Die Rolle roter Blutzellen bei der Thrombusbildung

Die Rolle roter Blutzellen bei
der Thrombusbildung
Alexandra Maas
2522124
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Die Rolle roter Blutzellen bei der Thrombusbildung
Inhaltsverzeichnis
1.
Theoretische Grundlagen ............................................................................................ 3
1.1.
Aufbau der Membran von RBCs .................................................................................. 3
1.2.
Hämostase ................................................................................................................... 5
2.
Aggregations-Kaskade in RBCs .................................................................................... 6
3.
Adhäsion der RBCs ...................................................................................................... 7
4.
Untersuchung der Regulation der Exposition von PS in RBCs ..................................... 10
5.
Zusammenfassung .................................................................................................... 15
6.
Literaturverzeichnis .................................................................................................. 16
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Die Rolle roter Blutzellen bei der Thrombusbildung
1.
Theoretische Grundlagen
Die Hauptaufgabe der roten Blutzellen (engl.: red blood cells, RBCs), die in der Medizin als
Erythrozyten bezeichnet werden, liegt im Transport von Sauerstoff und Kohlendioxid
innerhalb des Organismus. Für die Bindung des Sauerstoffs bzw. des Kohlendioxids ist das in
den roten Blutzellen enthaltene Hämoglobin verantwortlich, welches auf Grund der
Anwesenheit von Protoporphyrin IX (Häm) die reversible Bindung dieser Stoffe ermöglicht.
Die Vorläufer der roten Blutzellen werden im roten Knochenmark gebildet und verlieren im
Laufe ihrer Entwicklung, der Erythropoese, ihren Zellkern, wodurch die roten Blutzellen ihre
charakteristische bikonkave Form erhalten. Im Durchschnitt beträgt die Lebensdauer von
roten Blutzellen 100 bis 120 Tage, bevor sie vor allem in der Leber oder in der Milz abgebaut
werden.
1.1.
Aufbau der Membran von RBCs
Die Membran der roten Blutzellen ist eine Lipiddoppelschicht und setzt sich aus Proteinen,
Lipiden und Kohlenhydraten zusammen. Die Membranlipide lassen sich dabei in drei Klassen
einteilen: Phospholipide,
Glycosphingolipide und neutrale Lipide, wobei letztere
hauptsächlich durch Cholesterol repräsentiert werden. Die am häufigsten auftretenden
Membranlipide sind die Phospholipide, die in die beiden Klassen Sphingomyelin und
Glycerophospholipide unterteilt werden können. Die Glycerophospholipide lassen sich
erneut unterteilen in Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylethanolamin (PE) und
Phosphatidylserin
(PS).
Zu
den
Glycerophospholipiden
gehören
des
Weiteren
Phosphatidsäure und Phosphatidylinositol (PI), die aber deutlich seltener in die Zellmembran
eingebaut werden.
Die Lipiddoppelschicht der roten Blutzellen zeigt eine ungleichmäßige Verteilung der
Phospholipide zwischen beiden Lipidreihen. Unter physiologischen Bedingungen befinden
sich Sphingomyelin und Phosphatidylcholin hauptsächlich in der Membranaußenseite,
Phosphatidylethanolamin
und
Phosphatidylserin
hingegen
hauptsächlich
in
der
Membraninnenseite (Abbildung 1). Diese asymmetrische Verteilung ist essentiell für die
normale Funktion der Membran und wird durch verschiedene Proteine gewährleistet.
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Die Rolle roter Blutzellen bei der Thrombusbildung
Abbildung 1: Verteilung der Phospholipide zwischen innerer und äußerer Lipidreihe in verschiedenen Organismen
(Nguyen, 2010).
Zu den Proteinen, die für die asymmetrische Verteilung der Lipide verantwortlich sind,
gehörten die Flippasen, die Floppasen und die Scramblasen. Die ersten beiden katalysieren
den Übergang von bestimmten Lipiden von einer Membranseite zur anderen unter
ATP-Verbrauch, wobei die Flippasen den Transport zur cytoplasmatischen Seite und die
Floppasen den umgekehrten Transport zur exoplasmatischen Seite katalysieren. Bei den
Scramblasen hingegen handelt es sich um unspezifische Translokasen, die eine gleichmäßige
Verteilung der Lipide in der Membran bewirken. Die Scramblasen wirken somit den
Flippasen und Floppasen entgegen (Munk, Abröll, & Kurth, 2008).
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Die Rolle roter Blutzellen bei der Thrombusbildung
1.2.
Hämostase
Der Begriff Hämostase fasst alle Prozesse zusammen, die für die Beendigung einer Blutung
verantwortlich sind. Dabei werden zwei nacheinander ablaufende Prozesse unterschieden
(Behrends, Bischofberger, & Deutzmann, 2012):
1. Primäre Hämostase (Blutungsstillung)
Durch eine Verletzung der Endothelwand kommt es zur Freilegung von subendothelialem
Kollegen und zur Freisetzung des sog. von-Willebrand-Faktor (vWF). Dieser bindet
gleichzeitig an das freigelegte Kollagen, als auch an einen bestimmten Glykoproteinkomplex
auf der Thrombozytenoberfläche. Das Kollagen bindet zusätzlich noch direkt an den
Glykoproteinkomplex und diese beiden Interaktionen führen zum Anhaften der
Thrombozyten an die Gefäßwand. Des Weiteren kommt es durch die Bindung des vWF an
den Glykoproteinkomplex und durch das in geringe Mengen gebildete Thrombin zur
Aktivierung der Thrombozyten. Diese Aktivierung führt durch die Auslösung verschiedener
Mechanismen zur Adhäsion und Aggregation der Thrombozyten und somit zur Ausbildung
eines Thrombozytenpfropfs, der als weißer Thrombus bezeichnet wird. Zusätzlich werden
bestimmte Stoffe (Serotonin, Thrombaxan A2) von den Thrombozyten freigesetzt, die eine
Vasokonstriktion bewirken.
2. Sekundäre Hämostase (Blutgerinnung)
Die sekundäre Hämostase hat den stabilen Wundverschluss durch Ausbildung eines
Fibrinnetzes zum Ziel. Dabei werden drei verschiedene Phasen durchlaufen. In der ersten
Phase, der Aktivierungsphase, kommt es zur Bildung von Thrombin. Danach wird in der
Koagulationsphase ausgehend von Fibrinogen das Fibrinnetz gebildet und daran
anschließend erfolgt die Kontraktion des Fibrinnetzes unter Beteiligung der Thrombozyten,
wodurch sich die Wundränder einander annähern (Retraktionsphase). Durch die
anschließende Einlagerung von Blutzellen (u.a. rote Blutzellen) entsteht der sog. rote
Thrombus, der die Wunde stabil verschließt.
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Die Rolle roter Blutzellen bei der Thrombusbildung
2.
Aggregations-Kaskade in RBCs
Lange Zeit wurde angenommen, dass die roten Blutzellen nur passiv an dem Prozess der
Thrombusbildung beteiligt sind, da davon ausgegangen wurde, dass diese einfach nur im
Fibrinnetz gefangen bleiben. Auf Grund von neuen Erkenntnissen, zum Beispiel über den
Zusammenhang zwischen reduzierten Hämatokrit-Werten und längeren Blutungszeiten,
wurde jedoch auf eine aktive Teilnahme der roten Blutzellen an diesem Prozess geschlossen.
In Bezug auf die aktive Beteiligung der roten Blutzellen bei der Thrombusbildung wurde von
Kaestner und Bernhardt eine Signalkaskade zur Aggregation der roten Blutzellen
vorgeschlagen, die auf der Aufnahme von Ca2+ über einen nicht-selektiven Kationen-Kanal
beruht (Abbildung 2).
Abbildung 2: Vorgeschlagene Signalkaskade zur Aggregation der roten Blutzellen nach Stimulation (Nguyen, 2010).
Das Modell besagt, dass die Aktivierung von Thrombozyten, die zum Beispiel durch eine
Verletzung ausgelöst wird, zur Freisetzung von Lysophosphatidylsäure (LPA) und
Prostaglandin
E2
führt.
Diese
Substanzen
aktivieren
einen
nicht-selektiven,
spannungsabhängigen Kationen-Kanal (NSVDC), durch den Ca2+ in das Innere der roten
Blutzellen einströmen kann. Der schnelle Anstieg der intrazellulären Ca 2+-Konzentration
führt dann zur Aktivierung des Gardos-Kanals und der Scramblase, sowie zur Inhibierung der
Flippase.
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Die Rolle roter Blutzellen bei der Thrombusbildung
Der Gardos-Kanal gehört zur Gruppe der Ca2+-aktivierten K+-Kanäle und der Einstrom von
Ca2+ bewirkt einen Efflux von K+ und Cl- und führt schließlich zum osmotisch bedingten
Wasserausstrom und somit zum Schrumpfen der Zelle. Die Aktivierung der Scramblase und
der Flippase haben eine Umverteilung der Phospholipide in der Zellmembran zur Folge,
wodurch es zur Exposition von Phosphatidylserin kommt, welches unter physiologischen
Bedingungen fast ausschließlich auf der cytosolischen Membranseite auftritt. Diese führt
schließlich zur Adhäsion und Aggregation der roten Blutzellen.
3.
Adhäsion der RBCs
Die vorgeschlagenen Interaktionen, die zur Adhäsion der roten Blutzellen durch die
Exposition von Phosphatidylserin führen, sind in Abbildung 3 dargestellt.
Abbildung 3: Vorgeschlagenes Modell zur Adhäsion der RBCs durch Exposition von Phosphatidylserin (Nguyen, 2010).
Eine Möglichkeit besteht darin, dass das von den aktivierten roten Blutzellen oder von
Mikrovesikeln
exponierte
Phosphatidylserin
von
den
Phosphatidylserin-bindenden
Rezeptoren oder der CD36-Rezeptoren, die sich auf der Oberfläche der Zelle befinden,
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Die Rolle roter Blutzellen bei der Thrombusbildung
gebunden wird. Dies führt entweder zur Adhäsion der roten Blutzellen an die Endothelzellen
oder zum Aneinanderheften der Blutzellen untereinander. Eine weitere Interaktion tritt in
Anwesenheit von Calcium-Ionen auf. Dabei kommt es zur Ausbildung einer Brückenstruktur
zwischen zwei Phosphatidylserinen, wodurch die Blutzellen aneinander adhärieren können.
Mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie konnte diese Adhäsion zwischen zwei roten Blutzellen
nachgewiesen werden. Das grundlegende Prinzip, das zur Bestimmung der Adhäsionskräfte
zwischen zwei Zellen verwendet wird, ist in Abbildung 4 dargestellt. Bei dieser Methode wird
zunächst eine Zelle am Cantilever und eine andere Zelle an einer Oberfläche angeheftet.
Anschließend werden die Zellen miteinander in Kontakt gebracht und dann wieder
voneinander gelöst. Die entsprechende Adhäsionskraft, die zwischen beiden Zellen wirkt,
wird durch die Auslenkung des Cantilevers ermittelt.
Abbildung 4: Prinzip der Kraftmessung mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie (Steffen et al., 2011).
Zur Ermittlung der Adhäsionskräfte zwischen roten Blutzellen wurde der Versuch einmal mit
unbehandelten roten Blutzellen durchgeführt und zusätzlich mit roten Blutzellen, die zuvor
mit 2,5 μM LPA behandelt wurden. Entsprechende Beispiele für die erhaltenen
Kraft-Distanz-Kurven von den unbehandelten Kontrollzellen und den Zellen nach
LPA-Behandlung sind der Abbildung 5 zu entnehmen.
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Die Rolle roter Blutzellen bei der Thrombusbildung
Abbildung 5: Beispiel einer Kraft-Distanz-Kurve von unbehandelten Zellen (grün) und von Zellen, die zuvor mit LPA
behandelt wurden (rot) (Steffen et al., 2011).
In den Kontrollmessungen mit den unbehandelten Zellen konnten nur sehr schwache
Interaktionen zwischen den roten Blutzellen nachgewiesen werden (Abbildung 5,
grüne Linie). Die durchschnittliche Kraft, der zur Trennung der beiden Zellen voneinander
benötigt wurde, lag bei 28,8 ± 8,9 pN. Nach der Behandlung mit LPA konnten deutlich stärke
Adhäsionskräfte zwischen den roten Blutzellen beobachtet werden (Abbildung 5, rote Linie).
Bei diesen Zellen lag die durchschnittliche Kraft, die zur Trennung benötigt wurde bei
100 ± 8,4 pN und somit deutlich über dem Wert, der für die Kontrollzellen ermittelt wurde
(Steffen et al., 2011). Demnach zeigten roten Blutzellen nach entsprechender Stimulation ein
deutlich stärkeres Adhäsionsverhalten als unbehandelte rote Blutzellen.
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Die Rolle roter Blutzellen bei der Thrombusbildung
4.
Untersuchung der Regulation der Exposition von PS in RBCs
Die Exposition von Phosphatidylserin hat nachweislich bedeutende physiologische
Konsequenzen. Neben der verstärkten Zell-Zell-Interaktion, dient die PhosphatidylserinExposition auch als Signal für die Einleitung der Eryptose und für die Entfernung von
apoptotischen Zellen durch Makrophagen. Die Exposition von Phosphatidylserin auf
Thrombozyten spielt ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Blutgerinnung. Das exponierte
Phosphatidylserin ermöglicht die Anlagerung von Gerinnungsfaktoren, wie zum Beispiel von
Prothrombinase oder dem Tenasekomplex. Auf Grund von unterschiedlichen Ergebnissen in
Bezug auf den Mechanismus, der die Exposition von Phosphatidylserin auslöst, wurde der
Zusammenhang
zwischen
erhöhter
intrazellulärer
Calcium-Konzentration
und
der
Phosphatidylserin-Exposition noch mal genauer untersucht (Nguyen et al., 2011).
Es besteht ein nachweislicher Zusammenhang zwischen einer erhöhten intrazellulären
Calcium-Konzentration
und
bestimmten
Prozessen,
die
für
die
Exposition
von
Phosphatidylserin von Bedeutung sind. Dazu zählt die Aktivierung der Scramblase und die
Inhibierung der Flippase, als auch die Aktivierung des Gardos-Kanals. Die Aktivierung des
Gardos-Kanals führt zum Verlust von KCl und Wasser, was zur Folge hat, dass die Zelle
schrumpft. Des Weiteren bewirkt die erhöhte intrazelluläre Calcium-Konzentration die
Aktivierung der Proteinkinase Cα und der Ca2+-Pumpe. Zusätzlich wird die Calcium-abhängige
Protease Calpain aktiviert, die zum Abbau des Zytoskeletts und zur Bildung von
Membranbläschen und Mikrovesikeln führt.
Um den Zusammenhang zwischen der intrazellulären Calcium-Konzentration und der
Exposition von Phosphatidylserin zu untersuchen, wurden die roten Blutzellen mit drei
unterschiedlichen Substanzen behandelt. Die Substanz LPA wird von aktivierten
Thrombozyten freigesetzt und führt zu einem Anstieg der intrazellulären Ca 2+-Konzentration,
indem ein nicht-selektiver Kationen-Kanal aktiviert wird. Der Calcium-Ionophor A23187
hingegen wirkt als Carrier und transportiert die Ca2+-Ionen durch die Membran und bewirkt
auf diese Weise einen erhöhten Ca2+-Gehalt im Inneren der roten Blutzellen. Die Substanz
PMA dient der Aktvierung verschiedener Isoformen der Proteinkinase C, die auch bei der
Exposition von Phosphatidylserin auf der Zellmembran eine wichtige Rolle spielen.
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Die Rolle roter Blutzellen bei der Thrombusbildung
Um die intrazellulären Ca2+-Konzentration zu ermitteln wurden die Zellen mit dem
calciumsensitiven Fluoreszenzfarbstoff Fluo-4 AM behandelt und mit Hilfe eines
Fluoreszenzmikroskops analysiert. Der Fluoreszenzfarbstoff Fluo-4 AM ist auf Grund seiner
Acetoxyacetylester-(AM)-Gruppe in der Lage, die Lipiddoppelschicht zu überqueren. Im
Zytoplasma werden die AM-Gruppen durch unspezifische Esterasen gespalten, wodurch das
Fluo-4 an die freien Ca2+-Ionen binden kann. Diese Bindung führt dann zu einer deutlichen
Erhöhung der Emission des Fluoreszenzfarbstoffs (Halle, 2005).
Nach der Behandlung der roten Blutzellen mit den verschiedenen Substanzen zeigten sich
über einen Zeitraum von 30 Minuten unterschiedliche Verläufe der Fluoreszenzintensitäten
(Abbildung 6).
2+
Abbildung 6: Fluo-4 AM Fluoreszenzintensitäten der RBCs in Bezug auf den Ca -Gehalt nach Behandlung mit LPA, A23187
und PMA (Nguyen et al., 2011).
Die Zugabe von LPA bewirkte einen schnellen Anstieg der intrazellulären Ca 2+-Konzentration,
die über 30 Minuten relativ konstant blieb. Bei der Behandlung mit dem Ionophor A23187
konnte am Ende der Untersuchung eine gleiche Ca2+-Konzentration, wie bei LPA-Behandlung
nachgewiesen werden, jedoch zeigte sich zu Beginn eine verzögerte Ca2+-Aufnahme. Diese
Verzögerung kann dadurch erklärt werden, dass sich der Ionophor zuerst in die Membran
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Die Rolle roter Blutzellen bei der Thrombusbildung
einlagert, bevor er als Ionophor wirkt. Im Vergleich zu LPA und A23187 zeigte PMA eine
deutlich verringerte Aufnahme von Ca2+. Durch die Behandlung mit PMA konnte nur
ungefähr die Hälfte der intrazellulären Ca2+-Konzentration erreicht werden, die nach
30 Minuten bei LPA und A23187 ermittelt wurde.
Ähnliche Ergebnisse konnten bei der Analyse der Zellen mittels der Durchflusszytometrie
nachgewiesen werden (Abbildung 7, schwarze Balken).
Abbildung 7: Mittels Durchflussanalyse ermittelter prozentualer Anteil an RBCs mit erhöhter intrazellulärer
2+
Ca Konzentration (Nguyen, 2010).
Nahezu alle Zellen, die zuvor mit dem Ionophor A23187 behandelt wurden zeigten eine
deutlich erhöhte intrazelluläre Ca2+-Konzentration (99,2 %). Auch nach der Zugabe von LPA
könnten bei 80 % der Zellen eine verstärkte intrazelluläre Ca2+-Konzentration nachgewiesen
werden. Bei PMA hingegen zeigte sich dies nur für ca. 40 % der Zellen (Nguyen et al., 2011).
Zusätzlich zu der Ca2+-Konzentration wurde mittels der Durchflusszytometrie des Weiteren
die Phosphatidylserin-Exposition untersucht (Abbildung 8). Die Analyse der Exposition von
Phosphatidylserin erfolgte mit Hilfe von Annexin V-FITC, welches an das Phospholipid bindet
und somit den Nachweis ermöglicht.
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Die Rolle roter Blutzellen bei der Thrombusbildung
Abbildung 8: Mittels Durchflussanalyse ermittelter prozentualer Anteil an RBCs mit signifikanter PS-Exposition. (links) in
2+
2+
Anwesenheit von extrazellulärem Ca , (rechts) in Abwesenheit von extrazellulärem Ca (Nguyen et al., 2011).
Die Analyse zeigte, dass ca. 35 % der Zellen nach Behandlung mit LPA und nur ca. 20 % der
Zellen nach Behandlung mit A23187 eine Exposition von Phosphatidylserin aufwiesen. Die
stärkste Phosphatidylserin-Exposition konnte nach Stimulation der Zellen mit PMA
beobachtet werden (80 %). Zusätzlich wurde der gleiche Versuch ohne extrazelluläres Ca 2+
durchgeführt. Dabei konnte lediglich für die Zellen, die zuvor mit PMA behandelt wurden,
eine Phosphatidylserin-Exposition nachgewiesen werden (50 %). Durch Zugabe von LPA und
A23187 konnte keine Exposition detektiert werden. Die aus der Analyse der
Phosphatidyserin-Exposition gewonnenen Ergebnisse können nicht mit den Ergebnissen zur
Untersuchung der intrazellulären Ca2+-Konzentration zur Deckung gebracht werden.
Dieser fehlende Zusammenhang zwischen intrazellulärer Ca2+-Konzentration und der
Exposition
von
Phosphatidylserin
konnte
auch
mittels
der
konfokalen
Fluoreszenzmikroskopie bestätigt werden (Abbildung 9). Bei dieser Untersuchung zeigte sich,
dass bei manchen Zellen zwar eine erhöhte Ca2+-Konzentration nachgewiesen werden
konnte, aber diese Zellen kein Phosphatidylserin auf ihrer Zellmembran exponierten. Auch
der umgekehrte Zustand konnte beobachtet werden. In diesem Fall erfolgte eine Exposition
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Die Rolle roter Blutzellen bei der Thrombusbildung
von Phosphatidylserin, aber für diese Zellen könnte kein erhöhter intrazellulärer Ca 2+-Gehalt
detektiert werden (Nguyen et al., 2011).
Abbildung 9: Konfokale Fluoreszenzmikroskopie von Fluo-4 AM und Annexin V-alexa 568 markierten RBCs nach der
Behandlung mit LPA, A23187 und PMA (Nguyen et al., 2011).
Basierend auf den Ergebnissen, die bei diesen Untersuchungen erhalten wurden, wurden
drei verschiedene Mechanismen vorgeschlagen, die für die Exposition von Phosphatidylserin
in roten Blutzellen verantwortlich sind. Dazu gehört zum einem die Aktivierung der
Scramblase und die Inhibierung der Flippase durch eine erhöhte intrazelluläre
Ca2+-Konzentration. Die Calcium-Aufnahme kann dabei über verschiedene Wege erfolgen.
Durch Stimulation mit LPA wird zum Beispiel der nicht-selektive Kationen-Kanal
(NSVDC-Kanal) aktiviert, wohingegen PMA dazu führt, dass der ω-agatoxin-TK-sensitive,
Cav2.1-like (P/Q-type)-Ca2+-Kanal geöffnet wird (Andrews, Yang, & Low, 2002). Der zweite
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Die Rolle roter Blutzellen bei der Thrombusbildung
Mechanismus der zur Exposition von Phosphatidylserin führt, beruht auf einer direkten
Aktivierung der Proteinkinase Cα. Dieser Zusammenhang konnte deutlich bei der
Untersuchung der roten Blutzellen nach Behandlung mit PMA beobachtet werden. Durch
Untersuchungen von roten Blutzellen aus Schafen, denen das Enzym Scramblase fehlt,
konnte ein weiterer Mechanismus identifiziert werden. Hierbei kommt es vermutlich zur
Einlagerung von LPA in die Membran was einen Lipid-Flop von Phosphatidylserin von der
Membraninnenseite zur Membranaußenseite bewirkt.
5.
Zusammenfassung
Durch die Exposition von Phosphatidylserin auf der Zellmembran kommt es zur Adhäsion der
roten Blutzellen an die Endothelzellen oder zum Aneinanderheften der roten Blutzellen
untereinander. Die Mechanismen, die dieser Exposition zu Grunde liegen sind sehr komplex
und noch nicht vollständig aufgeklärt. Es konnte aber nachgewiesen werden, dass die
intrazelluläre Ca2+-Konzentration und die Proteinkinase C dabei von großer Bedeutung sind.
Des Weiteren konnte in zusätzlichen Versuchen gezeigt werden, dass auch weitere Faktoren,
wie zum Beispiel die K+-Konzentration, das Zellvolumen, aber auch die Ca2+-Pumpe ebenfalls
einen Einfluss auf die Phosphatidylserin-Exposition ausüben.
Auch wenn die grundlegenden Prozesse noch nicht vollständig aufgeklärt sind, bieten diese
neue Erkenntnisse, die zur Adhäsion von roten Blutzellen führen, neue Möglichkeiten, die
sowohl in Bezug auf die Therapie, als auch zur Prävention der Thrombusbildung verwendet
werden können.
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Die Rolle roter Blutzellen bei der Thrombusbildung
6.
Literaturverzeichnis
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