Melanoma Differentiation-Associated Protein 5 (MDA5) als

Aus der Abteilung für Klinische Pharmakologie
Leiter: Prof. Dr. med. Stefan Endres
Medizinische Klinik und Poliklinik IV
der Ludwig-Maximilians-Universität München
Direktor: Prof. Dr. med. Martin Reincke
Melanoma Differentiation-Associated Protein 5 (MDA5) als Zielstruktur für die
Immuntherapie des Pankreaskarzioms
Dissertation
zum Erwerb des Doktorgrades der Medizin
an der Medizinischen Fakultät der
Ludwig-Maximilians-Universität zu München
vorgelegt von
Ebba Beller
aus München
2015
http://d-nb.info/1073222640
III
Inhaltsverzeichnis
1. EINLEITUNG
1
1.1 Das Pankreaskarziom
1
1.1.1 Standardtherapie des Pankreaskarzioms
1
1.1.2 Immuntherapie des Pankreaskarzioms
2
1.2 Pattern-Recognition Rezeptoren
4
1.2.1 Toll-like Rezeptoren
5
1.2.1.1 Toll-like Rezeptor 3 (TLR3)
6
1.2.2 RIG-l-like Helikasen (RLH)
6
1.3 Das dsRNA Analogon poly(l:C)
8
1.3.1 Poly(l:C)-vermittelte Immunmodulation
8
1.3.2 Antitumorale Wirkung von poly(l:C)
9
1.4 Hintergrund und Ziel dieser Arbeit
10
2. MATERIAL UND METHODEN
13
2.1 Geräte, Chemikalien, Puffer
13
2.1.1 Geräte
13
2.1.2 Verbrauchsmaterial
13
2.1.3 Chemikalien
14
2.1.4 Zellkulturmaterialien
15
2.1.5 Antikörper
16
2.1.5.1 Färbeantikörper für Durchflusszytometrie
16
2.1.5.2 Antiköper für Western Blot
16
2.1.6 Stimulanzen
17
2.1.7 ELISA
17
2.1.8 Verschiedene Sets
18
2.1.9 Puffer, Lösungen und Zellkulturmedien
18
2.1.10 Narkose und Antidot
19
2.2 Zellkultur
20
2.2.1 Zelllinien
20
2.2.2 Zellkulturbedingungen
20
2.2.3 Ausplattieren der Zellen
21
2.2.4 In vitro Transfektion von poly(l:C) und siRNA
21
2.2.5 Small interfering RNA (siRNA)
21
2.3 In vivo Experimente
22
2.3.1 Versuchstiere und Haltung
22
2.3.2 Induktion subkutaner Pankreastumore
22
IV
2.3.3 Induktion orthotoper Pankreastumore
23
2.3.4 Immuntherapie subkutaner und orthotoper Pankreastumore
24
2.3.5 Entnahme von Milz und Tumor
25
2.4 Molekularbiologische Methoden
26
2.4.1 RNA-Isolation
26
2.4.2 Reverse Transkription
26
2.4.3 Quantitative Real Time-PCR (qRT-PCR)
27
2.4.4 Gelelektrophorese
28
2.4.5 Caspase-9 Assay
29
2.4.6 Western Blot
29
2.4.6.1 Durchführung
29
2.4.6.2 Strippen der Western Blot Membran
30
2.5 Immunologische Methoden
30
2.5.1 Prinzip der Durchflusszytometrie
30
2.5.2 Färbung der Leukozyten-Subpopulationen im Blut und in der Milz
30
2.5.3 Intrazelluläre IFN-y-Färbung
31
2.5.4 Prinzip der Apoptosebestimmung mittels Annexin V und Propidiumiod
32
2.5.5 Annexin V/PI- und MHC-I-Färbung
33
2.5.6 Enzyme-Iinked immunosorbent assay (ELISA)
34
2.6 Statistik
34
3. ERGEBNISSE
35
3.1 Humane Pankreaskarzinomzellen exprimieren funktionelles MDA5
35
3.1.1 Verstärkte Expression von RIG-I, MDA5 und TLR3 nach Interferongabe
35
3.1.2 Poly(l:C)c induziert MDA5, RIG-I und TLR3 Expression und plRF3
37
3.2 Immunologische Effekte von poly(l:C)c auf humane Pankreaskarzinomzellen
39
3.2.1 Sekretion von Zytokinen und Hochregulation der MHC-I Expression
39
3.2.2 Poly(l:C)c induziert effektiv Apoptose in humanen Pankreaskarzinomzellen
41
3.3 Die antitumorale Wirkung von poly(l:C)c basiert auf der Aktivierung von MDA5.... 43
3.3.1 Analyse der poly(l:C)c-basierten Immuntherapie im murinen Sarkommodell
43
3.3.2 Aktivierung von MDA5 über poly(l:C)c in humanen Pankreaskarzinomzellen
45
3.4 Funktionelle Konsequenzen der MDA5 Aktivierung in murinen
Pankreaskarzinomzellen
46
3.5 MDA5-basierte Immuntherapie im orthotopen Panc02 -Modell
48
3.5.1 Zytokinmilieu im Tumor und Leukozyten-Aktivierung in der Milz
48
3.5.2 Zytokinspiegel im Serum und Leukozyten-Aktivierung im Blut
51
3.5.3 Verlängertes Überleben und Ausbildung einer adaptiven Immunantwort
53
V
3.6 Tumorkontrolle durch lokale MDA5-basierte Therapie im subkutanen Panc02Pankreaskarzinommodell
55
4. DISKUSSION
57
4.1 Expression von MDA5, RIG-I und TLR3 in humanen Pankreaskarzinomzellen
57
4.2 Funktionelle Konsequenzen von MDA5 Aktivierung in humanen
Pankreaskarzinomzellen
58
4.3 Überprüfung der Effektivität einer MDA5-basierten Immuntherapie in zwei
murinen Pankreaskarzinommodellen
60
4.4 Molekulare Wirkmechanismen der poly(l:C)c-basierten Tumorimmuntherapie
62
4.4.1 Untersuchungen zur MDA5-Abhängigkeit der Therapieeffekte
62
4.4.2 Immuntherapie mit komplexiertem versus unkomplexiertem poly(l:C)
63
4.5 Ausblick
65
5. ZUSAMMENFASSUNG
68
6. LITERATURVERZEICHNIS
70
7. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
77
8. DANKSAGUNG
79
9. VERÖFFENTLICHUNGEN
80