Eukaryonte
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2. DER VERGLEICH DER PROKARYONTISCHEN UND EUKARYONTISCHEN ZELLEN Die zelluläre Organisation Prokaryonten (Abb. 2.1.) kein Zellkern Bakterien, Cyanobakterien Eukaryonten (Abb. 2.2.) enthalten echten Zellkern einzellige oder multizelluläre Organismen Abbildung 2.1. Die Struktur einer prokaryontischen Zelle. Genetischer Apparat Prokaryonten ein ringförmiges chromosomales DNA Molekül vorwiegend codierende Regionen verbundene Transkription-Translation (Chromosom-Polysom Komplex) extrachromosomales DNA: Plasmid F-Faktor (F+, F- Zellen) Konjugation Eukaryonten mehr lineare chromosomale DNA Moleküle in der Form des Chromatins vorwiegend nichtcodierende Regionen extrachromosomale DNA: mitochondriale DNA chloroplastische DNA (Pflanzen) Zellulären Organellen Prokaryonten (Abb. 2.1.) Zellwand (Peptidoglykan) Zellmembran Ribosomen keine membranumschlossene Organellen Eukaryonten (Abb. 2.2.) membranumschlossene Organellen (Kompartmentalisation): Nucleus, endoplasmatisches Reticulum, Golgi-Apparat, Lysosomen, Mitochondrium, Peroxisomen 2 Abbildung 2.2. Die Struktur einer eukaryontischen Zelle. Cytoskelett, Zellteilung Prokaryonten kein Cytoskelett keine Endocytose, Exocytose kein mitotischer Spindelapparat Zellteilung durch einfacher Zweiteilung Eukaryonten Mikrofilamente, Intermediärfilamente, Microtubuli Endocytose, Exocytose, Bewegung der Organellen Mitotischer Spindelapparat Kernteilung: Mitose, Meiose Der Ursprung der eukaryontischen Zellen (Abb. 2.3.) Endosymbiontentheorie Ursprung der Peroxisomen, des Mitochondriums, der Chloroplasten 3 Abbildung 2.3. Der Ursprung von eukaryontischen Zellen. 4 3. NUCLEINSÄUREN Allgemeine Eigenschaften lineare Makromoleküle bestehen aus Nucleotide können genetische Information speichern und exprimieren Nucleotide (= Base + Pentose + Phosphorsäure/n/) (Abb. 3.3.) heterozyklische Basen (Abb. 3.1) Purine: Adenin (A), Guanin (G) Pyrimidine: Cytosin (C), Thymin (T), Uracil (U) Pentose (Abb. 3.2.) Ribose, Desoxyribose Phosphorsäure Nucleoside (= Base + Pentose) 3’-5’-Phosphodiesterbindung Oligonucleotide, Polynucleotide Abbildung 3.1. Die heterozyklische Basen von Nucleinsäuren Abbildung 3.2. Die Struktur von Pentosen der Nucleinsäuren 5 Abbildung 3.3. Die Struktur von ATP und Zyklische-AMP. DNA (= Desoxyribonucleinsäure) DNA ist das genetische Material Transformation von Bacterien Streptococcus pneumoniae (Pneumococcus): S-Stamm, R-Stamm Bakteriophageninfektion Transfektion Struktur Abbildung 3.4. Die doppelhelicale Struktur von DNA Watson-Crick Modell (Abb. 3.4.) Doppelhelix Zucker-Phosphat Gerüst komplementäre Basenpaarung antiparallele Orientation Denaturierung, Renaturerung Hyperchromocytät, Schmelztemperatur (Tm) (Abb.3.5.) zyrkuläre, lineare DNA Superhelix DNP (= Desoxyribonucleoprotein) Abbildung 3.5. Temperatur-Denaturierung von DNA. 6 Abbildung 3.6. Die Struktur von B-DNA und Z-DNA. RNA (= Ribonucleinsäure) im allgemeinen einzelsträngig Haarnadel und Stamm-Schleife Sekundärstrukturelemente sind möglich (Abb. 3.7.) RNP (= Ribonucleoprotein) RNA-Typen mRNA (= messenger RNA) Templat für Proteinsynthese rRNA (= ribosomale RNA) Bestandteile der Ribosomen prokaryotische 5S, 16S und 23S rRNA-Moleküle eukaryotische 5S, 5.8S, 18S und 28S rRNA-Moleküle tRNA (= transfer-RNA) transportieren Aminosäuren pre-mRNA, pre-rRNA Vorläufer von mRNA und rRNA Ribozyme katalytische RNA-Moleküle funktionieren in: Auto-Spleißen, RNA-Spaltung, Formation der Peptidbindung. u.s.w. 7 Abbildung 3.7. Sekundärstruktur von eukaryotischen 18S rRNA. (Doppelsträngige Regionen sind nummeriert.) 8 4. PROTEINE Allgemeine Eigenschaften lineare, unverzweigten Polypeptidketten bestehen aus Aminosäuren funktionelle Unterteilung - Enzyme - strukturelle Proteine (z.B. Proteine des Cytoskelettes) - regulatorische Proteine (z.B. Transkriptionsfaktoren) - Transportproteine (z.B. importin) - Signalproteine (z.B. Polypeptid-Hormone, Adapterproteine) - Antikörper - Chaperonen - Rezeptorproteine (z.B. hormonbindende Rezeptoren) Aminosäuren allgemeine Struktur (Cα-Atom, Aminogruppe, Carboxygruppe, R = Seitenkette) funktionelle Kategorien positiv geladene Aminosäuren (z.B. Arginin, Lysin) negativ geladene Aminosäuren (z.B. Asparaginsäure, Glutaminsäure) ungeladene, polaren Aminosäuren (z.B. Serin, Tyrosin) unpolare Aminosäuren (z.B. Leucin, Valin) Peptidbindung (Abb. 4.1.) entsteht zwischen einer Amino- und einer Carboxygruppe (-CO-NH-) die Ende einer Polypeptidkette: N-Terminus, C-Terminus Abbildung 4.1. Die Entstehung einer Peptidbindung. Struktur der Proteine Primärstruktur = Aminosäuresequenz Sekundärstruktur (Abb. 4.2.) α-Helix, β-Faltblatt werden stabilisiert durch Wasserstoffbindungen Tertiärstruktur (Abb. 4.3.) wird stabilisiert durch ionischen Bindungen, hydrophoben Wechselwirkungen, van der Waals Kräfte, Wasserstoffbindungen und Disulfidbindungen Konformation der Proteine strukturale Domänen (Abb. 4.4.) Chaperonproteine Quartärstruktur Anordnung der struktureller Untereinheiten von komplex Proteinen 9 komplexe Proteinmaschinen Abbildung 4.2. Strukturelle Elementen der Sekundärstruktur von Proteine: α-Helix und βFaltblatt. Abbildung 4.3. Tertiärstruktur von Ribonuclease. 10 Abbildung 4.4. Die Domänen des Insulinrezeptors. Enzyme Biokatalysatoren Activierungsenergie (Abb. 4.5.) aktives Zentrum „Hand in den Handschuh” Mechanismus Mechanismus Coenzyme Abbildung 4.5 Enzyme vermindern die Aktivierungsenergie der chemischen Reaktionen. 11 5. KOHLEINHYDRATE UND LIPIDE Kohlenhydrate allgemeine Eigenschaften allgemeine chemische Formel: (CH2O)n Polyhydroxy-Aldehide oder –Ketone verschiedene Klassen Monosaccharide Triosen: z.B. Glycerinaldehid, Dihydroxyaceton Pentosen: z.B. Ribose, Desoxyribose Hexosen: z.B. Glucose, Fructose, Mannose, Galactose (Abb. 5.1.) Disaccharide: z.B. Sucrose (Glucose + Fructose), Maltose (Glucose + Glucose) Lactose (Glucose + Galactose) (Abb. 5.2.) Abbildung 5.1. Lineare und Ringstruktur von Glucose: α- und β-Anomere. Abbildung 5.2. Die Struktur von Maltose. Oligosaccharide Polysaccharide (Abb. 5.3.) Cellulose lineare Polysaccharidketten von Glucose Komponent der Zellwand in Pflanzen Stärke Amylose + Amylopectin Polysaccharid von Glucose speichert Glucose in Pflanzen Glykogen Polysaccharid von Glucose 12 speichert Glucose in Zellen von Säugtieren (am meistens in Leber und Muskel) Glycosaminoglycane bestehen aus wiederholenden Disaccharideinheiten enthält Derivate von Hexosen befindet sich in der Extrazellulären Matrix verbinden sich mit Proteine (Proteoglycane) z.B. Chondroitinsulfat, Heparin, Dermatansulfat Abbildung 5.3. Die Struktur von Cellulose und Stärke Lipide allgemeine Eigenschaften hydrophobische (wasserhassende) Bindungen löslich nur in organischem Lösmittel Gruppierung Triglyceride (Abb. 5.4.A.) Glycerin + 3 Fettsäuren gespeichert als Tröpfchen im Cytoplasma inr Zweck: Energiespeicherung Phospholipide enthält Phosphorsäure amphipathische Lipide, die sowohl hydrophobe als auch hydrophile Bereiche besitzen ihre Funktionen: Componente von Membranen nehmen in Signalübermittlung teil Glycerophospholipide (Abb. 5.4.B.) Sphingomyeline (Abb. 5.5.) 13 + H C Glycerin 2 O C CH2 O CH CH2 O O C O C O CH2 CH2 CH2 Cholin CH2 -O O P O Phosphatgruppe O Fettsäuren R1 (CH 3 )3 N CH2 R2 CH CH2 O O C O C CH2 CH 2 Glycerin O Fettsäuren R3 A. R1 R2 B. Abbildung 5.4. Die Struktur von Triglyceride (A.) und Glycerophospholipide (B.). Abbildung 5.5. Die Struktur von Sphingomyelin 14 Glycolipide enthalten Zuckermoleküle – erhöhte Wasserlöslichkeit befinden sich an der exoplasmischen Obrefläche der Membrane dienen als Markers z.B. Cerebroside, Ganglioside Steroide (Abb. 5.6.) Steroidring-Struktur z.B. Cholesterin (Membrankomponent), Steroidhormone, Gallensäuren, Vitamin-D3 Carotinoide (Abb. 5.7.) Pigmente (konjugierte Doppelbindungen) z.B. β-Carotin, Retinal, Retinsäure Abbildung 5.7. Die Struktur von β-Carotin. 15 6. IN VIVO UND IN VITRO AMPLIFIKATION VON DNA FRAGMENTEN Restriktionsendonukleasen Infektion von E. coli-Zellen bei Bakteriophage λ Restriktion, Modifikation Restriktionsendonukleasen (Abb. 6.1.A.) Erkennungsstellen: palindromische Sequenz direkte Spaltung → glatte Enden (blunt ends) “stufenförmig” Spaltung → adhäsive Enden (sticky ends) Modifikationsmethylasen (Abb. 6.1.B.) 5’ 3’ GAATTC CTTAAG 3’ 5’ EcoRI 5’ 3’ AGCT TCGA 3’ 5’ 5’ 3’ * GAATTC CTTAAG * 3’ 5’ AluI A. B. Abbildung 6.1. Die von Restriktionsendonukleasen (A.) und Modificationsmethylasen (B.) erkannbare Sequenzen (*= Methyl-Gruppe) Klonierung von DNA-Fragmenten (Abb. 6.2.) rekombinierte DNA-Techniken Vektoren: Plasmid λ-Phage Cosmid Adenoviren, Retroviren (in den Säugetieren) Künstliches Hefechromosom (YAC, yeast artificial chromosome) DNA-Ligasen Abbildung 6.2. Konstruktion eines rekombinierten Plasmids. 16 Genomische Bibliothek (Abb. 6.3.) Konstruiert in Insertionsvektoren (z.B. λ-Phage) Hauptschritte: genomische Restriktionsfragmente → Ligation mit λ-Armem → Verpackung → Infektion von E. coli-Zellen → durchmustern (screening) um die Bibliothek (mit molekularer Hybridisierung) Abbildung 6.3. Konstruktion einer genomischen Bibliothek (A.) und durchmustern für den gewünschten Klon durch molekulare Hybridisierung. Polymerasekettenreaktion (PCR, polymerase chain reaction) (Abb. 6.4.) In-vitro-DNA-Amplifikation DNA-Synthese-Mischung: Primer, dNTPen, DNA-Matrize, Taq Polymerase Schritte: Denaturation (Trennung der DNA-Stränge) → Primerzugabe → DNA- Synthese Thermozykler 17 Abbildung 6.4. Das Prinzip von Polymerasekettenreaktion. real-time PCR PCR-Reaktion → wachsende Fluoreszenz→Quantifikation von dem Thermozykler (Abb. 6.5.) Abbildung 6.5. Das Prinzip von real-time PCR. Scritte:1 Polymerisation; 2. Frei Machung von dem fluoreszenzen Frabstoff durch Taq-Polimerase, wachsende Fluoreszenz; 3. Degradation von Sonde, Komplettierung von Polymerisation. 18 7. ANALYSE VON DNA-SEQUENZ Molekulare Hybridisierung (Abb. 7.1.) Denaturierung - Renaturierung markierte Sonde Filter-Hybridisierung In-situ-Hybridisierung Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) doppelsträngige DNA einzelsträngige DNA Incubation mit markierter Sonde Abbildung 7.1. Das Prinzip der molekularer Hybridisierung (Filter-Hybridisierung). Restriktionskartierung (Abb. 7.2.) Spaltung von DNA mit Restriktionsendonucleasen (RE) → Abtrennung von DNA-Fragmenten mit Gelelektrophorese → Gröβe-Determination → Kartierung von Restriktionsschnittstellen 19 Abbildung 7.2. Restriktionskartierung: elektrophoretisches Muster der DNA-Fragmenten (A.) und Kartierung von Restriktionsschnittstellen der zirkuläre DNA (B.). Southern-Blotting (Abb. 7.3.) identifizieren DNA-Fragmente, die spezifische Sequenzen tragen RE-Spaltung von DNA → Agarose-Gelelektrophorese → Denaturierung → blotten → Hybridisierung an der Membran → Autoradiographie Abbildung 7.3. Das Prinzip von „Southern blotting“. DNA-Sequenzierung Maxam-Gilbert Methode (Chemische Sequenzierung) Base-spezifische Spaltung der DNA → Gröβe-Determination mit PAGE → DNASequenz Sanger Methode (Didesoxy-Sequenzierung, Kette-Termination Methode; Abb. 7.4.) In-vitro-DNA-Synthese-Mischung synthetische Oligonucleotid-Primer Didesoxyribonucleosidetriphosphaten (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP) werden angewandt die Reaktion zu stoppen Gröβe-Determination mit denaturierendem PAGE 20 kann man automatisieren (Abb. 7.5.) Abbildung 7.4. Das Prinzip von Sanger-Methode (Kette-Termination-Methode). Abbildung 7.5. Automatisierte DNA-Sequenzierung. DNA-Microchips (Abb. 7.6.) = Sequenzierung mit Hybridisierung Microchip mit Oligonucleotiden von bekannten Sequenzen → Hybridisierung mit der fluoreszenzmarkierten Zielnucleinsäuren → konfokales Lasermikroskop → Komputer → Sequenz wird determiniert (Abb. 7.7.) 21 Abbildung 7.6. Das Prinzip der Sequenz-Determination mit Oligonucleotid-chip. Abbildung 7.7. Vorrichtung für Sequenzierung mit Hybridisierung (Oligonucleotid-Microchip Technologie) z.B. SNP-chip (detektieren Single-Nucleotid- Polymorphis) cDNA- chip (beobachten Gen-Expression) Human-Genom-Project Sequenzierung des gesamten menschlichen Genoms 1990 – ist begonnen 2001- ist beendet 22 strukturelles und funktionelles Genomik 23 8. EXPRESSION VON FREMDEN GENEN Gen-Expression (Abb. 8.1.) Abbildung 8.1. Schritte der Gen-Expression. cDNA-Klonierung (Abb. 8.2.) cDNA = komplementäres DNA Molekül zu einem spezifischen RNA Molekül Synthese von cDNA mRNA Matrize + Oligo(dT)-Primer + Reverse Transkriptase + dNTPen cDNA-Klonierung doppelsträngige cDNA → Ligation von adhäsiven Enden → Ligation in einem Klonierungsvektor Insertionsvektoren, Expressionsvektoren Baculovirus-Vektoren Abbildung 8.2. Klonierung von cDNA (A.) und Expression von klonierten cDNA in E. coli (B.). 24 Gen-Transfer in eukaryontische Zellen Physikalische Techniken Microinjektion Elektroporation chemische Methoden Transfektion Liposom-vermittelter Gen-Transfer biologische Methoden = Virusvektoren Retroviren, Adenoviren usw. vorübergehende vs. stabile Expression Transgene Organismen (Abb. 8.3.) = tragen das fremde Gen (Transgen) in all ihren diploiden Zellen Einschleusen des Transgenes - Microinjektion von dem Transgen in befruchteten Eizellen – Gen-Transfer in embryonalen Stammzellen → Injektion in Blastocoel → chimäre Embryonen→ Züchten → wirkliche transgene Tiere Abbildung 8.3. Herstellung von transgenen Mäuse mit manipulierten embryonalen Stammzellen. 25 9. HINDERUNG VON ENDOGENER GEN-EXPRESSION Gezielte Gen-Disruption (Abb. 9.1.) = K.O. Mutation (Knock-Out-Mutation) K.O.Vektor neor Gen – Neomycin-Selektion tk (= Thymidin-kinase) Gen – Gancyclovir-Selektion random, nicht-homologe Integration homologe Rekombination Abbildung 9.1. Das Prinzip von gezielten Gen-Disruption. Antisense-Oligonucleotiden = komplementär an einer Region von der gezielten RNA Ribozymen = komplementär an einer Region von der gezielten RNA + Endonuklease Aktivität siRNA = kleine durchgreifende RNA RNA-Interferenz (Abb. 9.3.) Gen silencing (Gen-Unterdrückung) 26 Abbildung 9.2. Ribozym-Spaltung von mRNA. Abbildung 9.3. Das Prinzip von RNA-Interferenz: Degradation von der Ziel-mRNA durch endogene (A) oder exogene (B) siRNA. Hinderung von Protein-Funktion - Microinjektion von spezifischem Antikörper - Expression von spezifischem intracellulärem Antikörper - Expression von dominanten hemmenden Proteinen - Peptidomimetiken - kompetitiver Inhibitor 27 10. IDENTIFIZIERUNG VON SPEZIFISCHEN GEN-PRODUKTEN cDNA-Bibliothek total mRNA (Abtrennung mit Oligo(dT)-Zellulose-Chromatographie) → cDNA-Synthese → Ligation in einen Klonierungsvektor → Transfer in Wirtzelle → durchmustern um die Bibliothek Expression-cDNA-Bibliothek „Immunoscreening” Northern-Blotting (Abb. 10.1.) = Identifizierung von einer spezifischen RNA in einem komplex RNA-Gemisch Formaldehyd/Agarose Gelelektrophorese → blotten → Hybridisierung → Autoradiographie Abbildung 10.1. Das Prinzip von Northenr blotting. Immunologische Techniken = identifizieren spezifische Proteine mit ihren Antikörpern Immunocytochemistrie Immunfluoreszenzmikroskopie Antikörper markiert mit fluoreszierenden Farbstoff sichtbar in Fluoreszenzmikroskop (konfokale Lasermikroskop) Immunogold Technik für Immun-Elektronenmikroskopie Antikörper markiert mit Goldpartikeln Immunprezipitation (Abb- 10.2.) Zelle-Extrakt → gemischt mit Antikörper-bedeckt Agarose Perlen → Zentrifugation → SDS-PAGE → Protein wird sichtbar gemacht (z.B. Autoradiographie) Abbildung 10.2. Immunopräzipitation (an dem Autoradiogramm, das Muster von totalen Proteingemisch /Specziemen 1/ und das Muster von Immunopräzipitat /Speziemen 2/ sindsind sichtbar. 28 Immun-Blotting (Western-Blotting) (Abb. 10.3.) Proteingemisch → SDS-PAGE → blotten → inkubieren die Trägermembran mit spezifischen Antikörper → Antikörper wird sichtbar gemacht (z.B. with Farbenreaktion) Abbildung 10.3. Das Prizip von Immunoblotting (Western blotting). Funktionelles Genomik =global Analyse von in einer Zelle expressierte RNA und Proteine Transcriptom (RNom) = alle in einer Zelle expressierte RNA Proteom = alle in einer Zelle expressierte Proteine Phosphoproteom = alle in einer Zelle expressierte phosphorilierte Proteine Interactom = alle Interaktionen zwischen den Proteinen in einer Zelle cDNA „chips“ Beobachtung von RNA-Expression Proteomik verwendete Techniken: 2D-Elektrophorese (Protein-Fraktionierung) Massenspektrometrie (Protein-Indentifizierung) medizinische Bedeutung 29 11. DER ZELLKERN Ultrastruktur (Abb. 11.1.) Kernmembran/Kernhülle Chromatin Kernmatrix Nucleolus Abbildung 11.1. Elektronenmikroskopische Struktur des Zellkerns. Kernmembran äußere Membran, innere Membran, perinucleärer Raum Kernlamina Lamin Proteinen Laminopathien = hereditäre Krankheiten mit abnormaler Kernlamina Myopathie, Lipodystrophie, Neuropathie Kernporenkomplex (Abb. 11.2.) Nucleoporin cytoplasmitische Filamente Kernkäfig Zentralstruktur Abbildung 11.2. Die Struktur des Kernporenkomplex. 30 Nucleo-cytoplasmatischer Transport Protein Import (Abb. 11.3.) nucleäre Proteine: Kernlokalisierungssignal (NLS), Kernexportierungssignal (NES) Shuttle-Proteine (Carrierproteine) z.B. Importin Proteine, Exportin Proteine Ran•GDP, Ran•GTP Abbildung 11.3 Import und Export der Kernproteinen: Shuttling-Carrier Modell (Schritte: 1. Formation von Protein mit NLS/Importin/Ran•GDP-Komplex; 2. „Docking“ auf cytoplasmatischen Filament; 3. Translocation durch Kernporenkomplex; 4. Komplex wird dissoziiert; 5. Formation von Protein mit NES/Exportin/Ran•GTP Komplex,6. Translokation zu das Cytoplasma, 7. Komplex wird dissoziiert(GTP-Hydrolyse). Abbildung 11.4. Export des mRNPs durch dem Kernproteinkomplex. (1. mRNP tritt in die Kernpore ein; 2. Translokation durch der Pore; 3. Formation von Polysom an der cytoplasmatische Seite des Pores. 31 Chromatin Typen: Heterochromatin-konstitutiv -fakultativ perinucleoläres (an Nukelolen angelagert) Chromatin peripherisches (randständiges) Chromatin transkriptionsinaktiv Euchromatin transkriptionsaktiv Kernmatrix Proteinfilament Netzwerk 32 12. ORGANISATION DES EUKARYOTISCHES GENOMS DNA-Renaturierung Experiment genomische DNA → Spaltung mit Ultraschall → Denaturierung mit thermischer Energie → langsame Kühlung → Renaturierung → Messung der Rate von Renaturierung E. coli-DNA: enthält hauptsächlich singuläre Gene / Einzelkopiegene Säuger-DNA: ∼ 60% Einzelkopiegene ∼ 40% wiederholte DNA-Sequenzen Abbildung 12.1. Renaturierung-Kurven von E. coli- und Säuger-DANN.. Satelliten-DNA stark-wiederholte DNA-Sequenzen: kurze, tandemartig wiederholte Sequenzen sie lassen sich von der übrigen zellulären DNA durch eine Gleichgewichtsdichtegradientenzentrifugation abtrennen (Abb. 12.2.) Abbildung 12.2. Isolierung von Satelliten DNA durch Cäsiumchlorid-gradientenzentrifugation. 33 befinden sich in Centromeren oder Telomeren sie werden nicht transkribiert Minisatelliten-DNA: kurze, wiederholte DNA-Sequenzen stark polymorphisch → (VNTR = variable number of tandem repeats) genetischer Fingerabdruck (Abb. 12.3.) Microsatelliten-DNA: sehr kurze, wiederholte Sequenzen (z.B. Trinucleotid-Wiederholungen) genetische Instabilität → dynamische Mutationen → Expansion von TrinucleotidWiederholungen, z.B. zerbrechliches-X-Syndrom (fragile X syndrome) Huntington disease Abbildung 12.3. Genetischer Fingerabdruck Ananlyse mit einer Minisatelliten-DNA Sonde in einem Vaterschaft-Test. Verstreut-wiederholte DNA-Elemente Kopien verstreut allerorts ins Genom z.B. Alu-Sequenzen Tandemartig Wiederholte Gene identische Kopien eines Gens im gleichen Bereich des Genoms die nichttranskribierte Spacer befinden sich zwischen den transkribierten Bereichen z.B. 45S-Prä-rRNA Gene Histon Gene Amplifikation der Gene z.B. rRNA-Gene Abbildung 12.4. Tandemartig wiederholte Gene. Genfamilien Ähnliche aber nicht identische Kopien z.B. Globin-Genfamilie (α- und β-Globingene) Pseudogene 34 Einzelgene Nur 1 Kopie kommt ins haploiden Genom vor z.B. das Insulin Gen Bewegliche DNA-Elemente (Abb. 12.5.) bewegen sich ins Genom, sie können an eine andere Stelle des Genoms überspringen Transposons Transposition - replikativ - nonreplikativ Transposase Retrotransposons werden durch eine RNA-Zwischenstufe transponiert virale Retrotransposons endogene Retroviren nichtvirale Retrotranspososns z.B. Alu-Sequenzen Abbildung 12.5. Der Mechanismus von Transposition (A: nonreplikative Transposition; B: replikative Transposition; C: Retrotransposition). 35 13. CHROMATIN Strukturelle Organisation des Chromatins Ebenen der morphologischen Organisation (Abb. 13.1.) - DNA Doppelhelix - „Perlschnur” Form des Chromatins Nucleosomen oktamerer Histonkern linker-DNA H1-Histon Abbildung 13.1. Ebenen der Chromatinorganisation. Chromatosom = oktamerer Histonkern + H1-Histon (13.2.) - Solenoid 6 Nucleosomen pro Windung - Schleife-Domänen von DNA stabilisiert von Chromosomengerüst - Metaphasechromosom sehr kondensiert 36 Abbildung 13.2. Die Struktur der Chromatosom. Chemische Komposition DNA, Histone, Nonhiston Proteine, (RNA, inorganische Ione) Histone kleine, basische Lisin- und Arginin-reiche Proteine nucleosomale Histone bilden den oktamere Histonkern Histon H2A, H2B, H3, H4 stark konservierte Proteine H1-(„linker”)-Histon ist für die Entstehung der Solenoid Form verantwortlich chemische Modifizierungen Phosphorylierung Acetylierung (Abb. 13.3.) Funktionen: strukturale Elemente Regulation der Genexpression Abbildung 13.3. Die Folge von Acetylierung der nucleosomalen Histone: Lockerung der Nucleosomstruktur. „Nonhiston” Chromosomengerüst-Proteine: heterogene Molekülstruktur Hunderte von Typen Gewebespezifische Expression chemische Modifizierungen Phosphorylierung z.B. Lamine des Zellkerns Transkriptionsfaktoren funktionelle Kategorien - Strukturproteine (z.B. Lamine) - Enzyme (z.B. DNA- und RNA-Polymerase) 37 - Transkriptionsfaktoren - Rezeptorproteine (z.B. Steroidrezeptoren) - Transportproteine (z.B. Importin) - Chaperone (z.B. Nucleoplasmin) 38 14. DIE PHASEN DES ZELLZYKLUS Interphase und Mitose (Abb. 14.1.) Interphase G1-Phase diploid (2n) DNA Inhalt G0-Phase: „ruhende” Zelle S-Phase DNA Replikation Synthese von Histone Duplizierung des Zentralkörperchens G2-Phase tetraploid (4n) DNA Inhalt Abbildung 14.1. Phasen des Zellzyklus. Synchronisierung der Zellkulturen - Serumentziehung = Entziehung von Wachstumsfaktoren - Mitotisch „shake-off” - Colchicin hindert die Polimerisation der Mikrotubuli - 5-Fluor-Desoxyuridin blockiert die DNA-Replikation - FACS (= fluorescenzaktivierter Zellsortierer) auf Grund der Durchflusscytometrie (Abb. 14.2.; 14.3.) 39 Abbildung 14.2. Fluorescenzaktivierter Zellsortierer. Abbildung 14.3 . Das FACS-Diagramm einer unsynchronisierten Zellkultur nach DNA-Färbung. Die Dauer von Zellzyklus-Phasen Generationszeit / Zellzyklusdauer = die Zeit die für die Verdopplung der Zellenanzahl einer Kultur benötigt ist S-Phase [3H]-Desoxythymidin Pulsmarkierung (pulse-chase-labelling) → Autoradiographie → % von Zellen in der S-Phase → Dauer von S-Phase M-Phase % von mitotische Zellen (mitotischer Index) – Dauer von M-Phase G1-Phase 40 Synchronisierung durch mitotisch „shake-off” → [3H]-Desoxythymidin Markierung→ Autoradiographie → erste markierte Zellkerne G2-Phase unsynchronisierte Zellkultur → [3H]-Desoxythymidin Markierung → erste markierte Chromosomen 41 15. REGULIERUNG DES ZELLZYKLUS Methode für die Untersuchung der Regulierung des Zellzyklus genetische Experimente mit Hefezellen temperatursensitive cdc-Mutanten (cdc = „cell division cycle”) permissive und nichtpermissive Temperaturen Mikroinjektion der Froschei mit spezifischen Proteinen, mRNA oder antisense-Oligonucleotiden Experimente mit Froschei-Extrakte um die Teilung der Zellkerne im experimentelle System zu induzieren Zellfusionsexperimente Hybridzellen: S + G1 Zelle → DNA-Synthese in G1-Zellkern → S-Phase-fördernder Faktor (SPF) G1 + G2 Zelle → keine DNA-Replikation S + G2 Zelle → keine / blockierte Replikation in G2 Zelle M + Interphasezelle → das Chromatin kondensiert sich in Interphasekern → M-Pase mitosefördernder Faktor (MPF) Cyclin / Cdk Komplexe (Abb. 15.1.) regulatorische Moleküle der Zelle heterodimerische Struktur: Cyclin = reguletorische Untereinheit Cdk ( = Cyclin-dependent / -abhängige Kinase) = die katalytische Untereinheit Abbildung 15.1. Expression der Cyclin/Cdk Komplexe während des Zellzyklus der Säugetierzellen (R = Restriktionspunkt). G1/S Übergang Restriktionspunkt SPF = G1 Cyclin / Cdk Komplex DNA kann während des Zellzyklus nur einmal repliziert werden Initiation der Replikation: DNA-Replikationskomplexe am Replikationsursprung 42 Abbildung 15.2. Die Funktion von DNA-Replikationskomplexe am Replikationsursprung. G2/M Übergang MPF = mitotische Cyclin / Cdk Komplex (Abb. 15.3.) Abbau des Cyclins in M-Phase → Mitose wird komplettiert mitotisc he Cyclin Konzentration MPF-Aktivität Interphase Abbildung 15.3. Mitose Interphas e Mitose Interphase Mitose Änderungen der MPF-Aktivität und Cyclin-Konzentration während des Zellzyklus. Regulierung der Cdk-Aktivität (Abb. 15.4., 15.5.) Cyclin Synthese / Abbau Cdk-Phosphorylierung / Dephosphorylierung Cdk-Inhibitoren Abbildung 15.4. Der Mechanismus der Cdk Regulierung. 43 Abbildung 15.5. Regulierung von MPF-Aktivität während des Zellzyklus. Kontrollpunkte in der Regulierung des Zellzyklus (Abb. 15.6.) G1-Kontrollpunkt DNA Beschädigungen → p53 Tumorsuppressorprotein ↑→ Cdk-Inhibitor ↑→ Halt in G1 G2-Kontrollpunkt nonreplizierte DNA → keine MPF-Aktivierung → kein Eintritt in die Mitose → Halt in G2 M-Kontrollpunkt abnormale mitotische Spindel → Cyclin wird nicht abgebaut → Halt in M-Phase Abbildung 15.6. Kontrollpunkte des Zellzyklus. 44 16. Mitosis Eukaryotische Zellteilung Chromosomen werden geformt Mitose: die Zellteilung von somatischen Zellen Meiose: produziert Keimzellen, wie z.B. Eizellen und Spermien von Menschen Interphase (Abb. 16.1.) G1 – S – G2 mitotischer Apparat (Abb. 16.2.) Centrosom oder Mikrotubuliorganisationszentrum (MTOC) besteht aus die zwei Centriolen und der perizentriolären Matrix dupliziert sich in der S-Phase Abbildung 16.1. Die Phasen des Zellzyklus. 45 Abbildung 16.2. Die Organisation der Mikrotubuli in der Interphase und während der Zellteilung. Die Phasen der mitotischen Zellteilung Prophase MPF-Aktivierung → H1-Histon Phosphorylierung→ Chromatinkondensation → Lamin Phosphorylierung → Auflösung der Kernmembran → Phosphorylierung der Cytoskelettproteine → Ausbildung der mitotischen Spindel Verschwindung der Nucleolus Fragmentierung des endoplasmatisches Retikulum und Golgi Apparats Metaphase mitotische Spindel - Kinetochormikrotubuli - polare Mikrotubuli - Astralmikrotubuli Anaphase Chromatiden trennen sich und werden auseinander gezogen Anaphase A Verkürzung der Kinetochormikrotubuli → Wanderung der Chromatide Anaphase B (Abb. 16.3.) zwischen den polaren Mikrotubuli wird eine Schubkraft erzeugt, deshalb rücken die Spindelpole selbst auseinander → die Zelle wird ausgedehnt 46 Abbildung 16.3. Elongation der mitotischen Spindel in der Anaphase B. Telophase Abbau des MPFs → Chromosomen lockern sich → die Kernhülle wird wieder gebildet → das Endoplasmatisches Retikulum und der Golgi Apparat werden wieder aufgebaut Kernteilung Cytokinese (Abb. 16.4.) = Teilung des Cytoplasmas Mikrofilamente → kontraktiler Ring Abbildung 16.4. Cytokinese in einer sich teilenden Tierzelle.
