Die Bedeutung des Transkriptionsfaktors AP

Die Bedeutung des Transkriptionsfaktors
AP-1 in der Chlamydieninfektion
Jugert, C., van Zandbergen, G., Rupp, J.
[email protected]
Institut für Med. Mikrobiologie und Hygiene; Ratzeburger Allee 160, 23538 Lübeck
Einleitung
Chlamydia pneumoniae (Cp) ist ein Bakterium, das sich nur innerhalb einer menschlichen
Wirtszelle vermehren kann. Es durchläuft bei seiner Entwicklung charakteristische Stadien. Die
infektiösen Elementarkörperchen (EB) infizieren die Wirtszelle und wandeln sich zu
nichtinfektiösen Retikularkörperchen (RB) um. Innerhalb der Zelle bildet sich ein
Chlamydieneinschluss, in denen sie sich vermehren. Nach Umwandlung in die wieder infektiösen
EB platzt die Zelle, die EBs werden freigesetzt und ein neuer Infektionszyklus beginnt (Abb.1).
Chlamydia pneumoniae verursacht Infektionen der oberen und unteren Atemwege bei Kindern
und Erwachsenen. Das klinischen Bild äußert sich in einer Pharyngitis (Entzündung der
Rachenschleimhaut) mit trockenem Reizhusten bis hin zur Pneumonie (Lungenentzündung). [2]
Abb.1 Entwicklungszyklus von Chlamydien[1]
Durch die Infektion mit Chlamydien werden in der Wirtszelle Signalkaskaden beeinflusst, die zur Bildung des Transkriptionsfaktors AP-1 führen. Der
Transkriptionsfaktor AP-1 besteht aus zwei Proteinen. Diese können entweder gleichartig (Homodimer) oder verschiedenen sein (Heterodimer). Die
Proteinen werden als Jun, Fos oder ATF bezeichnet (Abb.2). Die Bildung von AP-1 Dimeren ist Voraussetzung für das Binden an nukleäre DNA und
nachfolgende Aktivierung von AP-1 regulierten Genen [3].
Jun
Ziel dieser Arbeit ist, die Zusammensetzung des Transkriptionsfaktors AP-1 zu untersuchen
und Hinweise zu finden, ob Dimere von AP-1 das Überleben der Zelle während des intrazellulären Entwicklungszyklus von Chlamydien steuern.
Jun
Jun
Homodimer
Fos
Jun
Heterodimer
ATF
Heterodimer
Abb.2 Beispiele für die Zusammensetzung des Transkriptionsfaktors AP
- 1
Methoden und Ergebnisse
Nachweis von zellulären AP-1 Proteinen
Nachweis der Aktivität von AP-1
Epithelzellen (HEp2-Zellen) wurden mit Chlamydia
pneumoniae (Stamm CWL029) infiziert. Nach
verschiedenen Zeitpunkten wurde das Zelllysat
mittels Lysispuffer gewonnen. Das proteinhaltige
Lysat wurde auf ein 12% SDS-Gel aufgetragen und
elektrophoretisch getrennt. Die Detektion der
Unterproteine des Transkriptionsfaktors AP-1
erfolgte durch sog. Westernblotanalyse, indem
spezifische Antikörper an das nachzuweisende
Protein binden. Vier Stunden nach der Infektion mit
Cp war bei den infizierten Zellen eine Zunahme der
Proteinmenge an c-Jun und FosB nachweisbar.
AP-1 wird als Transkriptionsfaktor im Kern aktiv. Mittels
der Methode EMSA (electrophoretic mobility shift
assay) wurde die Bindung von AP-1 an DNA
untersucht. Dafür wurden aus infizierten und nichtinfizierten HEp2-Zellen Proteine aus dem Kern
extrahiert. Mit einer radioaktiv markierten DNA-Sonde,
die die Bindestelle für AP-1 enthält, wurden die
Kernproteine inkubiert und anschließend in einem Gel
elektrophoretisch getrennt. Hat sich AP-1 an die Sonde
angelagert, so kann man das durch Schwärzung
erkennen. Je intensiver die Schwärzung ist, um so
mehr AP-1 Proteine waren im Kern. Bei zusätzlicher
Zugabe eines Antikörpers gegen AP-1 Proteine wird
der Komplex größer. Er läuft langsamer im Gel und
man sieht einen sog. “Supershift”. Nach einer
Chlamydieninfektion konnten mehr AP-1 Proteine im
Kern nachgewiesen werden.
A
B
1
2
1
2
Abb. 3 Bild A: Nachweis von c- Jun 4 h nach Infektion,
Spur 1: Medium behandelte Zellen, Spur 2: Cp infizierte
Zellen; Bild B: Nachweis von FosB 4 h nach Infektion,
Spur 1: Medium behandelte Zellen, Spur 2: Cp infizierte
Zellen
Darstellung von AP-1 Proteinen mittels
Fluoreszenzmikroskopie
Um die Verteilung und evtl. Zunahme des
Transkriptionsfaktors AP-1 in der Zelle sichtbar zu
machen, wurden die Unterproteine von AP-1 mittels
fluoreszierender Antikörper gefärbt. Der auffälligste
Unterschied zwischen infizierten und nicht infizierten
Zellen wurde nach 4 Stunden bei den Proteinen
cJun und c-Fos detektiert.
A
B
C
D
Supershift mit c-Fos
AP-1
- +
- +
C. pneumoniae
- -
+ +
c-Fos Antikörper
Abb. 4 Fluoreszenzfärbungen: Nachweis von c- Jun an
nicht infizierten Zellen (A) und an Cp infizierten Zellen
(B); Nachweis von c- Fos an nicht infizierten Zellen (C)
und Cp infizierten Zellen (D)
Zusammenfassung und Ausblick
Es konnte gezeigt werden, dass durch Infektion mit Chlamydia pneumoniae die Menge des Transkriptionsfaktors AP-1 vier Stunden nach der Infektion
sowohl in der gesamten infizierten Zelle als auch nur im Kern zunimmt. Zur Kontrolle dienten nicht infizierte Zellen, bei denen die Menge an
nachgewiesenem AP-1 wesentlich geringer war. Der Nachweis erfolgte durch Westernblotanalysen, EMSA und Fluoreszenzmikroskopie. Die
bisherigen Untersuchungen wurden an HEp2-Zellen durchgeführt, in denen Chlamydien den replikativen Entwicklungszyklus durchlaufen. Es konnte
bereits in anderen Arbeiten gezeigt werden, dass Chlamydien ihre Wirtszellen so beeinflussen können, dass der programmierter Zelltod (Apoptose)
verhindert wird [4]. Ziel dieser Arbeit ist es zu zeigen, dass durch den Transkriptionsfaktor AP-1 in Chlamydien infizierten Zellen solche Proteine
vermehrt gebildet werden, die über Leben und Tod der Wirtszelle entscheiden.
Literatur
1) www.genomics.uni-duesseldorf.de
2) H. Freidank, Akute respiratorische Infektionen durch Chlamydia pneumoniae, Dtsch. med. Wschr. 117 (1992), 187-191
3) Hess et al., Ap-1 subunits: quarrel and harmony among siblings, Journal of Cell Science 117 (2004), 5965-5973
4) Rajalingam et al., Epithelial Cells Infected with Chlamydophila pneumoniae Are Resistant to Apoptosis, Infection and Immunity (2001), 7880-7888