Charakterisierung von CD4 CD25 T

Aus der Chirurgischen Klinik und Poliklinik der Universität Würzburg
Chirurgische Klinik I
Direktor: Professor Dr. med. Prof. h.c. A. Thiede
Charakterisierung von
CD4+ CD25+ T-Regulatorzellen (Treg) der Ratte:
In vitro Kultivierung, Cytokinprofil und
regulatorische Funktion
Inaugural - Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde der
Medizinischen Fakultät
der
Bayerischen Julius-Maximilians-Universität zu Würzburg
vorgelegt von
Marc Oliver Kuckein
aus Würzburg
Würzburg, Dezember 2005
Referent:
Priv.-Doz. Dr. rer. nat. Christoph Otto
Korreferent: Prof. Dr. rer. nat. Thomas Herrmann
Dekan:
Prof. Dr. med. G. Ertl
Tag der mündlichen Prüfung:
Der Promovend ist Arzt
Inhaltsverzeichnis
1.
2.
Einleitung ...........................................................................1
Fragestellung .....................................................................5
3.
Material und Methoden.......................................................6
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
3.8
3.9
4.
Ergebnisse ....................................................................... 14
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
4.6
4.7
4.8
5.
6.
7.
8.
9.
Tiere........................................................................................ 6
Antikörper ............................................................................... 6
Kulturmedien und Pufferlösungen........................................... 7
Isolierung von Treg ................................................................... 7
Proliferationsassay.................................................................. 8
Inhibitionsassay ...................................................................... 9
Durchflusszytometrie ............................................................. 10
Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion .............. 11
Cytokin-Nachweis im ELISA .................................................. 13
Nachweis von Treg in lymphatischen Organen ....................... 14
Isolierung und Reinheit von Treg ............................................. 16
Der Phänotyp aufgereinigter Treg ........................................... 18
In-vitro-Kultivierung von Treg................................................... 21
Aktivierung von Treg: Durchflusszytometrische Analyse ......... 24
Aktivierung von Treg: Bestimmung der Proliferation................ 27
Aktivierung von Treg: Nachweis von Cytokinen....................... 29
Nachweis der regulatorischen Funktion von Treg im
Inhibitionsassay ..................................................................... 33
Beantwortung der Fragen................................................. 35
Diskussion........................................................................ 37
Ausblick............................................................................ 44
Zusammenfassung........................................................... 45
Literaturverzeichnis .......................................................... 46
Anhang............................................................................. 51
Danksagung
Lebenslauf
Einleitung
1.
Einleitung
Die Organtransplantation stellt eine der größten Herausforderungen der modernen Medizin dar. Seit der ersten klinisch erfolgreichen Nierentransplantation
zwischen eineiigen Zwillingen durch Joseph E. Murray im Jahre 1954 (Murray
JE und Merrill JP, 1955) etablierte sich die Organtransplantation innerhalb
kürzester Zeit als therapeutisches Routineverfahren (Hariharan S et al., 2000).
Nach Angaben von Eurotransplant wurden allein in Deutschland im Jahre 2002
mehr als 3.300 − von hirntoten Spendern stammende − Organe transplantiert
(www.eurotransplant.nl).
Das größte Problem der Transplantationsmedizin ist jedoch nach wie vor die
durch das fremde Organ ausgelöste und zum Funktionsverlust führende
Abstoßung. Diese Immunantwort kann dabei hyperakut, akut oder chronisch
verlaufen, so dass der Patient ständig dem Risiko ausgesetzt ist, sein
Transplantat zu verlieren (Übersicht u.a. bei Le Moine A et al. 2002; Otto C und
Ulrichs K, 2004). Die derzeit einzige Möglichkeit eine Abstoßung effektiv zu
verhindern, ist die Unterdrückung des Empfängerimmunsystems mit sog.
Immunsuppressiva. Auch wenn diese erstmals in den 60er Jahren erfolgreich
eingesetzten Medikamente ständig durch verbesserte ersetzt werden, so
bleiben doch die von ihnen ausgelösten Nebenwirkungen weiterhin ein ernstzunehmendes Problem (Ratcliffe PJ et al., 1996). Da diese Medikamente die
gesamte körpereigene Abwehr unterdrücken, kann der Organismus der Entstehung und Ausbreitung von Tumoren und Infektionen kaum mehr adäquat
entgegenwirken. Nach statistischen Erhebungen von Eurotransplant stellen
schwerwiegende Infektionen auch weiterhin die Haupttodesursache bei
Organempfängern dar.
Diese Situation verdeutlicht die Notwendigkeit neue Strategien zu entwickeln,
um die Transplantatfunktion ohne − oder zumindest mit geringeren − Nebenwirkungen zu erhalten. Auch wenn moderne Immunsuppressiva in erster Linie
-1-
Einleitung
die Funktion von T-Lymphozyten hemmen, die als wichtige Effektorzellen die
Transplantatabstoßung auslösen (u.a. Kishimoto K et al., 2000), so wird doch
über das Immunsystem hinaus der gesamte Organismus beeinträchtigt, und die
Langzeitfolgen dieser Immunsuppression sind für den Patienten nach wie vor
schwerwiegend (u.a. Hong JC und Kahan BD, 2000). Das Ziel einer optimierten
Therapiestrategie muss daher sein, zur Erhaltung der Transplantatfunktion
ausschließlich den Teil des Immunsystems zu hemmen, der für die Abstoßung
des fremden Organs verantwortlich ist. Dabei sollen die lebenswichtigen
Abwehrfunktionen des Immunsystems nicht beeinträchtigt werden (u. a. Otto C
und Ulrichs K, 2004).
Als mögliche Alternative zur "chemischen" Immunsuppression mit z.B. Cyclosporin, Tacrolimus oder Rapamycin (Denton MD et al., 1999) könnte sich die
zellulär-vermittelte Suppression entwickeln (Zelenika D et al., 2001). Solche
Suppressor- oder Regulatorzellen sind insbesondere für T-Lymphozyten nachgewiesen worden (Gershon RK und Kondo K, 1970). Ihre besondere Fähigkeit
besteht darin, Immunantworten zu hemmen (Groux H et al., 1997; Jiang S et
al., 2003). Für die Transplantationsmedizin von Bedeutung ist, dass bereits
1975 Suppressor T-Lymphozyten im Zusammenhang mit dem Funktionserhalt
von Hauttransplantaten beschrieben worden sind (Kilshaw P et al., 1975). Sollte
sich zeigen, dass regulatorische T-Lymphozyten die Erwartungen als Therapeutikum erfüllen, d.h. sie hemmen antigenspezifisch die Immunantwort gegen das
Transplantat langfristig und sicher, und ihr klinischer Einsatz ließe sich realisieren, so wäre möglicherweise die ultimative Therapie gegen die Transplantatabstoßung gefunden.
Nach intensiven Untersuchungen in den 70er Jahren des letzten Jahrhunderts
erlangten die Regulator T-Lymphozyten erst in den 90er Jahren wieder neues
Interesse durch Sakaguchi und Mitarbeiter. Sie konnten zeigen, dass bestimmte
(natürlich vorkommende) T-Lymphozyten mit dem Phänotyp CD4+ CD25+
Regulatorzellen darstellen (Sakaguchi S et al., 1995). Eine ihrer wesentlichen
-2-
Einleitung
Funktionen ist dabei die Kontrolle potentiell autoreaktiver T-Lymphozyten zur
Verhinderung von Autoimmunität. In den folgenden Jahren gelang es, die
Regulatorfunktion dieser CD4+ CD25+ T-Lymphozyten oder Treg durch weitere
experimentelle Daten zu bestätigen (Thornton AM und Shevach EM, 1998).
Heute gilt die T-Zell-vermittelte Immunregulation als ein wichtiger Mechanismus
auch bei der Erhaltung der Transplantatfunktion (Wood K et al., 2003).
Neben den Treg gibt es noch weitere Subtypen von Regulator CD4+ T-Lymphozyten (u.a. Zeng D et al., 1999; Zhang Z et al., 2000). Die Abgrenzung der einzelnen Subtypen ist jedoch nicht immer einfach, so dass die Suche nach
eindeutigen Markern für Regulatorzellen auch weiterhin von großer Bedeutung
bleibt (Davies J et al., 1999; Read S et al., 2000; Stephens L et al., 2001;
Brunkow M et al., 2001; Roncarolo MG et al., 2001). Eine Besonderheit der Treg
ist, dass sie – wie bereits erwähnt – in den lymphatischen Organen unbehandelter Tiere vorkommen (Shevach E, 2001). Da diese Zellen den Interleukin-2Rezeptor-Komplex exprimieren, ist es leicht möglich, sie mit Hilfe von
Antikörpern, die gegen die α-Kette (CD25) des Interleukin-2-Rezeptors gerichtet
sind, von den CD25-negativen T-Lymphozyten zu trennen. Dabei stellt das
Oberflächenmolekül CD25 jedoch keinen optimalen Marker dar, da ebenfalls
"konventionelle", also nicht-regulatorische, T-Lymphozyten nach ihrer Aktivierung CD25 positiv werden. Somit weisen nicht alle CD4+ CD25+ T-Lymphozyten regulatorische Aktivität auf, und andererseits exprimieren wohl nicht alle
potentiell regulatorisch aktiven T-Lymphozyten das Oberflächenmolekül CD25.
Dennoch erlaubt diese Methode, Treg in unbehandelten Tieren eindeutig zu
identifizieren, um sie aus verschiedenen lymphatischen Organen wie Lymphknoten, Milz oder Thymus zu isolieren.
In den vergangenen Jahren wurden zahlreiche neue Erkenntnisse über
Funktion und Eigenschaften humaner und muriner Treg gewonnen (Hori S et al.,
2003). Dennoch bleiben wichtige Fragen bis heute ungeklärt. So wird z.B. die
Rolle von Cytokinen für die Vermittlung der regulatorischen Funktion nach wie
-3-
Einleitung
vor kontrovers diskutiert. Zahlreiche in vivo Studien konnten zwar einen Zusammenhang zwischen Interleukin-10 und dessen regulatorischer Funktion aufzeigen (Assemann C et al., 1999), doch ließ sich dies in vitro nicht bestätigen
(u. a. Thornton A et al., 1998). Auch Interleukin-2 ist Gegenstand heftiger Diskussionen, insbesondere ist die Frage zu klären, ob dieses Cytokin für das
Überleben von Treg essentiell ist (Shevach EM, 2002). Ebenfalls umstritten ist,
dass Treg selbst kein IL-2 produzieren, und sie ihre regulatorische Funktion
durch Kostimulierung verlieren (Takahashi T et al., 1998; Malek TR, 2003).
Während humane und murine Treg bereits sehr gut charakterisiert sind, ist über
die Immunbiologie von Treg der Ratte zurzeit weniger bekannt (Seddon B und
Mason D, 1999; Lin C und Hünig T, 2003). Da aber die Ratte ein wichtiges
Kleintiermodell für experimentelle Transplantationen nach klinischem Vorbild ist,
könnten Untersuchungen in dieser Spezies, die Transplantatabstoßung mit Treg
nebenwirkungsfrei zu hemmen, sehr attraktiv für die biomedizinische Grundlagenforschung sein.
Ein wesentliches Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung "natürlich" vorkommender Treg (Bluestone JA and Abbas AK, 2003) aus unbehandelten LewisRatten. Insbesondere die Expression bestimmter Oberflächenmoleküle sowie
die Produktion der Cytokine IL-2 und IL-10 wurden untersucht. Hierzu war es
notwendig zu klären, ob und unter welchen Bedingungen Treg zu kultivieren
sind. Ein weiteres wichtiges Ziel der Charakterisierung war zudem, die erwartete regulatorische Funktion von Treg der Ratte nachzuweisen.
-4-
Fragestellung
2.
Fragestellung
Das Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung von CD4+, CD25+ T-Regulatorzellen (Treg) der Ratte. Die Beantwortung folgender Fragen stand dabei
im Mittelpunkt der Untersuchungen:
1)
CD4+, CD25+ T-Regulatorzellen (Treg) wurden bei Mäusen und Menschen
nachgewiesen. Sind sie auch in der Ratte vorhanden?
2)
Lassen sich Treg der Ratte in vitro kultivieren?
3)
Humane und murine Treg sezernieren Cytokine mit inhibitorischer
Funktion. Verfügen auch die Treg der Ratte über diese Fähigkeit?
4)
Humane und murine Treg weisen einen bestimmten CD45R-Phänotyp
auf; ist dieser Phänotyp auch für die Treg der Ratte nachzuweisen?
5)
Sind auch für die Treg der Ratte suppressive Eigenschaften in vitro
nachzuweisen?
-5-
Material und Methoden
3.
Material und Methoden
3.1
Tiere
Es wurden männliche Ratten der Firma Harlan Winkelmann, Borchen,
verwendet; der Inzuchtstamm Lewis (LEW, RT1l) zur Isolierung regulatorischer
T-Lymphozyten (Treg) und Dark Agouti (DA, RT1avl) zur Isolierung dendritischer
Zellen ("Dendritic Cells", DC). Bei der Organentnahme waren die Tiere im
Durchschnitt 8-10 Wochen alt und wogen zwischen 150-220 g.
3.2
Antikörper
Verschiedenste monoklonale Antikörper (Tab. 3.1) für die durchflusszytometrischen Analysen und zur Isolierung von Treg wurden verwendet. Ihre optimale
Konzentration wurde in Vorversuchen ermittelt.
Tab. 3.1: Übersicht über die in dieser Arbeit eingesetzten Antikörper, ihre Spezifität und
Bezugsquelle; TCR = T-cell receptor, T-Zellrezeptor.
Antikörper
Epitop
zu finden auf
Hersteller
Ox 1
CD45
Leukozyten allgemein
Linaris, Wertheim
Ox 6
b
B-Lymphozyten & aktivierte
RT1
(MHC-Klasse-II)
T-Lymphozyten
Linaris, Wertheim
Ox 7
CD90
Thymozyten
Linaris, Wertheim
Ox 22
CD45RC
T-Helferzellen
Linaris, Wertheim
Ox 39 / NDS61
CD25
aktivierte T-Lymphozyten
Linaris, Wertheim
Ox 40
CD134
aktivierte T-Lymphozyten
Linaris, Wertheim
W3/25
CD4
CD4 T-Lymphozyten
Medac, Hamburg
R 73
αβ TCR
α,β -T-Lymphozyten
Linaris, Wertheim
JJ319
CD28
T-Lymphozyten
Linaris, Wertheim
+
-6-
Material und Methoden
3.3
Kulturmedien und Pufferlösungen
Zur Kultivierung der Treg wurde RPMI-1640 Medium mit folgenden Zusätzen
verwendet: 20 mM HEPES, 1 mM Natrium-Pyruvat, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml
Penicillin G, 100 µg/ml Streptomycin, 5x10-5 M 2-Mercaptoethanol, 1% nicht-essentielle Aminosäuren und 10% fetales Kälberserum (CellConcepts, Umkirch;
alle weiteren Reagenzien von Gibco/Invitrogen). Für die Inkubation mit Antikörpern wurden die Zellen in PBS ("phosphate buffered saline") aufgenommen:
140 mM Natriumchlorid, 2,7 mM Kaliumchlorid, 7,2 mM Natriumdihydrogenphosphat und 1,47 mM Kaliumdihydrogenphosphat, pH 7,2. Zur Lyse der Erythrozyten wurde 1-fach konzentrierter Lysepuffer verwendet. Die 10-fach konzentrierte Stammlösung enthält 1,68 M Ammoniumchlorid, 99,88 mM Kaliumhydrogencarbonat und 12,6 mM EDTA (alle Angaben als Endkonzentration).
3.4
Isolierung von Treg
Die Isolierung wurde unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Aus einer LewisRatte wurden 8-10 mesenteriale-, 2-3 parailiacale- und 4 cervicale Lymphknoten sowie Milz und Thymus entnommen, die Organe getrennt durch ein Sieb
(Falcon Cell Strainer, 70 µm Nylon) gedrückt und die Zellsuspensionen in
RPMI-1640 Medium aufgefangen. Die Zellen wurden für 6 Minuten bei 402 xg
und 20°C zentrifugiert, und – falls notwendig – die Erythrozyten für 3 Minuten
mit 1-fach Lysepuffer inkubiert. Die verbliebenen Leukozyten wurden in RPMI1640 Medium überführt und erneut zentrifugiert. Nach Bestimmung der Zellzahl
wurden die Lymphozyten mit dem unkonjugierten anti-CD25-Antikörper NDS61
für 25 Minuten auf Eis inkubiert. Für 1x106 Zielzellen wurden 0,3 µg von dem
Antikörper eingesetzt, wobei der maximale Anteil der Treg an den Lymphknotenzellen sowie Milzzellen mit 10% und an den Thymozyten mit 5% kalkuliert
wurde. Diese Dosierung wurde in Vorversuchen ermittelt. Nach erneutem
Waschen (6 Minuten, 402 xg, 20°C) wurden die Zellen mit paramagnetischen
Mikropartikeln (CELLection Pan Mouse IgG Dynabeads, Dynal Biotech Oslo,
Norwegen) für 20 Minuten auf Eis inkubiert. Pro Zielzelle wurden 4 Dynabeads
-7-
Material und Methoden
eingesetzt. Nach der Inkubation wurden die Treg über einen Magneten (Dynal,
Magnetic Particle Concentrator) von den CD25neg abgetrennt. Die Treg wurden
anschließend in 200 µl RPMI-Medium resuspendiert und für 20 Minuten bei
Raumtemperatur mit 5 µl DNase mit 55 U/µl inkubiert. Die durch die DNase von
den Dynabeads freigesetzten Zellen verblieben im Überstand, während die
paramagnetischen Partikel mit einem Magneten entfernt wurden.
3.5
Proliferationsassay
Der T-Zell-Proliferationsassay wurde in Gewebekulturschalen mit 96 Vertiefungen (96-"well“-Rundbodenplatten, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen)
durchgeführt. Die T-Lymphozyten wurden in einer Zelldichte von 1x105 Zellen
pro Vertiefung in einem Endvolumen von 150 µl ausgesät. Die Versuchsansätze
wurden für maximal 72 Stunden bei 37°C und 5% CO2 inkubiert und für die
letzten 6 Stunden der Kultur mit 0,5 µCi [3H]-Thymidin pro Vertiefung versetzt
("gepulst"). Nach Versuchsende wurden die Zellen lysiert und der Einbau von
[3H]-Thymidin in die DNA sich teilender Zellen in einem Szintillationsmessgerät
bestimmt (Institut für Virologie und Immunbiologie der Medizinischen Fakultät
der Universität Würzburg).
Aktivierung von Treg mit R73 und JJ319
Die Zellkulturschalen mit 96 Vertiefungen wurden 24 Stunden vor Versuchsbeginn mit einem polyklonalen Antikörper der Firma Dianova, Hamburg,
beschichtet (pro Vertiefung: 50 µl einer 30 µg/ml Stammlösung). Dieser Antikörper stammt aus der Ziege und ist spezifisch für Maus IgG Fcγ. Die frisch
isolierten Treg bzw. CD25neg -Zellen wurden mit den beiden Antikörpern R73 und
JJ319 (jeweils 1 µg für 6x105 T-Lymphozyten) in einem Volumen von 1 ml PBS
für 20 Minuten auf Eis inkubiert.
-8-
Material und Methoden
Aktivierung von Treg mit IL-2 und / oder allogenen DC
Rekombinantes IL-2 (Strathmann Biotech AG, Hamburg) wurde in einer Endkonzentration von 13 ng/ml dem Versuchsansatz zugesetzt. Alternativ wurden
zusätzlich allogene DC aus Milzen von Dark Agouti-Ratten (1x104 DC pro Vertiefung) zugegeben. Die Milz-DC wurden aus der Über-Nacht-Kultur durch Zentrifugation (1.823 xg für 13 Minuten) über 14,5% Metrizamid (Cedarline, Kanada, über Biozol, Eching) angereichert und vor ihrer Verwendung als antigenpräsentierende Zellen mit 20 Gray bestrahlt (Gammastrahler, Institut für
Strahlenkunde der Medizinischen Fakultät der Universität Würzburg).
3.6
Inhibitionsassay
Mit diesem Assay wurde untersucht, ob auch Treg der Ratte die Aktivierung von
CD25neg-Zellen in vitro hemmen. Dies wurde in Abhängigkeit von der eingesetzten Zellzahl an Treg überprüft. Dazu wurden die Zellen in einem Endvolumen
von 150 µl für 72 Stunden bei 37°C und 5% CO2 in Gewebekulturschalen mit 96
Vertiefungen inkubiert. Die aus Parailiacal-, Cervical- und Mesenterial-Lymphknoten isolierten Treg wurden für 48 Stunden mit R73 und JJ319 in Zellkulturschalen vorstimuliert, die mit dem polyklonalen Antikörper goat-anti-mouse IgG
Fcγ (Jackson Immuno Research über Dianova, Hamburg, Bestell-Nr.: 115-005008) beschichtet waren. Erst dann wurden sie zusammen mit den CD25negZellen für 3 Tage im Proliferationsassay inkubiert. Die CD25neg Zellen wurden
ebenfalls mit R73 und JJ319 vorstimuliert; auch hierzu waren die Zellkulturschalen mit dem polyklonalen Antikörper goat-anti-mouse IgG Fcγ beschichtet
(siehe oben). Das Verhältnis von Treg zu CD25neg Zellen betrug 1:1, 1:10 und
1:100. Hierzu wurden je 1x105, 1x104 und 1x103 Treg zu den vorgelegten
CD25neg-Zellen (1x105) zugegeben; das Endvolumen betrug jeweils 150 µl. Um
die Proliferationsrate in Abhängigkeit von der Inkubationszeit zu bestimmen,
wurden sie für 72 Stunden inkubiert und 6 Stunden vor Beendigung des Versuchs mit 0,5 µCi [3H]-Thymidin pro Vertiefung versetzt. Anschließend wurde
die Radioaktivität mit einem Szintillationsgerät gemessen.
-9-
Material und Methoden
3.7
Durchflusszytometrie
Für die durchflusszytometrischen Analysen wurden 5x105 Zellen in 50 µl PBS
mit den in Tabelle 3.1 (Abschnitt 3.2) aufgeführten Antikörpern für 25 Minuten
auf Eis inkubiert und zweimal mit 200 µl PBS gewaschen (6 Minuten, 402 xg,
20°C). Anschließend wurden die Zellpellets mit 300 µl PBS aufgenommen und
der Anteil der Antikörper-positiven Zellen im Durchflusszytometer (FACScan,
Becton-Dickinson GmbH, Heidelberg) auf der Basis von jeweils 10.000 Ereignissen ermittelt. Die Durchflusszytometrie ist eine Methode zur Analyse von
Einzelzellen in Suspension. Sie basiert auf der Messung von verschiedenen
optischen Signalen, wie das von den Zellen verursachte Streulicht und das
durch gebundene, Farbstoff-konjugierte Antikörper ausgelöste Fluoreszenzlicht.
Hierzu passieren die Zellen hintereinander einen Laserstrahl. Das Vorwärtsstreulicht (engl. Forward Light Scatter, FSC) gibt Auskunft über die Größe der
Zellen, während das Seitwärtsstreulicht (engl. Side Light Scatter, SSC) von der
Granularität der Zellen abhängt. Die Möglichkeit, mit einem Durchflusszytometer Fluoreszenzlicht zu messen, erlaubt die Bestimmung einer Vielzahl von
Merkmalen, wie z.B. der Nachweis verschiedenster Oberflächenmoleküle; vorausgesetzt hierfür sind Antikörper erhältlich. Gängige, für die Durchflusszytometrie verwendete Fluoreszenzfarbstoffe sind z.B. Fluoreszeinisothiozyanat
(Grünfluoreszenz, Emissionsmaximum bei 530 nm) oder Phycoerythrin (Rotfluoreszenz, Emissionsmaximum bei 585 nm). Das Streu- und Fluoreszenzlicht
wird von verschiedenen Detektoren aufgefangen und nach Intensität und Farbe
getrennt digital gespeichert. So wird für jede einzelne gemessene Zelle eine
charakteristische Kombination von optischen Eigenschaften aufgezeichnet
(FSC, SSC und bis zu 3 Fluoreszenzsignale).
Die so gewonnenen digitalen Daten wurden mit dem im Internet frei erhältlichen
Programm WinMDI in der Version 2.8 (http://facs.scripps.edu/ software.html)
statistisch und graphisch ausgewertet. Mit Hilfe von Excel 2002 (Microsoft)
wurden mehrere Messreihen statistisch und graphisch aufgearbeitet und dargestellt. Die Streulichtdaten wurden in linearer und die Fluoreszenzdaten in
- 10 -
Material und Methoden
logarithmischer Skalierung dargestellt. Die graphische Auswertung einzelner
Parameter erfolgte in Form von Histogrammen, die von zwei Parametern in x,y-Diagrammen.
3.8
Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion
Die Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (reversed transcriptase
polymerase chain reaction, RT-PCR) dient zur selektiven Anreicherung
bestimmter Sequenzen aus einem Gemisch von mRNA. Hierzu werden zuerst
die mRNA-Moleküle durch das Enzym Reverse Transkriptase in cDNA
umgeschrieben, aus der mit Hilfe einer thermostabilen DNA-Polymerase, z.B.
mit der Taq-Polymerase, die gewünschten Sequenzen spezifisch amplifiziert
werden. Mit Hilfe der RT-PCR kann somit überprüft werden, welche Gene aktiv
sind.
In einem ersten Schritt wurde die RNA von 1x106 Lymphknotenzellen (Treg oder
CD25neg-Zellen) mit 1 ml Trizol (Invitrogen GmbH, Karlsruhe) nach den Angaben des Herstellers extrahiert. Die luftgetrocknete RNA wurde in 40 µl 1 mM
Natriumzitratlösung (Ambion, Texas, USA) gelöst und jeweils 5 µl für die cDNASynthese mit dem GeneAmp RNA-PCR-Kit von Applied Biosystems GmbH,
Weiterstadt, eingesetzt. In einem Endvolumen von 20 µl befanden sich: 1x
PCR-Puffer II (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3); 5 mM MgCl2, dNTP-Gemisch: 1 mM;
RNase-Inhibitor: 1U/µl;
MuLV
Reverse-Transkriptase: 2,5 U;
d(T)16 Oligonukleotide: 2,5 µM (alle Angaben als Endkonzentrationen).
Die anschließende Polymerase-Kettenreaktion wurde mit jeweils 5 µl cDNA in
einem Reaktionsvolumen von 50 µl durchgeführt. Die Endkonzentrationen der
einzelnen Komponenten waren dabei: 1x PCR-Puffer II; 1,5 mM MgCl2; 2 U
AmpliTaq DNA-Polymerase und jeweils 0,5 µM der entsprechenden Primer
(Tab. 3.2).
- 11 -
Material und Methoden
Tab. 3.2: Die Sequenzen der in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide ("primer“) für
Interleukine. Angabe der Produktgröße in Basenpaaren (bp), der Temperatur
(Temp. in °C = "Annealing"-Temperatur des jeweiligen Primerpaares) sowie der
Primer-Orientierung (for = forward; rev = reverse). Die verwendeten Primer basieren
auf publizierten Sequenzen: IL-2, IL-4 IL-10 und IFN-γ (Siegling A et al., 1994);
GAPDH (Kruse JJ et al., 1999) und IL-13 (Giellespie KM et al., 1996).
Primer
bp
Temp.
IL-2
351
62
IL-10
371
55
IL-13
280
55
IFN-γ
419
62
GAPDH
319
62
Sequenz 5´→ 3´
for
GCG CAC CCA CTT CAA GCC CT
rev
CCA CCA CAG TTG CTG GCT CA
for
rev
TCC ATC CGG GGT GAC AAT AAC
for
CAG GGA GCT TAT CGA GGA GC
rev
AAG TTG CTT GGA GTA ATT GAG C
for
CCC TCT CTG GCT GTT ACT GC
rev
CTC CTT TTC CGC TTC CTT AG
for
rev
GGT CGG TGT GAA CGG ATT TG
AAT CAT TCT TCA CCT GCT CC
GTG AGC CCC AGC CTT CTC CAT
Die Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) wurde als PositivKontrolle ("house-keeping" Gen) verwendet. Die Amplifikate wurden in einem
2%-igen Agarosegel mit 5 µg Ethidiumbromid pro Gramm Agarose (von Sigma
und die Agarose von Amresco über MoBiTec GmbH Göttingen) elektrophoretisch separiert und anschließend unter UV-Licht mit dem ImageMaster UDS
(Pharmacia Biotech) begutachtet und fotografiert. Sämtliche Primer wurden von
MWG Biotech AG, Ebersberg, synthetisiert.
- 12 -
Material und Methoden
Tab. 3.3: Die Sequenzen der in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide ("primer“). Angabe
der Produktgröße in Basenpaaren (bp), der Temperatur (Temp. in °C = "Annealing"Temperatur des jeweiligen Primerpaares) sowie der Primer-Orientierung: for =
forward; rev = reverse. Die Primer für MHC-Klasse-II Moleküle vom Haplotyp RT1
sind publiziert (Syha-Jedeljauser J et al. Biochim Biophys Acta 1991; 1089: 414-416),
die Primer für CD80 und CD86 wurden, basierend auf publizierten Sequenzen in
PubMed (CD80: NM_012926; CD86: NM_020081), mit dem Programm "Oligo
TM
Perfect Designer" (www.invitrogen.com) konstruiert.
Primer
bp
Temp.
MHC-II
517
55
CD80
517
50
CD86
518
53
3.9
Sequenz 5´→ 3´
for
rev
AGC TGT GGT TGT GCT GA
for
TGG TGA AAC ACC TGA CCA
rev
GTT TCT CTG CTT GCC TCA
for
TGG GAA ACA GAG CTC TCA
rev
AGG TTG ATC GAC TCG TCA
CAG GAT CTG GAA GGT CCA
Cytokin-Nachweis im ELISA
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) ist ein weit verbreitetes Analyseverfahren zum Nachweis von Proteinen. Der ELISA-Test basiert auf der Antikörper-Antigen-Reaktion. Zum Nachweis eines bestimmten Proteins sind zwei
dazu passende Antikörper notwendig (Sandwich-ELISA): der an die ELISAPlatte fixierte Antikörper, der das Antigen bindet und verhindert, dass dieses
zusammen mit den nicht-gebundenen Antigenen herausgewaschen wird. In
einem zweiten Schritt wird ein Biotin-konjugierter Antikörper und anschliessend
Streptavidin-Peroxidase hinzugegeben. Der durch die Enzymaktivität ausgelöste Farbniederschlag ist proportional zur Menge an gebundenem Antigen. Die
Kulturüberstände von nicht-stimulierten und in vitro stimulierten Treg sowie
CD25neg-Zellen (jeweils 1x105 Zellen in 150 µl RPMI-1640 Medium) wurden
nach 24, 48 und 72 Stunden gesammelt und auf die Anwesenheit von IL-2 und
IL-10 überprüft. Verwendet wurden BioSource ELISA-Kits (BioSource International, Kalifornien, USA): IL-2 (Katalog-Nr.: IKRC0022) und L-10 (Katalog-Nr.:
KRC0102). Die Farbintensität wurde als optische Dichte (OD) bei 450 nm mit
einem ELISA-Reader (Dynatech Microplate Reader MRX) gemessen.
- 13 -
Ergebnisse
4.
Ergebnisse
4. 1
Nachweis von Treg in lymphatischen Organen
Treg wandern nach ihrer Entstehung im Thymus in die Peripherie aus. Um zu
klären, ob sie bevorzugt in bestimmte lymphatische Organe auswandern, wurde
ihr Anteil in Milz sowie Mesenterial-, Cervical- und Parailiacal-Lymphknoten in
8-10 Wochen alten Lewis-Ratten bestimmt. Hierzu wurden die Zellen mit dem
anti-CD4-Antikörper W3/25 und dem anti-CD25-Antikörper Ox 39 markiert, um
ihren prozentualen Anteil an den Lymphozyten durchflusszytometrisch zu ermitteln.
Abb. 4.1 zeigt die Verteilung von Lymphknotenzellen im FSC/SSC-Diagramm
(Abschnitt 3.7). Hier werden sie nach Zellgröße (FSC) und Granularität (SSC)
sortiert. Bei der Datenauswertung wurden ausschließlich Zellen der Region R1
berücksichtigt (ausgenommen Abb. 4.15 und 4.21). Bei dieser Population handelte es sich um CD45 (Ox1) positive Lymphozyten (siehe auch Abb. 4.8), die
zudem Annexin-negativ und somit lebend waren. Wie Abb. 4.3 zeigt, waren in
Region R1 mit 6,5% kaum Annexin-positive Zellen zu finden. In der Population
R2 hingegen waren die in Apoptose befindlichen, Annexin-positiven Zellen mit
98,5% lokalisiert (ebenfalls Abb. 4.3). Die Abb. 4.1 bis 4.3 zeigen repräsentative
Diagramme zur Größenverteilung von Lymphozyten, zur Vitalität der isolierten
Zellen und welchen Anteil Treg an der Lymphozytenpopulation in cervikalen
Lymphknoten (CLK) haben. Hierfür wurden jeweils fünf Lewis-Ratten untersucht
(s. auch Tab. 4.1).
- 14 -
102
53,5 4,6
R1
40,4 1,5
100
R2
101
SSC
W3/25 PE (CD4)
103
255
104
Ergebnisse
100
0
0
255
101
256
0
10 0
10 1
10 2
10 3
R2
98,5%
Events
6,5%
10 4
104
Abb. 4.2:
pos
pos
CD25
im oberen
Anteil der Treg (= CD4
rechten Quadranten) an den cervicalen
Lymphknotenzellen einer Lewis-Ratte. Repräsentative durchflusszytometrische Analyse
(untersucht wurden 5 Tiere).
0
Events
256
R1
103
OX 39 FITC (CD25)
FSC
Abb. 4.1:
Cervicale Lymphknotenzellen einer LewisRatte in einem repräsentativen FSC/SSCDiagramm (untersucht wurden 5 Tiere).
102
10 0
10 1
10 2
10 3
10 4
ANNEXIN V
ANNEXIN V
Abb. 4.3:
Nachweis apoptotischer Zellen in den Regionen R1 und R2 (siehe Abb. 4.1). Lebende Zellen
aus der Region R1 sind kaum Annexin V positiv, während alle Zellen aus der Region R2
Annexin V positiv und damit apoptotisch sind. Repräsentative Darstellung aus 5 untersuchten
Lewis-Ratten.
Aus einer Lewis-Ratte wurden in der Regel 8-12 mesenteriale, 2-3 parailiacale
und 4 cervicale Lymphknoten entnommen. Der Anteil der Treg an den Lymphozyten lag dabei zwischen 4 und 5%. In den parailiacalen Lymphknoten waren
- 15 -
Ergebnisse
sie mit 6% am stärksten vertreten. Auch in Milz und Thymus wurden CD25pos-TLymphozyten nachgewiesen (Tab. 4.1). Ihr Anteil an den Milzleukozyten lag
ebenfalls zwischen 4 und 5%, während sie im Thymus mit nur 1,3% vertreten
waren.
Tab. 4.1: Prozentuale Verteilung der Treg in verschiedenen lymphatischen Organen von 5 LewisRatten. MLK = mesenteriale Lymphknoten, PLK = popliteale Lymphknoten, CLK =
cervicale Lymphknoten
% OX 39 / W3/25 doppelt-positive Zellen in R1 (siehe Abb. 4.1)
Organ
Maximum
Minimum
Mittelwert
MLK
4,6
4,5
4,6
PLK
6,6
5,5
6,1
CLK
4,8
4,2
4,5
Milz
5,0
4,0
4,5
Thymus
1,7
0,9
1,3
4. 2 Isolierung und Reinheit von Treg
Da in allen untersuchten Lymphknoten und der Milz Treg deutlich nachzuweisen
waren (Tab. 4.1), wurden sie in einem nächsten Schritt mit dem anti-CD25Antikörper NDS61 und paramagnetischen Mikropartikeln (sog. „Dynabeads“)
isoliert. Hierzu wurden die unterschiedlichen Lymphknoten „gepoolt“ und die
Reinheit der isolierten Treg anschließend durchflusszytometrisch überprüft (Abb.
4.4). Für die Isolierung aus den Lymphknoten wurden Reinheiten von bis zu
94,3% (Min.: 87,4%; Max.: 94,3%; n=22) erzielt, während Treg aus Milzen mit
einer Reinheit von 65-79% (n=9) isoliert wurden (Abb. 4.5). Treg-Präparationen
aus Milzen waren dabei mit einem höheren Anteil an W3/25neg, CD25pos Zellen
(vermutlich CD8+ T-Lymphozyten) verunreinigt. Aus diesem Grund konzentrierten sich die Untersuchungen in dieser Arbeit auf die Treg aus den Lymphknoten.
- 16 -
W3/25 PE (CD4)
101
102
103
103
102
101
W3/25 PE (CD4)
104
104
Ergebnisse
1,9 89,2
2,7 78,2
2,7 6,3
100
100
6,8 12,3
100
101
102
103
OX 39 FITC (CD25)
104
Abb. 4.4:
pos
Aufgereinigte CD25 aus "gepoolten“
Lymphknotenzellen.
Repräsentative
Darstellung aus 11 Aufreinigungen von
22 Lewis-Ratten.
100
101
102
103
OX 39 FITC (CD25)
104
Abb. 4.5:
pos
Aufgereinigte CD25
der Milz. Repräsentative Darstellung aus 9 Aufreinigungen von 9 Lewis-Ratten.
Mit der hier verwendeten Methode gelang es in der Regel, solche Treg zu
isolieren, die in der Durchflusszytometrie stark CD25-positiv waren (Bereich G2
in Abb. 4.6 u. 4.7). Ob die Zellen im Bereich G1 ebenfalls CD25-positiv waren,
konnte nicht festgestellt werden. Tatsache ist, dass sie mit der hier
durchgeführten Isolierungsmethode jedenfalls nicht angereichert wurden (Abb.
100
10 2
10 3
Ox39 FITC (CD25)
10 4
Abb. 4.6:
Treg vor ihrer Aufreinigung.
G1: CD25 „intermediate“ Population
G2: CD25 stark positive Population
Repräsentative Darstellung aus 11
Aufreinigungen.
G1
G2
101
10 2
10 3
10 4
101
100
W3/25 PE (CD4)
10 3
G2
10 2
G1
101
10 0
W3/25 PE (CD4)
10 4
4.7).
100
101
102
103
104
Ox39 FITC (CD25)
Abb. 4.7:
Treg nach ihrer Aufreinigung.
Ausschließlich die CD25 stark
positiven Treg aus G2 wurden isoliert.
Repräsentative Darstellung aus 11
Aufreinigungen.
- 17 -
Ergebnisse
4. 3
Der Phänotyp aufgereinigter Treg
Die Charakterisierung der isolierten Treg mit monoklonalen Antikörpern ergab
folgenden Phänotyp (Abb. 4.8 A): Sie sind positiv für CD45 (Ox 1) und den α,β
T-Zellrezeptor (R73), zum Teil positiv für CD134 (Ox 40: 36,2%) sowie CD90
(Ox 7: 12%) und negativ für den Antikörper Ox6 (2,9%). Bei den Treg handelt es
sich, erkennbar an der Expression der IL-2-Rezeptor-α-Kette (Abb. 4.4 - 4.7),
um aktivierte T-Lymphozyten. Wie auch "konventionelle" T-Lymphozyten der
Ratte nach ihrer Aktivierung MHC-Klasse-II Moleküle auf ihrer Zelloberfläche
exprimieren (*), waren die isolierten CD25-positiven Treg erst nach ihrer in vitro
Stimulierung MHC-Klasse-II positiv. Im Gegensatz zu den nicht-stimulierten Treg
war nun auch die entsprechende mRNA nachzuweisen (Abb. 4.8B).
% positive Zellen
100
80
60
40
20
0
R 73
Ox 1
Ox 40
Ox 7
Ox 6
Abb. 4.8 A:
Repräsentative Darstellung zum
Phänotyp von Treg aus Lymphknoten der Lewis-Ratte (n=5).
Auf der Abszissenachse sind
die Bezeichnungen der verwendeten Antikörper, auf der Ordinate der prozentuale Anteil
positiver Zellen in R1 angegeben (siehe hierzu auch Tab.
3.1).
Zusätzlich wurde die mRNA für CD80 und CD86 in stimulierten Treg (Abb. 4.8 B)
M
D
86
C
D
80
C
II
C
H
M
G
AP
M
Abb. 4.8 B:
Qualitativer Nachweis unterschiedlicher
PCR-Amplifikate (RT-PCR) in nichtstimulierten (A) und stimulierten (B) Treg.
6
Zur Stimulierung wurden 1x10 Zellen mit
den Antikörpern R73 und JJ319 für 48
Stunden inkubiert. Nicht-stimulierte Treg
wurden direkt nach ihrer Isolierung für die
RT-PCR aufgearbeitet. Repräsentative
Darstellung aus 3 unterschiedlichen Isolierungen. M = 100-Basenpaar-DNA-Leiter.
Zu den Größen der Amplifikate siehe Tab.
3.3.
D
H
als auch in konventionellen T-Lymphozyten nachgewiesen (*).
A
B
* André Heeg: "Immunbiologie der Transplantatabstoßung: Charakterisierung alloreaktiver MHC-Klasse-II-positiver T-Lymphozyten",
Inaugural-Dissertation der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg (in Fertigstellung).
- 18 -
Ergebnisse
Treg wurden ebenfalls auf das Vorhandensein von CD45RC (Ox22) untersucht,
einem weiteren Oberflächenmarker, der auch von regulatorischen T-Lymphozyten exprimiert wird. Sowohl naive als auch ruhende T-Lymphozyten haben die
hochmolekulare Isoform von CD45R, die bei der Ratte als CD45RC bezeichnet
wird (Bell EB et al., 1998). Diese wird vom Antikörper Ox22 erkannt und nach
der Stärke der Fluoreszenz, die durch die Bindung des Fluoreszenz-markierten
Antikörpers im Histogramm zustande kommt, als CD45RChigh bezeichnet (Abb.
4.9). Effektor und Gedächtnis (memory) T-Lymphozyten exprimieren hingegen
nicht diese Isoform, weshalb sie, da der Antikörper Ox22 auf diesen Zellen nicht
bindet, ihrer Lage im Histogramm entsprechend als CD45RClow bezeichnet
werden (Abb. 4.10). Die Versuche hierzu (Abb. 4.9 bis 4.12) wurden mit Zellen
256
256
aus jeweils drei unterschiedlichen Lewis-Ratten durchgeführt.
CD45RChigh
CD45RClow
CD45RC
90,2 %
low
Events
Events
85,2 %
0
0
*
10 0
10 1
10 2
10 3
10 0
10 4
Abb. 4.9:
Der CD45R-Phänotyp nicht-aktivierter
neg
CD25 . Repräsentative Darstellung
aus 3 Experimenten.
10 1
10 2
10 3
10 4
OX22 FITC (CD45 RC)
OX22 FITC (CD45 RC)
Abb. 4.10:
Der
CD45R-Phänotyp
aktivierter
neg
48 Stunden nach in vitro
CD25
Stimulation mit R73 und JJ319. Repräsentative Darstellung aus 3 Experimenten. Ein sehr geringer Anteil der
high
Zellen ist auch weiterhin CD45RC
(*).
Auch für frisch isolierte Treg wurde der CD45RClow-Phänotyp bestätigt (Abb.
4.11). In der Stärke ihrer CD45RC-Expression unterschieden sich frisch isolierte
Treg nicht von den in vitro restimulierten (Abb. 4.11 und 4.12).
- 19 -
256
256
Ergebnisse
CD45RC
low
low
10 0
0
0
Events
Events
CD45RC
10 1
10 2
10 3
10 4
10 0
Ox22 FITC (CD45 RC)
10 1
10 2
10 3
10 4
OX 22 FITC (CD45 RC)
Abb. 4.11:
Der CD45R-Phänotyp nicht-aktivierter
Treg. Repräsentative Darstellung aus 3
Experimenten.
Abb. 4.12:
Der CD45R-Phänotyp aktivierter Treg 48
Stunden nach in vitro Stimulation mit
R73 und JJ319. Repräsentative Darstellung aus 3 Experimenten.
Um zu zeigen, dass sich sowohl frisch isolierte als auch stimulierte Treg, im
Gegensatz zu nicht-aktivierten und aktivierten CD25neg, nicht in ihrer CD45RCExpression unterscheiden, wurden die Histogramme der Abb. 4.9 u. 4.10 sowie
256
256
4.11 u. 4.12 übereinander gelegt (Abb. 4.13 und 4.14).
CD45RC
10 1
10 2
10 3
10 4
10 0
OX22 FITC (CD45 RC)
Abb. 4.13:
Die Expression von CD45RC nichtneg
stimulierter Treg und CD25 :
neg
CD25 : ausgefülltes Histogramm
Treg
: transparentes Histogramm
Repräsentative Darstellung aus 3
Experimenten.
low
0
10 0
CD45RC
Events
low
0
Events
CD45RC
high
10 1
10 2
10 3
10 4
OX22 FITC (CD45 RC)
Abb. 4.14:
Die Expression von CD45RC stimulierter
neg
Treg und CD25 nach 48 Stunden:
neg
CD25 : ausgefülltes Histogramm
Treg
: transparentes Histogramm
Repräsentative Darstellung aus 3
Experimenten.
- 20 -
Ergebnisse
4. 4
In vitro Kultivierung von Treg
Zur Bestimmung der regulatorischen Funktion von Treg (Kap. 4.7) war es wichtig
zu überprüfen, für welchen Zeitraum sie in Kultur zu halten sind. Hierzu wurden
die Zellen direkt nach ihrer Isolierung und nach 24, 48 sowie 72 Stunden
Kulturdauer durchflusszytometrisch analysiert. Im Zeitverlauf wurde der prozentuale Anteil der Zellen der Region R1 (vitale Zellen) und der Region R2 (tote
Zellen) im FSC/SSC-Diagramm bestimmt. Dieses Verfahren ist in Abbildung
4.15 für nicht-stimulierte Treg exemplarisch dargestellt. Parallel dazu wurde auch
nach Isolierung
SStSt d
R2
R2
255
72 Stunden
R2
R1 = 41,2%
R2 = 58,8%
255
R1 = 26,9%
R2 = 73,1%
R1
0
R1
0
R1
0
255
255
48 Stunden
0
R1 = 54,9%
R2 = 45,1%
0
0
R1
R2
24 Stunden
R1 = 90,2%
R2 = 9,8%
0
255
SSC
255
255
die Lebensdauer von CD25neg Zellen bestimmt (Abb. 4.17).
0
255
FSC
Abb. 4.15:
In vitro Kultivierung isolierter, nicht aktivierter Treg. Dargestellt ist die Abnahme vitaler Zellen in
R1 nach 24, 48 und 72 Stunden Kulturdauer im Vergleich zu frisch isolierten Zellen. Im gleichen
Zeitraum nahm der Anteil toter Zellen in R2 stark zu. Repräsentative Darstellung aus fünf
Isolierungen.
- 21 -
Ergebnisse
Bereits nach 24 Stunden verringerte sich der Anteil vitaler Treg in der Region R1
von 90,2 auf 54,9%. Nach 48 Stunden waren noch 41,2% und nach 72 Stunden
nur noch 26,9% am Leben (Abb. 4.16). Bei den CD25neg-T-Lymphozyten war
die Abnahme der vitalen Zellen wesentlich langsamer. So waren nach 72
Stunden noch 55,6% der Zellen vital (Abb. 4.17).
100
100
% Zellen in R1
% Zellen in R1
80
60
40
20
80
60
40
20
0
0
0
24
48
0
72
24
48
72
Inkubationsdauer (Stunden)
Inkubationsdauer (Stunden)
Abb. 4.16:
In vitro Kultivierung isolierter, nicht aktivierter Treg. Dargestellt ist die Abnahme vitaler Zellen in R1. Die zugrunde liegenden
Daten wurden nach der in Abb. 4.15
exemplarisch dargestellten Auswertung erhoben und basieren auf den Ergebnissen
von zwei unterschiedlichen Kultivierungsansätzen.
Abb. 4.16:
In vitro Kultivierung isoliert
Treg. Dargestellt ist die
Zellen in R1. Die zugrunde
wurden nach der in Abb. 4
dargestellten Auswertung
basieren auf den Ergeb
unterschiedlichen Kultivieru
Durch die Stimulierung der Treg mit den beiden Antikörpern R73 und JJ319
wurde die Abnahme der lebenden Zellen deutlich verlangsamt. So waren nach
72 stündiger Kultivierung noch 70,8% der Zellen vital (Abb. 4.18). Diese
Vitalisierung der Zellpopulation beruhte darauf, dass die aktivierten Zellen proliferierten und sich somit der Anteil lebender Zellen stabilisierte (siehe Kap. 4.4).
Auch für die CD25neg-Population war die Stimulierung zum Erhalt der Vitalität
wichtig: So waren nach 48 Stunden noch 74,6% der Zellen lebend (Abb. 4.19),
doch sank ihr Anteil bereits nach 72 Stunden auf 40,5% und war damit deutlich
unter dem zu diesem Zeitpunkt für Treg ermittelten Wert von 70%.
- 22 -
Ergebnisse
80
80
% Zellen in R1
100
% Zellen in R1
100
60
40
20
0
60
40
20
0
0
24
48
72
0
Inkubationsdauer (Stunden)
24
48
72
Inkubationsdauer (Stunden)
Abb. 4.18:
In vitro Kultivierung isolierter, aktivierter Treg.
Dargestellt ist die Abnahme vitaler Zellen in
R1. Die Stimulierung wurde mit R73 und
JJ319 durchgeführt. Die zugrunde liegenden
Daten wurden nach der in Abb. 4.15
exemplarisch dargestellten Auswertung erhoben und basieren auf den Ergebnissen
von zwei Kultivierungsansätzen.
Abb. 4.19:
In vitro Kultivierung isolierter, aktivierter
neg
CD25 . Dargestellt ist die Abnahme vitaler
Zellen in R1. Die Stimulierung wurde mit R73
und JJ319 durchgeführt. Die zugrunde
liegenden Daten wurden nach der in Abb. 4.15
exemplarisch dargestellten Auswertung erhoben und basieren auf den Ergebnissen von
zwei Kultivierungsansätzen.
Zur Klärung der Frage, ob Interleukin-2 das Überleben der Treg maßgeblich
beeinflusste, wurden die frisch isolierten Zellen mit Interleukin-2 in einer
Endkonzentration von 13 ng/ml inkubiert. Nach 24 Stunden waren noch 77,3%
der Treg vital, nach 72 Stunden noch 51,7% (Abb. 4.20). Somit verzögerte
sowohl die Stimulierung mit den beiden Antikörpern R73 und JJ319 (Abb. 4.18)
als auch mit Interleukin-2 das Absterben der Treg in Kultur.
Abb. 4.20:
In vitro Kultivierung isolierter, aktivierter Treg.
Dargestellt ist die Abnahme vitaler Zellen in
R1. Die Stimulierung wurde mit IL-2 (13
ng/ml) durchgeführt. Die dieser Darstellung
zugrunde liegenden Daten wurden nach der
in Abb. 4.15 exemplarisch dargestellten
Auswertung erhoben und basieren auf den
Ergebnissen von zwei Kultivierungsansätzen.
% Zellen in R1
100
80
60
40
20
0
0
24
72
Inkubationsdauer (Stunden)
- 23 -
Ergebnisse
4. 5
Aktivierung von Treg: Durchflusszytometrische Analyse
Bereits 24 Stunden nach Stimulation war bei ca. 10% der Treg eine deutliche
Zunahme der Zellgröße zu erkennen (Abb. 4.21). Diese T-Zellblasten wurden
als FSCbright bezeichnet. Ihr Anteil erhöhte sich nach 48 Stunden auf 61,3% und
nach 72 Stunden auf 66,2%. Es ist davon auszugehen, dass die Zunahme der
Zellgröße mit der Aktivierung und Proliferation der Zellen korreliert. In Kapitel
255
255
4.6 werden die Ergebnisse hierzu präsentiert.
Nach Isolierung
24 Stunden
10,3%
0
0
6,5%
0
255
255
255
255
0
SSC
48 Stunden
72 Stunden
*
0
255
66,2%
0
0
61,3%
0
255
FSC
Abb. 4.21:
In vitro Kultivierung isolierter, aktivierter Treg. Dargestellt ist die Zunahme der Zellgröße (FSC)
nach Stimulierung mit den beiden Antikörpern R73 und JJ319. Auch der Anteil toter Zellen
nimmt zu (*). Repräsentative Darstellung aus fünf unterschiedlichen Kultivierungsansätzen.
- 24 -
Ergebnisse
Wie Abb. 4.21 zeigt, war nicht bei allen Treg eine Größenzunahme nach Stimulierung mit R73 und JJ319 festzustellen. Um dies zu verdeutlichen, wurde ihre
Zellgröße gegen ihre CD25-Expression aufgetragen (Abb. 4.22). Zwischen 6 bis
11,5% (n=22) der frisch isolierten Treg waren bereits FSCbright. Nach 24 Stunden
Stimulation erhöhte sich ihr Anteil auf 20,5%. Nach 48 Stunden waren eindeutig
zwei Treg-Populationen unterscheidbar, wobei die Gruppe der FSCbright mit
63,7% deutlich dominierte. Dieses Phänomen war auch nach 72 Stunden zu
104
104
beobachten.
102
101
101
102
103
24 Stunden
103
Nach Isolierung
0
255
79,5%
20,5%
0
255
104
104
Ox39
11,7%
100
100
88,3%
48 Stunden
101
101
102
102
103
103
72 Stunden
0
63,7%
35,2%
100
100
36,3%
255
0
64,8%
255
FSC
Abb. 4.22:
bright
Zellen innerhalb der
In vitro Kultivierung aktivierter Treg. Dargestellt ist die Zunahme der FSC
Treg Population nach Stimulierung mit den beiden Antikörpern R73 und JJ319. Repräsentative
Darstellung aus fünf unterschiedlichen Kultivierungsansätzen. Im Gegensatz zu Abb. 4.21 sind
hier die toten Zellen nicht dargestellt.
- 25 -
Ergebnisse
Auch die Inkubation mit allogenen dendritischen Zellen führte zur Aktivierung
von Treg. Hierbei kam es ebenfalls zu einer Zunahme der FSCbright-Zellen. Die
verwendeten dendritischen Zellen wurden aus Milzen von Dark-Agouti-Ratten
(DA, RT1avl) isoliert. Dabei wurden 1x104 dendritische Zellen mit 1x105 Treg
inkubiert. Parallel dazu wurde in einem weiteren Ansatz IL-2 in einer Endkonzentration von 13 ng/ml zugesetzt. Nach 24, 48 und 72 Stunden wurden die
Zellen durchflusszytometrisch analysiert, wie in Abb. 4.21 exemplarisch gezeigt,
und die prozentuale Zunahme der FSCbright-Zellen graphisch dargestellt (Abb.
4.23). Durch die Inkubation mit dendritischen Zellen verdoppelte sich die Zahl
der FSCbright-Zellen innerhalb von 24 Stunden auf 8,9%. Nach 72 Stunden
verdoppelte sich der Anteil auf 16,4%. Die Kombination aus allogenen dendritischen Zellen und exogener Gabe von Interleukin-2 führte dazu, dass sich der
Anteil der FSCbright-Zellen weiter erhöhte: Nach 72 Stunden waren 31,5% der
Treg FSCbright (Abb. 4.24).
40
30
Prozent
vergrößerte
Zellen
plus DC
20
plus DC und IL-2
10
0
0
24
48
72
Inkubationsdauer (Stunden)
Abb. 4.23:
In vitro Kultivierung isolierter, aktivierter Treg. Dargestellt ist die
bright
prozentuale Zunahme der vergrößerten oder FCS
Zellen (siehe
hierzu Abb. 4.22) nach Stimulierung mit allogenen dendritischen Zellen
(DC) bzw. in Kombination mit IL-2 in einer Konzentration von 13 ng/ml.
Hierbei handelt es sich um die Auswertung eines Versuchs. Die dieser
Darstellung zugrunde liegenden Daten wurden nach der in Abb. 4.22
exemplarisch dargestellten durchflusszytometrischen Auswertung
erhoben.
- 26 -
Ergebnisse
Bei den CD25neg war der Unterschied zwischen den Versuchansätzen mit
dendritischen Zellen und zusätzlicher IL-2-Gabe wesentlich geringer (Abb.
4.24). Dies zeigte sich besonders deutlich nach 72 Stunden. Hier führte die
Inkubation mit dendritischen Zellen zur Ausbildung von 25,3% FSCbright-Zellen;
im Vergleich dazu waren im kombinierten Ansatz nur 27,7% FSCbright-Zellen zu
finden.
40
30
Prozent
vergrößerte
Zellen
plus DC
20
plus DC und IL-2
10
0
0
24
48
72
Inkubationsdauer (Stunden)
Abb. 4.24:
neg
In vitro Kultivierung isolierter, aktivierter CD25 . Dargestellt ist die
Zunahme der Zellgröße (FSC) nach Stimulierung mit allogenen
dendritischen Zellen (DC) bzw. in Kombination mit IL-2 (13 ng/ml).
Hierbei handelt es sich um die Auswertung eines Versuchs. Die dieser
Darstellung zugrunde liegenden Daten wurden nach der in Abb. 4.22
exemplarisch dargestellten Auswertung erhoben.
4. 6
Aktivierung von Treg: Bestimmung der Proliferation
Um zu zeigen, dass die in der Durchflusszytometrie nachgewiesene Größenzunahme auf der Aktivierung von T-Lymphozyten beruhte, wurden die
stimulierten Treg mit [3H]-Thymidin gepulst und die Radioaktivität gemessen
(Abschnitt 3.5). Dabei korrelierte der Anteil von in die DNA eingebautem [3H]Thymidin, gemessen als radioaktive Zerfälle pro Minute ("counts per minute"
bzw. Cpm), mit der Proliferation der stimulierten Treg. Mit der Zunahme an
FSCbright-Zellen während der Stimulierung (Abb. 4.22) war auch ein kontinuierlicher Anstieg der Proliferation zu messen (Abb. 4.25).
- 27 -
Ergebnisse
20000
Cpm
15000
10000
5000
0
24
48
72
Inkuba tionsdaue r (Stunde n)
Abb. 4.25:
In vitro Kultivierung aktivierter Treg. Dargestellt ist die Zunahme der
Proliferation (gemessen als Cpm) nach Stimulierung mit R73 und
JJ319. Repräsentative Darstellung aus drei unterschiedlichen
Experimenten (siehe auch Abb. 4.22).
Auch die Stimulierung der CD25neg T-Lymphozyten führte zu einem Einbau von
radioaktiv markiertem Thymidin (Abb. 4.26). Hier war das Maximum der
Proliferation nach 48 Stunden festzustellen.
25000
Cpm
20000
15000
10000
5000
0
24
48
72
Inkuba tionsdaue r (Stunde n)
Abb. 4.26:
neg
In vitro Kultivierung aktivierter CD25 . Dargestellt ist die Zunahme
der Proliferation (gemessen als Cpm) nach Stimulierung mit R73 und
JJ319. Repräsentative Darstellung aus drei unterschiedlichen
Experimenten.
- 28 -
Ergebnisse
4. 7
Aktivierung von Treg: Nachweis von Cytokinen
Da die Bedeutung bestimmter Cytokine für die durch Treg vermittelte Hemmung
nach wie vor nicht vollständig geklärt ist, wurde in dieser Arbeit untersucht, ob
Treg der Ratte Interleukin-2 und Interleukin-10 in vitro sezernieren. Hierzu
wurden nach 24, 48 und 72 Stunden die Zellkulturüberstände abgenommen und
im ELISA gemessen. An allen drei Messzeitpunkten lag die IL-2-Sekretion für
die aktivierten Treg zwischen 347 und 402 pg/ml (Abb. 4.27). Für das immunregulatorische Cytokin IL-10 wurden Konzentrationen zwischen 405 und
1.213,2 pg/ml gemessen. Hingegen sezernierten nicht-stimulierte Treg weder
Interleukin-2 noch Interleukin-10 (Abb. 4.27).
Im Gegensatz zu den Treg produzierten aktivierte CD25neg Interleukin-2 in
Konzentrationen zwischen 699,8 und 785,5 pg/ml. Nach 72 Stunden Inkubation
verringerte sich dieser Wert auf 502,8 pg/ml (Abb. 4.28). Dieses Ergebnis
korreliert mit den Untersuchungen zur Proliferation (siehe hierzu Abb. 4.26): In
beiden Fällen lag das Maximum am zweiten Tag der Kultivierung. Die Werte für
Interleukin-10 lagen zwischen 308 und 419 pg/ml.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Treg nach Stimulierung hohe
Konzentrationen des inhibitorischen Cytokins IL-10 sezernieren. Auch die
Produktion des Wachstumsfaktors IL-2 wird durch die Stimulierung induziert.
- 29 -
IL-2
48 Stunden
72 Stunden
1000
1000
1000
800
800
800
600
600
600
400
400
400
200
200
200
0
0
stimuliert
nicht stimuliert
0
stimuliert
nicht stimuliert
nicht stimuliert
stimuliert
nicht stimuliert
- 30 -
stimuliert
IL-10
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
stimuliert
nicht stimuliert
stimuliert
nicht stimuliert
Abb. 4.27:
5
In vitro Kultivierung stimulierter und nicht-stimulierter Treg. Gemessen wurde ihre Produktion von IL-2 und IL-10 (in pg/ml für 1x10 Zellen) im
Zellkulturüberstand mit spezifischem ELISA (BioSource Cytoscreen). Repräsentative Darstellung zweier unterschiedlicher Experimente. Die
Sensitivität beider ELISA liegt laut Hersteller bei 5 pg/ml.
Ergebnisse
24 Stunden
IL-2
48 Stunden
72 Stunden
1000
1000
1000
800
800
800
600
600
600
400
400
400
200
200
200
0
0
0
stimuliert
nicht stimuliert
stimuliert
nicht stimuliert
nicht stimuliert
stimuliert
nicht stimuliert
- 31 -
stimuliert
IL-10
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
stimuliert
nicht stimuliert
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
stimuliert
nicht stimuliert
Abb. 4.28:
neg
5
In vitro Kultivierung aktivierter und nicht-aktivierter CD25 . Gemessen wurde ihre Produktion von IL-2 und IL-10 (in pg/ml für 1x10 Zellen) im Zellkulturüberstand mit spezifischem ELISA (BioSource Cytoscreen). Repräsentative Darstellung zweier unterschiedlicher Experimente.
Ergebnisse
24 Stunden
Ergebnisse
Auch die Präsenz cytokinspezifischer mRNA wurde für Treg nach 48 Stunden
überprüft (Abb. 4.29 und Tab. 4.2). Bereits in frisch isolierten, nicht-stimulierten
Treg wurde mRNA für Interleukin-2 und Interleukin-10 nachgewiesen. Nach einer
48-stündigen Stimulierung wurde die mRNA für weitere Cytokine, wie IFN-γ und
Interleukin-13, gefunden.
M
G
DH
P
A IL-2
3
0
-γ
N
-1 L-1
I
IL
IF
M
nicht-stimuliert
G
DH
P
A IL-2
γ
3
0
N- L-1 L-1
F
I
I
I
stimuliert
Abb. 4.29:
Qualitativer Nachweis verschiedener Cytokin mRNA (RT-PCR) nicht-stimulierter und
6
6
stimulierter Treg. Zwischen 0,6x10 und 1x10 Zellen wurden mit den Antikörpern R73 und JJ319
für 48 Stunden stimuliert. Repräsentative Darstellung von 6 (für nicht-stimulierte Treg) bzw. 7 (für
stimulierte Treg) unterschiedlichen Isolierungen. M = 100-Basenpaar-DNA-Leiter. Zu den
Größen der Amplifikate siehe Tab. 3.2, Seite 12.
Tab. 4.2: Übersicht über die Anzahl positiver Ergebnisse beim qualitativen Nachweis
verschiedener Cytokin-mRNA (RT-PCR) von nicht-stimulierten und stimulierten Treg
(s. auch Abb. 4.29). Anmerkung: In allen Treg wurde mRNA für FoxP3 und FasL
nachgewiesen (s. Anhang).
Nachweis von
Anzahl erfolgreicher Nachweise
nicht-stimulierte Treg
stimulierte Treg
IL-2
5 von 6
7 von 7
IL-10
6 von 6
7 von 7
IFN-γγ
3 von 6
6 von 7
IL-13
1 von 6
4 von 7
- 32 -
Ergebnisse
4. 8
Nachweis der regulatorischen Funktion von Treg im Inhibitionsassay
Um nachzuweisen, dass auch Treg der Ratte über regulatorische Eigenschaften
verfügen, wurde überprüft, ob sie in vitro die Aktivierung der CD25neg verhindern
können. Hierzu wurden die Treg für 48 Stunden mit R73 und JJ319 vorstimuliert,
bevor sie im Inhibitionsassay eingesetzt wurden. Dieser Zeitpunkt wurde deshalb gewählt, da sowohl die Proliferation als auch die Produktion von Cytokinen
hier sehr stark war (Kapitel 4.4 und 4.5). Die CD25neg wurden, wie in Kapitel 3.4
beschrieben, zum Zeitpunkt des Inhibitionsassays aus einer Lewis-Ratte isoliert
und mit R73 und JJ319 inkubiert, um sie anschließend in die mit Ziege-antiMaus beschichteten Zellkulturschalen zu überführen (siehe Material und
Methoden). Die aktivierten Treg sollten nun diese polyklonale Aktivierung der
CD25neg hemmen. Es wurden unterschiedliche Verhältnisse von Treg zu CD25neg
ausgetestet (Abb. 4.30).
70000
60000
Cpm
50000
40000
30000
20000
10000
0
Anzahl Treg
neg
Anzahl CD25
_
_
5
5
1x10
5
1x10
5
4
1x10
3
5
5
1x10
2x10
1x10
1x10
1x10
Verhältnis
neg
Treg / CD25
_
_
1:1
1:10
1:100
Cpm
42.179
55.434
3029
10.544
33.909
Abb. 4.30:
Inhibitionsassay zum Nachweis der regulatorischen Funktion von Treg der Ratte. Dargestellt ist
5
neg
die Hemmung der Aktivierung von jeweils 1x 10 CD25 Zellen in Abhängigkeit von der Anzahl
5
3
zugesetzter Treg (von 1x10 bis 1x10 Zellen). Die Mittelwerte und Standardabweichungen einer
Versuchsserie mit jeweils 12 Parallelwerten pro Einzelexperiment sind angegeben.
- 33 -
Ergebnisse
Wie aus Abb. 4.30 ersichtlich, war die Stärke der Proliferationshemmung abhängig vom Verhältnis von Treg zu CD25neg. Bei einem Verhältnis von 1:1 war
eine nahezu vollständige Hemmung der CD25neg-Proliferation zu beobachten
(3.029,7 Cpm zu 42.179 Cpm bei 1x105 CD25neg), während mit abnehmender
Anzahl an Treg die Proliferation der CD25neg T-Lymphozyten anstieg (Abb. 4.30).
Die Stärke der von Treg vermittelten Hemmung schien allgemein davon abhängig zu sein, wie groß der Anteil der FSCbright-Zellen nach der 48-stündigen
Vorstimulierung (Abschnitt 3.6) an der Treg Population war (Abb. 4.31). War ihr
Anteil gering, dann war auch die Hemmung weniger effektiv.
104
CD25neg
50000
103
40000
102
Cpm
30000
20000
101
10000
0
∅
71,4%
1x105
1x104
1x103
100
28,6%
0
255
Treg
104
Ox39
CD25neg
50000
103
40000
Cpm
30000
102
20000
101
10000
0
∅
39,7%
1x105
1x104
1x103
100
65,3%
0
Treg
255
FSC
Abb. 4.31:
bright
Zellen innerhalb der Treg Population (rechter Quadrant im FSC/Ox39
Der Anteil an FSC
Diagramm) scheint ein Maß für die Effektivität der Treg vermittelten Proliferationsinhibition zu
5
neg
bei untersein. Dargestellt ist die Hemmung der Aktivierung von jeweils 1x10 CD25
3
5
schiedlicher Anzahl zugesetzter Treg (von 1x10 bis 1x10 ). ∅ zeigt die ungehemmte Prolifeneg
Zellen. Dargestellt sind Mittelwert und Standardabweichung jeweils einer
ration der CD25
Versuchsserie zu je 12 Parallelwerten pro Einzelexperiment.
- 34 -
Beantwortung der Fragen
5.
Beantwortung der Fragen
1)
CD4+, CD25+ T-Regulatorzellen (Treg) wurden bei Mäusen und
Menschen nachgewiesen. Sind sie auch in der Ratte vorhanden?
In unbehandelten 8 bis 10 Wochen alten Lewis-Ratten wurden Treg in verschiedenen peripheren lymphatischen Organen, wie Lymphknoten, Milz oder
Thymus, nachgewiesen. In den untersuchten Lymphknoten und der Milz lag ihr
prozentualer Anteil an der Lymphozytenpopulation zwischen 4,5 und 6,1%,
während sich im Thymus nur ein geringer Anteil von 1,3% nachweisen ließ.
2)
Lassen sich Treg der Ratte in vitro kultivieren?
Nicht-stimulierte Treg ließen sich nicht in vitro kultivieren. So waren bereits nach
72 Stunden in Kultur noch lediglich 26% der Zellen vital. Durch Stimulierung,
entweder mit Antikörpern, IL-2 oder allogenen dendritischen Zellen, ließ sich
dieses Absterben deutlich verzögern. So führte die 72-stündige Stimulierung mit
den beiden Antikörpern R73 und JJ319 dazu, dass noch 71% der Treg vital
waren.
3)
Humane und murine Treg sezernieren Cytokine mit inhibitorischer
Funktion. Verfügen auch die Treg der Ratte über diese Fähigkeit?
Aktivierte Treg der Ratte produzierten das Cytokin IL-10 (mehr als 1.000 pg/ml
nach 72-stündiger Stimulierung). Dies wurde sowohl im spezifischen ELISA als
auch auf mRNA-Ebene in der RT-PCR gezeigt. Darüber hinaus wurde in diesen
Zellen ebenfalls mRNA für IL-2, IL-13 und IFN-γ nachgewiesen.
- 35 -
Beantwortung der Fragen
4)
Humane und murine Treg weisen einen bestimmten CD45R-Phänotyp
auf; ist dieser Phänotyp auch für die Treg der Ratte nachzuweisen?
Wie die humanen und murinen Treg, so sind auch die die Treg der Ratte
CD45Rlow, was charakteristisch für den Phänotyp aktivierter T-Lymphozyten ist.
In der Ratte wird die Isoform von CD45R als CD45RC bezeichnet. Dass Treg der
Ratte in der Tat negativ für CD45RC sind, wird durch die Lage der mit dem
Antikörper Ox22 markierten Zellen im Histogramm deutlich (Abb. 4.11 u. 4.12),
weshalb sie als CD45RClow bezeichnet werden. Naive CD25neg CD4+-TLymphozyten exprimieren CD45RC (CD45RChigh Zellen), während sie nach
ihrer Aktivierung diese Expression verlieren (CD45RClow Zellen). Hingegen
wurden weder stimulierte noch nicht-stimulierte Treg vom Antikörper Ox22
erkannt; sie waren CD45Rlow. Dies ist somit ein weiterer Hinweis darauf, dass
es sich bei den isolierten Treg der Ratte um aktivierte Zellen handelt.
5)
Sind auch für die Treg der Ratte suppressive Eigenschaften in vitro
nachzuweisen?
Die regulatorische Funktion von Treg der Ratte wurde in einem in vitro
Inhibitionsassay eindeutig nachgewiesen. Hierzu war es jedoch notwendig sie
vorher zu stimulieren. Erst dann konnten sie die Aktivierung von CD25neg-Zellen
hemmen. Die Effizienz der Stimulierung von Treg beeinflusste wesentlich die
Stärke der von ihnen vermittelten Hemmung der Proliferation CD25neg-Zellen
(Abb. 4.31).
- 36 -
Diskussion
6.
Diskussion
Die selektive Hemmung der Transplantatabstoßung ohne dabei die lebenswichtige Immunabwehr massiv zu beeinträchtigen, ist das große Ziel der
Transplantationsforschung (Matthews JB et al., 2003). Die T-Zell-vermittelte
Immunregulation, die unter anderem Immunantworten gegen Selbst-Antigene
kontrolliert und so vor Autoimmunerkrankungen schützt, könnte ein geeigneter
Mechanismus sein, um auch Immunantworten gegen Transplantatantigene zu
hemmen (Wood K und Sakaguchi S, 2003). Bei diesen Antigenen handelt es
sich in erster Linie um die allogenen MHC-Moleküle auf den Zellen des
Transplantates (Snell GD, 1980). Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit
der Immunbiologie natürlich vorkommender CD4+, CD25+ T-Lymphozyten oder
Treg der Ratte. Insbesondere die Ratte hat sich in den letzten 50 Jahren als
wichtiges Kleintiermodell für experimentelle Transplantationen nach klinischem
Vorbild bewährt (u.a. Timmermann W et. al., 1998). Zudem konzentrierte sich
bisher der Großteil der Untersuchungen auf humane und murine Treg, so dass
gegenwärtig nur wenige Daten über Treg der Ratte zur Verfügung stehen (z.B.
Lin C und Hünig T, 2003).
Als Entstehungsort für Treg scheint dem Thymus eine Schlüsselrolle zuzukommen. Im Thymus unbehandelter Mäuse werden durchschnittlich 5% Treg
nachgewiesen (Itoh M et al., 1999). Um die Frage zu klären, ob der Thymus
tatsächlich der Ursprungsort für Treg ist, wurden aus murinen Thymozyten die
Treg depletiert und die verbliebenen CD25neg einer athymischen Maus injiziert.
Dies führte dazu, dass es in diesen Tieren zum Ausbruch diverser Autoimmunerkrankungen kam (Itoh M et al., 1999). Um sicherzustellen, dass Treg nicht erst
nach ihrer Aktivierung in der Peripherie in den Thymus einwandern, wurden
Thymozyten von neonatalen Mäusen untersucht. Itoh et al. zeigten, dass Treg
bereits am zweiten Lebenstag im Thymus zu finden sind, nicht aber in den
peripheren lymphatischen Organen. Diese Experimente deuten auf eine
Schlüsselrolle des Thymus für die Entstehung von Treg hin, auch wenn es Hin-
- 37 -
Diskussion
weise dafür gibt, dass sich aus naiven T-Lymphozyten in der Peripherie Treg
nach oraler oder intravenöser Verabreichung eines Antigens entwickeln
(Thorstenson KM et al., 2001). Die Lokalisation der Regulatorzellen im Thymus
selbst ist jedoch noch unklar. In der Maus scheinen sie sich in der Medulla zu
befinden (Itoh M et al., 1999), während humane Treg vorzugsweise gefäßnah in
den fibrösen Septen vorkommen (Annunziato F et al., 2002). Tatsache ist, dass
Treg nach ihrer Entstehung im Thymus mit der Zeit in die peripheren
lymphatischen Organe auswandern. Dies könnte erklären, warum der Anteil von
Treg an den Thymozyten bei 8 bis 10 Wochen alten Ratten nur sehr gering war
(siehe Kapitel 4.1).
Die wichtigste Voraussetzung für die Arbeit mit Treg ist ihre zweifelsfreie Identifizierung in den lymphatischen Organen mit Hilfe spezifischer Marker. Obwohl
dieses Ziel bis heute noch nicht vollständig erreicht wurde, ist es doch möglich,
bestimmte Populationen von Regulatorzellen anhand eines bestimmten
Phänotyps zu identifizieren. Eine solche Population wird in der Literatur als
CD4+, CD25+, CD45Rlow oder Treg bezeichnet. Diese Zellen sind sowohl beim
Menschen (Dieckmann D et al., 2001) als auch in der Maus (Sakaguchi S et al.,
1995) nachgewiesen worden. In Kapitel 4.3 der vorliegenden Arbeit wurde
dieser Phänotyp auch für die Lewis-Ratte bestätigt. Trotz umfangreicher Daten
über Treg scheint lediglich unbestritten, dass sie in der Lage sind, die Aktivierung
anderer T-Lymphozyten zu hemmen. Trotz großer Anstrengungen wurden die
molekularen Mechanismen ihrer regulatorischen Funktion bisher nicht eindeutig
geklärt. Grundsätzlich werden zwei mögliche Wege zur Übertragung des inhibitorischen Prinzips diskutiert: Entweder über direkten Zell-Zell-Kontakt oder über
lösliche Faktoren (v.a. Cytokine). Zu beiden Wegen findet sich in der Literatur
eine große Anzahl an Experimentaldaten, die sehr kontrovers diskutiert werden
(z.B. Shevach EM, 2002).
Ein wesentlicher Aspekt der vorliegenden Arbeit war nachzuweisen, dass Treg
der Ratte Interleukin-10, dem vorwiegend inhibitorische Eigenschaften zugeschrieben werden, sezernieren. Aus Kapitel 4.7 geht hervor, dass in der Tat Treg
- 38 -
Diskussion
nicht-behandelter Lewis-Ratten nach Stimulierung große Mengen an IL-10 (bis
zu 1.200 pg/ml am 3. Tag der Stimulierung) produzierten. Dies wurde, mit
wenigen Ausnahmen (u.a. Levings M et al., 2002), auch für murine und humane
Regulatorzellen gezeigt. Gegenwärtig wird intensiv diskutiert, ob Interleukin-10
tatsächlich an der Immunregulation von Treg beteiligt ist. Während in vivo Daten
dies unterstützen (Assemann C et al., 1999; Hara M et al., 2001), weist die
überwiegende Anzahl der in vitro Daten eher darauf hin, das IL-10 nicht an
dieser Immunregulation beteiligt ist (Thornton A et al., 1998). Diese Widersprüche haben ihre Ursache vermutlich in den jeweiligen experimentellen Bedingungen. Wie stark der Einfluss von IL-10 auf die regulatorische Funktion von
Treg ist, konnte in dieser Arbeit nicht eindeutig geklärt werden. Tatsache ist
jedoch, dass der Anteil an IL-10, der von Treg der Ratte produziert wurde, um
ein Vielfaches höher war als der von nicht-regulatorischen CD4+ T-Lymphozyten.
Der überwiegende Anteil der zahlreichen in vitro Daten legt nahe, dass Treg ihre
Regulatorfunktion ausschließlich über Zell-Zell-Kontakte vermitteln. Dies wirft
die Frage auf, welche molekularen Strukturen auf der Zelloberfläche dieser
Zellen hierbei involviert sind. So wäre die Beteiligung des cytotoxic-T-Lymphocyte-antigen (CTLA-4), dem nachweisbar eine wichtige Rolle bei der Regulation
von T-Lymphozyten zukommt, denkbar (Walunas T et al., 1994). Zahlreiche
Untersuchungen ergaben, dass humane und murine Treg, aber auch Treg der
Ratte (Lin C und Hünig T, 2003), tatsächlich eine starke Expression von CTLA4 aufweisen (u.a. Takahashi T et al., 2000). Takahashi et al. zeigten auch, dass
die Blockade von CTLA-4 bei gesunden Mäusen zur Ausbildung von Autoimmunerkrankungen führt (Takahashi T et al., 2000). Alternativ wird membrangebundenes TGF-β (transforming-growth-factor-β) als Vermittler der Regulatorfunktion von Treg diskutiert. Nakamura et al. konnten eine starke Expression von
TGF-β auf Treg nachweisen. Sie konnten ebenfalls zeigen, dass gegen TGF-β
gerichtete Antikörper die Suppressor-Eigenschaften der Treg in vitro blockieren
(Nakamura K et al., 2001). Auch dieses Ergebnis wurde jedoch von anderen
Gruppen bezweifelt bzw. experimentell widerlegt (u.a. Sullivan T et al., 2001).
- 39 -
Diskussion
Diese Beispiele verdeutlichen, wie schwierig der Regulator-Mechanismus zu
erklären ist. Es erscheint auch nicht unwahrscheinlich, dass dieser Mechanismus auf der Interaktion mehrerer Faktoren beruht.
In dieser Arbeit wurde die Fähigkeit der aus Lymphknoten frisch isolierten Treg
der Ratte untersucht, neben IL-10 auch IL-2 zu produzieren. Dieses Cytokin
wird in der Literatur generell als essentiell für das Überleben von Treg eingestuft
(u.a. Papiernik M et al., 1997; Übersicht bei Nelson BH, 2004). Im Gegensatz
zu den Arbeiten, die sich mit den Treg der Maus, des Menschen (Levings M et
al., 2001) aber auch der Ratte (Lin C und Hünig T, 2003) beschäftigten, konnte
in der vorliegenden Arbeit bei stimulierten Treg IL-2 im Zellkulturüberstand nachgewiesen werden; wenn auch, im Vergleich zu IL-10, in geringerer Konzentration. Diese Tatsache könnte auch erklären, warum Treg ohne exogene Zugabe von IL-2 nach Stimulation überleben können. Wie in Kapitel 4.4 dargestellt, sterben frisch isolierte Treg ohne Stimulus rasch ab (siehe auch Lin C und
Hünig T, 2003). Die vorliegende Arbeit zeigt außerdem, dass dieser lebenswichtige Stimulus nicht zwangsläufig exogenes IL-2 sein muss, sondern auch
eine Stimulation mit R73 (anti-αβ T-Zell-Rezeptor) und JJ319 (anti-CD28) sowie
mit allogenen dendritischen Zellen zur Vitalisierung der Kultur beiträgt. Die
Abhängigkeit der Treg von IL-2 könnte erklären, warum zahlreiche Immunsuppressiva zwar die Aktivierung alloreaktiver T-Lymphozyten effektiv verhindern,
aber der Ausbildung von Toleranz entgegenwirken (Li Y et al., 1999). Solche
Immunsuppressiva hemmen die Expression von IL-2, wodurch zwar die
Expansion alloreaktiver T-Lymphozyten verhindert wird, aber auch ein
wesentlicher Faktor zum Erhalt von Treg fehlt.
IL-10 mRNA wurde in frisch isolierten Treg, nicht aber in frisch isolierten konventionellen CD25neg Zellen nachgewiesen (Abb. 4.29). Für die nicht-stimulierten,
IL-10 mRNA-positiven Treg war jedoch kein IL-10-Protein im ELISA nachzuweisen, sondern erst nach ihrer Stimulierung (Abb. 4.27). Auch ihre SuppressorFunktion war erst nach ihrer Stimulierung messbar (Kapitel 4.8). So wurde für
- 40 -
Diskussion
nicht-stimulierte Treg nie eine suppressive Funktion in vitro nachgewiesen (nicht
gezeigt). In der Literatur sind für IL-10 produzierende Treg regulatorische Eigenschaften in verschiedenen Situationen beschrieben. So verhindern sie in vivo
das Auftreten einer Colitis (Asseman C et al., 1999), hemmen die Transplantatabstoßung (Hara M et al., 2001) oder regulieren die Expansion konventioneller
T-Lymphozyten (Annacker O et al., 2001).
Zumindest in vivo scheint auch die Kostimulation für die Entwicklung von Treg
von elementarer Bedeutung zu sein. So konnten Salomon et al. zeigen, dass
sowohl in CD28 als auch B7 knockout Mäusen keine regulatorischen TLymphozyten nachzuweisen waren, weshalb diese Tiere auch dazu neigten,
spontan einen Autoimmundiabetes zu entwickeln (Salomon B et al., 2000).
In einem weiteren Teil dieser Arbeit (Kap. 4.8) gelang es, erste Versuche zum
Nachweis der regulatorischen Funktion von Treg der Ratte in einem in vitro
Inhibitionsassay durchzuführen. Auch hierbei ergaben sich einige Unterschiede
zu publizierten Daten. So wird von einigen Gruppen (u.a. Takahashi T et al.,
1998) beschrieben, dass Treg nach einer Aktivierung über den T-Zell-Rezeptor
in einem anergen Zustand übergehen, um regulatorisch wirksam zu werden.
Für Treg der Maus wurde beschrieben, dass die auch in der vorliegenden Arbeit
durchgeführte Stimulierung über den T-Zell-Rezeptor plus CD28 zu einer
Proliferation der Treg führte, sie damit aber gleichzeitig ihre regulatorische
Funktion verloren (Itoh M et al., 1999). In den hier beschriebenen Experimenten
wurde genau das Gegenteil beobachtet: Je stärker die Proliferation der vorstimulierten Treg war, desto stärker war auch ihr inhibitorischer Effekt im Inhibitionsassay. Als Indikator für die Proliferation wurde hierbei die Vergrößerung
der Zellen (FSCbright) herangezogen (siehe Abb. 4.31). Die Tatsache, dass Treg
nach der Inkubation mit R73 und JJ319 proliferieren und dennoch regulatorisch
tätig bleiben, wurde auch in einer anderen Arbeit über Treg der Ratte beschrieben (Lin C et al., 2003). Dies scheint ein entscheidender Unterschied zu
humanen und murinen Treg zu sein.
- 41 -
Diskussion
Die eigenen Daten zeigen somit, dass natürlich vorkommende CD25+ CD4+ TLymphozyten der Lewis-Ratte eindeutige Suppressor-Eigenschaften in vitro
aufweisen, wenn sie zuvor aktiviert wurden, und sie somit die Bezeichnung Treg
zu Recht tragen.
- 42 -
CD45R
Phänotyp
- 43 -
Autor
Jahr
Spezies
Papiernik et al.
1997
Maus
low
Takahash et al.
1998
Maus
Asseman et al.
1999
Hara et al.
Stimulierung mit
Produktion von
Regulatorische Aktivität
IL-2
IL-10
anti-CD3
nein
ja
low
anti-CD3,
Concanavalin-A
kaum
nein
Aktivierung über TCR,
keine Proliferation
Maus
low
anti-CD3
k. A.
ja
Aktivierung über TCR,
keine Proliferation
2001
Maus
low
allogene APC
nein
nein
Aktivierung über TCR,
keine Proliferation
Dieckmann.et al.
2001
Mensch
low
anti-CD3, anti-CD28,
DC
kaum
ja
Aktivierung über TCR,
keine Proliferation
Annunziato et al.
2002
Mensch
k. A.
anti-CD3, anti-CD28
nein
kaum
Aktivierung über TCR,
keine Proliferation
Dieckmann et al.
2002
Mensch
low
anti-CD3, anti-CD28,
DC
nein
ja
Aktivierung über TCR,
keine Proliferation
Lin & Hünig
2003
Ratte
low
anti-TCR, anti-CD28.
nein
ja
Aktivierung über TCR,
Proliferation
TCR= T-cell receptor; T-Zellreptor; k.A. keine Angabe
keine Angaben
Diskussion
Tab. 6.1: Die Stimulierung von Treg als grundlegende Voraussetzung für ihre regulatorische Aktivität scheint ein generelles
Charakteristikum zu sein. Obwohl für die Aktivierung der T-Zellrezeptor (T-cell receptor, TCR) notwendig ist, werden die
Mechanismen, die diese Eigenschaft vermitteln, kontrovers diskutiert. Auffallend ist, dass Treg der Ratte nach ihrer
Aktivierung proliferieren. Dies ist für murine und humane Treg nicht beschrieben.
7.
Ausblick
Die Tatsache, dass regulatorische T-Lymphozyten auch im menschlichen
Organismus nachgewiesen wurden (u.a. Jonuleit H et al, 2002), lässt eine
klinisch relevante Therapie mit diesen Zellen prinzipiell möglich erscheinen.
Bevor eine solche Zelltherapie jedoch zu realisieren sein wird, sind noch
zahlreiche Fragen zu klären, wie z.B. die nach der molekularen Grundlage ihrer
Suppressor- oder Regulator-Funktion. Dabei ist sicher hochinteressant zu
untersuchen, ob sich intrazelluläre Signalwege von Treg und konventionellen
CD25neg nach ihrer Aktivierung wesentlich unterscheiden. In erster Linie dürften
wohl die vom T-Zellrezeptor ausgelösten Signalwege (Wilkinson B et al., 2004)
zur Beantwortung dieser Frage zu untersuchen sein.
Auch bezüglich der Suche nach geeigneten Markern für Treg ist von großem
Interesse, welche Unterschiede beide Zelltypen, Treg und CD25neg, in ihrer
Genexpression aufweisen. Hierzu wird ohne Zweifel die Microarray-Technologie
(z.B. Raghavan A, 2002) als wichtiges Analyseverfahren Antworten liefern.
Nach Bruder et al. könnte mit dem Rezeptor Neuropilin-1 bereits ein potentieller
Marker für Treg gefunden sein (Bruder D et al., 2004). Dieser Marker könnte
ebenfalls bei der Isolierung von Treg aus der Ratte Bedeutung erlangen, sollte
sich sein Vorhandensein auch in dieser Spezies bestätigen.
Eine weitere Voraussetzung für eine mögliche klinische Anwendung von Treg ist
ihre gezielte Expansion. Hierbei könnte der Einsatz von CD28-Superagonisten
von großer Bedeutung sein, wie bereits von Lin et al. für die Expansion von Treg
der Ratte beschrieben (Lin C und Hünig T, 2003). Als sehr bedeutsam für die
Transplantationsmedizin ist auch die Möglichkeit, antigenspezifische Treg zu
generieren (Jiang S et al., 2003). Weitere Untersuchungen werden zeigen müssen, ob solche antigenspezifischen Treg wirklich in der Lage sind, die gegen das
Transplantat gerichtete Immunantwort gezielt zu hemmen. Sollte sich dies bewahrheiten, so könnten Treg möglicherweise der Schlüssel zu einer nebenwirkungsfreien Immuntherapie nach Transplantation sein.
- 44 -
8.
Zusammenfassung
Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Charakterisierung regulatorischer CD4+ CD25+ T-Lymphozyten (Treg) der Ratte und dem Nachweis ihrer
Suppressor-Funktion in vitro. Als erstes wurde die Verteilung dieser Zellen in
den lymphatischen Organen untersucht. Dabei waren sie sowohl in den parailiacalen, cervicalen und mesenterialen Lymphknoten (zwischen 4,5 und 6,1%)
als auch im Thymus mit 1,3% und in der Milz mit 4,5% nachzuweisen. Ihr
CD45Rlow Phänotyp entspricht dem humaner und muriner Treg. Alle Treg der
Ratte exprimieren den αβ T-Zellrezeptor, und sie sind zu 40% für einen
weiteren Aktivierungsmarker, nämlich CD134, positiv. Um die Vitalität frisch
isolierter Treg in vitro erfolgreich zu erhalten, ist es notwendig, sie zu stimulieren;
entweder mit den beiden Antikörpern R73 (anti-TCR) und JJ319 (anti-CD28)
oder mit allogenen dendritischen Zellen und/oder IL-2. Ein weiteres wesentliches Ergebnis dieser Arbeit war, dass stimulierte Treg sowohl IL-2 als IL-10
produzierten. Während der dreitägigen Kultivierung sezernierten 100.000 Treg
mit 1.200 pg/ml dreimal soviel IL-10 wie IL-2 (402 pg/ml) in den Kulturüberstand.
Die Suppressor-Funktion von Treg der Ratte wurde in Inhibitionsassays bestätigt. Gemessen wurde ihre Fähigkeit, in Abhängigkeit ihrer Zellzahl die polyklonale Aktivierung von CD25neg zu hemmen. Wurden Treg und CD25neg zu
gleichen Anteilen kultiviert, so war eine nahezu vollständige Hemmung der Aktivierung von CD25neg nachweisbar. Je geringer der Anteil aktivierter Treg im Inhibitionsassay war, desto geringer war auch der von ihnen übertragende suppressive Effekt. Zudem wurde gezeigt, dass die Suppression umso stärker war, je
größer der Anteil blastoider FSCbright Zellen an den im Inhibitionsassay eingesetzten Treg war.
Die Charakterisierung von Treg der Ratte hat somit gezeigt, dass sie über
eindeutige Suppressor-Eigenschaften verfügen. Dieser Nachweis stellt die
wesentliche Voraussetzung für künftige in vivo Untersuchungen dar.
- 45 -
9.
Literaturverzeichnis
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- 50 -
FoxP3
CD
2
Al
le
po
s
5 ne
g
CD
25
Anhang
Abb. A1:
pos
Nachweis von FoxP3 mRNA in aufgereinigten Treg (= CD25 ).
neg
CD25
T-Lymphozyten sind hingegen negativ für FoxP3
mRNA. Repräsentative Darstellung von jeweils 3 Isolierungen.
GAPDH
Abb. A2:
Exklusiver Nachweis von FoxP3 in
pos
frisch isolierten Treg Zellen (CD4
pos
CD25 ) vor und nach Aktivierung.
neg
Im Vergleich dazu bleiben CD25
T-Lymphozyten auch nach ihrer
Aktivierung negativ für FoxP3
mRNA. Dieses Stimulierungsexperiment ist einmal durchgeführt
worden, wobei zwei unabhängige
RT-PCR Analysen zu dem gleichen Ergebnis führten. LNC =
Lymphknotenzellen (lymph node
cells).
Nicht-stimuliert
Stimuliert
FoxP3
GAPDH
LNC
CD25neg CD25pos
CD4+
LNC
CD25neg CD25pos
CD4+
Abb A3:
Nachweis von FasL mRNA in frisch
CD4+ CD25pos
CD4+ CD25neg
isolierten, nicht-stimulierten (NS) Treg und in
pos
stimulierten
(S) Treg Zellen (CD4+ CD25 )
S
NS
S
NS
sowie naiven T-Lymphozyten (CD4+
neg
neg
CD25 ). CD25 T-Lymphozyten sind erst
nach ihrer Aktivierung mit den Antikörpern
R73 und JJ319 (Abschnitt 3.5) positiv für
FasL mRNA, während bereits in frisch
isolierten Treg FasL mRNA nachzuweisen ist.
Repräsentative Darstellung von zwei
unabhängigen RT-PCR Analysen eines Versuches. Links und Rechts die “100bp-Leiter“.
Positivkontrolle (GAPDH) nicht gezeigt.
- 51 -
Tab. A1: Die Sequenzen der Oligonukleotide ("primer“) für FoxP3 und FasL. Angabe der
Produktgröße in Basenpaaren (bp), Temperatur (Temp.) in °C ("Annealing"Temperatur der Primer) sowie der Primer-Orientierung (for = forward; rev = reverse).
Beide Primer basieren auf publizierten Sequenzen: FoxP3 (Hori S et al. Science
2003; 299; 1057), FasL (Kuranaga E et al. FEBS Letters 2000; 472: 137).
Primer
bp
Temp.
FoxP3
382
57
FasL
698
55
Sequenz 5´→ 3´
for
CAG CTG CCT ACA GTG CCC CTA G
rev
GTA AAC GGT GGT CAC CCA TC
for
rev
CCA GAT CTA CTG GGT AGA
ATG GTC AGC AAC GGT AAG
3,5
Optische Dichte (OD)
Optische Dichte (OD)
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
200
400
600
800
1000
0
Konzentration IL-2 (pg/ml)
200
400
600
800
1000
Konzentration IL-10 (pg/ml)
Abb. A4: Repräsentative Eichkurven zur Bestimmung der Konzentration an IL-2 bzw. IL-10 in
Zellkulturüberständen. Verwendet wurden BioSource ELISA-Kits (BioSource International,
Kalifornien, USA): IL-2 (Katalog-Nr.: IKRC0022) und L-10 (Katalog-Nr.: KRC0102). Die Daten
für IL-2 basieren auf linearer Regression und die für IL-10 quadratischer Regression. Der
Korrelationskoeffizient lag stets über 0,95.
- 52 -
bp
1
2
3
3.
4
2
5.
6
7
bp
13
14
15
16
17
18
19
2
1
8.
20
n.
Ko
8.
8.
3
9
10
11
12
Abb. A5: Das Vß-Repertoire von Treg ist polyklonal. Die Primer basieren auf der Publikation von
Shirwan H et al. J Immunol 151 (10): 5228-5238, 1993. Sie sind auch in der Promotionsschrift
von Frau Dr. Ana Gabriela Sitaru zu finden (http://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/opus/
frontdoor.php?source_opus=456). Repräsentative Darstellung aus zwei Zellisolierungen.
- 53 -
Diese Arbeit wurde in Teilen publiziert:
Poster und Kongressbeitrag
Otto C., Kuckein O., Ulrichs K. Characterization of rat CD4+ CD25+ T regulator
cells. Immunobiol 2003; 208: 254 (T.16).
Otto C., Kuckein O., Hein B., Seubert C. Thiede A., Gassel H.J. Ulrichs K.,
Charakterisierung CD4+ CD25+ regulatorischer T-Lymphozyten der Ratte: In
vitro-Kultivierung, Cytokinprofil und regulatorische Funktion.
Transplantationsmedizin 2004 (Suppl); S. 137
Poster
Otto C., Heeg A., Kottenmeier S., Kuckein O., Hein B., Tiurbe G.C., Thiede A.,
Ulrichs
K.
Immunbiologie
der Transplantatabstoßung.
Charakterisierung
alloreaktiver MHC-Klasse-II-positiver T-Lymphozyten. 14. Jahrestagung der
Deutschen Transplantationsgesellschaft, Rostock, 22. - 24. September. 2005
Kuckein O, Hein B., Thiede A., Ulrichs K, Otto C. Charakterisierung
regulatorischer T-Lymphozyten der Ratte: Kultivierung, Cytokinprofil und
regulatorische Funktion. 93. Jahrestagung der Vereinigung Mittelrheinischer
Chirurgen, Würzburg, 22. – 24. September 2005
Vortrag und Kongressbeitrag
Otto C., Kuckein O., Hein B., Thiede A., Ulrichs K., Charakterisierung von CD4+
CD25+ regulatorischen T-Lymphozyten (Treg) der Ratte.
2. Treffen des Arbeitskreises Transplantationsimmunologie der Deutschen
Gesellschaft für Immunologie (DGfI), Charitẻ-Universitätsmedizin, CampusVirchow-Klinikum, Berlin, 26. - 27. März 2004
- 54 -
Danksagung
Die vorliegende Arbeit wurde in der Experimentellen TransplantationsImmunologie der Chirurgischen Klinik der Bayerischen Julius-MaximiliansUniversität Würzburg unter der Anleitung von Herrn Privatdozent Dr. rer. nat.
Christoph Otto durchgeführt. Für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes und die
großzügige finanzielle Unterstützung möchte ich mich ganz herzlich bei Herrn
Prof. Dr. med. Prof. h.c. A. Thiede, Direktor der Chirurgischen Universitätsklinik,
bedanken.
Frau Prof. Dr. rer. nat. K. Ulrichs, Leiterin der Arbeitsgruppe Experimentelle
Transplantationsimmunologie, danke ich für die Schaffung der hervorragenden
Arbeitsbedingungen.
Herrn Privatdozent Dr. rer. nat. Christoph Otto danke ich sehr für die
Überlassung des Promotionsthemas und seinen außergewöhnlichen Einsatz
bei der konstruktiven Betreuung meiner Arbeit. Seine unermüdliche Diskussionsbereitschaft und nicht zuletzt seine moralische Unterstützung trugen
maßgeblich zur Fertigstellung dieser Arbeit bei.
Frau A. Gebert und Frau N. Martens, beide medizinisch-technische Assistentinnen, sowie meinem Vorgänger, Herrn P. Schmitz, danke ich für die
gewissenhafte Einarbeitung in die verschiedenen Arbeitstechniken. Frau B.
Hein, pharmazeutisch-technische Assistentin, danke ich für ihre unermüdliche
Mithilfe bei der praktischen Durchführung der Experimente. Ebenfalls danke
Frau C. Seubert und Frau M. Schneider für ihre moralische Unterstützung und
die Aufrechterhaltung eines angenehmen Arbeitsklimas.
Nicht zuletzt gilt mein besonderer Dank meinen Eltern Frau Christel Kuckein
und Prof. Dr. Jürgen Kuckein, sowie meiner Lebensgefährtin Nina Kasper, die
mir durch ihre vielfältige Unterstützung das Studium der Humanmedizin und
diese Promotion erst ermöglichten.
Lebenslauf
Marc Oliver Kuckein
Geburtsdatum/-ort
11.05.1976 in Memmingen
Familienstand
ledig
Konfession
evangelisch
Eltern
Prof. Dr. Jürgen Kuckein, Richter am Bundesgerichtshof
Christel Kuckein, geb. Thomas, Krankenschwester und
Logotherapeutin
Schullaufbahn
1983-1987
Grundschule
1987-1997
Gymnasium in Würzburg
Abiturnote: 1,9
Studium
10/1998-03/1999
Studium der Biologie an der Julius-Maximilians-Universität in
Würzburg
04/1999-11/2005
Studium der Humanmedizin an der Julius-MaximiliansUniversität in Würzburg
03/2001
Physikum, Note: 3,0
03/2002
1. Staatsexamen, Note: 3,0
08/2004
2. Staatsexamen, Note: 3,0
11/2005
3. Staatsexamen, Note: 2,0
Famulaturen
Urologie
Universitätsklinikum Würzburg (2002)
Anästhesie
Missionsärztliche Klinik Würzburg (2003)
Dermatologie
Gemeinschaftspraxis Dres. Schubert/Frank/Kristen Würzburg
(2003)
Chirurgie
Universitätsklinikum Würzburg (2004)
Praktisches Jahr
10/04-02/05
Innere Medizin am Universitätsklinikum Würzburg
02/05-05/05
Chirurgie am Universitätsklinikum Würzburg
05/05-09/05
Anästhesiologie am Universitätsklinikum Würzburg
Praktische Erfahrung
1997
Ausbildung zum Rettungssanitäter im Rahmen des
Zivildienstes
1998 bis heute
Regelmäßige Tätigkeit im Rettungsdienst der
Malteser in Würzburg vor allem im Bereich
Notfallrettung, seit 02/99 als Nebenamt
Kenntnisse
Sprachen:
Englisch, Französisch, Latein
EDV:
Microsoft Office, WinMDI, LAS+SAP Uni Würzburg
Medizin:
Zusatzkurse: Präparierkurs für Fortgeschrittene,
Sonographie, EKG, chirurgische Naht, diverse
notfallmedizinische Fortbildungen