Bakterielle Phytopathogenese – Xanthomonas als

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BIOSPEKTRUM • 1.00 • 6. JAHRGANG
Dirk Nennstiel, Jens Boch und Ulla Bonas
Institut für Genetik, Martin-Luther-Universität
Halle-Wittenberg
gensatz zu systemischen Pathogenen (z. B.
X. c. pv. campestris), nicht in der gesamten
Pflanze ausbreitet [2]. Wird hingegen eine
resistente Pflanze von Xcv infiziert, kommt
es zur Erkennung und Induktion einer hypersensitiven Reaktion (HR). Die HR ist
eine schnelle, lokale Abwehrreaktion (programmierter Zelltod), durch die das bakterielle Wachstum im Pflanzengewebe eingeschränkt oder verhindert wird [1]. Es ist noch
unklar, ob die HR Ursache oder Konsequenz
der Resistenz ist.
A
B
Bakterielle Phytopathogenese –
Xanthomonas als Modellorganismus
Obwohl Pflanzen in der Natur mit einer
Vielzahl von potentiell pathogenen
Mikroorganismen konfrontiert werden,
sind sie gegenüber den meisten Pathogenen resistent. Ein erfolgreich pathogener
Mikroorganismus hat daher ausgeklügelte
Strategien entwickelt, um eine Pflanze zu
infizieren und zu kolonisieren. Ein Modellorganismus zum Studium von bakteriellen
Pflanzenpathogenen ist der Erreger der
Bakteriellen Fleckenkrankheit bei Tomate
und Paprika, Xanthomonas campestris pv.
vesicatoria. Wie in den meisten anderen
phytopathogenen Bakterien scheint für ein
Überleben des Bakteriums im Interzellularraum der Pflanze ein Typ III-Sekretionssystem die Schlüsselrolle zu spielen. Dabei
erlaubt dieses System nicht nur die
Sekretion von Effektorproteinen in den
Interzellularraum, sondern vermutlich
auch deren direkte Injektion in die
eukaryotische Zelle.
C
쑺 Forschungsergebnisse der letzten Jahre
haben gezeigt, daß bakterielle Tier- und
Pflanzenpathogene ganz ähnliche Strategien benutzen, um ihren Wirt zu besiedeln.
Im Gegensatz zu Wirbeltieren, in denen spezialisierte Zellen Fremdorganismen unschädlich machen, muß in einer Pflanze jede
Zelle autonom in der Lage sein, harmlose
bzw. symbiontische von pathogenen Mikroorganismen zu unterscheiden und abzuwehren. Die Pflanzen, die sich bereits über natürliche Barrieren gegen viele Mikroorganismen schützen können, sind auch aufgrund
vielfältiger Erkennungsmechanismen für
„fremde“ Organismen in der Lage, Abwehrreaktionen zu induzieren und so die Etablierung potentiell pathogener Mikroorganismen zu verhindern [1]. Erfolgreiche pathogene Interaktionen sind also eher die Ausnahme als die Regel und beruhen auf einer
trickreichen Überlistung des Wirts zum
Nutzen des Pathogens.
Das Gram-negative Bakterium Xanthomonas campestris pathovar (pv.) vesicatoria
(Xcv) ist der Erreger der Bakteriellen Flekkenkrankheit bei Paprika und Tomate (Abb.
1). Diese Krankheit stellt vor allem in Anbaugebieten mit feucht-warmem Klima ein
großes ökonomisches Problem dar. In der
Natur entwickeln sich die Bakterien nur innerhalb der Wirtspflanze, können aber in
abgestorbenen Pflanzenteilen überdauern
und lassen sich leicht auf künstlichen Nährmedien vermehren. Xcv gelangt mittels Wassertropfen über Stomata oder Verwundungen in das pflanzliche Gewebe und vermehrt
sich in anfälligen (suszeptiblen) Pflanzen im
Interzellularraum bis zu hohen Zelldichten.
Einige Tage nach der Infektion sind zuerst
wäßrige Läsionen, dann nekrotische Flekken zu beobachten, wobei Xcv in der Infektionsstelle lokalisiert bleibt und sich, im Ge-
Abb. 1: Krankheitssymptome auf Paprika,
hervorgerufen von Xanthomonas campestris pv.
vesicatoria. Die Bakterien vermehren sich im
Interzellularraum des Frucht- (A) und Blattgewebes (B), das daraufhin wäßrige Läsionen und
später nekrotische Flecken aufweist. Die
Bakterien lassen sich auf Labormedien isolieren
und besitzen eine leuchtend gelbe Farbe (C).
hrp-Gene kontrollieren die
Pflanzeninteraktion
Neben Toxinen, zellwandlytischen Enzymen und extrazellulären Polysacchariden,
die häufig entscheidend oder modulierend
an der Ausbildung der Krankheitssymptome beteiligt sind [3], sind in allen Gram-negativen Phytopathogenen, mit Ausnahme
von Agrobacterium spp., hrp(hypersensitive
reaction and pathogenicity)-Gene identifiziert worden, die essentiell für die Etablierung und Vermehrung der Bakterien in der
Pflanze sind [4]. hrp-Mutanten weisen einen
pleiotropen Phänotyp in der Pflanze auf:
Während das Wachstum der hrp-Mutanten
auf künstlichen Medien völlig normal ist,
sind diese nicht in der Lage, sich in der
Pflanze zu vermehren und in suszeptiblen
Pflanzen Krankheitssymptome auszulösen.
Ferner können hrp-Mutanten in resistenten
Pflanzen keine HR induzieren.
Regulation der hrp -Gene
Die 23-kb hrp-Genregion von Xcv kodiert für 22 Gene, die in sechs Transkriptionseinheiten, hrpA bis hrpF, organisiert sind
(Abb. 2; [5]). Die Expression der hrp-Gene
ist in Komplexmedium supprimiert, wird
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Komponenten von Typ III-Proteinsekretionssystemen auf, die zuerst für tierpathogene Bakterien beschrieben wurden [9]. Mit
Ausnahme des HrcN-Proteins (ATPase),
sind die Hrc-Proteine membranlokalisiert.
Die Funktion der nicht-konservierten hrpGene, die wie die hrc-Gene essentiell für die
Pflanzeninteraktion sind, ist bislang unklar.
Es könnte sich um wichtige strukturelle
Komponenten des Typ III-Systems handeln.
Die dritte Klasse von Genen, hpa, ist essentiell für die pathogene Interaktion, nicht aber
für die Erkennung des Pathogens in resistenten Pflanzen. HpaA wird sekretiert und ist
vermutlich nicht an der Ausbildung des HrpSekretionsapparates selbst, sondern an einer
Modulierung der Interaktion mit der Pflanze beteiligt [10].
Avirulenzprotein AvrBs3:
Modell zum Studium der Pathogenität
Abb. 2: Modell der hrp-Gen Regulation in Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Umweltsignale, die
die Bedingungen im pflanzlichen Gewebe widerspiegeln, werden über einen noch unbekannten Sensor
auf den konstitutiv exprimierten Response-Regulator HrpG übertragen. HrpG aktiviert daraufhin die
Expression von hrpA und hrpX. HrpX induziert die Expression der übrigen hrp-Operons (hrpB - hrpF).
jedoch in der Pflanze und in Minimalmedien induziert [6]. Zwei hrp-regulatorische
Gene (hrpG, hrpX) sind außerhalb der hrpRegion lokalisiert: HrpG ist homolog zu
Response-Regulatoren von Zwei-Komponentensystemen der OmpR-Familie und
aktiviert die Expression von hrpA und des
regulatorischen Gens hrpX [7]. hrpX kodiert
für einen Aktivator der AraC-Familie, der die
Expression der anderen hrp-Operons aktiviert [8]. Der für das Zwei-Komponentensystem postulierte Sensor und potentielle
Aktivator des HrpG- Proteins ist bisher nicht
identifiziert.
Hrp-Typ III-Sekretionssystem
Die Analyse der DNA-Sequenz und des
Phänotyps nicht-polarer Mutanten ergab
drei Klassen von Genen in der hrp-Genregion von Xcv (Abb. 3): (i) Gene, deren Produkte in pflanzen- und tierpathogenen Bakterien konserviert sind (hrc, hrp conserved),
(ii) nicht in allen Phytopathogenen vorhandene, aber für Xcv essentielle hrp-Gene, und
(iii) hpa (hrp associated) Gene. Die neun
Hrc-Proteine sind homolog zu Proteinen aus
anderen pflanzenpathogenen Bakterien und
weisen signifikante Sequenzähnlichkeit zu
Abb. 3: Das 23 kb hrp-Gencluster aus Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Die sechs transkriptionellen Einheiten (hrpA bis hrpF) beinhalten drei Klassen von Genen. hrc-Gene, die für konservierte
Proteine kodieren (hrp conserved, rot), hrp-Gene, die nicht in allen Phytopathogenen vorkommen
(hypersensitive reaction and pathogenicity, grün) und hpa-Gene, die mit hoher Wahrscheinlichkeit
Zielproteine des Hrp-Sekretionsapparates darstellen (hpa, hrp associated, gelb).
Wie bereits erwähnt, findet man unter
den Wirtspflanzen auch Pflanzen, die einer
Infektion widerstehen können, also resistent sind. Häufig beruht diese Resistenz
auf einer „passenden“ Kombination eines
pflanzlichen Resistenzgens (R-Gens) zu einem Avirulenzgen (avr) im Pathogen (Abb.
4). Diese in den 40er Jahren von Flor aufgestellte „Gen-für-Gen“-Hypothese wurde
mittlerweile für viele Pathosysteme (Bakterien, Pilze, Viren) molekular bestätigt;
beispielsweise sind mehr als 40 avr-Gene
aus Subspezies von Pseudomonas syringae
und Xanthomonas bekannt [11]. In der einfachsten Interpretation der Gen-für-GenBeziehung kodiert das R-Gen für einen
Rezeptor und das avr-Gen für dessen Liganden, wodurch die Pflanze in der Lage
ist, das Pathogen rechtzeitig zu erkennen
und die Abwehrreaktion auszulösen. Daher
ist auch nur bei Anwesenheit beider Gene
in den interagierenden Organismen das
Bakterium avirulent und die Pflanze resistent. Ein solches avirulentes Bakterium ist
aber nach wie vor pathogen, also virulent,
für eine Pflanze, die nicht das passende RGen besitzt. Wie die Erkennung molekular abläuft und welche Rolle dabei die RGene spielen, ist Gegenstand intensiver
Forschung. Bisher wurde nur für das „Paar“
AvrPto aus P. syringae und Pto aus Tomate
eine molekulare Interaktion gezeigt [11].
Xcv-Bakterien, die das Avirulenzgen
avrBs3 exprimieren, induzieren in Paprikapflanzen, die das Resistenzgen Bs3 tragen,
spezifisch die HR (Abb. 4). Das avrBs3-Gen
ist auf einem konjugativen Plasmid lokalisiert und ist Mitglied einer Genfamilie in
Xanthomonas spp. Interessanterweise wurde für einige avrBs3-homologe Gene nicht
nur eine Avirulenzfunktion, sondern auch
eine Virulenzfunktion bei Infektion suszeptibler Pflanzen nachgewiesen [12]. Dies
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könnte erklären, warum diese bakteriellen
Gene nicht evolutionär eliminiert wurden
und deutet auf eine wichtige Funktion für
die Bakterien hin. Das 122 kDa-AvrBs3Protein weist eine interessante Domänenstruktur auf ([13]; Abb. 5): Die mittlere
Region des AvrBs3-Proteins besteht aus
17,5 direkten Sequenzwiederholungen von
je 34 Aminosäuren, die fast identisch sind
und die Erkennungsspezifität des AvrBs3Proteins in der Pflanze determinieren [14].
Im C-terminalen Bereich sind zwei funktionelle Kernlokalisierungssignale (NLS),
von denen mindestens eines unabdingbar
für die Funktion des Proteins ist [15].
Typ III-Sekretion in vitro
Bei der Typ III-Sekretion werden Proteine ohne Prozessierung sekretiert. Dies
wurde sowohl für Proteine aus tier- als auch
pflanzenpathogenen Bakterien gezeigt, wobei die Kulturbedingungen und Signale für
die Auslösung der Sekretion unterschiedlich sind [9, 16, 17]. Die hrp-abhängige Proteinsekretion in vitro stellte sich für phytopathogene Bakterien als äußerst schwierig
heraus und ist zur Zeit noch weniger effizient als bei tierischen Pathogenen. Vermutlich spielt der Kontakt zwischen Bakterium und Wirtszelle eine Schlüsselrolle für
die Sekretion von Virulenzfaktoren sowie
eventuell auch für die Expression sekretierter Proteine.
Die Etablierung von in vitro-Sekretionsbedingungen für Xcv gelang durch Verwendung eines konstitutiv aktiven hrpG-Konstruktes (hrpG*), das eine hrp-Genexpression unabhängig von hrp-Induktionsbedingungen erlaubt [18]. Die Inkubation von
HrpG*-Bakterien in Minimalmedium bei
pH 5,4 führt zur hrp-spezifischen Sekretion von AvrBs3 und anderen Avr-Proteinen
in vitro [19]. hrp-abhängig sekretiert werden
nicht nur verschiedene Xcv- sondern auch
heterologe Proteine wie PopA aus Ralstonia solanacearum und YopE aus Yersinia pseudotuberculosis, wodurch erstmals die Konserviertheit des Sekretionssignals gezeigt werden konnte [19].
Abb. 4: Avirulenzgene bestimmen den
Ausgang einer Interaktion von Phytopathogen und Wirtspflanze.
A. Xanthomonas campestris pv. vesicatoriaStämme, die das Avirulenzgen avrBs3
tragen, rufen auf Paprikapflanzen, die das
entsprechende Bs3-Resistenzgen besitzen,
eine Abwehrreaktion (hypersensitive
Reaktion, HR) hervor, die das Wachstum der
Bakterien stark einschränkt (inkompatible
Interaktion).
B. Ist eine der beiden Komponenten nicht
vorhanden – entweder die Bakterien
besitzen kein avrBs3, oder die Pflanze nicht
das entsprechende Bs3-Resistenzgen –
können die Bakterien sich vermehren und
typische Krankheitssymptome (Läsionen)
hervorrufen (kompatible Interaktion).
C. Bakterielle Wachstumskurve. In einer
kompatiblen Interaktion wachsen die
Bakterien zu hohen Zelldichten (ca. 108
CFU/cm2 Blattfläche) im pflanzlichen
Gewebe, während sie in einer inkompatiblen Interaktion im Wachstum stark
eingeschränkt sind.
die das „korrespondierende“ Resistenzgen
tragen, gezeigt [20]. Während die Expression des avr-Gens in der Pflanze ausreichend für die Induktion der HR ist, benötigt das Pathogen dazu zusätzlich die hrpGene. Es liegt daher der Schluß nahe, daß
pflanzenpathogene Bakterien Avr-Proteine
und vermutlich Virulenzproteine (Effektoren) mittels des Hrp-Sekretionssystems in
die Wirtszelle „injizieren“ ([20]; Abb. 6).
Ein weiteres Protein, das vermutlich seinen
Wirkort in der Pflanzenzelle hat, ist HpaA.
Darauf deuten Sekretionsexperimente und
die Tatsache hin, daß HpaA zwei funktionelle NLS aufweist, die wichtig für seine
Funktion sind [10].
Ausblick
Bislang konnte der direkte Proteintransfer aus phytopathogenen Bakterien in die
Pflanzenzelle nicht nachgewiesen werden.
So kann man nur spekulieren, wie dieser
Prozeß abläuft (Injektion oder Endozytose?).
Pflanzliche Zellen besitzen, im Gegensatz
zu tierischen Zellen, eine Zellwand, die eine
Typ III-Sekretion in vivo
Pflanzen- und tierpathogene Bakterien
ähneln sich nicht nur hinsichtlich des Typ
III-Sekretionsapparats, sondern auch darin,
daß dieses Proteinsekretionssystem vermutlich dazu dient, Effektorproteine direkt
(?) in die eukaryotische Zelle zu transferieren („injizieren“). Diese Hypothese wird
gestützt durch Befunde, daß bakterielle
Avr-Proteine ihren Wirkort in der Pflanzenzelle haben. Dies wurde mittels transienter Expression von avrBs3 aus Xcv und avrGenen aus Pseudomonas syringae in Pflanzen,
Abb. 5: Das bakterielle AvrBs3-Protein ist durch distinkte Proteindomänen charakterisiert. AvrBs3 ist
ein 122 kDa-Protein und besitzt im mittleren Bereich einen Abschnitt mit 17,5 direkten Sequenzwiederholungen von je 34 Aminosäuren. Diese Motive bestimmen die Spezifität von AvrBs3 in einer inkompatiblen Interaktion. Außerdem wurden im C-Terminalen Bereich zwei funktionelle Kernlokalisierungssequenzen (NLS) identifiziert, die dafür verantwortlich sind, daß das Protein in den Kern der Wirtszelle
gelangt, wo es dann vermutlich seine Funktion entfaltet.
Überblick
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Literatur
Abb. 6: Schema der Interaktion zwischen
phytopathogenem Bakterium und pflanzlicher
Wirtszelle. Hrp- und Hrc-Proteine bauen den Typ
III-Sekretionsapparat auf, der in beiden
bakteriellen Membranen verankert ist und eine
extrazelluläre Extension (Pilus?) aufweist. Über
das Hrp-Sekretionssystem werden Effektorproteine direkt in die Wirtszelle geschleust, wo sich
das Ergebnis der Interaktion entscheidet: Werden
die Effektoren erkannt, wird das Abwehrsystem
aktiviert und die Pflanze ist resistent. Bei
Nichterkennung kommt es vermutlich zur
Manipulation pflanzlicher Prozesse, die
letztendlich den Bakterien das Wachstum
ermöglichen und zur Ausbildung der Krankheit
führen. ZW, Zellwand; ZM, Zellmembran; HR,
hypersensitive Reaktion.
natürliche physikalische Barriere schafft
zwischen Bakterium und eukaryotischer
Plasmamembran. Ob Xcv und andere phytopathogene Bakterien während der Interaktion mit der Pflanzenzelle lytische Enzyme sekretieren oder Pilus-ähnliche Oberflächenstrukturen die Zellwand durchdringen
und dadurch das Bakterium an die eukaryotische Zellmembran annähern, ist unklar.
Weitere aktuelle Fragen betreffen die Natur und biochemische Funktion der sekretierten Effektorproteine, die letztlich dazu
dienen sollten, der pflanzlichen Erkennung
zu entgehen und Nährstoffe im extrazellulären Raum des Gewebes für die bakterielle Vermehrung zur Verfügung zu stellen. Die
Identifizierung der pflanzlichen „Targets“.
der Effektoren wird mit Spannung erwartet.
Danksagung
Wir danken allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe für ihren wissenschaftlichen Beitrag.
Projekte in unserer Arbeitsgruppe werden zur
Zeit von der DFG (SFB 363, Projekte C14,
C15) und der EU (Biotech 4) gefördert.
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Ulla Bonas
geboren 1955, Studium der Biologie in Köln,
Promotion und ein Jahr Postdoc bei Prof. H. Saedler
am Max-Planck-Institut für Züchtungsforschung in
Köln; 2 Jahre Postdoc (DAAD und DFG gefördert) an
der University of California, Berkeley, bei Prof. B.
Staskawicz; anschl. Arbeitsgruppenleiterin für 5 Jahre
am Institut für Genbiologische Forschung in Berlin;
1993-1997 Arbeitsgruppenleiterin (CNRS Directeur
de Recherche) am CNRS-Institut des Sciences
Vegetales in Gif-sur-Yvette (bei Paris); seit 1998
Professur in Genetik an der Universität Halle. Seit
1999 Sprecherin des SFB 363 „Pflanzliche Zellbiologie“.
Korrespondenzadresse
Prof. Dr. Ulla Bonas
Institut für Genetik
Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
D-06099 Halle
Tel: 0345-55 26291
Fax: 0345-55 27259
e-Mail: [email protected]