Untersuchungen zur Funktion des murinen Proteins EFhd2
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Untersuchungen zur Funktion des murinen Proteins EFhd2/Swiprosin-1 in der B Zellentwicklung und Immunantwort in vivo Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. vorgelegt von Sebastian Brachs aus Bamberg Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der FriedrichAlexander-Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 30.4.12 Vorsitzender der Promotionskommission : Prof. Dr. Rainer Fink Erstberichterstatter: Prof. Dr. Hans-Martin Jäck Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Falk Nimmerjahn Numquam autem invenietur, si contenti fuerimus inventis. Seneca der Jüngere Epistulae morales ad Lucilium, 33,10 Inhaltsverzeichnis Inhalt 1. Zusammenfassung.............................................................................1 2. Summary .............................................................................................2 3. Einleitung ............................................................................................3 3.1. Das adaptive Immunsystem.......................................................................... 3 3.1.1. Die humorale Immunabwehr ..................................................................................3 3.1.2. Entwicklung der B Lymphozyten ............................................................................4 3.1.3. B Zellaktivierung, Plasmazellen und Gedächtnis B Zellen .....................................8 3.2. EFhd2 ............................................................................................................ 14 3.2.1. Namensgebung und Entdeckung .........................................................................14 3.2.2. Gen- und Proteinstruktur von EFhd2....................................................................14 3.2.3. Kalzium-bindende EF-Hand Proteine ...................................................................16 3.2.4. Expression, Vorkommen und Regulation von EFhd2...........................................16 3.2.5. Funktionen von EFhd2 .........................................................................................18 3.2.6. EFhd2 in B Lymphozyten .....................................................................................18 4. Fragestellung....................................................................................20 5. Ergebnisse ........................................................................................21 5.1. Monoklonale EFhd2 Antikörper .................................................................. 21 5.1.1. Hintergrund...........................................................................................................21 5.1.2. Immunisierung und Screening der Mausseren.....................................................21 5.1.3. Screening und Charakterisierung der fusionierten und der subklonierten Hybridomzellen...............................................................................................................23 5.1.4. Kartierung der Epitopbindungsstelle EFhd2-spezifischer Antikörper ...................25 5.1.5. EFhd2-spezifische Antikörper in der Immunfluoreszenz ......................................26 5.2. Konditionale EFhd2 defiziente Mauslinie................................................... 27 5.2.1 Hintergrund............................................................................................................27 5.2.2. Planung des Targeting .........................................................................................27 5.2.3. Targeting ..............................................................................................................30 5.2.4. Southern Blot Screening der ESZ Klone ..............................................................31 5.2.5. Injektion des ESZ Klons 5.2D...............................................................................33 5.3. Konstitutive EFhd2 defiziente Mauslinie.................................................... 34 5.3.1. Hintergrund...........................................................................................................34 5.3.2. Targeting ..............................................................................................................34 Inhaltsverzeichnis 5.3.3. Southern Blot Verifizierung des ESZ Klons AD1 ..................................................35 5.3.4. Injektion des ESZ Klons AD1 ...............................................................................37 5.3.5. Verifizierung AD1 homozygoter Mäuse ................................................................38 5.4. Analyse der EFhd2 defizienten Mauslinie.................................................. 39 5.4.1. Proteinexpression im ESZ Stadium......................................................................39 5.4.2. LacZ Expression im Gehirn ..................................................................................40 5.4.3. EFhd2 Expression in peritonealen Zellen des B1a Phänotyp ..............................41 5.4.4. Expressionsänderung von EFhd1 infolge der EFhd2 Defizienz ...........................42 5.4.5. Vererbung des AD1 Allels ....................................................................................43 5.4.6. Analyse der Lebensdauer von EFhd2 defizienten Mäusen ..................................44 5.4.7. Durchflusszytometrische Analysen lymphoider Zellstadien immunrelevanter Organe in EFhd2 defizienten Mäusen ............................................................................45 5.4.7.1. Analyse des Knochenmarks ..........................................................................45 5.4.7.2. Analyse des Thymus .....................................................................................47 5.4.7.3. Analyse der Milz und der inguinalen Lymphknoten .......................................49 5.4.7.4. Analyse der Peritonealhöhle..........................................................................52 5.4.8. Interaktion von EFhd2 und Kalzium......................................................................54 5.4.8.1. In vitro Kalziumbindungsfähigkeit des EFhd2 Proteins .................................54 5.4.8.2. Messung des Kalziumfluxes in Primärzellen nach BZR Stimulation .............55 5.4.9. IgM Oberflächenexpression EFhd2 defizienter B Zellen nach LPS Stimulation...60 5.4.10. Immunglobulinserumspiegel EFhd2 defizienter Mäuse......................................61 5.4.10.1. Natürliche Immunglobulinserumspiegel.......................................................61 5.4.10.2. Autoantikörper .............................................................................................62 5.4.11. Immunisierungen ................................................................................................63 5.4.11.1. T Zell-unabhängige Immunisierungen .........................................................64 5.4.11.1.1. T Zell-unabhängige Immunisierung mit NP-Ficoll.................................64 5.4.11.1.2 T Zell-unabhängige Immunisierung mit TNP-LPS .................................65 5.4.11.2. T Zell-abhängige Immunisierungen mit NP-KLH .........................................66 5.4.11.2.1 Kurzes Monitoring der T Zell-abhängigen Immunantwort......................66 5.4.11.2.2 Verlängertes Monitoring der T Zell-abhängigen Immunantwort.............67 5.4.11.3. T Zell-abhängige Immunisierung mit Schaferythrozyten .............................69 5.4.11.3.1. Durchflusszytometrische Analysen des Keimzentrums ........................70 5.4.11.3.2. Immunhistochemische Analysen des Keimzentrums ...........................72 5.4.12. CD40 Oberflächenexpression EFhd2 defizienter B Zellen .................................74 6. Diskussion ........................................................................................76 6.1. EFhd2 ............................................................................................................ 76 6.2. Generierung monoklonaler EFhd2-spezifischer Antikörper .................... 76 Inhaltsverzeichnis 6.3. Etablierung der EFhd2 defizienten Mauslinie............................................ 77 6.3.1 Technische Probleme bei der konditionalen Deletion des efhd2 Gens .................77 6.3.2. Konstitutive Deletion des efhd2 Gens ..................................................................78 6.4. Auswirkung der EFhd2 Deletion/Charakterisierung der konstitutiven EFhd2 defizienten Mauslinie AD1 ...................................................................... 79 6.4.1. Kompensation des EFhd2 Proteins durch das homologe Schwesterprotein EFhd1? ...........................................................................................................................79 6.4.2. EFhd2 in der B Zelldifferenzierung .......................................................................79 6.4.3. Erwarteter Einfluss von EFhd2 auf die Entwicklung von B1a B Zellen.................81 6.4.4. Die Funktion des EFhd2 Proteins in der B Zellaktivierung ...................................81 6.4.5. Der negative Regulator EFhd2 in der Immunantwort ...........................................83 6.4.6. EFhd2 in Autoimmunerkrankungen und Neuropathien ........................................86 7. Material..............................................................................................88 7.1. Chemikalien und Verbrauchsmaterialien.................................................................88 7.2. Antikörper ................................................................................................................88 7.3. Oligonukleotide........................................................................................................90 7.4. Vektoren und Konstrukte .........................................................................................91 7.5. Puffer, Lösungen und Medien .................................................................................91 7.6. Zelllinien und Kulturbedingungen ............................................................................93 7.6.1. Zelllinien ...........................................................................................................93 7.6.2. Kultivierung von Zelllinien.................................................................................94 7.7. Mausstämme ...........................................................................................................94 7.8. Kommerziell erhältliche Kits ....................................................................................94 7.9. Software ..................................................................................................................95 8. Methoden ..........................................................................................96 8.1. Proteinbiochemische und molekularbiologische Methoden.................... 96 8.1.1. GST-EFhd2 Fusionsprotein..................................................................................96 8.1.1.1. Konstruktion GST-EFhd2 ..............................................................................96 8.1.1.2. Gewinnung und Aufreinigung des GST-EFhd2 Fusionsprotein.....................96 8.1.2. Herstellung von Zelllysaten ..................................................................................96 8.1.3. Quantitative Proteinbestimmung ..........................................................................97 8.1.3.1. BCA Assay ....................................................................................................97 8.1.3.2. Bradford Test.................................................................................................97 8.1.4. Gelelektrophorese ................................................................................................97 8.1.5. Western Blot .........................................................................................................98 8.1.5.1. Durchführung.................................................................................................98 8.1.5.2. Verifizierung der EFhd2 defizienten Mäuse...................................................98 Inhaltsverzeichnis 8.1.6. Isolation und Aufreinigung genomischer DNA......................................................98 8.1.6.1. Für Southern Blot Analysen...........................................................................98 8.1.6.2. Für Mausgenotypisierungen ..........................................................................99 8.1.7. Polymerase-Kettenreaktion ..................................................................................99 8.1.7.1. Konditionaler Targeting Vektor ......................................................................99 8.1.7.2. Mausgenotypisierung ....................................................................................99 8.1.8. Herstellung des konditionalen Targeting-Vektor.................................................100 8.1.9. Southern Blot......................................................................................................100 8.1.9.1. Durchführung...............................................................................................100 8.1.9.2. Southern Blot Sonden für das Screening des konditionalen KO .................101 8.1.10. Autoradiographie ..............................................................................................102 8.1.11. Herstellung und Transformation kompetenter Bakterien ..................................102 8.1.11.1. Elektrokompetente Bakterien ....................................................................102 8.1.11.2. Chemischkompetente Bakterien und Hitzeschock-Transformation ...........103 8.1.12. Präparation von Vektor-DNA ............................................................................103 8.1.13. DNA Konzentrationsbestimmung .....................................................................103 8.2. Isolation und Aufreinigung muriner Zellen.............................................. 103 8.2.1. Gewinnung von Primärzellen..............................................................................103 8.2.2. Erythrozytenlyse und Zellzahlbestimmung .........................................................104 8.2.3. Sortierung von Milz B Zellen mittels MACS Technologie ...................................104 8.3. Zellkulturverfahren..................................................................................... 104 8.3.1. Kultivierung.........................................................................................................104 8.3.2. Lagerung von Zelllinien mittels Kryokonservierung ............................................104 8.3.3. Auftauen von kryokonservierten Zellen ..............................................................105 8.3.4. Hybridomzellfusion .............................................................................................105 8.3.5. Stimulation von Primärzellen und Zelllinien........................................................105 8.3.6. Embryonale Stammzellen...................................................................................106 8.3.6.1. Herstellung embryonaler Fibroblasten.........................................................106 8.3.6.2. Kultivierung embryonaler Feeder- und Stammzellen ..................................106 8.3.6.3. Elektroporation und Selektion von ESZ.......................................................107 8.3.6.4. Isolation von ESZ Klonen nach der Selektion .............................................107 8.3.6.5. Einfrieren der ESZ Klone in 96-Well Zellkulturplatten .................................108 8.3.6.6. Auftauen und Expansion positiver Stammzellklone.....................................108 8.3.6.7. Injektionsvorbereitung .................................................................................108 8.4. Tierexperimentelle Techniken................................................................... 109 8.4.1. Immunisierung ....................................................................................................109 8.4.1.1. Antikörper ....................................................................................................109 8.4.1.2. Immunantwort..............................................................................................109 Inhaltsverzeichnis 8.4.2. Serumgewinnung................................................................................................109 8.5. Immunologische Methoden....................................................................... 110 8.5.1. ELISA .................................................................................................................110 8.5.2. lacZ-Färbung ......................................................................................................110 8.5.3. Immunhistochemie auf Gefrierschnitten .............................................................111 8.5.4. Durchflusszytometrische Analysen.....................................................................111 8.5.4.1. Analyse von membranständigen und intrazellulären Proteinen ..................111 8.5.4.2. Analyse des Kalziumlux in Primärzellen......................................................112 8.5.4.3. Sortierung von Zellpopulationen mittels MoFlo™........................................112 8.6. Computerprogrammgestützte Arbeiten ................................................... 113 8.6.1. Planung von Oligonukleotiden, Konstrukten und Targeting-Vektor....................113 8.6.2. Densitometrische Quantifizierung von Western Blots ........................................113 8.6.3. Statistik ...............................................................................................................113 10. Anhang ..........................................................................................114 10.1. Abkürzungen .......................................................................................................114 10.2. Literaturverzeichnis .............................................................................................117 10.3. Eigene Publikationen...........................................................................................134 10.4. Nutzungserklärung des NIH KOMP Programms .................................................134 10.5. Lebenslauf ...........................................................................................................135 10.6. Danksagung ........................................................................................................136 10.7. Erklärung .............................................................................................................138 Zusammenfassung 1. Zusammenfassung Das Kalzium-bindende EFhd2 Protein wird in allen B Zellstadien exprimiert. Unsere Arbeiten zeigten, dass es B Zellrezeptorsignale in WEHI231 B Zellen verstärkt. Außerdem ist EFhd2 Bestandteil der konservierten transkriptionellen T und B Gedächtnissignatur. EFhd2 könnte daher eine Funktion in der B Zellentwicklung sowie bei der antigenabhängigen B Zellaktivierung ausüben. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Funktion des EFhd2 Proteins in vivo in B Zellen zu entschlüsseln. Zu diesem Zweck wurde eine konstitutive EFhd2 defiziente c57Bl/6 Mauslinie aus erworbenen embryonalen Stammzellen etabliert und charakterisiert. Während die B und T Zelldifferenzierung EFhd2 defizienter Mäuse bis auf signifikant reduzierte, peritoneale CD4+ T Zellen ohne Defizite normal verläuft, wurden deutliche Unterschiede in der antigenabhängigen B Zelldifferenzierung festgestellt. So traten in einjährigen Mäusen spontan mehr gegen doppelsträngige DNA gerichtete Autoantikörper auf; dies nivellierte sich nach eineinhalb Jahren jedoch wieder. Die Typ I T Zell-unabhängige IgM Immunantwort nach TNP-LPS Immunisierung war an Tag 12, nicht jedoch bei späten Zeitpunkten, signifikant verbessert. Bei der T Zell-abhängigen Immunantwort gegen NP-KLH ergaben sich weder nach primärer Immunisierung noch nach Reimmunisierung quantitative Unterschiede. Allerdings bildeten wiederholt immunisierte EFhd2 defiziente Mäuse deutlich höher affine NP-spezifische IgG1 Antikörper als Wildtyp Mäuse. Um die Hypothese zu überprüfen, dass die höher affinen IgG1 Antikörper eine Folge verstärkter primärer Keimzentrumsreaktionen sind, wurden Keimzentrums B Zellen nach Immunisierung mit Schaferythrozyten analysiert. Während sich die Oberflächenexpression von IgM, MHCII und CD40 nicht zwischen Wildtyp und EFhd2 defizienten Mäusen unterschied, waren am Tag 7, nicht jedoch an Tag 12, mehr Keimzentrums B Zellen und größere Keimzentren in EFhd2 defizienten Mäusen vorhanden. Dies führt vermutlich zu einem erhöhten Selektionsdruck in Keimzentren von EFhd2 defizienten Mäusen. Die mit dieser Mauslinie erhobenen Daten lassen die Schlussfolgerung zu, dass EFhd2 ein transienter, negativer Regulator der B Zellaktivierung und möglicherweise auch der peripheren Immuntoleranz ist. Für weitergehende Untersuchungen, die sich auch auf den Menschen ausdehnen könnten, wurden im Rahmen dieser Arbeit monoklonale EFhd2spezifische Antikörper generiert, die in zytoplasmatischen Färbungen in Maus und Mensch einsetzbar sind. 1 Einleitung 2. Summary The calcium-binding protein EFhd2 is expressed in all B cell stages. Our previous work has shown that EFhd2 amplifies B cell receptor signals in WEHI231 B cells. Moreover, EFhd2 is part of a conserved transcriptional, memory B and T cells signature. Thus, EFhd2 could play a role in B cell differentiation as well as in antigen-dependent B cell activation. The aim of this work was to elucidate the in vivo function of EFhd2 in B cells. For this purpose a constitutive EFhd2 deficient c57Bl/6 mouse line was established from commercial available embryonic stem cells and characterized. While B and T cell differentiation in EFhd2 deficient mice is normal, aside from significantly reduced peritoneal CD4+ T cells, there are major differences in B cell activation. For instance, one-year-old mice developed spontaneously more anti double-stranded DNA autoantibodies, but this effect was evened out after one and a half year of age. Type I T cell independent IgM immune response after TNP-LPS immunization was transient, but not at late time points significantly enhanced. T cell dependent immune responses against NP-KLH revealed no quantitative differences, neither in response to primary immunization nor after booster immunization. However, repeatedly immunized EFhd2 deficient mice exhibited clearly higher affine NP-specific IgG1 antibodies compared to wild type mice. To test the hypothesis that the higher affine IgG1 antibodies are a consequence of enhanced primary germinal center reactions, germinal center B cells were analyzed after SRBC immunization. Whereas the surface expression of IgM, MHCII and CD40 did not differ between wild type and EFhd2 deficient B cells, EFhd2 deficient mice developed significantly more germinal center B cells and larger germinal centers on day 7 but not on day 12. Thus, the selection pressure in germinal centers of EFhd2 deficient mice is most likely enhanced favoring selection of high affinity B cells. The data suggest that EFhd2 is a transient, negative regulator of B cell activation and potentially peripheral tolerance. Further analysis that could possibly involve the human system will be facilitated by monoclonal EFhd2-specific antibodies, which have been established here for use in cytoplasmic stainings. 2 Einleitung 3. Einleitung 3.1. Das adaptive Immunsystem Gegenüber Invertebraten, die nur ein angeborenes Immunsystem besitzen, hat sich bei Vertebraten zusätzlich das adaptive Immunsystem entwickelt. Dieses ist hoch komplex und hat die Fähigkeit, sich an Pathogene anzupassen. Verschiedenste Zelltypen und deren Interaktion untereinander sowie mit dem angeborenen Immunsystem spielen dabei eine entscheidende Rolle. Das adaptive Immunsystem stellt einen besonderen Schutzmechanismus dar, der das Potential hat, auf gleichem evolutionären Stand wie die sich ständig verändernden Krankheitserreger zu sein. Eine Koevolution des adaptiven Immunsystems mit pathogenen Viren, Pilzen, Bakterien und Parasiten kann damit gewährleistet werden. Dabei sind die bedeutendsten Merkmale des adaptiven Immunsystems die nahezu unerschöpfliche Diversität und Spezifität der gebildeten Antikörper sowie die Entstehung von langlebigen Gedächtniszellen, die in manchen Fällen sogar für einen lebenslangen Schutz bei erneutem Pathogenkontakt sorgen können (Jokinen et al., 2007; Reikie et al., 2010). Darüber hinaus besitzt das immunologische Gedächtnis das Potential zu einer wesentlich effektiveren und rascheren Immunantwort auf eine Reinfektion (Ahmed and Gray, 1996). Die für diesen Schutz verantwortlichen Zellen des immunologischen Gedächtnisses sind T und B Gedächtniszellen sowie langlebige Plasmazellen. Diese stellen die Basis für das humorale Immunsystem dar und entwickeln sich nach Antigenkontakt aus T bzw. B Lymphozyten. Der Entwicklungsprozess von Vorläuferzellen zu den fertigen Zellen des Immunsystems unterliegt strenger Überwachung und beinhaltet Kontrollpunkte der positiven und negativen Selektion. Doch aufgrund der Vielschichtigkeit und Komplexität des adaptiven Immunsystems können trotz aller Schutzmechanismen Fehler auftreten, die zu Immundefekten (Gaspar et al., 2001), Autoimmunerkrankungen (Guilherme and Kalil, 2010), Überempfindlichkeiten wie Allergien (Yazdanbakhsh and Matricardi, 2004) und Krebserkrankungen wie Lymphomen (Kuppers et al., 2006) führen können. 3.1.1. Die humorale Immunabwehr Antigenerkennung und adaptive Immunabwehr wird vorrangig von B und T Lymphozyten übernommen. Während T Zellen B Zellen unterstützen und auch eine zellvermittelte Immunantwort gewährleisten, realisieren B Zellen hauptsächlich die humorale Immunabwehr. Diese können spezifische Antikörper, die gegen bestimmte Antigene der Pathogene gerichtet sind, produzieren und in die Körperflüssigkeiten (Blut, Lymphe und Schleimhäute) sezernieren. Diese Antikörper binden ihr Antigen und können aufgrund ihrer Effektorfunktion das Pathogen auf verschiedene Weise eliminieren: Das Antigen eines Pathogens oder Toxins kann blockiert und neutralisiert, opsoniert und anschließend von Makrophagen und Monozyten phagozytiert oder durch Rekrutierung weiterer Effektorzellen wie natürliche Killerzellen (NK Zellen) beseitigt werden. Die Beseitigung von Pathogenen durch Effektorzellen wird als antikörperabhängige, zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC, antibody dependent cellular cytotoxicity) bezeichnet. 3 Einleitung Antikörper, die als membranständiger B Zellrezeptor oder in sezernierter Form vorkommen, setzen sich aus je zwei identischen schweren (H, heavy) und zwei leichten (L, light) Immunglobulinketten (Ig) zusammen. IgH und IgL bestehen jeweils aus konstanten und variablen Regionen, wobei die variablen Regionen durch Umlagerung von V, (D,) J Gensegmenten während der B Zellentwicklung gebildet werden (Blackwell and Alt, 1989; Jung et al., 2006; Mombaerts et al., 1992; Schatz et al., 1992; Schatz and Swanson, 2011; Shinkai et al., 1992; Tonegawa, 1983). Die konstante Region der L (κ / λ) und H (α – ε) Kette und ihre Subtypen vermitteln gemäß ihrem Isotyp die verschiedenen Effektorfunktionen der sekretierten Antikörper (Schroeder and Cavacini, 2010). 3.1.2. Entwicklung der B Lymphozyten Die B Zellentwicklung verläuft vor der Geburt in der fötalen Leber (Hardy and Hayakawa, 2001) und bei juvenilen und adulten Vertebraten im Knochenmark (Hardy, 2003; Osmond, 1986, 1990). Dabei entstehen B lymphoide Zellen aus hämatopoetischen Vorläuferzellen (CLP, common lymphoid progenitors, c-kit+/CD43+/CD19-/B220+) (Kondo et al., 1997), die sich wiederum aus pluripotenten hämatopoetischen Stammzellen (HSC, c-kit+/Lin-/CD19/B220-) bilden. Die HSC sind der Ursprung für alle Zellen der lymphoiden Linie wie T, B sowie NK Zellen und der myeloiden Linie wie Erythrozyten, Plättchen, Granulozyten, Monozyten (Mastzellen und Makrophagen) und Eosinophile (Nakajima, 2011). Für die Differenzierung der CLP in Richtung B Zellen zu frühen Pro B Zellen (frühe Vorläufer B Zelle, progenitor B cell, CD19+/c-kit+/CD43+/B220+, Abb. 3.1.) müssen die Transkriptionsfaktoren E2A, EBF-1 (early B cell factor 1), PU.1 und Ikaros hoch reguliert werden (Matthias and Rolink, 2005). Als erster Schritt beginnt im frühen Pro B Zellstadium die Umlagerung der DH (Diversity) zu JH (Joining) Gensegmente auf einem Allel im Immunglobulinlokus der schweren Ketten (IgH) durch die Hochregulation und Anlagerung des Rag-1/Rag-2 (recombination activating gene 1/2) Rekombinationskomplexes und endet in der späten Pro B Zelle mit dem VH (Variable) zu DJH Rearrangement (Blackwell and Alt, 1989; Jung et al., 2006; Mombaerts et al., 1992; Schatz et al., 1992; Schatz and Swanson, 2011; Shinkai et al., 1992; Tonegawa, 1983). Nach produktiver Umlagerung wird der Prä B Zellrezeptor (Prä BZR) aus zwei schweren Immunglobulinketten (µHC) und zwei surrogaten, leichten Ketten, die aus VpreB und λ5 bestehen, gebildet und mit den Signalmolekülen Igα und Igβ an die Zelloberfläche transportiert (Hombach et al., 1990; Karasuyama et al., 1990; Tsubata and Reth, 1990). Dieser Schritt stellt den Übergang vom Pro B zum frühen Prä B Zellstadium (Vorläufer B Zelle, precursor B cell, CD19+/CD25+/B220+, Abb. 3.1.) und einen wichtigen Kontrollpunkt zur positiven Selektion dar (von Boehmer and Melchers, 2010; Yurasov and Nussenzweig, 2007). Wurde eine funktionelle µHC Kette gebildet, werden Rag-1 und Rag-2 herunterreguliert (Grawunder et al., 1995) und durch das Allelausschlussprinzip eine Umlagerung der VHDHJH Gensegmente auf dem zweiten Allel unterbunden (Alt et al., 1984; Busslinger, 2004; Matthias and Rolink, 2005; Nussenzweig et al., 1987; Vettermann et al., 2006; Vettermann and Jack, 2010). Das Allelausschlussprinzip stellt sicher, dass ein reifer B Lymphozyt niemals verschiedene Antikörper produziert, sondern immer nur eine Spezifität für ein einziges Antigen aufweist. So erhalten B Zellen mit autoreaktiven BZR keine Überlebenssignale. Sollte die Umlagerung nicht produktiv gewesen sein, kann ein weiteres Rearrangement des Lokus auf dem zweiten Allel stattfinden. Sollte der neue Prä BZR wieder unproduktiv sein und die Zelle dadurch keine Überlebenssignale erhalten, geht sie in 4 Einleitung Apoptose (Lu and Osmond, 1997). War eine Umlagerung erfolgreich und der Prä BZR wurde auf die Zelloberfläche transportiert, tritt die frühe oder große Prä B Zelle in die klonale Expansion mit vier bis sechs Zellteilungen ein (Hombach et al., 1990; Kline et al., 1998). Die Klone entwickeln sich anschließend durch ein Rearrangement der leichten Kette zu späten oder kleinen Prä B Zellen weiter. Die VL zu JL Umlagerung des Leichtkettenlokus verläuft analog dem der schweren Kette, wobei der Leichtkettenlokus keine D Gensegmente enthält. Auch existieren zwei Leichtkettenlozi (IgLκ und IgLλ). War das Rearrangement am IgLκ Lokus nicht erfolgreich oder der BZR autoreaktiv, so können die Gensegmente des IgLλ Lokus umgelagert werden (Rezeptoreditierung) (Geier and Schlissel, 2006; Langerak and van Dongen, 2006). Das Verhältnis der κ/λ-Nutzung beträgt normalerweise etwa 20:1 in der Maus (McGuire and Vitetta, 1981). Die oben erwähnte klonale Expansion trägt zur Diversität des Antikörperrepertoires bei, da Klone mit derselben schweren Kette nun verschiedene leichte Ketten bilden können (Hess et al., 2001; Rolink et al., 2000). Verläuft die Umlagerung eines IgL Lokus erfolgreich, bildet sich zusammen mit der IgH Kette der B Zellrezeptor (BZR), der den Übergang von der Prä B Zelle zur unreifen B Zelle (CD19+/IgM+/IgD-) markiert. Die antigenunabhängige B Zellentwicklung im Knochenmark ist mit der Expression des BZR auf der Zelloberfläche durchlaufen. Es folgt ein weiterer Kontrollschritt, diesmal mit negativer Selektion auf Autoreaktivität des BZR, der bei autoreaktiven B Zellen je nach Signalstärke zu Rezeptoreditierung (Melamed et al., 1998; Nemazee and Weigert, 2000), Anergie oder Apoptose führen kann (von Boehmer and Melchers, 2010; Yurasov and Nussenzweig, 2007). Während der gesamten B Zelldifferenzierung definiert die Qualität des BZR Signals das Schicksal der B Zelle (Hardy and Hayakawa, 2001; Tussiwand et al., 2009). Durch Hochregulation von IgM (Loder et al., 1999) sowie Sphingosin-1-Phosphat-Rezeptor 1 (Pereira et al., 2010) können unreife B Lymphozyten (B220+/CD19+/IgMhi/IgD-(lo)) nun das Knochenmark verlassen (Thomas et al., 2006). Loder und Kollegen nennen auch eine schwache Expression von IgD(lo) als Voraussetzung für den Knochenmarksegress (Loder et al., 1999). Die unreifen B Zellen gelangen durch die Zirkulation im Blutstrom, in dem die Konzentration an Sphingosin-1-Phosphat hoch ist (Pyne and Pyne, 2000; Spiegel and Milstien, 2003), in die Milz (Thomas et al., 2006). Nach der Differenzierung in der Milz können sie wieder als reife oder rezirkulierende B Zellen (B220+/CD19+/IgMlo/IgDhi) durch die peripheren lymphatischen Organe und das Knochenmark zirkulieren, um ihr spezifisches Antigen zu treffen (MacLennan, 2008). Diese Wanderung wird fortgesetzt, bis die B Zelle entweder das passende Antigen findet oder in Apoptose geht. Im Knochenmark entwickeln sich täglich etwa 2 x 107 B lymphoide Zellen, von denen allerdings nur 10 - 20% das Knochenmark verlassen (Allman et al., 1993; Osmond, 1991, 1993). 5 Einleitung Prä BZR BZR † IgH Lokus: IgL Lokus: Rag-1/2: frühe späte Pro B Zelle † HSC CLP große kleine Prä B Zelle unreife B Zelle Keimbahn Keimbahn Keimbahn Keimbahn DH►JH Keimbahn VH►DJH Keimbahn VDJH Keimbahn VDJH VL►JL VDJH VJL - - + + - + - CD43: B220: CD19: c-kit: CD25: IgM: Abb. 3.1.: Schematische Darstellung der B Zellentwicklung im Knochenmark der Maus. Die einzelnen Differenzierungsstadien der murinen B-Zellentwicklung sind mit den Selektionskontrollpunkten (unterbrochene Zelle mit †), an denen ausgesonderte Zellen in Apoptose gehen, dargestellt. Die Entwicklung verläuft von der hämatopoetischen Stammzelle (HSC) über die CLP (common lymphoid progenitor) Zelle, die frühe und späte Pro B Zelle, die große und kleine Prä B Zelle bis zur unreifen B Zelle. Hierbei werden die VH, DH und JH Gensegmente am Schwerkettenlokus (IgH) und die VL und JL Gensegmente am Leichtkettenlokus (IgL) umgelagert. Die temporäre Expression des Rekombinationsenzymkomplexes Rag-1/2 (recombination activating gene 1/2) und verschiedener Oberflächenmarker ist darunter abgebildet. (Prä) BZR: (Prä) B Zellrezeptor; CD: Cluster of differentiation. Nach Verlassen des Knochenmarks differenziert ein Teil der unreifen B Zellen in der Peripherie zu verschiedenen B Zellsubtypen weiter (Abb. 3.2.) (Rolink and Melchers, 1996). Die meisten B Zellen erreichen die Milz und entwickeln sich dort zu reifen B Zellen, wobei diese Population nur noch etwa 1 - 3% der Zellen umfasst, die das Knochenmark verlassen haben (Allman et al., 1993; Carsetti et al., 1995; Melchers et al., 1995). Die in die Milz gelangten, unreifen B Zellen werden als transitionelle B Zellen bezeichnet und können in drei Differenzierungsstadien (transitional type B cell 1-3) unterteilt werden (Allman et al., 2001; Loder et al., 1999; Matthias and Rolink, 2005; Teague et al., 2007; Tussiwand et al., 2009; Vossenkamper and Spencer, 2011): Transitionelle1 (T1, AA4.1+/CD23-/IgMhi/B220+), Transitionelle2 (T2, AA4.1+/CD23+/IgMhi/B220+) und Transitionelle3 (T3, AA4.1+/CD23+/IgMintlo /B220+). T1 B Zellen entwickeln sich unter großem, negativen Selektionsdruck weiter zu T2 B Zellen und aus diesen differenzieren reife B Zellen (AA4.1-/B220+) und T3 B Zellen, wobei die Funktion der T3 B Zellen nicht geklärt ist und diese möglicherweise eine Population anerger Zellen darstellen (Allman and Pillai, 2008; Merrell et al., 2006; Teague et al., 2007). Auch ist nicht abschließend geklärt, ob sich auch T1 Zellen direkt zu reifen B Zellen entwickeln können (Allman and Pillai, 2008). Die B Zellentwicklung ist vorerst bis zu einem Antigenkontakt mit dem Stadium der reifen B Zelle abgeschlossen und kann in mindestens drei verschiedene Subpopulationen unterteilt werden (Abb. 3.2.). Die Hauptpopulationen sind dabei in der Milz die B1 B Zellen (B1, CD23-/CD21int/IgMhi/IgDlo/CD43+/B220lo) und die B2 B Zellen (B2, CD21int-hi/CD23+/IgMhi/IgDhi/B220+), die allerdings nur ein Vorstadium darstellen und weiter zu follikulären B Zellen (Fo, CD21int/CD23+/IgMlo/IgDhi/B220+) oder Marginalzonen B Zellen (Mz, CD21hi/CD23lo/IgMhi/IgDlo/B220+) differenzieren (Shapiro-Shelef and Calame, 2005). Für die Entwicklung in eine der Populationen sind vor allem die BZR Signalstärke, IgD aber auch Signalproteine wie Btk (Brutons Tyrosinkinase) und CD21 sowie Transkriptionsfaktoren wie Aiolos und Foxo1 wichtig (Cariappa et al., 2001; Casola et al., 2004; Chen et al., 2010; Duong et al., 2010). Die Marginalzonen B Zellen sind in der 6 Einleitung Marginalzone der Milz direkt an der Blut-Lymphe-Schnittstelle lokalisiert (Gray et al., 1982) und sind besonders für frühe, meist Thymus-unabhängige Immunantworten vom Typ II (TI-II) verantwortlich (Lopes-Carvalho and Kearney, 2004; Martin and Kearney, 2002). B1 Zellen kommen nicht nur in der Milz, in der sie kein MAC1 auf der Oberfläche zeigen, sondern auch in der Peritonealhöhle vor, in der sie anhand des Oberflächenmarkers CD5 nochmals in zwei Populationen, die B1a (CD5+/Mac1+/CD43+/B220lo) und B1b (CD5-/Mac1+/CD43+/B220lo), unterschieden werden (Berland and Wortis, 2002). B1 B Zellen dienen auch einer schnellen, ersten Immunantwort, wiederum meist TI-II, werden aber vor allem in der Peritonealhöhle als Produzenten der ohne vorherigen Antigenkontakt zustande kommenden natürlichen Immunglobulinspiegel angesehen (Baumgarth et al., 2000; Martin and Kearney, 2001; Shapiro-Shelef and Calame, 2005). Die Fo B Zellen machen etwa 90% der reifen B Zellen aus, zirkulieren durch Blut und Lymphe auf der Suche nach ihrem spezifischen Antigen und besiedeln die peripheren lymphatischen Organe. Sie sind weitestgehend für die Thymusabhängige Immunantwort (TD) verantwortlich (Allman and Pillai, 2008). a) Knochenmark Milz T3 Mz † T1 T2 B2 Fo unreife B Zelle B1a 2° lymphatische B1 Peritonealhöhle Organe B1b b) Marker CD19 B220 IgM IgD AA4.1 CD21 CD23 CD5 CD43 Unreife B Zelle ++ ++ +++ - - - - - - T1 ++ ++ +++ + +++ - - - - T2 ++ ++ +++ +++ ++ ++ ++ - - T3 ++ ++ + +++ + ++ ++ - - B1 ++ + +++ + - ++ - - + B2 ++ ++ +++ +++ - ++ +++ - - Fo ++ ++ + +++ - ++ +++ - - Mz ++ ++ +++ + - +++ + - - B1a ++ + +++ + - + + + + B1b ++ + +++ + - + + - + Abb. 3.2.: Schematische Darstellung der B Zellentwicklung in der Peripherie der Maus. a) Die einzelnen Differenzierungsstadien der murinen B-Zellentwicklung mit dem Selektionskontrollpunkt (gestrichelte Zelle mit †), an dem die Zellen teilweise in Apoptose gehen, sind von der unreifen B Zelle über die transitionellen Stadien 1-3 (T1-3) bis zu den reifen B Zellpopulationen in der Peripherie dargestellt. Fo: follikuläre B Zellen; Mz: Marginalzonen B Zellen b) Die für ein B Zellentwicklungsstadium spezifischen Oberflächenmarker sind mit ihrer Expressionsstärke im jeweiligen Stadium abgebildet. -: negativ; +: niedrig; ++: intermediär; +++: hoch. 7 Einleitung 3.1.3. B Zellaktivierung, Plasmazellen und Gedächtnis B Zellen Reife B Zellen sind Immuneffektorzellen, die nach Antigenaktivierung eine klonale Expansion und Plasmazelldifferenzierung sowie antigentyp-abhängig die Etablierung eines immunologischen Gedächtnisses durchlaufen können (McHeyzer-Williams, 2003). Je nach Subpopulation läuft dabei die weitere Differenzierung nach Antigenkontakt unterschiedlich ab: Mz und B1 B Zellen erkennen eher TI-II Antigene wie Phosphorylcholin und reagieren mit extrafollikulären Immunantworten (Allman and Pillai, 2008; Alugupalli et al., 2003). In diesem Fall entstehen meist kurzlebige Plasmazellen, die hauptsächlich Antikörper des IgM Isotyps produzieren. Dabei wird kein Klassenwechsel durchgeführt und kein Gedächtnis gebildet. Mz B Zellen können aber auch TD Immunantworten unterstützen, indem sie TD Antigene in Follikel transportieren, um dort B und T Zellen zu aktivieren (Attanavanich and Kearney, 2004; Cinamon et al., 2008; Song and Cerny, 2003). Die Fo B Zellen entwickeln sich nach Antigenkontakt mit T Zellhilfe (TD) entweder in kurzlebige Plasmazellen oder treten in die Keimzentrumsreaktion ein. Durch den Kontakt des BZR auf der Zelloberfläche mit dem spezifischen Antigen wird die B Zelle aktiviert (Harwood and Batista, 2010). Das Antigen wird durch Internalisierung ins Zellinnere transportiert und in Lysosomen zu Peptiden prozessiert. Die Peptide können dann von der B Zelle über MHCII (major histocompatibility complex class II) auf der Zelloberfläche präsentiert (Dani et al., 2004; Lanzavecchia and Bove, 1985) und von bereits aktivierten CD4+ T Helferzellen über deren T Zellrezeptor (TZR) erkannt und gebunden werden (Deenick and Ma, 2011). Dadurch kommt eine T und B Zellinteraktion zustande. Über die TZR/MHCII-Antigen Interaktion und CD4, kostimulatorische Signale wie CD40/CD40-Ligand Bindung sowie B7/CD28 Interaktion und Zytokine wie Interleukin (IL)-2, IL-4, IL-5 und IL-13 wird die B Zelle zur weiteren Proliferation und Differenzierung aktiviert (Abb. 3.3.) (Mills and Cambier, 2003; Noelle et al., 1992a; Noelle et al., 1992b). IL-2, IL-4 IL-5, IL-13 IL-Rγ IL-Rγ CD40 CD40L JAK-3 Btk Antigen MHCII T B TZR IgM CD4 T Zelle CD28 B7 B Zelle Abb. 3.3.: Die immunologische Synapse. Dargestellt ist die Interaktion einer aktivierten T Zelle (T) mit einer B Zelle (B), die über MHCII das prozessierte Peptid eines aufgenommenen Antigens präsentiert. Die interagierenden Moleküle sind der T Zellrezeptor (TZR), CD40 und CD40L sowie CD28 und B7. Daraufhin sekretiert die T Zelle zur B Zellstimulation verschiedene Interleukine (IL). Modifiziert nach (Goldsby et al., 2000). 8 Einleitung In der Keimzentrumsreaktion entstehen Plasmablasten, die weiter zu kurz- und langlebigen Plasmazellen differenzieren, sowie Gedächtnis B Zellen, die einen Schutz bei einer Reinfektion vermitteln. Im Keimzentrum durchlaufen die Keimzentrums B Zellen sowohl die somatische Hypermutation (SHM), bei der die Spezifität des Antikörpers zum Antigen erhöht werden kann, als auch den Klassenwechsel, bei dem die konstante Region des Antikörpers von IgM je nach Antigentyp und Kostimulation zu IgG, IgA oder IgE gewechselt wird. Für TI Antigene ist nicht unmittelbar T Zellhilfe notwendig, das Antigen wird von B Zellen beispielsweise über Toll-like Rezeptoren 4 gebunden (TLR-4). Für TD Antigene ist die T Zellhilfe jedoch Voraussetzung. Die Art der Immunreaktion von B Zellen hängt vom Ursprung, dem Typ, der Menge sowie dem Ort des Zusammentreffens mit dem Antigen ab (Shapiro-Shelef and Calame, 2005). Die Interaktion der B und T Zellen einer TD Immunantwort findet in den sekundären lymphatischen Organen an den Rändern der B und T Zellbereiche statt. Aktivierte B Zellen, die T Zellhilfe erhalten haben, können expandieren und für eine sofortige Immunantwort ohne somatische Hypermutation, aber zum Teil mit Klassenwechsel zu kurzlebigen Plasmazellen (extrafollikuläre Immunantwort) (Jacob et al., 1991a) differenzieren (Shapiro-Shelef et al., 2003) oder auch ins Innere eines Primärfollikels einwandern, um dort Keimzentren zu bilden (Abb. 3.4.) (McHeyzer-Williams et al., 2001; McHeyzer-Williams, 2003). Natürliche Antikörper und IgA ASZ B1 Zelle Mz Plasmazelle IgM Apoptotische Zelle Keimzentrum Proliferation und SHM Gedächtnis B Zelle Fo Plasmazelle IgG, IgA, IgE IgM Plasmazelle Selektion und CSR Knochenmarksnische Erste Woche Zweite Woche Dritte Woche Abb. 3.4.: Differenzierung einer reifen, naiven B Zelle nach Antigenkontakt. Dargestellt ist der jeweilige Differenzierungsweg von B1, Marginalzonen (Mz) und follikulären (Fo) B Zellen zu Antikörper-sezernierenden Zellen (ASZ) oder Plasmazellen und Gedächtnis B Zellen. B1 Zellen können sich auch ohne Antigen zu ASZ entwickeln und natürliche IgM bzw. im Darm auch IgA Antikörper sezernieren. Mz und Fo werden durch Antigenkontakt aktiviert und differenzieren für eine frühe Immunantwort (erste Woche) in extrafollikulären Reaktionen zu kurzlebigen, IgMproduzierenden Plasmazellen. Einige Fo bilden nach Antigenaktivierung ein Keimzentrum (zweite Woche). Dort proliferieren sie, durchlaufen die somatische Hypermutation (SHM), die Selektion sowie teilweise den Klassenwechsel (CSR, class switch recombination). Danach verlassen sie das Keimzentrum (dritte Woche) und entwickeln sich zu Gedächtnis B Zellen, die reaktivierbar sind, oder zu Plasmazellen, die die jeweiligen Antikörper (IgG, IgA, IgE) produzieren. Diese Plasmazellen können kurzlebig sein oder als langlebige im Knochenmark Überlebensnischen besiedeln. Modifiziert nach (Shapiro-Shelef and Calame, 2005). 9 Einleitung Für die Keimzentrumsreaktion ist T Zellhilfe essentiell (Fairfax et al., 2008). Im Keimzentrum durchlaufen die aktivierten B Zellen eine Proliferationsphase, wobei die meisten Zellen die transkriptionellen Repressoren Bcl-6 (B cell lymphoma 6), Pax5 (paired box protein 5) und BACH-2, welches Blimp-1 (B lymphocyte-induced maturation protein 1) bis zum Abschluss der Keimzentrumsreaktion reprimiert (Shaffer et al., 2000; Tunyaplin et al., 2004), exprimieren (Calame, 2006; Cattoretti et al., 1995; Muto et al., 2004). Wenn die aktivierten B Zellen, nachdem sie kognate T Zellhilfe erhalten haben, in die Keimzentrumsreaktion eingetreten sind (Abb. 3.5.), proliferieren sie in der dunklen Zone als Zentroblasten und vollziehen die somatische Hypermutation (Klein and Dalla-Favera, 2008). Die somatische Hypermutation ist eine Affinitätsreifung des BZR. Dabei werden Mutationen durch die ungerichtete Wirkung des Enzyms AID (activation induced cytidine deaminase), das einzelne Nukleotide in den IgH und IgL Gensegmenten mutiert, in der variablen Region eingeführt (Hackney et al., 2009; Muramatsu et al., 2000; Muramatsu et al., 1999; Pavri and Nussenzweig, 2011; Stavnezer, 2011), wodurch die Spezifität des Antikörpers für sein Antigen erhöht werden soll (Allen et al., 1987; Jacob et al., 1991b; McKean et al., 1984). In der hellen Zone des Keimzentrums werden die B Zellen als Zentrozyten bezeichnet. Hier findet die Selektion, positiv bezüglich der Spezifität sowie Affinität und negativ hinsichtlich einer möglicherweise auftretenden Autoreaktivität des mutierten BZR statt (Berek et al., 1991; Jacob et al., 1991b). Sie erfolgt durch Kompetition um Antigen, das durch follikuläre dendritische Zellen (FDC) in Antigen-Antikörper-Komplexen präsentiert wird (Aguzzi and Krautler, 2010; El Shikh et al., 2010; Mitchell and Abbot, 1965) sowie durch Überlebenssignale von follikulären CD4+ T Helferzellen (Choe et al., 2000; Yellin et al., 1994). Durch die Kompetition um Antigen und Überlebenssignale werden die B Zellen mit mutierten, höher affinen BZR bzw. Antikörpern selektioniert (van Eijk et al., 2001), während B Zellen mit niedrig affinen oder autoreaktiven BZR Fas-(CD95)-vermittelt in Apoptose gehen (Hao et al., 2008). Die FDC dienen ferner zur Aufrecherhaltung der primären Follikel als exklusive B Zellnische, halten aber auch die B Zellen im Keimzentrum (Wang et al., 2011). Weiterhin kann es im Keimzentrum zum Ig Klassenwechsel kommen, bei dem die konstante Region des Antikörpers und damit die Effektorfunktion gewechselt wird (Honjo et al., 2002; Kracker and Durandy, 2011; Manis et al., 2002; Radbruch et al., 1986; Stavnezer et al., 2008). Auch für den Ig Klassenwechsel spielt das Enzym AID eine entscheidende und zentrale Rolle (Hackney et al., 2009; Muramatsu et al., 2000; Muramatsu et al., 1999; Pavri and Nussenzweig, 2011; Stavnezer, 2011). 10 Einleitung FDC Helle Zone TFH Zelle B Zelle Apoptose Dunkle Zone B Zellzone SHM Abb. 3.5.: Schematische Darstellung der Keimzentrumsreaktion. Dargestellt ist ein Keimzentrum in der B Zellzone. Die Zentroblasten in der dunklen Zone beginnen mit einem Expansionsschritt, daran schließt sich die somatische Hypermutation (SHM) der variablen Region des Antikörpers zur Affinitätsreifung an und der Klassenwechsel (CSR), bei dem der Isotyp von IgM zu IgG, IgA und IgE geändert werden kann. Kommt es zu einer Erhöhung der Affinität des BZR, kann die B Zelle als Zentrozyt in der hellen Zone bei der Selektion an Antigen-präsentierenden follikulären dendritischen Zellen (FDC) Überlebenssignale erlangen und erhält dann kognate T Zellhilfe durch CD4+ follikuläre T Helferzellen (TFH Zellen). Unterliegt die B Zelle bei der Kompetition, geht sie in Apoptose. Wird anschließend die Expression von Bcl-6 herunter- und von IRF-4 hochreguliert, können die gereiften B Zellen das Keimzentrum verlassen und je nach Expressionsprofil in Plasmazellen oder Gedächtnis B Zellen differenzieren. Bleibt die Bcl-6 Expression konstant, erfolgt der Wiedereintritt der B Zelle in die Keimzentrumsreaktion beginnend mit der Expansion in der dunklen Zone. Modifiziert nach (McHeyzer-Williams et al., 2011). Die überlebenden B Zellen, die die Bcl-6 Expression herunterregulieren, können dann das Keimzentrum verlassen (Pelletier et al., 2010). Dabei entwickeln sie sich entweder zu Gedächtnis B Zellen oder über Plasmablasten zu langlebigen Plasmazellen, die hochaffine Antikörper sezernieren und damit die späte Phase der primären Immunantwort abdecken. Die Mechanismen, die zur Entscheidung führen, ob eine gereifte B Zelle in eine Plasmazelle oder Gedächtnis B Zelle differenziert, sind bisher noch nicht vollständig aufgeklärt. Man geht aber davon aus, dass Gen- und Proteinregulation eine entscheidende Rolle spielen. Nach dieser Entscheidung besiedeln sie ihre entsprechenden Nischen im Organismus. Plasmablasten besitzen noch die Fähigkeit zu proliferieren, produzieren dabei aber schon große Mengen Antikörper und entwickeln sich zu ausdifferenzierten Plasmazellen, die zu Entzündungsorten, in die Mukosa, aber vor allem in das Knochenmark wandern (Kunkel and Butcher, 2003). Sie teilen sich nicht mehr, exprimieren keinen BZR mehr auf der Zelloberfläche und erhalten in ihrer Nische antigenunabhängig Überlebenssignale, vor allem IL-5, IL-6, APRIL (a proliferation-inducing ligand), BAFF (B cell activating factor of the TNF family), TNF (Tumornekrosefaktor) sowie CD44 (Belnoue et al., 2008; Benson et al., 2008; Cassese et al., 2003; Minges Wols et al., 2002; Nie et al., 2004; O'Connor et al., 2004). Etwa 11 Einleitung 20% dieser Plasmazellen werden langlebig (Ochsenbein et al., 2000) und je nach Antigen können manche lebenslang existieren (Manz et al., 1997; Sze et al., 2000) und produzieren durch ihre hochaffinen Antikörper einen ständigen Schutz vor ihrem spezifischen Antigen (Radbruch et al., 2006). Die Plasmazelle (Abb. 3.6.) ist bereits seit mehr als 60 Jahren bekannt, jedoch konnten viele Vorgänge ihrer Differenzierung noch nicht abschließend entschlüsselt werden (Fagraeus, 1948). Die Plasmazelldifferenzierung wird in erster Linie durch den Transkriptionsfaktor Blimp-1 reguliert. Zum einen verhindert Blimp-1 die Pax-5 Expression, wodurch Xbp-1 (X-box binding protein 1) wieder exprimiert werden kann (Reimold et al., 2001). Zum anderen unterdrückt Blimp-1 Bcl-6 und AID, wodurch die Keimzentrumsreaktion beendet wird (Pelletier et al., 2010; Sciammas and Davis, 2004). Weiterhin ist IRF-4 (interferon regulatory factor 4) essentiell, das nach Antigenkontakt exprimiert wird und ohne das nur eine reduzierte IgM Konzentration und keine antigenspezifischen Antikörper im Serum nach einer Immunisierung zu finden sind (Mittrucker et al., 1997; Sciammas et al., 2006). So werden die Repression von Bcl-6 und Pax-5 sowie die Induktion von Xbp-1, IRF-4 und Blimp-1 als ausschlaggebend für die Plasmazelldifferenzierung angenommen (Abb. 3.6.) (Diehl et al., 2008; Kallies et al., 2004; McHeyzer-Williams et al., 2011; Ozaki et al., 2004; Pelletier et al., 2010; Vinuesa et al., 2005). Aktivierte B Zelle Prä Plasmablast Plasmablast Kurzlebige Plasmazelle Langlebige Plasmazelle Oberflächen Ig+ B220+ CD138MHCII++ CD19+++ CXCR-4- Oberflächen Ig+ B220+ CD138MHCII+ CD19++ CXCR-4- Oberflächen Ig+ B220lo CD138+ MHCII+ CD19++ CXCR-4+ Oberflächen IgB220CD138++ MHCII+ CD19+ CXCR-4++ Oberflächen IgB220CD138+++ MHCIICD19CXCR-4+++ Pax-5+++ IRF-4Blimp-1- Pax-5+ IRF-4++ Blimp-1- Pax-5IRF-4+++ Blimp-1+ Pax-5IRF-4+++ Blimp-1++ Pax-5IRF-4+++ Blimp-1+++ Pax-5 IRF-4 Blimp-1 Abb. 3.6.: Schematische Darstellung der Plasmazelldifferenzierung. Dargestellt sind verschiedene Phasen der Plasmazellentwicklung mit typischen Oberflächenmarkern (Mitte) und Transkriptionsfaktoren (darunter). Diese werden in der Differenzierung von der aktivierten B Zelle zur langlebigen Plasmazelle unterschiedlich exprimiert: -: negativ; +: niedrig; ++: intermediär; +++: hoch. Der Transkriptionsfaktor Pax-5, der für die bisherige B Zellentwicklung entscheidend war, wird herunterreguliert, während IRF-4 und Blimp-1, die für die Plasmazell-Identität essentiell sind, sukzessive hochreguliert werden (unten). Weiterhin gehen im Zuge der Differenzierung auch die meisten Oberflächenmarker verloren, nur CD138 und CXCR-4 (C-X-C chemokine receptor type 4) für die Wanderung in eine Knochenmarksnische werden hochreguliert. Modifiziert nach (Oracki et al., 2010). 12 Einleitung Erfolgt keine Bcl-6 Repression, tritt die B Zelle erneut in die Keimzentrumsreaktion ein (Tarlinton et al., 2008). Wird aber Bcl-6 ohne gleichzeitige Induktion von Blimp-1 reprimiert, gilt dies als Regulation zur Gedächtnis B Zellentwicklung (Kuo et al., 2007). Die Gedächtnis B Zellen sezernieren im Gegensatz zu Plasmazellen keine Antikörper, besitzen aber noch ihren BZR auf der Oberfläche und sind durch das spezifische Antigen reaktivierbar. Sie sind langlebig und unabhängig von T Zellen (Schittek and Rajewsky, 1990; Vieira and Rajewsky, 1990). Die meisten Gedächtnis B Zellen sind vom IgG Isotyp, doch kommen auch die anderen Isotypen vor (Anderson et al., 2007; White and Gray, 2000). Sie sind in der Milz lokalisiert und bei einer Reinfektion gewährleisten sie Schutz vor ihrem spezifischen Antigen und realisieren eine schnelle und effektive Immunantwort (Ahmed and Gray, 1996; McHeyzer-Williams and McHeyzer-Williams, 2005; Pelletier and McHeyzer-Williams, 2009). Dabei unterscheidet sich die Gedächtnis B Zellantwort nicht nur durch die Geschwindigkeit und Effizienz von der primären Immunantwort (Radbruch et al., 2006; Rennick et al., 1980; Vora et al., 1999). Ferner werden bei einer Reinfektion acht bis zehnmal mehr Plasmazellen gebildet und bereits geringere Antigenmengen reichen zur Reaktivierung der Gedächtnis B Zellen aus (Bullock and Rittenberg, 1970; Klinman, 1972). Allerdings existieren Gedächtnis B Zellen nur in sehr geringer Anzahl, etwa 5 x 103 -5 x 105 pro Milz einer Maus (Anderson et al., 2007) im Gegensatz zu etwa 109 Lymphozyten im gesamten Immunsystem (Jerne, 1974). 13 Einleitung 3.2. EFhd2 3.2.1. Namensgebung und Entdeckung EF-hand domain-containing protein D2 (EFhd2) wird auch als Swiprosin-1 bezeichnet. Diese Benennung stammt von den Schweizer Entdeckern des Proteins, die es Swiss-Prot Q96C19, kurz Swirposin-1 nannten (Vuadens et al., 2004). Als Abkürzungen sind Sw-1, Swip-1 und SWS1 bekannt, letztere wird für verschiedene Proteine, wie das SWIM domain-containing and Srs2-interacting protein 1 (SPBC11B10.06) (Martin et al., 2006) oder das Shortwavelength sensitive opsin (van Hazel et al., 2006) verwendet und für EFhd2 seltener genutzt. Erstmals wurde EFhd2 in 2D Gelelektrophorese-Analysen von CD8+ T Zellen 2004 von der Schweizer Gruppe Vuadens und Kollegen beschrieben (Vuadens et al., 2004). In B lymphoiden Zellen wurde das EFhd2 Protein 2005 in proteinbiochemischen Analysen von Detergenz-resistenten Membranen (DRM, lipid rafts) der unreifen B Zelllinie WEHI231 durch unsere Arbeitsgruppe entdeckt (Mielenz et al., 2005). 3.2.2. Gen- und Proteinstruktur von EFhd2 Das efhd2 Gen ist im humanen Genom auf Chromosom 1, Position 15,736,391 – 15,756,839 in Orientierung des Vorwärtsstranges und bei der Maus (Abb. 3.7.) auf Chromosom 4, Position 141,414,057 – 141,430,835 in Orientierung des Rückwärtsstranges lokalisiert (Flicek et al., 2011). Das murine efhd2 Gen liegt in einem Suszeptibilitätslokus für den systemischen Lupus erythematosus (SLE) (Wakeland et al., 2001), das humane Gen im PARK7 (Parkinson disease (autosomal recessive, early onset) 7) Lokus (1p36,33 – 1p36,12), der mit autosomal rezessiver, früh ausbrechender parkinsonscher Krankheit assoziiert ist (van Duijn et al., 2001). Das humane efhd2 Gen hat eine Größe von etwa 20,45 kb, das murine eine von 16,78 kb. ATG 5’ dP1 dP2 1 kB E1 E2 E3 E4 pP 3’ I1 5‘ UTR I2 I3 3‘ UTR murines efhd2 Abb. 3.7.: Muriner efhd2 Lokus mit regulatorischen Elementen. Das murine efhd2 Gen auf Chromosom 4 ist maßstabsgetreu abgebildet und zeigt auch 5’ gelegene Pomotorelemente: dP1,2: distale Promotorelemente, pP: proximales Promotorelement, E1-4: Exon 1-4, I1-3: Intron 1-3, UTR: untranslatierter Bereich. Das efhd2 Gen besteht aus vier Exons, wobei das erste Exon für etwa 42,6%, das zweite für 20,5%, das dritte für 18,7% und das vierte für 18,2% des EFhd2 Proteins kodiert. Es besitzt einen kurzen 5’ untranslatierten Bereich (UTR) von 53 bp, der 3’ UTR beträgt 1,6 kb. Das erste Intron ist sowohl im humanen als auch im murinen Genom mit über 12 kb relativ groß. Das humane und das murine EFhd2 Protein sind zu 91% identisch (Avramidou et al., 2007). Das murine EFhd2 Protein besitzt N-terminal eine low complexity region (LC), die sich über zwei disordered regions erstreckt, gefolgt von einer Prolin-reichen Region, die als 14 Einleitung vorhergesagte und funktionelle SH3 (Src homology 3)-Bindestelle identifiziert wurde (Kroczek et al., 2010), zwei Kalzium-bindenden EF-Hand Domänen (EF) und einer Cterminalen coiled coil Domäne (CC) (Abb. 3.8.a). 20 AS a) LC CC CC b) Abb. 3.8.: Vorhergesagte Sekundärstruktur und Sequenzvergleich von EFhd2 und EFhd1. a) Die Exonstruktur des murinen EFhd2 und EFhd1 Proteins mit den vorhergesagten Domänen: low complexity region (LC), Prolin-reiche Regionen (PR), EF-Hand Domänen (EF1 & 2) und coiled coil Domäne (CC); mit ihren Lagen in der nach ELM vorhergesagten Sekundärstruktur (Puntervoll et al., 2003). Als Maßstab sind 20 Aminosäuren (AS) angegeben. b) Abgleich der Aminosäuresequenzen von EFhd1 und EFhd2 mittels ClustalW2 (Larkin et al., 2007). Positionen der AS sind rechts angegeben. „*“ markiert identische, „:“ konservierte und „.“ semikonservierte AS. Modifiziert nach (Dutting et al., 2011). Durch Homologievergleich wurde das Schwesterprotein EF-hand domain-containing protein D1 (EFhd1, Abb. 3.8.a) identifiziert. Dieses wird auch Swiprosin-2 (Sws2) oder Mitocalcin genannt (Tominaga et al., 2006). Das murine efhd1 Gen ist aber nicht auf Chromosom 4, sondern auf Chromosom 1, Position 89,160,938 - 89,207,414 auf dem Vorwärtsstrang lokalisiert. Die Aminosäuresequenzen beider Proteine sind zu 64,58% identisch und zu 84,58% homolog, insbesondere die EF-Hand Motive sind hoch konserviert. Auch weisen beide Proteine sehr ähnliche, vorhergesagte Sekundärstrukturen auf (Abb. 3.8.a). Dennoch unterscheiden sie sich vor allem in den N-terminalen Aminosäuren (AS 20-80; Abb. 3.8.b), in ihrer Expression und in wichtigen Funktionen (Dutting et al., 2011). In diesem Bereich wurde für EFhd2 ein Aminosäureabschnitt (AS 70-78) identifiziert, der für den Transport des EFhd2 Proteins an die Detergenz-resistenten Membranen in der WEHI231 Zelllinie wichtig ist (Kroczek et al., 2010). 15 Einleitung 3.2.3. Kalzium-bindende EF-Hand Proteine Kalzium ist ein sehr wichtiger Botenstoff in Zellen und an einer Vielzahl von Vorgängen in verschiedenen Kompartimenten beteiligt. Kalziumionen regulieren enzymatische Aktivitäten, die Mitose, den Zelltod durch Apoptose, die Genexpression, die synaptische Kommunikation, die Homeostase von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und sind an Steuerungsprozessen des Zytoskeletts sowie der Transkription beteiligt (Yan et al., 2006). Die Kalziumsignale sind Folgen von zeitlichen und lokalen Änderungen in der intrazellulären Kalziumkonzentration, wobei sich Kalziumkanäle im endoplasmatischen Retikulum (ER) und der Plasmamembran öffnen und Kalziumionen in das Zytoplasma einströmen können. An diesen Vorgängen sind viele verschiedene Proteine beteiligt. Eine grundlegende Rolle kommt dabei auch Kalziumbindenden Proteinen der EF-Hand-Superfamilie zu. Diese Proteine sind in die Regulation vieler Zellfunktionen involviert, wie Mitose und Apoptose (Berridge et al., 1998; Berridge et al., 2000; Carafoli et al., 2001) oder auch Differenzierung und Effektorfunktionen von Zellen des Immunsystems (Feske, 2007; Oh-hora and Rao, 2008). Es gibt eine Vielzahl EF-Hand enthaltender Proteine (Kawasaki and Kretsinger, 1994, 1995), die eine sehr heterogene Gruppe in Bezug auf ihre Struktur, ihre Kalziumbindungsfähigkeit und die Anzahl der vorhandenen EF-Hand Motive bilden. Erstmals beschrieben und benannt wurde das EFHand Motiv von R. H. Kretsinger, der es in der Struktur von Parvalbumin als Kalziumbindendes Helix-Loop-Helix Motiv entdeckte (Kretsinger and Nockolds, 1973). Sowohl EFhd2 als auch EFhd1 besitzen je zwei EF-Hand Motive und können damit selbst Kalzium binden (vorliegenden Arbeit; (Hagen et al., 2012; Tominaga et al., 2006; Vega et al., 2008). Weiterhin wurde entdeckt, dass EFhd2 das BZR-induzierte Kalziumsignal in WEHI231 Zellen regulieren kann (Hagen et al., 2012; Kroczek et al., 2010). 3.2.4. Expression, Vorkommen und Regulation von EFhd2 Bereits in Insekten wurde eine Expression von EFhd2 nachgewiesen. Während der Mesodermentwicklung von Drosophila melanogaster konnte EFhd2 gefunden werden (Furlong et al., 2001). Das Drosophila-homologe EFhd2 wurde auch im fertig entwickelten Tier in Zellen des Immunsystems von Drosophila (Hornbruch-Freitag et al., 2011), speziell in S2 Zellen (Henikoff et al., 2009) sowie in Hämozyten identifiziert (Estrada et al., 2006). Untergruppen dieser Zellen dienen auch dem Immunsystem der Insekten zur Überwachung, in dem sie durch den Körper wandern und dabei Pathogene phagozytieren sowie antimikrobielle Peptide segretieren, ähnlich den Monozyten und Makrophagen (Williams, 2007). Weiterhin wurden EFhd2 Orthologe im Pharynx, der Körperwandmuskulatur, dem Nervensystem und dem ventralen Nervenstrang von Caenorhabditis elegans, im Gehirn, Auge, urogenital Gewebe, Kiemen, Muskel und olfaktorischen Rosetten des Zebrafisches gefunden (Kiefer, 2007). Weitere Daten vor allem aus dem murinen und humanen System unterstützen, dass die Expression von EFhd2 im Gehirn und dem Nervensystem eine Rolle auch bei Erkrankungen spielen könnte. Sowohl bei Neurodegenerationen wie Tauopathien als auch in Gehirnen von Alzheimer-Patienten wurde EFhd2 angereichert entdeckt (Vega et al., 2008). Des Weiteren wird EFhd2 auf Proteinniveau in Schizophrenie-Patienten gleichzeitig mit Mikrotubuliassoziierten Proteinen hochreguliert (Martins-de-Souza et al., 2009). Aber auch bei Alkohol- 16 Einleitung sensitiven bzw. –abhängigen Mäusen wurde efhd2 mit einem Faktor von acht an sechster Stelle von ungefähr 300 dysregulierten Genen gefunden (MacLaren and Sikela, 2005). Ebenso existieren Daten, dass EFhd2 in Nogo-A defizienten Mäusen, die sowohl ein verbessertes Neuritenwachstum als auch ein erhöhtes Regenerationsvermögen aufweisen, herunterreguliert ist (Dimou et al., 2006). Schließlich liegen noch Daten vor, die zeigen, dass EFhd2 in Mikrogliazellen auf Proteinniveau zweifach hochreguliert wird, wenn mit nitriertem α-Synuclein stimuliert wurde (Reynolds et al., 2008a), und EFhd2 von diesen aktivierten Mikrogliazellen sogar sekretiert wird (Reynolds et al., 2008b). Mikrogliazellen sind zwar Zellen des Nervensystems, dienen aber dem immunprivilegierten Gehirn als mononukleärephagozytäre Immuneffektorzellen und stellen damit weniger Nervenzellen als viel mehr einen Teil des zellulären Immunsystems im Gehirn dar (Nimmerjahn et al., 2005). Abgesehen von Gehirn und Nervensystem zeigte ein weiterer Fund, dass EFhd2 während der Osteoblastendifferenzierung von humanen mesenchymalen Stammzellen transient hochreguliert wurde (Zhang et al., 2007). Im murinen System gibt es weitere Daten, die EFhd2 in verschiedenen Entwicklungsschritten und Geweben identifizieren konnten. Während der Mausembryogenese im Stadium E8.5 beispielsweise wird EFhd2 stark im rostralen Darmrohr und kaudalen Dickdarm exprimiert, wohingegen es in Foxa2 defizienten Mausembryos herunterreguliert ist (Tamplin et al., 2008). In vielen Geweben ist dabei die Expressionsstärke sehr variabel: Die stärkste Expression wurde bei Analysen des gesamten Mausgehirns gefunden (Avramidou et al., 2007; Vega et al., 2008), in anderen Analysen konnte der Hippocampus als Expressionsort identifiziert werden (Shin et al., 2004). Weiterhin nachgewiesen wurde die Expression in der Milz, der Lunge und der Leber (Avramidou et al., 2007) sowie den Ovarien (unpublizierte Daten) und am schwächsten in Thymus und Niere (Avramidou et al., 2007). Auch im Herz und in verschiedenen Gehirnregionen wie Stammhirn, Kleinhirn, Mandelkern, Striatum, Hippocampus sowie Kortex konnte eine EFhd2 Expression durch Western Blot Analyse nachgewiesen werden (Vega et al., 2008). Im murinen Hippocampus wurde EFhd2 ferner von Shin und Kollegen bestätigt (Shin et al., 2004). Ebenso in Zellen des Immunsystems konnte EFhd2 nachgewiesen werden; es wurde in Mastzellen gefunden und in vitro in diesen durch Phorbolester (PMA/Ionomycin) sowie in in vivo Modellen passiver kutaner Anaphylaxie und atopischer Dermatitis hochreguliert (Ramesh et al., 2009; Thylur et al., 2009). In der murinen Makrophagenzelllinie RAW264 wurde EFhd2 während der Differenzierung zu Osteoklasten nach Behandlung mit RANK-L (receptor activator of NF-κB ligand) hochreguliert (Nomiyama et al., 2005). Ebenso wurde EFhd2 in natürlichen Killerzellen (Meng and Wilkins, 2005) und in mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) gefunden, in denen es bei Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) herunterreguliert ist (Dotzlaw et al., 2004; Schulz et al., 2007). Speziell in lymphoiden Zellen wird EFhd2 in murinen CD4+ T Zellhybridomzellen exprimiert (Marson et al., 2007) und auch in CD8+ T Zellen, in denen es erstbeschrieben wurde (Vuadens et al., 2004). In der Entwicklung muriner B Zellen wurde EFhd2 bereits in Pro B Zellen und Prä B Zellen exprimiert (Avramidou et al., 2007), wohingegen das Schwesterprotein EFhd1 nur in Pro B Zellen gefunden werden konnte (Dütting, 2010). Die höchste Expression wurde in unreifen B Zellen detektiert, aber auch in reifen B Zellen war noch EFhd2 Expression vorhanden (Avramidou et al., 2007). Weiterhin ist die EFhd2 Expression Teil einer evolutionär konservierten Transkriptionssignatur von CD4+ und CD8+ T und B Gedächtniszellen (Haining et al., 2008). 17 Einleitung 3.2.5. Funktionen von EFhd2 Obwohl EFhd2 und seine Orthologen in vielen Organismen und in diesen in vielen verschiedenen Geweben vorkommen und auch reguliert werden, sind bisher doch nur wenige Daten über die möglichen Funktionen vorhanden, die dem Gen bzw. Protein in den verschiedenen Geweben zukommen könnten. So wurde in HeLa Zellen entdeckt, dass das EFhd2 Protein in der G1- und der G2/M-Phase an Serin 74 und Serin 76 phosphoryliert wird (Dephoure et al., 2008). Auch wurde es als Substrat der Cyclin-abhängigen Kinase 1 (CDK-1, cyclin dependent kinase 1) identifiziert (Blethrow et al., 2008) und im Gehirn von Mäusen an Tyrosin 83 phosphoryliert gefunden (Ballif et al., 2008). Weiterhin wurde in HeLa Zellen gezeigt, dass EFhd2 nach Stimulation mit epidermalem Wachstumsfaktor (EGF, epidermal growth factor) mit gleicher Kinetik wie Gelsolin, einem Aktin-bindenden Protein, auch dephosphoryliert werden kann (Blagoev et al., 2004). Eine Mitose-spezifische Interaktion mit der Polo-Box Domäne (PBD) von Poloähnlicher Kinase 1 (Plk-1, polo-like kinase 1) wurde von Lowery und Kollegen entdeckt (Lowery et al., 2007). Ebenso wurde eine Assoziation mit phosphoryliertem Tau im JNPL3 Tau-transgenen (P301L) Mausmodell (Lewis et al., 2000), im Gehirn von Alzheimer-Patienten sowie FTDP-17 (Chromosom 17 gekoppelte frontotemporale Demenz und Parkinsonismus)-Patienten, aber auch im Gehirn normal gealterter Menschen gefunden (Vega et al., 2008). Von Xu und Kollegen wurde publiziert, dass nach Stimulation von THP-1 Zellen, einer humanen Monozytenzelllinie, mit einem rekombinanten Mycobacterium bovis Stamm EFhd2 hochreguliert wird und sich daraufhin die Antigenpräsentationsfähigkeit dieser Zellen, die CD8+ Immunantwort und TNFα Produktion verbessert (Xu et al., 2010). Weiterhin wurde entdeckt, dass EFhd2 in der humanen Mastzelllinie HMC-1 (Thylur et al., 2009) sowie in natürlichen Killerzellen mit dem Zytoskelett assoziiert ist (Meng and Wilkins, 2005). Ferner wurde gezeigt, dass EFhd2 mit dem Zytoskelettprotein Ezrin in einem Caspase 9enthaltenden Porteinkomplex verknüpft ist (Checinska et al., 2009). 3.2.6. EFhd2 in B Lymphozyten In WEHI231 Zellen wurde EFhd2 in DRM gefunden (Mielenz et al., 2005). Hier konnte eine Kolokalisation mit dem BZR sowie eine Internalisierung gleichzeitig mit diesem nachgewiesen werden (Avramidou et al., 2007). Außerdem senkt EFhd2 den Schwellenwert des BZR Signals in WEHI231 Zellen (Avramidou et al., 2007). Bei diesen Analysen war EFhd2 in DRM von unreifen B Zelllinien zu finden, die nach BRZ Stimulation in Apoptose gingen, nicht aber in reifen B Zelllinien wie CH27 (Mielenz et al., 2005). Dabei amplifizierte EFhd2 die BZR-induzierte Apoptose in WEHI231 Zellen zusätzlich noch (Avramidou et al., 2007). EFhd2 konnte die Expression von bcl-xL, einem antiapoptotischen NF-κB Zielgen, blocken und die spontane und BZR-vermittelte Apoptose dieser Zellen positiv regulieren (Avramidou et al., 2007). Nach shRNA-vermitteltem Wegfall von EFhd2 war die spontane und BZR-beeinflusste Überlebensrate verbessert (Avramidou et al., 2007). Eine NF-κB Aktivierung durch den BZR und BAFF (B cell activating factor of the TNF family), anti-CD40 sowie LPS (bakterielles Lipopolysaccharid) wirkte der EFhd2-verstärkten Apoptose entgegen (Avramidou et al., 2007). 18 Einleitung Schließlich konnte in WEHI213 Zellen gezeigt werden, dass EFhd2 den BZR-induzierten Kalziumeinstrom in dieser Zelllinie reguliert, einen positiven Regulator der Syk-Aktivität darstellt und auch die Tyrosinphosphorylierung von SLP-65 und PLCγ2 erhöht (Kroczek et al., 2010). Die Kalziumbindungsfähigkeit wurde in vitro von Vega und Kollegen gezeigt (Vega et al., 2008) und gleichzeitig von uns bestätigt (Hagen et al., 2012). Weiterhin wurden die für die Kalziumbindung kritischen Aminosäuren beider EF-Hände identifiziert und die spezifische Bindungskapazität für Kalzium (Kd) des EFhd2 Proteins mit 110 µM bestimmt. Pro Mol EFhd2 Protein können 2 Mol Kalzium gebunden werden (Hagen et al., 2012). Ferner zeigte EFhd2 ohne die kritischen Aminosäuren ein signifikant verringertes, BZR-ausgelöstes Kalziumsignal (Hagen et al., 2012). Somit wurde gezeigt, dass EFhd2 den BZR-vermittelten Kalziumflux durch einen Kalzium-abhängigen positiven Feedback-Mechanismus in WEHI231 Zellen reguliert (Hagen et al., 2012). Die meisten Befunde betreffend EFhd2 resultieren aus B Zelllinien und Array-Daten. Bisher konnten die Funktionen von EFhd2 vor allem in vivo nicht umfangreich aufgeklärt werden. Die meisten Daten zeigen nur Hinweise auf mögliche Wirkungsmechanismen von EFhd2. Diese gilt es in der vorliegenden Arbeit für die B Lymphozyten aufzuklären. 19 Fragestellung 4. Fragestellung Erstmals wurde EFhd2 in CD8+ T Zellen beschrieben und wenig später auch in B Zellen dokumentiert. Die bisherigen Daten unserer Arbeitsgruppe, die mit dem WEHI231 Zellkultursystem generiert wurden, deuten darauf hin, dass EFhd2 einen wichtigen Faktor für B Zellen darstellt, der den Schwellenwert des B Zellrezeptorsignals für Apoptose und den proximalen Kalziumflux modulieren kann. Zudem wurde EFhd2 als Bestandteil der konservierten Gedächtnissignatur von B und T Zellen identifiziert. Hypothetisch könnte EFhd2 somit in die B Zellentwicklung, die antigenabhängige B Zellreifung und die Etablierung der peripheren B Zelltoleranz involviert sein. Daher sollte in dieser Arbeit untersucht werden, welche Funktion EFhd2 in vivo in B Zellen hat, welchen Einfluss es auf die B Zellentwicklung und naive B Zellen nimmt und ob es einen positiven oder negativen Regulator in B Zellen repräsentiert. Das Hauptziel dieser Arbeit war es demnach, eine EFhd2 defiziente Mauslinie zu generieren, um in vivo die Funktion von EFhd2 in murinen B Zellen zu entschlüsseln. Als zweites Ziel sollten monoklonale EFhd2-spezifische Antikörper hergestellt werden, die in immunhistochemischen Färbungen einsetzbar sind. 20 Ergebnisse 5. Ergebnisse 5.1. Monoklonale EFhd2 Antikörper 5.1.1. Hintergrund Im Zuge dieser Arbeit sollten neue monoklonale, EFhd2-spezifische Mausantikörper generiert werden. Ziel war es hierbei, diese neuen Antikörper für weitere Methoden wie Immunfluoreszenzfärbungen verwenden zu können, die durch die bisherigen Möglichkeiten nicht ausreichend zugänglich waren. Speziell für die Analyse der Expression und für die intrazelluläre Lokalisation bzw. für Kolokalisationsanalysen von EFhd2 mit anderen Proteinen, war ein solcher Antikörper notwendig. Aufgrund von eigenen Vordaten und Publikationen anderer Gruppen, die EFhd2 im Zusammenspiel mit Tau-Proteinen und daraus resultierenden Krankheiten wie Alzheimer zeigen konnten (Vega et al., 2008), wurde ein weiterführendes Projekt initiiert, das auf die Einsetzbarkeit der neu generierten Antikörper in der Immunfluoreszenz angewiesen ist. 5.1.2. Immunisierung und Screening der Mausseren Zur Herstellung monoklonaler EFhd2-spezifischer Antikörper wurden drei weibliche Balb/c Mäuse im Alter von 13 Wochen mit GST-EFhd2 Fusionsprotein immunisiert. Die Mäuse wurden zweimal immunisiert und sowohl vor der ersten als auch nach jeder Immunisierung zur Serumgewinnung geblutet. Die Seren wurden anschließend im Western Blot auf ihre Reaktivität gegen EFhd2 getestet. Dazu wurden Zelllysate von WEHI231 Zellen (Boyd and Schrader, 1981) genutzt, die eine EFhd2-spezifische short hairpin RNA (shRNA) exprimieren (WEHI231-shEFhd2, sh) (Avramidou et al., 2007) bzw. Myc-getaggtes EFhd2 wieder ektopisch überexprimieren, indem die cDNA-Sequenz von EFhd2 ohne den 3’ UTR, gegen den die shRNA gerichtet ist, eingebracht wurde (WEHI231-EFhd2Myc, Myc) (Kroczek et al., 2010). In der Western Blot Analyse der Präimmunseren wurde für keine Maus eine Reaktion gegen das EFhd2 Protein festgestellt (Abb. 5.1.). Nach der ersten und zweiten Immunisierung allerdings wurde bei Maus 1 im Western Blot ein deutliches Signal gegen EFhd2 detektiert, nicht jedoch bei der Negativkontrolle. Deutlich zu erkennen war, dass das Signal nach der zweiten Immunisierung stärker wurde. Bei Maus 2 war nur ein sehr schwaches Signal gegen EFhd2 nach der zweiten Immunisierung zu beobachten, während nach der ersten Immunisierung kein Unterschied in den Seren zu erkennen war. Außerdem gab es ein starkes Signal nach der zweiten Immunisierung, das nicht EFhd2-spezifisch sein konnte, da es auch in den Zellen ohne EFhd2 auftrat und eine andere molekulare Masse aufwies. Bei Maus 3 war kein spezifisches Signal gegen EFhd2 festzustellen. Somit zeigte Maus 1 die spezifischste und stärkste Reaktivität gegen das murine EFhd2 Protein. 21 Ergebnisse [kDa] 200 Maus 1 Prä IS1 Maus 3 Maus 2 IS2 Prä IS1 IS2 Prä IS1 IS2 116 97 66 45 EFhd2 31 sh | Myc sh | Myc sh | Myc sh | Myc sh | Myc sh | Myc sh | Myc sh | Myc sh | Myc Abb. 5.1.: Serumreaktivität der GST-EFhd2 immunisierten Mäuse im Western Blot. Zur Serumgewinnung wurden Maus 1, 2 und 3 vor Immunisierung (Prä) und nach der 1. (IS1) und 2. Immunisierung (IS2) mit GST-EFhd2 Fusionsprotein geblutet. Die Seren wurden 1:200 verdünnt und mit Western Blot Streifen, auf denen je Zelllysate von WEHI231-shEFhd2 (sh) und -EFhd2Myc (Myc) Zellen geblottet waren, über Nacht inkubiert und mit einem HRP-gekoppelten, Maus-spezifischen IgG Sekundärantikörper entwickelt. Das EFhd2 Protein wird bei 34 kDa detektiert. Eine Ponceau S Färbung diente als Ladekontrolle (nicht gezeigt). Um ein späteres Screening der Hybridome zu erleichtern, wurde komplementär zum Western Blot ein ELISA etabliert, der zwischen Serumreaktivität gegen GST oder gegen EFhd2 diskriminiert. Dafür wurde eine ELISA-Platte mit gleichen molaren Konzentrationen von GST-EFhd2 oder nur GST beschichtet und Verdünnungsreihen der Seren von Maus 1 und Maus 3 vor und nach der zweiten Immunisierung untersucht. In Abbildung 5.2. ist gezeigt, dass das Serum nach der zweiten Immunisierung sowohl von Maus 1 als auch von Maus 3 eine deutliche Reaktivität gegen GST-EFhd2, nicht aber gegen GST alleine aufweist. Keines der Seren vor Immunisierung zeigt ein Signal im ELISA. 22 Ergebnisse Extinktion [oD] Extinktion [oD] 0.6 GST GST GST GST FP FP FP FP 1 Prä 3 Prä 1 IS2 3 IS2 1 Prä 3 Prä 1 IS2 3 IS2 0.4 0.2 0.0 0 2500 5000 7500 10000 12500 Serumverdünnung [x-fach] Serumverdünnung Abb. 5.2.: Bestimmung der Serumreaktivität GST-EFhd2 immunisierter Mäuse durch ELISA. Blut wurde von Maus 1 (graue Linien) und Maus 3 (schwarze Linien) vor Immunisierung (Prä) und nach der 2. Immunisierung (IS2) mit GST-EFhd2 Fusionsprotein (FP) genommen und daraus Serum gewonnen. Ein Endpunkt-ELISA mit HRP und Säurestopp wurde mit den angegebenen Verdünnungen der Seren sowohl gegen 1 µg/ml GST (GST, unterbrochene Linien) als auch 2 µg/ml GST-EFhd2 Fusionsprotein (durchgezogene Linien) durchgeführt und die Extinktion bei 490 nm bestimmt. Aufgrund der Ergebnisse des Western Blots und des ELISA wurde Maus 1 für die Fusion ausgewählt. Diese Maus wurde fünf Tage vor der geplanten Fusion nochmals immunisiert. Danach wurden die Milzzellen entnommen und mit Hybridomzellen fusioniert. 5.1.3. Screening und Charakterisierung der fusionierten und der subklonierten Hybridomzellen Nach der Fusion wurden subklonierte Klone mittels ELISA auf ihre Reaktivität gegen EFhd2 und gegen GST getestet. Nur Klone, die kein GST Signal aufwiesen, wurden in Kultur genommen (Tab. 5.1.: Spalte 1+2). Vier dieser Klone (A4, D4, E7 und G24) wurden nochmals subkloniert und im ELISA, im Western Blot und in der Immunfluoreszenz (IF) getestet (Tab. 5.1.: Spalte 4-7). Alle Subklone des Klons G24 zeigten in Western Blot Analysen auch EFhd2-unspezifische Reaktivität und wurden daher verworfen (Daten nicht gezeigt). Drei Klone (A4.15, A4.18, E7.23), die unterschiedlich starke Signale in der Immunfluoreszenz aufwiesen, wurden für eine weitere Subklonierung ausgewählt. Diesmal wurde die neuen Subklone mittels Immunfluoreszenz und Western Blot auf ihre Einsetzbarkeit getestet (Tab. 5.1.: Spalte 9-11). Vier Subklone mit den stärksten Signalen (A4.15.28, A4.15.48, A4.18.18, E7.23.20) wurden ausgewählt und weiterkultiviert. 23 Ergebnisse Tab. 5.1.: Charakterisierung der Klone sowie der 1. und 2. Subklone der Hybridomzellen. Aufgeführt sind Klone und Subklone der 1. und 2. Subklonierung ausgehend von den Resultaten der Experimente der voranstehenden Klone. Getestet wurde mittels ELISA mit 2 µg/ml EFhd2-GST und 1 µg/ml GST, Western Blot (WB) mit WEHI231 Zelllysaten mit und ohne EFhd2 Protein und/oder Immunfluoreszenzfärbungen (IF) auf Leberschnitten von WT und KO Mäusen (Etablierung der EFhd2 defizienten Mauslinie AD1 5.3.ff). ELISA-Resultate sind angegeben in optischer Dichte (oD), Färbung der IF / Bande im WB: - ohne, + schwach, ++ gut, +++ stark. Bei allen G24 Subklonen wurden Banden auch im WB in der Spur ohne EFhd2 (+++) detektiert. Ausgewählten Klone und ihre Resultate sind fettgedruckt. Klon A4 1. Subklon ELISA 2,596 A4.3 A4.11 A4.13 A4.15 A5 A11 A13 D4 E1 E2 E6 E7 G24 WB IF - + + +++ 0,215 0,86 0,888 0,765 A4.18 0,769 - ++ A4.24 0,767 + - D4.6 D4.8 D4.9 D4.11 D4.23 0,413 0,41 0,462 0,423 0,43 + - - E7.8 E7.16 E7.20 E7.21 E7.23 0,651 0,759 0,886 0,726 0,7 +++ + ++ + IF WB A4.15.28 A4.15.48 +++ +++ +++ +++ A4.18.18 +++ +++ E7.23.20 +++ +++ 0,177 0,161 0,164 0,297 0,222 0,214 0,428 2,609 1,708 G24.9 G24.19 G24.21 G24.22 G24.23 J2 N12 N14 P6 Z1 13 Z3 1 2. Subklon ELISA 0,758 0,7 0,714 0,723 0,692 (+++) (+++) (+++) (+++) (+++) 0,364 0,149 0,13 0,106 0,359 0,215 24 + + - Ergebnisse 5.1.4. Kartierung der Epitopbindungsstelle EFhd2-spezifischer Antikörper Um das Epitop im EFhd2 Protein zu identifizieren, an das die vier Antikörper binden, wurde die Bindungsstelle durch Western Blot Analysen mit Zelllysaten von WEHI231 Deletionsmutanten kartiert. Den Deletionsmutanten fehlte jeweils eine der vorhergesagten Proteindomänen des EFhd2 Proteins: Die low complexity region (LC), die Prolin-reiche Region (PR), die erste EF-Hand (EF1), die zweite EF-Hand (EF2) oder die coiled coil Domäne (CC). Als Kontrolle wurden jeweils auch Zelllysate ohne EFhd2 Protein sowie mit ektopisch überexprimiertem EFhd2 aufgetragen. Alle Deletionsmutanten besaßen am Ende des jeweiligen mutanten EFhd2 Proteins einen Myc-Tag (Hagen et al., 2012). In Abbildung 5.3. war zu erkennen, dass keiner der 4 Antikörper ein Signal erzeugte, wenn die LC fehlte. Die LC Mutante konnte jedoch immer mittels anti-Myc Antikörper detektiert werden. Somit liegt das Epitop der vier EFhd2-spezifischen Antikörper in der low complexity region von EFhd2. sh Myc LC PR EF1 EF2 CC sh Myc LC PR EF1 EF2 CC sh Myc LC PR EF1 EF2 CC sh Myc LC PR EF1 EF2 CC [kDa] 31 A4.15.28 A4.15.48 A4.18.18 E7.23.20 Myc Myc Myc Myc 31 Abb. 5.3.: Kartierung der Epitopbindungsstelle der EFhd2-spezifischen Antikörper durch Western Blot Analyse. Western Blot Analyse von WEHI231 Zelllysaten, die entweder kein EFhd2 Protein exprimieren (sh), die mit EFhd2Myc rekonstituiert wurden (Myc) oder denen die low complexity region (LC), die Prolinreiche Region (PR), eine der beiden EF-Hand Domänen (EF1, EF2) oder die coiled coil Domäne (CC) fehlte. In der oberen Reihe wurde pro Blot je einer der subklonierten, aufgereinigten Antikörper mit 1 µg/ml eingesetzt und mittels HRP-gekoppeltem, Maus-spezifischen IgG Sekundärantikörper entwickelt. In der unteren Reihe wurden alle Blots mit einem anti-Myc Antikörper entwickelt, um das jeweilige mutante Protein nachzuweisen. Die molekulare Masse des EFhd2 Protein beträgt bei voller Länge 34 kDa; die Deletionsmutanten (LC, PR, EF1, EF2 und CC) laufen entsprechend der jeweilig fehlenden Domänen niedriger, alle Deletionsmutanten und die EFhd2 überexprimierende Linie (Myc) sind mit einem Myc-Tag versehen. 25 Ergebnisse 5.1.5. EFhd2-spezifische Antikörper in der Immunfluoreszenz Für die Immunfluoreszenzanalysen wurden sowohl WEHI231 Zellen ohne EFhd2 Protein (sh) als auch WEHI231 Zellen, die EFhd2Myc (Myc) ektopisch exprimieren, mit den Antikörpern inkubiert und mit einem Fluoreszenzfarbstoff-gekoppelten Sekundärantikörper gefärbt. Abbildung 5.4. zeigt deutlich, dass Zellen, die EFhd2 exprimieren, gut gefärbt wurden, wohingegen in Zellen ohne EFhd2 Protein nur eine schwache Hintergrundfärbung zu erkennen war. In der Hellfeldaufnahme ist zu sehen, dass für beide Zelltypen ausreichend Zellen im Fokus der Aufnahme lagen. Besonders stark ist die Färbung an der Zellmembran und in zytoplasmatischen Vesikeln zu erkennen. A4.15.48 A4.18.18 E7.20.23 Myc sh A4.15.28 Fluoreszenz Hellfeld Fluoreszenz Hellfeld Fluoreszenz Hellfeld Fluoreszenz Hellfeld 94 µm Abb. 5.4.: Immunfluoreszenzfärbung von WEHI231 Zellen durch EFhd2-spezifische Antikörper. Sh und Myc WEHI231 Zellen wurden auf Teflon beschichteten Objektträgern aufgebracht, mit PFA fixiert und permeabilisiert. Die fixierten Zellen wurden mit den angegebenen Subklonen der EFhd2spezifischen Antikörper (Konzentration: 16, 4, 8 und 2 µg/ml) inkubiert und mit einem Cy3gekoppelten, Maus-spezifischen Sekundärantikörper gefärbt. Nach dem Eindeckeln wurden die Zellen mittels konfokaler Mikroskopie (1 Z Ebene) untersucht. Abgebildet sind die Detektion von Zellen im Fluoreszenzkanal sowie im Hellfeld und der Maßstab. (Abbildung entnommen aus Brachs et al., in Vorbereitung.) Zusammenfassend wurde gezeigt, dass durch drei Subklonierungsschritte vier monoklonale EFhd2-spezifische Mausantikörper der Subklasse IgG1κ (Daten nicht gezeigt) generiert wurden, die eine spezifische Bande in Western Blot Analysen und ein deutliches Signal in Immunfluoreszenzfärbungen liefern. Die Antikörper detektieren nicht nur das murine, sondern auch das humane EFhd2 Protein (Daten nicht gezeigt). Mit Hilfe dieser Antikörper konnte bereits die Lokalisation von EFhd2 an der Zellmembran bestätigt werden, die von unserer Arbeitsgruppe durch Isolierung von lipid rafts (Detergenz-resistente Membranabschnitte), 2D Gelelektrophorese und massenspektrometrischer Analyse sowie Western Blot Analyse gezeigt wurde (Mielenz et al., 2005). Auch in Immunfluoreszenzaufnahmen wurde ein EFhd2-GFP Fusionsprotein an der Zellmembran von WEHI213 Zellen lokalisiert (Avramidou et al., 2007). Durch die neuen Antikörper konnte nun auch das unmodifizierte EFhd2 Protein in den gleichen Zellbereichen nachgewiesen werden, wie bisher das EFhd2-GFP Fusionsprotein. GFP hat offensichtlich keinen Einfluss hinsichtlich der Lokalisation des Proteins. Des Weiteren konnte das EFhd2 Protein auch als Bestandteil zytoplasmatischer Vesikel (Abb. 5.4.) sowie präsynaptischer Vesikel im Gehirn von Mäusen nachgewiesen werden (unpubliziert). Zukünftige Arbeiten werden sich mit der genauen subzellulären Lokalisation des EFhd2 Proteins beschäftigen. 26 Ergebnisse 5.2. Konditionale EFhd2 defiziente Mauslinie 5.2.1 Hintergrund Um die Funktion von EFhd2 in vivo in B Zellen aufzuklären, sollte in dieser Arbeit eine EFhd2 defiziente Mauslinie etabliert werden. Dazu sollte efhd2 mit Hilfe des Cre-LoxP Systems, das schon in vielen Mauslinien erfolgreich eingesetzt werden konnte (Gu et al., 1993; Hobeika et al., 2006; Rickert et al., 1997), konditional deletiert werden. Dadurch kann eine mögliche embryonale Letalität (Betz et al., 1996; French et al., 2007) umgangen werden. 5.2.2. Planung des Targeting Der Lokus des efhd2 Gens liegt beim Menschen auf Chromosom 1, bei der Maus (Mus musculus) auf Chromosom 4. Der murine efhd2 Lokus mit voranliegenden, putativen Promotorelementen ist in Abbildung 5.5. dargestellt. ATG 5’ dP1 dP2 1 kB E1 E2 E3 E4 pP 3’ I1 5‘ UTR I2 I3 3‘ UTR murines efhd2 Abb. 5.5.: Muriner efhd2 Lokus. Das murine efhd2 Gen ist auf Chromosom 4, Position 141414057-141430835 lokalisiert. Die maßstabsgetreue Abbildung zeigt auch 5’ gelegene Pomotorelemente: dP1,2: distale Promotorelemente 1,2; pP: proximales Promotorelement; E1-4: Exon 1-4; I1-3: Intron 1-3; UTR: untranslatierter Bereich. Die Targeting-Strategie sollte gewährleisten, dass nach konditionaler Deletion das EFhd2 Protein nicht mehr gebildet wird bzw. nicht mehr funktionell ist. Es wurde zunächst davon ausgegangen, dass es aufgrund der Größe des ersten Introns (12,5 kb) mit konventionellen Techniken kaum möglich wäre, alle Exons gemeinsam zu deletieren. Wenn andererseits nur die Exons 2, 3 und 4 deletiert würden, bestünde die Gefahr, dass immer noch eine mRNA und damit ein Protein auftreten könnte beispielsweise in verkürzter Form. Dieses mutante Protein könnte Funktionen von EFhd2 behalten oder durch eine andere Faltung zu neue Funktionen gelangen, denn Exon 1 kodiert für fast die Hälfte (42,6%) des EFhd2 Proteins. Daher wurde eine Strategie entwickelt, bei der bereits eine Deletionsgröße von ein bis zwei Kilobasenpaaren (kb) theoretisch gewährleisten würde, dass das Protein nicht mehr produziert oder zumindest seine Funktion verlieren würde. Daher wurde der proximale Promotorbereich in die Deletion aufgenommen. Zunächst wurde der Promotorbereich mit dem 5’ UTR bis zu 10 kb vor dem Startcodon (ATG) auf theoretisch vorhergesagte konservierte Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren mit dem Programm rVista 2.0 analysiert (Loots and Ovcharenko, 2004). Wie Abbildung 5.6. zeigt, wurden im Vergleich der murinen mit der humanen Sequenz des efhd2 Gens drei Bereiche mit Häufungen von putativen Bindungsstellen gefunden. Zwei davon liegen vom Startcodon 2,5 bzw. 5 kb entfernt (distale Promotorelemente genannt, dP1,2). Eine dritte Häufung ist direkt vor dem 27 Ergebnisse Startcodon lokalisiert, enthält den 5’ UTR und wird als proximales Promotorelement (pP) bezeichnet. Durch die Deletion des proximalen Promotorbereichs (etwa 724 bp) würden putative Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren entfernt, die normalerweise in direkter Nähe des Translationsstarts liegen. Auch eine mögliche TATA Box und der 5’ UTR würden entfernt. Die zwei distalen Promotorelemente wurden aufgrund ihrer Entfernung nicht ins Targeting aufgenommen. 5‘ 3‘ Abb. 5.6.: Putative Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren im Sequenzvergleich des murinen und des humanen efhd2 Gens 10 kb stromaufwärts des Startcodons. Es wurden 10 kb der murinen und der humanen Sequenz vor dem Startcodon ATG im Programm rVista2.0 abgeglichen und auf konservierte Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren untersucht. In der linken Spalte stehen die vorhergesagten Transkriptionsfaktoren, im Hauptfeld ist ihre Lokalisation in der Sequenz (rosa hinterlegt) und unter dem Hauptfeld sind die Häufungen der einzelnen Bindungsstellen als rote Balken zusammengefasst. Des Weiteren wurde für das Targeting das erste Exon analysiert. Dies besitzt das Startcodon ATG und einige wichtige strukturelle Regionen des Proteins. Folgende Charakteristika wurden für die Sekundärstruktur des EFhd2 Proteins durch ELM vorhergesagt (Puntervoll et al., 2003): Eine low complexity region, eine Prolin-reiche Region, zwei Kalzium bindende EFHand Domänen und eine C-terminale coiled coil Domäne sowie vier Myristoylierungsstellen (M), schematisch dargestellt in Abbildung 5.7.a) (Avramidou et al., 2007; Dutting et al., 2011). Von der konditionalen Deletion betroffen sind die LC, die PR und der Beginn der ersten EF-Hand, sowie zwei Myristoylierungsstellen (Abb. 5.7 b). 28 Ergebnisse a) Sekundärstruktur: Myristoylierungsstellen: Putative Domänen: 102.6 Exon 1 M M LC 49.3 45 44 2 3 4 M PR M CC EF1 & 2 b) Konditionale Deletion AS 240 AS - der Sekundärstruktur: deletierter Bereich unbetroffener Bereich ATG - auf DNA-Ebene: dP1 dP2 pP Intron 1 (~ 12,5 kb) E1 E2 E3 E4 Abb. 5.7.: Vorhergesagte Sekundärstruktur des EFhd2 Proteins sowie beabsichtigte Deletion. a) EFhd2 Protein in Exonstruktur. Die Proteingröße ist in Aminosäuren (AS) angegeben, darunter potentielle Myristoylierungsstellen (M) und die vorhergesagten Domänen: low complexity region (LC), Prolin-reiche Region (PR), beide EF-Hand Domänen (EF1 & 2) und coiled coil Domäne (CC); mit ihren Lagen in der nach ELM vorhergesagten Sekundärstruktur des Proteins. b) Von der Deletion betroffener Bereich in der Sekundärstruktur des EFhd2 Proteins sowie auf DNA Ebene im efhd2 Gen. Die Linien kennzeichnen jeweils Beginn und Ende eines Exons (E1-E4, schwarze Balken) auf DNA Ebene. Distale und proximales Promotorelement (dP1,2, pP, offene Ovale) sowie 5’ und 3’ UTR (offene Balken) sind auf DNA Ebene ebenfalls gekennzeichnet. Daraus wird ersichtlich, dass das erste Exon für eine erfolgreiche konditionale Deletion ins Targeting eingeschlossen werden muss. Dies sollte zu gravierenden Einschnitten möglicher Funktionen der betroffenen Domänen sowie sehr wahrscheinlich zu Dysfunktionen in der Proteinfaltung führen, falls wider Erwarten noch ein Protein gebildet würde. Durch Aufnahme eines kurzen, 154 bp großen Bereichs zu Beginn des ersten Introns, sollte eine eventuelle Spleißdonorstelle eliminiert werden. Zusätzlich wurde darauf geachtet, dass exakt so viele Basenpaare entfernt werden, dass es, falls trotz fehlendem Promotor und Startcodon noch eine mRNA entstehen sollte, zu einer Leserasterverschiebung und damit zu vorzeitigen Stoppcodons in der mRNA kommen würde. Für die konditionale Deletion des efhd2 Gens wurde also der proximale Promotorbereich inklusive des 5’ UTR, das erste Exon und 154 bp am Beginn des ersten Introns gewählt, die zusammen etwa 1,2 kb betragen. 29 Ergebnisse 5.2.3. Targeting Für die konditionale Deletion des efhd2 Gens wurde der Targeting-Vektor „pRapidFlirt“ genutzt (A. Bruehl und A. Waisman, unpubliziert). Eine Übersicht über die TargetingStrategie ist in Abbildung 5.8. schematisch dargestellt. a) 11,4 kb 9,6 kp SphI HindIII ATG dP1 5’ 1 kB E1 SphI HindIII E3 E4 pP dP2 5‘ Sonde 3‘ Sonde b) HindlII 5’ E2 tk c) SphI pP - E1 dP2 muriner efhd2WT ClaI neo pRapidFlirt-Δefhd2 6 kb 7 kb HindIII HindlII 5’ dP1 SphI pP - E1 dP2 SphI E3 E4 neo 5‘ Sonde 3‘ Sonde d) E2 efhd2Δefhd2 11,5 kb 7 kb SphI SphI HindIII E2 HindlII dP1 5’ E3 E4 pP - E1 dP2 5‘ Sonde 3‘ Sonde e) efhd2Δefhd2 neo-del 10,1 kb 8,5 kb SphI HindIII dP1 5’ 5‘ Sonde SphI E2 HindlII E3 E4 dP2 3‘ Sonde efhd2Δefhd2 del Abb. 5.8.: Ortspezifische Integration des LoxP-flankierten Δefhd2 Allels in den murinen efhd2WT Lokus mittels Gene Targeting Techniken. Die Abbildung ist schematisch skizziert und bis auf ausgesparte DNA-Bereiche am Ende des ersten Introns (//) maßstabsgetreu. a) Genomischer efhd2WT Lokus der Maus (Mus musculus). DNA Bereiche, die in den Targeting-Vektor „pRapidFlirt-Δefhd2“ (b) als homologe Sequenzen einkloniert waren, sind als dicke Linien gekennzeichnet. Exons sind als schwarze Balken (E1-E4), 5’ und 3’ UTR als weiße Balken dargestellt. ATG kennzeichnet den Translationsstartpunkt. Die Restriktionsenzymschnittstellen HindIII und SphI, die für die Southern Blot Analysen relevant sind, sowie die entsprechenden Hybridisierungssonden sind farblich markiert und die zu detektierenden Fragmentgrößen angegeben. Die distalen Promotorelemente (dP1, dP2) sind durch graue Ovale, das proximale Promotorelement (pP) durch ein offenes Oval dargestellt. b) Der Targeting-Vektor „pRapidFlirt-Δefhd2“, der durch ClaI-Restriktionsverdau am 5’ Ende des 5’ homologen Arms linearisiert wurde, enthält eine Neomycinresistenzkassette (neo), die von FRTSequenzen (offene Dreiecke) flankiert ist, zwei LoxP-Sequenzen (geschlossene Dreiecke), die neo und den der DNA homologen Bereich aus pP und E1 flankieren, sowie ein Thymidinkinasegen (tk) 5’ des 5’ homologen Arms. Die Orientierung von neo und tk ist in Pfeilform dargestellt. c) efhd2 Lokus nach homologer Rekombination („efhd2Δefhd2“). Die zu erwartenden Fragmentgrößen beider Hybridisierungssonden der Southern Blot Analysen sind eingezeichnet. (d) Homolog rekombinierter efhd2 Lokus nach FRT-vermittelter Deletion von neo. Die mRNA des efhd2 Gen kann unter dem endogenen Promotor noch transkribiert werden. e) Homolog rekombinierter efhd2 Lokus nach Cre-vermittelter Deletion des proximalen Promotors, des 5’ UTR und des ersten Exons. Die Länge beider homologer Arme wurde anfangs mit über 4 kb gewählt. Nach vielen Amplifikationsversuchen, die höchstwahrscheinlich aufgrund hochrepetitiver 30 Ergebnisse Sequenzabfolgen erfolglos blieben, wurde der 5’ Arm auf 2,5 kb verkürzt. Der 3’ homologe Arm blieb 4 kb lang, ist im ersten Intron lokalisiert und wurde problemlos in einem Stück amplifiziert. Die homologen Arme wurden so in den Targeting-Vektor einkloniert, dass sie die zu deletierende Sequenz flankieren, die zwischen zwei, im Vektor bereits enthaltene LoxPSequenzen kloniert wurde. Der Targeting-Vektor „pRapidFlirt“ besitzt bereits ein Neomycinresistenzgen (neo), das zwischen zwei FRT-Sequenzen und innerhalb der LoxPSequenzen liegt, so dass es nach erfolgreicher Positivselektion mit dem Antibiotikum Geneticin über einen FRT-Rekombinase vermittelten Schritt entfernt werden kann (Abb. 5.8.d). Über die LoxP-Sequenzen kann danach die Deletion des gewünschten Genabschnitts mittels spezifischer Cre-Rekombinasen zellstadienspezifisch erfolgen (Abb. 5.8.e) (Gu et al., 1994; Orban et al., 1992; Schwenk et al., 1995). Durch Doppelselektion mit Geneticin und Gancyclovir können ESZ auf korrekte, homologe Integration des Targeting-Vektors in den efhd2 Lokus überprüft und selektioniert werden (Mansour et al., 1988; Thomas and Capecchi, 1987). Mit dem fertig gestellten, linearisierten Vektor „pRapidFlirtΔefhd2“ wurde die ESZ Linie V6.5 elektroporiert, die sich von F1-Nachkommen einer c57Bl/6 x 129/Sv-Verpaarung ableitet (Eggan et al., 2001). Nach der Elektroporation wurden die ESZ durch Doppelselektion mit Geneticin und Gancyclovir für zehn Tage angereichert und anschließend 480 Klone vereinzelt. Durch den Vergleich der Kolonienzahl mit einer Gancyclovir unbehandelten Kontrollplatte konnte eine fünffache Anreicherung ermittelt werden. 5.2.4. Southern Blot Screening der ESZ Klone Für das Screening mittels Southern Blot wurden beiderseits des Integrationsorts des Targeting-Vektors Hybridisierungssonden außerhalb der homologen Arme verwendet. Fünf Platten mit der ESZ DNA der insgesamt 480 doppelt-resistenten ESZ Klone wurden mit dem Restriktionsenzym HindIII verdaut und mit der HindIII-spezifischen 5’ Hybridisierungssonde analysiert. In Abbildung 5.9. sind drei der fünf Southern Blots exemplarisch abgebildet (Southern Blot 2 und 4 nicht gezeigt). Wie aus Abbildung 5.8. ersichtlich ist, beträgt das Signal der 5’ Hybridisierungssonde (HindIII Fragment des WT Allels) 9,6 kb, für das des rekombinierten Lokus 7 kb. Es wurde ein Klon mit Doppelbande auf Platte 5, Well 2D (5.2D) gefunden (Abb. 5.9., Platte 5). Von 480 selektionierten ESZ Klonen konnten 423 in der HindIII Southern Blot Analyse ausgewertet werden. Dies entspricht einer Frequenz positiver Klone von 0,23%. 31 Ergebnisse Platte 1 Platte 3 genomisches Fragment: 9,6 kb rekombiniertes Fragment: 7 kb 5.2D Platte 5 Abb. 5.9.: Southern Blot Analysen der selektionierten ESZ Klone im 96-Well Maßstab. Die ESZ Klone wurden in den Zellkulturplatten lysiert, die DNA mit HindIII verdaut, über ein Agarosegel aufgetrennt und auf eine PVDF Membran geblottet. Durch die radioaktiv markierte 5’ Sonde wurde detektiert, ob die Allele des efhd2 Lokus nur dem WT entsprachen oder homolog rekombiniert werden konnten. Die erwarteten Fragmentgrößen für das WT und das mutante Allel des efhd2 Lokus sind in Abbildung 5.8.a) und c) gezeigt. Der homolog rekombinierte Klon 5.2D, genannt nach Plattennummer (5) und seiner Lage auf dieser (2D), wurde hervorgehoben. Die relevanten Banden (10 und 8 kb) des Größenstandards (1 kb DNA-Leiter; NEB; je Spur 17) wurden durch schwarze Balken gekennzeichnet. Der als positiv identifizierte Klon wies von der 5’ Seite ausgehend eine korrekte homologe Rekombination auf. Um die vollständige und korrekte Integration des Targeting-Vektors zu überprüfen, wurden Klon 5.2D sowie fünf weitere, negative ESZ Klone, die zufällig von der gleichen Platte ausgewählt wurden, mit SphI verdaut und mit der radioaktiv markierten 3’ Sonde mittels Southern Blot analysiert. Abbildung 5.10. zeigt die Southern Blot Analyse dieser ESZ Klone. Das Fragment des homolog rekombinierten Allels beträgt 6 kb, während das Fragment des genomischen Lokus 11,4 kb groß ist. Nur der ESZ Klon 5.2D zeigt beide Banden, ist daher auf einem Allel korrekt homolog rekombiniert. 32 Ergebnisse Platte 5 .2G .2D .7H .3C STD .7G .12A [kb] 10 Å genomisches Fragment: 11,4 kb 8 6 Å rekombiniertes Fragment: 6 kb 5 4 Abb. 5.10.: Southern Blot Analyse zur Verifizierung des ESZ Klons 5.2D mit der 3’ Sonde. DNA des mit HindIII positiv getesteten Klons 5.2D und 5 weiterer, nicht homolog rekombinierter Klone (.2G, ,7H, .3C, .7G, .12A) der 5. Platte als Negativkontrolle wurden mit SphI verdaut, durch ein Agarosegel aufgetrennt und auf eine PVDF Membran geblottet. Durch die radioaktiv markierte 3’ Sonde wurde überprüft, ob der ESZ Klon 5.2D tatsächlich auf einem Allel korrekt homolog rekombiniert wurde Die erwartete Fragmentgröße beträgt für das WT Allel 11,4 kb und für das mutierte Allel 6 kb (siehe Abb. 5.8.a,c). Größenstandard: 1 kb DNA-Leiter. Es wurde ein EZS Klon identifiziert, der in Southern Blot Analysen von beiden Seiten die erwarteten Fragmentgrößen für das WT sowie das homolog rekombinierte Allel besitzt. Das im Vergleich zum rekombinanten Allel stärkere Signal des WT Allels ist damit zu erklären, dass auch die DNA der Feeder-Zellen verdaut wurde, die zwei intakte efhd2 WT Allele besitzen. 5.2.5. Injektion des ESZ Klons 5.2D Der Klon 5.2D wurde kultiviert und in mehreren Aliquots zur Lagerung in Stickstoff eingefroren. Er wurde auch mehrmals zur Injektion in Blastozysten vorbereitet. Dazu wurde der Klon bis zum Tag der Injektion kultiviert und entsprechend des Injektionsprotokolls vorbereitet. Für die Injektion wurden nur optisch einwandfreie ESZ verwendet. Bei keinem der mindestens zehn Injektionsversuche, bei denen jeweils zwischen 25 und 60 Blastozysten injiziert wurden, entstand ein fertiler, gesunder, chimärer Nachkomme. Wenn es zur Geburt kam, war der Nachwuchs nur zu maximal 20% chimär oder im Wachstum nicht vollständig entwickelt und konnte daher nicht zur Zucht verwendet werden. 33 Ergebnisse 5.3. Konstitutive EFhd2 defiziente Mauslinie 5.3.1. Hintergrund Während dieser Arbeit wurde unter Leitung des NIH-finanzierten Knockout Mouse Project (KOMP, www.komp.org) eine mittels VelociGene® Technologie der Firma Regeneron Pharmaceuticals Inc. (www.velocigene.com) generierte, konstitutive lacZ Knock-in, EFhd2 defiziente ESZ Linie für wissenschaftliche Zwecke angeboten. Die von Regeneron für das Targeting genutzte ESZ Linie basiert auf dem c57Bl/6 Hintergrund. Da leider keine chimären Nachkommen des ESZ Klons 5.2D entstanden, wurden über das KOMP Repository drei ESZ Klone der konstitutiven, EFhd2 defizienten ESZ Linie bezogen und parallel bearbeitet. Obwohl die ESZ Klone bereits als homolog rekombinant angeboten waren, wurden diese nach Erhalt nochmals verifiziert. Anschließend sollte davon eine EFhd2 defiziente Mauslinie etabliert werden, um die Funktion von EFhd2 in vivo zu untersuchen, sofern die Nachkommen nicht embryonal letal sein würden. 5.3.2. Targeting Das von Regeneron durchgeführt Targeting, ähnelt dem konditionalen Targeting, das bereits in dieser Arbeit erläutert wurde (5.2.3.). Der Hauptunterschied in der Strategie ist, dass nicht nur Exon 1 deletiert wurde, sondern die gesamte kodierende Sequenz nach dem endogenen Startcodon ATG bis zum Stoppcodon und stattdessen eine Insertionskassette an dieser Stelle eingebaut wurde, die neben einem Neomycinresistenzgen mit eigenem Promotor zur Selektion der ESZ auch ein lacZ Gen als Reporter enthält. Das lacZ Gen besitzt keinen eigenen Promotor, sondern wird direkt hinter das Startcodon ATG fusioniert, so dass das lacZ Gen unter der Kontrolle des endogenen efhd2 Promotors exprimiert wird und als Reporter für die efhd2 Expression genutzt werden kann. LacZ besitzt aber ein eigenes polyA Stoppsignal am Ende. Der 5’ und 3’ UTR sowie Enhancer-Sequenzen, die außerhalb der kodierenden Sequenz liegen, bleiben dadurch endogen erhalten. Zur Rekombination waren auf jeder Seite der Insertionskassette jeweils 2 kb lange Sequenzen gewählt, die zu den entsprechenden DNA Bereichen homolog sind. Die Targeting-Strategie wurde nach den Daten von Regeneron mittels Vector NTI® erstellt und ist schematisch in Abbildung 5.11. dargestellt. 34 Ergebnisse a) 8 kb AflII HindIII ATG SphI dP1 5’ 1 kB 11,4 kb 9,6 kp E1 AflII E2 SphI HindIII E3 E4 pP dP2 5‘ Sonde 5‘ Sonde2 3‘ Sonde b) AflII 5’ lacZ - pA murines efhd2WT HindlII neo Insertionskassette-lacZ c) 11,7 kb 14,8 kb AflII HindIII 5’ AflII ATG SphI dP1 dP2 pP lacZ - pA HindlII neo efhd2lacZ 5‘ Sonde Abb. 5.11.: Ortspezifische Integration der Insertionskassette in den murinen efhd2WT Lokus mittels Gene-Targeting Techniken. Das Targeting wurde von der Firma Regeneron durchgeführt. Die Abbildung ist nach der Vorlage von Regeneron schematisch skizziert und bis auf ausgesparte DNA-Bereiche am Ende des ersten Introns (//) maßstabsgetreu. a) Genomischer efhd2WT Lokus der Maus (Mus musculus). Die DNA-Bereiche, die in der Insertionskassette (b) als homologe Sequenzen vorliegen, sind als dicke Linien gekennzeichnet. Exons sind als schwarze Balken (E1-E4), 5’ und 3’ UTR als offene Balken dargestellt. Das Startcodon ATG kennzeichnet den Translationsstartpunkt. Die Restriktionsenzymschnittstellen HindIII, AflII und SphI, die für die Southern Blot Analysen relevant sind, sowie die entsprechenden Hybridisierungssonden sind farblich markiert und die zu detektierenden Fragmentgrößen angegeben. Die distalen Promotorelemente (dP1, dP2) sind durch graue Ovale, das proximale Promotorelement (pP) durch ein offenes Oval dargestellt. b) Die Insertionskassette (Insertionskassette-lacZ) enthält ein lacZ Gen mit PolyA (pA) (grauer Balken) und direkt anschließend ein Neomycinresistenzgen mit eigenem Promotor (neo, grauer Pfeil). Eingezeichnet sind zwei Restriktionsenzymschnittstellen in der Insertionskassette, die die Fragmentgrößen in der Southern Blot Analyse ändern. Die Orientierung von neo ist in Pfeilform dargestellt. c) efhd2 Lokus nach homologer Rekombination („efhd2lacZ“). Die zu erwartenden Fragmentgrößen beider 5’ Hybridisierungssonden der Southern Blot Analysen sind eingezeichnet, die Bindungsstelle der 3’ Hybridisierungssonde ist durch das Targeting nicht mehr vorhanden. 5.3.3. Southern Blot Verifizierung des ESZ Klons AD1 Die Southern Blot Strategie konnte weitgehend von der schon etablierten, konditionalen Screeningstrategie übernommen werden. Die Bindungsstelle für die 5’ Hybridisierungssonde für das Restriktionsenzym HindIII liegt außerhalb des 5’ homologen Arms, die zweite Schnittstelle liegt im 3’ homologen Arm jenseits der Insertionskassette. Zur Verifizierung wurde eine zweite, bereits vorhandene 5’ Hybridisierungssonde (5’ Sonde 2) eingesetzt. Die Bindungsstelle der 3’ Hybridisierungssonde ist auf dem rekombinierten Allel nicht mehr vorhanden. Von den drei erhaltenen ESZ Klonen (AC6, AD1, BD10) wurde willkürlich der Klon AD1 zur Verifizierung ausgewählt. Dieser wurde unter Geneticin Selektion kultiviert und zur DNA Gewinnung eingesetzt. Die AD1 ESZ DNA und eine c57Bl/6 (WT) Kontrolle wurden mit den Restriktionsenzymen HindIII, AflII und SphI verdaut und mit den drei entsprechenden, radioaktiv markierten Hybridisierungssonden im Southern Blot analysiert. Abbildung 5.12. zeigt unter a) die Southern Blot Analysen der Klone mit den verschiedenen Sonden sowie unter b) die erwarteten Fragmentgrößen für das AD1 und das WT Allel. Die erwarteten Fragmente wurden durch beide 5’ Sonden sowohl bei AD1 als auch bei WT korrekt detektiert, die 3’ Hybridisierungssonde zeigte bei AD1 und WT, wie erwartet, nur die 35 Ergebnisse Bande für das WT Allel. Die obere Lauffront der DNA zeigt aufgrund der hohen DNA Menge im mittleren Blot eine unspezifische Hintergrundfärbung. a) [kb] STD | AD1 | WT STD | AD1 | WT STD | AD1 | WT 10 8 6 5 4 b) Screening WT 5‘ Sonde 9,6 kb 14,8 kb 5‘ Sonde 2 3‘ Sonde AD1 8 kb 11,7 kb 11,4 kb 3 5’ Sonde (HindIII) 5’ Sonde 2 (AflII) 3’ Sonde (SphI) Abb. 5.12.: Southern Blot Analyse zur Verifizierung des ESZ Klons AD1. a) DNA einer c57Bl/6 Maus (WT) und des ESZ Klons AD1 wurden mit HindIII, AflII und SphI verdaut, über ein Agarosegel aufgetrennt und auf eine PVDF Membran geblottet. Durch zwei radioaktiv markierte 5’ und eine 3’ Sonde wurde überprüft, ob der ESZ Klon AD1 tatsächlich auf einem Allel korrekt homolog rekombiniert wurde (weißer Kasten & Pfeil). Die WT Bande entspricht dem nichtrekombinierten WT Allel (schwarzer Kasten & Pfeil). Die Bindungsstelle in der genomischen DNA für die 3’ Sonde wurde durch die homologe Rekombination deletiert, daher ist keine zweite Bande vorhanden. Die erwarteten Fragmentgrößen sind unter b) angegeben. Größenstandard: 1 kb DNALeiter (STD). b) Erwartete Fragmentgrößen der unterschiedlichen Hybridisierungssonden im WT und im rekombinierten AD1 Lokus des jeweils passenden Restriktionsverdaus. Durch die Insertionskassette wurde der Bereich, in dem die 3’ Sonde hybridisiert, deletiert, daher gibt es keine Bande (-) im AD1 Lokus. Der Klon AD1 ist heterozygot für den efhd2 Lokus und besitzt ein WT Allel mit dem efhd2 Gen und ein rekombinantes Allel mit dem lacZ Gen und dem Neomycinresistenzgen. Da der Klon unter Selektion mit Geneticin kultiviert wurde, ist das Neomycinresistenzgen funktionell. Nach erfolgreicher Verifizierung des ESZ Klons AD1 wurde dieser zur Injektion in Blastozysten zu Prof. Dr. Michael Bösl, Transgenic Core Facility am Max-Planck-Institut für Neurobiologie, Martinsried, geschickt. 36 Ergebnisse 5.3.4. Injektion des ESZ Klons AD1 Der ESZ Klon AD1 wurde in Kultur genommen, aufbereitet, in Albino c57Bl/6 Blastozysten injiziert und diese in scheinschwangere Mäuse transplantiert. Die ursprüngliche ESZ Linie, die von Regeneron für das Targeting verwendet wurde, trägt die Bezeichnung VGB6 (ehemals B6A6) und wurde aus dem Mausstamm c57Bl/6NTac (Taconic) isoliert. Die Injektion dieser ESZ in Albino c57Bl/6 Blastozysten bringt schwarz, chimäre Mäuse hervor. Die Injektion sowie die Analyse des Fellfarben-Chimärismus, wodurch man die mosaische Zusammensetzung eines Tieres bezüglich injiziertem Klon zu verwendeter Blastozyste ermitteln kann, wurde von Prof. Dr. Michael Bösl, Transgenic Core Facility am Max-PlanckInstitut für Neurobiologie, Martinsried, vorgenommen und ist in Tabelle 5.2. zusammengefasst. Tab. 5.2.: Nachkommen der AD1 ESZ Injektion. Nummer, Geschlecht, Fellfarben-Chimärismus und Geburtsdatum der chimären Founder-Mäuse (Fx). Fx Nummer Geschlecht Fellfarben-Chimerismus [%] Geburtsdatum #9001 #9002 #9190 #9191 #9192 #9193 #9194 ♂ ♀ ♂ ♂ ♂ ♂ ♂ 99% 99% 50% 25% 100% 50% 100% 20.02.2009 21.02.2009 21.02.2009 21.02.2009 21.02.2009 21.02.2009 21.02.2009 Vier Männchen (9001, 9190, 9192, 9194) der sieben hoch chimären Mäuse wurden mit c57Bl/6 Weibchen verpaart, nach Erlangen transportiert und dort nach acht Wochen Quarantäne in die IVC Haltung überführt. In der IVC Haltung wurden Zuchten etabliert, um sowohl WT, heterozygote und KO Mäuse in den Würfen zu erhalten. 37 Ergebnisse 5.3.5. Verifizierung AD1 homozygoter Mäuse Die Nachkommen der chimären Fx-Mäuse (F1 Generation) wurden mittels PCR Analyse isolierter Schwanz-DNA genotypisiert (vgl. Methoden 8.1.7.2.). Heterozygote Mäuse der F1 Generation, die ein positives PCR Signal aufwiesen, stammten von einer heterozygoten Samenzelle mit rekombinantem Allel ab, somit besaß eine solche Maus ein rekombinantes sowie ein WT Allel und vererbte diese beiden auch. Die Keimbahngängigkeit des Knock-in konnte dadurch bestätigt werden. Die heterozygoten Mäuse wurden darauf hin weiter verpaart und schon die F2 Generation konnte bereits auf das Auftreten von homozygoten KO und WT Mäusen genotypisiert werden. Abbildung 5.13. zeigt die ersten vier homozygoten Tiere, je zwei WT und KO Mäuse, die für Versuche genutzt wurden. Bei diesen wurde zur Kontrolle der Genotypisierung durch PCR sowohl DNA für eine Southern Blot Analyse isoliert, aufgereinigt und mit der 5’ Sonde nach HindIII Verdau überprüft (a), als auch aus den immunrelevanten Organen (Knochenmark, Milz und Thymus) Proteinextrakte für eine Western Blot Analyse hergestellt und auf das Vorhandensein von EFhd2 Protein untersucht (b). a) b) WT2 | KO4 | WT6 | KO8 [kDa] KM 45 [kb] WT2 M KO4 T KM M WT6 T KM M KO8 T KM M T Å AD1 10 8 Å WT Å EFhd2 6 31 5 97 5‘ Sonde (HindIII) Å HSP90 66 Abb. 5.13.: Verifizierung homozygoter Mäuse der F2 Generation des ESZ Klons AD1. a) DNA PCR-genotypisierter Mäuse (WT2, KO4, WT6, KO8) wurde aus Schwanzbiopsien isoliert, HindIII verdaut, über ein Agarosegel aufgetrennt und auf eine PVDF Membran transferiert. Die Southern Blot Analyse wurde mit der radioaktiven 5’ Sonde für HindIII durchgeführt. Die erwartete Fragmentgröße des WT Allels (WT) ist 9,6 kb und des rekombinierten AD1 Allels (AD1) 14,8 kb (siehe Abb. 5.12.b). Größenstandard: 1 kb DNA-Leiter. b) Western Blot Analysen wurden von Zelllysaten lymphatischer Gewebe (Knochenmark (KM), Milz (M), Thymus (T)) derselben Mäuse mittels polyklonalem, EFhd2-spezifischen Hasenantikörpers durchgeführt. Detektion erfolgte mit HRP-gekoppeltem, Hasen-spezifischen IgG Sekundärantikörper. Als Ladekontrolle wurde ein HSP90-spezifischer (heat shock protein 90) Antikörper verwendet. Sowohl auf DNA- als auch auf Proteinebene ist eindeutig erkennbar, dass beide WT Mäuse nur das WT Allel und das EFhd2 Protein besitzen, die zwei KO Mäuse jedoch nur das rekombinante Allel tragen und damit auch kein EFhd2 Protein mehr herstellen können (5.13.b). Es handelt sich bei der AD1 Linie, wenn die Mäuse für AD1 homozygot sind, also um konstitutiv EFhd2 defiziente Mäuse. 38 Ergebnisse 5.4. Analyse der EFhd2 defizienten Mauslinie 5.4.1. Proteinexpression im ESZ Stadium Um der Frage nachzugehen, ob das EFhd2 Protein bereits im Stadium der ESZ exprimiert wird, wurde eine Western Blot Analyse mit Zelllysaten aus ESZ durchgeführt. Hierfür wurden ESZ der Linie V6.5 und AD1 verwendet. Dadurch wurde ebenso geklärt, ob ein Gendosiseffekt in AD1 ESZ auftritt, da diese nur noch ein funktionelles WT Allel und als zweites Allel die Insertionskassette besitzen. Sollte das der Fall sein, wäre zu erwarten, dass bei AD1 nur etwa die Hälfte der EFhd2 Proteinmenge im Vergleich zur homozygoten V6.5 Linie mit zwei WT Allelen vorliegt. In Abbildung 5.14.a) ist kein Unterschied in der Bandenintensität zwischen Signalen von V6.5 und AD1 für EFhd2 sowie für die Ladekontrolle Aktin bei beiden eingesetzten Proteinmengen zu erkennen. Auch bei quantitativer Auswertung der Bandenstärke mittels normalisierter densitometrischer Analyse der Western Blots, gezeigt in Abbildung 5.14.b), gibt es keinerlei Anzeichen einer Haploinsuffizienz von EFhd2, da die EFhd2 Expression in AD1 auf etwa gleichem Niveau liegt wie in V6.5. Dies ist ein Hinweis, dass heterozygote Mäuse (WT/AD1) nicht bereits einen Phänotyp entwickeln. Dieser Versuch zeigt deutlich, dass für die korrekte Expression des EFhd2 Proteins nicht zwei funktionelle efhd2 Lozi benötigt werden, sondern bereits ein Allel ausreicht, um die gleich Proteinmenge bereitzustellen. Wäre eine Haploinsuffizienz gegeben, würde sich das in der geringeren Proteinmenge der AD1 ESZ zeigen. V6.5 [kDa] 45 31 40 80 b) AD1 40 80 [µg] Å EFhd2 45 Å Aktin normalisierte Bandenintensität [AU] a) 200 V6.5 AD1 150 100 50 0 40 80 Eingesetzte Gesam tproteinm enge [µg] Abb. 5.14.: EFhd2 Expression in V6.5 und AD1 ESZ. a) Je 40 und 80 µg Protein aus Zelllysaten der ESZ Linie V6.5 und AD1 wurden nach Proteinkonzentrationsbestimmung mittels BCA Protein Assay im Western Blot auf Expressionsstärke des EFhd2 Proteins untersucht. Detektiert wurde mit polyklonalem, EFhd2-spezifischen Hasenantikörper und HRP-gekoppeltem, Hasen-spezifischen IgG Sekundärantikörper. Als Ladekontrolle diente Aktin. b) Die Bandenintensität von V6.5 und AD1 im Western Blot (a) wurde mittels der Software Scion Image for Windows quantitativ ausgewertet und der Hintergrund subtrahiert. Die EFhd2 Expression wurde anschließend auf die Aktin Expression normalisiert und ist in Arbitrary Units (AU) angegeben. 39 Ergebnisse Auch β-Galaktosidase, das Protein des lacZ Gens, wird bereits in diesem Stadium unter dem endogenen efhd2 Promotor exprimiert (Daten nicht gezeigt). Da sowohl β-Galaktosidase als auch EFhd2 Protein in ESZ Linien nachweisbar sind, ist der efhd2 Promotor bereits im ESZ Stadium aktiv. Die fehlende efhd2 Expression hat aber keinen gravierenden Einfluss auf die Embryonalentwicklung, da EFhd2 defiziente Mäuse lebend geboren werden. 5.4.2. LacZ Expression im Gehirn Da bekannt ist, dass EFhd2 in verschiedenen Organen exprimiert wird, sollte durch das lacZ Reportergen untersucht werden, ob auch β-Galaktosidase als Protein vorhanden ist und damit, ob bestätigt werden kann, dass der efhd2 Promotor im Gehirn stark aktiv ist, wie Northern Blot Daten zeigen (Avramidou et al., 2007), was die Voraussetzung einer EFhd2 Proteinexpression ist. Zudem sollte auch überprüft werden, ob eine Lokalisation und spezifische Zuordnung des EFhd2 Proteins in bestimmte Gehirnregionen möglich ist. Durch eine β-Galaktosidase-Färbelösung, die durch β-Galaktosidase hydrolysiert wird und sich dadurch blau verfärbt, kann die Expression des lacZ Gens durch den endogenen efhd2 Promotor und entsprechend das EFhd2 Protein nachgewiesen werden. Um einen möglichen Einfluss einer EFhd2 Defizienz auf die Ausbildung von Gehirnstrukturen auszuschließen, wurden in Abbildung 5.15. neben einer WT Maus je ein heterozygotes Weibchen und Männchen (WT/AD1) für den Versuch genutzt. Die WT Maus dient als Negativkontrolle und zeigt keinerlei Färbung. Bei den heterozygoten Mäusen hingegen ist eine starke Blaufärbung des gesamten zerebralen Kortex kranial sowie kaudal zu beobachten, wohingegen das Zerebellum, die Sehnerven und der Rückenmarksstrang keine flächige Färbung zeigen. Eine starke Expression von EFhd2 im Kortex von Mäusen konnte damit bestätigt werden. WT / WT ♂ WT / AD1 ♂ WT / AD1 ♀ kranial kaudal 5 mm Abb. 5.15.: β-Galaktosidase Expression im Gehirn von WT und AD1 heterozygoten Mäusen. Gehirne von homozygoten (WT/WT) und heterozygoten (WT/AD1) Mäusen wurden präpariert, fixiert und mit einer β-Galaktosidase-Färbelösung gefärbt. Die Gesamtpräparate wurden unter einem Stereomikroskop mit 10x Vergrößerung von kranial sowie kaudal aufgenommen. In Anwesenheit des β-Galaktosidase Proteins kommt es zu einer Blaufärbung durch Hydrolyse der Färbelösung. 40 Ergebnisse β-Galaktosidase-Färbungen der Milz zeigten aufgrund der geringeren Expression von efhd2 (Avramidou et al., 2007) und damit auch von lacZ nur sehr schwache Färbungen (Daten nicht gezeigt). Offensichtlich ist eine starke Expression für deutlich sichtbare Färbungen nötig. Im humanen Gehirn wurde die EFhd2 Expression von Vega und Kollegen bestätigt (Vega et al., 2008). Weitere Fragestellungen, wie die genaue Identifizierung von Regionen und Strukturen des Gehirns, die efhd2 exprimieren, oder die Analyse, ob EFhd2 defiziente Mäuse im Bezug auf das Gehirn oder ihr Verhalten abnormal entwickelt sind, waren nicht mehr Inhalt dieser Arbeit, werden aber in einem weiteren Projekt der Arbeitsgruppe, das sich speziell mit der Rolle von EFhd2 in Tauopathien beschäftigt, fortgeführt. 5.4.3. EFhd2 Expression in peritonealen Zellen des B1a Phänotyp Aus Versuchen mit WEHI231 Zellen wurde die Hypothese abgeleitet, dass EFhd2 eine Rolle als Signalmolekül in unreifen B Zellen spielt, da es die BZR vermittelte Apoptose reguliert, den Schwellenwert des BZR Signals senkt (Avramidou et al., 2007) und den BZR induzierten Kalziumflux steuert (Kroczek et al., 2010). Da B1a Zellen meist sehr sensitiv auf Veränderungen im Signalosom reagieren (persönliche Kommunikation, Prof. Nitschke) (Jellusova et al., 2010; Wang et al., 1998), wurde überprüft, ob und wie stark EFhd2 in peritonealen B1a B Zellen im Vergleich zu Milz B Zellen exprimiert wird. Um dies zu beantworten, wurden von sechs c57Bl/6 WT Mäusen die B1a (CD19+/CD43+/CD5+) und die B2 B Zellen (CD19+/CD43+/CD5-) am MoFlo® Cell Sorter sortiert sowie Milz B Zellen (CD19+) am VarioMACS® aufgereinigt und die EFhd2 Proteinexpression mittels Western Blot und quantitativer, densitometrischer Analyse überprüft. Das EFhd2 Signal ist in Bezug auf Aktin bei 1 x 106 B1a B Zellen vergleichbar mit 2 x 106 Milz B Zellen (Abb. 5.16.a). Daraus lässt sich auf eine deutlich höhere EFhd2 Expression in B1a B Zellen als in ruhenden Milz B Zellen schließen. Dieses Ergebnis wird in der quantitativen Analyse noch deutlicher (Abb. 5.16.b). Auf Aktin normalisiert, exprimieren B1a B Zellen fast dreimal mehr EFhd2 als Milz B Zellen und etwa doppelt soviel wie peritoneale B2 B Zellen. 41 Ergebnisse [kDa] Milz B Zellen 0,5 1 2 4 6 B1a B2 1 1,1 b) x 106 Zellen ÅEFhd2 31 45 ÅAktin normalisierte Bandenintensität [AU] a) 80 60 40 20 0 mBz B1a Zellpopulation B2 Abb. 5.16.: EFhd2 Expressionsanalyse von peritonealen B1a, B2 B Zellen und Milz B Zellen. a) Die Peritonealhöhle von 6 c57Bl/6 Mäusen wurde gespült und die Zellen mittels MoFlo® Cell Sorter in B1a (CD19+/CD43+/CD5+, Reinheit: 77,68%) und B2 (CD19+/CD43+/CD5-, Reinheit: 88,67%) B Zellen sortiert. Die Milz B Zellen wurden mittels VarioMACS® CD19-Positivselektion sortiert. Die Zellzahlen wurden bestimmt, aus der angegebene Menge Zellen Zelllysate hergestellt und mittels Western Blot die Expressionsstärke von EFhd2 analysiert. Detektiert wurde mit polyklonalem, EFhd2spezifischen Hasenantikörper und HRP-gekoppeltem, Hasen-spezifischen IgG Sekundärantikörper. Als Ladekontrolle diente Aktin. b) Die Bandenintensität von EFhd2 für jede Zellpopulation des Western Blots (a) wurde mittels Scion Image for Windows quantitativ ausgewertet und der Hintergrund subtrahiert. Die ermittelte EFhd2 Expression wurde anschließend auf die Aktin Expression normalisiert und ist in Arbitrary Units (AU) angegeben. 5.4.4. Expressionsänderung von EFhd1 infolge der EFhd2 Defizienz Da EFhd1 zu EFhd2 85% homolog ist (Dutting et al., 2011), sollte überprüft werden, ob die EFhd1 Expression bei EFhd2 Defizienz hochreguliert wird, um eventuell die Funktion von EFhd2 zu übernehmen. Das EFhd1 Protein wird nur in Pro B Zellen exprimiert, aber in Prä B Zellen herunterreguliert und wurde weder in unreifen noch in reifen B Zellen mehr detektiert (S. Dütting, Dissertation, 2010). Mittels Western Blot Analyse wurde die Proteinexpression von EFhd1 und EFhd2 in immunrelevanten Organen von je zwei WT und KO Mäusen untersucht (Abbildung 5.17.). In den untersuchten Organen der WT Mäuse wurde ein deutliches Signal für EFhd2 detektiert, nicht aber in denen der defizienten Mäuse. Ein Signal für EFhd1 konnte nicht detektiert werden. Dies liegt daran, dass die Pro B Zellpopulation nur etwa 5% der B Zellen im Knochenmark ausmacht und daher das Signal zu schwach ist. Wäre aber die EFhd1 Expression infolge der EFhd2 Defizienz in KO Mäusen auf ein ähnliches Maß erhöht, müsste das Signal detektierbar sein. In dem als Positivkontrolle eingesetzten Zelllysat der Pro B Zelllinie 38B9 wurde durch den EFhd1-spezifische Antikörper ein Signal erhalten. HSP90 wurde als Ladekontrolle verwendet und ist vergleichbar. 42 Ergebnisse Knochenmark WT [kDA] 714 724 KO 713 721 Milz WT 714 724 Thymus KO WT KO 713 721 714 724 713 721 Tier Nr. 34 ÅEFhd2 38B9 34 ÅEFhd1 97 ÅHSP90 Abb. 5.17.: EFhd1 Proteinexpressionsanalyse in EFhd2 defizienten Mäusen. Von je zwei WT und KO Mäusen (Tier Nr.) wurden die Zelllysate lymphatischer Organe (Knochenmark, Milz, Thymus) auf die Expressionsmenge von EFhd1 und EFhd2 untersucht. Es wurden zwei identische Western Blots angefertigt, da ihre Molekularmasse etwa gleich groß ist. Zur Detektion wurde der polyklonale, EFhd2-spezifische und ein polyklonaler, EFhd1-spezifischer Hasenantikörper und ein HRP-gekoppelter, Hasen-spezifischer IgG Sekundärantikörper eingesetzt. Als Ladekontrolle diente HSP90. Aufgrund seiner bekannten geringen Expressionsstärke war EFhd1 Protein im Knochenmark nicht detektierbar. Man würde aber erwarten, dass es zumindest ähnlich stark wie EFhd2 in WT Mäusen exprimiert wäre, wenn es tatsächlich die Funktionen des fehlenden EFhd2 kompensatorisch ersetzen würde. Außerdem wird EFhd1 unter einem anderen Promotor als EFhd2 exprimiert und zeigt trotz der hohen Homologie dennoch deutliche Unterschiede zu EFhd2 (Dutting et al., 2011). Somit kann EFhd1 höchstwahrscheinlich nicht die EFhd2 Defizienz kompensieren. 5.4.5. Vererbung des AD1 Allels Um einen möglichen Einfluss der Deletion des efhd2 Gens auf die Embryonalentwicklung auszuschließen, wurden alle Mäuse der AD1 Linie erfasst und genotypisiert. Dadurch konnte die Vererbung des rekombinanten AD1 Allels überprüft werden. Hierbei wurde deutlich, dass es sich bei der Vererbung des AD1 Allels um einen normalen Erbgang nach den mendelschen Gesetzmäßigkeiten handelt (Tab. 5.3.). Das AD1 Allel wird zufällig, weder bevorzugt noch benachteiligt weitergegeben. Die prozentuale Verteilung ist in Tabelle 5.3. für alle Mäuse, aber auch nach Geschlechtern getrennt zusammengefasst. Es wurden annährend 50% heterozygote Mäuse und je 25% homozygote beider Genotypen (WT und KO) geboren. Aus der Analyse lies sich keine Evidenz ermitteln, dass AD1 besser, schlechter oder geschlechtsspezifisch vererbt würde. Auch in der Geschlechterverteilung bestand die Nachkommenschaft zu etwa gleichen Teilen aus Männchen und Weibchen. 43 Ergebnisse Tab. 5.3.: Vererbung des AD1 Allels in der gesamten Nachkommenschaft. Die Verteilung der Genotypen der AD1 Linie ist sowohl für alle Mäuse als auch nach Geschlecht getrennt in Prozent (%) und in absoluter Zahl (AZ) angegeben. Auch die Geschlechterverteilung aller Mäuse ist in der letzten Spalte aufgeführt. Wildtyp Heterozygot Geschlechterverteilung Knockout % AZ % AZ % AZ % AZ Tiere 28,89 117 47,16 191 23,95 97 100 405 Männchen 30,35 61 46,76 94 22,89 46 49,63 201 Weibchen 27,45 56 47,55 97 25,00 51 50,37 204 5.4.6. Analyse der Lebensdauer von EFhd2 defizienten Mäusen Bis zum Zeitpunkt der Anfertigung dieser Arbeit wurden zwei Kohorten von Mäusen in der offenen Tierhaltung gehalten, um zu überprüfen, ob sich die EFhd2 Defizienz auf die Lebensdauer der Versuchstiere auswirkt. Unter Labortierhaltungsbedingungen schwankt das Durchschnittsalter von c57Bl/6 Mäusen von 104,4 Wochen bis zu 113,4 Wochen für Weibchen und 125,4 Wochen für Männchen (Goodrick et al., 1990; Kunstyr and Leuenberger, 1975; Storer, 1966). Für diesen Versuch startete die erste Kohorte mit acht WT und neun KO Mäusen, wovon zwei WT Mäuse nach 44 bzw. 63 Wochen starben und eine KO Maus nach 66 Wochen. Die verbleibenden Mäuse waren mit 104 Wochen zum Ende der Analyse noch am Leben. In der zweiten Kohorte wurden vier WT und fünf KO Mäuse untersucht, wovon lediglich ein KO im Alter von 97 Wochen starb, die anderen Mäuse waren zum Zeitpunkt der Zusammenschrift der Arbeit mindesten 93 Wochen alt. In der gesamten Beobachtungszeit starben zwei WT und zwei KO Mäuse verschiedenen Alters. Insgesamt wurden acht WT Männchen und vier WT Weibchen, sowie sieben KO Männchen und sieben KO Weibchen für die Untersuchung der Lebensdauer eingesetzt. 85% aller Mäuse lebten bei Versuchsende noch. Auf den Genotyp bezogen starben 14,2% der KO und 16,6% der WT Mäuse vorzeitig. In Tabelle 5.4. ist eine Zusammenfassung der untersuchten Mäuse aufgeführt. Damit wurde kein Einfluss der EFhd2 Defizienz auf die Lebensdauer von Mäusen festgestellt. Tab. 5.4.: Beobachtung der Lebensdauer zweier Mauskohorten. Aufgeführt ist die Tiernummer (Nr.), der Genotyp (Geno), das Geschlecht (M/W), der Geburtstag (Ì), der Sterbetag (h) und das Alter in Wochen. Nr. 9958 A020 9968 A327 A112 A114 9953 9959 9960 9962 9965 9969 9970 9971 A021 A024 A121 Geno WT WT KO WT KO KO WT KO KO KO WT KO KO KO WT WT WT M/W ♂ ♂ ♀ ♀ ♂ ♂ ♀ ♂ ♂ ♂ ♀ ♀ ♀ ♀ ♂ ♂ ♂ 1. Kohorte Ì 23.08.09 24.08.09 23.08.09 15.09.09 01.09.09 01.09.09 23.08.09 23.08.09 23.08.09 23.08.09 23.08.09 23.08.09 23.08.09 23.08.09 24.08.09 24.08.09 28.08.09 h Alter 28.06.11 44 08.11.10 63 31.11.10 66 102 104 104 105 105 105 105 105 105 105 105 105 105 105 44 Nr. A664 B222 A781 A783 A786 B048 B049 B050 B055 Geno M/W KO ♀ KO ♀ WT ♂ KO ♂ WT ♀ WT ♂ KO ♂ WT ♂ KO ♀ 2. Kohorte Ì 05.10.09 19.11.09 14.10.09 14.10.09 14.10.09 04.11.09 04.11.09 04.11.09 04.11.09 h Alter 16.08.11 97 93 95 95 95 95 95 95 95 Ergebnisse 5.4.7. Durchflusszytometrische Analysen lymphoider Zellstadien immunrelevanter Organe in EFhd2 defizienten Mäusen 5.4.7.1. Analyse des Knochenmarks Bei Versuchen mit der B Zelllinie WEHI231 wurde entdeckt, dass EFhd2 in die BZR vermittelte Apoptose involviert ist: Fehlte EFhd2, überlebten mehr Zellen nach BZR Stimulation (Avramidou et al., 2007). Daraus wurde die bereits erwähnte Hypothese abgeleitet, dass EFhd2 eine Rolle als Signalmolekül in unreifen B Zellen spielt. Daher sollten im Knochenmark von EFhd2 defizienten Mäusen mehr unreife B Zellen zu finden sein als in WT Mäusen. Um dies zu überprüfen, wurden in durchflusszytometrischen Analysen wichtige Entwicklungsstadien der B lymphoiden Linie des Knochenmarks, vor allem unreife und reife B Zellen, anhand charakteristischer Oberflächenmarker untersucht. Für die Analysen wurde CD19 als Oberflächenmarker aller B Zellstadien gewählt. Es wurden zuerst die Lymphozyten durch ihre Morphologie im FSC / SSC, dann alle CD19+ Zellen ausgewählt und darauf hin mit verschiedenen Färbungen die einzelnen Stadien voneinander diskriminiert. In Abbildung 5.18.a) ist die Gating-Strategie für die analysierten B Zellstadien exemplarisch dargestellt. Alle Versuche wurden als Dot-Plots auf die relative Frequenz der ausgewählten Populationen analysiert und statistisch ausgewertet Die Frequenzen sowie absolute Zellzahlen sind als Balkendiagramm in Abbildung 5.18.b) und c) zusammengefasst. a) WT WT KO KO Prä SSC CD25 Rezirk FSC IgD-bio Sa-PE Reif Unreif IgD CD19 IgD-bio Sa-PE B220 IgM FSC κ λ Pro κ c-kit Rezirk λ B220 λ 45 λ Ergebnisse b) Frequenz der analysierten Zellpopulation [%] 50 n = 10 n=8 40 WT KO 30 20 10 c) + + C + C D8+ D C D8 + 8 C C D4+ D C D4 + 4 + la lam mla bd bd a+ m bda a+ kakapp kpa a+ pp a pa+ R R eif eRi efi f i U Unr nUr eif neri efi f rä R R ez ez irk i R ez P Pr rä Pä + P Pr ro Po ro C C D1 DC 9+ 19 D 19+ Ly m L ph ym Loyz ph myt oz phe on z 0 6 n=6 n=4 WT KO 20 15 10 30 C D 8+ ka pp a+ U nr e if 20 R ez irk Pr ä Pr o n yt e Ly m ph oz C D 19 + 10 R ei f 00 C D 4+ 5 la m bd a+ Zellzahl der analysierten Popultaion [x 10 ] 25 Abb. 5.18.: Durchflusszytometrische Analysen B lymphoider Entwicklungsstadien im Knochenmark anhand charakteristischer Oberflächenmarker von WT und KO Mäusen. a) Knochenmarkszellen wurden isoliert, zur Analyse mit verschiedenen fluoreszenzgekoppelten Antikörpern gegen verschiedene stadienspezifische Oberflächenmarker gefärbt und im Durchflusszytometer untersucht. Die Zellpopulationen sind mit den entsprechenden Oberflächenmarkern in Dot-Plots dargestellt. Die durchschnittliche relative Frequenz (%) der Zellpopulationen ist je an den Gates angegeben. Für alle Analysen wurde die Lymphozytenregion im Forward- / Sidescatter (FSC, SSC) vorausgewählt und für alle B lymphoiden Entwicklungsstadien wurde CD19+ als Oberflächenmarker vorausgesetzt (B Zellen). Hiervon ausgehend wurden mit entsprechenden Oberflächenmarkern das Auftreten aller weiterer Stadien analysiert: Pro B Zellen (Pro, B220+/ckit+), Prä B Zellen (Prä, B220+/CD25+), rezirkulierende B Zellen (Rezirk; B220high/ckitoder B220high/CD25-), unreife B Zellen (Unreif; IgMhigh/IgDlow.), reife B Zellen (Reif; IgMhigh/IgDhigh) und das Verhältnis der kappa+ (κ) und lambda+ (λ) Leichtkettennutzung. Zwei T Zellpopulationen (CD4+ & CD8+) wurden von der Lymphozytenregion ausgehend analysiert. Die abgebildeten Daten repräsentieren 10 unabhängige Experimente mit ähnlichen Ergebnissen. (T Zellen nicht gezeigt). b) Frequenzen aller analysierten Zellpopulationen. Der prozentuale Anteil der Populationen wurde nach den unter a) angegebenen Kriterien ausgewertet. Balken repräsentieren die mittlere Frequenz ± SEM 10 unabhängiger Versuche für die B lymphoiden Stadien bzw. 8 für die T Zellen. c) Absolute Zellzahlen der analysierten Populationen. Soweit möglich, wurden absolute Zellzahlen kalkuliert. Die Zellpopulationen entsprechen denen aus a). Es wurden 6 Experimente für die B lymphoiden Entwicklungsstadien bzw. 4 für die T Zellen ausgewertet. Balken repräsentieren den Mittelwert ± SEM. 46 Ergebnisse Entgegen der Hypothese, dass EFhd2 eine Rolle bei der Apoptose unreifer B Zellen spielt, ist nur ein marginaler Anstieg der unreifen B Zellpopulation im Knochenmark, aber kein Unterschied zu den WT Mäusen zu beobachten (Abb. 5.18.b). In der Analyse des Knochenmarks wurden keine Anomalien bei der Entwicklung der B Zellen sowie der CD4+ und CD8+ T Zellpopulationen festgestellt. Die B Zellentwicklung im Knochenmark der KO Mäuse verlief analog zu der der WT Mäuse, blieb von der EFhd2 Deletion offensichtlich unbeeinflusst. Alle Stadien sind in gleicher Frequenz und in ähnlicher Absolutzahl vorhanden. Auch das Verhältnis der Nutzung der κ- (CD19+|κ+) und λ-leichten Kette (CD19+| λ +) ist nicht verändert. Wie aus den Einzeldaten zu erwarten, wurden in der statistischen Analyse keine Unterschiede festgestellt. Möglicherweise wirkt EFhd2 in vivo erst in späteren Zellstadien proapoptotisch oder aber die Zelle muss erst ein Aktivierungssignal durch den BZR bekommen, damit EFhd2 seine proapoptotische Funktion ausführt. Ebenso stellen WEHI231 Zellen nicht in jeder Hinsicht unreife B Zellen dar, da sie sich ständig im Zellzyklus befinden und nicht wie unreife B Zellen des Knochenmarks ruhen, wohingegen ruhende Zellen in die Proliferation eintreten, nachdem sie aktiviert wurden. Dies sollte in Aktivierungs- und Immunisierungsversuchen untersucht werden. Ein Einfluss von EFhd2 auf die analysierten B Zellentwicklungsstadien im Knochenmark ist somit nicht gegeben. 5.4.7.2. Analyse des Thymus Da die EFhd2 Deletion konstitutiv in allen Zellen der Maus vorhanden ist und EFhd2 auch in CD4+, vor allem aber in CD8+ T Zellen exprimiert wird (Vuadens et al., 2004), würde man einen Einfluss auf die Zellpopulationen des Thymus erwarten. Daher wurde der Thymus auf die T Zellentwicklung und die Anwesenheit von B Zellen durchflusszytometrisch untersucht. Abbildung 5.19.a) zeigt exemplarisch Dot-Plots von WT und KO Mäusen mit den zugehörigen Frequenzen. Im Thymus sind kaum B Zellen zu erwarten, da ausschließlich T lymphoide Zellen im Thymus reifen, denn im Thymus wird die B Zelllymphopoese durch die Mirkoumgebung inhibiert und B Zellen bleiben im frühen Pro B Zellstadium arretiert (Hashimoto et al., 2002). In Abbildung 5.19.b) sind die Frequenzen der reifen B Zellen und der CD4+, CD8+ sowie DP T Zellen aller Experimente zusammengefasst und in Abbildung 5.19.c) die absoluten Zellzahlen. 47 Ergebnisse a) WT WT KO KO CD4+ DP CD4 SSC CD8+ FSC CD8 IgM B Zellen CD19 40 20 lls T Ze B ce lle lls Bn ce B 8+ C T C D 8+ T DC 8D + C 4+ C D 4+ T D C4D + s te T ce D PD lls TP ce lls DP Ly m Ly ph m p oLz hocy te y my pthe s on cy 0 150 100 50 00 5 10 C D 8+ 60 WT n = 6 KO C D 4+ 80 200 D P nn == 44 Ly m ph oz yt en nn == 10 10 Zellzahl der analysierten Popultaion [x 106] c) 100 F r e q u e n z d e r a n a ly s ie r te n P o p u la tio n [% ] b) Abb. 5.19.: Durchflusszytometrische Analysen lymphozytärer Entwicklungsstadien im Thymus anhand charakteristischer Oberflächenmarker von WT und KO Mäusen. a) Thymuszellen wurden isoliert, zur Analyse mit verschiedenen fluoreszenzgekoppelten Antikörpern gegen verschiedene stadienspezifische Oberflächenmarker gefärbt und im Durchflusszytometer untersucht. Die Zellpopulationen sind mit den entsprechenden Oberflächenmarkern in Dot-Plots dargestellt. Die durchschnittliche relative Frequenz (%) der Zellpopulationen ist je an den Gates angegeben. Für alle Analysen wurde die Lymphozytenregion im Forward- / Sidescatter (FSC, SSC) vorausgewählt. Hiervon ausgehend wurde die Frequenz von CD4+ und CD8+ T Zellen und deren doppeltpositives Vorläuferstadium (DP) sowie reife B Zelle (CD19+/IgMhigh) mit entsprechenden Oberflächenmarkern analysiert. Die abgebildeten Daten repräsentieren 10 unabhängige Experimente für T lymphoide bzw. 4 für B lymphoide Zellen mit ähnlichen Ergebnissen. b) Frequenzen der analysierten Zellpopulationen. Der prozentuale Anteil der Populationen wurde nach den unter a) angegebenen Kriterien ausgewertet. Balken repräsentieren die mittlere Frequenz ± SEM 10 unabhängiger Versuche für die T Zellstadien bzw. 4 für die B Zellen. c) Absolute Zellzahlen der analysierten Populationen. Soweit möglich, wurden absolute Zellzahlen kalkuliert. Die Zellpopulationen entsprechen denen aus a). Es wurden 6 Experimente für die T lymphoiden Entwicklungsstadien ausgewertet. Balken repräsentieren den Mittelwert ± SEM. 48 Ergebnisse Eindeutig festzustellen war, dass die analysierten T Zellpopulationen nicht von der EFhd2 Defizienz beeinflusst wurden. Auch die Frequenzen der reifen B Zellen im Thymus zeigten keinen Unterschied. Bei den Lymphozyten und dem doppeltpositiven Vorläuferstadium der T Zelle war zwar ein großer Unterschied zu beobachten, jedoch war auch der Standardfehler des Mittelwertes sehr groß. Die CD4+ und CD8+ T Zellpopulationen blieben unverändert. Die statistische Analyse ergab keine signifikanten Unterschiede. Auf die Entwicklung von CD4+ und CD8+ T Zellen im Thymus und die Immigration von reifen B Zellen in den Thymus hat das Fehlen von EFhd2 keine Auswirkung. 5.4.7.3. Analyse der Milz und der inguinalen Lymphknoten Da keine Unterschiede bei unreifen B Zellen im Knochenmark auftraten, wurde die Milz von WT und KO Mäusen verglichen, da auch T1 Zellen beim Eintritt in die Milz einen Toleranzkontrollpunkt durchlaufen und in Apoptose gehen können. Möglicherweise wirkt EFhd2 hier proapoptotisch oder ist in die Entwicklung der Zellen anhand der BZR Signalstärke involviert (Casola et al., 2004). Abbildung 5.20.a) zeigt exemplarisch die GatingStrategie. Weder bei den relativen Frequenzen (5.20.b) noch den absoluten Zellzahlen (5.20.c) trat ein Unterschied zwischen WT und KO Mäusen auf. Auch in der Milz liegen die verschiedenen B Zellpopulationen trotz EFhd2 Defizienz dem WT entsprechend vor. Dies gilt im gleichen Maße für die analysierten T Zellpopulationen. Weder der Toleranzkontrollpunkt beim Eintritt der transitionellen T1 B Zellen in die Milz, bei dem Apoptose ein wichtige Rolle spielt, noch die Differenzierung in die verschiedenen B Zellstadien durch Feinmodulation der BZR Signalstärke wurden von der EFhd2 Deletion beeinflusst. Daher wird auch bei der folgenden Analyse der B Zellen der inguinalen Lymphknoten keine Abweichung erwartet. Respektive wird eine Funktion von EFhd2 eventuell in B Zell Populationen der Peritonealhöhle zu finden sein, da auch dort Apoptosevorgänge eine große Rolle spielen, oder aber erst nach Aktivierung der Zellen durch ein geeignetes Antigen. 49 Ly m 5 ll CD21 λ 50 ka pp a + la aa++ m bd a aa++ + C + D T 4+ + T C + D+ T 8 T+ akD4 tDT4+ + FSC 2 T3 T3T 3 IgM AA4.1 CD5 SSC KO TTT22 λ CD8 CD19 FSC TTT11 1 R re ei U rfe nr r ei e fre λ Tllss b) B5-) 2-) CD23 WT BBB1 11 κ a) Mnne ze 9++ la Flo r ar yt en . . C D 9 19 + ph oz Frequenz der analysierten Population [%] Ergebnisse WT KO T B2 B1 IgM Unreif Reif B220 Fo T1 | T2 T3 Mz κ CD23 λ CD8+ CD4+ CD4 100 n = 10 n = 8 WT KO KO 80 60 40 20 0 Ergebnisse c) n=6 60 n=4 WT KO 50 40 30 20 10 T ka 3 pp la a + m bd a+ C D 4+ C D 8+ ak tT T2 40 T1 B 2 B 1 z M Fo 20 Ly m ph o zy te n C D 19 + 00 T R ei U f nr ei f Zellzahl der analysierten Popultaion [x 106] 70 Abb. 5.20.: Durchflusszytometrische Analysen der B Zellstadien der Milz anhand charakteristischer Oberflächenmarker von WT und KO Mäusen. a) Die Milzen wurde entnommen, Einzelzellsuspensionen hergestellt, mit verschiedenen fluoreszenzgekoppelten Antikörpern gegen verschiedene stadienspezifische Oberflächenmarker gefärbt und im Durchflusszytometer untersucht. Die Zellpopulationen sind mit den entsprechenden Oberflächenmarkern in Dot-Plots dargestellt. Die durchschnittliche relative Frequenz (%) der Zellpopulationen ist je an den Gates angegeben. Für alle Analysen wurde die Lymphozytenregion im Forward- / Sidescatter (FSC, SSC, 1. Paneel links) vorausgewählt. Von der Lymphozytenregion ausgehend wurden B1 (IgM+/CD5+) und B2 B Zellen (IgM+/CD5-) sowie T Zellen (T, IgM-/CD5+) analysiert (1. Paneel rechts). Des Weiteren wurden unreife (B220+/AA4.1+) und reife B Zellen (B220+/AA4.1-) analysiert (2. Paneel rechts). Die Population der unreifen B Zellen wurde weiter unterschieden in die Fraktionen transitioneller B Zellen 1 (T1: CD23-/IgMhi), 2 (T2: CD23+/IgMhi) und 3 (T3: CD23+/IgMint) (3. Paneel rechts). Als Oberflächenmarker für alle B Zellen wurde CD19+ genutzt (2. Paneel links). Von CD19+ ausgehend wurden Marginalzonen (Mz, CD21+/CD23low) und follikuläre B Zellen (Fo, CD21+/CD23+; 3. Paneel links) sowie das Verhältnis der kappa+ (κ) und lambda+ (λ) Leichtkettennutzung in B Zellen analysiert (4. Paneel links). Zwei T Zellpopulationen (CD4+ & CD8+) wurden unterschieden (4. Paneel rechts). Die abgebildeten Daten repräsentieren 10 unabhängige Experimente für die B Zellstadien bzw. 8 für T Zellen mit ähnlichen Ergebnissen. (Aktivierte T Zellen nicht gezeigt (akt T, CD4+/CD25+)). b) Frequenzen aller analysierten Zellpopulationen. Der prozentuale Anteil der Populationen wurde nach den unter a) angegebenen Kriterien ausgewertet. Balken repräsentieren die mittlere Frequenz ± SEM 10 unabhängiger Versuche für die B lymphoiden Stadien bzw. 8 für die T Zellen. c) Absolute Zellzahlen der analysierten Populationen. Soweit möglich, wurden absolute Zellzahlen kalkuliert. Die Zellpopulationen entsprechen denen aus a). Es wurden 6 Experimente für B lymphoiden Entwicklungsstadien bzw. 4 für T Zellen ausgewertet. Balken repräsentieren den Mittelwert ± SEM. Die B Zellstadien der inguinalen Lymphknoten wurden anhand der gleichen Oberflächenmarker wie die der Milz untersucht. Der Lymphknoten unterscheidet sich in der Zusammensetzung seiner B und T Zellpopulationen von der Milz nur durch das Fehlen der Marginalzone (Martin and Kearney, 2002). Durch andere Oberflächenmarkersets lassen sich zwar auch im Lymphknoten B Zellen finden, die monozytoide oder nodale Marginalzonen B Zellen genannt werden und den Marginalzonen B Zellen ähnliche Charakteristika aufweisen (Tierens et al., 1999); diese wurden jedoch nicht analysiert. Daher wurde auf die Darstellung der Gating-Strategie in Dot-Plots und auf die Kalkulation der absoluten Zellzahlen verzichtet. 51 Ergebnisse In Abbildung 5.21. sind die relativen Zellfrequenzen analog der Analyse der Milz als Balkendiagramm zusammengefasst. Vier unabhängige Versuche wurden ausgewertet und statistisch analysiert. Es wurden keine Unterschiede festgestellt. Da die Fehlerbalken sehr gering waren, konnte davon ausgegangen werden, dass die EFhd2 Deletion die analysierten Zellpopulationen der inguinalen Lymphknoten nicht veränderte und die Analyse trotz geringer Versuchszahl valide und repräsentativ war. Frequenz der analysierten Population [%] 100 WT KO KO n=4 80 60 40 20 B 1 B B1B 2 1 ( B C 2 D (C 5BD5 ) 2 T -) c T ell ce s Tl M ls at RMa ure Im etiufr UImma e nrm tu eaiture ka ka f re pkpappa + la la papa++ ml mb bamd da bad + a++ C D CC 4+ DD4 T 4++ T C ac CCD8 + t ac iva DD8 8+ T + tiv te at d C T aedk D4 tCDT + 4+ + F lli M oll cul ar ic ar F u M gi ar na olar gi l na zo l z ne M on ze Ly m Ly pLhmp yo m ho zphy cyt otc e eynt s e C CD s DC 19 1D + Fo 919+ 0 Abb. 5.21.: Durchflusszytometrische Analysen der B Zellstadien des inguinalen Lymphknotens anhand charakteristischer Oberflächenmarker von WT und KO Mäusen. Frequenzen aller analysierten Zellpopulationen. Die Zellpopulationen wurden mit den gleichen Oberflächenmarkern wie in der Analyse der Milz (Abb. 5.20.a) gefärbt und nach gleichen Charakteristika analysiert. Abgebildet ist der prozentuale Anteil der verschiedenen Zellpopulationen Balken repräsentieren die mittlere Frequenz ± SEM 4 unabhängiger Versuche. Die EFhd2 defiziente Mauslinie zeigte keine Auffälligkeiten oder Abweichungen der analysierten B und T Zellpopulationen in der Milz und in den inguinalen Lymphknoten. Somit ist ein Einfluss von EFhd2 auf die Verteilung und Ansiedelung sowie auf die Häufigkeit dieser Populationen ausgeschlossen. 5.4.7.4. Analyse der Peritonealhöhle Da B1a B Zellen anfälliger als andere B Zellpopulationen für Änderungen von Proteinen mit Signalfunktion scheinen (persönliche Kommunikation, Prof. Nitschke) (Jellusova et al., 2010; Wang et al., 1998), sollten auch die in der Peritonealhöhle auftretenden B Zellstadien untersucht werden. Die Gating-Strategie ist in Abbildung 5.22.a) exemplarisch dargestellt und die relativen Frequenzen in 5.22.b). Eine Analyse der absoluten Zellzahl der Peritonealhöhle ist nicht aussagekräftig, da die Zahlen der isolierten Zellen auch bei gründlicher Spülung zu sehr schwanken. 52 Ergebnisse a) WT WT KO KO B2 B1b CD5 SSC B1a FSC CD43 Reif IgD CD19 Trans IgM FSC κ CD8+ λ κ CD8 CD4+ λ λ CD4 λ Frequenz der analysierten Population [%] b) 100 n = 8 WT KO KO n = 10 80 60 40 20 a+ C D 4 CCD+ T D 4 4+ + T C D 8 CCD+ D T 8+8 + T p + la lam a+ m la bbd m d a+ bda + 2 kakap p kp app a+ a BB2 B2 a BB1b B1b 1b BB1a B1a 1 + M Rat M eure Tr at if a ur e Tr nsi an Ttrio si anna tio s ls na ls Ly mLym Lpyh ph mo oc phz y oyctetes ytn e s CCD1 D 9 C D19 + 19 + 0 Abb. 5.22.: Durchflusszytometrische Analysen der B Zellstadien der Peritonealhöhle anhand charakteristischer Oberflächenmarker von WT und KO Mäusen. a) Zellen der Peritonealhöhle wurden nach Isolation zur Analyse mit verschiedenen fluoreszenzgekoppelten Antikörpern gegen verschiedene stadienspezifische Oberflächenmarker gefärbt und im Durchflusszytometer untersucht. Die Zellpopulationen sind mit ihren Oberflächenmarkern in Dot-Plots dargestellt. Die durchschnittliche relative Frequenz (%) ist je an den Gates angegeben. Für alle Analysen wurde die Lymphozytenregion im Forward- / Sidescatter (FSC, SSC) vorausgewählt. Für B lymphoide Entwicklungsstadien wurde CD19+ als Oberflächenmarker vorausgesetzt (B Zellen). Hiervon ausgehend wurden alle weiteren B Zellstadien mit entsprechenden Oberflächenmarkern analysiert: B1a (CD43+/CD5+); B1b (CD43+/CD5-), B2 B Zellen (CD43-/CD5-), reife B Zellen (Reif, IgMhigh/IgDhigh), transitionelle B Zellen (Trans, IgMhigh/IgDint) und das Verhältnis der kappa+ (κ) und lambda+ (λ) Leichtkettennutzung. Zwei T Zellpopulationen (CD4+ & CD8+) wurden von der Lymphozytenregion ausgehend analysiert. Die abgebildeten Daten repräsentieren 10 unabhängige Experimente für B Zellen bzw. 8 für T Zellen mit ähnlichen Ergebnissen. b) Frequenzen aller analysierten Zellpopulationen. Der prozentuale Anteil der Populationen wurde nach den unter a) angegebenen Kriterien ausgewertet. Balken repräsentieren die mittlere Frequenz ± SEM 10 unabhängiger Versuche für die B lymphoiden Stadien bzw. 8 für die T Zellpopulationen. (Ì, p = 0,0379; Mann-Whitney Test). 53 Ergebnisse Die relative Frequenz der B1a B Zellen war nur sehr geringfügig in KO Mäusen reduziert, die der B1b und B2 B Zellen annährend gleich. In der statistischen Analyse der B Zellpopulationen wurden keine signifikanten Unterschiede festgestellt. Bei den analysierten T Zellpopulationen war bei CD8+ T Zellen kein Unterschied feststellbar, allerdings waren die CD4+ T Zellen der Peritonealhöhle in ihrer relativen Frequenz signifikant reduziert (p = 0,0379; Mann-Whitney Test). Möglicherweise hat dies Einfluss auf das Zusammenspiel und die Aktivierung von B Zellen, wobei peritoneale B Zellpopulationen (B1a und B1b) insbesondere für die natürlichen Immunglobulinspiegel verantwortlich sind (Baumgarth et al., 2005; Yang et al., 2007). In den durchflusszytometrischen Analysen des Knochenmarks, des Thymus, der Milz, der inguinalen Lymphknoten und der Peritonealhöhle junger Mäuse wurden naive B und T Zellpopulationen untersucht. Es traten keine signifikanten Unterschiede zwischen WT und EFhd2 defizienten Mäusen in der B Zellentwicklung und in den verschiedenen B Zellpopulationen auf. Auch die analysierten T Zellpopulationen waren bis auf eine signifikante Reduktion der peritonealen CD4+ T Zellen ähnlich. Der erwartete proapoptotische Effekt von EFhd2 auf die Zellpopulationen an Kontrollpunkten in der B Zellentwicklung wurde in diesen Analysen nicht bestätigt. Die KO Mäuse sind durch das Fehlen des efhd2 Gens nicht in der Entwicklung von B Zellen eingeschränkt. 5.4.8. Interaktion von EFhd2 und Kalzium Bei Messungen des intra- und extrazellulären Kalziumflux verschiedener WEHI231 Mutanten nach BZR Stimulation wurde ein deutlicher Einfluss von EFhd2 auf das Kalziumsignal festgestellt. Ist EFhd2 shRNA vermittelt herunterreguliert, kommt der intrazelluläre Kalziumflux zum Erliegen (Kroczek et al., 2010). Daher sollte einerseits untersucht werden, ob sich der Effekt des fehlenden EFhd2 in primären murinen B Zellen auf gleiche Weise auswirkt wie in WEHI213 Zellen. Andererseits sollte eine mögliche Kalziumbindungsfähigkeit des EFhd2 Protein an sich analysiert werden. 5.4.8.1. In vitro Kalziumbindungsfähigkeit des EFhd2 Proteins Um zu verifizieren, ob das EFhd2 Protein selbst die Fähigkeit zur Kalziumbindung besitzt, beispielsweise über seine „EF-Hand“ Domänen, wurde die 45Ca2+ Autoradiographie-Methode verwendet (Maruyama et al., 1984). Dafür wurde das GST-EFhd2 Fusionsprotein und zur Kontrolle isomolares GST nach Western Blot mit radioaktivem Kalzium überschichtet und analysiert. In Abbildung 5.23. ist deutlich zu erkennen, dass das GST-EFhd2 Fusionsprotein sowohl nach Elution als auch nach Dialyse die Fähigkeit besaß, weit mehr radioaktives Kalzium als nur GST zu binden. Ein schwaches Signal des radioaktiven Kalziums war aber auch bei hoher GST Konzentration zu beobachten. Als Nachweis des Fusionsproteins wurde ein Western Blot mit dem polyklonalen, EFhd2 Antikörper durchgeführt. Dabei wurden weitere Banden, die aus abgebautem Fusionsprotein resultieren könnten, detektiert. Diese zeigten jedoch keine Kalziumbindungsfähigkeit. In diesem Western Blot war allerdings auch zu erkennen, dass beim Beladen etwas GST-EFhd2 Fusionsprotein in die GST Spuren hineingelaufen war. Diese geringe Menge führte aber zu keiner messbaren Kalziumbindung. 54 Ergebnisse Die 45Ca2+ Autoradiographie zeigt, dass das EFhd2 Protein selbst im Stande ist, Kalzium zu binden. GST * GST-EFhd2 # * [kDa] 2 20 5 10 50 2 10 40 97 66 GST * GST-EFhd2 # * 2 20 5 10 50 2 10 40 GST * GST-EFhd2 # * 2 20 5 10 50 2 10 40 Å GST-EFhd2 45 31 Å GST Ponceau S 45Ca²+-Overlay Western-Blot Abb. 5.23.: Kalziumbindungsfähigkeit des GST-EFhd2 Fusionsproteins in vitro. GST-EFhd2 Fusionsprotein oder GST Protein wurde von E. coli (Stamm: DH5α) nach IPTG Induktion exprimiert, die Zellen lysiert, das gewünschte Protein aufgereinigt und bereits eluiert (#, in µl) oder dialysiert (*, in µg) eingesetzt. Die Proteinkonzentration wurde durch Bradford Assay bestimmt, äquimolare Mengen GST und GST-EFhd2 Fusionsprotein wurden über eine 10% SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine Nitrocellulosemembran geblottet. Die Membran wurde mit 1 µCi/ml radioaktivem Kalzium inkubiert und das radioaktive Signal des spezifisch gebundenen Kalziums über eine Phosphoimager-Platte detektiert. Anschließend wurde eine Ponceau S Färbung durchgeführt und das EFhd2 Protein mit dem spezifischen Hasenantikörper und einem Hasen-spezifischen, HRPgekoppelten Sekundärantikörper detektiert. Somit wurde die Kalziumbindungsfähigkeit von EFhd2 bestätigt, die in der Zwischenzeit von Vega und Kollegen publiziert worden war. (Vega et al., 2008). Um aber die verantwortliche Domäne bzw. Strukturen des EFhd2 Proteins zu identifizieren, wurden EFhd2 Punktmutanten entworfen, in denen eine kritische Aminosäure in je einer oder in beiden EFHand Domänen mutiert wurden. Diese wurde im Rahmen einer Diplomarbeit hergestellt und analysiert (Hagen et al., 2012). 5.4.8.2. Messung des Kalziumfluxes in Primärzellen nach BZR Stimulation In Folge der Kalziummessungen in BZR stimulierten WEHI231 Zellen (Kroczek et al., 2010) wurden auch Primärzellen der EFhd2 defizienten Mauslinie untersucht. Begonnen wurde mit unreifen B Zellen des Knochenmarks, da WEHI231 Zellen, wie bereits erwähnt, diesem Stadium am ehesten entsprechen sollten (Boyd and Schrader, 1981). Um unreife B Zellen des Knochenmarks zu analysieren, wurden die Zellen mit fluoreszenzgekoppeltem Fab IgM gefärbt und zum Ausschluss der Prä B Zellen und der rezirkulierenden B Zellen mit den Oberflächemarkern CD25 und IgD negativ selektioniert. Allerdings trat wider Erwarten bei keiner der eingesetzten F(ab)2 Konzentrationen ein Unterschied zwischen WT und KO Zellen nach Stimulation auf (Abb. 5.24.). Wie am Kalziumflux zu erkennen war, funktionierte die Stimulation der defizienten Primärzellen, obwohl ihnen das EFhd2 Protein fehlt. Möglicherweise entspricht die Stimulation der unreifen B Zellen im Knochenmark nicht der physiologischen Situation, denn im Organismus findet ein Antigenkontakt erst nach Austritt aus dem Knochenmark in den sekundären lymphatischen Organen statt mit Ausnahme von 55 Ergebnisse Autoantigenen zur Negativselektion (Rezeptoreditierung, Anergie, Apoptose) selbstreaktive Rezeptoren (Melchers et al., 1995; Sandel and Monroe, 1999). WT auf KO WT: KM 2 µg F(ab)2 KO: SSC SSC Unreife B Zellen F(ab)2 FSC FSC Fab IgM Fab IgM Zeit B220 WT: KM 6 µg F(ab)2 KO: F(ab)2 CD25 CD25 B220 Zeit WT: KM 20 µg F(ab)2 KO: IgD IgD Unreife B Zellen WT: KO: KM 5 µl Iono F(ab)2 Iono Zeit Zeit Abb. 5.24.: Kalziumflux unreifer B Zellen des Knochenmarks vor und nach BZR Stimulation mit F(ab)2. Knochenmarkszellen wurden isoliert, aufbereitet, mit Indo-1 beladen, mit fluoreszenzgekoppelten Oberflächenmarkern markiert und am Becton Dickinson LSRII Durchflusszytometer analysiert. Die Population der unreifen B Zellen (linkes Paneel: 1. Graph: Lymphozytenregion; 2. Graph: B220+/IgM+; 3.Graph: CD25-/IgD-) wurde ausgewählt und der Kalziumflux zuerst für 50 s unstimuliert und anschließend nach Zugabe der angegebenen Menge F(ab)2 für weitere 190 s gemessen (rechtes Paneel). Zur Kontrolle der Beladung der Zellen mit Indo-1 wurden 8,3 µg/ml Ionomycin (Iono, linkes Paneel, unten) zugegeben. Da im Knochenmark kein Effekt gefunden wurde, sollte eine B Zellpopulation untersucht werden, die als sensitiv gegenüber Veränderungen im BZR Signalweg gilt und daher bereits für andere Signalproteine Effekte auf den Kalziumflux nach BZR Stimulation gezeigt hatte (Ackermann et al., 2011; Jellusova et al., 2010). Folglich wurden die peritonealen Populationen der B1a B Zellen (CD5+/B220lo-int) aber auch der gesamten B Zellen (B220+) auf den Kalziumflux nach BZR Stimulation analysiert. In Abbildung 5.25. ist nur die Konzentration von 20 µg/ml F(ab)2 exemplarisch gezeigt. Es wurde weder ein Unterschied im Kalziumflux vor noch nach BZR Stimulation beobachtet. Der Kalziumflux der Zellen, ob mit oder ohne EFhd2, verhielt sich identisch, auch wenn mit niedrigeren Konzentrationen von F(ab)2 stimuliert wurde (Daten nicht gezeigt). 56 Ergebnisse WT KO WT: Peri 20 µg F(ab)2 KO: SSC SSC B1a FSC F(ab)2 Zeit FSC WT: Peri 20 µg F(ab)2 KO: B220+ CD5 CD5 F(ab)2 Zeit B220 B220 B220 B220 B1a FSC WT: KO: Peri 5 µl Iono Iono Zeit B220+ WT: KO: Peri 5 µl Iono Iono Zeit FSC Abb. 5.25.: Kalziumflux peritonealer B Zellen vor und nach BZR Stimulation mit F(ab)2. Zellen wurden aus der Peritonealhöhle isoliert, mit Indo-1 beladen, mit fluoreszenzgekoppelten Oberflächenmarkern markiert und am LSRII analysiert. Nach Selektion der Lymphozyten (linkes Paneel, 1. Graph) wurden entweder die B1a B Zellen (B1a, linkes Paneel: 2. Graph: CD5+/B220low-int) oder die gesamten B Zellen (B220+, linkes Paneel, 3. Graph: B220+) ausgewählt und jeweils der Kalziumflux zuerst für 50 s unstimuliert und anschließend nach Zugabe von 20 µg/ml F(ab)2 für weitere 190 s gemessen (rechtes Paneel, entsprechende Graph). Zur Kontrolle der Beladung der Zellen mit Indo-1 wurden 8,3 µg/ml Ionomycin zugegeben (rechtes Paneel, unten). Die Milz ist ein weiteres, sekundäres lymphatisches Organ, das bei der B Zellreifung nach Antigenkontakt und damit bei der Pathogenabwehr eine zentrale Rolle spielt. In ihr sind die Marginalzonen und follikulären B Zellen lokalisiert und nach Aktivierung durch Antigene findet die Follikelbildung und Keimzentrumsreaktion hauptsächlich in der Milz statt. Daher wurden sowohl die Marginalzonen (CD21+/CD23lo), die follikulären (CD21+/CD23+) sowie die gesamten B Zellen (B220+) analysiert. In Abbildung 5.26.a) ist der Kalziumflux der genannten B Zellpopulationen für je zwei F(ab)2 Konzentrationen exemplarisch dargestellt. Eine Zusammenfassung der Analysen in 5.26.b) zeigt links den basalen Kalziumflux vor der Stimulation und rechts den Kalziumflux nach Stimulation mit der angegebenen Menge F(ab)2. Weder vor der Gabe noch bei einer der eingesetzten F(ab)2 Konzentrationen wurde ein Unterschied zwischen WT und KO Zellen festgestellt. Insgesamt kam es zu einem leichten Anstieg des Kalziumfluxes mit steigender Konzentration, dies galt aber für WT und KO Zellen gleichermaßen. 57 Ergebnisse a) KO SSC F(ab)2 FSC Zeit B220 B220 FSC FSC Zeit WT: Milz 6 µg F(ab)2 KO: WT: Milz 6 µg F(ab)2 KO: Mz Fo CD23 CD23 Fo CD21 Mz Iono F(ab)2 F(ab)2 Mz CD21 WT: KO: Milz 5 µl Iono WT: Milz 20 µg F(ab)2 KO: F(ab)2 FSC Fo WT: Milz 6 µg F(ab)2 KO: B220+ SSC WT Zeit Zeit WT: KO: Milz 5 µl Iono WT: Milz 20 µg F(ab)2 KO: Iono WT: Milz 20 µg F(ab)2 KO: F(ab)2 F(ab)2 Zeit Zeit Zeit Zeit 40000 n=9 30000 20000 10000 0 150000 Ratio: Indo1 (Violet)-A/Indo1 (Blue)-A Ratio: Indo1 (Violet)-A/Indo1 (Blue)-A b) WT KO KO WT Basaler Kalziumflux vor Stimulation n=1 n=2 n=2 n=3 n=5 n=1 n=1 WT KO 100000 50000 0 0,8 0,8 0,8 22 2 33 3 66 6 10 141414 20 2020 1010 [µg] KalziumfluxF(ab) nach2 stimulation F(ab)2 Stimulation [µg/ml] Abb. 5.26.: Kalziumflux ruhender Milz B Zellen vor und nach BZR Stimulation mit F(ab)2. a) Zellen der Milz wurden isoliert, aufbereitet, mit Indo-1 beladen, mit fluoreszenzgekoppelten Oberflächenmarkern markiert und am LSRII analysiert. Nach Selektion der Lymphozyten (linkes Paneel, 1. Graph) wurden entweder die gesamten B Zellen (linkes Paneel: 2. Graph: B220+), die follikulären (Fo, linkes Paneel, 3. Graph: CD21+/CD23+) oder die Marginalzonen B Zellen (Mz, linkes Paneel, 3. Graph: CD21low/CD23+) ausgewählt und jeweils der Kalziumflux zuerst für 50 s unstimuliert und anschließend nach Zugabe der angegebenen Menge F(ab)2 für weitere 190 s gemessen (rechtes Paneel, entsprechender Graph). Zur Kontrolle der Beladung der Zellen mit Indo-1 wurden 8,3 µg/ml Ionomycin zugegeben (linkes Paneel, unten). b) Kalziumflux ruhender B Zellen vor und nach BZR Stimulation. Ausgewertet wurden der Kalziumflux unstimulierter Milz B Zellen in den ersten 50 s von 9 unabhängigen Experimenten (linkes Diagramm), bevor die Stimulation des BZR erfolgte, und der maximale Peak nach der Stimulation mit der angegebenen Menge F(ab)2 (rechtes Diagramm). Für jede Stimulation ist die Anzahl an unabhängigen Experimenten angegeben. Wenn möglich, wurde aus den Werten der Mittelwert ± SEM errechnet. Möglicherweise ist diese abweichende Beobachtung in EFhd2 herunterregulierten WEHI231 Zellen und primären, EFhd2 defizienten Zellen damit zu erklären, dass sich die immortalisierten WEHI231 Zellen ständig in Proliferation befinden, während die Primärzellen bis zum Antigenkontakt im Zellzyklus arretiert sind und ruhen. Um dies genauer zu untersuchen, wurde der Kalziumflux primärer Milz B Zellen nach Entnahme zum Teil sofort 58 Ergebnisse (Abb. 5.26.) oder nach 48 h Stimulation mit 10 µg/ml LPS untersucht. Abbildung 5.27.a) zeigt links, dass sich die stimulierten B Zellen zu proliferierenden B Zellblasten entwickelt hatten. Rechts ist exemplarisch der Kalziumflux vor und nach BZR Stimulation dargestellt. In Abbildung 5.27.b) sind drei unabhängige Versuche zusammengefasst. Während ohne BZR Stimulation der basale Kalziumflux von WT und KO Zellen auf gleichem Niveau verlief, war nach BZR Stimulation mittels F(ab)2 zu beobachten, dass die proliferierenden KO B Zellen einen verringerten, maximalen Kalziumflux zeigten. Obwohl eine klare Tendenz zu erkennen ist, war dieser Unterschied nicht signifikant (p = 0,2; Mann-Whitney Test). Hierzu bedarf es noch weiterer Analysen. a) KO SSC SSC WT WT: LPS Blasten 10 µg F(ab)2 KO: FSC FSC WT: LPS Blasten 5 µl Iono KO: F(ab)2 Zeit Iono Zeit b) 110000 =3 □n WT ■ KO n=3 n=3 Ratio: Indo1 (Violet)-A/Indo1 (Blue)-A Ratio: Indo1 (Violet)-A/Indo1 (Blue)-A 40000 30000 20000 10000 0 WT KO KO BasalesWT Kalzium vor Stimulation Basaler Kalziumflux vor Stimulation 100000 90000 80000 70000 60000 10 µg 10 µg WTF(ab)2 stimulationKO Kalziumflux nach Stimulation mit 10 µg/ml F(ab)2 Abb. 5.27.: Kalziumflux 48 h stimulierter LPS-Blasten vor und nach BZR Stimulation mit F(ab)2. a) Zellen der Milz wurden isoliert und durch CD43 MACS Depletion B Zellen angereichert, für 48 h mit 10 µg/ml LPS inkubiert, mit Indo-1 beladen und am LSRII analysiert. Der Kalziumflux der proliferierenden Zellen (linkes Paneel, obere Graph) wurde zuerst für 50 s unstimuliert und anschließend nach Zugabe von 10 µg/ml F(ab)2 für weitere 190 s gemessen (rechtes Paneel). Zur Kontrolle der Beladung der Zellen mit Indo-1 wurden 8,3 µg/ml Ionomycin zugegeben (linkes Paneel, unten). b) Kalziumflux proliferierender B Zellen vor und nach BZR Stimulation. Ausgewertet wurden der Kalziumflux in den ersten 50 s von 4 unabhängigen Experimenten (linkes Diagramm), bevor die Stimulation des BZR erfolgte, und der maximale Peak von 3 unabhängigen Experimenten nach der Stimulation mit 10 µg/ml F(ab)2 (rechtes Diagramm). Aus den Werten wurde der Mittelwert ± SEM errechnet. 59 Ergebnisse Zusammenfassend zeigen BZR stimulierte, EFhd2 defiziente Primärzellen kaum Unterschiede im BZR vermittelten Kalziumflux, im Gegensatz zu Experimenten in WEHI231 Zellen. Allerdings bestehen Unterschiede zwischen ruhenden primären B Zellen und immortalisierten WEHI231 Zellen, die sich ständig im Zellzyklus befinden, daher auch ein anderes Profil von „aktiven“ Proteinen aufweisen, und die sich auch morphologisch unterscheiden. Damit einhergehend zeigten durch LPS stimulierte, proliferierende, EFhd2 defiziente Milz B Zellen jedoch einen verminderten Kalziumflux. 5.4.9. IgM Oberflächenexpression EFhd2 defizienter B Zellen nach LPS Stimulation Da in LPS stimulierten Milz B Zellen ein verringerter Kalziumflux nach BZR Stimulation zu beobachten war, wurde die IgM Oberflächenexpression auf primären Milz B Zellen vor und nach Aktivierung analysiert. Möglicherweise wird auf der Oberfläche prolieferierender KO B Zellen weniger IgM exprimiert, wodurch nach Stimulation weniger BZR Signale und damit ein verringerter Kalziumflux generiert werden würden. In Abbildung 5.28. ist die Oberflächenexpression von IgM dargestellt. Bei der in vitro Aktivierung ruhender Milz B Zellen durch LPS Stimulation wurde ein sehr starker Anstieg der IgM Oberflächenexpression sowohl auf WT als auch KO B Zellen beobachtet. Der starke Anstieg der Expression spricht für eine verbesserte Sensitivität der aktivierten Zellen für Antigene in Folge eines Pathogenkontaktes, um effektiver reagieren zu können (Bourgois et al., 1977). Zu den Messzeitpunkten 72 h und 96 h war die IgM Oberflächenexpression bei WT und KO wieder etwa auf Ausgangsniveau. Der leichte Expressionsunterschied bei 48 h kann nicht die Verminderung des Kalziumfluxes nach BZR Stimulation erklären. WT1 WT2 WT3 KO4 KO5 KO6 Milz CD430, 24, 48, 72, 96 h LPS Stimulation Oberflächenexpression IgM [MFI] b) Zellfrequenz vom Maximum [%] a) 3000 2000 1000 0 IgM WT KO n=3 0 0 24 48 72 24 48 72 LPS Stimulation [h] 96 96 Abb. 5.28.: IgM Oberflächenexpression von ruhenden und LPS stimulierten Milz B Zellen. a) MACS sortierte Milz B Zellen wurden sofort (erstes Paneel) und nach 24, 48, 72 und 96 h mit 10 µg/ml LPS Stimulation (folgende Paneele von links nach rechts) mit fluoreszenzgekoppelten Antikörpern beladen und nach Selektion auf B Zellen im Durchflusszytometer auf IgM Oberflächenexpression untersucht. Dargestellt sind exemplarisch die Messungen eines Versuchs dreier Mäuse als Kurven im Histogramm. b) Die mittlere Fluoreszenzintensität der unter a) analysierten Kurven der IgM Oberflächenexpression. Die Mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) der Oberflächenexpression jeder Probe wurde mittels FlowJo Software ermittelt. Gezeigt sind die Einzelwerte eines repräsentativen Versuchs zwei unabhängiger Experimente mit Mittelwert ± SEM. 60 Ergebnisse 5.4.10. Immunglobulinserumspiegel EFhd2 defizienter Mäuse Nachdem sich in der Entwicklung der B Zellen bisher kein gravierender Effekt der EFhd2 Defizienz erkennen ließ, aber reife, LPS stimulierte, EFhd2 defiziente B Zellen nach Aktivierung über den BZR nicht identisch in ihrem Aktivierungsmuster zu WT Zellen waren, sollten nun die Funktionen reifer B Zellen untersucht werden. Das Hauptmerkmal reifer B Zellen ist die Sekretion von Immunglobulinen, sowohl spontan ohne Antigenkontakt, wie beispielsweise das natürliche IgM der B1a Zellen (Hardy and Hayakawa, 2001; ThomasVaslin et al., 1992), sowie nach Antigenkontakt als antigenspezifische Antikörper mit oder ohne T Zellhilfe. 5.4.10.1. Natürliche Immunglobulinserumspiegel Vor den Immunisierungsexperimenten wurden zuerst die natürlichen Immunglobulinserumspiegel untersucht, um zu überprüfen, ob bereits hier ein Einfluss der EFhd2 Defizienz zu beobachten ist. Der natürlich vorkommende Immunglobulinserumspiegel der Immunglobulinsubklassen wurde im Serum junger (6-13 Wochen) und älterer Mäuse (56 Wochen) untersucht. In Abbildung 5.29.a) ist die Analyse junger Mäuse dargestellt. Die Konzentration der verschiedenen Immunglobulinsubklassen in den Seren unterschied sich nicht wesentlich zwischen WT und KO Mäusen. Die IgA und IgM Spiegel waren auf ähnlichem Niveau entsprechend dem natürlichen Vorkommen. IgE lies sich in den Seren mittels ELISA kaum detektieren (Daten nicht gezeigt). In den IgG Subklassen traten nur geringe Schwankungen zwischen WT und KO Mäusen auf. Dies änderte sich auch mit zunehmendem Alter der Mäuse nicht (Abb. 5.29.b). Hier wurden die Immunglobulinspiegel von IgM und von totalem IgG analysiert. Die natürlich vorkommenden Immunglobulinkonzentrationen waren bei älteren Mäusen zwar deutlich erhöht, dies galt aber für WT und KO Mäuse. Das Fehlen des EFhd2 Proteins zeigte keinen statistisch signifikanten Einfluss auf die Produktion und Sekretion von natürlichen Immunglobulinen ohne Antigenstimulation. 61 Ergebnisse 600 100 100 50 50 KO KO WT WT 150 100 50 150 100 50 KO KO 600 400 200 WT WT KO KO WT WT KO KO 400 200 0 WT WT WT WT KO KO 12 nn==12 800 0 KO KO 250 relative IgG2b Konzentration [µg/ml] relative IgG2a Konzentration [µg/ml] 300 200 100 0 WT WT KO KO 50000 1500 relative IgG Konzentration [µg/ml] IgM Konzentration [µg/ml] b) 200 0 WT WT 200 0 400 IgG3 Konzentration [µg/ml] 00 1000 IgG 1 K onzentration [µg/m l] 150 150 IgM Konzentration [µg/ml] IgAIgA Konzentration [µg/ml] Konzentration [µg/ml] a) 1000 500 0 WT WT KO KO WT KO n=8 40000 30000 20000 10000 0 WT WT KO KO Abb. 5.29.: ELISA natürlich vorkommender Immunglobulinsubklassen im Serum. a) Unter IVC Bedingungen gehaltene, unimmunisierte Mäuse wurden zur Serumgewinnung geblutet. ELISAs für IgA, IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b und IgG3 wurden durchgeführt, um die natürlich vorkommenden Immunglobulinspiegel zu bestimmen. Abgebildet sind sowohl die Einzelwerte der jeweiligen Immunglobulinkonzentration von 12 Mäusen im Alter von 6 - 13 Wochen und der Mittelwert ± SEM. b) Zum Vergleich wurden 56 Wochen alte, auch unter IVC Bedingungen gehaltene Mäuse zur Serumgewinnung geblutet. ELISAs für die IgM und die totalen IgG Serumspiegel wurden durchgeführt. Angegeben sind die Einzelwerte von 8 Mäusen und der Mittelwert ± SEM. 5.4.10.2. Autoantikörper Parallel wurde das spontane Auftreten von Autoantikörpern im Serum von Mäusen im Alter von 56 Wochen sowie sechs Monate später untersucht. Mittels ELISA wurde auf Antikörper gegen doppel- und einzelsträngige DNA getestet. Abbildung 5.30.a) zeigt, dass ein signifikanter Anstieg der anti-dsDNA Antikörper in KO Mäusen zu erkennen ist (p = 0,0312; Mann-Whitney Test). Zu diesem Zeitpunkt betrug das Alter der Mäuse 56 Wochen. Bei der Analyse von Seren der gleichen Mäuse hinsichtlich anti-dsDNA Antikörpern sechs Monate später variierten die Werte der KO Mäuse allerdings so stark (Abb. 5.30.b), dass der Unterschied nicht mehr signifikant war (p = 0,1179; Mann-Whitney Test). Möglicherweise entwickelten sich zu diesem Zeitpunkt auch in den WT Mäusen mehr Autoantikörper als zum früheren Zeitpunkt. Die große Schwankung der oD Skala resultierte daraus, dass es sich um zwei unabhängig durchgeführte ELISA handelte, die nicht nach gleicher Inkubationszeit des Substrats abgestoppt wurden. Bei der Analyse der Seren des zweiten Zeitpunkts auf anti- 62 Ergebnisse ssDNA Antikörper (Abb. 5.30.c) war auch kein signifikanter Unterschied zwischen WT und KO Mäusen zu beobachten (p = 0,1806; Mann-Whitney Test). Zwar war in beiden Analysen des späteren Zeitpunkts eine Tendenz zu erkennen, allerdings war die Streuung der Einzelwerte zu groß. Die KO Mäuse in Abbildung 5.30.a) wiesen dennoch keine offensichtlichen Symptome einer Autoimmunerkrankung auf; lediglich eine signifikante Neigung zur Bildung von anti-dsDNA Antikörpern war vorhanden. Ein als Positivkontrolle mitgeführtes Serum von NZB/W autoimmunerkrankten Mäusen zeigte eine drastisch erhöhte Konzentration an anti-dsDNA Antikörpern im Vergleich zu den WT und KO Mäusen (Daten nicht gezeigt). Jedoch ist festzuhalten, dass EFhd2 defiziente Mäuse im Alter mehr autoreaktive Antikörper entwickeln als vergleichbare WT Mäuse. Entweder ist die Kontrolle gegen die Entstehung solcher Antiköper nicht mehr vollends funktionell oder EFhd2 defiziente B Zellen älterer Mäuse neigen eher zur Bildung autoreaktiver Immunglobulinketten. Daher müssen Kontrollmechanismen an zentraler oder peripherer Stelle in Folge der EFhd2 Defizienz versagt haben. Ì 150 100 50 0 20 15 10 5 0 WT KO c) 25 relative anti-ssDNA Antikörperkonzentration (oD) b) 200 relative anti-dsDNA Antikörperkonzentration (oD) relative anti-dsDNA Antikörperkonzentration (oD) a) WT WT KO KO 400 WT n = 6 KO n = 10 300 200 100 0 WT WT KO KO Abb. 5.30.: ELISA natürlich vorkommender anti-ds DNA und anti-ssDNA Autoantikörper im Serum. Unter IVC Bedingungen gehaltene Mäuse wurden im Alter von (a) 56 Wochen und (b) sowie (c) 78 Wochen zur Serumgewinnung geblutet. Anschließend wurde mittels ELISA die Konzentration von verschiedenen Autoantikörpern der IgG Klassen bestimmt. Angegeben sind die Einzelwerte von 6 WT und 10 KO Mäusen in oD und deren Mittelwert ± SEM. a) Die Seren wurden auf anti-dsDNA Antikörper der IgG Klassen untersucht. (Ì, p = 0,0312; MannWhitney Test) b) Die Seren wurden auf anti-dsDNA Antikörper der IgG Klassen untersucht. c) Die Seren wurden auf anti-ssDNA Antikörper der IgG Klassen untersucht. 5.4.11. Immunisierungen Nach der Analyse der natürlichen Immunglobulinspiegel sollten die spezifischen Immunantworten nach T Zell-unabhängigen und T Zell-abhängigen Immunisierungen untersucht werden. Für die vorliegende Arbeit wurde NP-Ficoll für die T Zell-unabhängige und NP-KLH sowie Schaferythrozyten (SRBC) für die T Zell-abhängige Immunantwort als Antigen verwendet. 63 Ergebnisse 5.4.11.1. T Zell-unabhängige Immunisierungen 5.4.11.1.1. T Zell-unabhängige Immunisierung mit NP-Ficoll b) 1500 1000 500 0 0 0 5 5 12 12 0 5 12 Tag Tagenach nachImmunisierung Immunisierung [d] [d] c) 150 100 50 0 250 relative IgG3 Konzentration [µg/ml] relative IgM IgM Konzentration Konzentration [µg/ml] [µg/ml] a) relative NP-spez. IgM Konzentration [µg/ml] Die T Zell-unabhängige Immunantwort (TI) wurde durch die intraperitoneale Applikation von 50 µg NP-Ficoll analysiert. Dazu wurde Serum vor der sowie an Tag 5 und 12 nach der Immunisierung auf die totale IgM Konzentration (Abb. 5.31.a), die relative NP-spezifische IgM Konzentration (Abb. 5.31.b) und die relative IgG3 Konzentration (Abb. 5.31.c) untersucht. In Abbildung 5.33.a) zeigte sich nur eine geringe Immunantwort in Bezug auf totales IgM, da schon der Basiswert des natürlichen IgM Serumspiegels bei etwa 500 µg/ml lag. Der Mittelwert der KO Mäuse lag über dem der WT Mäuse, jedoch war die Streuung der Werte für eine statistische Aussage zu groß. Es wurde ein leichter Anstieg bis Tag 12 nach Immunisierung beobachtet, dieser verlief aber in beiden Genotypen ähnlich. Bei Betrachtung der NP-spezifischen Antikörper der IgM Subklasse war ein wesentlich deutlicherer Verlauf der Immunantwort und der Bildung der spezifischen Immunglobuline zu erkennen. Die T Zellunabhängige Immunantwort verlief in WT und KO Mäusen nahezu identisch (Abb. 5.31.b). Für die IgG3 Immunglobulinsubklasse sind die relativen Konzentrationen ähnlich denen von totalem IgM, allerdings wesentlich geringer vorhanden (Abb. 5.31.c). Hier liegen die Immunglobulinspiegel der KO tendenziell über denen der WT Mäuse, besonders stark ist dies an Tag 5 zu beobachten. In den WT Mäusen ist ein leichter Anstieg infolge der Immunreaktion zu beobachten, bei den KO Mäusen ist der Anstieg wesentlich stärker, aber nicht signifikant. An Tag 12 fällt der Immunglobulinspiegel in beiden Populationen ab. Die Halbwertszeit von IgG3 im Serum beträgt etwa 7 Tage (Morell et al., 1970). Die T Zellunabhängige Immunantwort, vor allem im Bezug auf NP-spezifische Antikörper, verläuft in EFhd2 defizienten Mäusen analog zu den WT Mäusen. 0 0 5 5 12 12 0 5 12 Tag nach Immunisierung [d] Tage nach Immunisierung [d] WT KO n=6 200 150 100 50 0 0 0 5 5 12 12 0 5 12 Tag nach Immunisierung [d] Tage nach Immunisierung [d] Abb. 5.31.: Immunantworten auf T Zell-unabhängige Immunisierung mittels NP-Ficoll. Mäuse wurden mit 50 µg NP-Ficoll in PBS i.p. immunisiert. Blut wurde vor Immunisierung (0) und an Tag 5 sowie Tag 12 nach Immunisierung zur Serumgewinnung genommen. ELISAs für verschiedene Immunglobulinklassen wurden damit durchgeführt. Angegeben sind die Einzelwerte von je 6 WT und KO Mäusen sowie deren Mittelwert ± SEM. a) Die totale IgM Konzentration in den Seren wurde bestimmt. b) Die relative NP-spezifische IgM Konzentration zwischen WT und KO Mäusen wurde analysiert. c) Die relative IgG3 Konzentration in den Seren wurde untersucht. 64 Ergebnisse 5.4.11.1.2 T Zell-unabhängige Immunisierung mit TNP-LPS relativeTNP-spez. TNP-spez. IgM [µg/ml] relative IgMKonzentration Konzentration [µg/ml] Die T Zell-unabhängige Immunantwort wurde auch mit dem Antigen TNP-LPS untersucht. Zur Immunisierung wurden 50 µg TNP-LPS intraperitoneal appliziert und vor sowie an den Tagen 2, 5, 8, 12, 16, 21 und 28 nach Immunisierung Blut genommen. TNP-LPS induziert autonom durch die repetitiven Strukturen des LPS eine polyklonale Aktivierung unreifer und reifer B Zellen (TI Typ I) über TLR-4 und induziert spezifische, in diesem Fall gegen TNP gerichtete IgM und IgG Antikörper (Huchet, 1985; Lopes-Carvalho and Kearney, 2004), während NP-Ficoll keine intrinsische B Zellstimulierungsaktivität aufweist (TI Typ II) und nur reife B Zellen, hauptsächlich B1a B Zellen aktiviert (Fagarasan and Honjo, 2000; Mond et al., 1995). Dabei entstehen Antikörper des IgM, aber auch des IgG3 Isotyps. Durch TNP-LPS kann eine Immunantwort ohne Hilfe von dendritischen oder T Zellen untersucht werden. In Abbildung 5.32. ist die relative TNP-spezifische IgM Konzentration der Immunantwort dargestellt. An den ersten beiden Zeitpunkten wurde kaum eine Reaktion auf die Immunisierung beobachtet. An Tag 5 gab es einen sprunghaften Anstieg der Antikörperkonzentration, der den Höhepunkt der Immunreaktion markierte. Daraufhin folgte ein rascher Abfall an Tag 8, anschließend klang die Immunreaktion langsam ab. Die EFhd2 defizienten Mäuse zeigen hierbei tendenziell mehr spezifisches Immunglobulin im Serum. Auch der Abfall der Immunantwort verlief nicht so schnell wie bei den WT Tieren. Diese Verzögerung der ausklingenden Immunantwort unterschied sich in EFhd2 defizienten Mäusen signifikant von jener der WT Mäuse (p = 0,0079; Mann-Whitney Test). Dies zeigt, dass EFhd2 defiziente Mäuse eine effizientere und länger anhaltende Immunantwort in einer T Zell-unabhängigen Immunantwort entwickeln als WT Mäuse. 30 WT KO n=5 20 ÌÌ 10 0 00 22 55 88 1212 1616 2121 Tage nach Immunisierung [d] Tag nach TNP-LPS Immunisierung 2828 Abb. 5.32.: Immunantworten auf T Zell-unabhängige Immunisierung mittels TNP-LPS. Mäuse wurden mit 50 µg TNP-LPS in PBS i.p. immunisiert. Blut wurde vor Immunisierung (0) und an Tag 2, 5, 8, 12, 16, 21 und 28 nach Immunisierung zur Serumgewinnung genommen. Mittels ELISA wurde die relative TNP-spezifische IgM Konzentration untersucht. Angegeben sind die Einzelwerte von je 5 WT und KO Mäusen sowie deren Mittelwert ± SEM (ÌÌ, p = 0,0079; Mann-Whitney Test). 65 Ergebnisse 5.4.11.2. T Zell-abhängige Immunisierungen mit NP-KLH Da EFhd2 als Teil einer konservierten Signatur von Genen in Gedächtnis T und B Zellen hochreguliert wird (Haining et al., 2008), sollte überprüft werden, ob sich die EFhd2 Defizienz auf die Bildung der Immunantwort und des B Zellgedächtnisses nach einer T Zellabhängigen Immunisierung auswirkt. Dafür wurde auf das Modellantigen NP(27)-KLH zurückgegriffen. Dieser Komplex ruft eine sehr effiziente T Zell-abhängige Immunantwort hervor und generiert ein NP-spezifisches Gedächtnis, das durch eine zweite Immunisierung aktiviert und analysiert werden kann (Berek et al., 1987; Liu et al., 1991). 5.4.11.2.1 Kurzes Monitoring der T Zell-abhängigen Immunantwort Bei dieser Immunisierung wurden die Mäuse intraperitoneal mit NP(27)-KLH immunisiert und für 30 Tage überwacht. Die zweite Immunisierung wurde intravenös gegeben, um das gebildete Gedächtnis zu aktivieren. Wie aber aus Abbildung 5.33.a) zu erkennen ist, war die Immunantwort der ersten Immunisierung noch nicht wieder abgeklungen, so dass sich die Aktivierung der Gedächtnisantwort mit der ersten Immunisierung überlagerte. Bei totalem IgG war ein deutlicher Anstieg als Reaktion auf die initiale Immunisierung bis Tag 14 sowohl bei WT als auch KO Mäusen zu beobachten, die dann langsam wieder abfiel, in den KO Mäusen jedoch an Tag 30 fast wieder das Niveau von Tag 14 erreichte. Möglicherweise war hierfür die Depotwirkung des Adjuvans verantwortlich, das für eine kontinuierliche Antigenabgabe sorgt. Nach der zweiten Immunisierung war kaum ein Anstieg des totalen IgG Serumspiegels zu erkennen. Insgesamt konnten während des gesamten Immunisierungsexperiments keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden. Bei der Analyse der NP-spezifischen Antikörper der IgG1 Subklasse war nach der ersten Immunisierung sowohl bei WT als auch KO Mäusen nur eine sehr geringe Immunantwort zu beobachten (Abb. 5.33.b), durch die zweite Immunisierung wurde jedoch eine deutliche Gedächtnisantwort induziert. Diese fiel in den KO Mäusen stärker aus, streute aber sehr (B*6: p = 0,099; Student’s T Test). An Tag 30 betrug die Irrtumswahrscheinlichkeit p = 0,1095. Auch wenn kein signifikanter Unterschied zwischen KO und WT Mäusen zu beobachten war, zeigte sich jedoch wieder eine Tendenz dahingehend, dass in EFhd2 defizienten Mäusen der Immunglobulinserumspiegel nach T Zell-abhängiger Immunisierung über dem Niveau der WT Mäuse lag. 66 IgG Konzentration [µg/ml] a) b) 15000 10000 5000 0 0 0 0 7 7 14 14 21 21 30 30 14Immunisierung 7 Tag nach 21 [d] 30 Tage nach Immunisierung [d] B6 relative NP(16)-spez. IgG1 Konzentration [µg/ml] Ergebnisse 8000 WT n = 6 KO n = 5 6000 4000 2000 B6 B*6 0 0 0 0 7 7 14 14 21 21 30 30 14Immunisierung 7 Tag nach 21 [d] 30 Tage nach Immunisierung [d] B*6 B*6 B*6 Abb. 5.33.: Immunantworten des ersten T Zell-abhängigen Immunisierungsexperiments mittels NP(27)-KLH. Mäuse wurden mit 50 µg NP(27)-KLH und dem Adjuvans Imject® Alum (Pierce) in PBS i.p. immunisiert und vor (Tag 0) sowie an Tag 7, 14, 21 und 30 nach Immunisierung geblutet. Anschließend wurden die Mäuse mit 10 µg NP(27)-KLH in PBS i.v. immunisiert und 6 Tage später geblutet (B*6). Die Seren wurden für verschiedene ELISAs verwendet. Abgebildet sind die Einzelwerte von 6 WT und 5 KO Mäusen sowie deren Mittelwert ± SEM. a) ELISA für die totale IgG Konzentration [µg/ml] aller Messzeitpunkte. b) ELISA für die relative NP-spezifische IgG1 Konzentration aller Messzeitpunkte. 5.4.11.2.2 Verlängertes Monitoring der T Zell-abhängigen Immunantwort Da die Immunantwort nach der ersten Immunisierung im Versuch 5.4.11.2.1 noch nicht abgeklungen war und sich mit der Aktivierung der NP-spezifischen Gedächtnis B Zellen überlagerte, wurde das Immunisierungsexperiment wiederholt. Diesmal wurde das Monitoring nach der ersten Immunisierung aber deutlich verlängert. Zwischenzeitlich wurde durch ELISA überprüft, ob die erste Immunantwort abgeklungen war und eine zweite Immunisierung vorgenommen werden konnte, damit sich nicht primäre und sekundäre Immunantwort überlagern würden. Daher wurde nach der ersten Immunisierung 120 Tage gewartet, bis die zweite Immunisierung, diesmal auch intraperitoneal, appliziert wurde. In Abbildung 5.34.a) ist die Analyse aller Seren mittels ELISA mit NP(16)-BSA dargestellt. 67 a) relative NP(16)-spez. IgG1 Konzentration [µg/ml] Ergebnisse 800 WT KO n=6 600 400 200 0 0 0 0 7 7 7 14 14 14 21 21 30 30 21 40 40 55 55 75 75 100100 120120 30 40 55 75 100 120 Tag nach Immunisierung [d] B5 B5 B14B14 B21B21 B31B31 B*5 B*14 B*21 B*31 Tage nach Immunisierung [d] relative NP(4)-spez. IgG1 Konzentration [µg/ml] b) 1500 WT KO n=6 Ì 1000 Ì 500 0 21 2121 31 B5 B5 B 14 B 14 B 21 B 21 31 31 B*5 B*14 B*21 Tage nach Immunisierung [d] B 31 B 31 B*31 Abb. 5.34.: Immunantworten des zweiten T Zell-abhängigen Immunisierungsexperiments mittels NP(27)-KLH. Mäuse wurden mit 50 µg NP-KLH und dem Adjuvans Imject® Alum in PBS i.p. immunisiert. Blut wurde vor Immunisierung (Tag 0) sowie an Tag 7, 14, 21, 30, 40, 55, 75, 100, 120 nach Immunisierung genommen. Anschließend wurden die Mäuse mit 10 µg NP-KLH in PBS i.p. nochmals immunisiert und an Tag 5, 14, 21, 31 Tage danach geblutet (B*5, B*14, B*21, B*31). Die Seren wurden für verschiedene ELISAs verwendet. a) ELISA für NP-spezifisches IgG1 wurde mit den Seren aller Zeitpunkte durchgeführt. Hierfür wurden die ELISA-Platten mit NP(16)-BSA beschichtet. Abgebildet ist wegen der Übersichtlichkeit nur der Mittelwert ± SEM von je 6 WT und KO Mäusen. b) ELISA zur Detektion hochaffiner, NP-spezifischer IgG1 Antikörper wurde mit NP(4)-BSA beschichteten ELISA-Platten für alle Seren der ausgewählter Zeitpunkte durchgeführt. Abgebildet sind die Einzelwerte von je 6 WT und KO Mäusen sowie deren Mittelwert ± SEM. (Ì, B*14: p = 0,0150; B*21: p = 0,0388; Student’s T Test). 68 Ergebnisse Es wurde die relative Konzentration der NP-spezifischen Antikörper der IgG1-Subklasse ermittelt. Wie beim ersten T Zell-abhängigen Immunisierungsexperiment mit kurzem Monitoring gab es einen raschen Anstieg der NP-spezifischen IgG1 Antikörper bis Tag 14. Darauf folgte ein Abfall der Immunantwort an Tag 21 und eine zweite Spitze, die an Tag 40 erreicht wurde. Danach klang die Immunantwort langsam bis Tag 120 ab. Die Depotwirkung des Adjuvans erklärt die lang anhaltende Abklingphase der Immunisierung. Nach der ersten Immunisierung kam es zu keinem signifikanten Anstieg der Antikörperkonzentration in den KO Mäusen, wobei aber zu beobachten war, dass die Immunglobulinkonzentration konstant über der der WT Mäuse lag. Nach der zweiten Immunisierung war eine starke Reaktivierung der Immunantwort durch die gebildeten Gedächtnis B Zellen zu erkennen, wobei die KO Mäuse schon früher und stärker (B*14) reagierten. Die Reaktivierung unterschied sich aber nicht signifikant zu den WT Mäusen (B*5: p = 0,2949; B*14: p = 0,0708; B*21: p = 0,2361; Student’s T Test). Um zu untersuchen, ob die EFhd2 defizienten Mäuse möglicherweise effektiver auf das Antigen reagierten, wurde mittels NP(4)-BSA gekoppeltem ELISA analysiert (5.34.b), ob die entstandenen Antikörper der IgG1 Subklasse der KO Mäuse eine höhere Affinität zu NP aufwiesen. Dafür wurden ausgewählte Zeitpunkte, vor allem die nach Reaktivierung der Gedächtnis B Zellen analysiert, da hier die affinitätsgereiften, hypermutierten Gedächtnis B Zellen zu finden sein sollten. Während nach der ersten Immunisierung sowohl WT als auch KO Mäuse eine ähnliche Konzentration hochaffiner NPspezifischer Immunglobuline zeigten, änderte sich dies signifikant nach der zweiten Immunisierung. An Tag 14 und Tag 21 konnte eine deutlich höhere Konzentration hochaffiner NP-spezifischer Antikörper in den Seren der KO Mäusen beobachtet werden (B*14: p = 0,0150; B*21: p = 0,0388; Student’s T Test). Zu erklären ist der Abfall der Immunantwort an Tag 31 nach der zweiten Immunisierung einerseits durch das Fehlen des Antigen-Reservoirs, andererseits durch die effektivere Beseitigung des Antigens sowie durch die Halbwertszeit der IgG1 Antikörper (ca. 27 Tage). In EFhd2 defizienten Mäusen wurden durch NP(27)-KLH Gedächtnis B Zellen generiert, die nach Reaktivierung höher affine NPspezifische Immunglobuline der IgG1 Subklasse segregierten. EFhd2 scheint als negativer Regulator auf die Ausbildung hochaffiner Antikörper nach T Zell-abhängigem Antigenkontakt zu wirken. 5.4.11.3. T Zell-abhängige Immunisierung mit Schaferythrozyten Aus den bisher gewonnenen Daten wurde die Hypothese abgeleitet, dass EFhd2 ein negativer Regulator der B Zellaktivierung ist. Daher wurde erwartet, dass nach T Zellabhängiger Immunisierung größere und mehr Keimzentren zu beobachten wären. Dies sollte mit einem anderen Modellantigen und weiteren Methoden überprüft werden. Dazu wurden WT und KO Mäuse mit Schaferythrozyten immunisiert. Dadurch wird eine sehr rasche und starke T Zell-abhängige Immunantwort ausgelöst. Da sich im vorangegangenen Immunisierungsversuch gezeigt hat, dass KO Mäuse nach Reimmunisierung höher affine Antikörper generieren, sollte geklärt werden, ob mehr aktivierte B Zellen in Keimzentren zu finden sind, mehr Gedächtnis B Zellen entstehen oder eine größere Anzahl Plasmazellen vorhanden ist. Auch sollte geklärt werden, ob KO Mäuse bereits in der Keimzentrumsreaktion eine schnellere Antwort als WT Mäuse aufweisen. 69 Ergebnisse 5.4.11.3.1. Durchflusszytometrische Analysen des Keimzentrums Es wurden zwei Kohorten von Mäusen mit Schaferythrozyten immunisiert und nach 7 bzw. 12 Tagen auf das Vorhandensein relevanter Zellpopulationen mittels Durchflusszytometrie analysiert. Abbildung 5.35. zeigt die Analyse der aktivierten PNA+/GL7+ Keimzentrums B Zellen. Unter 5.35.a) ist exemplarisch die Auswahlstrategie (Gating-Strategie) dargestellt. Es wurden aus den Lymphozyten die follikulären (CD21+/CD23+) sowie Marginalzonen B Zellen (CD21+/CD23low) ausgewählt und innerhalb dieser die Population der PNA+/GL7+ Keimzentrums B Zellen analysiert. Unter 5.35.b) ist die Analyse für je fünf Mäuse zu beiden Zeitpunkten zusammengefasst. An Tag 7 waren signifikant mehr aktivierte, doppeltpositive Keimzentrums B Zellen vorhanden (p = 0,0012; Student’s T Test). Bis Tag 12 fiel die Zellfrequenz dann ab und lag sogar etwas unterhalb des WT Niveaus. Dies spricht für eine schnellere und effizientere Aktivierbarkeit von EFhd2 defizienten B Zellen im Keimzentrum. Nun blieb die Frage zu klären, ob die Zellen sich gleichermaßen zu Gedächtnis B Zellen und Plasmazellen entwickeln oder ob tatsächlich die Population der Gedächtnis B Zellen vermehrt gebildet wird, wie es die Daten unter Kapitel 5.4.11.2. unterstützen würden, da dort noch kein Unterschied nach der ersten Immunisierung, aber eine verbesserte und raschere Antwort nach der Reimmunisierung zu beobachten war. Tag 7 b) KO SSC SSC WT FSC CD23 CD23 FSC CD21 GL7 GL7 CD21 8 Frequenz der PNA+ GL7+ GC B Zellen [%] a) ÌÌÌ WT KO n=5 6 4 2 0 d7 d12 7 d7 12 d12 Tage nach SRBC Immunisierung Tage nach SRBC Immunisierung[d] [d] PNA PNA + Abb. 5.35.: Frequenz der PNA /GL7+ Keimzentrums B Zellen 7 bzw. 12 Tage nach Immunisierung mit Schaferythrozyten. Je 10 WT und KO Mäuse wurden mit 1 x 109 SRBC i.p. immunisiert. Nach 7 bzw. 12 Tagen wurden je 5 Mäuse getötet und aus einer Hälfte der Milz Einzelzellsuspensionen hergestellt, aufgearbeitet und mit Antikörpern für die FACS Analyse inkubiert. a) Es wurde die Lymphozytenregion durch Forward- / Sidescatter (FSC, SSC; oberes Paneel) ausgewählt, anschließend die für das Keimzentrum wichtigen B Zellpopulationen (Mz: CD21+/CD23low; Fo: CD21+/CD23+; mittleres Paneel). Von diesen wurden die PNA+/GL7+ Keimzentrums B Zellen analysiert (unteres Paneel). Die dargestellten Daten repräsentieren 5 unabhängige Experimente. b) Die Frequenzen der aktivierten, PNA+/GL7+ Keimzentrums B Zellpopulation wurden für alle Mäuse aus der in a) selektionierten Region ermittelt. Dargestellt sind die Einzelwerte sowie der Mittelwert ± SEM. (, p = 0,0012; Student’s T Test). 70 Ergebnisse Daher wurde auch die Population der Plasmazellen (CD138/zyt. κ+/λ+) in diesem Experiment untersucht (Abb. 5.36.) Wie jedoch aus 5.36.b) ersichtlich ist, war zu keinem Zeitpunkt ein Unterschied in der Frequenz der Plasmazellen zu beobachten. Ihre Frequenz blieb durch die häufiger auftretenden PNA+/GL7+ Keimzentrums B Zellen unbeeinflusst. Tag 7 b) KO SSC SSC WT Frequenz der Plasmazellen [%] a) FSC CD138 CD138 FSC zyt. κ/λ zyt. κ/λ 1.5 WT KO n=5 1.0 0.5 0.0 7 7 12 12 7 12 Tage Tage nach nach SRBC SRBC Immunisierung Immunisierung [d] [d] Abb. 5.36.: Frequenz der Plasmazellen 7 bzw. 12 Tage nach Immunisierung mit Schaferythrozyten. Je 10 WT und KO Mäuse wurden mit 1 x 109 SRBC i.p. immunisiert. Nach 7 bzw. 12 Tagen wurden je 5 Mäuse getötet und aus einer Hälfte der Milz Einzelzellsuspensionen hergestellt. Die Zellen wurden fixiert, permeabilisiert und mit Antikörpern für die FACS Analyse inkubiert. a) Die Lymphozyten wurden im Forward- / Sidescatter (FSC, SSC; oberes Paneel) ausgewählt und hiervon ausgehend die Plasmazellen (zyt. κ+/λ+/CD138+, unteres Paneel) analysiert. Die dargestellten Daten repräsentieren 5 unabhängige Experimente. b) Die Frequenzen der Plasmazellen wurden für alle Mäuse aus der in a) selektionierten Region ermittelt. Dargestellt sind die Einzelwerte sowie der Mittelwert ± SEM. Da eine Immunisierung mit Schaferythrozyten eine T Zell-abhängige Immunantwort hervorruft, wurden auch die CD4+ und CD8+ T Zellpopulationen in diesem Versuch untersucht. Die Population der CD4+ T Zellen unterschied sich zu keinem Zeitpunkt zwischen WT und KO (Abb. 5.37.b links). Die Population der CD8+ T Zellen ist jedoch an Tag 7 signifikant verringert (p = 0,0147; Student’s T Test). An Tag 12 ist die Frequenz wieder ähnlich. Es ist bisher kein direkter Einfluss von CD 8+ T Zellen auf die T Zell-abhängige Immunantwort bekannt, jedoch ist EFhd2 in humanen CD8+ T Zellen stark exprimiert. Allerdings ist dieser Unterschied nur schwer vorstellbar funktionell relevant, da trotzdem noch fast 25% CD8+ T Zellen in den KO Mäusen im Vergleich zu knapp 30% in WT Mäusen vorhanden waren. Es kann weder von einem Fehlen dieser Zellen noch von einer nicht ausreichenden Zellzahl ausgegangen werden. 71 Ergebnisse Tag 7 KO b) SSC SSC WT FSC CD3 CD3 FSC Frequenz der T Zellen [%] a) FSC CD8 CD8 FSC CD4 60 40 Ì 20 0 CD4 WT KO n=5 7 7 7 12 7 7 + 12 1212 1212 7 + CD8 T cells CD4 T cells + + CD4 T Zellen CD8 T Zellen Tage nach SRBC Immunisierung [d] Tage nach SRBC Immunisierung [d] Abb. 5.37.: Frequenzen der CD4+ und der CD8+ T Zellen 7 bzw. 12 Tage nach Immunisierung mit Schaferythrozyten. Je 10 WT und KO Mäuse wurden mit 1 x 109 SRBC i.p. immunisiert. Nach 7 bzw. 12 Tagen wurden je 5 Mäuse getötet und aus einer Hälfte der Milz Einzelzellsuspensionen hergestellt, aufgearbeitet und mit Antikörpern für die FACS Analyse inkubiert. a) Die Lymphozyten wurden im Forward- / Sidescatter (FSC, SSC; oberes Paneel) und anschließend die gesamten T Zellen (CD3+, mittleres Paneel) ausgewählt. Die CD4+ und die CD8+ T Zellsubpopulationen (unteres Paneel) wurden anhand der spezifischen Oberflächenmarker unterschieden. Die dargestellten Daten repräsentieren 5 unabhängige Experimente. b) Die Frequenzen der CD4+ und CD8+ T Zellen wurden für alle Mäuse aus den in a) selektionierten Regionen ermittelt. Dargestellt sind die Einzelwerte sowie der Mittelwert ± SEM. (, p = 0,0147; Student’s T Test). In der durchflusszytometrischen Analyse EFhd2 defizienter Mäuse sind an Tag 7 nach Immunisierung mit Schaferythrozyten fast doppelt so viele aktivierte, PNA+/GL7+ Keimzentrums B Zellen bei gleichbleibender Frequenz von Plasmazellen vorhanden. Auch die in der Keimzentrumsreaktion T Zellhilfe gewährenden CD4+ T Zellen sind nicht beeinflusst. 5.4.11.3.2. Immunhistochemische Analysen des Keimzentrums Nach der durchflusszytometrischen Analyse sollten die Milzen der immunisierten Mäuse an Tag 7 auch mit Immunfluoreszenzfärbungen auf Anzahl und Größe der Keimzentren analysiert werden. Dazu wurden die jeweilig anderen Hälften der Milzen (5.4.11.2) in TissueTek® eingebettet und deren Keimzentren durch geeignete Immunfluoreszenzfärbungen ausgewertet. In Abbildung 5.38.a) ist die Keimzentrumsfärbung mit PNA (Keimzentrums B Zellen, grün) und IgD (Marginalzonen B Zellen, rot) und in 5.38.b) die Auswertungsstrategie exemplarisch dargestellt. Alle Keimzentren wurden gezählt, gelb umrandet und ihre Fläche mit der Software Axiovision ermittelt. In Abbildung 5.38.c) sind die Flächen der Keimzentren zusammengefasst. In beiden Genotypen gab es sowohl kleine als auch große Keimzentren, die mittlere Größe war jedoch bei EFhd2 defizienten Mäusen signifikant größer (p = 0,0013; Student’s T Test). Weiterhin wurde in Abbildung 5.38.d) überprüft, ob bei KO Mäusen auch eine größere Anzahl an Keimzentren gebildet wurde. Dies war jedoch nicht signifikant. Die Anzahl an Keimzentren pro Maus war bei KO Mäusen nur tendenziell erhöht. 72 Ergebnisse a) WT Tag 7 KO PNA IgD b) WT Tag 7 KO PNA IgD GC Fläche 10000 d) ÌÌÌ WT n = 32 KO n = 54 8000 6000 4000 2000 0 WT KO 7 Tage nach SRBC Immunisierung [d] 30 Anzahl der Keimzentren pro Maus Fläche des Keimzentrums [µm²] c) WT KO n=4 20 10 0 WT KO 7 Tage nach SRBC Immunisierung [d] Abb. 5.38.: Anzahl und Größe der Keimzentren 7 Tage nach Immunisierung mit Schaferythrozyten. Die jeweilig anderen Hälften der Milzen von vier mit SRBC immunisierten Mäusen aus Kapitel 5.4.11.2 wurden in Tissue-Tek® eingebettet und 4 µm dicke Gefrierschnitte angefertigt. a) Die Milzschnitte wurden mit PNA (grün) und anti-IgD Antikörper (rot) zur Keimzentrumsdetektion angefärbt und am Fluoreszenzmikroskop (Axioplan 2 Mikroskop) mit dem 10x Objektiv ausgewertet. Die abgebildeten Aufnahmen repräsentieren je eine Aufnahme eines Schnittes der immunisierten Mäuse. b) Alle Keimzentren pro Schnitt (PNA+, begrenzt von IgD) wurden erfasst, gelb umrandet und ihre Fläche mittels Axiovision errechnet. Der Umrechnungsfaktor von Pixel in µm betrug 1,06. Das Auswertungsverfahren ist exemplarisch dargestellt. c) Die Flächen der Keimzentren wurden durch ein 10% winsorisiertes Mittel bereinigt und sind als Einzelwerte sowie mit ihrem Durchschnitt ± SEM dargestellt (ÌÌÌ, p = 0,0013). d) Die Anzahl aller Keimzentren pro Maus wurde ermittelt und ist mit Mittelwert ± SEM abgebildet. Dafür wurde je ein Schnitt pro Maus komplett durch mehreren Aufnahmen ausgewertet. 73 Ergebnisse Dies spricht dafür, dass sich die früh entstehenden Keimzentrums B Zellen nicht mehr als normal an der ersten Immunantwort beteiligen, aber nach Reaktivierung als Gedächtnis B Zellen mit einer besseren Affinitätsreifung eine weitaus größere Rolle spielen. Sei es dadurch, dass ein größerer Selektionsdruck durch begrenzt zur Verfügung stehendes Antigen auf die größere Keimzentrums B Zellpopulation wirkt, die B Zellen durch T Zellen besser aktivierbar sind oder aber die Zellen in größerer Zahl die Reifung durchlaufen. 5.4.12. CD40 Oberflächenexpression EFhd2 defizienter B Zellen Daher wurde die Oberflächenexpression von CD40 auf der Oberfläche von ruhenden und proliferierenden Milz B Zellen untersucht, um zu überprüfen, ob CD40 vermehrt auf der Zelloberfläche exprimiert wird und die Zellen eventuell deswegen durch T Zellhilfe besser aktiviert werden können. CD40 ist ein wichtiges kostimulatorisches Signalmolekül auf Antigen präsentierenden Zellen und ist notwendig für ihre Aktivierung mittels T Zellhilfe, so dass B Zellen beispielsweise in die Keimzentrumsreaktion eintreten können (Foy et al., 1994). Daher wurde die CD40 Oberflächenexpression auf ruhenden und 24 h mit F(ab)2 stimulierten Milz B Zellen im Durchflusszytometer analysiert. In Abbildung 5.39.a) ist die Zellfrequenz der CD40 exprimierenden Zellen von je zwei WT und KO Mäusen exemplarisch dargestellt. Daraus wurde die Mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) für CD40 auf der Zelloberfläche ermittelt (Abb. 5.39.b). Die CD40 Oberflächenexpression war weder in ruhenden noch in durch Stimulation des BZR mit F(ab)2 zur Proliferation gebrachten Milz B Zellen in EFhd2 defizienten Mäusen erhöht. Es wurde insgesamt etwas mehr CD40 auf der Oberfläche von proliferierenden im Vergleich zu ruhenden Milz B Zellen exprimiert. EFhd2 defiziente B Zellen zeigten aber keine erhöhte CD40 Expression. Die bessere Aktivierbarkeit der EFhd2 defizienten B Zellen in Immunantworten kann nicht durch höhere CD40 Expression erklärt werden. Zellfrequenz vom Maximum [%] CD40 WT1: WT2: Milz CD43KO3: 0 h Stimulation KO4: CD40 WT1: Milz CD43WT2: 24 h F(ab)2 KO3: Stimulation KO4: Oberflächenexpression CD40 [MFI] b) Zellfrequenz vom Maximum [%] a) 250 WT KO n=6 200 150 100 50 0 0h 0h 24h F(ab)2 24h F(ab)2 0 24 F(ab)2Stimulation Stimulation [h][h] F(ab) 2 Abb. 5.39.: CD40 Expression von ruhenden und 24 h mit F(ab)2 stimulierten Milz B Zellen. a) MACS sortierte Milz B Zellen wurden entweder sofort (linkes Histogramm) oder nach 24 h Stimulation mit 10 µg/ml F(ab)2 (rechtes Histogramm) mit fluoreszenzgekoppelten Antikörpern inkubiert und nach Selektion auf B Zellen im Durchflusszytometer auf ihre CD40 Oberflächenexpression untersucht. Dargestellt sind die Messungen der einzelnen Mäuse als Kurven im Histogramm. b) Die Mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) im CD40 detektierenden Kanal jeder Probe wurde mittels FlowJo® Software ermittelt. Dargestellt ist die MFI der Einzelwerte je 6 unabhängiger Experimente und deren Mittelwert ± SEM. 74 Ergebnisse Diese Arbeit zeigt, dass EFhd2 ein negativer Regulator der B Zellaktivierung und möglicherweise auch der peripheren Immuntoleranz ist, da in vivo in EFhd2 defizienten B Zellen der Kalziumflux aktivierter Milz B Zellen tendenziell verringert ist, in älteren Mäusen spontan mehr anti-dsDNA Antikörper auftreten, bei T Zell-unabhängiger Immunisierung ein Trend zu erhöhtem IgG3 Immunglobulinserumspiegel zu beobachten war, in T Zellabhängigen Immunisierungen tendenziell mehr Np-spezifische IgG1 Antikörper mit signifikant besserer Affinität gebildet werden und auch mehr Keimzentrums B Zellen in größeren Keimzentren gefunden wurden. 75 Diskussion 6. Diskussion 6.1. EFhd2 Trotz beschriebener Expression von EFhd2 in Zelltypen des angeborenen und adaptiven Immunsystems ist wenig über die Funktion des EFhd2 Proteins bekannt (Dutting et al., 2011). Da die bisherigen Daten und Analysen EFhd2 als vielseitiges, interessantes und wichtiges Protein darstellen, gerade auch für B Lymphozyten, meist aber mit Hilfe von Zelllinien gearbeitet wurde, war es Hauptbestandteil der vorliegenden Arbeit eine EFhd2 defiziente Mauslinie zu etablieren. Mit deren Hilfe sollte die in vivo Funktion von EFhd2 entschlüsselt werden. Da EFhd2 einen wichtigen Faktor für B Zellen darstellt, der den Schwellenwert des B Zellrezeptorsignals modulieren kann und somit in die B Zellentwicklung, die antigenabhängige B Zellreifung und die Etablierung der B Zelltoleranz involviert ist (Avramidou et al., 2007; Hagen et al., 2012; Kroczek et al., 2010; Mielenz et al., 2005), sollte in der vorliegenden Arbeit besonderes die B Zellentwicklung und B Zellaktivierung, der Einfluss auf naive B Zellen, die Immunantwort sowie Antikörper-Generierung charakterisiert werden. Zu klären war, ob EFhd2 einen positiven oder negativen Regulator in B Zellen darstellt. In einem weiteren Teilprojekt dieser Arbeit sollte ein monoklonaler EFhd2-spezifischer Antikörper hergestellt werden, der vor allem in Immunfluoreszenzfärbungen einsetzbar ist. 6.2. Generierung monoklonaler EFhd2-spezifischer Antikörper Im Rahmen dieser Arbeit wurden vier murine monoklonale EFhd2-spezifische Antikörper generiert, welche sowohl im Western Blot, im ELISA, als auch in der Immunhistochemie einsetzbar sind. Vor allem um Zugang zu Immunfluoreszenzfärbungen zu erlangen, die mit den bisherigen Antikörpern nicht zur Verfügung standen, wurden diese Antikörper hergestellt. Die Epitopbindungsstelle aller Klone konnte mit Hilfe von Deletionsmutanten des EFhd2 Proteins kartiert werden. Dabei ist auffällig, dass nicht nur alle Subklone des Klons A4, sondern auch der Subklone E7.23.20 in derselben Region des EFhd2 Proteins binden. Entweder ist diese Region im Protein exponiert und damit leicht zugänglich oder besonders immunogen, so dass sich Antikörper bevorzugt gegen diese Region bilden. Dieses Epitop bringt vor allem den Vorteil, dass genau diese Region den größten Unterschied zum Schwesterprotein EFhd1 besitzt und - wie durch Analysen bereits gezeigt werden konnte detektieren die generierten Antikörper nur das EFhd2, nicht aber das EFhd1 Protein (Brachs et al, in Vorbereitung). Somit konnte EFhd2 bereits in Gewebeschnitten von WT, nicht aber von EFhd2 defizienten Mäusen eindeutig detektiert werden (Brachs et al, in Vorbereitung). Die erzeugten Antikörper werden gegenwärtig erfolgreich in einer weiterführenden Dissertation, welche sich mit der vermuteten Rolle von EFhd2 bei der Pathogenese neurodegenerativer Erkrankungen beschäftigt (Vega et al., 2008), in immunhistologischen Färbungen eingesetzt (persönliche Kommunikation, P. Purohit). 76 Diskussion 6.3. Etablierung der EFhd2 defizienten Mauslinie 6.3.1 Technische Probleme bei der konditionalen Deletion des efhd2 Gens Zur Etablierung einer EFhd2 defizienten Mauslinie wurde eine konditionale Deletion des efhd2 Gens mittels des Cre-LoxP Systems (Gu et al., 1993; Hobeika et al., 2006; Rickert et al., 1997) verfolgt. Dazu wurde der Vektor „pRapidFlirt“ (A. Bruehl und A. Waisman, unpubliziert) passend für efhd2 modifiziert, die embryonale Stammzelllinie V6.5 (Eggan et al., 2001) homolog rekombiniert und der einzige Klon 2D.5 überprüft. Schon bei der Klonierung der homologen Bereiche für den Targeting Vektor der konditionalen Deletion traten Schwierigkeiten auf. Der efhd2 Lokus in c57Bl/6 DNA schien für die Enzyme der PCR nur schwer zugänglich zu sein, die Amplifikation größerer Bereiche scheiterte stets. Dies konnte erst durch ein efhd2 enthaltendes Bacmid, effizientere Polymerasen und die Zugabe von 3% DMSO zur Reaktion gelöst werden (Chakrabarti and Schutt, 2001). Weiterhin musste der 5’ homologe Bereich verkürzt und aufgeteilt werden, da der Promotorbereich des efhd2 Gens längere, hochrepetitive Sequenzen enthält. Dies bewirkte stets unvollständige PCR Produkte. Für das Southern Blot Screening mussten verschiedene Sonden getestet werden, da vor allem im Promotorbereich, aber auch im ersten Intron repetitive Sequenzen wie Mikrosatelliten, LINEs und SINEs (long/short interspersed nuclear elements) lokalisiert sind, die regelmäßig zu unspezifischen Signalen in den Southern Blot Analysen führten (Daten nicht gezeigt). Es ist nicht auszuschließen, dass dadurch auch die homologe Rekombination im efhd2 Lokus beeinträchtigt wird. Das Southern Blot Screening aller selektionierter ESZ Klone zeigte nur einen einzigen positiven Klon (ca. 0,23% Rekombinationsfrequenz). Es gibt zwar dem gemäß keinen Richtwert für Rekombinationsfrequenzen; problematisch war dann jedoch, dass nur ein einziger positiver Klon der konditionalen Deletion des efhd2 Gens für die Blastozysteninjektion zur Verfügung stand. Eine normale Morphologie von ESZ Klonen, wie sie hier vorlag, lässt nicht erkennen, ob eine Genominstabilität vorliegt, wie beispielsweise Abberationen oder sonstige Fehler im Chromosomensatz (Crasta et al., 2012), die nach Injektion zu Problemen bei der Embryogenese führen. Daher ist eine Auswahl von ESZ Klonen, die injiziert werden können und von denen im Idealfall Karyogramme erstellt werden sollten, von enormem Vorteil. Chromosomale Aberrationen könnten erklären, warum die chimären Nachkommen des einzigen konditionalen efhd2 ESZ Klons verkrüppelt waren und dies umso mehr, je höher der Fellfarben-Chimerismus war (persönliche Kommunikation, Prof. Bösl). Waren die Mäuse nur bis zu 20% chimar, waren sie zwar lebensfähig, konnten aber nicht zur Zucht eingesetzt werden. Daher konnte trotz wiederholter Injektionsversuche aus dem ESZ Klon 2D.5 leider keine konditionale EFhd2 defiziente Mauslinie etabliert werden. 77 Diskussion 6.3.2. Konstitutive Deletion des efhd2 Gens Im Vergleich zum konditionalen Targeting war jedoch schon die erste Injektion des von KOMP Repository erworbenen ESZ Klons AD1 mit sieben, teilweise höchst chimären Nachkommen sehr erfolgreich (Tab. 5.2.). Da die Deletion anders gewählt war, schloss das Targeting nicht den Promotorbereich ein (Abb. 6.1.). 1 kB 5’ tk pP - E1 dP2 ATG 5’ dP1 dP2 3’ pRapidFlirt-Δefhd2 neo E1 E2 I1 5’ E3 E4 pP lacZ - pA neo I2 I3 3’ murines efhd2WT 3‘ UTR 3’ Insertionskassette-lacZ Abb. 6.1.: Vergleich der Targeting-Strategie der konditionalen und konstitutiven Deletion im efhd2 Lokus. Sowohl der Targeting-Vektor pRapidFlirt-Δefhd2 für die konditionale Deletion als auch die zum Targeting verwendete Insertionskassette-lacZ sind mit ihren Homologieregionen (schwarze Balken) maßstabsgetreu abgebildet. Die bei der homologen Rekombination von beiden Strategien betroffenen Regionen im murine efhd2 Gen sind durch die gestrichelten, schwarzen Linien gekennzeichnet. dP1,2: distale Promotorelemente, pP: proximales Promotorelement, E1-4: Exon 1-4, I1-3: Intron 1-3, neo: Neomycinresistenz, UTR: untranslatierter Bereich, //: Aussparungen im efhd2 Lokus. Möglicherweise war daher der Lokus besser zugänglich und bei der homologen Rekombination wurden Komplikationen umgangen. Die Zucht mit den AD1 Founder-Mäusen zeigte, dass der Ersatz der codierenden Sequenz des efhd2 Gens durch das lacZ-Reportergen über die Keimbahn nicht vor- oder nachteilig, sondern nach den mendelschen Regeln vererbt wurde (Tab. 5.3.). Weiterhin waren auch die homozygoten, EFhd2 defizienten F2-Nachkommen fertil und lebensfähig. Die konstitutive Deletion des efhd2 Gens ist somit nicht letal, wie man aus den bisher publizierten Expressionsdaten hätte erwarten können (Dutting et al., 2011), da EFhd2 bereits während der Embryonalentwicklung im Stadium E8.5 (Tamplin et al., 2008), in der ESZ Linie V6.5 sowie in Ovarien (Daten nicht gezeigt) und vielen weiteren Geweben exprimiert wird (Avramidou et al., 2007; Shin et al., 2004; Vega et al., 2008). Dass EFhd2 in dieser Arbeit als negativer Regulator auftritt, unterstützt dies indirekt, da durch den Wegfall des efhd2 Gens keine positive Funktion des Gens betroffen wurde. Der Mausembryo weist keine offensichtlichen Schäden durch eine EFhd2 Defizienz auf. Allerdings wurden auch keine Vorteile beobachtet, die sich beispielsweise in einer Präferenz für das efhd2 defiziente Allel widerspiegeln könnten (Tab. 5.3.). Weiterhin scheint das fehlende EFhd2 Protein in homozygoten Mäusen keinen negativen Einfluss auf die Lebenserwartung zu haben. Bis zur Zusammenschrift dieser Arbeit (dieser Zeitpunkt entsprach etwa einem Alter der Mäuse von zwei Jahren) starb der gleiche Prozentsatz an WT und KO Mäusen (Tab. 5.4.). Möglicherweise wird bei einer Verlängerung dieser Studie noch ein Einfluss sichtbar, allerdings ist diesbezüglich kein Hinweis gegeben. Zusammenfassend konnte die konstitutive EFhd2 defiziente Mauslinie des ESZ Klons AD1 in dieser Arbeit etabliert werden. Sowohl auf DNA-Ebene mittels Southern Blot als auch auf Proteinebene mittels Western Blot wurde die erfolgreiche, konstitutive Deletion des efhd2 Gens und somit auch des Proteins verifiziert. 78 Diskussion 6.4. Auswirkung der EFhd2 Deletion/Charakterisierung der konstitutiven EFhd2 defizienten Mauslinie AD1 6.4.1. Kompensation des EFhd2 Proteins durch das homologe Schwesterprotein EFhd1? EFhd1 ist zwar zu 85% homolog zu EFhd2, besitzt jedoch ein völlig anderes Expressionsprofil als das Schwesterprotein (Dutting et al., 2011). In B Lymphozyten wurde von unserer Arbeitsgruppe bisher nur eine Expression in Pro B Zellen nachgewiesen (S. Dütting, Dissertation, 2010). Allerdings konnte die EFhd1 Expression mittels Western Blot Analyse nicht in Lysaten von Gesamt-Knochenmarkszellen nachgewiesen werden (Abb. 5.17.). Nur 2% davon sind Pro B Zellen. Wenn man von einer Übernahme der Funktionen von EFhd2 durch das EFhd1 Protein ausgehen würde, könnte man zumindest eine ähnlich starke Proteinexpression erwarten. Es besteht zwar theoretisch noch die Möglichkeit, dass geringe Mengen von EFhd1, die nicht im Western Blot nachgewiesen werden können, exprimiert werden. Allerdings unterscheiden sich die zwei Proteine gerade im N-terminalen Teil stark von einander. Besonders dieser Teil wird aber für die Lokalisation des EFhd2 Proteins zu den DRM verantwortlich gemacht und wird mit Funktionen, den BZR und das Kalziumsignal betreffend, in Verbindung gebracht (Avramidou et al., 2007; Kroczek et al., 2010). Da EFhd1 ein völlig anderes Expressionsprofil und bis auf die Kalziumbindung abweichende Funktionen als EFhd2 zeigt, wird nicht davon ausgegangen, dass EFhd1 für EFhd2 in EFhd2 defizienten Mäusen kompensiert. 6.4.2. EFhd2 in der B Zelldifferenzierung Während der Entwicklung von B Zellen in jungen Mäusen ab der Pro B Zelle im Knochenmark bis hin zur reifen, naiven B Zelle in der Milz und auch in allen charakterisierten B Zellpopulationen in den analysierten Organen wurde kein Einfluss der EFhd2 Defizienz festgestellt. Die relativen Frequenzen sowie die absoluten Zellzahlen der einzelnen Populationen und auch das Verhältnis der Nutzung der kappa- und lambda-leichten Ketten zeigten in den analysierten Organen keine statistisch signifikanten Unterschiede (Abb. 5.18.5.22.). Auch die untersuchten T Zellpopulationen in den analysierten Organen und das doppeltpositive Vorläuferstadium im Thymus sind mit Ausnahme der CD4+ T Zellpopulation in der Peritonealhöhle nicht von der Defizienz des EFhd2 Proteins betroffen. Diese sind jedoch signifikant reduziert, wobei die peritonealen CD4+ T Zellen erst im Zuge einer Immunreaktion eine Rolle zu spielen scheinen (Freeman and Ziegler, 2005). Insgesamt liefen die intraperitoneal applizierten Immunisierungen in EFhd2 defizienten Mäusen effizienter ab. Vorangegangene Arbeiten ließen eine Dysfunktion der negativen Regulation in EFhd2 defizienten B Zellen annehmen (Avramidou et al., 2007; Kroczek et al., 2010), die sich im Knochenmark in einer Verschiebung der Populationsfrequenzen äußern sollte. Wenn die EFhd2 Defizienz zu Defekten der Kontrollpunkte der B Zellentwicklung geführt hätten, müssten sowohl mehr unreife, aber auch mehr transitionelle und naive B Zellen, möglicherweise mit einem veränderten Verhältnis der Nutzung der kappa- zu lambda- 79 Diskussion leichten Ketten auftreten. In einer unregulierten B Zellentwicklung, beispielsweise beim Verlust eines negativen Regulators, tritt oft das Phänomen der Splenomegalie auf (Nishizumi et al., 1995; Qian et al., 2004). Bei EFhd2 defizienten Tieren wurde weder eine Vergrößerung der Milz noch eine Änderung in der absoluten Zellzahl oder im Verhältnis der kappa und lambda Leichtkettennutzung nachgewiesen. Möglicherweise können diese Effekte jedoch in EFhd2 defizienten Mäusen bei der Analyse im Durchflusszytometer nicht beobachtet werden, da alle Zellen betroffen sind und die Populationen insgesamt langsamer oder schneller gebildet werden, jedoch von der Anzahl her unverändert bleiben. Dies könnte ein kompetitiver Knochenmarkstransfer aufklären, denn möglicherweise treten Unterschiede in der B Zellentwicklung auch erst unter Konkurrenzbedingungen zwischen WT und KO Zellen in Erscheinung. In den knochenmarkschimären Mäusen können feine Unterschiede deutlich sichtbar werden, beispielsweise in der Entwicklungsgeschwindigkeit der Zellen oder in einer eingeschränkten oder besseren Fähigkeit, Überlebenssignale an den Kontrollpunkten zu erhalten (Ackermann et al., 2011). Wie die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, stellt EFhd2 einen negativen Regulator in B Lymphozyten dar. Daher entwickeln sich vielleicht die EFhd2 defizienten B Zellpopulationen schneller, aber die negative Selektion von Zellen mit leicht autoreaktivem BZR funktioniert nicht mehr so effizient, da der BZR Schwellenwert durch die EFhd2 Defizienz verändert ist. Dafür würde sprechen, dass in einjährigen EFhd2 defizienten Mäusen spontan auftretende autoreaktive Antikörper gegen doppelsträngige DNA signifikant akkumuliert wurden (Abb. 5.30.). Es könnte durchaus sein, dass sich zwei Defekte bei der Frequenzanalyse im Durchflusszytometer aufheben und die Homöostase in der B Zellentwicklung erhalten bleibt. Ein höherer Schwellenwert des BZR und eine gleichzeitig beeinträchtigte negative Regulation und Apoptose könnten die Frequenzen der B Zellpopulationen auf ähnlichem Niveau halten. Dadurch würden B Zellen überleben, die im WT System normalerweise eliminiert, editiert oder anergisiert würden (Melamed et al., 1998; Nemazee and Weigert, 2000; von Boehmer and Melchers, 2010; Yurasov and Nussenzweig, 2007). Auch könnte die periphere Toleranz durch fehlende oder zusätzlich auftretende Stimuli gebrochen werden (Melchers et al., 1995). Solche entgegengesetzte Effekte im Bezug auf die Qualität des BZR Signals müssten den Differenzierungsweg nicht beeinflussen (Hardy and Hayakawa, 2001; Tussiwand et al., 2009), könnten wohl aber zur vermehrten Bildung von autoreaktiven BZR oder zur Überwindung der Toleranz führen, die erst in späteren Stadien in Erscheinung treten könnten. Eine weitere Möglichkeit ist, dass EFhd2 in vivo erst bei der Antigen-abhängigen B Zellaktivierung proapoptotisch wirkt. Da die WEHI231 Zelllinie aus einem induzierten murinen B Zelllymphom entstand, lässt sich schlussfolgern, dass sie nur mit Einschränkungen das Stadium unreifer B Zellen repräsentiert (Boyd and Schrader, 1981; Gutman et al., 1981). Die Zellen sind demnach entartet, befinden sich also ständig in Proliferation und exprimieren AID, wobei dies bei ihnen nicht zum Klassenwechsel und nur zu marginaler Hypermutation führt (Spillmann and Wabl, 2004). Diese Fakten widersprechen dem Stadium der unreifen B Zelle. Allerdings exprimieren sie IgM auf ihrer Oberfläche und sind suszeptibel für BZR-vermittelte Apoptose (Avramidou et al., 2007; Benhamou et al., 1990; Boyd and Schrader, 1981; Hasbold and Klaus, 1990), wie auch unreife B Zellen. Insgesamt sind daher WEHI231 Zellen eher als aktivierte B Zellen anzusehen (Spillmann and Wabl, 2004). 80 Diskussion 6.4.3. Erwarteter Einfluss von EFhd2 auf die Entwicklung von B1a B Zellen Ebenso wurde erwartet, dass die Population der B1a B Zellen in der Peritonealhöhle von der EFhd2 Defizienz betroffen sein würde, da einerseits gerade die Populationen der B1 B Zellen sehr sensitiv auf Veränderungen von Signalmolekülen reagieren (Jellusova et al., 2010; Niiro and Clark, 2002; Wang et al., 1998), andererseits weil in sortierten B1a Zellen etwa dreimal mehr EFhd2 Protein als in Milz B Zellen und doppelt so viel wie in B2 B Zellen gefunden wurde (Abb. 5.16.). Allerdings war die relative Frequenz der peritonealen B1a B Zellen nur geringfügig in KO Mäusen reduziert, die der B1b B Zellen annährend gleich. Der Verlust der großen Menge des EFhd2 Proteins scheint keinen Einfluss auf die Population der B1a B Zellen zu nehmen. Auch die Produktion der natürlichen IgM Spiegel, wofür hauptsächlich peritoneale B1 B Zellen (Baumgarth et al., 2005; Yang et al., 2007), aber auch Marginalzonen B Zellen verantwortlich sind (Lopes-Carvalho and Kearney, 2004; Martin et al., 2001), ist weder in jungen noch in älteren Mäusen beeinflusst (Abb. 5.29.). Die Affinität der natürlichen Immunglobuline konnte nicht überprüft werden. Daher ist es möglich, dass auch hier EFhd2 als negativer Regulator eine Rolle spielt und viele B1a Zellen auf Grund einer nochmals erhöhten Autoreaktivität anerg sind (Fagarasan et al., 2000), aber die restlichen Zellen kompensatorisch mehr natürliches Immunglobulin sekretieren. Dies würde eine geringere, intakte Zellzahl ausgleichen und das Niveau des Serumspiegels wäre unverändert. Es könnte auch sein, dass die Produktion der natürlichen Immunglobuline komplett von Marginalzonen B Zellen übernommen wird (Lopes-Carvalho and Kearney, 2004; Martin et al., 2001). Möglich wäre auch, dass durch fehlendes EFhd2 die BZR Proteinkomposition verändert wird, der „Gegenspieler“ BAFF dominiert (Avramidou et al., 2007; Smith and Cancro, 2003) und daher mehr Zellen bei gleichzeitiger beeinträchtigter Negativselektion überleben (Henley et al., 2008). Vermehrt auftretende, vor allem leicht autoreaktive Zellen könnten die B1a B Zellnische dann schneller auffüllen (Mercolino et al., 1988; Rowley et al., 2007). Insgesamt gesehen könnte zwar EFhd2 eventuell bereits eine Funktion in Vorläufer B Zellen haben, ohne Antigeneinfluss bzw. ohne B Zellaktivierung konnte jedoch dem EFhd2 Protein keine grundlegende Funktion zugeschrieben werden. Die Homeostase der B Zellenwicklung bleibt erhalten. 6.4.4. Die Funktion des EFhd2 Proteins in der B Zellaktivierung Während EFhd2 bei der B Zelldifferenzierung und der Besiedlung der peripheren lymphoiden Gewebe mit naiven B Zellen wider Erwarten keine essentielle Rolle spielt, stellt EFhd2 einen negativen Faktor der B Zellaktivierung und der peripheren Immuntoleranz dar, der die Aktivierung von follikulären B Zellen zu Keimzentrums B Zellen regulieren, die Antikörperreifung und -produktion steuern sowie die Immunantwort limitieren kann. Weder in unreifen B Zellen des Knochenmarks noch in ruhenden primären Milz B Zellen wurde eine Änderung des Kalziumfluxes nach BZR Stimulation gefunden (Abb. 5.24-26.). In WEHI231 Zellen, die sich ständig im Zellzyklus befinden und daher - wie bereits erwähnt eher das Stadium aktivierter B Zellen repräsentieren (Gutman et al., 1981; Spillmann and Wabl, 2004), konnte dies jedoch gezeigt werden (Kroczek et al., 2010). Wurden nun primäre 81 Diskussion Milz B Zellen durch LPS Stimulation aktiviert, konnte nach BZR Stimulation eine tendenzielle Verringerung des Kalziumfluxes beobachtet werden, die allerdings nicht signifikant war. Die WEHI231 Zellen entsprechen also deutlich besser dem Status der aktivierten, proliferierenden primären Milz B Zellen. Zwar sind die damit erzielten Resultate bisher nicht so verlässlich wie in den Versuchen mit WEH213-shEFhd2 Zellen (Kroczek et al., 2010), aber dies dürfte der wesentliche Erklärungsansatz für die abweichenden Resultate der kultivierten immortalisierten, unreifen B Zelllinie WEHI231 und der Primärzellen sein. Weiterhin wurde von Haggerty und Kollegen berichtet, dass WEHI231 Zellen im Gegensatz zu unreifen B Zellen eine hohe Expression von IgD auf der Oberfläche zeigen würden, einem Merkmal von reifen B Zellen (Haggerty et al., 1993). Dies konnte jedoch in unserem Labor nicht reproduziert werden (Daten nicht gezeigt). Von Monroe und Kollegen wurde beanstandet, dass der Phänotyp der IgM-vermittelten Signalgabe in WEHI231 Zellen nicht mit dem Stadium der unreifen B Zelle übereinstimmt (Monroe, 1988:Monroe, 1989 #515). Ferner wäre ein kompensatorischer Effekt in vivo denkbar, der in WEHI231 nicht eintritt. Hätte die B Zelle beispielsweise durch vergrößerte Organellen, wie sie auch bei höherer Antikörperproduktion vorhanden sind (Kirk et al., 2010) ein größeres endoplasmatisches Retikulum (ER), würde dieses folgerichtig auch mehr Kalziumregulatoren wie das ER Chaperon Calreticulin (CRT) (Michalak et al., 2009; Ni and Lee, 2007) und IP3 (Inositoltriphosphat) Rezeptoren enthalten (Mikoshiba, 2007) und so möglicherweise einen verringerten Kalziumflux wieder erhöhen oder Änderungen abpuffern können (Ma and Pan, 2003; Michalak et al., 2009; Ni and Lee, 2007). Es gibt erste Hinweise auf ein vergrößertes ER in aktivierten EFhd2 defizienten B Zellen, was aber noch genauer untersucht werden muß. Ebenso wäre es möglich, dass EFhd2 an der ER Membran neben den Kalziumkanälen lokalisiert ist und dort das Kalziumsignal abpuffert, indem es Kalziumionen mit niedriger Affinität (spezifische Bindungskapazität Kd = 110 µM) erst bindet und dann wieder frei gibt (Hagen et al., 2012), wenn die Kalziumlager im ER nach Stimulation ins Zytoplasma geleert werden. Es könnte hier als negativer Regulator einen Kalziumüberschuss verhindern, da ansonsten die IP3 Rezeptoren durch die erhöhte Kalziumkonzentration wieder inaktiviert würden (Dufour et al., 1997; Kiselyov et al., 1999). Damit wäre EFhd2 als negativer Feinregulator in die Steuerung der intrazellulären Kalziumkonzentration involviert, der ein überschießendes Maximum verhindern könnte. Dieser Effekt ist möglicherweise in primären B Zellen nicht so ausgeprägt, da die Regulation des Kalziumfluxes vielleicht von anderen Proteinen, beispielsweise ER Chaperone, wie BiP oder CRT, übernommen wird (Dudek et al., 2009; Hendershot, 2004; Prins and Michalak, 2011). Diese Hypothese könnte durch Expressionsanalysen von BiP und CRT überprüft werden. Würden BiP und CRT in EFhd2 defizienten B Zellen die Funktion von EFhd2 übernehmen, müsste das ER folglich vergrößert sein. Schließlich vergrößert sich das ER auch im Zuge der Antikörperproduktion, was wiederum BiP und CRT involviert. Fehlt EFhd2, werden vermehrt Antikörper produziert, das ER also vergrößert, was sich wiederum auf den BZR-induzierten Kalziumflux auswirken könnte. 82 Diskussion 6.4.5. Der negative Regulator EFhd2 in der Immunantwort Um die Funktion von EFhd2 bei der B Zellaktivierung in vivo genauer aufzuklären, wurden in dieser Arbeit verschiedenste Modellantigene für Immunisierungen eingesetzt. Zusammenfassend wurde festgestellt, dass bei allen Immunisierungen tendenziell mehr Antikörper vorhanden waren, zum Teil mit signifikant erhöhten Werten bei bestimmten Zeitpunkten und Isotypen (Abb. 5.32.-5.34.). In den T Zell-unabhängigen Immunisierungen (TI) liegen die Immunglobulinspiegel der EFhd2 defizienten Mäuse tendenziell höher. Am deutlichsten ist der Unterschied bei der TI Typ I. Dabei gilt es zu beachten, dass bei der T Zell-unabhängigen Immunisierung Typ II (NP-Ficoll) eher reife und B1a B Zellen aktiviert werden, bei der T Zell-unabhängigen Immunisierung Typ I (TNP-LPS) alle Zellen durch die polyklonale Aktivierung angesprochen werden, also auch die Marginalzonen B Zellen (Huchet, 1985; Lopes-Carvalho and Kearney, 2004). Möglicherweise sind besonders diese für den signifikanten Anstieg an IgM zu Tag 12 verantwortlich. In der T Zell-unabhängigen Immunisierung Typ II ist IgG3 erhöht, schwankt aber stark. Dies könnte mit der kurzen Halbwertszeit von nur sieben Tagen im Serum zusammenhängen. Der Höhepunkt der Immunreaktion wird bereits an Tag 5 erreicht und an Tag 12 ist sie beinahe wieder beendet. So würde bereits eine kurze Verschiebung der Immunantwort der Mäuse ausreichen, um eine hohe Variation unter den Mäusen zu verursachen. Ebenso wurde nach Reimmunisierung mit TD Antigen eine signifikante Verbesserung der Antikörperaffinität zum Antigen bei Abwesenheit des negativen Regulators EFhd2 festgestellt. Die nach primärer Immunisierung im Keimzentrum gebildeten Gedächtnis B Zellen wurden also besser somatisch hypermutiert. Bestätigt wurde dies durch die Ausbildung größere Keimzentren und einer größeren Anzahl aktivierter Keimzentrums B Zellen in EFhd2 defizienten Mäusen (Abb. 5.35., 5.28.). Die in den Experimenten beobachteten Effekte lassen sich aber nicht auf eine unterschiedliche Präsentation von Oberflächenmolekülen wie CD40, IgM und MHCII auf den aktivierten B Zellen zurückführen. Die sekundäre Immunantwort läuft rascher ab als die primäre Immunantwort; der Antikörperspiegel fiel bereits an Tag 31 nach der Reimmunisierung ab. Dies war sowohl im WT als auch KO zu beobachten. Dabei werden sehr rasch wieder Gedächtnis B Zellen gebildet (Tomayko et al., 2010). Die erneut gebildeten Gedächtnis B Zellen sollten bei EFhd2 Defizienz nochmals ihre Affinität erhöht haben, wie das nach der ersten Immunisierung bereits der Fall war. Eine solche Erhöhung der Affinität wird nur erreicht, wenn passend zur BZR Affinität auch die entsprechende T Zellhilfe im Keimzentrum zur Verfügung steht (Victora et al., 2010). Daraus wird geschlossen, dass das EFhd2 Protein in reifen naiven B Zellen tatsächlich in die B Zellaktivierung eingreift. Alle Daten zusammengenommen zeigen, dass EFhd2 in vivo die Funktion eines negativen Regulators in der B Zellaktivierung und für die periphere Immuntoleranz hat. Dabei treten allerdings zwei Effekte gleichzeitig auf: Zum Einen werden mehr Zellen aktiviert. Dies lässt eine bessere T-B Zellinteraktion vermuten, möglicherweise auch eine verbesserte Präsentation des Antigens oder ein besseres Ansprechen auf Aktivierungsstimuli. Zum Anderen sekretieren die B Zellen effizienter. Es sind höhere Antikörperspiegel nachweisbar und deren Affinität zum Antigen ist erhöht. Hierbei ist möglicherweise auch die periphere Toleranz betroffen, indem die negative Regulation durch EFhd2 wegfällt und vermehrt auch 83 Diskussion autoreaktive B Zellen aktiviert werden können, die normalerweise durch die negative Selektion eliminiert würden. Ein Mechanismus, der durch EFhd2 Defizienz in reifen B Zellen aktiviert wird, könnte sein, dass sich die Proliferationsrate nach Stimulation durch Antigen erhöht und dadurch mehr aktivierte Keimzentrum B Zellen entstehen. In WEHI213 Zellen wurde der Einfluss von EFhd2 auf BZR-vermittelte Apoptose bereits entdeckt, in diesen fungiert EFhd2 proapoptotisch und CD40 Signale können EFhd2 negativ regulieren (Avramidou et al., 2007; Kroczek et al., 2010). Hierzu sollten noch Folgeversuche durchgeführt werden. In vivo jedoch spricht die vermehrte Bildung von Keimzentrums B Zellen zum frühen Zeitpunkt (Tag 7) für eine beschleunigte Immunantwort. Die Population der reifen B Zellen ist in EFhd2 defizienten Mäusen unverändert, auch werden ähnlich viele Keimzentren nach Immunisierung gebildet. Allerdings sind die Keimzentren im KO wesentlich größer ausgeprägt. Daher muss die Proliferationsgeschwindigkeit oder die Teilungsrate der aktivierten Zellen ohne EFhd2 deutlich erhöht sein. Ein Modellszenario wäre, dass die Keimzentrums B Zellen bei der Selektion im Keimzentrum um Überlebenssignale von T Helferzellen und FDC konkurrieren, wobei sich nur die Zellen durchsetzen, die die höchste Affinitätsreifung ihres BZR durchlaufen haben (Allen et al., 2007). So ist in EFhd2 defizienten Mäusen einerseits der Ausgangspool an aktivierten Zellen vergrößert und daher gibt es - insgesamt betrachtet mehr Möglichkeiten zur somatischen Hypermutation. Andererseits sind dadurch auch die Überlebenssignale begrenzter, da nicht davon auszugehen ist, dass sich die Anzahl der interagierenden Zellen erhöht. Außerdem steht den Keimzentrums B Zellen nicht mehr Antigen zur Präsentation zur Verfügung. Dadurch könnte sich also der Selektionsdruck auf die einzelne B Zelle erhöhen. Die Keimzentrums B Zellen scheinen dabei im Keimzentrum von EFhd2 defizienten Mäusen schneller zu entstehen. Vielleicht verlassen sie die Keimzentrumsreaktion aber auch schneller wieder, wenn der negative Regulator EFhd2 fehlt. Hierfür spricht, dass an Tag 12 sogar weniger Keimzentrums B Zellen bei EFhd2 defizienten Mäusen detektiert wurden, die Immunreaktion sich also schon weiter im Abklang befand als im WT. Dies würde definitiv für einen beschleunigten Durchsatz im EFhd2 defizienten Keimzentrum sprechen (Barnett et al., 2012; Gatto et al., 2007). Möglicherweise ist der beobachtete Phänotyp früher in der Immunantwort noch drastischer, da die ersten Plasma- und Gedächtniszellen bereits sehr früh (Tag 3 - 4) entstehen (Blink et al., 2005; Shinall et al., 2000). Die vergrößerte B Zellpopulation im Keimzentrum ist PNA+ und GL7+. Dies bedeutet, dass es sich um proliferierende, aktivierte Keimzentrums B Zellen handelt. Sie durchlaufen die somatische Hypermutation und anschließend den Klassenwechsel und werden sowohl zu Plasmazellen, als auch zu Gedächtniszellen. Interessanterweise könnte eine Parallele zwischen der erhöhten Frequenz an Keimzentrums B Zellen (GL7+/PNA+) in EFhd2 defizienten Mäusen und der Expression des GL7 Epitops bestehen. So proliferierte die GL7+ Population IL-5 stimulierter B Zellen in Versuchen von Laszlo stark und sekretierte viel IgM, die GL7- Population macht dies nur geringfügig (Laszlo et al., 1993). Auch zeigten in vitro aktivierte, sortierte GL7hi Milz B Zellen immunisierter Mäuse eine höhere Antikörperproduktion, aber auch spezifischere Antikörper und eine verbesserte Antigenpräsentation als die GL7lo B Zellen (Cervenak et al., 2001). Die Ergebnisse der EFhd2 defiziente Mäusen weisen sehr ähnliche Effekte auf, zudem eine Erhöhung der GL7+ Population. 84 Diskussion Die erhöhte PNA+/GL7+ Population zeigt auch CD95 auf ihrer Oberfläche. Das bedeutet, dass sie sich noch vor der oder gerade in der Selektion befinden (Daten nicht gezeigt) (Kondo and Yoshino, 2007). Interessanterweise war die Frequenz der Plasmazellen zum Zeitpunkt dieser Analyse jedoch nicht erhöht. Daraus könnte man schließen, dass nicht mehr Zellen als im WT die Keimzentrumsreaktion erfolgreich durchlaufen, sondern die aktivierten Keimzentrums B Zellen einem höheren Selektionsdruck unterworfen sind und deswegen höhere Affinitäten für ihr Antigen besitzen. Es wäre vorstellbar, aus den gewonnenen Erkenntnissen und der EFhd2 defizienten Mauslinie direkten Nutzen zu ziehen. Es wäre möglich, die generierte EFhd2 defiziente Mauslinie zur Antikörperherstellung und -verbesserung einzusetzen. Durch wiederholte Immunisierung EFhd2 defizienter Mäuse könnten so hochspezifische monoklonale Antikörper generiert werden, die beispielsweise für Therapieansätze oder zur Depletion von Zellen mit entsprechenden Oberflächenmarkern verwendet werden könnten. Eine vergrößerte Anzahl an Keimzentrums B Zellen könnte ein sterisches Problem verursachen. Durch die Antigen-induzierte Teilung der B Zellen wächst das Keimzentrum von innen heraus. Möglicherweise werden dadurch die Nischen anderer Zelltypen besetzt. Dies könnte im Fall der CD8+ T Zellen stattgefunden haben, deren Kompartiment in EFhd2 defizienten Mäusen an Tag 7 verringert war (Abb. 5.37.). Ob dieser Unterschied in der Immunantwort eine entscheidende Rolle spielt, ist nicht gewiss. Möglicherweise werden die CD8+ T Zellen teilweise als regulatorische CD8+ T Zellen benötigt, um Selbsttoleranz durch die Inhibition von follikulären T Helferzellen zu vermitteln (Kim et al., 2010). Dies könnte dann die negative Regulation in EFhd2 defizienten Mäusen zusätzlich betreffen. Die CD4+ T Zellen, die essentiell für die T Zellhilfe sind (Crotty, 2011; Freeman and Ziegler, 2005), bleiben hingegen bei der Immunisierung mit Schaferythrozyten in ihrer Frequenz unverändert. Ebenso könnte die Zytokinzusammensetzung ohne EFhd2 im Keimzentrum verändert sein, wodurch die Keimzentrumsreaktion beschleunigt wird und möglicherweise auch eine Veränderung in der Plasmazell- und Gedächtnis B Zellentstehung verursacht würde (Choe and Choi, 1998). Als Gegenspieler zu EFhd2 in B Zellen könnte GRB2 (Growth factor receptor-bound protein 2) in Betracht gezogen werden. GRB2 defiziente Mäuse zeigen ein verstärktes Kalziumsignal, weniger reife, follikuläre B Zellen in der Peripherie aufgrund verminderten B Zellüberlebens, eine eingeschränkte Keimzentrumsbildung und eine verringerte IgG und B Zellgedächtnisantwort (Ackermann et al., 2011). Nahezu jeder dieser Effekte wurde in EFhd2 defizienten Mäusen in entgegengesetzter Richtung beobachtet. Obwohl das Kalziumsignal in EFhd2 defizienten Mäusen nicht eindeutig reguliert wird, spricht doch etwas dafür, dass beide im gleichen Signalweg lokalisiert sind. Bei allen beobachteten Effekten der EFhd2 Defizienz ist es auffällig, dass immer das gleiche Schema in den Versuchen mit EFhd2 defizienten Mäusen/Zellen auftritt. Die Reaktion ist erhöht und beschleunigt, nivelliert sich dann aber wieder. Erstens waren die Autoantikörper gegen doppelsträngige DNA bei einem Alter von einem Jahr erhöht, ein halbes Jahr später war dieser Effekt jedoch nicht mehr so drastisch und eindeutig. Zweitens waren die Antworten auf Immunisierungen meist erhöht, wobei sie gegen Ende der Reaktion wieder auf ein ähnliches oder tieferes Niveau als der WT abfielen. Auch nach Reimmunisierung zeigte die Gedächtnisantwort erhöhte Antikörperspiegel die gegen Ende auf WT Niveau zurückgingen. Drittens zeigte die Immunreaktion induziert mit Schaferythrozyten an Tag 7 vergrößerte Keimzentren, die mehr aktivierte Keimzentrums B Zellen enthalten. Jedoch auch 85 Diskussion dieser Effekt ist an Tag 12 nicht mehr vom WT zu unterscheiden, unterschreitet ihn sogar leicht. Daher muss es einen Feedback-Mechanismus geben, der die Effekte des fehlenden EFhd2 abschaltet bzw. wieder an das WT Niveau anpasst. Zusammenfassend betrachtet, stellt EFhd2 einen negativen Regulator der B Zellaktivierung dar und ist in die Etablierung der peripheren Immuntoleranz involviert. Dies alles mit einbezogen, bleibt die übergeordnete Frage, warum es überhaupt einen negativen Regulator geben sollte, der es der Immunreaktion sowie der Antikörperreifung nicht erlaubt, uneingeschränkt abzulaufen und sich perfekt an ein Antigen anzupassen. Dadurch könnte die Möglichkeit, sich lange Zeit optimal an Pathogene gemäß einer Koevolution anzupassen, verloren gehen. Pathogene, die sich sehr schnell und stark verändern, wie beispielsweise der Grippevirus, könnten bei zu hoher Affinität des Antikörpers nicht mehr erkannt werden. Auch wären unspezifischere oder ältere Gedächtnis B Zellen nicht mehr vorhanden, weil sie von den höchstspezifischen aus den Überlebensnischen verdrängt wurden. Würden immer nur bestens passende Antikörper generiert, könnte dies zu Lasten einer Minderung der Erkennungsvielfalt führen. Trotzdem müssen Gedächtniszellen weit spezifischer als naive B Zellen sein, dennoch kann ein breit angelegtes Repertoire den Schutz effizienter sicher stellen als ein höchst spezialisiertes (Borghans et al., 1999). Daraus ließe sich schließen, dass eine maximale Anpassung der Affinität nur schrittweise und langsamer erfolgen sollte, um nicht über das Ziel hinauszuschießen und den Nutzen einer fortwährenden Reifung zu verlieren, wenn die besten Antikörper dann das Antigen eines evolvierten Pathogens nicht mehr als dieses erkennen können. Eine Dysregulation der Modulatoren im Keimzentrum birgt die Gefahr, dass Zellen hier bereits einen hochproliferativen Status haben und daher leichter Entartungen entstehen können (Kondo and Yoshino, 2007). Es ist bekannt, dass das Keimzentrum eine Hauptquelle für B Zelllymphome darstellt (Kondo and Yoshino, 2007). Deswegen werden die positive und die negative Selektion sowie die beteiligten Regulatoren normalerweise streng gesteuert und überwacht. Folglich kann der Verlust des negativen Regulators EFhd2 weitere, noch nicht beobachtete Folgen für den Organismus bereithalten. 6.4.6. EFhd2 in Autoimmunerkrankungen und Neuropathien Der Wegfall der negativen Regulation durch EFhd2 könnte erklären, warum bei EFhd2 Defizienz spontan Autoantikörper auftreten, da leicht autoreaktive B Zellen der Selektion entgehen könnten. Verstärkt würde dies noch durch eine Aktivierung der Zellen durch Antigenkontakt, wodurch die Zellen „beiläufig“ mitaktiviert werden könnten. Die gemessenen spontanen Autoantikörperspiegel entsprechen nicht der Menge, die in dem autoimmunen Mausmodell NZB/W gefunden werden. Aber es zeigt eine Prävalenz zur Dysregulation ohne EFhd2, die möglicherweise andere Effekte verstärkt. Dies könnte durch die Kreuzung mit einem autoimmunen Mausmodell oder der Induktion von Autoimmunität durch die Applikation von Pristan überprüft werden (Gado et al., 2001; Holmdahl et al., 2001; Satoh et al., 2000). Durch das Fehlen des negativen Regulator EFhd2 könnte ein Effekt verstärkt werden, der in vitro von Melchers und Kollegen entdeckt wurde. Durch polyklonale Aktivierung von B Zellen über CD40 kann in Anwesenheit von IL-4 - typische Merkmale einer T Zell-abhängigen Immunantwort - die Anergie von B Zellen und damit die periphere Toleranz gebrochen werden (Melchers et al., 1995). Dies könnte die vermehrte Aktivierung von B Zellen in EFhd2 defizienten Mäusen fördern. 86 Diskussion Die spontane Entwicklung von Autoantikörpern des IgG Isotyps gegen doppelsträngige DNA ist ein Kennzeichen für autoimmune Erkrankungen, wie zum Beispiel systemischer Lupus erythematosus (SLE) oder rheumatoide Arthritis. Eine genetische Assoziation von EFhd2 mit Autoimmunerkrankungen ist möglich, da das murine efhd2 Gen in einem Suszeptibilitätslokus für SLE lokalisiert (Wakeland et al., 2001). Ebenso wurde EFhd2 in PBMC (mononukleäre Zellen des peripheren Blutes) gefunden, wohingegen in PBMC von Patienten mit RA EFhd2 herunterreguliert vorlag (Dotzlaw et al., 2004; Schulz et al., 2007). Alle Befunde von EFhd2 mit eingebunden, könnte dies dazu führen, dass Antikörper-sekretierende Zellen von RA Patienten mehr und höher affine Antikörper, vor allem aber Autoantikörper ausschütten (Dorner and Burmester, 2003). Dies könnte zu einer Aggravitation des Krankheitsverlaufs führen. Ein Charakteristikum von RA ist der hohe TNFα Spiegel (Keffer et al., 1991). In Vorversuchen zeigten PBMC und Milz B Zellen von TNFα transgenen Mäusen sowie von autoimmunen Mäusen des SLE Tiermodells NZB/W eine starke Herunterregulation des EFhd2 Proteins (unpublizierte Daten). Dies könnte in den entsprechenden Zellen zu einer zusätzlichen Eskalation mit effizienterer Autoantikörperproduktion sowie vermehrter Sekretion führen. EFhd2 stellt einen negativen Regulator in der Maus dar. Für die Zukunft gilt es, diesen Ansatz mit Blick auf die B Zellaktivierung und periphere Immuntoleranz ins humane System zu translatieren. 87 Material 7. Material 7.1. Chemikalien und Verbrauchsmaterialien Chemikalien, Reagenzien und Lösungen wurden, sofern nicht anders angemerkt, von Becton Dickinson Biosciences (BD, Heidelberg), Life Technologies (Darmstadt) Merck (Darmstadt), Peqlab (Erlangen), Roche (Mannheim), Roth (Karlsruhe), Sigma-Aldrich (Steinheim) und Thermo Fisher Scientific (Bonn) bezogen. Plastik- und Verbrauchsmaterialien wurden von BD, Eppendorf (Hamburg), Sarstedt (Numbrecht), Greiner Bio-One (Frickenhausen), Corning (Wiesbaden), Millipore (Schwalbach) und Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach) erworben. Zellkulturmedien stammten von Gibco (Life Technologies) und Pan Biotech (Aidenbach). Enzyme wurden von New England Biolabs (NEB, Frankfurt am Main), Invitrogen (Life Technologies) oder Qiagen (Hilden) bezogen. Wurde etwas von einer anderen Firma erworben, ist dies jeweils angegeben. 7.2. Antikörper Alle verwendeten Antikörper wurden gemäß den Herstellerangaben gelagert. Selbst aufgereinigte Antikörper (entweder in der vorliegende Arbeit hergestellt oder im Labor etabliert) wurden in PBS mit 3% BSA und 0,1% NaN3 oder unverdünnt versetzt mit 0,1% NaN3 bei 4°C gelagert. Je nach Anwendung wurden die Antikörper gemäß Tabelle 7.1. (Verdünnung) eingesetzt. Tab. 7.1.: Übersicht der verwendeten Antikörper. AF647: Alexa Fluor 647; APC: Allophycocyanin; BD: Becton Dickinson; Bio: Biotinyliert; Cy3: Cyanine3; Cy5: Cyanine5; ELISA: Enzyme-linked Immunosorbent Assay; FACS: Fluorescence Activated Cell Sorting; FITC: Fluoresceinisothiocyanat; IH: Immunhistologie; HRP: MeerettichPeroxidase; HÜS: Hybridomüberstand; PE: Phycoerythrin; PerCP: Peridinin-Chlorophyll; Stim: Stimulation; Southern Biot.: Southern Biotech; UNLB: unkonjugiert; WB: Western Blot. Antigen Antikörper Methode Verdünnung Herkunft A4.15.28 Maus IgG1-anti-Maus EFhd2 WB/IH 1 µg/ml/2 µg/ml vorliegende Arbeit A4.15.48 Maus IgG1-anti-Maus EFhd2 WB/IH 1 µg/ml/2 µg/ml vorliegende Arbeit A4.18.18 Maus IgG1-anti-Maus EFhd2 WB/IH 1 µg/ml/2 µg/ml vorliegende Arbeit AA4.1 Bio-Ratte IgG-anti-Maus AA4.1 FACS 1:100 eBioscience Aktin Hase Ig-anti-Maus Aktin WB 1:1000 Sigma-Aldrich B220 FITC-Ratte IgG-anti-Maus B220 FACS 1:500 eBioscience B220 PerCP-Ratte IgG-anti-Maus B220 FACS 1:75 Miltenyi Biotin Cy3-Streptavidin IH 1:1000 GE Healthcare Biotin PE-Streptavidin FACS 1:1000 eBioscience Biotin PerCP-Streptavidin FACS 1:2000 BD CD3 FITC-Ratte IgG-anti-Maus CD3 IH/FACS 1:100 BD CD4 FITC-Ratte IgG-anti-Maus CD4 FACS 1:800 BD CD4 PE-Ratte IgG-anti-Maus CD4 IH 1:200 BD CD5 PE-Ratte IgG-anti-Maus CD5 FACS 1:400 BD CD8 APC-Ratte IgG-anti-Maus CD8a FACS 1:800 eBioscience CD19 AF647-Ratte IgG-anti-Maus CD19 FACS 1:1500 eBioscience 88 Material CD19 CD21/CD35 CD21/CD35 CD23 CD25 CD25 CD40 CD40 CD43 CD138 c-kit E7.20.23 EFhd1 EFhd2 EFhd2 GL-7 GST HSP90 IgA IgA IgD IgD IgE IgE IgG IgG IgG IgG IgG IgG IgG1 IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 IgM IgM IgM IgM IgM IgM IgM κ λ λ myc PNA PE-Ratte IgG-anti-Maus CD19 Bio-Ratte IgG-anti-Maus CD21/CD35 FITC-Ratte IgG-anti-Maus CD21/CD35 PE-Ratte IgG-anti-Maus CD23 Bio- IgG-anti-Maus CD25 PE-Ratte IgG-anti-Maus CD25 PE-Ratte IgG-anti-Maus CD40 Ratte anti-Maus CD40 HÜS: FGK FITC-Ratte IgG-anti-Maus CD43 APC-Ratte IgG-anti-Maus CD138 PE-Ratte IgG-anti-Maus c-kit Maus IgG1-anti-Maus EFhd2 Hase IgG-anti-Maus EFhd1 Hase IgG-anti-Maus EFhd2 Ziege IgG-anti-EFhd2 (Maus, Mensch) AF647-Ratte IgM-anti-Maus GL-7 Maus anti-GST; HÜS: 63E7 Maus-Ig-anti-Maus HSP90 HRP-Ziege anti-Maus IgA UNLB-Ziege anti-Maus IgA Bio-Ratte IgG-anti-Maus IgD FITC-Ratte IgG-anti-Maus IgD HRP-Ratte IgG-anti-Maus IgE UNLB-Ratte IgG-anti-Maus IgE HRP-Esel Ig-anti-Ziege IgG (H+L) HRP-Ziege Ig-anti-Maus IgG (H+L) HRP-Ziege Ig-anti-Maus IgG, Fcγ FITC-Ratte IgG-anti-Maus IgG HRP-Ziege IgG-anti-Maus IgG UNLB-Ziege IgG-anti-Maus IgG HRP-Ziege IgG-anti-Maus IgG PE-Ratte IgG-anti-Maus IgG1 HRP-Ziege IgG-anti-Maus IgG HRP-Ziege IgG-anti-Maus IgG HRP-Ziege IgG-anti-Maus IgG Bio-Maus IgG-anti-Maus IgM Cy5-Ziege IgM-anti-Maus Fab Cy5-Ziege IgG-anti-Maus IgM FITC-Ziege IgG-anti-Maus IgM. HRP-Ziege IgG-anti-Maus IgG UNLB-Ziege IgG-anti-Maus IgG Ziege IgM-anti-Maus F(ab’)2 PE-Ratte IgG-anti-Maus kappa FITC-Ratte IgG-anti-Maus lambda PE-Ratte IgG-anti-Maus lambda Maus anti-myc; HÜS: 9E10 Fluorescein Peanut Agglutinin 89 FACS FACS FACS FACS FACS FACS FACS Stim FACS FACS FACS WB/IH WB WB WB IH/FACS WB WB ELISA ELISA FACS FACS ELISA ELISA WB WB WB FACS ELISA ELISA ELISA FACS ELISA ELISA ELISA FACS FACS FACS FACS ELISA ELISA Stim FACS FACS FACS WB IH/FACS 1:800 1:100 1:100 1:400 1:200 1:100 1:500 10 µg/ml 1:200 1:500 1:100 1 µg/ml/2 µg/ml 2 µg/ml 1 µg/ml 0,5 µg/ml 1:50/1:200 unverdünnt 1:1000 1:2000 1:1000 1:1000 1:100 1:2000 1:1000 1:10000 1:3000 1:25000 1:200 1:2000 1:1000 1:2000 1:200 1:2000 1:2000 1:2000 1:400 1:3000 1:1000 1:200 1:2000 1:1000 1-20 µg/ml 1:1500 1:100 1:1000 unverdünnt 1:400/1:2000 eBioscience eBioscience eBioscience eBioscience eBioscience eBioscience eBioscience Labor BD BD BD vorliegende Arbeit Dr. Mielenz Dr. Mielenz Everest Biotech eBioscience Dr. Mielenz Santa Cruz Southern Biot. Southern Biot. Southern Biot. Southern Biot Southern Biot Southern Biot Santa Cruz Biorad Jackson eBioscience Southern Biot Southern Biot Southern Biot Southern Biot. Southern Biot Southern Biot Southern Biot BD Jackson Southern Biot. Southern Biot. Southern Biot Southern Biot Jackson Southern Biot. Southern Biot. Southern Biot. Labor Vector Labs Material 7.3. Oligonukleotide Alle Oligonukleotide (Primer) wurden von Invitrogen (Life Technologies) bezogen. In der Tabelle 7.2. sind die verwendeten Oligonukleotide für PCR-Amplifikationen und Sequenzierungsreaktionen sowie ihre Verwendungszwecke (Genotypisierung von Mäusen, Sequenzierung, Sonden für Southern Blot Analyse, Vektorklonierung) aufgeführt. Die Sequenzen sind aufsteigend nach ihrer ER-Nummer geordnet. Die Annealing-Temperatur bei PCR-Reaktionen wurde etwa 5°C unter der Schmelztemperatur der Oligonukleotide, die den zugehörigen, mitgelieferten Datenblättern entnommen wurde, gewählt. Tab. 7.2.: Übersicht der verwendeten Oligonukleotide. Registernummer und Nukleotidsequenz. Eingebrachte Restriktionsschnittstellen sind unterstrichen. for: forward; G: Primer für Genotypisierungs-PCR; rev: reverse; Seq: Sequenzierprimer, SB: Primer zur Amplifikation von Southern Blot Sonden; TV: Primer für Targeting-Vektoramplifikate. Nutzung ER# Sequenz (5’-3’) Name Seq AATACGACTCACTATAGG T7 (pCR2.1) #685 Seq CAGGAAACAGCTATGAC M13 (pCR2.1) #686 Seq GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG 5 pGex #315 Seq CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG 3 pGex #316 G βgal1 fwd #4153 AACTGGCAGATGCACG G βgal1 rev #4154 GCGCGTAAAAATGCG G/SB 3 SBp vorn fwd #4155 GGTCAAGTTTAGTCCTCGG G/SB 3 SBp vorn rev #4156 TTCATCAGTCAAATGGCTG SB 5 left SBp no rep #4157 CCCAACCCATATGCAA SB 3 left SBp no rep #4158 ATTAGTGAGGCCTTCCGA SB 5 left SBp Hind3 only #4159 GCTCTAGAGGGGACATTGAG SB 3 left SBp Hind3 only #4160 GGCATAAGACTGGGACTTTC TV 3 primer right arm Not1 #2020 GATCGCGGCCGCGTTCTACAAGGCCTTCAGCT TV 5 primer right arm Bcl1 #2021 GATCTGATCAAGCACGCAAGTGGATCTGGG TV 3 primer floxed allel Sbf1 #2022 GATCCCTGCAGGTGGTGGGTCTGGAAGCCTC TV 5 floxed allel Sal1 #4161 GACGTCGACAAGAGGCAACATGGAGATCTC TV 5 primer new left arm Xho1 #4162 GACCTCGAGAAGCAGCAAGGCTCCTGTG TV 3 la part2 #4163 GACTTACATCTGCACTTGCCTAG TV 5 la part3 #4164 GACCTCCAAGGCTCACCAGAGT TV 3 la part3 Fse1 #4165 GACGGCCGGCCTGATGGGGATCCCAGAGG Seq Right Arm Seq1 fwd #4166 CCAGTGACAGTTCCTC Seq Right Arm Seq2 fwd #4167 TAGAACGGCAGGAATC Seq Right Arm Seq3 fwd #4168 AGAGAAGGAAGTGCCA Seq Right Arm Seq4 fwd #4169 GGCCTCAGACTTTATC Seq Right Arm Seq5 fwd #4170 CAGGCATAGAGGCAC Seq new la Seq1 fwd #4171 AGCATCTAAGGGTGC Seq new la Seq2 fwd #4172 GATTTTCTACGGGGAC Seq new la Seq3 fwd #4173 GGGAGGCAGAAGC Seq pRF Seq1 fwd loxP,Frt #4174 CCGAGGGCAGTATC Seq pRF Seq2 fwd Frt #4175 CAATAGCAGGCATGC Seq pRF Seq3 fwd loxP #4176 CCATTTCTCCCGTATC 90 Material 7.4. Vektoren und Konstrukte In Tabelle 7.3. sind die in dieser Arbeit verwendeten und modifizierten Vektoren zusammengefasst. Tab. 7.3.: Übersicht der verwendeten Vektoren amp: Ampicillinresistenzgen, kan: Kanamycinresistenzgen; neo: Neomycinresistenzgen. Name Insert Resistenz Firma/Herkunft pCR2.1 TA-Klonierunsstelle Invitrogen (Life Technologies) amp/kan/neo pGex2T Ohne Insert (GST Expression) Amersham Pharmacia Biotech amp pGex2T-EFhd2 EFhd2 cDNA Amersham Pharmacia Biotech amp pRapidFlirt LoxP/FRT-neo-FRT-LoxP-tk A. Bruehl & A. Waisman amp/neo pRapidFlirt-TV Targeting-Vektor efhd2 vorliegende Arbeit amp/neo 7.5. Puffer, Lösungen und Medien Alle in dieser Arbeit verwendeten Puffer, Lösungen und Medien wurden mit Reinstwasser (Milli-Q® Reference, Millipore) angesetzt und sind in Tabelle 7.4. zusammengefasst. Tab. 7.4.: Rezepte der Puffer, Medien und Lösungen. U: Unit. lacZ-Färbelösung 5x SDS-Ladepuffer 313 mM Tris/HCl pH 6,8 2 mg/ml Xgal/DMSO 10% SDS 5 mM Kaliumhexacyanidoferrat(II) 25% Glycerin 5 mM Kaliumhexacyanidoferrat(III) 1 mM EDTA in lacZ-Waschpuffer 500 mM DTT 0,005% Bromphenolblau lacZ-Fixierlösung 0,005% Pyronin Y 0,2% Glutaraldehyd 5 mM EGTA 10x Ponceau S Färbelösung 2 mM MgCl2 0,2% Ponceau S in PBS 3% Trichloressigsäure 3% Sulfosalicylsäure lacZ-Waschpuffer 2 mM MgCl2 10x TBST 1% NP-40 in PBS 200 mM Tris/HCl pH 7,4 1,5 M NaCl M2-Medium 1% Tween 20 600 µl Optimem (- Phenolrot, + HEPES) 20x SSC Lösung (pH 7,0) 0,6 µl L-Glutamin 24 µl FCS 3 M NaCl 2 µl LIF 0,3 M Natriumcitrat-Trinatriumsalz MACS Puffer / Blockpuffer 2% FCS in PBS Beschichtungspuffer 15 mM Na2CO3 35 mM NaHCO3 91 Material Church II Puffer 250 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,2 7% SDS 1 mM EDTA 100 µg/ml Lachssperma DNA Mowiol 12 g 30 g 30 ml 60 ml ECL Lösung 0,1 M 2,5 mM 0,4 mM 0,03% PBND Puffer 50 mM KCl 10 mM Tris/HCl pH 8,3 2,5 mM MgCl2-6H2O 0,1 mg/ml Gelatine 0,45% NP-40 0,45% Tween 20 Tris/HCl pH 8,5 Luminol/DMSO (Fluka) p-Cumarsäure/DMSO (Roth) 35% H2O2 Einfriermedium 90% FCS 10% DMSO Mowiol 4-88 (Calbiochem) Glycerol H2O 0,2 M Tris/HCl pH 8,5 Proteinase K Puffer 100 mM NaCl 10 mM Tris/HCl pH 8,0 50 mM EDTA pH 8,0 0,5% SDS Einfriermedium für Feeder-Zellen 50% Feeder-Medium 20% DMEM 20% FCS 10% DMSO Proteindialysepuffer 20 mM Tris/HCl pH 8,0 140 mM NaCl 1 mM DTT ELISA-Waschpuffer 0,05% Tween 20 in PBS Proteinlysepuffer 20 mM Tris/HCl pH 8,0 140 mM NaCl 1 mM DTT 2 mM EDTA 1% Triton X-100 1 mM PMSF Erythrozytenlysepuffer 0,15 M NH4Cl 20 mM HEPES ESZ / Feeder-Medium 500 ml DMEM 75 ml FCS (ESZ getestet) 6 ml Natriumpyruvat 6 ml Glutamin 6 ml MEM-NEAA 6 ml Penicillin/Streptomycin 1,2 ml β-Mercaptoethanol 106 U/l LIF, nur ESZ (ESGRO, Chemicon) R10+ (R5+) Medium 10% (5%) FCS 2 mM L-Glutamin 1 mM Natriumpyruvat 50 U/ml Penicillin 50 µg/ml Streptomycin 50 µM β-Mercaptoethanol ESZ Einfriermedium 12,5 % DMSO 88,5 % ESZ-FCS FACS Puffer 2% FCS in PBS 0,01% NaN3 1 mM EDTA (optional) 92 Material HRP-Substrat 20 mM Na2HPO4 7 mM Zitronensäure 0,1% O-Phenylendiamin 1‰ 30% H2O2 RIPA Puffer 0,1% SDS 0,25% Natriumdeoxycholat 1% Triton X-100 150 mM NaCl 5 mM EDTA 25 mM Tris/HCl pH 7,4 1 mM Vanadat 1 mM PMSF IHC-Blockpuffer 10% FCS 0,1% BSA in PBS TE Puffer 10 mM 1 mM IHC-Färbelösung 2% FCS 0,05% Tween 20 in PBS Tris/HCl pH 8,0 EDTA Überschichtungspuffer 60 mM KCl 5 mM MgCl2 10 mM Imidazol/HCl pH 6,8 7.6. Zelllinien und Kulturbedingungen 7.6.1. Zelllinien In Tabelle 7.5. sind alle verwendeten Zelllinien aufgeführt. Auch die durch Vektoren eingeführten Mutationen und die entsprechenden Resistenzen sind angegeben. Tab. 7.5.: Übersicht der verwendeten Zelllinien. neo: Neomycinresistenzgen; puro: Puromycinresistenzgen; sh: shRNA; LC: low complexity region; EF1, 2: EF Hand Domäne 1, 2; PR: Prolin-reiche Region; CC: Coiled coil Domäne. Name Mutation Resistenz Herkunft 38B9 Pro B Zelllinie (Alt et al., 1981) Feeder-Zellen Murine Fibroblastenzellen vorliegende Arbeit neo SP2/0 Balb/c Hybridomzelllinie Helga Polet V6.5 ESZ Embryonale Stammzelllinie (Eggan et al., 2001) Unreife B Zelllinie (Boyd and Schrader, 1981) WEHI231 EFhd2 cDNA + myc-Tag (Avramidou et al., 2007) WEHI231sh.myc puro, neo EFhd2 cDNAΔCC + myc-Tag puro, neo (Kroczek et al., 2010) WEHI231sh.ΔCC EFhd2 cDNAΔEF1 + myc-Tag puro, neo (Kroczek et al., 2010) WEHI231sh.ΔEF1 EFhd2 cDNAΔEF2 + myc-Tag puro, neo (Kroczek et al., 2010) WEHI231sh.ΔEF2 EFhd2 cDNAΔLC + myc-Tag (Kroczek et al., 2010) WEHI231sh.ΔLC puro, neo EFhd2 cDNAΔPR + myc-Tag (Kroczek et al., 2010) WEHI231sh.ΔPR puro, neo EFhd2 shRNA (Avramidou et al., 2007) WEHI231sh35 puro 93 Material 7.6.2. Kultivierung von Zelllinien Die WEHI231 Zelllinie und alle abstammenden mutanten Zelllinien sind Suspensionszellen und wurden in R10+, wenn nötig, unter der jeweiligen Selektion auf 37°C, 5% CO2 und 100% Luftfeuchtigkeit kultiviert. Die adhärenten Feeder-Zellen und die embryonalen Stammzellen der Linie V6.5 wurden in Feeder- bzw. ESZ-Medium auf 37°C 7,5% CO2 und 100% Luftfeuchtigkeit kultiviert. 7.7. Mausstämme Alle verwendeten Versuchstiere wurden unter pathogenfreien Bedingungen in individuell belüfteten Käfigen (IVC) in der IVC-Tierhaltung im Tierstall des Franz-Penzoldt-Zentrums in Erlangen gehalten. Für alle Experimente wurden Wurfgeschwister oder Mäuse vergleichbaren Alters (Mindestalter: 6 Wochen), möglichst Männchen und Weibchen in gleichem Verhältnis verwendet. Für Versuche wurden die Mäuse durch mindestens zweiminütige Begasung mit 1,5 bar CO2 getötet. Wenn nötig, wurden Mäuse kommerzieller Züchter zugekauft. Alle Experimente wurden nach einheitlichen ethischen Richtlinien für Tierversuche und Sicherheitsvorgaben für Genmanipulationsversuche durchgeführt. Die jeweilige Herkunft der Versuchstiere ist in Tabelle 7.6. aufgeführt. Tab. 7.6.: Übersicht der verwendeten Versuchstiere. Stamm Herkunft AD1, C57Bl/6 vorliegende Arbeit BALB/c Charles River WIGA GmbH, Sulzfeld C57Bl/6 Elevage Janvier, Le Genest St. Isle, Frankreich 7.8. Kommerziell erhältliche Kits In Tabelle 7.7. sind alle in dieser Arbeite verwendeten kommerziell erhältlichen Kits zusammengefasst. Tab. 7.7.: Übersicht der verwendeten kommerziellen Kits. Kit Firma BCA™ Protein Assay Kit ® EndoFree Plasmid Maxi Kit Fix&Perm Cell Permeabilization Kit Prime-It II Random Primer Labeling Kit QIAEX®II Gel Extraction Kit ® QIAGEN Plasmid Maxi Kit ® QIAGEN Plasmid Midi Kit ® QIAprep Spin Miniprep Kit ® QIAquick Gel Extraction Kit QIAquick® PCR Purification Kit TOPO-TA Cloning-Kit for sequencing Thermo Scientific (ehemals Pierce) Qiagen AN DER GRUB, Kaumberg, Österreich Agilent, Böblingen Qiagen Qiagen Qiagen Qiagen Qiagen Qiagen Invitrogen (Life Technologies) 94 Material 7.9. Software Die genutzten Computerprogramme sowie Online-zugängliche Software ist in Tabelle 7.8. aufgeführt. Tab. 7.8.: Übersicht der verwendeten Computerprogramme. Programm Firma/URL BASReader 3.14 Raytest, Düsseldorf CellQuest™ v4.0.2 BD ELM Online, http://elm.eu.org Ensembl Online, http://www.ensembl.org FACSDiva BD FlowJo 8.8.6 Tree Star Inc., Ashland, OR, USA GraphPad Prism GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA Microsoft Office Excel / Word Microsoft®, Unterschleißheim NCBI Blast Online, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi Primer3 Online, http://frodo.wi.mit.edu/primer3/ RepeatMasker Online, http://www.repeatmasker.org/ rVista 2.0 Online, http://rvista.dcode.org/ Scion Image / Image J National Institutes of Health, USA SeqMan DNASTAR, Inc., Madison, WI, USA SOFTMax Pro v3.0 Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Vector NTI Invitrogen (Life Technologies) 95 Methoden 8. Methoden 8.1. Proteinbiochemische und molekularbiologische Methoden 8.1.1. GST-EFhd2 Fusionsprotein 8.1.1.1. Konstruktion GST-EFhd2 Das pGEX-2T Expressionsvektorsystem (GE Healthcare, ehemals Amersham Pharmacia Biotech, München) wurde genutzt, um das murine EFhd2 Protein mit GST-Tag im E. coli Stamm Rosetta (Invitrogen) zu exprimieren. Dazu wurde die cDNA, die für EFhd2 kodiert, mittels PCR amplifiziert, das PCR Produkt in den Vektor pCR®2.1-TOPO® (TA Cloning® Kit) kloniert, sequenziert und nach Amplifikation sowie EcoRI Verdau zwischen die EcoRI Schnittstellen des Expressionsvektors pGEX-2T kloniert. Das GST-EFhd2 Konstrukt wurde in E. coli Rosetta transformiert und exprimiert. 8.1.1.2. Gewinnung und Aufreinigung des GST-EFhd2 Fusionsprotein Die transformierten E. coli wurden aus einer Vorkultur in 100 ml LB-Medium mit Ampicillin angeimpft und zur GST-EFhd2 Expression bei einer oD600 = 0,6 mit 1 mM Isopropyl-β-D-1thiogalactopyranosid (IPTG) für 2 h auf 37°C induziert. Anschließend wurden die Zellen für 30 min mit 10000g auf 4°C (Avanti™ J25, Beckman Coulter, Krefeld) abzentrifugiert, im Proteinlysepuffer resuspendiert, und für 10 min auf Eis inkubiert. Nach nochmaliger Zentrifugation wurde der Überstand mit GST-Separose für 2 h auf 4°C auf einem Rotator inkubiert. Nach Zentrifugation für 3 min mit 1000g auf 4°C erfolgte die Aufreinigung mit 100 mM reduziertem L-Glutathion. Etwa 800 µg GST-EFhd2 Fusionsprotein konnte aus 100 ml Kultur gewonnen werden. Je nach Versuch wurde das Fusionsprotein für 1,5 h, 2 h und über Nacht (ü/N) gegen das 1500fache Volumen Proteindialysepuffer dialysiert. Das GST-EFhd2 Fusionsprotein wurde sowohl zur Immunisierung von Mäusen, zum Beschichten von ELISA-Platten als auch für die 45Ca2+ Autoradiographiemethode eingesetzt (Maruyama et al., 1984). 8.1.2. Herstellung von Zelllysaten Zellen wurden zweimal mit kaltem PBS gewaschen und für 5 min mit 4000 rpm auf 4°C in einer Biofuge (Eppendorf) abzentrifugiert. Das Pellet wurde in 50 µl RIPA Puffer pro 1 x 106 Zellen resuspendiert und für mindestens 30 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurde für 15 96 Methoden min mit 14000 rpm auf 4°C zentrifugiert und der Überstand, der die Proteinfraktion enthält, entnommen und bis zur weiteren Verwendung auf -70°C gelagert. 8.1.3. Quantitative Proteinbestimmung 8.1.3.1. BCA Assay Die Proteinbestimmung wurde für Zelllysate mittels dem BCA™ Protein Assay Kit durchgeführt. Hierzu wurden eine Standardreihe mit BSA und Duplikate der zu messenden Probe in Mikrotiterplatten (Microlon) mit 200 µl Detektionslösung (50:1, Reagenz A:Reagenz B) für 30 min auf 37°C inkubiert und die Absorption bei einer Wellenlänge von 562 nm am SpectraMax 190 (Molecular Devices, Ismaning) gemessen. Durch die Software SOFTmax Pro wurde anhand der Standardkurve die Proteinkonzentration der Probe ermittelt. 8.1.3.2. Bradford Test Die Proteinkonzentration des GST-EFhd2 Fusionsproteins wurde aufgrund von Pufferbestandteilen mittels Bradford Test bestimmt (Bradford, 1976). Dazu wurde BradfordReagenz (Bio-Rad, München) 1:5 in dH20 in einer Photoküvette verdünnt, 1 - 10 µl Probe zugegeben und nach 5 min Inkubation auf RT die Absorption des Extinktionskoeffizienten bei 280 nm am Photometer (Biophotometer, Eppendorf) vermessen. Als Standard wurde BSA und zur Einstellung des Nullwerts der Elutionspuffer ohne Protein verwendet. Die Proteinkonzentration der Probe wurde anhand einer Standardkurve ermittelt. 8.1.4. Gelelektrophorese Die Proben wurden mit SDS-Ladepuffer für 5 min auf 95°C denaturiert und bis zur Beladung des Gels auf Eis abgekühlt. Durch diskontinuierliche Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDSPAGE) erfolgte die Proteinauftrennung über ein 4% Sammel- und ein 10% Trenngel in einer Elektrophorese-Trennkammer (Hoefer, San Francisco, USA) bei 60 mA nach Laemmli (Laemmli, 1970). Die Zusammensetzung der Gele ist in Tabelle 8.1. aufgeführt. Als Standard der molekularen Masse wurde für alle Experimente der SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range (Bio-Rad) verwendet. Tab. 8.1.: Einzelkomponenten und Zusammensetzung der verwendeten Polyacrylamidgele. Komponente 10% Trenngel 4 % Sammelgel Acrylamid/Bisacrylamid (30%) 10,4 ml 1,68 ml Tris/HCl 6,8 1,49 ml Tris/HCl 8,8 11,7 ml SDS 310 µl 120 µl 7,7 ml 8,4 ml dH2O Ammoniumpersulfat (15 mg/ml) 650 µl 600 µl TEMED 15,6 µl 12 µl 97 Methoden 8.1.5. Western Blot 8.1.5.1. Durchführung Nach der Auftrennung über die Gelelektrophorese erfolgte der Western Blot Transfer mittels Semidry-Blot-System (Peqlab) bei 200 mA für 75 min oder bei 400 mA für 45 min auf eine Nitrozellulosemembran (Whatman®). Die Membran wurde kurz mit dH2O gewaschen, mit Ponceau S Färbelösung gefärbt, der Standard markiert und der Blot dokumentiert. Nach nochmaligem Waschen wurde die Membran in 5% Magermilchpulver/TBST für 1 h abgeblockt und für 1 h mit dem gewünschten Erstantikörper auf einer Wippe (Duomax 1030, Heidolph, Schwabach) bei RT inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit 1x TBST für 10 min wurde der entsprechende Zweitantikörper für 1 h dazugegeben und anschließend wieder dreimal gewaschen. Die Membran wurde kurz mit dH2O gewaschen und mit 20 ml ECL Lösung (Enhanced Chemoluminescence) für 1 min inkubiert. Autoradiographiefilme (CLXposure™ Film, Thermo Scientific) wurden für die gewünschte Belichtung aufgelegt und in der Entwicklermaschine Curix 60 (Agfa Healthcare, Bonn) entwickelt. 8.1.5.2. Verifizierung der EFhd2 defizienten Mäuse Alle Versuchstiere wurden zusätzlich zur Genotypisierung mittels PCR, wenn dies die Menge an Primarmaterial zuließ, im Nachhinein auch durch Western Blot Analyse auf ihren Genotyp überprüft. 8.1.6. Isolation und Aufreinigung genomischer DNA 8.1.6.1. Für Southern Blot Analysen Die DNA wurde aus genügend embryonalen Stammzellen, ¼ Mausleber oder einem ausreichend langen Stück einer Mausschwanzbiopsie (> 5 mm) gewonnen. Das Sample wurde in 800 µl Proteinase K Puffer + 8 µl Proteinase K (20 mg/ml) ü/N auf 55°C ohne Schütteln verdaut. Nach Zugabe von 20 µl RNase A (10 mg/ml, Quiagen) wurde die Lösung für 1 - 2 h auf 37°C inkubiert und dann die unlöslichen Bestandteile kurz bei 13000 rpm auf RT abzentrifugiert. 750 µl DNA-Lösung wurden mit 750 µl Phenol in ein 2 ml Reaktionsgefäß überführt, 100x invertiert und für 5 min mit 13000 rpm auf RT abzentrifugiert. Dieser Schritt wurde mit der obere Phase und zuerst 750 µl Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1) sowie anschließend dreimal 750 µl Chloroform in Phase Lock Gel Heavy 2ml Reaktionsgefäßen (5Prime, Hamburg) wiederholt. Die wässrige Lösung, die die DNA enthielt, wurde in einem neuen Reaktionsgefäß mit dem gleichen Volumen 100% Isopropanol durch Inversion vorsichtig gefällt, die ausgefallene DNA mit einer geschmolzenen Pasteurpipette gefischt, zur Reinigung in 70% EtOH geschwenkt, kurz getrocknet und in 100 µl TE Puffer resuspendiert. 98 Methoden 8.1.6.2. Für Mausgenotypisierungen In 150 µl PBND Puffer + 0,75 µl Proteinasse K wurde ein 2 - 4 mm langes Stück einer Mausschwanzbiopsie für 6 h – ü/N bei 56°C mit 450 rpm im Thermomixer (Eppendorf) inkubiert, bis es vollständig verdaut war. Anschließend wurde die Proteinase K für 10 min auf 95°C hitzeinaktiviert. Die Lösung wurde mit 13000 rpm für 10 min auf RT abzentrifugiert und auf 4°C gelagert. 8.1.7. Polymerase-Kettenreaktion 8.1.7.1. Konditionaler Targeting Vektor Als Vorlage für alle PCR-Reaktionen wurde DNA eines efhd2 enthaltenden Bacmids mit c57Bl/6J Hintergrund (Source BioScience LifeSciences, ehemals ImaGenes, Berlin) eingesetzt. Der verkürzte 5’ homologe Arm wurde zur Amplifikation in 2 Stücke aufgeteilt, die sich an einer endogenen Restriktionsschnittstelle (XbaI) überlappen. Die amplifizierten PCRProdukte wurden alle in den Zwischenvektor pCR®2.1-TOPO® einkloniert und durch Sequenzierung verifiziert. Die Oligonukleotide wurden für 55°C Annealing-Temperatur entworfen und sind in Tabelle 7.2. (s. Material) aufgeführt. Bei komplizierteren Amplifikationen wurde die AnnealingTemperatur der Oligonukleotide durch eine Gradienten-PCR (Mastercycler Gradient, Eppendorf) optimiert. Es wurden folgende Polymerasen eingesetzt: Deep Vent (NEB), Phusion (Thermo Scientific), Taq (Genaxxon, Ulm). Bei allen Reaktionen wurden 3% DMSO zugesetzt. Das Ansatzvolumen betrug 50 µl. Die DNA wurde bei 95°C für 30 s denaturiert und es wurden zwischen 30-35 Zyklen durchgeführt. 8.1.7.2. Mausgenotypisierung Zur Genotypisierung einer Maus wurden 3 µl PBND-isolierte Mausschwanz-DNA je Oligonukleotidset verwendet. Das eine Set detektierte das WT Allel (3 SBp vorn fwd + rev), das andere war spezifisch für das lacZ Gen (βgal1 fwd + rev). Somit konnten die Mäuse als homozygot für WT oder KO und als heterozygote Träger identifiziert werden. Die PCRReaktionen wurden mittels Primus 96 (Peqlab), GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems, Life Technologies) und Mastercycler Pro (Eppendorf) durchgeführt. Die Bedingungen sind in Tabelle 8.2. zusammengefasst. Tab. 8.2.: Übersicht über die PCR zur Mausgenotypisierung. Die Oligonukleotidpaare βgal1 und 3 SBp vorn sind in Tabelle 7.2. (G) aufgelistet. Komponente Volumen Temperatur Dauer DNA 3 µl 95°C 2 min Primer fwd (5 µM) 1 µl 95°C 30 s Primer rev (5 µM) 1 µl 58°C 30 s dNTP-Mix (10 mM) 0,5 µl 72°C 30 s Taq-Puffer (10x, Genaxxon) 2 72°C 10 min Taq-Polymerase (5 U/µl, Genaxxon) 0,2 µl 4°C ∞ 11,7 µl Lichrosolv® H2O 99 Zyklen \ > 32x / Methoden 8.1.8. Herstellung des konditionalen Targeting-Vektor Die durch PCR hergestellten, verifizierten DNA-Amplifikate wurden aus den Zwischenvektoren durch eingebrachte, singuläre Restriktionsenzymschnittstellen ausgeschnitten und in den Vektor „pRapidFlirt“ kloniert. Die Klonierungsstrategie ist in Abbildung 8.1. dargestellt. XhoI FseI SalI SbfI 5’ amp tk XbaI floxed allel FseI SalI #4162 #4164 #4163 pRapidFlirt neo left arm XhoI 1 kB BamHI NotI ClaI SbfI #4161 #4165 Amplifizierte Homologiesequenzen right arm BclI NotI #2021 #2022 #2020 PCR-Oligonukleotide ClaI 5’ ClaI amp tk left arm floxed allel neo right arm linearisierter pRapidFlirt-Δefhd2 Abb. 8.1.: Klonierungsstrategie des Targeting-Vektors „pRapidFlirt Δefhd2“. Dargestellt ist der Ausgangsvektor „pRapidFlirt“ mit dem Ampicillinresistenzgen (amp), dem Thymidinkinasegen (tk) und dem Neomycinresistenzgen (neo), in den die durch PCR amplifizierten Homologiesequenzen zu efhd2 (weiße Balken: left arm, floxed allel, right arm) über singuläre Restriktionsenzymschnittstellen (Enzymname angegeben) kloniert wurden. Die verwendeten PCROligonukleotide mit ihrer Orientierung (Pfeile) sind mit der # ER-Nummer angegeben. Darunter ist der fertig klonierte, linearisierte Targeting-Vektor „pRapidFlirtΔefhd2“ dargestellt. Die Abbildung ist bis auf Aussparungen (//) und die Länge der Oligonukleotide maßstabsgetreu. Der fertige Vektor „pRapidFlirtΔefhd2“ wurde durch Sequenzierreaktionen (Oligonukleotide in Tabelle 7.2. (Seq)) sowie durch Kontrollverdau mit verschiedenen Restriktionsenzymen nochmals auf Vollständigkeit überprüft (Daten nicht gezeigt). Anschließend wurde der Vektor für die Elektroporation Endotoxin-frei (EndoFree® Plasmid Maxi Kit) aufgereinigt, mittels ClaI Restriktionsenzymverdau linearisiert und durch ein Agarosegel kontrolliert, dass kein unverdauter Targeting-Vektor mehr vorhanden war (Daten nicht gezeigt). Die Aufreinigung der linearisierten DNA erfolgte gemäß der Aufreinigung der DNA für Southern Blot Analysen (8.1.6.1.) und anschließender LiCl/EtOH Fällung, allerdings wurde die DNA nach Trocknung in sterilem Wasser resuspendiert, vermessen und auf die Konzentration von 1 µg/µl eingestellt. 8.1.9. Southern Blot 8.1.9.1. Durchführung 50 µl der zu analysierenden DNA wurden nochmals mit 5 µl 5 M LiCl und 110 µl 100% EtOH für 2 h gefällt, der Überstand verworfen, die DNA dreimal mit 70% EtOH gewaschen und für 10-20 min getrocknet. Jeder Ansatz wurde mit 40 µl des entsprechenden Verdaumastermixes (Tab. 8.3.) ü/N bei 37°C inkubiert. 100 Methoden Tab. 8.3.: Übersicht über einen Ansatz des Verdaumastermix . Es wurden die Restriktionsenzyme HindII, AflII und SphI verwendet. Komponente Volumen Restriktionsenzym 2 µl (40 U) Zugehöriger NEB Puffer (10x) 4 µl BSA (10x) 4 µl Spermidin 2 µl (5 µM) RNase A 0,25 µl 27,75 µl H2O Anschließend wurde die verdaute DNA über ein 0,8% Agarosegel aufgetrennt und der Verdau dokumentiert. Das Gel wurde in 0,25 M HCl für 30 min unter leichtem Schütteln zur DNA-Fragmentierung inkubiert, zweimal kurz in dH2O gewaschen, in 1,5 M NaCl/0,5 M NaOH für 30 min unter leichtem Schütteln denaturiert, wieder zweimal gewaschen und für 10 min in 0,4 M NaOH leicht geschüttelt. Auf einen 10 cm hohen Stapel Zellstofftücher wurden zwei dicke, trockene und ein NaOH-getränktes Whatmanpapier gelegt. Darauf kam eine NaOH-getränkte PVDF-Membran (Gene Screen Plus, PerkinElmer, Rodgau), darauf das Gel und wieder 2 dicke, NaOH-getränkte Whatmanpapiere. Ein langes, dünnes Whatmanpapier bildete eine Saugbrücke in ein erhöhtes, mit 0,4 M NaOH gefülltes Reservoir. Ungewollte Saugbrücken wurden durch Parafilmabdeckung verhindert und der Blotaufbau mit einer Glasscheibe abgedeckt und mit etwa 1 kg Gewicht beschwert. Geblottet wurde ü/N bei RT. Anschließend wurden die Taschen auf der Membran mit Bleistift markiert, die DNA im Stratalinker® UV-Crosslinker (Stratagene, Waldbronn) mit dem Programm Auto-Crosslink auf die Membran vernetzt und bei -20°C gelagert oder direkt verwendet. Die Membran wurde in Church II Puffer für 1 h bei 65°C im Hybridisierungsofen prähybridisiert. 25 ng DNA der entsprechenden Hybridisierungssonde wurden mit dem Rad Prime DNA Labeling System Kit nach Herstellerprotokoll mittels 50 µCi [α-³²P] dCTP (Hartmann Analytic, Braunschweig) radioaktiv markiert, zum Church II Puffer auf die Membran gegeben und bei 65°C ü/N inkubiert. Danach wurde die Membran mit 2x SSC/0,1% SDS kurz, mit 2x SSC/0,1% SDS für 20 min auf 65°C und zuletzt mit 0,2x SSC/0,1% SDS für 20 min auf 65°C gewaschen. Auf die gewaschene Membran wurde eine Phosphoimager-Platte ü/N aufgelegt, am FLA-3000 (Fujifilm, Düsseldorf) ausgelesen und mittels BASReader 3.14 Software ausgewertet. 8.1.9.2. Southern Blot Sonden für das Screening des konditionalen KO Für das Southern Blot Screening aller ESZ Klone wurde der 96 Well-Maßstab gewählt, um mit einer Analyse alle fünf Platten auf homolog rekombinierte ESZ Klone untersuchen zu können. Je eine DNA Platte der vereinzelten ESZ Klone wurde für das Southern Blot Screening mit der 5’ Sonde eingesetzt, um Klone mit einem erfolgreichen homologen Targeting von der 5’ Seite aus nachzuweisen. Da die Länge der homologen Arme über 2,5 kb betrug und bereits Schwierigkeiten bei der PCR Amplifizierung der Arme durch verminderte Zugänglichkeit des efhd2 Lokus auftraten, wurde ein Screening der ESZ Klone per PCR von vornherein nicht in Betracht gezogen. Daher wurden beiderseits des Integrationsorts des Targeting-Vektors Southern Blot Hybridisierungssonden entworfen, die außerhalb der homologen Arme in der genomischen DNA lokalisiert sind und die durch geeigneten Restriktionsenzymverdau gut unterscheidbare Fragmente in der Southern Blot Analyse ergeben. Auf der 5’ Seite wurden 101 Methoden zwei geeignete Restriktionsenzyme, HindIII und AflII, und zwei entsprechende Hybridisierungssonden, auf der 3’ Seite nur SphI und eine Hybridisierungssonde gefunden (gezeigt in Abb. 5.8.). Die Hybridisierungssonden wurden mit der Software Vector NTI® (Invitrogen) entworfen und durch das Programm RepeatMasker (A.F.A. Smit, R. Hubley & P. Green RepeatMasker at http://repeatmasker.org) auf repetitive Sequenzen, Mikrosatelliten und LINE/SINE Elemente überprüft und mittels NCBI BLAST® (Altschul et al., 1990) auf mögliche Kreuzreaktionen in der genomischen DNA überprüft, um Spezifität zu gewährleisten und zufällige, falschpositive Signale in der Southern Blot Analyse auszuschließen. Anschließend wurden für die Sonden entsprechende Oligonukleotide entworfen (Tab. 7.2. Material (SB)), die Hybridisierungssonden durch PCR amplifiziert, getestet und für das Southern Blot Screening nach Protokoll eingesetzt. 8.1.10. Autoradiographie Der Nachweis der Kalziumbindungsfähigkeit von EFhd2 erfolgte nach der Autoradiographiemethode (Maruyama et al., 1984). Dazu wurden verschiedene Konzentrationen des GST-EFhd2 Fusionsproteins und GST als Kontrolle über SDS-PAGE aufgetrennt und per Western Blot auf eine Membran transferiert. Diese wurde auf RT nach dreimaligem Waschen mit Überschichtungspuffer für 20 min mit 1 mCi/l 45Ca2+ in Überschichtungspuffer für 10 min inkubiert. Nach einmaligem Waschen für 5 min auf RT mit 50% EtOH wurde die Membran für 3 h getrocknet und eine Phosphoimager-Platte ü/N aufgelegt. Die Platte wurde am FLA-3000 ausgelesen und mit BASReader 3.14 ausgewertet. Die Radioaktivität wurde von der Membran mit 50% EtOH/0,1 M EDTA gewaschen und eine Ponceau S Färbung sowie eine EFhd2 Detektion durchgeführt. 8.1.11. Herstellung und Transformation kompetenter Bakterien 8.1.11.1. Elektrokompetente Bakterien 500 ml LB Medium wurden aus einer E. coli GeneHog-Vorkultur (Invitrogen) angeimpft, im Bakterienschüttler auf 37°C bis zu oD600 = 0,6 kultiviert und für 30 min auf Eis inkubiert. Die Kultur wurde wiederholt für 15 min mit 3000 rpm auf 4°C (Avanti) abzentrifugiert und mit 500 ml, 250 ml und 20 ml steriler 10% Glycerinlösung gewaschen. Anschließend wurde das Pellet in 2 ml 10% Glycerinlösung resuspendiert und zu 50 µl Aliquots auf -70° eingefroren. Die GeneHog-Bakterien wurden zur Elektroporation vor allem von Klonierungen genutzt. Zur Transformation wurde ein Aliquot mit 1 µl klonierter Vektor-DNA-Lösung gemischt, in eine gekühlte Elektroporationsküvette (Spaltbreite 1 mm) überführt und mittels GenePulser (BioRad) mit 25 µF, 1,6 kV und 200 Ω elektroporiert. Die transformierten Bakterien wurden in 750 µl LB-Medium aufgenommen, für 30 min auf 37°C gestellt, auf LB-Agar-Platten mit dem entsprechenden Antibiotikum ausplattiert und ü/N im 37°C Brutschrank inkubiert. 102 Methoden 8.1.11.2. Chemischkompetente Bakterien und Hitzeschock-Transformation Zur Transformation durch Hitzeschock wurden E. coli Bakterien des Stammes DH5α (Invitrogen) (Hanahan, 1983) genutzt. Dazu wurden 300 ml Bakterienkultur bei einer oD600 = 0,6 für 30 min auf Eis inkubiert, anschließend zweimal für 10 min auf 4°C erst bei 5000 rpm, dann bei 3000 rpm zentrifugiert (Avanti) und je in 150 ml kaltem 100 mM MgCl2 resuspendiert. Danach wurden die Zellen 20 min auf Eis inkubiert, nach 10 min Zentrifugation mit 3000 rpm auf 4°C wurde das Pellet in 1,5 ml 100 mM CaCl2/15% Glycerin resuspendiert und zu je 50 µl Aliquots auf -70°C eingefroren. Zur Hitzeschocktransformation wurden 10 µl Ligation zu 50 µl chemischkompetenten Bakterien gegeben, für 10 - 30 min auf Eis, anschließend für 1 - 2 min auf 42°C und dann wieder für 5 min auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden in 1 ml LB-Medium aufgenommen, für 30 min auf 37°C inkubiert und ausplattiert. 8.1.12. Präparation von Vektor-DNA Vektor-DNA wurde mit Hilfe der kommerziellen Kits für Mini-, Midi- und Maxiprep isoliert. 8.1.13. DNA Konzentrationsbestimmung Durch Messung der Absorption bei 260 nm und 280 nm mittels NanoDrop (Peqlab) wurde die Konzentration von DNA-Lösungen ermittelt. 8.2. Isolation und Aufreinigung muriner Zellen 8.2.1. Gewinnung von Primärzellen Alle Versuchstiere wurden direkt vor Organentnahme mittels zweiminütigem CO2 Bad getötet. Zur Isolation von Zellen aus der Peritonealhöhle wurde das Fell, ohne den Eingeweidesack zu verletzten, vorsichtig entfernt, 5 ml MACS Puffer mit einer G23-Kanüle (BD) in die Peritonealhöhle injiziert, der Bauchraum kurz massiert und der Puffer wieder aufgezogen. Dieser Vorgang wurde mit dem gleichen Puffer dreimal wiederholt. Zur Isolation der Knochenmarkszellen wurden die Femora und Tibiae entnommen, beiderseits geöffnet und das Knochenmark durch eine 23G-Kanüle mit kaltem MACS Puffer gründlich herausgespült. Die Milz oder der Thymus wurden komplett entnommen, wenn nötig, von Binde- und Fettgewebe befreit und mittels 70 µm Zellsieb zu einer Einzelzellsuspension homogenisiert. 103 Methoden 8.2.2. Erythrozytenlyse und Zellzahlbestimmung Zur Beseitigung der Erythrozyten wurden Primärzellsuspensionen für 5 min auf 4°C mit 1500 rpm (Heraeus Megafuge) abzentrifugiert, in 5 ml Erythrozytenlysepuffer resuspendiert, für exakt 5 min auf RT inkubiert, mit 6 ml MACS Puffer abgestoppt, erneut zentrifugiert und in MACS Puffer resuspendiert. Die Zellzahl wurde mittels Neubauer-Zählkammer bestimmt und die Probe bis zur Weiterverarbeitung auf Eis gelagert. 8.2.3. Sortierung von Milz B Zellen mittels MACS Technologie Die Zellen wurden für 5 min bei 1500 rpm auf 4°C abzentrifugiert und in 1 µl Microbeads (Miltenyi Biotec) und 9 µl MACS Puffer je 106 Zellen resuspendiert. Nach 20 min Inkubation auf Eis wurde mit MACS Puffer gewaschen, zentrifugiert, das Pellet in 1 ml MACS Puffer resuspendiert und durch einen 30 µm Pre-Separation Filter (Miltenyi Biotec) gereinigt und mittels VarioMACS® (Miltenyi Biotec) durch sensitive Depletion für CD43-Mikrobeads oder Positivselektion für CD19-Mikrobeads in 1 ml MACS Puffer sortiert. 8.3. Zellkulturverfahren 8.3.1. Kultivierung Suspensionszelllinien wurden gegebenenfalls auf ein Fünftel reduziert und wieder mit frischem Medium aufgefüllt. Bei adhärenten Zelllinien wurde das Medium abgesaugt, die Zellen nach Bedarf mit PBS gewaschen und neues Medium zugegeben oder die Zellen mittels 5 min Inkubation auf 37°C mit Trypsin-EDTA abgelöst, die Reaktion mit Medium gestoppt, die Zellen für 5 min mit 1500 rpm auf 4°C abzentrifugiert und nur ein Teil der Zellen wieder ausgesät. Vor einem Experiment wurden die Zellen mit PBS gewaschen und ständig auf 4°C gehalten. 8.3.2. Lagerung von Zelllinien mittels Kryokonservierung Zur Lagerung wurden etwa 5 x 106 Zellen für 5 min mit 1500 rpm auf 4°C abzentrifugiert, in 1 ml Einfriermedium resuspendiert, in Kryoröhrchen überführt und mittels IsopropanolEinfrierhilfe bei -70°C eingefroren. Nach 1 - 2 Wochen wurden die Zellen zur längerfristigen Lagerung in flüssigen Stickstoff überführt. 104 Methoden 8.3.3. Auftauen von kryokonservierten Zellen Die Zellen wurden rasch aufgetaut, in 10 ml entsprechendes Zellkulturmedium überführt und für 5 min bei 1500 rpm auf 4°C abzentrifugiert. Das Pellet wurde vorsichtig in Zellkulturmedium resuspendiert, im geeigneten Volumen ausgesät und unter den entsprechenden Bedingungen kultiviert. 8.3.4. Hybridomzellfusion Die Milz der immunisierten Maus wurde steril entnommen, durch ein 70 µm Zellsieb zu einer Einzelzellsuspension homogenisiert und nach Erythrozytenlyse die Zellzahl bestimmt. Zusätzlich wurde eine Einzelzellsuspension von SP2/0 Myelomzellen im Verhältnis 1:4 zu den Milzzellen hergestellt. Beide Zellsuspensionen wurden zweimal mit 30 ml 37°C warmen R0+ gewaschen, für 8 min mit 1200 rpm auf RT abzentrifugiert und anschließend gemischt. Nach nochmaligem Waschen wurden langsam 2 ml Polyethylenglykol 1500 (Roche) zugegeben und für 1 h bei 37°C inkubiert. Nach erneutem Waschen mit R0+ wurden die Zellen in R10+ Medium mit HAT (Sigma) und 3% IL-6 resuspendiert, in Grenzverdünnungsreihen ausgesät und für 2 Wochen in einem Zellinkubator auf 37°C, 5% CO2 und 100% Luftfeuchtigkeit (BBD6220 CO2 Incubator, Hereaus) inkubiert. 8.3.5. Stimulation von Primärzellen und Zelllinien Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und in ausreichend Medium aufgenommen, mit der vorgesehenen Menge eines oder mehrerer Stimulanzien (Tab. 8.4.) versetzt und für die gewünschte Zeit im entsprechenden Zellinkubator kultiviert. Anschließend wurden die Zellen entweder direkt am Durchflusszytometer analysiert oder nach einem Waschschritt für ein Experiment verwendet. Tab. 8.4.: Liste der verwendeten Stimulanzien. Aufgeführt ist die Ausgangskonzentration (AK), die eingesetzte Konzentration (EK) und die Herkunft. Stimulanz AK EK Firma/Herkunft LPS 10 mg/ml 10 µg/ml Sigma-Aldrich αCD40 1,77 mg/ml 10 µg/ml Hybridomüberstand FGK IL-4 100000 U/ml 100 U/ml Miltenyi 1,3 mg/ml 0,8 - 20 µg/ml Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. F(ab)2 105 Methoden 8.3.6. Embryonale Stammzellen 8.3.6.1. Herstellung embryonaler Fibroblasten Zur Herstellung embryonaler Fibroblasten (Feeder-Zellen) wurde eine schwangere Rag1 defiziente Maus an Tag 14,5 getötet und die Embryos in PBS aus dem Uterus präpariert. Der Rag1 KO enthält ein Neomycinresistenzgen, das notwendig ist, damit auch die FeederZellen die Selektion der ESZ Klone überleben. Kopf und fötale Leber wurden entfernt und das PBS gewechselt. Dann wurden die Embryos in 50 ml Trypsin-EDTA zerkleinert. 12,5 ml der Suspension wurden in 50 ml Röhrchen mit etwa 15 ml sterilen Glaskügelchen gefüllt und auf 37°C für 30 min zur Homogenisation auf einem Rollmischer (Roller Mixer SRT9, Stuart) inkubiert. Der Trypsinverdau wurde mit je 25 ml Feeder-Medium gestoppt, mit einer 25 ml Pipette vom Boden her aufgenommen, um die Filtereigenschaft der Glaskügelchen zu nutzen, und nochmals mit 25 ml Feeder-Medium gespült. Die Zellsuspension wurde durch einen 70 µm Filter gegeben und für 10 min mit 1200 rpm auf Raumtemperatur abzentrifugiert. Die Pellets wurden in je 5 ml Feeder-Medium aufgenommen, vereinigt, gezählt und 1 x 106 Zellen in 25 ml Feeder-Medium in einer großen Schale (15 cm) ausgesät. Die embryonalen Feeder-Zellen wurden bei 37°C, 7,5% CO2 inkubiert, bis sie konfluent gewachsen waren. Zum Einfrieren wurden die Schalen mit PBS gewaschen und mit 3 ml Trypsin-EDTA für 5 min auf 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde mit 7 ml Feeder-Medium gestoppt und die verbleibenden Zellen durch mehrmaliges Spülen gelöst. Alle Zellsuspensionen wurden vereint und für 10 min mit 1400 rpm auf 4°C abzentrifugiert. Das Pellet wurde in 1 ml Einfriermedium pro Schale resuspendiert und zu je 1 ml in einem Kryoröhrchen eingefroren. Zum Auftauen wurde ein Röhrchen Feeder-Zellen in 10 ml Feeder-Medium aufgetaut, für 5 min mit 1500 rpm auf 4°C abzentrifugiert, in 40 ml Feeder-Medium resuspendiert und zu je 10 ml auf vier 10 cm Schalen ausgesät. Die Feeder-Zellen wurden bei 37°C, 7,5% CO2 bis zur Konfluenz kultiviert und vor ESZ Zugabe mit 30 Gy bestrahlt, um die Feeder-Zellen mitotisch zu inaktivieren. 8.3.6.2. Kultivierung embryonaler Feeder- und Stammzellen Zur Kultivierung von ESZ wurde ESZ-Medium verwendet. Das Medium für die Expansion von Feeder-Zellen entsprach weitestgehend dem ESZ-Medium, allerdings wurden nur 50 ml ESZ-FCS (zur ESZ Kultivierung getestet) zugefügt und kein LIF. Bei ESZ wurde der Mediumwechsel spätestens alle 24 h durchgeführt, bei Feeder-Zellen nach Bedarf. Medien und Zusätze wurden mit Ausnahme von LIF (Millipore) von PAN Biotech bezogen und nur zur ESZ Kultur genutzt. 106 Methoden 8.3.6.3. Elektroporation und Selektion von ESZ Vier 10 cm Schalen mit ESZ wurden kultiviert, bis sie annährend dicht besiedelt waren, am Tag der Elektroporation wurde morgens das Medium gewechselt, abends zweimal mit PBS gewaschen und die Zellen für 7 min im Brutschrank mit 1,3 ml Trypsin-EDTA pro Schale inkubiert. Die abgelösten Zellen wurden durch wiederholtes Pipettieren vereinzelt, die Trypsinreaktion mit je 3,7 ml ESZ-Medium gestoppt, die Schalen nochmals gründlich gespült, alle Zellen in ein 50 ml Röhrchen überführt und für 10 min mit 1400 rpm auf 15°C abzentrifugiert. Anschließend wurden die Zellen in Optimem-Medium (Invitrogen) ohne Phenolrot, aber mit HEPES resuspendiert, 1/40 als untransfizierte Kontrolle zur NeomycinSelektion ausgesät und die restlichen Zellen für 7 min abzentrifugiert. Das Pellet wurde in 1,54 ml Optimem resuspendiert, je 770 µl Zellsuspension wurde mit 30 µl linearisierter „pRapidFlirtΔefhd2“ Vektor-DNA (1 µg/µl) in eine sterile, 4 mm Elektroporationsküvette gegeben und für 5 min auf RT inkubiert. Die Elektroporation erfolgte mittels GenePulser Exel with Capacitance Extender (Bio-Rad) mit den Einstellungen „Exponential Protocol, 480 µF, 240 V“. Die Zellen wurden nach 5 min Inkubation auf RT in 105 ml ESZ-Medium resuspendiert und eine Schale mit 5 ml Zellsuspension zur Neomycin-Selektion sowie weitere zehn Schalen mit 10 ml Zellsuspension (etwa 2 x 106 Zellen) für die Doppelselektion ausgesät. 24 h nach Elektroporation wurde das Medium mit 300 µg/ml NeomycinSelektionsmedium (G418, PAA Laboratories, Pasching, Österreich) zur Positivselektion gewechselt und weitere 48 h später erfolgte die Negativselektion zusätzlich mit 2 µM Ganciclovir (Syntex Cymeven, Roche). Die Doppelselektion wurde für alle zehn Schalen für 7 Tage weitergeführt, für die anderen beiden Schalen nur die Neomycin-Selektion. Anhand der Kolonienzahl auf den Kontrollplatten konnten die Transformationseffizienz und die Negativselektion durch Ganciclovir überprüft werden. 8.3.6.4. Isolation von ESZ Klonen nach der Selektion Am Tag vor der Isolation der doppelt-selektionierten Klone wurden sieben konfluente 15 cm Schalen mit Feeder-Zellen geerntet, mit 30 Gy bestrahlt und in 15 96-Well Zellkulturplatten ausgesät. 3 – 6 h vor Beginn wurde in den Schalen der ESZ Klone das Medium gewechselt. Zur Isolation wurden die Schalen mit PBS gewaschen und mit 10 ml PBS befüllt. Auf Eis wurden 48 brauchbare ESZ Klone je Platte in 5 µl PBS gepickt und in eine gekühlte 96-Well Platte mit vorgelegten 50 µl Trypsin-EDTA transferiert. Nach 4 min Inkubation auf 37°C wurde die Reaktion mit 105 µl ESZ-Medium gestoppt, die Zellen durch Resuspension vereinzelt und auf je ein Well von drei der 15 96-Well Zellkulturplatten mit Feeder-Zellen aufgeteilt. Dies wurde für alle zehn ESZ Platten mit Neomycin- und Gancyclovirselektion durchgeführt. Daher wurden 480 ESZ Klone in Triplikaten gewonnen und unter täglichem Wechsel des selektionsfreien ESZ-Medium kultiviert. Bei geeigneter Dichte wurden zwei der drei identischen Platten eingefroren. Je die dritte Platte wurde wiederum auf drei FeederPatten aufgeteilt und zur DNA Isolation für die Southern Blot Analysen verwendet. Dafür wurden die konfluent gewachsenen Platten gewaschen und trocken bei -70°C eingefroren. Nach Bedarf wurde die DNA zur Southern Blot Analyse, wie beschrieben, direkt in den Wells lysiert, gefällt und anschließend geeignet verdaut. 107 Methoden 8.3.6.5. Einfrieren der ESZ Klone in 96-Well Zellkulturplatten Die zwei konfluenten, identischen ESZ Platten wurden zur Sicherheit an verschiedenen Tagen gewaschen, mit 40 µl Trypsin-EDTA je Well für 4 min auf 37°C inkubiert, auf Eis 160 µl ESZ Einfriermedium zugegeben, gut resuspendiert und mit 50 µl gekühltem Mineralöl überschichtet. Anschließend wurden sie mit Parafilm abgedichtet und in vorgekühlten Styroporboxen bei -70°C eingefroren. Nach erfolgreicher Southern Blot Analyse konnten hieraus die korrekt homolog rekombinierten ESZ Klone aufgetaut und kultiviert werden. 8.3.6.6. Auftauen und Expansion positiver Stammzellklone Nach dem Southern Blot Screening wurde eine Platte, die den positiven ESZ Klon enthielt, aufgetaut, der Klon in ESZ-Medium überführt und sukzessive über 48-Well, und 6-Well auf eine 10 cm Kulturschale expandiert und weiterkultiviert. Hiervon wurden mehrmals, mehrere Backups eingefroren und der Klon zur Injektion vorbereitet. 8.3.6.7. Injektionsvorbereitung Zur Injektion wurde eine mittlere Schale nach 4 Tagen Kultivierung mit PBS gewaschen, für 5 min auf 37°C mit 1 ml Trypsin-EDTA inkubiert, sorgfältig vereinzelt und die Reaktion mit 9 ml ESZ-Medium gestoppt. Nach 5 min Zentrifugation mit 1200 rpm auf 4°C wurden die Zellen in 19 ml ESZ-Medium resuspendiert, auf einer neuen Schale ausgesät und für 30 - 45 min im Brutschrank inkubiert. Das Medium wurde mit dem Zellschrot vorsichtig abgesaugt und die ESZ wurden dreimal mit 5 ml eiskaltem ESZ-Medium abgespült, so dass die Feeder-Zellen zurückblieben. Nach Zentrifugation für 6 min mit 1200 rpm auf 4°C wurde das Medium restlos verworfen, die Zellen in 100 µl M2-Medium aufgenommen und auf Eis zur Injektion gebracht. Die Infektionsversuche wurden teils im Biotechnologischen Entwicklungslabor Erlangen, teils in der Transgenic Core Facility am Max-Planck-Institut für Neurobiologie, Martinsried, von Prof. Dr. Michael Bösl durchgeführt. 108 Methoden 8.4. Tierexperimentelle Techniken 8.4.1. Immunisierung Mäuse wurden entweder intraperitoneal (i.p.) oder intravenös (i.v.) mit verschiedenen Reagenzien in PBS verdünnt immunisiert. 8.4.1.1. Antikörper Zur Antikörpergenerierung wurden drei 13 Wochen alte BALB/c Weibchen mit 50 µg dialysiertem GST-EFhd2 Fusionsprotein in PBS verdünnt, 1:1 mit komplettem FreundAdjuvans gemischt und i.p. immunisiert (Harlow, 1988). Die zweite Immunisierung wurde 25 Tage später, die dritte 45 Tage später mit jeweils 10 µg GST-EFhd2 Fusionsprotein in PBS verdünnt, 1:1 mit inkompletem Freund-Adjuvans gemischt i.p. vorgenommen. Die Maus mit der höchsten Immunantwort gegen das Fusionsprotein wurde 5 Tage vor der Fusion mit je 10 µg GST-EFhd2 Fusionsprotein in PBS ohne Adjuvans i.p. und i.v. immunisiert. 8.4.1.2. Immunantwort Die Immunisierungsexperimente an den Mäusen wurden mit 50 µg NP-Ficoll (Biosearch Technologies, Kalifornien), 50 µg NP(27)-KLH (Biosearch Technologies) oder mit etwa 109 Schaferythrozyten (SRBC, Fiebig Nährstofftechnik, Idstein-Niederauroff/Ts.) in PBS i.p. durchgeführt. Bei NP-Ficoll und Np(27)-KLH wurde das Adjuvans Imject® Alum (Thermo Scientific) 1:1 zugegeben und für mindestens 30 min bei RT auf einem Rotator inkubiert. Nur für NP(27)-KLH erfolgte eine zweite Immunisierung während des kurzen Monitorings i.v., während des verlängerten Monitorings i.p. je mit 10 µg NP(27)-KLH in PBS ohne Adjuvans. 8.4.2. Serumgewinnung Zur Serumgewinnung wurden die Mäuse in den Schwanz geritzt und das Blut mittels Microtainer SST™ Tubes (BD) aufgefangen und nach 30 min Inkubationszeit auf RT für 3 min mit 13000 rpm in einer Biofuge Pico (Heraeus) abzentrifugiert. Das Serum wurde entnommen und bei -20°C gelagert. 109 Methoden 8.5. Immunologische Methoden 8.5.1. ELISA Mikrotiter Platten (Microlon) wurden mit einer bestimmten Menge Protein oder Antikörper (Tab. 7.1. und 8.5.) in 50 µl Beschichtungspuffer je Well ü/N auf 4°C beschichtet. Für die Analyse von Autoantikörpern gegen ssDNA und dsDNA wurden die Platten vor dem Beschichten mit 50 µl Poly-L-Lysin in TE Puffer pro Well ü/N auf 4°C vorgekoppelt, dreimal mit TE Puffer gewaschen und mit ssDNA oder dsDNA aus Kalbsthymus in TE Puffer ü/N beschichtet. Nach dreimaligem Waschen der Platten mit ELISA-Waschpuffer wurden mit 275 µl Blockpuffer je Well für 1 h auf RT geblockt und der Blockpuffer verworfen. Anschließend wurden die Platten mit Standard, den zu analysierenden Seren oder Überständen und Kontrollen sowie deren Verdünnungsreihen in Blockpuffer für 1 h auf RT inkubiert. Meistens betrug das Volumen 50 µl je Well. Die Proben wurden verworfen, ohne sich zu vermischen, und dreimal gewaschen. Je Well wurden 50 µl geeigneter, HRP-gekoppelter Detektionsantikörper in Blockpuffer verdünnt zugegeben und für 1 h auf RT inkubiert. Wiederum wurde dreimal gewaschen und 50 µl HRP-Substrat je Well zugegeben. Nach ausreichend Farbumschlag wurde die Reaktion mit 50 µl 0,5 M H2SO4 gestoppt und bei 490 nm am SpectraMax 190 gemessen. Tab. 8.5.: Übersicht über Beschichtungsreagenzien. Reagenz Beschichtungskonzentration GST 1 µg/ml GST-EFhd2 2 µg/ml NP(4)-BSA 1 µg/ml NP(16)-BAS 1 µg/ml TNP-BSA 1 µg/ml Poly-L-Lysin 20 µg/ml dsDNA (Kalbsthymus) 20 µg/ml ssDNA (Kalbsthymus) 20 µg/ml 8.5.2. lacZ-Färbung Die Gehirne wurden nach Öffnen der Schädeldecke vorsichtig mit einer stumpfen Pinzette entnommen und in Puffer gewaschen. Alle folgenden Wasch- und Inkubationsschritte wurden auf einem Rotator durchgeführt. Die Gehirne wurden in lacZ-Fixierlösung für 1 h bei RT inkubiert, dann zweimal für 30 min in lacZ-Waschpuffer bei RT gewaschen und für 2 h auf 37°C in lacZ-Färbelösung inkubiert. Anschließend wurde dreimal für 15 min gewaschen und ü/N in 10% Formalin bei 4°C fixiert. Wieder wurde dreimal für 15 min in PBS auf 4°C gewaschen und die Gehirne für je 1 h in 50%, 70% und 80% EtOH bei 4°C inkubiert. Die lacZ-Färbung der präparierten Gehirne wurde an einem Stereomikroskop mit 10x Vergrößerung analysiert. Die Lagerung erfolgte in 80% EtOH auf 4°C. 110 Methoden 8.5.3. Immunhistochemie auf Gefrierschnitten Die zu analysierenden Milzen wurden entnommen, komplett oder teilweise in Tissue-Tek® Einbettmedium (Sakura, Staufen) vollständig eingebettet und auf -70°C mindestens ü/N eingefroren. An einem Kryotom (CM3050S, Leica) mit -18°C Kammer- und -15°C Objekttischtemperatur wurden 4-8 µm dicke Schnitte der Organe angefertigt, auf Objektträger aufgebracht, für 10 min auf -20°C in Aceton fixiert, luftgetrocknet und auf -20°C gelagert. Zur Färbung wurden die Schnitte 15 min auf RT aufgetaut, 5 min in PBS rehydriert, für 30 min in IHC-Blockpuffer abgeblockt und anschließend mit den gewünschten Antikörpern in IHC-Färbelösung für 30 min auf RT in einer dunklen, feuchten Kammer gefärbt. Danach wurde für 10 min zweimal mit 0,05% Tween 20 in PBS und einmal mit PBS gewaschen, anschließend wurden die Schnitte mit 50 µl Mowiol eingedeckelt. Zur Aushärtung wurden die Objektträger ü/N bei 4°C gelagert. Die Auswertung der Schnitte erfolgte an einem Axioplan 2 Mikroskop (Carl Zeiss) mit der Software Axiovision Rel 4.6 (Carl Zeiss). 8.5.4. Durchflusszytometrische Analysen 8.5.4.1. Analyse von membranständigen und intrazellulären Proteinen Zur Analyse von Oberflächenproteinen wurden je nach benötigter Zellzahlaufnahme zwischen 1 x 105 und 2 x 106 Zellen je Ansatz verwendet. Diese wurden für 5 min mit 1500 rpm auf 4°C zentrifugiert, wenn nötig, in FACS Puffer gewaschen, der Überstand abgesaugt, in 100 µl Antikörperlösung resuspendiert und für 20 min auf Eis im Dunkeln inkubiert. Für die Antikörperlösung wurden der oder die gewünschten Antikörper entsprechend ihrer Verdünnung in FACS Puffer ad 100 µl gegeben. Nach der Inkubation wurde mit 750 µl FACS Puffer aufgefüllt, wieder zentrifugiert und je nach Zellzahl die Zellen zur Messung in 150 – 500 µl FACS Puffer resuspendiert oder mit einem Zweitantikörper die Prozedur wiederholt. Um intrazelluläre Proteine zu analysieren, wurden entweder das Fix&Perm® Kit (An der Grub) zum Fixieren und Permeabilisieren der Zellen gemäß Protokoll genutzt oder die Zellen wurden nach dem Waschen in 200 µl 4% PFA für 10 min auf RT inkubiert. Dann mit FACSPuffer gewaschen, mit 200 µl 0,1% Tween 20 in PBS für 15 min auf 37°C inkubiert und wieder gewaschen. Anschließend wurden die Zellen wie ab Antikörperzugabe beschrieben, gefärbt und analysiert. Die Zellen wurden an einem FACSCalibur Durchflusszytometer (BD) mit der Software CellQuest™ v4.0.2 gemessen und mit der Software FlowJo 8.8.6 ausgewertet. 111 Methoden 8.5.4.2. Analyse des Kalziumlux in Primärzellen 5 x 106 - 1 x 107 Zellen der zu analysierenden Organe wurden nach Erythrozytenlyse in 700 µl R5+ Medium aufgenommen, mit 1 mM Indo-1, AM *cell permeant* (Indo-1, Molecular Probes, Life Technologies) in 0,015% Pluronic F127 (Molecular Probes) in DMSO für 25 min auf 30°C im Wasserbad inkubiert und nach Zugabe von 700 µl R10+ für 10 min auf 37°C inkubiert. Die Proben wurden zweimal mit 2 ml Krebs-Ringer (Serumwerk Bernburg, Bernburg) gewaschen und für 5 min mit 1500 rpm auf 4°C zentrifugiert. Nach Bedarf wurden die Zellen mit Antikörperlösung gefärbt (8.5.4.1.) oder direkt in 600 µl Krebs-Ringer aufgenommen, anschließend am LSRII Durchflusszytometer (BD) mit der Software FACSDiva analysiert, dabei wurde das Verhältnis zwischen Ca2+-freien und Ca2+gebundenem Indo-1 erfasst, und mittels FlowJo v 8.8.6 ausgewertet. Zur Messung wurden 60 µl Zellsuspension in 540 µl 37°C warmen Krebs-Ringer aufgenommen und nach etwas 15 s Vorlauf für 50 s unstimuliert analysiert. Dann wurde die gewünschter Menge F(ab)2 als Stimulanz zugegeben und unverzüglich für weitere 190 s gemessen. Als Kontrolle zur Indo-1 Beladung wurden die Zellen mit 8,3 µg/ml Ionomycin stimuliert. Mittels entsprechender Antikörperfärbungen konnten verschiedene B Zellpopulationen in den Analysen von einander diskriminiert werden. Für die Analysen der unreifen Milz B Zellen wurden die Zellen am VarioMACS® mittels CD43 Depletion vorsortiert. Für die Untersuchung des Kalziumfluxes von proliferierenden Zellen wurden die vorsortierten Milz B Zellen für 48 h mit 10 µg/ml LPS stimuliert und nach der Stimulation nach Protokoll vorbereitet und analysiert. Um unreife B Zellen des Knochenmarks analysieren zu können, wurden die Zellen mit Cy5IgM Fab gefärbt, wodurch zwar der BZR markiert, jedoch die Zelle nicht aktiviert wurde, da es sich um die Bindung eines singulären Antigen-bindenden Fragments handelte. Dadurch wurde ein Gating auf die B Zellen möglich, welche bereits den BZR auf der Oberfläche tragen. Um in dieser heterogene Population auch Prä sowie rezirkulierende B Zellen auszuschließen, wurde auf die Marker CD25 und IgD negativ selektioniert. Dadurch konnten nur die unreife B Zellen des Knochenmarks analysiert werden. 8.5.4.3. Sortierung von Zellpopulationen mittels MoFlo™ Es wurden Einzelzellsuspensionen hergestellt, die Erythrozyten lysiert, die Zellen gezählt, mit MACS-Puffer gewaschen, für 10 min mit 1600 rpm auf 4°C pelletiert und in 1 ml Antikörperlösung aufgenommen. Nach 20 min Inkubation im Dunkeln wurden die Zellen gewaschen, der Zellzahl entsprechend in MACS-Puffer aufgenommen, über einen PreSeparations Filter von Zellaggregaten und Klumpen gereinigt und am MoFlo™Durchflusszytometer (Dako Cytomation, Hamburg) anhand der Oberflächenmarker sortiert. Nach der Sortierung wurden die Zellen gewaschen und entsprechend für den Versuch weiterverarbeitet. 112 Methoden 8.6. Computerprogrammgestützte Arbeiten 8.6.1. Planung von Oligonukleotiden, Konstrukten und TargetingVektor Alle Oligonukleotide, Sonden und Vektoren wurden mit Hilfe Vector NTI® entworfen und Oligonukleotide mittels NCBI Blast (Altschul et al., 1990) und Primer3 (Rozen and Skaletsky, 2000) überprüft. Ebenso wurden die theoretische Planung des Targetings-Vektors sowie der Kreuzungsschritte zur Deletion der FRT- und LoxP-Stellen und alle Sequenzarbeit mit Vector NTI® durchgeführt. 8.6.2. Densitometrische Quantifizierung von Western Blots Mittels Scion Image for Windows und des Nachfolgers ImageJ (National Institutes of Health) wurden Western Blots densitometrisch quantifiziert, um eine genauere Aussage über die Signalstärke treffen und Banden besser vergleichen zu können. Dafür wurden die Banden mit der Software vermessen, der Hintergrund abgezogen und anhand einer Ladekontrolle normalisiert. Anschließend konnten die Werte in einem Diagramm dargestellt und verglichen werden. 8.6.3. Statistik Mit GraphPad Prism (GraphPad Software) wurden die Daten auf Normalverteilung analysiert. War eine Normalverteilung gegeben, wurde der Student’s T Test gewählt. Waren die Replikate eines Datensatzes zu gering oder nicht normal verteilt, wurde auf signifikante Unterschiede mittels Mann-Whitney Test geprüft. 113 Anhang 10. Anhang 10.1. Abkürzungen µHC Abb. ADCC AF647 AID amp APC APRIL AS ASZ AU B BAFF BCA Bcl-6 BD Bio Blimp-1 Bp / kb BSA Btk BZR bzw. CC CD CDK-1 CLP CMAH CRT CSR CXCR-4 Cy3 Cy5 d D DMSO DNA DRM dsDNA E. coli EBF-1 ECL EF1/2 EFhd1 EFhd2 ELISA ER EtOH FACS FCS FDC FITC Negativ µ schwere Kette Abbildung antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (antibody dependent cellular cytotoxicity Alexa Fluor 647 Activation induced cytidine deaminase Ampicillinresistenzgen Allophycocyanin a proliferation-inducing ligand Aminosäure(n) Antikörper-sezernierenden Zellen Arbitrary Units B Zelle B cell activating factor of the TNF family Bicinchoninic Acid B-cell lymphoma 6 Becton Dickinson Biosciences Biotinyliert B lymphocyte-induced maturation protein 1 Basenpaar(e) / Kilobasenpaare bovines Serumalbumin Brutons Tyrosinkinase B Zellrezeptor beziehungsweise Coiled Coil domain Cluster of differentiation Cyclin-abhängige Kinase 1 (cyclin dependent kinase 1) Common lymphoid progenitor CMP-Neu5Ac Hydroxylase Calreticulin Klassenwechsel (class switch recombination) C-X-C chemokine receptor type 4 Cyanine3 Cyanine5 Tag Diversity Dimethylsulfoxid Desoxyribonukleinsäure (deoxyribonucleic acid) Detergenz-resistente Membran (lipid raft) doppelsträngige DNA Escherichia coli early B cell factor 1 Enhanced Chemoluminescence EF Hand Domäne 1/2 EF-hand domain-containing protein D1, Swiprosin-2 EF-hand domain-containing protein D2, Swiprosin-1 Enzymgekoppelter Immunoadsorptionstest endoplasmatisches Retikulum Ethanol Fluoreszenz-assoziierte Zellsortierer (Fluorescence Activated Cell Sorting) Fötales Kälberserum (fetal calf serum) Follikuläre dendritische Zelle Fluoresceinisothiocyanat 114 Anhang Fo for FP FTDP-17 G GC GRB2 GST Gy h hi, +++ HRP HSC HSP90 HUS i.p. i.v. IF Ig IgH IgL IH IL-x int, ++ Iono IP3 IPTG IRF-4 IVC J kan kDa KLH KM KO LC LIF LINE lo, + LPS MFI MHCII min myc Mz NEB neo Neu5Ac Neu5GC NK Zellen NP NP-40 oD PARK7 Pax5 PBD PBMC PBS PCR PDI PE PerCP Follikuläre B Zellen Forward GST-EFhd2 Fusionsprotein Chromosom 17 gekoppelte frontotemporale Demenz und Parkinsonismus Primer für Genotypisierungs-PCR Germinal center (Keimzentrum) Growth factor receptor-bound protein 2 Gluthation-S-Transferase Gray Stunde High Meerettich-Peroxidase; (Horseradish peroxidase) Hämatopoetische Stammzelle (hematopoietic stem cell) Heat Shock Protein 90 Hybridomüberstand Intraperitoneal Intravenous Immunfluoreszenzfärbung Immunglobulin(kette) Schwere Immunglobulinkette (heavy) Leichte Immunglobulinkette (light) Immunhistologie Interleukin-x Intermediary Ionomycin Inositoltriphosphat Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid Interferon regulatory factor 4 Individuell belüftete Käfige (individual ventilated cages) Joining Kanamycinresistenzgen Kilodalton Keyhole limpet Hämocyanin Knochenmark Knockout Low complexity region Leukämie inhibierender Faktor (leukemia inhibitory factor) long interspersed nuclear element Low Bakterielles Lipopolysaccharid Mittlere Fluoreszenzaktivität major histocompatibility complex class II Minute WEHI231-mycEFhd2 Marginalzone, Marginalzonen B Zellen New England Biolabs Neomycinresistenzgen N-actylneuraminic acid N-glycolylneuraminic acid Natürliche Killerzellen 4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl Nonident P-40 optische Dichte Parkinson disease (autosomal recessive, early onset) 7 Paired box protein 5 Polo-Box Domäne Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (peripheral blood mononuclear cells) Phosphat gepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline) Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction) Protein-Disulfid-Isomese Phycoerythrin Peridinin-Chlorophyll 115 Anhang Peri PFA Plk-1 PNA Pr Prä (IS) Prä B Zelle Prä BZR Pro B Zelle puro RA RAG1/2 RANK-L rev RNA ROS rpm RT s SB SEM Seq sh SHM SHP-1 SINE SLE South Biot SRBC ssDNA Stim T T1-3 Tab. TACI TD TFH Zellen TI TI-I TI-II TLR-4 TNF TV TZR U ü/N UNLB UTR V WB WT Xbp1 X-Gal zyt. Peritoneum, Peritonealhöhle Paraformaldehyd Polo-ähnlicher Kinase 1 (polo-like kinase 1) Erdnuss Agglutinin (Peanut Agglutinin) Prolin-reiche Region vor (Immunisierung) Vorläufer B Zelle (precursor B cell) Prä B Zellrezeptor frühe Vorläufer B Zelle (progenitor B cell) Puromycinresistenzgen rheumatoide Arthritis Recombination activating gene ½ receptor activator of NF-κB ligand reverse Ribonukleinsäure (ribonucleic acid) reaktiven Sauerstoffspezies (reactive oxigen species) Runden pro Minute Raumtemperatur Sekunde Primer zur Amplifikation von Southern Blot Sonden standard error of the mean Sequenzierprimer WEHI231-shEFhd2, (shRNA) Somatische Hypermutation Src homology phosphatase-1 short interspersed nuclear element systemischen Lupus erythematosus Southern Biotech Schaferythrozyten (sheep red blood cells) einzelsträngige DNA (single strand) Stimulation T Zelle Transitionelle B Zellen 1-3 (transitional type B cell 1-3) Tabelle transmembran aktivator, calcium modulator, cyclophilin ligand interactor Thymus-abhängige Immunantwort CD4+ follikuläre T Helferzellen Thymus-unabhängige Immunantwort Thymus-unabhängige Immunantwort Typ I Thymus-unabhängige Immunantwort Typ II Toll-like Rezeptor 4 Tumornekrosefaktor Primer für Targeting-Vektoramplifikate T Zellrezeptor Unit über Nacht unkonjugiert untranslatierter Bereich (untranslated region) Variable Western Blot Wildtyp X-box binding protein 1 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl- β-D-galactopyranosid zytoplasmatisch 116 Anhang 10.2. 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The B cell receptor-induced calcium flux involves a calcium mediated positive feedback loop. Hagen S*, Brachs S*, Kroczek C, Fürnrohr BG, Lang C, Mielenz D. Cell Calcium. 2012 Feb 6. [Epub ahead of print] * Both authors contributed equally EFhd2/Swiprosin-1 connects the B cell receptor to organization of LAMP-1 positive vesicles. Brachs S, Lang C, Buslei R, Kalbacher H, Herrmann M, Mielenz D. In Vorbereitung EFhd2/Swiprosin-1 is a negative regulator of B cell activation. Brachs S, Lang C, Bösl M, Winkler T, Jäck HM, Mielenz D. In Vorbereitung 10.4. Nutzungserklärung des NIH KOMP Programms Die AD1 ESZ, die für diese Forschungsarbeit verwendet wurde, wurde durch das trans-NIH KnockOut Mouse Project (KOMP) generiert und über das KOMP Repository (www.komp.org) bezogen. NIH Förderungen für Velocigene der Firma Regeneron Inc (U01HG004085) und das CSD Konsortium (U01HG004080) finanzierten die Generierung von gene-targeted ES Zellen für 8500 Gene des KOMP Programms, durchgeführt und angeboten vom KOMP Repository an der UC Davis und Children’s Hospital of Oakland Research Institute (CHORI, U42RR024244). Für weitere Informationen oder den Kauf von KOMP Produkten siehe www.komp.org oder Email an [email protected]. The vector, ES cell(s), and/or mouse strain used for this research project was generated by the transNIH Knock-Out Mouse Project (KOMP) and obtained from the KOMP Repository (www.komp.org). NIH grants to Velocigene at Regeneron Inc (U01HG004085) and the CSD Consortium (U01HG004080) funded the generation of gene-targeted ES cells for 8500 genes in the KOMP Program and archived and distributed by the KOMP Repository at UC Davis and CHORI (U42RR024244). For more information or to obtain KOMP products go to www.komp.org or email [email protected]. 134 Anhang 10.5. Lebenslauf Sebastian Frank Brachs Geboren 29.07.1980 in Bamberg Familie Mutter Heide-Marie Brachs, Hausfrau Vater Meinrad Brachs, Dipl. Rechtspfleger Bruder Kilian Brachs, Bankangestellter Konfession Evangelisch 1984 Kindergarten St. Urban 1984-1987 Wechsel in den St. Elisabethen-Kindergarten 1987-1991 Grundschule Wildensorg-Bamberg 1991-2000 Kaiser-Heinrich-Gymnasium in Bamberg Juli 2000 Abitur (Schnitt: 1,9; LK: Biologie, Altgriechisch) 2000-2001 Zivildienst im Albrecht-Dürer-Altenheim des Diakonischen Werkes Bamberg WS 2001/ 2002- Biologiestudium an der FAU WS 2004/2005 Studentische Hilfskraft (Praktikum der Biologie für Mediziner) WS 2006/2007 Juni 2007 Abschluss: Diplom Biologe (Schnitt: 1,0) Beginn der Doktorarbeit in der Abteilung der Molekularen Immunologie an der Medizinischen Klinik 3, Friedrich-Alexander-Universität ErlangenNürnberg mit dem Thema: Untersuchungen zur Funktion des murinen Proteins EFhd2/ Swiprosin-1 in der B Zellentwicklung und Immunantwort in vivo. als Mitglied der B Zellforschergruppe FOR832 und assoziiertes Mitglied des Graduiertenkolleg 592 135 Anhang 10.6. Danksagung Herrn Prof. Dr. Hans-Martin Jäck danke ich für die Überlassung des Promotionsthemas, für seine stete Diskussionsbereitschaft, auch in der Funktion als Mitglied meiner Betreuungskommission und für die mir überlassenen Freiheiten bei der Durchführung meiner Versuche. Ebenso möchte ich mich für die Bereitstellung der hervorragenden Arbeitsbedingungen sowie für die Betreuung dieser Arbeit bedanken. Herrn Dr. Dirk Mielenz danke ich besonders für dieses herausfordernde Promotionsthema und gleichfalls die Betreuung dieser Arbeit. Auch möchte ich mich für die stete Motivation, Aufmunterung und das entgegengebrachte Vertrauen bedanken. Zudem danke ich für das außerordentliche Engagement sowie die steten Diskussionen und Anregungen in Bezug auf dieses Projekt. Herrn Prof. Dr. Falk Nimmerjahn gilt mein besonderer Dank für die Übernahme der Betreuung dieser Arbeit seitens der Naturwissenschaftlichen Fakultäten und für die Erstellung des Zweitgutachtens. Herrn Prof. Dr. Thomas Winkler danke ich für die Diskussionen und Unterstützung meines Projekts mit Rat und Tat, für die Leitung der B Zellforschergruppe FOR832 und für die Bereitschaft, Zeit als Prüfer für diese Dissertationsarbeit aufzuwenden. Herrn Prof. Dr. Lars Nitschke danke ich als Mitglied meiner Betreuungskommission für seine Ratschläge und Hilfe, sowie für seine Unterstützung mit Reagenzien, Einweisung und Nutzung von Geräten sowie für die Bereitschaft, als Prüfer dieser Dissertationsarbeit zu fungieren. Herrn Prof. Dr. Andre Gessner danke ich als Mitglied meiner Betreuungskommission für die regen Diskussionen und Ratschläge. Der Deutschen Forschungsgemeinschaft gilt mein Dank für die akademische und finanzielle Förderung dieser Arbeit im Rahmen der B Zellforschergruppe 832 und des Graduiertenkollegs 592 – Lymphozyten. Dabei danke ich insbesondere dessen Sprechern Herrn Prof. Dr. Thomas Winkler und Herrn Prof. Dr. Hans-Martin Jäck für die Aufnahme und allen Mitgliedern für die Bereitschaft zu Hilfe und Diskussion vor Ort und auf unseren Tagungen. Bei Herrn Prof. Dr. Michael Bösl möchte ich mich für die Injektion der embryonalen Stammzellen bedanken. Besonders bedanken möchte ich mich auch bei Christiane Lang für die tatkräftige Unterstützung bei vielen Arbeiten an diesem Projekt sowie dem gesamten Swip-Team, allen voran Sebastian Dütting, der die lange Zeit der Doktorarbeit mit Rat, Tat und Spaß ausgefüllt hat, Sandra Hagen für ihre Zusammenarbeit an diesem Protein, wie auch Pavitra Purohit, Kristin Fritsch und meinen Praktikantinnen Johanna Rothamer, Mona Biermann und Melanie Haars. 136 Anhang Dr. Martina Porstner möchte ich herzlichst für alle guten Gespräche, ihre Unterstützung und Hilfe sowie für ihre Durchsicht und die Korrektur dieser Arbeit und unser Kanada-Erfahrung danken. Danken möchte ich auch Lisa Lang für ihre Unterstützung bei allen Fragen abseits der direkten Wissenschaft, sowie allen Molims für die angenehme Arbeitsatmosphäre, ihren Rat und ihre Hilfe sowie ihre Geduld, meine ständigen Fragen zu ertragen. Ganz besonderer Dank gilt auch Andreas Brandl und Sven Brenner für ihre Unterstützung und ihre Erfahrung bezüglich der Generation einer Knockout-Maus, die beide auch außerhalb der regulären Geschäftszeiten bei einem Kaltgetränk gerne mit mir teilten und die auch die Mittagspausen stets mit Geschmack füllten – wie immer! Auch möchte ich mich bei Heidi Wölfel und den Tierpflegern des FPZ, BTE und NFZ für die Versorgung meiner Versuchstiere bedanken. Weiterhin danke ich dem „harten Kern“ des GK592 (Kerstin, Eva, Jockel, Mario, Mark, Heiko, Andi, Sven und Sebastian) für den ausgesprochen guten Zusammenhalt, das gegenseitige Verständnis und für den Spaß, den wir innerhalb und außerhalb der Institution zusammen hatten, sei es bei Retreats, den vielfältigen Bergsportarten (Klettern, Boarden, Berg) oder bei einem Bierchen. Besonders bedanken möchte ich mich bei meiner Freundin Claudia Hinca, dass sie mir während der Doktorarbeit immer zur Seite stand, mich aufmunterte, stets für mich da war und Geduld und Verständnis zeigte, wenn mal zu wenig Zeit vorhanden war. Ein ganz besonderer Dank gilt meinen Eltern, die mir nicht nur mein Studium ermöglicht haben, sondern mich all die Jahre unterstützten, immer für mich da waren und auch an dieser Arbeit mit großem Interesse und bester Korrekturfunktion teilgenommen haben. Von Herzen bedanken möchte ich mich bei meinem Bruder Kilian, auf den ich mich jederzeit und in allen Belangen verlassen kann und der für die nötige Ablenkung sorgte, wenn dies nötig war. Nicht zuletzt möchte ich mich bei all meinen Freunden, dem „Mob“, den Hornfreunden e.V. und den „Uhus“ bedanken, die mir so viele Rückzugspunkte geschaffen haben, immer zur Stelle waren und mich abgelenkten, aufgebauten und motivierten, je nachdem, was gerade notwendig erschien und auch die ein oder andere Feier mit mir zelebriert haben. 137 Anhang 10.7. Erklärung „Ich erkläre: Ich habe die vorgelegte Dissertation selbstständig und ohne unerlaubte fremde Hilfe und nur mit Hilfen angefertigt, die ich in der Dissertation angegeben habe. Alle Textstellen, die wörtlich oder sinngemäß aus veröffentlichten oder nicht veröffentlichten Schriften entnommen sind, und alle Angaben, die auf mündlichen Auskünften beruhen, sind als solche kenntlich gemacht. Bei den von mir durchgeführten und in der Dissertation erwähnten Untersuchungen habe ich die Grundsätze guter wissenschaftlicher Praxis eingehalten, wie sie in den „Richtlinien der Friedrich-Alexander-Universität ErlangenNürnberg zur Sicherung guter wissenschaftlicher Praxis“ niedergelegt sind.“ Erlangen, den 27.02.2012 ________________________ Unterschrift 138 Anhang Niemals aber wird man etwas entdecken, wenn man sich mit dem bereits Entdeckten begnügt. Seneca der Jüngere Epistulae morales ad Lucilium, 33,10 139
