VL Proteine 3
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Proteine III SDS-PolyacrylamidGelelektrophorese Fachbereich Molekulare Biologie Blutserum vs. Blutplasma • Plasma ist der flüssige, zellfreie Teil des Blutes. Nach der Blutabnahme wird Blutplasma durch Abscheiden der Blutzellen durch Zentrifugation gewonnen. Es enthält noch alle Gerinnungsfaktoren. • Blutserum ist der flüssige, zellfreie Teil des Blutes abzüglich der Gerinnungsfaktoren (vor allem Fibrinogen). Nach der Blutabnahme wird die Gerinnungsreaktion nicht unterbunden, danach wird der Blutkuchen (enthält Erythrozyten, Leukozyten und Thrombozyten) durch Zentrifugation vom Serum getrennt. http://www.heilberufe-ausbildung.de/Blut/Blut_Grundlagen.htm Fachbereich Molekulare Biologie 2 Serumproteine • ca. 100 verschiedenen Proteine im Blutplasma; stammen aus Leber und Lymphknoten; • Gesunder Organismus: dynamisches Gleichgewicht zwischen Biosynthese und Abbau von Plasmaproteinen • Hypoproteinämie – zu niedriger Plasmaproteinspiegel unter 66 g/L Ursachen: - verringerte Biosynthese (vermindertes Aminosäureangebot oder Leberparenchymschäden) - vermehrte Ausscheidung - Nierenschädigung • Hyperproteinämie – zu hoher Plasmaproteinspiegel über 83 g/L durch vermehrte Biosynthese; meist klonale Expansion von -Globulin produzierenden Plasmazellen Fachbereich Molekulare Biologie 3 Serumproteine Bestimmung der gesamten Proteinkonzentration besitzt nur beschränkte Aussagekraft – Auftrennen der Plasmaproteine in Einzelfraktionen diagnostische Hinweise Grundsätzlich kann man Plasmaproteine in 5 Fraktionen trennen: 1) Albumine 2) 1-Globuline 3) 2-Globuline 4) -Globuline 5) -Globuline Fachbereich Molekulare Biologie 4 Serumproteine • Die Trägerelektrophorese wird meist routinemäßig (,screening method‘) bei Verdacht auf bestimmte Krebstypen durchgeführt. • Nach der elektrophoretischen Auftrennung kann man 5 gefärbte Banden (Albumin und Globuline) erkennen. http://www.med4you.at/laborbefunde/lbef_ephorese_eiweiss.htm • Die Albuminfraktion stellt eine homogene Substanz dar, andere Fraktionen entstehen durch Überlagerung verschiedener Proteine mit ähnlichen physikalischen Eigenschaften Fachbereich Molekulare Biologie 5 Serumproteine Albumin • Macht 60% der Plasmaproteine aus, wobei nur 40% von Albumin im Plasma sind, 60% befinden sich im Extrazellulärraum • hohe Fähigkeit zur Wasserbindung kolloidosmotischen Drucks • Transportvehikel für Pharmaka, Vitamine, Magnesium, Calcium, nicht- veresterte Fettsäuren, Spurenelemente, Abbau- und toxische Produkte im Blut wichtiger Regulator des PDB code 1E7H Fachbereich Molekulare Biologie 6 Serumproteine 1-Globuline • • • Ca. 4% der Plasmaproteine Wichtigster Vertreter ist 1-Antitrypsin als Proteaseinhibitor Saures 1-Glycoprotein > Akut-Phase-Protein 2-Globuline • • Ca. 6% der Plasmaproteine Wichtigste Vertreter sind 2-Makroglobulin (Rolle im Entzündungsgeschehen) und Haptoglobin, welches Hämoglobin bindet Fachbereich Molekulare Biologie 7 Serumproteine -Globuline • • • • • Transferrin (bindet und transportiert Eisenmoleküle) Fibrinogen (Fibrinvorstufe – dient der Blutgerinnung) CRP (C-reaktives Protein): fördert die Phagozytose, indem es Makrophagen und das Komplementsystem aktiviert. CRP steigt bei Entzündungen 10-1000fach an und wird zu den Akute-PhaseProteinen gezählt. -Lipoprotein (low densitiy lipoprotein-LDL), für den Lipidtransport Faktoren des Komplementsystems Fachbereich Molekulare Biologie 8 Serumproteine -Globuline • Immunglobuline: IgG, IgA, IgM, IgD und IgE • -Globuline werden von zu Plasmazellen ausgereiften B-Zellen produziert. Sie zirkulieren im Blut, befinden sich aber auch an der Oberfläche von allen B-Lymphozyten, wo sie als Membranrezeptoren für Antigene wirken. Fachbereich Molekulare Biologie 9 Serumproteine • Zur genaueren Analyse können die Banden eingescannt und mittels Bildanalyseprogrammen berechnet werden (Abb.1). • Am wichtigsten ist die Erkennung abnormer Eiweißstoffe, sog. Paraproteine (Abb.2). Paraproteine können Indikatoren für Krankheiten sein (zB Morbus Waldenström). http://www.med4you.at/laborbefunde/lbef_ephorese_eiweiss.htm Fachbereich Molekulare Biologie 10 Elektrophorese • Elektrophorese ist die Wanderung geladener Teilchen in einem elektrischen Feld. • Zur Erzeugung des elektrischen Feldes wird das ganze ElektrophoreseSystem in einen Puffer getaucht und Spannung angelegt. Über die im Puffer enthaltenen Ionen fließt Strom. • Dabei wandern positiv geladene Teilchen (Kationen) zur Kathode (-) und negativ geladene Teilchen (Anionen) zur Anode (+). • Die Mobilität dieser Teilchen wird von mehreren Faktoren beeinflusst: - Form und Größe - Nettoladung - Porengröße des Trägers - Stärke des elektrischen Feldes - Reibung Fachbereich Molekulare Biologie 11 Sodiumdodecylsulfat Polyacrylamidgel-Elektrophorese SDS-PAGE Fachbereich Molekulare Biologie 12 Sodiumdodecylsulfat Polyacrylamidgel-Elektrophorese SDS-PAGE • häufige Methode um Proteingemische zu trennen und die Größe von Proteinen abzuschätzen • Das Detergens (SDS) bindet im Überschuss an die Proteine im Proteingemisch (etwa 1,4g SDS / 1g Protein). Alle Proteine tragen daher eine beständig negative Ladung und wandern zum positiven Pol, der Anode. www.ibg.kit.edu/nmr/downloads/Gelelektrophorese.pdf Fachbereich Molekulare Biologie 13 SDS-PAGE • Dient dazu, die Proteine zu denaturieren, da es fast alle nicht-kovalenten Wechselwirkungen in nativen Proteinen zerstört. Erhitzen auf 95°C löst alle Tertiär – und Sekundärstrukturen auf. • Die SDS-Anionen binden sich an die Hauptketten der denaturierten Proteine, sodass Komplexe mit einer stark negativen Ladung entstehen. • Um noch vorhandene Disulfidbrücken zu reduzieren, gibt man 2-Mercaptoethanol oder Dithiothreitol (DTT) zu. -Mercaptoethanol) (DTT) Fachbereich Molekulare Biologie 14 SDS-PAGE Polyacrylamidgele als Trägermaterial • Die Wanderung von Proteinen aufgrund des elektrischen Feldes wird durch das Gel größenabhängig abgebremst. Moleküle, die im Verhältnis zu den Gelporen klein sind, wandern schnell, Moleküle, die größer sind als die Poren, sind nahezu unbeweglich. • Polyacrylamid wird in der Elektrophorese gerne als Trägersubstanz verwendet, da: - es chemisch inert ist - es sich leicht herstellen lässt - die Porengröße leicht zu variieren ist http://elte.prompt.hu/sites/default/files/tananyagok/practical_biochemistry/ch07s03.html Fachbereich Molekulare Biologie 15 SDS-PAGE Polyacrylamidgele http://sdspage123.blogspot.co.at/ APS (Ammoniumpersulfat) TEMED (Tetramethylethylenediamin) Fachbereich Molekulare Biologie 16 SDS-PAGE Polyacrylamidgele • Polyacrylamidgele sollten kurz vor Gebrauch hergestellt werden. • Das Monomer Acrylamid wird mit einem quervernetzenden Agens -meist N,N`- Methylenbisacrylamid (Kurzform: ,Bis‘) mit Hilfe eines Radikalbildners (Ammoniumpersulfat) und eines Katalysators (TEMED) polymerisiert. • Die Porengröße wird durch das Verhältnis der Konzentration des AcrylamidMonomers zu der des Quervernetzungsagens Bis bestimmt. Fachbereich Molekulare Biologie 17 SDS-PAGE Polyacrylamidgele % Acrylamide MW range (kDa) 7 50-500 10 20-300 12 10-200 15 3-100 Fachbereich Molekulare Biologie 18 SDS-PAGE Probenvorbereitung • Die Proben enthalten neben SDS und -Mercaptoethanol noch Glycerin oder Saccharose, um die Dichte zu erhöhen, und Bromphenolblau als Markierungsfarbstoff. • Vor dem Laden der Gele werden die Proben für 10 min. aufgekocht, damit alle Proteine vollständig denaturiert werden und auch hydrophobe Proteine in Lösung gehen. Fachbereich Molekulare Biologie 19 SDS-PAGE Diskontinuierliches Puffersystem • Die Diskontinuierliche (Disk -) Elektrophorese wurde von U.K. Laemmli eingeführt • Bei der Disk -Elektrophorese wird die Gelmatrix in 2 Bereiche geteilt: 1) weitporiges Sammelgel 2) engmaschiges Trenngel Bei der Disk – Elektrophorese ist der unterschiedliche pH Wert der beiden Gele mitentscheidend • Die Disk - Elektrophorese hat 2 Vorteile: 1) Aggregation von Proteinen bei Eintritt in das Gel wird verhindert 2) Schärfung der Banden Fachbereich Molekulare Biologie 20 SDS-PAGE Diskontinuierliches Puffersystem Fachbereich Molekulare Biologie 21 SDS-PAGE Diskontinuierliches Puffersystem Fachbereich Molekulare Biologie 22 SDS-PAGE Diskontinuierliches Puffersystem Fachbereich Molekulare Biologie 23 SDS-PAGE Prinzip der Elektrophorese http://elte.prompt.hu/sites/default/files/tananyagok/practical_biochemistry/ch07.html Fachbereich Molekulare Biologie 24 SDS-PAGE Prinzip der Elektrophorese • Die Mobilität von Teilchen im elektrischen Feld wird beeinflusst von: F (beschleunigend) = q (Ladung) x E (Feldstärke) E ist definiert in Volt / m F (bremsend) = f (Reibungskoeffizient) x v (Geschwindigkeit) F (bremsend) wird durch die Größe und Gestalt der Partikel, sowie die Viskosität des Mediums beeinflusst Fachbereich Molekulare Biologie 25 SDS-PAGE Prinzip der Elektrophorese • Sobald die Elektrophorese gestartet wurde gilt: qxE=fxv Teilchen, die eine unterschiedliche elektrophoretische Mobilität haben, können voneinander durch Elektrophorese getrennt werden. Fachbereich Molekulare Biologie 26 SDS-PAGE Prinzip der Elektrophorese – Praktische Probleme • • • • Hohe Ionenstärke bedeutet geringen spezifischen Widerstand Hohe Ionenstärke bedeutet hohe spezifische Leitfähigkeit Hohe Ionenstärke bedeutet hohe Stromstärke Hohe Stromstärke bedeutet hohe Wärmeentwicklung Wärme – Dissoz. – mehr Ionen – mehr Strom – mehr Wärme..... W = E2 x x c W (Joulesche Wärme) E (elektrische Feldstärke) (Äquivalentleitfähigkeit) c (molare Konzentration des Analyten) Fachbereich Molekulare Biologie 27 SDS-PAGE Prinzip der Elektrophorese – Praktische Probleme • Im elektrischen Feld wandern Probe-Ionen und Puffer-Ionen Verwendung von Puffertanks an beiden Elektroden als Pufferreservoirs Puffer darf sich nicht „erschöpfen“ • Anteil der Probe-Ionen soll möglichst hoch sein (Optimierung der Wanderungsgeschwindigkeit der Probeionen); gering konzentrierter Elektrophoresepuffer (aber noch puffernd) (ideale Ionenstärke 0,05 – 0,10 mol / L) Ohmsches Gesetz: I = U x R I = Stromstärke (in Ampere A) U = Spannung (in Volt V) R = Widerstand (in Ohm W) Fachbereich Molekulare Biologie 28 Andere Proteingel-Typen Gradienten – Gele Eignen sich, wenn man auf einem Gel Proteine mit sehr unterschiedlichen Größen trennen will - Porenweite verringert sich mit der Gellänge - Trennschärfe in jedem Bereich sehr gut Native Proteingele - SDS-frei - Sekundär- und Tertiärstruktur bleibt erhalten - Wanderung der Proteine durch ihre Eigenladung Nicht reduzierende Proteingele - Ohne DTT oder 2-Mercaptoethanol - Disulfidbrücken und somit Quartärstruktur bleiben erhalten Nachteile von nativen und nicht reduzierenden Gelen - Neigung zur Aggregatbildung - Schlechte Auflösung - Schlechte Reproduzierbarkeit Fachbereich Molekulare Biologie 29 Praktikumsteil Fachbereich Molekulare Biologie 30 Praktikumsteil Fachbereich Molekulare Biologie 31 Praktikumsteil Fachbereich Molekulare Biologie 32 Praktikumsteil Fachbereich Molekulare Biologie 33 Praktikumsteil Fachbereich Molekulare Biologie 34 Praktikumsteil Fachbereich Molekulare Biologie 35 Praktikumsteil Fachbereich Molekulare Biologie 36 Praktikumsteil Fachbereich Molekulare Biologie 37 Praktikumsteil Fachbereich Molekulare Biologie 38 Praktikumsteil Fachbereich Molekulare Biologie 39 Praktikumsteil Fachbereich Molekulare Biologie 40 Praktikumsteil Fachbereich Molekulare Biologie 41 Praktikumsteil Befüllen des Anodenraums mit Elektrodenpuffer Fachbereich Molekulare Biologie 42 Praktikumsteil Fachbereich Molekulare Biologie 43 Praktikumsteil Fachbereich Molekulare Biologie 44 Praktikumsteil Fachbereich Molekulare Biologie 45 Praktikumsteil Färben und Entfärben des Gels / Nachweismethoden • Coomassie-Brilliant-Blue Das Gel wird dabei in eine Lösung aus CoomassieBrilliant-Blue und 10% Essigsäure eingelegt. Die Proteine werden gefärbt und gleichzeitig durch die Essigsäure fixiert. Nachweisgrenze: 0,5-1mg stöchiometrische Färbung • Silverstain Ag+ Ionen werden durch schwefelhaltige und basische Aminosäuren zu metallischem Silber reduziert. Die Färbung ergibt rotbraune bis schwarze Spots. Empfindlichere Methode mit einer Nachweisgrenze von ca.10ng nicht-stöchiometrische Färbung Fachbereich Molekulare Biologie 46
