Expression eines Signalproteins (RGS14) in HEK293 Zellen
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wissenschaft & praxis Expression eines Signalproteins (RGS14) in HEK293 Zellen plex vor und sind als solcher aktiv (1). Klassifizierung der heterotrimeren G-Proteine Die so genannte „Schalterfunktion“ unterliegt der α-UnStörung der Oberflächenexpression G-Protein gekoppelter tereinheit; sie wird für die herRezeptoren oder fatale Hemmung der Zellproliferation. kömmliche Klassifikation der heterotrimeren G-Proteine naDie meisten Hormone sind zur Signalübertra- mensgebend herangezogen. Die α-Untereinheiten der vergung auf G-Protein gekoppelte Rezeptoren schiedenen G-Proteine sind in ihrer Struktur – bedingt durch (GPCR) und heterotrimere GTP-bindende Pro- ihre Spezifität für diverse Bindungspartner – sehr variabel. wissenschaft teine angewiesen. Gleiches gilt für NeuroAnhand der Sequenzen der α-Untereinheiten lassen sich & praxis transmitter und Sinnesreize (1). die G-Proteine in vier Familien einteilen: Gs-, Gi-, Gq-, und Heterotrimere G-Proteine regulieren eine Vielzahl von G12-Subfamilie. Effektoren (second messenger produzierende Enzyme, Ionenkanäle) und vermögen die meisten, um nicht zu sagen alRGS- (Regulators of G protein signaling) le zellulären Prozesse zu beeinflussen. Um für grundsätzliche Vorgänge in der Signalübertra- und RGS-like-Proteine RGS- (Regulators of G protein signaling) und RGS-likegung der Zelle Verständnis zu schaffen, möchte ich auf folProteine sind eine Familie von mehr als 30, sehr untergende Begriffe näher eingehen: schiedlichen, multifunktionellen Proteinen, die direkt an aktivierte Gα-Subeinheiten von G-Proteinen binden und so auf G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR) diese einen regulierenden Einfluss haben. Sie stimulieren die Unter „G-Protein gekoppelten Rezeptoren“ versteht man GTPase-Aktivität der Gα-Untereinheiten wesentlich und beeine große Gruppe von Proteinen, die erheblich zur Signal- wirken somit deren Deaktivierung und Beendigung der nachübermittlung beitragen. An der Membran binden sie spezifisch geschalteten Signalweiterleitung (2). Liganden und aktivieren durch G-Proteine, mit welchen sie eiDas Ziel meiner Arbeit war, die Funktionsweise von RGSnen Komplex bilden, Effektoren und second messenger. Der Proteinen näher zu beleuchten und so einen Beitrag in der funktionelle Aufbau von GPCR gliedert sich in drei Domänen: Erforschung der vielfältigen Regulationsmechanismen der ■ Extrazelluläre Domäne Signalweiterleitung in Zellen zu leisten. ■ Transmembrandomäne Erkenntnisse auf diesem Gebiet stellen eine wesentliche ■ Intrazelluläre Domäne Grundlage für die Entwicklung von Pharmaka dar. MedikaFür den Mechanismus der Signalübertragung ist ein Mo- mente, die an der Modulation der Aktivität von RGS-Prodell des zyklischen An- und Abschaltens des Rezeptors ak- teinen ansetzen, wären von großer Bedeutung für die Reguzeptiert. In Abwesenheit eines Agonisten (Neurotransmit- lierung von Signalen endogener Hormone oder Neurotransters, autacoiden Botenstoffes etc.) liegt der Rezeptor in einer mitter. Der Mechanismus beruht auf dem selben Prinzip wie bindungsinaktiven Form – auch als „Ruhezustand“ bezeich- der von Monoaminoxidase-Hemmer und Serotoninwiedernet – vor. Die Bindung eines Agonisten bewirkt eine Rezep- aufnahme-Hemmer. Diese haben aufgrund einer Verlängetorkonformation mit hoher Affinität sowohl zum Agonist rung der Aktivität endogener Neurotransmitter indirekt einen als auch zum nachgeschalteten G-Protein. Einfluss auf G-Protein gekoppelte Rezeptoren (3). Durch die Rezeptoraktivierung bindet das inaktive heVon einigen RGS-Proteinen (z.B. Axin) ist bekannt, dass terotrimere G-Protein (GDP-Form) an den Rezeptor und wird sie während der Entwicklung Zellmigration bewirken. Andere selbst durch den Austausch von GDP durch GTP aktiviert. In wiederum haben Einfluss auf Apoptose und Zellproliferatiseiner aktivierten Form löst sich das G-Protein aus dem Kom- on oder induzieren den Zelltod. Die Wirkung von RGS-Proplex mit dem Rezeptor, der daraufhin entweder erneut in sei- teinen in Form einer Feinabstufung von Immunantworten nen inaktiven Ruhezustand zurückkehrt oder weitere G-Pro- wurde ebenfalls in verschiedenen Studien nachgewiesen (2). teine aktiviert. Das aktivierte G-Protein zerfällt in seine UnAuf dem Gebiet der Neuropsychiatrie wird aufgrund der tereinheiten (α und βγ), und diese binden an ihre Effektoren. Ergebnisse diverser Studien bezüglich dem Auftreten bzw. der EntZur Umwandlung des G-Proteins in seinen inaktiven Zustand wicklung von Schizophrenie die Hypothese aufgestellt, dass wird GTP durch die GTPase wiederum zu GDP gespalten (2). niedrige RGS4-Expressionsspiegel einen möglichen Risikofaktor für die Ausbildung von Schizophrenie darstellen können (2). Somit hat die Forschung auf dem Gebiet der RGS- und Heterotrimere G-Proteine RGS-like-Proteine einen wesentlichen Stellenwert in der PharHeterotrimere G-Proteine stellen spezifische Reaktions- makologie eingenommen. partner in der Signalübertragung durch 7-Helix-TransmemWenn die Funktion von RGS-Proteinen darin besteht, die branrezeptoren – woher auch deren Bezeichnung als „G-Pro- auf eine Zelle eintreffenden Signale zu ordnen, müssen über die tein gekoppelte Rezeptoren“ stammt – dar. G-Proteinselektivität hinaus zusätzliche Spezifitätsmerkmale Allen G-Proteinen gemeinsam ist ihr Aufbau, welcher in vorhanden sein. Es ist vorstellbar, dass ein RGS-Protein die Sigdrei Untereinheiten gegliedert ist: nalgebung eines Rezeptors dämpft, während die eines zweiten ■ α-Untereinheit: enthält eine Bindungsstelle für GTP bzw. Rezeptors in derselben Zelle unbeeinflusst bleibt, selbst wenn GDP und besitzt die GTPase-Aktivität. beide Rezeptoren sich desselben Pools an G-Proteinen bedie■ β- und γ-Untereinheiten: liegen als fest assoziierter Kom- nen. Diese Arbeit beschäftigt sich im Wesentlichen mit dem q 15 wissenschaft & praxis Wirkungsmechanismus von RGS14 auf die Signaltransduktion durch den G-Protein gekoppelten A1-Adenosinrezeptor. Abb. 1: Aufgaben des A1-Adenosinrezeptors a) Schutzfaktor vor Hypoxie Problemstellung Die RGS-Domäne von RGS14 reguliert spezifisch die Aktivität von G-Proteinen der Gi/o-Klasse in vitro. Zu den Gi/ogekoppelten Rezeptoren zählen unter anderem der A1-Adenosinrezeptor und der D2-Dopaminrezeptor. Die Experimente wurden von der Hypothese geleitet, dass RGS14 den A1Adenosinrezeptor erkennt und diese Wechselwirkung – zusätzlich zur G-Proteinspezifität – selektivitätsstiftend für die Aktivität von RGS14 sein könnte. Meine Experimente gingen der Frage nach, ob durch heterologe Expression eine Assoziation von RGS14 und dem A1Adenosinrezeptor nachgewiesen werden kann. Für eine derartige Paarung gab es in der Vergangenheit funktionelle indirekte Evidenz (Nanoff, C. et al, 1997, Neuropharmacology). Wie bereits bewiesen ist, können RGS-Proteine die Ausbildung eines Effekts nach Bindung eines Rezeptors an ein bestimmtes G-Protein unterbinden und auf diesem Weg die Signaltransduktion unterdrücken. Schon vor Entstehung dieser Arbeit konnte, bei einer Kotransfektion von HEK293 Zellen mit RGS14 und einem A1Adenosinrezeptor-Plasmid, die Unterdrückung der Bildung eines funktionell intakten Rezeptors beobachtet werden. In Zusammenarbeit mit meinem Betreuer Univ. Prof. Dr. Christian Nanoff habe ich zwei Hypothesen aufgestellt. In Anlehnung an den im vorherigen Absatz genannten Vorbefund gingen wir in der Hypothese A davon aus, dass eine Kotransfektion mit einem RGS-Protein-Plasmid und einem Rezeptor mit dem Überleben der Zellen unvereinbar ist. Im Unterschied zur Hypothese B, welche behauptet, dass der Export eines Rezeptors vom Ort seiner Biosynthese (dem endoplasmatischen Retikulum) an die Zellmembran durch RGS-Proteine behindert wird. Daraus lässt sich die Frage ableiten, ob dieses Phänomen der Exportunterdrückung auf alle Typen G-Protein gekoppelter Rezeptoren zutrifft oder ob die Hemmung auf einem Rezeptor-spezifischen Prozess beruht. Um diese beiden Möglichkeiten zu unterscheiden, habe ich Transfektionsexperimente mit verschiedenen Rezeptoren an zwei Zelllinien durchgeführt und jeweils die Expression funktionellen Rezeptorproteins untersucht. Verwendete Zelllinien: HEK293-Zellen (human embryonic kidney cells), SH-Zellen (humane Neuroblastomzellen) Verwendete Rezeptoren: A1-Adenosinrezeptor, A2A-Adenosinrezeptor, D2-Dopaminrezeptor Ergebnisse Frage 1: Liegt das Problem für die verminderte Expression des A1-Adenosinrezeptors in einer eventuellen Promotorkompetition? Zum Ausschluss einer Promotorkompetition wurden die Zellen folgendermaßen transfiziert: Effekt der Koexpression von RGS14 mit dem A1-Adenosinrezeptor 600 DPCPX-Bindung (fmo\mg) ■ Herz (Myocardinfarkt) ■ Gehirn (Zellnekrose, -schädigung) b) Funktion in der Niere ■ Hemmung der Diurese (Antagonist = Coffein) c) Funktion im Herz ■ Unterdrückung der Sinusfrequenz kein RGS14 + RGS14 400 200 0 a) A1-Adenosinrezeptor mit bzw. ohne RGS14 Das stark verminderte Rezeptorexpressionsniveau unter Anwesenheit von RGS14 führte zu der Fragestellung, ob das Hemmphänomen lediglich auf die Kotransfektion mit RGS14 zurückzuführen ist oder ob eine Promotorkompetition vorliegt. Promotorkompetition findet auf der Ebene der Transkription statt. Aufgrund desselben Promotors kommt es hierbei zur Unterdrückung eines von zwei Plasmiden in der Wirtszelle. b) A1-Adenosinrezeptor mit GFP vs. A1-Adenosinrezeptor mit RGS14 Abb. 2: A1-Adenosinrezeptor mit GFP vs. A1-Adenosinrezeptor mit RGS14 1200 1000 DPCPX-Bindung (fmo\mg) 16 800 A1 R/GFP 600 A1 R/RGS14 400 200 0 Um das Vorliegen einer Promotorkompetition auszuschließen, wurde anschließend neben einer Kotransfektion mit dem A1-Adenosinrezeptor und RGS14 auch eine Kotransfektion mit dem A1-Adenosinrezeptor und einem leeren EGFP-Vektor durchgeführt. Damit soll geklärt werden, ob die Rezeptorexpressionshemmung ausschließlich durch den Vektor – und somit durch den Promotor – bedingt ist oder ob das im Vektor transfizierte Insert (RGS14) die Hemmung bewirkt. Wie aus den Ergebnissen ersichtlich wird, liegt keine Promotorkompetition vor, da das Rezeptorexpressionsniveau unter Kotransfektion des A1-Adenosinrezeptors und des GFPVektors im Vergleich zur totalen Rezeptorexpression (Abb. 1, blauer Balken) nicht abnimmt. Da der A2A-Adenosinrezeptor und der D2-Dopaminrezeptor den selben Vektor wie der A1-Adenosinrezeptor haben, kann wissenschaft & praxis Frage 2: Ist die G-Proteinkoppelung des Rezeptors für den Hemmeffekt durch RGS entscheidend? Der D2-Dopaminrezeptor ist wie der A1-Adenosinrezeptor ein Gi/o-gekoppelter Rezeptor. Der A2A-Adenosinrezeptor ist jedoch ein ausschließlich Gs-gekoppelter Rezeptor. Bei Kotransfektion dieser beiden Rezeptoren mit RGS14 bzw. RGS4 wird die Bildung funktionellen Rezeptorproteins nicht unterdrückt. Wenn man den Hemmeffekt durch RGS14 auf G-Proteinspezifität zurückführt, wäre davon auch der D2Dopaminrezeptor, aber nicht der A2A-Adenosinrezeptor betroffen. Somit ist die G-Protein-Koppelung für die Expressionshemmung des A1-Adenosinrezeptors nicht maßgebend. Radioligandenbindung (fmo\mg) Abb. 3: Effekt der Kotransfektion von HEK293 Zellen mit einem RGS14-Vektor und einem Rezeptor -Plasmid 20 000 GFP RGS14 15 000 GFP Auch der Einfluss von RGS4 führt zu einer verminderten Rezeptorexpression. Jedoch geht von RGS-lsc kein Hemmeffekt auf den A1-Adenosinrezeptor aus. Die Ursache dafür liegt in der Spezifität von RGS-lsc auf G12/13-gekoppelte Rezeptoren (A1-R=Gi/o-gekoppelter Rezeptor). Abb. 4: Effekt der Kotransfektion von HEK293 Zellen mit zwei RGS-Vektor und einem A1-Rezeptor -Plasmid 3000 2000 400 350 300 250 200 150 100 50 0 GFP RGS4 GFP RGS-lsc RGS14 10 000 Frage 5: Kann der Effekt in SH-Zellen wiedergefunden werden? 5 000 0 Frage 4: Ist der Hemmeffekt spezifisch für RGS14? DPCPX-Bindung (fmo\mg) man anhand der Ergebnisse mit dem A1-Adenosinrezeptor für diese Rezeptoren eine Promotorkompetition ausschließen. Im Weiteren wurde jedoch zur Kontrolle bei jeder Transfektion auch ein leerer EGFP-Vektor mitgeführt. A2A-R D2-R Frage 3: Sind Zellen durch die Transfektion im Überleben eingeschränkt? Wie aus den Kotransfektionen von HEK293 Zellen am Beispiel von A2A-Adenosinrezeptor und D2-Dopaminrezeptor festgestellt werden konnte, werden die Zellen durch die Transfektion mit einem G-Protein gekoppelten Rezeptor und RGS14 prinzipiell in ihrem Überleben nicht behindert. Um auszuschließen, dass der Befund „RGS14 + A1-Adenosinrezeptor in HEK293 Zellen“ kein Zufall war, wurden drei unterschiedliche, stabile Zelllinien gezüchtet, welche mit dem A1-Adenosinrezeptor und RGS14 kotransfiziert wurden. Bei allen drei Zelllinien war der Hemmeffekt – verursacht durch RGS14 – festzustellen. Ein weiterer Beweis für das Überleben der transfizierten Zellen liegt somit in der stetigen Zellteilung. Literaturverzeichnis: 1) KRAUSS, G. (1997): Biochemie der Regulation und Signaltransduktion. Erscheinungsort: WILEY-VCH. 2) HOLLINGER S., HEPLER J. R. (2002): Cellular Regulation of RGS Proteins: Modulators and Integrators of G Protein Signaling. Department of Pharmacology, Emory University School of Medicine, Atlanta, Georgia (Online-Publikation: URL: http://pharmrev.aspetjournals.org/cgi/content/full/ 54/3/527, download 29.01.2004) 3) HEPLER, J.R. (2003): RGS Protein and G Protein Interactions: A Little Help from Their Friends. The American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics [http://idp.med.ufl.edu/Core/Spring/2B_7593/ 2004%20Principles%20Diskussion%201.pdf] 27.012004 In den Versuchen an SH-Zellen wurden die Zellen mit dem A1-Adenosinrezeptor und RGS14, RGS4 sowie RGSlsc (p115RhoGEF) kotransfiziert. In Anbetracht der Ergebnisse liegt die Vermutung nahe, dass die Rezeptorexpressionshemmung einem zellspezifischen Mechanismus unterliegt. Der bei HEK293-Zellen auftretende Effekt kann an SH-Zellen nicht wiedergefunden werden. Frage 6: Kann man den A1-Adenosinrezeptor immunzytochemisch erkennen (d.h. wird das Rezeptorpolypeptid überhaupt synthetisiert, wenn es zusammen mit RGS4 bzw. RGS14 kotransfiziert wird)? Das immunzytochemische Experiment zeigte das Vorhandensein des A1-Adenosinrezeptors in – mit A1-Adenosinrezeptor und RGS4 kotransfizierten – stabilen HEK293-Zellen. Damit wird sichergestellt, dass das Rezeptor-Plasmid zumindest synthetisiert wird. Aufgrund dieser Feststellung liegt nahe, dass die Blockade der Rezeptorexpression durch RGS im Export des Rezeptors vom Ort seiner Biosynthese (endoplasmatisches Retikulum) an die Zellmembran ansetzt. ■ Miriam Konrad, Dipl. MTA Die Diplomarbeit (2004) von Miriam Konrad wurde an der Akademie für den medizinisch-technischen Laboratoriumsdienst am AKH Wien verfasst. Thema: Expression eines Signalproteins (RGS14) in HEK293 Zellen – Störung der Oberflächenexpression G-Protein gekoppelter Rezeptoren oder fatale Hemmung der Zellproliferation Fachbereich: Molekularbiologie Betreuer: Ao Univ.-Prof. Dr. Christian Nanoff, Institut für Pharmakologie der medizinischen Universität Wien. 17
