Institut für Molekulare Immunologie

Institute of
Molecular
Immunology
München
Munich
(Direktorin:
Prof. Dr. Dolores J. Schendel)
ie Forschungsaktivitäten des Instituts bewegen sich im Grenzgebiet
zwischen Hämatologie, Immunologie, Onkologie und Transplantationsbiologie. Hier werden Konzepte zur Modulation
des Immunsystems mittels zell- und molekularbiologischer Methoden entwickelt.
Untersucht werden neue Strategien der Immuntherapie und Gentherapie bei Krebs
sowie bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen und Transplantat-Abstoßungsreaktionen. Dabei kommen Tiermodelle und In-vitro-Studien mit isolierten
Zellen des menschlichen Immunsystems
zum Einsatz. Auf der Grundlage dieser
Strategien werden in enger Kooperation
mit medizinischen Fakultäten sowohl innerhalb als auch außerhalb München klinische Studien entworfen und umgesetzt.
Am Institut für Molekulare Immunologie
arbeiten zum Jahresende 8 Wissenschaftler, 6 Nachwuchswissenschaftler (davon
2 sonderfinanziert) und 8 technische Assistenten (1 sonderfinanziert), an immunologischen Projekten der Grundlagenforschung bzw. der anwendungsorientierten
Forschung.
Im Jahr 2002 promovierten zwei Doktoranden in der Biologie (Dr. rer. nat.), eine
Doktorandin absolvierte ihre tiermedizinische Promotion (Dr. med. vet.).
Als Beispiel unserer Forschungsaktivitäten im Jahr 2002 stellen wir ein Projekt aus
der Arbeitsgruppe Tumorimmunologie vor,
D
DIE
INSTITUTE
Institut für
Molekulare
Immunologie
(Director:
Prof. Dr. Dolores J. Schendel)
esearch in the institute is focused on
the intersecting field between
haematology, immunology, oncology, and transplantation biology. Concepts
are developed for modulating the immune
system by means of cellular and molecular
methods. New strategies are investigated
for the immunotherapy and gene therapy
of cancer, and the treatment of autoimmune
diseases and transplant rejection reactions.
The research uses both animal models and
in vitro studies with isolated cells from the
human immune system. Clinical studies
based on these strategies are designed and
carried out in close cooperation with
medical faculties both in Munich and elsewhere.
As an example of our activities in 2002,
we present a project from the research
group in Tumour Immunology that was
performed in collaboration with the DKFZ
(Experimental and Molecular Pathology,
Prof. Gröne) and the Institute of Pathology
at the GSF (Prof. Hutzler).
At the end of 2002, there were 8 scientists, 6 junior scientists (2 supported by
grant funds), and 8 technicians (1 supported
by grant funds) involved in basic and
applied immunological research at the
Institute. In 2002, three students were
awarded doctorates, two in biology and
one in veterinary medicine.
R
221
GSF
das in Zusammenarbeit mit dem DKFZ (Experimentelle und Molekulare Pathologie,
Prof. Gröne) und dem Institut für Pathologie der GSF (Prof. Hutzler) bearbeitet wird.
Charakterisierung des lymphozytären
Infiltrats im Nierenzellkarzinom
Tumorparenchym
Bindegewebs-Kapsel
M. Rosmanit, E. Nößner
Das Nierenzellkarzinom wird, wie das
Melanom, zu den immunogenen Tumoren
gezählt, weil in seltenen Fällen spontane
Remissionen auftreten und weil die systemische Applikation von Zytokinen bei einigen Patienten zur Tumorregression führt.
Auch gelang es uns und anderen Arbeitsgruppen, T-Lymphozyten aus Tumoren zu
isolieren, die in vitro zytotoxische Aktivität
gegen Tumorzellen zeigten. Über die letzten Jahre hinweg waren die aus Tumoren
von Patienten isolierten Lymphozyten
(tumorinfiltrierende Lymphozyten, TIL) der
Fokus unserer Forschungsaktivitäten, und
die gewonnenen Kenntnisse wurden in ein
allogenes Tumorzell-Vakzine-Konzept umgesetzt, das demnächst an der Urologischen
Klinik und Poliklinik Großhadern (Prof.
Hofstetter) und der Robert-Rößle-Klinik
Berlin (Prof. Pezzutto) an Patienten mit metastasiertem Nierenzellkarzinom evaluiert
wird (siehe auch Jahresbericht 1998 und
2001).
Die Beobachtung, dass T-Zellen mit zytotoxischer Aktivität gegen autologe Tumorzellen relativ oft und auch bei Patienten mit
fortgeschrittener Tumorerkrankung isoliert
werden können, lässt uns mit der Frage
zurück, warum das Tumorwachstum in den
meisten Fällen dennoch nicht verhindert
wird. Die Diskrepanz zwischen dem positiven Nachweis zytotoxischer Lymphozyten
und dem Versagen der Lymphozyten bei
der Kontrolle des Tumorwachstums veranlasste uns dazu, das lymphozytäre Infiltrat
am Ort des Tumors (in situ) zu untersuchen,
um Hinweise zu erhalten, warum die T-Zellen in situ nicht aktiv sind.
Wir führten immunhistologische Färbungen an 16 klarzelligen Nierenzellkarzinomen
222
GSF
peritumorale Lymphfollikel
Normales Nierengewebe
Abb.1: Histologische Übersicht des Nierenzellkarzinoms von Patient 26. Rot gefärbt
(APAAP-Methode) sind CD8-positive Zellen.
Deutlich sind die peritumoralen follikelartigen
Lymphozyten-Ansammlungen zu sehen.
durch und konzentrierten uns dabei auf die
Tumor-charakteristische Morphologie, die
Verteilung des lymphozytären Infiltrats innerhalb der histologisch unterschiedlichen
Bereiche des Tumors und die Zusammensetzung des lymphozytären Infiltrats. Zur
Quantifizierung der Lymphozyten-Subpopulationen isolierten wir TIL aus frischem
Tumorgewebe und charakterisierten diese
mittels Dreifarben-Immunfluoreszenz
(FACS-Analyse). Weiterhin untersuchten
wir die Expression funktionsrelevanter Proteine, wie der T-Zell-Rezeptor-assoziierten
(TCR)-zeta-Kette und des zytotoxischen
Effektormoleküls Perforin. Die TCR-zetaKette ist für die Weiterleitung des über den
TCR empfangenen antigenspezifischen
Signals verantwortlich. Eine verminderte
oder fehlende Expression der TCR-zetaKette wurde bei verschiedenen malignen
Erkrankungen, hauptsächlich Leukämien,
aber auch einigen soliden Tumoren beobachtet und wird als ein zentraler Immunevasionsmechanismus diskutiert. Perforin
ist das zentrale Effektormolekül zytotoxischer MHC-Klasse I-restringierter T-Lymphozyten und natürlicher Killer (NK)-Zellen.
Die Immunhistologie zeigte, dass das
Nierenzellkarzinom von einer ausgeprägten
fibrinösen „Pseudo-Kapsel“ vom Normalgewebe separiert ist (Abb. 1). Auch das
Tumorparenchym ist regelmäßig von
Bindegewebssepten durchzogen, die oftmals einen direkten Kontakt der infiltrierenden Lymphozyten mit den Tumorzellen verhindern. Das lymphozytäre Infiltrat konzentrierte sich in der Kapsel und den Septen,
während das Tumorparenchym spärlich infiltriert war. Die bevorzugte Konzentrierung
des Infiltrats in der Kapsel und den Septen
könnte bedeuten, dass hier spezifische
Rekrutierungsmechanismen zum Tragen
kommen. Die Einwanderung der Lymphozyten ins Tumorparenchym könnte dadurch
beeinträchtigt sein. Besonders ausgeprägt
waren peritumoral (im Bereich des Normalnierengewebes) an die Bindegewebskapsel
angelagerte Lymphozyten-Ansammlungen,
die morphologisch eine den Keimzentren
ähnliche Organisation (Follikel) zeigten
(Abb. 1). Ob diese „Follikel“ eine spezielle
Bedeutung haben, etwa als Initiationszentren einer antitumoralen Immunantwort, ist
derzeit unklar.
Phänotypische Charakterisierung des
lymphozytären Infiltrats
DIE
INSTITUTE
Charakteristische Morphologie des
Nierenzellkarzinoms und Verteilung des
lymphozytären Infiltrats
Die CD3-positiven T-Lymphozyten exprimierten nahezu ausschließlich den -TZell-Rezeptor (TCR). TCR- positive TLymphozyten wurden extrem selten gefunden. Innerhalb des T-Zell-Infiltrats dominierten die CD8-positiven T-Zellen über die
CD4-positiven T-Zellen. Die Unterrepräsentation von CD4-T-Zellen könnte ein Grund
sein, warum sich eine CD8-T-Zell-vermittelte Immunreaktion gegen Tumorantigene
nicht optimal entwickelt. Neben den T-Lymphozyten wurden in allen Proben auch
CD3+/Perforin +
(T-Zelle)
CD3+/Perforin +
(NK-Zelle)
Abb. 2: Immunhistologische Fluoreszenzdoppelfärbung mit Antikörpern gegen CD3 (grün) und
Perforin (rot). Im Großbild dargestellt sind CD3-positive T-Lymphozyten (grün), die überwiegend
Perforin-negativ sind. Zwei T-Lymphozyten (Pfeile) zeigten schwache Färbung für Perforin (in der
Überlagerung gelb gefärbt). Die diffuse Verteilung der Perforin-haltigen Granula bei T-Lymphozyten (Vergrößerung, oben) läßt vermuten, dass kein Antigen-spezifischer Kontakt mit Tumorzellen besteht. Unten dargestellt ist eine Perforin-positive, CD3-negative Zelle (NK-Zelle) mit polarer
Anordnung der Perforin-Granula (rot). Zellkerne sind blau dargestellt.
223
GSF
NK-Zellen in variabler Menge von 5% bis
40% (Mittelwert bei 18%) gefunden.
Untersuchungen zum Effektorstatus des
lymphozytären Infiltrats
Um Aufschluss über den Effektorzustand
der tumorinfiltrierenden Lymphozyten zu
erhalten, wurden Färbungen mit Antikörpern gegen Perforin und der TCR-assoziierten Zeta-Kette durchgeführt. Bei allen
untersuchten Proben war die TCR-zetaKette sowohl histologisch als auch mittels
FACS-Analyse nachweisbar. Nur in Einzelfällen zeigte ein geringer Prozentsatz der
T-Zellen einen Verlust der TCR-zeta-Kette.
Auffällig dagegen war die geringe Zahl
an Perforin-positiven Zellen. Bei den wenigen Perforin-positiven T-Lymphozyten ließ
die diffuse Verteilung der Perforin-haltigen
Granula vermuten, dass diese T-Lymphozyten nicht in zytotoxischem Kontakt mit
Tumorzellen stehen (Abb. 2). NK-Zellen
waren in der Mehrzahl positiv für Perforin,
und die polare Ausrichtung der PerforinGranula könnte auf zytotoxischen Kontakt
mit Zielzellen hindeuten. Da aber die benachbarten Tumorzellen keine Anzeichen
von Apoptose zeigten, ist anzunehmen,
dass auch die Effektorfunktion der NK-Zellen inhibiert ist.
Bedeutung der Befunde für die
Immuntherapie des Nierenzellkarzinoms
i) Die Untersuchungen zeigten, dass das
Nierenzellkarzinom von potenziell zytotoxischen Lymphozyten (T-Zellen und
NK-Zellen) infiltriert ist. Das Fehlen von
Perforin bei den T-Lymphozyten könnte
auf eine Dysfunktion in situ hinweisen,
die durch eine aktive Suppression oder
alternativ durch Erschöpfung der T-Zellen nach permanentem Kontakt mit
Tumorzellen entsteht. Inwieweit auch
eine unzureichende Hilfe z. B. durch zu
wenige oder unzureichend aktivierte
CD4-positive T-Zellen die Dysfunktion
der CD8-T-Zellen in situ erklären könnte,
muss noch geklärt werden.
224
GSF
ii) Im Gegensatz zu den T-Lymphozyten
exprimierten tumorinfiltrierende NKZellen Perforin. Dennoch zeigten sie
direkt nach Isolierung aus Tumorgewebe
keine oder nur schwache zytotoxische
Aktivität.
Aus unseren In-vitro-Untersuchungen
wissen wir, dass CD8-T-Zellen und
NK-Zellen ex vivo durch Kultivierung in
IL-2-haltigem Medium zytotoxische
Aktivität gewinnen können. In der klinischen Situation könnte die Applikation
von IL-2 für die Wiederbelebung der
funktionellen Kapazität der CD8+ CTL
relevant sein.
iii) T-Lymphozyten, die den -TCR exprimierten, wurden nur sehr selten gefunden. Da -T-Zellen möglicherweise
eine sehr wichtige T-Zell-Populationen
für die antitumorale Immunabwehr
sind, könnte eine Rekrutierung von T-Zellen im Rahmen von Impfstrategien
Bedeutung haben.
Suizid-Gentherapie beim Hund als
Modell für adoptive Immuntherapie
beim Menschen
M. Weber, H. Adler, W. Günther, H.-J. Kolb
Die allogene Stammzelltransplantation
ist heute in der Behandlung von zahlreichen hämatologischen Erkrankungen, z.B.
von akuten und chronischen Leukämien,
Lymphomen sowie Myelomen, etabliert.
Der Erfolg der allogenen im Vergleich zur
autologen Transplantation ist in erster Linie
auf den durch die Spender-Lymphozyten
vermittelten sog. „Graft-versus-Leukemia“
– Effekt (GvL) zurückzuführen. Die SpenderLymphozyten verursachen jedoch auch
eine Reihe von Komplikationen, die den
therapeutischen Nutzen teilweise stark beeinträchtigen. Dazu gehören lebensbedrohliche Infektionen und „Graft versus Host
Disease“ (GvHD).
GvHD kann durch die Depletion von
T-Zellen aus dem Transplantat weitgehend
verhindert werden. Nachteile der T-ZellDepletion sind ein höheres Abstoßungs-
A
DIE
INSTITUTE
nicht-toxischen Substanz, da nur sie zur
Umwandlung in die toxische Form in
der Lage sind. Alle anderen Zellen werden
von der Substanz nicht beeinträchtigt.
Das gegenwärtig am besten charakterisierte Suizid-Gen ist das Herpes-simplexVirus-Thymidin-Kinase-Gen (HSV-TK), welches bereits in ersten klinischen Studien
eingesetzt wurde. HSV-TK kann die Substanz Ganciclovir in eine nicht-toxische Zwischensubstanz, ein Monophosphat, umwandeln. Dazu sind zelleigene Kinasen
nicht in der Lage. Die zelleigenen Kinasen
wandeln anschließend das Ganciclovirmonophosphat in die Triphosphat-Form
um. Das Ganciclovirtriphosphat wird bei
der zellulären DNA-Synthese anstelle des
normalerweise verwendeten Thymidintri-
und Infektionsrisiko sowie eine höhere
Rate des Wiederauftretens der Grunderkrankung. Das Rezidiv kann durch erneute
Infusion von Spenderlymphozyten (Donor
Lymphocyte Infusion [DLI]) behandelt
werden, womit das Risiko schwerer GvHD
verbunden sein kann. Deshalb wäre eine
Möglichkeit, durch gezielte Ausschaltung
der Spender-Lymphozyten die GvHD zu
behandeln, von großem Vorteil. Das kann
durch das Einbringen eines Suizid-Gens in
die Spender-Lymphozyten erreicht werden.
Ein Suizid-Gen kodiert für ein Protein,
welches in der Lage ist (in den modifizierten Zellen) eine nicht-toxische Substanz in
eine toxische Form umzuwandeln. Demzufolge werden Zellen, die das Suizid-Gen
exprimieren, empfindlich gegenüber der
B
64
KnochenmarkTransplantation
Events
M1
Spender
Empfänger
Blut
HSV-Tk
Selektion
0
100
425 TK
425 Ko
70000
60000
50000
cpm
102
103
104
D
80000
40000
30000
20000
10000
0
GCV (µg/ml) 0
0,01
0,1
1
10
100
% transduzierte Zellen im Blut
C
101
4
3,5
transduzierte Zellen
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
1
2
3
4
5
6
7
14 21 28 35 56 115 227
Abb. 3: Nachweis der Persistenz der Gen-modifizierten Zellen: Nach einer allogenen Knochenmarktransplantation wurden dem Spender T-Lymphozyten entnommen und mit dem Suizidgen
transduziert (A). Die Gen-modifizierten Zellen wurden auf über 95% Reinheit angereichert (B) und
auf ihre Empfindlichkeit gegenüber Ganciclovir getestet (C). 80 Tage nach der Transplantation
wurden die T-Zellen dem Knochenmarkempfänger transfundiert. Die Persistenz der Zellen im
peripheren Blut wurde mittels FACS-Analyse nachgewiesen (D).
225
GSF
phosphats in die DNA eingebaut. Dies führt
in Folge zu einem Abbruch der DNA-Synthese und letztendlich zum Zelltod. Obwohl
die HSV-TK bereits bei einigen Patienten
klinisch angewandt wurde, sind viele Fragen
noch offen. Da durch die Beantwortung
dieser Fragen Gefährdungen des Patienten
ausgeschlossen werden können, sollen
sie im Versuch an einem Tier modellartig
beantwortet werden.
Zur Entwicklung der Stammzell-Transplantation haben sich Versuche beim Hund
bestens bewährt; Methoden der Organ-,
Knochenmark- und Stammzell-Transplantation wurden bis zur klinischen Reife gebracht. Für die Untersuchungen zum Einsatz der HSV-TK als Suizidgen werden zwei
Gruppen von Spender-Empfänger-Kombinationen ausgewählt: In der ersten Gruppe
DLA-haploidentischer Empfänger mit DLAhomozygoten Spendern soll geprüft werden, ob die Transfusion der Gen-modifizierten Zellen zum Auftreten einer ähnlich
schweren GvHD wie die unmodifizierter
Zellen führen kann. Danach soll untersucht
werden, ob und bis zu welchem Zeitpunkt
die GvHD durch die Gabe von Ganciclovir
erfolgreich therapiert werden kann. In der
zweiten Gruppe bei DLA-identischen Spen-
der-Empfänger-Kombinationen tritt keine
GvHD auf, wenn die Lymphozyten-Infusion
erst 60 Tage nach der T-Zell-depletierten
Transplantation erfolgt. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung der Verteilung,
der Funktion und der Überlebensrate der
transfundierten Zellen sowie die Untersuchung einer potenziell auftretenden Immunreaktion seitens des Empfängers gegen
die Gen-modifizierten Spender-Zellen.
In unseren Untersuchungen haben wir
HSV-TK-modifizierte T-Zellen beim Hund
eingesetzt (Abb. 3). Das Ziel unserer Arbeiten ist es, den Einsatz der HSV-TK beim
Hunde soweit zu entwickeln, dass die gegenwärtig noch bestehenden Probleme gelöst werden können und eine breite klinische
Anwendung möglich wird. Wir konnten zeigen, dass die Funktion von mit HSV-TK
modifizierten T-Zellen in vitro erhalten bleibt
und dass diese Zellen Ganciclovir-sensitiv
sind. Es gelang ebenfalls, aus den modifizierten T-Zellen zytotoxische Zellen zu
generieren, ohne dass diese ihre Spezifität
und Funktion verloren. In ersten In-vivoExperimenten konnten wir zeigen, dass die
Gen-modifizierten Zellen im lebenden Organismus überleben und über einen längeren Zeitraum im Blut nachzuweisen sind.
Zusammenarbeit
Ausgewählte Veröffentlichungen
Sechs Mitarbeiter des Instituts sind am Lehrbetrieb der
Ludwig-Maximilians-Universität beteiligt. Die Institutsleiterin ist Koordinatorin des HGF-Programms „Infektion und Immunität“ für die GSF und stellvertretende
Sprecherin eines DFG-Sonderforschungsbereichs (SFB
455).
Noessner, E.*, Gastpar, R.*, Milani, V.*, Brandl, A.,
Hutzler, P.J.S., Kuppner, M.C., Roos, M., Kremmer, E.,
Asea, A., Calderwood, S.K. and Issels, R.D.: Tumorderived heat shock protein 70-peptide complexes are
cross-presented by human dendritic cells. J. Immunol.
169: 5424–5432 (2002).
(* shared first authorship).
Es bestehen direkte Kooperationen mit verschiedenen
HGF-Zentren (DKFZ und MDC). Darüber hinaus bestehen Kooperationen mit der Urologischen Klinik und
Poliklinik der Ludwig-Maximilians-Universität München,
dem Institut für Experimentelle Onkologie und Therapieforschung der Technischen Universität München,
sowie der Universität Tübingen, Institut für Zellbiologie,
Abt. Immunologie (Dr. S. Stevanovic, Prof. Rammensee).
Die Arbeiten des Instituts werden mit Drittmitteln der
DFG, der Wilhelm-Sander-Stiftung, des BMBF und der
HGF gefördert.
Beisel, C., Imhof, A., Greene, J., Kremmer, E., Sauer, F.:
Histone methylation by the Drosophila epigenetic transcriptional regulator Ash1. Nature, 419: 857–862 (2002).
Kronenberger, K., Dieckmann, A., Selmayr, M., Strehl, J.,
Wahl, U., Lindhofer, H., Kraal, G. und Mocikat, R.: Impact
of the lymphoma idiotype on in vivo tumor protection
in a vaccination model based on targeting antigens to
antigen-presenting cells. Blood 99: 1327–1331 (2002).
Falk, C.S., Noessner, E., Weiss, E.H. and Schendel, D.J.:
Retaliation against tumor cells showing aberrant HLA
expression using lymphokine activated killer (LAK)derived T cells. Cancer Res. 62(2): 480–487 (2002).
Schleuning, M., Stoetzer, O., Waterhouse, C.,
Schlemmer, M., Ledderose, G., Kolb, H.J.: Hematopoietic stem cell transplantation after reduced-intensity
conditioning as treatment of sickle cell disease.
Exp Hematol: 30(1): 7–10 (2002).
226
GSF