anzahl der Proben (296)
134
162
0
0
Mycobacterium tuberculosis
Mycoplasma arginini
Mycoplasma hominis
Mycoplasma hyorhinus
Mycoplasma orale
Mycoplasma pneumoniae
Mycoplasma salivarium
Neisseria cinerea
Neisseria flavescens
Neisseria gonorrhoea
Neisseria lactamica
Neisseria meningitidis A, B, C & D
Neisseria mucosa
Neisseria perflava
Neisseria pharyngis
Parainfluenza-Virus, Typ 1,2,3 & 4b
Pneumocystis carinii
Poliovirus, Typ 1 & 2
Respiratory Syncytial Virus
Rhinovirus
Staphylococcus aureus
Streptococcus Gruppen A, B, C, D, F, G
Varicella-Zoster-Virus
14.4.KREUZREAKTIVITÄT
Der IMAGEN Adenovirus-Test wurde an Präparationen anderer
Viren und Mikroorganismen durchgeführt, die mit hoher
Wahrscheinlichkeit in Atemwegs- oder ophthalmischen Proben
oder Zellkulturen vorhanden sind. Alle getesteten Organismen
(Tabelle 4) fielen mit dem IMAGEN Adenovirus-Test negativ aus.
Tabelle 14.4 Mit dem IMAGEN Adenovirus-Test getestete und
für nicht reaktiv befundene Organismen
Acholeplasma laidlawii
Branhamella catarrhalis
Candida albicans
Chlamydia psittaci
Chlamydia trachomatis
Coxsackie-Virus
Zytomegalie-Virus
Echovirus
Epstein-Barr-Virus
Haemophilus influenzae
Herpes simplex-Virus
Influenza-Virus A & B
Legionella pneumophila
Masernvirus
Mumpsvirus
Mycobacterium avium
Mycobacterium intracellulare
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IFU X7846, überarbeitet März 2013
Oxoid Ltd., Wade Road,
Basingstoke, Hants,
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