Die Kalzium-Abhängigkeit der T-Zell-Proliferation Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin Der Medizinischen Fakultät Der UNIVERSITÄT DES SAARLANDES 2006 vorgelegt von: Kerstin Wagner geb. am: 25.08.1982 in Saarbrücken Physiologisches Institut Universitätsklinikum des Saarlandes, Homburg/Saar Direktor: Prof. Dr. Markus Hoth Inhaltsverzeichnis 1 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Inhaltsverzeichnis 1. Zusammenfassung .................................................................................................................4 2. Einleitung ..............................................................................................................................8 2.1. Funktion von T-Lymphozyten im Immunsystem............................................................8 2.2. Kalzium-abhängige Signaltransduktion in T-Lymphozyten .........................................10 2.3. Bedeutung des CRAC-Kanals in humanen T-Lymphozyten ........................................14 2.4. Kalzium-abhängige Proliferation in T-Lymphozyten ...................................................16 2.5. Apoptose in T-Lymphozyten.........................................................................................17 2.6. Zielsetzung der Arbeit ...................................................................................................20 3. Material und Methoden .......................................................................................................21 3.1. Material.............................................................................................................................21 3.1.1. Chemikalien und Assays ........................................................................................21 3.1.2. Medien und Puffer ..................................................................................................22 3.1.3. Antikörper...............................................................................................................22 3.1.4. 96-Well Mikrotiterplatten.......................................................................................22 3.1.5. Geräte .....................................................................................................................23 3.1.6. Auswertungsprogramme.........................................................................................23 3.2. Methoden ..........................................................................................................................24 3.2.1. Zellkultur: ...............................................................................................................24 3.2.2. Proliferationsexperimente:......................................................................................24 3.2.3. Apoptosemessungen: ..............................................................................................25 3.2.4. Isolation von humanen, peripheren Blutmonozyten...............................................26 3.2.5. Ca2+-Kontrollmessung und Antikörperfärbung der isolierten Lymphozyten.........27 3.2.6. Antikörperfärbung in der Messkammer .................................................................30 3.2.7. Antikörperfärbung im Reaktionsröhrchen..............................................................30 3.2.8. Intrazelluläre Kalziummessung in 96-well-Platten ................................................31 3.2.9. Bestimmung der freien Kalziumkonzentration in RPMI-komplett Medium..........32 3.2.10. Herstellung von Antikörper-beschichteten Polystyrol-Beads ................................32 Inhaltsverzeichnis 2 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 4. Ergebnisse............................................................................................................................34 4.1. Ermittlung einer für alle Versuche geeigneten Zellzahl im linearen Messbereich........34 4.2. Instantanes Signal: Kalibrierung der EZ4U-Messmethode ...........................................37 4.3. Qualitätsvergleich von sterilfiltriertem und autoklaviertem EGTA ..............................39 4.4. Überprüfung der Eignung von EGTA zur Modifikation der extrazellulären Kalziumkonzentration ...................................................................................................41 4.5. Überprüfung der Eignung von BAPTA als Kalziumchelator für Proliferationsexperimente ...................................................................................................................43 4.6. Unterschiede der Kalzium-abhängigen Proliferation der parentalen Zelllinie und der Zelllinien CJ1 und CJ5 ..................................................................................................45 4.7. Bestimmung der Kalzium-Konzentration in RPMI-1640 Medium...............................48 4.8. Blockade des CRAC- Kanals mittels BTP2 ..................................................................51 4.9. Bestimmung der Proliferation und der intrazellulären Kalziumkonzentration am Beispiel der parentalen Zelllinie und der Zelllinie CJ1 – Kompensation des CRACDefekts? .........................................................................................................................53 4.10. Bestimmung der Proliferation und des Ruhekalziums von PHA- stimulierten JurkatZellen .............................................................................................................................55 4.11. Apoptose von PHA- stimulierten Jurkat- Zellen ...........................................................57 4.12. Kalziumsignal-Messung als Vitalitätskontrolle der isolierten peripheren Blutlymphozyten (PBLs)......................................................................................................59 4.13. Bestimmung des Anteils an T- und B-Lymphozyten der isolierten PBLs ....................61 4.14. Proliferation von PHA- stimulierten PBLs....................................................................62 4.15. Induktion von Apoptose in PBLs ..................................................................................63 4.16. Kinetik von Caspase –3 und –7 .....................................................................................64 4.17. Apoptose von PHA- stimulierten PBLs ........................................................................66 4.18. Fokale Stimulation peripherer Blutlymphozyten ..........................................................67 4.19. Apoptose fokal stimulierter Blutlymphozyten ..............................................................69 5. Diskussion ...........................................................................................................................70 6. Literatur ...............................................................................................................................79 Inhaltsverzeichnis 3 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 7. Anhang ................................................................................................................................85 7.1. Abkürzungsverzeichnis ....................................................................................................85 8. Danksagung .........................................................................................................................87 9. Lebenslauf ...........................................................................................................................88 1. Zusammenfassung 4 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Die Kalzium-Abhängigkeit der T-Zell-Proliferation 1. Zusammenfassung Das menschliche Immunsystem bekämpft das Eindringen körperfremder Antigene und die Expression körperfremder Proteine. T-Lymphozyten, die der spezifischen, zellulären Komponente des Immunsystems angehören, werden über eine Antigen-Präsentation durch den T-Zell-Rezeptor aktiviert. Die Aktivierung des T-Zell-Rezeptors führt durch einen KalziumEinstrom über in der Plasmamembran lokalisierte, Speicher-aktivierte Kanäle, zu einem Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration. Durch den Anstieg des intrazellulären Kalziums wird die Expression bestimmter Gene wie z.B. Interleukin-2 induziert. Interleukin-2 stimuliert das Wachstum der T-Lymphozyten und wirkt chemotaktisch auf weitere immunkompetente Zellen. Zellen der Jurkat T-Zelllinie proliferieren, ohne einen exogenen Stimulus zu benötigen. Sie entstammen einer akuten lymphatischen Leukämie, deren Zellen möglicherweise durch den Verlust von Kontrollpunkten aus der G0-Phase des Zellzyklus wieder aktiv in die Interphase und anschließend in die Mitose eintreten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Proliferation von drei verschiedenen Jurkat T-Zelllinien untersucht, um Aufschlüsse über die Kalzium-Abhängigkeit der Proliferation zu erlangen: Die parentale Zelllinie, sowie die daraus hervorgegangenen Zelllinien CJ1 und CJ5, die durch einen stark verminderten Kalziumeinstrom über die Speicher-aktivierten Kanäle der Plasmamembran charakterisiert sind (Fanger et al., 1995). Die Proliferation wurde in 96-Well-Platten mittels des EZ4U-Assays bestimmt, durch den Reduktionsäquivalente gemessen werden, die linear zur Anzahl der lebenden Zellen sind. Unter normalen Wachstumsbedingungen war kein Unterschied in der Proliferation dieser drei Zelllinien festzustellen. Unter limitierter extrazellulärer Kalziumkonzentration konnte jedoch beobachtet werden, dass sich die Zelllinien CJ1 und CJ5 im Vergleich zur parentalen Zelllinie langsamer teilten. In diesen Experimenten wurden außerdem für die jeweiligen Zelllinien die zu einem halbmaximalen Wachstum benötigten extrazellulären Kalziumkonzentrationen ermittelt. Diese waren bei den Zelllinien CJ1 und CJ5 im Vergleich zur parentalen Zelllinie signifikant erhöht, was zeigt, dass der Speicher-aktivierte Kalziumeinstrom für die Proliferation notwendig ist und ein Defekt dieses Einstroms durch eine erhöhte extrazelluläre Kalziumkonzentration kompensiert werden muss. Dies wurde in weiteren Experimenten, in denen die Speicher-aktivierten Kalziumkanäle mittels 1. Zusammenfassung 5 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ des Pyrazolderivates BTP2 blockiert wurden, bestätigt. In diesen Experimenten zeigten alle drei Zelllinien unter limitiertem extrazellulärem Kalzium im Bereich der zum halbmaximalen Wachstum notwendigen Konzentration signifikant erniedrigte Proliferationsraten. Diese Ergebnisse zeigen, dass der Kalziumhaushalt für die Viabilität und das Wachstumsverhalten der Lymphozyten essentiell ist und dass die Speicher-aktivierten Kalziumkanäle diese Vorgänge wahrscheinlich entscheidend regulieren. Im Gegensatz zu den T-Lymphozyten der Jurkat Zelllinie, die keinen Stimulus zur Proliferation benötigen und unter Stimulation sogar langsamer proliferieren, benötigen primäre periphere Blutlymphozyten einen exogenen Stimulus zur Aktivierung. Hier konnte gezeigt werden, dass eine fokale Stimulation mit Hilfe von anti-CD3/anti-CD28 Antikörper-beschichteten Polystyrol-Beads die effizienteste Methode zur Wachstumsinduktion darstellt, die den physiologischen Aktivierungsweg der Lymphozyten über den T-Zell-Rezeptor und ein kostimulatorisches Molekül imitiert. Parallel zur Proliferation wurden für primäre und für Jurkat T-Lymphozyten Apoptoseraten durch die Messung der Aktivität der Caspasen -3 und -7 bestimmt. Erste Ergebnisse zeigen, dass sowohl die Stimulation mit dem Lectin PHA als auch eine fokale Stimulation der Zellen zu höheren Apoptoseraten im Vergleich zu unstimulierten Zellen führt. Da mit Hilfe der verwendeten Assays immer Zellpopulationen gemessen werden, ist es möglich, dass einzelne Zellen der gemessenen Populationen sehr stark proliferieren, während andere Zellen apoptotisch werden und dass somit sowohl im Proliferations- als auch im Apoptoseassay hohe Signale gemessen werden können. Die folgende Arbeit hat Aufschluss über die Kalziumabhängigkeit der T-Zell-Proliferation geliefert. Das Verständnis des Kalziumhaushaltes der T-Lymphozyten könnte dazu beitragen, ein Werkzeug zur Therapie von Erkrankungen des Immunsystems zu finden. Dabei spielen insbesondere die Speicher-aktivierten Kalziumkanäle in der Plasmamembran eine wichtige Rolle. Sie werden bezüglich ihres molekularen Aufbaus und als pharmakologischer Angriffspunkt derzeit erforscht. 1. Zusammenfassung 6 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Calcium-dependance of T-cell proliferation Summary The human immune system has to cope with extrinsic antigens and with the expression of foreign proteins. T-lymphocytes, which are associated with the specific, cellular part of the immune system, are activated by antigen presentation through the T-cell receptor. Activation of T-cell receptor leads to a rise of intracellular calcium (Ca2+) by Ca2+entry through Ca2+ storeoperated channels in the plasma membrane. The rise of intracellular Ca2+ controls gene expression and finally, among others, the production of interleukin-2, which is a stimulus for proliferation of T-lymphocytes and has also chemotactic effects on other immune-competent cells. In contrast, the human T-cell line Jurkat proliferates without any extracellular stimulus. The Jurkat cell line E6-1 was established from the peripheral blood of a 14 year old boy who suffered from an acute lymphatic leukaemia. Jurkat cells permanently re-enter the cell cycle, probably because they lost the G0-checkpoint of cell cycle. In my thesis work, the proliferation of three different Jurkat T-cell lines was compared to obtain new results about the Ca2+dependence of T-cell proliferation. A parental Jurkat cell line and the two mutant cell lines CJ1 and CJ5, which show a reduced level of capacitive Ca2+ entry (Fanger et al., 1995), were analyzed. Proliferation was carried out in 96- well plates using the EZ4U assay which measures reduction equivalents, which were shown to linearly correlate with the number of viable cells. Under standard growth conditions, no difference in proliferation could be measured. However, when limiting the extracellular Ca2+ concentration, CJ1 and CJ5 cells were found to proliferate more slowly than the parental cell line. To quantify this effect, the extracellular Ca2+ concentrations necessary for half-maximal proliferation were determined. These Ca2+ concentrations were significantly higher for CJ1 and CJ5 T-cells compared to the parental cell line, indicating that first, Ca2+ entry through store operated channels is necessary for T- cell proliferation and second, that a reduced Ca2+ influx can be compensated by elevating the external Ca2+ concentration. These results were confirmed by blocking store-operated Ca2+ channels using the pyrazol derivate BTP2. In these experiments, the three cell lines show significantly decreased proliferation rates under limiting extracellular Ca2+ conditions which were in the range of the half maximal Ca2+ concentrations necessary for proliferation. These 1. Zusammenfassung 7 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ results indicate, that the regulation of Ca2+ entry is essential for viability and proliferation of lymphocytes and that store-operated Ca2+ channels play an essential role as a key regulator of Ca2+ homeostasis. In contrast to Jurkat T-lymphocytes, which do not need a stimulus for proliferation and proliferate even more slowly when stimulated, peripheral blood lymphocytes require an external stimulus for proliferation. Comparing different stimuli, I found that the newly established focal stimulation using antibody-coated polystyrol-beads is the most efficient method to induce proliferation. This method mimics the focal aspect of the physiological activation through formation the immunological synapse between the T-cell and an antigenpresenting cell. In addition to proliferation, apoptosis was analyzed in primary as well as in Jurkat T-lymphocytes by measuring the activity of caspases –3 and –7. Preliminary experiments showed increased apoptosis rates when cells were stimulated with the lectin PHA as well as by focal stimulation. Due of the fact, that we measured the average of a cell population, it is possible that, at the same time, single cells strongly proliferate whereas other cells become apoptotic. Therefore, both proliferation and apoptosis could be increased. My thesis work sheds light on the Ca2+-dependance of T-cell proliferation. A better understanding of the Ca2+ homeostasis may help to develop new tools for immunotherapy. In particular, store-operated Ca2+ channels localized in the plasma membran appear to be good targets to screen for new immune-suppressive drugs. 2. Einleitung 8 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 2. Einleitung 2.1. Funktion von T-Lymphozyten im Immunsystem Das Immunsystem dient der Abwehr körperfremder pathogener Keime sowie der Erkennung und Eliminierung körpereigener entarteter Zellen. Dabei spielen T-Lymphozyten, die der spezifischen, zellulären Immunabwehr zugeordnet werden, eine wichtige Rolle. T-Zellen nehmen verschiedene Aufgaben innerhalb des Immunsystems wahr und werden in entsprechende Unterklassen eingeteilt. 65 % der T-Lymphozyten sind T-Helferzellen (CD4+). Sie fördern die Differenzierung von BLymphozyten zu antikörperproduzierenden Plasmazellen und erfüllen somit bei der Induktion der Immunantwort eine wichtige regulatorische Aufgabe. Die weitere Einteilung der T-Helferzellen erfolgt durch die Produktion unterschiedlicher Zytokine. Ausgehend von der TH0-Zelle, die die Interleukine (IL) -2, -4 und –5 produziert, kann die Entwicklung je nach vorherrschendem Zytokinmuster zu TH1- oder TH2-Zellen verlaufen. TH1-Zellen produzieren neben IL-2, das wichtig für ihre eigene Aktivierung ist, Interferon γ, dass chemotaktisch auf Makrophagen wirkt. TH2-Zellen sezernieren die Interleukine –4 und -10, wobei IL-4 das Wachstum von weiteren TH2Zellen stimuliert und IL-10 die Aktivierung der Makrophagen hemmt. Die sezernierten Zytokine nehmen wesentlichen Einfluss auf den Verlauf der Immunantwort. Welche TH-Subpopulation im Falle einer Infektion gebildet wird, hängt von verschiedenen Faktoren, wie z.B. der Art des Erregers oder dem betroffenen Gewebe ab. Aus T-Helferzellen können sich nach AntigenKontakt T-Gedächtniszellen bilden. Sie ermöglichen bei einem erneuten Kontakt mit dem gleichen Antigen eine schnellere und effektivere Immunantwort (Sekundärantwort) und vermitteln folglich die Immunität. Die übrigen 35 % der T-Lymphozyten werden den CD8positiven T-Killerzellen zugerechnet (zytotoxische T-Lymphozyten). Sie können Virus-infizierte Zellen nach antigen-spezifischer Präsentation erkennen und mittels Perforinen lysieren. T-Lymphozyten werden aktiviert durch professionell antigenpräsentierende Zellen wie dendritische Zellen, B-Lymphozyten und Makrophagen, die Histokompatilitätsantigene (MHCMoleküle = major histocompatibility complex) exprimieren und darüber dem T-Zell-Rezeptor (TCR) der Zielzelle Antigenfragmente präsentieren. Bei dem TCR handelt es sich um ein Heterodimer, das meist aus einer α- und einer β-Kette (αβ+-T-Zellen), selten aus einer γ- und 2. Einleitung 9 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ einer δ-Kette (γδ+-T-Zellen) aufgebaut ist. Die T-Zell-Rezeptoren unterscheiden sich in ihrer Antigen- erkennenden Region, so dass jede T-Zelle nur ein spezifisches Antigen erkennt. Durch genetische Rekombination sind theoretisch 1015 verschiedene Variationen der Antigenerkennenden Region möglich. Diese Vielfalt in der Erkennung von Antigenen macht das menschliche Immunsystem zu einem hochkompetenten Schutzschild gegenüber pathogenen Keimen. Nach der Bindung des Antigenfragment/MHC-Komplexes an den TCR ist eine Signalübertragung ins Zellinnere zur Aktivierung der T-Zelle notwendig. Diese wird durch den Molekülkomplex CD3 (CD = Cluster of differentiation) übernommen. Der CD3-Molekülkomplex ist nicht-kovalent mit dem TCR assoziiert und besteht aus vier membranverankerten Polypeptiden, der γ-, δ- und zwei ε-Ketten (diese sind nicht mit den Untereinheiten des TCR identisch). Der TCR und der CD3- Molekülkomplex werden zusammen als funktioneller TCRKomplex bezeichnet. Dieser Komplex ist mit einem Homodimer von ζ-Ketten assoziiert, die für die Signalübertagung in die Zelle nach Antigenkontakt zuständig sind. Mit dem TCR sind noch weitere signalübertragende Moleküle nicht kovalent assoziiert, wie z.B. der kostimulatorische Rezeptor CD28 sowie die Ko-Rezeptoren CD4 bzw. CD8. Der CD4-Rezeptor dient der Interaktion mit dem MHC-II-Komplex, während der CD8-Rezeptor mit dem MHC-I-Komplex interagiert. Ohne kostimulatorische Moleküle würden die T-Zellen bei der Antigenerkennung apoptotisch werden (Yashiro et al., 1998). In diesem Stadium wären die T-Zellen auch bei einem zukünftigen „korrekten“ Stimulus nicht mehr aktivierbar. Dieser Mechanismus dient auch der Elimination von T-Zellen, die mit körpereigenen Strukturen reagieren und ist somit ein wichtiger Schutz vor Autoimmunreaktionen. Die bereits erwähnten MHC-Moleküle, die auch HLA-Moleküle (human leukocyte antigen) genannt werden, werden in zwei Gruppen eingeteilt: MHC-Moleküle der Klasse I werden auf allen kernhaltigen körpereigenen Zellen exprimiert. Sie dienen der Erkennung veränderter bzw. zellfremder Peptide, wie sie im Rahmen von Virusinfektionen auftreten. Durch die Präsentation dieser Peptide über die MHC-I-Moleküle an CD8+-Zellen werden diese aktiviert und sind in der Lage, die infizierten Zellen mit Hilfe von Perforinen zu lysieren. Im Gegensatz zu den MHC-I-Molekülen werden die der Klasse II nur von professionell antigenpräsentierenden Zellen exprimiert. Diese Zellen sind in der Lage, komplexe Antigene (Bakterien oder vollständige Proteine) zu phagozytieren und zu zerkleinern, so dass über den MHC-II- 2. Einleitung 10 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Komplex schließlich einzelne Peptide den CD4+-Lymphozyten (T-Helferzellen) präsentiert werden. Im Rahmen dieser Präsentation kommt es zur Aktivierung von intrazellulären Signalkaskaden (s. Kapitel 2.2), die schließlich zur Bildung und Ausschüttung verschiedener Zytokine führen. IL-2 induziert im Sinne eines „positiven feedbacks“ die Produktion identischer Zellpopulationen und führt dadurch zur klonalen Expansion. Weiterhin werden über die Interleukine –2 und -4 B-Lymphozyten aktiviert, die zur Proliferation angeregt werden und sich zu Antikörper-produzierenden Plasmazellen entwickeln. Je nach ausgeschütteten Zytokinen werden außerdem natürliche Killerzellen, Mastzellen, Makrophagen und Granulozyten aktiviert. Das korrekte Zusammenspiel dieser Zellen und die korrekten Abläufe von Zellkontakt bis hin zu intrazellulären Signalkaskaden (s. Kapitel 2.2) sind wichtig für ein funktionierendes Immunsystem. Krankheiten wie z.B. Allergien, Autoimmunerkrankungen wie Lupus erythematodes oder chronisch entzündliche Darmerkrankungen wie z.B. Morbus Crohn oder Colitis ulcerosa sind auf Störungen dieser Abläufe zurückführen und verdeutlichen die Bedeutung des Immunsystems. 2.2. Kalzium-abhängige Signaltransduktion in T-Lymphozyten Der funktionelle TCR-Komplex und die assoziierten signalübertragenden Ko-Rezeptoren (CD4, bzw. CD8) sind mit den Proteinkinasen Fyn und Lck, die aus der Familie der Src-Kinasen hervorgehen, assoziiert. Die Bindung des MHC/Antigen-Komplexes an den TCR-Komplex führt den funktionellen TCR-Komplex mit dem CD4- bzw. CD8-Molekül sowie CD45 zusammen. CD45 aktiviert die Tyrosinkinasen Lck und Fyn durch die Abspaltung inhibitorischer Phosphatgruppen. Durch Phosphorylierung der ζ-Ketten des CD3-Moleküls können Lck und Fyn die im Zytosol lokalisierte Tyrosinkinase ZAP-70 binden und aktivieren. ZAP-70 wiederum phosphoryliert die Adapterproteine LAT (Linker of activated T-Cells) und SLP-76, die zur Aktivierung der Phospholipase Cγ (PLCγ) führen (Janeway, Immunobiology, 2005). Die Phospholipase Cγ spaltet das membranständige Phospholipid Phosphatidylinositol-4,5bisphosphat (PIP2) in die „second messenger“ Inositol-1,4,5-triphosphat (IP3) und Diazylglyzerol (DAG). IP3 führt durch Bindung an den IP3-Rezeptor des endoplasmatischen Retikulums zu einer Freisetzung von Kalziumionen aus dem Kalziumspeicher in das Zytoplasma. Der zweite freigesetzte intrazelluläre Botenstoff („second messenger“) DAG führt zusammen mit der 2. Einleitung 11 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration zu einer Aktivierung der Proteinkinase C (PKC). Diese wiederum führt über die Phosphorylierung mehrerer Proteinkomplexe wie z.B. AP1 und IκB (inhibitory factor κB)/NFκB (nuclear factor κB) zu einer Dissoziation des IκB/NFκBKomplexes in die Untereinheiten IκB und NFκB (Crabtree and Clipstone, 1994). Das phosphorylierte IκB wird im Zytoplasma degradiert, wohingegen der nun aktivierte Transkriptionsfaktor NFκB in den Zellkern wandert, wo er an den Promotor des IL-2-Gens bindet und zusammen mit anderen Transkriptionsfaktoren, wie AP-1 und NFAT (nuclear factor of activated T-cells) die Expression von IL-2 induziert (Baldwin, 1996; Partiseti et al., 1994). Der Transkriptionsfaktor NFAT liegt dabei zunächst in einer phosphorylierten Form im Zytosol vor. Durch die Erhöhung des intrazellulären Kalziums wird die Kalzium-abhängige Phosphatase Calcineurin aktiviert, die NFAT dephosphoyliert und so dessen Translokation in den Nukleus erlaubt. Dort bildet NFAT zusammen mit AP-1 einen Komplex, der zur Transkription des IL-2 Gens führt (Quintana et al., 2005). Zur Aktivierung von Transkriptionsfaktoren ist eine relativ langanhaltende Erhöhung des intrazellulären Kalziums notwendig. Dabei führen oszillierende Kalziumkonzentrationen zu einer effizienteren Aktivierung der Transkriptionfaktoren NFAT und NFκB als eine konstant hohe intrazelluläre Kalziumkonzentration (Dolmetsch et al., 1998). Außerdem wurde entdeckt, dass das Kalziumsignal in aktivierten T-Lymphozyten biphasisch ansteigt, d.h. dass es eine transiente Erhöhung und ein längeranhaltendes Plateau zeigt (Gardner, 1989). Somit erschien es als wahrscheinlich, dass neben der Entleerung der intrazellulären Speicher ein Kalziumeinstrom von extrazellulär stattfinden muss, der für die Funktion des Immunsystems essentiell ist. Es wurde gezeigt, dass die Entleerung der intrazellulären Kalziumspeicher das Aktivierungssignal für diesen Einstrom ist (Putney, 1990). Aus diesem Grund wird diese Art von Kanal, die auch in vielen anderen Zellarten gefunden wurde, „Speicher-aktivierter Kanal“ (SOC = Store-operated channel) genannt wurde. Der in T-Zellen nachgewiesene „Store-operated Channel“ heißt CRACKanal (Calcium-release activated Calcium-Kanal) nach dem gleichen, ursprünglich in Mastzellen nachgewiesenen Kanal (Hoth and Penner, 1992). Er unterscheidet sich von anderen SOCs durch seine hohe Selektivität für Kalziumionen. Durch den Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration werden Kalzium-abhängige Kaliumkanäle (KCa) und die Ca2+-ATPase (PMCA) der Plasmamembran aktiviert und der CRAC-Kanal gehemmt. Die Hemmung des CRAC-Kanals durch die ansteigende Kalziumkonzentration hätte also zur Folge, dass das 2. Einleitung 12 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Kalziumsignal schnell wieder abfallen würde. Dies wird dadurch verhindert, dass die Mitochondrien, die nahe der Plasmamembran und somit des CRAC-Kanals lokalisiert sind, einen Teil des einströmenden Kalziums über einen Uniporter aufnehmen und somit einer Art Pufferfunktion nachkommen. Das von den Mitochondrien aufgenommene Kalzium wird nur langsam wieder über einen Na+/Ca2+-Austauscher in das Zytoplasma abgegeben (Hoth et al., 1997; Lewis, 2001). Ebenso wird ein Teil des eingeströmten Kalziums über die SERCA-Pumpe (sarco-endoplasmatic-reticulum-Ca2+-ATPase) aktiv aus dem Zytosol aufgenommen. Neben dem oben beschriebenen Weg zur wurden zwei weitere Ansätze zur Freisetzung von Kalzium aus intrazellulären Speichern beschrieben. Sowohl die T-Zelllinie Jurkat- als auch primäre T-Lymphozyten exprimieren den Ryanodin-Rezeptor in der Membran des endoplasmatischen Retikulums. Durch Bindung des „second messengers“ cADPR (cyclic ADPribose) wird Kalzium aus dem ER freigesetzt. Während der IP3-abhängige Weg wichtig für die schnelle Freisetzung von Kalzium und die anschließende Aktivierung des CRAC-Kanals nötig ist, spielt cADPR eine Rolle in der Aufrechterhaltung des Kalziumsignals (Guse, 2004). Weiterhin wird in T-Lymphozyten eine NAADP+-abhängige (NAADP+ = nicotinic acid adenine dinuleotide phosphate) Kalziumfreisetzung aus intrazellulären Speichern beschrieben. Die NAADP+-sensitiven Speicher unterscheiden sich allerdings von den IP3- und cADPR-abhängigen Speichern; NAADP+ löst z.B. keine Kalziumfreisetzung aus dem ER aus (Genazzani and Galione, 1996). Über diesen Freisetzungsmechanismus ist insgesamt bisher wenig bekannt. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass NAADP+-Konzentrationen im nanomolaren Bereich zu einer Kalziumfreisetzung führen (Lee et al., 1997). Die folgende Abbildung 1.1 gibt einen Überblick über den für unsere Arbeitsgruppe relevanten Teil der Kalzium-abhängigen Signaltransduktion in T-Lymphozyten. 2. Einleitung 13 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Abb. 2.1 Kalziumabhängige Signaltransduktion in T-Lymphozyten. Durch die Antigenpräsentation über den MHC-II-Komplex kommt es zur Aktivierung der intrazellulären Signalkaskade in T-Zellen. Über eine anhaltende Steigerung der intrazellulären Kalziumkonzentration werden Transkriptionsfaktoren aktiviert, die zu der Synthese von IL-2 führen. Die zeitliche und räumliche Dynamik des Kalziumsignals, die sich durch das Zusammenspiel von intrazellulärem und extrazellulärem Kalziumeinstrom in das Zytosol ergibt, ermöglicht die Modulation von Immunantworten. Die Bedeutung des korrekten Ablaufs der Signalkaskade wird dadurch verdeutlicht, dass eine Störung im Ablauf dieser Kalziumsignale Ursache einer Immundefizienz sein kann. Zum genauen Verständnis unterschiedlich ausgeprägter Immunantworten und zum Entwickeln geeigneter Immuntherapien ist es wichtig, die zugrunde liegenden Signalwege aufklären zu können, um geeignete Ansatzpunkte für eine Therapie zu finden. 2. Einleitung 14 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 2.3. Bedeutung des CRAC-Kanals in humanen T-Lymphozyten Der CRAC-Kanal ist wie bereits im vorherigen Kapitel beschrieben, ein Kalzium-abhängiger Kalziumkanal in der Plasmamembran, der außer in T-Lymphozyten auch in Mastzellen und vielen anderen Zelltypen vorkommt. Er zeichnet sich durch eine hohe Selektivität für Kalziumionen im Verhältnis von 1000:1 gegenüber anderen monovalenten Kationen aus (Hoth and Penner, 1993) und besitzt eine Einzelkanalleitfähigkeit von etwa 10-20 fS (Prakriya and Lewis, 2002; Zweifach and Lewis, 1993). Der CRAC-Kanal ähnelt bezüglich der Kalziumselektivität den spannungsabhängigen Kalziumkanälen, weist jedoch eine geringere Einzelstromstärke auf. Weiterhin wird dieser Kanal nicht durch eine Änderung des Membranpotentials, sondern durch die Entleerung der intrazellulären Kalziumspeicher aktiviert. Über den molekularen Aufbau des CRAC-Kanals ist bisher wenig bekannt. Man geht davon aus, dass er sich aus mehreren Untereinheiten zusammensetzt. Als beste Kandidaten zur Bildung dieser Untereinheiten gelten Proteine aus der TRP-Protein-Familie (TRP = transient receptor potential). Das erste Protein dieser Familie wurde in der Fruchtfliege Drosophila entdeckt (Montell and Rubin, 1989). Mittlerweile sind sieben Unterklassen der TRP-Familie bekannt. Die Einteilung in die einzelnen Klassen erfolgte anhand von Sequenzhomologien. Ein Kandidatenprotein für die Bildung des CRAC-Kanals ist TRPC3. Es konnte gezeigt werden, dass das TRPC3-Gen in T-Zell-Mutanten, die einen Defekt im Kalzium-Einstrom zeigen, defekt war. Durch Wiedereinfügen der kompletten menschlichen TRPC3 cDNA in diese Mutanten konnte der Kalziumeinstrom wieder gemessen werden (Philipp et al., 2003). Während des Schreibens dieser Arbeit wurde von Feske und Kollegen die Beteiligung eines neuen Proteins am Aufbau des CRAC-Kanals nachgewiesen (Feske et al., 2006). Dieses Protein, das nach den Himmelswächtern der griechischen Mythologie „ORAI1“ benannt wurde, wurde nahezu gleichzeitig von Vig et al. sowie Zhang et al. beschrieben (Vig et al., 2006, Zhang et al., 2006). Die Studien dieser Arbeitsgruppen zeigen klar, dass ORAI1 am Kalziumeinstrom über den CRAC-Kanal beteiligt ist. Trotz dieses großen Fortschrittes ist der genaue Aufbau des Kanals jedoch immer noch nicht vollständig verstanden. Neben dem molekularen Aufbau des CRAC-Kanals ist auch der molekulare Mechanismus, der zur Aktivierung des CRAC-Kanals führt, noch nicht endgültig geklärt. In einem Übersichtsartikel von Venkatachalam et al. (Venkatachalam et al., 2002) sind verschiedene noch diskutierte 2. Einleitung 15 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Aktivierungsmodelle erläutert. Ein Modell geht davon aus, dass die Freisetzung von Kalzium aus dem endoplasmatischen Retikulum zur Aktivierung eines Faktors führt (CIF = Calcium influx factor), der den CRAC-Kanal aktiviert. In glatten Muskelzellen, die ebenfalls einen Speicheraktivierten Kanal besitzen, konnte die Rolle des CIF genauer identifiziert werden. CIF spaltet Calmodulin von der Kalzium-unabhängigen Phospholipase A2 (iPLA2 = Ca2+-independant phospholipase A2) ab, was deren Aktivierung und die Bildung von Lysophospholipiden zur Folge hat. Diese wiederum aktivieren Speicher-aktivierte Kanäle (Smani et al., 2004). Ein weiteres Modell zur Aktivierung des CRAC-Kanals geht von einer direkten Kopplung des Speicher-aktivierten Kanals in der Membran an den Kalzium-Kanal des ERs aus. Diskutiert wird, ob diese Kopplung nicht permanent vorhanden ist, sondern nur bei Aktivierung der T-Zelle durch einen dynamischen Prozess formiert wird. Auch eine ausgeprägte räumliche Nähe zwischen Plasmamembran und ER, die kurzreichenden Signalen die Aktivierung des Speicher-abhängigen Kanals ermöglicht, wird untersucht. Weiterhin gibt es Vertreter der These eines „Sekretionsmodells“, in dem die Kanäle in Vesikeln liegen und bei Aktivierung durch Fusion in die Membran eingebaut werden (Venkatachalam et al., 2002). Die neuesten Untersuchungen zur Aktivierung des CRAC-Kanals zeigen, dass das im Endoplasmatischen Retikulum lokalisierte Protein STIM1 (STIM = stromal interaction molecule) an der ungeklärten Signaltransduktion zwischen Speicherentleerung und CRAC-Aktivierung beteiligt sein könnte. Dieses Protein scheint einen Sensor für die Speicherfüllung darzustellen, indem es bei fehlender Bindung von Kalzium an dem EF-Hand-Motif eine Transformationsänderung vollzieht und zur Plasmamembran transloziert (Roos et al., 2005; Liou et al., 2005; Zhang et al., 2005). Dort werden dann möglicherweise Untereinheiten des CRAC-Kanals aktiviert, Verbindungen zwischen der Membran und dem intrazellulären Speicher formiert oder funktionelle CRACKanäle gebildet (Zhang et al., 2005). Im Rahmen meiner Doktorarbeit wurde die Kalzium-abhängige Proliferation von TLymphozyten untersucht. Dazu wurden hauptsächlich der Jurkat T-Zell-Klon par (parental) sowie die daraus hervorgegangenen Mutanten CJ1 und CJ5 benutzt (Fanger et al., 1995). Ausgehend von der parentalen Zelllinie wurden mutierte Zelllinien mittels γ-Bestrahlung hergestellt und nach dem Phänotyp der Mutation in die Zelllinien CJ1 bis CJ5 unterteilt (CJ= Ca2+ Jurkat mutants). Die Mutanten zeigen Defizite in ihrem NFAT-abhängigen Transkriptionsweg. Der zugrunde liegende Defekt wurde untersucht, dabei wurde festgestellt, dass die Jurkat-Mutanten einen 2. Einleitung 16 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ verminderten speicher-aktivierten Kalzium-Einstrom aufweisen, der dem NFAT-abhängigen Transkriptionsweg zugrunde liegt. Es konnte gezeigt werden, dass dem Defekt im Speicheraktivierten Kalzium-Einstrom ein verminderter Strom durch den CRAC-Kanal (ICRAC) zugrunde liegt. Die Funktion der spannungsabhängigen und Kalzium-abhängigen Kalium-Kanäle, die über Potentialänderungen ebenso den Kalziumeinstrom beeinflussen könnten, ist in den Mutanten unverändert gegenüber der Funktion in der parentalen Zelllinie. Auch die Export-Mechanismen für Kalzium sind in den Mutanten unbeeinträchtigt. Der Defekt im Speicher-aktivierten Kalziumeinstrom und somit der Defekt im NFAT-abhängigen Signaltransduktionsweg sind auf die verminderten Einwärtsströme über den CRAC-Kanal zurückzuführen (Fanger et al., 1995). Für diese Doktorarbeit wurden neben der parentalen Zelllinie, die keine Defekte aufweist (100% ICRAC), die Zelllinien CJ1, die den stärksten Phänotyp zeigt, also den am stärksten verminderten Strom über den CRAC-Kanal (fast kein Strom messbar), sowie die Zelllinie CJ5, die den schwächsten Phanötyp zeigt (ICRAC: ~ 41%), verwendet. Diese Zellen stellen ein gutes Modell zur Untersuchung der Kalzium-abhängigen Proliferation dar. 2.4. Kalzium-abhängige Proliferation in T-Lymphozyten T-Lymphozyten müssen, um ihre Aufgabe im Immunsystem adäquat erfüllen zu können, im Bedarfsfall proliferieren, damit sie in ausreichender Zahl zur Bekämpfung eines Antigens vorhanden sind. Im Rahmen der Proliferation durchlaufen sie den Zellzyklus, der durch die Aufeinanderfolge von Interphase und Mitose charakterisiert ist. Die Dauer dieses Zellzyklus ist in den verschiedenen proliferierenden Geweben variabel. Zellen der Jurkat T-Zelllinie, die aus einer akuten lymphatischen Leukämie hervorgegangen sind, benötigen keinen externen Stimulus zur Proliferation und teilen sich in Kultur entsprechend der Dauer eines Zellzyklus etwa alle 24 Stunden. Die von uns isolierten, nativen, peripheren Blutlymphozyten verbleiben ohne Stimulus in der G0-Phase des Zellzyklus. Sie benötigen den Antigen-T-Zell-Rezeptor-Kontakt zur Aktivierung und zum Wiedereintritt in den Zellzyklus. Für diesen komplexen Ablauf, der mit der Aktivierung des TCR beginnt und über die in Kapitel 2.2 beschriebene Signalkaskade letztlich zur Produktion von IL-2 und zur Proliferation führt, ist das Vorhandensein von Kalzium essentiell. Der Anstieg des intrazellulären Kalziums führt zum Fortschreiten des Zellzyklus von der G0-Phase in die frühe G1-Phase und ist für weitere Kontrollpunkte im Zellzyklus wichtig 2. Einleitung 17 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ (Berridge, 1995; Kahl and Means, 2003). Die intrazelluläre Kalziumkonzentration wird von dem Zusammenspiel von Kalziumeinstrom, z.B. über den CRAC-Kanal, und Kalziumausstrom, wie z.B. mittels der Plasmamembran-Ca2+-ATPase, reguliert. Im Ruhezustand weisen die meisten Zellen eine intrazelluläre Kalziumkonzentration von etwa 50-100 nM auf, im Zustand der Aktivierung kann diese bis auf Werte von 1 µM oder höher ansteigen (Bootman et al., 2001). Mitochondrien und das endoplasmatische Retikulum spielen für die Kalziumhomöostase der Zelle eine wichtige Rolle, da sie als „Puffer“ wirken, die hohe Kalziumkonzentrationen bei einer Aktivierung der Zelle aufnehmen können und somit einer Überladung des Zytosols entgegenwirken. Das aufgenommene Kalzium kann nach und nach bei Bedarf wieder abgegeben werden (Lewis, 2001). Ansteigende Kalziumkonzentrationen in der mitochondrialen Matrix aktivieren Enzyme des Zitratzyklus und führen über erhöhte ATP-Syntheseraten zu einer erhöhten Energiebereitstellung (Hajnoczky et al., 1995). Jedoch kann eine Überladung der Mitochondrien mit Kalzium über den Verlust des Transmembranpotentials zur Freisetzung von Cytochrom c und damit zur Apoptose führen (Berridge et al., 2000). Auch eine Überladung des Zytosols oder des endoplasmatischen Retikulums kann durch die Aktivierung von StressSignalen zum Zelltod führen (Berridge et al., 1998). Die zentrale zelluläre Rolle von Kalzium ist die eines intrazellulären Botenstoffes, der die Aktivität und Proliferation der Zelle sowie den Ablauf des Zellzyklus reguliert (Berridge, 1995; Berridge et al., 1998; Bootman et al., 2001; Munaron et al., 2004; Santella, 1998). Während eine Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration zur Proliferation der Zelle führt, kann eine Überladung der Zelle pro-apoptotisch wirken (Berridge et al., 2000). Der eng regulierte Kalziumhaushalt ist somit entscheidend für das Leben oder Sterben der Zelle. 2.5. Apoptose in T-Lymphozyten Unter Apoptose versteht man den programmierten Tod von Zellen, der durch Schrumpfen der Zellen, Zerteilung der DNA durch Endonukleasen in definierte Stücke und durch Ausbildung von membranumschlossenen Vesikeln, die von Zellen des Immunsystems aufgenommen werden, gekennzeichnet ist. Im Gegensatz dazu schwillt bei der Nekrose die Zelle an, die Plasmamembran wird zerstört und das Zytosol und die Zellorganellen werden in den Extrazellulärraum freigesetzt. Dies hat eine Entzündungsreaktion zur Folge, die bei der Apoptose nicht zu beobachten ist. 2. Einleitung 18 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Der Zelltod durch Apoptose spielt im Immunsystem eine wichtige Rolle. Während der Reifung der T-Lymphozyten werden diejenigen Zellen durch Apoptose aussortiert, denen wichtige Antigen-Erkennungsstrukturen fehlen oder die solche exprimieren, die gegen körpereigene Strukturen gerichtet sind. Apoptotische Prozesse sind ebenso an der Limitierung der Dauer und der Stärke einer Immunantwort beteiligt. Eine zentrale Rolle im Ablauf der Apoptose spielen die Caspasen (Shi, 2002; Thornberry and Lazebnik, 1998). Caspasen sind Cystein-Proteasen, die Substrate nach einem Aspartat-Rest spalten und gehören einer Familie von Enzymen an, die eine Zelle unwiderruflich apoptotisch werden lassen. Die erste Caspase, das Interleukin-1b-converting enzyme (ICE, Caspase -1) wurde in menschlichen Zellen entdeckt. Die Beteiligung von Caspasen an der Apoptose wurde jedoch erstmals in dem Nematoden Caenorhabditis elegans beschrieben, in dem das Gen ced-3 für eine Cystein-Protease kodiert, dass eine sehr starke Ähnlichkeit mit der in Säugetieren entdeckten ersten Caspase zeigt. Seit der Entdeckung der ersten Caspase konnten insgesamt 14 verschiedene Caspasen identifiziert werden, von denen 11 in menschlichen Zellen vorkommen (reviewed in (Riedl and Shi, 2004)). Unterteilt werden Caspasen zunächst in inflammatorische (Caspasen –1, 4, -5, -13, -14) und apopototische Caspasen (Caspasen –2, –3, -6, -7, -8, -9, -10) (Earnshaw et al., 1999; Shi, 2002). Die Caspasen, die an der Regulation der Apoptose beteiligt sind, werden wiederum unterteilt in Initiator- (-8, -10, -9, -2) und Effektorcaspasen (-3, -7, -6). Die Effektorcaspasen werden durch Spaltung durch die Initiatorcaspasen aktiviert (Boatright and Salvesen, 2003) und führen über die proteolytische Spaltung einer Vielzahl von zellulären Zielen zum Tod der Zelle. Die Aktivierung der Effektorcaspasen durch proteolytische Spaltung wird von verschiedenen Assays zur Messung genutzt, wie z.B. bei dem von uns verwendeten Caspase –3/7 Glo Assay. Damit ist eine Aussage über die Aktivität der Effektorcaspasen in den Zellen möglich. Wie jedoch kommt es zur Aktivierung der Initiatorcaspasen? Auch diese liegen im Zytosol der Zelle in einer inaktiven Form als Procaspase vor und müssen, um wiederum die Effektorcaspasen aktivieren zu können, selbst aktiviert werden (Ramage et al., 1995; Yamin et al., 1996). Beschrieben wurden ein extrinsischer Aktivierungsweg, der Rezeptor-abhängig stattfindet, und ein intrinsischer Weg, der als Reaktion auf toxische Intermediärstoffe im Zellstoffwechsel stattfindet. 2. Einleitung 19 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Der extrinsische Weg findet über Rezeptoren der TNF-Rezeptor (TNF = tumor necrosis factor) Familie statt. Dazu gehört neben anderen der CD95- (auch Apo-1 oder Fas-) Rezeptor, für den der Ablauf der folgenden Signalkaskade am besten charakterisiert ist. CD95 ist ein 45 kD großes Typ-I Transmembranprotein, das in vielen verschiedenen Geweben, besonders stark jedoch in Thymozyten und T-Lymphozyten, exprimiert wird. Der Ligand des CD95-Rezeptors (CD95L) ist ein 40 kD großes Glykoprotein der TNF Familie, das jedoch auf der Oberfläche nur weniger Zelltypen, wie z.B. aktivierten T-Lymphozyten oder natürlichen Killerzellen, exprimiert wird (reviewed in Li-Weber and Krammer, 2003)). Die Bindung des Liganden an den Rezeptor führt zur Rekrutierung des zytosolischen Proteins FADD (Fas-associated protein with death domain), das durch homophile Interaktion mit der „death effector domain“ (DED) der Procaspase –8 einen Signalkomplex bildet (DISC = death-inducing signaling complex). Durch die Bildung dieses Signalkomplexes wird die Caspase –8 über einen noch nicht endgültig geklärten Mechanismus aktiviert und führt über die Spaltung der Effektorcaspasen zur deren Aktivierung und zum Zelltod (aus (Riedl and Shi, 2004)). Der intrinsische Weg wird als Antwort auf Stimuli aktiviert, die zur Aktivierung von Onkogenen oder zur Schädigung von DNA führen. Eine Schädigung dieses Weges ist für die Entstehung von Neoplasien mitverantwortlich (Hanahan and Weinberg, 2000). Der intrinsische Weg wird über die Mitochondrien reguliert und ist eng mit der Bcl-2-Proteinfamilie verknüpft. Die Bcl-2Familie besteht aus pro- und antiapoptotischen Proteinen, die Ähnlichkeiten in Sequenz und Struktur ihrer Bcl-2 homologen Regionen (BH-Region) aufweisen. Bisher sind vier verschiedene BH-Regionen (BH1-BH4) bekannt. Zu den pro-apoptotischen Proteinen gehören die Proteine BID, BIM und PUMA, die nur die BH3-Region aufweisen. Diese werden bei DNA-Schäden aktiviert und führen durch die Hemmung der antiapoptotischen Proteine zu Schädigungen der Mitochondrien. Dadurch kommt es zur Freisetzung von proapoptotischen Molekülen wie z.B. Cytochrom c und SMAC/DIABLO (SMAC = second mitochondria derived activator of caspases, DIABLO = direct inhibitor of apoptosis (IAP)-binding protein) ins Zytosol. Cytochrom c bindet an APAF-1 (apoptotic-protease-activating-factor-1) und führt über eine Konformationsänderung zur Bindung von ATP/dATP. Das so gebildetete „Apoptosom“ wandelt die Procaspase –9 in die aktive Form um, die dann wiederum die Effektorcaspasen aktiviert (nach (Marsden and Strasser, 2003)). 2. Einleitung 20 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Dieser intrinsische Weg kann bei primär induziertem extrinsischen Weg zusätzlich aktiviert werden. Die im extrinsischen Weg aktivierte Caspase –8 kann das proapoptotische Protein BID aktivieren, das wie oben beschrieben über die Schädigung der Mitochondrien zur Cytochrom c Freisetzung führt (Riedl and Shi, 2004). Die Apoptose ist ein sehr komplexer zellulärer Regulationsmechanismus, der zur Erhaltung von funktionellem gesundem Gewebe von großer Bedeutung ist. Defekte im Ablauf des programmierten Zelltodes können zu Autoimmunerkrankungen, Malignomen und Infektionen führen. 2.6. Zielsetzung der Arbeit Jurkat T-Lymphozyten proliferieren im Gegensatz zu nativen, peripheren Blutlymphozyten ohne einen externen Stimulus. Sowohl die Zelllinie als auch die nativen Zellen weisen aber einen eng regulierten Kalziumhaushalt auf, der für ihre Proliferation essentiell ist. Durch Proliferationsexperimente mit Mutanten der Jurkat- Zelllinie, die durch einen verminderten Strom über den für den Kalziumhaushalt wichtigen CRAC-Kanal charakterisiert sind, sollte die Bedeutung dieses Kanals für die Proliferation untersucht werden. Proliferationsexperimente sind zur Überprüfung von funktionellen Eigenschaften sehr gut geeignet, da sie am ehesten das physiologische Milieu der Zellen nachahmen und über einen größeren Zeitraum stattfinden können. Neben der Arbeit mit der Jurkat- Zelllinie wurden auch periphere Blutlymphozyten verwendet. Diese benötigen einen externen Stimulus, um proliferieren zu können. Es sollte ein Stimulus gefunden werden, der die physiologische Stimulation am besten imitiert und der für zukünftige Proliferationsexperimente eingesetzt werden kann. Außerdem sollte überprüft werden, ob bei erhöhter Proliferation der Zellen die Apoptose gleichzeitig erniedrigt ist und inwiefern der Kalziumhaushalt der Zellen an dem Gleichgewicht zwischen Proliferation und Apoptose beteiligt ist. 3. Material und Methoden 21 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 3. Material und Methoden 3.1. Material 3.1.1. Chemikalien und Assays Hier nicht aufgeführte Standardlaborchemikalien und Lösungen wurden von den Firmen VWR, Roche oder Sigma in Analysequalität bezogen. BAPTA Sigma BCA (Bicinchoninsäure) Sigma BSA (Serumalbumin aus dem Kalb) Protein Standard Sigma Caspase-3/7 Glo (Apoptoseassay) Promega CellTiter Blue (Fluoreszenzassay) Promega CellTiterGlo Promega EGTA (Ethylene-Glycol-Tetraacetic Acid) Sigma EZ4U (Absorptionsassay) Biozol FCS (fetales Kälberserum) Invitrogen Ficoll-Paque TM Plus Amersham Biosciences Fura-2 AM „cell permeant“ Molecular Probes Glycerol J.T. Baker NaN3 (Natriumazid) Sigma PHA-P (Phytohemagglutinin) Sigma Polyornithin Sigma Thapsigargin Molecular Probes Trypan Blau Sigma WST-1 (Absorptionsassay) Roche 3. Material und Methoden 22 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 3.1.2. Medien und Puffer HBSS PAA Laboratories GmbH, Kat.-Nr. H15-009 Kalziumfreies Medium (RPMI-1640, +5mg/l Biochrom AG, im Auftrag angefertigt Phenolrot, +2 mg/l NaHCO3, ∅ L-Glutamin, ∅ Ca2+) RPMI-1640 Invitrogen, Kat.-Nr. 21875-034 PBS Invitrogen, Kat.-Nr. 14190-094 3.1.3. Antikörper Antikörper Firma Methode anti -CD3-RPE DAKO, R0810 Zytologie anti -CD3-FITC DAKO, F0818 Zytologie anti -CD19-FITC DAKO, F0768 Zytologie anti -CD4-RPE DAKO, R0805 Zytologie anti -CD8-RPE (Cy5) DAKO, C7079 Zytologie anti -CD3 Serotec, MCA 463XZ Proliferation anti -CD3 Euroclone, Kat.-Nr. 1932205HB Proliferation, Bead-Herstellung anti -CD28 Euroclone, Kat.-Nr. 1928111IA anti -IgG Proliferation, Bead-Herstellung Proliferation, Bead-Herstellung 3.1.4. 96-Well Mikrotiterplatten Schwarz, komplett BD, Kat-Nr. 353945 Schwarz, transparenter Boden BD, Kat.-Nr. 353948 Transparent BD, Kat.-Nr. 353072 Weiß BD, Kat.-Nr. 353296 3. Material und Methoden 23 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 3.1.5. Geräte Mikroskope Photometer IX 70, Fluoreszenz Olympus CK 30, Durchlicht Olympus BioPhotometer Eppendorf Universal-Mikroplattenmessgerät Genius Pro Zentrifugen Tecan ELX800UV BIO-TEK Instruments Centrifuge 5415 R Eppendorf Universal 32 R Hettich 3.1.6. Auswertungsprogramme Excel Microsoft IGOR Pro WaveMetrics, Inc. Till Vision Till Photonics XFluor4GENiosPro (Excel-Einfügung) Tecan 3. Material und Methoden 24 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 3.2. Methoden 3.2.1. Zellkultur: Für die Proliferationsexperimente wurden Zelllinien verwendet, die ursprünglich von dem Jurkat T-Zellklon E6-1 (ATCC-Nr.: TIB-152) abstammen: die Diphterietoxin- resistente parentale Zelllinie (par) sowie die Klone CJ1 bzw. CJ5, die von Fanger et al. hergestellt wurden und durch einen verminderten Kalzium-Einstrom charakterisiert sind. Die Zellen wurden in RPMI 1640-Medium, das mit 10 % fetalem Kälberserum und PenicillinStreptomycin versetzt wurde (RPMI-komplett-Medium), kultiviert und unter logarithmischem Wachstum bei 37°C und 5 % CO2 gehalten. 3.2.2. Proliferationsexperimente: Absorption: EZ4U: Proliferationsmessungen mittels des EZ4U-Assays wurden in transparenten 96-WellPlatten ausgelesen, wobei die Daten sich aus dem Mittelwert von Triplikaten ergeben. Bei den meisten Experimenten wurden pro Well 7500 Zellen in einem Volumen von 200 µl für 48 Stunden bei 37°C und 5 % CO2 kultiviert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde die Anzahl der lebenden Zellen durch die Reduktion des Tetrazolium-Salzes EZ4U in ein Formazan– Derivat bestimmt (Biozol, #BI-5000). Dabei wurden zu jedem Well 20 µl des EZ4U-Assays hinzugefügt und die Zellen für weitere vier Stunden inkubiert. Die optische Dichte wurde anschließend in einem Universal-Mikroplattenleser (zunächst ELX800UV, BIO-TEK Instruments, spätere Versuche mit Genius Pro, Tecan) bei einer Wellenlänge von 465-630 nm gemessen. WST-1: Der Proliferationsassay der Firma Roche (#1644807) basiert auf der Spaltung des Tetrazoliumsalzes WST-1 durch reduzierende Enzyme an der Plasmamembran. Die Versuchsdurchführung und die Messung sind identisch mit dem EZ4U-Assay, durch die Umsetzung des Farbstoffes an der Plasmamembran bleiben die Zellen jedoch vital. 3. Material und Methoden 25 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Chemilumineszenz: CellTiter-Glo (Promega, #G7570): Im Gegensatz zu den Absorptionsmessungen fanden diese Proliferationsexperiment in einem Volumen von 100 µl in weißen Mikrotiterplatten statt. Nach der Inkubationszeit von 48 Stunden wurde die Platte für ca. 30 Minuten bei Raumtemperatur äquilibriert, bevor eine äquivalente Menge Substrat zugegeben wurde. Anschließend wurde die Platte für zwei Minuten geschüttelt, um die Zelllyse zu induzieren. Nach weiteren zehn Minuten Inkubationszeit bei Raumtemperatur zur Stabilisierung des Signals konnte die Chemilumineszenz in einem Universal-Mikroplattenleser gemessen werden. Das emittierte Licht verhält sich proportional zu dem ATP-Gehalt, der sich wiederum proportional zur Zellzahl verhält. Der ATP-Gehalt wird durch eine Luziferase- abhängige Oxygenierung des Luziferins in Anwesenheit von Mg2+, ATP und O2 bestimmt. Fluoreszenz: CellTiter-Blue (Promega, #G8080): Dieser Fluoreszenzassay basiert auf der Eigenschaft lebender Zellen, den blauen Farbstoff Resazurin, der kaum fluoresziert, zu Resorufin zu reduzieren. Resorufin zeichnet sich durch eine starke Fluoreszenz mit einem Exzitationsmaximum bei 579 nm und einem Emissionsmaximum bei 584 nm aus. Die Vorbereitung der in diesem Fall schwarzen 96-Well-Platten erfolgte wie bei den Absorptionsmessungen. Nach der Zugabe von 20 µl Substrat wurden die Platten für drei Stunden inkubiert und bei 535Ex/590Em gemessen. Da das CellTiter-Blue- Substrat nicht toxisch ist, ist es möglich, diesen Assay mit weiteren funktionellen Assays, wie z.B. einem fluorimetrischen Apoptoseassay, zu kombinieren. 3.2.3. Apoptosemessungen: Caspase-Glo3/7 (Promega, #G8090): Dieser auf Chemilumineszenz beruhende Assay bestimmt den Gehalt an aktiver Caspase -3 und Caspase -7. Caspasen sind die Schlüsselenzyme der Apoptose in Zellen, wobei die Caspasen -3 und –7 als ausführende Caspasen bezeichnet werden. Durch Hinzufügen einer äquivalenten Menge des Caspase-Substrats zu dem Versuchsvolumen startet folgende Reaktion: Das Substrat enthält das Tetrapeptid DEVD, das durch die Caspasen –3 und -7 abgespalten wird. Dabei entstehen ATP, O2 und Aminoluciferin, 3. Material und Methoden 26 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ das durch eine Luciferase- und Mg2+-abhängige Reaktion Licht freisetzt. Das Maximum an Licht ist 30 Minuten nach Zugabe des Substrats messbar. 3.2.4. Isolation von humanen, peripheren Blutmonozyten Für die Versuche mit primären menschlichen Lymphozyten liegt ein positives Votum der Ethikkomission vor. Zur Isolation von humanen, nativen Blutmonozyten wurden LeukozytenDepletionsfilter, die uns von der Abteilung für klinische Hämostaseologie und Transfusionsmedizin zur Verfügung gestellt wurden, verwendet. Alle Zentrifugationen wurden bei Raumtemperatur in der Hettichzentrifuge (32R) durchgeführt. Die Filter wurden laut Abbildung befestigt und entgegen der Filtrationsrichtung mit 60-70 ml HBSS- Puffer gespült, um die aus der Blutkonserve gefilterten Leukozyten zu gewinnen. Das heruntergespülte BlutPuffergemisch wurde auf zwei mit je 15 ml Ficoll beladene Leukosep-Röhrchen (Greiner) verteilt und für 30 Minuten bei 450 g ohne Bremse zentrifugiert. Dabei erhält man einen Gradienten, bei dem die restlichen Erythrozyten auf den Boden des Leukosep-Röhrchens absinken und die Leukozyten eine ringförmige Struktur etwa einen Zentimeter oberhalb des Leukosep-Filters bilden. Dieser Leukozytenring sowie der des zweiten Gradienten wurde mit einer Pipette abgenommen und in ein 50 ml Reaktionsröhrchen überführt. Die Leukozyten wurden mit HBSS-Puffer auf 50 ml aufgefüllt und für weitere 15 Minuten bei 250 g zentrifugiert. Das so erhaltene Zellsediment enthält noch einige Erythrozyten, die mit 2-3 ml Lysepuffer (155 mM NH4Cl, 10 mM KHO3, 0,1 mM EDTA, pH 7,3) für 2-3 Minuten lysiert wurden. Das Reaktionsröhrchen wurde zum Stoppen der Lyse mit HBSS-Puffer auf 50 ml aufgefüllt und bei 200 g 10 Minuten zentrifugiert. Dieser letzte Zentrifugationsschritt mit niedriger g-Zahl soll ermöglichen, dass die Thrombozyten im Überstand bleiben. Die nun von Erythrozyten befreiten Zellen wurden in 20 ml Medium aufgenommen und mit Trypan Blau (Sigma) als Vitalitätskontrolle in einer Neubauer-Kammer gezählt. Anschließend wurden die Zellen in einer Dichte von 2*106 Zellen/ml in Zellkulturflaschen ausgesät und über Nacht bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Dies dient der Adhäsion adhärenter Zellen an den Flaschenboden. Am nächsten Tag wurden die sich in Suspension befindenden Zellen für Proliferationsexperimente genutzt. 3. Material und Methoden 27 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Um zu überprüfen, ob in den Zellen nach der Präparation noch Kalziumsignale, wie z.B. eine Entleerung der intrazellulären Speicher, induzierbar sind, wurde zur Kontrolle eine Messung der intrazellulären Kalziumkonzentrationen durchgeführt (s. Punkt 3.2.5). Bild 1 Bild 2 Bild 3 Abb. 3.1: Ausspülung der PBMC’s aus einem Leukozyten-Depletionsfilter. Der Filter wird wie in Bild 1 und Bild 2 gezeigt befestigt und die Klemmen werden angebracht. Anschließend wird der mit Pfeil 1 bezeichnete Schlauch durchgeschnitten und das Ende in die Zellkulturflasche gesteckt. Dann erfolgt ein Schnitt an Pfeil 2. Nun werden die Klemmen entfernt und der Filter wird, wie in Bild 3 zu sehen, gegen die Laufrichtung mit einer mit HBSS gefüllten Spritze gespült. Das Blut/HBSS-Gemisch wird in der Flasche aufgefangen und weiterverarbeitet. (modifiziert nach Ebner et al., 2001) 3.2.5. Ca2+-Kontrollmessung und Antikörperfärbung der isolierten Lymphozyten Zunächst werden Deckgläser mit einem Durchmesser von 25 mm mit einem Tropfen Polyornithin (0,1 mg/ml) bei Raumtemperatur inkubiert. Diese Vorbehandlung soll der Haftung der Zellen dienen. Nach 30 Minuten wurde der Tropfen abgesaugt. Des weiteren wurden zur Herstellung des Lademediums 10 ml RPMI-komplett-Medium auf Raumtemperatur erwärmt und mit 100 µl 1 M Hepes versetzt (Endkonzentration: 10 mM). In DMSO gelöstes Fura-2/AM (Stocklösung: 1 mM) wurde aufgetaut und in einer Konzentration von 1 µM zu 1 ml Lademedium zugegeben. Das Fura-2/AM enthaltende Medium wurde für 15 s bei maximaler Geschwindigkeit mit einem Vortexer gemischt. 1,5 ml der zu messenden Zellsuspension wurden in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß pipettiert und schnell und kurz zentrifugiert 3. Material und Methoden 28 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ (Eppendorf-Zentrifuge 5415C), um ein Zellsediment zu erhalten, welches dann in dem mit Fura-2 versetzten Medium resuspendiert und für 30 Minuten im Dunkeln inkubiert wurde. Fura-2 ist ein Kalzium-bindender Farbstoff, der zur Bestimmung der intrazellulären Kalziumkonzentration verwendet wird. In der Zwischenzeit wurden die für die Messung benötigten Lösungen hergestellt. Zur Speicherentleerung wurde Messlösung 1 (1 µM Thapsigargin, 155 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 10 mM Glucose, 5 mM Hepes, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 7,4) verwendet, der Ca2+Einstrom wurde mit Messlösung 2 (1 µM Thapsigargin, 155 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 10 mM Glucose, 5 mM Hepes, 2 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, pH 7,4) induziert. Der Messplatz mit Lampe und Kontrolleinheit, Kamera, Mikroskop und Pumpe für Lösungswechsel wurde eingeschaltet und der Computer sowie das Till- Vision Programm gestartet. Die für 30 Minuten mit Fura-2 inkubierten Zellen wurden abzentrifugiert, einmal mit 1 ml Medium gewaschen und schließlich je nach Größe des Zellsediments in 20-50 µl Medium aufgenommen. 10 µl dieser Zellsuspension wurden auf das vorbereitete Deckglas aufgetragen und für weitere 15 Minuten im Dunkeln inkubiert, so dass der Furaester gespalten werden kann und die Zellen absetzen können. Danach wurde das Deckglas in das Kammerunterteil gesetzt und mit dem mit Silikon (VWR) abgedichteten Kammeroberteil bedeckt. Zwei Öffnungen in dieser Kammer machen einen Lösungswechsel und Spülen während der Messung möglich. Zur Abdichtung von oben wurde ein 12 mm Deckglas eingesetzt. Die Kammer wurde in die Vertiefung des Mikroskops eingelassen, festgeklemmt und schließlich an die vorher mit 1 mM Ca2+- Lösung durchgespülten Schläuche angeschlossen. Die Zellen wurden mit einem 20x Objektiv) betrachtet und so lange mit 1 mM Ca2+- Lösung (155 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 10 mM Glucose, 5 mM Hepes, 2 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, pH 7,4) gespült, bis möglichst keine Zellen mehr übereinander lagen. Im Till-Photonics Programm wurde unter Grab Settings die Einstellung „Kamera“ gewählt. Dann wurde der Fura-Filtersatz (AMF Analysentechnik) ausgewählt und ein Fluoreszenzbild bei 360 nm und 50 ms Belichtungszeit aufgenommen (360_b). Die emittierten Fluoreszenzen mit Wellenlängen von λ > 440 nm wurden mit einer CCD Kamera aufgenommen. In diesem Bild wurde das Analysefeld selektiert. Desweiteren wurde noch ein Transmissionsbild mit 10 ms Belichtungszeit aufgenommen (trans_a). Nun wurde im Programm die Einstellung „Analysis“ gewählt. Live Display und Live Kinetics wurden ausgewählt und bei letzterem das Analysefeld des 360_b- Bildes ausgewählt. Als Werte für Minimum und Maximum wurden 200 bzw. 1200 eingegeben, die Optionen für das Live 3. Material und Methoden 29 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Display wurden wie folgt festgelegt: T1 35, T2 35, Scale 1000, Bg1 65, Bg2 70. Bei der Einstellung „Series“ wurden verwendet: Einstellungen: Ratio image pair, 340, 380; Start time:0; Cycle time: 5000; Number of cycles: 280; Exposure time: 20. Zur besseren Darstellung der Konzentrationsänderungen in den Zellen wurde eine farbige Anzeige für die intrazelluläre Kalziumkonzentration gewählt. Nun wurde das eigentliche Experiment gestartet. Die Zellen wurden abwechselnd bei 340 nm und 380 nm angeregt. Alle 5 s wurde ein Ratio-Bild (340nm/380nm) aufgenommen. Während der Messung, die über einen Zeitraum von 1400 s lief, wurden die verschiedenen Lösungen (siehe oben) in die Kammer gespült. Zur Beurteilung, ob während des Experiments Zellen verrutscht sind, wurde am Ende noch einmal ein Transmissionsbild aufgenommen. Ein weiteres Bild bei 360 nm wurde aufgenommen, um die Ladung der Zellen mit Fura-2/AM zu überprüfen. Dann wurde ein Bereich ohne Zellen gesucht und Hintergrundbilder bei 340 bzw. 380 nm und jeweils 20 ms Belichtungszeit aufgenommen, um den Hintergrund berechnen und mit in die Auswertung einbeziehen zu können. Die Daten wurden anschließend als Experiment gespeichert. Die Auswertung erfolgte mit den Programmen TILL Vision (TILL Photonics) und Igor pro. Die Ratio 340/380 ist dabei direkt proportional zur intrazellulären Kalziumkonzentration: Letztere wurde durch eine Kalibration des Messplatzes berechnet (analog zur Kalibration von Mag-Fura in 3.2.9.) (Grynkiewicz et al., 1985). A B C D Abb. 3.2: Abbildung der zum Messen verwendeten Kammer. Die Kammer besteht aus zwei Teilen (Bild A), die zusammengesetzt werden können (Bild B). Das Deckglas mit den Zellen sitzt unter dem kleinen Kammerteil und wird mit Silikon abgedichtet, von oben wird die Kammer mit einem kleinen Deckglas abgedichtet. Die zusammengebaute Kammer wird in die Vertiefung am Mikroskop eingespannt und an zwei Schläuche angeschlossen, die einen Lösungswechsel während der Messung ermöglichen. 3. Material und Methoden 30 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 3.2.6. Antikörperfärbung in der Messkammer Im Anschluss an die Messung der intrazellulären Kalziumkonzentration wurde in der Regel eine Doppelfärbung der Zellen (CD3/CD19) in der Messkammer durchgeführt. Hierzu wurden 60 µl einer 1:15 Verdünnung eines FITC-markierten anti-CD19-Antikörpers und eines RPEmarkierten anti-CD3-Antikörpers hergestellt. Diese Lösung wurde rückwärts in die Kammer eingesaugt und 15 Minuten im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurde von einem ausgewählten Bereich zunächst ein Transmissionsbild aufgenommen. Mit einem für RPE geeigneten Filter (F41-007, Cy3, Anregungsfilter: HQ 545/30, Dichroischer Spiegel: Q565 LP, Emissionsfilter: HQ 610/75, A.H.F. Analysetechnik AG) wurde anschließend bei 550 nm und einer Belichtungszeit von 1000 ms ein Bild aufgenommen, dann wurde bei 490 nm und 5000 ms Belichtungszeit mit einem FITC-geeigneten Filter (F41-017, EGFP, Anregungsfilter: HQ 470/40, Dichroischer Spiegel: Q495 LP, Emissionsfilter: HQ 525/50, A.H.F. Analysetechnik AG) fotografiert. Dieser Vorgang wurde für mehrere Bildausschnitte wiederholt. Der Vergleich der Fluoreszenzbilder und des Transmissionsbildes ermöglicht die Bestimmung der T- bzw. BZellpopulation. 3.2.7. Antikörperfärbung im Reaktionsröhrchen Eine weitere Möglichkeit zur Antikörperfärbung ist die Färbung im Reagenzröhrchen (Falcon). Dazu wurden ca. 1*106 Zellen in ein 15 ml-Reaktionsröhrchen pipettiert und bei 250 g und Raumtemperatur für 10 Minuten in der Hettich-Zentrifuge (30F) zentrifugiert. Das Zellsediment wurde in 100 µl einer 1:15 Verdünnung der unter Punkt 3.2.6 beschriebenen Farbstoffe resuspendiert und für 30 Minuten auf Eis und im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurde die Suspension mit 15 ml RPMI-komplett-Medium aufgefüllt und ein weiteres Mal für 10 Minuten bei 250 g zentrifugiert. Das Zellsediment wurde in einer Dichte von ungefähr 3*107 Zellen aufgenommen und weiter auf Eis gelagert. Etwa 15 µl der gefärbten Zellen wurden auf ein vorher mit 0,1 mg/ml Polyornithin beschichtetes Deckglas pipettiert und wie bei der bereits beschriebenen Kalziummessung in die Messkammer gesetzt. Waren die Zellen zu dicht, wurde mit 1 mM-Ca2+-Lösung (155 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 10 mM Glucose, 5 mM Hepes, 2 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, pH 7,4) gespült. Danach konnten die Bilder mit den gleichen Einstellungen wie bei der oben beschriebenen Antikörperfärbung aufgenommen werden. 3. Material und Methoden 31 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 3.2.8. Intrazelluläre Kalziummessung in 96-well-Platten Um parallel neben der Proliferation auch die intrazelluläre Kalziumkonzentration der Zellen bestimmen zu können, wurde eine Methode entwickelt, die es ermöglicht, eine proliferierende Zellpopulation direkt in einer 96-Well-Platte auf ihr intrazelluläres Kalzium zu testen. Dazu wurden 7500 Jurkat- Zellen pro Well unter verschiedenen, mit EGTA eingestellten Kalziumkonzentrationen in eine 96-Well-Mikrotiterplatte pipettiert (in 200 µl Endvolumen) und für 48 Stunden bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Da wir uns mit der geringen Zellzahl und den erwarteten Signalen nur knapp über der Auflösungsgrenze des Messgerätes befinden und der Fura-2/AM-Farbstoff eine Ratio bestimmt und damit unabhängig von der Zellzahl ist, konnten die Zellen als 6-fach Werte angesetzt werden, um letztlich mehr Zellen bei der Messung zur Verfügung zu haben. Nach der Inkubationszeit wurden die zu messenden Zelllinien in 1,5 ml-Reaktionsgefäße umpipettiert und kurz abzentrifugiert. Als Messlösung wurde ein von einer Firma angefertigtes RPMI-Medium ohne Kalzium (Biochrom AG) verwendet. Durch Zugabe von CaCl2 wurden Kalziumkonzentrationen eingestellt, die den Wachstumsbedingungen in der 96-Well-Platte entsprachen. Zur Herstellung des Lademediums wurden zu einem Teil des jeweiligen Mediums je 2 µM Fura-2/AM zugefügt und durch Mischen mittels eines Vortexers eine Suspension hergestellt. Die abzentrifugierten Zellen wurden anschließend in dem jeweiligen Lademedium resuspendiert und für 30 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur geladen. Nach der Ladezeit wurden die Zellen erneut abzentrifugiert und ein Mal in dem entsprechenden Medium ohne Fura-2/AM gewaschen. Nach erneuter Zentrifugation wurde das Zellsediment letztlich in 600 µl der Messlösung aufgenommen und als Triplikat in eine schwarze 96-well-Mikrotiterplatte mit transparentem Boden pipettiert. Die Zellen wurden für weitere 15 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend jeweils bei 380 nm und 340 nm Anregungs- (Filter 380/10, 340/10, Tecan) und 510 nm Emissionswellenlänge (Filter 510/40, Tecan) in einem UniversalMikrotiterplatten-Messgerät von unten gemessen. Die aus 340 nm und 380 nm ermittelte Ratio ist direkt proportional zur intrazellulären Kalziumkonzentration, welche durch eine Kalibration der Messapperatur bestimmt wurde (analog zur Kalibration von Mag-Fura in Kapitel 3.2.9.). 3. Material und Methoden 32 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 3.2.9. Bestimmung der freien Kalziumkonzentration in RPMI-komplett Medium Zur Bestimmung der freien Kalziumkonzentration in RPMI-komplett-Medium mittels der Formel [Ca2+]i= K**(R-Rmin)/(Rmax-R) (Grynkiewicz et al., 1985) wurde zunächst eine Kalibration des Messplatzes durchgeführt. Die Fluoreszenz wurde wie unter Punkt 3.2.5 beschrieben gemessen, wobei die Lösungswechsel jeweils nach der Einstellung eines Gleichgewichtes erfolgten. Die Messlösungen wurden ausgehend von einer 0 mM-Ca2+-Lösung (10 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7,4) und einer 10 mM Ca2+-Lösung (10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4), die jeweils 5 µM des Mag-Fura-2-Salzes (Molecular Probes) enthielten, in 0,2 mM-Abständen angefertigt. Dies diente dazu, gleiche Mag-FuraKonzentrationen in den Messlösungen zu gewährleisten. Rmin wurde mit der 0 mM Ca2+Lösung, der zusätzlich 1mM EGTA hinzugefügt wurde, gemessen. Zur Bestimmung von Rmax wurde die 10 mM Ca2+-Lösung mit 1 M CaCl2 auf 30 mM eingestellt. Beide Lösungen enthielten jeweils 5 µM Mag-Fura-2. Der effektive Kd (K*) wurde im Gegensatz zu den experimentell bestimmbaren Werten Rmin und Rmax rechnerisch mit Hilfe der Igor pro Software bestimmt. Mit Hilfe der Formel nach Grynkiewicz et al. und gemessener Ratios (340 nm/380 nm) konnte die Konzentration an freiem Kalzium bestimmt werden. Die Ratios wurden in RPMI-komplett-Medium bestimmt, das mit 5 µM Mag-Fura-2 geladen und mit verschiedenen EGTA-Konzentrationen (in mM: 0; 0,5; 0,6; 0,62; 0,65; 0,66; 0,68; 0,7; 0,72; 0,75; 0,8; 0,9; 1,0) versetzt wurde, bestimmt. 3.2.10. Herstellung von Antikörper-beschichteten Polystyrol-Beads Zur Herstellung der Antikörper-beschichteten Polystyrol-Beads wurden zunächst 100 ml der Bead-Suspension (∅ 6 µm, Polysciences Inc., #07312) in ein 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Diese wurden mit 900 µl Bor-Puffer (0,1 M, pH 8,5) aufgefüllt und kurz mit einem Vortexer gemischt. Alle folgenden Zentrifugationen erfolgten bei 10000 Umdrehungen/Minute (Upm) in einer Eppendorf –Zentrifuge (5415 C). Die Suspension wurde zunächst 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und das Sediment in 1 ml Bor-Puffer aufgenommen. Anschließend wurde erneut fünf Minuten zentrifugiert. Der letzte Schritt wurde noch ein Mal wiederholt, dann wurden die Beads für zehn Minuten zentrifugiert. Das Sediment wurde in einer mit Bor-Puffer hergestellten 1:10 Verdünnung des jeweiligen Antikörpers (antiCD3-Ak, anti-CD28-Ak, anti-IgG-Ak) resuspendiert und über Nacht bei Raumtemperatur 3. Material und Methoden 33 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ geschüttelt. Am nächsten Tag wurde zunächst 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und zur Proteinbestimmung aufgehoben. Das Sediment wurde in 0,5 ml des BorPuffers, der zu diesem Zweck mit 10 mg/ml Serumalbumin aus dem Kalb (BSA; Sigma, P0914) versetzt wurde, gelöst und für 30 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt. Anschließend wurde erneut zehn Minuten zentrifugiert. Diese beiden Schritte wurden ein Mal wiederholt, bevor das die Beads enthaltende Sediment zur Lagerung bei 4°C in einem speziellen Puffer (0,1 M Phosphatpuffer, 15 mM NaCl, 1% BSA, 5% Glycerol, 0,1 % NaN3, pH 7,4) resuspendiert wurde. 4. Ergebnisse 34 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 4. Ergebnisse 4.1. Ermittlung einer für alle Versuche geeigneten Zellzahl im linearen Messbereich Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Kalzium-abhängige Proliferation von T-Lymphozyten untersucht. Als Modell wurde die T-Zelllinie Jurkat (ATCC-Nr.: TIB-152, E6-1) und die daraus hervorgegangenen Zelllinien parental (= par), CJ1 und CJ5 verwendet. Die verwendeten JurkatZelllinien E6-1, par, CJ1 und CJ5 zeigen ein exponentielles Wachstum. Aus der parentalen Zelllinie sind die Mutanten CJ1 und CJ5 hervorgegangen, die durch einen verminderten Einstrom über den Kalzium-abhängigen Kalziumkanal charakterisiert sind. Dabei zeigt die Zelllinie CJ5 den schwächsten Phänotyp, d.h. der Kalziumeinstrom ist im Vergleich zu den parentalen Zellen am geringsten vermindert. Die Zelllinie CJ1 ist durch einen sehr stark verminderten Kalziumeinstrom charakterisiert. Die folgenden Experimente zur Kalzium-abhängigen Proliferation wurden in 96-Well-Platten mittels des EZ4U-Assays durchgeführt. Verschiedene Wachstumsbedingungen wurden als Triplikate gemessen, woraus der Mittelwert und die Standardabweichung berechnet wurden. Für diese Experimente musste eine Zellzahl gewählt werden, bei der sichergestellt ist, dass das Wachstum der Zellen auf die Modulation der gewählten Parameter (wie z.B. Änderung der extrazellulären Kalziumkonzentration mittels EGTA) zurückzuführen ist. Dazu muss eine Anfangszellzahl gewählt werden, bei der das Messsignal linear mit der zu messenden Zellzahl steigt. Nur solange die Zellzahl linear zum gemessenen Signal steigt, ist sichergestellt, dass der Parameter des Zellwachstums gemessen wird, ohne dass andere Parameter, wie z.B. Wellgröße, Zelldichte oder Verbrauch von Medium eine Rolle spielen. Um den Bereich ermitteln zu können, in dem sich das gemessene Signal linear zur Zellzahl verhält, wurden verschiedene Anfangszellzahlen über vier Tage gemessen. Zunächst wurde das Wachstumsverhalten der ursprünglichen Jurkat T-Zelllinie E6-1 untersucht. Diese liegen an Tag 1 im linearen Bereich bei einer anfänglichen Zellzahl von 1000 bis 12500 Zellen pro Well, an Tag 2 zwischen 5000 und 12500 Zellen, an Tag 3 zwischen 2500 und 10000 Zellen und an Tag 4 zwischen 1000 und 5000 Zellen pro Well. Als Beispiel für das Proliferationsverhalten dieser Zelllinie werden die Mittelwerte zweier Messungen an Tag 2 gezeigt (s. Abb. 4.1). 4. Ergebnisse 35 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Abb. 4.1 Wachstum der ursprünglichen T-Zelllinie E6-1 in Abhängigkeit von der Anfangszellzahl. Aufgetragen ist die optische Dichte von verschiedenen Anfangszellzahlen nach einem Proliferationszeitraum von zwei Tagen. Die Daten ergeben sich aus der Messung von Triplikaten, die Abbildung zeigt die Mittelwerte und Standardabweichungen aus zwei Experimenten. Die Zelllinie E6-1 wurde nur als Test, nicht aber für weitere Experimente verwendet, da die aus ihr hervorgegangene parentale Zelllinie die beste Kontrollzelllinie für CJ1 und CJ5 darstellt. Die parentale Zelllinie zeigt an Tag 1 Signale, die linear zur Zellzahl steigen, wenn eine Anfangszellzahl von 2500 bis 12500 Zellen pro Well, an Tag 2 und Tag 3 zwischen 2500 und 10000 Zellen pro Well und an Tag 4 zwischen 1000 und 5000 Zellen pro Well gewählt wird. Die Zelllinien CJ1 und CJ5 zeigen ebenso wie die parentale Zelllinie an Tag 1 bei einer Anfangszellzahl von 2500 bis 12500 Zellen pro Well einen zur Zellzahl linearen Signalanstieg, an Tag 2 und Tag 3 verhalten sich die Signale linear zur Zellzahl bei anfänglichen 2500 bis 10000 Zellen pro Well, an Tag 4 zwischen 500 und 2500 Zellen pro Well. Die Zelllinie CJ5 zeigt insgesamt ein der Zelllinie CJ1 sehr ähnliches Wachstum. Die Signale sind an Tag 1 und Tag 2 fast gleich hoch. An Tag 3 und Tag 4 sind die Signale der Zelllinie CJ5 niedriger. Abb. 4.2 zeigt die Mittelwerte aus vier Experimenten für Tag 1-3, bzw. drei Experimenten für Tag 4. 4. Ergebnisse 36 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Abb. 4.2 Wachstum der parentalen Zelllinie und der Zelllinien CJ1 und CJ5 in Abhängigkeit von der Anfangszellzahl. Die Abbildungen zeigen den Signalanstieg der Zellen in Abhängigkeit von der Anfangszellzahl über einen Proliferationszeitraum von vier Tagen. Die Daten zeigen den Mittelwert und die Standardabweichung aus vier Experimenten an Tag 1-3, bzw. aus 3 Experimenten an Tag 4. In den einzelnen Versuchen wurden die Daten als Triplikate gemessen. Aufgrund dieser Untersuchungen wurden für die folgenden Experimente für alle Zelllinien folgende Parameter gewählt: Bei einem zur Zellzahl linearen Signalanstieg und uneingeschränkter Proliferation wurde für Tag 2 eine Anfangszellzahl von 7500 Zellen pro Well gewählt. Für Experimente an Tag 3 wurden 5000 Zellen pro Well gewählt. 4. Ergebnisse 37 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 4.2. Instantanes Signal: Kalibrierung der EZ4U-Messmethode Mit der EZ4U-Methode wird nicht direkt die Zellzahl gemessen. Die lebenden Zellen setzen durch enzymatische Reaktionen das Tetrazoliumsalz EZ4U in ein Formazan-Derivat um. Dabei entstehen Reduktionsäquivalente, die linear mit der Anzahl der lebenden Zellen steigen. Die Zellzahl wird dadurch abgeschätzt, dass die Absorption des umgesetzten Reagenz gemessen wird. Es muss nun sichergestellt sein, dass alle verwendeten Zelllinien in dem gewählten Zellzahlbereich das Messreagenz gleich umsetzen, insbesondere deswegen, weil bei den nachfolgenden Experimenten sehr kleine Unterschiede in der Proliferation der parentalen Zelllinie und der Mutanten CJ1 und CJ5 erwartet werden. Es ist also besonders wichtig sicherzustellen, dass geringe Signalunterschiede ausschließlich auf Effekte der Proliferation zurückzuführen sind. Jede Zelllinie muss also bei gleicher Zellzahl gleich hohe Signale liefern. Dies wird kontrolliert, indem die Messung der Zellen unmittelbar nach dem Pipettieren erfolgt und somit für die Zellen keine Möglichkeit zur signifikanten Proliferation gegeben ist. Abb. 4.3 zeigt die Zusammenfassung der Experimente zur Bestimmung des instantanen Signals. Für Experimente an Tag 2 wurde eine Anfangszellzahl von 7500 Zellen pro Well gewählt, die sich unter Annahme eines exponentiellen Wachstums an Tag 2 auf ungefähr 30000 Zellen pro Well vermehrt haben sollten. Experimente, die an Tag 3 gemessen wurden, wurden mit 5000 Zellen pro well gestartet. Somit sollten an Tag 3, an dem gemessen wurde, ca. 40000 Zellen in einem Well sein. Für uns ist demnach der Bereich zwischen 5000 und 40000 Zellen pro Well relevant. Die Abbildung 4.3 zeigt, dass die Zelllinien bei Zellzahlen in diesem Bereich keine signifikanten Unterschiede im Signal zeigen. Es ist sichergestellt, dass das Messreagenz von den Zelllinien gleich gut umgesetzt wird und dass es in dem verwendeten Zellzahlbereich überhaupt noch umgesetzt werden kann. Daher ist der Assay für weitere Versuche geeignet. Weiterhin ist zu erkennen, dass die Messung einer optischen Dichte von z.B. 0,6 einer Zellzahl von ungefähr 40000 Zellen pro Well entspricht. Dies erlaubt für Proliferationsexperimente mit Hilfe des EZ4U-Assays eine Abschätzung der im Well vorhandenen Zellzahl. 4. Ergebnisse 38 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Abb. 4.3 Signalstärke in Abhängigkeit von der Zellzahl – instantanes Signal. Die Abbildung zeigt die zellzahlabhängige Signalstärke der parentalen Zelllinie (par) sowie die der Mutanten CJ1 und CJ5. Aufgetragen sind die Mittelwerte und Standardabweichungen aus zwei Experimenten, bei mit * versehenen Balken beträgt n=4. Die Daten der einzelnen Experimente wurden aus Triplikaten errechnet. 4. Ergebnisse 39 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 4.3. Qualitätsvergleich von sterilfiltriertem und autoklaviertem EGTA Um die Kalzium-abhängige Proliferation der Zelllinien untersuchen zu können, muss die extrazelluläre Konzentration des Ions genau moduliert werden können. Dazu wurde EGTA als Kalzium-Chelator eingesetzt. Zur möglichst genauen Einstellung der erwünschten extrazellulären Kalziumkonzentration für die nachfolgenden Versuche ist es wichtig, dass das EGTA die bestmögliche Qualität hat und dass seine Bindungseigenschaften nicht gestört werden. Für Proliferationsexperimente ist die Sterilität aller verwendeten Substanzen und Materialien unbedingt notwendig. Viele Substanzen können autoklaviert werden, ohne dass sie in ihrer Stabilität beeinträchtigt werden. Um festzustellen, ob Autoklavieren die Eigenschaften von EGTA beeinflusst, wurde ein frisch angesetztes Volumen EGTA geteilt. Ein Teil wurde filtriert, der zweite Teil wurde autoklaviert. Parentale Zellen wurden jeweils mit filtriertem und autoklaviertem EGTA für 48 bzw. 72 Stunden inkubiert. In der Abbildung 4.4, die das Experiment nach 48-stündiger Inkubationszeit zeigt, ist zu erkennen, dass die mit autoklaviertem EGTA inkubierten Zellen insbesondere in dem für die Zellen kritischen Konzentrationsbereich sehr viel höhere Signale zeigen, als diejenigen, welche mit einer gleichen Konzentration sterilfiltriertem EGTA behandelt wurden. Dies weist darauf hin, dass in diesen Wells eine höhere extrazelluläre Kalziumkonzentration herrscht als in den mit filtriertem EGTA pipettierten Wells. Das gleiche Ergebnis ergibt sich nach 72-stündiger Inkubation der Zellen mit filtriertem bzw. autoklaviertem EGTA. Der gerade unter stringenten Bedingungen auftretende starke Signalunterschied zwischen filtriertem und autoklaviertem EGTA lässt auf unterschiedliche Chelationseigenschaften schließen. Da Filtrieren im Vergleich zu Autoklavieren eine schonendere Behandlung ist, lässt dieses Ergebnis darauf schließen, dass die Bindungsfähigkeit des autoklavierten EGTA für Kalzium abnimmt. Autoklavieren scheint EGTA in seinen Eigenschaften so zu verändern, dass es zur Benutzung für unsere Proliferationsexperimente, die eine genaue Einstellung der extrazellulären Kalziumkonzentration erfordern, ungeeignet ist. Für alle weiteren Versuche wurde somit sterilfiltriertes EGTA verwendet. 4. Ergebnisse 40 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Abb. 4.4 Unterschiede in der Proliferation von parentalen Zellen bei 48- stündiger Inkubationszeit mit sterilfiltiertem bzw. autoklaviertem EGTA (n=1). Parentale Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen autoklaviertem bzw. sterilfiltriertem EGTA inkubiert. Aufgetragen sind Mittelwerte und Standardabweichungen, die aus Triplikaten ermittelt wurden. 4. Ergebnisse 41 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 4.4. Überprüfung der Eignung von EGTA zur Modifikation der extrazellulären Kalziumkonzentration EGTA zeichnet sich im Vergleich zu anderen Chelatoren für zweiwertige Ionen (wie z.B. EDTA) dadurch aus, dass es eine große Selektivität für Kalzium (Kd:175 nM) gegenüber zweiwertigen Ionen wie z.B. Magnesium aufweist. Es muss jedoch sichergestellt werden, dass der Effekt von EGTA tatsächlich nur auf die Bindung des für die Proliferation entscheidenden Kalziums zurückzuführen ist und dass es keine Interferenzen mit dem Assay oder eine direkte toxische Wirkung auf die Zellen zeigt . Dazu wurde zu den Zelllinien zusätzlich zu verschiedenen EGTA- Konzentrationen 0,5 mM bzw. 1 mM CaCl2 zugefügt. Wenn der Effekt von EGTA nur auf die Chelation von Kalzium zurückzuführen ist, sollten die Zellen mit der entsprechenden Gabe von CaCl2 in ihrer Proliferation unbeeinflusst bleiben. Zur Abschätzung des nach Zugabe von EGTA in der Lösung verbleibenden freien Kalziums kann folgende Formel verwendet werden: A= (AT-BT-k)/±√[((AT-BT-k)/2)² +k*AT] (A: freies Ca2+ [mM]; AT: in der Lösung vorhandenes bzw. zugefügtes Kalzium; BT: zugegebenes EGTA [mM]; k: Dissoziationskonstante für EGTA [0,000175 mM]) In dem für die Versuche verwendeten RPMI-1640 Medium liegen zusätzlich Proteine vor, die Kalzium binden können. Es ist jedoch davon auszugehen, dass diese Proteine bereits mit dem im Medium vorhandenen Kalzium gesättigt sind. Bei einer Zugabe von 0,5 mM CaCl2 zu 0,5 mM EGTA in RPMI-1640 Medium bleiben demnach etwa 9,4 µM des zugegebenen Kalziums als freies Kalzium über. Man kann also grob abschätzen, dass sich die Effekte des EGTA und des CaCl2 auf die Proliferation bei einer äquimolaren Zugabe aufheben müssten. Die Abbildung 4.5 zeigt exemplarisch einen entsprechenden Versuch an Tag 2. Die Zellen wurden mit 1 mM EGTA und 1 mM CaCl2 pipettiert. Als Kontrollen wurden Zellen ohne EGTA und ohne zusätzliches Kalzium inkubiert. Man kann erkennen, dass die Zelllinien, die mit EGTA und Kalzium inkubiert wurden, keine signifikanten Signalunterschiede zu den Zellen, die komplett unbehandelt blieben, zeigen. Diese sichtbaren Effekte lassen sich mit der Konzentration an verbleibendem extrazellulären Kalzium erklären. Durch die äquimolare Zugabe von CaCl2 und EGTA wird das Kalzium nahezu vollständig gebunden, somit ist die verbliebene extrazelluläre Kalziumkonzentration der der Kontrolle ohne EGTA und ohne Kalzium nahezu gleich. Der Chelator selbst interferiert 4. Ergebnisse 42 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ weder mit dem Assay, noch zeigt er in dem für die Experimente gewählten Bereich weitere Effekte auf die Zellen. Das gleiche Experiment wurde für Tag 3 durchgeführt. Auch hier fanden sich keine Anhaltspunkte für nicht erwünschte Effekte auf die Zellen. Somit ist EGTA zur Einstellung des extrazellulären Kalziums für weitere Versuche geeignet. Abb. 4.5 Prüfung der Toxizität von EGTA nach 48-stündiger Inkubation. Die parentale Zelllinie (par) sowie die Mutanten CJ1 und CJ5 wurden für 48 Stunden mit 1 mM EGTA inkubiert. Zusätzlich wurde 1 mM CaCl2 zugefügt. Zur Kontrolle wurden Wells ohne Kalzium und ohne EGTA (0mM EGTA/ 0 mM CaCl2) pipettiert. Die Abbildung zeigt ein einzelnes Experiment; Mittelwerte und Standardabweichungen wurden aus Triplikaten ermittelt. 4. Ergebnisse 43 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 4.5. Überprüfung der Eignung von BAPTA als Kalziumchelator für Proliferationsexperimente BAPTA ist ein dem EGTA ähnlicher Kalziumchelator, der sich laut Literatur durch eine ebenso hohe Selektivität für Kalzium wie EGTA auszeichnet (Kd: 107 nM). BAPTA ist jedoch schneller in der Aufnahme bzw. Abgabe von Kalziumionen und wird weniger von Änderungen des pH-Wertes beeinflusst (Tsien, 1980). Aufgrund dieser Eigenschaften ist BAPTA für Proliferationsexperimente als Modulator extrazellulärer Kalziumkonzentrationen interessant und muss ebenso wie EGTA zunächst auf toxische Eigenschaften auf das Zellwachstum, die nicht auf die Chelation von Kalzium zurückzuführen sind, untersucht werden. Das Experiment wurde nach dem gleichen Pipettierschema wie das zur Überprüfung der Eignung von EGTA durchgeführt: Zu den Zelllinien wurden verschiedene BAPTAKonzentrationen sowie 0,5 mM bzw. 1 mM CaCl2 zugefügt, anschließend wurden die Zellen für 48 Stunden inkubiert. Aus Vorversuchen war bekannt, dass BAPTA mit dem EZ4U-Assay interferiert, daher wurde die optische Dichte mit Hilfe des WST-1-Assays bestimmt. Der WST-1-Assay funktioniert vom Prinzip her wie der EZ4U-Assay, unterscheidet sich jedoch dadurch, dass das Tetrazoliumsalz an der Plasmamembran umgesetzt wird und daher die Zellen auch nach der Messung noch lebendig sind. Der Versuch wurde in RPMI-1640 Medium ohne Phenolrot durchgeführt, da der Farbstoff „Phenolrot“ mit dem Assay interferiert und somit zu falschen Messergebnissen führen würde. Die Abbildung 4.6 zeigt zur Vereinfachung nur die wesentlichen Ergebnisse des Experiments. Es ist deutlich zu erkennen, dass BAPTA trotz Zugabe einer äquimolaren Menge CaCl2 Effekte auf das Zellwachstum zeigt. Diejenigen Zellen, die mit einer Konzentration von 1 mM BAPTA inkubiert wurden, scheinen trotz Zugabe von Kalzium apoptotisch zu werden und liefern nur noch sehr geringe Signale im Vergleich zu der Kontrolle, die ohne Zugabe von BAPTA pipettiert wurden (0,00 mM BAPTA/ 0 mM CaCl2). 4. Ergebnisse 44 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Abb. 4.6 Prüfung der Toxizität von BAPTA nach 48-stündiger Inkubationszeit. Die parentale Zelllinie sowie die Zelllinien CJ1 und CJ5 wurden mit 1mM BAPTA und äquimolarer Zugabe von CaCl2 für 48 Stunden inkubiert. Als Kontrollen wurden Zellen ohne BAPTA und ohne Kalzium inkubiert (0 mM BAPTA/ 0 mM CaCl2). Die Abbildung zeigt ein einzelnes Experiment. Die Daten wurden aus Triplikaten bestimmt und als Mittelwert + Standardabweichung gezeigt. BAPTA scheint neben der Eigenschaft als Kalziumchelator noch weitere Effekte auf die Zellen zu haben, die für unsere Experimente ungeeignet sind, da nur die Konzentration des extrazellulären Kalziums modifiziert werden soll. Für die weiteren Experimente zur Bestimmung der Kalzium-abhängigen Proliferation der T-Lymphozyten wurde daher EGTA als Kalziumchelator verwendet. 4. Ergebnisse 45 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 4.6. Unterschiede der Kalzium-abhängigen Proliferation der parentalen Zelllinie und der Zelllinien CJ1 und CJ5 Das Hauptinteresse dieser Arbeit gilt der Kalzium-abhängigen Proliferation von TLymphozyten. Diese sollte mit Hilfe der parentalen Zelllinie, die normale CRACKanalaktivität zeigt, sowie der Mutanten CJ1 und CJ5, die durch einen verminderten Strom durch den CRAC- Kanal charakterisiert sind, untersucht werden. Durch die Modifikation der extrazellulären Kalziumkonzentration mit Hilfe von EGTA sollte diejenige Kalziumkonzentration bestimmt werden, bei der 50 % der Zellen noch vital sind. Die Experimente wurden alle in 96-Well-Platten durchgeführt. Alle drei Zelllinien wurden mit verschiedenen EGTA- Konzentrationen inkubiert und an Tag 2 mit Hilfe des EZ4U-Assays gemessen. Die folgende Abbildung 4.7 zeigt eine repräsentative Messung. Abb. 4.7 Proliferation der parentalen Zelllinie sowie der Zelllinien CJ1 und CJ5 unter variierenden Kalziumkonzentrationen. Die extrazelluläre Kalziumkonzentration wurde mit Hilfe von EGTA erniedrigt. Die Abbildung zeigt eines aus 15 Experimenten, wobei die Proliferation der Zellen in normalem Medium (ohne EGTA) auf 100 % gesetzt wurde. Die Daten wurden aus Triplikaten ermittelt, abgebildet sind Mittelwerte und Standardabweichungen. 4. Ergebnisse 46 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Für jedes einzelne Experiment wurden in Igor Pro die IC50-Werte des EGTA für die parentalen Zellen sowie die Zelllinien CJ1 und CJ5 ermittelt. Die folgende Abbildung 4.8 zeigt einen in Igor Pro erstellten repräsentativen Fit der Zelllinie CJ1 für das in Abbildung 4.7 gezeigte Experiment. Abb. 4.8 Ermittlung des IC50-Wertes in Igor Pro für die Zelllinie CJ1. Aufgetragen wurden die gemessenen Signale zu den entsprechenden EGTA-Konzentrationen. Mit Hilfe einer Funktion in Igor Pro wurde der Verlauf der Kurve und die dem IC50-Wert entsprechende EGTA-Konzentration bestimmt. Der Verlauf der Kurven wird durch folgende Funktion bestimmt: y = max- max/(1+exp((xhalf-x)/rate))) + min Die Variable „xhalf“ entspricht dem von uns gesuchten halbmaximalem x, also dem IC50-Wert. „Max“ entspricht dem Maximum, die Variable „rate“ gibt die Steilheit der Kurve wieder. Die Variable „min“ gibt die Eigenschaft der Kurve wieder, bei unendlich großem x gegen einen minimalen Wert zu streben. Bei der Verwendung dieser Fit- Funktion entspricht das Maximum der Kurve der Summe aus „max“ + „min“. Für die meisten Experimente ist min = 0, da die Zellen bei nicht vorhandenen freien extrazellulären Kalziumionen nicht proliferieren können. 4. Ergebnisse 47 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Für die in Abbildung 4.8 gezeigte Kurve gelten folgende Werte: max = 0,599, xhalf = 0,749, rate = 0,034, min = 0. Nach der Bestimmung der IC50-Werte der einzelnen Zelllinien für jedes Experiment ergeben sich folgende Mittelwerte für Tag 2 (s. Abb. 4.9): Parentale Zelllinie: 0,762 mM EGTA ± 0,0087 CJ1: 0,733 mM EGTA ± 0,0088 s. Kapitel 4.7 zur Bestimmung der CJ5: 0,739 mM EGTA ± 0,0117 entsprechenden Kalziumkonzentrationen Abb. 4.9 Darstellung der IC50-Werte der parentalen Zelllinie und der Zelllinien CJ1 und CJ5 für Tag 2. Abgebildet sind Mittelwerte ± SEM aus 15 Experimenten. Die einzelnen IC50-Werte wurden in Igor Pro ermittelt. Die Signifikanz der sichtbaren Unterschiede wurde mit einem gepaarten, nach zwei Seiten offenen t-Test überprüft. Die IC50-Werte der parentalen Zelllinie unterscheiden sich hoch signifikant von denen der Zelllinie CJ1 (p<0,005 für n=11 Datenpaare) und unterscheiden sich signifikant von denen der Zelllinie CJ5 (p<0,05 für n=11 Datenpaare). Zwischen den Zelllinien CJ1 und CJ5 lässt sich statistisch kein Unterschied nachweisen. 4. Ergebnisse 48 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 4.7. Bestimmung der Kalzium-Konzentration in RPMI-1640 Medium Die unter Kapitel 4.6 beschriebenen halbmaximalen EGTA-Konzentrationen sollten noch in Kalziumkonzentrationen umgerechnet werden. Daher wurden mit Hilfe einer Eichgerade die Kalziumkonzentrationen in mit EGTA versetztem RPMI-1640 Medium bestimmt. Zur Berechnung des freien Kalziums nach der Formel von Grynkiewicz et al., 1985) ([Ca2+]= Kd*(x-Rmin)/(Rmax-x) müssen die Werte für Rmin und Rmax bestimmt werden. Dazu wurde ein Kalzium-Imaging-Experiment mit dem Farbstoff MagFura für Ringer-Lösungen mit einem Kalziumgehalt von 0-30 mM durchgeführt (Die Lösungen wurden freundlicherweise von Bettina Strauß hergestellt). MagFura wurde daher verwendet, da es eine hohe Selektivität für Kalziumionen mit einer Dissoziationskonstante von 25 µM aufweist und daher für die zu messenden Lösungen geeignet war. Abb. 4.10 Eichgerade zur Bestimmung des freien Kalziums. Gezeigt ist der relevante Bereich zur Umrechnung der in Kap. 4.6 bestimmten EGTA-Konzentrationen. Die gemessenen Ratios (340nm/380nm) aus zwei Experimenten wurden gegen die eingesetzten Kalziumkonzentrationen aufgetragen. Der mittlere Verlauf der Kurven wurde in Igor Pro berechnet. 4. Ergebnisse 49 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Hieraus leitet sich folgende Formel zur Errechnung des freien Kalziums ab: [Ca2+] = 1689,12*((x-247,56)/(10482,9-x)) Desweiteren mussten experimentell nach der gleichen Methode die entsprechenden Ratios zu dem mit verschiedenen EGTA-Konzentrationen versetzten RPMI-1640 Medium bestimmt werden. Die daraus mit oben gezeigter Formel bestimmten Kalziumkonzentrationen wurden in Igor Pro gegen die entsprechenden EGTA- Konzentrationen aufgetragen und mit einer doppeltexponentiellen Funktion gefittet. Daraus ergab sich die in Abb. 4.11 gezeigte Kurve, die durch die Formel y = -4,56441 + 2112,64*exp(-6,8417*x) + 2574,56* exp( -6,83486*x) beschrieben wird. Mit Hilfe dieser Formel ist es möglich, jede verwendete EGTA- Konzentration in die entsprechende Kalzium-Konzentration umzurechnen. Abb. 4.11 Doppelt-exponentieller fit zur Errechnung von Kalzium-Konzentrationen bei bekannter EGTAKonzentration. Die aus den gemittelten Ratios zweier Experimente errechneten Kalzium-Konzentrationen wurden gegen die entsprechenden EGTA-Konzentrationen aufgetragen. In Igor Pro wurde der Verlauf der abgebildeten Kurve errechnet, die es ermöglicht, für alle EGTA-Konzentrationen die entsprechenden Kalzium-Werte zu bestimmen. 4. Ergebnisse 50 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Für die halbmaximalen EGTA- Konzentrationen an Tag 2 ergeben sich somit folgende Kalzium-Konzentrationen: Parentale Zelllinie: 0,762 mM EGTA ⇒ 21,0 µM Ca2+ CJ1: 0,733 mM EGTA ⇒ 26,6 µM Ca2+ CJ5: 0,739 mM EGTA ⇒ 25,4 µM Ca2+ Unter nicht modifizierter extrazellulärer Kalziumkonzentration sind keine Unterschiede im Wachstumsverhalten der parentalen Zelllinie und der Zelllinien CJ1 und CJ5 zu beobachten. Erst unter stringenten Bedingungen werden die Effekte des reduzierten Stroms über den CRAC-Kanal sichtbar. Die Mutanten CJ1 und CJ5 sind durch einen verminderten Strom charakterisiert, der zur Folge hat, dass die Zellen nur unter vermehrtem extrazellulären Kalzium einen zur Proliferation ausreichenden Strom und damit ein ausreichendes Kalzium-Niveau aufrecht erhalten können. 4. Ergebnisse 51 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 4.8. Blockade des CRAC- Kanals mittels BTP2 Die Kapitel 4.6 und 4.7 zeigen die Kalzium-abhängige Proliferation von Zelllinien, die durch verschiedene Ströme über den CRAC- Kanal charakterisiert sind. Die Zelllinien CJ1 und CJ5, die durch einen verminderten Strom charakterisiert sind, benötigen ein erhöhtes extrazelluläres Kalzium, um eine der parentalen Zelllinie adäquate Proliferation zu erreichen. Uns interessierte nun, ob eine sehr starke Inhibierung des CRAC-Kanals mittels des Pyrazol-Derivats BTP2 (Zitt et al., 2004) unterschiedliche Effekte auf die Proliferation der verschiedenen Zelllinien aufweist. BTP2 blockiert selektiv den CRAC-Kanal mit einem IC50-Wert von ~100nM, ohne mit anderen für die Kalziumhomöostase wichtigen Zellmechanismen zu interagieren. Um die Auswirkungen eines starken CRAC-Kanal-Blocks auf die Zellen zu untersuchen, wurden die parentale Zelllinie sowie die Zelllinien CJ1 und CJ5 in 96-Well Platten unter verschiedenen EGTA- Konzentrationen mit 400 nM BTP2 inkubiert. Die EGTA- Konzentrationen wurden so gewählt, dass sie den in Kapitel 4.6 ermittelten kritischen Bereich abdecken. An Tag 2 wurde die Zelldichte mittels des EZ4U-Assays gemessen. Abbildung 4.12 zeigt die Mittelwerte aus 11 Experimenten für die parentale Zelllinie und aus jeweils 6 Experimenten für die Zelllinien CJ1 und CJ5. Abb. 4.12 CRAC-Kanal-Block durch BTP2. Abgebildet sind Mittelwerte + SEM der parentalen Zellen (11 Experimente) und der Zelllinien CJ1 und CJ5 (jeweils 6 Experimente) in Prozenten. Für jede Zelllinie wurden nebeneinander die Mittelwerte ohne und mit Behandlung von BTP2 aufgetragen. Das Signal der Zellen, die ohne EGTA und BTP2 inkubiert wurden, wurde auf 100 % gesetzt. 4. Ergebnisse 52 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Bei EGTA- Konzentrationen zwischen 0,00 und 0,72 mM sind für die zusätzlich mit BTP2 inkubierten Zellen keine signifikanten Reduktionen der Zelldichte sichtbar. Erst unter stark limitiertem extrazellulärem Kalzium im Bereich des in Kapitel 4.7 ermittelten IC50-Wertes ist eine signifikante Reduktion vorhanden. Der gepaarte, nach zwei Seiten offene t-test ergab für eine Konzentration von 0,75 mM EGTA im Vergleich der CRAC- Kanal blockierten bzw. nicht-blockierten Zellen folgende Signifikanzen: Parentale Zellen unterscheiden sich hoch signifikant (p<0,005), die Zelllinien CJ1 und CJ5 zeigen jeweils einen signifikanten Unterschied (p<0,05). Auch unter 0,80 mM EGTA sind noch signifikante Effekte des BTP2 auf die Zellen sichtbar (parentale Zellen: p<0,005, CJ1: p<0,05, CJ5: p=0,05), allerdings sind im Durchschnitt nur noch 20 % der Zellen lebendig, was die Aussagekraft dieser Werte relativiert. Zusammenfassend ist festzustellen, dass eine Blockade des CRAC- Kanals mittels BTP2 nur unter limitierten extrazellulären Kalziumkonzentrationen das Wachstum der T-Zellen reduziert. Ein möglicher Grund dafür ist die Tatsache, dass die Jurkat-Zelllinie aus Leukämie-Zellen entstanden ist, die proliferieren, ohne irgendeinen Stimulus zu benötigen. Aufgrund dieses enormen Proliferationsvermögens ist es möglich, dass der Effekt von BTP2 nur dann nachweisbar ist, wenn die Zellen durch Reduktion der extrazellulären Kalziumkonzentration in ihrer Wachstumsfähigkeit so eingeschränkt sind, dass der CRAC-Kanal für das weitere Überleben essentiell wird. Die BTP2-Experimente implizieren weiterhin, dass ein sehr geringer Kalziumeinstrom über den CRAC-Kanal für die Proliferation der Zellen ausreicht. Die möglichen Ursachen für das reduzierte Wachstum der T-Zellen nur unter limitierten extrazellulären Kalziumkonzentrationen werden in Kapitel 5 genauer diskutiert. 4. Ergebnisse 53 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 4.9. Bestimmung der Proliferation und der intrazellulären Kalziumkonzentration am Beispiel der parentalen Zelllinie und der Zelllinie CJ1 – Kompensation des CRACDefekts? Im Rahmen ihrer biologischen Facharbeit untersuchte Katherina Waggershauser in unserer Arbeitsgruppe die intrazelluläre Kalziumkonzentration der Zelllinie CJ1 nach 48- bzw. 72stündiger Inkubation mit EGTA. Bei allen Zellen stellte sich je nach zugegebener EGTAKonzentration eine intrazelluläre Gleichgewichtskonzentration ein, die für Tag 2 (48h) und Tag 3 (72h) gleich war. Die Ergebnisse wurden in Igor Pro gefittet und sind in der folgenden Abbildung 4.13 links gezeigt. Die unter verschiedenen EGTA- Konzentrationen gemessenen intrazellulären Kalziumkonzentrationen wurden mit den entsprechenden Proliferationsdaten, die in den vorigen Abschnitten erläutert wurden, korreliert. Die daraus folgende Grafik ist in der Abbildung 4.13 rechts dargestellt. Abb. 4.13 Kompensation des CRAC- Defekts bei der Zelllinie CJ1. Die linke Abbildung zeigt die Bestimmung der intrazellulären Kalziumkonzentration bei variierenden EGTA- Konzentrationen (gemessen und ausgewertet von Katherina Waggershauser), rechts ist die Korrelation der intrazellulären Kalziumkonzentration mit der Proliferation gezeigt. Die Proliferation wurde an Tag 2 mittels des EZ4U-Assays gemessen, die intrazellulären Kalziumkonzentrationen sind die Mittelwerte aus > 3000 gemessenen Zellen an Tag 2 und 3. Aufgrund der hohen gemessenen Zellzahl und der Einstellung einer intrazellulären Gleichgewichtskonzentration sind keine Standradabweichungen in der Abbildung zu erkennen. Dargestellt sind jeweils die einzelnen Messpunkte der parentalen Zelllinie sowie der Zelllinie CJ1 sowie die in Igor Pro erstellten Fits. 4. Ergebnisse 54 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Die linke Abbildung verdeutlicht zunächst, dass die parentalen Zellen im Vergleich zu Zellen der Zelllinie CJ1 bei gleicher EGTA-Konzentration eine erhöhte intrazelluläre Kalziumkonzentration aufweisen. Werden nun die einzelnen Kalziumkonzentrationen mit den Ergebnissen der Proliferationsexperimente korreliert, zeigt sich, dass die Zelllinie CJ1 bei gleicher intrazellulärer Kalziumkonzentration erhöhte Proliferationsraten im Vergleich zu der parentalen Zelllinie zeigt. Es ist denkbar, dass die Zellen der Zelllinie CJ1, die einen verminderten Strom über den CRAC-Kanal aufweisen, dies über einen noch unbekannten Mechanismus kompensieren können und somit die gleiche Proliferationsrate wie die parentalen Zellen bei einer geringeren intrazellulären Kalziumkonzentration aufrecht erhalten können. 4. Ergebnisse 55 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 4.10. Bestimmung der Proliferation und des Ruhekalziums von PHA- stimulierten JurkatZellen Im Rahmen der Versuche zur Bestimmung des IC50-Wertes für EGTA an Tag 2 wurde versucht, die Zellen zusätzlich mit PHA (2µg/ml) zu stimulieren, um durch den dadurch zusätzlich entstehenden Wachstumsreiz Unterschiede in der Proliferation der Zelllinien besser verdeutlichen zu können. Zellen der Jurkat-Zelllinie benötigen im Gegensatz zu peripheren Blutlymphozyten in der Regel keinen zusätzlichen Stimulus, um proliferieren zu können, da sie, wie in Kapitel 4.8 bereits erwähnt, aus Leukämie-Zellen abstammen. Bei einer zusätzlichen Stimulation mit PHA müsste jedoch verstärkt der T-Zell-Rezeptor aktiviert werden und über die Signaltransduktionskaskade zu einem erhöhten intrazellulären Kalzium und einer verstärkten Proliferation führen. Überraschenderweise konnte beobachtet werden, dass die stimulierten Zellen im Vergleich zu den unstimulierten Zellen schlechter proliferieren. Für uns stellte sich dann die Frage, inwiefern das verminderte Wachstum mit der intrazellulären Kalziumkonzentration korreliert. Zur Überprüfung dieser Fragestellung wurde das Ruhekalzium der Zellen in 96-Well-Platten untersucht, parallel dazu wurde die Proliferation bestimmt. Abbildung 4.14 zeigt die reduzierte Proliferation der mit PHA stimulierten Zellen, in Abbildung 4.15 ist das Ruhekalzium von unstimulierten und stimulierten Jurkat- Zellen gezeigt. Abb. 4.14 Erniedrigte T- Zell- Proliferation bei PHA- Zugabe. Gezeigt ist die Proliferation der parentalen Zelllinie und der Zelllinien CJ1 und CJ5 in Abhängigkeit von PHA unter normalem extrazellulärem Kalzium. Die Proliferation der Zellen ohne PHA wurde auf 100 % gesetzt. Die Abbildung zeigt Mittelwerte + SEM aus zwei Experimenten. Die Daten der einzelnen Experimente wurden jeweils aus Triplikaten errechnet. 4. Ergebnisse 56 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Abb. 4.15 Messung des Ruhekalziums von unstimulierten im Vergleich zu stimulierten T-Zellen. Die Grafik zeigt den Anstieg des intrazellulären Kalziums unter Zugabe von PHA (+) im Vergleich zu Kontrollen ohne PHA (-). Die intrazelluläre Kalziumkonzentration wurde mittels des Fura-2 Farbstoffes in einer 96-Well-Platte gemessen. Abgebildet sind Mittelwerte + SEM der parentalen Zelllinie (n=4) sowie der Zelllinien CJ1 (n=1) und CJ5 (n=2). Die Daten der einzelnen Versuche wurden aus Triplikaten ermittelt. Die parentale Zelllinie zeigt unter Zugabe von PHA eine im Mittel um 12,7 % erniedrigte Proliferation, die Zelllinie CJ1 um 21,1 % und die Zelllinie CJ5 um 13,7 %. Gleichzeitig findet sich bei der parentalen Zelllinie eine um 52 % erhöhte intrazelluläre Kalziumkonzentration bei Behandlung mit PHA, die Zelllinie CJ1 zeigt ein um 76 % und die Zelllinie CJ5 ein um 58 % erhöhtes intrazelluläres Kalzium. Beim Vergleich dieser Zahlen findet sich für die Zelllinien eine Korrelation zwischen Proliferationsabnahme und Steigerung des intrazellulären Kalziums. Auch unter Erniedrigung des extrazellulären Kalziums mittels verschiedener EGTAKonzentrationen zeigt sich für alle Zelllinien unter Zugabe von PHA eine im Mittel um 21 % geringere Proliferation (Daten nicht gezeigt). 4. Ergebnisse 57 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 4.11. Apoptose von PHA- stimulierten Jurkat- Zellen Im vorigen Kapitel wurde die verminderte Proliferation von PHA- stimulierten Jurkat T-Zellen beschrieben. Diese zeigten gleichzeitig erhöhte intrazelluläre Kalziumkonzentrationen. Da die Zellen einen eng regulierten Kalziumhaushalt haben, ist es möglich, dass das erhöhte intrazelluläre Kalzium zur erhöhten Apoptoseraten führt, die dann gleichzeitig als verminderte Proliferation auffallen. Daher wurde versucht, parallel zur Proliferation Schlüsse über die Apoptoserate mittels des Nachweises der Aktivität der Apoptose-ausführenden Caspasen -3 und –7 mittels Chemilumineszenz ziehen zu können. In Abbildung 4.16 ist eines von zwei Experimenten zur Bestimmung der Caspaseaktivität dargestellt. Beide Experimente zeigten identische Ergebnisse. Abb. 4.16 Apoptose von unstimulierten und stimulierten Jurkat- Zelllinien. Abgebildet ist die Aktivität der Caspasen -3 und -7 in parentalen Zellen (schwarz, grau), in der Zelllinie CJ1 (rot, weiß) und in der Zelllinie CJ5 (grün, hellgrün). Die Zugabe von PHA ist mit (+), Kontrollen ohne PHA sind mit (–) gekennzeichnet. Die Grundaktivität der Caspasen –3 und –7 in unstimulierten Zellen unter nicht modifizierter extrazellulärer Kalziumkonzentration wurde auf 1 gesetzt. Die Grafik zeigt eines der zwei Experimente. Die aufgesetzten Balken geben die Standardabweichungen der gemessenen Triplikate wieder. 4. Ergebnisse 58 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Beide Versuche zur Bestimmung der Caspase-Aktivität in unstimulierten und stimulierten Jurkat- Zellen zeigen, dass die Aktivität in stimulierten parentalen Zellen und in stimulierten Zellen der Zelllinie CJ5 unter normaler extrazellulärer Kalziumkonzentration leicht erhöht ist. Im zweiten Experiment zeigt auch die Zelllinie CJ1 unter Stimulation eine um 26 % erhöhte Caspase-Aktivität. Die Zusammenfassung beider Experimente zeigt eine Steigerung der Apoptoserate bei Stimulation um 19,6 % für die parentale Zelllinie, um 8,2 % für die Zelllinie CJ1 und eine Steigerung um 64,8 % für die Zelllinie CJ5. Unter Reduktion des extrazellulären Kalziums in den Bereich des ermittelten IC50-Wertes zeigen sich insgesamt um den Faktor 2,5 bis 3,5 erhöhte Caspase-Aktivitäten. Diese Daten korrelieren mit der in Abbildung 4.7 abnehmenden Proliferation bei sinkendem extrazellulärem Kalzium. Dabei ist die Caspase-Aktivität der mit PHA stimulierten parentalen Zelllinie um im Mittel 8,6 % im Vergleich zu nicht stimulierten Zellen erniedrigt, die der Zelllinie CJ1 um 30,9 % und die der Zelllinie CJ5 um 18,2 % (Zusammenfassung für n=2 Versuche). PHA steigert also unter nicht modifizierter Kalziumkonzentration die Aktivität an Caspase –3 und -7 und somit die Apoptoserate gering, bei erniedrigten extrazellulären Kalziumkonzentrationen im Bereich des IC50-Wertes mindert PHA jedoch die Aktivität der Apoptose-ausführenden Caspasen. 4. Ergebnisse 59 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 4.12. Kalziumsignal-Messung als Vitalitätskontrolle der isolierten peripheren Blutlymphozyten (PBLs) Im Rahmen der weiteren Experimente sollte die Stimulierbarkeit humaner, primärer T-Zellen untersucht werden. Um nach deren Isolation ein Auswahlkriterium für die Vitalität der Zellen zu haben, wurde eine Messung induzierbarer Kalziumsignale mit Hilfe des Fura-2-Farbstoffes durchgeführt. In Abbildung 4.17 ist der Verlauf einer Messung der intrazellulären Kalziumkonzentration zu sehen. Zunächst wurden die Kalziumspeicher mit Thapsigargin entleert. Thapsigargin blockiert den Rücktransport des intrazellulären Kalziums über die SERCA-Pumpe (SERCA= Sarcoendoplasmatic-reticulum-Ca2+-ATPases) in das endoplasmatische Retikulum. Das Kalziumsignal in der Zelle steigt kurz an und fällt anschließend wieder ab, da die Kalzium-ATPase in der Plasmamembran das Kalzium aus der Zelle transportiert. Das in der kalziumfreien Lösung zusätzlich enthaltene EGTA bindet das aus der Zelle freiwerdende Kalzium. Im Anschluss an die 0 mM Ca2+-Lösung wurde eine 1 mM Ca2+-Lösung mit Thapsigargin eingespült. Da die intrazellulären Speicher zuvor entleert wurden, ist der Kalzium-abhängige Kalziumkanal (CRAC-Kanal), der ein Speicher-aktivierter Kanal ist (SOC= Store operated channel) geöffnet, was zu einem raschen Kalziumeinstrom und einem starken Anstieg des Signals führt. Nach der Zugabe einer kalziumfreien Lösung sinkt das Signal wieder ab, da kein Einstrom mehr möglich ist und das sich intrazellulär befindende Kalzium aus der Zelle transportiert wird, wo es wiederum von dem sich in der Lösung befindenden EGTA gebunden wird. Die Abbildung 4.17 zeigt ein repräsentatives Ergebnis einer Messung der intrazellulären Kalziumkonzentration in PBLs. Die Kalziumkonzentration verhält sich proportional zur Ratio 340nm/380nm in den einzelnen Zellen und kann mit der Formel von Grynkiewicz et al., 1985, bei bekanntem Rmin und Rmax berechnet werden. 4. Ergebnisse 60 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Abb. 4.17 Kalziummessung als Vitalitätskontrolle der isolierten PBLs. Gezeigt ist der Verlauf der intrazellulären Kalziumkonzentration ([Ca2+]i [nM]) von 332 gemessenen Zellen unter verschiedenen Kalziumlösungen. Die Lösungswechsel fanden bei 100 s, 600 s und 1100 s statt. Die intrazellulären Kalziumkonzentrationen wurden aus den gemessenen Ratios mit Hilfe der Formel von Grynkiewicz et al. berechnet. Die gezeigten Bildausschnitte zeigen jeweils Momentaufnahmen der intrazellulären Kalziumkonzentration der PBLs im Verlauf der Messung. Es ist zu sehen, dass die PBLs nach der Isolation aus Depletionsfiltern adäquat auf Stimuli, die Einfluss auf ihren intrazellulären Kalziumgehalt nehmen, reagieren. Das zu Beginn gemessene Ruhekalzium liegt bei etwa 60 nM, demnach sind die PBLs nicht voraktiviert. Sie sind somit in Bezug auf das von uns untersuchte Kriterium für weitere Proliferationsexperimente geeignet. 4. Ergebnisse 61 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 4.13. Bestimmung des Anteils an T- und B-Lymphozyten der isolierten PBLs Die isolierten PBLs wurden nach der der Vitalitätskontrolle dienenden Kalziummessung gefärbt, um den Anteil an T- und B-Lymphozyten aus den isolierten Zellen bestimmen zu können. Abbildung 4.18 zeigt einen Ausschnitt aus einer Färbung, die mittels eines RPEmarkierten CD3- Antikörpers T-Lymphozyten und mittels eines FITC- markierten CD19Antikörpers B-Lymphozyten darstellt. Abb. 4.18 Antikörperfärbung von isolierten peripheren Blutlymphozyten. Links ist ein Ausschnitt eines Durchlichtbildes mit 61 Zellen zu sehen. Rechts daneben sind die mit einem RPE- markierten CD3-Antikörper gefärbten T-Lymphozyten zu sehen. Ganz rechts ist die Färbung der B-Lymphozyten mittels eines FITCmarkierten CD19-Antikörpers dargestellt. 47 der im Durchlichtbild gezeigten Zellen lassen sich mit dem CD3Antikörper färben (77,1 %), 7 mit dem CD19- Antikörper (11,5 %). Dies entspricht in etwa dem aus 6 Isolationen errechnetem Mittelwert (s.u.) Auf die oben dargestellte Art wurden isolierte Zellen aus sechs Depletionsfiltern (n=3122 Zellen) untersucht. Die isolierten Zellen setzten sich zu 74,6 ± 3,1 % aus T-Lymphozyten und zu 9,7 ± 1,6 % aus B-Lymphozyten zusammen. Die Zusammensetzung der Restpopulation wurde nicht untersucht. Zwei weitere Filter wurden mit drei Antikörpern gegen CD4, CD8 und CD19 gefärbt. Daraus lässt sich die T-Zell-Population genauer in T-Helfer- und T-Killerzellen unterscheiden. Von insgesamt 936 untersuchten Zellen gehörten 61,6 ± 1,6 % zu der Population der CD4-positiven T-Helferzellen, 12,9 ± 2,2 % zu den CD8-positiven T-Killerzellen und 17,7 ± 3,7 % zu den CD19-positiven B-Lymphozyten. Auch hier kann keine Aussage über die Zusammensetzung der Restpopulation gemacht werden. 4. Ergebnisse 62 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 4.14. Proliferation von PHA- stimulierten PBLs Im Kapitel 4.9 wurde gezeigt, dass PHA- stimulierte Jurkat T-Zellen schlechter proliferieren. Im Anschluss wurde auch die Proliferation von PHA-stimulierten nativen Blutlymphozyten untersucht. Dazu wurden unterschiedliche Anfangszellzahlen der PBLs von vier Patienten mit 2µg/ml PHA für 48 Stunden inkubiert und gemessen. Im Gegensatz zu den Zelllinien ist beo primären T-Lymphozyten ein Wachstumsanstieg unter Stimulation mit PHA zu erkennen. Im Mittel ist die Proliferation bei einer Anfangszellzahl von 100000 Zellen/Well um 125 ± 46 % erhöht, bei einer Anfangszellzahl von 75000 Zellen um 139 ± 26 %, bei 50000 Zellen um 128 ± 10 % und bei 25000 Zellen um 63 ± 27 %. Die Abbildung 4.19 zeigt ein repräsentatives Proliferationsexperiment mit stimulierten und unstimulierten PBLs eines Patienten. Abb. 4.19 Proliferationssteigerung von stimulierten gegenüber unstimulierten PBLs eines Patienten. Gezeigt sind die mit Hilfe des Chemilumineszenzassays CellTiterGlo gemessenen Signale der unstimulierten und stimulierten primären T-Lymphozyten eines Patienten. Die Mittelwerte und Standardabweichungen wurden aus Triplikaten ermittelt. Abgebildet sind die repräsentativen Daten der Zellen eines aus insgesamt vier Depletionsfiltern. Im Gegensatz zur Jurkat T-Zelllinie zeigen periphere Blutlymphozyten bei Zugabe von PHA eine hohe Proliferationssteigerung. PHA wurde für weitere Experimente mit Bead- stimulierten PBLs als Positivkontolle zur Wachstumsinduktion verwendet. 4. Ergebnisse 63 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 4.15. Induktion von Apoptose in PBLs Parallel zu den Proliferationsexperimenten mit stimulierten PBLs sollte auch deren Apoptose gemessen werden. Dies sollte durch die Bestimmung der Aktivität der Caspasen –3 und –7 mittels des Caspase –3/7 Glo Assays erfolgen. Diese Caspasen sind die Effektorcaspasen der Apoptose. Um den Verlauf der Caspase-Aktivität in unseren Zellen bestimmen zu können, sollte eine Kinetik in den PBLs über einen Zeitverlauf von Tag 0 bis Tag 3 gemessen werden. Dazu wurde eine Substanz benötigt, die in den Zellen maximal Apoptose, jedoch keine Nekrose auslöst. Als Indikatoren zur Apoptose wurden Thapsigargin, Doxorubicin und 5’-FluorDesoxyuridin getestet. Für Thapsigargin wurde zunächst mittels eines Proliferationsexperimentes der Bereich des IC50Wertes in Jurkat-Zellen und in primären T-Lymphozyten bestimmt. Die ThapsigarginKonzentration, bei der 50 % der Zellen noch lebendig sind, liegt zwischen 0,5 und 1 µM. Zur Bestimmung der Caspase-Aktivität wurden dann in PBLs Konzentrationen von 50 und 250 nM eingesetzt, da die Zellen zwar eine möglichst hohe Aktivität an Caspase –3 und –7 zeigen, jedoch immer noch lebendig sein sollten. In diesen Konzentrationen ließ sich jedoch nur unzureichend Apoptose induzieren. Doxorubicin löst sowohl in unstimulierten als auch in stimulierten Blutlymphozyten Apoptose aus (Ferraro et al., 2000). Der IC50-Wert liegt für unstimulierte PBLs zwischen 0,3 und 1 µM. Für PHA-stimulierte primäre Lymphozyten liegt der Bereich in höheren Konzentrationen, wurde jedoch nicht mehr genauer bestimmt. Doxorubicin wurde bei unstimulierten PBLs in Konzentrationen von 100 und 200 µM verwendet, war jedoch zum Auslösen von Apoptose ungeeignet, da es mit dem von uns verwendeten Caspase -3/7 Glo Assay Interferezen zeigte. 5’-Fluor-Desoxyuridin wurde in einer Konzentration von 100 nM getestet. Diese Konzentration löst bei PBLs Apoptose aus. Die Signale waren in etwa so stark wie die der Bead-stimulierten Zellen und vierfach höher als die der unstimulierten Zellen. 5’-Fluor-Desoxyuridin induzierte keine maximale Aktivität der Caspasen –3 und –7, war jedoch im Vergleich zu den anderen getesteten Substanzen am ehesten zur Auslösung von Apoptose in PBLs geeignet. Zur Messung einer Kinetik der Caspasen –3 und –7 wurde 5’-Fluor-Desoxyuridin daher zur Induktion der Apoptose eingesetzt. 4. Ergebnisse 64 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 4.16. Kinetik von Caspase –3 und –7 Um für die Experimente zur Bestimmung von Apoptose in unstimulierten und stimulierten Zellen eine Aussage über das Stadium der Apoptose treffen zu können, wurde eine Kinetik der Effektorcaspasen –3 und –7 gemessen. Sie sollte Aufschluss darüber geben, an welchem Tag die Zellen ein Maximum an Apoptose zeigen. Dazu wurde der Verlauf der Caspase-Aktivität der PBLs über einen Zeitraum von Tag 0 bis Tag 3 bestimmt. Es wurden PHA-stimulierte und unstimulierte Zellen jeweils mit und ohne 5’-Fluor-Desoxyuridin pipettiert und die Aktivität der Caspasen mittels des Caspase –3/7 Glo Assays gemessen. Die folgende Abbildung 4.20 zeigt das Experiment zur Bestimmung der Caspase-Kinetik. Abb. 4.20 Kinetik der Aktivität der Caspasen –3 und –7 in primären peripheren Blutlymphozyten. Die Aktivität der Caspasen wurde mittels des Caspase –3/7 Glo Assays über einen Zeitraum von drei Tagen bestimmt (0h, 24h, 48h, 72h). Der schwarze Balken zeigt mit PHA (2µg/ml) stimulierte Zellen, die zusätzlich mit 100 nM 5’-Fluor-Desoxyuridin (5-FdUr) inkubiert wurden. Dunkelgrau sind die nur mit 5-FdUr inkubierten Zellen dargestellt, der hellgraue Balken gibt die Caspaseaktivität von stimulierten Zellen wieder. Der weiße Balken zeigt als Kontrolle unstimulierte PBLs. Die Daten wurden in einzelnen Wells bestimmt, daher kann keine Standardabweichung angegegeben werden. Die Abbildung zeigt, dass die basale Caspase-Aktivität der unterschiedlich behandelten Zellen an Tag 0 nahezu gleich ist. Mit 5-FdUr inkubierte, stimulierte Zellen zeigen an Tag 1 ein 4. Ergebnisse 65 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Maximum an Caspase-Aktivität, die sich an Tag 2 und Tag 3 auf einem niedrigeren Plateau einstellt. Unstimulierte Zellen zeigen unter Behandlung mit 5-FdUr maximale CaspaseAktivität an Tag 2, ebenso wie die Zellen, die als Kontrolle ohne Substanzzusatz inkubiert wurden. An Tag 3 weisen die mit 5-FdUr inkubierten, unstimulierten Zellen nahezu wieder basale Caspase-Aktivitäten auf. Die unbehandelten Zellen zeigen bei einer maximalen CaspaseAktivität an Tag 2 ab Tag 3 einen langsamen Abfall. Von uns wurden in den weiteren Versuchen zur Apoptose stimulierte PBLs an Tag 2 untersucht. An Tag 2 ist nach dem oben gezeigten Versuch zur Kinetik der Caspasen –3 und –7 das Aktivitätsmaximum jedoch schon überschritten. Der von uns gewählte Zeitpunkt scheint demnach nicht optimal zur Apoptosebestimmung mittels des Nachweises der Aktivität der Caspasen –3 und –7 geeignet, da es durchaus möglich ist, dass ein Teil der Zellpopulation bereits nicht mehr lebendig ist und somit die Messung beeinflusst. Eine Bestimmung der Apoptose mittels einer kombinierten Annexin/Propidiumiodid-Färbung wäre wahrscheinlich besser geeignet, wurde jedoch aus Zeitgründen nicht mehr durchgeführt. Da uns jedoch das Verhältnis der Apoptose zwischen stimulierten und unstimulierten T-Zellen und nicht die absolute Apoptoserate interessiert, sind die mittels des Caspase –3/7 Glo Assays gemessenen Daten für uns ausreichend. 4. Ergebnisse 66 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 4.17. Apoptose von PHA- stimulierten PBLs Periphere Blutlymphozyten lassen sich wie im vorigen Kapitel gezeigt, sehr effektiv mit PHA stimulieren. Wir wollten nun überprüfen, ob die stimulierten Zellpopulationen trotz des messbaren erhöhten Wachstums verstärkt apoptotisch werden. Dazu wurden die isolierten Zellen aus vier verschiedenen Depletionsfiltern auf ihren Gehalt an Caspase -3 und –7 untersucht. Die folgende Abbildung zeigt die Apoptoserate der unstimulierten und stimulierten Zellen. Abb. 4.21 Caspase-Aktivität von unstimulierten und stimulierten peripheren Blutlymphozyten. Abgebildet sind Mittelwerte und Standardabweichungen der Zellen aus vier Depletionsfiltern (F1-F4). Der Gehalt der Zellen an Caspase -3 und –7, die ohne PHA (-) inkubiert wurden, wurde auf 1 gesetzt. Zellen, die mit PHA stimuliert wurden, sind mit (+) gekennzeichnet. Die Zellen wurden mit einer Anfangszellzahl von 100000 Zellen/Well inkubiert und nach 48 Stunden gemessen. Die Abbildung zeigt, dass bei drei von vier Filtern die Apoptoserate unter Stimulation mit PHA erhöht ist. Im Mittel zeigt sich eine Erhöhung der Caspase-Aktivität um 73,6 %, jedoch schwanken die Werte, wie in der Abbildung zu sehen ist, erheblich. Ein für diese vier Filter durchgeführter nach zwei Seiten offener, gepaarter T-Test zeigt keine Signifikanz bezüglich der gemessenen Differenzen zwischen unstimulierten und stimulierten PBLs, dennoch ist aus den Daten eine Tendenz ersichtlich. Weitere Experimente werden nötig sein, um diese Daten zu bestätigen und hinsichtlich ihrer physiologischen Bedeutung deuten zu können. 4. Ergebnisse 67 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 4.18. Fokale Stimulation peripherer Blutlymphozyten Native, periphere Blutlymphozyten benötigen im Gegensatz zu Jurkat T-Zellen einen Stimulus zur Proliferation. Bisher wurde dazu PHA verwendet, ein Lectin aus Phaseolus vulgaris, das sämtliche Oberflächenrezeptoren auf den T-Zellen vernetzt und somit auch zu einer Aktivierung des T-Zell-Rezeptors führt. Da dieser Stimulus nicht spezifisch für den T-ZellRezeptor ist, sollte die Verwendung von Antikörper-beschichteten Polystyrol- Beads etabliert werden. Die folgende Abbildung 4.22 zeigt eines aus vier Experimenten zur Bead- Stimulation. Abb. 4.22 Stimulation peripherer Blutlymphozyten mittels Antikörper-beschichteter Beads. Die Signalstärke wurde an Tag 3 mittels des EZ4U-Assays gemessen. Abgebildet sind Mittelwerte und Standardabweichungen der Zellen zweier Patienten. Die Daten wurden aus Triplikaten ermittelt. Als Nullkontrolle (NK) wurden Zellen verwendet, die ohne Zugabe eines Stimulus inkubiert wurden. IgG- beschichtete Beads sollten keine Aktivierung der Zellen induzieren; sie dienen dem Ausschluss einer alleine durch Beads herbeigeführten Stimulation. Die Beads wurden den Zellen (Anfangszellzahl: 50000 Zellen/Well) im Verhältnis 1:1 zugefügt. Eingefügt ist eine Infrarot-Aufnahme eines Bead-Zell-Kontaktes (zur Verfügung gestellt von Ariel Quintana Gonzaléz). Die Abbildung zeigt, dass eine fokale Stimulation mit Beads zu einer besseren Proliferation im Vergleich zur Stimulation mit PHA führt. Dabei führt der Stimulus mit Beads, die neben einem Antikörper gegen CD3 auch mit einem Antikörper gegen das kostimulatorische Molekül CD28 4. Ergebnisse 68 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ beschichtet sind, zu stärksten Proliferation. Von sieben getesteten Patienten zeigten sechs die höchste Proliferation unter Stimulation mit anti-CD3/CD28 Beads. Ein Patient zeigte die höchste Proliferation bei PHA- stimulierten Zellen. Parallel wurden Zellen mit in Lösung zugegebenen, bzw. in die Wells beschichteten Antikörpern stimuliert, was jedoch zu keiner Steigerung der Proliferation führte. Antikörper scheinen also nur in der fokalen Stimulationsform zur Proliferationsinduktion geeignet. Für weitere Proliferationsexperimente in unserem Labor wurden nach diesen Ergebnissen antiCD3/CD28 beschichtete Beads zur Stimulation der peripheren Blutlymphozyten benutzt. 4. Ergebnisse 69 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 4.19. Apoptose fokal stimulierter Blutlymphozyten Erste Ergebnisse zur Apoptose fokal stimulierter peripherer Blutlymphozyten zeigen, dass die Stimulation mit Antikörper-beschichteten Beads zu erhöhten Apoptoseraten führt. Dabei verhält sich die Apoptose proportional zur Proliferation der Zellen. Abbildung 4.23 zeigt, dass PHA-stimulierte Zellen eine geringere Rate an Apoptose aufweisen, als fokal stimulierte Zellen. Bei fokal stimulierten Zellen zeigen alleine mit anti-CD3 beschichtete Beads kleinere Apoptoseraten als solche, die zusätzlich mit dem Kostimulus anti-CD28 beschichtet sind. Abb. 4.23 Aktivität von Caspase –3 und –7 in fokal stimulierten Zellen. Die Abbildung zeigt die mittels des Caspase-3/-7 Glo Assays gemessene Caspase-Aktivität derjenigen Zellen, deren Proliferation in Abbildung 4.20 als dunkelgrauer Balken gezeigt wurde. Die abgebildeten Daten zeigen die Messungen einzelner Wells. Die gemessenen Zellpopulationen von drei Patienten zeigen alle, dass die Apoptose von unstimulierten Zellen und Zellen, die mit anti-IgG beschichteten Beads inkubiert wurden, nahezu gleich ist. Somit ist eine allein durch die Polystyrol-Beads ausgelöste Apoptose ausgeschlossen. Weiterhin zeigen alle drei Filter, dass die fokale Antikörperstimulation zu einer höheren Caspase-Aktivität führt als die Stimulation mit PHA, wobei jeweils bei der Costimulation mit CD3 und CD28 die stärksten Signale messbar sind. Das gemessene Signal der nicht stimulierten Zellen war in allen Zellen relativ konstant, was auf eine Grundaktivität der Caspasen –3 und -7 schließen lässt. 5. Diskussion 70 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 5. Diskussion Das Thema dieser Arbeit ist die Kalzium-abhängige Proliferation von T-Lymphozyten. Insbesondere sollte die Proliferation der parentalen Jurkat T-Zelllinie sowie der daraus hervorgegangenen Mutanten CJ1 und CJ5, die durch einen verminderten Strom über den CRAC-Kanal charakterisiert sind, untersucht werden. Da mit Hilfe von Zellen aus Patienten, die einen Immundefekt aufweisen, gezeigt wurde, dass der CRAC-Kanal einen wichtigen Mechanismus im Aktivierungsweg der T-Lymphozyten darstellt und für den Kalziumeinstrom essentiell ist (Feske et al., 2001; Le Deist et al., 1995; Partiseti et al., 1994), erwartet man, dass Zellen, die an dieser Stelle einen Defekt aufweisen, schlechter proliferieren. Um diese Hypothese überprüfen zu können, wurden die Proliferationsexperimente unter stringenten Kalziumkonzentrationen durchgeführt, sodass die Kalziumabhängigkeit der Proliferation sichtbar wird und somit Rückschlüsse über die Rolle des CRAC-Kanals für den Kalziumhaushalt und die Proliferation gezogen werden konnten. Dabei wurde festgestellt, dass die verwendeten Zelllinien geringe, aber dennoch signifikante Unterschiede aufweisen. Sie benötigen unterschiedliche extrazelluläre Kalziumkonzentrationen, um ein halbmaximales Wachstum aufrecht zu erhalten. Die parentalen Zellen benötigen eine Konzentration von 21 µM, während die Zelllinie CJ1 26,6 µM und die Zelllinie CJ5 25,4 µM extrazelluläres Kalzium benötigen. Diese Tendenz entspricht den jeweiligen Strömen über den CRAC-Kanal. Die parentale Zelllinie zeigt den ursprünglich in Jurkat T-Lymphozyten vorhanden Strom (ICRAC = 100 %), wohingegen die Zelllinie CJ5 nur noch einen Strom von 41 % des Ursprungsstroms zeigt. Für die Zelllinie CJ1 ist nahezu kein Strom mehr messbar (Fanger et al., 1995). Das benötigte Kalzium zur halbmaximalen Proliferation korreliert also mit dem Defekt des Kanals. Dies bedeutet, dass die Zelllinien mit einem Defekt im Speicher-aktivierten Kalziumeinstrom mehr extrazelluläres Kalzium benötigen, um den eingeschränkten Strom ausgleichen zu können. Hoth und Penner zeigten bereits in ihrer Veröffentlichung von 1993 in Mastzellen der Ratte die Abhängigkeit des ICRAC von der extrazellulären Kalziumkonzentration (s. Abb. 5.1). 5. Diskussion 71 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Abb. 5.1 Abhängigkeit des Stroms durch den CRAC-Kanal (ICRAC) von der extrazellulären Kalziumkonzentration. Die Abbildung zeigt den relativ zum Strom bei 10 mM extrazellulärem Kalzium gemessenen ICRAC unter verschiedenen extrazellulären Kalziumkonzentrationen ([Ca2+]o). Der Strom wurde mittels IP3 und EGTA aktiviert. Der messbare ICRAC bei 10 mM extrazellulärem Kalzium wurde auf 1,0 gesetzt, der halbmaximale Strom (0,5 I/I (10mM Ca2+)) ist bei ca. 2-3 mM [Ca2+]o messbar (Die Abbildung wurde von (Hoth and Penner, 1993) entnommen). Für die Mutanten CJ1 und CJ5 wurde lediglich gezeigt, dass der Strom über den CRAC-Kanal vermindert ist. Der genaue zugrunde liegende Defekt, d.h. die molekulare Basis des Defekts, wurde jedoch in der Veröffentlichung von Fanger et al. aus dem Jahr 1995 nicht beschrieben. Philipp et al. konnten 2003 zeigen, dass das TRPC3-Gen in allen T-Zell-Mutanten, die einen Defekt des CRAC-Kanals zeigen, defekt war. Durch Wiedereinfügen der TRPC3 cDNA konnten wieder Kalziumströme über den CRAC-Kanal gemessen werden, die den ursprünglichen Kalziumströmen der parentalen Zelllinie entsprechen. Es ist also möglich, dass der Defekt im Strom auf einem Defekt im molekularen Aufbau des Kanals zurückzuführen ist, sollte das TRPC3-Protein in der Tat daran beteiligt sein. Die Schwierigkeit, die Kalziumabhängigkeit der Proliferation in den T-Lymphozyten zu untersuchen, lag darin, dass die parentale Jurkat T-Zelllinie und die daraus hervorgegangen Mutanten CJ1 und CJ5 aus Zellen einer akuten T-Zell-Leukämie hervorgegangen sind (ATCC Number TIB-152). Diese Zellen proliferieren, ohne einen exogenen Stimulus zu benötigen. 5. Diskussion 72 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Dies konnte z.B. beim Durchführen der Zellkultur beobachtet werden. Die Zellen mussten alle zwei bis drei Tage verdünnt werden, wobei die parentalen Zellen im Vergleich zu den Zelllinien CJ1 und CJ5 immer stärker verdünnt werden mussten und sich allem Anschein nach schneller vermehrten. Dieses Phänomen könnte durch den reduzierten CRAC-Strom (ICRAC) erklärt werden. In Kapitel 4.1 wurden die Ergebnisse gezeigt, die der Ermittlung einer geeigneten Zellzahl für alle folgenden Proliferationsexperimente dienen sollten. Gleichzeitig hätte man, entsprechend der Beobachtungen bei der Durchführung der Zellkultur, Unterschiede in der Proliferation von parentalen Zellen zu der Proliferation der Zelllinien CJ1 und CJ5 sehen müssen. Man würde erwarten, dass die parentale Zelllinie stärker proliferiert als die Zelllinien CJ1 und CJ5. Dies war jedoch nicht der Fall. Da ein Unterschied bei keiner der gewählten Zellzahlen in dem Bereich von anfänglichen 500 bis 1500 Zellen pro Well zu sehen war, scheint dies nicht auf einen zu starken Verbrauch von Medium oder Platzprobleme im Well zurückführbar zu sein. Wahrscheinlicher ist, dass dieser Effekt deshalb nur bei der Durchführung der Zellkultur sichtbar wird, da man in diesem Fall Zellzahlen zwischen 5*106 und 1*107 im Vergleich zu maximal 2*105 Zellen an Tag 4 des Proliferationsexperimentes betrachtet. Der für die Proliferationsexperimente verwendete EZ4U-Assay ist möglicherweise nicht sensitiv genug, um die geringen Unterschiede zwischen dem Proliferationsverhalten der einzelnen Zelllinien sichtbar zu machen. Auch lassen sich unter Ruhebedingungen keine Unterschiede im Proliferationsverhalten der parentalen Zellen im Vergleich zu dem der Mutanten CJ1 und CJ5 auflösen, da die Proliferation aufgrund der Abstammung der Zellen aus leukämischen Zellen von dem normalen Zellzyklus entkoppelt ist. Nur wenn die extrazelluläre Kalziumkonzentration so eingeschränkt ist, dass die Zellen unter Minimalbedingungen gehalten werden, werden auch geringe Effekte des defekten Stroms über den CRAC-Kanal sichtbar. Die so durchgeführten Proliferationsexperimente unter stringenten Kalziumbedingungen untermauern die Bedeutung des CRAC-Kanals für die Proliferation. Verminderte Ströme über den CRAC-Kanal in den Mutanten führen zu verminderter Proliferation, welche nur durch eine erhöhte extrazelluläre Kalziumkonzentration wieder auf Werte nahe denen der parentalen Zellen gebracht werden kann. Die Bedeutung der Kalziumabhängigkeit für die T-ZellProliferation lässt sich durch die zwei bekannten Fälle von Patienten mit einem Defekt des CRAC-Kanals in den T-Lymphozyten belegen, die infolge dessen an einer schweren Immundefizienz leiden (Le Deist et al., 1995; Partiseti et al., 1994). 5. Diskussion 73 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Um weitere Einsichten in die Beteiligung des CRAC-Kanals an der Proliferation zu erhalten, wurde der Kanal mittels des Pyrazol-Derivats BTP2 vollkommen blockiert. BTP2 wurde erstmals als YM-58483 mit der Eigenschaft, Speicher-abhängige Kanäle und die Interleukin-2 Produktion in T-Lymphozyten zu hemmen, beschrieben (Ishikawa et al., 2003). BTP2 unterscheidet sich von bisher bekannten Kalziumkanalblockern durch die hohe Selektivität für Speicher-abhängige Kanäle gegenüber Spannungs-aktivierten Kanälen. Im Gegensatz zu Econazole, dass auch die Spannungs-aktivierten Kanäle blockiert, zeigt BTP2 keine Wirkung auf das Membranpotential der T-Lymphozyten (Ishikawa et al., 2003). Im Vergleich zu SK&F96365, dem bisher am meisten verwendeten CRAC-Kanal-Blocker, weist BTP2 einen sehr viel niedrigeren IC50-Wert auf. Der Speicher-aktivierte Kalziumeinstrom wird von BTP2 mit einem IC50-Wert von ~10 nM blockiert. Allerdings ist eine Vorinkubation von mindestens zwei Stunden nötig, damit BTP2 seinen vollen Effekt entwickeln kann (Zitt et al., 2004). Für die Proliferationsexperimente wurden die Zellen über einen Zeitraum von 48 Stunden mit 400 nM BTP2 inkubiert, was einen fast vollständigen Block des CRAC-Kanals sicherstellen sollte. Unter Ruhebedingungen, d.h. nicht modifizierter extrazellulärer Kalziumkonzentration, konnte kein Unterschied in der Proliferation von BTP2-behandelten und unbehandelten Zellen gesehen werden. Nur unter limitiertem extrazellulärem Kalzium im Bereich des für Kalzium ermittelten IC50-Wertes war die Proliferation der mit BTP2 inkubierten Jurkat Zelllinien signifikant erniedrigt. Der CRAC-Kanal ist demnach von Bedeutung für die Proliferation der Zellen. Während die Lymphozyten bei nicht modifiziertem extrazellulärem Kalzium normal proliferieren können, ist dies unter stringenten Bedingungen nicht mehr möglich. Die Abbildung 5.1 zeigt die Abhängigkeit des ICRAC von der extrazellulären Kalziumkonzentration ([Ca2+]o). Je höher [Ca2+]o ist, desto größer ist der messbare Strom. Dies bedeutet, dass der ICRAC bei 0,75 mM EGTA im Medium bereits sehr stark erniedrigt ist. Werden dann durch Zugabe von BTP2 fast alle CRAC-Kanäle blockiert, reicht der Kalzium-Einstrom nicht mehr zur Aufrechterhaltung der Proliferation aus. Wieso jedoch stoppt die Proliferation nicht auch ohne Senkung der extrazellulären Kalziumkonzentration bei einem Block des CRAC-Kanals? Eine Möglichkeit ist, dass BTP2 den CRAC-Kanal nicht zu 100 % blockiert. Selbst bei einer Vorinkubation der Zellen über einen Zeitraum von 24 Stunden wird der Kalziumeinstrom mit 100 nM BTP2 nur zu etwa 90 % gehemmt (Zitt et al., 2004). Für die Zellen, die unter normaler extrazellulärer Kalziumkonzentration inkubiert werden, könnten die verbleibenden 10 % des Stroms ausreichen, um die Proliferation aufrecht zu erhalten. Eine weitere Erklärung für die 5. Diskussion 74 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ normale Proliferation der Zellen, die ohne Zugabe von EGTA mit BTP2 inkubiert wurden, liegt darin, dass der Block des CRAC-Kanals erst nach mehreren Stunden Vorinkubation einen Gleichgewichtszustand erreicht hat. Bis zu diesem Zeitpunkt ist noch genügend Strom vorhanden, um die Proliferation aufrecht zu halten. Es ist also möglich, dass man bei der Messung der Proliferation nach 48 Stunden teilweise noch Effekte der ersten Stunden misst, die das Gesamtergebnis beeinflussen. Die Proliferationsexperimente zur Blockade des CRAC-Kanals lassen insgesamt den Schluss zu, dass die Jurkat T-Zelllinien par, CJ1 und CJ5 unter Ruhebedingungen noch soviel Strom über den CRAC-Kanal aufweisen, dass selbst ein fast vollständiger Block nicht ausreicht, um die Proliferation zu hemmen. Ist der Strom jedoch durch eine verminderte extrazelluläre Kalziumkonzentration schon reduziert, führt dieser Block dazu, dass nicht mehr genügend Kalzium in die Zelle einströmen kann, was zum Wachstumsstop bzw. zur Apoptose führt. Diese Experimente belegen, dass selbst leukämische T-Lymphozyten zur Proliferation den Kalziumeinstrom über den CRAC-Kanal benötigen. Es scheint so, dass der benötigte Kalziumeinstrom eng reguliert ist: Es ist nur ein geringer Strom zur Proliferation der Zellen nötig, aber das Ausschalten dieses geringen Einstroms lässt die Proliferation stoppen und begünstigt die Apoptose der Zellen. Ein weiterer Aspekt der von uns untersuchten Kalzium-abhängigen Proliferation ist die zugrunde liegende intrazelluläre Kalziumkonzentration und die dazu korrelierende Apoptose. Um diese zu untersuchen, wurde parallel zur Proliferation die intrazelluläre Kalziumkonzentration und die Apoptose von unstimulierten und stimulierten Jurkat TZelllinien der selben Zellpopulation in 96-Well-Platten bestimmt. Dabei ergab sich, dass die mit dem Lectin PHA stimulierten Zellen unter Ruhebedingungen schlechter proliferieren und erhöhte Apoptoseraten zeigen als die unstimulierten Zellen. Die intrazelluläre Kalziumkonzentration wurde durch die Stimulation mit PHA um 78 bis 110 nM im Vergleich zum Ruhekalzium erhöht. Das Ruhekalzium lag für die Jurkat Zelllinien par, CJ1 und CJ5 im Bereich von 150 nM. Dieser Wert liegt etwa um den Faktor 3 höher als Werte, die mittels Einzelzell-Imaging von verschiedenen Arbeitsgruppen gemessen wurden (Philipp et al., 2003; Smani et al., 2004; Zitt et al., 2004). Dieser Unterschied basiert auf unterschiedlichen Kalibrationen und der Tatsache, dass bei der Messung in einer 96-Well-Platte sämtliche Zellen gemessen werden. Voraktivierte Zellen, die im Voraus schon eine erhöhte extrazelluläre Kalziumkonzentration aufweisen, können im Gegensatz zur Einzelzellmessung nicht bei der 5. Diskussion 75 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Auswertung der Daten aus der Berechnung des Mittelwertes herausgenommen werden. Wichtiger als der absolute Wert der intrazellulären Kalziumkonzentration ist für uns aber die Tatsache, dass die intrazelluläre Kalziumkonzentration bei Stimulation der Zellen steigt, gleichzeitig aber die Proliferation abnimmt. Die Viabilität von T-Lymphozyten korreliert eng mit dem Kalziumhaushalt der Zelle, demnach kann ein zu hohes intrazelluläres Kalzium nicht nur zum Anhalten der Proliferation, sondern auch zur Apoptose der Zellen führen (Berridge et al., 1998; Berridge et al., 2003; Berridge et al., 2000; Santella, 1998). PHA stimuliert die TLymphozyten über die Quervernetzung aller membranständigen Glykoproteine (Kay, 1991). Hierbei wird der T-Zell-Rezeptor aktiviert, wobei jedoch im Gegensatz zum physiologischen Aktivierungsweg ein kostimulatorisches Signal fehlt. Während dieser Aktivierung steigt die intrazelluläre Kalziumkonzentration so stark an, dass sie nicht mehr zur Proliferation, sondern zur Apoptose der Jurkat T-Lymphozyten führt. Eine andere Beobachtung ließ sich bei primären peripheren Blutlymphozyten (PBLs) machen. Im Gegensatz zu Jurkat T-Lymphozyten würden die PBLs ohne Stimulation in einem Stadium der Anergie verweilen (Macian et al., 2004). Nach Stimulation mit PHA zeigen sie jedoch erhöhte Proliferationsraten. Jurkat Zellen benötigen keinen zusätzlichen exogenen Stimulus zur Proliferation, da sie aufgrund ihrer Abstammung aus leukämischen Zellen einen entkoppelten Zellzyklus aufweisen und sich permanent teilen. Daher ist die Jurkat T-Zelllinie insgesamt kein perfektes Modell um Aussagen zur Kalzium-abhängigen Proliferation treffen zu können, da das Wachstumsverhalten dieser Zellen aufgrund ihrer Abstammung verändert ist. Zur Messung von Ionenströmen durch Kanäle und die Messung von intrazellulären Kalziumkonzentrationen sind die Zelllinien mit Sicherheit gut geeignet, da bestimmte Eigenschaften der Zellen wie z.B. der Speicher-aktivierte Kalziumeinstrom durch die Leukämie nicht beeinflusst wurden. Bei der Messung eines so komplexen Ablaufs wie der Proliferation ist es jedoch schwierig, Aussagen treffen zu können, da der Ablauf scheinbar teilweise von der normal zugrunde liegenden Signalkaskade entkoppelt ist. Durch die Tatsache, dass die Zellen ohne äußeren Stimulus proliferieren, müssen die Rahmenbedingungen für die Proliferationsexperimente gut überlegt werden, damit keine Artefakte, sondern wirkliche Effekte auf die Proliferation aufgelöst werden. Mit der parentalen Zelllinie und den daraus hervorgegangenen Mutanten CJ1 und CJ5, die einen Defekt im Speicher-aktivierten Kalziumeinstrom zeigen, war es dennoch möglich, Aufschluss über die Rolle des CRAC-Kanals für die Proliferation zu gewinnen. Bei der Betrachtung von Daten, die aus der Messung von Zelllinien entstanden sind, sollte man sich jedoch immer vor Augen 5. Diskussion 76 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ führen, dass die vorliegenden Ergebnisse nicht zwangsläufig auf primäre Zellen übertragbar sind. Ein Beispiel dafür sind die Ergebnisse der Messungen von PHA-stimulierten Lymphozyten. Im Gegensatz zu Jurkat Lymphozyten, die sowohl unter PHA- als auch unter Bead-Stimulation (Daten nicht gezeigt) schlechter als unstimulierte Zellpopulationen proliferieren und im Vergleich zu den Kontrollen höhere Apoptoseraten zeigen, lassen sich die von uns isolierten PBLs sehr gut mit PHA stimulieren. Neue Ergebnisse aus unserer Arbeitsgruppe zeigen, dass sich die aus diesen PBLs aufgereinigten reinen T-Zell-Populationen ebenso wie die Jurkat TLymphozyten nicht mit PHA stimulieren lassen, da diese laut Literatur ohne einen Kostimulus wie z.B. CD28 im Stadium der Anergie bleiben (Macian et al., 2004; Yashiro et al., 1998). Die von uns verwendeten PBLs enthielten jedoch immer zu einem gewissen Anteil B-Lymphozyten und andere Leukozyten, die den fehlenden Kostimulus liefern konnten und so zur Proliferation der Zellen führten. Die PBLs zeigen jedoch auch bei einer physiologisch korrekten Stimulation über den T-Zell-Rezeptor und ein kostimulatorisches Molekül andere Eigenschaften als JurkatZellen, die sich auch bei dieser T-Zell-spezifischen Stimulation mit Antikörpern gegen CD3 und CD28 beschichteten Beads nicht mehr stimulieren lassen. Die Jurkat Lymphozyten proliferierten trotz des korrekten Stimulus wahrscheinlich nicht mehr, da sie sich mit ihrem Teilungsverhalten bereits am Maximum befinden. Zur Stimulation von PBLs für Proliferationsexperimente wurden also neben PHA Antikörperbeschichtete Polystyrol-Beads verwendet. In Lösung zugegebene Antikörper können eine inadäquate Aktivierung der Lymphozyten verursachen, wenn sie nicht an die T-Lymphozyten oder an die Oberfläche der Wells binden (Trickett and Kwan, 2003). Polystyrol-Beads führen bei Zellkontakt zu einer fokalen Stimulierung der T-Lymphozyten, ähneln also der physiologischen MHC-vermittelten Aktivierung. Die Beads wurden mit einem gegen den TZell-Rezeptor gerichteten Antikörper (anti-CD3) und gegen das kostimulatorischen Molekül CD28 (anti-CD28) beschichtet. Die Proliferation der T-Lymphozyten ist von einem kostimulatorischen Molekül abhängig (Frauwirth and Thompson, 2002). Zellpopulationen, die nur mit einem gegen CD3 gerichteten Antikörper stimuliert werden, enthalten viele apoptotische Zellen (Yashiro et al., 1998). In unseren Experimenten konnte gezeigt werden, dass eine Kostimulation mit anti-CD3/ anti-CD28 beschichteten Beads zu einer erhöhten Proliferation im Vergleich zu nur mit anti-CD3 stimulierten Zellen führt. Dies entspricht auch den von der Arbeitsgruppe um Yashiro gemessenen Ergebnissen. Unsere Experimente zeigen 5. Diskussion 77 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ außerdem, dass die fokale Stimulation der PBLs zu höheren Proliferationsraten als die Stimulation mit PHA führt. Trickett et al. zeigten 2003 die Effektivität verschiedener Stimuli mittels des Nachweises der Expression von CD25, der α-Kette des IL-2 Rezeptors, und von CD69, einem Molekül, dass in die Aktivierung von Lymphozyten involviert ist. In diesen Experimenten führte die Stimulation mit PHA zu höheren Expressionsraten von CD25 und CD69 als die Stimulation mit anti-CD3/ anti-CD28 beschichteten Beads, obwohl diese in einem Verhältnis von fünf Beads zu einer Zelle eingesetzt wurden (Trickett and Kwan, 2003). Diese Experimente wurden jedoch über einen Zeitraum von 24 Stunden durchgeführt. In unseren Experimenten wurde die Proliferation nach einer Inkubationszeit von 48 Stunden gemessen, wobei die Bead-Stimulation in 6 von 7 Fällen erfolgreicher als die Stimulation mit PHA war. Weiterhin führt nur die Kostimulation mit Antikörpern gegen CD3 und CD28 zur IL-2 Produktion in T-Lymphozyten. Eine Stimulation nur mit gegen CD3 gerichteten Antikörpern oder auch in Kombination mit anderen kostimulatorischen Molekülen, wie z.B. CD9 oder CD2 führt zu nahezu keiner IL-2 Produktion (Yashiro et al., 1998). Mehrere Arbeitsgruppen zeigten außerdem, dass eine Aktivierung der T-Lymphozyten mit nur gegen den T-Zell-Rezeptor gerichteten Antikörpern eine Anergie der Zellen (Salazar-Fontana and Bierer, 2001) bzw. sogar Apoptose auslöst (Yashiro et al., 1998). Durch Kostimulation des CD28-Moleküls sollen die anti-apoptotischen Proteine Bcl-xL (Boise et al., 1995) und c-FLIP-short (Kirchhoff et al., 2000b) hochreguliert werden und die Expression des Fas-Liganden vermindert werden (Kirchhoff et al., 2000a). Unsere Messungen der Caspase-3 und –7 Aktivität in den stimulierten Zellen zeigte jedoch höhere Caspaseaktivitäten in den mit anti-CD3/anti-CD28 beschichteten Beads stimulierten PBLs im Vergleich zu Zellen, die nur mit anti-CD3 beschichteten Beads oder PHA stimuliert wurden. Gleichzeitig zeigten alle stimulierten Zellen höhere CaspaseAktivitäten als unbehandelte Zellen. Obwohl die stimulierten Zellpopulationen höhere Proliferationsraten im Vergleich zu unstimulierten Populationen aufweisen, zeigen sie auch höhere Apoptoseraten. Es ist möglich, dass innerhalb der einzelnen stimulierten Populationen wenige Zellen auf den Stimulus hin sehr stark proliferieren, während andere Zellen durch den starken Aktivierungsreiz apoptotisch werden. Dies könnte den Effekt von erhöhten Proliferationsraten bei parallel erhöhten Apoptoseraten erklären. Eine FACS-Analyse der Zellpopulationen könnte bei Färbung der Zellen mit Propidiumiodid und Annexin Aufschluss über den Anteil an apoptotischen, nekrotischen und lebenden Zellen geben. 5. Diskussion 78 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Weiterhin ist es möglich, dass durch die Aktivierung der Zellen, die zu einem Kalziumeinstrom über den CRAC-Kanal führt, einige Zellen einen so starken Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration zeigen, dass das erhöhte intrazelluläre Kalzium dieser Zellen zur Apoptose führt. Die genaue Ursache der erhöhten Apoptoserate bei mit anti-CD3/ anti-CD28 beschichteten Beads stimulierten Zellen ist jedoch nicht bekannt und bedarf weiterer Untersuchungen, insbesondere der Messung der intrazellulären Kalziumkonzentration. Obwohl speziell bei den Experimenten mit primären peripheren Blutlymphozyten Fragen offen bleiben, kann mit Hilfe der Experimente zur Kalzium-abhängigen Proliferation der Jurkat TLymphozyten die Aussage getroffen werden, dass der Kalziumhaushalt entscheidend für die Viabilität der Zelle ist. Insbesondere der CRAC-Kanal ist für die eng regulierte Kalziumhomöostase essentiell und Defekte im kapazitativen Kalziumeinstrom können schwere Immundefizienzen zur Folge haben (Feske et al., 2001; Le Deist et al., 1995; Partiseti et al., 1994). Umgekehrt könnte der CRAC-Kanal jedoch als pharmakologischer Angriffspunkt zur Therapie von Autoimmunerkrankungen verwendet werden. Ist der molekulare Aufbau des CRAC-Kanals bekannt, kann noch gezielter nach einem spezifischen Blocker für den Kanal gesucht werden (Li et al., 2002). Erste Ergebnisse bezüglich der Aufklärung der molekularen Identität des CRAC-Kanals liegen bereits vor. Es konnte gezeigt werden, dass das Einfügen von TRPC3 cDNA in die Jurkat Mutanten, die einen Defekt dieses Kanals aufweisen, zur Wiederherstellung des kapazitiven Stroms über den CRAC-Kanal führt (Philipp et al., 2003). Weiterhin ist bekannt, dass das Pyrazolderivat BTP2 den CRAC-Kanal blockieren kann (Zitt et al., 2004). Nun konnte gezeigt werden, dass in HEK293 Zellen, die TRPC3 überexprimieren, der TRPC3-vermittelte Strom ebenfalls von BTP2 blockiert wird (He et al., 2005). Diese Informationen lassen auf einen Zusammenhang zwischen dem CRAC-Kanal und dem Protein TRPC3 schließen und auf baldige genaue Aufklärung der molekularen Identität des CRACKanals hoffen. Ist der molekulare Aufbau des CRAC-Kanals erst bekannt, sollte es möglich sein, ihn als Angriffspunkt zur pharmakologischen Therapie zu verwenden und damit Erkrankungen des Immunsystems gezielt therapieren zu können. 6. Literatur 79 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 6. Literatur Baldwin, A. S., Jr. (1996). The NF-kappa B and I kappa B proteins: new discoveries and insights. Annu Rev Immunol 14, 649-683. Berridge, M. J. (1995). Calcium signalling and cell proliferation. Bioessays 17, 491-500. Berridge, M. J., Bootman, M. D., and Lipp, P. (1998). Calcium-a life and death signal. Nature 395, 645-648. Berridge, M. J., Bootman, M. D., and Roderick, H. L. (2003). Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nat Rev Mol Cell Biol 4, 517-529. Berridge, M. J., Lipp, P., and Bootman, M. D. (2000). The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol 1, 11-21. Boatright, K. M., and Salvesen, G. S. (2003). Mechanisms of caspase activation. Curr Opin Cell Biol 15, 725-731. Boise, L. H., Minn, A. J., Noel, P. J., June, C. H., Accavitti, M. A., Lindsten, T., and Thompson, C. B. (1995). CD28 costimulation can promote T cell survival by enhancing the expression of Bcl-XL. Immunity 3, 87-98. Bootman, M. D., Collins, T. J., Peppiatt, C. M., Prothero, L. S., MacKenzie, L., De Smet, P., Travers, M., Tovey, S. C., Seo, J. T., Berridge, M. J., et al. (2001). Calcium signalling--an overview. Semin Cell Dev Biol 12, 3-10. Crabtree, G. R., and Clipstone, N. A. (1994). Signal transmission between the plasma membrane and nucleus of T lymphocytes. Annu Rev Biochem 63, 1045-1083. Dolmetsch, R. E., Xu, K., and Lewis, R.S. (1998). Calcium oscillations increase the efficiency and specificity of gene expression. Nature 392, 933-936 Earnshaw, W. C., Martins, L. M., and Kaufmann, S. H. (1999). Mammalian caspases: structure, activation, substrates, and functions during apoptosis. Annu Rev Biochem 68, 383-424. Emmel, P. D., de Andrada e Silva, E. A., and da Cunha Lima, I. C. (1989). Lightly doped and compensated quantum wells: The density of states in the dipole model. Physical Review B Condensed Matter 40, 3394-3396. Fanger, C. M., Hoth, M., Crabtree, G. R., and Lewis, R. S. (1995). Characterization of T cell mutants with defects in capacitative calcium entry: genetic evidence for the physiological roles of CRAC channels. J Cell Biol 131, 655-667. 6. Literatur 80 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Ferraro, C., Quemeneur, L., Prigent, A. F., Taverne, C., Revillard, J. P., and Bonnefoy-Berard, N. (2000). Anthracyclines trigger apoptosis of both G0-G1 and cycling peripheral blood lymphocytes and induce massive deletion of mature T and B cells. Cancer Res 60, 1901-1907. Feske, S., Giltnane, J., Dolmetsch, R., Staudt, L. M., and Rao, A. (2001). Gene regulation mediated by calcium signals in T lymphocytes. Nat Immunol 2, 316-324. Feske, S., Gwack, Y., Prakriya, M., Srikanth, S., Puppel, S. H., Tanasa, B., Hogan, P. G., Lewis, R. S., Daly, M., and Rao, A. (2006). A mutation in Orai1 causes immune deficiency by abrogating CRAC channel function. Nature (epub) Flanagan, W. M., Corthesy, B., Bram, R. J., and Crabtree, G. R. (1991). Nuclear association of a T-cell transcription factor blocked by FK-506 and cyclosporin A. Nature 352, 803-807. Frauwirth, K. A., and Thompson, C. B. (2002). Activation and inhibition of lymphocytes by costimulation. J Clin Invest 109, 295-299. Gardner, P. (1989). Calcium and T lymphocyte activation. Cell 59, 15-20. Genazzani, A. A., and Galione, A. (1996). Nicotinic acid-adenine dinucleotide phosphate mobilizes Ca2+ from a thapsigargin-insensitive pool. Biochem J 315 ( Pt 3), 721-725. Grynkiewicz, G., Poenie, M., and Tsien, R. Y. (1985). A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem 260, 3440-3450. Guse, A. H. (2004). Regulation of calcium signaling by the second messenger cyclic adenosine diphosphoribose (cADPR). Curr Mol Med 4, 239-248. Hajnoczky, G., Robb-Gaspers, L. D., Seitz, M. B., and Thomas, A. P. (1995). Decoding of cytosolic calcium oscillations in the mitochondria. Cell 82, 415-424. Hanahan, D., and Weinberg, R. A. (2000). The hallmarks of cancer. Cell 100, 57-70. He, L. P., Hewavitharana, T., Soboloff, J., Spassova, M. A., and Gill, D. L. (2005). A Functional Link between Store-operated and TRPC Channels Revealed by the 3,5Bis(trifluoromethyl)pyrazole Derivative, BTP2. J Biol Chem 280, 10997-11006. Hoth, M., Fanger, C. M., and Lewis, R. S. (1997). Mitochondrial regulation of store-operated calcium signaling in T lymphocytes. J Cell Biol 137, 633-648. Hoth, M., and Penner, R. (1992). Depletion of intracellular calcium stores activates a calcium current in mast cells. Nature 355, 353-356. Hoth, M., and Penner, R. (1993). Calcium release-activated calcium current in rat mast cells. J Physiol 465, 359-386. 6. Literatur 81 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Ishikawa, J., Ohga, K., Yoshino, T., Takezawa, R., Ichikawa, A., Kubota, H., and Yamada, T. (2003). A pyrazole derivative, YM-58483, potently inhibits store-operated sustained Ca2+ influx and IL-2 production in T lymphocytes. J Immunol 170, 4441-4449. Janeway, C.A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M.J. (2005). Immunobiology: the immune system in health and disease. 6th ed, Garland Science, New York Kahl, C. R., and Means, A. R. (2003). Regulation of cell cycle progression by calcium/calmodulin-dependent pathways. Endocr Rev 24, 719-736. Kay, J. E. (1991). Mechanisms of T lymphocyte activation. Immunol Lett 29, 51-54. Kirchhoff, S., Muller, W. W., Krueger, A., Schmitz, I., and Krammer, P. H. (2000a). TCRmediated up-regulation of c-FLIPshort correlates with resistance toward CD95-mediated apoptosis by blocking death-inducing signaling complex activity. J Immunol 165, 6293-6300. Kirchhoff, S., Muller, W. W., Li-Weber, M., and Krammer, P. H. (2000b). Up-regulation of cFLIPshort and reduction of activation-induced cell death in CD28-costimulated human T cells. Eur J Immunol 30, 2765-2774. Le Deist, F., Hivroz, C., Partiseti, M., Thomas, C., Bue, H. A., Oleastro, M., Belohradsky, B., Choquet, D., and Fischer, A. (1995). A primary T-cell immunodeficiency associated with defective transmembrane calcium influx. Blood 85, 1053-1062. Lee, H. C., Aarhus, R., Gee, K. R., and Kestner, T. (1997). Caged nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate. Synthesis and use. J Biol Chem 272, 4172-4178. Lewis, R. S. (2001). Calcium signaling mechanisms in T lymphocytes. Annu Rev Immunol 19, 497-521. Li, S. W., Westwick, J., and Poll, C. T. (2002). Receptor-operated Ca2+ influx channels in leukocytes: a therapeutic target? Trends Pharmacol Sci 23, 63-70. Liou, J., Kim, M. L., Heo, W. D., Jones, J. T., Myers, J. W., Ferrell, J. E., and Meyer, T. (2005). STIM is a Ca2+ Sensor Essential for Ca2+-Store-Depletion-Triggered Ca2+ Influx. Curr Biol. 15, 1235-41 Li-Weber, M., and Krammer, P. H. (2003). Function and regulation of the CD95 (APO-1/Fas) ligand in the immune system. Semin Immunol 15, 145-157. Macian, F., Im, S. H., Garcia-Cozar, F. J., and Rao, A. (2004). T-cell anergy. Curr Opin Immunol 16, 209-216. Marsden, V. S., and Strasser, A. (2003). Control of apoptosis in the immune system: Bcl-2, BH3-only proteins and more. Annu Rev Immunol 21, 71-105. Montell, C., and Rubin, G. M. (1989). Molecular characterization of the Drosophila trp locus: a putative integral membrane protein required for phototransduction. Neuron 2, 1313-1323. 6. Literatur 82 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Munaron, L., Antoniotti, S., and Lovisolo, D. (2004). Intracellular calcium signals and control of cell proliferation: how many mechanisms? J Cell Mol Med 8, 161-168. Partiseti, M., Le Deist, F., Hivroz, C., Fischer, A., Korn, H., and Choquet, D. (1994). The calcium current activated by T cell receptor and store depletion in human lymphocytes is absent in a primary immunodeficiency. J Biol Chem 269, 32327-32335. Peinelt, C., Vig, M., Koomoa, D. L., Beck, A., Nadler, M. J. S., Koblan-Huberson, M., Lis, A., Fleig, A., Penner, R., and Kinet, J. P. (2006). Amplification of CRAC current by STIM1 and CRACM1 (Orai1). Nat Cell Biol (epub) Philipp, S., Strauss, B., Hirnet, D., Wissenbach, U., Mery, L., Flockerzi, V., and Hoth, M. (2003). TRPC3 mediates T-cell receptor-dependent calcium entry in human T-lymphocytes. J Biol Chem 278, 26629-26638. Prakriya, M., and Lewis, R. S. (2002). Separation and characterization of currents through store-operated CRAC channels and Mg2+-inhibited cation (MIC) channels. J Gen Physiol 119, 487-507. Putney, J. W., Jr. (1990). Capacitative calcium entry revisited. Cell Calcium 11, 611-624. Quintana, A., Griesemer, D., Schwarz, E. C., and Hoth, M. (2005). Calcium-dependant activation of T-lymphocytes. Pflugers Arch, Eur J Physiol 450, 1-12 Ramage, P., Cheneval, D., Chvei, M., Graff, P., Hemmig, R., Heng, R., Kocher, H. P., Mackenzie, A., Memmert, K., Revesz, L., and et al. (1995). Expression, refolding, and autocatalytic proteolytic processing of the interleukin-1 beta-converting enzyme precursor. J Biol Chem 270, 9378-9383. Riedl, S. J., and Shi, Y. (2004). Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol 5, 897-907. Roos, J., DiGregorio, P. J., Yeromin, A. V., Ohlsen, K., Lioudyno, M., Zhang, S., Safrina, O., Kozak, J. A., Wagner, S. L., Cahalan, M. D., Velicelebi, G., and Stauderman, K. A. (2005). STIM1, an essential and conserved component of store-operated Ca2+ channel function. J Cell Biol 169, 435-445. Salazar-Fontana, L. I., and Bierer, B. E. (2001). T-lymphocyte coactivator molecules. Curr Opin Hematol 8, 5-11. Santella, L. (1998). The role of calcium in the cell cycle: facts and hypotheses. Biochem Biophys Res Commun 244, 317-324. Shi, Y. (2002). Mechanisms of caspase activation and inhibition during apoptosis. Mol Cell 9, 459-470. 6. Literatur 83 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Smani, T., Zakharov, S. I., Csutora, P., Leno, E., Trepakova, E. S., and Bolotina, V. M. (2004). A novel mechanism for the store-operated calcium influx pathway. Nat Cell Biol 6, 113-120. Thornberry, N. A., and Lazebnik, Y. (1998). Caspases: enemies within. Science 281, 13121316. Trickett, A., and Kwan, Y. L. (2003). T cell stimulation and expansion using anti-CD3/CD28 beads. J Immunol Methods 275, 251-255. Tsien, R. Y. (1980). New calcium indicators and buffers with high selectivity against magnesium and protons: design, synthesis, and properties of prototype structures. Biochemistry 19, 2396-2404. Venkatachalam, K., van Rossum, D. B., Patterson, R. L., Ma, H. T., and Gill, D. L. (2002). The cellular and molecular basis of store-operated calcium entry. Nat Cell Biol 4, E263-272. Vig, M., Peinelt, C., Beck, A., Koomoa, D. L., Rabah, D., Koblan-Huberson, M., Kraft, S., Turner, H., Fleig, A., Penner, R., and Kinet, J. P. (2006). CRACM1 is a plasma membrane protein essential for store-operated Ca2+ entry. Science 312, 1220-1223 Yamin, T. T., Ayala, J. M., and Miller, D. K. (1996). Activation of the native 45-kDa precursor form of interleukin-1-converting enzyme. J Biol Chem 271, 13273-13282. Yashiro, Y., Tai, X. G., Toyo-oka, K., Park, C. S., Abe, R., Hamaoka, T., Kobayashi, M., Neben, S., and Fujiwara, H. (1998). A fundamental difference in the capacity to induce proliferation of naive T cells between CD28 and other co-stimulatory molecules. Eur J Immunol 28, 926-935. Zhang, S. L., Yu, Y., Roos, J., Kozak, J. A., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Stauderman, K. A., and Cahalan, M. D. (2005). STIM1 is a Ca2+ sensor that activates CRAC channels and migrates from the Ca2+ store to the plasma membrane. Nature 437, 902-905. Zitt, C., Strauss, B., Schwarz, E. C., Spaeth, N., Rast, G., Hatzelmann, A., and Hoth, M. (2004). Potent inhibition of Ca2+ release-activated Ca2+ channels and T-lymphocyte activation by the pyrazole derivative BTP2. J Biol Chem 279, 12427-12437. Zweifach, A., and Lewis, R. S. (1993). Mitogen-regulated Ca2+ current of T lymphocytes is activated by depletion of intracellular Ca2+ stores. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 6295-6299. 6. Literatur 84 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Eigene Veröffentlichungen A Quintana, EC Schwarz, AS Wenning, C Schwindling, K Wagner, P Lipp, L Kaestner, M Hoth. Immunological synapse triggers, sustains and requires translocation of mitochondria close to plasma membrane calcium channels. (Manuskript in Vorbereitung). EC Schwarz, K Wagner, AS Wenning, B Strauß, MJ Wolfs , A Quintana, M Hoth. The calcium dependence of T-cell activation. (Manuskript in Vorbereitung). D Griesemer, E Tutsch, D Franze, B Heß, K Wagner, E Schwarz, M Hoth (2004). Establishing lymphocyte preparations from mouse and human blood and intestine to analyze calcium signals and calcium dependent proliferation. 83. Jahrestagung der Deutschen Physiologischen Gesellschaft. EJP Vol. 445, S149a D Griesemer, E Tutsch, A Quintana, K Wagner, C Zitt, N Spaeth, A Hatzelmann, A Stallmach, EC Schwarz, M Hoth (2004). Plasma membrane calcium channels and T-cell activation. Tagung der deutschen Gesellschaft für Immunologie (Maastricht)a. K Wagner, A Wenning, MJ Wolfs, B Strauß, A Quintana, M Hoth, EC Schwarz (2005). Calcium-dependence of proliferation in native peripheral blood lymphocytes and Jurkat T-cells. 84. Jahrestagung der Deutschen Physiologischen Gesellschaft. EJP Vol. 449, S133a EC Schwarz, MJ Wolfs, AS Wenning, K Wagner, B Strauß, A Quintana, and M Hoth (2005). Transient receptor potential cation channels are involved in Ca2+ signalling in human primary T-lymphocytes. Annual congress of the british society for immunology .a 7. Anhang 85 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 7. Anhang 7.1. Abkürzungsverzeichnis APAF-1 apoptotic-protease-activating-factor-1 AP-1 activator-protein 1 APC Antigen presenting cell ATP/dATP Adenosin 5’-triphosphat/ desoxy- Adenosin 5’-triphosphat BH-Region Bcl2- homologe Region cADPR cyclic adenosine diphosphoribose CD Cluster of differentiation cDNA complementary DNA, komplementäre DNA CD95L CD95-Ligand CIF Calcium influx factor CRAC Calcium- release activated calcium DAG Diazyglyzerol DED Death effector domain DIABLO direct inhibitor of apoptosis- binding protein DISC Death- inducing signaling complex ER Endoplasmatisches Retikulum FADD Fas- associated protein with death domain FITC Fluorescein-5-isothiocyanat HLA Human leukocyte antigen ICE Interleukin- 1b- converting enzyme (= Caspase 1) IκB inhibitory protein κB IL-2 Interleukin 2 IP3 Inositol-1,4,5-triphosphat IP3-R Inositol-1,4,5-triphosphat- Rezeptor iPLA2 Ca2+- independent phospholipase A2 kD Kilodalton 7. Anhang 86 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ LAT Linker of activated T-cells MHC major histocompatibility complex NAADP+ nicotinic acid adenine dinuleotide phosphate NFAT Nuclear factor of activated T-cells NFκB Nuclear factor κB PBLs periphere Blutlymphozyten PIP2 Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat PKC Proteinkinase C PLCγ Phospholipase Cγ PMCA Plasma membrane Ca2+-ATPase RPE R-Phycoerythrin SERCA sarco-endoplasmatic-reticulum- Ca2+-ATPase SMAC second mitochondria derived activator of caspases SOC Store-operated channel STIM Stromal interaction molecule TCR T-cell-receptor TG Thapsigargin TK Tyrosinkinase TNF-R Tumornekrosefaktor-Rezeptor TRP Transient receptor potential ZAP-70 ζ-chain-associated protein of 70 kD 8. Danksagung 87 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 8. Danksagung Mein herzlicher Dank gilt Herrn Prof. Dr. Markus Hoth für die Aufnahme in seine Arbeitsgruppe, für die Bereitstellung des interessanten Themas und die stete Bereitschaft zur Diskussion. Ein herzliches Dankeschön der gesamten Arbeitsgruppe, die mir stets diskussions- und hilfsbereit zur Seite gestanden haben. Danke auch dafür, dass immer jemand zu einer Kaffeepause, zum Austausch der täglichen „Weltnachrichten“ oder zu einer Runde „Prokerstinaten“ bereit war und mir somit geholfen hat, nie den Spaß an der Arbeit zu verlieren. Ganz besonders möchte ich mich bei meiner lieben Frau Dr. Eva Schwarz bedanken. Vielen Dank für all die fachliche Hilfe, für das riesige Engagement und dafür, dass die Tür für mich immer offen war. Mir wird ihr wunderbares Naturell sehr fehlen. Weiterhin möchte ich mich bei meiner Kommilitonin Susanne Stolz für das Korrekturlesen der Arbeit bedanken und auch dafür, dass wir während unseres Studiums so viele schöne Momente erlebt haben und gemeinsam unschlagbar waren. Zum Schluss geht der Dank an meine Familie, die mich in meiner Arbeit immer unterstützt und mir dies alles ermöglicht haben. 9. Lebenslauf 88 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 9. Lebenslauf Persönliche Daten Name: Kerstin Wagner Geburtsdatum: 25.08.1982 in Saarbrücken Anschrift: Hauptstr. 39 66132 Saarbrücken Telefon: 0681/892383 E-mail: [email protected] Familienstand: ledig Staatsangehörigkeit: deutsch Schulbildung 1988-1992 Grundschule Bischmisheim 1992-1998 Realschule Bruchwiese, Saarbrücken 1998-2001 Wirtschaftsgymnasium Saarbrücken, Abschluss Abitur Studium seit Oktober 2001: Studium der Medizin in Homburg September 2003: Ärztliche Vorprüfung WS 2006/2007: Praktisches Jahr