Löslicher Interleukin-2-Rezeptor-α als möglicher prognostischer
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Aus der Abteilung für Gastroenterologie und Hepatologie der Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil Bochum Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum Leitender Arzt: Prof. Dr. med. B. May Löslicher Interleukin-2-Rezeptor-α als möglicher prognostischer Marker des virologischen Ansprechens einer Therapie mit PEG-Interferon-alpha-2b und Ribavirin bei Patienten mit chronischer Hepatitis C, die auf eine vorangegangene Therapie mit Interferon-alpha und Ribavirin nicht angesprochen haben (NonResponder) Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Henning Henke aus Dortmund 2001 Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: Prof. Dr. med. B. May Koreferent: Prof. Dr. med. W. Schmiegel Tag der mündlichen Prüfung: 19.11.2002 2 Meinen lieben Eltern und meiner lieben Frau in herzlicher Dankbarkeit 3 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 6-7 a. Zytokine 8-10 I. Löslicher Interleukin-2-Rezeptor 10-11 II. sIL-2R-α bei Patienten mit HCV 11-14 b. Immunbiologie der HCV-Infektion 14-16 c. Therapie der Hepatitis C 16-17 I. Interferon 17-20 II. PEG-Interferon 21-22 III. Ribavirin 23 IV. Kombinationstherapie 23-24 2. Methodik a. Patienten 25-27 b. Durchführung 28-29 c. Untersuchungsverfahren 30-32 d. Statistik 33 3. Ergebnisse 34-39 4. Diskussion 40-47 5. Zusammenfassung 48 6. Literaturverzeichnis 49-65 4 Abkürzungsverzeichnis DNA Desoxyribonukleinsäure ELISA Enzyme-linked immuno sorbent assay HCC Hepatozelluläres Karzinom HCV Hepatitis C Virus IFN Interferon IL Interleukin MHC Major Histocompatibility Complex NANBH Non-A-, Non-B-Hepatitis NK Natürliche Killerzellen NS Nicht-Strukturprotein PCR Polymerase-Kettenreaktion PEG Polyethylenglykol PEG-IFN pegyliertes Interferon RNA Ribonukleinsäure sIL-2R-α löslicher Interleukin-2-Rezeptor-α SVR sustained virological response TH T-Helferzellen 5 1. Einleitung Die chronische Hepatitis C ist eine der häufigsten Infektionskrankheiten. Weltweit sind schätzungsweise 170 Millionen Menschen mit dem Hepatitis C-Virus ( HCV ) infiziert [1]. In der Bundesrepublik Deutschland sind es ca. 0,5 – 1 Millionen Menschen [2]. Ein chronischer Verlauf tritt bei ca. 75 – 85 % der HCV-Infizierten auf. Eine Leberzirrhose entwickelt sich bei 15 – 25 % der chronisch Infizierten nach 10 – 20 Jahren [3, 4]. Meist auf dem Boden einer Leberzirrhose treten als Spätkomplikationen mit einer Inzidenz von 1 - 6% hepatozelluläre Karzinome ( HCC ) auf [5, 6, 7]. Mit der Einführung einer Therapie mit Interferon-α konnte das Therapieziel einer dauerhaften Viruselimination erstmals bei einer geringen Zahl von Patienten erreicht werden. Durch eine Kombinationstherapie mit Interferon-alpha und Ribavirin konnte die dauerhafte virologische Ansprechrate mehr als verdoppelt werden. Dennoch können von dieser Therapie nur etwas mehr als die Hälfte aller Behandelten langfristig profitieren. Neuere Therapieregime beinhalten die Verwendung von pegyliertem Interferon kombiniert mit Ribavirin. Diese Therapie scheint speziell einer Untergruppe der Patienten einen besseren Erfolg zu versprechen. Da diese Therapien nicht nur sehr kostenintensiv, sondern insbesondere auch reich an Nebenwirkungen und somit für den Patienten sehr belastend sind, werden prädiktive Parameter gesucht, welche eine Aussage bezüglich eines virologischen Ansprechens ermöglichen sollen. In diesem Zusammenhang kommt der Bestimmung von Zytokinen und ihrer Rezeptoren ein besonderes Gewicht zu. 6 Untersuchungen zeigten dabei bei einer Monotherapie mit Interferon-α meßbare Unterschiede in den Serumkonzentrationen von löslichem Interleukin-2Rezeptor-α ( sIL-2R-α ) bei Respondern und Non-Respondern. Ziel der vorliegenden Untersuchung war es festzustellen, ob es bei der Therapie der chronischen HCV-Infektion mit PEG-Interferon ( PEG-IFN ) und Ribavirin zu quantifizierbaren Veränderungen des sIL-2R-α-Plasmaspiegels kommt und ob dem sIL-2R-α eine prognostische Aussagekraft bezüglich des Ansprechens auf diese Therapie zukommt. Die Untersuchung erfolgte bei Non-Respondern, einer speziellen Patientenuntergruppe, bei denen nach einer vorangegangenen Therapie mit Interferon-α ( IFN-α ) und Ribavirin weder eine Normalisierung der Transaminasen noch eine Negativierung der HCV-RNA erreicht werden konnte. 7 1.a. Zytokine Seit einigen Jahren versucht man durch die Bestimmung von Zytokinen weiteres Verständnis von pathophysiologischen Vorgängen bei den verschiedensten Erkrankungen zu gewinnen. Bei der chronischen HCV-Infektion wurden Zytokine im Plasma und in der Leber bestimmt, um Einblicke in die Immunbiologie bei der Therapie der HCV-Infektion zu erhalten. Weiterhin hat man auch die therapeutische Gabe von Zytokinen mit dem Ziel einer Viruselimination untersucht. Zytokine sind regulatorische Proteine, die von verschiedenen Zellen des Immunsystems unter physiologischen und pathologischen Bedingungen gebildet werden und im Gegensatz zu Hormonen auf zahlreiche Zielzellen des Immunsystems einwirken. In der Regel werden sie nur nach Bedarf, d.h. nach Stimulation produziert. Zytokine binden an z.T. hochaffine Rezeptoren und aktivieren vorzugsweise Nachbarzellen in kurzer Distanz. In der Regel handelt es sich um Polypeptide von 5 – 100 kDa. Ausgehend von der Rezeptorbindung gelangen über Signaltransduktionswege Informationen in den Zellkern. Dort werden auf Transkriptionsebene verschiedene Gene reguliert. Durch diese Genregulation werden biologische Aktivitäten ermöglicht, z.B. zellspezifische Funktionen, Proliferation, Migration, Adhaesion und Apoptose. Über Wechselwirkungen der Zytokine untereinander besteht ein komplexes Zytokinnetzwerk. Dieses ermöglicht es Zellen auf pathogene Ereignisse zielgerecht abgestimmt zu reagieren [8, 9, 10]. Die Einteilung der Zytokine erfolgt historisch anhand ihrer biologischen Eigenschaften. Nach dieser Art der Zytokinklassifikation kann anhand der Bezeichnung bereits etwas über die Funktion des Zytokins abgeleitet werden. Allerdings hat sich gezeigt, daß die meisten Zytokine neben ihren Haupteigenschaften 8 weitere Funktionen ausüben können. Neben den Interferonen gehören die Interleukine zu den erstbeschriebenen Zytokinen [11]. Als erste Zytokine wurden die Mediatoren Interleukin-1 ( IL-1 ) und Interleukin-2 ( IL-2 ) Ende der siebziger Jahre als Interleukine aufgrund ihrer Eigenschaft, die Lymphozytenproliferation zu stimulieren, bezeichnet. Später stellte sich heraus, daß auch die Interleukine nicht nur eine, sondern pleotrope, multifunktionelle Funktionen besitzen. T-Helferzellen werden hinsichtlich ihrer Zytokinproduktion in Subklassen eingeteilt: TH1-Zellen produzieren Typ-1-Zytokine wie IL-2, IFN-γ und Tumor- nekrosefaktor-β. Sie regulieren die Immunantwort vom verzögerten Typ, aktivieren Makrophagen und die antikörperabhängige zellmediierte Zytotoxizität. TH2-Zellen produzieren Typ-2-Zytokine wie IL-4, IL-5, IL-10 und IL-13. Sie mediieren die humorale Immunantwort gegen extrazelluläre Pathogene wie z.B. Bakterien. Zusätzlich hemmen TH2-Zellen die Typ-1-Zytokin-Antwort [12]. TH0-Zellen produzieren überlappende Zytokinprofile. Wie die Interferone werden auch Zytokine aufgrund ihrer antitumoralen Wirkungen in der Onkologie eingesetzt [13]. Bei der chronischen Hepatitis C wurde die therapeutische Gabe von rekombinantem IL-12 von Zeuzem und Mitarbeitern in einer Phase I/II-Studie untersucht [14]. Diese Therapie zeigte sich allerdings der herkömmlichen IFN-Therapie unterlegen. Es konnte keine Viruselimination erreicht werden. Die Leber stellt im Zytokinnetzwerk ein zentrales Organ dar. Die Hepatozyten tragen Rezeptoren für verschiedene Zytokine wie IL-1-α, IL-1-β, IL-6, Tumornekrosefaktor-α und andere. Weiterhin sind nicht-parenchymatöse Zellen der 9 Leber wie z.B. die Kupfferschen Sternzellen in der Lage, proinflammatorische Zytokine zu produzieren [15]. 1.a.I. Löslicher Interleukin-2-Rezeptor-α α (sIL-2R-α α) Die biologischen Aktivitäten der Zytokine werden jeweils nach Bindung an einen hochaffinen Rezeptor ausgelöst. IL-2 bindet an einen spezifischen membranständigen IL-2-Rezeptor. Der zunächst als T-Zell-Wachstumsfaktor beschriebene Faktor IL-2 ist ein Polypeptid aus 133 Aminosäuren von 15,4 kDa. Es handelt sich um ein Zytokin, welches von mitogen- oder antigen-aktivierten Lymphozyten freigesetzt werden kann und selbst T-Lymphozyten aktiviert, sowie die Proliferation IL-2-Rezeptor-positiver Zellen induziert. Zusätzlich aktiviert IL-2 NK-Zellen und zytotoxische T-Zellen. Dies hat zum therapeutischen Einsatz von rekombinantem IL-2 in der Tumortherapie, insbesondere bei Nierenzellkarzinom und malignem Melanom geführt [13]. Bei Patienten mit Lungenmetastasen von Nierenzellkarzinomen wird es als Inhalat eingesetzt [16]. Als Teil des Zytokinnetzwerkes wird die IL-2-Produktion nach Aktivierung und Proliferation von TH-Zellen durch IL-1 induziert. Der spezifische membranständige IL-2-Rezeptor ist ein Heterotrimer aus drei unterschiedlichen Glykoproteinketten ( α-, β-, γ-Kette ). Hierbei besitzt die α-Kette eine niedrige Bindungsaffinität zu IL-2, die längere βKette eine hohe Affinität. Die γ-Kette kann allein kein IL-2 binden, konvertiert jedoch die α- und β-Kette und somit den gesamten Rezeptor zu einer deutlich höheren Bindungsaffinität. 10 Für die Signaltransduktion spielt in erster Linie der IL-2-Rezeptor-β und partiell IL-2R-γ die entscheidende Rolle [13]. Neben der membranverankerten Form des IL-2-Rezeptors läßt sich im Serum nach natürlicher proteolytischer Spaltung IL-2R-α in löslicher Form nachweisen. Weil die α-Kette alleine aufgrund ihrer schwachen Bindungsaffinität nur einen schwachen Inhibitor von IL-2 darstellt, ist die biologische Funktion von sIL-2R-α zu großen Teilen unklar. Erhöhte Serumspiegel von sIL-2R-α korrelieren jedoch mit erhöhten IL-2Spiegeln und mit erhöhter T-Zellaktivierung [12, 17]. Kinder unter 15 Jahren haben gegenüber Erwachsenen signifikant erhöhte sIL2R-α-Serumspiegel; geschlechtsspezifische Unterschiede zwischen Frauen und Männern gibt es nicht [18]. Bestimmungen des sIL-2R-α werden nicht nur zum besseren Verständnis der Immunmodulation bei der Therapie von chronischen Hepatitiden durchgeführt. So lassen sich erhöhte sIL-2R-α-Serumspiegel auch bei anderen Viruserkrankungen [19], bei bestimmten Tumorerkrankungen wie dem malignen Melanom [20], bei kardiologischen [21, 22] und neuro-psychiatrischen Erkrankungen [23, 24] nachweisen. 1.a.II. sIL-2R-α α bei Patienten mit HCV Über signifikant gegenüber Gesunden erhöhte sIL-2R-α-Serumspiegel bei HCVPatienten wurde von verschiedenen Autoren berichtet [25, 26, 27, 28, 29]. Die erhöhten sIL-2R-α-Serumspiegel sind Ausdruck der in vivo Aktivierung von TLymphozyten [30]. 11 Dabei unterscheiden sich laut Kawakami [28] bezüglich des erhöhten sIL-2R-αSerumspiegels asymptomatische HCV-Träger nicht von Patienten mit aktiver chronischer Hepatitis oder mit HCV-assoziierter Leberzirrhose. Verschiedene Arbeitsgruppen untersuchten den Einfluß einer IFN-Therapie auf die peripheren sIL-2R-α-Serumspiegel. Dabei wurden unterschiedliche Ergebnisse erhoben. Sugimura et al. [31] sahen unter IFN-Therapie einen signifikanten Anstieg der sIL-2R-α-Serumspiegel nach 24 Wochen. Obwohl die sIL-2R-α-Spiegel bei Respondern weniger anstiegen als bei Non-Respondern war dieser Unterschied nicht signifikant. Naveau et al. [25] konnten 4 Wochen nach Therapiebeginn mit IFN bei den Non-Respondern einen signifikant höheren sIL-2R-α-Serumspiegel gegenüber dem Therapiebeginn nachweisen. Bei den Respondern zeigte sich kein signifikanter Anstieg des sIL-2R-α-Serumspiegels nach 4 Wochen gegenüber den Ausgangswerten. In den darauffolgenden Wochen kam es zu einer beständigen Abnahme des sIL-2R-α-Serumspiegels unter IFN-Therapie. Dabei zeigte sich nach 72 Wochen bei den Respondern ein gegenüber den Ausgangswerten signifikant erniedrigter sIL-2R-α-Serumspiegel. Grungreiff et al. [26] bestimmte bei Respondern unter IFN-Therapie eine vor Therapie 40 % höhere sIL-2R-α-Serumkonzentration gegenüber einem Normalpersonenkollektiv. Die mittlere sIL-2R-α-Serumkonzentration bei Non- Respondern lag 4-fach höher als bei der Kontrollgruppe. Unter der Therapie zeigte sich bei den Respondern ein Abfall des sIL-2R-α-Serumspiegels um 40 Prozent. Morishima et al. [32] erhoben als Hauptbefund ihrer Untersuchungen bei Respondern nach Therapie mit IFN gegenüber den Ausgangskonzentrationen 12 erniedrigte sIL-2R-α-Serumspiegel; demgegenüber waren die sIL-2R-α-Serumspiegel der Non-Responder nach Therapieende weiterhin signifikant erhöht. Bei Hayashi et al. [27] stiegen die sIL-2R-α-Serumspiegel aller Patienten unter IFN-Therapie an. 6 Monate nach Therapieende lagen die sIL-2R-α-Serumspiegel der Responder im Bereich der Normalpatienten. Die Non-Responder zeigten sIL-2R-α-Serumspiegel, die noch über den Ausgangswerten vor Therapie lagen. Es läßt sich feststellen, daß eine IFN-Therapie zu Veränderungen der sIL-2R-αSerumkonzentrationen bei Patienten mit chronischer HCV-Infektion führt. Die zum Teil unterschiedlichen Ergebnisse sind möglicherweise auf die unterschiedlichen IFN-Dosierungen, die unterschiedliche IFN-Therapiedauer sowie insbesondere auf die unterschiedlichen Beobachtungsintervalle zurückzuführen. Die Art der Veränderung der sIL-2R-α-Serumspiegel scheint abhängig von der Dauer der Therapie zu sein. Je länger die Beobachtungsdauer, desto mehr unterschieden sich die sIL-2R-α-Serumspiegel von Respondern und NonRespondern. Unter IFN-Therapie kommt es bei den Non-Respondern zunächst zu einem höheren Anstieg der sIL-2R-α-Serumspiegel als bei Respondern. Bei längeren Beobachtungszeiträumen zeigt sich bei beiden Gruppen ein Abfall der sIL-2R-αSerumspiegel. Dieser ist bei den Respondern deutlich höher als bei den NonRespondern. Die sIL-2R-α-Serumspiegel von Respondern nähern sich nach Therapie denen von Normalpersonen an. Bei Grungreiff et al. [26] zeigte sich zudem bei den Non-Respondern vor Therapie ein signifikant erhöhter sIL-2R-α-Serumspiegel im Vergleich zu den Respondern. Es bleibt damit festzuhalten, daß es unter IFN-Therapie zunächst zu einer Verstärkung der TH-1-Zytokinantwort kommt. Je niedriger die sIL-2R-α-Serum- 13 spiegel zu Beginn der Therapie liegen, um so eher scheint eine HCV-RNANegativierung zu gelingen. Interessanterweise bleiben die sIL-2R-α-Serumspiegel auch nach Negativierung der HCV-RNA erhöht, um dann im Verlauf langsam abzufallen. Somit scheint auch bei negativer HCV-RNA eine Aktivierung des Immunsystemes vorzuliegen. All diese Ergebnisse ließen eine Untersuchung des Verlaufes der sIL-2R-αPlasmaspiegel unter aktueller Therapie mit PEG-IFN und Ribavirin interessant erscheinen, insbesondere unter dem Gesichtspunkt, daß es sich um bereits vorbehandelte Patienten handelte. Die bekannten Ergebnisse unter IFNMonotherapie ließen auch unter der modernen Kombinationstherapie meßbare Unterschiede zwischen Respondern und Non-Respondern erwarten. 1.b. Immunbiologie der HCV-Infektion Die HCV-Infektion verursacht ein großes Spektrum an verschiedenen Krankheitsmanifestationen: chronisch aktive Hepatitis, extrahepatische Organbeteiligung, Leberzirrhose und HCC. Daneben gibt es aber auch gesunde Virusträger. An all diesen Erkrankungsformen ist das Immunsystem entscheidend beteiligt. Bei der Virusabwehr werden unspezifische und spezifische Immunantwort unterschieden. Zur unspezifischen Abwehr gehören phagozytierende Zellen, Zytokine und NK-Zellen. Die spezifische Immunreaktion umfaßt die B- und T-Zellantwort. Wie bei allen Viruserkrankungen werden auch bei der HCV-Infektion B-Zellen zur Bildung von Antikörpern aktiviert. HCV-spezifische Antikörper können ab etwa der 8. Woche nach Infektion nachgewiesen werden. Meist werden Antikörper gegen das konservierte HCV-Core oder gegen Nichtstrukturprotein ( NS3 ) zuerst gebildet. Diese können bei solitärem Nachweis ein Hinweis auf eine akute Hepatitis C sein [33]. Bestimmte, für ein Erkrankungsstadium typi14 sche Antikörpermuster wie bei der Hepatitis B konnten bei der Hepatitis C nicht festgestellt werden. Ein neutralisierender Antikörper konnte bisher nicht sicher nachgewiesen werden. Nach derzeitigem Kenntnisstand scheint es somit keine Ausheilung der HCV-Infektion durch HCV-spezifische Antikörper zu geben. Zwar können HCV-spezifische Antikörper nach Ausheilung der Infektion meist dauerhaft im Serum nachgewiesen werden [34], im Tierversuch können sie aber eine Reinfektion nicht verhindern [35]. Sie haben also somit keinen protektiven Effekt. Die antivirale T-Zellantwort umfaßt ein komplexes Netzwerk von Zellinteraktionen: Nach einer Antigenpräsentation durch eine antigenpräsentierende Zelle kommt es zu einer Aktivierung von CD4+-TH-Zellen ( TH-Zellen ). Diese regulieren und steuern über Zytokine die weitere Immunantwort. Sie unterstützen die Entwicklung von spezifischen zytolytischen CD8+-T-Zellen, aktivieren Makrophagen und steuern Qualität und Quantität der humoralen Immunantwort. Untersuchungen haben gezeigt, daß der T-Zell-vermittelten zellulären Immunität eine zentrale Rolle bei der Heilung einer HCV-Infektion zukommt. Bei Patienten mit akuter Hepatitis C ist eine starke HCV-spezifische CD4+-THZell-Antwort, welche vor allem gegen Nichtstrukturproteine ( NS3 und NS4 ) gerichtet ist, mit der Viruselimination assoziiert. Fehlt diese spezifische, TH1dominierte antivirale T-Zell-Aktivität oder geht sie verloren, kommt es zur Entwicklung einer chronischen Hepatitis C [36, 37]. Patienten mit chronischer HCV-Infektion zeigen zwar zum Teil eine polyklonale + multispezifische CD4 -TH-Zell-Antwort, ein hoher Prozentsatz ( 41 – 56 % ) der Patienten zeigt jedoch keine meßbare wertige CD4+-TH-Zell-Reaktion [38, 39, 40]. Bezüglich der HCV-spezifischen CD8+-T-Zell-Antwort ist untersuchungs- technisch bedingt noch vieles unklar. Eine frühzeitig einsetzende polyklonale 15 und multispezifische CD8+-T-Zellreaktion korrelierend mit einer TH-Zell-Antwort kann möglicherweise entscheidend für den Verlauf der Erkrankung sein [33]. Zusammenfassend scheint die T-Zell-Antwort bei Patienten mit chronischer Hepatitis C zur Viruselimination nicht auszureichen. Bekannterweise läßt sich die HCV-spezifische TH-1/TH2-Antwort über Jahre nach Viruselimination und klinischer Remission nachweisen [33]. Ob dieses Phänomen Ausdruck des immunologischen Gedächtnisses oder für ein Verbleiben des HCV in bisher nicht identifiziertem Gewebe spricht, bleibt derzeit offen. Möglicherweise hängt jedoch ein häufiger Relapse nach zu frühzeitiger Beendigung der Therapie hiermit zusammen. Aus therapeutischer Sicht scheint eine Verschiebung der Zytokinbalance weiter in Richtung TH-1-Antwort ein zusätzlicher Therapieeffekt der Inter- feron/Ribavirin-Kombinationstherapie gegenüber der IFN-Monotherapie zu sein [41]. Ziel neuer Behandlungsansätze ist es, die fehlende oder zu schwache antivirale T-Zell-Antwort von Patienten mit chronischer HCV-Infektion zu induzieren oder zu verstärken. Eine hierzu möglicherweise notwendige therapeutische Impfung mit Virusbestandteilen ist Gegenstand weltweiter Forschung. 1.c. Therapie der Hepatitis C Primäres Behandlungsziel einer HCV-Therapie ist die Viruselimination. Ein dauerhaftes virologisches Ansprechen ( sustained virological response, SVR ) wird angenommen, wenn sechs Monate nach Therapieende keine HCV-RNA mittels PCR mehr nachweisbar ist. Von einem biochemischen Ansprechen wird bei Normalisierung der Transaminasen ( GOT, GPT ) im Serum ohne Negativierung der HCV-RNA gesprochen [42]. 16 Weitere Therapieziele sind die Verhinderung einer Fibrose und Zirrhose, eine Senkung der Inzidenz des HCC sowie der HCV-bedingten Mortalität. Kommt es nach einer primär erfolgreichen Therapie zu einem Wiederauftreten von HCV-RNA, liegt ein Relapse vor. Studien haben gezeigt, daß man bei Respondern fünf bis zehn Jahre nach Therapie nicht nur normale Transaminasen, sondern auch eine normale Leberhistologie nachweisen kann [43, 44]. Prinzipiell sollte bei jedem Patienten mit gesicherter Hepatitis C und Zeichen der Virusreplikation bei Fehlen von Kontraindikationen nach Durchführung einer Leberbiopsie eine Therapie überdacht werden. In den Evaluierungsprozeß sollten der HCV-Genotyp, die Viruslast, das biologisches Alter des Patienten und die Leberhistologie mit einbezogen werden [45]. In der Leberhistologie werden Entzündungsaktivität und Fibrosestadium mit Score-Systemen ( nach Ishak et al., [46] ) bewertet. Eine Therapieindikation ist besonders bei Fibrose-Scores von 2 oder höher gegeben [47]. 1.c.I. Interferon Noch bevor HCV als Erreger der NANBH identifiziert werden konnte, wurde bereits erstmals die Wirksamkeit von Interferon bei diesen Infizierten nachgewiesen [48]. Seitdem beruhen alle Standard-Therapieregime auf der Gabe von IFNα. Durch eine beständige Suche nach besserer Wirksamkeit und Verträglichkeit unterlagen Art, Dosierung sowie Kombination von IFN-α mit anderen Virostatika in den letzten Jahren jedoch einem beständigen Wandel. Interferone sind endogene, natürlich vorkommende, den Zytokinen zugeordnete Glykoproteine, welche als Reaktion auf einen Virusinfekt gebildet werden. Man 17 unterscheidet drei verschiedene Gruppen, die alle antivirale, antiproliferative und immunmodulatorische Wirkungen besitzen. IFN-α und IFN-β werden aufgrund ihrer gemeinsamen Abstammung als Typ-1Interferone, Interferon-γ als Typ-2-Interferon bezeichnet. IFN-α wird im wesentlichen von B-Lymphozyten und Monozyten gebildet. Es existieren mehr als 20 verschiedene Subtypen mit einem Molekulargewicht von 16 bis 27 kDa. Die Subtypen haben eine z.T. unterschiedliche antivirale Aktivität. Alle bislang entdeckten 23 Gene, welche die menschlichen alpha-Interferone kodieren, sind auf Chromosom 9 lokalisiert [49]. IFN-β wird von Fibroblasten, IFN-γ von T-Lymphozyten gebildet [50]. Die Wirkung von IFN kann erst nach Bindung an spezifische Interferonrezeptoren erfolgen ( Abbildung 1 ). Der entstehende Interferon-Rezeptorkomplex wird in die Zelle aufgenommen. Danach werden über eine Signaltransduktionskaskade die spezifischen Wirkungen vermittelt. Bisher sind drei antivirale Wirkmechanismen des Interferons bekannt [51]: Zum einen kommt es über eine IFN vermittelte Aktivierung der DoppelstrangRNA-abhängigen Proteinkinase zu einer Hemmung der viralen Translation. Der zweite bekannte antivirale Mechanismus beruht auf einer Stimulierung des Enzyms 2´-5´-Oligoadenylatsynthetase durch IFN. Diese aktiviert eine RNAse, welche Einzelstrang-RNA spaltet und damit virale RNA zerstört. Weiterhin aktivieren vorzugsweise Typ-1-Interferone sogenannte Mx-Proteine, welche die virale Transkription hemmen. Der Begriff Mx-Proteine leitet sich dabei von Tierversuchen mit Myxoviren, die zu der Entdeckung dieser Proteine geführt haben, ab. 18 Abbildung 1: Interferonwirkung auf subzellulärer Ebene modifiziert nach Maier, 1998 [50] 19 Die immunmodulatorische Wirkung von IFN-α erfolgt über eine Modulation der Zytokinexpression, welche zu einer Aktivierung von Natural-Killer-Zellen ( NKZellen ), Makrophagen und zu einer verstärkten Expression von MHC-Klasse-IProteinen, sowie zu einer Stimulierung der T-Helfer-1-( TH1 )-Zellantwort und Suppression der TH2-Zellantwort führt [52] ( Abb. 1 ). Bei der Behandlung der HCV-Infektion kommen gentechnisch hergestellte alpha-Interferone zum Einsatz. IFN-α2a und IFN-α2b unterscheiden sich in einer einzigen Aminosäure und sind sich in ihrer Wirkung ebenbürtig. Das sogenannte Konsensusinterferon ist aus den jeweils am häufigsten vertretenen Aminosäuren der verschiedenen bekannten α-Interferone zusammengesetzt und ist zu 89 % mit IFN-α2b identisch [53]. Alle drei therapeutisch eingesetzten α-Interferone besitzen eine Halbwertszeit von 8 - 11 Stunden; aufgrund dieser kurzen Halbwertszeit müssen sie mehrmals wöchentlich verabreicht werden. Die HCV-RNA weist im Serum unbehandelter Patienten nur geringgradige Schwankungen auf [54]. Unter einer Therapie mit IFN-α kommt es nach einer Latenzphase von 8 Stunden zu einem biphasischen Abfall der Virämie. In der ersten Phase von 24 – 48 Stunden nach Therapiebeginn ist dieser Abfall der HCV-RNA bis zu einer IFN-α-Dosis von 10 Mio. i.E. dosisabhängig. In der zweiten Phase nach 24 – 48 Stunden verläuft der Abfall der HCV-RNA im Serum deutlich langsamer. Diese Phase ist durch die Absterberate infizierter Zellen bestimmt und ist weniger interferonabhängig. Non-Responder zeigen in der 2. Phase meist keinen Abfall der HCV-RNA [55, 56, 57]. Die Untersuchungen zur Viruskinetik führten zu Studien mit einer zu Beginn der Behandlung höheren und täglichen Interferongabe. Hierbei zeigte sich ein Vorteil unter und am Ende der Therapie gegenüber der Standardbehandlung. Der SVR 24 Wochen nach Therapieende war bei Hochdosisinduktionstherapien jedoch nur marginal besser [58, 59]. 20 1.c.II. PEG-Interferon ( PEG-IFN ) Untersuchungen zur Pharmakokinetik und Viruskinetik zeigten, daß hohe kontinuierliche IFN-Serum-Spiegel zu einer verbesserten Viruselimination führen und möglicherweise einer viralen Resistenzbildung durch Entstehung von IFNunempfindlichen Quasispecies entgegenwirken [57, 60]. Um die Halbwertszeit der therapeutisch eingesetzten α-Interferone zu verlängern, gelang es, diese mit dem weitgehend inerten Trägermolekül Polyethylenglykol ( PEG ) zu koppeln. Die Verbindung erfolgt entweder mit einem linearen PEG von 12 kDa ( PEGIFN-α-2b, Abbildung 2 ) oder mit einem verzweigtkettigen PEG von 40 kDa ( PEG-IFN-α-2a, Abbildung 3). O O CH3O-(CH2CH2O)n-O2C-CH2CH2-C-O-N O Abbildung 2: Lineares PEG O O O mPEG-O-C-NH-CH-C-O-N (CH2)4 O O mPEG-O-C-NH Abbildung 3: Verzweigtes PEG 21 Durch die Konjugation von IFN-α mit PEG lassen sich Plasmahalbwertszeiten von 31 ± 3 Stunden ( PEG-IFN-α-2b ) bzw. 77 ± 45 Stunden ( PEG-IFN-α-2a ) erzielen [61]. Dadurch müssen sie nur einmal pro Woche subcutan injiziert werden und erzielen deutlich gleichmäßigere Wirkspiegel als bei einer herkömmlichen täglichen oder zweitäglichen Verabreichung von IFN-α. Durch die wöchentlich einmalige Gabe kommt es weiterhin zu einer Verbesserung der Patienten-Compliance. Die Pegylierung stellt dabei einen Schutz vor schneller Resorption an der Injektionsstelle, vor Metabolisierung und Proteolyse dar. Ferner wird die renale Clearance verzögert. PEG-Interferone zeigten sich in Studien bei der Monotherapie der HCVInfektion gegenüber IFN-α hinsichtlich des Therapieerfolges deutlich überlegen. Es konnte durch eine PEG-Monotherapie eine Verdoppelung der SVR gegenüber der Standard-IFN-Therapie mit einer dauerhaften Viruselimination zwischen 25 % und 39 % erreicht werden [62, 63, 64]. Nach ersten Ergebnissen zeigt sich auch eine Kombinationstherapie mit PEGIFN/Ribavirin gegenüber der herkömmlichen Kombinationstherapie bezüglich eines Ansprechens als auch eines SVR überlegen [65, 66]. Die Nebenwirkungsraten von herkömmlichem IFN und PEG-IFN sind im wesentlichen ähnlich [67]. Insbesondere mit HCV-Genotyp 1 infizierte Patienten, welche auf eine IFNTherapie die schlechtesten virologischen Ansprechraten zeigen, scheinen von einer Therapie mit PEG-IFN zu profitieren. Peg-IFN-α-2b ist seit März 2001 in Deutschland zur Kombinationstherapie der chronischen HCV-Infektion zugelassen, PEG-IFN-α-2a steht in Deutschland kurz vor der Zulassung. 22 1.c.III. Ribavirin Ribavirin ist ein Nukleosidanalogon von 244 Da mit antiproliferativen, virostatischen und immunmodulatorischen Eigenschaften. Als Wirkmechanismen des Guanosinanalogons werden eine Hemmung der viralen RNA-abhängigen Polymerase sowie eine Hemmung der Ionosin-MonoPhosphat-Dehydrogenase diskutiert [68, 69]. Als immunmodulatorische Wirkung konnte von Hultgren und Mitarbeitern 1998 eine dosisabhängige Hemmung der mRNA-Konzentration von TH1- und TH2Antwort-induzierenden Zytokinen gezeigt werden [70]. Die Ribavirin-Monotherapie führt jedoch zu keiner HCV-Replikationshemmung [71]. Hauptnebenwirkungen einer Ribavirintherapie sind eine dosisabhängige hämolytische Anämie sowie Teratogenität [72, 73]. Wegen der Akkumulation des Ribavirins in den Erythrozyten muß aus diesem Grunde eine strenge Kontrazeption mindestens 6 Monate über das Ende der Therapie hinaus durchgeführt werden. 1.c.IV. Kombinationstherapie Die IFN-α/Ribavirin-Kombinationstherapie war vor der PEG-IFN/RibavirinTherapie der Therapiestandard bei der chronischen HCV-Infektion. SVR läßt sich in 38 – 48 % erreichen [72, 74, 75, 76]. Dies entspricht etwa der doppelten SVR verglichen mit der IFN-Monotherapie. Die Kombinationstherapie mit PEG-IFN-α-2b/Ribavirin zeigt nach ersten Ergebnissen eine noch bessere SVR. Die SVR betrug ca. 80 % bei Patienten mit den HCV-Genotypen 2 und 3, bei Patienten mit Genotyp 1 konnte ohne Berücksichtigung der Viruslast eine SVR von 42 % gegenüber 33 % bei einer herkömmlichen Kombinationstherapie mit IFN/Ribavirin erreicht werden [77]. 23 Dabei war das Ergebnis bei Patienten mit HCV-Genotyp 1 abhängig von der gewählten PEG-IFN-α-2b-Dosis. Das beste Ergebnis wurde mit einer Dosis von 1,5 µg/kg KG erzielt. Die Kosteneffizienz der Kombinationsbehandlung ist für die USA nachgewiesen [78]. Ausgehend von den Literaturangaben über möglicherweise vorhandene Unterschiede des sIL-2R-α-Serumspiegels bei Respondern und Non-Respondern unter IFN-Therapie untersuchten wir den Einfluß einer Kombinationstherapie mit PEG-IFN-α-2b und Ribavirin auf die sIL-2R-α-Plasmaspiegel von Patienten mit chronischer HCV-Infektion, welche Non-Responder einer vorangegangenen Kombinationstherapie waren. Ziel der vorliegenden Arbeit war es festzustellen, ob es unter der modernen Kombinationstherapie mit PEG-Interferon und Ribavirin zu quantifizierbaren Veränderungen des sIL-2R-α-Plasmaspiegels kommt und ob dem sIL-2R-α eine prognostische Aussagekraft bezüglich des Ansprechens auf diese Therapie zukommt. 24 2. Methodik 2.a. Patienten Das Patientenkollektiv bestand aus 15 Patienten mit einer chronischen HCVInfektion. Alle Patienten waren Non-Responder auf eine vorangegangene Therapie mit IFN-α und Ribavirin. Das Durchschnittsalter des Patientenkollektives betrug 51,1 Jahre; 2 Patienten waren weiblich, 13 männlich. Der Median lag bei 50 Jahren bei einem Minimum von 33 und einem Maximum von 69 Jahren. Einschlußkriterien waren ein Alter zwischen 18 und 69 Jahren, ein Körpergewicht von mehr als 50 kg, eine kompensierte Lebererkrankung, erhöhte Transaminasen vor Therapiebeginn, sowie das Fehlen der bekannten Kontraindikationen gegen eine Therapie mit IFN-α und Ribavirin. Alle Patienten hatten nachweisbare positive HCV-Antikörper und bei allen war HCV-RNA mittels PCR im Serum nachweisbar. 12 der Patienten zeigten bei der HCV-Genotypisierung einen Genotyp 1, zwei den Genotyp 2 und einer den Genotyp 4. Bei allen Patienten bis auf einen lag vor Therapiebeginn eine aktuelle Leberhistologie vor ( Tabelle 1 und 2 ). Weiterhin wurden vor Therapiebeginn neben Größe und Gewicht auch die Begleiterkrankungen erhoben. 25 Tabelle 1: Patientenkollektiv: Geschlecht ( m = männlich, w = weiblich), Alters-, Größen- und Gewichtsverteilung, Begleiterkrankungen Pat. 1 GeAlter schlecht (Jahre) m 46 Größe (cm) 183 Gewicht (kg) 80 Pat. 2 w 62 167 73 Pat. 3 m 39 176 109 Pat. 4 w 50 160 65 Struma Pat. 5 m 64 185 89 arterielle Hypertonie Pat. 6 m 43 170 67 Pat. 7 m 48 180 83 Pat. 8 m 61 174 68 Pat. 9 m 43 170 72 Pat.10 m 52 170 73 Pat.11 w 57 156 65 Pat.12 m 69 173 75 Pat.13 m 37 182 90 Pat.14 m 63 173 76 Pat.15 m 37 184 90 26 Begleiterkrankungen Diabetes mellitus Typ 2 Diabetes mellitus Typ 1, arterielle Hypertonie arterielle Hypertonie Diabetes mellitus Typ 2, pAVK, arterielle Hypertonie arterielle Hypertonie Tabelle 2: Patientenkollektiv : Genotyp, Viruslast in Kopien/ml, Leberhistologie-Grading ( HAI 1-3: minimale chronische Hepatitis, HAI 4-6: milde chronische Hepatitis, HAI 9-12: mäßiggradige chronische Hepatitis, HAI 13-18: schwere chronische Hepatitis ), Leberhistologie-Fibrosegrad ( 0 : keine Fibrose, 1 : milde Fibrose, 2 : mäßiggradige Fibrose, 3 : schwere Fibrose, 4 : Zirrhose ) Genotyp Pat. 1 Pat. 2 Pat. 3 Pat. 4 Pat. 5 Pat. 6 Pat. 7 Pat. 8 Pat. 9 Pat.10 Pat.11 Pat.12 Pat.13 Pat.14 Pat.15 2 1b 1 1b 1b 1a 1b 1b 1a 4 1a 1b 1b 1a 2b Viruslast (Kopien/ml) 50000 360000 18000 540000 >2000000 >2000000 >2000000 >2000000 1052000 1020000 408000 670000 1620000 1192000 200000 HAI 4-6 4-6 9-12 1-3 1-3 1-3 4-6 9-12 4-6 4-6 9-12 1-3 4-6 Fibrosegrad 2 1 0 3 0 2 4 1 3 1 1 1 Alle Untersuchten waren Patienten der Berufsgenossenschaftlichen Krankenanstalten ´Bergmannsheil´ Bochum, Universitätsklinik. Die Untersuchung wurde nach Genehmigung durch die Ethikkommission der Ruhr-Universität Bochum durchgeführt ( Registrier-Nr. 1473 ). Alle Patienten wurden entsprechend aufgeklärt und haben zu dem Studienprotokoll ihre schriftliche Zustimmung gegeben. 27 2.b. Durchführung Alle Untersuchungen wurden im gastroenterologischen wissenschaftlichen Labor der Berufsgenossenschaftlichen Krankenanstalten ´Bergmannsheil´ Bochum durchgeführt. Die Patienten erhielten nach Aufklärung und Ausschluß von Kontraindikationen ab September 2000 folgendes Therapieschema: PEG-Interferon-α-2b ( PegIntron der Firma ESSEX ): Induktionsphase ( = Therapiebeginn bis Woche 8 ): 100 µg s.c. einmal wöchentlich Erhaltungsphase ( = Woche 9 bis Woche 48 ): 50 µg s.c. einmal wöchent- lich Ribavirin ( Rebetol der Firma ESSEX ): 800 mg täglich oral in 2 geteilten Dosen bis Woche 48 Den Patienten wurde im Rahmen unserer Untersuchungen vor Beginn der Medikation und 4, 8 und 12 Wochen nach Beginn der Medikation zur Bestimmung des sIL-2R-α-Plasmaspiegels venöses Blut abgenommen. Zusätzlich erfolgte eine Bestimmung der HCV-RNA 8, 24 und 48 Wochen nach Therapiebeginn. Bei den Patienten, welche bei Therapieende nach 48 Wochen einen Response zeigten, d.h. eine negative HCV-RNA in der PCR hatten, erfolgte zur Feststellung der SVR eine neuerliche Bestimmung der HCV-RNA zum Ende des 24wöchigen Nachbeobachtungszeitraumes. . 28 Material EDTA – Plasmamonovetten der Fa. Sarstedt, Numbrecht, BRD Minifuge-T der Fa. Haereus, Osterode, BRD ELISA – Plattenreader MR 5000 der Fa. Dynatech, Denkendorf, BRD humaner sIL-2R-α ELISA – Kit ´Quantikine´ der Fa. R&D Systems, Wiesbaden, BRD ( Sensitivität: minimal erkennbare sIL-2R-α-Konzentration von kleiner 10 pg/ml. Spezifität: bei Tests mit allen gängigen Zytokinen und Faktoren bei einer Konzentration von 50 ng/ml zeigte sich keine Kreuzreaktivität oder Interferenz mit sIL-2R-α. Intra-Assay Präzision: im Durchschnitt 5,6 %. Inter-Assay Präzision: im Durchschnitt 6,7 %. ) Blutentnahme und Zentrifugation Nach Desinfektion der Blutentnahmestelle mit 70%igem Äthanol und anschließender Punktion wurde den Patienten zur Bestimmung von Transaminasen und Blutbild 25 ml venöses Blut entnommen. Zur Bestimmung der HCV-RNA mittels PCR wurde dem Patientenkollektiv weiterhin vor Beginn der Medikation sowie in Woche 8, 24 und 48 nach Beginn der Therapie sowie 24 Wochen nach Therapieende eine zusätzliche Serummonovette abgenommen. Das zur Bestimmung des sIL-2R-α abgenommene EDTA-Plasma wurde jeweils sofort in der Zentrifuge bei Raumtemperatur über 10 Minuten mit 1000 x g zentrifugiert. Das gewonnene Plasma wurde sofort abpipettiert und bei – 70° C bis zur weiteren Verarbeitung eingefroren. Blutbild, Transaminasen und HCV-RNA ( mittels PCR ) wurden im Zentrallabor der Berufsgenossenschaftlichen Kliniken ´Bergmannsheil´ Bochum bestimmt ( Direktor: Prof. Dr. med. Krieg ). 29 2.c. Untersuchungsverfahren Die Bestimmung und Quantifizierung des sIL-2R-α erfolgte mit Hilfe eines Enzyme-linked immuno sorbent assay ( ELISA ). ELISA Das enzymimmunologische Testverfahren ELISA ist eines der am weitesten verbreiteten Nachweismethoden für Antigene, Antikörper und Zytokine. ELISAs zeichnen sich durch eine hohe Sensitivität und Spezifität sowie Reproduzierbarkeit aus. Ein für das zu messende Substrat spezifischer monoklonaler Antikörper ist auf einer Testmikroplatte gebunden. Das zu untersuchende Substrat wird ( z.T. nach entsprechend erforderlicher Verdünnung ) hinzugegeben. Danach wird ein Konjugat mit einem polyklonalen Antikörper für das zu messende Substrat, welcher mit einem Enzym ( Peroxidase ) verbunden ist, hinzugegeben und die Testplatte inkubiert. In dieser Zeit wird sämtliches Substrat zwischen wandständigem Antikörper und dem enzymverbundenem polyklonalen Antikörper gebunden ( Sandwich-Technik, siehe Abbildung 4 ). Ungebundenes AntikörperEnzym-Reagens wird ausgewaschen. Hiernach wird ein farbloses Chromogen zugesetzt, welches durch den Enzymanteil des Testsubstrates in ein farbiges Endprodukt umgesetzt wird. Der Test wird durch Zugabe einer Stoppsubstanz beendet. Die entstandene Farbintensität ist proportional dem jeweils gebundenen zu messenden Substrat und wird photometrisch gemessen [79]. 30 Abbildung 4: Schematische Darstellung eines ELISA mit `Sandwichtechnik` ( modifiziert nach Roitt 1987 [79] ) 31 Bestimmung von sIL-2R-α α mittels ELISA Das eingefrorene Plasma des Patientenkollektives wurde unmittelbar vor Ansatz des ELISA aufgetaut. Von allen Proben wurden je 50 µl entnommen und mit 150 µl eines dem ELISA beiliegendem Kalibrators um das 4-fache verdünnt. Mittels eines beiliegenden sIL-2R-α-Standards wurde eine Standardverdünnungsreihe angelegt. In die ELISA-Platte, welche den monoklonalen Antikörper gegen sIL-2R-α gebunden enthält, wurden dann nacheinander pipettiert: 100 µl einer gepufferten Proteinbase, 50 µl des jeweiligen Standards bzw. der jeweiligen verdünnten Patientenprobe und 100 µl eines Peroxidase-Konjugates von polyklonalem Antikörper gegen sIL-R2-α. Hiernach wurde die ELISA-Platte 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde jede ELISA-Platte 4mal mit einer Waschpufferlösung gewaschen. Anschließend wurde 200 µl Farbreagenz ( Tetramethylbenzidin ) in jede ELISA-Platten-Vertiefung pipettiert. Nach einer Inkubationszeit von 20 Minuten wurde mittels Zugabe von 50 µl einer Stopp-Lösung der entstandene Farbumschlag gestoppt. Die Extinktion wurde anschließend mittels eines ELISA-Platten-Lesegerätes photometrisch bei 450 nm gegen eine Wellenlängenkorrektur von 550 nm gemessen. Anhand der mitgelieferten Standardprobenverdünnung wurde nach photometrischer Messung durch lineare Regression eine Standardkurve ermittelt. Anhand dieser Standardkurve wurden die photometrisch ermittelten Daten in die sIL-2R-α Konzentration umgerechnet. Aufgrund der im Testansatz initial notwendigen 4-fachen Verdünnung wurden alle gemessenen Konzentrationen mit 4 multipliziert. 32 2.d. Statistik Mittels der vorliegenden Untersuchung wurde über einen gegebenen Zeitraum von 12 Wochen eine Patientengruppe zu definierten Zeitpunkten ( vor Therapiebeginn sowie 4, 8 und 12 Wochen nach Therapiebeginn ) untersucht. Zielgröße war die Bestimmung der sIL-2R-α-Konzentration. Zusätzlich wurden die Transaminasen im Serum zu diesen Zeitpunkten bestimmt. Weiterhin wurde die HCV-RNA im Patientenserum mittels PCR 8, 24 und 48 Wochen nach Therapiebeginn, sowie 24 Wochen nach Therapieende bestimmt. Eine HCV-RNA-Negativität lag vor, wenn weniger als 100 Kopien HCV pro Milliliter Serum vorlagen. Die Einflußgröße auf diese Parameter war die Therapie mit PEG-IFN und Ribavirin. Dabei wurde zwischen Patienten, welche 24 Wochen nach Therapieende HCVRNA-positiv waren ( Non-Responder ) und Patienten, die zu diesem Zeitpunkt HCV-RNA-negativ waren ( Responder mit SVR ), unterschieden. Die bestimmten Meßwerte in der Patientengruppe waren bei Anwendung des Kolmogorov-Smirnov-Testes nicht normalverteilt. Die abhängigen Variablen wurden mit Hilfe des Wilcoxon-Testes, die unabhängigen Variablen mit Hilfe des Mann-Whitney-U-Testes auf statistische Signifikanz hin untersucht. Die statistische Berechnung erfolgte unter Zuhilfenahme eines Computerprogrammes zur statistischen Datenanalyse ( SPSS Version 10 der Fa. SPSS, München, BRD ). Die Ergebnisse wurden als Median ( Minimum - Maximum ) ausgedrückt. 33 3. Ergebnisse 3.a. Virologisches Ansprechen Ein Patient schied nach zwei Wochen wegen einer aufgetretenen Thrombozytopenie aus der Studie aus. Unter der Kombinationstherapie mit PEG-IFN und Ribavirin zeigten 3 von verbliebenen 14 Patienten einen initialen Response, d.h. 8 Wochen nach Therapiebeginn konnte die HCV-RNA im Serum mittels PCR bei diesen Patienten nicht mehr nachgewiesen werden. Ein weiterer Patient zeigte nach 24 Wochen Therapiedauer einen virologischen Response. Alle 4 Responder auf die Re-Therapie mit PEG-IFN und Ribavirin waren 24 Wochen nach Therapieende weiter HCV-RNA negativ. Somit wurde ein SVR bei 4 von 14 Patienten erreicht. 3.b. Bestimmung der sIL-2R-α α-Plasmaspiegel unter Therapie Unter der Therapie mit PEG-IFN und Ribavirin wurden die sIL-2R-αPlasmaspiegel aller Patienten vor Therapiebeginn sowie 4, 8 und 12 Wochen nach Therapiebeginn bestimmt ( Abbildung 5 ). 34 3000 sIL-2R-alpha-Plasmaspiegel (pg/ml) 2500 2000 1500 1000 500 0 0 4 8 12 Wochen Abbildung 5: Zeitlicher Verlauf der sIL-2R-α α-Plasmaspiegel von NonRespondern (π π) und Respondern (= =) unter Therapie mit PEG-IFN / Ribavirin. = Median. 35 3.c. Vergleich der sIL-2R-α α-Plasmaspiegel von Respondern und NonRespondern Die sIL-2R-α-Plasmaspiegel von Respondern mit SVR nach 48 wöchiger Therapie und von Non-Respondern wurden vor sowie unter Therapie mit PEG-IFN und Ribavirin verglichen ( Tabelle 3, Abbildung 5 ). Tabelle 3: Vergleich der sIL-2R-α α-Plasmaspiegel (in pg/ml) von Respondern ( mit SVR ) nach 48 wöchiger Therapie und Non-Respondern unter Therapie mit PEG-IFN / Ribavirin vor Therapie - Therapie mit PEG-IFN/Ribavirin 4 Wochen NonResponder n= Responder (mit SVR) 8 Wochen 12 Wochen 1552,17 1711,98 1704,10 1601,77 (932,11 – 2225,26) (903,59 - 2448,74) (800,25 - 2445,80) (885,28 - 2536,22) 10 10 10 10 931,76 1126,16 1247,59 1134,22 (995,40 – 2141,47) (1070,81– 2298,08) (839,98 – 1338,75) (1046,83 – 1873,78) n= 4 4 4 4 p= 0,016 0,120 0,396 0,258 Die späteren Responder hatten vor Therapiebeginn gegenüber den späteren 36 Non-Respondern signifikant niedrigere sIL-2R-α-Plasmaspiegel. Die sIL-2R-α-Plasmaspiegel im Verlauf unter Therapie mit PEG-IFN und Ribavirin unterschieden sich nicht im Vergleich zwischen Respondern und NonRespondern. 3.d. sIL-2R-α α-Plasmaspiegel unter Therapie im zeitlichen Verlauf Der zeitliche Verlauf der sIL-2R-α-Plasmakonzentration unter Therapie wurde für Patienten, die einen SVR erreichten, getrennt von den noch immer HCVRNA-positiven Patienten untersucht. Hierzu wurden die sIL-2R-α-Plasmakonzentrationen 4, 8 und 12 Wochen nach Therapiebeginn mit den entsprechenden Plasmakonzentrationen vor Therapiebeginn verglichen ( Tabelle 4 und 5 ). Tabelle 4: Zeitlicher Verlauf der sIL-2R-α α-Plasmaspiegel ( in pg/ml ) unter Therapie mit PEG-IFN bei Patienten, bei denen sich am Therapieende noch HCV-RNA im Serum nachweisen ließ ( Non-Responder ) vor Therapie - Therapie mit PEG-IFN/Ribavirin 4 Wochen NonResponder 1552,17 (932,11 - 2225,26) n= p= 10 1711,98 8 Wochen 12 Wochen 1704,10 (903,59 - 2448,74) (800,25 - 2445,80) 1601,77 (885,28 - 2536,22) 10 10 10 0,114 0,241 0,203 37 Die Non-Responder auf die PEG-IFN/Ribavirin-Re-Therapie zeigten unter Therapie keine signifikannten Veränderungen der sIL-2R-α-Plasmaspiegel zum Ausgangswert. Tabelle 5: Zeitlicher Verlauf der sIL-2R-α α-Plasmaspiegel ( in pg/ml ) unter Therapie mit PEG-IFN und Ribavirin bei Patienten mit SVR nach 48wöchiger Therapie ( Responder ) vor Therapie - Therapie mit PEG-IFN/Ribavirin 4 Wochen 8 Wochen 12 Wochen Responder 931,76 1126,16 1247,59 (839,98 -1338,75) (1046,83 – 1873,78) (995,40 - 2141,47) n= 4 4 1134,22 (1070,81- 2298,08) 4 4 Im zeitlichen Verlauf unterschieden sich die sIL-2R-α-Plasmaspiegel von Respondern und Non-Respondern nicht signifikant ( p > 0,05 ). 38 3.e. GPT-Serumspiegel der Patienten unter Therapie Das biologische Ansprechen von Respondern und Non-Respondern unter Therapie mit PEG-IFN/Ribavirin ist in Abbildung 6 dargestellt. 160 140 120 GPT ( U/l ) 100 80 60 40 20 0 0 4 8 12 Wochen Abbildung 6: GPT-Serumspiegel von Non-Respondern ( ) und Respondern (= =) im zeitlichen Verlauf unter Therapie mit PEG-IFN / Ribavirin. = Median. 39 4. Diskussion Als einer weltweit verbreiteten Infektionskrankheit kommt der chronischen HCVInfektion nicht nur aus medizinischen, sondern auch aus sozioökonomischen Überlegungen ein besonderes Gewicht zu. Die Behandlung der chronischen HCV-Infektion konnte im Laufe der letzten Jahre ständig verbessert werden und die Ansprechraten auf eine Therapie sowie der anhaltende Behandlungserfolg im Sinne einer anhaltenden Virusfreiheit gesteigert werden. Dennoch ist die Therapie für die Mehrzahl der Patienten belastend. Bei einem Großteil der Behandelten kommt es zu keinem virologischen Ansprechen, so daß die teure und belastende Therapie umsonst durchgeführt wurde. Das Ziel weitergehender Forschungen muß somit die Suche nach weniger belastenden Behandlungsmöglichkeiten mit einem noch größeren therapeutischen Benefit sein. Hier erscheint eine weitergehende Grundlagenforschung wesentlich. Warum bei einigen Patienten die chronische HCV-Infektion ausheilt, bei dem Großteil der Patienten als chronische Infektion bestehen bleibt und warum die etablierte Therapie nicht bei allen Patienten zum Behandlungserfolg führt, bleibt vor dem Hintergrund des Immunsystems mit seiner komplexen Vernetzung von zellulären und humoralen Komponenten noch unklar. Insbesondere von der Beobachtung der Verschiebung von Zytokinprofilen von Patienten mit chronischer HCV-Infektion verspricht man sich weitergehende Erkenntnisse. 40 Immunantwort bei HCV-Infektion Der humoralen Immunantwort beim Menschen gelingt es nicht, das HCV zu eliminieren. Dieses kann unter anderem dadurch erklärt werden, daß die meisten Antikörper gegen Epitope aus einer hypervariablen Region eines HüllenGlykoproteins des HCV gerichtet sind. Neutralisierende und damit potentiell protektive Antikörper werden somit durch ein schnell mutierendes Virus ihrer Wirksamkeit enthoben. Die Zahl der Virusquasispezies nimmt dabei im Laufe der Zeit zu [80]. Demgegenüber ist im Rahmen der zellulären Immunantwort bei der HCVInfektion die zytotoxische T-Zell-Antwort relativ stark ausgeprägt, jedoch polyklonal und multispezifisch. Die meisten in der Leber HCV-Infizierter nachweisbaren, das Lebergewebe infiltrierenden T-Zellen sind in ihrer Funktion nicht HCVAntigen spezifisch [81]. Ausgehend von HCV-Antigen-aktivierten Zellen erfolgt durch Zytokine eine Aktivierung von unspezifischen T-Zellen in der Leber, welche wahrscheinlich für einen wesentlichen Teil der chronischen Entzündung verantwortlich sind. Eine Verschiebung des TH1/TH2-Quotienten wird als möglicher Faktor der Progression und Chronizität der HCV-Infektion diskutiert [12]. Dabei können bei der chronischen HCV-Infektion im peripheren Blut besonders TH2-Zytokine nachgewiesen werden [82]. Demgegenüber lassen sich jedoch bei HCV-Infizierten intrahepatisch vermehrt TH1-Zytokine, IL-2 und IFN-γ nachweisen [83]. Eine starke Korrelation zwischen TH1-Zellen, TH1-Zytokinen und der entsprechenden Leberzellschädigung bei der HCV-Infektion wird einerseits vermutet [84], andererseits scheint bei der akuten Hepatitis C eine starke gegen Nichtstrukturproteine des Virus gerichtete TH1-dominierte Zellantwort mit der Viruselimination assoziiert zu sein [36, 37]. 41 Bei der Wirkung der Kombinationstherapie mit IFN-α und Ribavirin werden neben direkten antiviralen insbesondere immunmodulatorische Effekte diskutiert. Die HCV-Elimination unter Therapie läuft in zwei Phasen ab: Nach einem raschen, dosisabhängigen Abfall der HCV-Konzentration in den ersten 24 – 48 Stunden der Behandlung folgt ein langsamer, prolongierter Abfall der HCV-Konzentration in der 2. Phase der Therapie [59, 85, 86]. Diese 2. Phase reflektiert die Absterberate der infizierten Hepatozyten. NonResponder zeigen typischerweise in dieser Phase eine konstante Virämie oder sogar ein neuerliches Ansteigen der Viruslast [87]. Cramp et al. [41] sahen in ihren Untersuchungen eine maximale Induktion der virusspezifischen T-Zellaktivität in der 4. bis 8. Woche nach Behandlungsbeginn mit deutlichen Unterschieden zwischen Respondern und NonRespondern bezüglich des Zytokinprofils. Diese Verschiebung der Zytokinbalance deuteten sie als wichtigen Faktor für die 2. Phase der Viruselimination. Cramp et al. konnten ebenfalls zeigen, daß die zusätzliche Ribavirintherapie die Zytokinbalance durch Suppression der IL-10-Produktion weiter in Richtung TH1-Antwort verschiebt. Auf die sIL-2R-α-Serumspiegel hatte Ribavirin keinen Einfluß. sIL-2R-α α bei Patienten mit chronischer HCV-Infektion Die durch die chronische HCV-Infektion ausgelöste T-Zell-Aktivierung ist u.a. charakterisiert durch die Synthese und Freisetzung von IL-2 sowie die Expression des IL-2-Rezeptors auf der Zellmembran der immunkompetenten Zellen. Die Wirkung von IL-2 ist dabei durch das Zusammenspiel von IL-2 und IL-2Rezeptor mediiert. Nach Lymphozytenaktivierung wird die α-Kette des IL-2- 42 Rezeptors in löslicher Form freigesetzt. Erhöhte sIL-2R-α-Serumspiegel reflektieren somit die in vivo Aktivierung von T-Lymphozyten [30]. Obwohl die biologische Funktion des sIL-2R-α, der für sich allein genommen nur schwache Bindungsaffinität besitzt, zu großen Teilen unklar ist, eignet sich seine Bestimmung als Marker einer TH-1-Zytokinantwort. Untersuchungen des sIL-2R-α-Serumspiegels zeigten, daß die sIL-2R-αSerumspiegel bei Patienten mit chronischer HCV-Infektion deutlich über denen gesunder Probanden lagen, unabhängig vom Ausmaß der chronischen Entzündung und dem Vorliegen einer Leberzirrhose [28]. Die erhöhten sIL-2R-α-Serumspiegel werden dabei als Ausdruck der bestehenden T-Zell-Aktivierung gesehen. Verschiedene Arbeitsgruppen untersuchten die sIL-2R-α-Serumspiegel von HCV-Patienten unter IFN-Monotherapie [25, 26, 27, 31, 32]. Dabei zeigte sich zunächst unter IFN-Therapie ein Anstieg der sIL-2R-αSerumspiegel. Nach einigen Monaten kam es bei den Respondern zu einem Abfall der sIL-2R-α-Serumspiegel bis auf das Niveau von Gesunden. Bei NonRespondern blieben die sIL-2R-α-Serumspiegel jedoch auch unter der IFNTherapie gegenüber Gesunden erhöht. Naveau et al. [25] sahen in der Veränderung der sIL-2R-α-Serumspiegel 4 Wochen nach Therapiebeginn einen spezifischen prognostischen Marker bezüglich eines SVR. Grungreiff et al. [26] sah bei einer Fallzahl von n = 10 einen deutlichen Unterschied in der Höhe der sIL-2R-α-Serumspiegel vor IFN-Therapie von Respondern und Non-Respondern. 43 Von diesen Ergebnissen ausgehend untersuchten wir die Wirkung einer PEGIFN/Ribavirin-Kombinationstherapie auf den sIL-2R-α-Plasmaspiegel von HCVpositiven Patienten, welche auf eine vorangegangene Therapie mit IFN-α und Ribavirin nicht angesprochen hatten ( Non-Responder ). Es wurden 15 Patienten prospektiv untersucht. Ein Patient mußte nach 2 Wochen wegen einer auftretenden Thrombozytopenie aus der Studie ausscheiden. 3 Patienten zeigten eine initiale Viruselimination mit negativer HCV-PCR nach 8 Wochen, ein weiterer Patient zeigte ein späteres Ansprechen mit negativer HCV-RNA nach 24 Wochen und Normalisierung der Transaminasen erst 24 Wochen nach Therapieende. Alle 4 Patienten, bei denen eine Viruselimination unter der Re-Therapie erzielt werden konnte, zeigten auch 24 Wochen nach Therapieende eine negative HCV-PCR und erreichten somit eine anhaltende Viruselimination. Von den 4 Respondern hatten 2 den Genotyp 1, einer hiervon mit hoher Viruslast. Die sIL-2R-α-Plasmakonzentration von allen Patienten wurden vor Therapiebeginn sowie 4, 8 und 12 Wochen nach Therapiebeginn untersucht. In diesem Beobachtungszeitraum kam es sowohl bei den Respondern als auch bei den Non-Respondern zunächst zu einem Anstieg der sIL-2R-α-Plasma- konzentrationen. Es zeigte sich ein signifikanter Unterschied bezüglich der sIL-2R-α-Plasmakonzentrationen von Respondern und Non-Respondern vor Therapiebeginn. Die Responder hatten signifikant niedrigere sIL-2R-α-Plasmakonzentrationen. Der Patient, der erst nach 24 Wochen eine Viruselimination zeigte, hatte den höchsten sIL-2R-α-Plasmaspiegel von den 4 Respondern. 44 Das Niveau der sIL-2R-α-Plasmakonzentrationen lag bei den Non-Respondern unter Therapie höher als bei den Respondern; dieser Unterschied war jedoch nicht signifikant. Die Veränderungen im zeitlichen Verlauf beider Gruppen zeigten ebenfalls keine Signifikanz gegenüber den Ausgangskonzentrationen vor Therapie. Die erhobenen Ergebnisse mit PEG-IFN unterscheiden sich somit nicht wesentlich von den beschriebenen Ergebnissen unter herkömmlicher IFN-Therapie. sIL-2R-α α-Plasmaspiegel als möglicher prognostischer Marker einer Therapie mit PEG-IFN / Ribavirin bei Non-Respondern Alle untersuchten Patienten waren Non-Responder unter einer vorangegangenen Therapie mit herkömmlichem IFN-α/Ribavirin. Interessanterweise zeigten die sIL-2R-α-Plasmaausgangskonzentrationen der Patienten, welche auch auf die neuerliche Therapie mit PEG-IFN/ Ribavirin nicht ansprachen, vor Therapiebeginn einen signifikanten Unterschied zu den sIL-2R-α-Plasmakonzentrationen der Patienten mit SVR. Somit erscheint bei Non-Respondern in der Primärtherapie mit IFN-α ein niedriger sIL-2R-α-Plasmaspiegel vor erneuter Therapie mit einem Therapieerfolg im Sinne eines SVR bei der Re-Therapie mit PEG-Interferon/Ribavirin assoziiert zu sein. Die bestimmten sIL-2R-α-Plasmaspiegel unter laufender Therapie zeigten demgegenüber keine prognostische Relevanz. Diese Ergebnisse sind vor allem im Hinblick auf die bekanntermaßen schlechten Ergebnisse einer Re-Therapie bei Therapieversagern interessant. Eine IFN-α-Monotherapie führt bei Non-Respondern nur in weniger als 10 % zu einem SVR. Die Literaturangaben eines SVR nach Re-Therapie mit einer IFN45 α/Ribavirin-Kombinationstherapie bei primären Non-Respondern schwanken zwischen 0 und 40 %. In einer Metaanalyse der vorliegenden kontrollierten und unkontrollierten Studien konnten Cheng et al. eine gemittelte SVR von 13,2 % ( OR 4,9 ) nach Re-Therapie bei Non-Respondern bestimmen [88, 89, 90, 91]. Das Ansprechen bei 4 von insgesamt 15 Patienten in unserer Untersuchungsgruppe läßt unter einer Kombinationstherapie von PEG-Interferon/ Ribavirin bei Non-Respondern ein besseres Ergebnis erwarten. Erste veröffentlichte Arbeiten zu einer Re-Therapie mit PEG-Interferon/ Ribavirin zeigen hier gegenüber einer Re-Therapie mit einer IFN-α/Ribavirin-Kombinationstherapie einen deutlichen Vorteil für die Kombinationstherapie mit PEG-IFN, abschließende Ergebnisse stehen zumeist noch aus [92, 93, 94]. Um bei den insgesamt schlechten Ergebnissen einer Re-Therapie bei NonRespondern dem Großteil der Patienten eine belastende Therapie, welche zu keiner Viruselimination führt, zu ersparen, ist ein aussagekräftiger prognostischer Marker wünschenswert. Therapeutisch relevante, unabhängige prognostische Faktoren bezüglich eines Therapieansprechens konnten im Rahmen internationaler Multicenter-Studien zur Kombinationstherapie bestimmt werden [72, 74]. Als prognostisch günstig wurden hierbei das Vorliegen von HCV-Genotyp 2 oder 3, eine niedrige Viruslast ( < 2 Mio. Kopien/ml bzw. < 800000 IU/ml ), ein Alter jünger als 40 Jahre, weibliches Geschlecht sowie ein geringer Fibrosegrad in der Leberhistologie bestimmt. Liegen alle prognostisch günstigen Kriterien vor, konnte die Wahrscheinlichkeit einer anhaltenden Remission nach IFN/Ribavirin-Kombi- nationstherapie mit ca. 80% bestimmt werden. Bei Patienten mit allen ungünstigen Faktoren lag diese Wahrscheinlichkeit bei 20 % [74]. Keiner dieser prognostischen Marker kann jedoch allein einen SVR voraussagen. Berg et al. konnten im Rahmen einer deutschen Multicenter-Studie zeigen, daß bei einem Abfall der HCV-Virämie innerhalb der ersten 4 Wochen nach Thera- 46 piebeginn um weniger als 75 % ein Non-Response verläßlich vorausgesagt werden kann [95]. Als prognostischer Marker bezüglich eines Ansprechens einer Therapie mit IFN/Ribavirin hat nach Zeuzem et al. ein Abfall der HCV-RNA um mehr als 3 Logarithmusstufen bzw. ein negativer HCV-RNA-Nachweis 4 Wochen nach Behandlungsbeginn die stärkste Aussagekraft. Dieses Ergebnis korreliert mit dem SVR [86]. Naveau et al. konnten 1999 zeigen, daß die Veränderung des sIL-2R-αSerumspiegels 4 Wochen nach Therapiebeginn eine noch höhere Spezifität bezüglich eines SVR nach IFN-Monotherapie als der Abfall der HCV-RNA zu diesem Zeitpunkt besitzt [25]. Die Ergebnisse unserer Untersuchung deuten darauf hin, daß die Bestimmung des sIL-2R-α-Plasmaspiegels bei Non-Respondern vor einer Re-Therapie mit PEG-IFN/Ribavirin möglicherweise einen sinnvollen prognostischen Marker darstellt. Die Patienten, welche ein dauerhaftes virologisches Ansprechen auf die ReTherapie mit PEG-IFN/Ribavirin zeigten, unterschieden sich bezüglich des sIL2R-α-Plasmaspiegels vor Therapiebeginn signifikant von den neuerlichen NonRespondern. Eine Überprüfung dieser Ergebnisse in einer Studie mit größeren Fallzahlen sowie unter gewichtsadaptierter Therapie erscheint hier wünschenswert. 47 5. Zusammenfassung Bei Patienten mit chronischer Hepatitis C verspricht man sich von einer Untersuchung der Zytokinmuster unter Therapie weitergehende Erkenntnisse. Insbesondere bei Non-Respondern nach einer Primärtherapie mit Interferon werden prognostische Marker gesucht, welche einen virologischen Response bei einer Re-Therapie voraussagen können. Wir untersuchten Patienten mit chronischer Hepatitis C, welche auf eine vorangegangene Therapie mit Interferon-α und Ribavirin nicht angesprochen hatten. Bei diesen Non-Respondern erfolgte eine Re-Therapie mit PEG-Interferon-α-2b und Ribavirin. 4 von 15 Patienten zeigten einen Therapieerfolg mit SVR. Bei einem Patienten mußte die Behandlung bei Thrombozytopenie abgebrochen werden. Mittels ELISA wurden die sIL-2R-α-Plasmaspiegel der Patienten vor und unter Therapie bestimmt. Bei den Patienten, welche auf die Re-Therapie erneut nicht ansprachen, zeigte sich vor Therapiebeginn ein signifikanter Unterschied in der Höhe des sIL-2R-αPlasmaspiegels zu den Respondern. Ein deutlich erhöhter sIL-2R-α-Plasmaspiegel bei Non-Respondern einer vorangegangenen Therapie scheint somit möglicherweise ein negativer prognostischer Marker eines virologischen Ansprechens auf eine Re-Therapie mit PEGInterferon-α-2b und Ribavirin zu sein. Weitere Untersuchungen zur Überprüfung der Aussagekraft des sIL-2R-αPlasmaspiegels bezüglich der anhaltenden virologischen Response sollten bei größeren Fallzahlen angestrebt werden. 48 6. Literaturverzeichnis 1] WHO Hepatitis C: global prevalence. Wkly Epidemiol Rec 72;341-4 (1997). 2] Heintges T., Niederau C., Häussinger D. Epidemiologie und Übertragungswege der HCV-Infektion. In: Häussinger, D., Niederau, C.: Hepatitis C. Blackwell Verlag Oxford 1997. 3] Seef L.B., Buskell B.Z., Wright E.C. et al. 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Müthing Schulausbildung 1972-1976 Benno-Grundschule, Dortmund 1976-1980 Bert-Brecht-Gymnasium, Dortmund 1980-1985 Ernst-Barlach-Gymnasium, Castrop-Rauxel 21.05.1985 Abitur Studium 1985-1991 Studium der Humanmedizin an der Ruhr-Universität Bochum 25.08.1987 Physikum 25.08.1988 1. Staatsexamen 10.09.1990 2. Staatsexamen 1990- 1991 Praktisches Jahr im Marienhospital Herne 68 08.11.1991 3. Staatsexamen Berufliche Tätigkeiten und Weiterbildung 02/1992-07/1993 Arzt im Praktikum in der Medizinischen Klinik der Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum Marienhospital Herne, Chefarzt Prof. Dr. Sturm. Davon 15 Monate im Rahmen des Zivildienstes 01.08.1993 Approbation als Arzt 08/1993-07/2001 Assistenzarzt in der Medizinischen Abteilung des St. Vincenz-Krankenhauses Datteln, Chefärzte Prof. Dr. Grün (Gastroenterologie) und Dr. Lenga (Kardiologie) 23.01.1999 Facharzt für Innere Medizin 16.09.2000 Erlangung der Schwerpunktbezeichnung Gastroenterologie seit 07/2001 Arzt in der Weiterbildung in der Abteilung für Gastroenterologie und Hepatologie der Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil Bochum 69
