Die Kalzium-Abhängigkeit der T-Zell-Proliferation Dissertation zur

Die Kalzium-Abhängigkeit der T-Zell-Proliferation
Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin
Der Medizinischen Fakultät
Der UNIVERSITÄT DES SAARLANDES
2006
vorgelegt von: Kerstin Wagner
geb. am: 25.08.1982 in Saarbrücken
Physiologisches Institut
Universitätsklinikum des Saarlandes, Homburg/Saar
Direktor: Prof. Dr. Markus Hoth
Inhaltsverzeichnis
1
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Inhaltsverzeichnis
1.
Zusammenfassung .................................................................................................................4
2.
Einleitung ..............................................................................................................................8
2.1. Funktion von T-Lymphozyten im Immunsystem............................................................8
2.2. Kalzium-abhängige Signaltransduktion in T-Lymphozyten .........................................10
2.3. Bedeutung des CRAC-Kanals in humanen T-Lymphozyten ........................................14
2.4. Kalzium-abhängige Proliferation in T-Lymphozyten ...................................................16
2.5. Apoptose in T-Lymphozyten.........................................................................................17
2.6. Zielsetzung der Arbeit ...................................................................................................20
3.
Material und Methoden .......................................................................................................21
3.1. Material.............................................................................................................................21
3.1.1. Chemikalien und Assays ........................................................................................21
3.1.2. Medien und Puffer ..................................................................................................22
3.1.3. Antikörper...............................................................................................................22
3.1.4. 96-Well Mikrotiterplatten.......................................................................................22
3.1.5. Geräte .....................................................................................................................23
3.1.6. Auswertungsprogramme.........................................................................................23
3.2. Methoden ..........................................................................................................................24
3.2.1. Zellkultur: ...............................................................................................................24
3.2.2. Proliferationsexperimente:......................................................................................24
3.2.3. Apoptosemessungen: ..............................................................................................25
3.2.4. Isolation von humanen, peripheren Blutmonozyten...............................................26
3.2.5. Ca2+-Kontrollmessung und Antikörperfärbung der isolierten Lymphozyten.........27
3.2.6. Antikörperfärbung in der Messkammer .................................................................30
3.2.7. Antikörperfärbung im Reaktionsröhrchen..............................................................30
3.2.8. Intrazelluläre Kalziummessung in 96-well-Platten ................................................31
3.2.9. Bestimmung der freien Kalziumkonzentration in RPMI-komplett Medium..........32
3.2.10. Herstellung von Antikörper-beschichteten Polystyrol-Beads ................................32
Inhaltsverzeichnis
2
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4.
Ergebnisse............................................................................................................................34
4.1. Ermittlung einer für alle Versuche geeigneten Zellzahl im linearen Messbereich........34
4.2. Instantanes Signal: Kalibrierung der EZ4U-Messmethode ...........................................37
4.3. Qualitätsvergleich von sterilfiltriertem und autoklaviertem EGTA ..............................39
4.4. Überprüfung der Eignung von EGTA zur Modifikation der extrazellulären
Kalziumkonzentration ...................................................................................................41
4.5. Überprüfung der Eignung von BAPTA als Kalziumchelator für Proliferationsexperimente ...................................................................................................................43
4.6. Unterschiede der Kalzium-abhängigen Proliferation der parentalen Zelllinie und der
Zelllinien CJ1 und CJ5 ..................................................................................................45
4.7.
Bestimmung der Kalzium-Konzentration in RPMI-1640 Medium...............................48
4.8. Blockade des CRAC- Kanals mittels BTP2 ..................................................................51
4.9. Bestimmung der Proliferation und der intrazellulären Kalziumkonzentration am
Beispiel der parentalen Zelllinie und der Zelllinie CJ1 – Kompensation des CRACDefekts? .........................................................................................................................53
4.10. Bestimmung der Proliferation und des Ruhekalziums von PHA- stimulierten JurkatZellen .............................................................................................................................55
4.11. Apoptose von PHA- stimulierten Jurkat- Zellen ...........................................................57
4.12. Kalziumsignal-Messung als Vitalitätskontrolle der isolierten peripheren Blutlymphozyten (PBLs)......................................................................................................59
4.13. Bestimmung des Anteils an T- und B-Lymphozyten der isolierten PBLs ....................61
4.14. Proliferation von PHA- stimulierten PBLs....................................................................62
4.15. Induktion von Apoptose in PBLs ..................................................................................63
4.16. Kinetik von Caspase –3 und –7 .....................................................................................64
4.17. Apoptose von PHA- stimulierten PBLs ........................................................................66
4.18. Fokale Stimulation peripherer Blutlymphozyten ..........................................................67
4.19. Apoptose fokal stimulierter Blutlymphozyten ..............................................................69
5.
Diskussion ...........................................................................................................................70
6.
Literatur ...............................................................................................................................79
Inhaltsverzeichnis
3
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7.
Anhang ................................................................................................................................85
7.1. Abkürzungsverzeichnis ....................................................................................................85
8.
Danksagung .........................................................................................................................87
9.
Lebenslauf ...........................................................................................................................88
1. Zusammenfassung
4
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Die Kalzium-Abhängigkeit der T-Zell-Proliferation
1. Zusammenfassung
Das menschliche Immunsystem bekämpft das Eindringen körperfremder Antigene und die
Expression körperfremder Proteine. T-Lymphozyten, die der spezifischen, zellulären
Komponente des Immunsystems angehören, werden über eine Antigen-Präsentation durch den
T-Zell-Rezeptor aktiviert. Die Aktivierung des T-Zell-Rezeptors führt durch einen KalziumEinstrom über in der Plasmamembran lokalisierte, Speicher-aktivierte Kanäle, zu einem
Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration. Durch den Anstieg des intrazellulären
Kalziums wird die Expression bestimmter Gene wie z.B. Interleukin-2 induziert. Interleukin-2
stimuliert das Wachstum der T-Lymphozyten und wirkt chemotaktisch auf weitere
immunkompetente Zellen. Zellen der Jurkat T-Zelllinie proliferieren, ohne einen exogenen
Stimulus zu benötigen. Sie entstammen einer akuten lymphatischen Leukämie, deren Zellen
möglicherweise durch den Verlust von Kontrollpunkten aus der G0-Phase des Zellzyklus
wieder aktiv in die Interphase und anschließend in die Mitose eintreten. Im Rahmen dieser
Arbeit wurde die Proliferation von drei verschiedenen Jurkat T-Zelllinien untersucht, um
Aufschlüsse über die Kalzium-Abhängigkeit der Proliferation zu erlangen: Die parentale
Zelllinie, sowie die daraus hervorgegangenen Zelllinien CJ1 und CJ5, die durch einen stark
verminderten Kalziumeinstrom über die Speicher-aktivierten Kanäle der Plasmamembran
charakterisiert sind (Fanger et al., 1995). Die Proliferation wurde in 96-Well-Platten mittels des
EZ4U-Assays bestimmt, durch den Reduktionsäquivalente gemessen werden, die linear zur
Anzahl der lebenden Zellen sind. Unter normalen Wachstumsbedingungen war kein
Unterschied in der Proliferation dieser drei Zelllinien festzustellen. Unter limitierter
extrazellulärer Kalziumkonzentration konnte jedoch beobachtet werden, dass sich die Zelllinien
CJ1 und CJ5 im Vergleich zur parentalen Zelllinie langsamer teilten. In diesen Experimenten
wurden außerdem für die jeweiligen Zelllinien die zu einem halbmaximalen Wachstum
benötigten extrazellulären Kalziumkonzentrationen ermittelt. Diese waren bei den Zelllinien
CJ1 und CJ5 im Vergleich zur parentalen Zelllinie signifikant erhöht, was zeigt, dass der
Speicher-aktivierte Kalziumeinstrom für die Proliferation notwendig ist und ein Defekt dieses
Einstroms durch eine erhöhte extrazelluläre Kalziumkonzentration kompensiert werden muss.
Dies wurde in weiteren Experimenten, in denen die Speicher-aktivierten Kalziumkanäle mittels
1. Zusammenfassung
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des Pyrazolderivates BTP2 blockiert wurden, bestätigt. In diesen Experimenten zeigten alle drei
Zelllinien unter limitiertem extrazellulärem Kalzium im Bereich der zum halbmaximalen
Wachstum notwendigen Konzentration signifikant erniedrigte Proliferationsraten. Diese
Ergebnisse zeigen, dass der Kalziumhaushalt für die Viabilität und das Wachstumsverhalten der
Lymphozyten essentiell ist und dass die Speicher-aktivierten Kalziumkanäle diese Vorgänge
wahrscheinlich entscheidend regulieren.
Im Gegensatz zu den T-Lymphozyten der Jurkat Zelllinie, die keinen Stimulus zur Proliferation
benötigen und unter Stimulation sogar langsamer proliferieren, benötigen primäre periphere
Blutlymphozyten einen exogenen Stimulus zur Aktivierung. Hier konnte gezeigt werden, dass
eine fokale Stimulation mit Hilfe von anti-CD3/anti-CD28 Antikörper-beschichteten
Polystyrol-Beads die effizienteste Methode zur Wachstumsinduktion darstellt, die den
physiologischen Aktivierungsweg der Lymphozyten über den T-Zell-Rezeptor und ein
kostimulatorisches Molekül imitiert. Parallel zur Proliferation wurden für primäre und für
Jurkat T-Lymphozyten Apoptoseraten durch die Messung der Aktivität der Caspasen -3 und -7
bestimmt. Erste Ergebnisse zeigen, dass sowohl die Stimulation mit dem Lectin PHA als auch
eine fokale Stimulation der Zellen zu höheren Apoptoseraten im Vergleich zu unstimulierten
Zellen führt. Da mit Hilfe der verwendeten Assays immer Zellpopulationen gemessen werden,
ist es möglich, dass einzelne Zellen der gemessenen Populationen sehr stark proliferieren,
während andere Zellen apoptotisch werden und dass somit sowohl im Proliferations- als auch
im Apoptoseassay hohe Signale gemessen werden können.
Die folgende Arbeit hat Aufschluss über die Kalziumabhängigkeit der T-Zell-Proliferation
geliefert. Das Verständnis des Kalziumhaushaltes der T-Lymphozyten könnte dazu beitragen,
ein Werkzeug zur Therapie von Erkrankungen des Immunsystems zu finden. Dabei spielen
insbesondere die Speicher-aktivierten Kalziumkanäle in der Plasmamembran eine wichtige
Rolle. Sie werden bezüglich ihres molekularen Aufbaus und als pharmakologischer
Angriffspunkt derzeit erforscht.
1. Zusammenfassung
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Calcium-dependance of T-cell proliferation
Summary
The human immune system has to cope with extrinsic antigens and with the expression of
foreign proteins. T-lymphocytes, which are associated with the specific, cellular part of the
immune system, are activated by antigen presentation through the T-cell receptor. Activation of
T-cell receptor leads to a rise of intracellular calcium (Ca2+) by Ca2+entry through Ca2+ storeoperated channels in the plasma membrane. The rise of intracellular Ca2+ controls gene
expression and finally, among others, the production of interleukin-2, which is a stimulus for
proliferation of T-lymphocytes and has also chemotactic effects on other immune-competent
cells. In contrast, the human T-cell line Jurkat proliferates without any extracellular stimulus.
The Jurkat cell line E6-1 was established from the peripheral blood of a 14 year old boy who
suffered from an acute lymphatic leukaemia. Jurkat cells permanently re-enter the cell cycle,
probably because they lost the G0-checkpoint of cell cycle. In my thesis work, the proliferation
of three different Jurkat T-cell lines was compared to obtain new results about the Ca2+dependence of T-cell proliferation. A parental Jurkat cell line and the two mutant cell lines CJ1
and CJ5, which show a reduced level of capacitive Ca2+ entry (Fanger et al., 1995), were
analyzed. Proliferation was carried out in 96- well plates using the EZ4U assay which measures
reduction equivalents, which were shown to linearly correlate with the number of viable cells.
Under standard growth conditions, no difference in proliferation could be measured. However,
when limiting the extracellular Ca2+ concentration, CJ1 and CJ5 cells were found to proliferate
more slowly than the parental cell line. To quantify this effect, the extracellular Ca2+
concentrations necessary for half-maximal proliferation were determined. These Ca2+
concentrations were significantly higher for CJ1 and CJ5 T-cells compared to the parental cell
line, indicating that first, Ca2+ entry through store operated channels is necessary for T- cell
proliferation and second, that a reduced Ca2+ influx can be compensated by elevating the
external Ca2+ concentration. These results were confirmed by blocking store-operated Ca2+
channels using the pyrazol derivate BTP2. In these experiments, the three cell lines show
significantly decreased proliferation rates under limiting extracellular Ca2+ conditions which
were in the range of the half maximal Ca2+ concentrations necessary for proliferation. These
1. Zusammenfassung
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results indicate, that the regulation of Ca2+ entry is essential for viability and proliferation of
lymphocytes and that store-operated Ca2+ channels play an essential role as a key regulator of
Ca2+ homeostasis.
In contrast to Jurkat T-lymphocytes, which do not need a stimulus for proliferation and
proliferate even more slowly when stimulated, peripheral blood lymphocytes require an
external stimulus for proliferation. Comparing different stimuli, I found that the newly
established focal stimulation using antibody-coated polystyrol-beads is the most efficient
method to induce proliferation. This method mimics the focal aspect of the physiological
activation through formation the immunological synapse between the T-cell and an antigenpresenting cell. In addition to proliferation, apoptosis was analyzed in primary as well as in
Jurkat T-lymphocytes by measuring the activity of caspases –3 and –7. Preliminary experiments
showed increased apoptosis rates when cells were stimulated with the lectin PHA as well as by
focal stimulation. Due of the fact, that we measured the average of a cell population, it is
possible that, at the same time, single cells strongly proliferate whereas other cells become
apoptotic. Therefore, both proliferation and apoptosis could be increased.
My thesis work sheds light on the Ca2+-dependance of T-cell proliferation. A better
understanding of the Ca2+ homeostasis may help to develop new tools for immunotherapy. In
particular, store-operated Ca2+ channels localized in the plasma membran appear to be good
targets to screen for new immune-suppressive drugs.
2. Einleitung
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2. Einleitung
2.1. Funktion von T-Lymphozyten im Immunsystem
Das Immunsystem dient der Abwehr körperfremder pathogener Keime sowie der Erkennung und
Eliminierung körpereigener entarteter Zellen. Dabei spielen T-Lymphozyten, die der
spezifischen, zellulären Immunabwehr zugeordnet werden, eine wichtige Rolle. T-Zellen nehmen
verschiedene Aufgaben innerhalb des Immunsystems wahr und werden in entsprechende
Unterklassen eingeteilt.
65 % der T-Lymphozyten sind T-Helferzellen (CD4+). Sie fördern die Differenzierung von BLymphozyten zu antikörperproduzierenden Plasmazellen und erfüllen somit bei der Induktion der
Immunantwort eine wichtige regulatorische Aufgabe. Die weitere Einteilung der T-Helferzellen
erfolgt durch die Produktion unterschiedlicher Zytokine. Ausgehend von der TH0-Zelle, die die
Interleukine (IL) -2, -4 und –5 produziert, kann die Entwicklung je nach vorherrschendem
Zytokinmuster zu TH1- oder TH2-Zellen verlaufen. TH1-Zellen produzieren neben IL-2, das
wichtig für ihre eigene Aktivierung ist, Interferon γ, dass chemotaktisch auf Makrophagen wirkt.
TH2-Zellen sezernieren die Interleukine –4 und -10, wobei IL-4 das Wachstum von weiteren TH2Zellen stimuliert und IL-10 die Aktivierung der Makrophagen hemmt. Die sezernierten Zytokine
nehmen wesentlichen Einfluss auf den Verlauf der Immunantwort. Welche TH-Subpopulation im
Falle einer Infektion gebildet wird, hängt von verschiedenen Faktoren, wie z.B. der Art des
Erregers oder dem betroffenen Gewebe ab. Aus T-Helferzellen können sich nach AntigenKontakt T-Gedächtniszellen bilden. Sie ermöglichen bei einem erneuten Kontakt mit dem
gleichen Antigen eine schnellere und effektivere Immunantwort (Sekundärantwort) und
vermitteln folglich die Immunität. Die übrigen 35 % der T-Lymphozyten werden den CD8positiven T-Killerzellen zugerechnet (zytotoxische T-Lymphozyten). Sie können Virus-infizierte
Zellen nach antigen-spezifischer Präsentation erkennen und mittels Perforinen lysieren.
T-Lymphozyten werden aktiviert durch professionell antigenpräsentierende Zellen wie
dendritische Zellen, B-Lymphozyten und Makrophagen, die Histokompatilitätsantigene (MHCMoleküle = major histocompatibility complex) exprimieren und darüber dem T-Zell-Rezeptor
(TCR) der Zielzelle Antigenfragmente präsentieren. Bei dem TCR handelt es sich um ein
Heterodimer, das meist aus einer α- und einer β-Kette (αβ+-T-Zellen), selten aus einer γ- und
2. Einleitung
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einer δ-Kette (γδ+-T-Zellen) aufgebaut ist. Die T-Zell-Rezeptoren unterscheiden sich in ihrer
Antigen- erkennenden Region, so dass jede T-Zelle nur ein spezifisches Antigen erkennt. Durch
genetische Rekombination sind theoretisch 1015 verschiedene Variationen der Antigenerkennenden Region möglich. Diese Vielfalt in der Erkennung von Antigenen macht das
menschliche Immunsystem zu einem hochkompetenten Schutzschild gegenüber pathogenen
Keimen.
Nach
der
Bindung
des
Antigenfragment/MHC-Komplexes
an
den
TCR
ist
eine
Signalübertragung ins Zellinnere zur Aktivierung der T-Zelle notwendig. Diese wird durch den
Molekülkomplex CD3 (CD = Cluster of differentiation) übernommen. Der CD3-Molekülkomplex ist nicht-kovalent mit dem TCR assoziiert und besteht aus vier membranverankerten
Polypeptiden, der γ-, δ- und zwei ε-Ketten (diese sind nicht mit den Untereinheiten des TCR
identisch). Der TCR und der CD3- Molekülkomplex werden zusammen als funktioneller TCRKomplex bezeichnet. Dieser Komplex ist mit einem Homodimer von ζ-Ketten assoziiert, die für
die Signalübertagung in die Zelle nach Antigenkontakt zuständig sind. Mit dem TCR sind noch
weitere signalübertragende Moleküle nicht kovalent assoziiert, wie z.B. der kostimulatorische
Rezeptor CD28 sowie die Ko-Rezeptoren CD4 bzw. CD8. Der CD4-Rezeptor dient der
Interaktion mit dem MHC-II-Komplex, während der CD8-Rezeptor mit dem MHC-I-Komplex
interagiert. Ohne kostimulatorische Moleküle würden die T-Zellen bei der Antigenerkennung
apoptotisch werden (Yashiro et al., 1998). In diesem Stadium wären die T-Zellen auch bei einem
zukünftigen „korrekten“ Stimulus nicht mehr aktivierbar. Dieser Mechanismus dient auch der
Elimination von T-Zellen, die mit körpereigenen Strukturen reagieren und ist somit ein wichtiger
Schutz vor Autoimmunreaktionen.
Die bereits erwähnten MHC-Moleküle, die auch HLA-Moleküle (human leukocyte antigen)
genannt werden, werden in zwei Gruppen eingeteilt: MHC-Moleküle der Klasse I werden auf
allen kernhaltigen körpereigenen Zellen exprimiert. Sie dienen der Erkennung veränderter bzw.
zellfremder Peptide, wie sie im Rahmen von Virusinfektionen auftreten. Durch die Präsentation
dieser Peptide über die MHC-I-Moleküle an CD8+-Zellen werden diese aktiviert und sind in der
Lage, die infizierten Zellen mit Hilfe von Perforinen zu lysieren.
Im Gegensatz zu den MHC-I-Molekülen werden die der Klasse II nur von professionell antigenpräsentierenden Zellen exprimiert. Diese Zellen sind in der Lage, komplexe Antigene (Bakterien
oder vollständige Proteine) zu phagozytieren und zu zerkleinern, so dass über den MHC-II-
2. Einleitung
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Komplex schließlich einzelne Peptide den CD4+-Lymphozyten (T-Helferzellen) präsentiert
werden. Im Rahmen dieser Präsentation kommt es zur Aktivierung von intrazellulären
Signalkaskaden (s. Kapitel 2.2), die schließlich zur Bildung und Ausschüttung verschiedener
Zytokine führen. IL-2 induziert im Sinne eines „positiven feedbacks“ die Produktion identischer
Zellpopulationen und führt dadurch zur klonalen Expansion. Weiterhin werden über die
Interleukine –2 und -4 B-Lymphozyten aktiviert, die zur Proliferation angeregt werden und sich
zu Antikörper-produzierenden Plasmazellen entwickeln. Je nach ausgeschütteten Zytokinen
werden außerdem natürliche Killerzellen, Mastzellen, Makrophagen und Granulozyten aktiviert.
Das korrekte Zusammenspiel dieser Zellen und die korrekten Abläufe von Zellkontakt bis hin zu
intrazellulären Signalkaskaden (s. Kapitel 2.2) sind wichtig für ein funktionierendes
Immunsystem. Krankheiten wie z.B. Allergien, Autoimmunerkrankungen
wie Lupus
erythematodes oder chronisch entzündliche Darmerkrankungen wie z.B. Morbus Crohn oder
Colitis ulcerosa sind auf Störungen dieser Abläufe zurückführen und verdeutlichen die
Bedeutung des Immunsystems.
2.2. Kalzium-abhängige Signaltransduktion in T-Lymphozyten
Der funktionelle TCR-Komplex und die assoziierten signalübertragenden Ko-Rezeptoren (CD4,
bzw. CD8) sind mit den Proteinkinasen Fyn und Lck, die aus der Familie der Src-Kinasen
hervorgehen, assoziiert. Die Bindung des MHC/Antigen-Komplexes an den TCR-Komplex führt
den funktionellen TCR-Komplex mit dem CD4- bzw. CD8-Molekül sowie CD45 zusammen.
CD45 aktiviert die Tyrosinkinasen Lck und Fyn durch die Abspaltung inhibitorischer
Phosphatgruppen. Durch Phosphorylierung der ζ-Ketten des CD3-Moleküls können Lck und Fyn
die im Zytosol lokalisierte Tyrosinkinase ZAP-70 binden und aktivieren. ZAP-70 wiederum
phosphoryliert die Adapterproteine LAT (Linker of activated T-Cells) und SLP-76, die zur
Aktivierung der Phospholipase Cγ (PLCγ) führen (Janeway, Immunobiology, 2005). Die
Phospholipase Cγ spaltet das membranständige Phospholipid Phosphatidylinositol-4,5bisphosphat (PIP2) in die „second messenger“ Inositol-1,4,5-triphosphat (IP3) und Diazylglyzerol
(DAG). IP3 führt durch Bindung an den IP3-Rezeptor des endoplasmatischen Retikulums zu einer
Freisetzung von Kalziumionen aus dem Kalziumspeicher in das Zytoplasma. Der zweite
freigesetzte intrazelluläre Botenstoff („second messenger“) DAG führt zusammen mit der
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11
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Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration zu einer Aktivierung der Proteinkinase C
(PKC). Diese wiederum führt über die Phosphorylierung mehrerer Proteinkomplexe wie z.B. AP1 und IκB (inhibitory factor κB)/NFκB (nuclear factor κB) zu einer Dissoziation des IκB/NFκBKomplexes in die Untereinheiten IκB und NFκB (Crabtree and Clipstone, 1994). Das
phosphorylierte IκB wird im Zytoplasma degradiert, wohingegen der nun aktivierte
Transkriptionsfaktor NFκB in den Zellkern wandert, wo er an den Promotor des IL-2-Gens
bindet und zusammen mit anderen Transkriptionsfaktoren, wie AP-1 und NFAT (nuclear factor
of activated T-cells) die Expression von IL-2 induziert (Baldwin, 1996; Partiseti et al., 1994). Der
Transkriptionsfaktor NFAT liegt dabei zunächst in einer phosphorylierten Form im Zytosol vor.
Durch die Erhöhung des intrazellulären Kalziums wird die Kalzium-abhängige Phosphatase
Calcineurin aktiviert, die NFAT dephosphoyliert und so dessen Translokation in den Nukleus
erlaubt. Dort bildet NFAT zusammen mit AP-1 einen Komplex, der zur Transkription des IL-2
Gens führt (Quintana et al., 2005).
Zur Aktivierung von Transkriptionsfaktoren ist eine relativ langanhaltende Erhöhung des
intrazellulären Kalziums notwendig. Dabei führen oszillierende Kalziumkonzentrationen zu einer
effizienteren Aktivierung der Transkriptionfaktoren NFAT und NFκB als eine konstant hohe
intrazelluläre Kalziumkonzentration (Dolmetsch et al., 1998). Außerdem wurde entdeckt, dass
das Kalziumsignal in aktivierten T-Lymphozyten biphasisch ansteigt, d.h. dass es eine transiente
Erhöhung und ein längeranhaltendes Plateau zeigt (Gardner, 1989). Somit erschien es als
wahrscheinlich, dass neben der Entleerung der intrazellulären Speicher ein Kalziumeinstrom von
extrazellulär stattfinden muss, der für die Funktion des Immunsystems essentiell ist. Es wurde
gezeigt, dass die Entleerung der intrazellulären Kalziumspeicher das Aktivierungssignal für
diesen Einstrom ist (Putney, 1990). Aus diesem Grund wird diese Art von Kanal, die auch in
vielen anderen Zellarten gefunden wurde, „Speicher-aktivierter Kanal“ (SOC = Store-operated
channel) genannt wurde. Der in T-Zellen nachgewiesene „Store-operated Channel“ heißt CRACKanal (Calcium-release activated Calcium-Kanal) nach dem gleichen, ursprünglich in Mastzellen
nachgewiesenen Kanal (Hoth and Penner, 1992). Er unterscheidet sich von anderen SOCs durch
seine
hohe
Selektivität
für
Kalziumionen.
Durch
den
Anstieg
der
intrazellulären
Kalziumkonzentration werden Kalzium-abhängige Kaliumkanäle (KCa) und die Ca2+-ATPase
(PMCA) der Plasmamembran aktiviert und der CRAC-Kanal gehemmt. Die Hemmung des
CRAC-Kanals durch die ansteigende Kalziumkonzentration hätte also zur Folge, dass das
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Kalziumsignal schnell wieder abfallen würde. Dies wird dadurch verhindert, dass die
Mitochondrien, die nahe der Plasmamembran und somit des CRAC-Kanals lokalisiert sind, einen
Teil des einströmenden Kalziums über einen Uniporter aufnehmen und somit einer Art
Pufferfunktion nachkommen. Das von den Mitochondrien aufgenommene Kalzium wird nur
langsam wieder über einen Na+/Ca2+-Austauscher in das Zytoplasma abgegeben (Hoth et al.,
1997; Lewis, 2001). Ebenso wird ein Teil des eingeströmten Kalziums über die SERCA-Pumpe
(sarco-endoplasmatic-reticulum-Ca2+-ATPase) aktiv aus dem Zytosol aufgenommen.
Neben dem oben beschriebenen Weg zur wurden zwei weitere Ansätze zur Freisetzung von
Kalzium aus intrazellulären Speichern beschrieben. Sowohl die T-Zelllinie Jurkat- als auch
primäre
T-Lymphozyten
exprimieren
den
Ryanodin-Rezeptor
in
der
Membran
des
endoplasmatischen Retikulums. Durch Bindung des „second messengers“ cADPR (cyclic ADPribose) wird Kalzium aus dem ER freigesetzt. Während der IP3-abhängige Weg wichtig für die
schnelle Freisetzung von Kalzium und die anschließende Aktivierung des CRAC-Kanals nötig
ist, spielt cADPR eine Rolle in der Aufrechterhaltung des Kalziumsignals (Guse, 2004).
Weiterhin wird in T-Lymphozyten eine NAADP+-abhängige (NAADP+ = nicotinic acid adenine
dinuleotide phosphate) Kalziumfreisetzung aus intrazellulären Speichern beschrieben. Die
NAADP+-sensitiven Speicher unterscheiden sich allerdings von den IP3- und cADPR-abhängigen
Speichern; NAADP+ löst z.B. keine Kalziumfreisetzung aus dem ER aus (Genazzani and
Galione, 1996). Über diesen Freisetzungsmechanismus ist insgesamt bisher wenig bekannt. Es
konnte jedoch gezeigt werden, dass NAADP+-Konzentrationen im nanomolaren Bereich zu einer
Kalziumfreisetzung führen (Lee et al., 1997). Die folgende Abbildung 1.1 gibt einen Überblick
über den für unsere Arbeitsgruppe relevanten Teil der Kalzium-abhängigen Signaltransduktion in
T-Lymphozyten.
2. Einleitung
13
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Abb. 2.1 Kalziumabhängige Signaltransduktion in T-Lymphozyten. Durch die Antigenpräsentation über den
MHC-II-Komplex kommt es zur Aktivierung der intrazellulären Signalkaskade in T-Zellen. Über eine anhaltende
Steigerung der intrazellulären Kalziumkonzentration werden Transkriptionsfaktoren aktiviert, die zu der Synthese
von IL-2 führen.
Die zeitliche und räumliche Dynamik des Kalziumsignals, die sich durch das Zusammenspiel von
intrazellulärem und extrazellulärem Kalziumeinstrom in das Zytosol ergibt, ermöglicht die
Modulation von Immunantworten. Die Bedeutung des korrekten Ablaufs der Signalkaskade wird
dadurch verdeutlicht, dass eine Störung im Ablauf dieser Kalziumsignale Ursache einer
Immundefizienz
sein
kann.
Zum
genauen
Verständnis
unterschiedlich
ausgeprägter
Immunantworten und zum Entwickeln geeigneter Immuntherapien ist es wichtig, die zugrunde
liegenden Signalwege aufklären zu können, um geeignete Ansatzpunkte für eine Therapie zu
finden.
2. Einleitung
14
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2.3. Bedeutung des CRAC-Kanals in humanen T-Lymphozyten
Der CRAC-Kanal ist wie bereits im vorherigen Kapitel beschrieben, ein Kalzium-abhängiger
Kalziumkanal in der Plasmamembran, der außer in T-Lymphozyten auch in Mastzellen und
vielen anderen Zelltypen vorkommt. Er zeichnet sich durch eine hohe Selektivität für
Kalziumionen im Verhältnis von 1000:1 gegenüber anderen monovalenten Kationen aus (Hoth
and Penner, 1993) und besitzt eine Einzelkanalleitfähigkeit von etwa 10-20 fS (Prakriya and
Lewis, 2002; Zweifach and Lewis, 1993). Der CRAC-Kanal ähnelt bezüglich der
Kalziumselektivität den spannungsabhängigen Kalziumkanälen, weist jedoch eine geringere
Einzelstromstärke auf. Weiterhin wird dieser Kanal nicht durch eine Änderung des
Membranpotentials, sondern durch die Entleerung der intrazellulären Kalziumspeicher aktiviert.
Über den molekularen Aufbau des CRAC-Kanals ist bisher wenig bekannt. Man geht davon aus,
dass er sich aus mehreren Untereinheiten zusammensetzt. Als beste Kandidaten zur Bildung
dieser Untereinheiten gelten Proteine aus der TRP-Protein-Familie (TRP = transient receptor
potential). Das erste Protein dieser Familie wurde in der Fruchtfliege Drosophila entdeckt
(Montell and Rubin, 1989). Mittlerweile sind sieben Unterklassen der TRP-Familie bekannt. Die
Einteilung in die einzelnen Klassen erfolgte anhand von Sequenzhomologien. Ein
Kandidatenprotein für die Bildung des CRAC-Kanals ist TRPC3. Es konnte gezeigt werden, dass
das TRPC3-Gen in T-Zell-Mutanten, die einen Defekt im Kalzium-Einstrom zeigen, defekt war.
Durch Wiedereinfügen der kompletten menschlichen TRPC3 cDNA in diese Mutanten konnte
der Kalziumeinstrom wieder gemessen werden (Philipp et al., 2003). Während des Schreibens
dieser Arbeit wurde von Feske und Kollegen die Beteiligung eines neuen Proteins am Aufbau des
CRAC-Kanals
nachgewiesen
(Feske
et
al.,
2006).
Dieses
Protein,
das
nach
den
Himmelswächtern der griechischen Mythologie „ORAI1“ benannt wurde, wurde nahezu
gleichzeitig von Vig et al. sowie Zhang et al. beschrieben (Vig et al., 2006, Zhang et al., 2006).
Die Studien dieser Arbeitsgruppen zeigen klar, dass ORAI1 am Kalziumeinstrom über den
CRAC-Kanal beteiligt ist. Trotz dieses großen Fortschrittes ist der genaue Aufbau des Kanals
jedoch immer noch nicht vollständig verstanden.
Neben dem molekularen Aufbau des CRAC-Kanals ist auch der molekulare Mechanismus, der
zur Aktivierung des CRAC-Kanals führt, noch nicht endgültig geklärt. In einem Übersichtsartikel
von Venkatachalam et al. (Venkatachalam et al., 2002) sind verschiedene noch diskutierte
2. Einleitung
15
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Aktivierungsmodelle erläutert. Ein Modell geht davon aus, dass die Freisetzung von Kalzium aus
dem endoplasmatischen Retikulum zur Aktivierung eines Faktors führt (CIF = Calcium influx
factor), der den CRAC-Kanal aktiviert. In glatten Muskelzellen, die ebenfalls einen Speicheraktivierten Kanal besitzen, konnte die Rolle des CIF genauer identifiziert werden. CIF spaltet
Calmodulin von der Kalzium-unabhängigen Phospholipase A2 (iPLA2 = Ca2+-independant
phospholipase A2) ab, was deren Aktivierung und die Bildung von Lysophospholipiden zur Folge
hat. Diese wiederum aktivieren Speicher-aktivierte Kanäle (Smani et al., 2004).
Ein weiteres Modell zur Aktivierung des CRAC-Kanals geht von einer direkten Kopplung des
Speicher-aktivierten Kanals in der Membran an den Kalzium-Kanal des ERs aus. Diskutiert wird,
ob diese Kopplung nicht permanent vorhanden ist, sondern nur bei Aktivierung der T-Zelle durch
einen dynamischen Prozess formiert wird. Auch eine ausgeprägte räumliche Nähe zwischen
Plasmamembran und ER, die kurzreichenden Signalen die Aktivierung des Speicher-abhängigen
Kanals ermöglicht, wird untersucht. Weiterhin gibt es Vertreter der These eines
„Sekretionsmodells“, in dem die Kanäle in Vesikeln liegen und bei Aktivierung durch Fusion in
die Membran eingebaut werden (Venkatachalam et al., 2002). Die neuesten Untersuchungen zur
Aktivierung des CRAC-Kanals zeigen, dass das im Endoplasmatischen Retikulum lokalisierte
Protein STIM1 (STIM = stromal interaction molecule) an der ungeklärten Signaltransduktion
zwischen Speicherentleerung und CRAC-Aktivierung beteiligt sein könnte. Dieses Protein
scheint einen Sensor für die Speicherfüllung darzustellen, indem es bei fehlender Bindung von
Kalzium
an
dem
EF-Hand-Motif
eine
Transformationsänderung
vollzieht
und
zur
Plasmamembran transloziert (Roos et al., 2005; Liou et al., 2005; Zhang et al., 2005). Dort
werden dann möglicherweise Untereinheiten des CRAC-Kanals aktiviert, Verbindungen
zwischen der Membran und dem intrazellulären Speicher formiert oder funktionelle CRACKanäle gebildet (Zhang et al., 2005).
Im Rahmen meiner Doktorarbeit wurde die Kalzium-abhängige Proliferation von TLymphozyten untersucht. Dazu wurden hauptsächlich der Jurkat T-Zell-Klon par (parental) sowie
die daraus hervorgegangenen Mutanten CJ1 und CJ5 benutzt (Fanger et al., 1995). Ausgehend
von der parentalen Zelllinie wurden mutierte Zelllinien mittels γ-Bestrahlung hergestellt und nach
dem Phänotyp der Mutation in die Zelllinien CJ1 bis CJ5 unterteilt (CJ= Ca2+ Jurkat mutants).
Die Mutanten zeigen Defizite in ihrem NFAT-abhängigen Transkriptionsweg. Der zugrunde
liegende Defekt wurde untersucht, dabei wurde festgestellt, dass die Jurkat-Mutanten einen
2. Einleitung
16
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verminderten speicher-aktivierten Kalzium-Einstrom aufweisen, der dem NFAT-abhängigen
Transkriptionsweg zugrunde liegt. Es konnte gezeigt werden, dass dem Defekt im Speicheraktivierten Kalzium-Einstrom ein verminderter Strom durch den CRAC-Kanal (ICRAC) zugrunde
liegt. Die Funktion der spannungsabhängigen und Kalzium-abhängigen Kalium-Kanäle, die über
Potentialänderungen ebenso den Kalziumeinstrom beeinflussen könnten, ist in den Mutanten
unverändert gegenüber der Funktion in der parentalen Zelllinie. Auch die Export-Mechanismen
für Kalzium sind in den Mutanten unbeeinträchtigt. Der Defekt im Speicher-aktivierten
Kalziumeinstrom und somit der Defekt im NFAT-abhängigen Signaltransduktionsweg sind auf
die verminderten Einwärtsströme über den CRAC-Kanal zurückzuführen (Fanger et al., 1995).
Für diese Doktorarbeit wurden neben der parentalen Zelllinie, die keine Defekte aufweist (100%
ICRAC), die Zelllinien CJ1, die den stärksten Phänotyp zeigt, also den am stärksten verminderten
Strom über den CRAC-Kanal (fast kein Strom messbar), sowie die Zelllinie CJ5, die den
schwächsten Phanötyp zeigt (ICRAC: ~ 41%), verwendet. Diese Zellen stellen ein gutes Modell zur
Untersuchung der Kalzium-abhängigen Proliferation dar.
2.4. Kalzium-abhängige Proliferation in T-Lymphozyten
T-Lymphozyten müssen, um ihre Aufgabe im Immunsystem adäquat erfüllen zu können, im
Bedarfsfall proliferieren, damit sie in ausreichender Zahl zur Bekämpfung eines Antigens
vorhanden sind. Im Rahmen der Proliferation durchlaufen sie den Zellzyklus, der durch die
Aufeinanderfolge von Interphase und Mitose charakterisiert ist. Die Dauer dieses Zellzyklus ist in
den verschiedenen proliferierenden Geweben variabel. Zellen der Jurkat T-Zelllinie, die aus einer
akuten lymphatischen Leukämie hervorgegangen sind, benötigen keinen externen Stimulus zur
Proliferation und teilen sich in Kultur entsprechend der Dauer eines Zellzyklus etwa alle 24
Stunden. Die von uns isolierten, nativen, peripheren Blutlymphozyten verbleiben ohne Stimulus
in der G0-Phase des Zellzyklus. Sie benötigen den Antigen-T-Zell-Rezeptor-Kontakt zur
Aktivierung und zum Wiedereintritt in den Zellzyklus. Für diesen komplexen Ablauf, der mit der
Aktivierung des TCR beginnt und über die in Kapitel 2.2 beschriebene Signalkaskade letztlich
zur Produktion von IL-2 und zur Proliferation führt, ist das Vorhandensein von Kalzium
essentiell. Der Anstieg des intrazellulären Kalziums führt zum Fortschreiten des Zellzyklus von
der G0-Phase in die frühe G1-Phase und ist für weitere Kontrollpunkte im Zellzyklus wichtig
2. Einleitung
17
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(Berridge, 1995; Kahl and Means, 2003). Die intrazelluläre Kalziumkonzentration wird von dem
Zusammenspiel von Kalziumeinstrom, z.B. über den CRAC-Kanal, und Kalziumausstrom, wie
z.B. mittels der Plasmamembran-Ca2+-ATPase, reguliert. Im Ruhezustand weisen die meisten
Zellen eine intrazelluläre Kalziumkonzentration von etwa 50-100 nM auf, im Zustand der
Aktivierung kann diese bis auf Werte von 1 µM oder höher ansteigen (Bootman et al., 2001).
Mitochondrien und das endoplasmatische Retikulum spielen für die Kalziumhomöostase der
Zelle eine wichtige Rolle, da sie als „Puffer“ wirken, die hohe Kalziumkonzentrationen bei einer
Aktivierung der Zelle aufnehmen können und somit einer Überladung des Zytosols
entgegenwirken. Das aufgenommene Kalzium kann nach und nach bei Bedarf wieder abgegeben
werden (Lewis, 2001). Ansteigende Kalziumkonzentrationen in der mitochondrialen Matrix
aktivieren Enzyme des Zitratzyklus und führen über erhöhte ATP-Syntheseraten zu einer
erhöhten Energiebereitstellung (Hajnoczky et al., 1995). Jedoch kann eine Überladung der
Mitochondrien mit Kalzium über den Verlust des Transmembranpotentials zur Freisetzung von
Cytochrom c und damit zur Apoptose führen (Berridge et al., 2000). Auch eine Überladung des
Zytosols oder des endoplasmatischen Retikulums kann durch die Aktivierung von StressSignalen zum Zelltod führen (Berridge et al., 1998).
Die zentrale zelluläre Rolle von Kalzium ist die eines intrazellulären Botenstoffes, der die
Aktivität und Proliferation der Zelle sowie den Ablauf des Zellzyklus reguliert (Berridge, 1995;
Berridge et al., 1998; Bootman et al., 2001; Munaron et al., 2004; Santella, 1998). Während eine
Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration zur Proliferation der Zelle führt, kann eine
Überladung der Zelle pro-apoptotisch wirken (Berridge et al., 2000).
Der eng regulierte Kalziumhaushalt ist somit entscheidend für das Leben oder Sterben der Zelle.
2.5. Apoptose in T-Lymphozyten
Unter Apoptose versteht man den programmierten Tod von Zellen, der durch Schrumpfen der
Zellen, Zerteilung der DNA durch Endonukleasen in definierte Stücke und durch Ausbildung von
membranumschlossenen Vesikeln, die von Zellen des Immunsystems aufgenommen werden,
gekennzeichnet ist. Im Gegensatz dazu schwillt bei der Nekrose die Zelle an, die Plasmamembran
wird zerstört und das Zytosol und die Zellorganellen werden in den Extrazellulärraum freigesetzt.
Dies hat eine Entzündungsreaktion zur Folge, die bei der Apoptose nicht zu beobachten ist.
2. Einleitung
18
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Der Zelltod durch Apoptose spielt im Immunsystem eine wichtige Rolle. Während der Reifung
der T-Lymphozyten werden diejenigen Zellen durch Apoptose aussortiert, denen wichtige
Antigen-Erkennungsstrukturen fehlen oder die solche exprimieren, die gegen körpereigene
Strukturen gerichtet sind. Apoptotische Prozesse sind ebenso an der Limitierung der Dauer und
der Stärke einer Immunantwort beteiligt.
Eine zentrale Rolle im Ablauf der Apoptose spielen die Caspasen (Shi, 2002; Thornberry and
Lazebnik, 1998). Caspasen sind Cystein-Proteasen, die Substrate nach einem Aspartat-Rest
spalten und gehören einer Familie von Enzymen an, die eine Zelle unwiderruflich apoptotisch
werden lassen. Die erste Caspase, das Interleukin-1b-converting enzyme (ICE, Caspase -1) wurde
in menschlichen Zellen entdeckt. Die Beteiligung von Caspasen an der Apoptose wurde jedoch
erstmals in dem Nematoden Caenorhabditis elegans beschrieben, in dem das Gen ced-3 für eine
Cystein-Protease kodiert, dass eine sehr starke Ähnlichkeit mit der in Säugetieren entdeckten
ersten Caspase zeigt. Seit der Entdeckung der ersten Caspase konnten insgesamt 14 verschiedene
Caspasen identifiziert werden, von denen 11 in menschlichen Zellen vorkommen (reviewed in
(Riedl and Shi, 2004)). Unterteilt werden Caspasen zunächst in inflammatorische (Caspasen –1, 4, -5, -13, -14) und apopototische Caspasen (Caspasen –2, –3, -6, -7, -8, -9, -10) (Earnshaw et al.,
1999; Shi, 2002). Die Caspasen, die an der Regulation der Apoptose beteiligt sind, werden
wiederum unterteilt in Initiator- (-8, -10, -9, -2) und Effektorcaspasen (-3, -7, -6). Die
Effektorcaspasen werden durch Spaltung durch die Initiatorcaspasen aktiviert (Boatright and
Salvesen, 2003) und führen über die proteolytische Spaltung einer Vielzahl von zellulären Zielen
zum Tod der Zelle. Die Aktivierung der Effektorcaspasen durch proteolytische Spaltung wird von
verschiedenen Assays zur Messung genutzt, wie z.B. bei dem von uns verwendeten Caspase –3/7
Glo Assay. Damit ist eine Aussage über die Aktivität der Effektorcaspasen in den Zellen
möglich.
Wie jedoch kommt es zur Aktivierung der Initiatorcaspasen? Auch diese liegen im Zytosol der
Zelle in einer inaktiven Form als Procaspase vor und müssen, um wiederum die Effektorcaspasen
aktivieren zu können, selbst aktiviert werden (Ramage et al., 1995; Yamin et al., 1996).
Beschrieben wurden ein extrinsischer Aktivierungsweg, der Rezeptor-abhängig stattfindet, und
ein intrinsischer Weg, der als Reaktion auf toxische Intermediärstoffe im Zellstoffwechsel
stattfindet.
2. Einleitung
19
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Der extrinsische Weg findet über Rezeptoren der TNF-Rezeptor (TNF = tumor necrosis factor)
Familie statt. Dazu gehört neben anderen der CD95- (auch Apo-1 oder Fas-) Rezeptor, für den
der Ablauf der folgenden Signalkaskade am besten charakterisiert ist. CD95 ist ein 45 kD großes
Typ-I Transmembranprotein, das in vielen verschiedenen Geweben, besonders stark jedoch in
Thymozyten und T-Lymphozyten, exprimiert wird. Der Ligand des CD95-Rezeptors (CD95L) ist
ein 40 kD großes Glykoprotein der TNF Familie, das jedoch auf der Oberfläche nur weniger
Zelltypen, wie z.B. aktivierten T-Lymphozyten oder natürlichen Killerzellen, exprimiert wird
(reviewed in Li-Weber and Krammer, 2003)). Die Bindung des Liganden an den Rezeptor führt
zur Rekrutierung des zytosolischen Proteins FADD (Fas-associated protein with death domain),
das durch homophile Interaktion mit der „death effector domain“ (DED) der Procaspase –8 einen
Signalkomplex bildet (DISC = death-inducing signaling complex). Durch die Bildung dieses
Signalkomplexes wird die Caspase –8 über einen noch nicht endgültig geklärten Mechanismus
aktiviert und führt über die Spaltung der Effektorcaspasen zur deren Aktivierung und zum Zelltod
(aus (Riedl and Shi, 2004)).
Der intrinsische Weg wird als Antwort auf Stimuli aktiviert, die zur Aktivierung von Onkogenen
oder zur Schädigung von DNA führen. Eine Schädigung dieses Weges ist für die Entstehung von
Neoplasien mitverantwortlich (Hanahan and Weinberg, 2000). Der intrinsische Weg wird über
die Mitochondrien reguliert und ist eng mit der Bcl-2-Proteinfamilie verknüpft. Die Bcl-2Familie besteht aus pro- und antiapoptotischen Proteinen, die Ähnlichkeiten in Sequenz und
Struktur ihrer Bcl-2 homologen Regionen (BH-Region) aufweisen. Bisher sind vier verschiedene
BH-Regionen (BH1-BH4) bekannt. Zu den pro-apoptotischen Proteinen gehören die Proteine
BID, BIM und PUMA, die nur die BH3-Region aufweisen. Diese werden bei DNA-Schäden
aktiviert und führen durch die Hemmung der antiapoptotischen Proteine zu Schädigungen der
Mitochondrien. Dadurch kommt es zur Freisetzung von proapoptotischen Molekülen wie z.B.
Cytochrom c und SMAC/DIABLO (SMAC = second mitochondria derived activator of caspases,
DIABLO = direct inhibitor of apoptosis (IAP)-binding protein) ins Zytosol. Cytochrom c bindet
an APAF-1 (apoptotic-protease-activating-factor-1) und führt über eine Konformationsänderung
zur Bindung von ATP/dATP. Das so gebildetete „Apoptosom“ wandelt die Procaspase –9 in die
aktive Form um, die dann wiederum die Effektorcaspasen aktiviert (nach (Marsden and Strasser,
2003)).
2. Einleitung
20
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Dieser intrinsische Weg kann bei primär induziertem extrinsischen Weg zusätzlich aktiviert
werden. Die im extrinsischen Weg aktivierte Caspase –8 kann das proapoptotische Protein BID
aktivieren, das wie oben beschrieben über die Schädigung der Mitochondrien zur Cytochrom c
Freisetzung führt (Riedl and Shi, 2004).
Die Apoptose ist ein sehr komplexer zellulärer Regulationsmechanismus, der zur Erhaltung von
funktionellem gesundem Gewebe von großer Bedeutung ist. Defekte im Ablauf des
programmierten Zelltodes können zu Autoimmunerkrankungen, Malignomen und Infektionen
führen.
2.6. Zielsetzung der Arbeit
Jurkat T-Lymphozyten proliferieren im Gegensatz zu nativen, peripheren Blutlymphozyten ohne
einen externen Stimulus. Sowohl die Zelllinie als auch die nativen Zellen weisen aber einen eng
regulierten
Kalziumhaushalt
auf,
der
für
ihre
Proliferation
essentiell
ist.
Durch
Proliferationsexperimente mit Mutanten der Jurkat- Zelllinie, die durch einen verminderten Strom
über den für den Kalziumhaushalt wichtigen CRAC-Kanal charakterisiert sind, sollte die
Bedeutung dieses Kanals für die Proliferation untersucht werden. Proliferationsexperimente sind
zur Überprüfung von funktionellen Eigenschaften sehr gut geeignet, da sie am ehesten das
physiologische Milieu der Zellen nachahmen und über einen größeren Zeitraum stattfinden
können.
Neben der Arbeit mit der Jurkat- Zelllinie wurden auch periphere Blutlymphozyten verwendet.
Diese benötigen einen externen Stimulus, um proliferieren zu können. Es sollte ein Stimulus
gefunden werden, der die physiologische Stimulation am besten imitiert und der für zukünftige
Proliferationsexperimente eingesetzt werden kann. Außerdem sollte überprüft werden, ob bei
erhöhter Proliferation der Zellen die Apoptose gleichzeitig erniedrigt ist und inwiefern der
Kalziumhaushalt der Zellen an dem Gleichgewicht zwischen Proliferation und Apoptose beteiligt
ist.
3. Material und Methoden
21
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3. Material und Methoden
3.1. Material
3.1.1. Chemikalien und Assays
Hier nicht aufgeführte Standardlaborchemikalien und Lösungen wurden von den Firmen VWR,
Roche oder Sigma in Analysequalität bezogen.
BAPTA
Sigma
BCA (Bicinchoninsäure)
Sigma
BSA (Serumalbumin aus dem Kalb) Protein Standard
Sigma
Caspase-3/7 Glo (Apoptoseassay)
Promega
CellTiter Blue (Fluoreszenzassay)
Promega
CellTiterGlo
Promega
EGTA (Ethylene-Glycol-Tetraacetic Acid)
Sigma
EZ4U (Absorptionsassay)
Biozol
FCS (fetales Kälberserum)
Invitrogen
Ficoll-Paque TM Plus
Amersham Biosciences
Fura-2 AM „cell permeant“
Molecular Probes
Glycerol
J.T. Baker
NaN3 (Natriumazid)
Sigma
PHA-P (Phytohemagglutinin)
Sigma
Polyornithin
Sigma
Thapsigargin
Molecular Probes
Trypan Blau
Sigma
WST-1 (Absorptionsassay)
Roche
3. Material und Methoden
22
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3.1.2. Medien und Puffer
HBSS
PAA Laboratories GmbH, Kat.-Nr. H15-009
Kalziumfreies Medium (RPMI-1640, +5mg/l
Biochrom AG, im Auftrag angefertigt
Phenolrot, +2 mg/l NaHCO3, ∅ L-Glutamin,
∅ Ca2+)
RPMI-1640
Invitrogen, Kat.-Nr. 21875-034
PBS
Invitrogen, Kat.-Nr. 14190-094
3.1.3. Antikörper
Antikörper
Firma
Methode
anti -CD3-RPE
DAKO, R0810
Zytologie
anti -CD3-FITC
DAKO, F0818
Zytologie
anti -CD19-FITC
DAKO, F0768
Zytologie
anti -CD4-RPE
DAKO, R0805
Zytologie
anti -CD8-RPE (Cy5)
DAKO, C7079
Zytologie
anti -CD3
Serotec, MCA 463XZ
Proliferation
anti -CD3
Euroclone, Kat.-Nr. 1932205HB Proliferation, Bead-Herstellung
anti -CD28
Euroclone, Kat.-Nr. 1928111IA
anti -IgG
Proliferation, Bead-Herstellung
Proliferation, Bead-Herstellung
3.1.4. 96-Well Mikrotiterplatten
Schwarz, komplett
BD, Kat-Nr. 353945
Schwarz, transparenter Boden
BD, Kat.-Nr. 353948
Transparent
BD, Kat.-Nr. 353072
Weiß
BD, Kat.-Nr. 353296
3. Material und Methoden
23
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3.1.5. Geräte
Mikroskope
Photometer
IX 70, Fluoreszenz
Olympus
CK 30, Durchlicht
Olympus
BioPhotometer
Eppendorf
Universal-Mikroplattenmessgerät Genius Pro
Zentrifugen
Tecan
ELX800UV
BIO-TEK Instruments
Centrifuge 5415 R
Eppendorf
Universal 32 R
Hettich
3.1.6. Auswertungsprogramme
Excel
Microsoft
IGOR Pro
WaveMetrics, Inc.
Till Vision
Till Photonics
XFluor4GENiosPro (Excel-Einfügung)
Tecan
3. Material und Methoden
24
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
3.2. Methoden
3.2.1. Zellkultur:
Für die Proliferationsexperimente wurden Zelllinien verwendet, die ursprünglich von dem
Jurkat T-Zellklon E6-1 (ATCC-Nr.: TIB-152) abstammen: die Diphterietoxin- resistente
parentale Zelllinie (par) sowie die Klone CJ1 bzw. CJ5, die von Fanger et al. hergestellt wurden
und durch einen verminderten Kalzium-Einstrom charakterisiert sind.
Die Zellen wurden in RPMI 1640-Medium, das mit 10 % fetalem Kälberserum und PenicillinStreptomycin versetzt wurde (RPMI-komplett-Medium), kultiviert und unter logarithmischem
Wachstum bei 37°C und 5 % CO2 gehalten.
3.2.2. Proliferationsexperimente:
Absorption:
EZ4U: Proliferationsmessungen mittels des EZ4U-Assays wurden in transparenten 96-WellPlatten ausgelesen, wobei die Daten sich aus dem Mittelwert von Triplikaten ergeben. Bei den
meisten Experimenten wurden pro Well 7500 Zellen in einem Volumen von 200 µl für 48
Stunden bei 37°C und 5 % CO2 kultiviert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde die Anzahl
der lebenden Zellen durch die Reduktion des Tetrazolium-Salzes EZ4U in ein Formazan–
Derivat bestimmt (Biozol, #BI-5000). Dabei wurden zu jedem Well 20 µl des EZ4U-Assays
hinzugefügt und die Zellen für weitere vier Stunden inkubiert. Die optische Dichte wurde
anschließend in einem Universal-Mikroplattenleser (zunächst ELX800UV, BIO-TEK
Instruments, spätere Versuche mit Genius Pro, Tecan) bei einer Wellenlänge von 465-630 nm
gemessen.
WST-1: Der Proliferationsassay der Firma Roche (#1644807) basiert auf der Spaltung des
Tetrazoliumsalzes WST-1 durch reduzierende Enzyme an der Plasmamembran. Die
Versuchsdurchführung und die Messung sind identisch mit dem EZ4U-Assay, durch die
Umsetzung des Farbstoffes an der Plasmamembran bleiben die Zellen jedoch vital.
3. Material und Methoden
25
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Chemilumineszenz:
CellTiter-Glo (Promega, #G7570): Im Gegensatz zu den Absorptionsmessungen fanden diese
Proliferationsexperiment in einem Volumen von 100 µl in weißen Mikrotiterplatten statt. Nach
der Inkubationszeit von 48 Stunden wurde die Platte für ca. 30 Minuten bei Raumtemperatur
äquilibriert, bevor eine äquivalente Menge Substrat zugegeben wurde. Anschließend wurde die
Platte für zwei Minuten geschüttelt, um die Zelllyse zu induzieren. Nach weiteren zehn
Minuten Inkubationszeit bei Raumtemperatur zur Stabilisierung des Signals konnte die
Chemilumineszenz in einem Universal-Mikroplattenleser gemessen werden. Das emittierte
Licht verhält sich proportional zu dem ATP-Gehalt, der sich wiederum proportional zur
Zellzahl verhält. Der ATP-Gehalt wird durch eine Luziferase- abhängige Oxygenierung des
Luziferins in Anwesenheit von Mg2+, ATP und O2 bestimmt.
Fluoreszenz:
CellTiter-Blue (Promega, #G8080): Dieser Fluoreszenzassay basiert auf der Eigenschaft
lebender Zellen, den blauen Farbstoff Resazurin, der kaum fluoresziert, zu Resorufin zu
reduzieren.
Resorufin
zeichnet
sich
durch
eine
starke
Fluoreszenz
mit
einem
Exzitationsmaximum bei 579 nm und einem Emissionsmaximum bei 584 nm aus. Die
Vorbereitung der in diesem Fall schwarzen 96-Well-Platten erfolgte wie bei den
Absorptionsmessungen. Nach der Zugabe von 20 µl Substrat wurden die Platten für drei
Stunden inkubiert und bei 535Ex/590Em gemessen. Da das CellTiter-Blue- Substrat nicht toxisch
ist, ist es möglich, diesen Assay mit weiteren funktionellen Assays, wie z.B. einem
fluorimetrischen Apoptoseassay, zu kombinieren.
3.2.3. Apoptosemessungen:
Caspase-Glo3/7 (Promega, #G8090): Dieser auf Chemilumineszenz beruhende Assay bestimmt
den Gehalt an aktiver Caspase -3 und Caspase -7. Caspasen sind die Schlüsselenzyme der
Apoptose in Zellen, wobei die Caspasen -3 und –7 als ausführende Caspasen bezeichnet
werden. Durch Hinzufügen einer äquivalenten Menge des Caspase-Substrats zu dem
Versuchsvolumen startet folgende Reaktion: Das Substrat enthält das Tetrapeptid DEVD, das
durch die Caspasen –3 und -7 abgespalten wird. Dabei entstehen ATP, O2 und Aminoluciferin,
3. Material und Methoden
26
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das durch eine Luciferase- und Mg2+-abhängige Reaktion Licht freisetzt. Das Maximum an
Licht ist 30 Minuten nach Zugabe des Substrats messbar.
3.2.4. Isolation von humanen, peripheren Blutmonozyten
Für die Versuche mit primären menschlichen Lymphozyten liegt ein positives Votum der
Ethikkomission vor. Zur Isolation von humanen, nativen Blutmonozyten wurden LeukozytenDepletionsfilter,
die
uns
von
der
Abteilung
für
klinische
Hämostaseologie
und
Transfusionsmedizin zur Verfügung gestellt wurden, verwendet. Alle Zentrifugationen wurden
bei Raumtemperatur in der Hettichzentrifuge (32R) durchgeführt. Die Filter wurden laut
Abbildung befestigt und entgegen der Filtrationsrichtung mit 60-70 ml HBSS- Puffer gespült,
um die aus der Blutkonserve gefilterten Leukozyten zu gewinnen. Das heruntergespülte BlutPuffergemisch wurde auf zwei mit je 15 ml Ficoll beladene Leukosep-Röhrchen (Greiner)
verteilt und für 30 Minuten bei 450 g ohne Bremse zentrifugiert. Dabei erhält man einen
Gradienten, bei dem die restlichen Erythrozyten auf den Boden des Leukosep-Röhrchens
absinken und die Leukozyten eine ringförmige Struktur etwa einen Zentimeter oberhalb des
Leukosep-Filters bilden. Dieser Leukozytenring sowie der des zweiten Gradienten wurde mit
einer Pipette abgenommen und in ein 50 ml Reaktionsröhrchen überführt. Die Leukozyten
wurden mit HBSS-Puffer auf 50 ml aufgefüllt und für weitere 15 Minuten bei 250 g
zentrifugiert. Das so erhaltene Zellsediment enthält noch einige Erythrozyten, die mit 2-3 ml
Lysepuffer (155 mM NH4Cl, 10 mM KHO3, 0,1 mM EDTA, pH 7,3) für 2-3 Minuten lysiert
wurden. Das Reaktionsröhrchen wurde zum Stoppen der Lyse mit HBSS-Puffer auf 50 ml
aufgefüllt und bei 200 g 10 Minuten zentrifugiert. Dieser letzte Zentrifugationsschritt mit
niedriger g-Zahl soll ermöglichen, dass die Thrombozyten im Überstand bleiben. Die nun von
Erythrozyten befreiten Zellen wurden in 20 ml Medium aufgenommen und mit Trypan Blau
(Sigma) als Vitalitätskontrolle in einer Neubauer-Kammer gezählt. Anschließend wurden die
Zellen in einer Dichte von 2*106 Zellen/ml in Zellkulturflaschen ausgesät und über Nacht bei
37°C im Brutschrank inkubiert. Dies dient der Adhäsion adhärenter Zellen an den
Flaschenboden. Am nächsten Tag wurden die sich in Suspension befindenden Zellen für
Proliferationsexperimente genutzt.
3. Material und Methoden
27
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Um zu überprüfen, ob in den Zellen nach der Präparation noch Kalziumsignale, wie z.B. eine
Entleerung der intrazellulären Speicher, induzierbar sind, wurde zur Kontrolle eine Messung
der intrazellulären Kalziumkonzentrationen durchgeführt (s. Punkt 3.2.5).
Bild 1
Bild 2
Bild 3
Abb. 3.1: Ausspülung der PBMC’s aus einem Leukozyten-Depletionsfilter. Der Filter wird wie in Bild 1 und
Bild 2 gezeigt befestigt und die Klemmen werden angebracht. Anschließend wird der mit Pfeil 1 bezeichnete
Schlauch durchgeschnitten und das Ende in die Zellkulturflasche gesteckt. Dann erfolgt ein Schnitt an Pfeil 2. Nun
werden die Klemmen entfernt und der Filter wird, wie in Bild 3 zu sehen, gegen die Laufrichtung mit einer mit
HBSS gefüllten Spritze gespült. Das Blut/HBSS-Gemisch wird in der Flasche aufgefangen und weiterverarbeitet.
(modifiziert nach Ebner et al., 2001)
3.2.5. Ca2+-Kontrollmessung und Antikörperfärbung der isolierten Lymphozyten
Zunächst werden Deckgläser mit einem Durchmesser von 25 mm mit einem Tropfen
Polyornithin (0,1 mg/ml) bei Raumtemperatur inkubiert. Diese Vorbehandlung soll der Haftung
der Zellen dienen. Nach 30 Minuten wurde der Tropfen abgesaugt. Des weiteren wurden zur
Herstellung des Lademediums 10 ml RPMI-komplett-Medium auf Raumtemperatur erwärmt
und mit 100 µl 1 M Hepes versetzt (Endkonzentration: 10 mM). In DMSO gelöstes Fura-2/AM
(Stocklösung: 1 mM) wurde aufgetaut und in einer Konzentration von 1 µM zu 1 ml
Lademedium zugegeben. Das Fura-2/AM enthaltende Medium wurde für 15 s bei maximaler
Geschwindigkeit mit einem Vortexer gemischt. 1,5 ml der zu messenden Zellsuspension
wurden in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß pipettiert und schnell und kurz zentrifugiert
3. Material und Methoden
28
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(Eppendorf-Zentrifuge 5415C), um ein Zellsediment zu erhalten, welches dann in dem mit
Fura-2 versetzten Medium resuspendiert und für 30 Minuten im Dunkeln inkubiert wurde.
Fura-2 ist ein Kalzium-bindender Farbstoff, der zur Bestimmung der intrazellulären
Kalziumkonzentration verwendet wird.
In der Zwischenzeit wurden die für die Messung benötigten Lösungen hergestellt. Zur
Speicherentleerung wurde Messlösung 1 (1 µM Thapsigargin, 155 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 10
mM Glucose, 5 mM Hepes, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 7,4) verwendet, der Ca2+Einstrom wurde mit Messlösung 2 (1 µM Thapsigargin, 155 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 10 mM
Glucose, 5 mM Hepes, 2 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, pH 7,4) induziert. Der Messplatz mit Lampe
und Kontrolleinheit, Kamera, Mikroskop und Pumpe für Lösungswechsel wurde eingeschaltet
und der Computer sowie das Till- Vision Programm gestartet. Die für 30 Minuten mit Fura-2
inkubierten Zellen wurden abzentrifugiert, einmal mit 1 ml Medium gewaschen und schließlich
je nach Größe des Zellsediments in 20-50 µl Medium aufgenommen. 10 µl dieser
Zellsuspension wurden auf das vorbereitete Deckglas aufgetragen und für weitere 15 Minuten
im Dunkeln inkubiert, so dass der Furaester gespalten werden kann und die Zellen absetzen
können. Danach wurde das Deckglas in das Kammerunterteil gesetzt und mit dem mit Silikon
(VWR) abgedichteten Kammeroberteil bedeckt. Zwei Öffnungen in dieser Kammer machen
einen Lösungswechsel und Spülen während der Messung möglich. Zur Abdichtung von oben
wurde ein 12 mm Deckglas eingesetzt. Die Kammer wurde in die Vertiefung des Mikroskops
eingelassen, festgeklemmt und schließlich an die vorher mit 1 mM Ca2+- Lösung
durchgespülten Schläuche angeschlossen. Die Zellen wurden mit einem 20x Objektiv)
betrachtet und so lange mit 1 mM Ca2+- Lösung (155 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 10 mM Glucose,
5 mM Hepes, 2 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, pH 7,4) gespült, bis möglichst keine Zellen mehr
übereinander lagen. Im Till-Photonics Programm wurde unter Grab Settings die Einstellung
„Kamera“ gewählt. Dann wurde der Fura-Filtersatz (AMF Analysentechnik) ausgewählt und
ein Fluoreszenzbild bei 360 nm und 50 ms Belichtungszeit aufgenommen (360_b). Die
emittierten Fluoreszenzen mit Wellenlängen von λ > 440 nm wurden mit einer CCD Kamera
aufgenommen. In diesem Bild wurde das Analysefeld selektiert. Desweiteren wurde noch ein
Transmissionsbild mit 10 ms Belichtungszeit aufgenommen (trans_a). Nun wurde im
Programm die Einstellung „Analysis“ gewählt. Live Display und Live Kinetics wurden
ausgewählt und bei letzterem das Analysefeld des 360_b- Bildes ausgewählt. Als Werte für
Minimum und Maximum wurden 200 bzw. 1200 eingegeben, die Optionen für das Live
3. Material und Methoden
29
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Display wurden wie folgt festgelegt: T1 35, T2 35, Scale 1000, Bg1 65, Bg2 70. Bei der
Einstellung „Series“ wurden verwendet: Einstellungen: Ratio image pair, 340, 380; Start
time:0; Cycle time: 5000; Number of cycles: 280; Exposure time: 20. Zur besseren Darstellung
der Konzentrationsänderungen in den Zellen wurde eine farbige Anzeige für die intrazelluläre
Kalziumkonzentration gewählt. Nun wurde das eigentliche Experiment gestartet. Die Zellen
wurden abwechselnd bei 340 nm und 380 nm angeregt. Alle 5 s wurde ein Ratio-Bild
(340nm/380nm) aufgenommen. Während der Messung, die über einen Zeitraum von 1400 s
lief, wurden die verschiedenen Lösungen (siehe oben) in die Kammer gespült. Zur Beurteilung,
ob während des Experiments Zellen verrutscht sind, wurde am Ende noch einmal ein
Transmissionsbild aufgenommen. Ein weiteres Bild bei 360 nm wurde aufgenommen, um die
Ladung der Zellen mit Fura-2/AM zu überprüfen. Dann wurde ein Bereich ohne Zellen gesucht
und Hintergrundbilder bei 340 bzw. 380 nm und jeweils 20 ms Belichtungszeit aufgenommen,
um den Hintergrund berechnen und mit in die Auswertung einbeziehen zu können. Die Daten
wurden anschließend als Experiment gespeichert.
Die Auswertung erfolgte mit den Programmen TILL Vision (TILL Photonics) und Igor pro. Die
Ratio 340/380 ist dabei direkt proportional zur intrazellulären Kalziumkonzentration: Letztere
wurde durch eine Kalibration des Messplatzes berechnet (analog zur Kalibration von Mag-Fura
in 3.2.9.) (Grynkiewicz et al., 1985).
A
B
C
D
Abb. 3.2: Abbildung der zum Messen verwendeten Kammer. Die Kammer besteht aus zwei Teilen (Bild A),
die zusammengesetzt werden können (Bild B). Das Deckglas mit den Zellen sitzt unter dem kleinen Kammerteil
und wird mit Silikon abgedichtet, von oben wird die Kammer mit einem kleinen Deckglas abgedichtet. Die
zusammengebaute Kammer wird in die Vertiefung am Mikroskop eingespannt und an zwei Schläuche
angeschlossen, die einen Lösungswechsel während der Messung ermöglichen.
3. Material und Methoden
30
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3.2.6. Antikörperfärbung in der Messkammer
Im Anschluss an die Messung der intrazellulären Kalziumkonzentration wurde in der Regel
eine Doppelfärbung der Zellen (CD3/CD19) in der Messkammer durchgeführt. Hierzu wurden
60 µl einer 1:15 Verdünnung eines FITC-markierten anti-CD19-Antikörpers und eines RPEmarkierten anti-CD3-Antikörpers hergestellt. Diese Lösung wurde rückwärts in die Kammer
eingesaugt und 15 Minuten im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurde von einem
ausgewählten Bereich zunächst ein Transmissionsbild aufgenommen. Mit einem für RPE
geeigneten Filter (F41-007, Cy3, Anregungsfilter: HQ 545/30, Dichroischer Spiegel: Q565 LP,
Emissionsfilter: HQ 610/75, A.H.F. Analysetechnik AG) wurde anschließend bei 550 nm und
einer Belichtungszeit von 1000 ms ein Bild aufgenommen, dann wurde bei 490 nm und 5000
ms Belichtungszeit mit einem FITC-geeigneten Filter (F41-017, EGFP, Anregungsfilter: HQ
470/40, Dichroischer Spiegel: Q495 LP, Emissionsfilter: HQ 525/50, A.H.F. Analysetechnik
AG) fotografiert. Dieser Vorgang wurde für mehrere Bildausschnitte wiederholt. Der Vergleich
der Fluoreszenzbilder und des Transmissionsbildes ermöglicht die Bestimmung der T- bzw. BZellpopulation.
3.2.7. Antikörperfärbung im Reaktionsröhrchen
Eine weitere Möglichkeit zur Antikörperfärbung ist die Färbung im Reagenzröhrchen (Falcon).
Dazu wurden ca. 1*106 Zellen in ein 15 ml-Reaktionsröhrchen pipettiert und bei 250 g und
Raumtemperatur für 10 Minuten in der Hettich-Zentrifuge (30F) zentrifugiert. Das
Zellsediment wurde in 100 µl einer 1:15 Verdünnung der unter Punkt 3.2.6 beschriebenen
Farbstoffe resuspendiert und für 30 Minuten auf Eis und im Dunkeln inkubiert. Anschließend
wurde die Suspension mit 15 ml RPMI-komplett-Medium aufgefüllt und ein weiteres Mal für
10 Minuten bei 250 g zentrifugiert. Das Zellsediment wurde in einer Dichte von ungefähr 3*107
Zellen aufgenommen und weiter auf Eis gelagert. Etwa 15 µl der gefärbten Zellen wurden auf
ein vorher mit 0,1 mg/ml Polyornithin beschichtetes Deckglas pipettiert und wie bei der bereits
beschriebenen Kalziummessung in die Messkammer gesetzt. Waren die Zellen zu dicht, wurde
mit 1 mM-Ca2+-Lösung (155 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 10 mM Glucose, 5 mM Hepes, 2 mM
MgCl2, 1 mM CaCl2, pH 7,4) gespült. Danach konnten die Bilder mit den gleichen
Einstellungen wie bei der oben beschriebenen Antikörperfärbung aufgenommen werden.
3. Material und Methoden
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3.2.8. Intrazelluläre Kalziummessung in 96-well-Platten
Um parallel neben der Proliferation auch die intrazelluläre Kalziumkonzentration der Zellen
bestimmen zu können, wurde eine Methode entwickelt, die es ermöglicht, eine proliferierende
Zellpopulation direkt in einer 96-Well-Platte auf ihr intrazelluläres Kalzium zu testen. Dazu
wurden 7500 Jurkat- Zellen pro Well unter verschiedenen, mit EGTA eingestellten
Kalziumkonzentrationen in eine 96-Well-Mikrotiterplatte pipettiert (in 200 µl Endvolumen)
und für 48 Stunden bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Da wir uns mit der geringen Zellzahl
und den erwarteten Signalen nur knapp über der Auflösungsgrenze des Messgerätes befinden
und der Fura-2/AM-Farbstoff eine Ratio bestimmt und damit unabhängig von der Zellzahl ist,
konnten die Zellen als 6-fach Werte angesetzt werden, um letztlich mehr Zellen bei der
Messung zur Verfügung zu haben. Nach der Inkubationszeit wurden die zu messenden
Zelllinien in 1,5 ml-Reaktionsgefäße umpipettiert und kurz abzentrifugiert. Als Messlösung
wurde ein von einer Firma angefertigtes RPMI-Medium ohne Kalzium (Biochrom AG)
verwendet. Durch Zugabe von CaCl2 wurden Kalziumkonzentrationen eingestellt, die den
Wachstumsbedingungen in der 96-Well-Platte entsprachen. Zur Herstellung des Lademediums
wurden zu einem Teil des jeweiligen Mediums je 2 µM Fura-2/AM zugefügt und durch
Mischen mittels eines Vortexers eine Suspension hergestellt. Die abzentrifugierten Zellen
wurden anschließend in dem jeweiligen Lademedium resuspendiert und für 30 Minuten im
Dunkeln bei Raumtemperatur geladen. Nach der Ladezeit wurden die Zellen erneut
abzentrifugiert und ein Mal in dem entsprechenden Medium ohne Fura-2/AM gewaschen. Nach
erneuter Zentrifugation wurde das Zellsediment letztlich in 600 µl der Messlösung
aufgenommen und als Triplikat in eine schwarze 96-well-Mikrotiterplatte mit transparentem
Boden pipettiert. Die Zellen wurden für weitere 15 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur
inkubiert und anschließend jeweils bei 380 nm und 340 nm Anregungs- (Filter 380/10, 340/10,
Tecan) und 510 nm Emissionswellenlänge (Filter 510/40, Tecan) in einem UniversalMikrotiterplatten-Messgerät von unten gemessen. Die aus 340 nm und 380 nm ermittelte Ratio
ist direkt proportional zur intrazellulären Kalziumkonzentration, welche durch eine Kalibration
der Messapperatur bestimmt wurde (analog zur Kalibration von Mag-Fura in Kapitel 3.2.9.).
3. Material und Methoden
32
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3.2.9. Bestimmung der freien Kalziumkonzentration in RPMI-komplett Medium
Zur Bestimmung der freien Kalziumkonzentration in RPMI-komplett-Medium mittels der
Formel [Ca2+]i= K**(R-Rmin)/(Rmax-R) (Grynkiewicz et al., 1985) wurde zunächst eine
Kalibration des Messplatzes durchgeführt. Die Fluoreszenz wurde wie unter Punkt 3.2.5
beschrieben gemessen, wobei die Lösungswechsel jeweils nach der Einstellung eines
Gleichgewichtes erfolgten. Die Messlösungen wurden ausgehend von einer 0 mM-Ca2+-Lösung
(10 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7,4) und einer 10 mM Ca2+-Lösung (10 mM Hepes, 150
mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4), die jeweils 5 µM des Mag-Fura-2-Salzes (Molecular Probes)
enthielten, in 0,2 mM-Abständen angefertigt. Dies diente dazu, gleiche Mag-FuraKonzentrationen in den Messlösungen zu gewährleisten. Rmin wurde mit der 0 mM Ca2+Lösung, der zusätzlich 1mM EGTA hinzugefügt wurde, gemessen. Zur Bestimmung von Rmax
wurde die 10 mM Ca2+-Lösung mit 1 M CaCl2 auf 30 mM eingestellt. Beide Lösungen
enthielten jeweils 5 µM Mag-Fura-2. Der effektive Kd (K*) wurde im Gegensatz zu den
experimentell bestimmbaren Werten Rmin und Rmax rechnerisch mit Hilfe der Igor pro Software
bestimmt. Mit Hilfe der Formel nach Grynkiewicz et al. und gemessener Ratios (340 nm/380
nm) konnte die Konzentration an freiem Kalzium bestimmt werden.
Die Ratios wurden in RPMI-komplett-Medium bestimmt, das mit 5 µM Mag-Fura-2 geladen
und mit verschiedenen EGTA-Konzentrationen (in mM: 0; 0,5; 0,6; 0,62; 0,65; 0,66; 0,68; 0,7;
0,72; 0,75; 0,8; 0,9; 1,0) versetzt wurde, bestimmt.
3.2.10. Herstellung von Antikörper-beschichteten Polystyrol-Beads
Zur Herstellung der Antikörper-beschichteten Polystyrol-Beads wurden zunächst 100 ml der
Bead-Suspension (∅ 6 µm, Polysciences Inc., #07312) in ein 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß
überführt. Diese wurden mit 900 µl Bor-Puffer (0,1 M, pH 8,5) aufgefüllt und kurz mit einem
Vortexer gemischt. Alle folgenden Zentrifugationen erfolgten bei 10000 Umdrehungen/Minute
(Upm) in einer Eppendorf –Zentrifuge (5415 C). Die Suspension wurde zunächst 5 Minuten
zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und das Sediment in 1 ml Bor-Puffer
aufgenommen. Anschließend wurde erneut fünf Minuten zentrifugiert. Der letzte Schritt wurde
noch ein Mal wiederholt, dann wurden die Beads für zehn Minuten zentrifugiert. Das Sediment
wurde in einer mit Bor-Puffer hergestellten 1:10 Verdünnung des jeweiligen Antikörpers (antiCD3-Ak, anti-CD28-Ak, anti-IgG-Ak) resuspendiert und über Nacht bei Raumtemperatur
3. Material und Methoden
33
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geschüttelt. Am nächsten Tag wurde zunächst 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde
abgenommen und zur Proteinbestimmung aufgehoben. Das Sediment wurde in 0,5 ml des BorPuffers, der zu diesem Zweck mit 10 mg/ml Serumalbumin aus dem Kalb (BSA; Sigma, P0914) versetzt wurde, gelöst und für 30 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt. Anschließend
wurde erneut zehn Minuten zentrifugiert. Diese beiden Schritte wurden ein Mal wiederholt,
bevor das die Beads enthaltende Sediment zur Lagerung bei 4°C in einem speziellen Puffer (0,1
M Phosphatpuffer, 15 mM NaCl, 1% BSA, 5% Glycerol, 0,1 % NaN3, pH 7,4) resuspendiert
wurde.
4. Ergebnisse
34
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4. Ergebnisse
4.1. Ermittlung einer für alle Versuche geeigneten Zellzahl im linearen Messbereich
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Kalzium-abhängige Proliferation von T-Lymphozyten
untersucht. Als Modell wurde die T-Zelllinie Jurkat (ATCC-Nr.: TIB-152, E6-1) und die daraus
hervorgegangenen Zelllinien parental (= par), CJ1 und CJ5 verwendet. Die verwendeten JurkatZelllinien E6-1, par, CJ1 und CJ5 zeigen ein exponentielles Wachstum. Aus der parentalen
Zelllinie sind die Mutanten CJ1 und CJ5 hervorgegangen, die durch einen verminderten
Einstrom über den Kalzium-abhängigen Kalziumkanal charakterisiert sind. Dabei zeigt die
Zelllinie CJ5 den schwächsten Phänotyp, d.h. der Kalziumeinstrom ist im Vergleich zu den
parentalen Zellen am geringsten vermindert. Die Zelllinie CJ1 ist durch einen sehr stark
verminderten Kalziumeinstrom charakterisiert.
Die folgenden Experimente zur Kalzium-abhängigen Proliferation wurden in 96-Well-Platten
mittels des EZ4U-Assays durchgeführt. Verschiedene Wachstumsbedingungen wurden als
Triplikate gemessen, woraus der Mittelwert und die Standardabweichung berechnet wurden.
Für diese Experimente musste eine Zellzahl gewählt werden, bei der sichergestellt ist, dass das
Wachstum der Zellen auf die Modulation der gewählten Parameter (wie z.B. Änderung der
extrazellulären Kalziumkonzentration mittels EGTA) zurückzuführen ist. Dazu muss eine
Anfangszellzahl gewählt werden, bei der das Messsignal linear mit der zu messenden Zellzahl
steigt. Nur solange die Zellzahl linear zum gemessenen Signal steigt, ist sichergestellt, dass der
Parameter des Zellwachstums gemessen wird, ohne dass andere Parameter, wie z.B. Wellgröße,
Zelldichte oder Verbrauch von Medium eine Rolle spielen.
Um den Bereich ermitteln zu können, in dem sich das gemessene Signal linear zur Zellzahl
verhält, wurden verschiedene Anfangszellzahlen über vier Tage gemessen. Zunächst wurde das
Wachstumsverhalten der ursprünglichen Jurkat T-Zelllinie E6-1 untersucht. Diese liegen an
Tag 1 im linearen Bereich bei einer anfänglichen Zellzahl von 1000 bis 12500 Zellen pro Well,
an Tag 2 zwischen 5000 und 12500 Zellen, an Tag 3 zwischen 2500 und 10000 Zellen und an
Tag 4 zwischen 1000 und 5000 Zellen pro Well. Als Beispiel für das Proliferationsverhalten
dieser Zelllinie werden die Mittelwerte zweier Messungen an Tag 2 gezeigt (s. Abb. 4.1).
4. Ergebnisse
35
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Abb. 4.1 Wachstum der ursprünglichen T-Zelllinie E6-1 in Abhängigkeit von der Anfangszellzahl.
Aufgetragen ist die optische Dichte von verschiedenen Anfangszellzahlen nach einem Proliferationszeitraum von
zwei Tagen. Die Daten ergeben sich aus der Messung von Triplikaten, die Abbildung zeigt die Mittelwerte und
Standardabweichungen aus zwei Experimenten.
Die Zelllinie E6-1 wurde nur als Test, nicht aber für weitere Experimente verwendet, da die aus
ihr hervorgegangene parentale Zelllinie die beste Kontrollzelllinie für CJ1 und CJ5 darstellt.
Die parentale Zelllinie zeigt an Tag 1 Signale, die linear zur Zellzahl steigen, wenn eine
Anfangszellzahl von 2500 bis 12500 Zellen pro Well, an Tag 2 und Tag 3 zwischen 2500 und
10000 Zellen pro Well und an Tag 4 zwischen 1000 und 5000 Zellen pro Well gewählt wird.
Die Zelllinien CJ1 und CJ5 zeigen ebenso wie die parentale Zelllinie an Tag 1 bei einer
Anfangszellzahl von 2500 bis 12500 Zellen pro Well einen zur Zellzahl linearen Signalanstieg,
an Tag 2 und Tag 3 verhalten sich die Signale linear zur Zellzahl bei anfänglichen 2500 bis
10000 Zellen pro Well, an Tag 4 zwischen 500 und 2500 Zellen pro Well. Die Zelllinie CJ5
zeigt insgesamt ein der Zelllinie CJ1 sehr ähnliches Wachstum. Die Signale sind an Tag 1 und
Tag 2 fast gleich hoch. An Tag 3 und Tag 4 sind die Signale der Zelllinie CJ5 niedriger. Abb.
4.2 zeigt die Mittelwerte aus vier Experimenten für Tag 1-3, bzw. drei Experimenten für Tag 4.
4. Ergebnisse
36
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Abb. 4.2 Wachstum der parentalen Zelllinie und der Zelllinien CJ1 und CJ5 in Abhängigkeit von der
Anfangszellzahl. Die Abbildungen zeigen den Signalanstieg der Zellen in Abhängigkeit von der Anfangszellzahl
über einen Proliferationszeitraum von vier Tagen. Die Daten zeigen den Mittelwert und die Standardabweichung
aus vier Experimenten an Tag 1-3, bzw. aus 3 Experimenten an Tag 4. In den einzelnen Versuchen wurden die
Daten als Triplikate gemessen.
Aufgrund dieser Untersuchungen wurden für die folgenden Experimente für alle Zelllinien
folgende Parameter
gewählt:
Bei
einem zur Zellzahl
linearen
Signalanstieg
und
uneingeschränkter Proliferation wurde für Tag 2 eine Anfangszellzahl von 7500 Zellen pro
Well gewählt. Für Experimente an Tag 3 wurden 5000 Zellen pro Well gewählt.
4. Ergebnisse
37
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
4.2. Instantanes Signal: Kalibrierung der EZ4U-Messmethode
Mit der EZ4U-Methode wird nicht direkt die Zellzahl gemessen. Die lebenden Zellen setzen
durch enzymatische Reaktionen das Tetrazoliumsalz EZ4U in ein Formazan-Derivat um. Dabei
entstehen Reduktionsäquivalente, die linear mit der Anzahl der lebenden Zellen steigen. Die
Zellzahl wird dadurch abgeschätzt, dass die Absorption des umgesetzten Reagenz gemessen
wird. Es muss nun sichergestellt sein, dass alle verwendeten Zelllinien in dem gewählten
Zellzahlbereich das Messreagenz gleich umsetzen, insbesondere deswegen, weil bei den
nachfolgenden Experimenten sehr kleine Unterschiede in der Proliferation der parentalen
Zelllinie und der Mutanten CJ1 und CJ5 erwartet werden. Es ist also besonders wichtig
sicherzustellen, dass geringe Signalunterschiede ausschließlich auf Effekte der Proliferation
zurückzuführen sind.
Jede Zelllinie muss also bei gleicher Zellzahl gleich hohe Signale liefern. Dies wird kontrolliert,
indem die Messung der Zellen unmittelbar nach dem Pipettieren erfolgt und somit für die
Zellen keine Möglichkeit zur signifikanten Proliferation gegeben ist. Abb. 4.3 zeigt die
Zusammenfassung der Experimente zur Bestimmung des instantanen Signals.
Für Experimente an Tag 2 wurde eine Anfangszellzahl von 7500 Zellen pro Well gewählt, die
sich unter Annahme eines exponentiellen Wachstums an Tag 2 auf ungefähr 30000 Zellen pro
Well vermehrt haben sollten. Experimente, die an Tag 3 gemessen wurden, wurden mit 5000
Zellen pro well gestartet. Somit sollten an Tag 3, an dem gemessen wurde, ca. 40000 Zellen in
einem Well sein. Für uns ist demnach der Bereich zwischen 5000 und 40000 Zellen pro Well
relevant.
Die Abbildung 4.3 zeigt, dass die Zelllinien bei Zellzahlen in diesem Bereich keine
signifikanten Unterschiede im Signal zeigen. Es ist sichergestellt, dass das Messreagenz von
den Zelllinien gleich gut umgesetzt wird und dass es in dem verwendeten Zellzahlbereich
überhaupt noch umgesetzt werden kann. Daher ist der Assay für weitere Versuche geeignet.
Weiterhin ist zu erkennen, dass die Messung einer optischen Dichte von z.B. 0,6 einer Zellzahl
von ungefähr 40000 Zellen pro Well entspricht. Dies erlaubt für Proliferationsexperimente mit
Hilfe des EZ4U-Assays eine Abschätzung der im Well vorhandenen Zellzahl.
4. Ergebnisse
38
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Abb. 4.3 Signalstärke in Abhängigkeit von der Zellzahl – instantanes Signal. Die Abbildung zeigt die
zellzahlabhängige Signalstärke der parentalen Zelllinie (par) sowie die der Mutanten CJ1 und CJ5. Aufgetragen
sind die Mittelwerte und Standardabweichungen aus zwei Experimenten, bei mit * versehenen Balken beträgt n=4.
Die Daten der einzelnen Experimente wurden aus Triplikaten errechnet.
4. Ergebnisse
39
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4.3. Qualitätsvergleich von sterilfiltriertem und autoklaviertem EGTA
Um die Kalzium-abhängige Proliferation der Zelllinien untersuchen zu können, muss die
extrazelluläre Konzentration des Ions genau moduliert werden können. Dazu wurde EGTA als
Kalzium-Chelator eingesetzt. Zur möglichst genauen Einstellung der erwünschten extrazellulären Kalziumkonzentration für die nachfolgenden Versuche ist es wichtig, dass das EGTA
die bestmögliche Qualität hat und dass seine Bindungseigenschaften nicht gestört werden. Für
Proliferationsexperimente ist die Sterilität aller verwendeten Substanzen und Materialien
unbedingt notwendig. Viele Substanzen können autoklaviert werden, ohne dass sie in ihrer
Stabilität beeinträchtigt werden. Um festzustellen, ob Autoklavieren die Eigenschaften von
EGTA beeinflusst, wurde ein frisch angesetztes Volumen EGTA geteilt. Ein Teil wurde
filtriert, der zweite Teil wurde autoklaviert. Parentale Zellen wurden jeweils mit filtriertem und
autoklaviertem EGTA für 48 bzw. 72 Stunden inkubiert. In der Abbildung 4.4, die das
Experiment nach 48-stündiger Inkubationszeit zeigt, ist zu erkennen, dass die mit
autoklaviertem EGTA inkubierten Zellen insbesondere in dem für die Zellen kritischen
Konzentrationsbereich sehr viel höhere Signale zeigen, als diejenigen, welche mit einer
gleichen Konzentration sterilfiltriertem EGTA behandelt wurden. Dies weist darauf hin, dass in
diesen Wells eine höhere extrazelluläre Kalziumkonzentration herrscht als in den mit filtriertem
EGTA pipettierten Wells. Das gleiche Ergebnis ergibt sich nach 72-stündiger Inkubation der
Zellen mit filtriertem bzw. autoklaviertem EGTA. Der gerade unter stringenten Bedingungen
auftretende starke Signalunterschied zwischen filtriertem und autoklaviertem EGTA lässt auf
unterschiedliche Chelationseigenschaften schließen.
Da Filtrieren im Vergleich zu Autoklavieren eine schonendere Behandlung ist, lässt dieses
Ergebnis darauf schließen, dass die Bindungsfähigkeit des autoklavierten EGTA für Kalzium
abnimmt.
Autoklavieren scheint EGTA in seinen Eigenschaften so zu verändern, dass es zur Benutzung
für unsere Proliferationsexperimente, die eine genaue Einstellung der extrazellulären
Kalziumkonzentration erfordern, ungeeignet ist. Für alle weiteren Versuche wurde somit
sterilfiltriertes EGTA verwendet.
4. Ergebnisse
40
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Abb. 4.4 Unterschiede in der Proliferation von parentalen Zellen bei 48- stündiger Inkubationszeit mit
sterilfiltiertem bzw. autoklaviertem EGTA (n=1). Parentale Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen
autoklaviertem bzw. sterilfiltriertem EGTA inkubiert. Aufgetragen sind Mittelwerte und Standardabweichungen,
die aus Triplikaten ermittelt wurden.
4. Ergebnisse
41
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
4.4. Überprüfung der Eignung von EGTA zur Modifikation der extrazellulären
Kalziumkonzentration
EGTA zeichnet sich im Vergleich zu anderen Chelatoren für zweiwertige Ionen (wie z.B.
EDTA) dadurch aus, dass es eine große Selektivität für Kalzium (Kd:175 nM) gegenüber
zweiwertigen Ionen wie z.B. Magnesium aufweist. Es muss jedoch sichergestellt werden, dass
der Effekt von EGTA tatsächlich nur auf die Bindung des für die Proliferation entscheidenden
Kalziums zurückzuführen ist und dass es keine Interferenzen mit dem Assay oder eine direkte
toxische Wirkung auf die Zellen zeigt .
Dazu wurde zu den Zelllinien zusätzlich zu verschiedenen EGTA- Konzentrationen 0,5 mM
bzw. 1 mM CaCl2 zugefügt. Wenn der Effekt von EGTA nur auf die Chelation von Kalzium
zurückzuführen ist, sollten die Zellen mit der entsprechenden Gabe von CaCl2 in ihrer
Proliferation unbeeinflusst bleiben. Zur Abschätzung des nach Zugabe von EGTA in der
Lösung verbleibenden freien Kalziums kann folgende Formel verwendet werden:
A= (AT-BT-k)/±√[((AT-BT-k)/2)² +k*AT] (A: freies Ca2+ [mM]; AT: in der Lösung vorhandenes
bzw. zugefügtes Kalzium; BT: zugegebenes EGTA [mM]; k: Dissoziationskonstante für EGTA
[0,000175 mM])
In dem für die Versuche verwendeten RPMI-1640 Medium liegen zusätzlich Proteine vor, die
Kalzium binden können. Es ist jedoch davon auszugehen, dass diese Proteine bereits mit dem
im Medium vorhandenen Kalzium gesättigt sind. Bei einer Zugabe von 0,5 mM CaCl2 zu 0,5
mM EGTA in RPMI-1640 Medium bleiben demnach etwa 9,4 µM des zugegebenen Kalziums
als freies Kalzium über. Man kann also grob abschätzen, dass sich die Effekte des EGTA und
des CaCl2 auf die Proliferation bei einer äquimolaren Zugabe aufheben müssten.
Die Abbildung 4.5 zeigt exemplarisch einen entsprechenden Versuch an Tag 2. Die Zellen
wurden mit 1 mM EGTA und 1 mM CaCl2 pipettiert. Als Kontrollen wurden Zellen ohne
EGTA und ohne zusätzliches Kalzium inkubiert. Man kann erkennen, dass die Zelllinien, die
mit EGTA und Kalzium inkubiert wurden, keine signifikanten Signalunterschiede zu den
Zellen, die komplett unbehandelt blieben, zeigen.
Diese sichtbaren Effekte lassen sich mit der Konzentration an verbleibendem extrazellulären
Kalzium erklären. Durch die äquimolare Zugabe von CaCl2 und EGTA wird das Kalzium
nahezu vollständig gebunden, somit ist die verbliebene extrazelluläre Kalziumkonzentration der
der Kontrolle ohne EGTA und ohne Kalzium nahezu gleich. Der Chelator selbst interferiert
4. Ergebnisse
42
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weder mit dem Assay, noch zeigt er in dem für die Experimente gewählten Bereich weitere
Effekte auf die Zellen. Das gleiche Experiment wurde für Tag 3 durchgeführt.
Auch hier fanden sich keine Anhaltspunkte für nicht erwünschte Effekte auf die Zellen.
Somit ist EGTA zur Einstellung des extrazellulären Kalziums für weitere Versuche geeignet.
Abb. 4.5 Prüfung der Toxizität von EGTA nach 48-stündiger Inkubation. Die parentale Zelllinie (par) sowie
die Mutanten CJ1 und CJ5 wurden für 48 Stunden mit 1 mM EGTA inkubiert. Zusätzlich wurde 1 mM CaCl2
zugefügt. Zur Kontrolle wurden Wells ohne Kalzium und ohne EGTA (0mM EGTA/ 0 mM CaCl2) pipettiert. Die
Abbildung zeigt ein einzelnes Experiment; Mittelwerte und Standardabweichungen wurden aus Triplikaten
ermittelt.
4. Ergebnisse
43
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4.5. Überprüfung der Eignung von BAPTA als Kalziumchelator für Proliferationsexperimente
BAPTA ist ein dem EGTA ähnlicher Kalziumchelator, der sich laut Literatur durch eine ebenso
hohe Selektivität für Kalzium wie EGTA auszeichnet (Kd: 107 nM). BAPTA ist jedoch
schneller in der Aufnahme bzw. Abgabe von Kalziumionen und wird weniger von Änderungen
des pH-Wertes beeinflusst (Tsien, 1980). Aufgrund dieser Eigenschaften ist BAPTA für
Proliferationsexperimente als Modulator extrazellulärer Kalziumkonzentrationen interessant
und muss ebenso wie EGTA zunächst auf toxische Eigenschaften auf das Zellwachstum, die
nicht auf die Chelation von Kalzium zurückzuführen sind, untersucht werden.
Das Experiment wurde nach dem gleichen Pipettierschema wie das zur Überprüfung der
Eignung von EGTA durchgeführt: Zu den Zelllinien wurden verschiedene BAPTAKonzentrationen sowie 0,5 mM bzw. 1 mM CaCl2 zugefügt, anschließend wurden die Zellen
für 48 Stunden inkubiert.
Aus Vorversuchen war bekannt, dass BAPTA mit dem EZ4U-Assay interferiert, daher wurde
die optische Dichte mit Hilfe des WST-1-Assays bestimmt. Der WST-1-Assay funktioniert
vom Prinzip her wie der EZ4U-Assay, unterscheidet sich jedoch dadurch, dass das
Tetrazoliumsalz an der Plasmamembran umgesetzt wird und daher die Zellen auch nach der
Messung noch lebendig sind. Der Versuch wurde in RPMI-1640 Medium ohne Phenolrot
durchgeführt, da der Farbstoff „Phenolrot“ mit dem Assay interferiert und somit zu falschen
Messergebnissen führen würde.
Die Abbildung 4.6 zeigt zur Vereinfachung nur die wesentlichen Ergebnisse des Experiments.
Es ist deutlich zu erkennen, dass BAPTA trotz Zugabe einer äquimolaren Menge CaCl2 Effekte
auf das Zellwachstum zeigt. Diejenigen Zellen, die mit einer Konzentration von 1 mM BAPTA
inkubiert wurden, scheinen trotz Zugabe von Kalzium apoptotisch zu werden und liefern nur
noch sehr geringe Signale im Vergleich zu der Kontrolle, die ohne Zugabe von BAPTA
pipettiert wurden (0,00 mM BAPTA/ 0 mM CaCl2).
4. Ergebnisse
44
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Abb. 4.6 Prüfung der Toxizität von BAPTA nach 48-stündiger Inkubationszeit. Die parentale Zelllinie sowie
die Zelllinien CJ1 und CJ5 wurden mit 1mM BAPTA und äquimolarer Zugabe von CaCl2 für 48 Stunden
inkubiert. Als Kontrollen wurden Zellen ohne BAPTA und ohne Kalzium inkubiert (0 mM BAPTA/ 0 mM CaCl2).
Die Abbildung zeigt ein einzelnes Experiment. Die Daten wurden aus Triplikaten bestimmt und als Mittelwert +
Standardabweichung gezeigt.
BAPTA scheint neben der Eigenschaft als Kalziumchelator noch weitere Effekte auf die Zellen
zu haben, die für unsere Experimente ungeeignet sind, da nur die Konzentration des
extrazellulären Kalziums modifiziert werden soll. Für die weiteren Experimente zur
Bestimmung der Kalzium-abhängigen Proliferation der T-Lymphozyten wurde daher EGTA als
Kalziumchelator verwendet.
4. Ergebnisse
45
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4.6. Unterschiede der Kalzium-abhängigen Proliferation der parentalen Zelllinie und der
Zelllinien CJ1 und CJ5
Das Hauptinteresse dieser Arbeit gilt der Kalzium-abhängigen Proliferation von TLymphozyten. Diese sollte mit Hilfe der parentalen Zelllinie, die normale CRACKanalaktivität zeigt, sowie der Mutanten CJ1 und CJ5, die durch einen verminderten Strom
durch den CRAC- Kanal charakterisiert sind, untersucht werden.
Durch die Modifikation der extrazellulären Kalziumkonzentration mit Hilfe von EGTA sollte
diejenige Kalziumkonzentration bestimmt werden, bei der 50 % der Zellen noch vital sind.
Die Experimente wurden alle in 96-Well-Platten durchgeführt. Alle drei Zelllinien wurden mit
verschiedenen EGTA- Konzentrationen inkubiert und an Tag 2 mit Hilfe des EZ4U-Assays
gemessen. Die folgende Abbildung 4.7 zeigt eine repräsentative Messung.
Abb. 4.7 Proliferation der parentalen Zelllinie sowie der Zelllinien CJ1 und CJ5 unter variierenden
Kalziumkonzentrationen. Die extrazelluläre Kalziumkonzentration wurde mit Hilfe von EGTA erniedrigt. Die
Abbildung zeigt eines aus 15 Experimenten, wobei die Proliferation der Zellen in normalem Medium (ohne
EGTA) auf 100 % gesetzt wurde. Die Daten wurden aus Triplikaten ermittelt, abgebildet sind Mittelwerte und
Standardabweichungen.
4. Ergebnisse
46
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Für jedes einzelne Experiment wurden in Igor Pro die IC50-Werte des EGTA für die parentalen
Zellen sowie die Zelllinien CJ1 und CJ5 ermittelt.
Die folgende Abbildung 4.8 zeigt einen in Igor Pro erstellten repräsentativen Fit der Zelllinie
CJ1 für das in Abbildung 4.7 gezeigte Experiment.
Abb. 4.8 Ermittlung des IC50-Wertes in Igor Pro für die Zelllinie CJ1. Aufgetragen wurden die gemessenen
Signale zu den entsprechenden EGTA-Konzentrationen. Mit Hilfe einer Funktion in Igor Pro wurde der Verlauf
der Kurve und die dem IC50-Wert entsprechende EGTA-Konzentration bestimmt.
Der Verlauf der Kurven wird durch folgende Funktion bestimmt:
y = max- max/(1+exp((xhalf-x)/rate))) + min
Die Variable „xhalf“ entspricht dem von uns gesuchten halbmaximalem x, also dem IC50-Wert.
„Max“ entspricht dem Maximum, die Variable „rate“ gibt die Steilheit der Kurve wieder.
Die Variable „min“ gibt die Eigenschaft der Kurve wieder, bei unendlich großem x gegen einen
minimalen Wert zu streben. Bei der Verwendung dieser Fit- Funktion entspricht das Maximum
der Kurve der Summe aus „max“ + „min“. Für die meisten Experimente ist min = 0, da die
Zellen bei nicht vorhandenen freien extrazellulären Kalziumionen nicht proliferieren können.
4. Ergebnisse
47
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Für die in Abbildung 4.8 gezeigte Kurve gelten folgende Werte: max = 0,599, xhalf = 0,749, rate
= 0,034, min = 0.
Nach der Bestimmung der IC50-Werte der einzelnen Zelllinien für jedes Experiment ergeben
sich folgende Mittelwerte für Tag 2 (s. Abb. 4.9):
Parentale Zelllinie: 0,762 mM EGTA ± 0,0087
CJ1: 0,733 mM EGTA ± 0,0088
s. Kapitel 4.7 zur Bestimmung der
CJ5: 0,739 mM EGTA ± 0,0117
entsprechenden Kalziumkonzentrationen
Abb. 4.9 Darstellung der IC50-Werte der parentalen Zelllinie und der Zelllinien CJ1 und CJ5 für Tag 2.
Abgebildet sind Mittelwerte ± SEM aus 15 Experimenten. Die einzelnen IC50-Werte wurden in Igor Pro ermittelt.
Die Signifikanz der sichtbaren Unterschiede wurde mit einem gepaarten, nach zwei Seiten
offenen t-Test überprüft. Die IC50-Werte der parentalen Zelllinie unterscheiden sich hoch
signifikant von denen der Zelllinie CJ1 (p<0,005 für n=11 Datenpaare) und unterscheiden sich
signifikant von denen der Zelllinie CJ5 (p<0,05 für n=11 Datenpaare). Zwischen den Zelllinien
CJ1 und CJ5 lässt sich statistisch kein Unterschied nachweisen.
4. Ergebnisse
48
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4.7. Bestimmung der Kalzium-Konzentration in RPMI-1640 Medium
Die unter Kapitel 4.6 beschriebenen halbmaximalen EGTA-Konzentrationen sollten noch in
Kalziumkonzentrationen umgerechnet werden. Daher wurden mit Hilfe einer Eichgerade die
Kalziumkonzentrationen in mit EGTA versetztem RPMI-1640 Medium bestimmt.
Zur Berechnung des freien Kalziums nach der Formel von Grynkiewicz et al., 1985) ([Ca2+]=
Kd*(x-Rmin)/(Rmax-x) müssen die Werte für Rmin und Rmax bestimmt werden. Dazu wurde ein
Kalzium-Imaging-Experiment mit dem Farbstoff MagFura für Ringer-Lösungen mit einem
Kalziumgehalt von 0-30 mM durchgeführt (Die Lösungen wurden freundlicherweise von
Bettina Strauß hergestellt). MagFura wurde daher verwendet, da es eine hohe Selektivität für
Kalziumionen mit einer Dissoziationskonstante von 25 µM aufweist und daher für die zu
messenden Lösungen geeignet war.
Abb. 4.10 Eichgerade zur Bestimmung des freien Kalziums. Gezeigt ist der relevante Bereich zur Umrechnung
der in Kap. 4.6 bestimmten EGTA-Konzentrationen. Die gemessenen Ratios (340nm/380nm) aus zwei
Experimenten wurden gegen die eingesetzten Kalziumkonzentrationen aufgetragen. Der mittlere Verlauf der
Kurven wurde in Igor Pro berechnet.
4. Ergebnisse
49
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Hieraus leitet sich folgende Formel zur Errechnung des freien Kalziums ab:
[Ca2+] = 1689,12*((x-247,56)/(10482,9-x))
Desweiteren mussten experimentell nach der gleichen Methode die entsprechenden Ratios zu
dem mit verschiedenen EGTA-Konzentrationen versetzten RPMI-1640 Medium bestimmt
werden. Die daraus mit oben gezeigter Formel bestimmten Kalziumkonzentrationen wurden in
Igor Pro gegen die entsprechenden EGTA- Konzentrationen aufgetragen und mit einer doppeltexponentiellen Funktion gefittet. Daraus ergab sich die in Abb. 4.11 gezeigte Kurve, die durch
die Formel
y = -4,56441 + 2112,64*exp(-6,8417*x) + 2574,56* exp( -6,83486*x)
beschrieben wird.
Mit Hilfe dieser Formel ist es möglich, jede verwendete EGTA- Konzentration in die
entsprechende Kalzium-Konzentration umzurechnen.
Abb. 4.11 Doppelt-exponentieller fit zur Errechnung von Kalzium-Konzentrationen bei bekannter EGTAKonzentration. Die aus den gemittelten Ratios zweier Experimente errechneten Kalzium-Konzentrationen wurden
gegen die entsprechenden EGTA-Konzentrationen aufgetragen. In Igor Pro wurde der Verlauf der abgebildeten
Kurve errechnet, die es ermöglicht, für alle EGTA-Konzentrationen die entsprechenden Kalzium-Werte zu
bestimmen.
4. Ergebnisse
50
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Für die halbmaximalen EGTA- Konzentrationen an Tag 2 ergeben sich somit folgende
Kalzium-Konzentrationen:
Parentale Zelllinie: 0,762 mM EGTA ⇒ 21,0 µM Ca2+
CJ1: 0,733 mM EGTA ⇒ 26,6 µM Ca2+
CJ5: 0,739 mM EGTA ⇒ 25,4 µM Ca2+
Unter nicht modifizierter extrazellulärer Kalziumkonzentration sind keine Unterschiede im
Wachstumsverhalten der parentalen Zelllinie und der Zelllinien CJ1 und CJ5 zu beobachten.
Erst unter stringenten Bedingungen werden die Effekte des reduzierten Stroms über den
CRAC-Kanal sichtbar. Die Mutanten CJ1 und CJ5 sind durch einen verminderten Strom
charakterisiert, der zur Folge hat, dass die Zellen nur unter vermehrtem extrazellulären Kalzium
einen zur Proliferation ausreichenden Strom und damit ein ausreichendes Kalzium-Niveau
aufrecht erhalten können.
4. Ergebnisse
51
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4.8. Blockade des CRAC- Kanals mittels BTP2
Die Kapitel 4.6 und 4.7 zeigen die Kalzium-abhängige Proliferation von Zelllinien, die durch
verschiedene Ströme über den CRAC- Kanal charakterisiert sind. Die Zelllinien CJ1 und CJ5,
die durch einen verminderten Strom charakterisiert sind, benötigen ein erhöhtes extrazelluläres
Kalzium, um eine der parentalen Zelllinie adäquate Proliferation zu erreichen. Uns interessierte
nun, ob eine sehr starke Inhibierung des CRAC-Kanals mittels des Pyrazol-Derivats BTP2 (Zitt
et al., 2004) unterschiedliche Effekte auf die Proliferation der verschiedenen Zelllinien
aufweist. BTP2 blockiert selektiv den CRAC-Kanal mit einem IC50-Wert von ~100nM, ohne
mit anderen für die Kalziumhomöostase wichtigen Zellmechanismen zu interagieren. Um die
Auswirkungen eines starken CRAC-Kanal-Blocks auf die Zellen zu untersuchen, wurden die
parentale Zelllinie sowie die Zelllinien CJ1 und CJ5 in 96-Well Platten unter verschiedenen
EGTA- Konzentrationen mit 400 nM BTP2 inkubiert. Die EGTA- Konzentrationen wurden so
gewählt, dass sie den in Kapitel 4.6 ermittelten kritischen Bereich abdecken. An Tag 2 wurde
die Zelldichte mittels des EZ4U-Assays gemessen. Abbildung 4.12 zeigt die Mittelwerte aus 11
Experimenten für die parentale Zelllinie und aus jeweils 6 Experimenten für die Zelllinien CJ1
und CJ5.
Abb. 4.12 CRAC-Kanal-Block durch BTP2. Abgebildet sind Mittelwerte + SEM der parentalen Zellen (11
Experimente) und der Zelllinien CJ1 und CJ5 (jeweils 6 Experimente) in Prozenten. Für jede Zelllinie wurden
nebeneinander die Mittelwerte ohne und mit Behandlung von BTP2 aufgetragen. Das Signal der Zellen, die ohne
EGTA und BTP2 inkubiert wurden, wurde auf 100 % gesetzt.
4. Ergebnisse
52
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Bei EGTA- Konzentrationen zwischen 0,00 und 0,72 mM sind für die zusätzlich mit BTP2
inkubierten Zellen keine signifikanten Reduktionen der Zelldichte sichtbar. Erst unter stark
limitiertem extrazellulärem Kalzium im Bereich des in Kapitel 4.7 ermittelten IC50-Wertes ist
eine signifikante Reduktion vorhanden. Der gepaarte, nach zwei Seiten offene t-test ergab für
eine Konzentration von 0,75 mM EGTA im Vergleich der CRAC- Kanal blockierten bzw.
nicht-blockierten Zellen folgende Signifikanzen: Parentale Zellen unterscheiden sich hoch
signifikant (p<0,005), die Zelllinien CJ1 und CJ5 zeigen jeweils einen signifikanten
Unterschied (p<0,05).
Auch unter 0,80 mM EGTA sind noch signifikante Effekte des BTP2 auf die Zellen sichtbar
(parentale Zellen: p<0,005, CJ1: p<0,05, CJ5: p=0,05), allerdings sind im Durchschnitt nur
noch 20 % der Zellen lebendig, was die Aussagekraft dieser Werte relativiert.
Zusammenfassend ist festzustellen, dass eine Blockade des CRAC- Kanals mittels BTP2 nur
unter limitierten extrazellulären Kalziumkonzentrationen das Wachstum der T-Zellen reduziert.
Ein möglicher Grund dafür ist die Tatsache, dass die Jurkat-Zelllinie aus Leukämie-Zellen
entstanden ist, die proliferieren, ohne irgendeinen Stimulus zu benötigen. Aufgrund dieses
enormen Proliferationsvermögens ist es möglich, dass der Effekt von BTP2 nur dann
nachweisbar ist, wenn die Zellen durch Reduktion der extrazellulären Kalziumkonzentration in
ihrer Wachstumsfähigkeit so eingeschränkt sind, dass der CRAC-Kanal für das weitere
Überleben essentiell wird. Die BTP2-Experimente implizieren weiterhin, dass ein sehr geringer
Kalziumeinstrom über den CRAC-Kanal für die Proliferation der Zellen ausreicht. Die
möglichen Ursachen für das reduzierte Wachstum der T-Zellen nur unter limitierten
extrazellulären Kalziumkonzentrationen werden in Kapitel 5 genauer diskutiert.
4. Ergebnisse
53
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4.9. Bestimmung der Proliferation und der intrazellulären Kalziumkonzentration am
Beispiel der parentalen Zelllinie und der Zelllinie CJ1 – Kompensation des CRACDefekts?
Im Rahmen ihrer biologischen Facharbeit untersuchte Katherina Waggershauser in unserer
Arbeitsgruppe die intrazelluläre Kalziumkonzentration der Zelllinie CJ1 nach 48- bzw. 72stündiger Inkubation mit EGTA. Bei allen Zellen stellte sich je nach zugegebener EGTAKonzentration eine intrazelluläre Gleichgewichtskonzentration ein, die für Tag 2 (48h) und Tag
3 (72h) gleich war. Die Ergebnisse wurden in Igor Pro gefittet und sind in der folgenden
Abbildung 4.13 links gezeigt. Die unter verschiedenen EGTA- Konzentrationen gemessenen
intrazellulären Kalziumkonzentrationen wurden mit den entsprechenden Proliferationsdaten,
die in den vorigen Abschnitten erläutert wurden, korreliert. Die daraus folgende Grafik ist in
der Abbildung 4.13 rechts dargestellt.
Abb. 4.13 Kompensation des CRAC- Defekts bei der Zelllinie CJ1. Die linke Abbildung zeigt die Bestimmung
der intrazellulären Kalziumkonzentration bei variierenden EGTA- Konzentrationen (gemessen und ausgewertet
von Katherina Waggershauser), rechts ist die Korrelation der intrazellulären Kalziumkonzentration mit der
Proliferation gezeigt. Die Proliferation wurde an Tag 2 mittels des EZ4U-Assays gemessen, die intrazellulären
Kalziumkonzentrationen sind die Mittelwerte aus > 3000 gemessenen Zellen an Tag 2 und 3. Aufgrund der hohen
gemessenen Zellzahl und der Einstellung einer intrazellulären Gleichgewichtskonzentration sind keine
Standradabweichungen in der Abbildung zu erkennen. Dargestellt sind jeweils die einzelnen Messpunkte der
parentalen Zelllinie sowie der Zelllinie CJ1 sowie die in Igor Pro erstellten Fits.
4. Ergebnisse
54
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Die linke Abbildung verdeutlicht zunächst, dass die parentalen Zellen im Vergleich zu Zellen
der Zelllinie CJ1 bei gleicher EGTA-Konzentration eine erhöhte intrazelluläre Kalziumkonzentration aufweisen. Werden nun die einzelnen Kalziumkonzentrationen mit den
Ergebnissen der Proliferationsexperimente korreliert, zeigt sich, dass die Zelllinie CJ1 bei
gleicher intrazellulärer Kalziumkonzentration erhöhte Proliferationsraten im Vergleich zu der
parentalen Zelllinie zeigt. Es ist denkbar, dass die Zellen der Zelllinie CJ1, die einen
verminderten Strom über den CRAC-Kanal aufweisen, dies über einen noch unbekannten
Mechanismus kompensieren können und somit die gleiche Proliferationsrate wie die parentalen
Zellen bei einer geringeren intrazellulären Kalziumkonzentration aufrecht erhalten können.
4. Ergebnisse
55
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4.10. Bestimmung der Proliferation und des Ruhekalziums von PHA- stimulierten JurkatZellen
Im Rahmen der Versuche zur Bestimmung des IC50-Wertes für EGTA an Tag 2 wurde
versucht, die Zellen zusätzlich mit PHA (2µg/ml) zu stimulieren, um durch den dadurch
zusätzlich entstehenden Wachstumsreiz Unterschiede in der Proliferation der Zelllinien besser
verdeutlichen zu können. Zellen der Jurkat-Zelllinie benötigen im Gegensatz zu peripheren
Blutlymphozyten in der Regel keinen zusätzlichen Stimulus, um proliferieren zu können, da sie,
wie in Kapitel 4.8 bereits erwähnt, aus Leukämie-Zellen abstammen. Bei einer zusätzlichen
Stimulation mit PHA müsste jedoch verstärkt der T-Zell-Rezeptor aktiviert werden und über
die Signaltransduktionskaskade zu einem erhöhten intrazellulären Kalzium und einer
verstärkten Proliferation führen. Überraschenderweise konnte beobachtet werden, dass die
stimulierten Zellen im Vergleich zu den unstimulierten Zellen schlechter proliferieren. Für uns
stellte sich dann die Frage, inwiefern das verminderte Wachstum mit der intrazellulären
Kalziumkonzentration korreliert.
Zur Überprüfung dieser Fragestellung wurde das Ruhekalzium der Zellen in 96-Well-Platten
untersucht, parallel dazu wurde die Proliferation bestimmt.
Abbildung 4.14 zeigt die reduzierte Proliferation der mit PHA stimulierten Zellen, in
Abbildung 4.15 ist das Ruhekalzium von unstimulierten und stimulierten Jurkat- Zellen gezeigt.
Abb. 4.14 Erniedrigte T- Zell- Proliferation bei PHA- Zugabe. Gezeigt ist die Proliferation der parentalen
Zelllinie und der Zelllinien CJ1 und CJ5 in Abhängigkeit von PHA unter normalem extrazellulärem Kalzium. Die
Proliferation der Zellen ohne PHA wurde auf 100 % gesetzt. Die Abbildung zeigt Mittelwerte + SEM aus zwei
Experimenten. Die Daten der einzelnen Experimente wurden jeweils aus Triplikaten errechnet.
4. Ergebnisse
56
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Abb. 4.15 Messung des Ruhekalziums von unstimulierten im Vergleich zu stimulierten T-Zellen. Die Grafik
zeigt den Anstieg des intrazellulären Kalziums unter Zugabe von PHA (+) im Vergleich zu Kontrollen ohne PHA
(-). Die intrazelluläre Kalziumkonzentration wurde mittels des Fura-2 Farbstoffes in einer 96-Well-Platte
gemessen. Abgebildet sind Mittelwerte + SEM der parentalen Zelllinie (n=4) sowie der Zelllinien CJ1 (n=1) und
CJ5 (n=2). Die Daten der einzelnen Versuche wurden aus Triplikaten ermittelt.
Die parentale Zelllinie zeigt unter Zugabe von PHA eine im Mittel um 12,7 % erniedrigte
Proliferation, die Zelllinie CJ1 um 21,1 % und die Zelllinie CJ5 um 13,7 %. Gleichzeitig findet
sich bei der parentalen Zelllinie eine um 52 % erhöhte intrazelluläre Kalziumkonzentration bei
Behandlung mit PHA, die Zelllinie CJ1 zeigt ein um 76 % und die Zelllinie CJ5 ein um 58 %
erhöhtes intrazelluläres Kalzium. Beim Vergleich dieser Zahlen findet sich für die Zelllinien
eine Korrelation zwischen Proliferationsabnahme und Steigerung des intrazellulären Kalziums.
Auch unter Erniedrigung des extrazellulären Kalziums mittels verschiedener EGTAKonzentrationen zeigt sich für alle Zelllinien unter Zugabe von PHA eine im Mittel um 21 %
geringere Proliferation (Daten nicht gezeigt).
4. Ergebnisse
57
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4.11. Apoptose von PHA- stimulierten Jurkat- Zellen
Im vorigen Kapitel wurde die verminderte Proliferation von PHA- stimulierten Jurkat T-Zellen
beschrieben. Diese zeigten gleichzeitig erhöhte intrazelluläre Kalziumkonzentrationen. Da die
Zellen einen eng regulierten Kalziumhaushalt haben, ist es möglich, dass das erhöhte
intrazelluläre Kalzium zur erhöhten Apoptoseraten führt, die dann gleichzeitig als verminderte
Proliferation auffallen. Daher wurde versucht, parallel zur Proliferation Schlüsse über die
Apoptoserate mittels des Nachweises der Aktivität der Apoptose-ausführenden Caspasen -3 und
–7 mittels Chemilumineszenz ziehen zu können. In Abbildung 4.16 ist eines von zwei
Experimenten zur Bestimmung der Caspaseaktivität dargestellt. Beide Experimente zeigten
identische Ergebnisse.
Abb. 4.16 Apoptose von unstimulierten und stimulierten Jurkat- Zelllinien. Abgebildet ist die Aktivität der
Caspasen -3 und -7 in parentalen Zellen (schwarz, grau), in der Zelllinie CJ1 (rot, weiß) und in der Zelllinie CJ5
(grün, hellgrün). Die Zugabe von PHA ist mit (+), Kontrollen ohne PHA sind mit (–) gekennzeichnet. Die
Grundaktivität der Caspasen –3 und –7 in unstimulierten Zellen unter nicht modifizierter extrazellulärer
Kalziumkonzentration wurde auf 1 gesetzt. Die Grafik zeigt eines der zwei Experimente. Die aufgesetzten Balken
geben die Standardabweichungen der gemessenen Triplikate wieder.
4. Ergebnisse
58
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Beide Versuche zur Bestimmung der Caspase-Aktivität in unstimulierten und stimulierten
Jurkat- Zellen zeigen, dass die Aktivität in stimulierten parentalen Zellen und in stimulierten
Zellen der Zelllinie CJ5 unter normaler extrazellulärer Kalziumkonzentration leicht erhöht ist.
Im zweiten Experiment zeigt auch die Zelllinie CJ1 unter Stimulation eine um 26 % erhöhte
Caspase-Aktivität. Die Zusammenfassung beider Experimente zeigt eine Steigerung der
Apoptoserate bei Stimulation um 19,6 % für die parentale Zelllinie, um 8,2 % für die Zelllinie
CJ1 und eine Steigerung um 64,8 % für die Zelllinie CJ5.
Unter Reduktion des extrazellulären Kalziums in den Bereich des ermittelten IC50-Wertes
zeigen sich insgesamt um den Faktor 2,5 bis 3,5 erhöhte Caspase-Aktivitäten. Diese Daten
korrelieren mit der in Abbildung 4.7 abnehmenden Proliferation bei sinkendem extrazellulärem
Kalzium.
Dabei ist die Caspase-Aktivität der mit PHA stimulierten parentalen Zelllinie um im Mittel 8,6
% im Vergleich zu nicht stimulierten Zellen erniedrigt, die der Zelllinie CJ1 um 30,9 % und die
der Zelllinie CJ5 um 18,2 % (Zusammenfassung für n=2 Versuche).
PHA steigert also unter nicht modifizierter Kalziumkonzentration die Aktivität an Caspase –3
und
-7
und
somit
die
Apoptoserate
gering,
bei
erniedrigten
extrazellulären
Kalziumkonzentrationen im Bereich des IC50-Wertes mindert PHA jedoch die Aktivität der
Apoptose-ausführenden Caspasen.
4. Ergebnisse
59
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4.12. Kalziumsignal-Messung als Vitalitätskontrolle der isolierten peripheren Blutlymphozyten (PBLs)
Im Rahmen der weiteren Experimente sollte die Stimulierbarkeit humaner, primärer T-Zellen
untersucht werden. Um nach deren Isolation ein Auswahlkriterium für die Vitalität der Zellen
zu haben, wurde eine Messung induzierbarer Kalziumsignale mit Hilfe des Fura-2-Farbstoffes
durchgeführt.
In Abbildung 4.17 ist der Verlauf einer Messung der intrazellulären Kalziumkonzentration zu
sehen. Zunächst wurden die Kalziumspeicher mit Thapsigargin entleert. Thapsigargin blockiert
den Rücktransport des intrazellulären Kalziums über die SERCA-Pumpe (SERCA= Sarcoendoplasmatic-reticulum-Ca2+-ATPases) in das endoplasmatische Retikulum. Das Kalziumsignal in der Zelle steigt kurz an und fällt anschließend wieder ab, da die Kalzium-ATPase in
der Plasmamembran das Kalzium aus der Zelle transportiert. Das in der kalziumfreien Lösung
zusätzlich enthaltene EGTA bindet das aus der Zelle freiwerdende Kalzium. Im Anschluss an
die 0 mM Ca2+-Lösung wurde eine 1 mM Ca2+-Lösung mit Thapsigargin eingespült. Da die
intrazellulären Speicher zuvor entleert wurden, ist der Kalzium-abhängige Kalziumkanal
(CRAC-Kanal), der ein Speicher-aktivierter Kanal ist (SOC= Store operated channel) geöffnet,
was zu einem raschen Kalziumeinstrom und einem starken Anstieg des Signals führt. Nach der
Zugabe einer kalziumfreien Lösung sinkt das Signal wieder ab, da kein Einstrom mehr möglich
ist und das sich intrazellulär befindende Kalzium aus der Zelle transportiert wird, wo es
wiederum von dem sich in der Lösung befindenden EGTA gebunden wird.
Die Abbildung 4.17 zeigt ein repräsentatives Ergebnis einer Messung der intrazellulären
Kalziumkonzentration in PBLs. Die Kalziumkonzentration verhält sich proportional zur Ratio
340nm/380nm in den einzelnen Zellen und kann mit der Formel von Grynkiewicz et al., 1985,
bei bekanntem Rmin und Rmax berechnet werden.
4. Ergebnisse
60
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Abb. 4.17 Kalziummessung als Vitalitätskontrolle der isolierten PBLs. Gezeigt ist der Verlauf der
intrazellulären Kalziumkonzentration ([Ca2+]i [nM]) von 332 gemessenen Zellen unter verschiedenen
Kalziumlösungen. Die Lösungswechsel fanden bei 100 s, 600 s und 1100 s statt. Die intrazellulären
Kalziumkonzentrationen wurden aus den gemessenen Ratios mit Hilfe der Formel von Grynkiewicz et al.
berechnet.
Die
gezeigten
Bildausschnitte
zeigen
jeweils
Momentaufnahmen
der
intrazellulären
Kalziumkonzentration der PBLs im Verlauf der Messung.
Es ist zu sehen, dass die PBLs nach der Isolation aus Depletionsfiltern adäquat auf Stimuli, die
Einfluss auf ihren intrazellulären Kalziumgehalt nehmen, reagieren. Das zu Beginn gemessene
Ruhekalzium liegt bei etwa 60 nM, demnach sind die PBLs nicht voraktiviert. Sie sind somit in
Bezug auf das von uns untersuchte Kriterium für weitere Proliferationsexperimente geeignet.
4. Ergebnisse
61
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4.13. Bestimmung des Anteils an T- und B-Lymphozyten der isolierten PBLs
Die isolierten PBLs wurden nach der der Vitalitätskontrolle dienenden Kalziummessung
gefärbt, um den Anteil an T- und B-Lymphozyten aus den isolierten Zellen bestimmen zu
können. Abbildung 4.18 zeigt einen Ausschnitt aus einer Färbung, die mittels eines RPEmarkierten CD3- Antikörpers T-Lymphozyten und mittels eines FITC- markierten CD19Antikörpers B-Lymphozyten darstellt.
Abb. 4.18 Antikörperfärbung von isolierten peripheren Blutlymphozyten. Links ist ein Ausschnitt eines
Durchlichtbildes mit 61 Zellen zu sehen. Rechts daneben sind die mit einem RPE- markierten CD3-Antikörper
gefärbten T-Lymphozyten zu sehen. Ganz rechts ist die Färbung der B-Lymphozyten mittels eines FITCmarkierten CD19-Antikörpers dargestellt. 47 der im Durchlichtbild gezeigten Zellen lassen sich mit dem CD3Antikörper färben (77,1 %), 7 mit dem CD19- Antikörper (11,5 %). Dies entspricht in etwa dem aus 6 Isolationen
errechnetem Mittelwert (s.u.)
Auf die oben dargestellte Art wurden isolierte Zellen aus sechs Depletionsfiltern (n=3122
Zellen) untersucht. Die isolierten Zellen setzten sich zu 74,6 ± 3,1 % aus T-Lymphozyten und
zu 9,7 ± 1,6 % aus B-Lymphozyten zusammen. Die Zusammensetzung der Restpopulation
wurde nicht untersucht.
Zwei weitere Filter wurden mit drei Antikörpern gegen CD4, CD8 und CD19 gefärbt. Daraus
lässt sich die T-Zell-Population genauer in T-Helfer- und T-Killerzellen unterscheiden. Von
insgesamt 936 untersuchten Zellen gehörten 61,6 ± 1,6 % zu der Population der CD4-positiven
T-Helferzellen, 12,9 ± 2,2 % zu den CD8-positiven T-Killerzellen und 17,7 ± 3,7 % zu den
CD19-positiven B-Lymphozyten. Auch hier kann keine Aussage über die Zusammensetzung
der Restpopulation gemacht werden.
4. Ergebnisse
62
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4.14. Proliferation von PHA- stimulierten PBLs
Im Kapitel 4.9 wurde gezeigt, dass PHA- stimulierte Jurkat T-Zellen schlechter proliferieren.
Im Anschluss wurde auch die Proliferation von PHA-stimulierten nativen Blutlymphozyten
untersucht. Dazu wurden unterschiedliche Anfangszellzahlen der PBLs von vier Patienten mit
2µg/ml PHA für 48 Stunden inkubiert und gemessen. Im Gegensatz zu den Zelllinien ist beo
primären T-Lymphozyten ein Wachstumsanstieg unter Stimulation mit PHA zu erkennen. Im
Mittel ist die Proliferation bei einer Anfangszellzahl von 100000 Zellen/Well um 125 ± 46 %
erhöht, bei einer Anfangszellzahl von 75000 Zellen um 139 ± 26 %, bei 50000 Zellen um 128 ±
10 % und bei 25000 Zellen um 63 ± 27 %. Die Abbildung 4.19 zeigt ein repräsentatives
Proliferationsexperiment mit stimulierten und unstimulierten PBLs eines Patienten.
Abb. 4.19 Proliferationssteigerung von stimulierten gegenüber unstimulierten PBLs eines Patienten. Gezeigt
sind die mit Hilfe des Chemilumineszenzassays CellTiterGlo gemessenen Signale der unstimulierten und
stimulierten primären T-Lymphozyten eines Patienten. Die Mittelwerte und Standardabweichungen wurden aus
Triplikaten ermittelt. Abgebildet sind die repräsentativen Daten der Zellen eines aus insgesamt vier
Depletionsfiltern.
Im Gegensatz zur Jurkat T-Zelllinie zeigen periphere Blutlymphozyten bei Zugabe von PHA
eine hohe Proliferationssteigerung. PHA wurde für weitere Experimente mit Bead- stimulierten
PBLs als Positivkontolle zur Wachstumsinduktion verwendet.
4. Ergebnisse
63
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4.15. Induktion von Apoptose in PBLs
Parallel zu den Proliferationsexperimenten mit stimulierten PBLs sollte auch deren Apoptose
gemessen werden. Dies sollte durch die Bestimmung der Aktivität der Caspasen –3 und –7
mittels des Caspase –3/7 Glo Assays erfolgen. Diese Caspasen sind die Effektorcaspasen der
Apoptose. Um den Verlauf der Caspase-Aktivität in unseren Zellen bestimmen zu können,
sollte eine Kinetik in den PBLs über einen Zeitverlauf von Tag 0 bis Tag 3 gemessen werden.
Dazu wurde eine Substanz benötigt, die in den Zellen maximal Apoptose, jedoch keine Nekrose
auslöst. Als Indikatoren zur Apoptose wurden Thapsigargin, Doxorubicin und 5’-FluorDesoxyuridin getestet.
Für Thapsigargin wurde zunächst mittels eines Proliferationsexperimentes der Bereich des IC50Wertes in Jurkat-Zellen und in primären T-Lymphozyten bestimmt. Die ThapsigarginKonzentration, bei der 50 % der Zellen noch lebendig sind, liegt zwischen 0,5 und 1 µM. Zur
Bestimmung der Caspase-Aktivität wurden dann in PBLs Konzentrationen von 50 und 250 nM
eingesetzt, da die Zellen zwar eine möglichst hohe Aktivität an Caspase –3 und –7 zeigen,
jedoch immer noch lebendig sein sollten. In diesen Konzentrationen ließ sich jedoch nur
unzureichend Apoptose induzieren.
Doxorubicin löst sowohl in unstimulierten als auch in stimulierten Blutlymphozyten Apoptose
aus (Ferraro et al., 2000). Der IC50-Wert liegt für unstimulierte PBLs zwischen 0,3 und 1 µM.
Für PHA-stimulierte primäre Lymphozyten liegt der Bereich in höheren Konzentrationen,
wurde jedoch nicht mehr genauer bestimmt. Doxorubicin wurde bei unstimulierten PBLs in
Konzentrationen von 100 und 200 µM verwendet, war jedoch zum Auslösen von Apoptose
ungeeignet, da es mit dem von uns verwendeten Caspase -3/7 Glo Assay Interferezen zeigte.
5’-Fluor-Desoxyuridin wurde in einer Konzentration von 100 nM getestet. Diese Konzentration
löst bei PBLs Apoptose aus. Die Signale waren in etwa so stark wie die der Bead-stimulierten
Zellen und vierfach höher als die der unstimulierten Zellen. 5’-Fluor-Desoxyuridin induzierte
keine maximale Aktivität der Caspasen –3 und –7, war jedoch im Vergleich zu den anderen
getesteten Substanzen am ehesten zur Auslösung von Apoptose in PBLs geeignet. Zur Messung
einer Kinetik der Caspasen –3 und –7 wurde 5’-Fluor-Desoxyuridin daher zur Induktion der
Apoptose eingesetzt.
4. Ergebnisse
64
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4.16. Kinetik von Caspase –3 und –7
Um für die Experimente zur Bestimmung von Apoptose in unstimulierten und stimulierten
Zellen eine Aussage über das Stadium der Apoptose treffen zu können, wurde eine Kinetik der
Effektorcaspasen –3 und –7 gemessen. Sie sollte Aufschluss darüber geben, an welchem Tag
die Zellen ein Maximum an Apoptose zeigen. Dazu wurde der Verlauf der Caspase-Aktivität
der PBLs über einen Zeitraum von Tag 0 bis Tag 3 bestimmt. Es wurden PHA-stimulierte und
unstimulierte Zellen jeweils mit und ohne 5’-Fluor-Desoxyuridin pipettiert und die Aktivität der
Caspasen mittels des Caspase –3/7 Glo Assays gemessen.
Die folgende Abbildung 4.20 zeigt das Experiment zur Bestimmung der Caspase-Kinetik.
Abb. 4.20 Kinetik der Aktivität der Caspasen –3 und –7 in primären peripheren Blutlymphozyten. Die
Aktivität der Caspasen wurde mittels des Caspase –3/7 Glo Assays über einen Zeitraum von drei Tagen bestimmt
(0h, 24h, 48h, 72h). Der schwarze Balken zeigt mit PHA (2µg/ml) stimulierte Zellen, die zusätzlich mit 100 nM
5’-Fluor-Desoxyuridin (5-FdUr) inkubiert wurden. Dunkelgrau sind die nur mit 5-FdUr inkubierten Zellen
dargestellt, der hellgraue Balken gibt die Caspaseaktivität von stimulierten Zellen wieder. Der weiße Balken zeigt
als Kontrolle unstimulierte PBLs. Die Daten wurden in einzelnen Wells bestimmt, daher kann keine
Standardabweichung angegegeben werden.
Die Abbildung zeigt, dass die basale Caspase-Aktivität der unterschiedlich behandelten Zellen
an Tag 0 nahezu gleich ist. Mit 5-FdUr inkubierte, stimulierte Zellen zeigen an Tag 1 ein
4. Ergebnisse
65
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Maximum an Caspase-Aktivität, die sich an Tag 2 und Tag 3 auf einem niedrigeren Plateau
einstellt. Unstimulierte Zellen zeigen unter Behandlung mit 5-FdUr maximale CaspaseAktivität an Tag 2, ebenso wie die Zellen, die als Kontrolle ohne Substanzzusatz inkubiert
wurden. An Tag 3 weisen die mit 5-FdUr inkubierten, unstimulierten Zellen nahezu wieder
basale Caspase-Aktivitäten auf. Die unbehandelten Zellen zeigen bei einer maximalen CaspaseAktivität an Tag 2 ab Tag 3 einen langsamen Abfall.
Von uns wurden in den weiteren Versuchen zur Apoptose stimulierte PBLs an Tag 2
untersucht. An Tag 2 ist nach dem oben gezeigten Versuch zur Kinetik der Caspasen –3 und –7
das Aktivitätsmaximum jedoch schon überschritten. Der von uns gewählte Zeitpunkt scheint
demnach nicht optimal zur Apoptosebestimmung mittels des Nachweises der Aktivität der
Caspasen –3 und –7 geeignet, da es durchaus möglich ist, dass ein Teil der Zellpopulation
bereits nicht mehr lebendig ist und somit die Messung beeinflusst. Eine Bestimmung der
Apoptose mittels einer kombinierten Annexin/Propidiumiodid-Färbung wäre wahrscheinlich
besser geeignet, wurde jedoch aus Zeitgründen nicht mehr durchgeführt. Da uns jedoch das
Verhältnis der Apoptose zwischen stimulierten und unstimulierten T-Zellen und nicht die
absolute Apoptoserate interessiert, sind die mittels des Caspase –3/7 Glo Assays gemessenen
Daten für uns ausreichend.
4. Ergebnisse
66
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4.17. Apoptose von PHA- stimulierten PBLs
Periphere Blutlymphozyten lassen sich wie im vorigen Kapitel gezeigt, sehr effektiv mit PHA
stimulieren. Wir wollten nun überprüfen, ob die stimulierten Zellpopulationen trotz des
messbaren erhöhten Wachstums verstärkt apoptotisch werden. Dazu wurden die isolierten
Zellen aus vier verschiedenen Depletionsfiltern auf ihren Gehalt an Caspase -3 und –7
untersucht. Die folgende Abbildung zeigt die Apoptoserate der unstimulierten und stimulierten
Zellen.
Abb. 4.21 Caspase-Aktivität von unstimulierten und stimulierten peripheren Blutlymphozyten. Abgebildet
sind Mittelwerte und Standardabweichungen der Zellen aus vier Depletionsfiltern (F1-F4). Der Gehalt der Zellen
an Caspase -3 und –7, die ohne PHA (-) inkubiert wurden, wurde auf 1 gesetzt. Zellen, die mit PHA stimuliert
wurden, sind mit (+) gekennzeichnet. Die Zellen wurden mit einer Anfangszellzahl von 100000 Zellen/Well
inkubiert und nach 48 Stunden gemessen.
Die Abbildung zeigt, dass bei drei von vier Filtern die Apoptoserate unter Stimulation mit PHA
erhöht ist. Im Mittel zeigt sich eine Erhöhung der Caspase-Aktivität um 73,6 %, jedoch
schwanken die Werte, wie in der Abbildung zu sehen ist, erheblich. Ein für diese vier Filter
durchgeführter nach zwei Seiten offener, gepaarter T-Test zeigt keine Signifikanz bezüglich der
gemessenen Differenzen zwischen unstimulierten und stimulierten PBLs, dennoch ist aus den
Daten eine Tendenz ersichtlich. Weitere Experimente werden nötig sein, um diese Daten zu
bestätigen und hinsichtlich ihrer physiologischen Bedeutung deuten zu können.
4. Ergebnisse
67
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4.18. Fokale Stimulation peripherer Blutlymphozyten
Native, periphere Blutlymphozyten benötigen im Gegensatz zu Jurkat T-Zellen einen Stimulus
zur Proliferation. Bisher wurde dazu PHA verwendet, ein Lectin aus Phaseolus vulgaris, das
sämtliche Oberflächenrezeptoren auf den T-Zellen vernetzt und somit auch zu einer
Aktivierung des T-Zell-Rezeptors führt. Da dieser Stimulus nicht spezifisch für den T-ZellRezeptor ist, sollte die Verwendung von Antikörper-beschichteten Polystyrol- Beads etabliert
werden. Die folgende Abbildung 4.22 zeigt eines aus vier Experimenten zur Bead- Stimulation.
Abb. 4.22 Stimulation peripherer Blutlymphozyten mittels Antikörper-beschichteter Beads. Die Signalstärke
wurde an Tag 3 mittels des EZ4U-Assays gemessen. Abgebildet sind Mittelwerte und Standardabweichungen der
Zellen zweier Patienten. Die Daten wurden aus Triplikaten ermittelt. Als Nullkontrolle (NK) wurden Zellen
verwendet, die ohne Zugabe eines Stimulus inkubiert wurden. IgG- beschichtete Beads sollten keine Aktivierung
der Zellen induzieren; sie dienen dem Ausschluss einer alleine durch Beads herbeigeführten Stimulation. Die
Beads wurden den Zellen (Anfangszellzahl: 50000 Zellen/Well) im Verhältnis 1:1 zugefügt. Eingefügt ist eine
Infrarot-Aufnahme eines Bead-Zell-Kontaktes (zur Verfügung gestellt von Ariel Quintana Gonzaléz).
Die Abbildung zeigt, dass eine fokale Stimulation mit Beads zu einer besseren Proliferation im
Vergleich zur Stimulation mit PHA führt. Dabei führt der Stimulus mit Beads, die neben einem
Antikörper gegen CD3 auch mit einem Antikörper gegen das kostimulatorische Molekül CD28
4. Ergebnisse
68
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beschichtet sind, zu stärksten Proliferation. Von sieben getesteten Patienten zeigten sechs die
höchste Proliferation unter Stimulation mit anti-CD3/CD28 Beads. Ein Patient zeigte die
höchste Proliferation bei PHA- stimulierten Zellen.
Parallel wurden Zellen mit in Lösung zugegebenen, bzw. in die Wells beschichteten
Antikörpern stimuliert, was jedoch zu keiner Steigerung der Proliferation führte. Antikörper
scheinen also nur in der fokalen Stimulationsform zur Proliferationsinduktion geeignet.
Für weitere Proliferationsexperimente in unserem Labor wurden nach diesen Ergebnissen antiCD3/CD28 beschichtete Beads zur Stimulation der peripheren Blutlymphozyten benutzt.
4. Ergebnisse
69
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4.19. Apoptose fokal stimulierter Blutlymphozyten
Erste Ergebnisse zur Apoptose fokal stimulierter peripherer Blutlymphozyten zeigen, dass die
Stimulation mit Antikörper-beschichteten Beads zu erhöhten Apoptoseraten führt. Dabei
verhält sich die Apoptose proportional zur Proliferation der Zellen. Abbildung 4.23 zeigt, dass
PHA-stimulierte Zellen eine geringere Rate an Apoptose aufweisen, als fokal stimulierte
Zellen. Bei fokal stimulierten Zellen zeigen alleine mit anti-CD3 beschichtete Beads kleinere
Apoptoseraten als solche, die zusätzlich mit dem Kostimulus anti-CD28 beschichtet sind.
Abb. 4.23 Aktivität von Caspase –3 und –7 in fokal stimulierten Zellen. Die Abbildung zeigt die mittels des
Caspase-3/-7 Glo Assays gemessene Caspase-Aktivität derjenigen Zellen, deren Proliferation in Abbildung 4.20
als dunkelgrauer Balken gezeigt wurde. Die abgebildeten Daten zeigen die Messungen einzelner Wells.
Die gemessenen Zellpopulationen von drei Patienten zeigen alle, dass die Apoptose von
unstimulierten Zellen und Zellen, die mit anti-IgG beschichteten Beads inkubiert wurden,
nahezu gleich ist. Somit ist eine allein durch die Polystyrol-Beads ausgelöste Apoptose
ausgeschlossen. Weiterhin zeigen alle drei Filter, dass die fokale Antikörperstimulation zu einer
höheren Caspase-Aktivität führt als die Stimulation mit PHA, wobei jeweils bei der
Costimulation mit CD3 und CD28 die stärksten Signale messbar sind.
Das gemessene Signal der nicht stimulierten Zellen war in allen Zellen relativ konstant, was auf
eine Grundaktivität der Caspasen –3 und -7 schließen lässt.
5. Diskussion
70
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5. Diskussion
Das Thema dieser Arbeit ist die Kalzium-abhängige Proliferation von T-Lymphozyten.
Insbesondere sollte die Proliferation der parentalen Jurkat T-Zelllinie sowie der daraus
hervorgegangenen Mutanten CJ1 und CJ5, die durch einen verminderten Strom über den
CRAC-Kanal charakterisiert sind, untersucht werden. Da mit Hilfe von Zellen aus Patienten,
die einen Immundefekt aufweisen, gezeigt wurde, dass der CRAC-Kanal einen wichtigen
Mechanismus im Aktivierungsweg der T-Lymphozyten darstellt und für den Kalziumeinstrom
essentiell ist (Feske et al., 2001; Le Deist et al., 1995; Partiseti et al., 1994), erwartet man, dass
Zellen, die an dieser Stelle einen Defekt aufweisen, schlechter proliferieren.
Um diese Hypothese überprüfen zu können, wurden die Proliferationsexperimente unter
stringenten Kalziumkonzentrationen durchgeführt, sodass die Kalziumabhängigkeit der
Proliferation sichtbar wird und somit Rückschlüsse über die Rolle des CRAC-Kanals für den
Kalziumhaushalt und die Proliferation gezogen werden konnten. Dabei wurde festgestellt, dass
die verwendeten Zelllinien geringe, aber dennoch signifikante Unterschiede aufweisen. Sie
benötigen unterschiedliche extrazelluläre Kalziumkonzentrationen, um ein halbmaximales
Wachstum aufrecht zu erhalten. Die parentalen Zellen benötigen eine Konzentration von 21
µM, während die Zelllinie CJ1 26,6 µM und die Zelllinie CJ5 25,4 µM extrazelluläres Kalzium
benötigen. Diese Tendenz entspricht den jeweiligen Strömen über den CRAC-Kanal. Die
parentale Zelllinie zeigt den ursprünglich in Jurkat T-Lymphozyten vorhanden Strom (ICRAC =
100 %), wohingegen die Zelllinie CJ5 nur noch einen Strom von 41 % des Ursprungsstroms
zeigt. Für die Zelllinie CJ1 ist nahezu kein Strom mehr messbar (Fanger et al., 1995). Das
benötigte Kalzium zur halbmaximalen Proliferation korreliert also mit dem Defekt des Kanals.
Dies bedeutet, dass die Zelllinien mit einem Defekt im Speicher-aktivierten Kalziumeinstrom
mehr extrazelluläres Kalzium benötigen, um den eingeschränkten Strom ausgleichen zu
können. Hoth und Penner zeigten bereits in ihrer Veröffentlichung von 1993 in Mastzellen der
Ratte die Abhängigkeit des ICRAC von der extrazellulären Kalziumkonzentration (s. Abb. 5.1).
5. Diskussion
71
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Abb. 5.1 Abhängigkeit des Stroms durch den CRAC-Kanal (ICRAC) von der extrazellulären
Kalziumkonzentration. Die Abbildung zeigt den relativ zum Strom bei 10 mM extrazellulärem Kalzium
gemessenen ICRAC unter verschiedenen extrazellulären Kalziumkonzentrationen ([Ca2+]o). Der Strom wurde mittels
IP3 und EGTA aktiviert. Der messbare ICRAC bei 10 mM extrazellulärem Kalzium wurde auf 1,0 gesetzt, der
halbmaximale Strom (0,5 I/I
(10mM Ca2+))
ist bei ca. 2-3 mM [Ca2+]o messbar (Die Abbildung wurde von (Hoth and
Penner, 1993) entnommen).
Für die Mutanten CJ1 und CJ5 wurde lediglich gezeigt, dass der Strom über den CRAC-Kanal
vermindert ist. Der genaue zugrunde liegende Defekt, d.h. die molekulare Basis des Defekts,
wurde jedoch in der Veröffentlichung von Fanger et al. aus dem Jahr 1995 nicht beschrieben.
Philipp et al. konnten 2003 zeigen, dass das TRPC3-Gen in allen T-Zell-Mutanten, die einen
Defekt des CRAC-Kanals zeigen, defekt war. Durch Wiedereinfügen der TRPC3 cDNA
konnten wieder Kalziumströme über den CRAC-Kanal gemessen werden, die den
ursprünglichen Kalziumströmen der parentalen Zelllinie entsprechen. Es ist also möglich, dass
der Defekt im Strom auf einem Defekt im molekularen Aufbau des Kanals zurückzuführen ist,
sollte das TRPC3-Protein in der Tat daran beteiligt sein.
Die Schwierigkeit, die Kalziumabhängigkeit der Proliferation in den T-Lymphozyten zu
untersuchen, lag darin, dass die parentale Jurkat T-Zelllinie und die daraus hervorgegangen
Mutanten CJ1 und CJ5 aus Zellen einer akuten T-Zell-Leukämie hervorgegangen sind (ATCC
Number TIB-152). Diese Zellen proliferieren, ohne einen exogenen Stimulus zu benötigen.
5. Diskussion
72
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Dies konnte z.B. beim Durchführen der Zellkultur beobachtet werden. Die Zellen mussten alle
zwei bis drei Tage verdünnt werden, wobei die parentalen Zellen im Vergleich zu den
Zelllinien CJ1 und CJ5 immer stärker verdünnt werden mussten und sich allem Anschein nach
schneller vermehrten. Dieses Phänomen könnte durch den reduzierten CRAC-Strom (ICRAC)
erklärt werden. In Kapitel 4.1 wurden die Ergebnisse gezeigt, die der Ermittlung einer
geeigneten Zellzahl für alle folgenden Proliferationsexperimente dienen sollten. Gleichzeitig
hätte man, entsprechend der Beobachtungen bei der Durchführung der Zellkultur, Unterschiede
in der Proliferation von parentalen Zellen zu der Proliferation der Zelllinien CJ1 und CJ5 sehen
müssen. Man würde erwarten, dass die parentale Zelllinie stärker proliferiert als die Zelllinien
CJ1 und CJ5. Dies war jedoch nicht der Fall. Da ein Unterschied bei keiner der gewählten
Zellzahlen in dem Bereich von anfänglichen 500 bis 1500 Zellen pro Well zu sehen war,
scheint dies nicht auf einen zu starken Verbrauch von Medium oder Platzprobleme im Well
zurückführbar zu sein. Wahrscheinlicher ist, dass dieser Effekt deshalb nur bei der
Durchführung der Zellkultur sichtbar wird, da man in diesem Fall Zellzahlen zwischen 5*106
und 1*107 im Vergleich zu maximal 2*105 Zellen an Tag 4 des Proliferationsexperimentes
betrachtet. Der für die Proliferationsexperimente verwendete EZ4U-Assay ist möglicherweise
nicht sensitiv genug, um die geringen Unterschiede zwischen dem Proliferationsverhalten der
einzelnen Zelllinien sichtbar zu machen. Auch lassen sich unter Ruhebedingungen keine
Unterschiede im Proliferationsverhalten der parentalen Zellen im Vergleich zu dem der
Mutanten CJ1 und CJ5 auflösen, da die Proliferation aufgrund der Abstammung der Zellen aus
leukämischen Zellen von dem normalen Zellzyklus entkoppelt ist. Nur wenn die extrazelluläre
Kalziumkonzentration so eingeschränkt ist, dass die Zellen unter Minimalbedingungen gehalten
werden, werden auch geringe Effekte des defekten Stroms über den CRAC-Kanal sichtbar.
Die so durchgeführten Proliferationsexperimente unter stringenten Kalziumbedingungen
untermauern die Bedeutung des CRAC-Kanals für die Proliferation. Verminderte Ströme über
den CRAC-Kanal in den Mutanten führen zu verminderter Proliferation, welche nur durch eine
erhöhte extrazelluläre Kalziumkonzentration wieder auf Werte nahe denen der parentalen
Zellen gebracht werden kann. Die Bedeutung der Kalziumabhängigkeit für die T-ZellProliferation lässt sich durch die zwei bekannten Fälle von Patienten mit einem Defekt des
CRAC-Kanals in den T-Lymphozyten belegen, die infolge dessen an einer schweren
Immundefizienz leiden (Le Deist et al., 1995; Partiseti et al., 1994).
5. Diskussion
73
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Um weitere Einsichten in die Beteiligung des CRAC-Kanals an der Proliferation zu erhalten,
wurde der Kanal mittels des Pyrazol-Derivats BTP2 vollkommen blockiert. BTP2 wurde
erstmals als YM-58483 mit der Eigenschaft, Speicher-abhängige Kanäle und die Interleukin-2
Produktion in T-Lymphozyten zu hemmen, beschrieben (Ishikawa et al., 2003). BTP2
unterscheidet sich von bisher bekannten Kalziumkanalblockern durch die hohe Selektivität für
Speicher-abhängige Kanäle gegenüber Spannungs-aktivierten Kanälen. Im Gegensatz zu
Econazole, dass auch die Spannungs-aktivierten Kanäle blockiert, zeigt BTP2 keine Wirkung
auf das Membranpotential der T-Lymphozyten (Ishikawa et al., 2003). Im Vergleich zu SK&F96365, dem bisher am meisten verwendeten CRAC-Kanal-Blocker, weist BTP2 einen sehr viel
niedrigeren IC50-Wert auf. Der Speicher-aktivierte Kalziumeinstrom wird von BTP2 mit einem
IC50-Wert von ~10 nM blockiert. Allerdings ist eine Vorinkubation von mindestens zwei
Stunden nötig, damit BTP2 seinen vollen Effekt entwickeln kann (Zitt et al., 2004). Für die
Proliferationsexperimente wurden die Zellen über einen Zeitraum von 48 Stunden mit 400 nM
BTP2 inkubiert, was einen fast vollständigen Block des CRAC-Kanals sicherstellen sollte.
Unter Ruhebedingungen, d.h. nicht modifizierter extrazellulärer Kalziumkonzentration, konnte
kein Unterschied in der Proliferation von BTP2-behandelten und unbehandelten Zellen gesehen
werden. Nur unter limitiertem extrazellulärem Kalzium im Bereich des für Kalzium ermittelten
IC50-Wertes war die Proliferation der mit BTP2 inkubierten Jurkat Zelllinien signifikant
erniedrigt. Der CRAC-Kanal ist demnach von Bedeutung für die Proliferation der Zellen.
Während die Lymphozyten bei nicht modifiziertem extrazellulärem Kalzium normal
proliferieren können, ist dies unter stringenten Bedingungen nicht mehr möglich. Die
Abbildung 5.1 zeigt die Abhängigkeit des ICRAC von der extrazellulären Kalziumkonzentration
([Ca2+]o). Je höher [Ca2+]o ist, desto größer ist der messbare Strom. Dies bedeutet, dass der
ICRAC bei 0,75 mM EGTA im Medium bereits sehr stark erniedrigt ist. Werden dann durch
Zugabe von BTP2 fast alle CRAC-Kanäle blockiert, reicht der Kalzium-Einstrom nicht mehr
zur Aufrechterhaltung der Proliferation aus. Wieso jedoch stoppt die Proliferation nicht auch
ohne Senkung der extrazellulären Kalziumkonzentration bei einem Block des CRAC-Kanals?
Eine Möglichkeit ist, dass BTP2 den CRAC-Kanal nicht zu 100 % blockiert. Selbst bei einer
Vorinkubation der Zellen über einen Zeitraum von 24 Stunden wird der Kalziumeinstrom mit
100 nM BTP2 nur zu etwa 90 % gehemmt (Zitt et al., 2004). Für die Zellen, die unter normaler
extrazellulärer Kalziumkonzentration inkubiert werden, könnten die verbleibenden 10 % des
Stroms ausreichen, um die Proliferation aufrecht zu erhalten. Eine weitere Erklärung für die
5. Diskussion
74
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normale Proliferation der Zellen, die ohne Zugabe von EGTA mit BTP2 inkubiert wurden, liegt
darin, dass der Block des CRAC-Kanals erst nach mehreren Stunden Vorinkubation einen
Gleichgewichtszustand erreicht hat. Bis zu diesem Zeitpunkt ist noch genügend Strom
vorhanden, um die Proliferation aufrecht zu halten. Es ist also möglich, dass man bei der
Messung der Proliferation nach 48 Stunden teilweise noch Effekte der ersten Stunden misst, die
das Gesamtergebnis beeinflussen.
Die Proliferationsexperimente zur Blockade des CRAC-Kanals lassen insgesamt den Schluss
zu, dass die Jurkat T-Zelllinien par, CJ1 und CJ5 unter Ruhebedingungen noch soviel Strom
über den CRAC-Kanal aufweisen, dass selbst ein fast vollständiger Block nicht ausreicht, um
die Proliferation zu hemmen. Ist der Strom jedoch durch eine verminderte extrazelluläre
Kalziumkonzentration schon reduziert, führt dieser Block dazu, dass nicht mehr genügend
Kalzium in die Zelle einströmen kann, was zum Wachstumsstop bzw. zur Apoptose führt.
Diese Experimente belegen, dass selbst leukämische T-Lymphozyten zur Proliferation den
Kalziumeinstrom über den CRAC-Kanal benötigen. Es scheint so, dass der benötigte
Kalziumeinstrom eng reguliert ist: Es ist nur ein geringer Strom zur Proliferation der Zellen
nötig, aber das Ausschalten dieses geringen Einstroms lässt die Proliferation stoppen und
begünstigt die Apoptose der Zellen.
Ein weiterer Aspekt der von uns untersuchten Kalzium-abhängigen Proliferation ist die
zugrunde liegende intrazelluläre Kalziumkonzentration und die dazu korrelierende Apoptose.
Um
diese
zu
untersuchen,
wurde
parallel
zur
Proliferation
die
intrazelluläre
Kalziumkonzentration und die Apoptose von unstimulierten und stimulierten Jurkat TZelllinien der selben Zellpopulation in 96-Well-Platten bestimmt. Dabei ergab sich, dass die
mit dem Lectin PHA stimulierten Zellen unter Ruhebedingungen schlechter proliferieren und
erhöhte Apoptoseraten zeigen als die unstimulierten Zellen. Die intrazelluläre Kalziumkonzentration wurde durch die Stimulation mit PHA um 78 bis 110 nM im Vergleich zum
Ruhekalzium erhöht. Das Ruhekalzium lag für die Jurkat Zelllinien par, CJ1 und CJ5 im
Bereich von 150 nM. Dieser Wert liegt etwa um den Faktor 3 höher als Werte, die mittels
Einzelzell-Imaging von verschiedenen Arbeitsgruppen gemessen wurden (Philipp et al., 2003;
Smani et al., 2004; Zitt et al., 2004). Dieser Unterschied basiert auf unterschiedlichen
Kalibrationen und der Tatsache, dass bei der Messung in einer 96-Well-Platte sämtliche Zellen
gemessen werden. Voraktivierte Zellen, die im Voraus schon eine erhöhte extrazelluläre
Kalziumkonzentration aufweisen, können im Gegensatz zur Einzelzellmessung nicht bei der
5. Diskussion
75
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Auswertung der Daten aus der Berechnung des Mittelwertes herausgenommen werden.
Wichtiger als der absolute Wert der intrazellulären Kalziumkonzentration ist für uns aber die
Tatsache, dass die intrazelluläre Kalziumkonzentration bei Stimulation der Zellen steigt,
gleichzeitig aber die Proliferation abnimmt. Die Viabilität von T-Lymphozyten korreliert eng
mit dem Kalziumhaushalt der Zelle, demnach kann ein zu hohes intrazelluläres Kalzium nicht
nur zum Anhalten der Proliferation, sondern auch zur Apoptose der Zellen führen (Berridge et
al., 1998; Berridge et al., 2003; Berridge et al., 2000; Santella, 1998). PHA stimuliert die TLymphozyten über die Quervernetzung aller membranständigen Glykoproteine (Kay, 1991).
Hierbei wird der T-Zell-Rezeptor aktiviert, wobei jedoch im Gegensatz zum physiologischen
Aktivierungsweg ein kostimulatorisches Signal fehlt. Während dieser Aktivierung steigt die
intrazelluläre Kalziumkonzentration so stark an, dass sie nicht mehr zur Proliferation, sondern
zur Apoptose der Jurkat T-Lymphozyten führt. Eine andere Beobachtung ließ sich bei primären
peripheren Blutlymphozyten (PBLs) machen. Im Gegensatz zu Jurkat T-Lymphozyten würden
die PBLs ohne Stimulation in einem Stadium der Anergie verweilen (Macian et al., 2004).
Nach Stimulation mit PHA zeigen sie jedoch erhöhte Proliferationsraten. Jurkat Zellen
benötigen keinen zusätzlichen exogenen Stimulus zur Proliferation, da sie aufgrund ihrer
Abstammung aus leukämischen Zellen einen entkoppelten Zellzyklus aufweisen und sich
permanent teilen. Daher ist die Jurkat T-Zelllinie insgesamt kein perfektes Modell um
Aussagen zur Kalzium-abhängigen Proliferation treffen zu können, da das Wachstumsverhalten
dieser Zellen aufgrund ihrer Abstammung verändert ist. Zur Messung von Ionenströmen durch
Kanäle und die Messung von intrazellulären Kalziumkonzentrationen sind die Zelllinien mit
Sicherheit gut geeignet, da bestimmte Eigenschaften der Zellen wie z.B. der Speicher-aktivierte
Kalziumeinstrom durch die Leukämie nicht beeinflusst wurden. Bei der Messung eines so
komplexen Ablaufs wie der Proliferation ist es jedoch schwierig, Aussagen treffen zu können,
da der Ablauf scheinbar teilweise von der normal zugrunde liegenden Signalkaskade entkoppelt
ist. Durch die Tatsache, dass die Zellen ohne äußeren Stimulus proliferieren, müssen die
Rahmenbedingungen für die Proliferationsexperimente gut überlegt werden, damit keine
Artefakte, sondern wirkliche Effekte auf die Proliferation aufgelöst werden. Mit der parentalen
Zelllinie und den daraus hervorgegangenen Mutanten CJ1 und CJ5, die einen Defekt im
Speicher-aktivierten Kalziumeinstrom zeigen, war es dennoch möglich, Aufschluss über die
Rolle des CRAC-Kanals für die Proliferation zu gewinnen. Bei der Betrachtung von Daten, die
aus der Messung von Zelllinien entstanden sind, sollte man sich jedoch immer vor Augen
5. Diskussion
76
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führen, dass die vorliegenden Ergebnisse nicht zwangsläufig auf primäre Zellen übertragbar
sind.
Ein Beispiel dafür sind die Ergebnisse der Messungen von PHA-stimulierten Lymphozyten. Im
Gegensatz zu Jurkat Lymphozyten, die sowohl unter PHA- als auch unter Bead-Stimulation
(Daten nicht gezeigt) schlechter als unstimulierte Zellpopulationen proliferieren und im
Vergleich zu den Kontrollen höhere Apoptoseraten zeigen, lassen sich die von uns isolierten
PBLs sehr gut mit PHA stimulieren. Neue Ergebnisse aus unserer Arbeitsgruppe zeigen, dass
sich die aus diesen PBLs aufgereinigten reinen T-Zell-Populationen ebenso wie die Jurkat TLymphozyten nicht mit PHA stimulieren lassen, da diese laut Literatur ohne einen Kostimulus
wie z.B. CD28 im Stadium der Anergie bleiben (Macian et al., 2004; Yashiro et al., 1998). Die
von uns verwendeten PBLs enthielten jedoch immer zu einem gewissen Anteil B-Lymphozyten
und andere Leukozyten, die den fehlenden Kostimulus liefern konnten und so zur Proliferation
der Zellen führten. Die PBLs zeigen jedoch auch bei einer physiologisch korrekten Stimulation
über den T-Zell-Rezeptor und ein kostimulatorisches Molekül andere Eigenschaften als JurkatZellen, die sich auch bei dieser T-Zell-spezifischen Stimulation mit Antikörpern gegen CD3
und CD28 beschichteten Beads nicht mehr stimulieren lassen. Die Jurkat Lymphozyten
proliferierten trotz des korrekten Stimulus wahrscheinlich nicht mehr, da sie sich mit ihrem
Teilungsverhalten bereits am Maximum befinden.
Zur Stimulation von PBLs für Proliferationsexperimente wurden also neben PHA Antikörperbeschichtete Polystyrol-Beads verwendet. In Lösung zugegebene Antikörper können eine
inadäquate Aktivierung der Lymphozyten verursachen, wenn sie nicht an die T-Lymphozyten
oder an die Oberfläche der Wells binden (Trickett and Kwan, 2003). Polystyrol-Beads führen
bei Zellkontakt zu einer fokalen Stimulierung der T-Lymphozyten, ähneln also der
physiologischen MHC-vermittelten Aktivierung. Die Beads wurden mit einem gegen den TZell-Rezeptor gerichteten Antikörper (anti-CD3) und gegen das kostimulatorischen Molekül
CD28 (anti-CD28) beschichtet. Die Proliferation der T-Lymphozyten ist von einem
kostimulatorischen Molekül abhängig (Frauwirth and Thompson, 2002). Zellpopulationen, die
nur mit einem gegen CD3 gerichteten Antikörper stimuliert werden, enthalten viele
apoptotische Zellen (Yashiro et al., 1998). In unseren Experimenten konnte gezeigt werden,
dass eine Kostimulation mit anti-CD3/ anti-CD28 beschichteten Beads zu einer erhöhten
Proliferation im Vergleich zu nur mit anti-CD3 stimulierten Zellen führt. Dies entspricht auch
den von der Arbeitsgruppe um Yashiro gemessenen Ergebnissen. Unsere Experimente zeigen
5. Diskussion
77
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außerdem, dass die fokale Stimulation der PBLs zu höheren Proliferationsraten als die
Stimulation mit PHA führt. Trickett et al. zeigten 2003 die Effektivität verschiedener Stimuli
mittels des Nachweises der Expression von CD25, der α-Kette des IL-2 Rezeptors, und von
CD69, einem Molekül, dass in die Aktivierung von Lymphozyten involviert ist. In diesen
Experimenten führte die Stimulation mit PHA zu höheren Expressionsraten von CD25 und
CD69 als die Stimulation mit anti-CD3/ anti-CD28 beschichteten Beads, obwohl diese in einem
Verhältnis von fünf Beads zu einer Zelle eingesetzt wurden (Trickett and Kwan, 2003). Diese
Experimente wurden jedoch über einen Zeitraum von 24 Stunden durchgeführt. In unseren
Experimenten wurde die Proliferation nach einer Inkubationszeit von 48 Stunden gemessen,
wobei die Bead-Stimulation in 6 von 7 Fällen erfolgreicher als die Stimulation mit PHA war.
Weiterhin führt nur die Kostimulation mit Antikörpern gegen CD3 und CD28 zur IL-2
Produktion in T-Lymphozyten. Eine Stimulation nur mit gegen CD3 gerichteten Antikörpern
oder auch in Kombination mit anderen kostimulatorischen Molekülen, wie z.B. CD9 oder CD2
führt zu nahezu keiner IL-2 Produktion (Yashiro et al., 1998). Mehrere Arbeitsgruppen zeigten
außerdem, dass eine Aktivierung der T-Lymphozyten mit nur gegen den T-Zell-Rezeptor
gerichteten Antikörpern eine Anergie der Zellen (Salazar-Fontana and Bierer, 2001) bzw. sogar
Apoptose auslöst (Yashiro et al., 1998). Durch Kostimulation des CD28-Moleküls sollen die
anti-apoptotischen Proteine Bcl-xL (Boise et al., 1995) und c-FLIP-short (Kirchhoff et al.,
2000b) hochreguliert werden und die Expression des Fas-Liganden vermindert werden
(Kirchhoff et al., 2000a). Unsere Messungen der Caspase-3 und –7 Aktivität in den stimulierten
Zellen zeigte jedoch höhere Caspaseaktivitäten in den mit anti-CD3/anti-CD28 beschichteten
Beads stimulierten PBLs im Vergleich zu Zellen, die nur mit anti-CD3 beschichteten Beads
oder PHA stimuliert wurden. Gleichzeitig zeigten alle stimulierten Zellen höhere CaspaseAktivitäten als unbehandelte Zellen. Obwohl die stimulierten Zellpopulationen höhere
Proliferationsraten im Vergleich zu unstimulierten Populationen aufweisen, zeigen sie auch
höhere Apoptoseraten. Es ist möglich, dass innerhalb der einzelnen stimulierten Populationen
wenige Zellen auf den Stimulus hin sehr stark proliferieren, während andere Zellen durch den
starken Aktivierungsreiz apoptotisch werden. Dies könnte den Effekt von erhöhten
Proliferationsraten bei parallel erhöhten Apoptoseraten erklären. Eine FACS-Analyse der
Zellpopulationen könnte bei Färbung der Zellen mit Propidiumiodid und Annexin Aufschluss
über den Anteil an apoptotischen, nekrotischen und lebenden Zellen geben.
5. Diskussion
78
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Weiterhin ist es möglich, dass durch die Aktivierung der Zellen, die zu einem Kalziumeinstrom
über den CRAC-Kanal führt, einige Zellen einen so starken Anstieg der intrazellulären
Kalziumkonzentration zeigen, dass das erhöhte intrazelluläre Kalzium dieser Zellen zur
Apoptose führt. Die genaue Ursache der erhöhten Apoptoserate bei mit anti-CD3/ anti-CD28
beschichteten Beads stimulierten Zellen ist jedoch nicht bekannt und bedarf weiterer
Untersuchungen, insbesondere der Messung der intrazellulären Kalziumkonzentration.
Obwohl speziell bei den Experimenten mit primären peripheren Blutlymphozyten Fragen offen
bleiben, kann mit Hilfe der Experimente zur Kalzium-abhängigen Proliferation der Jurkat TLymphozyten die Aussage getroffen werden, dass der Kalziumhaushalt entscheidend für die
Viabilität der Zelle ist. Insbesondere der CRAC-Kanal ist für die eng regulierte
Kalziumhomöostase essentiell und Defekte im kapazitativen Kalziumeinstrom können schwere
Immundefizienzen zur Folge haben (Feske et al., 2001; Le Deist et al., 1995; Partiseti et al.,
1994). Umgekehrt könnte der CRAC-Kanal jedoch als pharmakologischer Angriffspunkt zur
Therapie von Autoimmunerkrankungen verwendet werden. Ist der molekulare Aufbau des
CRAC-Kanals bekannt, kann noch gezielter nach einem spezifischen Blocker für den Kanal
gesucht werden (Li et al., 2002). Erste Ergebnisse bezüglich der Aufklärung der molekularen
Identität des CRAC-Kanals liegen bereits vor. Es konnte gezeigt werden, dass das Einfügen von
TRPC3 cDNA in die Jurkat Mutanten, die einen Defekt dieses Kanals aufweisen, zur
Wiederherstellung des kapazitiven Stroms über den CRAC-Kanal führt (Philipp et al., 2003).
Weiterhin ist bekannt, dass das Pyrazolderivat BTP2 den CRAC-Kanal blockieren kann (Zitt et
al., 2004). Nun konnte gezeigt werden, dass in HEK293 Zellen, die TRPC3 überexprimieren,
der TRPC3-vermittelte Strom ebenfalls von BTP2 blockiert wird (He et al., 2005). Diese
Informationen lassen auf einen Zusammenhang zwischen dem CRAC-Kanal und dem Protein
TRPC3 schließen und auf baldige genaue Aufklärung der molekularen Identität des CRACKanals hoffen.
Ist der molekulare Aufbau des CRAC-Kanals erst bekannt, sollte es möglich sein, ihn als
Angriffspunkt zur pharmakologischen Therapie zu verwenden und damit Erkrankungen des
Immunsystems gezielt therapieren zu können.
6. Literatur
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7. Anhang
85
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
7. Anhang
7.1. Abkürzungsverzeichnis
APAF-1
apoptotic-protease-activating-factor-1
AP-1
activator-protein 1
APC
Antigen presenting cell
ATP/dATP
Adenosin 5’-triphosphat/ desoxy- Adenosin 5’-triphosphat
BH-Region
Bcl2- homologe Region
cADPR
cyclic adenosine diphosphoribose
CD
Cluster of differentiation
cDNA
complementary DNA, komplementäre DNA
CD95L
CD95-Ligand
CIF
Calcium influx factor
CRAC
Calcium- release activated calcium
DAG
Diazyglyzerol
DED
Death effector domain
DIABLO
direct inhibitor of apoptosis- binding protein
DISC
Death- inducing signaling complex
ER
Endoplasmatisches Retikulum
FADD
Fas- associated protein with death domain
FITC
Fluorescein-5-isothiocyanat
HLA
Human leukocyte antigen
ICE
Interleukin- 1b- converting enzyme (= Caspase 1)
IκB
inhibitory protein κB
IL-2
Interleukin 2
IP3
Inositol-1,4,5-triphosphat
IP3-R
Inositol-1,4,5-triphosphat- Rezeptor
iPLA2
Ca2+- independent phospholipase A2
kD
Kilodalton
7. Anhang
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LAT
Linker of activated T-cells
MHC
major histocompatibility complex
NAADP+
nicotinic acid adenine dinuleotide phosphate
NFAT
Nuclear factor of activated T-cells
NFκB
Nuclear factor κB
PBLs
periphere Blutlymphozyten
PIP2
Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat
PKC
Proteinkinase C
PLCγ
Phospholipase Cγ
PMCA
Plasma membrane Ca2+-ATPase
RPE
R-Phycoerythrin
SERCA
sarco-endoplasmatic-reticulum- Ca2+-ATPase
SMAC
second mitochondria derived activator of caspases
SOC
Store-operated channel
STIM
Stromal interaction molecule
TCR
T-cell-receptor
TG
Thapsigargin
TK
Tyrosinkinase
TNF-R
Tumornekrosefaktor-Rezeptor
TRP
Transient receptor potential
ZAP-70
ζ-chain-associated protein of 70 kD
8. Danksagung
87
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8. Danksagung
Mein herzlicher Dank gilt Herrn Prof. Dr. Markus Hoth für die Aufnahme in seine
Arbeitsgruppe, für die Bereitstellung des interessanten Themas und die stete Bereitschaft zur
Diskussion.
Ein herzliches Dankeschön der gesamten Arbeitsgruppe, die mir stets diskussions- und
hilfsbereit zur Seite gestanden haben. Danke auch dafür, dass immer jemand zu einer
Kaffeepause, zum Austausch der täglichen „Weltnachrichten“ oder zu einer Runde
„Prokerstinaten“ bereit war und mir somit geholfen hat, nie den Spaß an der Arbeit zu verlieren.
Ganz besonders möchte ich mich bei meiner lieben Frau Dr. Eva Schwarz bedanken. Vielen
Dank für all die fachliche Hilfe, für das riesige Engagement und dafür, dass die Tür für mich
immer offen war. Mir wird ihr wunderbares Naturell sehr fehlen.
Weiterhin möchte ich mich bei meiner Kommilitonin Susanne Stolz für das Korrekturlesen der
Arbeit bedanken und auch dafür, dass wir während unseres Studiums so viele schöne Momente
erlebt haben und gemeinsam unschlagbar waren.
Zum Schluss geht der Dank an meine Familie, die mich in meiner Arbeit immer unterstützt und
mir dies alles ermöglicht haben.
9. Lebenslauf
88
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9. Lebenslauf
Persönliche Daten
Name:
Kerstin Wagner
Geburtsdatum:
25.08.1982 in Saarbrücken
Anschrift:
Hauptstr. 39
66132 Saarbrücken
Telefon:
0681/892383
E-mail:
[email protected]
Familienstand:
ledig
Staatsangehörigkeit:
deutsch
Schulbildung
1988-1992
Grundschule Bischmisheim
1992-1998
Realschule Bruchwiese, Saarbrücken
1998-2001
Wirtschaftsgymnasium Saarbrücken, Abschluss Abitur
Studium
seit Oktober 2001:
Studium der Medizin in Homburg
September 2003:
Ärztliche Vorprüfung
WS 2006/2007:
Praktisches Jahr