Einfluss des Histamin H4-Rezeptors auf die T-Zell
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Tierärztliche Hochschule Hannover Einfluss des Histamin-H4-Rezeptors auf die T-Zell-Aktivierung bei allergischen Hauterkrankungen INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae ( Dr. med. vet. ) vorgelegt von Hannah Mariele Bunk (Frankfurt am Main) Hannover 2011 Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Wolfgang Bäumer, Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie 1. Gutachter: Prof. Dr. Wolfgang Bäumer 2. Gutachter: Prof. Dr. M. Hewicker-Trautwein Tag der mündlichen Prüfung: 16.5.2011 Die Arbeit wurde durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft gefördert. Für Arman und meine lieben Eltern Inhalt 1 Einleitung..........................................................................................................................13 2 Literaturübersicht.............................................................................................................15 2.1 Histamin......................................................................................................................15 2.2 Die Histaminrezeptoren ..............................................................................................17 2.2.1 Der Histamin-H1-Rezeptor...................................................................................18 2.2.2 Der Histamin-H2-Rezeptor...................................................................................19 2.2.3 Der Histamin-H3-Rezeptor...................................................................................19 2.3 Der Histamin-H4-Rezeptor..........................................................................................20 2.3.1 Vorkommen ..........................................................................................................21 2.3.2 Signaltransduktion über den H4R..........................................................................21 2.3.3 Liganden ...............................................................................................................22 2.4 Das Immunsystem.......................................................................................................27 2.4.1 T-Helferzellen – Th1/Th2 Balance ......................................................................28 2.4.2 Dendritische Zellen..............................................................................................30 2.4.3 Interaktion zwischen dendritischen Zellen und T-Helferzellen...........................31 2.5 Die Interleukin-12-Familie .........................................................................................33 2.5.1 Interleukin-12.......................................................................................................34 2.5.2 Interleukin-23.......................................................................................................36 2.5.3 Interleukin-27.......................................................................................................38 2.6 Allergisch entzündliche Hauterkrankungen................................................................39 2.6.1 Atopische Dermatitis ...........................................................................................40 2.6.2 Allergische Kontaktdermatitis .............................................................................41 2.6.3 Murine Kontaktallergiemodelle ...........................................................................42 3 Material und Methoden....................................................................................................44 3.1 Geräte und Reagenzien ................................................................................................44 3.1.1 Geräte für In-vitro-Versuche.................................................................................44 3.1.2 Reagenzien für In-vitro-Versuche.........................................................................45 3.1.3 Geräte für In-vivo-Versuche .................................................................................45 3.1.4 Reagenzien für In-vivo-Versuche ........................................................................46 3.1.5 Geräte/Reagenzien für ELISA und Proteinextraktion ..........................................46 3.1.6 Histaminrezeptoragonisten/ -antagonisten............................................................47 3.1.7 Hergestellte Puffer und Lösungen für In-vitro-Versuche ....................................47 3.2 Versuchstiere...............................................................................................................48 3.3 Versuchsübersicht ........................................................................................................48 3.4 In-vivo-Versuche..........................................................................................................49 3.4.1 TDI-Kontaktallergiemodell..................................................................................50 3.4.2 FITC-Kontaktallergiemodell................................................................................53 3.4.3 Versuche zum akuten Entzündungsgeschehen ....................................................56 3.4.4 Einzelparameter der In-vivo-Versuche ................................................................57 3.5 In-vitro-Versuche.........................................................................................................58 3.5.1 Generierung muriner dendritischer Zellen...........................................................58 3.5.2 Stimulation muriner dendritischer Zellen mit Toll-Like-Receptor-Agonisten.....59 3.5.3 Zytokinbestimmung in Zellkulturüberständen mittels ELISA .............................60 3.6 Statistische Auswertung..............................................................................................60 4 Ergebnisse..........................................................................................................................61 4.1 In-Vitro-Versuche .......................................................................................................61 4.1.1 Einfluss des H4R auf die Zytokinkonzentration nach Stimulation mit Toll-LikeReceptor-Agonisten .............................................................................................61 4.1.2 Einfluss von Histamin und 4-Methylhistamin auf die Zytokinsekretion in dendritischen Zellen ............................................................................................65 4.2 In-vivo-Versuche.........................................................................................................69 4.2.1 Einfluss des H4R im TDI-Modell in der Sensibilisierungsphase.........................69 4.2.2 Einfluss des H4R im TDI-Modell in der chronischen Dermatitis ........................73 4.2.3 Einfluss des H4R im FITC-Modell in der Sensibilisierungsphase.......................77 4.2.4 Einfluss des H4R im FITC-Modell in der Challengephase..................................80 4.2.5 Einfluss des H4R im Arachidonsäure-Modell......................................................84 5 Diskussion ..........................................................................................................................85 5.1 Einfluss des H4-Rezeptors auf die Zytokinproduktion stimulierter dendritischer Zellen in vitro.........................................................................................................................86 5.2 Rolle des H4-Rezeptors in murinen Kontaktallergiemodellen....................................89 5.3 Schlussfolgerung und Ausblick ..................................................................................94 6 Zusammenfassung ...........................................................................................................97 7 Summary............................................................................................................................99 8 Literaturverzeichnis .......................................................................................................102 9 Tabellenanhang ..............................................................................................................136 Abkürzungsverzeichnis ± Plus / Minus % Prozent °C Grad Celsius 4-MH 4-Methylhistamin µl Mikroliter µg Mikrogramm AA Arachidonsäure Abb. Abbildung ACD Allergische Kontaktdermatitis AD Atopische Dermatitis Ag Antigen AP-1 Activator protein-1 APC Antigenpräsentierende Zelle ATP Adenosintriphosphat BMDC Bone marrow derived dendritic cells BSA Bovines Serum Albumin bzw. beziehungsweise cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat CCL2 Chemokin (C-C motif) ligand 2 CD Cluster of differentiation CIA Collagen-induzierte Arthritis ConA Concanavalin A DC Dendritische Zelle d.h. das heißt DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) DNCB 2,4-Dinitrochlorobenzen EAE Experimentelle Autoimmun Encephalitis EBI3 Epstein-Barr-Virus 3 ELISA Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay ERK Extracellular-regulated kinase et al. et alii, und Andere FITC Fluorescein-Isothiocyanat FKS Fetales Kälberserum g Gramm GM-CSF Granulocyte macrophage colony-stimulating factor GPCR G-Protein gekoppelter Rezeptor h hora, Stunde HDC Histidindecarboxylase HPBCD Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin H1 R Histamin-H1-Rezeptor(en) H2 R Histamin-H2-Rezeptor(en) H3 R Histamin-H3-Rezeptor(en) H4 R Histamin-H4-Rezeptor(en) IFN Interferon Ig Immunglobulin IL Interleukin i.p. intraperitoneal IRF interferon regulatory factor JAK Janus Kinase JNJ JNJ7777120 JNK c-Jun N-terminal Kinase kg Kilogramm KGW Körpergewicht l Liter LC Langerhanszellen LLNA local lymph node assay Ln./Lnn. Lymphonodus, Lymphknoten LPS Lipopolysaccharid LTA Lipoteichonsäure MAPK Mitogen-aktivierte Proteinkinase MEST Mouse-Ear-Swelling-Test mg Milligramm MHC Major-Histocompatibility-Complex ml Milliliter MW Mittelwert MoDC Monocyte derived dendritic cells n Anzahl der Versuche NFκB nuclear factor κB NK natürliche Killerzelle NKSF Natural killer cell stimulatory factor PAMP Pathogen-associated molecular pattern PBS Phosphate-buffered saline PGE Prostaglandin E PGN Peptidoglykan PRR Pathogen recognition receptor s.c. Subcutan SEM Standard error of the mean/Standardfehler SOCS suppressors of cytokine signaling STAT Signal transducer and activator of transcription Tab. Tabelle TCCR T-cell cytokine receptor TDI Toluen-2,4-diisothiocyanat TGF Transforming Growth Factor Th T-Helferzelle TNF Tumor-Nekrose-Faktor TLR Toll-Like-Receptor TZR T-Zell-Rezeptor u.a. unter anderem v.a. vor allem z.B. zum Beispiel ZNS Zentralnervensystem 1 Einleitung Das biogene Amin Histamin ist ein wichtiger Mediator bei allergischen Entzündungsreaktionen wie beispielsweise der atopischen Dermatitis. Als Gewebshormon ist die Wirkung von Histamin vielfältig. Histamin vermittelt seine Wirkungen über vier verschiedene Histaminrezeptoren (HxR), die nach ihrer Reihenfolge der Entdeckung H1R, H2R, H3R und H4R genannt werden. Der im Jahr 2000 entdeckte H4R wird für die Behandlung von allergischen Hauterkrankungen als eine mögliche Alternative zu den bisherigen Antihistaminika gesehen. Der Einsatz von klassischen H1R-Antihistaminika bei allergischen Entzündungen wie der allergischen Kontaktdermatitis und der atopischen Dermatitis führt bisher zu einem nicht zufriedenstellenden therapeutischen Effekt. Bislang nicht erklärbare Funktionen von Histamin sollen durch den H4R erschlossen werden. Der H4R wird unter anderem von Zellen des Immunsystems exprimiert. Die Expression auf dendritischen Zellen, T-Zellen, eosinophilen Granulozyten, basophilen Granulozyten, Mastzellen und vielen anderen Zellen zeigt eine enge Beziehung des H4R zwischen Entzündungsgeschehen und dem Ablauf einer Immunantwort. Es konnte bereits nachgewiesen werden, dass der H4R sowohl für die Chemotaxis einiger Immunzellen als auch für eine Beeinflussung der Zytokinsekretion verantwortlich ist. Bislang werden H4RAntagonisten vielversprechende immunmodulatorische Eigenschaften zugeordnet. Inwieweit sich eine neue Therapiemöglichkeit ergibt, ist noch nicht hinreichend geklärt. Die vorliegende Arbeit setzt sich aus In-vitro-Versuchen mit dendritischen Zellen und Invivo-Versuchen an der Maus zusammen. Dendritische Zellen spielen eine zentrale Rolle bei der Immunantwort, wodurch sie einen wichtigen Faktor bei allergischen Krankheiten darstellen. Es ist ihnen möglich, eindringende Antigene aufzunehmen, zu prozessieren und im Lymphknoten antigenspezifische T-Zellen zu aktivieren. Ziel der Arbeit ist es, den Einfluss des H4R auf T-Zell-spezifische Zytokine und damit die Wirkung bei allergischen Entzündungen zu untersuchen. Bei den In-vitro-Versuchen, die mit aus Knochenmark von Mäusen generierten dendritischen Zellen von Wildtyp und H4R-Knockout-Mäusen durchgeführt werden, wird besonderes Augenmerk auf die proinflammatorischen Zytokine der IL-12-Familie gelegt, die bei immunologischen Erkrankungen wie beispielsweise Psoriasis eine wichtige Rolle spielen. Hierfür werden die Zellen mit Toll-Like-ReceptorAgonisten stimuliert und die Konzentrationen der Zytokine in den Zellkulturüberständen 13 bestimmt. In vivo soll die Wirkung des Rezeptors in der allergischen Kontaktallergie anhand zweier Th2-dominierter Kontaktallergiemodelle untersucht werden. Mit Hilfe eines spezifischen Antagonisten des H4R und H4R-Knockout-Mäusen soll geprüft werden, ob eine Blockade des Rezeptors einen klinischen Effekt auf die allergische Entzündungsreaktion zeigt, wodurch er als mögliche Therapie von chronisch-allergischen Entzündungen der Haut von Interesse wäre. Wichtige Parameter sind dabei die entzündliche Ohrschwellung, Gewicht und Zellzahl der regionalen Lymphknoten sowie Expression verschiedener pro- und antiinflammatorischer Zytokine. 14 2 Literaturübersicht 2.1 Histamin Histamin ist ein Gewebshormon und Neurotransmitter im Organismus. Es übernimmt vielfältige Funktionen, unter anderem im Allergiegeschehen und Immunsystem, im Magen zur Regulation der Säuresekretion und im ZNS als Transmitter spezifischer histaminerger Neurone auf den Schlaf-Wach-Rhythmus. Im Jahre 1907 wurde Histamin, damals unter dem Namen „Imidazoläthylamin“, von A. Windhaus und W. Vogt als „chemische Kuriosität“ synthetisch hergestellt. 3 Jahre später, 1910, isolierte Sir Henry Dale als erster Mensch diese Substanz aus dem Getreidepilz Mutterkorn (BARGER u. DALE, 1910; DALE u. LAIDLAW, 1910). Der Naturstoff konnte im gleichen Jahr von DALE und LAIDLAW (1910) im Körper nachgewiesen werden. Da es sich herausstellte, dass sich diese Substanz in vielen Geweben des menschlichen Körpers befindet (BEST et al., 1927), wurde ihr der Name „Histamin“ gegeben, abstammend von dem griechischen Wort histos = Gewebe und amin = stickstoffhaltige Substanz. Struktur und Biosynthese Das Gewebshormon gehört zu der Klasse der biogenen Amine (chemischer Name 2-(4-Imidazolyl)-ethylamin). Es besteht aus einem fünfgliedrigen Kohlenstoffring mit zwei substituierten Stickstoffatomen mit einer Ethylamin-Seitenkette (siehe Abbildung 2-1). Abbildung 2-1: Strukturformel von Histamin Gebildet wird es aus der Aminosäure L-Histidin durch oxidative Decarboxylierung mit Hilfe des zytoplasmatischen Enzyms Histidindecarboxylase (SCHAYER, 1956). OHTSU et al. (2001) untersuchten Histidindecarboxylase-defiziente Mäuse (HDC-/-) und konnten zeigen, dass diese nicht in der Lage waren aus Histidin Histamin zu synthetisieren. 15 Die Biosynthese erfolgt im Organismus in Mastzellen, basophilen Granulozyten, Zellen der Epidermis, der Magenschleimhaut und des ZNS. Gespeichert wird es in Vesikeln durch Bindung an das saure Mucopolysaccharid Heparin. RILEY und WEST konnten 1952 erstmals den Zusammenhang von Histamin und Mastzellen feststellen. Sie zeigten, dass Substanzen, die zur Freisetzung von Histamin führten, ebenfalls Gewebsmastzellen zerstören (RILEY u. WEST, 1952). In zahlreichen Zellen wie z.B. T-Zellen und Makrophagen kann Histamin zudem synthetisiert werden. Es wird in diesen Zellen nicht gespeichert, sondern spontan aus der Zelle freigesetzt. Ansonsten erfolgt die Freisetzung durch Degranulation der histaminspeichernden Vesikel (RILEY u. WEST, 1952). Funktion Histamin spielt bei vielen physiologischen und pathophysiologischen Vorgängen im Körper eine Rolle. Es dient im Organismus sowohl als Gewebshormon als auch als Neurotransmitter. Im Magen-Darm-Trakt reguliert es Magensäureproduktion und Motilität. Zudem induziert es im Herz-Kreislaufsystem eine Kontraktion der großen Blutgefäße und Erweiterung kleinerer Gefäße und führt dadurch beispielsweise zu Hautrötung. Direkt am Herzen wirkt Histamin positiv ionotrop und chronotrop. Auch in Teilen des zentralen Nervensystems können Histaminkonzentrationen nachgewiesen werden. Über präsynaptische Rezeptoren reguliert Histamin die Freisetzung von Histamin selbst aber auch Neurotransmittern wie Acetylcholin und Serotonin. So ist es u.a. verantwortlich für Steuerung des Schlaf-Wach-Rhythmus und der Appetitkontrolle. Histamin ist auch an verschiedenen pathophysiologischen Vorgängen beteiligt, so zum Beispiel als Mediator allergischer Reaktionen. So befinden sich während allergischer Hautreaktionen hohe Konzentrationen von Histamin in der Haut, wodurch es zu Juckreiz, Schmerz, Ödemen und Hautrötungen kommt, den klassischen Symptomen einer Entzündung. Ferner führt Histamin durch seine Effekte auf Blutgefäße und Bronchien zu Blutdruckabfall und Atemnot (PARSONS u. GANELLIN, 2006). 16 Abbildung 2-2: Funktionen von Histamin (modifiziert nach AKDIS u. SIMONS, 2006) 2.2 Die Histaminrezeptoren Histaminrezeptoren sind ubiquitär im Organismus vorhanden. Durch Bindung von Histamin an die bislang vier bekannten Histaminrezeptoren, die nach der Reihenfolge ihrer Entdeckung H1-Rezeptor (H1R), H2-Rezeptor (H2R), H3-Rezeptor (H3R) und H4-Rezeptor (H4R) benannt wurden, werden die Effekte des biogenen Amins vermittelt. Im Jahr 1966 gelang es ASH und SCHILD (1966), die Salzsäuresekretion in der Magenschleimhaut zu blockieren, wodurch der Grundstein zur Postulierung des H2R gelegt wurde (ASH u. SCHILD, 1966; BLACK et al., 1972). Nachdem 1972 eine pharmakologische Unterscheidung zwischen H1R und H2R erfolgte (BLACK et al., 1972), wurde 1983 der H3R erstmals beschrieben (ARRANG et al., 1983). In den 90er Jahren konnte die genetische Struktur der drei Rezeptoren aufgeschlüsselt werden. Erst im Jahr 2000 wurde der humane H4R von verschiedenen Arbeitsgruppen entdeckt und charakterisiert, zum selben Zeitpunkt wurde seine DNA-Sequenz kloniert (NAKAMURA et al., 2000; ODA et al., 2000). 17 Die vier Histaminrezeptoren unterscheiden sich in ihrem Expressionsprofil, ihrem Signaltransduktionsweg, ihrer Funktion und auch in ihrer Affinität Histamin zu binden (AKDIS u. SIMONS, 2006). Sie gehören zu der Gruppe der membranständigen G-Proteingekoppelten Rezeptoren (GANTZ et al., 1991; YAMASHITA et al., 1991; LOVENBERG et al., 1999). G-Proteine übertragen ein Signal auf einen intrazellulären second messenger, der entweder direkt oder über einen Zwischenschritt beispielsweise eine Ionenkanalkonformation herbeiführt, die durch Phosphorylierung von Proteinen zustande kommt. Jedem Rezeptortyp können spezifische Effekte zugeordnet werden. 2.2.1 Der Histamin-H1-Rezeptor Der H1R befindet sich ubiquitär im Körper, insbesondere in der glatten Muskulatur von Atmungs-, Magen-Darm- und Urogenitaltrakt sowie im kardiovaskulären System. Zudem findet man ihn im zentralen Nervensystem und auf verschiedenen Zelltypen wie z.B. Lymphozyten und Endothelzellen (SCHWARTZ et al., 1991; HAAS u. PANULA, 2003). Die Stimulation des H1R beeinflusst hauptsächlich die Kontraktion der glatten Muskulatur von Bronchien, Darm und Gefäßen. Bindet Histamin an den H1R auf Arteriolen, wird die Stickstoffmonoxidbildung stimuliert, wodurch die Gefäßmuskelzellen erschlaffen. Venolen dagegen reagieren durch Bindung von Histamin an den H1R mit einer Kontraktion von Endothelzellen, wodurch sich Lücken im Zellverband bilden durch die Plasmaflüssigkeit ausströmen kann (BAKKER et al., 2002). Zudem entsteht durch Stimulation afferenter Nervenendigungen Juckreiz. Demnach spielt der H1R eine große Rolle in Allergie- und Entzündungsgeschehen. Auch immunmodulatorische Effekte können über den H1R vermittelt werden. So konnten Untersuchungen an H1R-Knockout-Mäusen zeigen, dass die T- und B-Zell-Proliferation deutlich reduziert war (BANU u. WATANABE, 1999). Zudem aktiviert der H1R die Transkriptionsfaktoren AP-1 (activator protein-1) und NF-κB (nuclear factor κB), die eine wichtige Rolle bei Entzündungen spielen. Dieser Effekt konnte durch H1R-Antihistaminika geblockt werden (BAKKER et al., 2002; ROUMESTAN et al., 2008). H1R-Antagonisten sind seit den 30er Jahren bekannt. Therapeutisch eingesetzte H1RAntagonisten gibt es in drei Generationen. H1-Antihistaminika der ersten Generation wie Diphenhydramin und Mepyramin sind stark lipophil und können daher die Blut-HirnSchranke passieren. Sie wirken über den H1R im ZNS sedierend, so dass sie in der Humanmedizin als Schlafmittel Anwendung finden. Im Gegensatz dazu sind die H1-Antihistaminika der 2. und 3. Generation wie Ceterizin und Loratadin schlecht bis gar 18 nicht lipohil. Sie werden häufig bei allergischer Konjunktivitis und Rhinitis eingesetzt. Als H1-Antihistaminika ist in der Veterinärmedizin ausschließlich der Wirkstoff Chlorphenamin in einem Kombinationspräparat (Atussin®) bei Pferd und Hund zur Behandlung von allergisch bedingtem Husten zugelassen. 2.2.2 Der Histamin-H2-Rezeptor Der H2R wird hauptsächlich von Parietalzellen der Magenschleimhaut exprimiert. Bindet Histamin an den H2R, kommt es zu einer Sekretion von Magensäure und Pepsin. Dieser Effekt konnte durch H2R-Antagonisten verringert werden (PENDLETON et al., 1985). Daraus ergab sich eine große therapeutische Bedeutung der H2R-Antagonisten bei der Behandlung von Gastritis oder Magenulzera. Auch die glatte Muskulatur von Herz, Gefäßsystem und Atemwegen exprimiert den H2R. An glatter Muskulatur wirkt Histamin über den H2R relaxierend, zudem wird über ihn eine Gefäßerweiterung der Arteriolen vermittelt (FOREMAN et al., 1985; DEL VALLE u. GANTZ, 1997; HILL et al., 1997; BACHERT, 2002). Am Herz verursacht eine Stimulation des H2R ausgeprägte positiv chronotrope und ionotrope Wirkungen (BLACK et al., 1972). Auf Immunzellen wie basophilen Granulozyten, dendritischen Zellen und Monozyten hat Histamin über den H2R Einfluss auf die Produktion diverser Zytokine, so wird die durch bakterielle Antigene induzierte Produktion von TNF-α, IL-1 sowie IL-12 gehemmt und die Produktion von IL-10 und IL-18 gefördert (VANNIER et al., 1991; ELENKOV et al., 1998; VAN DER POUW KRAAN et al., 1998; KOHKA et al., 2000). Auf humanen dendritischen Zellen wird ebenfalls durch Stimulation des H2R eine Erhöhung von IL-10 und eine Senkung von IL-12 induziert (SCHWARTZ et al., 1991; GUTZMER et al., 2002; JUTEL et al., 2002). In der Human- sowie Tiermedizin werden H2R-Antihistaminika wie Cimetidin und Ranitidin bei säurebedingter Gastritis und Magenulzera eingesetzt (FREY u. LÖSCHER, 2009). 2.2.3 Der Histamin-H3-Rezeptor Der H3R wurde durch ARRANG et al. (1983) in Cortexgewebe der Ratte entdeckt und als Autorezeptor identifiziert, welcher die Freisetzung und Synthese von Histamin kontrolliert. Alsbald konnte er auch als Heterorezeptor nachgewiesen werden, der an präsynaptischen Nervenendigungen nicht-histaminerger Neuronen die Freisetzung vieler Neurotransmitter reguliert wie zum Beispiel Acetylcholin, Noradrenalin oder Serotonin (SCHLICKER et al., 19 1994; SANDER et al., 2008). Histaminerge Neurone sind in vielen Teilen des Gehirns verbreitet und beteiligt an der Regulation des Schlaf-Wach-Rhythmus, der Erinnerung und dem Hungergefühl. Es wird vermutet, dass H3R-Antagonisten einen positiven Einfluss in der Behandlung von kognitiven Störungen, Adipositas, Schlafstörungen, Alzheimer, Schizophrenie oder auch bei Ischämie-bedingten Herzarrhythmien und Migräne haben. ZNS-gängige H3R-Antagonisten wie zum Beispiel das Nicht-Imidazol-Derivat Pitolisant sind als mögliche Medikamente dieser Erkrankungen in der frühen klinischen Phase (PARSONS u. GANELLIN, 2006; LEURS et al., 2005). Weiterhin wird in der Literatur eine Rolle des H3R im Entzündungsgeschehen sowie in der Entstehung von Juckreiz diskutiert. Untersuchungen zeigten, dass der H4R-Agonist/ H3RAntagonist Clobenpropit wie auch der H3R/H4R-Antagonist Thioperamid in Mäusen Juckreiz induzierte. Da die in diesen Studien verwendeten H3R-Liganden jedoch nicht spezifisch für den H3R sind, sondern gleichfalls Affinitäten für den H4R besitzen, ist die Rolle des H3R in der Entstehung von Entzündung und Juckreiz nicht eindeutig geklärt (BELL et al., 2004). Der H3R konnte in der Zwischenzeit in vielen Geweben verschiedener Spezies identifiziert werden. LOVENBERG et al. (1999) gelang es im Jahr 1999, das Gen des humanen H3R zu klonieren. Kurze Zeit später gelang zudem die Klonierung des H3R der Ratte (LOVENBERG et al., 1999, 2000) und des Meerschweinchens (TARDIVEL-LACOMBE et al., 2000). 2.3 Der Histamin-H4-Rezeptor Als im Jahr 1999 der H3R kloniert werden konnte, wurden durch die Homologie des H4R zum H3R die Grundsteine zur Identifizierung des H4R gelegt. Schon 1994 wurde von RAIBLE et al. (1994) die Existenz eines vierten Histaminrezeptors vermutet. In einer Studie mit eosinophilen Granulozyten konnte eine Histamin-induzierte Calcium (Ca2+)-Mobilisation festgestellt werden, die durch den H3R-Antagonisten Thioperamid, nicht jedoch durch H1R-/H2R-Antagonisten gehemmt werden konnte. Dieser Effekt war mit Histamin deutlicher als mit H3R-Agonisten, so dass die Existenz eines weiteren Histaminrezeptors vermutet wurde. Kurze Zeit später klonierten verschiedene Arbeitsgruppen den humanen H4R unabhängig voneinander (NAKAMURA et al., 2000; ODA et al., 2000; LIU et al., 2001b; NGUYEN et al., 2001). Mittlerweile sind auch die Sequenzen des H4R für Ratte, Maus, Meerschweinchen, Schwein und Affe sowie die des Hundes entschlüsselt worden (LIU et al., 2001a; ODA et al., 2002; ODA et al., 2005; JIANG et al., 2008). 20 2.3.1 Vorkommen Der H4R befindet sich in vielen unterschiedlichen Geweben wie Milz, Thymus, Lunge, Herz sowie Dünn- und Dickdarm (AKDIS u. SIMONS, 2006). Zudem konnte die Expression des H4R im Gehirn von Ratte und Mensch nachgewiesen werden (STRAKHOVA et al., 2009). Neuere Studien zeigten, dass H4R-Antagonisten eine Rolle bei der Hemmung der Schmerzwahrnehmung und des Juckreizes spielen. Da die Effekte der H4R-Liganden unabhängig vom Vorhandensein von Mastzellen waren, wurde vermutet, dass der H4R auf peripheren Neuronen exprimiert wird (DUNFORD et al., 2007; CONELLY et al., 2009). Bislang wurde die Expression des H4R vor allem auf Zellen des Immunsystems nachgewiesen. Er befindet sich auf zahlreichen hämatopoetischen Zellen wie Mastzellen, dendritischen Zellen, eosinophilen Granulozyten (Eosinophile), basophilen Granulozyten (Basophile), Monozyten und T-Zellen (CD8+) (NAKAMURA et al., 2000; ODA et al., 2000; LIU et al., 2001b; MORSE et al., 2001; ZHU et al., 2001; GANTNER et al., 2002; GUTZMER et al., 2005; HOFSTRA et al., 2003). So zeigt sich, dass der H4R vermehrt von Zellen exprimiert wird, die in Entzündungsgeschehen und in allergischen Vorgängen involviert sind. 2.3.2 Signaltransduktion über den H4R Bindet Histamin an das pertussis-sensitive Gi-Protein, wird die Aktivität der Adenylatcyclase reduziert. Über die βγ-Untereinheit des Gi Proteins aktiviert der H4R die Phospholipase C, was in einem intrazellulären Calcium Anstieg resultiert. Zudem kann es zu einer Phosphorylierung von MAP-Kinasen (MAPK) kommen, wodurch die MAPK-Kaskade aktiviert wird (ODA et al., 2000; HOFSTRA et al., 2003). GUTZMER et al. (2005) konnten zeigen, dass in humanen DC der Transkriptionsfaktor AP-1, der durch Phosphorylierung der MAPK ERK1/2, JNK und p38 aktiviert wird, durch Histamin und den H4R-Agonisten Clobenpropit, nicht aber durch die Agonisten der anderen Histaminrezeptoren, aktiviert wurde. Die Phosphorylierung von ERK1/2 fand allerdings nicht statt, so dass GUTZMER et al. (2005) davon ausgingen, dass die Signaltransduktion des H4R nicht über ERK1/2 läuft. Die Mechanismen der Signalübertragung scheinen in Mäusen, Ratten und Meerschweinchen identisch zu sein (LIU et al., 2001b). 21 2.3.3 Liganden Bisher bekannte Liganden der Histaminrezeptoren weisen unterschiedlich starke Affinitäten zum H4R auf. So binden klassische H1R- und H2R-Antagonisten nur mit sehr geringer Affinität an den H4R (FUNG-LEUNG et al., 2004). Gängige Therapeutika gegen allergische Erkrankungen wie Diphenhydramin, Ceterizin, Desloratadin und Fexofenadin, die als H1RAntagonisten fungieren, zeigten in Konzentrationen bis zu 10 µM keine antagonistischen Wirkungen an dem H4R. Im Gegensatz dazu erwies sich das ursprünglich als H2R-Agonist entwickelte 4-Methylhistamin als viel potenterer Agonist am humanen H4R als am H2R. Es konnte eine 100-fach höhere Selektivität von 4-Methylhistamin zum H4R gegenüber allen anderen Histaminrezeptoren gezeigt werden (LIM et al., 2005). Viele Verbindungen, die an den H3R binden, zeigen auch Affinitäten zum H4R, was durch die Strukturähnlichkeit beider Rezeptoren zu erklären ist. Vor allem die Imidazolabkömmlinge wie Imepip, Imetit oder (R)-α-Methylhistamin wirken an beiden Rezeptoren agonistisch. Dagegen wirken Clobenpropid oder Clozapin am humanen H3R antagonistisch, am H4R jedoch partiell agonistisch. Bei allen Spezies wirkt Thioperamid sowohl am H3R als auch am H4R als Antagonist bzw. inverser Agonist (GBAHOU et al., 2006). Im Laufe der Erforschung des H4R wurden spezifische Agonisten und Antagonisten für den Rezeptor entwickelt. Im Jahre 2003 wurden die ersten hochselektiven H4R-Antagonisten beschrieben: JNJ7777120 (1-[(5-Chloro-1-indol-2-yl)carbonyl]-4-methylpiperazin) und sein Benzimidazolanalogon VUF6002 (JABLONOWSKI et al., 2003). JNJ7777120 weist dabei eine fast 4-fach höhere Affinität zum humanen H4R im Vergleich zu VUF6002 auf. Als weiterer selektiver H4R-Antagonist ist A-987306 bekannt, der sowohl den humanen wie auch den murinen H4R blockieren kann (LIU et al., 2008). Die ersten selektiven Agonisten waren OUP16, die jedoch nur eine moderate Bindungsaffinität zum H4R aufweisen, und der NichtImidazol-Abkömmling VUF8430, der als hochselektiv für den humanen H4R gilt (LIM et al., 2006). Zwischen den einzelnen Spezies kann nur eine relativ geringe Sequenzhomologie des H4R festgestellt werden, wodurch sich die unterschiedlichen Bindungsaffinitäten der H4R-Liganden zu den artspezifischen Rezeptoren erklären lassen (siehe Tabelle 2-1). So zeigt z.B. Clobenpropit am H4R des Meerschweinchens, der Maus und des Menschen eine hohe Affinität, während es am H4R der Ratte eher schwach bindet (LIU et al., 2001a). Die Unterschiede in den Bindungsaffinitäten spiegeln sich ebenso bei der funktionellen Affinität der Liganden am Rezeptor wider. LIU et al. (2001b) nutzten ein Reportergen-Assay, um die 22 forskolininduzierte cAMP-Akkumulation in Zellen zu messen und fanden heraus, dass Burimamid ein schwacher Agonist am humanen H4R, aber inaktiv am H4R anderer Spezies war (LIU et al., 2001b). Die Bindungsaffinität des H4R für Histamin selbst zeigt ebenfalls eine starke Variation zwischen den verschiedenen Spezies. Die Rezeptoren von Mensch und Meerschweinchen besitzen eine vergleichsweise hohe Affinität für Histamin im Gegensatz zu den Rezeptoren von Maus und Ratte (JIANG et al., 2008). Tabelle 2-1: Affinitäten der H4-Rezeptoren zu Histamin (nach JIANG et al., 2008) Spezies 3 H-Histamin KD [nmol/l]±SD Hund 17,8 ± 0,8 Mensch 4,8 ± 2,5 Affe 3,0 ± 0,3 Schwein 4,4 Meerschwein 6,0 ± 1,2 Ratte 136 ± 41 Maus 42 ± 6 2.3.4 Funktionen des H4R 2.3.4.1 In-vitro-Untersuchungen zu immunmodulatorischen Eigenschaften des H4R Der immunmodulatorische Einfluss des H4R zeigt sich unter anderem bei Stimulation von Mastzellen oder Eosinophilen, woraus eine vermehrte Chemotaxis resultiert (HOFSTRA et al., 2003; GUTZMER et al., 2005; LING et al., 2004). Eine Untersuchung an Langerhanszellen (LC), welche die wichtigsten Antigen-präsentierende Zellen (APC) der Haut repräsentieren und damit eine entscheidende Rolle bei allergischen Hauterkrankungen spielen, zeigte, dass sowohl murine als auch humane LC den H4R, im Gegensatz zum H1R und H2R, auf mRNA Ebene exprimieren (OHTANI et al., 2003; GSCHWANDTER et al., 2010). Histamin kann somit auf LC über den H4R interagieren. Eine andere Studie zeigte, 23 dass es auf humanen LC nach einer Stimulation mit Histamin oder dem Agonisten Clobenpropit zu einer Runterregulation des proinflammatorischen Th2-Chemokins CCL2 kommt. Der H4R-Antagonist JNJ7777120 konnte diesen Effekt aufheben (GSCHWANDTNER et al., 2010). Zudem wurde sowohl durch Histamin als auch durch die H4R-Agonisten Clobenpropit und 4-Methylhistamin die Expression von CCL2 und IL-12 (Th1-Zytokin) auf humanen Monozyten und DC herunterreguliert (DIJKSTRA et al., 2007; GUTZMER et al., 2005; DIJKSTRA et al., 2008), wobei Agonisten der anderen Histaminrezeptoren diesen Effekt nicht vermitteln konnten. Auch hier konnte JNJ7777120 den Effekt antagonisieren. Durch die Runterregulation von CCL2 und IL-12 kam es zu einer Abnahme der Migration von MoDC (monocyte derived dendritic cells) (GUTZMER et al., 2005). Nach H4R-Stimulation konnte auf CD8+ Zellen eine Hochregulierung das Chemokins IL-16 festgestellt werden (GANTNER et al., 2002), zudem wurde gezeigt, dass regulatorische T-Zellen den H4R exprimieren (MORGAN et al., 2007). Der zu diesem Zeitpunkt bestehende Kenntnisstand lässt vermuten, dass der H4R eine wichtige Funktion im Ablauf der Immunantwort hat, der sich in der bislang beschriebenen proinflammatorische Funktion sowohl auf murinen als auch auf humanen Zellen widerspiegelt. 2.3.4.2 In-vivo-Untersuchungen zu immunmodulatorischen Eigenschaften des H4R Die Funktion des H4R in der Pathogenese von entzündlichen Prozessen wie sie bei atopischer Dermatitis, Atemwegserkrankungen und Juckreiz eine Rolle spielen, konnte anhand verschiedener Tiermodelle gezeigt werden. In dieser Arbeitsgruppe wurde die Wirkung von JNJ7777120 auf die Hapten-induzierte Ohrschwellung an zwei Kontaktallergiemodellen untersucht. Sowohl im TDI-Modell, das eine Th2-dominierte Entzündung hervorruft, als auch im DNCB-Modell, wodurch eine Th1-dominierte Entzündung induziert wird, konnte JNJ7777120 jedoch die Ohrschwellung nicht reduzieren (ROSSBACH et al., 2009a). In HDC(-/-)-Mäusen konnte gezeigt werden, dass durch die wiederholte Gabe von 4-MH die Läsionen eines Hautekzems verschlechtert wurden und eine vermehrte Migration von Mastzellen und Eosinophilen in diesen Bereich stattfand, wohingegen in Wildtyp-Mäusen die chronischen Läsionen durch JNJ7777120 verbessert wurden. In derselben Studie konnte gezeigt werden, dass eine verminderte Anzahl an Th1-typischen-Zytokinen (IFNγ und IL-12) und im Gegensatz dazu eine vermehrte Anzahl an Th2-typischen-Zytokinen (IL-4) in HDC(+/+)-Mäusen zu finden waren und entsprechend andersherum in HDC(-/-)-Mäusen (SEIKE et al., 2010). In einer anderen Studie lösten COWDEN et al. (2010) durch topische 24 Gabe des Allergens Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) eine Entzündung in Form einer Ohrschwellung aus. Es konnte gezeigt werden, dass die Gabe des selektiven H4RAntagonisten JNJ7777120 in BALB/c Mäusen eine Reduktion der Ohrschwellung induzierte. Auch in H4R-Knockout-Mäusen konnte dieser Effekt nachgewiesen werden. Zudem war in den mit FITC behandelten BALB/c-Mäusen ein Anstieg von Neutrophilen, Mastzellen und Eosinophilen in der Haut zu beobachten, der durch die systemische Gabe von JNJ7777120 reduziert werden konnte. Dieses Bild spiegelte sich auch in der Expression von Zytokinen und Chemokinen in den Ohrhomogenaten wider, so dass COWDEN et al. (2010) die Beeinflussung der Th2-dominierten Immunantwort durch den H4R postulierten. Auch im Histamin-bedingten Juckreiz spielt der H4R eine Rolle. BELL et al. (2004) stellten fest, dass der Histamin-induzierte Juckreiz hauptsächlich über den H1R und den H4R vermittelt wird. Auch DUNFORD et al. (2007) konnten zeigen, dass durch intradermale Injektion von Histamin ein dosisabhängiger Juckreiz in Wildtyp-Mäusen zu sehen war, der in H4R-Knockout-Mäusen signifikant reduziert war. Auch die orale Gabe von JNJ7777120 hemmte signifikant den Histamin-induzierten Juckreiz in Wildtyp-Mäusen (DUNFORD et al., 2007). Sowohl im TDI- als auch im DNCB-Kontaktallergiemodell konnte JNJ7777120 den Juckreiz, ausgelöst durch Haptenapplikation im Rückenbereich, signifikant hemmen. Dieser Effekt wurde auch durch die Gabe des H1R-Antagonisten Ceterizin erzielt. Die Kombination aus beiden Antagonisten zeigte die stärkste Inhibition (ROSSBACH et al., 2009a). In einem In-vivo-Modell bei Hunden konnte durch intradermaler Applikation von Histamin und den H4R-Agonisten Clobenpropit und VUF8430 zwar eine klassische Quaddel ausgebildet werden, jedoch zeigten die Hunde keinerlei Juckreiz. JNJ7777120 konnte die Quaddelbildung reduzieren (ROSSBACH et al., 2009b). Auch bei Atemwegserkrankungen könnten H4R-Antagonisten eine wichtige Rolle spielen. In einem Ovalbumin-induzierten Asthma-Modell der Maus konnte gezeigt werden, dass der Allergen-induzierte inflammatorische Zellinflux durch JNJ7777120 signifikant gehemmt wurde. Das spiegelte sich in der Verminderung der Gesamtzellzahl, Gesamtleukozytenzahl und Eosinophilenzahl in der bronchioalveolären Lavage wider. Zusätzlich zeigte das Zytokinprofil in T-Zell-Überständen eine Abnahme der Th2-Zytokine, die normalerweise im akuten Entzündungsgeschehen von Asthma vorherrschen. Versuche in H4R-Knockout-Mäusen zeigten ähnliche Ergebnisse: auch hier war die Gesamtzellzahl in der bronchioalveolären Lavage gegenüber Wildtyp-Mäusen vermindert und es konnte ebenfalls eine Reduktion der Th2-Antwort beobachtet werden. Sie zeigten außerdem im Ovalbumin-induzierten Asthma25 Modell der Maus, dass die T-Zell-Infiltration in die Lunge und die Produktion von Th2Zytokinen durch die Gabe des H4R-Antagonisten JNJ7777120 gehemmt werden konnte (DUNFORD et al., 2006). So scheint die Gabe von H4R-Antagonisten eine Möglichkeit zu sein, das Entzündungsgeschehen einer allergischen Reaktion über die Modulation der Th2Antwort zu beeinflussen. In einem Entzündungsmodell des Darms konnte in der Ratte makroskopische Veränderung der Schleimhaut, Schwellung der Mukosa und Submukosa und Infiltration von Neutrophilen durch die H4R-Antagonisten JNJ7777120 gehemmt werden (ZAMPELI et al., 2009). Durch Thioperamid und JNJ7777120 konnte in der Zymosan-induzierten Peritonitis die Anzahl der Neutrophilen gehemmt werden (THURMOND et al., 2004). Daraus kann geschlossen werden, dass der H4R eine interessante Möglichkeit sein kann, um entzündliche Erkrankungen wie Allergie, Autoimmunerkrankungen, rheumatisch bedingte Arthritis zu behandeln (THURMOND et al., 2008; ZAMPELI u. TILIGADA, 2009). Tabelle 2-2: Charakterisierung der Histamin-Rezeptoren bezüglich der Verteilung im Gewebe, physiologischer und pathologischer Funktion, Signaltransduktion, Agonisten und Antagonisten (modifiziert nach JUTEL et al., 2005). H1 R H2 R H3 R H4 R Expression Hämatopoetische Zellen, Zellen des Gefäßsystems Parietalzellen des Magens, Muskulatur des Herzens und der Luftwege Zellen des zentralen Nervensystems Hämatopoetische Zellen Funktion Anstieg der Permeabilität in Gefäßen, Vasodilatation Sekretion der Magensäure, Anstieg von Herzfrequenz und Blutauswurf Neurotransmitter Immunmodulation, Chemotaxis, Zytokinsekretion Signalweg Gαq/11 Phospholipase C (Ca2+) ↑ Gαs Gαi/o Adenylyl cyclase (cAMP) ↓ Phospholipase C (Ca2+) ↑ Gαi/os Adenylyl cyclase (cAMP) ↓ Phospholipase C (Ca2+) ↑ Methimepip, Clobenpropit, Dimaprit Immethridin 4-Methylhistamin Ranitidin, Thioperamid, JNJ7777120, Cimetidin Ciproxifan Thioperamid Agonisten Adenylatcyclase (cAMP) ↑ Pyridylethylamin Amthamin, Antagonisten Clemastine, Cetirizin 26 2.4 Das Immunsystem Der Begriff Immunsystem leitet sich vom lateinischen „immunis“ (frei, unberührt, verschont) ab. Klassischerweise wird es als ein Abwehrsystem des Körpers gegenüber gefährlichen Einflüssen aus der Umwelt wie Pilzen, Bakterien, Viren, Giftstoffen sowie gefährlichen körpereigenen Einflüssen wie etwa entartete Zellen definiert. Im wissenschaftlichen Interesse stehen zwei Seiten des Immunsystems: zum einen die Stärkung der Immunabwehr zur Bekämpfung von Krankheiten, zum anderen das Supprimieren des Immunsystems zur Verhinderung von Autoimmunerkrankungen, Tolerierung nützlicher Mikroben sowie Generierung einer angemessenen, limitierten Immunantwort zur Vermeidung von Gewebeschäden. Des Weiteren manipuliert man das Immunsystem zur Tolerierung fremder Organtransplantate. Das Immunsystem wird eingeteilt in ein unspezifisches angeborenes und ein spezifisches adaptives System. Sie bedingen sich gegenseitig und nur durch eine gute Zusammenarbeit beider kann eine komplexe Immunreaktion des Körpers ermöglicht werden. Abbildung 2-3: Übersicht über den Aufbau des Immunsystems (modifiziert nach JANEWAY et al., 2001) Zum unspezifischen Immunsystem gehören z.B. der Säuremantel der Haut, physikalische Barrieren wie Epidermis und Schleimhäute, zellvermittelte Gegenwehr durch Phagozytose, das Komplementsystem und zelluläre Bestandteile. Es wird als unspezifisches System bezeichnet, weil es unhabhängig vom jeweils eindringenden Erreger auf gleiche Weise aktiv 27 wird. Diese Mechanismen stehen größtenteils auch schon Neugeborenen zur Verfügung. Durch die zellulären Bestandteile wie phagozytierende Zellen (Makrophagen, neutrophile Granulozyten, Monozyten) sowie basophile und eosinophile Granulozyten, Mastzellen und natürliche Killerzellen (NK) werden Pathogene direkt bekämpft, ohne dass der Organismus zuvor mit dem Erreger bereits Kontakt hatte. Im Gegensatz dazu ist das antigenspezifische oder auch adaptive Immunsystem lernfähig, so dass es mit verbesserten Mechanismen auf wiederholt attackierende, bereits bekannte Erreger reagieren kann. So bleiben nach einer Infektion spezifische Antikörper und Gedächtniszellen erhalten, um bei erneutem Kontakt mit dem Krankheitserreger binnen kurzer Zeit eine angemessene Abwehrreaktion zu ermöglichen. Es beruht auf Lymphozyten, die aus der lymphatischen Vorläuferzelle des Knochenmarks entstehen. Es gibt zwei Klassen von Lymphozyten: B-Lymphozyten (B-Zellen) sowie T-Lymphozyten (T-Zellen). Nach ihrer Aktivierung durch Zytokine, zu denen unter anderem Interleukine und Chemokine gehören, differenzieren sich die B-Zellen zu Antikörper-produzierenden Plasmazellen. T-Zellen bilden zwei Klassen, von denen die eine bei Aktivierung zu einer zytotoxischen T-Zelle wird, die virusinfizierte Zellen abtötet, die zweite Klasse umfasst Zellen, die wiederum andere Zellen wie B-Zellen oder Makrophagen, aktivieren (JANEWAY, 2001). 2.4.1 T-Helferzellen – Th1/Th2 Balance T-Zellen werden aufgrund spezifischer Oberflächenmoleküle in zwei Hauptgruppen unterteilt: die zytotoxische T-Zelle (CD8+), die den Oberflächenmarker CD8 (cluster of differentiation) exprimiert, und die T-Helferzellen (CD4+) mit dem Oberflächenmarker CD4 (CANTOR u. BOYSE, 1975). Beide Zellgruppen exprimieren den T-Zell-Rezeptor (TZR), der zur Familie der Immunoglobulin-Rezeptoren gehört und sie befähigt, Antigene zu erkennen (BENTLEY u. MARIUZZA, 1996). Der TZR kann nur Antigene erkennen, die ihm in Form codierter Proteine von der Gengruppe der major histocompatibility complex (MHC) präsentiert werden (DEMBIC et al., 1986). Die MHCs werden in zwei Klassen unterteilt: MHC I bindet nur an den TZR, wenn, wie bei zytotoxischen Zellen der Fall, das Oberflächenmolekül CD8 auf der T-Zelloberfläche exprimiert wird. Im Gegensatz dazu bindet MHC II an den TZR von T-Helferzellen, die CD4 exprimieren. Nur die Kombination der Oberflächenmarker CD4+ bzw. CD8+ mit dem TZR auf Seite der T-Zelle macht es möglich, Proteine, die über die MHCs präsentiert werden, zu erkennen und zu binden (BEVAN, 2004). 28 Abbildung 2-4: Aus Nature Review Immunology von Michael J. BEVAN, 2004 (Helping the CD8+ T-cell response) T-Helferzellen (Th) lassen sich in unterschiedliche Gruppen unterteilen, unter anderem Th1-, Th2- und Th17-Zellen, die sich durch Expression verschiedener Zytokine und in ihrer Funktion unterscheiden (SEDER u. PAUL, 1994; LIANG et al., 2006). Aus den naiven T-Zellen entwickeln sich nach Antigenkontakt die unterschiedlichen Gruppen in Abhängigkeit des Zytokinprofils in der Zellumgebung. Obwohl die Differenzierung auch durch die Antigenkonzentration und die Art der kostimulatorischen Moleküle beeinflusst wird, spielen Zytokine die größte Rolle in der Regulation des Differenzierungsprozesses (ABBAS et al., 1996; O ́GARRA et al., 1998). Herrscht ein IL-12 und IFN-γ dominiertes Milieu vor, entwickelt sich die naive T-Zelle zu einer Th1-Zelle, die vorwiegend IL-2, TNF und IFN-γ sezerniert. Dahingegen entwickelt sie sich unter IL-4-Einfluss zu einer Th2-Zelle, 29 die ihrerseits IL-4, IL-5, IL-10 und IL-13 sezerniert. Zudem entwickelt sich die seit kurzem bekannte Th17-Zelle unter IL-6-Einfluss und sezerniert IL-22, TNF-α und IL-17 (KIMURA u. KISHIMOTO, 2010; OZDEMIR et al., 2010). Die Unterscheidung der Klassen ist wichtig für die Physiologie und Pathophysiologie der Immunantwort, denn es dominieren entweder Th1- oder Th2-Zellen. MOSMANN u. COFFMAN (1989) zeigten, dass sie sich in der Maus gegenseitig unterdrücken. Die Th1-Immunantwort ist verantwortlich für die Bekämpfung von intrazellulären Pathogenen und Viren, sie aktivieren Makrophagen und herrschen unter anderem in chronischen Läsionen der atopischen Dermatitis vor. Dahingegen bekämpfen Th2Zellen extrazelluläre Pathogene, aktivieren B-Zellen, wodurch Antikörper produziert werden, und sind im Gegensatz zu Th1-Zellen in akuten Läsionen der atopischen Dermatitis zu finden. Welche Bedeutung die Th17-Zellen haben, ist noch nicht vollständig erforscht. Die Existenz von Th17-Zellen wurde erstmals 2006 in drei unabhängigen Studien vermutet, in denen gezeigt werden konnte, dass die Kombination von TGF-β und dem proinflammatorischen Zytokin IL-6 zur Produktion von IL-17 führte (VELDHOEN et al., 2006). Experimentelle Arbeiten zeigten, dass Th17-Zellen beteiligt sind an der Entstehung von Hautentzündungen und Autoimmunerkrankungen (ASARCH et al., 2008). 2.4.2 Dendritische Zellen Dendritische Zellen (DC, dendritic cells) wurden erstmals 1868 von dem Medizinstudenten Paul Langerhans in der Epidermis der Haut entdeckt. Nach ihm wurden zu einem späteren Zeitpunkt eine Untergruppe der dendritischen Zellen, die sogenannten Langerhans-Zellen (LC, langerhans cells) benannt. Erst 104 Jahre später begannen STEINMAN und COHN (1973) diese besondere Zelle genauer zu charakterisieren und es wurden erstmals Funktionen und Bedeutungen beschrieben, wie sie heute bekannt sind (STEINMAN u. COHN, 1973). DC gehören zur Gruppe der Antigen-präsentierenden Zellen (APC, antigen presenting cells), sie stellen neben Makrophagen und B-Lymphozyten die wichtigste und effektivste Komponente dieser Zellgruppe dar. Sie spielen als APC eine zentrale Rolle in der Induktion der Immunantwort (BANCHEREAU u. STEINMAN, 1998) und werden daher auch als „Wächter des Immunsystems“ bezeichnet. Man findet DC in allen lymphatischen Geweben, aber auch in nahezu allen nicht lymphatischen Geweben von Säugetieren. Eine charakteristische Eigenschaft der dendritischen Zellen ist ihre sternförmige Gestalt. Die Zellen bilden dünne zytoplasmatische Ausläufer, die bis zu 10 µm lang werden können. 30 Dadurch vergrößern sie ihre Zelloberfläche und damit ihre Möglichkeit Zell-Zell-Kontakte einzugehen (STEINMAN et al., 2000). Die unreifen (immature) Vorläuferzellen entwickeln sich aus den hämatopoetischen Stammzellen des Knochenmarkes und zirkulieren in allen peripheren Geweben. Sie nehmen die Pathogene durch Phagozytose, Makropinozytose oder rezeptorvermittelte Endozytose auf. Nach Antigenaufnahme migrieren die DC in Lymphorgane, wo sie sich zu reifen (mature) DC entwickeln. Aus einer ruhenden, phagozytierenden Zelle hat sich eine migrierende, antigenpräsentierende Zelle entwickelt. Das Pathogen bzw. Antigen wird in der Zelle durch Proteasen zu Peptiden zerkleinert, die über MHC II anderen zirkulierenden Zellen präsentiert wird. Antigen-spezifische Lymphozyten, T-Zellen und B-Zellen, werden angezogen und zur Ausdifferenzierung angeregt. Sowohl reife DC als auch aktivierte T-Zellen produzieren vermehrt Zytokine, wodurch wiederum Makrophagen, natürliche Killerzellen und Eosinophile aktiviert werden. Im Gegensatz dazu differenzieren aktivierte B-Zellen zu Antikörperproduzierenden Plasmazellen. Nachdem die dendritische Zelle das primäre Immunsystem induziert hat, stirbt sie durch Apoptose (BANCHEREAU u. STEINMAN 1998). 2.4.3 Interaktion zwischen dendritischen Zellen und T-Helferzellen Die Interaktion zwischen maturer dendritischer und naiver T-Zelle spielt eine wichtige Rolle im Ablauf der Immunantwort. Die DC beeinflusst die Entwicklung der T-Zellen in Richtung Th1- bzw. Th2-Polarisierung, wodurch es entweder zu einer zellulären oder einer humoralen Immunantwort kommt. Eine wichtige Rolle bei der Induktion einer Th1- oder Th2-Antwort durch DC spielen die Pathogen-assoziierten Faktoren, die vor der T-Zell-Aktivierung auf die DC einwirken, auch bezeichnet als pathogen associated molecular patterns (PAMPs). Die PAMPs stellen eine sehr heterogene, vielfältige Gruppe dar. Unter ihnen befinden sich Moleküle wie das Lipopolysaccharid (LPS) Gram-negativer Keime oder auch die Lipoteichonsäure (LTA) Gram-positiver Bakterien. Treffen DC auf Pathogene, die sie an ihren konservierten PAMPs wie zum Beispiel LPS erkennen, binden sie diese mit Hilfe von Oberflächenrezeptoren, sogenannte pathogen recognition receptors (PRRs) (DIEBOLD, 2009). Eine wichtige Gruppe unter den PRRs stellen die Toll-Like-Rezeptoren (TLRs) dar. Abhängig von der Art des erkannten Pathogens reagiert das Immunsystem mit der Induktion verschiedener Signalwege, die durch TLRs in die Wege geleitet werden. Bindet beispielsweise LPS an eine DC, läuft die Signalkaskade über den TLR4. Zudem leiten DC unabhängig vom Stimulus, der an unterschiedlichen TLRs binden kann und dadurch die 31 Ausschüttung von unterschiedlichen Zytokinen bedingt, eine Th1- oder Th2-Antwort ein (AGGRAWAL u. RAO, 1998). Die Aktivierung der T-Zellen ist abhängig von drei Signalen, die parallel zwischen DC und T-Zellen stattfinden. Das erste Signal beruht auf der Bindung des TZRs an ein über den MHC II präsentiertes Antigen auf der Oberfläche der DC. Als Signal 2 bezeichnet man die Co-Stimulation der T-Zelle durch Bindung der Oberflächenmarker CD80/86 auf Seite der DC an den Oberflächenmarker CD28 auf der TZell-Seite. Findet die Bindung dieser Oberflächenmarker nicht statt, bildet sich aus der TZelle eine inaktive, tolerante T-Zelle, die keine Fremdantigene im Körper erkennt. Dahingegen führt die Stimulation des TZRs in Verbindung mit dem Co-Signal zu der Entwicklung der naiven T-Zelle in eine protektive Effektor-T-Zelle, die vermehrt selektive Zytokine sezerniert. Die Differenzierung der T-Zelle in Th1 bzw. Th2 ist unabhängig von Signal 1 und Signal 2, sie wird ausschließlich von Signal 3 beeinflusst. Signal 3 ist verantwortlich für die Ausschüttung Th-Zell-polarisierender Moleküle. Es konnten schon mehrere von diesen Signal-3-Molekülen identifiziert werden. Die Ausschüttung dieser polarisierenden Moleküle wird beeinflusst durch PAMPs, die an den PRR binden. Je nachdem, ob eine Th1- oder eine Th2-Immunantwort nötig ist, werden unterschiedliche Zytokine oder Chemokine ausgeschüttet. So sind Th1-polarisierende Faktoren zum Beispiel die Mitglieder der IL-12-Familie, IL-12, IL-23 und IL-27 sowie Typ1-Interferone. Th2-Zellpolarisierende Moleküle sind CCL2, IL-10 oder auch TGF-β (KAPSENBERG, 2003). Diese Zytokine binden wiederum an einen für sie spezifischen Rezeptor, so dass die T-Zelle sich in die gewünschte Richtung differenzieren kann. Abbildung 2-5: Abhängigkeit der T-Zell-Stimulation und T-Helfer-Zell-Polarisation von drei Signalen der dendritischen Zelle (KAPSENBERG, 2003) 32 2.5 Die Interleukin-12-Familie Interleukine stellen einen wichtigen körpereigenen Botenstoff von Zellen des Immunsystems dar. Sie gehören zu einer Gruppe von Peptidhormonen, den sogenannten Zytokinen. Sie vermitteln die Kommunikation zwischen Leukozyten und anderen an der Immunreaktion beteiligten Zellen. Aufgrund Ihrer funktionellen Zusammengehörigkeit können verschiedene Familien unterschieden werden, wovon eine die Interleukin-12-Familie (IL-12-Familie) darstellt. Die IL-12-Familie setzt sich zusammen aus drei Zytokinen: IL-12, IL-23 und IL-27. Anfang der 90er Jahre wurde IL-12, damals bekannt unter dem Namen natural killer cell stimulatory factor (NKSF), als erstes der drei Zytokine charakterisiert. Alle drei Moleküle bestehen aus je zwei Untereinheiten und stellen somit Heterodimere dar. IL-12 setzt sich zusammen aus einem 40kDa (p40) und einem 35kDa (p35) schweren Teil. Erst 10 Jahre später wurde IL-23 charakterisiert, ein aus p40 und p19 bestehendes Heterodimer (OPPMANN et al., 2000). Einige Zeit später wurde IL-27 der IL-12-Familie zugeordnet. Es ist ebenfalls ein Heterodimer, zusammengesetzt aus dem p40-verwandten EBI3 (EpsteinBarr-Virus induziertes Gen 3) und dem p35-verwandten Protein p28. Alle drei Zytokine gelten als proinflammatorisch und beeinflussen die Entwicklung der T-Zellen. Dieser Schritt, bei dem eine naive CD4+-T-Zelle zu einer Th1- oder Th2-Zelle wird, hat einen entscheidenden Einfluss darauf, wie die adaptive Immunantwort ausfällt, ob hauptsächlich Makrophagen aktiviert oder aber Antikörper gebildet werden. Abbildung 2-6: Schematische Darstellung der Interleukine (PFLANZ et al., 2002) 33 2.5.1 Interleukin-12 Struktur und Bedeutung Im Jahr 1991 wurde das Zytokin IL-12 charakterisiert. Es gehört zu der Gruppe der proinflammatorischen Zytokine und entsteht bei vielen Infektionen in der frühen Phase. Es wird von DC, B-Zellen, Monozyten, neutrophilen Granulozyten und Makrophagen gebildet und sezerniert. Eine zentrale Rolle nimmt IL-12 bei der funktionellen Differenzierung naiver CD4+ T-Zellen in reife Th1-Effektor-Zellen sowie bei der Aktivierung von NK und CD8+ T-Zellen ein (TRINCHIERI et al., 2003; HÖLSCHER, 2004; BROMBACHER et al., 2003; WOLF et al., 1991). Durch Stimulierung natürlicher Killerzellen leitet IL-12 die Th1 vermittelte Immunantwort ein und erhält sie aufrecht, wodurch die zellvermittelte Immunantwort begünstigt wird. Zusätzlich steuert das von Makrophagen sezernierte IL-12 in Zusammenarbeit mit IFN-γ die Differenzierung aktivierter naiver CD4+-T-Zellen zu Th1-Effektorzellen. Kommt es auf DC zu einer Stimulation der Toll-Like-Rezeptoren TLR4 oder TLR9 wird die Produktion von IL-12 induziert und es kommt zusätzlich zu einer Expression von Co-stimulatorischen Molekülen wie CD40 (AKIRA et al., 2001). Binden von DC präsentierte parasitäre Antigene an den TZR, bedarf es eines Costimulus durch einen CD40-Ligand auf Seiten der T-Zellen, um die IL-12 Produktion in Gang zu setzen (CELLA et al., 1996). IL-12 ist ein durch Disulfidbrücken verbundenes Heterodimer (TRINCHIERI, 1995). WOLF et al. (1991) gelang es, die cDNA von beiden Untereinheiten, p40 und p35, zu klonieren (WOLF et al., 1991). Die kleinere Untereinheit p35 ist verwandt mit den Zytokinen IL-6 und GM-CSF. p40 hingegen hat keinerlei Homologien zu anderen Zytokinen, wobei es am ehesten der extrazellulären Domäne des IL-6-Rezeptors entspricht (GATELY et al., 1998). Die p40-Untereinheit von IL-12 wird im Gegensatz zur p35-Untereinheit nicht nur als Heterodimer, sondern auch als Homodimer unabhängig sezerniert (GILLESSEN et al., 1995). Das Homodimer kann sowohl antagonistisch als auch agonistisch auf den IL-12-Rezeptor wirken (GILLESSEN et al., 1995; HÖLSCHER et al., 2001; GATELY et al., 1996). Des Weiteren kann die IL-12p40-Untereinheit zusammen mit einem 19kd schweren Protein das IL-12-verwandte Zytokin IL-23 bilden (OPPMANN et al., 2000). Der IL-12-Rezeptor (IL-12R) ist auf aktivierten T-Zellen und NK-Zellen, aber auch auf DC zu finden. Der IL-12R ist ein Typ 1 transmembraner Zytokinrezeptor, der aus einer β1- und einer β2-Untereinheit besteht, die strukturelle Verwandtschaft zu der gp130-Untereinheit der Zytokinrezeptorfamilie aufweisen (GATELY et al., 1998). Die p35-Untereinheit bindet an die 34 IL-12Rβ2-Kette, während die p40-Untereinheit die IL-12Rβ1-Kette besetzt (PRESKY et al., 1996). Die IL-12Rβ2-Untereinheit wird auf humanen Th1-, jedoch nicht auf Th2-Zellen exprimiert und ist damit in vitro ein entscheidender Faktor bei der Differenzierung der Th-Zellen. Detaillierte Analysen von ROGGE et al. (1997) zeigten, dass IL-4 zu einem großen Teil für die Unterdrückung der IL-12Rβ2 Kette verantwortlich ist. Eine unabhängige Expression von IL-12Rβ1 wurde bei mehreren Zelltypen festgestellt, im Falle von IL-12R2 jedoch nur bei CD4+ T-Zellen (ROGGE et al., 1997). Die IL-12Rβ2 Untereinheit vermittelt hauptsächlich die Signaltransduktion. Der Signaltransduktionsweg erfolgt durch die Bindung beider Untereinheiten des IL-12 an den IL-12R, die zu einer Phosphorylierung der Janus Kinasen JAK2 und TYK2 führt. Die Effekte der Rezeptorbindung sind hauptsächlich auf die Phosphorylierung von „Signal transducer and activator of transcription“ STAT4 zurückzuführen. Die Expression von STAT4 wird reguliert durch die Aktivierung von T-Zellen (BACON et al., 1995a; BACON et al., 1995b). Physiologische und pathophysiologische Funktionen IL-12 ist ein immunregulatorisches Zytokin, das eine zentrale Rolle in der Einleitung der zellvermittelten Immunantwort spielt (GATELY et al., 1998). Wird IL-12 ausgeschaltet, kommt es zu einer gestörten IFN-γ-Produktion und Th1-Reaktion. Unter anderem IL-10, aber auch Th1-assoziierte Zytokine wie Typ-1-Interferone und TNFα blockieren in vitro IL-12 (ASTE-AMEZAGA et al., 1998; MA u. TRINCHIERI, 2001). Eine weitere Regulation erfährt IL-12 über die „suppressors of cytokine signalling“ (SOCS)-Familie. SOCS-1 und SOCS-3 blockieren IL-12-Signalwege und führen zu einer verminderten IFN--Produktion (EYLES et al., 2002). Zytokine wie GM-CSF aktivieren DC besonders effektiv, so dass sie co-stimulierende Signale exprimieren. Bei Infektionen fällt IL-12 eine wichtige Rolle zu, hauptsächlich bei Infektionen mit intrazellulären Pathogenen. In murinen Modellen wurde die essentielle Bedeutung von IL-12 bei der Abwehr von intrazellulären Krankheitserregern demonstriert. Studien an IL-12-defizienten Mäusen haben gezeigt, dass endogenes IL-12 eine entscheidende Rolle in der Abwehr von Infektionen spielt. Defekte im IL-12-Signalweg oder eine Blockade von IL-12 führt zu einer erhöhten Empfindlichkeit gegenüber intrazellulären Infektionenserregern wie Leishmanien, Mykobakterien und Trypanosoma (MATTNER et al., 1996; MURRAY et al., 2006; YAP et al., 2000; DE JONG et al., 1998; ALTARE et al., 1998; CASANOVA u. ABEL, 2004). In unterschiedlichen Untersuchungen konnte darüber hinaus eine differentielle Bedeutung der p35- und p40-Untereinheit beschrieben werden. So zeigte sich bei 35 p35-Knockout-Mäusen im Gegensatz zu Wildtyp-Mäusen eine erhöhte Resistenz gegen Mykobakterien (WAKEHAM et al., 1998; HÖLSCHER et al., 2001; KHADER et al., 2006; EHLERS et al., 2005). Neben der beschriebenen Rolle bei protektiven Immunantworten spielt IL-12 eine wichtige Rolle bei überschießenden Immunantworten, Erkrankungen des Menschen zu denen Morbus Crohn und rheumatoide Arthritis zählen. Eine Behandlung mit anti-IL-12p40-Antikörpern brachte bei Morbus Crohn-Patienten eine Besserung der akuten Symptomatik (MANNON et al., 2004). In einem Mausmodell der rheumatoiden Arthritis und der Collagen-induzierten Arthritis wiesen IL-12p35/p40-Knockout-Mäuse eine weniger ausgeprägte Erkrankung auf (MC INTYRE et al., 1996). Im Falle der Experimentellen Autoimmunen Enzephalitis (EAE), einem Mausmodell für Multiple Sklerose, verschlimmerte eine Gabe von rekombinanten IL-12p40 die Ausprägung der Entzündungsreaktion (MC INTYRE et al., 1996; LEONARD et al., 1996). 2.5.2 Interleukin-23 Struktur und Vorkommen Vor wenigen Jahren wurde Interleukin-23 als das zweite Mitglied der IL-12-Familie charakterisiert. Das Heterodimer setzt sich zusammen aus einem 19kDa schweren Protein (p19) und der von IL-12 bekannten Untereinheit p40 (OPPMANN et al., 2000). Sezerniert wird p19 vor allem von aktivierten DC und phagozytierenden Zellen. IL-23 bindet an seinen Rezeptor, der dem IL-12 entsprechend aus zwei Ketten besteht: p40 bindet an die IL-12R1Kette, p19 an eine IL-23R genannte Kette. Die humanen Rezeptorketten werden vornehmlich auf aktivierten T-Zellen, Gedächtnis-T-Zellen und NK-Zellen, zu einem geringen Grad aber auch auf Monozyten, Makrophagen und DC exprimiert. Im murinen Organismus findet sich der Rezeptor auf aktivierten T-Zellen, auf aus Knochenmark generierten DC sowie auf aktivierten Makrophagen (TRINCHIERI et al., 2003; BROMBACHER et al., 2003; LANGRISH et al., 2004; HUNTER, 2005). Die Bindung von IL-23 an den IL-23-Rezeptor (IL-23R) bewirkt eine Aktivierung von JAK-Kinasen, die den IL-23R phosphorylieren, so dass STATs (STAT 1, 3, 4 und 5) binden und ebenfalls dimerisieren werden können. Über die Regulation der IL-23p19-Expression ist bislang wenig bekannt. Ebenso wie IL-12 wird die Transkription über Aktivierung des Transkriptionsfactors c-Rel, der zur NF⎢B Familie gehört, beeinflusst (SANJABI et al., 2000; 36 GRUMONT et al., 2001; CARMONDY et al., 2007). Auch der Interferon-Regulatory-Factor5 (IRF) führt sowohl zur IL-12-, als auch zur IL-23-Expression (OUYANG et al., 2007). Bei Abwesenheit von IRF-1 und -8, welche die IL-12-Expression stimulieren, scheint die IL-23Synthese gesteigert (GORIELY et al., 2008). Der TLR-2-Ligand Peptidoglykan (PGN) ist ein potenterer Induktor der IL-23-Expression als das TLR-4-bindende LPS (CARMONDY et al., 2007; RE u. STROMINGER, 2001). Des Weiteren scheinen C-Typ Lektine bevorzugt zur Synthese von IL-23 zu führen (LEIBUNDGUT-LANDMANN et al., 2007), ebenso wie Prostaglandin E2 (PGE2) und Adenosintriphosphat (ATP) (SHEIBANIE et al., 2004; SCHNURR et al., 2005). Physiologische und pathophysiologische Funktionen IL-23 scheint die zentrale Rolle in der Pathogenese diverser Autoimmunerkrankungen wie Experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) (CUA et al., 2003; MURPHY et al., 2003), Collagen-induzierten Arthritis (CIA) (MURPHY et al., 2003) und experimenteller Colitis (UHLIG et al., 2006; YEN et al., 2006) zu spielen. Die genetische Deletion von IL23p19, nicht aber von IL-12p35, schützt Mäuse vor EAE und CIA. Im Rahmen der Helicobacter-induzierten T-Zell-abhängigen Colitis zeigten Mäuse mit einer p19-Defizienz eine leichtere Form der Erkrankung, während IL-12p35-Knockout Mäuse eine ausgeprägte Pathologie entwickelten (KULLBERG et al., 2006; HUE et al., 2006). Als grundlegend für die Erregerabwehr und Autoimmunerkrankungen wird derzeit die von IL-23 beeinflusste IL17-Produktion postuliert. IL-17 wirkt als proinflammatorisches Zytokin, das im Gewebe für eine Ausschüttung proinflammatorischer Mediatoren wie IL-8, CXCL-1, TNFα und G-CSF und somit für den Einstrom neutrophiler Granulozyten sorgt (AGGRAWAL et al., 2003; KOLLS et al., 2004; KELLY et al., 2005). IL-23-Knockout-Mäuse wiesen im Vergleich zu EAE-anfälligen Wildtyp-Mäusen gleiche Mengen an IFN-γ-produzierenden Zellen auf; die Menge IL-17-produzierender T-Zellen im ZNS war in den p19-defizienten Mäusen jedoch reduziert. Auch führt die Stimulation von aktivierten und Gedächtnis-T-Zellen in Anwesenheit von IL-23 zur Ausschüttung von IL-17 (MURPHY et al., 2003; LANGRISH et al., 2005). IL-23 spielt eine wichtige Rolle bei der Abwehr von Infektionen, z.B. mit Cryptococcus neoformans und Klebsiella pneumoniae. Unter einer Infektion starben Mäuse mit einer Deletion des IL-23p19 eher als der Wildtyp und zeigten eine höhere Erregerlast (KLEINSCHEK et al., 2006; HAPPEL et al., 2005). Bei einer intraperitonealen Infektion mit Toxoplasma gondii bewirkte die Behandlung von IL-12p40-Knockout-Mäusen mit 37 rekombinantem IL-23 einen Überlebensvorteil gegenüber den unbehandelten Kontrollmäusen, die an ungehinderter Parasitenreplikation verstarben (LIEBERMANN et al., 2004). 2.5.3 Interleukin-27 Struktur und Vorkommen Interleukin-27 ist ein heterodimeres Zytokin bestehend aus p28 und dem Eppstein-Barr induzierten Gen 3 (EBI3). Es wird unter anderem von humanen aktivierten Monozyten und murinen Makrophagen exprimiert (PFLANZ et al., 2002; WIRTZ et al., 2005). EBI3 weist Gemeinsamkeiten mit IL12p40 auf (DEVERGNE et al., 1997) und bildet mit p35 das Zytokin IL-35 (CASTELANI et al., 2010). Man kann sowohl Ähnlichkeiten zwischen der p28-Kette und der IL-12-Untereinheit p35 feststellen als auch zwischen EBI3 und der IL-12p40Untereinheit. EBI3 ist zudem auch der Struktur des löslichen IL-6-Rezeptors (IL-6Rα) nahe. Binden Liganden wie LPS oder Poly I:C an Toll-Like-Rezeptoren, wird die Produktion der Untereinheiten induziert (PFLANZ et al., 2002; SCHNURR et al., 2005; WIRTZ et al., 2005). Die Untereinheit p28 kann durch IFN-γ hochreguliert werden, während dies bei EBI3 durch Signalübertragung über CD40L und IL-1β möglich ist (SCHNURR et al., 2005; LIU et al., 2007). Der IL-27 Rezeptor (IL-27R), der von epithelialen Zellen, DC, Monozyten, natürlichen Killerzellen und T-Zellen exprimiert wird, setzt sich zusammen aus dem Signaltransduktionsmolekül Glykoprotein 130 (gp130) und der spezifischen IL-27Rα Kette, die auch WSX-1 oder TCCR (T-cell-cytokine-receptor) genannt wird (SHIBATA et al., 2010). Die IL-27Rα Kette wird ausschließlich auf Immunzellen wie T-Zellen, NK-Zellen, Mastzellen, Monozyten, neutrophilen Granulozyten und B-Zellen exprimiert (PFLANZ et al., 2004; WIRTZ et al., 2005). T-Lymphozyten zeigen die höchste Expressionsrate des IL-27Rα (VILLARINO et al., 2005). Während IL-27 in der Lage ist, auch in Abwesenheit von gp130 an die Kette des IL-27R zu binden, kann eine erfolgreiche Signaltransduktion nur in Anwesenheit beider Untereinheiten erfolgen. LUCAS et al. (2003) konnten zeigen, dass durch Bindung von IL-27 an seinen Rezeptor die Signalübertragung über STAT1 und STAT3 erfolgt (LUCAS et al., 2003). Physiologische und pathophysiologische Funktionen IL-27 induziert die Produktion von IFN-γ in humanen T-Zellen und verstärkt in Kombination mit IL-12 die Entwicklung der Th1-Immunantwort. Ebenso inhibiert IL-27 die 38 Differenzierung der Th17 Zellen (BATTEN et al., 2006; STUMHOFER et al., 2006). Auf der einen Seite hemmt IL-27 die Differenzierung von T-Helferzellen zu Th2 über eine Blockade des Transkriptionsfaktors GATA3, auf der anderen Seite induziert es die Entwicklung von Th1 über T-bet (YOSHIMOTO et al., 2007; PFLANZ et al., 2002; TAKEDA et al., 2003). Die suppressiven Effekte sind abhängig vom STAT1-Signaltransduktionsweg. Eine In-vivoStudie zeigte, dass IL-27R-defiziente Mäuse durchaus in der Lage sind, eine Th1 Antwort aufzubauen, die z.B. ausreicht, um die Parasiten-Vermehrung bei einer Toxoplasma gondii Infektion zu unterdrücken. Allerdings entwickelten diese Mäuse eine tödliche Th-Zellabhängige entzündliche Erkrankung im ZNS (VILLARINO et al., 2003). Auch die Infektion mit Leishmania donovani bei IL-27R-defizienten Mäusen resultiert in Th1-vermittelter Beseitigung des Parasiten, führt jedoch ebenfalls zur Entwicklung einer schweren Immunpathologie in der Leber (ROSAS et al., 2006). STUMHOFER et al. (2007) konnten nachweisen, dass IL-27 über einen STAT3 abhängigen Mechanismus die IL-10-Produktion induzieren kann (STUMHOFER et al., 2007). Abbildung 2-7: Schematische Darstellung der Rezeptoren (modifiziert nach ABBAS, 2010, und NING-WEI, 2010) 2.6 Allergisch entzündliche Hauterkrankungen Nicht nur in der Humanmedizin, sondern auch in der Veterinärmedizin treten vermehrt allergisch bedingte Hauterkrankungen auf, im allgemeinen Sprachgebrauch bekannt als Dermatitis oder Ekzem. Allergien oder Hypersensibilitätsreaktionen entstehen, wenn apathogene Substanzen (Allergene) wiederholt zu überschießenden Immunreaktionen führen. 39 Allergene sind meist exogener Herkunft, zum Beispiel tierischen oder pflanzlichen Ursprungs. Die wichtigsten Dermatitiden stellen die allergische Kontaktdermatitis (ACD) und die atopische Dermatitis (AD) dar. In der Veterinärmedizin lässt sich die atopische Dermatitis vor allem beim Hund beobachten, bei anderen Tierarten spielt sie eine vergleichsweise untergeordnete Rolle. Laut einer Studie, die 2001 in den USA durchgeführt wurde, erkranken 8,7 % der 30.000 untersuchten Hunde an atopischer Dermatitis (AD) (HILLIER u. GRIFFIN, 2001). Die allergische Kontaktdermatitis wird in der Veterinärmedizin nur selten beobachtet. 2.6.1 Atopische Dermatitis Die atopische Dermatits (AD) ist eine chronisch rezidivierende entzündliche Hauterkrankung, die sich beim Menschen vorwiegend im frühen Kindesalter manifestiert (SCHULTZLARSEN u. HANIFIN, 1992), häufig entwickeln betroffene Patienten im Laufe ihres Lebens eine allergische Rhinitis oder allergisches Asthma (GUTERMUTH et al., 2004). Wie auch bei der allergischen Kontaktdermatitis kann man in den letzten Jahren einen Anstieg der Ersterkrankungen in den westlichen Industrieländern verzeichnen (WERFEL et al., 2001). Umweltfaktoren spielen bei der Ätiologie der AD eine entscheidende Rolle (WERFEL, 2009). Im Menschen konnte bei ca. 80 % der Patienten ein erhöhter IgE-Spiegel im Blut nachgewiesen werden (GUTERMUTH et al., 2004). Die AD ist gekennzeichnet durch extremen Juckreiz und eine typische ekzematoide Morphologie und Körperverteilung der Läsionen (HILLIER, 2002). In den letzten Jahren kann man ein vermehrtes Auftreten auch in der Veterinärmedizin beobachten. Hier sind Läsionen hauptsächlich im Bereich des Kopfes, Pfoten und Bauch zu finden (HILLIER, 2002). Die genaue Pathogenese der AD ist noch nicht bis ins letzte Detail geklärt und wird nach wie vor erforscht. Man geht zum jetzigen Zeitpunkt davon aus, dass Allergene aus der Haut von DC aufgenommen werden. Durch die Aktivierung von B- und T-Zellen werden IgE-Antikörper produziert. Durch Kreuzvernetzung dieser kommt es zur Freisetzung von Histamin, Serotonin und anderen entzündlichen und juckreizfördernden Faktoren. Eine Reihe von Untersuchungen weisen zudem auf Dysregulation der zellulären Immunantwort hin (LEUNG et al., 2004). Früher ging man davon aus, dass die AD zu einer Th2-vermittelten Erkrankung zählt (COOPER et al., 2004). Mittlerweile anerkannt ist die Tatsache, dass ein Wechsel von Th2 in der akuten Phase zu einer Th1-vermittelten Immunantwort in der chronischen Phase der AD stattfindet (LEUNG et al., 2004; GREWE et al., 1998; WERFEL et al., 1996; KAPP, 1995; THEPEN et al., 1996). So dominieren in chronischen Ekzemen allergen-spezifische und IFN-γ-produzierende 40 Th1-Zellen. In zahlreichen Arbeiten wurden im peripheren Blut erwachsener Patienten mit AD signifikant mehr IL-4-positive sowie signifikant weniger IFN-γ-positive Th-Zellen gefunden (ALEKSZA et al., 2002; LEUNG, 2000; WERFEL et al., 1996). Nicht nur klinische Übereinstimmungen kann man zwischen caniner und humaner AD feststellen. In den Läsionen entzündeter Haut findet man auch beim Hund vermehrt T-Zellen und DC sowie erhöhte IgE-Spiegel im Blut (OLIVRY u. HILL, 2001; RING et al., 2001). Auch die Zytokinexpression zeigt ähnliche Muster. So fand man in läsionaler Haut atopischer Hunde die Th2-spezifischen Zytokine IL-4 und IL-5 sowie Th1-spezifische wie IFN-γ, TNF-α und IL-2, so dass auch beim Hund ein Wechsel des Zytokinmusters von Th2 zu Th1 in chronifizierten Läsionen wahrscheinlich ist (NUTTALL et al., 2002a, 2002b; OLIVRY u. HILL, 2001; MAEDA et al., 2008). 2.6.2 Allergische Kontaktdermatitis Die allergische Kontaktdermatitis (ACD) stellt den Prototyp einer durch T-Zellen vermittelten Immunreaktion dar. Definiert ist sie als eine Intoleranzreaktion der Haut gegen äußerlich einwirkende nicht-infektiöse Noxen, sogenannte Kontaktallergene. In den letzten Jahren kann eine deutliche Zunahme der allergischen Kontaktdermatitis in den westlichen Industrieländern verzeichnet werden, die Prävalenz der manifesten ACD liegt in Deutschland, der Schweiz und Österreich bei ungefähr 7 % (SCHNUCH et al., 2002). Die ACD wird hauptsächlich durch niedermolekulare Haptene hervorgerufen, die erst nach Bindung an körpereigene Proteine zum Allergen werden (EISEN et al., 1952). In der asymptomatischen Sensibilisierungsphase nehmen Langerhanszellen und dermale DC das entsprechende Allergen aus der Epidermis auf und wandern über afferente Lymphgefäße in regionale Lymphknoten und präsentieren dieses dort mit Hilfe des MHC II den T-Lymphozyten, die sich zu spezifischen T-Zellen entwickeln. Kommt der Organismus in der sogannten Challengephase erneut in Kontakt mit diesem Allergen, werden die im Blut zirkulierenden spezifischen T-Zellen aktiviert, die eine Vielzahl an Zytokinen exprimieren. Durch Aktivierung von Entzündungszellen, die in die betroffenen Gebiete einwandern, wird eine klinisch manifeste Entzündungsreaktion in Form eines Kontaktekzems ausgelöst (KRASTEVA et al., 1999). Zwischen der Sensibilisierungsphase und der Challengephase kann eine Latenzperiode von wenigen Tagen aber auch mehreren Jahren liegen. Lange Zeit ging man davon aus, dass das allergische Kontaktekzem als klassische Th1-Reaktion einzustufen ist, mehrere Studien zeigten allerdings, dass man von einem biphasischen Verlauf 41 der Entzündung ausgehen kann. Initial handelt es sich demnach um eine Th2-Reaktion mit vermehrtem Auftreten von Th2-spezifischen Zytokinen, in der chronischen Phase herrschen vorwiegend Th1-spezifische Zytokine vor (WERFEL et al., 1997). Die ACD kann in zwei Formen auftreten: als IgE-vermittelte Reaktion vom Soforttyp (Typ I) oder als zellvermittelte Reaktion vom Spättyp (Typ IV). Die Typ I Reaktion führt innerhalb von Sekunden oder Minuten zur Ausbildung von klinischen Symptomen, wohingegen es bei der Typ IV Reaktion zwischen 24 und 48 Stunden dauern kann. Häufig treten beide Reaktionen in Kombination auf. Durch die Antigenpräsentation von aktivierten B-Zellen wird antigenspezifisches IgE gebildet, das sich hauptsächlich in gebundener Form auf Mastzellen und basophilen Granulozyten befindet. Bei wiederholtem Kontakt des Allergens mit dem spezifischen IgE kommt es zu einer Kreuzvernetzung, wodurch Mastzellen aktiviert werden und degranulieren. Dabei werden inflammatorische Mediatoren wie Histamin und Leukotriene freigesetzt, die bekannte Symptome wie Konjunktivitis, Asthma, Urtikaria oder anaphylaktische Schocks auslösen (JANEWAY u. TRAVERS, 2001). 2.6.3 Murine Kontaktallergiemodelle Um allergische Hauterkrankungen erforschen und geeignete Therapeutika entwickeln zu können, wurden verschiedene Tiermodelle entwickelt. Sowohl bei der AD als auch der allergischen Kontaktdermatitis befinden sich vorwiegend T-Zellen vom Typ T-Helferzelle (CD4+) in entzündeten Hautarealen. In beiden Entzündungsgeschehen herrschen in akuten Läsionen vor allem Th2-spezifische Zellen, in chronischen Läsionen vor allem Th1-spezifische Zellen vor. Aus diesem Grund wurden unabhängige Mausmodelle entwickelt, die je eine Situation widerspiegeln. Die in diesen Modellen verwendeten Kontaktallergene sind Oxazolon, Toluen-2,4-diisocyanat (TDI), 2,4-Dinitrochlorbenzen (DNCB) und Fluorescein-Isothiocyanat (FITC). Sie werden als sogenannte strong haptens bezeichnet, da sie in fast allen Individuen eine 100 %ige Sensibilisierungsstärke aufweisen (KRASTEVA et al., 1999). Eine durch DNCB ausgelöste Kontaktallergie entwickelt ein Th1-vermitteltes Entzündungsgeschehen, im Gegensatz dazu herrscht ein Th2-vermitteltes Entzündungsgeschehen in dem FITC- und auch TDI-Modell vor (BÄUMER et al., 2004). Induziert man eine Th1-Immunantwort, werden für dieses Entzündungsgeschehen charakteristische Zytokine sezerniert (CUMBERBATCH et al., 2003; HOPKINS et al., 2005). Die Haptene FITC und TDI werden als „chemical respiratory antigens“ bezeichnet, da sie neben ihrer Haut-sensibilisierenden Eigenschaften 42 auch das Potential zur Atemwegssensibilisierung besitzen (SCHEERENS et al., 1999). Die durch sie ausgelösten Allergien führen zu einem 6 bis 12-fachen Anstieg der antigenspezifischen IgE-Antikörper im Serum, im DNCB-Modell konnte dies nicht beobachtet werden (DEARMAN u. KIMBER, 1991; POTTER u. WEDERBRAND, 1995). In einer Studie konnten bei einer durch FITC ausgelösten Entzündung erhöhte Spiegel der Th2-spezifischen Zytokine IL-4 und IL-10 nachgewiesen werden, das Th1-Zytokin IFN-γ dagegen nur in geringen Mengen (DEARMAN u. KIMBER, 2000). Auch im TDI-Modell wurden im Gewebe erhöhte Konzentrationen von IL-4 nachgewiesen (BÄUMER et al., 2004). 43 3 Material und Methoden 3.1 Geräte und Reagenzien 3.1.1 Geräte für In-vitro-Versuche Sterilbank Dynatech Laboratories, Denkendorf Kühlzentrifuge Eppendorf 5804 R, Hamburg Brutschrank US Auto Flow, Zapf, Sarstedt Wasserbad Büchi, Laboratoriumstechnik, Schweiz Mikroskop Axiovert 25, Zeiss, Jena Vortex : REAX top Heidolph, Nürnberg Sterilfilter Minisart, Sartorius, Göttingen Polypropylen-Röhrchen (15 ml/50 ml) Greiner, Frickenhausen Polystyrol-Petrischalen (100 mm x 20 mm) tissue culture dish cell+ Sarstedt, Nümbrecht Well-Platten (6-, 12-, 24-, 48-, 96- Well) Greiner, Frickenhausen 96-Well-Platten, round-bottom Greiner, Frickenhausen Pipetten Eppendorf, Hamburg Pipettenspitzen Eppendorf, Hamburg Einmalspritzen (2/10 ml) Omnifix, Braun, Melsungen Kanülen Henry Schein Medical, Hamburg Feinwaage, Sartorius 2002 MPI Sartorius, Göttingen Magnetrührer Ika, Staufen Neubauer-Zählkammer Neubauer, VWR, Mannheim Skalpellklingen Bayha, Tuttlingen Zentrifuge 5403 Eppendorf, Hamburg 44 Flawil, 3.1.2 Reagenzien für In-vitro-Versuche RPMI-1640-Medium Biochrom, Berlin Penicillin Invitrogen GmbH, Karlsruhe Streptomycin Invitrogen GmbH, Karlsruhe 10 % fetales Kälberserum Biochrom, Berlin β-Mercaptoethanol Sigma, Steinheim GM-CSF R&D-Systems, Wiesbaden Polyvidon-Iod-Lösung Braunol, Braun, Melsungen Lipopolysaccharid (LPS) E.coli O127 B8, Sigma, Steinheim Peptidoglykan (PGN) Sigma-Alderich Chemie, Deisenhofen Lipoteichonsäure (LTA) Sigma-Alderich Chemie, Deisenhofen Trypanblau Sigma, Steinheim Bovines Serum Albumin (BSA) Sigma, Steinheim Ethanol Sigma, Steinheim 3.1.3 Geräte für In-vivo-Versuche Einmalrasierer Wilkinson, Solingen Schermaschine Moser Elektrogeräte GmbH, Unterkirnach Pipetten Eppendorf, Hamburg Pipettenspitzen Eppendorf, Hamburg Folienstift Staedtler, Nürnberg Cutimeter Modell 7309, Mitutoyo, Neuss Feindosierungsspritzen, 1 ml Omnifix, Braun, Melsungen Kanülen, 26 G Omnifix, Braun, Melsungen Kanülen, 30 G Becton, Dickinson, GmbH, USA 45 3.1.4 Reagenzien für In-vivo-Versuche Veet®-Enthaarungscreme Reckitt Benckiser Deutschland GmbH, Mannheim Freund`s Complete Adjuvans Sigma, Steinheim Ethanol Sigma, Steinheim Dimethylsulfoxid (DMSO) Merck, Darmstadt Toluol-2,4-diisothiocyanat (TDI) Sigma, Steinheim Fluorescin Isothiocyanat (FITC) Sigma, Steinheim Arachidonsäure (AA) Sigma, Steinheim 3.1.5 Geräte/Reagenzien für ELISA und Proteinextraktion IL-10-, IL-12-, IL-23-, IL-27-, TNF-α-, CCL2, IL-6-, IL-17-ELISA R&D Systems, Wiesbaden Polystyrol-Nunc-Immuno-Platte Nunc GmbH, Wiesbaden Waschpipette Eppendorf, Hamburg Photometer Microplate Reader MRX, Dynatech Bovines Serum Albumin (BSA) Sigma, Steinheim Tween® 20 Sigma, Steinheim 3,3`,5,5`-Tetramethylbenzidine (TMB) Sigma, Steinheim Stop-Puffer (2N H2SO4) Merck, Darmstadt Pefa-Block Roche, Basel RPMI-1640-Medium Biochrom, Berlin Biorad Protein Assay Biorad, München 46 3.1.6 Histaminrezeptoragonisten/ -antagonisten 3.1.6.1 Histaminrezeptoragonisten Histamindihydrochlorid Sigma, Steinheim 4-Methylhistamin Tocris Bioscience, UK 3.1.6.2 Histaminrezeptorantagonisten JNJ7777120 Prof. H. Stark, Johann Wolfgang Goethe Universität, Frankfurt/Main 3.1.7 Hergestellte Puffer und Lösungen für In-vitro-Versuche DC-Medium RPMI 1640 10 % Fetales Kälberserum 1 % Penicillin / Streptomycin 50 µmol β-Mercaptoethanol PBS Puffer 8 g NaCl 0,2 g KCl 1,44 g Na2PO4 0,2 g KH2PO4 Aqua bidest ad 1000 ml pH 7,2 mit 1 mol/l HCl und 1 mol/l NaOH Reagent Diluent (1 %) 0,8 g BSA Aqua bidest ad 80 ml Erythrozytenlyse-Puffer 8,29 g NH4Cl 1 g KHCO3 0,034 g Na-EDTA Aqua bidest ad 1000 ml pH 7,4 mit 1 mol/l HCl und 1 mol/l NaOH 47 3.2 Versuchstiere Die Tierversuche sind durch das Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit in Oldenburg genehmigt worden (Aktenzeichen: 33.9-42502-0409/1633). Für die Versuche wurden zum einen weibliche Mäuse des Inzuchtstammes BALB/c verwendet und stammten vom Züchter Charles River (Sulzfeld). Die H4R-Knockout-Mäuse wurden von Robin Thurmond (Johnson & Johnson, La Jolla, CA, USA) zur Verfügung gestellt. Zu Beginn wurden 5 männliche und 5 weibliche Tiere geliefert, mit denen im eigenen Institut eine Züchtung stattfand. Die Tiere wurden regelmäßig genotypisiert. Alle Tiere waren zu Beginn der Untersuchungen acht Wochen alt und wogen etwa 20 g. Die Tiere wurden in Gruppen von 7-8 Tieren je Käfig gehalten und in einem 12-Stunden Hell/Dunkel-Lichtzyklus bei 23 °C Raumtemperatur. Pelletfutter (Altromin 1324) und Wasser standen ad libitum zur Verfügung. Zum Zeitpunkt der Versuche waren die Tiere klinisch gesund. 3.3 Versuchsübersicht In dieser Arbeit wurde die H4R-vermittelte Wirkung, zum einen durch H4R-Knockout-Mäuse zum anderen pharmakologisch durch den H4R-Antagonisten JNJ7777120, sowohl in vitro als auch in vivo untersucht. Ziel der In-vivo-Versuche war es, den Einfluss des H4R im Kontaktallergiegeschehen zu untersuchen. In den Versuchen wurde durch die Haptene Toluen-2,4-diisocyanat (TDI) und Fluorescein-Isothiocyanat (FITC), beides Substanzen die ein eher Th2-dominiertes Entzündungsgeschehen auslösen, eine Kontaktallergie erzeugt. Der Einfluss des H4R wurde sowohl in der Sensibilisierungsphase (Induktion der Allergie) als auch in der Challengephase (Auslösephase) untersucht. Als ein wichtiger Parameter galt in allen Versuchen die entzündliche Schwellung der Ohren, die mit den Haptenen in Kontakt kamen. Im Mouse-EarSwelling-Test (MEST) wurde die Hapten-induzierte allergische Reaktion sowie ihre Inhibition durch den H4R-Antagonisten bestimmt. Bei den TDI-Kontaktallergie-Versuchen konnte über das Lymphknotengewicht und die Gesamtzellzahl im Lymphknoten die Proliferation der 48 T-Zellen bestimmt werden. Desweiteren wurden sowohl die Lymphknotenzellen als auch Milzlymphozyten in vitro mit Concanavalin A (ConA) stimuliert und mittels ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) die Menge von pro- und antiinflammatorischen Zytokinen bestimmt. Um zu untersuchen, ob der H4R auf die akute, nichtallergische Entzündung einen Einfluss hat, wurde ein Versuch mit Arachidonsäure (AA) durchgeführt. Bei den In-vitro-Versuchen sollte der Einfluss von Toll-Like-Receptor-Agonists (TLR-Agonisten) auf verschiedene pro- sowie anti-inflammatorische Zytokine untersucht werden. In-vitro-generierte DC aus dem Knochenmark von H4R-Knockout- sowie WildtypMäusen wurden mit verschiedenen TLR-Agonisten stimuliert und mittels ELISA die Menge der produzierten Zytokine bestimmt. Von besonderem Interesse waren dabei die Mitglieder der IL-12-Familie (IL-12, IL-23, IL-27). Neben der Stimulation mit den TLR-Agonisten wurden die DC mit Histamin sowie dem H4R-Agonisten 4-Methylhistamin (4-MH) stimuliert. Auch dort wurde die Zytokinproduktion mittels ELISA bestimmt. 3.4 In-vivo-Versuche Für die vorliegende Arbeit wurden Untersuchungen in verschiedenen Kontaktallergie- und Entzündungsmodellen der Maus durchgeführt. Von besonderem Interesse war der Einfluss des H4R auf das Entzündungsgeschehen in der Haut durch genetische (H4R-Knockout-Mäuse) wie auch pharmakologische (JNJ7777120) Manipulation. Der Einfluss wurde sowohl während der Sensibilisierungs- als auch während der Challengephase untersucht. Für alle Versuche wurden die Mäuse in Gruppen à 7 bis 8 Tieren aufgeteilt. In jedem Versuch wurden vergleichend H4R-Knockout-Mäuse und Wildtyp-Mäuse (Vehikelgruppe) sowie mit dem H4R-Antagonisten JNJ7777120-behandelte Wildtypmäuse untersucht. Zudem dienten unbehandelte Kontrollmäuse als Basalkontrolle. Alle Tiere waren zu Beginn der Versuche 8 Wochen alt. Die jeweiligen Behandlungsschemata und Konzentrationen der verwendeten Substanzen für die verschiedenen Versuche sind nachfolgend einzeln beschrieben. Die entsprechenden Substanzen wurden in Tabelle 3-1 aufgeführt gelöst. 49 Tabelle 3-1: Übersicht über die verwendeten Substanzen und ihre Lösungsmittel aus den In-vivo-Versuchen Stoff Lösungsmittel Toluen-2,4-diisocyanat (TDI) Aceton Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) Aceton und Dibutylphtalat im Verhältnis 1 : 1 JNJ7777120 oral Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin (HPBCD) 20 % JNJ7777120 s.c. oder i.p. PBS und zum Vorlösen 2,5 % DMSO Arachidonsäure (AA) Aceton 3.4.1 TDI-Kontaktallergiemodell Von Interesse war der Einfluss des H4R auf die allergische Entzündung, die durch das Hapten Toluen-2,4- diisocyanat (TDI) ausgelöst wurde. Als Untersuchungsparameter dienten dazu in vivo die Ohrschwellung und ex vivo die Expression verschiedener inflammatorischer Zytokine in der Ohrhaut und Lymphozyten. Zur Vorbereitung der Versuche wurden die Mäuse in der Abdominalregion enthaart. Die Enthaarung erfolgte mit Veet-Enthaarungscreme, die auf die Bauchhaut aufgetragen und nach drei Minuten Einwirkzeit mit einem feuchten Tuch wieder entfernt wurde. Am darauf folgenden Tag begann die Sensibilisierung der Tiere mit TDI (in Aceton). Hierzu wurde die Bauchhaut zunächst zehnmal mit Tesafilmstreifen behandelt (Tape-Stripping) und daraufhin jeweils 100 µl 5 %iges TDI auf das Abdomen aufgetragen, an Tag 2 bis 4 je 50 µl. Durch die Behandlung der Bauchhaut mit Tesafilm an den ersten drei Tagen der Sensibilisierung wurden die oberen Hornschichten entfernt, wodurch eine Störung der Barrierefunktion und somit eine verbesserte Penetration des Kontaktallergens erreicht wird. An Tag 22 erfolgte eine Boosterung durch Gabe von TDI 5 % (100 µl) auf das Abdomen. An Tag 29 wurde die Ohrdicke der Tiere gemessen. Anschließend begann die Challenge mit dem Hapten TDI 0,5 % auf die Innen- und Außenseite des Ohrs (100 µl) sowie die Behandlung mit JNJ7777120 im wöchentlichen Abstand. 50 3.4.1.1 Untersuchung des Einflusses des H4R auf die allergische Entzündung im TDI-Modell 3.4.1.1.1 Sensibilisierung Im Sensibilisierungsversuch wurden zunächst unbehandelte Mäuse über einen Zeitraum von 3 Tagen mit dem Hapten TDI 0,5 % auf der Innen- und Außenseite des linken Ohrs behandelt. Neben einer Gruppe von H4R-Knockout-Mäusen und einer Vehikelgruppe wurde eine Behandlungsgruppe mit JNJ7777120 s.c. behandelt. Vor der ersten Behandlung wurde die Ohrdicke aller Mäuse gemessen. An den Tagen 1 bis 3 erfolgte eine Applikation von 20 µl TDI (0,5 %) auf das linke Ohr. 30 Minuten vor und 2 Stunden nach jeder TDI-Gabe wurden einer Wildtypmaus-Gruppe 30 mg/kg JNJ7777120 (gelöst in 1,5 % DMSO/PBS) s.c. in den Nacken appliziert. An Tag 5 wurde erneut die Ohrdicke gemessen und die Tiere durch zervikale Dislokation getötet. Für weitere Untersuchungen wurden die Lnn. auricularis und die Milz entnommen und die Ohren bei -80 °C eingefroren (für weiterführende Untersuchungen siehe Kapitel 3.4.4). Abbildung 3-1: Versuchsaufbau in der Sensibilisierung mit TDI 51 3.4.1.1.2 Challenge Für diesen Versuch standen vier Versuchsgruppen mit je 4 weiblichen und 4 männlichen Wildtyp- bzw. H4R-Knockout-Mäusen zur Verfügung. Eine Gruppe von Wildtyp-Mäusen diente als Kontrollgruppe, die nur mit dem Hapten TDI 5 % in Kontakt kam. Eine andere Gruppe von Wildtyp-Mäusen wurde sowohl in der Sensibilisierungs- als auch in der Challengephase, eine andere nur in der Challengephase mit JNJ7777120 (30 mg/kg) s.c. behandelt. JNJ7777120 wurde immer 30 Minuten vor und 2 Stunden nach TDI-Gabe (0,5 %) s.c. in den Nacken injiziert. Die H4R-Knockout-Mäuse wurden nur mit dem Hapten behandelt. Während jeder Challenge wurde vor und 24 Stunden nach Behandlung der Ohren mit dem Allergen die Ohrdicke bestimmt. Nach Challenge 8 (Woche 11) wurden die Tiere getötet. Die Ohren wurden für weitergehende Untersuchungen (Zytokinbestimmung) bei -80 °C eingefroren. Zudem wurden die Lymphknoten entnommen und entsprechende dem LocalLymph-Node-Assay (LLNA) behandelt. Außerdem wurden aus der Milz T-Lymphozyten gewonnen (für weiterführende Untersuchungen siehe Kapitel 3.4.4). Abbildung 3-2: Versuchsaufbau in der Challenge mit TDI 52 3.4.2 FITC-Kontaktallergiemodell In diesem Versuchsmodell war der Einfluss des H4R auf die allergische Entzündung von Interesse, die durch Applikation des Haptens Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) ausgelöst wurde. Als Untersuchungsparameter dienten in vivo die Ohrschwellung und ex vivo die Expression verschiedener inflammatorischer Zytokine in den Ohren und Lymphozyten. Zur Vorbereitung der Versuche wurden Wildtyp-Mäuse sowie H4R-Knockout-Mäuse in der Abdominalregion mittels Veet-Enthaarungscreme enthaart, die auf die Bauchhaut aufgetragen und nach drei Minuten Einwirkzeit mit einem feuchten Tuch wieder entfernt wurde. Am darauffolgenden Tag wurde mit der Behandlung der Tiere begonnen. Hierzu wurde die Bauchhaut zunächst zehnmal mit Tesafilmstreifen behandelt (Tape-Stripping) und daraufhin an Tag 1 und 2 jeweils 100 µl 1,5 % FITC auf das Abdomen aufgetragen. Durch die Behandlung der Bauchhaut mit Tesafilm während der Sensibilisierung wurden die oberen Hornschichten entfernt. Dadurch erreichte man eine Störung der Barrierefunktion und somit eine verbesserte Penetration des Kontaktallergens. An Tag 7 wurde die Ohrdicke der Tiere bestimmt und die Challenge durch die Gabe von 15 µl FITC auf die Innen- und Außenseite des linken Ohrs begonnen. Zudem begann an Tag 7 die Behandlung mit JNJ7777120 im wöchentlichen Abstand. 3.4.2.1 Untersuchung des Einflusses des H4R auf die allergische Entzündung im FITC-Kontaktallergiemodell 3.4.2.1.1 Sensibilisierung Über einen Zeitraum von 3 Tagen wurden zunächst unbehandelte Wildtyp-Mäuse mit FITC 0,1 % behandelt. Den Mäusen wurde das Hapten auf das linke Ohr appliziert. Die Behandlungsgruppe wurde mit JNJ7777120 (50 mg/kg) oral behandelt, die Vehikelgruppe bekam das Lösungsmittel von JNJ7777120 oral appliziert. Zudem dienten unbehandelte Kontrollmäuse, die nicht mit dem Hapten in Kontakt kamen, als Basalkontrolle. Die Behandlung an Tag 1 bis 3 mit JNJ7777120 bzw. Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin (HPBCD) erfolgte je 30 Minuten vor und 4 Stunden nach der Applikation von FITC. An Tag 5 wurde erneut die Ohrdicke bestimmt. Anschließend wurden die Tiere mittels zervikaler Dislokation getötet. Die regionalen Lymphknoten wurden für die Durchführung eines LLNA 53 entnommen. Die genaue Beschreibung der weiterführenden Untersuchungen sind in Kapitel 3.4.4 aufgeführt. Abbildung 3-3: Behandlungsschema in der Sensibilisierung; X = 1 mal pro Tag 3.4.2.1.2 Challenge Für diesen Versuch standen drei Gruppen von Wildtyp-Mäusen und eine von H4R-KnockoutMäusen zur Verfügung. Bei zwei Behandlungsgruppen (Wildtyp-Mäuse) erfolgte eine orale Behandlung mit JNJ7777120 in zwei unterschiedlichen Konzentrationen (20 mg/kg und 50 mg/kg), die andere Wildtyp-Maus-Gruppe bekam ausschließlich das Lösungsmittel von JNJ7777120 appliziert. Die H4R-Knockout-Maus-Gruppe wurde nur mit dem Hapten behandelt. Vor Versuchsbeginn wurde die Ohrdicke der Tiere auf beiden Seiten bestimmt. Danach erfolgte bei allen Gruppen die Sensibilisierung wie zuvor beschrieben. An Tag 6 erfolgte eine Applikation von FITC 0,5 % (15 µl) auf das linke Ohr. 20 Minuten vor und 4 Stunden nach Gabe des Haptens erfolgte eine orale Behandlung mit JNJ7777120. Weitere 24 Stunden danach wurde die Ohrdicke der Mäuse bestimmt. An Tag 13 wurde den Tieren 1,5 % FITC (15 µl) auf das rechte Ohr appliziert. Erneut erfolgte 20 Minuten vor und 2 Stunden nach FITC-Applikation eine orale Behandlung mit JNJ7777120. Die Ohrdicke wurde 24 Stunden nach der Behandlung bestimmt. Nachdem die Tiere mittels zervikaler Dislokation getötet wurden, wurden die Ohren und die Lymphknoten für die Bestimmung von Zytokinkonzentrationen mittels ELISA entnommen. 54 Abbildung 3-4: Versuchsaufbau in der Challenge mit FITC In einem weiteren Versuch in der Challengephase wurden die Tiere in drei Gruppen (WildtypMäuse) aufgeteilt. Der einen Behandlungsgruppe wurde JNJ7777120 (50 mg/kg) oral appliziert, einer anderen ausschließlich das Lösungsmittel HPBCD. Zudem diente eine Gruppe als unbehandelte Basalkontrolle. Die Sensibilisierung erfolgte wie in Kapitel 3.4.2.1.1 beschrieben. Ab Tag 6 wurde wöchentlich vor und 24 Stunden nach der Hapten-Applikation (15 µl von 1,5 % FITC auf die Innen- und Außenseite des linken Ohrs) die Ohrdicke bestimmt. Die Gabe von JNJ7777120 bzw. dem Lösungsmittel erfolgte 20 Minuten vor und 4 Stunden nach Gabe des Haptens FITC. 55 Abbildung 3-5: Versuchsaubau in der Challenge mit FITC 3.4.3 Versuche zum akuten Entzündungsgeschehen Ein möglicher Einfluss des H4 R ein akutes Entzündungsgeschehen wurde im Arachidonsäure-Modell untersucht. Hierbei wurde durch die topische Gabe von Arachidonsäure (AA) 5 % eine entzündliche Ohrschwellung ausgelöst. Die ausgelöste Entzündung wurde anhand der entstehenden Ohrschwellung untersucht. 3.4.3.1 Untersuchung zum Einfluss des H4R auf die Arachidonsäure-induzierte Entzündung In diesem Versuch gab es vier Gruppen, zwei Wildtypmaus-Gruppen und zwei H4RKnockout-Maus-Gruppen. Je eine diente als Vehikel-, die andere als Behandlungsgruppe, die mit JNJ7777120 (30 mg/kg) intraperitoneal behandelt wurden. Den Vehikelgruppen wurde das Lösungsmittel intraperitoneal gespritzt. Bei allen Gruppen wurde 30 Minuten später AA 5 % (20 µl) auf das Ohr gegeben. Nach weiteren 30 Minuten wurde die Ohrdicke bestimmt. 56 3.4.4 Einzelparameter der In-vivo-Versuche 3.4.4.1 Mouse-Ear-Swelling-Test (MEST) Das Prinzip des MEST ist die Erfassung der Ohrdicke vor und nach der Applikation des Entzündungszreizes, der durch das Hapten bzw. durch die Arachidonsäure ausgelöst wird. Die Zunahme der Ohrdicke wurde als Parameter für eine entzündliche Reaktion herangezogen. Die Durchführung erfolgte in Anlehnung an GAD et al. (1986) und BÄUMER et al. (2004). Vor Beginn des Versuchs wurde die ursprüngliche Dicke des Mäuseohres in µm gemessen. Als Messwerkzeug diente ein Cutimeter nach Mitutoyo (GAD et al., 1986). Die zweite Messung und somit die Erfassung der Zunahme der Ohrdicke erfolgte 24 Stunden nach Hapten- bzw. 30 Minuten nach AA-Gabe. Die Differenz der Werte ergab die tatsächliche Ohrschwellung. 3.4.4.2 Local-Lymph-Node-Assay (LLNA) Der LLNA diente dazu die Proliferationsrate der T-Zellen nach deren Stimulierung durch antigenpräsentierende Zellen zu untersuchen. Beim LLNA diente die Bestimmung des Gewichtes und der Gesamtzellzahl der regionalen Lymphknoten als Messparameter (EHLING et al., 2005). Werden im Rahmen der Sensibilisierung T-Zellen durch in den Lymphknoten migrierte antigenpräsentierende Zellen stimuliert, so proliferieren sie und führen nachfolgend zu einer Erhöhung des Gewichtes der zum Entzündungsgebiet gehörigen (drainierenden) Lymphknoten. 3.4.4.3 Gewinnung und Untersuchung der Lnn. auriculares Den Tieren wurden post mortem die regionalen Lymphknoten (Lnn. auriculares) der behandelten Ohrseite bzw. der unbehandelten Kontrollohren entnommen. Sie wurden zunächst jeweils in ein Well einer 24-Well-Platte mit PBS gelegt, von umgebenen Gewebe befreit und mit Hilfe einer Feinwaage gewogen. Um die Gesamtzahl der Lymphknotenzellen zu bestimmen, wurde von jedem Lymphknoten eine Zellsuspension hergestellt. Die in 500 µl PBS aufgenommenen Lymphknoten wurden mit Hilfe eines Homogenisators mit einem Glaspistill zerkleinert. Die gewonne Zellsuspension wurde in ein Eppendorfgefäß überführt 57 und bei 500 g und 4 °C für 10 Minuten zentrifugiert. Nach Dekantieren des Überstandes wurde das Zellpellet in 1 ml RPMI-Medium resuspendiert. Anschließend wurden von jeder Probe 10 µl entnommen und mit 90 µl Trypanblau (1:10) gemischt. Die Gesamtzellzahl wurde dann mittels der Neubauerzählkammer bestimmt. Von jeder Probe der Zellsupension wurden 5 x 105 Zellen entnommen, in eine 48-Well-Platte überführt und mit RPMI-Medium auf 500 µl aufgefüllt. Jede Probe wurde mit 2 µg/ml ConA bzw. 1 mg/ml FITC für 72 Stunden stimuliert. ConA fungiert hierbei als Mitogen, welches die T-Lymphozyten stimuliert. Zur weiteren Untersuchung (ELISA) wurden die Überstände bei -20 °C eingefroren. 3.4.4.5 Proteinextraktion aus den Ohren Um die Gesamtproteinmenge in den Ohren bestimmen zu können wurden die geforenen Ohren mittels Mörser unter flüssigem Stickstoff zerkleinert. Nach Zugabe von Medium und Proteaseblocker folgte eine Inkubationsphase von zwei Stunden auf Eis. Danach wurde die Suspension für 10 min bei 3000g und 4 °C zentrifugiert und der Überstand abpipettiert. In eine 96-well Platte wurden 0,5 µl des Überstandes mit 159,5 µl Medium überführt, in der zu jeder Probe 40 µl Biorad-Reagenz zugeführt wurde. Nach einer Inkubationsphase von 5 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Proteinmenge bei 570 nm im MRX-Reader gemessen. Um in jeder Probe die gleiche Gesamtproteinmenge zu haben wurde die jeweilige Suspension entsprechend der gemessenen Werte verdünnt. Nun wurde die Suspension bei -20 °C für weitere Untersuchungen (ELISA) eingefroren. Für diese von BRADFORD (1976) entwickelte Methode wurde ein kommerzielles Kit (Biorad protein assay) verwendet (BRADFORD, 1976). 3.5 In-vitro-Versuche 3.5.1 Generierung muriner dendritischer Zellen Die Gewinnung dendritischer Vorläuferzellen für die In-vitro-Experimente wurde nach einem Protokoll von LUTZ et al. (1999) durchgeführt. Die Kultivierung der Zellen (= BMDC, bone marrow derived dendritic cells) erfolgte über 10 Tage im Brutschrank. 58 Die Mäuse wurden durch zervikale Dislokation getötet und der Femur mittels sterilem Instrumentarium herauspräpariert. Der Femur wurde durch Abschaben mittels einer Skalpellklinge von der Muskulatur freipräpariert, um jedwede Kontamination zu vermeiden. Nach vollständiger Reinigung des Femur wurde dieser zunächst zur Desinfektion für 2 bis 5 Minuten in 70 % Ethanol, nachfolgend für einige Minuten in steriles PBS gelegt. Die Femurköpfe wurden mit Hilfe einer Skalpellklinge abgetrennt. Der Knochen wurde von beiden Seiten mit insgesamt 5 ml sterilfiltriertem PBS durchspült. Die Flüssigkeit wurde in einem Falconröhrchen aufgefangen, resuspendiert und anschließend für 10 Minuten bei 290 g und 4 °C zentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstandes wurde das Zellpellet in 5 ml DC-Medium resuspendiert. Um die Zellzahl der gewonnen Zellen zu bestimmen, wurden 100 µl der Zellsuspension für 5 Minuten in 100 µl Schwinzer-Lyse, einem ErythrozytenLysepuffer, bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Zellen im Verhältnis 1:3 mit Trypanblau gefärbt und mit Hilfe einer Neubauer Zählkammer gezählt. 2,5 bis 3,5 Millionen Zellen wurden in einer Cell+-Petrischale in 10 ml DC-Medium, unter Zugabe des Wachstumsfaktors GM-CSF (20 ng/ml) aufgenommen und die Zellen im Brutschrank bei 37 °C und 5 % CO2 im Brutschrank inkubiert. An Tag 3 erfolgte die Zugabe von 10 ml DC-Medium und GMCSF (20 ng/ml), an Tag 6 und 8 wurden 10 ml der Suspension abgenommen und zentrifugiert (290 g, 4 °C, 10 Minuten). Nach Verwerfen des Überstandes wurde das Zellpellet in frischem DC-Medium aufgenommen, resuspendiert und unter erneuter Zugabe des Wachstumsfaktors zu der verbliebenen Suspension gegeben. An Tag 10 standen die Zellen zur Behandlung zur Verfügung. 3.5.2 Stimulation muriner dendritischer Zellen mit Toll-Like-Receptor-Agonisten Die murinen DC von Wildtyp- und H4R-Knockout-Mäusen wurden an Tag 9 ihrer Kultivierung abgenommen und zentrifugiert (290 g, 4 °C, 10 Minuten). Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet in 3 ml DC-Medium aufgenommen. 50 µl der Zellsuspension wurden in 100 µl Trypanblau aufgenommen und mit Hilfe einer Neubauer Zählkammer gezählt. In einer 48-well-Platte wurden 250.000 Zellen in 500 µl ausgesät und mit den TLR-Agonisten behandelt. Die Zellen wurden für 24 Stunden mit 1 µg/ml Lipopolysaccharid (LPS), 10 µg/ml Lipoteichonsäure (LTA) und 10 µg/ml Peptidoglykan (PGN) im Brutschrank inkubiert. Hierbei fungiert LPS als TLR-4-Aktivator, PGN und LTA stimulieren den TLR-2. Nach der Stimulation wurden die Überstände abgenommen, zentrifugiert (500g, 4 °C, 10 59 Minuten) und bis zur weiteren Untersuchung mittels ELISA bei -20 °C eingefroren. Um den Einfluss von Histamin und 4-Methylhistamin (4-MH) auf die Zytokinproduktion zu untersuchen, wurden die kultivierten DC bereits an Tag 8 wie oben beschrieben abgenommen, gezählt und ausgesät und für 24h mit Histamin (1 mmol/l) bzw. 4-MH (10 µmol/l) vorstimuliert. Erst danach erfolgte die Stimulation mit den TLR-Agonisten wie beschrieben. Um die TLR-induzierte Zytokin-Sekretion beurteilen zu können, wurden unbehandelte Kontrollen mitgeführt. Die Zytokine wurden mittels ELISA bestimmt. 3.5.3 Zytokinbestimmung in Zellkulturüberständen mittels ELISA Die Bestimmung der Konzentration von verschiedenen Zytokinen (IL-12, IL-23, IL-27, TNFα, IFNγ, IL-17, IL-6, IL-10, CCL2, IL-1β) in den Überständen kultivierter DC wurde mittels enzymgebundenem Immunadsorptionstest (ELISA, Enzyme Linked Immunosorbent Assay) durchgeführt. Mit Hilfe dieses Tests können geringste Mengen an Peptiden und somit die Wechselwirkung zwischen Antigen und Antikörper nachgewiesen werden. Die ELISAs wurden nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Bei jedem Messansatz wurde eine Standardreihe mitgeführt. 3.6 Statistische Auswertung Die Darstellung der Ergebnisse erfolgte mit Angabe der Mittelwerte (MW) ± Standardfehler (SEM). Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Programm GraphPadPrism (Version 4.01, GraphPad Software, Inc.). In den Versuchen, in denen nur eine Vergleichsgruppe mit der Kontrollgruppe verglichen wurde, wurde ein ungepaarter T-Test verwendet. Bei Versuchen, bei denen die Kontrollgruppe mehreren Vergleichsgruppen gegenübergestellt wurde, wurde eine parametrische Varianz-Analyse (One-way-Anova) mit nachfolgendem Dunnetts-Test als post-hoc-Test gewählt. Es wurden Irrtumswahrscheinlichkeiten von 5 %, 1 % und 0,1 % bestimmt. Die entsprechenden Einzelwerte der durchgeführten Versuche sind in den Anhangstabellen aufgeführt. 60 4 Ergebnisse 4.1 In-Vitro-Versuche 4.1.1 Einfluss des H4R auf die Zytokinkonzentration nach Stimulation mit Toll-LikeReceptor-Agonisten In vitro wurde der Einfluss des Histamin-H4-Rezeptors (H4R) auf die Produktion verschiedener pro- und antiinflammatorischen Zytokine untersucht. Die Zytokinsekretion von bone-marrow-derived dendritic cells (DC) von Wildtyp- und von H4R-Knockout-Mäusen wurden miteinander verglichen. 4.1.1.1 Einfluss auf die Sekretion der Zytokine IL-12, IL-23 und IL-27 Alle mit einem Toll-Like-Receptor-Agonisten (TLR-Agonisten) stimulierten DC von Wildtyp-Mäusen wie von H4R-Knockout-Mäuse zeigten nach Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS), Lipoteichonsäure (LTA) und Peptidoglykan (PGN) im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle eine erhöhte Konzentration der Zytokine. Dieser Effekt war bei Stimulation mit PGN bei allen drei Zytokinen am deutlichsten. Des weiteren war überall eine konstant höhere Konzentration von allen Zytokinen bei den H4R-Knockout-DC im Vergleich zu den Wildtyp-DC zu sehen, die sich teilweise als signifikant darstellte. Abbildungen 4-1, 4-2 und 4-3 zeigen die Mittelwerte aus sechs unabhängigen Versuchen, in denen sich überall die gleichen Tendenzen zeigten. 61 Abbildung 4-1: IL-12-Konzentration muriner dendritischer Zellen nach Stimulation mit TLR-Agonisten Die Stimulierung der DC mit den TLR-Agonisten LPS (1 µg/ml), LTA (10 µg/ml) und PGN (10 µg/ml) führt zu einem Anstieg der IL-12-Konzentration (pg/ml) sowohl bei den Wildtyp- als auch bei den H4R-Knockout-DC. Zudem war eine höhere Konzentration von IL-12 bei den H4R-Knockout-DC im Vergleich zu den Wildtyp-DC zu sehen, der sich im Falle der LTA Stimulation als signifikant darstellte. Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-1; Darstellung der MW ± SEM; n=5, *p<0,05. Abbildung 4-2: IL-23-Konzentration muriner dendritischer Zellen nach Stimulation mit TLR-Agonisten Die Stimulation der Zellen führt mit den TLR-Agonisten LPS (1 µg/ml), LTA (10 µg/ml) und PGN (10 µg/ml) zu einem Anstieg der IL-23-Konzentration (pg/ml). Dieser Effekt war bei den H4RKnockout-DC ausgeprägter. Die H4R-Knockout-DC zeigten im Vergleich zu den Wildtyp-DC eine höhere Konzentration von IL-23. Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-2; Darstellung der MW ± SEM; n=5. Abbildung 4-3: IL-27-Konzentration muriner dendritischer Zellen nach Stimulation mit TLR-Agonisten 62 Die Stimulation der Zellen mit den TLR-Agonisten LPS (1 µg/ml), LTA (10 µg/ml) und PGN (10 µg/ml) führt zu einem Anstieg der Konzentration von IL-27 (pg/ml). Zudem war ein deutlicher Anstieg der IL-27-Konzentration der H4R-Knockout-DC im Vergleich zu den Wildtyp-DC zu sehen, der im Falle der Stimulation mit LPS signifikant war. Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-3; Darstellung der MW ± SEM; n=6, **p<0,01. 4.1.1.2 Einfluss auf die Sekretion der Zytokine CCL2, TNFα und IL-10 Zur Untersuchung des Einflusses des H4R nach Stimulation mit den TLR-Agonisten auf die Sekretion von CCL2, TNFα und IL-10 wurden die Zellen wie in Kapitel 3.5.2 beschrieben stimuliert und die Konzentration der Zytokine in Zellkulturüberständen mittels ELISA gemessen. 4.1.1.2.1 Einfluss auf die Sekretion von CCL2 Bei der Sekretion von CCL2 konnte ausschließlich nach PGN-Stimulation ein deutlicher Anstieg des Zytokins im Vergleich zu den Kontroll-DC erkannt werden. Hier war eine signifikante Induktion der Sekretion der H4R-Knockout-DC im Vergleich zu den Wildtyp-DC zu erkennen. Nach LPS und LTA Stimulation konnte kein Unterschied im Vergleich zum Kontrollansatz gesehen werden. Abbildung 4-4: CCL2-Konzentration muriner dendritischer Zellen nach Stimulation mit TLR-Agonisten Die Stimulation der Zellen mit dem TLR-Agonisten PGN (10 µg/ml) führt zu einem deutlichen Anstieg. Zudem führt diese Stimulation zu einer signifikanten Induktion der Konzentration von CCL2 (pg/ml) bei den H4R-Knockout-DC im Vergleich zu den Wildtyp-DC. Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-4; Darstellung der MW ± SEM; n=3, *p<0,05. 63 4.1.1.2.2 Einfluss auf die Sekretion von TNFα Abbildung 4-5 zeigt, dass kein Unterschied in den Konzentrationen von TNFα bei den Wildtyp-DC im Vergleich zu den H4R-Knockout-DC nach Stimulation mit allen TLRAgonisten vorhanden ist. Die Konzentration des Zytokins war bei den LPS- und PGNstimulierten Zellen deutlich höher im Vergleich zu den unstimulierten DC. Abbildung 4-5: TNFα-Konzentration muriner dendritischer Zellen nach Stimulation mit TLR-Agonisten Die Stimulation der Zellen mit den TLR-Agonisten LPS (1 µg/ml) und PGN (10 µg/ml) führt zu einem deutlichen Anstieg der Konzentration des Zytokins. Die Konzentration von TNFα (pg/ml) ist bei den H4R-Knockout-DC im Vergleich zu den Wildtyp-DC nicht unterschiedlich. Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-5; Darstellung der MW ± SEM; n=5. 4.1.1.2.3 Einfluss auf die Sekretion von IL-10 Die Konzentration von IL-10 war in den Wildtyp-DC im Vergleich zu den H4R-Knockout-DC nicht unterschiedlich. Durch die Stimulation mit LPS und PGN zeigte sich in diesem Fall eine erhöhte Konzentration des Zytokins, im Falle der Stimulation mit LTA konnte kein Anstieg der Konzentration festgestellt werden. 64 Abbildung 4-6: IL-10-Konzentration muriner dendritischer Zellen nach Stimulation mit TLR-Agonisten Die Stimulation der Zellen mit den TLR-Agonisten LPS (1 µg/ml), LTA (10 µg/ml) und PGN (10 µg/ml) führt zu einem Anstieg der Konzentration des Zytokins IL-10 (pg/ml), die im Falle von PGN am deutlichsten war. Es konnte kein Unterschied zwischen den H4R-Knockout-DC und den WildtypDC gesehen werden. Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-6; Darstellung der MW ± SEM; n=5. 4.1.2 Einfluss von Histamin und 4-Methylhistamin auf die Zytokinsekretion in dendritischen Zellen Von weiterem Interesse war der Einfluss von Histamin und dem H4R-Agonisten 4-Methylhistamin (4-MH) auf die Konzentrationen verschiedener Zytokine. Alle Versuche wurden in 3 bis 6 unabhängigen Ansätzen durchgeführt. 4.1.2.1 Einfluss auf die Konzentration von IL-12, IL-23 und IL-27 Sowohl bei den Wildtyp-DC als auch bei den H4R-Knockout-DC hemmte Histamin die Sekretion von IL-12. Bei der Stimulation mit 4-MH konnte in beiden Ansätzen kein Unterschied im Vergleich zu den Kontroll-DC nachgewiesen werden. 65 Abbildung 4-7: IL-12-Konzentration muriner dendritischer Zellen nach Stimulation mit Histamin und 4-MH Die Stimulierung der Zellen mit Histamin (1 mmol/ml) führte sowohl bei den H4R-Knockout-DC als auch bei den den Wildtyp-DC zu einer Inhibition der IL-12-Konzentration (pg/ml). Die mit 4-MHstimulierten DC (10 µmol/l) zeigten im Vergleich zu den Kontroll-DC keinen Unterschied. Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-7; Darstellung der MW ± SEM; n=4. Abbildung 4-8 und 4-9 zeigen die Konzentration von IL-23 und IL-27 nach Stimulation mit Histamin bzw. 4-MH. Histamin hemmt bei den H4R-Knockout-DC die Konzentration von IL-23 nur tendenziell im Vergleich zu den Kontroll-DC. Kein Unterschied ist zu sehen bei den Kontroll-DC im Vergleich zu den 4-MH-stimulierten Zellen. Sowohl Histamin als auch 4-MH haben keinen Einfluss auf die IL-27-Konzentration bei den Wildtyp-DC. Bei den H4R-Knockout-DC dagegen kann man eine tendenzielle Inhibition der mit Histamin-stimulierten Zellen im Vergleich zu den Kontroll-DC beobachten. 66 Abbildung 4-8: IL-23-Konzentration muriner dendritischer Zellen nach Stimulation mit Histamin und 4-MH Die mit Histamin (1 mmol/ml) bzw. 4-MH-stimulierten DC (10 µmol/l) zeigten im Vergleich zu den Kontroll-DC keinen Unterschied der IL-23-Konzentration (pg/ml). Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-8; Darstellung der MW ± SEM; n=3. Abbildung 4-9: IL-27-Konzentration muriner dendritischer Zellen nach Stimulation mit Histamin und 4-MH Die Stimulation der Wildtyp-DC mit Histamin (1 mmol/ml) und 4-MH (10 µmol/l) führte nicht zu einem Anstieg der IL-27-Konzentration (pg/ml). Bei den H4R-Knockout-DC dagegen kann eine tendenzielle Inhibition der IL-27-Konzentration (pg/ml) bei den mit Histamin stimulierten Zellen im Vergleich zu den Kontroll-DC beobachtet werden. Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-9; Darstellung der MW ± SEM; n=3. 4.1.2.2 Einfluss auf die Sekretion von TNFα 67 Abbildung 4-10 zeigt die Sekretion von TNFα in DC nach Stimulation mit Histamin und 4-MH. Histamin führt sowohl bei den Wildtyp-DC als auch bei den H4R-Knockout-DC zu einer tendenziellen Inhibition im Vergleich zu den Kontroll-DC in der Konzentration von TNFα hervorruft. Abbildung 4-10: TNFα-Konzentration muriner dendritischer Zellen nach Stimulation mit Histamin und 4-MH Nach Histamin-Stimulation (1 mmol/ml) ist sowohl bei den WT- als auch bei den H4R-Knockout-DC eine tendenzielle Inhibition der TNFα-Konzentration (pg/ml) zu sehen. Die Konzentration von TNFα nach 4-MH-Stimulierung (10 µmol/l) zeigt keinen Unterschied im Vergleich zu den Kontroll-DC. Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-10; Darstellung der MW ± SEM; n=4. 68 4.1.2.3 Einfluss auf die Sekretion von IL-6 Bei der Messung der IL-6-Konzentration mittels ELISA zeigten sich keinerlei Unterschiede in den Gruppen. Abbildung 4-11: IL-6-Konzentration muriner dendritischer Zellen nach Stimulation mit Histamin und 4-MH Konzentration von IL-6 (pg/ml) nach Histamin- (1 mmol/ml) und 4-MH-Stimulierung (10 µmol/l) zeigt keinerlei Unterschiede in den verschiedenen Gruppen. Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-11; Darstellung der MW ± SEM; n=3. 4.2 In-vivo-Versuche In den In-vivo-Versuchen wurde die H4R-vermittelte Wirkung sowohl auf pharmakologischer, durch den H4R-Antagonisten JNJ7777120, als auch durch genetische Deletion des H4R untersucht. In den durch Toluol-2,4-diisocyanat (TDI) und Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) ausgelösten Kontaktallergiemodellen wurde zum einen die Sensibilisierungsphase zum anderen die Challengephase beleuchtet. 4.2.1 Einfluss des H4R im TDI-Modell in der Sensibilisierungsphase Um die Sensibilisierungsphase näher untersuchen zu können, wurden zwei identische, aber unabhängige Versuche durchgeführt. Einer Gruppe von Wildtyp-Mäusen (Vehikelgruppe) und den H4R-Knockout-Mäusen wurde nur TDI 0,5 % topisch, der anderen Gruppe von 69 Wildtyp-Mäusen (Behandlungsgruppe, WT JNJ) zusätzlich JNJ7777120 subcutan appliziert. Die Abbildungen 4-12, 4-13, 4-14 und 4-15 zeigen die gepoolten Daten beider Versuche. 4.2.1.1 Ergebnis des Mouse-Ear-Swelling-Test Im Mouse-Ear-Swelling-Test (MEST) wurde die Ohrdicke vor der ersten Behandlung an Tag 1 und zum Abschluss des Versuchs an Tag 5 mit dem Cutimeter gemessen. Die Differenz der zwei Werte stellte die tatsächliche Ohrschwellung dar. Alle mit TDI behandelten Gruppen zeigten im Vergleich zu den unbehandelten Kontrolltieren eine deutliche Ohrschwellung. Abbildung 4-12 zeigt, dass durch Applikation von TDI 0,5 % bei den H4R-Knockout-Mäusen eine signifikant erhöhte Ohrschwellung ausgelöst werden konnte. Die Einzelwerte der Messungen der Ohrdicke aus beiden Versuchen sind in Anhangstabelle 9-12 aufgeführt. Abbildung 4-12: Ohrschwellung in der Sensibilisierung Im direkten Vergleich zur Vehikel- und der Behandlungsgruppe führt die Applikation von TDI 0,5 % bei den H4R-Knockout-Mäusen zu einem signifikanten Anstieg der Ohrdicke (Angabe in %). Darstellung der MW ± SEM; gepooltes Ergebnis aus zwei unabhängigen Versuchen mit jeweils n=7-8 Tieren; **p<0,01 (angegebene Signifikanz bezieht sich auf die Vehikelgruppe). 4.2.1.2 Ergebnisse der Local-Lymph-Node-Assays 70 Nach Durchführung des MEST wurden die Tiere getötet und die regionalen Lymphknoten entnommen. Von jedem Lymphknoten wurden Gewicht und Gesamtzellzahl bestimmt und eine Zellsuspension hergestellt. Diese Zellen wurden mit Concanavalin A (ConA) stimuliert und die Zytokinkonzentration gemessen. 4.2.1.2.1 Einfluss auf das Lymphknotengewicht und die Gesamtzellzahl Abbildung 4-13 zeigt, dass die topische Applikation von TDI 0,5 % bei allen Gruppen zu einem signifikanten Anstieg des Lymphknotengewichts führt. Derselbe Effekt konnte auch bei der Gesamtzellzahl beobachtet werden. Sowohl bei Lymphknotengewicht als auch bei der Gesamtzellzahl konnte in beiden Versuchen kein Unterschied zwischen den einzelnen Gruppen gezeigt werden (Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-13). Abbildung 4-13: Lymphknotengewicht in der Sensibilisierung Nach topischer Applikation von TDI 0,5 % ist ein signifikanter Anstieg des Lymphknotengewichts (Angabe in %) in den regionalen Lymphknoten aller Gruppen zu beobachten. Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-13; Darstellung der MW ± SEM; gepooltes Ergebnis aus zwei unabhängigen Versuchen mit jeweils n=7-8 Tieren; ***p<0,001 (angegebene Signifikanzen beziehen sich auf die Kontrollgruppe). 71 4.2.1.2.2 Einfluss auf die Zytokinsekretion Die im LLNA gewonnenen Lymphknotenzellen wurden mit Concanavalin A (ConA) (2 µg/ml) stimuliert. Danach wurden in den Zellkulturüberständen die Zytokine IFNγ und IL-6 gemessen. Wie Abbildung 4-14 zeigt, unterscheiden sich die Konzentrationen von IFNγ in den einzelnen Gruppen nicht. Im Gegensatz dazu konnte bei der Konzentration von IL-6 eine signifikante Inhibition in der Gruppe der H4R-Knockout-Mäuse im Vergleich zur Gruppe der Vehikeltiere beobachtet werden. Abbildung 4-14: IFNγ-Konzentration in Lymphknoten-Zellen nach ConA-Stimulation Nach Restimulierung der Lymphknotenzellen mit ConA (2 µg/ml) ist kein Unterschied bei der IFNγKonzentration (Angabe in %) in den mit TDI 0,5 % behandelten Gruppen zu sehen. Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-14; Darstellung der MW ± SEM; gepooltes Ergebnis aus zwei unabhängigen Versuchen mit jeweils n=7-8 Tieren 72 Abbildung 4-15: IL-6-Sekretion nach Stimulation mit ConA in den Lymphknoten-Zellen Die aus den Lymphknoten gewonnenen Zellen der H4R-Knockout-Mäuse zeigen nach ConAStimulierung (2 µg/ml) eine signifikante Inhibition der IL-6-Konzentration (Angabe in %) im direkten Vergleich zur Vehikelgruppe. Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-15; Darstellung der MW ± SEM; gepooltes Ergebnis aus zwei unabhängigen Versuchen mit jeweils n=7-8 Tieren; **p<0,01, ***p<0,001 (angegebene Signifikanz bezieht sich auf die Kontrollgruppe). 4.2.2 Einfluss des H4R im TDI-Modell in der chronischen Dermatitis Um den Unterschied von Sensibilisierung und Challenge während TDI-Gabe untersuchen zu können, erfolgte bei Wildtyp-Mäusen wie auch bei H4R-Knockout-Mäusen nach der Sensibilisierung eine Challenge mit TDI 0,5 %. Eine Behandlungsgruppe wurde sowohl in der Sensibilisierung als auch in der Challenge (JNJ(S+C)), die andere ausschließlich in der Challenge (JNJ(C)) mit JNJ7777120 behandelt. Zu den Untersuchungsparametern gehörten der MEST, die Untersuchung der regionalen Lymphknoten und die Bestimmung verschiedener pro- und antiinflammatorischer Zytokine in Ohrhomogenat, Lymphknotenzellen und T-Zellen. Das genaue Behandlungsschema ist in Kapitel 3.4.1.1 aufgeführt. 4.2.2.1 Ergebnis des Mouse-Ear-Swelling-Test Durch wiederholte Gabe von TDI 0,5 % über 11 Wochen wurde eine entzündliche Ohrschwellung induziert. Im Laufe des Versuches wurde wöchentlich die Ohrdicke bestimmt. Die Differenz der ersten und letzten Messung, die in Abbildung 4-16 zu sehen ist, zeigt den pharmakologischen sowie den genetischen Einfluss des H4R auf die Ohrschwellung. Es zeigte 73 sich, dass bei der Gruppe JNJ(S+C) eine signifikante Inhibition der Ohrschwellung nachzuweisen war. Betrachtet man in Abbildung 4-17 den Verlauf der Challenge, war schon zu Anfang zu beobachten, dass die Ohrdicke bei beiden mit JNJ7777120 behandelten Gruppen deutlich geringer waren als die der Vehikel- und der H4R-Knockout-Mäuse. Abbildung 4-16: Verlauf der Ohrdicke während TDI-Gabe in der Challenge Ab der 1. Woche der Challenge ist die Ohrdicke (µm) der beiden Gruppen von Wildtyp-Mäusen, die mit JNJ7777120 behandelt wurden, geringer als die der Vehikel und der H4R-Knockout-Mäuse. Abbildung 4-17: Ohrschwellung nach Challenge mit TDI 74 Hemmung der Ohrschwellung (µm) bei der Behandlungsgruppe JNJ(S+C). Differenz zwischen Ausgangswert und letzter Messung. Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-17; Darstellung der MW± SEM; n=7; *p<0,05 (angegebene Signifikanz bezieht sich auf die Vehikelgruppe). 4.2.2.2 Einfluss auf das Lymphknotengewicht und die Gesamtzellzahl Um mögliche Effekte auf die regionalen Lymphknoten beurteilen zu können, wurden den Tieren nach der Tötung die Lnn. auriculares entnommen und Gewicht und Gesamtzellzahl bestimmt. Sowohl bei Gewicht als auch bei Gesamtzellzahl konnten keine Unterschiede in den Gruppen festgestellt werden. Die Einzelwerte der Versuche sind in der Anhangstabelle 9-18 aufgeführt. 4.2.2.3 Einfluss auf die Zytokinkonzentration in der Ohrhaut Nach dem Töten der Tiere wurden die mit TDI 0,5 % behandelten Ohren abgetrennt, in dorsale und ventrale Seite getrennt und die Proteinkonzentration bestimmt. In der aus den Ohren hergestellten Zellsuspension wurde mittels ELISA die Konzentration der Zytokine IL-1β und IL-4 in der Haut bestimmt. Abbildung 4-18 zeigt, dass der Konzentrationsunterschied von IL-1β in der Haut der JNJ(C)-Gruppe im Vergleich zur Vehikelgruppe am stärksten ist. Bei der Sekretion von IL-4 war in den verschiedenen Gruppen kein Unterschied zu sehen. 75 Abbildung 4-18: IL-1β-Konzentration im Ohrhomogenat 24 Stunden nach Challenge Bei der JNJ(C)-Gruppe war ein signifikanter Anstieg der IL-1β-Konzentration (pg/mg) in den mit TDI 0,5 % behandelten Ohren zu beobachten. Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-18; Darstellung der MW ± SEM; n=7. 4.2.2.4 Einfluss auf die Zytokinkonzentration in den Lymphknoten Neben der Konzentrationsmessung von Zytokinen in den Ohren wurden die post mortem gewonnenen Lymphknotenzellen für 4 Tage mit ConA (2 µg/ml) stimuliert und die Zytokine IL-17 und IFNγ in den Überständen bestimmt. Die IL-17-Konzentration in den Lymphknotenzellen war in der JNJ(S+C)-Gruppe am höchsten, in der JNJ(C) konnte eine Tendenz des Anstiegs gesehen werden. Auch in der IFNγ-Konzentration zeigte sich ein signifikanter Anstieg in der JNJ(S+C)-Gruppe nach ConA-Stimulation. Die JNJ(C)-Gruppe dagegen zeigte hier nur einen tendenziellen Anstieg. Abbildung 4-19: IL-17-Konzentration in Lymphknotenzellen nach Restimulation mit ConA Im Vergleich zur Vehikelgruppe konnte bei der JNJ(C)-Gruppe eine Induktion bei der JNJ(S+C)Gruppe nur eine tendenzielle Induktion der IL-17-Konzentration (pg/ml), nach ConA-Stimulation (2 µg/ml) festgestellt werden. Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-19; Darstellung der MW ± SEM; n=6. 76 Abbildung 4-20: IFNγ-Konzentration in Lymphknotenzellen nach Restimulation mit ConA Im Vergleich zur Vehikelgruppe konnte bei der mit JNJ7777120-behandelten Gruppe eine tendenzielle Inhibition der IFNγ-Konzentration (pg/ml) sowohl nach ConA-Stimulation (2 µg/ml) festgestellt werden. Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-20; Darstellung der MW ± SEM; n=6; *p<0,05 (angegebene Signifikanz bezieht sich auf die Vehikelgruppe). 4.2.3 Einfluss des H4R im FITC-Modell in der Sensibilisierungsphase Neben der durch TDI-induzierten Kontaktallergie wurden zudem die Einflüsse des H4R auf die FITC-induzierte Kontaktallergie untersucht. Zur Untersuchung der Sensibilisierungsphase stand eine Gruppe von Mäusen zur Verfügung, der FITC 0,1 % ausschließlich topisch (Vehikelgruppe), zudem eine andere, der zusätzlich JNJ7777120 oral appliziert wurde (Behandlungsgruppe). Das genaue Behandlungsschema ist Kapitel 3.4.2.1.1 zu entnehmen. 4.2.3.1 Ergebnis des Mouse-Ear-Swelling-Test Mit einem Cutimeter wurde im MEST die Ohrdicke vor der ersten Behandlung an Tag 1 und zum Abschluss des Versuchs an Tag 5 gemessen. Die tatsächliche Ohrschwellung wurde durch die Differenz der Werte ermittelt. Nach der Applikation von FITC an drei aufeinanderfolgenden Tagen wurde in der Sensibilisierungsphase in keiner Behandlungsgruppe eine nennenswerte Ohrschwellung induziert. (Beispiel Ohrdicke: Vehikelgruppe Ohren 240 ± 20 µm (MW + SD), Behandlungsgruppe Ohren: 250 ± 20 µm 77 (MW + SD)). So kann man bei der gewählten FITC-Konzentration davon ausgehen, dass es sich um eine nicht-irritative Dosierung handelt. Die Einzelwerte der Versuche sind in Anhangstabelle 9-22 aufgeführt. 4.2.3.2 Ergebnisse des Lokal-Lymph-Node-Assays Nach Bestimmung der Ohrschwellung wurden die Tiere mittels zervikaler Dislokation getötet und die Lnn. auriculares entnommen. Von jedem Lymphknoten wurden Gewicht und Gesamtzellzahl bestimmt und eine Zellsuspension hergestellt. Diese Zellen wurden mit ConA und FITC stimuliert und die Zytokinkonzentration gemessen. 4.2.3.2.1 Einfluss auf Ohrschwellung, Gewicht und Gesamtzellzahl der Lymphknoten Die Ohrschwellung war nicht unterschiedlich in den Behandlungsgruppen. Auch bei Gewicht und Gesamtzellzahl konnten keine Unterschiede festgestellt werden. Die Einzelwerte der Versuche sind in Anhangstabelle 9-21 aufgeführt. 4.2.3.2.2 Einfluss auf die Zytokinkonzentration Die post mortem aus den regionalen Lymphknoten gewonnenen Zellen wurden für 72 Stunden im Brutschrank mit ConA (2 µg/ml) bzw. FITC (1 µg/ml) stimuliert. In den Überständen der Zellen wurde die Konzentration von IL-17 bestimmt. Sowohl in den mit ConA-stimulierten Zellen als auch in den mit FITC-stimulierten Zellen der Wildtyp-Mäuse, die mit JNJ7777120 (50 mg/kg) 30 Minuten vor und 4 Stunden nach FITC-Applikation behandelt wurden, konnte eine tendenzielle Inhibition der IL-17-Konzentration festgestellt werden. 78 Abbildung 4-21: IL-17-Konzentration in Lymphknotenzellen nach Restimulation mit ConA und FITC Im Vergleich zur Vehikelgruppe konnte bei der mit JNJ7777120-behandelten Gruppe eine tendenzielle Inhibition der IL-17-Konzentration (pg/ml) sowohl nach ConA- (2 µg/ml) als auch nach FITCStimulation (1 µg/ml) festgestellt werden. Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-22; Darstellung der MW ± SEM; n=6. 79 4.2.4 Einfluss des H4R im FITC-Modell in der Challengephase In zwei unabhängigen Versuchen wurde die H4R-vermittelte Wirkung auf die FITC-induzierte Kontaktallergie untersucht. Sowohl der H4R-Antagonist JNJ7777120 als auch H4R-KnockoutMäuse dienten in den Versuchen als Grundlage der Untersuchungen. Die Behandlung der Tiere erfolgte topisch über 2 bzw. 7 Wochen mit FITC 1,5 %. Als Untersuchungsparameter dienten hierbei die Ohrschwellung und die Zytokinbestimmung in Lymphozyten. 4.2.4.1 Ergebnis des Mouse-Ear-Swelling-Test Im ersten Versuch wurde die Ohrdicke jede Woche jeweils 24 Stunden nach der Applikation von FITC 1,5 % bestimmt. In diesem Versuchsansatz führte die topische Applikation von FITC in beiden Gruppen zu einem deutlichen Anstieg der Ohrschwellung im Verlauf des Versuchs. Ab Woche 3 zeigte sich, dass die Ohren der mit JNJ7777120 (50 mg/kg) behandelten Gruppe eine geringere Ohrdicke aufwiesen als die der Vehikeltiere. Abbildung 4-22: Verlauf der Ohrdicke während Challenge mit FITC über 7 Wochen Ab Woche 3 zeichnet sich eine stärkere Ohrschwellung (µm) bei den Vehikel-Mäusen ab, im Vergleich zu den JNJ7777120 behandelten Wildtyp-Mäusen, n=7. Im zweiten Versuch (2-wöchig) wurden den Behandlungsgruppen zwei verschiedene Konzentration von JNJ7777120 oral appliziert, zum einen 20 mg/kg JNJ7777120 (JNJ 20), zum anderen 50 mg/kg (JNJ 50). Hierbei wurde durch die topische Applikation von FITC 1,5 % in beiden mit JNJ7777120-behandelten Gruppen eine Inhibition der Ohrschwellung induziert sowohl im Vergleich zur Vehikelgruppe als auch zu den H4R-Knockout-Mäusen. 80 Abbildung 4-23: Ohrschwellung nach 2-wöchiger Challenge mit FITC Die Ohrschwellung (µm) nach 2-wöchiger Challenge mit FITC 1,5 % zeigt bei den beiden mit JNJ7777120 behandelten Gruppen eine signifikante Inhibition der Ohrschwellung sowohl im Vergleich zur Vehikelgruppe als auch zu den H4R-Knockout-Mäusen. Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-23; Darstellung der MW ± SEM; n=7; *p<0,05 (angegebene Signifikanzen beziehen sich auf die Vehikelgruppe). 4.2.4.2 Einfluss auf das Lymphknotengewicht und die Gesamtzellzahl Sowohl bei dem Lymphknotengewicht als auch bei der Gesamtzellzahl der Lymphknotenzellen konnten keine Unterschiede in den verschiedenen Gruppen gesehen werden. Die Einzelwerte werden in Anhangstabelle 9-24 aufgeführt. 4.2.4.3 Einfluss auf die Zytokinkonzentration Vierundzwanzig Stunden nach der Challenge wurden die mit FITC 1,5 % behandelten Ohren sowie Kontrollohren post mortem abgetrennt, in die dorsale und ventrale Ohrhälfte getrennt und die Proteinkonzentration bestimmt. Daraufhin wurde das Zytokin IL-1β in der Haut mittels ELISA gemessen. Es zeigte sich, dass alle Gruppen eine reduzierte Konzentration von IL-1β in den Ohren aufwiesen. 81 Abbildung 4-24: IL-1β-Konzentration im Ohrhomogenat nach 2-wöchiger Challenge mit FITC Die IL-1β-Konzentration (pg/mg) in den mit FITC-behandelten Ohren war im Vergleich zur Vehikelgruppe in allen anderen Gruppen gehemmt. Nur in der JNJ(50)-Gruppe stellte sich diese Inhibition als signifikant dar. Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-25; Darstellung der MW ± SEM; n=7. Nach dem Töten der Tiere wurden zudem die regionalen Lymphknoten entnommen und eine Zellsuspension hergestellt. Diese wurden für 72 Stunden mit FITC (1 µg/ml) stimuliert. In den Zellkulturüberständen wurde mittels ELISA die Konzentration der Zytokine IL-4 und IL17 bestimmt. Wie die Abbildungen 4-25 und 4-26 zeigen, konnte hierbei in den beiden mit JNJ7777120-behandelten Gruppen und bei den H4R-Knockout-Mäusen eine Inhibition der IL-4- und der IL-17-Konzentration im Vergleich zur Vehikelgruppe festgestellt werden, die sich aber auf Grund der geringen Stichprobenzahl nicht als signifikant darstellte. 82 Abbildung 4-25: IL-4-Konzentration in Lymphknotenzellen nach Challenge mit FITC Im Vergleich zur Vehikelgruppe konnte in allen anderen Gruppen eine Inhibition der IL-4Konzentration (pg/ml) beobachtet werden. Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-26; Darstellung der MW ± SEM; n=3. CAVE: weit unter der Beurteilungsgrenze. Abbildung 4-26: IL-17-Konzentration in Lymphozyten nach Challenge mit FITC Die IL-17-Kozentration (pg/ml) der JNJ (20)-, JNJ (50)- und der H4R-Knockout-Maus-Gruppe war im Vergleich zur Vehikelgruppe gehemmt. Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-27; Darstellung der MW ± SEM; n=3. 83 4.2.5 Einfluss des H4R im Arachidonsäure-Modell Um den Einfluss des H4R auf die durch Arachidonsäure (AA)-induzierte akute Entzündung zu untersuchen, wurde sowohl Wildtyp-Mäusen als auch H4R-Knockout-Mäusen AA topisch verabreicht. Um eventuelle Auswirkungen von JNJ7777120 beurteilen zu können, wurden in beiden Gruppen Vehikeltiere mit Mäusen, die JNJ7777120 oral appliziert bekamen, verglichen. Abbildung 4-27 zeigt den Einfluss von JNJ7777120 auf die Arachidonsäureinduzierte Entzündung. Vor allem bei den Wildtyp-Mäusen war eine tendenzielle Inhibition durch JNJ7777120 in der Ohrschwellung zu beobachten. Abbildung 4-27: Ohrschwellung nach AA-Applikation Tendenzielle Inhibition durch JNJ7777120 in der Ohrschwellung (µm) nach AA-Applikation (5 %) auf das Ohr, wobei diese stärker bei den Wildtyp-Mäusen als bei den H4R-Knockout-Mäusen ausgeprägt war. Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-28; Darstellung der MW ± SEM; n=7. 84 5 Diskussion Histamin, ein wichtiger Entzündungsmediator, spielt eine zentrale Rolle bei Allergien und Entzündungen. Seine immunmodulatorische Funktion im allergischen Geschehen wird seit langem untersucht. Nachdem zu den drei bekannten ein vierter Histaminrezeptor beschrieben wurde, der Histamin-H4-Rezeptor (H4R), versuchte man bisher schwer erklärbare Funktionen von Histamin dem neuen Rezeptor zuzuordnen. In welcher Weise der H4R ein allergisches Geschehen beeinflusst und die physiologischen und pathophysiologischen Vorgänge mediiert, wird in der Literatur diskutiert und unterschiedlich dargestellt. Sowohl anti- als auch proinflammatorische Eigenschaften werden ihm zugeschrieben (NEUMANN et al., 2010; SEIFERT et al., 2011). Als wichtigste, antigenpräsentierende Zelle fällt der dendritischen Zelle (DC) im Rahmen allergischer Hauterkrankungen wie der atopischen Dermatitis eine zentrale Rolle bei der Aktivierung antigenspezifischer T-Zellen zu. Dendritische Zellen besitzen auf ihrer Zelloberfläche Toll-Like-Rezeptoren, die pathogen associated molecular patterns (PAMPs), wie zum Beispiel Lipopolysaccharid (LPS), Lipoteichonsäure (LTA) und Peptidoglykan (PGN) binden können. Dies führt zur Aktivierung der DC, wodurch es zu einer Freisetzung verschiedener Zytokine kommt. In welcher Art und Weise Histamin dieses Geschehen beeinflusst, ist noch nicht hinreichend geklärt. Bei chronisch allergischen Prozessen moduliert Histamin beispielsweise die Zytokinsekretion dendritischer Zellen. Hierbei spielt der H1R eine wichtige Rolle, jedoch wird auch dem H4R zunehmend eine zentrale Rolle zugeschrieben. Ziel der Arbeit war es, die H4R-vermittelte Wirkung auf die T-ZellAktivierung bei allergischen Hauterkrankungen zu untersuchen. Neben in vitro Studien an dendritischen Zellen von Wildtyp- sowie H4R-Knockout-Mäusen wurde in vivo der genetische und pharmakologische Einfluss des H4R in zwei unabhängigen Mausmodellen, die einem Th2-dominierten Entzündungsgeschehen entsprechen, untersucht. So wurde in den Versuchen besonderes Augenmerk auf die H4R-Knockout-Maus und den selektiven H4R-Antagonisten JNJ7777120 gelegt. 85 5.1 Einfluss des H4-Rezeptors auf die Zytokinproduktion stimulierter dendritischer Zellen in vitro Inflammatorische, mikrobielle Stimuli wie LPS aktivieren und stimulieren DC zur Maturation und Sekretion von Zytokinen und fördern zusätzlich die Biosynthese von Histamin (AKIRA et al., 2001; OH et al., 1988). Die Zytokine der IL-12-Familie (IL-12, IL-23, IL-27) wurden nach Stimulation mit den TLR-Agonisten LPS, LTA und PGN sowohl bei DC von Wildtypals auch von H4R-Knockout-Mäusen vermehrt sezerniert. Hierbei war zu beobachten, dass die H4R-Knockout-Mäuse stets eine höhere Konzentration dieser Zytokine aufwiesen. So scheint die Sekretion dieser Zytokine H4R-mediiert zu sein. Stimuliert man den H4R, findet man geringere Konzentrationen dieser proinflammatorischen Zytokine der IL-12-Familie als nach genetischer Deletion. Dies kann im Hinblick auf die Funktionen dieser Zytokine im Ablauf einer immunologischen Erkrankung hilfreich sein, wenn auch H4R-Agonisten eine Inhibition dieser proinflammatorischen Zytokine zeigen würden. Auch CCL2, nicht aber TNFα, IL-10 und IL-6, wurde in den H4R-Knockout-Mäusen vermehrt sezerniert, so dass es scheint, als sei dieser Effekt zytokinspezifisch. Die H4R-vermittelte Inhibition von IL-12 und CCL2 wurde auch in anderen Arbeiten beschrieben. Humane DC und Monozyten zeigten nach Stimulation des H4R mit Histamin oder dem Agonisten 4-Methylhistamin (4-MH) eine Inhibition von proinflammatorischen Zytokinen, der spezifische Antagonist JNJ7777120 blockierte diesen Effekt, so dass auch dort dem H4R eine antiinflammatorische Wirkung zugeschrieben werden kann (GUTZMER et al., 2005; GSCHWANDTNER et al., unter Revision; DJIKSTRA et al., 2007). Im murinen System konnte dieser Effekt nur in Teilen reproduziert werden. Vergleichbar mit den Ergebnissen an humanen Monozyten zeigten auch murine DC nach Stimulation mit Histamin eine Inhibition von IL-12 und TNFα. Dieser Effekt war sowohl in Wildtyp- als auch in H4R-Knockout-Mäusen zu sehen. Die Inhibition durch 4-MH konnte im murinen System nicht gezeigt werden. Die Zytokine blieben hier unbeeinflusst. 4-MH gilt zwar als Agonist am H4R, allerdings werden ihm auch agonistische Wirkungen am H2R zugeschrieben. Man könnte daher eine Beteiligung des H2R an diesen Effekten nicht ausschließen, wobei 4-MH zumindest zum humanen H4R eine 100-fach höhere Affinität aufweist (LIM et al., 2005). Für den murinen H4R ist in der Literatur nichts Vergleichbares beschrieben. Da nach Stimulation des H4R durch den Agonisten 4-MH kein Effekt zu beobachten war und laut SEIFERT 4-MH am rekombinanten murinen H4R nicht spezifisch 86 ist*, Histamin dagegen die Zytokine inhibierte, kann man von einer Beteiligung anderer Hisraminrezeptoren wie zum Beispiel dem H2R ausgehen. Gestärkt wird diese Annahme durch die Daten der H4R-Knockout-Mäuse, die ebenfalls eine Inhibition der Zytokine nach Histaminstimulation, allerdings keinen Effekt nach Stimulation mit 4-MH zeigten. Bevor man begann, die H4R-vermittelte Wirkung auf die Zytokin- und Chemokinproduktion zu untersuchen, konnte gezeigt werden, dass bei Antigen-präsentierenden Zellen (APZ) Histamin über den H1R proinflammatorische Aktivität zeigt, über den H2R eine vorwiegend immunsupprimierende Funktion mediiert. Nach Binden von Histamin an den humanen H2R wurde die Produktion der proinflammatorischen Zytokine TNFα, IL-12, IL-18 inhibiert und das regulatorische IL-10 gesteigert (ELENKOV et al., 1998; VANNIER et al., 1991). Bislang wurde die durch Histamin induzierte Hemmung von IL-12 verschiedenen Histaminrezeptoren zugeschrieben. In Studien an humanen Zellen schrieben CARON et al. (2001) und GUTZMER et al. (2002) den Konzentrationsabfall dem H1R und H2R zu, IDZKO et al. (2002) dem H2R und dem H3R. Die Suppression von IL-12 scheint beim H2R cAMPvermittelt, beim H4R über die Aktivierung des Transkriptionsfaktors AP-1 vermittelt zu sein (GUTZMER et al., 2005). Die Interaktion von T-Zellen und DC ist ausschlaggebend für die Immunantwort bei allergischen Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen. Durch Histamin kann diese Interaktion beeinflusst werden. Betrachtet man beispielsweise die IL-12-Familie und deren Einfluss auf das Th1-dominierte Zellgeschehen bei murinen DC, kann man von einer Beeinflussung der T-Zellen zugunsten eines Th2-dominierten Geschehens durch die H4R-vermittelte Wirkung ausgehen. In einer anderen Arbeit an murinen DC wurde gezeigt, dass die Blockade des H4R mittels des spezifischen Antagonisten JNJ7777120 zu einer Runterregulation ders Th2-Zytokin IL-4, des proinflammatorischen Zytokins IL-6 und des Th17-Zytokins IL-17 führt (DUNFORD et al., 2006). So scheint es, als beeinflusse Histamin die Zytokinsekretion dendritischer Zellen zugunsten von Th2-Zellen. Th1-Zytokine wie IL-12 werden inhibiert, wohingegen das Th2-Zytokin IL-10 sowie das proinflammatorische Zytokin IL-6 in höheren Konzentrationen vorhanden sind. Die Untersuchungen machen deutlich, dass Histamin über den H4R als Immunmodulator wirkt, da sowohl immunsupprimierende als auch immunstimulierende Signale über den H4R mediiert werden. Die Zytokine der IL-12-Familie zeigten ein einheitliches Bild bezüglich ihrer Beeinflussung des H4R nach Stimulation mit * Prof. Dr. R. Seifert, mündliche Mitteilung, 16.3.2011. 87 TLR-Agonisten und Histamin. Trotzdem erscheint es sinnvoll sie einzeln zu betrachten, da sie in der Literatur mit unterschiedlichen Erkrankungen in Verbindung gebracht werden. Das proinflammatorische Zytokin IL-12 ist ein immunregulatorisches Schlüsselzytokin. Es polarisiert naive T-Zellen in Th1-Helferzellen und unterdrückt gleichzeitig Th2-Zytokine. Der Einfluss von Histamin auf die IL-12-Produktion von Zellen wurde von zahlreichen Autoren untersucht und scheint abhängig von der Spezies zu sein. Sowohl auf humanen als auch auf murinen DC konnte gezeigt werden, dass Histamin die durch LPS induzierte IL-12-Sekretion hemmt und somit zur Polarisierung einer Th2-Antwort beiträgt (GUTZMER et al., 2002, 2005; CARON et al., 2001; WENDORFF, 2008). Auf humanen DC konnte neben der Inhibition durch Histamin auch eine Inhibition durch 4-MH beobachtet werden, die durch den H4R-Antagonisten JNJ7777120 blockiert werden konnte (GUTZMER et al., 2005). Die Inhibition von IL-12 durch 4-MH konnte im murinen System nicht bestätigt werden. SEIFERT zeigte gleiche Effekte von 4-MH. Er zeigte nicht nur, dass 4-MH am rekombinanten H4R nicht spezifisch ist sondern auch dass 4-MH eine hohe Affinität zu anderen Histaminrezeptoren aufweist. Im Gegensatz zu humanen Zellen scheint der H4R bezüglich der Stimulation von IL-12 einen inhibierenden Effekt und dadurch eine antiinflammatorische Wirkung zu haben. IL-23, ebenfalls ein proinflammatorisches Zytokin, wird in der Literatur nicht ausschließlich als Th1-Zytokin, sondern vielfach neben IL-21 und TGFβ als wichtiger Faktor für die Entwicklung von Th17-Zellen beschrieben (CLARK u. FUHLBRIGGE, 2009; DIVEU et al., 2008). Seit der Entdeckung von Th17-Zellen und der direkten Verbindung zu IL-23 geht man davon aus, dass die IL-23/Th17-Achse und nicht mehr die IL-12/Th1-Achse für Autoimmunerkrankungen verantwortlich ist (KAGAMI, 2011). Th17-Zellen treten in Autoimmunerkrankungen wie zum Beispiel bei Psoriasis und Morbus Crohn vermehrt auf. Es konnte gezeigt werden, dass in Läsionen von Psoriasispatienten vermehrt IL-23 produziert wird. Auch bei der atopischen Dermatitis wird eine Beteiligung von Th17-Zellen diskutiert. Sowohl in Hautbiopsien als auch in peripherem Blut von Patienten mit atopischer Dermatitis wurde eine erhöhte Konzentration der Th17-Zellen bzw. des Th17-Zytokins IL-17 nachgewiesen (TODA et al., 2003; KOGA et al., 2008). Inwieweit IL-23 die Produktion der Th17-Zellen beeinflusst muss noch weiter erforscht werden. Die in dieser Arbeit gezeigte inhibierende Wirkung des H4R auf die Sekretion von IL-23 könnte bei der Behandlung von Psoriasis oder auch atopischer Dermatitis von Interesse sein. Eine Stimulation des H4R würde demnach zu einer Linderung der Symptome führen. 88 Das dritte Mitglied der IL-12-Familie, das proinflammatorische IL-27, wird von APZ gebildet. Zusammen mit IL-12 verstärkt es die Produktion von IFNγ, wodurch es zu einer Polarisierung der naiven T-Zellen in Richtung Th1 kommt (PFLANZ et al., 2002). Eine Studie mit IL-27-Knockout-Mäusen zeigte, dass die Deletion des IL-27-Rezeptors proinflammatorische Auswirkungen hat. Die Tiere entwickelten nach Infektion mit Mycobacterium tuberculosis über Aerosole stärkere Entzündungssymptome. Die proinflammatorischen Zytokine TNFα, IFNγ und IL-12 wiesen eine signifikant erhöhte Konzentration in der Lunge auf, zudem war eine verstärkte Anzahl von Leukozyten nachzuweisen (HÖLSCHER et al., 2005). Auch andere Studien mit IL-27-Knockout-Mäusen beschrieben erhöhte Entzündungssymptome nach Infektion mit intrazellulären Erregern (VILLARINO et al., 2003; ROSAS et al., 2006). Obwohl die Zytokine der IL-12-Familie Ähnlichkeiten in ihrer Struktur aufweisen, scheinen sie im Organismus gegensätzliche Funktionen zu haben. Auf der einen Seite werden monoklonale Antikörper gegen IL-23/IL-12p40 in klinischen Studien für Multiple Sklerose und Psoriasis getestet, auf der anderen Seite sind Typ 1 Interferone, welche die Synthese von IL-27 fördern, bei der Behandlung von Multipler Sklerose im Einsatz (BUTTMANN u. RIECKMANN, 2007). 5.2 Rolle des H4-Rezeptors in murinen Kontaktallergiemodellen Ziel der In-vivo-Versuche dieser Arbeit war es, die H4R-vermittelte Wirkung bei der Allergen-bedingten Kontaktallergie zu untersuchen. Von besonderem Interesse war hierbei der Vergleich auf pharmakologischer und genetischer Ebene. Daher wurde dem spezifischen H4R-Antagonisten JNJ7777120 in den Versuchen die H4R-Knockout-Maus gegenübergestellt. Die chronische Applikation von Allergenen erlaubt es, ein Kontaktallergiegeschehen in vivo zu untersuchen. Je nach Allergen dominierten T-Helferzellen vom Typ 1 bzw. vom Typ 2. Dinitrochlorbenzen (DNCB) beispielsweise löst eine Th1-dominierte Entzündung aus, Toluen-2,4-diisocyanat (TDI) und Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) eine Th2-dominierte (BÄUMER et al., 2004). In Patienten mit atopischer Dermatitis konnte man in akuten Läsionen vermehrt Th2-assoziierte Zytokine finden, in chronischen Läsionen vermehrt Th1assoziierte. Für allergische Hauterkrankungen ist die Erforschung beider Phasen einer Kontaktallergie von besonderem Interesse. In dieser Arbeit wurde besonderes Augenmerk auf das Th2-dominierte Geschehen im Organismus während Sensibilisierung und Challenge gelegt. Die Sensibilisierung entspricht der Induktion einer Kontaktallergie. Die Challenge kommt der chronischen Phase einer Allergie nahe und ist dadurch mit der atopischen 89 Dermatitis vergleichbar. Die H4R-vermittelte Wirkung in der Allergen-induzierten Kontaktallergie wurde anhand zweier Th2-mediierter muriner Modelle (TDI und FITC) untersucht. Das TDI-Modell ist in der Arbeitsgruppe gut etabliert, wobei das FITC-Modell nach Vorlage von COWDEN et al. (2010) umgesetzt wurde. Ein FITC-Kontaktallergiemodell wird als Th2-mediiertes, IgE und CD4+-Zell abhängiges Modell beschrieben, das dem Geschehen der atopischen Dermatitis sehr ähnlich ist (DEARMAN u. KIMBER, 2000). Untersuchungsparameter wie Ohrschwellung, Lymphknotenanalyse und Zytokinexpression halfen, die Vorgänge im Organismus während eines Allergiegeschehens zu analysieren. Durch Applikation der Allergene auf die Ohren wurde eine entzündliche Ohrschwellung ausgelöst. Im TDI-Kontaktallergiemodell konnte beobachtet werden, dass während der Challenge die mit dem H4R-Antagonisten JNJ7777120 behandelten Tiere eine reduzierte Ohrschwellung aufwiesen. In der Sensibilisierung dagegen wurde eine Steigerung der Ohrschwellung vor allem bei den H4R-Knockout-Mäusen aber auch nach Applikation des H4R-Antagonisten JNJ7777120 beobachtet. WENDORFF (2008) konnte im Th1-dominierten DNCB-Modell einen ähnlichen Effekt bei der entzündlichen Ohrschwellung zeigen. Auch dort hatten die mit dem H4R-Antagonisten behandelten Tiere in der Sensibilisierung eine tendenziell stärkere Ohrschwellung als die Vehikeltiere. In der Challenge konnte jedoch kein Unterschied beobachtet werden (WENDORFF, 2008). Man kann also von einer unterschiedlichen Beeinflussung des H4R zum einen im Th1- und Th2-dominierten Geschehen und zum anderen in der Sensibilisierung und Challenge ausgehen. Auch im FITCAllergiegeschehen waren Unterschiede zwischen Sensibilisierung und Challenge in Hinsicht auf die Ohrschwellung zu sehen. Während die Ohrdicke in der Sensibilisierung unbeeinträchtigt blieb, zeigte JNJ7777120 einen inhibierenden Effekt in der Challenge. Auch COWDEN et al. (2010) konnten in der Challenge einen Effekt des H4R-Antagonisten beobachten. Im FITC-Modell zeigten sie, dass die mit dem H4R-Antagonisten behandelten Mäuse und ebenso die H4R-Knockout-Mäuse eine signifikant reduzierte Ohrdicke aufwiesen (COWDEN et al., 2010). Auch bei der H4R-vermittelten Wirkung nach Allergenapplikation zeigte der H4R-Antagonist JNJ7777120 in der Sensibilisierungsphase in den lokalen Lymphknoten der Ohren unterschiedliche Funktionen. In dieser Arbeit konnte in keinem der Kontaktallergiemodelle unabhängig vom Zeitpunkt der Allergie eine Beeinflussung von Gewicht, Gesamtzellzahl und Zellinflux festgestellt werden, weder durch den H4R-Antagonisten JNJ7777120 (30 mg/kg subcutan bzw. 20/50 mg/kg per os) noch durch genetische Deletion des H4R in den Mäusen. 90 Dieser Effekt schien unabhängig von Art der Applikation und Dosis des Antagonisten zu sein. Nach intraperitonealer Applikation von 15 mg/kg JNJ7777120 konnte auch WENDORFF (2008) keine Veränderung dieser Entzündungsparameter beobachten. Im FITC- Kontaktallergiemodell dagegen wurde in eigenen Untersuchungen und bei COWDEN et al. (2010) nach oraler Gabe des H4R-Antagonisten eine Inhibition von Entzündung, Mastzellund Eosinophileninfiltration in den Allergen-behandelten Ohren festgestellt. Auch SEIKE et al. (2010) konnten in einem chronischen Modell in Hautbiopsien, die nach TNCB-Applikation untersucht wurden, ausschließlich nach repetitiver Gabe des Allergens einen Abfall von Mastzellen und Eosinophilen beobachten. Abhängig von der Art des Allergens war die H4R-vermittelte Wirkung auf die Konzentration verschiedener pro- und antiinflammatorischer Zytokine. Im FITC-Kontaktallergiemodell zeigte sich ein einheitliches Bild der H4R-vermittelten Wirkung auf Zytokine. Die pharmakologische und genetische Blockade des H4R in der Sensibilisierungs- und Challengephase stellte sich als inhibierend bei der Sekretion von Zytokinen heraus. Unabhängig von der Dosis (20 mg/kg bzw. 50 mg/kg per os) führte die Blockade des H4R zu geringeren Konzentrationen der proinflammatorischen Zytokine IL-1β und IL-17 sowie des Th2-Zytokins IL-4. Im FITC-Kontaktallergiemodell kann man demnach von einem proinflammatorischen Einfluss des H4R auf die Zytokine IL-1β, IL-4 und IL-17 ausgehen. Eine Inhibition der Zytokine IL-4, IL-1β, IL-6 und TNFα konnten ebenfalls COWDEN et al. (2010) in einem FITC-Kontaktallergiemodell nach oraler Behandlung mit JNJ7777120 feststellen. Auch in dieser Studie lag die Konzentration von JNJ7777120 bei 50 mg/kg. Mit dieser Arbeit übereinstimmend wurde in einem chronischen Ovalbumin-Asthma-Modell gezeigt, dass H4R-Knockout-Mäuse eine geringere Konzentration von IL-4, IL-5 und IL-17 in den Lymphknoten aufwiesen (DUNFORD et al., 2006). SEIKE et al. (2010) zeigten in ihrem chronischen TNCB-Modell eine geringere Konzentration der Th2-Zytokine IL-4, IL-5 und des proinflammatorischen Zytokins IL-6 bei den mit JNJ7777120 behandelten Mäusen. Zudem zeigten die Th1-Zytokine IL-12 und IFNγ eine erhöhte Konzentration. T-Zellen spielen unter anderem durch ihre Interaktion mit Histamin eine wichtige Rolle bei allergischen Hautreaktionen. Für die Kommunikation von T-Zellen und Histamin wurden bis vor kurzem hauptsächlich die H1- und H2-Rezeptoren verantwortlich gemacht (JUTEL et al., 2002). Die nachgewiesene Expression des H4R auf humanen Th2- und Th17-Zellen lässt hoffen, dass man über Agonisten oder Antagonisten des H4R ein Entzündungsgeschehen beeinflussen kann (GUTZMER et al., 2009). Bis heute wurde dem H4R in den meisten In-vivo-Arbeiten ein proinflammatorischer Effekt zugeschrieben. SEIKE et al. (2010) stellten 91 fest, dass ausschließlich nach wiederholter und nicht nach einmaliger Challenge ein Effekt des H4R-Antagonisten zu sehen war. Ebenfalls zeigten sie, dass nach repetitiver Gabe des Allergens JNJ7777120 einen inhibierenden Effekt auf Th2-Zytokine, jedoch einen induzierenden Effekt auf IL-12 vorwies (SEIKE et al., 2010). Die H4R-vermittelte Inhibition von IL-12 konnte auch in eigenen In-vitro-Untersuchungen gezeigt werden. Die Interaktion von Th1- und Th2-Zytokinen stellt einen wichtigen Bestandteil einer Allergie dar, so dass es von Bedeutung scheint, in welcher Art und Weise der H4R die Sekretion der Zytokine beider Klassen von T-Helferzellen beeinflusst und damit das Zellgeschehen im Organismus während einer Allergie. Weniger einheitlich zeigte sich das Bild in Bezug auf die TDI-Kontaktallergie in dieser Arbeit. Es waren sowohl pro- als auch antiinflammatorische Effekte des H4R zu beobachten. Zudem gab es kein übereinstimmendes Bild der pharmakologischen und genetischen Blockade des H4R. Die genetische Deletion des H4R zeigte ausschließlich in der Sensibilisierung einen Effekt. Dort konnte eine signifikante Inhibition des proinflammatorischen Zytokins IL-6 im regionalen Lymphknoten festgestellt werden. Alle anderen Zytokine blieben sowohl in der Sensibilisierung als auch in der Challenge in den H4R-Knockout-Mäusen unbeeinflusst. Anders wirkte sich die pharmakologische Blockade des H4R aus. In der Sensibilisierung zeigte im lokalen Lymphknoten ausschließlich IL-6 einen Konzentrationsabfall in der mit JNJ7777120 behandelten Gruppe. Das Th1-assoziierte, proinflammatorische Zytokin IFNγ blieb in der Sensibilisierung unbeeinflusst. In der Challenge dagegen zeigte sich ein Konzentrationsanstieg durch pharmakologische Blockade, genau wie bei den proinflammatorischen Zytokinen IL-1β und IL-17. Fasst man die Ergebnisse zusammen, kann man feststellen, dass der H4R-Antagonist proinflammatorische Zytokine auf unterschiedliche Weise beeinflusst. In der Sensibilisierung blieb IFNγ unbeeinflusst, IL-6 dagegen wurde inhibiert. Eine induzierende Wirkung dagegen zeigte sich in der Challenge auf die proinflammatorischen Zytokine IL-1β (Ohrhaut), IL-17 und IFNγ (lokale Lymphknoten). Der Einfluss des H4R-Antagonisten auf die Sekretion von Zytokinen scheint unter anderem abhängig vom Allergen zu sein. Im TDI-Modell zeigte sich überwiegend ein induzierender Effekt, nach FITC-Gabe konnte ausschließlich ein inhibierender Effekt beobachtet werden. Vergleicht man die In-vivo-Ergebnisse dieser Arbeit miteinander, können dem H4R sowohl proinflammatorische als auch antiinflammatorische Effekte zugesprochen werden. Es ist nicht möglich, die H4R-vermittelten Wirkungen der beiden Kontaktallergiemodelle zu vergleichen. 92 Auch die H4R-vermittelte Wirkung auf pharmakologischer und genetischer Ebene zeigte kein einheitliches Bild, so dass man den H4R-Antagonisten unabhängig von den H4R-KnockoutMäusen betrachten kann. Antiinflammatorische Effekte des H4R-Antagonisten werden in vielen Studien postuliert. Verschiedene Autoren publizierten, dass die H4R-vermittelte Wirkung bei Erkrankungen wie Bronchialasthma, atopischer Dermatitis und Pruritus eine proinflammatorische zu sein scheint (THURMOND et al., 2004; DUNFORD et al., 2006; MORGAN et al., 2007; LEURS et al., 2009; ROSSBACH et al., 2009b; SEIKE et al., 2010). Ein direkter Vergleich dieser Ergebnisse kann allerdings nicht durchgeführt werden, da zu viele Komponenten der Versuche nicht übereinstimmen und daher nicht vergleichbar sind. So werden unterschiedliche Zellarten, Allergene, verschiedene Konzentrationen des H4RAntagonisten und auch abweichende Applikationsarten verwendet. Allerdings kann festgestellt werden, dass der H4R-Antagonist JNJ7777120 keine einheitliche Wirkung zu haben scheint, weshalb NEUMANN et al. (2010) die Ergebnisse der Arbeiten zur H4R-vermittelten Wirkung im Asthma-Modell kritisch hinterfragten. Sie stellten unter anderem fest, dass es nur zwei Originalartikel gibt (DUNFORD et al., 2006; MORGAN et al., 2007), allerdings 5 Reviews (z.B. THURMOND et al., 2008; ZAMPELI et al., 2009) und weitere 15 Arbeiten, welche die zwei Originalarbeiten zitieren. Beachtet man, dass in einer Zeitspanne von 4 Jahren nur 2 Originalstudien erschienen sind, sich aber trotzdem ein überwiegend antiinflammatorisches Bild des H4R-Antagonisten durchgesetzt hat, sollte der H4R auch aus einem anderen Blickwinkel untersucht werden. Unter anderem im Zuge dieser Arbeit konnten dem H4R sowohl pro- als auch antiinflammatorische Wirkungen zugesprochen werden. Um die widersprüchlichen Ergebnisse des H4R zu ergründen, betrachteten auch SEIFERT et al. (2011) den H4R aus anderer Perspektive. Sie verglichen Arbeiten, die nicht ausschließlich die Interaktion eines G-Proteins mit dem G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) untersuchten, sondern auch die Interaktion anderer Proteine mit diesem Rezeptor. Da der Rezeptor nicht ausschließlich über die Aktivierung eines G-Proteins wirken kann, sondern auch über andere Proteine, scheint der übergeordnete Begriff der 7-TransmembranRezeptoren (7TM) die bessere Bezeichnung zu sein. Abhängig vom Liganden des 7TM-Rezeptors wird entweder ein G-Protein oder das Protein β-Arrestin aktiviert. β-Arrestin stimuliert G-Protein-unabhängige Signaltransduktionswege, die andere biochemische und funktionale Auswirkungen zeigen. Man muss allerdings beachten, dass diese aktivierende Funktion des β-Arrestin bislang ausschließlich an Zelllinien, nicht aber an Primärzellen nachgewiesen wurde (RAJAGOPAL et al., 2010). Die eigentlich Hauptfunktion von 93 β-Arrestin stellt die Inaktivierung des 7TM-Rezeptors dar (LUTTRELL und GESTYPALMER, 2010). In einer Studie von LUTTRELL und GESTY-PALMER (2010) wurde gezeigt, dass der H4R-Antagonist JNJ7777120 sehr effektiv ERK aktivierte, wohingegen Histamin diesen aktivierenden Effekt nur in geringem Maße zeigte. Die Aktivierung von ERK ist β-Arrestin-abhängig und G-Protein-unabhängig. JNJ7777120 stellte sich in dieser Arbeit als Agonist hinsichtlich der Aktivierung von ERK dar, wobei man beachten muss, dass die verwendete Konzentration des Antagonisten sehr hoch war, so dass man eine Beteiligung eines anderen Faktors an der ERK-Aktivierung nicht ausschließen kann. Zum gleichen Ergebnis bezüglich der G-Protein-unabhängigen Aktivierung des H4R durch JNJ7777120 kamen ROSETHORNE und CHARLTON (2011). Sie untersuchten die Wirkung von JNJ7777120 an humanen Osteosarkom-Zellen. Durch Zugabe des Pertussis Toxins zu den Zellen wurden die G-Proteine am Rezeptor inaktiviert (UI u. KATADA, 1990). So konnte man sicher sein, dass ein JNJ7777120-vermittelter Effekt nicht G-Protein abhängig sein kann. Der H4R Antagonist führte dann zu einer Konzentrationssteigerung von β-Arrestin (ROSETHORNE u. CHARLTON, 2011). Auch hier muss man vorsichtig mit der Aussage sein, dass ausschließlich der H4R für diesen Effekt verantwortlich ist. WALTERS et al. (2009) zeigten zum Beispiel, dass auch das Pertussis-Toxin zu einer Konzentrationssteigerung des β-Arrestin führt. Allerdings wurden nicht nur in dieser Rezeptorbindungsstudie agonistische Wirkungen des H4R-Antagonisten gezeigt. SCHNELL et al. (2011) untersuchten den H4R verschiedener Spezies auf neutralen Insektenzellen, in denen man eine Beeinflussung durch andere Faktoren ausschließen und damit die Wirkung des Antagonisten am Rezeptor untersuchen konnte. Es zeigte sich, dass JNJ7777120 am H4R von Maus, Ratte und Hund eine starke agonistische Wirkung bezüglich der Aktivierung des G-Proteins aufwies. Am humanen H4R stellte sich der Antagonist als inverser Agonist dar (SCHNELL et al., 2011). 5.3 Schlussfolgerung und Ausblick Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten verschiedene Aspekte der H4R-vermittelten Wirkung. Die Beeinflussung der Zytokinproduktion in vitro durch den H4R scheint in Bezug auf die Mitglieder der IL-12-Familie ein inhibierender Effekt zu sein. Das zeigten die Ergebnisse nach Stimulation mit den TLR-Agonisten eindeutig. Es kann jedoch kein Schluss bezüglich einer Beeinflussung eines entzündlichen Prozesses im Organismus gezogen werden, da zwar Struktur und Aufbau der Zytokine ähnlich ist, wodurch die einheitliche Inhibition zu erklären sein könnte, nicht aber die Wirkung der Zytokine in einem Entzündungsgeschehen. Da 94 sowohl IL-12 als auch IL-27 ein Th1-Zytokin sind, kann man zumindest teilweise von einer Beeinflussung des H4R bezüglich der Differenzierung von T-Zellen ausgehen. Betrachtet man die Ergebnisse nach Stimulation mit Histamin bzw. 4-MH, stellt man fest, dass zwar eine Inhibition der Zytokine durch Histamin, nicht aber durch den H4R-Agonisten beobachtet wurde. Die Tatsache, dass 4-MH am murinen H4R nicht spezifisch ist, konnte in ersten Versuchen gezeigt werden. Auch aus den Ergebnissen der In-vivo-Versuche kann keine richtungsweisende Quintessenz im Hinblick auf ein Th2-dominiertes Geschehen gezogen werden. Obwohl der H4R-Antagonist in den letzten 10 Jahren größtenteils als antiinflammatorische Substanz und als neue Therapiemöglichkeit verschiedener allergischer Erkrankungen gehandelt wurde, zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit und auch vereinzelter anderer, dass JNJ7777120 auch proinflammatorische Wirkungen aufweisen kann. Dabei ist die Ausgangssituation des Organismus nicht unentscheidend. So werden unterschiedliche Ergebnisse erzielt, je nachdem ob eine Prästimulation durch Histamin stattgefunden hat oder ausschließlich der physiologische Anteil an Histamin im Organismus vorhanden war. Dass pharmakologische Substanzen als spezifisch für einen Rezeptor deklariert werden, ihnen aber im Laufe der Jahre auch Wirkungen an anderen Rezeptoren zugesprochen werden, zeigte das zuerst als spezifischer H3R-Antagonist deklarierte Thioperamid, das sich auch als inverser H4R-Agonist herausstellte. Die bis zu diesem Zeitpunkt veröffentlichen Wirkungen von Thioperamid waren somit hinfällig (NGUYEN et al., 2001; SCHNEIDER et al., 2009; SCHNELL et al., 2010). Ob der H4R-Antagonist JNJ7777120 eher anti- oder eher proinflammatorische Wirkungen hat, scheint noch lange nicht geklärt. Nicht nur der H4R-Antagonist sondern auch die genetische Deletion des H4R wurde bislang nur sehr wenig untersucht. Insgesamt kann man sagen, dass es innerhalb von 10 Jahren vergleichsweise wenige Veröffentlichungen über die H4R-vermittelte Wirkung gibt. Viele beschrieben eine ausschließlich antiinflammatorische Wirkung des H4R-Antagonisten. Nur wenige, wie zum Beispiel GUTZMER et al. (2009), zeigen neben stimulierenden Funktionen des H4R auf die Migration von antigenpräsentierenden Zellen auch inhibierende Effekte des H4R auf die Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen. Daher stellen NEUMANN et al. (2010) in Frage, ob eventuell Ergebnisse, die nicht mit der deklarierten antiinflammatorischen Wirkung zusammen passten, nicht veröffentlich wurden. In dieser Arbeitsgruppe zeigten inzwischen zwei unabhängige Arbeiten widersprüchliche Ergebnisse des H4R-Antagonist JNJ7777120. Nicht vergessen sollte man trotz alledem, dass unterschiedliche Zellarten und Spezies, verschiedene Applikationsarten und Konzentrationen des H4R-Antagonisten verwendet wurden. Zusätzlich ist zu beachten, dass die Halbwertszeit von JNJ7777120 nach oraler 95 Applikation bei der Maus nur etwa eine Stunde beträgt und eine geringe Bioverfügbarkeit besteht (THURMOND et al., 2004). Ob und wie der H4R ein Allergiegeschehen beeinflusst und in welcher Art und Weise ein Agonist oder Antagonist in Krankheiten wie der atopischen Dermatitis zum Einsatz kommen kann, muss noch ausführlicher erforscht und die Ergebnisse kritischer hinterfragt werden. Sollte sich tatsächlich bestätigen, dass H4R-Antagonisten wie JNJ7777120 eine überwiegend antiinflammatorische Wirkung haben, wäre diese recht neue Gruppe eine weitere Option Allergien zu behandeln. 96 6 Zusammenfassung Hannah Mariele Bunk Einfluss des Histamin-H4-Rezeptors auf die T-Zell-Aktivierung bei allergischen Hauterkrankungen In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss des Histamin-H4-Rezeptors (H4R) auf die T-Zell-Aktivierung bei allergischen Hauterkrankungen untersucht. Hierfür wurde bei dendritischen Zellen die H4R-vermittelte Wirkung auf die Sekretion von Zytokinen untersucht. Zudem war die Wirkung des Rezeptors in Modellen der allergischen Kontaktdermatitis von besonderem Interesse. Mit Hilfe des spezifischen Histamin-H4-Rezeptorantagonisten JNJ7777120 und H4R-Knockout-Mäusen konnte der Einfluss des H4R analysiert werden. Die In-vitro-Untersuchungen wurden mit In-vitro-generierten dendritischen Zellen von BALB/c-Mäusen und H4R-Knockout-Mäusen mit BALB/c-Hintergrund durchgeführt. Es wurde der Einfluss des Rezeptors auf die Zytokine der Interleukin-12-Familie und zum Vergleich auf die Zytokine Chemokin-Ligand-2, Tumor-Nekrose-Faktor α, Interleukin-10 und Interleukin-6 untersucht, zum einen nach Stimulation mit Toll-Like-Receptor-Agonisten, zum anderen nach Stimulation mit Histamin und dem H4R-Agonisten 4-Methylhistamin. Nach Stimulation mit den Toll-Like-Receptor-Agonisten zeigten die dendritischen Zellen der H4R-Knockout-Mäuse stets eine höhere Konzentration von Interleukin-12, Interleukin-23 und Interleukin-27. Auch bei Chemokin-Ligand-2 wurde der gleiche Effekt beobachtet, nicht aber bei Tumor-Nekrose-Faktor-α und Interleukin-10. Die höheren Konzentrationen nach TollLike-Receptor-Stimulation scheinen zytokinspezifisch und H4R-mediiert zu sein. Dendritische Zellen spielen im Rahmen allergischer Entzündungen eine wichtige Rolle, da sie nach Migration in die regionalen Lymphknoten naiven T-Zellen das Antigen präsentieren. Daher wurde auch der Einfluss von Histamin und 4-Methylhistamin auf dendritische Zellen untersucht. Nach Stimulation mit 4-Methylhistamin konnte bei keinem der Zytokine unabhängig vom Maustyp ein Effekt beobachtet werden, wohingegen Histamin die Zytokine inhibierte. Inwieweit die Inhibition durch Histamin H4R-abhängig ist, kann nach der Stimulation mit 4-Methylhistamin, die keinen Effekt zeigte, schwer gesagt werden, da nach neuen, bislang unveröffentlichen Ergebnissen 4-Methylhistamin nicht nur am H4R agonistisch wirkt und zusätzlich am rekombinanten murinen H4R nicht spezifisch ist. 97 In vivo wurde der Einfluss des H4R-Antagonisten JNJ7777120 und der H4R-Knockout-Maus in verschiedenen murinen Kontaktallergiemodellen, die eine Th2-dominierte Entzündung darstellen, untersucht. Der Einfluss verschiedener Allergene auf die H4R-vermittelte Wirkung wurde sowohl in der Sensibilisierung als auch in der Challenge analysiert. Als Untersuchungsparameter wurden entzündliche Ohrschwellung, Lymphknotengewicht und Gesamtzellzahl in den regionalen Lymphknoten und Konzentrationen verschiedener Zytokine (Interleukin-6, Interleukin-4, Interleukin-17, Interleukin-1β, Interferon-γ) betrachtet. Im TDI-(Toluen-2,4-diisothiocyanat)-Kontaktallergiemodell zeigten die H4R-Knockout-Mäuse in der Sensibilisierung auf der einen Seite eine signifikante Induktion der Ohrschwellung und auf der anderen eine Inhibition der Interleukin 6 Konzentration im Lymphknoten. In der Challenge blieben alle Parameter unbeeinflusst. Durch den H4R-Antagonisten JNJ7777120 (30 mg/kg subcutan) wurde in der Sensibilisierung ausschließlich eine Inhibition von Interleukin-6 erzielt, während in der Challenge eine Inhibition der Ohrschwellung und erhöhte Konzentrationen von Interleukin-1β in der Ohrhaut und Interleukin-17 und Interferon-γ im lokalen Lymphknoten gesehen wurden. Dabei wurden Unterschiede beobachtet, wenn der Antagonist in Sensibilisierung und Challenge oder ausschließlich in der Challenge verabreicht wurde. Im FITC-(Fluorescein-Isothiocyanat)-Kontaktallergiemodell H4R-Knockout-Mäuse eine reduzierte Konzentration der Zytokine zeigten die Interleukin-1β, Interleukin-17 und Interleukin-4, die Ohrschwellung blieb unbeeinflusst. Der H4R-Antagonist JNJ7777120 dagegen bewirkte sowohl in der Sensibilisierung (20 mg/kg oral) als auch in der Challenge (20 bzw. 50 mg/kg oral) eine Inhibition aller untersuchten Zytokine (Interleukin17, Interleukin-1β und Interleukin-4). Auch die Ohrdicke der mit dem Antagonisten behandelten Tiere waren reduziert. Diese Effekte waren nicht konzentrationsabhängig. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass der H4R in Bezug auf seine Wirkungen im murinen Organismus ein vielfältiger Rezeptor ist. Inwieweit das Maus- Kontaktallergiemodell geeignet ist, um den Einfluss des H4R-Antagonisten JNJ7777120 auf Erkrankungen wie die atopische Dermatitis zu untersuchen, sollte in Zukunft kritisch hinterfragt werden, da der Antagonist in Bezug auf die Th2-dominierte Entzündung kein einheitliches Bild lieferte. Zudem sollte die Tatsache, dass die Homologie des H4R zwischen Mensch und Maus nur 68 % beträgt, nicht unbeachtet bleiben. Die Feststellung, dass der H4R die Sekretion der Zytokine der Interleukin-12-Familie moduliert, lässt darauf hoffen, dass bei Erkrankungen wie Multipler Sklerose oder Psoriasis, bei denen diese Zytokine eine Rolle spielen, eine neue Therapiemöglichkeit entsteht. 98 7 Summary Hannah Mariele Bunk Role of the histamine H4 receptor on T-cell-activation in models of allergic dermatitis In the present study the specific influence of the histamine H4 receptor (H4R) on naïve T cell activation in the course of allergic skin diseases was investigated. For this purpose, the H4Rmediated effect on cytokine secretion by dendritic cells (DC) was tested. An additional focus was set on the receptor's role in mouse models of allergic contact dermatitis. The H4R's influence was examined by applying the specific H4R antagonist JNJ7777120 and H4R knockout mice. The in vitro experiments were performed using primary dendritic cells from BALB/c mice as well as from H4R knockout mice with a BALB/c genetic background. In these experiments the receptor's effect on several members of the interleukin-12 family cytokines was tested and compared to its respective effect on chemokin-ligand-2, tumor-necrosis-factor-α, interleukin10, and interleukin-6 cytokine, after the stimulation with several toll-like-receptor agonists, histamine, and the H4R agonist 4-methylhistamine. The stimulation of dendritic cells with the toll-like-receptor agonists resulted in a higher concentration of interleukin-12, interleukin-23, and interleukin-27 in H4R knockout mice. The same was observed for chemokine-ligand-2 but not for tumor necrosis factor α or interleukin-10. This suggests that the higher concentrations after the toll-like-receptor stimulation are cytokine-specific and H4R-mediated. Furthermore, due to the important role of dendritic cells in the development of allergic inflammation (they present the antigens to the naïve T-cells after having migrated to the local lymph nodes), the effect of histamine and 4-methylhistamine on dendritic cells was assessed as well. The stimulation with 4-methylhistamine showed no effect on any cytokine regardless of the mouse type. However, the question wether histamine inhibition is connected to H4R or not, remains unanswered, since 4-methylhistamine does not exclusively have an agonistic effect on H4R, and, according to recent (yet unpublished) results, it is not specific for the recombinant murine H4R. 99 In vivo experiments were conducted in order to determine the influence of the H4R antagonist JNJ7777120 and H4R knockout mice in different murine contact allergy models mimicking a Th2 dominated inflammation. The impact regarding the distinct allergens was analyzed during the sensitization phase and at the time of elicitation. Inflammatory swelling of the ears, total amount of cells in-, as well as gross-weight of the local lymph nodes, and the concentration of various cytokines (interferon-γ, interleukin-6, interleukin-1β, interleukin-17, interleukin-4) served as the primary test parameters. In the TDI (Toluene-2,4diisothiocyanate) contact allergy model the H4R knockout mice showed not only a significant induction of ear swelling but also an inhibition of interleukin-6 concentration during the sensitization. During the elicitation phase all parameters stayed unaltered. During the senzitation phase the application of the H4R antagonist JNJ7777120 (30 mg/kg) yielded only an inhibition of the interleukin-6 cytokine, while at the time of elicitation there was a discernable inhibition of the ear swelling in addition to higher concentrations of interleukin1β in the ear skin, and of interleukin-17 as well as interferon-γ in the local lymph nodes. Differing results were observed depending on whether the antagonist was applied during both phases, or solely during the elicitation phase. In the FITC (Fluorescein isothiocyanate) contact allergy model reduced concentrations of interleukin-1β, interleukin-17, and interleukin-4 were found in H4R knockout mice, while their ear swelling remained unchanged. As opposed, the H4R antagonist JNJ7777120 caused an inhibition of all tested cytokines (interleukin-17, interleukin-1β, and interleukin-4), both during the sensitization (20 mg/kg orally), as well as during the elizitation phase (20 and 50 mg/kg respectively, applied orally). Furthermore, an inhibition of ear thickness could be observed in antagonist-treated mice, however this effect was not concentration-dependent. The results of the present study suggest that H4R is a diverse receptor with respect to its functions in murine organisms. The suitability of murine contact allergy models for assessing the H4R antagonist JNJ7777120’s impact on allergic diseases like atopic dermatitis should be carefully evaluated before conducting any further research, since the antagonist's effect on Th2-dominated inflammation did not yield homogenous results in these experiments. The fact that the H4R's homology between mice and humans is only 68 % in value should be taken into careful consideration as well. Nevertheless, the observation that the H4R exerts a modulating effect on the secretion of the interleukin-12 family cytokines, may offer new therapeutic options for autoimmune diseases in which these cytokines play an important role such as multiple sclerosis or psoriasis. 100 101 8 Literaturverzeichnis ABBAS A.K., MURPHY K.M., SHER A. (1996): Functional diversity of helper T- lymphocytes. Nature 383, 787-793 ABBAS A.K. (2010): Defective sialic acid acetylesterase and autoimmunity. Nature 466, 243-247 AGGARWAL S., RAO A. 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Stimulation mit LPS, LTA und PGN, 5 Versuche, n = 2-3 Versuch 1 Kon 15,3 13,7 DC von Wildtyp-Mäusen LPS LTA 11,4 13,7 18,3 12,2 PGN 51,4 61,4 DC von H4R-Knockout-Mäusen Kon LPS LTA PGN 56,8 86,8 87,6 209,9 59,1 87,6 99,1 208,3 2 <1,0 7,0 40,8 19,3 56,2 45,4 27,7 18,5 23,9 13,9 162,3 199,3 4,6 7,0 20,8 144,6 100,0 116,2 57,0 73,9 77,0 346,2 546,2 27,7 3 68,0 60,0 81,0 89,0 67,0 90,0 255,0 246,0 88,0 81,0 97,0 90,0 107,0 113,0 213,0 222,0 4 29,7 29,7 57,4 51,3 25,9 26,6 122,8 121,3 34,3 92,8 38,2 281,3 5 <1,0 <1,0 <1,0 130,6 160,6 157,3 450,6 597,3 480,6 <1,0 <1,0 245,6 252,3 155,6 136 759,0 877,3 397,3 Tabelle 9-3: IL-27-Konzentration (pg/ml) in dendritischen Zellen nach Stimulation mit LPS, LTA und PGN, 6 Versuche, n = 2-3 Versuch 1 Kon 20,2 17,1 DC von Wildtyp-Mäusen LPS LTA 125,1 53,0 138,2 52,3 PGN 163,3 123,7 Kon 23,7 28,5 DC von H4R-Knockout-Mäusen LPS LTA PGN 253,3 147,1 266,1 215,4 130,6 321,6 2 14,8 15,1 87,9 74,0 26,8 30,4 65,1 59,5 85,1 68,1 131,8 145,4 78,4 89,5 122,3 143,1 3 10,9 9,4 7,7 30,4 24,8 25,3 16,0 21,1 16,5 20,4 35,3 36,3 31,6 30,7 35,8 213,6 167,2 148,5 56,8 72,1 66,0 202,1 204,8 132,6 4 6,5 7,2 9,0 47,9 60,6 47,9 35,4 39,0 40,8 25,6 26,7 196,7 206,7 213,8 5 25, 22,0 89,7 101,6 76,3 77,7 13,6 224,2 6 7,4 8,6 75,4 84,0 35,4 39,7 8,8 7,7 104,9 128,6 26,9 24,2 76,7 83,6 72,0 25,3 117,3 53,8 57,7 Tabelle 9-4: CCL2-Konzentration (pg/ml) in dendritischen Zellen nach Stimulation mit LPS, LTA und PGN, 3 Versuche, n = 1-2 Versuch DC von Wildtyp-Mäusen LPS LTA 279,8 280,9 252,6 227,8 PGN 398,1 330,3 Kon 579 463,1 DC von H4R-Knockout-Mäusen LPS LTA PGN 561,5 466,2 944 538,7 463,7 873,4 1 Kon 930,9 931,5 2 251,5 249,8 203,7 314 228,4 490,6 411,7 777,8 3 18,3 26,42 61,8 81,0 42,5 49,8 570,6 473,3 97,5 323,7 179,8 839,5 137 Tabelle 9-5: TNFα-Konzentration (pg/ml) in dendritischen Zellen nach Stimulation mit LPS, LTA und PGN, 5 Versuche, n = 2-3 Versuch 1 Kon 256,5 264,83 DC von Wildtyp-Mäusen LPS LTA 866,5 351,5 851,5 246,5 PGN 959,83 1011,5 Kon 144 211,5 DC von H4R-Knockout-Mäusen LPS LTA PGN 1019 229 1739 1009 204 1644 2 656,5 484 909 841,5 441,5 504 2156,5 2111,5 66,5 854 364 1689 3 235,83 237,5 320,83 319,17 249,16 267,5 807,5 720,83 269,16 265,83 295,83 239,16 275,83 227,5 880,83 792,5 4 48 48 292 355 516 491 -3 22 304 344 5 285 287,5 330 1050 942,5 1130 2075 2415 2337,5 255 237,5 217,5 947,5 997,5 1130 982,5 1412,5 1275 625 592 1102,5 1010 1115 2515 2507,5 2497,5 Tabelle 9-6: IL-10-Konzentration (pg/ml) in dendritischen Zellen nach Stimulation mit LPS, LTA und PGN, 5 Versuche, n = 2-3 Versuch 1 Kon <4,0 81,3 <4,0 DC von Wildtyp-Mäusen LPS LTA 124,6 241,3 118 38 161,3 271,3 DC von H4R-Knockout-Mäusen LPS LTA PGN 168 111,3 3958 151,3 94,6 3174,6 154,6 141,3 3134,6 PGN 2468 2371,3 2941,3 Kon <4,0 <4,0 <4,0 14232 13402 14902 <4,0 <4,0 382 392 212 2 <4,0 <4,0 <4,0 432 342 282 3 <4,0 372 152 152 152 172 12282 14342 <4,0 62 262 202 272 172 13072 12362 4 <4,0 <4,0 46 37 49 41 1491 1610 <4,0 <4,0 20 26 36 50 1626 1542 5 <4,0 <4,0 397 443 911 1 898 <4,0 4 709 580 138 17692 17522 16402 1460 1939 H4R-vermittelte Wirkung auf die Produktion von Zytokinen nach Prästimulation mit Histamin (1 mmol/ml) und 4-Methylhistamin (10 µmol/ml) und zusätzlicher Stimulation mit LPS, LTA und PGN Tabelle 9-7: IL-12-Konzentration (pg/ml) in dendritischen Zellen nach Stimulation mit Histamin und 4Methylhistamin aus 4 Versuchen, n=3 Versuch 1 LPS 36 52,1 DC von Wildtypmäusen His + LPS 4MH + LPS 19,0 79,0 22,1 67,5 22,1 84,4 DC von H4R-Knockout-Mäusen LPS His + LPS 4MH + LPS 50,6 12,1 51,3 55,2 9,8 48,3 16,7 49,8 2 5,8 9,7 8,1 7,5 12 10,3 36,4 34,2 13,6 14,7 28,6 32,5 3 20,7 6,9 3,8 4,6 5,3 12,3 44,6 28,4 53,0 4 29,2 38,2 11,7 11,2 9,2 33,2 33,2 31,2 13,2 11,2 2,7 1,2 6,2 10,2 12,7 26,7 Tabelle 9-8: IL-23-Konzentration (pg/ml) in dendritischen Zellen nach Stimulation mit Histamin und 4Methylhistamin aus 3 Versuchen, n=2 Versuch 1 LPS 11,4 18,3 DC von Wildtypmäusen His + LPS 4MH + LPS 20,6 30,6 19,1 31,4 DC von H4R-Knockout-Mäusen LPS His + LPS 4MH + LPS 86,8 71,4 66,0 87,6 59,1 66,0 2 81 89 66 57 66 89 97 90 50 52 87 104 3 57,4 51,3 46,6 55,1 56,6 59,7 92,8 82,8 103,6 Tabelle 9-9: IL-27-Konzentration (pg/ml) in dendritischen Zellen nach Stimulation mit Histamin und 4Methylhistamin aus 3 Versuchen, n=2 Versuch 1 LPS 87,9 74,0 DC von Wildtypmäusen His + LPS 4MH + LPS 137,9 95,6 164,0 92,6 DC von H4R-Knockout-Mäusen LPS His + LPS 4MH + LPS 131,8 109,0 135,6 145,4 121,8 147,0 2 162,0 153,6 165,7 196,0 211,8 200,2 94,8 111,8 47,6 50,9 99,5 116,9 3 89,7 101,6 83,4 75,5 90,4 93,2 224,2 178,1 275,3 139 Tabelle 9-10: TNFα-Konzentration (pg/ml) in dendritischen Zellen nach Stimulation mit Histamin und 4Methylhistamin aus 4 Versuchen, n=2-3 Versuch 1 LPS 320,8 319, DC von Wildtypmäusen His + LPS 4MH + LPS 282,5 327,5 254,1 295,8 DC von H4R-Knockout-Mäusen LPS His + LPS 4MH + LPS 295,8 145,8 222,5 239,1 125,8 184,1 2 406,5 424,8 463,1 363,1 349,8 461,5 394,8 444,8 406,5 433,1 408,1 383,1 449,8 549,8 426,5 418,1 3 866,5 851,5 514,8 524,8 476,5 894,8 1141,5 1259 1019 1009 581,5 576,5 631,5 1229 1049 1099 4 909 841,5 601,5 541,5 824 864 854 616,5 856,5 Tabelle 9-11: IL-6-Konzentration (pg/ml) in dendritischen Zellen nach Stimulation mit Histamin und 4Methylhistamin aus 3 Versuchen, n=3 Versuch 1 LPS 2105,4 2337,9 DC von Wildtypmäusen His + LPS 4MH + LPS 2318,7 2441,2 2364,5 2344,5 2358,7 2260,4 DC von H4R-Knockout-Mäusen LPS His + LPS 4MH + LPS 2543,7 2427,9 2347,0 2483,7 2462,0 2188,7 2431,2 2627,9 2 2917,9 2855,4 2690,4 2789,5 2702,9 2927,0 1602,3 1796,1 1628,6 1628,6 1566,1 322,2 1632,3 1566,1 1353,6 1456,1 3 1149,8 1086,1 1283,6 1111,1 974,8 1166,1 1383,6 1439,8 1161,1 140 In-vivo-Versuche H4R-vermittelte Wirkung auf verschiedene Entzündungsparameter im TDI- Kontaktallergiemodell Sensibilisierung Versuch 2 Versuch 1 Tabelle 9-12: Ohrschwellung (µm) vor und nach einmaliger Allergenapplikation (TDI 0,5 % topisch) bei BALB/c-Mäusen ohne und mit subcutaner Applikation von JNJ7777120 (30 mg/kg) und H4R Knockout-Mäusen. 2 Versuche mit je 7 – 8 Tieren Tier 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 8 WT TDI vorher nachher 240 270 240 290 250 250 240 260 250 280 240 280 240 280 240 250 240 240 260 270 250 260 260 270 280 260 280 290 270 300 WT0 JNJ7777120 Vorher nachher 250 260 230 310 240 300 210 290 230 340 230 260 220 250 270 250 230 250 250 250 260 260 141 260 250 260 260 280 290 280 280 H4R Knockout vorher nachher 230 270 240 290 230 260 250 300 230 260 240 270 230 280 250 240 260 270 260 270 250 280 270 350 350 320 320 320 Versuch 2 Versuch 1 Tabelle 9-13: Lymphknotengewicht (mg) und Gesamtzellzahl (Mio.) des Lnn. auricularis nach einmaliger Allergenapplikation (TDI topisch) bei BALB/c-Mäusen ohne und mit subcutaner Applikation von JNJ7777120 und H4R Knockout-Mäusen. 2 Versuche mit je 7 – 8 Tieren. Tier 1 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 8 WT Kontrolle Gewicht Zellzahl 3,3 4,7 3,4 4,4 3,4 6,5 3,2 4,3 2,5 2,3 2,9 2,8 2,3 3,7 3,0 2,9 4 3,5 2,6 3,75 3 8 3,75 4,0 WT TDI Gewicht Zellzahl 9,3 11,5 11,4 22,1 11 23,2 10,4 20,9 13,6 27,5 14,5 31,5 11,7 16,4 7,3 8,6 9,8 8,6 9,9 11,5 9,5 11,1 13 17,5 20 20,2 15,8 22,4 11,6 21,9 WT JNJ Gewicht Zellzahl 7,5 9,1 11 22,4 9,4 15,8 9,9 22,7 9,7 16,7 9,9 16,2 10,5 20 6,2 10,3 11,4 8,8 9,5 7,7 9,9 9,1 7,8 20,4 25,7 14,7 25 11,6 19,7 16,7 H4R Knockout Gewicht Zellzahl 8,1 10,5 10,9 22,1 10,4 29,6 12,6 23,2 11,4 22,1 10,8 21,7 9,4 10 9,6 9,9 8 9,7 9,8 20 20,2 20,1 16,9 13,3 18,3 19,9 Tabelle 9-14: IFNγ-Konzentration (pg/ml) im Lnn. auricularis nach einmaliger Allergenapplikation (TDI topisch) bei BALB/c-Mäusen ohne und mit subcutaner Applikation von JNJ7777120 und H 4R KnockoutMäusen. 2 Versuche mit je 4 Tieren. Versuch 1 WT Kontrolle 430,2 372,7 4050,2 1047,7 WT Vehikel 3785,2 4127,7 3860,2 4255,2 WT JNJ 3075,2 3990,2 4152,7 4200,2 H4R Knockout 3645,2 2727,7 1022,7 2077,7 Versuch 2 1241,6 725 1241,6 775 4841,6 5708,3 4591,6 5558,3 5391,6 4975 5475 5775 3391,6 1508,3 2125 2458,3 142 Tabelle 9-15: IL-6-Konzentration (pg/ml) im Lnn. auricularis nach einmaliger Allergenapplikation (TDI 0,5 % topisch) bei BALB/c-Mäusen ohne und mit subcutaner Applikation von JNJ7777120 (30 mg/kg) und H 4R Knockout-Mäusen. 2 Versuche mit je 4 Tieren. Versuch 1 Versuch 2 WT Kontrolle 5,3 3,8 15,7 30,1 12,7 37,0 15,1 WT Vehikel 57,0 118,3 117,7 131 69,0 53,8 241,6 246,6 WT JNJ 11,8 37,7 68,1 168,6 6,2 24,0 79,0 H4R Knockout 11 22,5 97,3 72,7 8,8 17,9 28,3 51,6 111,6 35 421,6 746,6 466,6 523,3 788,3 551,6 441,6 426,6 311,6 488,3 408,3 351,6 Challenge Während chronischer Gabe von TDI (0,5 %) wurden folgende Gruppen miteinander verglichen: - BALB/c-Mäuse: Vehikel (TDI) BALB/c-Mäuse: Applikation von JNJ7777120 (30 mg/kg) in Challenge (JNJ) BALB/c-Mäuse: Applikation von JNJ7777120 (30 mg/kg) in Sensibilisierung und Challenge (JNJ+JNJ) H4R-Knockout-Mäuse Tabelle 9-16: Ohrdicke (µm) (Ausgangswert und Messung 24h nach letzter Applikation) nach mehrmaliger Allergenapplikation (TDI 0,5 % topisch), n = 7–9 Tier 1 2 3 4 5 6 7 8 9 WT Vehikel vorher nachher 260 620 240 580 270 500 250 620 260 510 260 510 280 800 250 510 WT JNJ + JNJ vorher nachher 240 400 240 410 250 430 240 460 240 440 260 540 260 480 143 WT JNJ vorher nachher 250 630 260 560 260 520 260 520 260 600 270 460 270 410 270 480 H4R Knockout vorher nachher 260 560 240 560 270 570 270 580 260 540 280 600 270 580 270 580 280 500 Tabelle 9-17: Lymphknotengewicht und Gesamtzellzahl Allergenapplikation (TDI 0,5 % topisch), n = 7–9 Tier 1 2 3 4 5 6 7 8 9 WT Vehikel Gewicht Zellzahl 5,9 9,4 10,3 16,6 9,8 16 11,9 30,4 11,2 14,4 13,3 22,2 13,7 16,8 WT JNJ + JNJ Gewicht Zellzahl 6,7 10 9,0 18,6 9,7 12,6 6,5 8,4 10,7 18,6 7,2 13,4 10,4 18,6 10,1 12,8 (Lnn. auricularis) WT JNJ Gewicht Zellzahl nachher 10,5 18 9,7 19,2 9,6 8,2 9,4 10 9,9 11 7,1 11,2 9,2 15,8 nach mehrmaliger H4R Knockout Gewicht Zellzahl 9,8 21 10,9 18,2 10,8 19,8 10,2 11 9,6 12 10,7 12,6 10,9 16,4 11 21,2 13,3 25,6 Tabelle 9-18: Konzentration von IL-1β (mg/ml) in der Ohrhaut während eines chronischen Allergiegeschehens (TDI 0,5 %), n= 7–9 Tier 1 Versuch 2 2 3 4 5 6 7 8 9 WT Vehikel 4,72 22,3 10,2 20,4 27,8 23,2 48,2 27,8 30,6 WT JNJ + JNJ 74,1 31,5 18,6 22,3 21,3 39,9 13,0 144 WT JNJ 50,0 26,9 34,3 22,3 37,1 59,3 42,6 49,1 H4R Knockout 29,7 60,2 10,2 33,4 32,5 28,7 22,3 17,6 15,8 Tabelle 9-19: Konzentration von IL-17 (pg/ml) im lokalen Lymphknoten (Lnn. auricularis) während eines chronischen Allergiegeschehens (TDI 0,5 %), n = 7–9 Tier 1 Versuch 2 2 3 4 5 6 7 8 WT Vehikel 15,2 74,8 198 219,6 1,0 1,0 100,4 WT JNJ + JNJ 1,0 34,4 804,8 93,2 56,8 185,2 1,0 WT JNJ 39,2 62,8 297,2 311,6 2,0 27,7 57,2 H4R Knockout 215,2 122,8 18,4 68,4 43,6 26,8 37,6 194,4 Tabelle 9-20: Konzentration von IFNγ (pg/ml) im lokalen Lymphknoten (Lnn. auricularis) während eines chronischen Allergiegeschehens (TDI 0,5 %), n = 7–9 Tier 1 Versuch 2 2 3 4 5 6 7 WT TDI 86,7 254,2 79,2 4,2 1,0 1,0 209,2 H4R-vermittelte WT JNJ + JNJ 949,2 31,7 896,7 536,7 534,2 Wirkung auf verschiedene WT JNJ 81,7 149,2 211,7 104,2 246,7 596,7 H4R Knockout 1,0 9,2 34,2 1,0 49,2 124,2 57,0 Entzündungsparameter im FITC- Kontaktallergiemodell Sensibilisierung Tabelle 9-21: Ohrschwellung (µm), Lymphknotengewicht (mg) und Gesamtzellzahl (Mio.) (Lnn. auricularis) nach einmaliger Allergenapplikation (FITC 0,1 % topisch), n = 6 Tier 1 Versuch 2 2 3 4 5 6 Ohrschwellung 0 0 0 -10 -20 0 WT Vehikel Gewicht 6,8 6,5 6,3 6,1 6,6 6,8 Zellzahl 2,9 2,3 2,2 2,6 2,0 2,0 145 Ohrschwellung 0 0 -20 10 -10 -10 WT JNJ Gewicht 6,0 6,4 6,5 6,2 6,0 4,7 Zellzahl 3,0 3,4 2,3 2,4 2,1 1,6 Tabelle 9-22: Konzentration von IL-17 (pg/ml) im lokalen Lymphknoten (Lnn. auricularis) nach einmaliger Allergenapplikation (FITC 0,1 % topisch), n = 5-6 Restimulation mit ConA WT Vehikel WT JNJ 443,0 105,2 246,1 232,1 527,1 323,4 648,1 157,0 376,4 488,4 327,1 Tier 1 2 3 4 5 6 Restimulation mit FITC WT Vehikel WT JNJ 1719,3 859,3 1702,6 1782 1378,5 1321,5 2159,5 1336 1354 1013,5 1024,5 Challenge Während chronischer Gabe von FITC (1,5 %) wurden folgende Gruppen miteinander verglichen: - BALB/c-Mäuse: Vehikel (FITC) BALB/c-Mäuse: Applikation von JNJ7777120 (20 bzw. 50 mg/kg) H4R-Knockout-Mäuse Tabelle 9-23: Ohrdicke (µm) (Ausgangswert und Messung nach letzter Allergenapplikation) nach mehrmaliger Allergenapplikation (FITC 1,5 % topisch), n = 7 Tier 1 2 3 4 5 6 7 WT Vehikel vorher nachher 270 540 250 400 250 570 250 580 270 550 260 510 260 530 WT JNJ (20) vorher nachher 260 430 280 490 250 440 260 450 250 400 250 480 260 430 146 WT JNJ (50) vorher nachher 250 450 270 520 270 380 270 400 260 480 230 460 270 400 H4R Knockout vorher nachher 260 580 260 540 260 530 250 480 260 570 260 600 280 450 Tabelle 9-24: Lymphknotengewicht (mg) und Gesamtzellzahl (Mio.) (Lnn. auricularis) nach chronischer Allergenapplikation (FITC 1,5 % topisch), n = 6 -7 Tier 1 2 3 4 5 6 7 WT Vehikel Gewicht Zellzahl 5,7 2,1 3,4 2,6 5,4 7,2 4,1 3,4 4,2 3,8 4,3 7,9 5,2 5,8 WT JNJ (20) Gewicht Zellzahl 4,2 11,2 3,8 5,9 3,9 9,1 5,7 6,8 4,7 5,8 2,8 3,5 4,5 4 WT JNJ (50) Gewicht Zellzahl 3,4 2,6 4,8 4,6 4,6 7,1 5,5 7,4 6,8 8,3 2 2,5 4,1 3,1 H4R Knockout Gewicht Zellzahl 7,1 6,6 3,4 2,9 2,9 3,9 2,1 1,4 3,4 1,8 3,4 3,6 Tabelle 9-25: Konzentration von IL-1β (mg/ml) in der Ohrhaut während eines chronischen Allergiegeschehens (FITC 1,5 %), n = 7 Tier 1 2 3 4 5 6 7 WT Vehikel 72,7 180,5 405,5 160,5 109,4 148,3 325 WT JNJ (20) 83,8 138,3 45,5 113,8 133,8 116,1 56,1 WT JNJ (50) 66,1 112,7 153,3 108,3 108,3 22,7 78,8 H4R Knockout 52,2 145 86,6 78,8 108,3 188,8 95 Tabelle 9-26: Konzentration von IL-4 (pg/ml) im lokalen Lymphknoten (Lnn. auricularis) während eines chronischen Allergiegeschehens (FITC 1,5 %), n = 3. CAVE: weit unter Beurteilungsgrenze! Tier 1 2 3 WT Vehikel 6,2 1,0 4,6 WT JNJ (20) 0,7 0,4 0,7 147 WT JNJ (50) 1,2 1,7 0,2 H4R Knockout 0,4 1,7 1,2 Tabelle 9-27: Konzentration von IL-17 (pg/ml) im lokalen Lymphknoten (Lnn. auricularis) während eines chronischen Allergiegeschehens (FITC 1,5 %), n = 3 Tier 1 2 3 WT Vehikel 9,7 8,2 5,3 WT JNJ (20) <1,0 <1,0 1,0 WT JNJ (50) 3,5 <1,0 1,4 H4R Knockout 5 1,0 <1,0 Einfluss des H4R im akuten Entzündungsgeschehen Tabelle 9-28: Ohrschwellung (µm) nach einmaliger Applikation von Arachidonsäure 5 % topisch, Vergleich von BALB/c-Mäusen und H4R-Knockout-Mäusen (unbehandelt oder mit JNJ7777120 behandelt), n = 6-7 Tier 1 2 3 4 5 6 7 WT Vehikel 190 150 90 90 130 140 WT JNJ 90 160 80 80 50 0 148 H4R Knockout Vehikel 110 140 110 80 70 110 130 H4R Knockout JNJ 60 120 100 120 130 80 40 Danksagung Mein besonderer und herzlicher Dank gilt zunächst Herrn Professor Dr. Wolfgang Bäumer für die Überlassung des interessanten Themas und die hervorragende Betreuung und nette Zusammenarbeit. Vielen Dank auch an Herrn Professor Dr. Manfred Kietzmann für seine Ratschläge und freundliche Unterstützung. Vielen Dank an alle Mitarbeiter des Labors für Ihre immerwährende Hilfsbereitschaft. Dank auch an Maria Gschwandtner, Hautklinik Linden, für die tatkräftige Unterstützung bei der Durchführung der PCR. Für die anregenden Diskussionen im Rahmen des Histamin-Treffens ein Dankeschön an die Arbeitsgruppe von Professor Dr. T. Werfel und Dr. Ralf Gutzmer der Hautklinik Linden, MHH Hannover, und an die Arbeitsgruppe von Professor R. Seifert der Pharmakologie der MHH, Hannover. Großer Dank geht an Herrn Professor Dr. Holger Stark und Kerstin Sander für die Bereitstellung und Herstellung des JNJ7777120 und an Herrn Professor Dr. Robin Thurmond für die Bereitstellung der H4R-Knockout-Mäuse. Der deutschen Forschungsgemeinschaft danke ich ganz herzlich für die finanzielle Unterstützung meiner Promotionsarbeit. Vielen Dank an Viki, Vanessa und Caro für die schöne Zeit im und außerhalb des Labors und die hervorragende Stimmung bei Ihnen im “Büro”, die immer offenen Ohren und die netten Abende nach Feierabend! Kristine, Jessi und Stephan: Vielen Dank für Euer stets offenes Ohr und Eurer Hilfe bei all den kleinen Problemen und für die mentale Unterstützung, und natürlich auch für die abwechslungreiche und lustige Zeit. Hierfür auch ein Dank an meinen Mitdoktoranden Katrin, Ruta, Verena, Katrin, Maren und Britta. Danke auch an Kristine und Finna für die vielen Spaziergänge in der Seelhorst und das Bespaßen von Balou. 149 Außerdem geht ein großer Dankeschön an alle meine Freunde für ihre Unterstützung und ihr Verständnis, dass ich so wenig Zeit für sie hatte (entschuldige vielmals liebe Chrissi). Meinen lieben Eltern danke ich für Ihren stetigen Rückhalt und ihre Unterstützung und vor allem ihre Liebe. Und ein großes Dankeschön an meine Brüder Lucius, Moritz und Justus, die immer ein offenes Ohr für mich hatten. Zu guter Letzt ein großes Dankeschön an Arman, der mich immer unterstützt und an mich geglaubt hat. Danke für Alles! 150
