Dokument_1. - OPUS Würzburg

Untersuchungen zur endogenen MHC-Klasse-IIrestringierten Präsentation nukleärer Antigene
Dissertation zur Erlangung des
naturwissenschaftlichen Doktorgrades
der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg
vorgelegt von
Alexander Riedel
aus Uslar
Würzburg 2007
Meiner Mutter
Eingereicht am: 07.08.2007
Mitglieder der Promotionskommission:
Vorsitzender: Prof. Dr. Martin Müller
Gutachter: Prof. Dr. med. Georg W. Bornkamm
Gutachter: Prof. Dr. Georg Krohne
Tag des Promotionskolloquiums: 05.12.2007
Doktorurkunde ausgehändigt am:
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Summary
VI
Zusammenfassung
VII
I.
Einleitung
1
1.
Das Immunsystem
1
1.1
Die angeborene und adaptive Immunität
1
1.2
Die zentrale Bedeutung der CD4+ T-Zellen für die antigenspezifische
2
Immunantwort
2.
Die Antigenpräsentation
2
2.1
Die Struktur der MHC-Moleküle
2
2.2
Die klassischen Antigenpräsentationswege
4
2.2.1
Der klassische MHC-I-assoziierte Antigenpräsentationsweg
4
2.2.2
Der klassische MHC-II-assoziierte Antigenpräsentationsweg
5
2.3
Die Aufnahme exogener Antigene
6
2.4
Die Antigenprozessierung im endosomal/lysosomalen Kompartiment
8
2.5
Die alternativen Präsentationswege
8
2.5.1
Kreuzpräsentation im MHC-I-Antigen-Präsentationsweg
9
2.5.2
Präsentation endogener Proteine auf MHC-II-Molekülen
9
2.5.2.1
Die Beteiligung zytoplasmatischer Proteasen
10
2.5.2.2
Die Beteiligung der Makroautophagie
10
2.5.2.3
Die Beteiligung der Chaperon-vermittelten Autophagie
12
3.
Autophagie
13
3.1
Die Funktion der Autophagie
13
3.2
Die molekulare Regulation der Autophagie
14
3.3
Autophagie und Immunität
16
4.
Die immunologische Bedeutung der endogenen Präsentation von Antigenen
17
auf MHC-II-Molekülen
5.
Fragestellung
18
II.
Material und Methoden
19
1.
Material und Geräte
19
1.1
Zelllinien
19
1.1.1
Antigenpräsentierende Zellen
19
1.1.2
T-Zellen
19
1.2
Bakterienstämme
19
1.3
Oligonukleotide
19
1.4
Expressionsplasmide
19
I
Inhaltsverzeichnis
1.5
Antikörper
20
1.5.1
Primärantikörper
20
1.5.2
Sekundärantikörper
20
1.6
DNA-modifizierende Enzyme
20
1.7
Chemikalien
20
1.8
Allgemeine Puffer und Lösungen
21
1.9
Zellkulturmedien
21
1.10
Geräte
21
2.
Methoden
23
2.1
Molekularbiologische Methoden
23
2.1.1
Amplifikation von Plasmid-DNA mittels Bakterienkulturen
23
2.1.1.1
Anzucht von Bakterienkulturen
23
2.1.1.2
Herstellung elektrokompetenter Bakterien zur Transformation
23
2.1.1.3
Transformation von Bakterien
24
2.1.1.4
Präparative Herstellung von Plasmid-DNA aus Bakterien
24
2.1.2
DNA-Klonierung
24
2.1.2.1
Schneiden der DNA mit Restriktionsendonukleasen
24
2.1.2.2
Auffüllen überhängender DNA-Enden
24
2.1.2.3
Phenol-Chloroform-Extraktion
25
2.1.2.4
Ligation von DNA-Molekülen
25
2.1.3
Agarosegelelektrophorese
26
2.1.4
Methoden zur Isolation und Detektion von RNA
26
2.1.4.1
RNA-Isolation
26
2.1.4.2
RNA-Gelelektrophorese mit anschließendem Northern-Transfer
26
2.1.4.3
Radioaktive Markierung von Nukleinsäuren mit anschließender Northern-Blot27
Hybridisierung
2.1.4.4
cDNA-Synthese durch Reverse Transkription von mRNA
27
2.1.5
Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
28
2.1.6
Real time-PCR
29
2.2
Zellbiologische Methoden
30
2.2.1
Kultivierung humaner Zelllinien
30
2.2.2
Transfektion von adhärent wachsenden Zellen
31
2.2.2.1
Polyethylenimin (PeI)-Transfektion
31
®
2.2.2.2
Transfektion mit FuGene HD
31
2.2.3
Transfektion von Suspensionszellen mittels Elektroporation mit anschließender
31
Ficoll-Aufreinigung
2.2.4
Magnetische Zellseparation (MACS)
32
2.2.5
FACS-Analyse
32
II
Inhaltsverzeichnis
2.2.6
Elutriationszentrifugation
33
2.2.6.1
Chromatinfärbung
34
2.2.7
GM-CSF-ELISA
34
2.2.8
IFNγ-ELIspot
35
2.2.9
Immunfluoreszenz
35
2.3
Proteinbiochemische Methoden
36
2.3.1
Herstellung von RIPA-Extrakten
36
2.3.2
Proteinaufreinigung
36
2.3.3
SDS-PAA-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
36
2.3.4
Western-Transfer und Immundetektion
37
2.3.5
Bradford-Bestimmung
38
III.
Ergebnisse
39
1.
Das NeoR-Modellantigensystem zur Untersuchung
Präsentation zytosolischer und nukleärer Antigene
der
endogenen
39
1.1
Überprüfung der intrazellulären Lokalisation der zytosolischen und nukleären
Variante des Modellantigens NeoR
39
1.2
Die endogene Präsentation von NeoR und NucNeoR in RCC1:24- und LCL1:1140
Zellen
2.
Autophagie-abhängige Präsentation von NeoR und NucNeoR in RCC1:24und LCL1:11-Zellen
42
3.
Toxizitätstest der verwendeten Inhibitoren
44
4.
Etablierung eines konditionalen Antigenexpressionssystems in LCL
47
4.1
Nachweis einer induzierbaren Antigenpräsentation
47
4.2
Erkennung der Doxcyclin-induzierten LCL1:11-Transfektanten durch die NeoR50
spezifischen T-Zellen
4.3
Fehlender Beitrag von freigesetztem Antigen für T-Zellerkennung der NeoR- und
NucNeoR-Transfektanten
50
4.4
Abschalten der Transkription nach Auswaschen des Doxycyclins
5.
Beteiligung des aktiven, nukleären Exports an der Präsentation nukleärer
Proteine
53
5.1
Nachweis der inhibierenden Wirkung von LMB auf den Kernexport mit Hilfe
eines Reporterproteins
53
5.2
Geringer Einfluss des CRM1-vermittelten Kernexports auf die MHC-II54
assoziierte Präsentation von NucNeoR-Protein
6.
Einfluss des Zellzyklus auf die Präsentation nukleärer Proteine auf MHC-IIMolekülen
55
6.1
Inhibition des Zellzyklus durch Aphidicolin
6.2
Untersuchung der Rolle des Zellzyklus auf die Präsentation nukleärer Antigene
durch Elutriationszentrifugation
57
6.2.1
Auftrennung von LCL1:11-Zellen nach Zellzyklusphasen
III
52
56
57
Inhaltsverzeichnis
6.2.2
Abhängigkeit der NeoR-spezifischen T-Zellstimulation von den Zellzyklusphasen
der NeoR- bzw. NucNeoR-Transfektanten
58
6.2.3
Nachweis der rekombinanten
Zellzyklusphasen
Antigenmenge
in
den
verschiedenen
59
6.2.4
Untersuchung der zellzyklusabhängigen MHC-II-Expression der LCL1:11-Zellen 60
6.2.5
Zellzyklusabhängige Antigenpräsentation nach exogener Proteinbeladung
61
6.2.6
Nachweis der Autophagie-Aktivität in den einzelnen Zellzyklusphasen
62
6.2.7
Rolle des nukleären Antigenreservoirs nach Auflösung der Kernmembran
63
6.2.8
Rolle der zellzyklusabhängigen Transkriptions- bzw. Translationsaktivität
65
6.2.9
Korrelation der NeoR-spezifischen CD4+ T-Zellerkennung und der
transkriptionellen/translationellen Aktivität der Transfektanten
67
7.
Bestätigung der Autophagie-abhängigen Präsentation nukleärer Proteine im
68
EBV-Modell LCL-EBNA3C
7.1
Autophagie-abhängige Präsentation von EBNA3C
68
7.2
Zellzyklusabhängige Präsentation von EBNA3C
69
7.3
Zellzyklusabhängige Präsentation von EBNA3C nach Doxycyclin-induzierter
71
Expression
8.
Autophagie- und zellzyklusabhängige Präsentation von NeoR und EBNA3C
in LCL-UB
71
8.1
Stufenlose Induzierbarkeit der Antigene NeoR und EBNA3C durch Doxycyclin71
Induktion des bidirektionalen Promotors in LCL-UB-NeoR-EBNA3C-Zellen
8.2
Inhibitorentest auf LCL-UB-NeoR-E3C-Zellen
72
IV.
Diskussion
74
1.
Die Dichotomie MHC-restringierter Antigenpräsentation
74
2.
Das Modellsystem zur Charakterisierung der endogenen MHC-II-restringierten
Präsentation nukleärer Antigene
74
3.
Die nukleäre Variante von NeoR wird über Autophagie präsentiert
4.
Die endogene Präsentation der nukleären NeoR-Variante (NucNeoR) erfolgte
unabhängig vom aktiven CRM1-vermittelten nukleären Export
76
5.
Die Auflösung der Kernmembran in der Mitose ist keine Voraussetzung für die
endogene Präsentation nukleärer Antigene auf MHC-II-Molekülen
77
Die endogene Präsentation intrazellulärer Antigene auf MHC-II-Molekülen
korreliert wahrscheinlich mit der Antigentranslation
78
6.
75
7.
Eine mögliche Rolle von DRiPs in der endogenen Präsentation von Antigenen auf
MHC-II-Molekülen
78
8.
Das Modell der Immunribosomen
80
9.
DRiPs und die endogene Antigenpräsentation auf MHC-II-Molekülen
81
10.
Möglichkeit einer Assoziation von Proteinsynthese und Autophagie
83
11.
Ausblick
83
IV
Inhaltsverzeichnis
V.
Literaturverzeichnis
85
VI.
Anhang
97
1.
Vektorkarten
97
2.
Abkürzungsverzeichnis
101
V
Summary
Summary
The endogenous presentation of intracellular antigens on major histocompatibility complex class II
(MHC-II) molecules plays an important role in adaptive immune responses, but the underlying
molecular mechanisms are not well understood.
The aim of this study was to gain insight into the endogenous presentation pathways for nuclear
antigens on MHC-II molecules.
By using antigen-specific CD4+ T cell clones, MHC-II presentation of the nuclear antigens neomycin
phosphotransferase II (NucNeoR) and Epstein-Barr virus nuclear antigen 3C (EBNA3C) was studied
in professional and non-professional antigen presenting cells (APC).
Both types of APC presented peptides derived from these nuclear proteins on MHC-II molecules by an
endogenous presentation pathway and not by release and reuptake as exogenous protein. Inhibition of
autophagy drastically reduced endogenous antigen presentation, indicating that nuclear proteins enter
the MHC-II processing and loading compartment through autophagic vesicles. Because
autophagocytosis occurs in the cytoplasm, potential entry routes for nuclear proteins into this pathway
were investigated.
Endogenous presentation of NucNeoR on MHC-II molecules by autophagy did neither involve the
CRM1-mediated export of the nuclear protein into the cytoplasm, nor the redistribution of nuclear and
cytoplasmic components following the dissolution of the nuclear envelope during mitosis.
Conditional antigen expression and cell cycle phase separation of antigen-expressing cells revealed
that antigen presentation was maximal in cells in G1/0 and then gradually decreased as cells progressed
in the cell cycle. This reduction in antigen presentation correlated with a cell cycle-dependent decrease
in antigen transcription/translation, but not with the total amount of antigen present in these cells. By
contrast, when antigen expression was turned off, antigen presentation correlated with MHC-II surface
expression, which increased from G1/0- to G2/M-phase. A similar correlation between antigen
presentation and antigen transcription/translation was also observed for the antigens EBNA3C and the
cytosolic variant of neomycin phosphotransferase II (NeoR).
These results identify autophagocytosis of newly-synthesized proteins as the molecular mechanism
mediating endogenous presentation of nuclear and cytosolic antigens on MHC-II molecules. By
coupling protein translation and autophagocytosis, newly-synthesized proteins gain access to the
endogenous MHC-II presentation pathway irrespective of their subcellular localisation and thereby
broaden the spectrum of intracellular antigens that are presented to CD4+ T cells.
VI
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die endogene Präsentation von intrazellulären Antigenen auf Major-Histokompatibilitätskomplex
Klasse-II (MHC-II) -Molekülen ist von entscheidender Bedeutung für eine Reihe von
immunologischen Prozessen. Die mechanistischen Grundlagen dieses Präsentationsweges sind aber
noch weitgehend unverstanden.
Ziel dieser Arbeit war es, einen Beitrag zum molekularen Verständnis der Abläufe zu leisten, die an
der endogenen Präsentation nukleärer Antigene auf MHC-II-Molekülen beteiligt sind.
Dazu sollte am Beispiel des nukleär lokalisierten Modellantigens Neomycin-Phosphotransferase II
(NucNeoR) sowie des viralen Kernantigens Epstein-Barr-virus nuclear antigen 3C (EBNA3C) und
entsprechender antigenspezifischer MHC-II-restringierter CD4+ T-Zellen die verantwortlichen
Präsentationswege in professionell und nicht-professionell antigenpräsentierenden Zellen untersucht
werden.
In beiden Zellsystemen wurde NucNeoR über einen endogenen Präsentationsweg und nicht über die
Freisetzung und Wiederaufnahme als exogenes Protein auf MHC-II-Molekülen präsentiert. Durch die
Verwendung chemischer Inhibitoren konnte eine Beteiligung der Autophagie an der endogenen
Antigenpräsentation nachgewiesen werden. Da Autophagie ausschließlich im Zytoplasma stattfindet,
wurde nach möglichen Eintrittspforten für nukleäre Proteine in diesen Abbauweg gesucht.
Für die Autophagie-abhängige Präsentation von NucNeoR war weder ein CRM1-vermittelter aktiver
Export des Antigens aus dem Kern ins Zytoplasma, noch eine Auflösung der Kernmembran im
Rahmen der Zellteilung und der dadurch bedingten Durchmischung nukleärer und zytoplasmatischer
Bestandteile notwendig. Mit Hilfe eines konditionalen Antigenexpressionsystems und der
Auftrennung
antigenexprimierender
Zellen
nach
Zellzyklusphasen
konnte
eine
verstärkte
Antigenpräsentation in der G1/0-Phase nachgewiesen werden, die mit fortschreitendem Zellzyklus
immer mehr abnahm. Die Antigenpräsentation korrelierte dabei mit der ebenfalls im Laufe des
Zellzyklus abnehmenden Transkriptions- bzw. Translationsrate des Antigens, aber nicht mit der
absoluten Menge an Antigen in den Zellen. Bei abgeschalteter Antigentranskription dagegen
korrelierte die Antigenpräsentation mit der MHC-II-Oberflächenexpression, die von der G1/0- bis hin
zur G2/M-Phase kontinuierlich zunahm. Eine ähnliche Korrelation von Antigentranskription/
Antigentranslation und Autophagie-abhängiger Antigenpräsentation wurde auch für EBNA3C und die
zytoplasmatisch lokalisierte NeoR-Variante beobachtet.
Diese Ergebnisse identifizieren die Autophagie-abhängige Präsentation neusynthetisierter Proteine als
den verantwortlichen molekularen Mechanismus für die endogene Präsentation der untersuchten
nukleären Antigene auf MHC-II-Molekülen. Durch die Kopplung von Translation und
autophagischem Abbau erlangen Proteine unabhängig von ihrer subzellulären Lokalisation Zugang zu
diesem Präsentationsweg und erweitern so das Spektrum der intrazellulären Antigene, die einer CD4+
T-Zellüberwachung unterliegen.
VII
I. Einleitung
I.
Einleitung
1.
Das Immunsystem
1.1
Die angeborene und adaptive Immunität
Das Immunsystem des Menschen besteht aus einer angeborenen und einer adaptiven oder erworbenen
Komponente.
Zur angeborenen, nicht-antigenspezifischen Immunabwehr zählen anatomische und physiologische
Barrieren wie Epithelien, lösliche Komponenten wie Defensine oder das Komplementsystem, und
Immunzellen wie Makrophagen und Granulozyten, die Pathogene durch Keimbahn-kodierte
Rezeptoren erkennen und von körpereigenen Zellen unterscheiden können (Zhang et al., 2000). Damit
können Krankheitserreger bekämpft werden, ohne dass der Organismus vorher mit dem Erreger
Kontakt gehabt haben muss. Zu diesen speziellen Rezeptoren des angeborenen Immunsystems
gehören beispielsweise die so genannten „toll-ähnlichen Rezeptoren“ (Toll-like receptor; TLR), die
Pathogene aufgrund unveränderlicher Merkmale, den sogenannten Pathogen-assoziierten, molekularen
Mustern (pathogen-associated molecular patterns; PAMP) erkennen (Albiger et al., 2007;
Lanzavecchia und Sallusto, 2007). Diese sind eng mit dem Überleben und/oder den krankmachenden
Eigenschaften des Erregers verbunden, so dass er sie nicht einfach verändern kann, um der
Immunreaktion zu entgehen.
Alle Vertebraten mit Kiefer (Gnathostomata) besitzen neben der angeborenen auch eine adaptive
Immunabwehr (Carrol und Prodeus, 1998). Sie zeichnet sich durch die Anpassungsfähigkeit
gegenüber neuen oder veränderten Krankheitserregern aus. Im Rahmen dieser Anpassung sind die
Zellen der adaptiven Immunabwehr in der Lage, spezifische Merkmale der Angreifer zu erkennen und
gezielt zelluläre und humorale Abwehrreaktionen auszulösen. Neben antigenpräsentierenden Zellen
(APC) wie Dendritischen Zellen (DC) stellen zwei weitere Gruppen von Zellen die wesentlichen
Elemente der adaptiven Immunität dar; die T-Lymphozyten (T-Zellen), welche die zellvermittelte,
antigenspezifische Immunantwort gewährleisten und die B-Lymphozyten (B-Zellen), die für die
humorale
antigenspezifische
Immunität
verantwortlich
sind.
Nach
der
Infektion
bleiben
antigenspezifische Antikörper (AK) sowie T- und B-Gedächtniszellen erhalten, um bei erneutem
Kontakt mit dem Antigen binnen kurzer Zeit eine angemessene Abwehrreaktion zu ermöglichen (Prlic
et al., 2007).
T-Zellen exprimieren auf ihrer Zelloberfläche einen klonotypischen T-Zell-Rezeptor (TCR), mit dem
sie antigene Peptide auf Major-Histokompatibilitätskomplex (MHC) -Molekülen erkennen
(Zinkernagel und Doherty, 1979; Viret and Janeway, 1999). Die Hauptgruppe der T-Zellen exprimiert
einen TCR, der aus einer α- und einer β-Kette besteht. Je nachdem, welchen Korezeptor diese TZellen exprimieren, weden sie in CD8+ und CD4+ T-Zellen unterteilt. Der Korezeptor entscheidet
darüber, welche Klasse von MHC-Molekülen gebunden wird (Rudolph et al., 2006).
Zytotoxische T-Zellen, die den CD8-Korezeptor tragen, erkennen Peptide, die auf MHC-Klasse-I
(MHC-I) -Molekülen präsentiert werden, T-Zellen, die den CD4-Korezeptor tragen, erkennen Peptide
1
I. Einleitung
im Kontext von MHC-Klasse-II (MHC-II) -Molekülen und werden abhängig von ihrer Funktion in
weitere Untergruppen eingeteilt.
1.2
Die zentrale Bedeutung der CD4+ T-Zellen für die antigenspezifische Immunantwort
CD4+ T-Zellen spielen eine entscheidende Rolle in der Initiation und Koordination der adaptiven
Immunabwehr. Durch die Sekretion von Zytokinen und die Expression membranständiger Liganden
regulieren CD4+ T-Zellen zelluläre und humorale Immunantworten, einschließlich der Ausbildung des
immunologischen Gedächtnisses. Da für die Produktion hochaffiner Antikörper durch B-Zellen CD4+
T-Zellhilfe benötigt wird, wurden CD4+ T-Zellen ursprünglich als T-Helferzellen bezeichnet. CD4+ THelferzellen vom Typ I (TH1-Zellen) bewirken proinflammatorische Reaktionen durch die
Ausschüttung der Zytokine Interferon-γ (IFNγ) und Tumornekrosefaktor-α (TNFα) und lösen zudem
die Aktivierung von Makrophagen und DC aus. Durch die Konditionierung von DC und die
Bereitstellung von T-Zell-Wachstumsfaktoren wie Interleukin-2 (IL-2) sind CD4+ T-Zellen auch an
der Initiation und Aufrechterhaltung vieler zytotoxischer CD8+ T-Zell-Antworten beteiligt. CD4+ THelferzellen vom Typ II (TH2-Zellen) unterstützen die humorale Immunantwort der B-Zellen durch
die Ausschüttung anderer Zytokine wie z.B. Tumorwachstumsfaktor-β (TGF-β), IL-4, IL-5, IL-10
und IL-13 (Del Prete et al., 1998). Darüber hinaus aktivieren CD4+ T-Zellen indirekt oder direkt
verschiedene Effektoren der angeborenen Immunantwort wie Makrophagen, Granulozyten oder
Natürliche Killerzellen. Neben ihren Helferfunktionen werden CD4+ T-Zellen auch für die
Eliminierung intrazellulär lebender Bakterien (z.B. Mycobacterium tuberculosis) benötigt (Monney et
al., 2002), und tragen direkt zur Eliminierung von Virus-infizierten, maligne transformierten und
allogenen Zellen bei (Appay, 2004; Heller et al., 2006). In den letzten Jahren wurden weitere
Untergruppen der CD4+ T-Zellen identifiziert wie z.B. die CD25+/Foxp3+ regulatorischen T-Zellen
(Treg), die Immunantworten kontrollieren, oder TH17-Zellen, die entzündliche Prozesse bei Infektionen
steuern, aber auch zur Entstehung von Autoimmunerkrankungen beitragen können (Afzali et al.,
2007).
Aufgrund dieser zentralen Stellung in der Steuerung antigenspezifischer Immunantworten führen
Dysregulationen der CD4+ T-Zell-Antwort oftmals zur Manifestation von Viruserkrankungen oder zur
Entstehung
von
Autoimmunerkrankungen.
Für
das
Verständnis
und
die
Modulation
antigenspezifischer Immunantworten ist somit die Kenntnis von Funktion, Regulation und Spezifität
der CD4+ T-Zellen von entscheidender Bedeutung.
2.
Die Antigenpräsentation
2.1
Die Struktur der MHC-Moleküle
MHC-I-Moleküle bestehen aus einer α-Kette, die nicht-kovalent mit einem β2-MikroglobulinMolekül assoziiert ist. Die α1- und α2-Domänen der α-Kette bilden eine Antigenbindungstasche, die
eine geschlossene Konformation aufweist (Abb. 1). Aus diesem Grund liegt die Größe der
2
I. Einleitung
gebundenen Peptide relativ konstant zwischen 8-11 Aminosäuren (AS) (Rammensee et al., 1993
Townsend et al., 1989). MHC-I-Moleküle sind auf allen kernhaltigen Körperzellen unterschiedlich
stark exprimiert.
α2
α1
α3
β 2Mikroglobulin
a
b
Abb. 1: Struktur des MHC-I-Moleküls
a) Domänenstruktur eines MHC-I-Moleküls bestehend aus einer membranständigen α-Kette und einem
kovalent gebundenen β2-Mikroglobulin. Die α1- und α2-Domänen der α-Kette bilden die
Antigenbindungstasche, die eine geschlossene Konformation aufweist. b) Dreidimensionale Proteinstruktur
mit einem gebundenen Peptid (rot). (Verändert nach Janeway et al., 2005).
MHC-II-Moleküle setzen sich aus einer α- und einer β-Kette zusammen. Beide tragen zur Ausbildung
der Antigenbindungstasche bei, die im Unterschied zu MHC-I-Molekülen eine an den Enden offene
Konformation besitzt (Abb. 2). Aus diesem Grund kann die Länge der gebundenen Peptide stark
variieren und liegt in der Regel zwischen 13 und 25 AS. MHC-II-Moleküle sind konstitutiv nur auf
sogenannten professionellen, antigenpräsentierenden Zellen (pAPC) exprimiert. Hierzu zählen DC,
Makrophagen, B-Zellen sowie epitheliale Zellen des Thymus. Darüber hinaus sind verschiedene
Zelltypen insbesondere endothelialer und parenchymaler Herkunft (Keratinozyten, Hepatozyten, etc.),
in der Lage nach Induktion mit inflammatorischen Zytokinen (IFNγ, TNFα) MHC-II-Moleküle zu
exprimieren. Da diese Zellen nur konditional MHC-II-Moleküle exprimieren, werden sie nichtprofessionelle APC (nicht-pAPC) genannt.
β1
α1
β2
α2
a
b
Abb. 2: Struktur des MHC-II-Moleküls
a) Domänenstruktur eines MHC-II-Moleküls. Das MHC-II-Heterodimer besteht aus einer α- und einer βKette, die beide mit ihrer α1- bzw. β1-Domäne an der Ausbildung der Antigenbindungstasche beteiligt sind.
Diese weist eine an den Enden offene Konformation auf. b) Dreidimensionale Proteinstruktur mit einem
gebundenen Peptid (rot). (Verändert nach Janeway et al., 2005)
3
I. Einleitung
2.2
Die klassischen Antigenpräsentationswege
2.2.1
Der klassische MHC-I-assoziierte Antigenpräsentationsweg
Peptide, die auf MHC-I-Molekülen präsentiert werden, stammen hauptsächlich von intrazellulären
Proteinen, die vom Proteasom, einem zytosolischen Multienzymkomplex, in Peptidfragmente
gespalten werden (Abb. 3). Diese werden über einen in der Membran des Endoplasmatischen
Retikulums (ER) lokalisierten Transporter (TAP: transporter associated with antigen processing)
ATP-abhängig in das Lumen des ER transferiert (Heemels und Ploegh, 1995). Manche Peptide werden
über zytosolische Peptidasen oder durch ER-lokalisierte Aminopeptidasen weiter prozessiert. Im ER
binden Peptide von 8-11 AS an neu synthetisierte MHC-I-Moleküle mit Hilfe verschiedener
Chaperone wie z.B. Calnexin, BiP oder Calretikulin. Diese sind zur Faltung vieler Proteine und zum
Schutz der MHC-I-Moleküle vor Degradation notwendig. Nur etwa 5% der ins ER transportierten
Peptide binden an MHC-I-Moleküle (Rammensee et al., 1997), der Rest wird höchstwahrscheinlich
über das Translokon (Sec61p-Kanal) zurück ins Zytoplasma exportiert und dort vollständig degradiert
(Koopmann et al., 2000). Beladene MHC-I-Peptid-Komplexe verlassen das ER und werden über den
Golgi-Apparat an die Zelloberfläche gebracht (Pamer und Cresswell, 1998; Rock und Goldberg,
1999).
CD8+
Plasmamembra n
zytosolisch e
Antigene
Proteasom
Golgi
TAP
antigene
Peptide
MHC-I
MHC-I-Pepti d
Abb. 3: Klassischer MHC-I-assoziierter Antigenpräsentationsweg
Zytoplasmatische Proteine werden durch das Proteasom in Peptide gespalten und diese über den transporter
associated with antigen processing (TAP) ins ER transportiert. Im ER binden die Peptide an neusynthetisierte
MHC-I-Moleküle und werden über das Tans-Golgi-Netzwerk (Golgi) an die Zelloberfläche transportiert, wo
sie von CD8+ T-Zellen erkannt werden können (verändert nach Heath und Carbone, 2001).
4
I. Einleitung
2.2.2
Der klassische MHC-II-assoziierte Antigenpräsentationsweg
MHC-II-Moleküle präsentieren hauptsächlich Peptide exogener Antigene (Abb. 4). Um dies zu
gewährleisten, sind eine räumliche und zeitliche Koordination von Synthese, intrazellulärem Transport
und Prozessierung von MHC-II-Molekülen sowie die Aufnahme und der Abbau von exogenem
Antigen unablässig.
Endozytose
exogener Proteine
CD4+
Endosom
Golgi
MIIC
Antigene
Peptide
MHC-II-Ii
MHC-II-CLIP
MHC-II-Peptid
Endoplasmatisches
Retikulum
MHC-II-Ii
Abb. 4: Klassischer MHC-II assoziierter-Antigenpräsentationsweg
Exogene Proteine werden durch Endozytose in die APC aufgenommen. Durch Ansäuerung des Endosoms
kommt es zur Aktivierung endosomaler Proteasen, die die aufgenommenen Proteine in Peptide spalten. MHCII-Moleküle gelangen über das Trans-Golgi-Netzwerk (Golgi) in das endosomal/lysosomale Kompartiment,
wo durch Abbau der invarianten Kette (li) und deren Spaltprodukt CLIP (class II invariant chain associated
peptide) die Reifung der MCH-II-Moleküle stattfindet. Im sogenannten MHC-II-Kompartiment (MIIC) binden
die Peptide der endozytierten Antigene an reife MHC-II-Moleküle. Mit diesen werden sie an die
Zelloberfläche transportiert und dort den CD4+ T-Zellen präsentiert (verändert nach Heath und Carbone,
2001).
Die aus einer α- und β-Kette bestehenden MHC-II-Moleküle werden kotranslational in die ERMembran eingefügt. Dort bilden sie einen Komplex mit der invarianten Kette (li). Diese verfügt über
eine Trimerisierungsdomäne im C-terminalen Bereich, wodurch Nonamerkomplexe aus drei li und
drei αβ-Dimeren entstehen (Cresswell et al., 1996). Die li erfüllt zwei wichtige Funktionen in der
Antigenpräsentation. Zum einen bindet ein Abschnitt von li namens CLIP (class II invariant chain
associated peptide) die Peptidbindungstasche des MHC-II-Moleküls, wodurch das MHC-Molekül
stabilisiert und eine frühzeitige Beladung mit Peptiden im ER verhindert wird. Zum anderen enthält
der zytoplasmatische N-Terminus von li Signalsequenzen, die MHC-II-Moleküle über das GolgiNetzwerk ins endosomale Kompartiment dirigieren.
5
I. Einleitung
Die Reifung und Beladung der neusynthetisierten MHC-II-Moleküle geschieht nach schrittweiser liDegradation im späten endosomalen Kompartiment. Der Abbau der invarianten Kette beginnt mit der
Abspaltung des C-terminalen Fragments, welches die Trimerisierungsdomäne enthält, was zu einer
Dissoziation der nonameren Komplexe führt. Nach schrittweiser C-terminaler Verkürzung verbleibt
lediglich das CLIP-Fragment in der Peptidbindungstasche. Für die Entfernung von CLIP und die
Beladung der MHC-II-Moleküle mit Peptiden ist wahrscheinlich das nicht klassische MHC-IIMolekül HLA-DM (human leucocyte antigen-DM) notwendig (Vogt und Kropshofer, 1999; Busch et
al., 2000). Dieses übernimmt eine Chaperonfunktion bei der Beladung von leeren bzw. CLIPgebundenen MHC-II-Molekülen (Sloan et al., 1995). Die Beladung von MHC-II-Molekülen kann
überall im endosomal/lysosomalen Kompartiment mit unterschiedlicher Effizienz erfolgen (Castellino
et al., 1995). Peptid/MHC-II-Komplexe werden dann über Transportvesikel (CIIVs; class II vesicles)
zur Zelloberfläche transportiert und dort für etwa 36 Stunden präsentiert (Turley et al., 2000; Mellman
und Steinman, 2001). Im Gegensatz zu MHC-I-Molekülen können vormals beladene, internalisierte
MHC-II-Moleküle im frühen endosomalen System erneut mit Peptid beladen werden und wieder an
die Oberfläche gelangen (Pinet et al., 1995; Pinet und Long, 1998). Dieser Beladungsweg wird MHCII-Recycling-Präsentationsweg genannt.
2.3
Die Aufnahme exogener Antigene
pAPC zeichnen sich durch eine hohe Phagozytoseaktivität aus. Ihre Hauptaufgabe ist es, ihre
Umgebung nach möglichen Pathogenen wie z.B. Bakterien, Viren oder toxischen Proteinen
abzusuchen. Somit stellt die Aufnahme von Antigen den ersten Schritt der MHC-II-restringierten
Antigenpräsentation auf der Zelloberfläche dar.
Exogene Proteine werden über Endozytose aufgenommen. Durch die Ansäuerung der Endosomen
werden schrittweise endosomale Proteasen aktiviert und die endozytierten Proteine in Peptide
gespalten. Nach Fusion der Endosomen mit dem MIIC werden die Peptide auf MHC-II-Molekülen
beladen und bilden mit diesen die MHC-II-Peptid-Komplexe (Pierre und Mellman, 1998b). Für die
Aufnahme extrazellulären Materials stehen den pAPC mehrere Endozytosemechanismen zur
Verfügung. Prinzipiell ist die aktinabhängige unspezifische Endozytose von umgebenden Partikeln
(Phagozytose) oder Medium (Makropinozytose) von der nicht-aktinabhängigen rezeptorvermittelten
Endozytose, die über spezielle Membranmikrodomänen erfolgt (Clathrin/Caveolinabhängige
Pinozytose) zu unterscheiden (Abb. 5) (Bakke und Nordeng, 1999; Conner und Schmid, 2003). Die
rezeptorvermittelte Aufnahme ist 100- bis 1000-fach effizienter (Norbury, 2006), aber aufgrund der
fehlenden Diversität nur auf einige wenige Antigene beschränkt. Beispiele hierfür sind das Flagellin
und das α-Mannan der Hefenzellwand, die über den Toll-like receptor 5 (TLR5) bzw. den MannoseRezeptor aufgenommen werden. Alle diese Rezeptoren sind membranständig und werden nach
Bindung ihres Antigens von der APC internalisiert (Watts, 1997; van Bergen et al., 1999).
6
I. Einleitung
Bei der aktinabhängigen Phagozytose, die auch als „cell eating“ bezeichnet wird, können große
Partikel mit einem Durchmesser von mehr als 1µm, wie z.B. apoptotische Zellen oder Mikroben, von
Zellen aufgenommen werden, wobei auch das umgebende Medium mit in die Zelle gelangt.
Phagozytose wird hauptsächlich bei Makrophagen, neutrophilen Zellen und Monozyten, aber auch in
geringerem Ausmaß bei unreifen DC beobachtet (Matsuno et al., 1996). B-Zellen phagozytieren
dagegen kaum (Stockinger et al., 1992).
Pinozytose
Phagozytose
(partikelabhängig)
Makropinozytose
Caveolinvermittelte
Endozytose
Clathrinvermittelte
Endozytose
aktinabhängig
Clathrin- und
Caveolinunabhängige
Endozytose
nicht-aktinabhängig (rezeptorvermittelt)
Abb. 5: Endozytosearten
Schematische Darstellung verschiedener Endozytosearten zur Internalisierung von Antigenen (verändert nach
Conner und Schmid, 2003).
Die Pinozytose (cell drinking) kann in mindestens vier Arten unterteilt werden.
Bei der ebenfalls aktinabhängigen, unspezifischen Makropinozytose stülpt sich die Plasmamembran
mit Hilfe des Zytoskeletts nach außen und schließt dabei große Mengen extrazellulärer Flüssigkeit in
große Vesikel (Makropinosomen) ein. Die Makropinozytose kommt vor allem bei Makrophagen und
unreifen DC und in geringerem Maße bei B-Zellen vor (Sallusto et al., 1995, Aderem et al., 1999;
Norbury, 2006).
Im Gegensatz zu Phagozytose und Makropinozytose erfolgt die rezeptorvermittelte Aufnahme von
extrazellulärem
Material
aktinunabhängig
in
speziellen
Membranmikrodomänen.
Ligand-
Rezeptorkomplexe werden typischerweise in Clathrin-haltige Vesikel aufgenommen oder zu einem
geringeren Anteil von Caveolin-enthaltenden Einbuchtungen internalisiert. Bei der Clathrinabhängigen, rezeptorvermittelten Endozytose, die in allen Säugerzellen vorkommt, werden
Oberflächenrezeptoren nach Bindung ihrer extrazellulären Liganden in sogenannten clathrin-coated
pits gesammelt und über clathrin-coated vesicles in die Zelle aufgenommen. Über diesen
Endozytoseweg gelangen z.B. Ferrotransferrin oder LDL (low-density lipoprotein) in das Zellinnere
(Norbury, 2006). Bei den ursprünglich elektronenmikroskopisch als Omega-förmige Invaginationen
der Zellmembran beschriebenen Caveolae handelt es sich um Membranmikrodomänen, die durch eine
spezifische Lipidzusammensetzung gekennzeichnet sind und die durch Polymerisation der CaveolinProteine an der Zellmembran entstehen. Caveolin-vermittelte Endozytose kommt in vielen Zellen von
7
I. Einleitung
Säugetieren vor, bei DC wird ihre Existenz noch diskutiert (Anderson, 1998; Sowa et al., 2001).
Wahrscheinlich verfügen DC aber über eine verwandte Form, die Clathrin- und Caveolin-unabhängige
Endozytose genannt wird. Über diese Form der Endozytose ist noch sehr wenig bekannt. Unter dieser
Bezeichnung werden alle Formen der Endozytose zusammengefasst, die keinem der oben genannten
Mechanismen zugeordnet werden können (Mayor und Pagano, 2007).
Nicht-pAPC zeigen nur eine geringe Pinozytoseaktivität, weshalb sie extrazelluläre Antigene um ein
Vielfaches schlechter aufnehmen und präsentieren.
2.4
Die Antigenprozessierung im endosomal/lysosomalen Kompartiment
Das endosomal/lysosomale System wird in frühe und späte Endosomen und Lysosomen unterteilt. Die
frühen Endosomen, die sich hauptsächlich in der Peripherie der Zelle befinden, haben einen schwach
sauren pH-Wert. Proteine in frühen Endosomen werden entweder zur vollständigen Degradation in
späte Endosomen und Lysosomen dirigiert oder wieder zurück an die Zelloberfläche gebracht.
Letzteres dient hauptsächlich dem Recycling von Oberflächenrezeptoren. Späte Endosomen befinden
sich mehr im Inneren der Zelle und stehen mit frühen Endosomen über Mikrotubuli-abhängigen
Vesikeltransport in Verbindung. Auch aus diesem Kompartiment können Proteine für eine erneute
Verwendung von anderen getrennt werden. Der niedrige pH-Wert in den späten Endosomen führt zu
einer Aktivierung von Proteasen wie z.B. Cystein-Proteasen oder Aspartyl-Proteasen. Die Reifung zu
späten Endosomen erfolgt entweder durch kontinuierliche Ansäuerung oder durch die Verschmelzung
von Endosomen mit Lysosomen. Lysosomen haben einen stark sauren pH-Wert, ein aggressives
proteolytisches Millieu und sind wie späte Endosomen in der Nähe des Zellkerns lokalisiert.
Ausschlaggebend für die effiziente Beladung von MHC-II-Molekülen mit Peptiden in späten
endosomalen Vesikeln, auch MIIC genannt, ist ein Gleichgewicht zwischen der Degradation und der
Halbwertszeit der Peptidfragmente. Eine wichtige Rolle könnten dabei die MHC-II-Moleküle selbst
spielen. Aufgrund ihrer an den Enden offenen Peptidbindungstasche (Abb. 2) wird die Bindung
längerer Peptide (Degradationsintermediate) sowie ganzer (entfalteter) Polypeptidketten ermöglicht
(Deng et al., 1993; Nelson et al., 1997; Castellino et al., 1998). Auf diese Weise könnten MHC-IIMoleküle das Peptid vor Degradation schützen, nicht aber die überhängenden Enden der
Polypeptidkette, die von verschiedenen Endo- bzw. Exopeptidasen abgebaut werden können (Busch
et al., 2005).
2.5
Die alternativen Präsentationswege
Wie oben bereits dargestellt, präsentieren MHC-I- und MHC-II-Moleküle klassischerweise Peptide
aus unterschiedlichen zellulären Kompartimenten. MHC-I-Moleküle präsentieren überwiegend
Peptide von intrazellulären Proteinen, MHC-II-Moleküle Peptide des extrazellulären Raumes, der
Zellmembran und des endosomal/lysosomalen Kompartiments (Rudensky et al., 1991; Chicz et al.,
1992; Hunt et al., 1992; Rammensee et al., 1993). Diese Aufteilung der Antigenpräsentation
8
I. Einleitung
entsprechend der zellulären Lokalisation des Antigens ist aber nicht absolut, und Ausnahmen zu dieser
Regel wurden in beiden Präsentationswegen beschrieben (Malnati et al., 1992; Lich et al., 2000;
Mukherjee et al., 2001).
2.5.1
Kreuzpräsentation im MHC-I-Antigen-Präsentationsweg
Erste Hinweise darauf, dass auch extrazelluläre Antigene auf MHC-I-Molekülen präsentiert werden
können, lieferten Transplantationsexperimente in Mäusen. Wurden Mäusen Zellen einer Spendermaus
injiziert, die sich sowohl im MHC-I-Phänotyp, als auch in der Expression eines MinorHistokompatibilitäts-Antigens (mHA) von der Empfängermaus unterschieden, so erkannten CD8+ TZellen der transplantierten Tiere mHA-Peptide des Spenders auf MHC-I-Molekülen des Empfängers
(Bevan, 1976). Dies deutete darauf hin, dass die APC des Empfängers Antigene des Spenders
endozytiert und auf MHC-I-Molekülen präsentiert hatten.
Inzwischen ist bekannt, dass bestimmte DC auch exogene Antigene im Komplex mit MHC-IMolekülen auf der Zelloberfläche präsentieren können (Albert et al., 1998; Norbury, 2001; Blachere et
al., 2006). Dies ist essentiell für die Induktion einer Immunantwort gegen Mikroorganismen, die die
DC nicht infizieren. Man spricht in diesem Fall von Kreuzpräsentation oder cross-priming (Bevan,
2006). Wie Peptide extrazellulärer Proteine auf MHC-I-Molekülen präsentiert werden, ist bislang
unbekannt. Ein Teil des endozytierten Materials scheint entweder teilweise degradiert oder intakt aus
dem endosomalen Kompartiment ins Zytosol zu gelangen (endosomal escape), wo es nach Spaltung
durch das Proteasom TAP-abhängig ins ER gelangt (Ackman und Cresswell, 2004; Yewdell et al.,
1988; Rodriguez et al., 1999). Darüber hinaus wurde ein TAP-unabhängiger Präsentationsweg
postuliert, der den retrograden Transport von internalisiertem Antigen aus dem endosomalen
Kompartiment ins ER vorsieht, wo die Peptide an MHC-I-Moleküle binden können (Saric et al.,
2002).
2.5.2
Präsentation endogener Proteine auf MHC-II-Molekülen
Erste Hinweise darauf, dass auch Spaltprodukte intrazellulärer Proteine auf MHC-II-Molekülen
präsentiert werden können, lieferten 1989 Experimente von Jacobson und Mitarbeitern. Nach
Infektion von Zellen mit Masern- oder Influenza-Viren wurde eine Präsentation viraler,
zytoplasmatischer Proteine auf MHC-II-Molekülen beobachtet (Jacobson et al., 1989; Nuchtern et al.,
1990). Dieser Präsentationsweg wurde als „endogener MHC-II-Präsentationsweg“ bezeichnet (Lechler
et al., 1996). Wie intrazelluläre Antigene auf MHC-II-Molekülen präsentiert werden, war lange Zeit
unbekannt. Erste molekulare Details dieses Präsentationswegs wurden erst in letzter Zeit beschrieben,
wobei die unterschiedlichen experimentellen Ansätze zum Teil zu widersprüchlichen Ergebnissen
führten. Momentan werden drei verschiedene Konzepte bei der Interpretation der Ergebnisse
diskutiert. Diese Konzepte werden in den nächsten Abschnitten vorgestellt.
9
I. Einleitung
2.5.2.1
Die Beteiligung zytoplasmatischer Proteasen
Das erste Konzept geht von einer Beteiligung von Schlüsselkomponenten des MHC-IPräsentationsweges aus (Chen et al., 1990; Lich et al., 2000; Nuchtern et al., 1990; Mukherjee et al.,
2001). Studien mit zytosolischen Modellantigenen deuteten darauf hin, dass sowohl das Proteasom
und die Tripeptidylpeptidase II (TPPII) als auch andere, nicht näher charakterisierte Proteasen des
Zytoplasmas an der Herstellung von Peptiden für MHC-II-Moleküle beteiligt sein könnten (Lich et al.,
2000; Mukherjee et al., 2001). Hierzu wurden hauptsächlich die Ergebnisse aus Experimenten mit
chemischen Inhibitoren herangezogen, die mit Schlüsselkomponenten dieses Präsentationsweges
interferieren. Für zwei Modellantigene, Glutamat-Decarboxylase (GAD) und Ovalbumin, wurde eine
Beteiligung zytoplasmatischer Proteasen an der Herstellung antigener Peptide für MHC-II-Moleküle
beschrieben (Lich et al., 2000; Mukherjee et al., 2001). Bei der Bewertung dieser Ergebnisse ist
jedoch zu beachten, dass in beiden Studien experimentelle Ansätze gewählt wurden, die andere
zellphysiologische Prozesse stark beeinflussen. Dies war zum einen der Transfer von exogenen
Proteinen ins Zytoplasma durch hypertone Lyse pinozytischer Vesikel (Mukherjee et al., 2001), zum
anderen die Verwendung von stabil mit dem Antigen transfizierten pAPC. Die hypertone Lyse der
endosomalen Vesikel führte zur Freisetzung des Inhalts in das Zytoplasma (Chen et al., 1990;
Mukherjee et al., 2001). Ein schwerwiegender Nachteil dieser Methode ist die Zerstörung der
Endosomen und die Freisetzung endosomaler Proteasen in das Zytoplasma, wodurch nur sehr
eingeschränkt Aussagen über den Antigenpräsentationsweg möglich sind. Außerdem kann nicht
ausgeschlossen werden, dass Teile des aufgenommenen Proteins im endosomalen System degradiert
werden und direkt in den klassischen MHC-II-Präsentationsweg einmünden. Um bei konstitutiver
zellulärer Expression des Antigens Effekte der verwendeten Inhibitoren erkennen zu können, war es in
den Versuchen von Lich und Mitarbeitern notwendig, bereits gebildete MHC-II-Peptid-Komplexe
durch Behandlung der Zellen mit Säure zu dissoziieren und die Zellen im Anschluss daran mit
Inhibitoren zu behandeln (Lich et al., 2000). Da in dieser Studie keine funktionelle Negativkontrolle
mitgeführt wurde (Modellantigen, dessen Präsentation nicht inhibiert werden sollte), kann nicht
ausgeschlossen werden, dass die Säurebehandlung, gefolgt von der Inkubation mit Inhibitoren zu einer
verminderten Antigenpräsentation führte.
2.5.2.2
Die Beteiligung der Makroautophagie
Die Versuche mit dem zytoplasmatischen Modellantigen Neomycin-Phosphotransferase II (NeoR)
durch Nimmerjahn und andere Kollegen der eigenen Arbeitsgruppe wiesen zum ersten Mal auf die
Beteiligung von Makroautophagie (oftmals nur als Autophagie bezeichnet) an der endogenen MHC-IIrestringierten Präsentation zytoplasmatischer Proteine hin (Nimmerjahn et al., 2003). Bei der
Autophagie werden Teile des Zytoplasmas in so genannte Autophagosomen aufgenommen, die mit
Lysosomen verschmelzen und als Autolysosomen Anschluss an das MHC-II-Kompartiment (MIIC)
erhalten (vgl. Kapitel I.3.1). Nimmerjahn und Kollegen konnten mit Hilfe biochemischer und
10
I. Einleitung
zellbiologischer
Methoden
nachweisen,
dass
das
NeoR-Antigen
als
intaktes
Protein
in
endosomal/lysosomale Vesikel gelangte und dass die spezifische Inhibition der Autophagie durch 3Methyladenin (3-MA) und Wortmannin zu einer Stabilisierung und Anreicherung des NeoR im
Zytoplasma sowie zu einer verminderten Aufnahme des Antigens in das endosomal/lysosomale
Kompartiment führte. Die verminderte Aufnahme in das vesikuläre Kompartiment korrelierte mit
einer starken Abnahme der MHC-II-restringierten Präsentation des Antigens, so dass ein direkter
Zusammenhang zwischen Autophagie-vermitteltem Abbau und MHC-II-assoziierter Präsentation des
Antigens postuliert werden konnte (Abb. 6).
Endozytose von
exogenen Proteinen
CD4+
Plasmamembran
Endosom
Lysosom
MIIC
Autophagosom
Autolysosom
Abb. 6: Autophagie-abhängige Präsentation zytoplasmatischer Antigene auf MHC-II-Molekülen
Autophagie beinhaltet den Einschluss von Teilen des Zytoplasmas durch eine Doppelmembran. Diese
Autophagosomen verschmelzen mit Vesikeln des endosomal/lysosomalen Kompartiments, was zu einer
Ansäuerung und zur Bildung sogenannter Autolysosomen führt. Die aufgenommenen Proteine und Organellen
werden durch lysosomale Proteasen zu Peptiden abgebaut, die dann im MHC-II-Kompartiment (MIIC) auf
MHC-II-Molekülen binden und auf der Zelloberfläche präsentiert werden können.
In der Zwischenzeit konnte auch für das nukleär lokalisierte Epstein-Barr-virus nuclear antigen 1
(EBNA1) eine Autophagie-vermittelte Präsentation nachgewiesen werden (Paludan et al., 2005). Wie
dieses Kernprotein in den im Zytoplasma stattfindenden, autophagischen Abbauweg gelangte, blieb in
diesen Untersuchungen ungeklärt. Darüber hinaus wurde auch für das epitheliale Tumorantigen
Mucin 1 (Muc1) eine zumindest zum Teil durch 3-MA inhibierbare und somit Autophagie-abhängige
Antigenpräsentation beschrieben. Allerdings konnten mögliche toxische Nebeneffekte des Inhibitors
als Ursache nicht ausgeschlossen werden (Dörfel et al., 2005).
11
I. Einleitung
Eine bedeutende Rolle von Autophagie bei der Präsentation nukleärer Antigene auf MHC-IIMolekülen implizierten auch massenspektroskopische Untersuchungen der auf MHC-II-Molekülen
präsentierten Antigene (Dengjel et al., 2005). Nach Induktion von Autophagie durch Serum- und
Aminosäurenentzug änderte sich das MHC-II-Antigenrepertoire von LCL (lymphoblastoid cell line)
grundlegend. Während in uninduziertem Zustand v.a. sezernierte und membranständige Antigene
präsentiert wurden, überwogen nach Induktion von Autophagie intrazelluläre und lysosomale
Antigene.
2.5.2.3
Die Beteiligung der Chaperon-vermittelten Autophagie
Jüngere Daten von Zhou und Mitarbeitern sprachen dafür, dass neben der so genannten
Makroautophagie auch die Chaperon-vermittelte Autophagie (vgl. Kapitel I.3.1) zur endogenen
Antigenpräsentation auf MHC-II-Molekülen beiträgt (Zhou et al., 2005). Sie beobachteten, dass die
Inhibition der zytoplasmatischen Protease Calpain im Falle von GAD zu einer fast vollständigen
Blockierung der Antigenpräsentation führte (Lich et al., 2000). Allerdings hatte die Inhibition von
TAP keine Auswirkung auf die Antigenpräsentation, so dass eine frühzeitige Beladung von MHC-IIMolekülen mit Peptiden im ER ausgeschlossen werden konnte. Die Antigenpräsentation konnte durch
die Überexpression des Chaperonmoleküls hsc70 und des lysosomalen Glykoproteins Lamp2A
(lysosomal membrane associated protein 2A) in antigenexprimierenden Zellen verstärkt und durch die
Herunterregulation beider Moleküle reduziert werden. Dies ließ auf eine Beteiligung von Chaperonvermittelter Autophagie an der Antigenpräsentation schließen (Zhou et al., 2005). Die Chaperonvermittelte Autophagie erfolgt über die Bindung von hsc70 an zytoplasmatische Proteine, die
bestimmte Erkennungssequenzen aufweisen. Diese Komplexe binden an den zytoplasmatischen Teil
von Lamp2A, was zu einer Internalisierung und zum Abbau der gebundenen Proteine in Lysosomen
führt. Ob die beschriebenen Effekte auf die veränderte Expression der an der Chaperon-vermittelten
Autophagie beteiligten Proteine hsc70 und Lamp2A zurückzuführen waren, oder die Etablierung
stabiler Transfektanten zu Sublinien mit veränderten Phänotyp führten, ist momentan nicht zu
beantworten. Da die beschriebenen Erkennungsmotive nur in etwa 30% der zytoplasmatischen
Proteine vorkommen, ist dieser Präsentationsweg vermutlich nur für einen Teil der zytoplasmatischen
Proteine zugänglich. Es ist jedoch nicht bekannt, ob die von Zhou und Mitarbeiter verwendeten
Modellantigene die beschriebenen Signalsequenzen trugen. Darüber hinaus wurde dieser
Präsentationsweg nur für Proteine und nicht für Peptide beschrieben (Cuervo und Dice, 1996).
Untersuchungen der eigenen Arbeitsgruppe mit dem Modellantigen NeoR zeigten keine verstärkte
Präsentation auf MHC-II-Molekülen, wenn das hsc70-Erkennungsmotiv an NeoR angefügt wurde
(unveröffentlichte Daten). Somit verhält sich NeoR entweder atypisch, oder dieser Chaperonvermittelte Abbauweg beruht auf weiteren und bislang unbekannten biochemischen Eigenschaften des
Substrats.
12
I. Einleitung
3.
Autophagie
Das Wort „Autophagie“ entstammt dem Griechischen und setzt sich aus den Worten „autos“ („selbst“)
und „phagein“ („essen“) zusammen. Autophagie ist ein in allen Eukaroyten evolutionär
hochkonservierter Prozess (Cuervo, 2004; Levine und Klionsky, 2004; Meijer und Codogno, 2004;
Levine und Yuan, 2005). Das Phänomen der „Selbst-Verdauung“ zytoplasmatischer Anteile unter
Mangelzuständen wurde erstmals von Ashford und Porter beschrieben (Ashford und Porter, 1962). Die
Erforschung der molekularen Grundlagen der Autophagie begann 1992 mit der Beobachtung, dass
Hefezellen unter nährstoffarmen Bedingungen Vesikel bildeten, die Mitochondrien und Ribosomen
enthielten und die als autophagische Körper bezeichnet wurden (Tsukada und Ohsumi, 1993).
Autophagie ist die generelle Bezeichnung für intrazelluläre Prozesse, bei denen zytosolische
Komponenten in Lysosomen mit Hilfe lysosomaler Enzyme degradiert werden.
3.1
Die Funktion der Autophagie
Die Identifizierung von Autophagie-assoziierten Genen in der Hefe (Apg) und entsprechender
Orthologe in höheren Organismen (Atg) belegte nicht nur die hohe evolutionäre Konservierung dieses
Abbauprozesses, sondern erlaubte auch die molekulargenetische und molekularbiologische
Untersuchung von Autophagie in verschiedenen Modellsystemen (Tsukada und Ohsumi, 1993; Kim
und Klionsky, 2000; Mizushima et al., 2003; Meijer und Codogno, 2004).
Autophagie ist neben dem Proteasom das wichtigste zelluläre Abbausystem. Durch das Proteasom
werden kurzlebige Proteine beispielsweise der Zellzykluskontrolle oder Proteine, die Teil der
Stressantwort auf DNA-Schäden sind, selektiv degradiert (Kim und Klionsky, 2000; Mizushima et al.,
2003; Edinger und Thompson, 2003). Über Autophagie werden langlebige Makromoleküle und auch
ganze Organellen wie z.B. defekte Mitochondrien abgebaut.
Die Autophagie kann in Makroautophagie, Mikroautophagie und Chaperon-vermittelte Autophagie
unterteilt werden, wobei der Makroautophagie, die wie schon erwähnt, häufig nur als Autophagie
bezeichnet wird, die größte Bedeutung zukommt (Mizushima et al., 2003; Meijer und Codogno, 2004;
Gozuacik und Kimchi, 2004). Hierbei werden Teile des Zytoplasmas wahllos durch eine
Doppelmembran ungeklärter Herkunft eingeschlossen. Diese sogenannten Autophagosomen
fusionieren mit Vesikeln des endosomal/lysosomalen Systems, was zum Abbau des eingeschlossenen
Materials durch lysosomale Enzyme führt.
Bei der Mikroautophagie wird zytoplasmatisches Material (Zytoplasma, Peroxisomen oder Teile des
Zellkerns) durch Invagination der Lysosomenmembran aufgenommen (Levine und Klionsky, 2004;
Majeski und Dice, 2004; Thompson et al., 2005).
Die Chaperon-vermittelte Autophagie ist ein direktes und selektives Degradationssystem, bei dem
zytosolische Proteinsubstrate aufgrund von Signal-Sequenzen von zytosolischen und lysosomalen KoChaperonen der Hsp70-Familie wie z.B. hsc70 erkannt werden. Der Proteinkomplex bindet an den
lysosomalen Rezeptor Lamp2A. Das Substrat wird entfaltet, in das Lysosomenlumen transportiert und
13
I. Einleitung
mit Hilfe lysosomaler Proteasen abgebaut (Ogier-Denis und Codogno, 2003; Majeski und Dice, 2004;
Mizushima, 2004; Schmid et al., 2006).
Die Hauptaufgabe der Autophagie ist die Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase. Sie ist auf
geringem Niveau in allen Zellen konstitutiv aktiv, die über ein lysosomales Kompartiment verfügen.
Durch Autophagie werden v.a. beschädigte oder überflüssige Produkte entfernt. Davon sind sowohl
lösliche, zytosolische Proteine als auch Organellen (Mitochondrien, Peroxisomen und Ribosomen)
oder Organellenteile (Regionen des Golgi-Apparates oder des ER) betroffen. Die Zusammensetzung
des Zytoplasmas und die Größe des ER wird so reguliert (Meijer und Codogno, 2004; Codogno und
Meijer, 2005).
Einige morphologische Studien zeigten, dass bei bestimmten Erkrankungen eine Störung oder
nachhaltige Veränderung der Autophagie nachweisbar ist. Ob eine veränderte Autophagie-Aktivität
Ausdruck eines adaptiven oder pathogenen Geschehens ist, ist noch unklar (Meijer und Codogno,
2004; Cuervo, 2004; Levine und Yuan, 2005; Pattingre et al., 2005).
3.2
Die molekulare Regulation der Autophagie
Die Entdeckung der Autophagie-Gene, welche die Autophagie in der Hefe Saccharomyces cerevisiae
regulieren, trug entscheidend zum Verständnis der molekularen Kontrolle der Autophagie bei
(Tsukada und Ohsumi, 1993). Die Mehrheit der Autophagie-Gene wird konstitutiv exprimiert, die
Genprodukte werden jedoch nur in Stresssituationen wie z.B. bei Nährstoffmangel von der Zelle
aktiviert.
Die Regulation der Autophagie erfolgt sowohl durch zellautonome als auch durch exogene Signale.
Dazu zählen beispielsweise intrazelluläre ATP- und Aminosäurespiegel sowie Hormone und
Wachstumsfaktoren.
Ein Mangel an Aminosäuren (AS) kann mindestens über drei Wege zu einer Aktivierung der
Autophagie führen (Codogno und Meijer, 2005). Erstens über einen noch nicht näher
charakterisierten, direkten Weg (Kanazawa et al., 2004), zweitens über die Aktivierung der Klasse IIIPI3K (Phosphatidylinositol 3-Kinase) im Komplex mit Beclin1 (Liang et al., 1999) und drittens über
die Hemmung von mTOR (mammalian target of rapamycin) (Beugnet et al., 2003). Die
Serin/Threonin-Kinase mTOR steuert unter anderem Zellwachstum und -proliferation in Abhängigkeit
vom Nährstoff- und Energiezustand der Zelle (Inoki et al., 2003b; Corradetti et al., 2004). Aber auch
die Inhibition der Autophagie durch bestimmte Wachstumsfaktoren wie z.B. Insulin wird durch
mTOR vermittelt. Die Bindung von Insulin an den Insulinrezeptor führt über die Klasse I-PI3K zu
einer Aktivierung von mTOR (Roux et al., 2004).
Bislang sind zwei Substrate von mTOR bekannt; S6K1 (p70 ribosomal S6 kinase 1) und 4E-BP1
(eukaryotic initiation factor 4E (eIF-4E) binding protein 1). Die Phosphorylierung von S6K1 führt zu
einer Phosphorylierung von S6 (Ribosomales Protein S6) und somit zu einer verstärkten Translation
von mRNA die eine Oligo-Pyrimidinsequenz in ihrer 5’-untranslatierten Region tragen (Murakami et
14
I. Einleitung
al., 2004). Diese mRNA kodieren vorwiegend für ribosomale Proteine. Die Phosphorylierung von
4E-BP1 durch mTOR hingegen bewirkt die Freisetzung von eIF-4E, was zu einer verbesserten
Translation von gekappten mRNA führt (Fingar et al., 2002 und 2004; Hay und Sonenberg, 2004;
Corradetti und Guan, 2006). Die Inhibition von mTOR, beispielsweise durch Aminosäuremangel oder
niedrigen ATP-Spiegel, drosselt nicht nur die Neusynthese von Proteinen, sondern fördert auch den
Abbau zytoplasmatischer Proteine durch Autophagie, da die S6K1 nicht aktiviert wird und somit S6
nicht phosphoryliert vorliegt. Wie nicht phosphoryliertes S6 Autophagie induziert, ist bislang noch
unbekannt. Verschiedene Agenzien können die oben beschriebenen Signalwege induzieren oder
reprimieren. Rapamycin, ein spezifischer Inhibitor von mTOR, führt zu einer Aktivierung der
Autophagie sowie zur Repression der Translationsaktivität, da die Phosphorylierung von S6 und
4E-BP1 inhibiert wird. 3-MA und Wortmannin sind Inhibitoren der Autophagie, und wirken über die
Inhibition der Klasse III-PI3K (Blommaart et al., 1997; Petiot et al., 2000). Die Klasse III-PI3K wurde
im Komplex mit dem Apg6 / Beclin1 gefunden, welches an der Autophagosomen-Bildung beteiligt ist
(Kihara et al., 2001).
Die beschriebenen Wege sowie die aufgeführten Inhibitoren sind in Abb. 7 schematisch aufgezeigt.
InsulinRezeptor
Rapamycin
AminosäureMangel
Klasse I-PI3K
?
mTOR
S6K1
S6K1
4E-BP1/eIF-4E
4E-BP1
S6
Autophagie
pS6
eIF-4E
5`TOP mRNA
Translation
Cap-mRNA
Translation
Klasse III-PI3K/Beclin1
3-MA
Wortmannin
Abb. 7: Induktion und Repression von Autophagie
Rapamycin führt über eine Hemmung von mTOR zu einer Aktivierung von Autophagie.
Inaktives mTOR (graues Dreieck); aktives mTOR (grünes Dreieck);
Abkürzungen: PI3K: Phosphatidylinositol 3-Kinase; mTOR: mammalian target of rapamycin; S6:
Ribosomales Protein S6; pS6: phosphoryliertes Ribosomales Protein S6; S6K1: 70kDa S6-Kinase1; 4E-BP1:
eukaryoten Initiationsfaktor 4E-Bindungsprotein 1; eIF-4E: eukaryoten Initiationsfaktor 4E; 3-MA: 3Methyladenin.
An der Bildung des Autophagosoms sind zwei Konjugationssysteme beteiligt, das Apg8- sowie das
Apg12-System. Im Folgenden soll näher auf das Apg8-System eingegangen werden (Abb. 8).
Der C-Terminus des Apg8-Proteins, welches in humanen Zellen auch Atg8/LC3 (light chain 3)
genannt wird, wird durch die Cystein-Protease Apg4 abgespaltet, wodurch ein Glycinrest exponiert
wird. Dieses G116 wird durch Apg7 ATP-abhängig aktiviert und mit Apg7 konjugiert. Apg8 wird
dann auf das Apg3 transferiert und schließlich über eine Amidbrücke an die Aminogruppe von
15
I. Einleitung
Phosphatidylethanolamin (PE) gebunden. Dieser Komplex lokalisiert über den Lipidteil in der
Autophagosomenmembran und vermittelt die Membranelongation. Da Apg8 mit Mikrotubuli
interagiert, wird vermutet, dass der Apg8-PE-Komplex beim Transport des Autophagosoms zum
Lysosom über das Zusammenspiel mit dem Mikrotubuli-Zytoskelett mitwirkt (Ohsumi, 2001)
g8
G
G
8
8
g
Ap
Ap
g
Ap
GR
Apg4
AMP
ATP +PPi
C
~
G
Apg8
G
R
~
Apg8
C
PE
Apg7
Apg7
Apg3
Abb. 8: Darstellung des Apg8-Konjugationssystems
Das Autophagie-Gen 8 (Apg8) wird über eine Aktivierungskaskade so verändert, dass es schlussendlich über
eine Amidbrücke an die Aminogruppe von Phosphatidylethanolamin (PE) bindet. Dieser Komplex lokalisiert
mit seinem Lipidteil in der Autophagosomenmembran und vermittelt damit ihre Elongation. (Verändert nach
Ohsumi, 2001).
3.3
Autophagie und Immunität
Neben den gut charakterisierten Aufgaben im Rahmen der Zellhomöostase (Mijaljica et al., 2007) und
des Caspase-unabhängigen, programmierten Zelltods (Moretti et al., 2007) weisen neuere Ergebnisse
auch auf eine Beteiligung der Autophagie an der angeborenen Immunabwehr hin. Über Autophagie
werden intrazellulär lebende Bakterien wie z.B. Mycobacterium tuberculosis eliminiert (Gutierrez et
al., 2004). Auch die Erkennung bestimmter viraler Infektionen in plasmazytoiden DC durch TLR ist
von Autophagie abhängig (Lee et al., 2007).
Erste Hinweise auf eine bedeutende Rolle von Autophagie in der adaptiven Immunantwort lieferten
die Untersuchungen zur endogenen Präsentation von NeoR auf MHC-II-Molekülen (Nimmerjahn et
al., 2003) (vgl. Kapitel I.2.5.2.2). Inzwischen konnte eine Autophagie-abhängige Präsentation auf
MHC-II-Molekülen für weitere Modellantigene z.B. das virale EBNA1 nachgewiesen werden
(Paludan et al., 2005). Die Erkennung Epstein-Barr-Virus (EBV) -infizierter Zellen einschließlich
EBV-positiver Burkitt-Lymphomzellen durch EBNA1-spezifische CD4+ T-Zellen implizierte eine
Rolle dieses Präsentationswegs in der MHC-II-restringierten Kontrolle viraler Infektionen und
womöglich virusassoziierter Tumoren. Interessant ist in dem Kontext von malignen Tumoren die
Beobachtung, dass Tumorzellen oftmals eine geringe Autophagie-Aktivität aufweisen, wofür entweder
die onkogene Aktivierung von negativen Regulatoren der Autophagie wie z.B. die Klasse I-PI3K oder
mTOR, oder der Verlust von Autophagie-assoziierten Genen verantwortlich ist. So ist Beclin 1 (das
Homolog des Atg 6 Gens in der Hefe) in bis zu 75% aller sporadisch auftretenden Brust-, Ovarial- und
Prostatakarzinomen monoallelisch deletiert (Aita et al., 1999). Ob diese Tumoren dadurch einer CD4+
T-Zell-Erkennung entgehen und/oder zellautonome Wachstums- bzw. Überlebensvorteile erlangen, ist
momentan noch unklar.
16
I. Einleitung
4.
Die immunologische Bedeutung der endogenen Präsentation von Antigenen auf MHCII-Molekülen
Die mögliche Bedeutung der endogenen Präsentation von intrazellulären Antigenen auf MHC-IIMolekülen für die CD4+ T-Zell-Antwort soll anhand von zwei Beispielen näher erläutert werden.
Während ihrer Reifung im Thymus werden T-Zellen eliminiert, die körpereigene Antigene erkennen
(zentrale Toleranz). Um eine möglichst komplette Eliminierung von autoreaktiven T-Zellen zu
erreichen, ist es notwendig, dass im Thymus das gesamte Antigen-Repertoire des Körpers präsentiert
wird. Diese Aufgabe wird durch zwei Zellpopulationen erfüllt. DC aus dem Knochenmark haben eine
hohe endozytotische Aktivität und sind wahrscheinlich verantwortlich für die Toleranzinduktion
gegenüber exogenen (Serum)-Proteinen (hämatopoetisches Selbst). Thymus-Epithelzellen (TEC)
hingegen sind kaum in der Lage, Endozytose zu betreiben und präsentieren deshalb vor allem Peptide
endogener Proteine (nicht-hämatopoetisches Selbst). TEC sind zudem in der Lage, gewebsspezifische
Proteine ektopisch zu exprimieren (Klein und Kyewski, 2000). Dieser Vorgang wird auch als
promiskuitive Genexpression bezeichnet und wurde z.B. für das Insulin beschrieben, das sonst nur in
den Langerhansschen Inseln der Bauchspeicheldrüse exprimiert wird (Geenen und Lefebvre, 1998).
Diese Eigenschaften von TEC ermöglichen die Präsentation des kompletten Spektrums an
Selbstantigenen im Thymus und somit auch die Eliminierung von T-Zellen, die gegen
gewebsspezifische Selbstantigene gerichtet sind.
Die
endogene
Präsentation
von
intrazellulären
Antigenen
auf
MHC-II-Molekülen
spielt
möglicherweise auch eine wichtige Rolle bei antitumoralen Immunantworten. Die meisten Tumoren
hämatopoetischen und epithelialen Ursprungs exprimieren auch in vivo MHC-II-Moleküle und können
so durch CD4+ T-Zellen erkannt werden. Bei vielen Tumoren wie z.B. Brust-, Kolon-, Zervix- und
Larynx-Karzinomen geht die MHC-II-Expression auf Tumorzellen mit einer guten Prognose einher
(Hilders et al., 1993; Jackson et al., 1996; Diederichsen et al., 1998; Lazzaro et al., 2001). Diese
Korrelation impliziert eine Rolle der CD4+ T-Zellen in der direkten Erkennung und Eliminierung von
Tumorzellen (Pardoll und Topalian, 1998). Bei einigen der bislang identifizierten Tumor-assoziierten
Antigenen, die von CD4+ T-Zellen erkannt werden, handelt es sich um zytoplasmatische oder nukleäre
Proteine (Pieper et al., 1999; Wang und Rosenberg, 1999; Wang, 2001; Mautner et al., 2005).
Kürzlich wurde zudem beschrieben, dass einige dieser Antigene auch von CD4+ Tregs erkannt werden
(Wang und Wang, 2007). Diese Ergebnisse könnten eine Erklärung für die klinische Beobachtung
liefern, dass die Expression von MHC-II-Molekülen auf Melanom- und Osteosarkomzellen mit einer
schlechten Prognose assoziiert ist (Moretti et al., 1997; Trieb et al., 1998).
Über welche Präsentationswege die intrazellulären Antigene auf MHC-II-Moleküle gelangen, ist
momentan noch unklar. Angesichts der Bedeutung der endogenen MHC-II-Antigenpräsentation für
die adaptive Immunabwehr ist die Definition der verantwortlichen Präsentationswege von
immunologischem und therapeutischem Interesse.
17
I. Einleitung
5.
Fragestellung
In der Arbeit von Nimmerjahn und Kollegen (Nimmerjahn et al., 2003) konnte am Modellantigen
NeoR erstmals gezeigt werden, dass zytosolische Antigene über Autophagie auf MHC-II-Molekülen
präsentiert werden können. Mittlerweile mehren sich die Hinweise darauf, dass auch nukleäre
Antigene über einen endogenen Präsentationsweg auf MHC-II-Molekülen gelangen (Oukka et al.,
1996; Mautner et al., 2005; Delmas et al., 2005). Für das im Zellkern lokalisierte EBNA1 konnte
kürzlich gezeigt werden, dass es Autophagie-abhängig auf MHC-II-Molekülen präsentiert wird
(Paludan et al., 2005). Wie dieses Kernantigen in diesen zytoplasmatischen Abbauweg gelangt, blieb
bislang ungeklärt.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte der endogene MHC-II-Präsentationsweg für nukleär lokalisierte
Antigene näher charakterisiert werden. Dazu sollte die endogene Präsentation einer ausschließlich im
Zellkern lokalisierten NeoR-Variante (NucNeoR) untersucht und mit der Autophagie-abhängigen
Präsentation der zytosolischen NeoR-Variante verglichen werden. Um mögliche zellspezifische
Unterschiede in der Antigenpräsentation zu erfassen, sollten diese Untersuchungen in pAPC und
nicht-pAPC durchgeführt und die erhaltenen Ergebnisse an einem nukleären Antigen des EBV
überprüft werden.
18
II. Material und Methoden
II.
Material und Methoden
1.
Material und Geräte
1.1
Zelllinien
1.1.1
Antigenpräsentierende Zellen
Linie
HLA-A
LCL1:11
2; 26
LCL-JM
0201; 0301
LCL-GB
0101
LCL-UB
0101; 0201
RCC1:24
1; 2
n.u.; nicht untersucht
1.1.2
HLA-Cw
n.u.
1203; 1402
0304; 0602
0401; 0702
n.u.
HLA-DRB1
1501; 1303
0801; 1301
1101; 1301
0701; 1101
0101; 0801
HLA-DQB1
0602; 0301;
0402; 0603
0301; 0603
0301; 0303
0501; 0402
HLA-DPB1
0301; 0402
0401; 1301
0401; 0402
0201; 0301
0301; 0401
T-Zellen
Klon
20-4/A4
3C-5H11
gp1/H2
M1/E5
GB 3C-3H10
JM CD8+(p27)
1.2
HLA-B
n.u.
1529; 5101
1501
0702; 3503
n.u
Spezifität
NeoR
EBNA3C
gp350
M1 Influenza A
EBNA3C
LMP2A
HLA-Restriktion
HLA-DPB1*0301
HLA-DRB1*0801
HLA-DQB1*0402
HLA-DRB1*1301
HLA-DRB1*1101
HLA-A*0201
Epitop
AA216-229 -DRYQDIALATRDIAAA325-339 -ENPYHARRGIKEHVIAA130-144 -VYFQDVFGTMWCHHAAA234-148 -LENLQAYQKRMGVQLAA627-640 –VVRMFMRERQLPQSAA350-358 –LLWTLVVLL-
Bakterienstämme
Es wurden ausschließlich die E.coli-Stämme XL1-blue MRF’ (Stratagene) und DH5α (Invitrogen)
verwendet.
1.3
Nummer
716
717
2117
2118
1.4
Oligonukleotide
Bezeichnung
Neo for
Neo rev
PPIB for
PPIB rev
Gen
Neomycin
Neomycin
Cyclophilin B
Cyclophilin B
Sequenz 5’-3’
ATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCT
CCGCATTGCATCAGCCATGATGGATAC
CTGCGGCCGATGAGAAGAAGAAGGG
GGGAAGCGCTCACCGTAGATGCTC
Expressionsplasmide
Siehe Anhang (vgl. Kapitel V.1)
19
II. Material und Methoden
1.5
Antikörper
1.5.1
Primärantikörper
Antikörper
C-2
H-50
G8795
9E10
G46-6
TÜ39
HB8737
1.5.2
Spezifität
Humanes Actin
Humanes MAP-LC3
Humanes GAPDH
Humanes c-Myc
HLA-DR
HLA-DR,DP,DQ
Humaner NGF-R
Isotyp und
Herkunft
IgG1; Maus
IgG; Kanninchen
IgG; Maus
IgG1; Maus
IgG; Maus
IgG; Maus
IgG; Maus
Santa Cruz Biotechnology
Santa Cruz Biotechnology
Sigma-Aldrich
Invitrogen
BD-Pharmingen
BD-Pharmingen
Hybridomüberstand
Sekundärantikörper
Antikörper
Schaf-anti-Maus Ig-HRP
Ziege-anti-Maus IgG- und IgM-R-Phycoerythrin
1.6
Hersteller
Hersteller
GE-Healthcare
Jackson ImmunoResearch
DNA-modifizierende Enzyme
Soweit nicht anders aufgeführt, wurden alle Restriktionsenzyme sowie T4-DNA-Polymerase, CIP, T4DNA-Ligase, Reverse Transkriptase und die dazugehörigen Puffer von NEB (Schwalbach) und MBI
Fermentas (Vilnius, Lettland) bezogen. Die Taq- bzw. Pfu-Polymerasen stammten von Promega
(Madison, USA).
1.7
Chemikalien
Chemikalien, Reagenzien und Enzyme wurden von den Firmen Becton-Dickinson, BioRad,
Calbiochem, Corning, Eppendorf, GE-Healthcare, Greiner, Integra, Invitrogen, MBI-Fermentas,
Merck, Millipore, New England Biolabs, Neolab, Nunc, PAA, Packard Instruments, Perkin Elmer,
Promega, Qiagen, Roche, Sartorius, Sigma-Aldrich, Stratagene bezogen. Weitere Bezugsquellen sind
im Einzelnen in der Methodenbeschreibung aufgeführt.
20
II. Material und Methoden
1.8
Allgemeine Puffer und Lösungen
DEPC-Wasser:
10x PBS:
10x TBS-Puffer:
10x TBE-Puffer:
20x SSC
TE-Puffer
1.9
0,1% DEPC in dH2O lösen
Inkubation über Nacht bei RT; autoklavieren
2g KCl
2g KH2PO4
80g NaCl
14,3g Na2HPO4:2H2O
gelöst in 1l dH2O, pH 7.2-7.4; autoklavieren
100 mM Tris
1,4 M NaCl
pH 7.2-7.4
0,9 M Tris
0,9 M Borsäure
0,02 M EDTA pH 8.0
3M NaCl
0,3M Natriumcitrat
pH 7.0
10mM Tris-HCl pH 7.5
1mM EDTA in H2O
Zellkulturmedien
RPMI1640-Komplettmedium
T-Zellmedium
DMEM-Komplettmedium
(Dulbeccos-Modified-Eagle-Medium)
1.10
500ml RPMI1640
10% FCS
1% nicht-essentielle Aminosäuren
2mM L-Glutamin
1mM Na-Pyruvat
100U/ml Penicillin
0,1mg/ml Streptomycin
500ml AIM-V (Invitrogen)
10% humanes Serum (hitzeinaktiviert)
2mM L-Glutamin
10mM HEPES
50µg/ml Gentamycin
500ml DMEM
10% FCS
100U/ml Penicillin
0,1mg/ml Streptomycin
Geräte
Bakterieninkubator (Haereus)
Brutschrank (Heraeus; ThermoForma)
Dialyseschlauch (Spectrum)
Elektrophoresekammern (Invitrogen)
Elektroporationsgerät Gene Pulser II (Bio-Rad)
ELISA-Reader (Tecan)
Elutriationsrotor JE-5.0 (Beckman Coulter)
Elutriationszentrifuge J6-MC (Beckman Coulter)
FACS-Scan (Becton-Dickinson)
Falcon-Roller (Coulter Electronics Limited)
Gefrierschrank -80°C (Colora)
Gefrierschrank -20°C (Liebherr)
21
II. Material und Methoden
Konfokalmikroskop (Zeiss)
Kühlschrank (Liebherr)
Lichtmikroskope (Zeiss)
Millipore-Anlage (Millipore)
Netzgerät (BioRad)
Neubauer-Zählkammer (GLW)
PCR-Thermocyler (Perkin Elmer)
pH-Meßgerät (Knick)
Pipetten (Gilson)
Pipettierhilfe (Integra)
Schüttelinkubatoren (New Brunswick Scientific)
Spektrophotometer (Eppendorf)
Sterilbank (Bio Flow Technik)
UV-Transluminator (UVP Inc.)
Vortexer Genie 2 (Bender & Hobein)
Zentrifugen (Eppendorf, Sorvall, Beckman, Hettich)
22
II. Material und Methoden
2.
Methoden
2.1
Molekularbiologische Methoden
Einige grundlegende Methoden der Molekularbiologie wurden in diesem Methodenteil nicht
ausführlich ausgeführt. Alle nicht beschriebenen bzw. nicht zitierten Methoden wurden nach
Sambrook et al. (2001) durchgeführt.
2.1.1
Amplifikation von Plasmid-DNA mittels Bakterienkulturen
2.1.1.1
Anzucht von Bakterienkulturen
Nährmedien für Bakterienkulturen
LB-Medium
10g NaCl
10g Trypton
5g Hefe-Extrakt
ad 1l dH2O
pH 7.0
autoklaviert
LB-Agar
SOB-Medium
20g Trypton
5g Hefe-Extrakt
0,5g NaCl
2,5mM KCl
10mM MgCl2
10mM MgSO4
ad 1l dH2O
autoklaviert
SOC-Medium
10g NaCl
10g Trypton
5g Hefe-Extrakt
20g Bacto-Agar
ad 1l dH2O
pH 7.0
autoklaviert
SOB Medium
0,2% Glucose
sterilfiltriert
Die mit Plasmiden transformierten E.coli-Stämme XL-1 blue MRF’ und DH5α wurden in Gegenwart
von Ampicillin (100µg/ml) in Fest- oder Flüssigmedium gehalten. Für eine längerfristige
Aufbewahrung der Bakterien wurde 1ml einer dicht gewachsenen Suspensionskultur abzentrifugiert
(5min, 6.000xg), in 1ml LB Medium mit 10% Glycerin resuspendiert und bei -80°C gelagert.
2.1.1.2
Herstellung elektrokompetenter Bakterien zur Transformation
500ml SOB Medium wurden mit 10µg/ml Tetracyclin versetzt und in einem 2l Erlenmeyerkolben mit
einer Einzelkolonie des Bakterienstamms XL-1 blue MRF’ angeimpft. Die Kultur wurde bei 37°C
solange geschüttelt bis die OD600 bei 0,5-0,7 lag. Anschließend wurde die Kultur für 15min auf Eis
abgekühlt, sedimentiert (15min, 4.800xg, 4°C) und in 250ml kaltem Glycerin (10% in H2O)
resuspendiert. Nach erneuter Zentrifugation und Resuspension in 250ml 10% Glycerin wurden die
Bakterien sedimentiert, in 2-4ml eiskaltem 10% Glycerin resuspendiert und in Aliquots von je 50µl in
flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Lagerung erfolgte bei -80°C.
23
II. Material und Methoden
2.1.1.3
Transformation von Bakterien
Pro Transformation wurden 20µl der auf Eis aufgetauten, elektrokompetenten Bakterien mit 1µl des
Ligationsansatzes vermischt. Nach Überführung in eine gekühlte Elektroporationsküvette (1mm
Spaltbreite) erfolgte die Transformation bei 1500 Volt, 25µF und 100Ω. Die Bakterien wurden sofort
in 1ml SOC-Medium aufgenommen und für 1h bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Danach wurden 50
und 100µl Proben der Kultur auf LB-Platten mit 100µg/ml Ampicillin ausgebracht und über Nacht bei
37°C im Brutschrank inkubiert.
2.1.1.4
Präparative Herstellung von Plasmid-DNA aus Bakterien
Für die Herstellung großer Mengen reiner Plasmid-DNA wurde eine 400ml Übernachtkultur pelletiert
(4.800xg, 10min) und die Plasmid-DNA über handelsübliche DNA-Adsorptionssäulen (Jet Star) nach
den Angaben des Herstellers aufgereinigt.
2.1.2
DNA-Klonierung
2.1.2.1
Schneiden der DNA mit Restriktionsendonukleasen
Die Spaltung von DNA mit Restriktionsendonuleasen wurde in den vom Hersteller empfohlenen
Pufferlösungen und unter den empfohlenen Bedingungen durchgeführt. Die meisten Spaltungen
wurden für 1-2h bei 37°C durchgeführt. Hierbei wurde darauf geachtet, dass die Menge an
eingesetztem Enzym 1/10 des Gesamtvolumens nicht überschritt, um die Enzymaktivität durch
das im Enzymstock enthaltene Glycerin nicht zu beeinträchtigen. Es wurden sowohl Einzel- als
auch Doppelspaltungen sowohl für analytische als auch präparative Zwecke durchgeführt. Bei
Doppelspaltungen mit Enzymen, die unterschiedliche Puffer benötigten, wurde die DNA nach
dem ersten Verdau durch Phenol-Chloroform-Extraktion gereinigt, mit Ethanol gefällt und
anschließend der zweite Verdau durchgeführt. Der Erfolg der Spaltung wurde auf einem
Agarosegel überprüft.
2.1.2.2
Auffüllen überhängender DNA-Enden
Durch die T4-DNA-Polymerase, die sowohl eine Exonukleaseaktivität in 3’-5’-Richtung sowie eine
Polymeraseaktivität in 5’-3’-Richtung besitzt, ist es möglich, partiell einzelsträngige DNA-Enden nach
Restriktionsverdau in doppelsträngige „glatte“ Enden umzuwandeln.
Restriktionsansatz:
Restriktionsverdau
dNTP (je 20nmol)
T4-DNA-Polymerase (5U/µl)
30
1
1
µl
µl
µl
24
II. Material und Methoden
Der Restriktionsverdau wurde auf 12°C abgekühlt, die dNTPs sowie die Polymerase zugegeben und
für 15min bei 12°C inkubiert. Anschließend wurde die Reaktion durch Phenol-Chloroform-Extraktion
gestoppt.
2.1.2.3
Phenol-Chloroform-Extraktion
Die Phenol-Chloroform-Extraktion dient der Reinigung von DNA z.B. nach Restriktionsverdau. Die
DNA-Lösung wurde mit 1x TE-Puffer auf 100µl aufgefüllt und mit 500µl Phenol durch leichtes
Vortexen gemischt. Durch kurzes Zentrifugieren bildeten sich zwei Phasen. Die obere, wässrige DNAhaltige Phase wurde möglichst vollständig abgenommen, in ein neues Reaktionsgefäß überführt und
mit 500µl Chloroform gemischt. Nach kurzem Vortexen und Zentrifugieren wurde erneut die obere
wässrige Phase in ein neues Reaktionsgefäß überführt und mit 800µl 100% EtOH versetzt. Die DNA
wurde 15min bei 18.000xg sedimentiert und anschließend der Überstand vollständig abgenommen.
Zum Waschen der DNA wurden 800µl 75% EtOH hinzugefügt und nach kurzem Vortexen für 5min
bei 18.000xg zentrifugiert. Nach Trocknen der DNA für 10-20min wurde diese in einer geeigneten
Menge H2O resuspendiert.
2.1.2.4
Ligation von DNA-Molekülen
Bei einer Ligation werden zwei DNA-Fragmente (z.B. linearisierter Vektor und Genfragment) mit
kompatiblen DNA-Enden durch die T4-DNA-Ligase kovalent miteinander verbunden. Dieses
Enzym katalysiert die ATP-abhängige Ausbildung einer Phosphodiesterbindung zwischen der 3’Hydroxylgruppe des einen und der 5’-Phosphatgruppe des anderen Fragments. Das Verhältnis von
eingesetztem Insert zu linearisiertem Vektor betrug etwa 3:1.
Ligationsansatz:
Linearisierte Vektor-DNA
Insert-DNA
T4-DNA-Ligase (40U/µl)
10x T4-DNA-Ligase-Puffer
dH2O
200
600
1
1,5
ad 15
ng
ng
µl
µl
µl
Alle Ligationsansätze wurden über Nacht bei RT inkubiert. Am folgenden Tag wurde der
Ligationsansatz für 10min auf 65°C erhitzt, um die Ligase zu inaktivieren. Anschließend wurden
elektrokompetente XL1-blue-MRF’-Bakterien mit einem Aliquot des Ligationsansatzes
transformiert und auf antibiotikahaltigen Agarplatten ausplattiert.
Um zu überprüfen, ob eine Religation des eingesetzten Vektors stattfand, wurde eine
Kontrollligation (Eigenligation) ohne DNA-Insert durchgeführt. Die Eigenligation erfolgte
ebenfalls über Nacht bei RT.
25
II. Material und Methoden
2.1.3
Agarosegelelektrophorese
Die Agarosegelelektrophorese ist eine Methode zur Auftrennung von DNA-Fragmenten und der
Bestimmung ihrer Größen. Je nach Größe der erwarteten DNA-Fragmente wurden entweder Gele mit
1% Agarose (Trennbereich: 0,3-8kb) oder 2% Agarose (Trennbereich: 0,07-2kb) angefertigt. Die
entsprechende Agarosemenge wurde in TAE-Puffer unter Aufkochen gelöst und nach Abkühlen auf
ca. 60°C mit Ethidiumbromid (Endkonzentration 0,2µg/ml) versetzt. Das Gel wurde anschließend in
eine horizontale Gelapparatur gegossen.
Die DNA-Proben wurden mit 1/10 Volumen DNA-Ladepuffer versetzt, in das Gel geladen und bei
100 Volt elektrophoretisch aufgetrennt. Die DNA wurde unter UV-Licht (Wellenlänge: 254nm)
sichtbar gemacht und fotografiert.
TAE-Puffer:
40mM Tris/HCl pH 7.8; 5mM NaAc; 1mM EDTA
Ladepuffer:
10mM Tris/HCl pH 7.5; 10mM EDTA; 0,05% Bromphenolblau; 10% Glycerin
2.1.4
Methoden zur Isolation und Detektion von RNA
2.1.4.1
RNA-Isolation
Die Isolation von RNA wurde mit dem Trizol®Reagent (Invitrogen) nach Herstellerangaben
durchgeführt. Zur Isolierung von Gesamt-RNA aus Zellen wurden 5x106 Zellen durch Zentrifugation
sedimentiert und in 1ml Trizol-Reagenz, das zuvor auf RT gebracht wurde, resuspendiert. Nach einer
Inkubation von 5min bei RT wurden 200µl Chloroform hinzugefügt, durch kräftiges Schütteln
gemischt und nach weiteren 2-3min Inkubation für 15min bei 11.000xg und 4°C zentrifugiert. Die
obere, wässrige Phase, die die RNA enthielt, wurde vorsichtig abgenommen und in ein neues
Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Zum Präzipitieren der RNA wurden 500µl 2-Propanol
zugegeben und nach kräftigem Schütteln für 10min bei RT inkubiert. Nach einer Zentrifugation von
10min bei 11.000xg und 4°C wurde der Überstand vollständig abgenommen und verworfen. Zum
Waschen der RNA wurde 1ml 75% EtOH in DEPC-H2O zum Sediment hinzugefügt, nach kurzem
Vortexen für 5min bei 4.500xg und 4°C zentrifugiert. Nach Trocknen der RNA für 5-10min wurde
diese in 50µl DEPC-H2O resuspendiert, anschließend durch 10-minütiges Erhitzen auf 55-60°C
vollständig gelöst und bei -80°C gelagert.
2.1.4.2
RNA-Gelelektrophorese mit anschließendem Northern-Transfer
Zur Herstellung des 1%igen Formaldehydgels wurden 2g Agarose in 20ml 10x MOPS-Puffer und
143ml H2O durch Aufkochen gelöst und nach Abkühlen auf 60°C 37ml einer 37%igen
Formaldehydlösung zugegeben. Nach Gießen und Aushärten des Gels wurden ca. 15-20µg GesamtRNA mit RNA-Ladepuffer (2x RNA Loading Dye, Fermentas) versetzt, 10min bei 65°C denaturiert,
26
II. Material und Methoden
auf Eis kurz abgekühlt und danach sofort auf das Gel geladen. Die gelelektrophoretische Auftrennung
erfolgte bei 15 Volt über Nacht in 1x MOPS-Puffer.
10x MOPS-Puffer:
200mM MOPS; 50mM Na-Acetat; 10mM EDTA; ad1l DEPC-H2O pH 7.0; autoklavieren
Danach wurde die aufgetrennte RNA auf einen Nylon-Membran (Hybond N) über Nacht geblottet. Als
Transfer-Puffer wurde 20x SSC-Puffer verwendet. Am nächsten Tag erfolgte die Immobilisierung der
RNA auf der Membran im UV-Cross-Linker (Stratagene).
2.1.4.3
Radioaktive Markierung von Nukleinsäuren mit anschließender Northern-BlotHybridisierung
200ng einer DNA-Matrize wurden in 11µl H2O gelöst und für 10min bei 95°C denaturiert.
Anschließend wurde das Reaktionsgefäß sofort in Eiswasser überführt und 4µl high prime-Mix
(Roche) und 5µl α-32P dCTP hinzupippetiert. Dieser Ansatz wurde für 15min bei 37°C im Wasserbad
inkubiert und anschließend die Reaktion mit 2µl einer 0,5M EDTA-Lösung gestoppt. Die Probe wurde
auf eine Sephadex G-50-Säule (Amersham) gegeben, mit 400µl TE-Puffer nachgespült und der
Säulendurchlauf verworfen. Anschließend wurden nacheinander 5x100µl TE-Puffer auf die Säule
gegeben und der Säulendurchlauf jeweils in einem Eppendorf-Gefäß aufgefangen. Die ersten drei
radioaktiven Fraktionen wurden vereinigt und nach Aufkochen auf 95°C für 5min als Sonde
verwendet.
Die Hybond N-Membran wurde für 2h bei 65°C in Church-Puffer vorhybridisiert. Anschließend
wurde der Puffer verworfen und die Membran mit 30ml vorgewärmten Church-Puffer, der die
aufgekochte Probe enthielt, über Nacht bei 65°C inkubiert. Am nächsten Tag wurde der Blot dreimal
mit je 50°C warmem Wasch-Puffer kurz gewaschen. Die Detektion erfolgte bei -80°C über
Autoradiographie.
Church-Puffer:
175ml 20% SDS; 250ml 1M NaH2PO4 (pH 7.4); 0,186g EDTA; ad 500ml H2O
Wasch-Puffer:
1% SDS in 2x SSC
2.1.4.4
cDNA-Synthese durch Reverse Transkription von mRNA
Zur cDNA-Synthese wurde die MuMLV-Reverse Transkriptase von NEB verwendet. 1µg GesamtRNA wurden in insgesamt 18µl RNase-freiem DEPC-H2O gelöst und 1µl Oligo(dT)-Primer (8nmol)
hinzugefügt. Der Ansatz wurde für 10min bei 70°C inkubiert und anschließend sofort in Eiswasser
überführt. Nach Abkühlen wurden 5µl 5x Reverse-Transkriptase-Puffer, 1µl 10mM dNTP und 1µl
Reverse-Transkriptase (200U/µl) hinzugegeben, gut gemischt und für 1h bei 37°C inkubiert.
27
II. Material und Methoden
2.1.5
Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
Die PCR ist eine Methode zur gezielten Amplifikation eines ausgewählten Nukleinsäurebereichs,
der durch zwei Oligonukleotide (Primer) eingegrenzt wird. Temperaturstabile DNA-Polymerasen,
wie z.B. die Taq-DNA-Polymerase aus dem Bakterium Thermus aquaticus, gestatten die
Durchführung wiederholter DNA-Synthese- und Denaturierungszyklen des zu amplifiziernden
DNA-Abschnitts.
Die Auswahl der Primer ist sehr wichtig für den Erfolg einer PCR-Reaktion. Die
Schmelztemperatur der beiden Primer sollte ähnlich sein und über 50°C liegen, da eine zu
niedrige Schmelztemperatur zu einer unspezifischen Bindung der Primer und somit auch zu einem
unspezifischen PCR-Produkt führen kann. Zur Berechnung der Schmelztemperatur TM gilt
folgende Regel:
TM = 4 x
∑ (G, C ) + 2 x ∑ ( A, T )
Die Annealing-Temperatur richtet sich nach der Schmelztemperatur und sollte ca. 5°C darunter
liegen. Ferner ist darauf zu achten, dass die Primer nicht mit sich selbst hybridisieren und nur an
eine DNA-Sequenz binden können.
Standard PCR-Ansatz:
cDNA bzw.
Plasmid-DNA
10x Reaktionspuffer (15mM MgCl2)
dNTP-Mix (je 20nmol)
Primer forward (100pmol/µl)
Primer reverse (100pmol/µl)
DMSO
Taq-Polymerase (5U/µl)
H2O
1
20
5
1
1
1
2,5
0,2
ad 50
µl
ng
µl
µl
µl
µl
µl
µl
µl
Der Reaktionsansatz wurde mit 50µl Mineralöl überschichtet und die Amplifikationsreaktion gestartet.
Sollten die PCR-Produkte für Klonierungen verwendet werden, wurde anstatt der Taq- eine PfuPolymerase mit Korrekturlesefunktion eingesetzt. Das verwendete PCR-Programm richtete sich nach
der Schmelztemperatur der jeweiligen Primer und der Länge der erwarteten PCR-Produkte (ca.
1min/1kb). Nach der PCR-Reaktion wurden die Ansätze mit 1/4 Volumen 4x Auftragspuffer
versetzt und auf einem 1-2% Agarosegel der Erfolg der PCR-Reaktion überprüft.
28
II. Material und Methoden
Standard PCR-Programm:
Schritt
1. Anfangsdenaturierung
2. Denaturierung
3. Annealing
4. Elongation
5. Abschließende Synthese
Temperatur [°C]
95
95
abhängig von den Primerpaaren
72
72
Dauer [min]
2
1
1
abhängig von der Produktgröße
10
Die Schritte 2-4 wurden 25-35x wiederholt.
2.1.6
Real time-PCR
Im Gegensatz zur konventionellen PCR, die nur semiquantitative Ergebnisse liefert, ist die real timePCR (rtPCR) ein hochsensitives und sehr selektives Verfahren zur Quantifizierung von DNA. Die
rtPCR ermöglicht die Aufzeichnung der Amplifikation „in Echtzeit“ während der gesamten Reaktion,
also auch bereits während der exponentiellen Phase, in der die Menge des Amplifikats noch
repräsentativ für die in der Reaktion eingesetzte DNA-Menge ist. Die Beobachtung der
Amplifikationsreaktion wird durch Zugabe des Fluoreszenzfarbstoffs SYBR Green ermöglicht, der
sequenzunspezifisch in die kleine Furche doppelsträngiger DNA bindet und mit blauem Licht
(λ = 530nm) zur Fluoreszenz angeregt werden kann. Die Fluoreszenz-Emission wird nach jedem
Zyklus am Ende der Elongationsphase gemessen und steigt mit wachsender Zahl der Amplifikate an.
Für die Quantifizierung der PCR-Produkte wird ermittelt, nach wie vielen Zyklen das
Fluoreszenzsignal aus dem Hintergrund tritt. Die Zyklenzahl ist indirekt proportional zur Kopienzahl
der Probe. Die Fluoreszenz wird graphisch dargestellt, wobei die Zyklenzahl auf der Abszisse und die
Fluoreszenzintensität auf der Ordinate aufgetragen wird. Es wird eine zur x-Achse parallel liegende so
genannte „Kreuzungslinie“ von der log-linearen Region jeder Kurve definiert, die signifikant über der
Hintergrundfluoreszenz liegt. Die Kreuzungslinie ist für alle Proben, die in einem Lauf analysiert
werden, gleich. Der Punkt, an dem die Kreuzungslinie die jeweilige Fluoreszenzkurve schneidet, ist
der so genannte „Kreuzungspunkt“, anhand dessen die Konzentration des PCR-Produktes berechnet
wird. Er wird von der Software nach der Second Derivative Maximum – Methode ermittelt, die das
Maximum der zweiten Ableitung einer Kurve bestimmt, an dem sich die Probenfluoreszenz am
deutlichsten von der Hintergrundfluoreszenz absetzt. Bei der relativen Quantifizierung wird die Menge
an Template nicht absolut ermittelt, sondern im Verhältnis zu einer Standardprobe.
Die Templatemenge in einer Probe wird nach folgender Formel berechnet:
Nn = N0 x ECP
Nn = Anzahl der Moleküle im PCR-Zyklus n
N0 = Anzahl der Moleküle zu Beginn der Reaktion
E
= Amplifikationseffizienz
CP = Zyklus, bei dem das Signal aus dem Hintergrund tritt (Kreuzungspunkt)
29
II. Material und Methoden
Im Idealfall findet eine Verdopplung pro Zyklus statt (E = 2). Die Amplifikationseffizienz ist jedoch
abhängig von Faktoren wie Sequenz, Fragmentlänge und Reinheit der Nukleinsäuren und damit für
jedes Gen und sein PCR-Produkt unterschiedlich. Um die Effizienz der jeweiligen PCR-Reaktion zu
berücksichtigen, wurde für jedes Gen eine Standardkurve erstellt.
Um die Qualität der PCR-Produkte zu überprüfen, wurde nach der PCR eine Schmelzkurvenanalyse
durchgeführt. Doppelsträngige DNA weist in Abhängigkeit von Sequenz, GC-Gehalt und Länge einen
charakteristischen Schmelzpunkt auf. Das erwünschte PCR-Produkt hat somit einen anderen
Schmelzpunkt als eventuelle Nebenprodukte oder Primer-Dimere. Durch kontinuierliches Erhitzen der
PCR-Produkte in der Kapillare wird die dsDNA langsam denaturiert und die Fluoreszenz sinkt mit
zunehmender Temperatur. Die Schmelztemperatur Tm eines Produkts ist definiert als die Temperatur,
bei der nur noch die Hälfte der ursprünglichen Fluoreszenz vorhanden ist.
Für die rtPCR wurde der LightCycler Fast Start DNA MasterPLUS SYBR Green I Kit (Roche) gemäß
dem Herstellerprotokoll verwendet. 2µl einer gewonnenen cDNA (20ng) wurde als Template für die
Amplifikation eingesetzt. Die Amplifikation erfolgte in speziellen Glaskapillaren (LightCycler
Capillaries
(20µl)
Roche)
mit
je
0,5µM
Primer in
einem Volumen
von 10µl.
Als
Kontaminationskontrolle wurde in einem Ansatz pro Lauf und Zielgen Wasser statt DNA verwendet.
Für die relative Quantifizierung wurde außerdem in einem Ansatz pro Lauf und Zielgen ein Standard
amplifiziert.
Das Standard rtPCR-Programm setzt sich aus folgenden Schritten zusammen:
Zyklen
1
50
1
1
Programm
Analyse
Temperatur
Haltezeit
Denaturierung
keine
95°C
10min
Amplifikation
Quantifikation
Schmelzkurve
Schmelzkurve
95°C
70°C bzw. 68°C
72°C
95°C
65°C
99°C
1sek
10sek
12sek
0sek
10sek
0sek
Kühlen
keine
40°C
30sek
2.2
Zellbiologische Methoden
2.2.1
Kultivierung humaner Zelllinien
Suspensionszelllinien
Die LCL wurden als Suspensionskulturen in RPMI1640-Komplettmedium gehalten. Die Zellen
wurden in einer Dichte von 3x105 Zellen/ml ausgebracht und alle 4 Tage nach Bedarf gesplittet. Die
humanen T-Zellen wurden in T-Zellmedium kultiviert und alle 14 Tage restimuliert. Alle Zellen
wurden, wenn nicht anders aufgeführt, mit max. 500xg für 10 min zentrifugiert.
30
II. Material und Methoden
Adhärent wachsende Zelllinien
Die Nierenzellkarzinomlinie RCC1:24 sowie die 293T-Zellen wuchsen adhärent und wurden in
RPMI1640-Komplettmedium bzw. in DMEM-Komplettmedium kultiviert. Alle vier Tage wurden die
Zellen durch Trypsin-Behandlung von den Kulturschalen gelöst und 1:10 verdünnt in einer neuen
Zellkulturschale ausgebracht.
2.2.2
Transfektion von adhärent wachsenden Zellen
2.2.2.1
Polyethylenimin (PeI)-Transfektion
Die Zellen wurden am Tag vor der Transfektion so in Zellkulturschalen ausgebracht, dass sie am Tag
der Transfektion etwa 80% Konfluenz erreicht hatten. Der Transfektionsmix wurde wie unten
angegeben zusammenpipettiert, 15min bei RT inkubiert und danach mit 6,5 bzw. 13,5ml Medium
gemischt.
Anschließend
wurde
das
Kulturmedium
in
den
Zellkulturplatten
durch
den
Transfektionsmix ersetzt. Am nächsten Tag wurde die gleiche Menge Komplettmedium zugegeben
und die Zellen eine weitere Nacht kultiviert.
Transfektionsmix:
OptiMEM (Invitrogen)
DNA
PeI (1mg/ml in H2O pH 7.0)
Inkubation
Medium nach Inkubation
2.2.2.2
10cm-Platte
1ml
30µg
45µl
6,5ml
13,5cm-Platte
1,5ml
45µg
67,5µl
15min, RT
13,5ml
Transfektion mit FuGene®HD
Der Transfektionsmix, bestehend aus DNA gelöst in OptiMEM sowie FuGene-Reagenz (Roche)
wurde in einem optimalen Verhältnis zusammengemischt und 15min bei RT inkubiert (siehe
Herstellerangaben). Danach wurde der Transfektionsmix langsam auf die zu etwa 80% konfluenten
Zellen gegeben und über Nacht inkubiert.
2.2.3
Transfektion von Suspensionszellen mittels Elektroporation mit anschließender FicollAufreinigung
Einen Tag vor Transfektion wurden die Zellen in frisches Medium überführt, um eine logarithmische
Wachstumsphase zu erreichen. Am nächsten Tag wurden pro Elektroporation 1x107 Zellen in
OptiMEM gewaschen und anschließend in 300µl OptiMEM aufgenommen. Zu der Zellsuspension
wurden 15µg des gewünschten Expressionsvektors und 5µg des pCMV-NGF-R-Plasmids gegeben.
Nach gründlichem Resuspendieren wurde die Suspension in eine 4mm-Elektroporationsküvette
überführt und bei 1mF und 230 Volt elektroporiert. Sofort nach Elektroporation wurden die Zellen in
500µl FCS aufgenommen und in eine Zellkulturflasche mit 10ml vorgewärmtem RPMI-
31
II. Material und Methoden
Komplettmedium überführt. Die Zellen wurden über Nacht bei 37°C, 5% CO2 inkubiert und am
nächsten Tag die lebenden Zellen mittels Ficoll-Paque-Gradientenzentrifugation (GE-Healthcare)
isoliert. Hierzu wurden 10ml Zellkultur mit 2,5ml Ficoll-Lösung unterschichtet und für 30min bei
1.000xg ohne Bremse bei RT zentrifugiert. Die lebenden Zellen, die sich oberhalb der Ficoll-Lösung
absetzten, wurden entnommen, in RPMI-Komplettmedium gewaschen und anschließend in einer
Dichte von 5x105 Zellen/ml ausgebracht.
2.2.4
Magnetische Zellseparation (MACS)
Zellen, die mit dem pCMV-NGF-R-Vektor transfiziert worden waren, oder Zellen, die den NGF-R
nach Doxycyclin-Induktion auf ihrer Oberfläche exprimierten, wurden mittels MACS aufgereinigt.
Hierzu wurden bis zu 1x107 Zellen einmal mit eiskaltem MACS-Puffer gewaschen und anschließend
mit 400µl Primärantikörper anti-NGF-R (1:10 in MACS-Puffer) für 20min auf Eis inkubiert. Nach
einmaligem Waschen wurden die Zellen in 180µl MACS-Puffer resuspendiert und mit 20µl Ziegeanti-Maus-Sekundärantikörper, der mit magnetischen Beads gekoppelt war, für weitere 20min auf Eis
inkubiert. Während des nachfolgenden Waschschritts wurde die MACS-Säule LS (Miltenyi Biotec)
mit 3ml MACS-Puffer äquilibriert und die in 500µl MACS-Puffer aufgenommenen Zellen auf die
Säule gegeben. Anschließend wurde die Säule dreimal mit je 3ml MACS-Puffer gewaschen, die Säule
vom Magneten genommen und die gebundenen Zellen von der Säule eluiert. Die erhaltenen Zellen
wurden dann in einer geeigneten Menge RPMI1640-Komplettmedium aufgenommen und expandiert.
MACS-Puffer:
2,5g BSA; 2ml 0,5M ETDA in 500ml PBS; Lagerung bei 4°C
2.2.5
Zum
FACS-Analyse
Nachweis
von
Oberflächenproteinen
oder
GFP-Fluoreszenz
wurden
die
Zellen
durchflußzytometrisch mit einem FACS-Gerät (FACScan von Becton-Dickinson) analysiert. Die GFPfluoreszierenden Zellen konnten direkt ohne Färbung analysiert werden. Es wurden sowohl Färbungen
mit direkt markierten Primärantikörpern, als auch mit markierten Sekundärantikörpern durchgeführt.
Für jede Färbung wurden mindestens 50.000-200.000 Zellen mit 800µl FACS-Puffer (1% FCS in
PBS) gewaschen und in 100µl verdünnter AK-Lösung (1:50 in FACS-Puffer) 30min auf Eis im
Dunkeln inkubiert. Anschließend wurden sie erneut zweimal mit 800µl FACS-Puffer gewaschen.
Wurde ein sekundärer AK zur Färbung eingesetzt, wurde das Verfahren mit einer 1:200 Verdünnung
des Zweitantikörpers wiederholt. Nach der letzten AK-Färbung wurden die Zellen zur Messung in
FACS-Röhrchen überführt. Um die Detektion toter Zellen zu ermöglichen, wurde Propidiumiodid in
einer Konzentration von 2µg/ml zu den gefärbten Zellen gegeben. Tote Zellen nehmen aufgrund ihrer
defekten Zellmembran Propidiumiodid auf und können so detektiert und bei der Analyse der Zellen
ausgeschlossen werden. Die Auswertung der FACS Messung erfolgte mit der CellQuest Software.
32
II. Material und Methoden
FACS-Puffer:
1% FCS in PBS
2.2.6
Die
Elutriationszentrifugation
Elutriationszentrifugation
(Elutriation) ermöglicht die
Auftrennung
von
Zellen
nach
Zellzyklusphasen (McEwens et al., 1968). Sie beruht auf zwei entgegengesetzt wirkenden Kräften.
Der Zentrifugalkraft durch den sich drehenden Rotor und der Kraft, der die Separationskammer
durchströmenden Flüssigkeit mit ihrer zentripetalen Ausrichtung. Durch diese zwei entgegengesetzt
wirkenden Kräfte können Zellen entsprechend ihrer Größe und Dichte aufgetrennt werden. Zellen mit
einem einfachen Chromosomensatz (G1/0-Phase-Zellen) weisen eine geringe Dichte auf und werden
zuerst elutriiert. Mit beginnender DNA-Synthese in der S-Phase nimmt die Dichte und Größe der
Zellen zu und erreicht ihr Maximum in der G2 - bzw. M-Phase, wenn die Zellen einen doppelten
Chromosomensatz aufweisen. Somit ist es möglich, asynchron wachsende Zellkulturen in einzelne
Zellpopulationen gleicher Zellzyklusphasen aufzutrennen (Abb. 9).
Das Ergebnis der Elutriation wurde, wie in Kapitel II.2.2.6.1 beschrieben, mittels Chromatinfärbung
der einzelnen Zellfraktionen im FACS überprüft.
Abb. 9: Schematische Darstellung der Elutriationszentrifugation
Die in die Apparatur injizierten Zellen wandern entsprechend ihrer Größe und Dichte zu dem Ort, an dem
zwischen den entgegengesetzt wirkenden Kräften, Zentrifugationskraft und Flussgeschwindigkeit, ein
Gleichgewicht herrscht. Durch Erhöhung der Durchflussgeschwindigkeit können Zellpopulationen der
gleichen Größe und Dichte aus der Seperationskammer ausgewaschen werden.
33
II. Material und Methoden
Durchführung
Für die Elutriation (Zentrifuge: J6-MC; Rotor JE-5.0; Beckman Coulter) wurden etwa 1x109 Zellen
eingesetzt. Diese wurden einmal in einer ausreichenden Menge PBS gewaschen, in 35ml
Elutriationsmedium aufgenommen und durch einen 0,7µm Filter filtriert. Anschließend wurden die
Zellen möglichst luftblasenfrei in einer 50ml Spritze aufgenommen. Mit Hilfe der Spritze wurden die
Zellen langsam in die Elutriationsapparatur injiziert (20ml/min). Die Beladung des Rotors erfolgte bei
1.400rpm und 30ml/min Durchflussgeschwindigkeit. Nachdem sich die Zellen komplett im Rotor
befanden,
wurde
die
Geschwindigkeit
auf
1.300rpm
reduziert
und
bei
steigenden
Durchflussgeschwindigkeiten je 400ml Fraktionen entnommen. Die Zellen der einzelnen Fraktionen
wurden gezählt und in nachfolgende Tests eingesetzt.
Elutriationsmedium:
RPMI1640 mit 10mM HEPES; 1mM EDTA; 0,25U/ml DNAse; 1% sterilflitriertes FCS
2.2.6.1
Chromatinfärbung
3x106 Zellen jeder Fraktion wurden für 1h bei 4°C in 80% EtOH in PBS fixiert. Anschießend wurden
die fixierten Zellen zweimal mit PBS gewaschen, in 1ml Chromatinfärbepuffer aufgenommen und
jeweils 1x105 Zellen im FACS analysiert.
Chromatinfärbepuffer:
PBS mit 50ng/ml Propidiumiodid; 10U/ml RNAseA; 1mM EDTA
2.2.7
GM-CSF-ELISA
Für die Antigenpräsentationsstudien wurde ein GM-CSF-Zytokin-ELISA von der Firma R&D
Systems verwendet. Dazu wurden 96-Loch ELISA-Platten (Corning) mit je 100µl/Loch des GM-CSFCapture-AK (1:180 in PBS) beschichtet und über Nacht bei RT inkubiert. Am nächsten Tag wurden
nach dreimaligem Waschen mit Waschpuffer die Platten mit je 300µl/Loch Blockpuffer für 2h bei RT
inkubiert. Nach erneutem dreimaligem Waschen erfolgte eine zweistündige Inkubation mit je 100µl
Kulturüberstand. Anschließend wurde der Zellüberstand durch mehrmaliges Waschen entfernt und je
100µl/Loch Detection-AK (1:180 in reagent diluent) zugegeben. Nach einer zweistündigen Inkubation
wurden die Platten erneut dreimal gewaschen und anschließend mit je 100µl/Loch des Avidin-HRPAK (1:200 in reagent diluent) für 20min bei RT inkubiert. Abschließend wurde die Platte dreimal mit
Waschpuffer gewaschen, mit 100µl/Loch Färbelösung versetzt und die Färbereaktion nach etwa 5 min
mit je 50µl Stopplösung abgestoppt. Die Färbung wurde umgehend bei 450nm im ELISA-reader
(Tecan) gemessen.
Waschpuffer:
0,05% Tween 20 in PBS
34
II. Material und Methoden
Blockpuffer:
1% BSA; 5% Sucrose in PBS
reagent diluent:
1% BSA in PBS sterilfiltriert
Stopplösung:
2N H2SO4
2.2.8
IFNγ-ELIspot
Durch diese Methode können einzelne IFNγ-sezernierende T-Zellen nachgewiesen werden, wodurch
quantitative Aussagen über die Häufigkeit solcher Zellen in einer T-Zellpopulation ermöglicht werden.
Eine 96-Loch Mikroplatte mit Zelluloseester-Boden (Millipore) wurde mit einem monoklonalen
Antikörper gegen humanes IFNγ (Mabtech) beladen und über Nacht bei 4°C inkubiert. Am nächsten
Tag wurde die Platte mehrmals mit PBS gewaschen, anschließend mit 100µl/Loch T-Zellmedium
beladen und für 1-2h bei 37°C inkubiert. Nach erneutem Waschen mit PBS wurden Stimulatorzellen
und T-Zellen in unterschiedlichen Zellzahlen ausgebracht und für 24h bei 37°C im Inkubator
kultiviert. Am nächsten Tag wurden die Zellen durch Waschen entfernt und pro Loch 100µl eines
biotinylierten Antikörpers gegen humanes IFNγ (1:1000 in PBS mit 0,5% FCS) zugegeben und für 2h
bei RT inkubiert. Nach weiterem Waschen wurde Alkalische-Phosphatase-konjugiertes Streptavidin
zugesetzt und für 1h bei RT inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurde Substratlösung
(BCIP/NBT) zugegeben. Es bildeten sich blau-schwarze Aggregate, die als Punkte (spots) die Stellen
der Zytokinsekretion markierten. Die Auszählung der spots erfolgt unter einem Stereomikroskop.
2.2.9
Immunfluoreszenz
RCC1:24-Zellen wurden in 10cm-Kulturschalen auf Poly-L-Lysin beschichteten Objektträgern
ausgebracht und am nächsten Tag mit FuGene oder PeI transfiziert. Nach 48h wurden die mit Zellen
bewachsenen Objektträger in Färbeschälchen einmal in PBS gewaschen und in 3% Paraformaldehyd
(PFA in PBS) für 15 min bei RT fixiert. Der Fixierungsschritt wurde durch Inkubation für 5min bei
RT mit 20% FCS in PBS abgestoppt. Die Absättigung und Permeabilisierung erfolgte in
Permeabilisierungspuffer für 10min bei RT. Anschließend wurden die Objektträger in eine feuchte
Kammer überführt und mit je 300µl Primärantikörper (verdünnt 1:100 in Permeabilisierungspuffer)
30min bei 37°C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen für je 5min in Permeabilisierungspuffer
erfolgte die Inkubation mit dem Sekundärantikörper (verdünnt 1:100 in Permeabilisierungspuffer) für
20min bei 37°C. Anschließend wurden die Objektträger mit Permeabilisierungspuffer gewaschen und
bei Bedarf mit Kaisers Glyceringelatine eingebettet.
Permeabilisierungspuffer:
3% BSA mit 0,1% Saponin in PBS
35
II. Material und Methoden
2.3
Proteinbiochemische Methoden
2.3.1
Herstellung von RIPA-Extrakten
5x106 bis 1x107 Zellen wurden einmal in 15ml eiskaltem PBS gewaschen, abzentrifugiert und der
Überstand restlos entfernt. Die Zellen wurden dann in 1ml RIPA-Puffer durch mehrmaliges Auf- und
Ab-Pipettieren aufgenommen und in ein frisches 1,5ml Reaktionsgefäß überführt. Dieser Ansatz
wurde für 30min auf Eis inkubiert und anschließend bei 20.000xg für 20min bei 4°C zentrifugiert. Der
Überstand wurde in ein frisches 1,5ml Reaktionsgefäß überführt und anschließend bei -80°C gelagert.
RIPA-Puffer:
1% NP40; 0,5% DOC; 0,15M NaCl; 5mM EDTA; 50mM Tris pH 8.0; 0,1% SDS in H2O. Vor Gebrauch
wurden 1/25 des Endvolumens Protease-Inhibitor-Cocktail (Roche) zugesetzt.
2.3.2
Proteinaufreinigung
In 10 große Zellkulturschalen (13,5cm) wurden 293T-Zellen so ausgebracht, dass sie am Tag der
Transfektion etwa 80% Konfluenz erreicht hatten. Die Vektoren pCMV-Trc-His-NeoR-myc oder
pCMV-Trc-His-NucNeoR-myc wurden mittels PeI in die Zellen eingebracht und diese Transfektanten
dann für 48h weiterkultiviert. Anschließend wurden die Zellen mit dem Medium vom Boden abgespült
und nach Zentrifugation bei 950xg für 5min in 50ml UREA-Lysispuffer lysiert. Anschließend wurde
das Zelllysat bei 6.000xg für 20min zentrifugiert und der Überstand vorsichtig in ein neues 50ml
Falcon pipettiert. Zu dem Überstand wurden 300µl Nickel-NTA-Beads (Qiagen) gegeben und für 24h
bei 4°C rotierend inkubiert. Anschließend wurden die Beads 10min bei 1.500xg sedimentiert und der
Überstand vollständig entfernt. Die Beads wurden dreimal mit je 5ml UREA-Lysispuffer aus dem
Falcon gewaschen, in einem 15ml Falcon gesammelt und 10min bei 1.500xg erneut sedimentiert.
Nach Entfernen des Überstandes wurden die über den His-Tag an die Nickel-NTA-Beads gebundenen
Proteine dreimal mit je 300µl Elutionspuffer von diesen eluiert. Zwischen den Elutionsschritten wurde
jeweils 5min bei 1.500xg zentrifugiert. Das eluierte Protein wurde in einem Reaktionsgefäß
gesammelt, mit einem Dialyseschlauch (Spectrum) dicht verschlossen und für zwei Tage gegen PBS
dialysiert.
UREA-Lysispuffer:
8M Harnstoff; 0,1M NaH2PO4; 0,01M Tris-Base; 0,05% Tween 20; 20mM Imidazol; gelöst in dH2O, pH 8.0
Elutionspuffer:
0,5M Imidazol in UREA-Lysispuffer
2.3.3
SDS-PAA-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Bei dieser Methode wurden Proteine in einem Polyacrylamidgel (PAA-Gel) aufgetrennt, das 0,1%
SDS enthielt. Das Acrylamidgel bestand aus einem Sammelgel, das der Fokussierung der geladenen
Proteine dient und einem Trenngel, das die Auftrennung der Proteine nach ihrer molekularen Masse
36
II. Material und Methoden
ermöglicht. Die verwendeten 10,5%-igen und 14%-igen Trenngele ermöglichten eine Auftrennung
von Proteinen im Bereich zwischen 15 und 100kDa.
Die RIPA-Extrakte wurden 4:1 mit dem SDS-PAGE Ladepuffer gemischt, für 5min bei 95°C
denaturiert und bis zum Auftragen auf Eis aufbewahrt. Nach dem Beladen des Gels erfolgte die
Gelelektrophorese bei 20mA pro Gel für ca. 2h.
Sammelgel:
1ml 30% PAA; 3,75ml 2x Tris/SDS pH 6.8; 2,7ml H20; 45µl 10% APS; 5µl TEMED
2x Tris/SDS pH 6.8:
7,56g Tris-Base; 2,5ml 20% SDS pH 6.8; H2O ad 250ml
Trenngel (10,5% bzw. 14%):
3,5ml bzw. 4,65ml 30% PAA; 5ml 2x Tris/SDS pH 8.8; 1,4ml bzw. 0,3ml H20; 83µl 10% APS;
8,5µl TEMED
2x Tris/SDS pH 8.8:
22,68g Tris-Base; 2,5ml 20% SDS; pH 8.8; H2O ad 250ml
Elektrophoresepuffer:
0,125M Tris-Base; 1,25M Glycin; 0,5% SDS
SDS-PAGE-Ladepuffer:
200mM Tris-HCl pH 6.8; 8% SDS; 40% Glycerin; 400mM DTT; 0,2mM EDTA/NaOH pH 8.0;
0,4% Bromphenolblau
2.3.4
Western-Transfer und Immundetektion
Zur spezifischen Detektion von Proteinen durch Antikörper wurden die gelelektrophoretisch
aufgetrennten Proteine auf eine PVDF-Membran (Hybond P, GE-Healthcare) übertragen. Dies erfolgte
in einer durch ein Eisbad gekühlten Transferkammer gefüllt mit Transferpuffer für 1h bei 90 Volt.
Transferpuffer:
14g Glycin; 3g Tris-Base; 20% Methanol; ad 1l H20
Nach dem Western-Transfer wurde die Membran für 1h mittels Blockpuffer abgesättigt. Danach
wurde die Membran mit dem Primärantikörper über Nacht bei 4°C in Inkubationspuffer auf einem
Falcon-Roller inkubiert. Nach dreimaligem Waschen für je 10min im Waschpuffer wurde ein HRPgekoppelter Sekundärantikörper (z.B. Schaf-anti-Maus IgG-HRP, GE-Healthcare) hinzugefügt und für
1h bei RT auf dem Falcon-Roller inkubiert. Nach erneutem Waschen wurden die Proteine mittels
ECL-Plus-Detektionssystem (GE-Healthcare) und anschließender Autoradiographie detektiert.
Blockpuffer:
5% Magermilchpulver in PBS
Inkubations- und Waschpuffer:
3% Magermilchpulver in PBS
37
II. Material und Methoden
2.3.5
Bradford-Bestimmung
Aufgereinigtes und dialysiertes Protein wurde in verschiedenen Verdünnungen in 160µl H2O
Endvolumen verdünnt. Nach mehrmaligen Mischen wurden 40µl der Protein-Färbelösung (Protein
Assay Solution, BioRad) hinzupipettiert und in einem Abstand von 10min durch mehrmaliges Aufund Abpipettieren durchmischt. Nach 40min wurde die Absorption bei 595nm gemessen und mit Hilfe
einer BSA-Standardkurve die Proteinmenge berechnet.
38
III. Ergebnisse
III.
Ergebnisse
In der eigenen Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass die endogene Präsentation eines
zytoplasmatischen Proteins auf MHC-II-Molekülen über Autophagie erfolgt (Nimmerjahn et al.,
2003). Autophagie ist ein in eukaryotischen Zellen hoch konservierter Abbauprozess (Mizushima et
al., 1998; Kabeya et al., 2000; Mizushima et al., 2001), bei dem Teile des Zytoplasmas durch eine
Doppelmembran eingeschlossen werden (Dunn, 1990; Seglen und Bohley, 1992; Teter und Klionsky,
2000). Durch Fusion dieser so genannten Autophagosomen mit Vesikeln des endosomal/lysosomalen
Sytems (Gordon und Seglen, 1988; Liou et al., 1997; Berg et al., 1998), kommt es zum Abbau des
eingeschlossenen Materials durch endosomal/lysosomale Proteasen.
1.
Das NeoR-Modellantigensystem zur Untersuchung der endogenen Präsentation
zytosolischer und nukleärer Antigene
Die Frage, ob auch nukleär lokalisierte Antigene Autophagie-abhängig auf MHC-II-Molekülen
präsentiert werden können, wurde mit Hilfe des bakteriellen Modellantigens NeoR und des NeoRspezifischen, HLA-DP3-resringierten CD4+ T-Zellklons 20-4/A4 bearbeitet. Um die Relevanz der
untersuchten Mechanismen für verschiedene Zelltypen zu evaluieren, sollte der Präsentationsweg
sowohl in pAPC, als auch in nicht-pAPC charakterisiert werden. Als pAPC wurde die EBVtransformierte B-Zelllinie LCL1:11 und als nicht-pAPC die Nierenkarzinomzelllinie RCC1:24
verwendet. Diese Zelllinie exprimiert MHC-II-Moleküle nur nach IFNγ-Behandlung.
1.1
Überprüfung der intrazellulären Lokalisation der zytosolischen und nukleären
Variante des Modellantigens NeoR
Bei dem verwendeten Modellantigen NeoR handelte es sich um ein zytosolisches Protein, das
aufgrund seiner geringen Größe von etwa 30kDa durch Kernporen diffundieren kann und somit auch
im Zellkern vorliegt. Um im Vergleich dazu die endogene Präsentation eines ausschließlich nukleär
lokalisierten Antigens zu untersuchen, wurde ein Kern-Lokalisations-Signal (3xNLS) an NeoR
angefügt, wodurch das chimäre Protein (NucNeoR) in den Zellkern dirigiert wurde. Zusätzlich wurde
an beide Antigenvarianten ein Antikörperepitop angefügt, was eine Detektion der Proteine mit Hilfe
eines anti-Myc-Antikörpers (9E10) ermöglichte.
Um die intrazelluläre Lokalisation von NeoR und NucNeoR zu überprüfen, wurden RCC1:24-Zellen
mit den Expressionsvektoren pINCO-NeoR-myc bzw. pINCO-NucNeoR-myc transfiziert und die
Lokalisation der Proteine nach 36h immunzytologisch untersucht (Abb. 10).
39
III. Ergebnisse
a.
b.
NeoR
myc
NeoR
NeoR
myc
3xNLS
NucNeoR
Abb. 10: Schematische Darstellung der Modellantigene NeoR und NucNeoR und Überprüfung ihrer
intrazellulären Lokalisation
a) Schematische Darstellung der verwendeten NeoR-Konstrukte pINCO-NeoR und pINCO-NucNeoR.
b) Gezeigt sind die panzelluläre Lokalisation des NeoR-Proteins und die nukleäre Lokalisation des NucNeoRProteins. RCC1:24 Zellen wurden mit den in a) gezeigten pINCO-Vektoren transfiziert und das NeoR- bzw.
NucNeoR-Protein nach 36h mittels Immunfluoreszenz mit dem anti-Myc-Antikörper (9E10) unter dem
Konfokalmikroskop (A, B) sichtbar gemacht. Als Kontrollen sind Aufnahmen mit dem Durchlichtmikroskop
gezeigt (A’, B’).
In den konfokalmikroskopischen Aufnahmen der transfizierten RCC1:24-Zellen konnte das NeoRProtein sowohl im Zytoplasma als auch im Kern detektiert werden. Dieser Effekt ist häufig bei
Proteinen zu finden, die kleiner als 40kDa sind, da sie frei durch die Kernporen diffundieren können.
Das NucNeoR-Protein war ausschließlich im Zellkern zu finden.
Somit eignete sich NeoR als Kontrolle und NucNeoR als Modellantigen für die Untersuchung der
Frage, ob endogene nukleäre Proteine auf MHC-II-Molekülen präsentiert werden können und welche
Mechanismen dabei involviert sind.
1.2
Die endogene Präsentation von NeoR und NucNeoR in RCC1:24- und LCL1:11-Zellen
Durch stabile Transfektion der RCC1:24-Zellen mit pINCO-NeoR bzw. pINCO-NucNeoR wurden die
Zelllinien RCC1:24-NeoR und RCC1:24-NucNeoR generiert. Wie die parentale Linie RCC1:24
exprimierten diese Transfektanten nur nach IFNγ-Behandlung MHC-II-Moleküle auf ihrer Oberfläche
(Abb. 11a).
40
III. Ergebnisse
a.
b.
200
ohne IFNγ
100U/ml IFNγ
120
80
GM-CSF (pg/ml)
Counts
160
1000
800
600
400
200
40
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
-I
FN
γ
γ
IF
N
γ
FN
RCC1:24-NeoR
+
0
-I
+
IF
N
γ
0
RCC1:24-NucNeoR
MHC-II FITC
Abb. 11: Induktion der MHC-II-Expression und Antigenpräsentation auf RCC1:24-NeoR- und
RCC1:24-NucNeoR-Zellen nach IFNγ-Induktion
RCC1:24-NeoR und RCC1:24-NucNeoR-Zellen wurden für 36h mit 100U/ml IFNγ inkubiert. a) Die IFNγinduzierte MHC-II-Expression auf der Zelloberfläche wurde mittels eines AK gegen die MHC-II-Moleküle
HLA-DR, DP und DQ (TÜ39) im FACS dargestellt. Gezeigt ist ein repräsentatives Ergebnis mit der Zelllinie
RCC1:24-NeoR. b) IFNγ-induzierte RCC1:24-NeoR- bzw. –NucNeoR-Zellen wurden 20h mit dem NeoRspezifischen CD4+ T-Zellklon 20-4/A4 kokultiviert. Dargestellt ist die GM-CSF-Konzentration im
Kulturüberstand, die mittels GM-CSF-ELISA gemessen wurde. Die Transfektanten wurden nur nach
Induktion der MHC-II-Expression erkannt.
Zur Beantwortung der Frage, ob Peptide von endogen synthetisiertem NeoR und NucNeoR auf MHCII-Molekülen von RCCs präsentiert werden können, wurden RCC1:24-NeoR- und –NucNeoR-Zellen
36h mit 100U/ml IFNγ inkubiert und anschließend für 20h mit dem CD4+ T-Zellklon 20-4/A4
kokultiviert. Die Präsentation von NeoR-Peptid im Kontext von HLA-DP3 auf der Zelloberfläche der
RCC1:24-Zellen führte zu einer Erkennung durch den T-Zellklon und zur Ausschüttung von
Zytokinen wie IFNγ und GM-CSF in den Überstand, die mittels ELISA nachweisbar waren.
Wie in Abb. 11b zu sehen ist, kam es bereits 36h nach IFNγ-Induktion in beiden Fällen zu einer
starken T-Zellerkennung, was auf eine endogene Präsentation nukleärer Antigene auf MHC-IIMolekülen hinwies.
Die gleiche Fragestellung sollte auch in der Zelllinie LCL1:11 untersucht werden. Diese Zelllinie
exprimierte ebenfalls HLA-DP3 und ließ sich, im Gegensatz zu den meisten LCL, sehr gut durch
Elektroporation transfizieren.
41
III. Ergebnisse
a.
b.
200
160
Counts
pINCO-GFP transfiziert
120
41%
80
GM-CSF (pg/ml)
600
untransfiziert
500
400
300
200
100
GFP
10
3
10
4
:1
1
LC
L1
FP
-G
O
pI
N
C
O
L1
:1
1
2
LC
10
N
C
1
pI
10
:1
1
0
LC
L1
10
LC
0
L1
:1
1
pI
N
C
O
N
N
uc
N
eo
R
eo
R
0
40
Abb. 12: Antigenpräsentation auf LCL1:11-Zellen nach Transfektion mit pINCO-NeoR/-NucNeoR
a) Die mit dem Kontrollvektor pINCO-GFP transfizierten LCL1:11-Zellen wurden 48h nach Transfektion
mittels FACS-Analyse auf GFP-Expression gestestet. 41% der Zellen exprimierten GFP. b) Die endogene
Präsentation von NeoR in LCL1:11-Zellen wurde durch Transfektion der Zellen mit den pINCO-NeoR- bzw.
pINCO-NucNeoR-Plasmiden und anschließender Kokultivierung mit dem NeoR-spezifischen CD4+ TZellklon 20-4/A4 belegt. Als Kontrolle wurden pINCO-GFP transfizierte bzw. untransfizierte LCL1:11-Zellen
verwendet.
Die FACS-Analyse in Abb. 12a zeigt LCL1:11-Zellen, die mit dem Kontrollvektor pINCO-GFP
transfiziert wurden. Ca. 41% der Zellen exprimierten GFP, was für LCL eine außergewöhnlich hohe
Transfektionsrate darstellte. Bereits 40h nach Transfektion der LCL1:11-Zellen mit den pINCO-NeoR
bzw. pINCO-NucNeoR-Expressionsplasmiden kam es zur Erkennung durch die NeoR-spezifischen
CD4+ T-Zellen (Abb. 12b). Erstaunlicherweise wurden NucNeoR-transfizierte LCL1:11-Zellen besser
erkannt als NeoR-transfizierte Zellen. Diese Versuche zeigten, dass auch pAPC in der Lage sind, ein
ausschließlich nukleär lokalisiertes Antigen auf MHC-II-Molekülen zu präsentieren. Die Kontrollen
pINCO-GFP- und untransfizierte Zellen wurden von den NeoR-spezifischen T-Zellen nicht erkannt. In
späteren Zellmischexperimenten (vgl. Kapitel III.4.3) wurde ausgeschlossen, dass exogenes Antigen
zur T-Zellerkennung beitrug.
2.
Autophagie-abhängige Präsentation von NeoR und NucNeoR in RCC1:24- und
LCL1:11-Zellen
Wie bereits erwähnt, konnte in der Arbeit von Nimmerjahn und Kollegen (2003) in den gleichen
Zelllinien, die auch in dieser Arbeit verwendet wurden, gezeigt werden, dass zytosolisches NeoR über
Autophagie ins vesikuläre Kompartiment gelangt, in Endosomen/Lysosomen abgebaut und auf MHCII-Molekülen präsentiert wird (Nimmerjahn et al., 2003). Die Autophagie konnte an verschiedenen
Stellen des Abbauwegs durch chemische Inhibitoren blockiert werden (Abb. 13). Dieselben
Inhibitoren wurden auch in dieser Arbeit eingesetzt. 3-MA inhibiert die Bildung von
Autophagosomen, Chloroquin inhibiert die Ansäuerung der endosomal/lysosomalen Vesikel und somit
die säureabhängige Aktivierung der darin enthaltenen Proteasen und Leupeptin inhibiert die in den
endosomal/lysosomalen Vesikeln enthaltene Familie der Cystein-Proteasen (z.B. Cathepsin B).
42
III. Ergebnisse
Endozytose von
exogenen Proteinen
CD4+
Plasmamembran
Endosom
3-MA
Lysosom
Autophagosom
Chloroquin
Autolysosom
Leupeptin
Abb. 13: Angriffspunkte der Autophagie-Inhibitoren in der MHC-II-restringierten Präsentation
intrazellulärer Antigene
Schematische Darstellung der Autophagie-abhängigen Präsentation intrazellulärer Proteine auf MHC-IIMoleküle und der Inhibitoren, die mit diesem Prozeß interferieren. 3-Methyladenin (3-MA) inhibiert die
Ausbildung der Autophagosomen, Chloroquin inhibiert die lysosomale Ansäuerung und Leupeptin inhibiert
die Familie der Cystein-Proteasen.
Die transfizierten LCL1:11-Zellen und die RCC1:24-NeoR-Zellen wurden für 24h mit den Inhibitoren
Leupeptin, Chloroquin bzw. 3-MA behandelt und der Einfluß der Inhibitoren auf die
Antigenpräsentation durch anschließende Kokultur mit den NeoR-spezifischen T-Zellen abgefragt. Da
die Wirkung aller verwendeter Inhibitoren reversibel ist und die Inhibitoren vor T-Zellzugabe
ausgewaschen werden müssen, um die T-Zellfunktion nicht zu beeinflussen, wurde ein Teil der APC
mit 0,5% Paraformaldehyd (PFA) fixiert, um den Status unmittelbar nach Inhibition festzuhalten.
Durch die PFA-Behandlung werden Proteine miteinander vernetzt, was zu einer Versteifung der
Zelloberfläche und zu einer Verringerung des T-Zellsignals um bis zu 60% führt. Bei allen
nachfolgenden T-Zelltests wurden deshalb sowohl unfixierte als auch PFA-fixierte Zielzellen
mitgeführt. Die Ergebnisse mit PFA-fixierten Zielzellen werden jedoch nur dargestellt, wenn diese im
Vergleich zu unfixierten Zellen qualitativ unterschiedliche Ergebnisse ergaben.
Abb.14 zeigt, dass sowohl NeoR- als auch NucNeoR-transfizierte LCL1:11- und RCC1:24-Zellen
nach Autophagie-Inhibition eine stark verminderte Antigenpräsentation aufwiesen. Diese Versuche
bestärkten zum einen die Autophagie-abhängige Präsentation von NeoR wie von Nimmerjahn und
Kollegen beschrieben (Nimmerjahn et al., 2003). Zum anderen zeigten diese Ergebnisse, dass auch die
Präsentation der nukleären Variante des NeoR-Proteins durch Leupeptin, Chloroquin und 3-MA
inhibiert wird und somit Autophagie-abhängig erfolgte.
43
III. Ergebnisse
a.
b.
Leupeptin
300
Chloroquin
ohne IFNγ
200
1000
100
GM-CSF (pg/ml)
IFNγ
3-MA
400
+IFNγ
GM-CSF (pg/ml)
500
ohne Inhibitor
3-MA
800
Leupeptin
600
Chloroquin
400
200
0
0
RCC1:24-NeoR
LCL1:11 pINCO-NeoR
RCC1:24-NucNeoR
LCL1:11 pINCO-NucNeoR
Abb. 14: Verminderte Präsentation von NeoR und NucNeoR auf MHC-II-Molekülen nach Inhibition
der Autophagie in RCC1:24- und LCL1:11-Zellen
Gezeigt sind RCC1:24- und LCL1:11-Zellen, die mit den Vektoren pINCO-NeoR oder pINCO-NucNeoR
transfiziert wurden. Nach der Behandlung der Zellen mit den Inhibitoren wurden die Zellen mit 0,5% PFA
fixiert und für 20h mit dem NeoR-spezifischen CD4+ T-Zellklon 20-4/A4 kokultiviert. Dargestellt ist die GMCSF-Konzentration im Kulturüberstand, die mittels ELISA gemessen wurde. a) RCC1:24-NeoR- und
RCC1:24-NucNeoR-Zellen wurden für 36h mit 100U/ml IFNγ zur Expression von MHC-II-Molekülen
stimuliert. Einem Teil der Zellen wurde entweder 3-Methyladenin (3-MA, 7,5mM), Leupeptin (200mM) oder
Chloroquin (100µM) für 24h zugesetzt, ein Teil blieb unbehandelt. Danach wurden die Zellen gründlich
gewaschen. Als Kontrolle wurden RCC1:24-Zellen ohne IFNγ-Behandlung mitgeführt. b) LCL1:11 pINCONeoR- und LCL1:11 pINCO-NucNeoR-Zellen wurden 24h nach Transfektion für 24h mit 3-MA (7,5mM),
Leupeptin (200mM) oder Chloroquin (100µM) behandelt. Als Kontrolle wurden unbehandelte transfizierte
LCL1:11-Zellen mitgeführt. In a) und b) führte die Inhibition der Autophagie zu einer deutlichen Reduktion
der Antigenpräsentation.
Die inhibitorischen Effekte von Leupeptin und Chloroquin in den beschriebenen T-Zellexperimenten
konnten aber auch darauf beruhen, dass der Abbau der invarianten Kette und somit die Reifung von
neu-synthetisierten MHC-II-Molekülen im endosomal/lysosomalen Kompartiment durch diese
Substanzen beeinträchtigt wurde. Deshalb wurden die mit Inhibitoren behandelten Zellen im FACS
auf die Expression von MHC-II- bzw. HLA-DP-Molekülen hin untersucht. Keine der Substanzen
reduzierte die MHC-II-Oberflächenexpression signifikant, so dass eine Beeinträchtigung der Reifung
von MHC-II-Molekülen als Ursache der verminderten Antigenpräsentation ausgeschlossen werden
konnte (Daten nicht gezeigt).
3.
Toxizitätstest der verwendeten Inhibitoren
In den zuvor beschriebenen Experimenten konnte jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass die
verwendeten Inhibitoren unspezifische, toxische Nebenwirkungen hatten und deshalb zu einer
verminderten T-Zellerkennung führten. Um dies zu untersuchen, wurden Kontrollexperimente zu ihrer
Wirkung auf die MHC-II-assoziierte Präsentation von exogenen und die MHC-I-assoziierte
Präsentation von endogenen Antigenen durchgeführt. Neben den bereits eingeführten Inhibitoren
wurden auch die in späteren Versuchen verwendeten Inhibitoren Leptomycin B (LMB) sowie
Aphidicolin getestet. LMB hemmt den CRM1-vermittelten Export von Proteinen aus dem Kern (vgl.
Kapitel III.5.), Aphidicolin inhibiert die DNA-Polymerase (vgl. Kapitel III.6.1).
Zusätzlich
wurde
ein
möglicher
Einfluss
der
Inhibitoren
auf
die
Endozytose
bzw.
Antigenprozessierung von exogenem Influenza-Matrix-Protein M1 in LCL-Zellen untersucht. Dazu
wurden LCL-JM-Zellen für 16h in An- oder Abwesenheit der Inhibitoren Chloroquin, Leupeptin,
44
III. Ergebnisse
3-MA, LMB und Aphidicolin mit M1 Protein inkubiert. Danach wurden die Inhibitoren und das
überschüssige M1-Protein durch wiederholtes Waschen entfernt und die LCL-JM-Zellen mit dem M1spezifischen autologen CD4+ T-Zell-Klon M1/E5 über Nacht kokultiviert. Die Menge des von den TZellen ausgeschütteten GM-CSF wurde anschließend mittels ELISA gemessen. Neben der
unspezifischen Aufnahme eines exogenen Proteins durch LCL-JM wurde darüber hinaus der Einfluss
der Inhibitoren auf die rezeptorvermittelte Aufnahme und Präsentation eines exogenen Proteins
untersucht. Die Präsentation von Antigenen der Epstein-Barr-Virushülle wie z.B. des Glykoproteins
gp350 erfolgt nach CD21-Rezeptor-vermittelter Aufnahme der Virionen und Prozessierung der
Strukturproteine im endosomal/lysosomalen Kompartiment (Adhikary et al., 2006). Deshalb wurden
LCL-JM-Zellen (die spontan Virionen freisetzen) ebenfalls für 16h mit den Inhibitoren inkubiert.
Nach Auswaschen der Inhibitoren wurden die Zellen mit den autologen CD4+ T-Zellklon gp/1H2
kokultiviert, der ein Peptid des EBV-Glykoproteins gp350 erkennt. Um den Einfluss der Inhibitoren
auch auf die endogene MHC-I-restringierte Antigenpräsentation zu untersuchen, wurden die gleichen
Zellen zudem mit einer CD8+ T-Zelllinie getestet, die ein Peptid des Latenten Membranproteins 2A
(LMP2A) von EBV auf HLA-A2 erkennt.
Abb. 15 zeigt, dass 3-MA Leupeptin und Aphidicolin in den verwendeten Konzentrationen keine
signifikante Beeinträchtigung der Endozytoseaktivität oder der Antigenprozessierung bewirkten, so
dass
unspezifische,
toxische
Effekte
ausgeschlossen
werden
konnten.
Die
verminderte
Antigenpräsentationsaktivität auf MHC-II-Molekülen der Chloroquin-behandelten Zellen beruht auf
der Inhibition der lysosomalen Ansäuerung, die für die Aktivierung lysosomaler Proteasen nötig ist.
Die Tatsache, dass Chloroquin die MHC-I-assoziierte Antigenpräsentation nicht beeinflusste, zeigt,
dass auch dieser Inhibitor nicht unspezifisch toxisch wirkte (Abb. 15c). Der Kernexportinhibitor LMB
führte in beiden MHC-II-restringierten Antigenpräsentationswegen (M1 und gp350), nicht aber bei der
endogenen
Antigenpräsentation
auf
MHC-I-Molekülen
zu
einer
leicht
verminderten
Antigenpräsentation, was auf einen geringen unspezifischen Effekt von LMB auf die MHC-IIrestringierte Antigenpräsentation hinwies.
Nach Leupeptin-Behandlung kam es zu einer verstärkten Präsentation von M1-Peptid (Abb. 15a), was
daran liegen könnte, dass das M1-Peptid, das auf HLA-DR13 präsentiert wird, durch Leupeptinsensitive Proteasen gespalten wurde. Nach Inhibition dieser Proteasen wurde das M1-Peptid
wahrscheinlich vor dem Abbau geschützt, sodass mehr MHC-II-Moleküle mit M1-Peptid beladen und
auf der Zelloberfläche präsentiert werden konnten.
45
III. Ergebnisse
b.
a.
500
800
600
400
400
300
200
0
0
oh
oh
n
M1-beladene LCL-JM + CD4+ T-Zellklon M1/E5
ne
100
In
hi
bi
to
r
3Le M
up A
C ep
hl
or tin
o
Ap qu
hi in
di
co
lin
TZe
lle LM
B
T- n a
lle
Ze
in
lle
n+ e
PH
A
200
In
hi
bi
to
r
3Le M
up A
C ep
hl
or tin
o
Ap qu
hi in
di
co
lin
TZe
lle LM
n
B
Tal
le
Ze
i
n
lle
n+ e
PH
A
GM-CSF (pg/ml)
1000
e
GM-CSF (pg/ml)
1200
LCL-JM + CD4+ T-Zellklon gp/1H2
c.
GM-CSF (pg/ml)
600
500
400
300
200
100
oh
ne
In
hi
bi
to
r
3Le M
up A
C ep
hl
or tin
o
Ap qu
hi in
di
co
lin
TZe
lle LM
n
al B
Tle
Ze
in
lle
e
n+
PH
A
0
LCL-JM + LMP2A-spezifische CD8+ T-Zelllinie (p27)
Abb. 15:
Toxizitätstests der verwendeten Inhibitoren mit LCL-JM-Zellen
Gezeigt ist der Einfluss der Inhibitoren 3-Methyladenin (3-MA), Leupeptin, Chloroquin, Aphidicolin und
Leptomycin B (LMB) auf die MHC-II-assoziierte Präsentation von exogenem Antigen und der MHC-Iassoziierten Präsentation von endogenem Antigen durch LCL-JM-Zellen. Die freigesetzte GM-CSF-Menge
wurde mittels ELISA bestimmt. a) LCL-JM-Zellen wurden in Anwesenheit der genannten Inhibitoren für 16h
mit 150ng/ml rekombinantem M1-Protein beladen. Danach wurden die Inhibitoren und nicht aufgenommenes
M1-Protein durch Waschen entfernt und die LCL-JM-Zellen mit dem autologen CD4+ T-Zellklon M1/E5 für
20h kokultiviert. Man erkennt eine verstärkte Antigenpräsentation nach Behandlung mit Leupeptin und eine
verminderte Antigenerkennung nach Behandlung mit Chloroquin und LMB. b und c) LCL-JM-Zellen wurden
für 16h mit den genannten Inhibitoren behandelt. Danach wurden die Inhibitoren ausgewaschen und die
gewaschenen LCL-JM-Zellen mit dem autologen gp350-spezifischen CD4+ T-Zellklon gp/1H2 (b) bzw. der
autologen LMP2A-spezifischen CD8+ T-Zelllinie JM (p27) (c) kokultiviert. Zu erkennen ist eine Reduktion
der MHC-II-assoziierten Präsentation von gp350 durch Chloroquin und LMB (b), während die MHC-Iassoziierte Präsentation von LMP2A durch keinen der Inhibitoren signifikant beeinflusst wurde (c).
46
III. Ergebnisse
4.
Etablierung eines konditionalen Antigenexpressionssystems in LCL
In den bislang beschriebenen Experimenten wurden zwar Hinweise auf eine Autophagie-abhängige
Präsentation von NucNeoR gefunden, eine genauere Charakterisierung des Präsentationsweges setzte
aber eine regulierbare Expression des Antigens voraus.
Deshalb wurde das Modellantigen NeoR bzw. NucNeoR in den regulierbaren Expressionsvektor
pRTS-1 kloniert (Bornkamm et al., 2005). Die zwei wesentlichen Vorteile dieses Vektors liegen darin,
dass erstens ein bidirektionaler, Tetrazyklin-induzierbarer Promotor die gleichzeitige Expression des
gewünschten Modellantigens mit einem Reportergen z.B. dem grün-fluoreszierenden Protein (GFP)
oder dem Nervenwachstumsfaktor-Rezeptors (nerve growth factor receptor; NGF-R) ermöglicht und
zweitens die Replikation extrachromosomal erfolgt, so dass die Antigenexpression bei stabiler
Transfektion keinen Positionseffekten unterliegt.
Im Folgenden soll dieses Antigenexpressionssystem charakterisiert und anschließend zur
Untersuchung möglicher Antigenpräsentationswege eingesetzt werden.
4.1
Nachweis einer induzierbaren Antigenpräsentation
LCL1:11-Zellen wurden mit den Vektoren pRTS-NeoR und pRTS-NucNeoR stabil transfiziert (vgl.
Kapitel II.2.2.3) und Aliquots dieser Zellen für 36h mit Doxycyclin in einer Konzentration von
1ng/ml bis 50ng/ml induziert. Abb. 16a zeigt die relative Menge an grünfluoreszierenden Zellen nach
24h Doxycyclin-Induktion. Der Prozentsatz an grünfluoreszierenden Zellen nahm mit steigenden
Mengen an zugesetztem Doxycyclin kontinuierlich zu und war für LCL1:11-NeoR- und LCL1:11NucNeoR-Zellen nahezu identisch. Parallel dazu wurden von 3x106 Zellen jeder Induktionsstufe
Proteinextrakte hergestellt und Gesamt-RNA isoliert. Die NeoR-RNA-Mengen wurden im
Northernblot
analysiert,
die
NeoR-Proteinmengen
wurden
über
Nachweis
des
c-myc-
Antikörperepitops im Westernblot nachgewiesen. Auch auf RNA- und Proteinebene ließ sich eine
stufenlose Induzierbarkeit der NeoR-Expression feststellen; je höher die Doxycyclinmenge gewählt
wurde, desto höher war die NeoR-Expression (Abb. 16b und c).
47
III. Ergebnisse
% grünfluoreszierende Zellen
a.
50
40
LCL1:11-NeoR
30
LCL1:11-NucNeoR
20
10
0
0ng/ml
1ng/ml
2ng/ml
4ng/ml
10ng/ml
20ng/ml
50ng/ml
Doxycyclin-Konzentration
Abb. 16:
Stufenlose Induzierbarkeit der stabil transfizierten LCL1:11-NeoR und -NucNeoR-Zellen
Dargestellt sind FACS- Northern- und Westernblot-Analysen Doxycyclin-induzierter LCL1:11-NeoR- und
LCL1:11-NucNeoR-Zellen. a) LCL1:11-NeoR- und LCL1:11-NucNeoR-Zellen wurden für 36h mit
steigenden Mengen an Doxycyclin (0-50ng/ml) behandelt und der Anteil grünfluoreszierender Zellen nach 24h
durch FACS-Analyse bestimmt. b) Stabil transfizierte LCL1:11-Zellen wurden für 36h mit den angegebenen
Mengen an Doxycyclin (0-50ng/ml) induziert und anschließend aus 3x106 Zellen jeder Induktionsstufe
Gesamt-RNA isoliert (b) sowie Proteinextrakte hergestellt (c). Gleiche RNA-Mengen jeder Induktionsstufe
wurden gelelektrophoretisch aufgetrennt (EthBr-Gel) und auf eine Nitrozellulose-Membran geblottet. Die
RNA wurde mit einer NeoR-spezifischen, radioaktiv-markierten Sonde detektiert und über Autoradiographie
auf dem Röntgenfilm sichtbar gemacht. c) Die Proteinextrakte wurden in einem Polyacrylamid-Gel
aufgetrennt, auf eine Membran geblottet und die NeoR- bzw. NucNeoR-Myc-Fusionsproteine mit Hilfe des
anti-Myc-Antikörpers (9E10) detektiert (schwarze Pfeile). Bei gleicher mRNA-Menge wurde mehr NucNeoRals NeoR-Protein exprimiert.
Auffällig war allerdings, dass trotz nahezu identischer GFP-Expression und gleichen RNA-Mengen
deutlich mehr NucNeoR- als NeoR-Protein nachweisbar war. Als eine mögliche Ursache für diese
Beobachtung kam eine unterschiedlich starke Erkennung der zwei NeoR-Varianten durch den antiMyc-Antikörper in Frage. Um dies zu untersuchen wurden definierte Mengen an rekombinantem, Histag-aufgereinigtem NeoR- und NucNeoR-Protein im Westernblot untersucht (Abb. 17). Bei etwas
geringeren Proteinengen wurde im Fall des His-NucNeoR-Proteins ein etwas stärkeres Signal im
Westernblot detektiert, was auf eine leicht stärkere Antikörperaffinität auf NucNeoR-Protein hinwies.
48
III. Ergebnisse
Abb. 17: Die nukleäre Variante des NeoR-Proteins wurde etwas besser als die zytosolische durch den
anti-Myc Antikörper erkannt.
Die His-NeoR- bzw. His-NucNeoR-Proteine wurden in 293T-Zellen exprimiert und über Nickel-NTA-Säulen
aufgereinigt. Nahezu identische Mengen an His-NeoR- und His-NucNeoR-Protein wurden über SDS-PAGE
aufgetrennt und die Proteine im Gel anschließend mit Coomassie angefärbt bzw. die Proteine nach WesternTransfer mit dem anti-Myc-Antikörper 9E10 detektiert. Bei etwas geringerer Proteinmenge wurde im Fall des
NucNeoR-Proteins ein etwas stärkeres Signal im Westernblot detektiert.
Ob darüber hinaus auch ein unterschiedlich schneller Abbau der Proteine in ihren jeweiligen
subzellulären Kompartimenten zum unterschiedlichen Expressionsniveau beitrug, wurde in
zusätzlichen Experimenten analysiert. Um den Einfluss der proteolytischen Degradation zu
untersuchen, wurden die Zelllinien LCL1:11-NeoR und LCL1:11-NucNeoR für 24h mit (30ng/ml)
Doxycyclin induziert und ein Teil der Zellen zusätzlich mit dem Proteasominhibitor MG132
behandelt. Aus je 5x106 Zellen wurden Proteinextrakte hergestellt und im Westernblot analysiert.
Abb. 18 zeigt, dass sich die zytoplasmatische Variante des NeoR-Proteins unter Behandlung mit dem
Proteasominhibitor MG132 stark anreicherte, während die Menge an NucNeoR unbeeinflusst blieb.
Vermutlich wurde das NeoR-Protein im Zytoplasma schnell durch das Proteasom degradiert, während
das NucNeoR-Protein im Zellkern vor einer proteasomalen Degradation „geschützt“ war.
Abb. 18: Die Inhibition der proteasomalen Degradation führt zu einer Anreicherung des
zytoplasmatischen, aber nicht des nukleären NeoR-Proteins
LCL1:11-NeoR- und LCL1:11-NucNeoR-Zellen wurden für 24h mit 30ng/ml Doxycyclin induziert und ein
Teil der Zellen zusätzlich mit dem Proteasominhibitor MG132 behandelt. Aus je 5x106 Zellen wurden
Proteinextrakte hergestellt und die Mengen an NeoR- bzw. NucNeoR-Protein nach Western-Transfer mit Hilfe
des anti-Myc-Antikörpers bestimmt. Die Inhibition des Proteasoms führt zu einer signifikanten Anreicherung
von NeoR-, nicht aber von NucNeoR-Protein.
49
III. Ergebnisse
4.2
Erkennung der Doxcyclin-induzierten LCL1:11-Transfektanten durch die NeoRspezifischen T-Zellen
Neben der Bestimmung der NeoR-mRNA- und -Proteinmenge wurden die Doxycyclin-induzierten
LCL1:11-NeoR/NucNeoR-Zellen darüber hinaus auch als Stimulatorzellen für den NeoR-spezifischen
CD4+ T-Zellklon 20-4/A4 verwendet. Mit beiden Stimulatorzelllinien wurde ab einem Schwellenwert
von 4ng/ml Doxycyclin eine T-Zellerkennung beobachtet, die mit steigenden Doxycyclinmengen
weiter zunahm bis ein Plateau erreicht wurde (Abb. 19).
LCL1:11-NucNeoR
600
500
500
GM-CSF (pg/ml)
600
400
300
200
400
300
200
100
0
0
0n
g/
m
l
1n
g/
m
l
2n
g/
m
l
4n
g/
m
l
10
ng
/m
l
20
ng
/m
l
50
ng
/m
l
100
0n
g/
m
l
1n
g/
m
l
2n
g/
m
l
4n
g/
m
l
10
ng
/m
l
20
ng
/m
l
50
ng
/m
l
GM-CSF (pg/ml)
LCL1:11-NeoR
Doxycyclin-Konzentration
Doxycyclin-Konzentration
Abb. 19: T-Zellerkennung der Doxycyclin-induzierten LCL1:11-NeoR- und LCL1:11-NucNeoR-Zellen
Nach Induktion der Zelllinien LCL1:11-NeoR und LCL1:11-NucNeoR für 36h mit den angegebenen Mengen
an Doxycyclin wurden die Zellen gewaschen und anschließend für 20h mit dem autologen NeoR-spezifischen
CD4+ T-Zellklon 20-4/A4 kokultiviert. Die freigesetzte GM-CSF-Menge wurde mittels ELISA bestimmt. Die
Ergebnisse wiesen auf eine konzentrationsabhängige Präsentation beider rekombinanter Proteine hin.
4.3
Fehlender Beitrag von freigesetztem Antigen für T-Zellerkennung der NeoR- und
NucNeoR-Transfektanten
Für die NeoR-Antigenpräsentation auf diesen Zellen kamen prinzipiell zwei Präsentationswege in
Frage; zum einen der oben beschriebene Autophagie-vermittelte Präsentationsweg und zum anderen
der Präsentationsweg über eine Freisetzung von Antigen, z.B. aus toten Zellen und Wiederaufnahme
des Antigens durch Nachbarzellen. Um zu testen, ob es zu einem relevanten interzellulären
Antigentransfer über das Kulturmedium kam, wie erst kürzlich von Taylor und Kollegen beschrieben
wurde (Taylor et al., 2006), wurden Zellkulturüberstände von induzierten Zellen auf untransfizierte
LCL1:11 übertragen. Durch diese Versuche konnte eine NeoR-Antigenpräsentation durch
interzellulären Antigentransfer ausgeschlossen werden (Abb. 20).
50
III. Ergebnisse
1000
LCL1:11-NeoR Überstand
800
LCL1:11-NucNeoR Überstand
LCL1:11
GM-CSF (pg/ml)
1200
600
400
200
0n
g/
m
l
1n
g/
m
l
2n
g/
m
l
4n
g/
m
l
10
ng
/m
l
20
ng
/m
l
50
Tn
Ze g/
lle ml
n
TZe all
lle ein
e
n
+
PH
A
0
Doxycyclin-Konzentration
Abb. 20: Exogenes Antigen trägt nicht zur MHC-II-restringierten T-Zellerkennung von Doxycyclininduzierten LCL1:11-NeoR- und LCL1:11-NucNeoR-Zellen bei.
5x104 untransfizierte LCL1:11-Zellen wurden in 200µl Zellkulturüberstand von Doxycyclin-induzierten
LCL1:11-NeoR- bzw. LCL1:11-NucNeoR-Zellen aufgenommen. Nach 20h wurden die Zellen gewaschen und
ein möglicher Antigentransfer auf untransfizierte LCL1:11-Zellen durch Kokultur mit den NeoR-spezifischen
CD4+ T-Zellen ausgeschlossen. PHA-stimulierte T-Zellen dienten als Positivkontrolle.
Obwohl diese Experimente gegen einen Antigentransfer zwischen induzierten und untransfizierten
Zellen sprach, konnte dieser nicht gänzlich ausgeschlossen werden. LCL zeigen in vitro häufig
Klumpenbildung. Deshalb war vorstellbar, dass es zwar innerhalb der Zellklumpen zu einem
Antigentransfer kam, dass die Antigene sich aber nicht im Kulturüberstand anreicherten, weil
freigesetztes Antigen sofort von Nachbarzellen endozytiert wurde. Falls ein lokaler Antigentransfer
stattfand, wäre zu erwarten, dass in einem Gemisch von NeoR-transfizierten und untransfizierten
LCL1:11-Zellen der Prozentsatz der von den T-Zellen erkannten Zielzellen höher wäre als der Anteil
an antigenexprimierenden Zellen. Um dies zu überprüfen, wurden Kulturen von LCL1:11-NeoR und
LCL1:11-NucNeoR Zellen, die jeweils etwa 15% transfizierte Zellen enthielten, mit Doxycyclin
behandelt (10ng/ml) und als Zielzellen in einen ELIspot-Test eingesetzt.
Maximal 10% der eingesetzten Zielzellen wurden von den T-Zellen erkannt. Dieser Anteil korrelierte
sehr gut mit dem Prozentsatz an eingesetzten NeoR-transfizierten Zellen und legte nahe, dass unter
den beschriebenen experimentellen Bedingungen vorwiegend, wenn nicht ausschließlich, endogene
und nicht interzelluläre, exogene Antigenpräsentation stattfand (Abb. 21).
51
III. Ergebnisse
∞
LCL1:11-NeoR
Spots pro Loch
300
LCL1:11-NucNeoR
250
200
150
100
50
0
10000
3000
1000
300
100
30
pAPCs pro Loch
Abb. 21: Nur Antigen-exprimierende LCL1:11-Zellen werden von den NeoR-spezifischen CD4+ TZellen erkannt
Von LCL1:11-Transfektanten, die bei einer Doxycyclin-Induktion für 20h mit 10ng/ml einen etwa 15%igen
Anteil an GFP-positiven Zellen enthielten, wurden 30 bis 10000 Zellen pro Loch in einer 96-Loch-ELIspotPlatte ausgebracht und mit 1x105 NeoR-spezifischen CD4+ T-Zellen 20-4/A4 für 20h kokultiviert. Das von
den T-Zellen ausgeschüttete IFNγ wurde durch einen spezifischen Antikörper detektiert und die spots pro
Loch unter dem Mikroskop ausgezählt. Der Anteil erkannter LCL-Zellen lag bei maximal 10%, was gegen
einen signifikanten interzellulären Antigentransfer sprach.
4.4
Abschalten der Transkription nach Auswaschen des Doxycyclins
Die zuvor beschriebenen Versuche zeigten eine stufenlose Induzierbarkeit des rekombinanten NeoRProteins in den Transfektanten LCL1:11-NeoR und LCL1:11-NucNeoR mit Doxycyclin. Um
herauszufinden, ob die NeoR-Transkription durch Doxycyclinentzug abgeschaltet werden kann,
wurden ca. 3x107 Transfektanten für 36h mit 10ng/ml Doxycyclin induziert. Zum Zeitpunkt 0h wurde
aus 5x106 Zellen RNA isoliert. Die restlichen Zellen wurden wiederholt gewaschen, um das
Doxycyclin möglichst quantitativ aus dem Medium zu entfernen. 8h, 24h und 48h nach dem
Auswaschen wurde ebenfalls RNA aus jeweils 5x106 Zellen isoliert und die Menge an NeoR-mRNA
im Northernblot untersucht (Abb. 22).
Abb. 22:
Abschaltung der NeoR-Transkription durch Doxycyclinentzug
Nach Doxycyclin-Behandlung für 36h wurde das Doxycylin aus der Zellkultur durch mehrfaches Waschen der
Zellen entfernt. Aus je 5x106 LCL1:11-NeoR- und LCL1:11-NucNeoR-Zellen wurde 0h, 8h, 24h und 48h
nach Doxycyclinentzug Gesamt-RNA isoliert. Identische Mengen an Gesamt-RNA wurden
gelelektrophoretisch aufgetrennt und im Northernblot mit einer NeoR-spezifischen, radioaktiv markierten
Sonde untersucht. Nach 8h war kaum noch und nach 48h gar keine NeoR-mRNA nachweisbar.
Bereits 8h nach Doxycyclinentzug waren kaum noch NeoR-Transkripte detektierbar, 48h nach
Auswaschen des Doxycyclin konnten auch nach längerer Exposition des Autoradiogramms keine
52
III. Ergebnisse
NeoR-Transkripte mehr nachgewiesen werden. Diese Versuche zeigten zum einen, dass nach
Entfernung des Doxycyclins der Promotor sehr schnell abgeschaltet wird und zum andern, dass NeoRTranskripte eine extrem kurze Halbwertszeit besitzen. Diese Ergebnisse waren für die Untersuchung in
Kapitel III.6.2.7 von Bedeutung.
5.
Beteiligung des aktiven, nukleären Exports an der Präsentation nukleärer Proteine
Da Autophagie ausschließlich im Zytoplasma stattfindet, war eine Beteiligung von NucNeoR an der
endogenen Präsentation auf MHC-II-Molekülen unerwartet. Eine Möglichkeit, wie Kernantigene
dennoch in diesen Abbauprozeß gelangen konnten, war ein hin und her Wandern zwischen Zellkern
und Zytoplasma, wie es für einige Kernproteine beschrieben wurde (Fornerod et al., 1997). Durch
einen, wenn auch nur kurzzeitigen, Aufenthalt im Zytoplasma konnte NeoR möglicherweise über
Autophagie in das vesikuläre Kompartiment gelangen.
Der Transport von Molekülen in und aus dem Zellkern erfolgt durch die Kernporen. Moleküle mit
einem Durchmesser kleiner als 9nm oder einem Molekulargewicht kleiner als 40kDa können durch die
Kernporen frei diffundieren. Dagegen wird der Transport größerer Proteine durch Transport-Moleküle
vermittelt. Der Export von Proteinen und RNA aus dem Zellkern ins Zytoplasma erfolgt durch
Transportproteine, die ihre Substrate anhand bestimmter Transportmotive erkennen.
CRM1 ist ein shuttle-Protein, das seine Substrate über leucinreiche Kernexportsignale (nuclear export
signal, NES) bindet und daraufhin exportiert. NES-Sequenzen bestehen aus Leucinen oder auch
anderen hydrophoben AS, die in regelmäßigem Abstand angeordnet sind und hauptsächlich durch
geladene, polare oder kleine AS getrennt werden. Die beiden ersten identifizierten NES-Sequenzen
wurden im Protein PKI (protein kinase inhibitor) und im viralen Protein Rev des humanen
Immundefizienz-Virus-1 (HIV-1) identifiziert (Wen et al., 1994; Askjaer et al., 1998). Die Bindung
von CRM1 an das Substrat kann spezifisch durch LMB verhindert werden (Nishi et al., 1994;
Ossareh-Nazari et al., 1997). LMB ist ein Antibiotikum aus Streptomyces species (Hamamoto et al.,
1983), das kovalent an einen Cystein-Rest von CRM1 bindet und somit die Bindung an das NESMotiv von Proteinen verhindert (Kudo et al., 1999).
5.1
Nachweis der inhibierenden Wirkung von LMB auf den Kernexport mit Hilfe eines
Reporterproteins
Um zu überprüfen, ob NucNeoR CRM1-abhängig aus dem Zellkern transportiert wird und so in den
Autophagie-Präsentationsweg gelangt, sollte der CRM1-vermittelte Kernexport durch LMB inhibiert
werden. Da in der Literatur widersprüchliche Angaben über Dosierung und Dauer der LMBBehandlung zu finden waren, sollten die Bedingungen anhand des in der Arbeitsgruppe zur Verfügung
stehenden Reporterkonstrukts NES-GFP-NeoR-GFP-NLS etabliert werden. Dieses Fusionsprotein
besteht aus zwei GFP-Molekülen, die ein NeoR-Protein flankieren. Zudem trägt es am C-Terminus ein
NLS und N-terminal ein NES aus dem Rev-Protein von HIV-1, von dem bekannt ist, dass es CRM1-
53
III. Ergebnisse
vermittelt aus dem Zellkern exportiert wird. Durch seine Größe von über 70kDa kann das
Reporterprotein nicht in oder aus dem Zellkern diffundieren. Aufgrund seiner gegensätzlichen
Lokalisationssignale sollte das Fusionsprotein sowohl im Zytoplasma als auch im Zellkern vorliegen.
Um die Bedingungen für die CRM1-Inhibition auszutesten, wurde deshalb der Vektor pCMV-NESGFP-NeoR-GFP-NLS in RCC1:24-Zellen transfiziert, die Zellen anschließend mit unterschiedlichen
Mengen LMB behandelt und die subzelluläre Lokalisation des Fusionsproteins im UVFluoreszenzmikroskop untersucht.
Abb. 23 zeigt die intrazelluläre Verteilung des Reporterproteins in unbehandelten und für 16h mit
8nM LMB behandelten RCC1:24-Zellen. Ohne LMB kam es zu einer Akkumulation des
Reporterproteins vornehmlich im Zytoplasma. Nach LMB Behandlung war eine klare Anreicherung
des Reporterproteins im Zellkern zu beobachten. Dieser Versuch zeigte, dass die eingesetzten Mengen
LMB während der Inkubationszeit von 16h den CRM1-vermittelten Export des Reporterproteins
wirksam inhibierten und nicht toxisch für die Zellen waren. Diese Bedingungen sollten nun auf
Untersuchung der Antigenpräsentation in NeoR-transfizierten LCL1:11-Zellen übertragen werden.
Abb. 23:
Leptomycin B inhibiert den Kernexport des Reporterproteins
RCC1:24-Zellen wurden transient mit dem Vektor pCMV-NES-GFP-NeoR-GFP-NLS transfiziert.
Anschließend wurde die intrazelluläre Lokalisation des Reporterproteins in unbehandelten (A) oder für 16h
mit LMB (8nM) behandelten Zellen (B) im UV-Fluoreszenzmikroskop analysiert. Während das
Fusionsprotein in unbehandelten Zellen vornehmlich im Zytoplasma vorlag, zeigten LMB behandelte Zellen
eine überwiegend nukleäre Lokalisation des Reporterproteins. In A’) und B’) sind Durchlichtaufnahmen der
transfizierten Zellen gezeigt.
5.2
Geringer Einfluss des CRM1-vermittelten Kernexports auf die MHC-II-assoziierte
Präsentation von NucNeoR-Protein
Die stabil transfizierten Zelllinien LCL1:11-NeoR und LCL1:11-NucNeoR wurden für insgesamt 36h
mit 20ng/ml Doxycyclin induziert und die letzten 16h zusätzlich mit LMB behandelt. Anschließend
wurden sowohl Doxycyclin als auch LMB ausgewaschen und identische Mengen an APC mit dem
54
III. Ergebnisse
autologen, NeoR-spezifischen CD4+ T-Zellklon 20-4/A4 für 20h kokultiviert. Die Menge an
ausgeschüttetem GM-CSF wurde mittels ELISA gemessen.
Während die LMB-Behandlung der LCL1:11-NeoR-Zellen die GM-CSF-Ausschüttung der T-Zellen
um etwa 30% reduzierte, stimulierten LMB-behandelte und unbehandelte LCL1:11-NucNeoR-Zellen
die T-Zellen annähernd gleich gut (Abb. 24). Wäre die endogene Präsentation von NucNeoR abhängig
von einem CRM-1-vermittelten Kernexport des Proteins, so wären genau entgegengesetzte Ergebnisse
zu erwarten gewesen.
Möglicherweise lag die Abnahme der T-Zell-Signale an Nebeneffekten, wie z.B. die der Inhibition des
Exports von anderen, an der Antigenpräsentation beteiligten Molekülen. Beim Toxizitätstest (vgl.
Kapitel III.3) war eine ähnlich starke Abnahme der Präsentation von exogenen Antigenen nach LMBBehandlung beobachtet worden (vgl. Abb. 15). Die Inhibition des CRM1-vermittelten Kernexports
hatte somit kaum Einfluss auf die endogene Präsentation von nukleären Antigenen auf MHC-IIMolekülen.
GM-CSF (pg/ml)
500
400
300
200
100
LCL1:11-NeoR
Abb. 24:
+
LM
B
B
-L
M
B
LM
+
-L
M
B
0
LCL1:11-NucNeoR
Leptomycin B beeinträchtig nur geringfügig die NeoR-Präsentation auf MHC-II-Moleküle
LCL1:11-NeoR- und LCL1:11-NucNeoR-Zellen wurden für insgesamt 36h mit 20ng/ml Doxycyclin induziert
und zudem während der letzten 16h mit LMB (8nM) behandelt. Anschließend wurden die Zellen mit dem
autologen, NeoR-spezifischen CD4+ T-Zell-Klon 20-4/A4 20h kokultiviert und die Menge an ausgeschüttetem
GM-CSF im ELISA gemessen.
6.
Einfluss des Zellzyklus auf die Präsentation nukleärer Proteine auf MHC-II-Molekülen
Der Zellzyklus eukaryonter Zellen wird in Mitose und Interphase, und diese weiter in G1-, S- und
G2/M-Phase unterteilt (Abb. 25). Während der S-Phase (Synthesephase) werden die Chromosomen
repliziert. Nach der anschließenden G2-Phase beginnt die Mitose oder auch M-Phase genannt, die
ebenfalls in mehrere Stadien unterteilt wird (Pro-, Meta-, Ana- und Telophase). Menschliche Zellen,
die sich schnell teilen, durchlaufen in rund 24h einen vollständigen Zellzyklus, wobei rund 30min auf
die Mitose, 9h auf die G1-Phase, 10h auf die S-Phase sowie 4,5h auf die G2-Phase entfallen.
Postmitotische Zellen vielzelliger Organismen können den Zellzyklus „verlassen“ und Tage, Wochen
oder sogar für immer ohne weitere Proliferation verbleiben. Diese Phase wird als G0-Phase bezeichnet.
In den meisten höheren Organismen löst sich die Kernmembran zu Beginn der Mitose in kleine
Vesikel auf. Erst im letzten Stadium der Mitose, in der Telophase, bildet sich um die segregierten,
55
III. Ergebnisse
dekondensierten Chromosomen erneut eine Kernhülle. Durch die kurzzeitige Auflösung der
Kernmembran während der M-Phase kommt es zu einer Durchmischung von nukleären und
zytoplasmatischen
Bestandteilen.
Während
dieser
Phase
könnten
nukleäre
Antigene
in
Autophagosomen aufgenommen und anschließend auf MHC-II-Molekülen präsentiert werden.
Deshalb sollte der Einfluss des Zellzyklus auf die Präsentation von NucNeoR auf MHC-II-Molekülen
untersucht werden.
Abb. 25:
Schematische Darstellung der verschiedenen Phasen des Zellzyklus
Zellen, die die Mitose (M-Phase) durchlaufen haben, bilden zwei Tochterzellen aus, die sich entweder in der
G1-Phase wieder auf die Zellteilung vorbereiten oder für längere Zeit oder sogar für immer in der G0-Phase
verweilen. In der S-Phase replizieren die Zellen ihre DNA zu Schwesterchromatiden. In der G2-Phase nehmen
die Zellen an Volumen zu und bereiten sich so auf die erneute mitotische Teilung in der M-Phase vor. (Lodish
et al., 2001)
6.1
Inhibition des Zellzyklus durch Aphidicolin
Die Behandlung von logarithmisch wachsenden Zellkulturen mit Aphidicolin führt zu einem
Zellzyklusstopp in der S-Phase. Aphidicolin inhibiert die DNA-Polymerase, die für die
Chromosomen-Verdopplung in der S-Phase verantwortlich ist.
Um zu untersuchen, ob die Zellteilung einen Effekt auf die Präsentation nukleärer Antigene auf MHCII-Molekülen hat, wurden die stabil transfizierten LCL1:11-NeoR- und LCL1:11-NucNeoR-Zellen für
insgesamt 36h mit 4ng/ml Doxycyclin induziert und die letzten 24h zusätzlich mit 290nmol
Aphidicolin behandelt. Anschließend wurden sowohl Doxycyclin als auch Aphidicolin ausgewaschen
und identische Mengen von APC mit dem NeoR-spezifischen CD4+ T-Zellklon 20-4/A4 für 20h
kokultiviert. Die Menge an ausgeschüttetem GM-CSF wurde mittels ELISA gemessen.
Wie in Abb. 26 dargestellt, resultierte die Aphidicolin-Behandlung der Zielzellen in einer etwa 30prozentigen Reduktion des T-Zellsignals. Diese Versuche legten einen Einfluss des Zellzyklus auf die
Antigenpräsentation nahe. Da allerdings auch die Präsentation der zytosolischen Variante von NeoR
durch Aphidicolin beeinträchtigt war, konnten unspezifische Nebeneffekt des Inhibitors nicht
ausgeschlossen werden. Deshalb wurde ein weiterer experimenteller Ansatz gewählt, um die
Bedeutung des Zellzyklus für die endogene Präsentation der NeoR-Varianten auf MHC-II-Molekülen
näher zu untersuchen.
56
Abb. 26:
+
id
ic
ol
in
-A
ph
-A
LCL1:11-NeoR
Ap
hi
di
co
lin
800
700
600
500
400
300
200
100
0
ph
id
ic
ol
in
+
Ap
hi
di
co
lin
GM-CSF (pg/ml)
III. Ergebnisse
LCL1:11-NucNeoR
Aphidicolin-Behandlung der Zielzellen resultiert in einer verminderten T-Zell-Stimulation
LCL1:11-NeoR- und LCL1:11-NucNeoR-Zellen wurden für 36h mit 4ng/ml Doxycyclin induziert und die
letzten 24h zusätzlich mit Aphodicolin (290nmol) behandelt. Danach wurde Doxycyclin und Aphidicolin
ausgewaschen, die Zellen mit dem NeoR-spezifischen CD4+ T-Zell-Klon 20-4/A4 für 20h kokultiviert und
anschließend die Menge an ausgeschüttetem GM-CSF bestimmt.
6.2
Untersuchung der Rolle des Zellzyklus auf die Präsentation nukleärer Antigene durch
Elutriationszentrifugation
Die
Elutriationszentrifugation
(Elutriation) ermöglicht die
Auftrennung
von
Zellen
nach
Zellzyklusphasen. Sie beruht auf zwei entgegengesetzt wirkenden Kräften, der Zentrifugalkraft durch
den sich drehenden Rotor und der Kraft der die Separationskammer durchströmenden Flüssigkeit mit
ihrer zentripetalen Ausrichtung (Abb. 9). Durch diese zwei entgegengesetzt wirkenden Kräfte können
Zellen entsprechend ihrer Größe und Dichte aufgetrennt werden. Die langsam in ein außerhalb der
Zentrifuge liegendes Reservoirgefäß injizierten Zellen wandern innerhalb der Separationskammer
entsprechend ihrer Größe und Dichte zu dem Ort, an dem ein Gleichgewicht zwischen diesen beiden
Kräften besteht. Durch Erhöhung der Durchflussgeschwindigkeit können die einzelnen Zellfraktionen
aus der Kammer ausgewaschen werden. Zellen mit einem einfachen Chromosomensatz (G1/0-PhaseZellen) weisen eine geringe Dichte und Größe auf und werden zuerst elutriiert. Mit beginnender DNASynthese in der S-Phase nehmen die Dichte und Größe der Zellen zu und erreichen ihr Maximum in
der G2- bzw. M-Phase, wenn die Zellen einen doppelten Chromosomensatz aufweisen. Somit ist es
möglich, asynchron wachsende Zellkulturen in einzelne Zellpopulationen gleicher Zellzyklusphasen
aufzutrennen.
6.2.1
Auftrennung von LCL1:11-Zellen nach Zellzyklusphasen
Das Ergebnis der eigenen Elutriation wurde mittels Chromatinfärbung der einzelnen Zellfraktionen im
FACS überprüft (vgl Kapitel II.2.2.6.1).
Die
FACS-Analyse
der
Propidiumiodid-gefärbten
Zellfraktionen
ergab,
dass
bei
einer
Durchflussmenge von 30ml/min fast ausschließlich Zellen mit einfachem Chromosomensatz elutriiert
wurden (Abb. 27). Diese zeigten eine Fluoreszenzintensität von etwa 300FE. Je mehr Chromatin in
der S-Phase synthetisiert wurde, desto höher wurde die Propidiumiodid-Fluoreszenz. Zellen der G2/M-
57
III. Ergebnisse
Phase wurden mit 80ml/min elutriiert. Im FACS wiesen diese Zellen eine Fluoreszenzintensität von
600FE auf. Diese Vorversuche zeigten, dass sich LCL1:11-Zellen sehr gut nach Zellzyklus-Phasen
auftrennen ließen. Dies eröffnete die Möglichkeit, die Rolle des Zellzyklus in der Präsentation von
NucNeoR auf MHC-II-Molekülen näher zu untersuchen.
unsepariert
2500
Counts
2000
1500
1000
500
0
0
200
400
600
800
1000
PI
45ml/min
2000
2000
1500
1000
500
2000
1500
1000
200
400
600
800
1000
0
200
400
PI
600
800
0
1000
60ml/min
70ml/min
1000
500
0
0
400
600
PI
800
1000
Counts
2000
1500
Counts
2000
1500
500
800
1000
800
1000
80ml/min
2000
1000
600
2500
1500
200
400
PI
2500
0
200
PI
2500
Counts
1000
0
0
0
1500
500
500
0
Abb. 27:
50ml/min
2500
Counts
2500
Counts
Counts
40ml/min
2500
1000
500
0
0
200
400
600
800
1000
PI
0
200
400
600
PI
Auftrennung der LCL1:11 Zellen nach Zellzyklusphasen durch Elutriation
Nach Elutriation wurden 3x106 Zellen jeder Zellfraktion mit 80% EtOH fixiert und anschließend mit 50µg/ml
Propidiumiodid in PBS gefärbt. Das Propidiumiodid interkaliert in die helikale Struktur des Chromatins und
ist somit ein Maß für den DNA-Gehalt von Zellen. Die x-Achse zeigt die Fluoreszenzintensität des
Propidiumiodid-gefärbten Chromatins, die y-Achse die Anzahl der Zellen.
6.2.2
Abhängigkeit der NeoR-spezifischen T-Zellstimulation von den Zellzyklusphasen der
NeoR- bzw. NucNeoR-Transfektanten
1x109 LCL1:11-NeoR- bzw. LCL1:11-NucNeoR-Zellen wurden für 36h mit 30ng/ml Doxycyclin
induziert und anschließend bei 1300rpm und mit Durchflussraten zwischen 40 und 80ml/min elutriiert.
Die Auftrennung der Zellen nach Zellzyklusphasen wurde durch Propidiumiodid-Färbung verifiziert
(Daten nicht gezeigt). Nach der Elutriation wurden gleiche Mengen an Zellen jeder Faktion zur
Stimulation der NeoR-spezifischen CD4+ T-Zellen eingesetzt.
Die beste T-Zell-Stimulation wurde mit Zellen in der G1/0-Phase erzielt; sie nahm mit Fortschreiten
des Zellzyklus hin zur G2/M-Phase kontinuierlich ab (Abb. 28). Für diese Unterschiede in der TZellstimulation kamen mehrere Ursachen in Betracht. Diese sollten im Folgenden näher untersucht
wurden.
58
40ml/min
45ml/min
50ml/min
60ml/min
70ml/min
GM-CSF (pg/ml)
500
80ml/min
400
Durchflussmengen
III. Ergebnisse
unsepariert
300
T-Zellen alleine
200
100
0
G1/0
S
G2/M
LCL1:11-NeoR
Abb. 28:
G1/0
S
G2/M
LCL1:11-NucNeoR
Abhängigkeit der T-Zellstimulation von den Zellzyklusphasen der Zielzellen
LCL1:11-NeoR- und LCL1:11-NucNeoR-Zellen wurden für 36h mit 30ng/ml Doxycyclin induziert.
Anschließend wurden die Zellen nach Zellzyklusphasen aufgetrennt und zur Stimulation der NeoRspezifischen T-Zellen eingesetzt. Die höchste T-Zellaktivierung, gemessen an der GM-CSF-Ausschüttung,
wurde nach Stimulation mit Zielzellen in der G1/0-Phase beobachtet. Dagegen stimulierten Zellen in späteren
Phasen des Zellzyklus die T-Zellen deutlich weniger.
6.2.3
Nachweis der rekombinanten Antigenmenge in den verschiedenen Zellzyklusphasen
Um zu testen, ob die Unterschiede in der Antigenpräsentation abhängig waren von den
Antigenmengen, wurden aus 5x106 Zellen jeder Elutriationsphase Proteinextrakte hergestellt, mittels
SDS-PAGE aufgetrennt und nach Western-Transfer die Mengen an exprimiertem NeoRFusionsprotein mit dem anti-Myc-Antikörper bestimmt.
Abb. 29 zeigt die Westernblot-Analyse der NeoR-Proteinmengen in den elutriierten LCL1:11-NeoRund LCL1:11-NucNeoR-Zellen. Bezogen auf die Ladungskontrolle des housekeeping-Proteins Aktin
wiesen alle Zellfraktionen beider Zelllinien annähernd gleiche Mengen an NeoR-Protein auf.
Abb. 29:
NeoR-Proteinexpression in Zellen verschiedener Zellzyklusphasen
LCL1:11-NeoR- und LCL1:11-NucNeoR-Zellen wurden für 36h mit 30ng/ml Doxycyclin induziert.
Anschließend wurden die Zellen nach Zellzyklusphasen aufgetrennt und aus 5x106 Zellen jeder
Elutriationsfraktion Proteinextrakte hergestellt, im SDS-PAGE aufgetrennt und nach Western-Transfer die
Mengen an NeoR-Protein mit dem anti-Myc-Antikörper bestimmt. Bezogen auf die Menge des housekeepingProteins Aktin wiesen Zellen in unterschiedlichen Zellzyklusphasen annähernd gleiche Mengen an
rekombinantem NeoR- bzw. NucNeoR-Protein auf.
59
III. Ergebnisse
6.2.4
Untersuchung der zellzyklusabhängigen MHC-II-Expression der LCL1:11-Zellen
Um zu testen, ob die MHC-II-Expression zellzyklusabhängigen Schwankungen unterliegt, wurden
LCL1:11-Zellen mittels Elutriation aufgetrennt und für 2h mit 500pg/ml bzw. 50pg/ml NeoR-Peptid
inkubiert. Anschließend wurden die Zellen gewaschen und nach Kokultur mit den NeoR-spezifischen
CD4+ T-Zellen die Menge an ausgeschütteten GM-CSF gemessen.
Auch in diesen Versuchen wurde eine unterschiedliche T-Zellaktivierung in Abhängigkeit von der
Zellzyklusphase der Stimulatorzellen beobachtet (Abb. 30). Dabei zeigte sich allerdings eine im
Vergleich zu Versuchen nach endogener Antigenpräsentation (Abb. 28) umgekehrte Korrelation;
Zellen der G2/M-Phase bewirkten die höchste Zytokinausschüttung, während Zellen der G1/0-Phase die
40ml/min
45ml/min
50ml/min
GM-CSF (pg/ml)
60ml/min
600
70ml/min
500
100ml/min
Durchflussmengen
T-Zellen am wenigsten stimulierten.
unsepariert
400
LCL1:11 ohne Peptid
300
200
100
0
G1/0
S
G2/M
LCL1:11 +
500pg/ml NeoR Peptid
Abb. 30:
G1/0
S
G2/M
LCL1:11 +
50pg/ml NeoR Peptid
Zellzyklusphasenabhängige T-Zellstimulation nach exogener Peptidbeladung der Zielzellen
LCL1:11-Zellen wurden nach Zellzyklusphasen aufgetrennt, für 2h mit 500pg/ml bzw. 50pg/ml NeoR-Peptid
inkubiert und zur Stimulation der NeoR-spezifischen CD4+ T-Zellen eingesetzt. Die niedrigste TZellaktivierung, gemessen an der GM-CSF Ausschüttung, wurde nach Stimulation mit Zielzellen in der G1/0Phase beobachtet; sie nahm mit Eintritt der Zellen in die S-Phase bis hin zur G2/M-Phase stetig zu.
Um zu überprüfen, ob diese Ergebnisse auf einer unterschiedlichen MHC-II-Expression beruhten,
wurde die HLA-DP-Oberflächenexpression auf Zellen in der G1/0 bzw. G2/M Phase im FACS
untersucht. Dabei zeigte sich eine deutlich erhöhte HLA-DP-Oberflächenexpression auf Zellen der
G2/M-Phase verglichen mit Zellen in der G1/0-Phase (Abb. 31).
60
III. Ergebnisse
HLA-DP Fluoreszenzeinheiten
200
150
100
50
0
G1/0-Phase
G2/M-Phase
Abb. 31: Zellen der G2/M-Phase exprimieren höhere Mengen an MHC-II-Molekülen auf ihrer
Zelloberfläche als Zellen in der G1/0-Phase
LCL1:11-Zellen wurden nach Zellzyklus-Phasen aufgetrennt und die HLA-DP Oberflächenexpression in den
G1/0- und G2/M-Phase Zellen mittels FACS quantifiziert.
6.2.5
Zellzyklusabhängige Antigenpräsentation nach exogener Proteinbeladung
Die zellzyklusabhängige Oberflächenexpression von MHC-II-Molekülen lieferte somit keine
Erklärung für die erhöhte T-Zellerkennung Doxycyclin-induzierter LCL1:11-NeoR- bzw. LCL1:11NucNeoR-Stimulatorzellen in der G1/0-Phase. Diese Versuche wiesen aber darauf hin, dass
möglicherweise auch weitere an der Antigenpräsentation beteiligte Moleküle zellzyklusabhängig
reguliert wurden und dass diese eventuell für die Unterschiede in der T-Zellaktivierung verantwortlich
waren. Deshalb wurden LCL1:11-Zellen für 20h mit limitierenden Mengen von rekombinantem
NeoR-Protein inkubiert (150ng/1x106 Zellen). In dieser Zeit nahmen die Zellen das Protein aus der
Umgebung über Endozytose auf, prozessierten es im endosomal/lysosomalen Kompartiment und
präsentierten es auf ihrer Zelloberfläche. Diese Zellen wurden dann über Elutriation aufgetrennt und
mit T-Zellen kokultiviert.
Ähnlich wie nach Beladung mit Peptid stimulierten auch proteinbeladene Zellen in der G2/M-Phase
die T-Zellen am stärksten, während Zellen der G1/0-Phase die geringste Zytokinausschüttung der TZellen bewirkten (Abb. 32). Eine verminderte Endozytoseaktivität bzw. Antigenprozessierungsrate
der Zellen nach Eintritt in den Zellzyklus konnte somit ausgeschlossen werden. Vielmehr spiegelten
diese Ergebnisse die Unterschiede in der MHC-II-Oberflächenexpression wider (vgl. Abb. 31).
61
40ml/min
45ml/min
50ml/min
60ml/min
GM-CSF (pg/ml)
500
70ml/min
100ml/min
unsepariert
400
300
Durchflussmengen
III. Ergebnisse
LCL1:11 ohne Protein
200
100
0
G1/0
S
G2/M
LCL1:11 + NeoR-Protein
Abb. 32:
Zellzyklusphasenabhängige T-Zellstimulation nach exogener Proteinbeladung der Zielzellen
LCL1:11-Zellen wurden für 20h mit NeoR-Protein inkubiert und danach elutriiert. Anschließend wurden die
verschiedenen Zellfraktionen zur Stimulation der NeoR-spezifischen CD4+ T-Zellen eingesetzt. Gemessen an
der GM-CSF Ausschüttung wurde eine kontinuierliche Zunahme der T-Zellstimulation von Zellen der G1/0hin zur G2/M-Phase beobachtet.
6.2.6
Nachweis der Autophagie-Aktivität in den einzelnen Zellzyklusphasen
Ein weiterer möglicher Grund für die beobachteten Unterschiede in der T-Zellstimulation konnte eine
unterschiedliche Autophagie-Aktivität der Zellen in Abhängigkeit vom Zellzyklus sein. Da es hierfür
in der Literatur bislang keine Hinweise gab, wurde die Expression des Autophagiegens LC3 in Zellen
verschiedener Zellzyklusphasen untersucht. Das LC3-Protein liegt in zwei unterschiedlichen Varianten
vor. Die inaktive 18kDa große Variante (LC3-I) wird durch proteolytische Spaltung in eine 16kDa
große Variante (LC3-II) aktiviert, die in die Autophagosomenmembran eingebaut wird (vgl. Kapitel
I.3.2, Abb. 8). Der Nachweis der beiden Proteinvarianten erlaubt somit Rückschlüsse auf die
Expression und die Aktivität des Proteins. Um die LC3-Aktivierung in den Doxycyclin-induzierten
Zellen zu untersuchen, wurden Proteinextrakte elutriierter LCL1:11-NeoR- und LCL1:11-NucNeoRZellen hergestellt, durch SDS-PAGE aufgetrennt und nach Western-Transfer mit einem Antikörper
gegen LC3 inkubiert.
Bezogen
auf
die
Menge
des
housekeeping-Proteins
GAPDH
(Glyceraldehyd-3-Phosphat-
Dehydrogenase) wiesen alle Zellen in den verschiedenen Zellzyklusphasen ähnliche Mengen beider
LC3-Proteinvarianten auf (Abb. 33). Diese Ergebnisse legten nahe, dass die Autophagie nicht
zellzyklusabhängig reguliert wird und dass die unterschiedliche Stimulation der T-Zellen durch Zellen
in verschiedenen Zellzyklusphasen nicht auf Unterschiede in der Autophagie-Aktivität beruhte.
62
III. Ergebnisse
Abb. 33: Expression und Aktivität des Autophagie-assoziierten LC3-Proteins werden zellzyklusunabhängig reguliert
LCL1:11-NucNeoR-Zellen wurden für 36h mit 30ng/ml Doxycyclin induziert. Anschließend wurden die
Zellen nach Zellzyklusphasen aufgetrennt und aus 5x106 Zellen jeder Elutriationsfraktion Proteinextrakte
hergestellt, mittels SDS-PAGE aufgetrennt und nach Western-Transfer die Mengen an LC3-Protein mit dem
anti-LC3-Antikörper bestimmt. Bezogen auf die Menge des housekeeping-Proteins GAPDH wiesen alle
Zellfraktionen annähernd gleiche Mengen an inaktivem LC3-I sowie aktivem LC3-II Protein auf. Ähnliche
Ergebnisse wurden mit LCL1:11-NeoR-Zellen erzielt.
6.2.7
Rolle des nukleären Antigenreservoirs nach Auflösung der Kernmembran
Da Zellen in allen Phasen des Zellzyklus in der Lage waren, exogenes Antigen effizient zu
präsentieren, konnte die verstärkte endogene Präsentation von NucNeoR auf MHC-II-Moleküle in der
G1/0-Phase darauf beruhen (Abb. 28), dass sich nukleäres Antigen während der Auflösung der
Kernmembran in der M-Phase ins Zytoplasma ergoss, dort von Autophagosomen aufgenommen und
in der nachfolgenden G1/0-Phase präsentiert wurde. In diesem Falle sollte es auch nach Abschalten der
Transkription durch Auswaschen des Doxycyclins in LCL1:11-NucNeoR-Zellen in der G1/0 Phase zu
einer verstärkten Antigenpräsentation kommen. Im Vergleich dazu sollten LCL1:11-NeoR-Zellen, in
denen NeoR während aller Phasen des Zellzyklus im Zytoplasma vorliegt, das rekombinante Antigen
zellzyklusunabhängig präsentieren.
Deshalb wurden LCL1:11-NeoR- und LCL1:11-NucNeoR-Zellen für 3 Tage mit 30ng/ml Doxycyclin
induziert. Danach wurden das Doxycyclin ausgewaschen, die Zellen für 36h weiterkultiviert und
anschließend nach Zellzyklusphasen aufgetrennt. Um die Abschaltung der Transkription zu
überprüfen, wurde nach Doxycyclin-Entfernung und unmittelbar vor Elutriation der Zellen GesamtRNA isoliert, in cDNA umgeschrieben und diese in eine rtPCR eingesetzt. Als Referenzgen zur
Bestimmung der Menge von NeoR-Transkripten wurde das housekeeping-Gen Cyclophilin B
verwendet.
Wie man an der Auswertung der rtPCR in Abb. 34 sehen kann, waren zum Zeitpunkt der Elutriation
nahezu keine NeoR-Transkripte mehr nachweisbar.
63
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
LCL1:11-NeoR
Abb. 34:
36
In h n
du a
kt ch
io
n
ie
rt
in
du
z
in
du
36
In h n
du a
kt ch
io
n
0,0
zi
er
t
relative Menge NeoR-mRNA
III. Ergebnisse
LCL1:11-NucNeoR
36h nach Auswaschen des Doxycyclins sind kaum noch NeoR-Transkripte nachweisbar
LCL1:11-NeoR- und LCL1:11-NucNeoR-Zellen wurden für 3 Tage mit 30ng/ml Doxycyclin induziert,
anschließend das Doxycyclin ausgewaschen und die Zellen für 36h weiterkultiviert. Zum Zeitpunkt des
Doxycyclin-Auswaschens sowie 36h danach wurde aus jeweils 5x106 Zellen Gesamt-RNA isoliert, in cDNA
umgeschrieben und diese in eine rtPCR eingesetzt. Gezeigt sind hier die relativen Mengen an NeoR-mRNA
normalisiert gegen Cyclophilin B-mRNA. 36h nach Auswaschen des Doxycyclins waren nahezu keine NeoRbzw. NucNeoR-Transkripte mehr nachweisbar.
Die elutriierten Zellen wurden in den T-Zelltest mit dem NeoR-spezifischen CD4+ T-Zell-Klon
20-4/A4 eingesetzt und die Stimulation der T-Zellen im GM-CSF-ELISA gemessen.
Entgegen der Arbeitshypothese wurde die stärkste MHC-II-restringierte Präsentation von
zytosolischem und von nukleärem Antigen in Zellen der G2/M-Phase beobachtet (Abb. 35) und somit
in derselben Zellzyklusphase wie nach exogener Beladung der Zellen mit Peptid oder Protein (vgl.
Abb. 30+32). Wäre die Auflösung der Kernmembran und die damit verbundene intrazelluläre
Umverteilung von NucNeoR Voraussetzung für die Autophagie-vermittelte Antigenpräsentation, wäre
zu erwarten gewesen, dass erstens Zellen in der G1/0-Phase die stärkste T-Zellstimulation bewirken,
zweitens das T-Zellsignal kontinuierlich über die sich anschließenden Zellzyklusphasen abnimmt, und
drittens
im
Vergleich
dazu
LCL1:11-NeoR-Zellen
eine
Zellzyklusphasen-unabhängige
Antigenpräsentation zeigen. Da dies nicht der Fall war, spielt die Auflösung der Kernmembran und die
dadurch bedingte Durchmischung nukleärer und zytoplasmatischer Zellbestandteile wahrscheinlich
keine entscheidende Rolle für die endogene Präsentation von NucNeoR auf MHC-II-Molekülen.
64
30ml/min
35ml/min
40ml/min
50ml/min
60ml/min
GM-CSF (pg/ml)
500
70ml/min
400
Durchflussmengen
III. Ergebnisse
100ml/min
300
unsepariert
200
100
0
G1/0
S
G2/M
LCL1:11-NeoR
G1/0
S
G2/M
LCL1:11-NucNeoR
Abb. 35: Nach Abschalten der NeoR-Transkription stimulieren Zellen in späten Phasen des Zellzyklus
die T-Zellen am stärksten
LCL1:11-NeoR- und LCL1:11-NucNeoR-Zellen wurden für 3 Tage mit 30ng/ml Doxycyclin induziert und
danach das Doxycyclin ausgewaschen. Die Zellen wurden für 36h weiterkultiviert, nach Zellzyklusphasen
aufgetrennt und zur Stimulation der NeoR-spezifischen CD4+ T-Zellen eingesetzt. In beiden Zelllinien war die
Fähigkeit zur T-Zellstimulation in späten Phasen (G2/M-Phase) des Zellzyklus am ausgeprägtesten; Zellen der
G1/0-Phase aktivierten die T-Zellen am wenigsten.
6.2.8
Rolle der zellzyklusabhängigen Transkriptions- bzw. Translationsaktivität
Der Hauptunterschied zwischen den Experimenten in III.6.2.2 und III.6.2.7 war das Abschalten der
NeoR-Transkription durch Auswaschen des Doxycyclins. Demnach könnte die zellzyklusabhängige
NeoR-Präsentation
durch
eine
unterschiedliche
Transkriptions-/Translationsaktivität
in
den
verschiedenen Zellzyklusphasen bedingt sein. Um dies zu testen wurden LCL1:11-NeoR- und
LCL1:11-NucNeoR-Zellen ohne Doxycyclin-Induktion mittels Elutriation nach Zellzyklusphasen
aufgetrennt. Sofort nach der Zellfraktionierung wurden 1,5x107 Zellen jeder Fraktion mit 1µg/ml
Doxycyclin für 7h induziert. Anschließend wurde aus jeweils 1x107 Zellen Protein und aus 5x106
Zellen Gesamt-RNA isoliert. Parallel dazu wurde über den gesamten Zeitraum von 0h bis 24h nach
Doxycyclin-Induktion die GFP-Expression der Zellen im FACS gemessen. Ein weiterer Teil der
induzierten Zellen wurde mit dem NeoR-spezifischen CD4+ T-Zell-Klon 20-4/A4 kokultiviert.
Wie aus der FACS-Analyse ersichtlich (Abb. 36), exprimierten Zellen der G1/0-Phase schneller mehr
GFP. Die Unterschiede sind 1h bis 8h nach Induktion am deutlichsten. 24h nach Induktion waren
keine nennenswerten Unterschiede mehr in der GFP-Fluoreszenz erkennbar. Dies war ein Hinweis
darauf, dass Zellen der G1/0-Phase eine höhere transkriptionelle/translationelle Aktivität aufweisen als
Zellen, die sich gerade in der Zellteilung befinden (späte Phasen der Elutriation).
65
% grünfluoreszierende Zellen
III. Ergebnisse
40
35
30
25
1h
3h
5h
8h
8
7
6
5
4
3
2
1
0
24h
40ml/min
45ml/min
50ml/min
70ml/min
S
G1/0
Abb. 36:
60ml/min
80ml/min unsepariert
G2/M
Stärkste GFP-Fluoreszenz nach Doxycyclin-Induktion in G1/0 Phase-Zellen
LCL1:11-NucNeoR-Zellen wurden nach Zellzyklusphasen aufgetrennt und mit 1µg/ml Doxycyclin induziert.
Zu verschiedenen Zeitpunkten nach Doxycyclin-Induktion wurde die GFP-Expression der Zellen im FACS
gemessen. Die G1/0-Phase-Zellen exprimieren schneller mehr GFP. 1h bis 8h nach Induktion sind die
Unterschiede am signifikantesten. 24h nach Induktion sind keine nennenswerten Unterschiede in der GFPFluoreszenz mehr messbar. Ähnliche Ergebnisse wurden mit LCL1:11-NeoR-Zellen erzielt.
Um diese Ergebnisse auf RNA-Ebene zu untermauern, wurden gleiche Mengen an Gesamt-RNA aus
den einzelnen Zellfraktionen in cDNA umgeschrieben und die darin enthaltene Anzahl an NucNeoRTranskripten mittels rtPCR ermittelt. Als Referenz diente wiederum das housekeeping-Gen
Cyclophilin B. Wie in der Auswertung der rtPCR zu sehen ist, waren in Zellen der G1/0-Phase die
meisten NucNeoR-Transkripte nachweisbar (Abb. 37), während die Menge an spezifischen
40
35
30
25
20
15
10
5
0
50
m
l/m
55 in
m
l/m
in
60
m
l/m
in
65
m
l/m
in
70
m
l/m
in
80
m
l/m
in
10
0m
l/m
oh
in
ne
D
ox
y.
relative Menge NeoR-mRNA
Transkripten im Verlauf des Zellzyklus bis zur G2/M-Phase kontinuierlich abnahm.
G1/0
Abb. 37:
S
G2/M
Stärkste Transkriptionsaktivität in G1/0-Phase-Zellen 7h nach Doxycyclin-Zugabe
LCL1:11-NucNeoR-Zellen wurden nach Zellzyklusphasen aufgetrennt und mit 1µg/ml Doxycyclin induziert.
7h nach Induktion wurden aus 5x106 Zellen jeder Elutriationsfraktion Gesamt-RNA isoliert, in cDNA
umgeschrieben und diese in eine rtPCR eingesetzt. Gezeigt sind hier die relativen Mengen an NeoR-mRNA
normalisiert gegen Cyclophilin B-mRNA. Ähnliche Ergebnisse wurden für LCL1:11-NeoR-Zellen erzielt.
66
III. Ergebnisse
Da aus der Transkriptionsrate nicht automatisch auf die translatierte Menge des Proteins geschlossen
werden konnte, wurde zusätzlich eine NeoR-spezifische Westernblot-Analyse durchgeführt (Abb. 38).
Auch hier konnte in den ersten Zellfraktionen eine höhere NucNeoR-Proteinmenge detektiert werden
als in den späten Fraktionen der Elutriation. Die NeoR-Proteinmenge war bei einer DoxycyclinInduktion von 7h so gering, dass sie im Western-Blot nicht nachweisbar waren.
Abb. 38:
Stärkste NucNeoR-Proteinexpression in G1/0-Phase-Zellen 7h nach Doxycyclin-Zugabe
LCL1:11-NucNeoR-Zellen wurden nach Zellzyklusphasen aufgetrennt und mit 1µg/ml Doxycyclin induziert.
7h nach Induktion wurde aus 1x107 Zellen jeder Zellfraktion ein Proteinextrakt hergestellt, mittels SDS-PAGE
aufgetrennt und nach Western-Transfer die Mengen an NucNeoR-Protein mit dem anti-myc-Antikörper
bestimmt. Bezogen auf die Ponceau S-Färbung enthielten Zellen der G1/0-Phase die größte Menge an
NucNeoR-Protein, die mit der Progression des Zellzyklus stetig abnahm. Der Pfeil markiert die Höhe der
NucNeoR-Protein-Bande. Die zusätzliche, oberhalb liegende Bande zeigt eine unspezifische Bindung des
Antikörpers bei ca. 40-minütiger Exposition.
6.2.9
Korrelation
der
NeoR-spezifischen
CD4+
T-Zellerkennung
und
der
transkriptionellen/translationellen Aktivität der Transfektanten
Ein weiterer Teil der elutriierten LCL1:11-NucNeoR-Zellen wurde zudem mit 50ng/ml Doxycyclin
induziert und unmittelbar mit den NeoR-spezifischen CD4+ T-Zellen kokultiviert (Abb. 39).
Am stärksten T-Zell-stimulierend wirkten Zellen der transkriptionell aktivsten G1/0-Phase. Die
geringste T-Zellstimulation verursachten Zellen der G2/M-Phase, die in den vorangegangenen
Experimenten auch die niedrigste transkriptionelle/translationelle Aktivität aufwiesen.
Zusammenfassend zeigten diese Versuche, dass die endogene Präsentation von NeoR keiner
Auflösung der Kernmembran bedarf, nicht von der intrazellulären Lokalisation oder der absoluten
Antigenmenge per se abhängt, sondern ausschließlich mit der Transkription/Translation von NeoR
korreliert.
67
35ml/min
40ml/min
45ml/min
50ml/min
60ml/min
70ml/min
Durchflussmengen
III. Ergebnisse
GM-CSF (pg/ml)
100ml/min
800
700
600
500
400
300
200
100
0
unsepariert
T-Zellen alleine
T-Zellen + PHA
G1/0
S
G2/M
LCL1:11-NucNeoR
Abb. 39: Unmittelbar nach Doxycyclin-Induktion stimulieren Zellen der G1/0-Phase die T-Zellen am
stärksten
LCL1:11-NucNeoR-Zellen wurden nach Zellzyklusphasen aufgetrennt, mit 50ng/ml Doxycyclin induziert und
direkt zur Stimulation der NeoR-spezifischen CD4+ T-Zellen über Nacht eingesetzt. Die stärkste TZellaktivierung wurde nach Stimulation mit Zielzellen in der G1/0-Phase beobachtet. Die T-Zell-stimulierenden
Eigenschaften der Zellen nahmen vom Eintritt in die S-Phase bis hin zur G2/M-Phase kontinuierlich ab. Für
LCL1:11-NeoR-Zellen wurden ähnliche Ergebnisse erziehlt.
7.
Bestätigung der Autophagie-abhängigen Präsentation nukleärer Proteine im EBVModell LCL-EBNA3C
Die Ergebnisse mit dem NucNeoR-Modellantigen zeigten, dass nukleäre Antigene über Autophagie
auf MHC-II-Molekülen präsentiert werden können. Um einen Hinweis darauf zu bekommen, ob es
sich dabei um einen Sonderfall oder einen möglicherweise allgemein gültigen Präsentationsweg
handelt, wurden diese Untersuchungen auf das virale Kernantigen EBNA3C ausgedehnt. Der nukleäre
Transkriptionsfaktor EBNA3C ist eines von neun Latenzgenen von EBV, die in allen EBV-positiven
LCL exprimiert werden. EBNA3C-spezifische CD4+ T-Zellen wurden in der Arbeitsgruppe von
mehreren Spendern etabliert und standen für diese Untersuchungen zur Verfügung. Diese T-Zellen
sind in der Lage, LCL direkt zu erkennen. Wie Peptide von EBNA3C auf MHC-II-Molekülen
präsentiert werden, war bislang jedoch unklar.
7.1
Autophagie-abhängige Präsentation von EBNA3C
Um eine mögliche Präsentation von EBNA3C auf MHC-II-Molekülen über Autophagie
nachzuweisen, wurden LCL-GB mit dem Vektor pRTS-EBNA3C stabil transfiziert. Die daraus
resultierende LCL-GB-EBNA3C-Zelllinie wurde für 36h mit 30ng/ml Doxycyclin induziert und die
letzten 24h zusätzlich mit den Inhibitoren Leupeptin, Chloroquin und 3-MA behandelt. Danach
wurden die Zellen mit PFA fixiert und mit dem EBNA3C-spezifischen, autologen CD4+ T-Zellklon
GB 3C-3H10 für 20h kokultiviert. Die T-Zellaktivierung wurde mittels GM-CSF-ELISA gemessen.
68
III. Ergebnisse
Die Behandlung der Zellen mit 3-MA führte zu einer Reduktion der T-Zellerkennung, was auf eine
Beteiligung von Autophagie an der Antigenpräsentation hindeutete. Durch die konstitutive Expression
von EBNA3C in LCL war diese Reduktion weniger ausgeprägt als bei NucNeoR (Abb. 40). Auch
Leupeptin und Chloroquin inhibierten die EBNA3C-Antigenpräsentation, was weitere Hinweise für
eine Beteiligung des vesikulären Systems an der Antigenpräsentation lieferte.
ohne Inhibitor
GM-CSF (pg/ml)
1000
3-MA
800
Leupeptin
600
Chloroquin
400
200
0
nicht fixiert
0,5% PFA fixiert
LCL-GB-EBNA3C
Abb. 40: Inhibition der Autophagie beeinträchtigt die Präsentation von EBNA3C auf MHC-IIMolekülen
LCL-GB-EBNA3C wurden für 36h mit 30ng/ml Doxycyclin induziert und die letzten 24h zusätzlich mit
3-MA, Leupeptin oder Chloroquin inkubiert. Nach der Inhibitorenbehandlung wurden die Zellen entweder
direkt oder nach Fixierung für 20h mit dem EBNA3C-spezifischen, autologen CD4+ T-Zellklon GB 3C-3H10
kokultiviert. Dargestellt ist die GM-CSF-Konzentration im Kulturüberstand, die mittels ELISA gemessen
wurde.
7.2
Zellzyklusabhängige Präsentation von EBNA3C
Um zu testen, ob EBNA3C ebenfalls zellzyklusabhängig auf MHC-II-Molekülen präsentiert wird,
wurden 5x108 LCL-JM-Zellen durch Elutriation nach Zellzyklusphasen aufgetrennt und in den TZelltest eingesetzt. Nach 20h Kokultur mit dem EBNA3C-spezifischen CD4+ T-Zell-Klon 3C-5H11
wurde die GM-CSF-Ausschüttung im ELISA sichtbar gemacht.
Ähnlich wie nach exogener Zugabe von NeoR-Protein (vgl. Abb. 32 in Kapitel III.6.2.5) oder nach
Doxycyclinentzug (vgl. Abb. 35 in Kapitel III.6.2.7) wurden auch hier Zellen der G2/M-Phase von
den T-Zellen am besten erkannt (Abb. 41).
69
35ml/min
40ml/min
45ml/min
50ml/min
60ml/min
GM-CSF (pg/ml)
70ml/min
Durchflussmengen
III. Ergebnisse
100ml/min
800
700
600
500
400
300
200
100
0
unsepariert
T-Zellen alleine
T-Zellen + PHA
S
G1/0
G2/M
LCL-JM
Abb. 41:
erkannt
LCL-JM Zellen der G2/M-Phase werden von den EBNA3C-spezifischen T-Zellen am besten
LCL-JM-Zellen wurden nach Zellzyklusphasen aufgetrennt und direkt zur Stimulation der EBNA3Cspezifischen T-Zellen über Nacht eingesetzt. Zellen der G1/0-Phase bewirkten die geringste ZytokinAusschüttung der T-Zellen, die mit der Progression der Zellen im Zellzyklus bis zur G2/M-Phase
kontinuierlich zunahm.
Ein interzellulärer Antigentransfer, wie für manche EBV-Proteine beschrieben (Landais et al., 2005;
Taylor et al., 2006), konnte in Kokulturexperimenten von MHC-II-differenten LCL mit autologen
PBMC (peripheral blood mononuclear cells) ausgeschlossen werden (Daten nicht gezeigt). Trotz der
geringen
Erkennung
von
Zellen
in
der
G1/0-Phase
war
eine
Translations-assoziierte
Antigenpräsentation vorstellbar, vorausgesetzt dass das EBNA3C-Protein gleichmäßig in allen Phasen
des Zellzyklus exprimiert wurde. In diesem Fall war zu erwarten, dass die T-Zellerkennung mit der
höheren MHC-II-Expression in späten Phasen des Zellzyklus korrelierte. Selbst bei einer
präferentiellen Transkription/Translation von EBNA3C in der G1/0-Phase, wie für NeoR beschrieben,
wären die Ergebnisse mit einer Translations-assoziierten Antigenpräsentation vereinbar, vorausgesetzt
die Halbwertszeit der Antigen/MHC-II-Komplexe überstieg die Generationszeit der LCL. In diesem
Fall würde es zu einer kontinuierlichen Akkumulation des Antigens auf der Zelloberfläche kommen,
bis die Zahl der Antigen/MHC-II-Komplexe durch die Zellteilung wieder halbiert würde. Beide
Annahmen waren bei unkontrollierter Antigenexpression experimentell schwer zu überprüfen, deshalb
sollte die Zellzyklus-abhängige Präsentation von EBN3C nach Doxycyclin-induzierter Expression
untersucht werden.
70
III. Ergebnisse
7.3
Zellzyklusabhängige
Präsentation
von
EBNA3C
nach
Doxycyclin-induzierter
Expression
8
7x10 LCL-JM-EBNA3C Zellen wurden für 36h mit 25ng/ml Doxycyclin induziert und anschließend
elutriiert. 5x104 Zellen jeder Zellfraktion wurden mit EBNA3C-spezifischen CD4+ T-Zellen
kokultiviert und die GM-CSF Ausschüttung nach 20h mittels ELISA gemessen.
Das erhaltene Muster an zellzyklusabhängiger T-Zellaktivierung unterschied sich grundlegend von
dem untransfizierter LCL-JM-Zellen (vgl. Abb. 41). Zellen der G1/0-Phase bewirkten die größte
Zytokinausschüttung, die hin zur G2/M-Phase immer mehr abnahm (Abb. 42). Ein ähnliches Muster
an T-Zellaktivierung wurde nach Doxycyclin-induzierter NeoR-Expression beobachtet, was auf die
35ml/min
40ml/min
45ml/min
GM-CSF (pg/ml)
50ml/min
350
60ml/min
unsepariert
300
LCL-JM
250
T-Zellen alleine
200
T-Zellen + PHA
Durchflussmengen
Benutzung der gleichen Antigenpräsentationswege schließen ließ.
150
100
50
0
G1/0
S
G2/M
LCL-JM-EBNA3C
Abb. 42: Stärkste T-Zellstimulation durch Doxycyclin-induzierte LCL-JM-EBNA3C-Zellen in der
G1/0-Phase
LCL-JM-EBNA3C-Zellen wurden nach Zellzyklusphasen aufgetrennt, mit 25ng/ml Doxycyclin induziert und
zur Stimulation der EBNA3C-spezifischen T-Zellen über Nacht eingesetzt. Die stärkste T-Zellaktivierung
wurde nach Stimulation mit Zielzellen in der G1/0-Phase beobachtet. Die T-Zellaktivierung nahm nach Eintritt
der Zellen in die S-Phase bis hin zur G2/M-Phase kontinuierlich ab.
8.
Autophagie- und zellzyklusabhängige Präsentation von NeoR und EBNA3C in
LCL-UB
8.1
Stufenlose Induzierbarkeit der Antigene NeoR und EBNA3C durch DoxycyclinInduktion des bidirektionalen Promotors in LCL-UB-NeoR-EBNA3C-Zellen
Die Experimente mit den Antigenen NeoR und EBNA3C wurden zwar mit dem gleichen
Expressionsvektor und unter gleichen experimentellen Bedingungen durchgeführt, unterschieden sich
aber in den verwendeten Zelllinien. Allgemeine Rückschlüsse aus dem Vergleich der einzelnen
Experimente waren deshalb problematisch. Darum wurde der pRTS-NeoR-EBNA3C-Vektor erstellt,
71
III. Ergebnisse
in dem die Expression von NeoR und EBNA3C durch einen bidirektionalen, Tetracyclin-regulierbaren
Promotor gesteuert wurde. Dieses Plasmid wurde stabil in die Zelllinie LCL-UB eingebracht, da diese
die restringierenden MHC-II-Moleküle der EBNA3C- und NeoR-spezifischen CD4+ T-Zellen
exprimierten. Durch Doxycyclin-Behandlung der als LCL-UB-NeoR-E3C bezeichneten Zelllinie
konnte die Autophagie- bzw. zellzyklusabhängige Präsentation beider Antigene gleichzeitig untersucht
werden.
LCL-UB-NeoR-E3C-Zellen wurden für 36h mit verschiedenen Mengen Doxycyclin induziert und
anschließend entweder mit NeoR-spezifischen (20-4/A4) oder EBNA3C-spezifischen CD4+ T-Zellen
(GB 3C-3H10) kokultiviert.
In Abhängigkeit von den eingesetzten Doxycyclinmengen wurden die Zellen von beiden T-Zellklonen
erkannt (Abb. 43). Da LCL-UB aufgrund der endogenen EBNA3C-Expression bereits durch die
EBNA3C-spezifischen T-Zellen erkannt wurden, waren die T-Zellsignale hier im Vergleich zu NeoRspezifischen T-Zellen erhöht. In beiden Fällen war aber ein ähnlich stetiger Anstieg der TZellerkennung durch steigende Mengen an Doxycyclin zu erkennen, was auf eine gleichmäßige
2ng/ml
10ng/ml
20ng/ml
50ng/ml
GM-CSF (pg/ml)
1000
100ng/ml
1µg/ml
800
T-Zellen alleine
600
Doxycyclin-Konzentration
Transkription beider Gene durch den bidirektionalen Promotor hinwies.
T-Zellen + PHA
400
200
0
20-4/A4
GB 3C-3H10
LCL-UB-NeoR-E3C
Abb. 43:
Stufenlose Induzierbarkeit beider Antigene durch Zugabe steigender Mengen an Doxycyclin
LCL-UB-NeoR-E3C-Zellen wurden mit den angegebenen Mengen an Doxycyclin induziert und anschließend
zur Stimulation der NeoR- bzw. der EBNA3C-spezifischen CD4+ T-Zellen eingesetzt. Die T-Zellaktivierung,
gemessen an der GM-CSF-Ausschüttung, korrelierte direkt mit der Menge an eingesetztem Doxycyclin.
8.2
Inhibitorentest auf LCL-UB-NeoR-E3C-Zellen
Um die Präsentationswege der beiden Antigene näher zu charakterisieren, wurden LCL-UB-NeoRE3C-Zellen für 36h mit 30ng/ml Doxycyclin induziert und die letzten 20h zusätzlich mit den
Inhibitoren 3-MA, Leupeptin, Chloroquin, Aphidicolin oder LMB behandelt. Anschließend wurden
die Inhibitoren und das Doxycyclin ausgewaschen, und die Zellen in den T-Zelltest eingesetzt
(Abb. 44).
72
III. Ergebnisse
Die Behandlung der LCL-UB-NeoR-E3C-Zellen mit den Autophagie-Inhibitoren 3-MA, Leupeptin
und Chloroquin sowie dem Zellzyklusinhibitor Aphidicolin verminderte die Erkennung der Zellen
durch NeoR-spezifische T-Zellen signifikant. Die Präsentation von EBNA3C hingegen war nur durch
die Inhibitoren 3-MA, Chloroquin und Aphidicolin inhibierbar. Die Inhibition der Cystein-Proteasen
durch Leupeptin zeigte nur einen geringen Effekt auf die EBNA3C-Präsentation auf HLA-DR11.
Möglicherweise sind die durch Leupeptin inhibierten Proteasen nicht oder kaum an der Prozessierung
von EBNA3C beteiligt. Die Kernexportinhibition durch LMB hatte weder auf die Präsentation des
NeoR-Proteins noch des EBNA3C-Proteins einen Einfluss.
Diese Ergebnisse zeigten, dass in der Zelllinie LCL-UB beide in dieser Arbeit verwendeten
Modellantigene, NeoR und EBNA3C, Autophagie-abhängig präsentiert werden und dass der
Zellzyklus die Präsentation von zytosolischen und nukleären Antigenen auf MHC-II-Molekülen
beeinflusst.
600
300
500
GM-CSF (pg/ml)
GM-CSF (pg/ml)
ohne Inhibitoren
350
250
200
3-MA
Leupeptin
Chloroquin
400
Aphidicolin
300
LMB
200
ohne Doxy.
50
100
T-Zellen alleine
0
0
150
100
20-4/A4
T-Zellen + PHA
GB 3C-3H10
Abb. 44: Verminderte Antigenpräsentation von NeoR und EBNA3C nach Inhibition der Autophagie
oder des Zellzyklus
LCL-UB-NeoR-E3C-Zellen wurden für 36h mit 30ng/ml Doxycyclin induziert und die letzten 20h mit den
Inhibitoren 3-Methyladenin (3-MA), Leupeptin, Chloroquin, Aphidicolin und Leptomycin B (LMB)
behandelt. Danach wurden die Inhibitoren ausgewaschen und die Zellen mit dem T-Zellklon 20-4/A4 (NeoRspezifisch) bzw. GB 3C-3H10 (EBNA3C-spezifisch) kokultiviert. Die freigesetzte GM-CSF-Menge wurde
mittels ELISA bestimmt.
73
IV. Diskussion
IV.
Diskussion
1.
Die Dichotomie MHC-restringierter Antigenpräsentation
Das als „Dichotomie MHC-restringierter Antigenpräsentation“ bezeichnete Modell besagt, dass MHCI- und MHC-II-Moleküle
Proteinfragmente
aus
unterschiedlichen
zellulären
Kompartimenten
präsentieren (Pieters, 2000; Braciale et al., 1987). Proteine des Zytoplasmas und des Zellkerns werden
im Kontext von MHC-I-Molekülen präsentiert, Proteine des extrazellulären Raumes und des
endosomal/lysosomalen Systems dagegen im Kontext von MHC-II-Molekülen. Heute weiß man
jedoch, dass eine strikte Trennung der Antigenpräsentation nach der Herkunft der Proteine nicht
aufrechterhalten werden kann, weil so genannte „alternative Antigenpräsentationswege“ existieren
(Malnati et al., 1992; Lich et al., 2000; Mukherjee et al., 2001). Bei der „Kreuzpräsentation“
(exogener MHC-I-Präsentationsweg) werden exogene Proteine im Kontext von MHC-I-Molekülen
präsentiert. Dieser Präsentationsweg spielt eine wichtige Rolle bei der Induktion von Immunantworten
gegen Viren und Tumoren. Die Präsentation von Peptiden intrazellulärer Proteine im Kontext von
MHC-II-Molekülen (endogener MHC-II-Präsentationsweg) umfasst zum einen Proteine der
Zellmembran und des endosomal/lysosomalen Systems, die direkten Zugang zum MHC-IIPräsentationsweg besitzen. Zum anderen können auch zytoplasmatische und nukleäre Antigene über
einen noch weitgehend unverstandenen Präsentationsweg auf MHC-II-Molekülen präsentiert werden.
Die Kenntnis dieses Präsentationsweges ist die Grundlage für das Verständnis wichtiger
immunologischer Prozesse wie etwa der Toleranzinduktion und der Induktion einer antitumoralen
Immunität.
2.
Das Modellsystem zur Charakterisierung der endogenen MHC-II-restringierten
Präsentation nukleärer Antigene
Aufbauend auf der Arbeit von Nimmerjahn wurde für die Untersuchung der endogenen, MHC-IIrestringierten Präsentation nukleärer Antigene das Modellantigen NeoR verwendet (Nimmerjahn,
2001; Nimmerjahn et al., 2003). Für die Untersuchung der Antigenpräsentation stand ein CD4+ TZellklon zur Verfügung, der ein Spaltprodukt von NeoR auf HLA-DP3 erkennt. Im Gegensatz zu
vielen viralen Genprodukten interferiert dieses bakterielle Protein nicht mit zellphysiologischen
Prozessen. Aufgrund der geringen Größe von ca. 30kDa weist NeoR sowohl eine zytoplasmatische als
auch eine nukleäre Lokalisation auf. Um die endogene Präsentation eines Kernantigens zu
untersuchen, wurde in der eigenen Arbeit zusätzlich eine rein nukleär lokalisierte Variante des NeoR
kloniert, die drei NLS am C-Terminus enthielt und als NucNeoR bezeichnet wurde. Durch den
Vergleich dieser beiden Antigenvarianten sollten Gemeinsamkeiten und Unterschiede in ihren
Präsentationswegen identifiziert werden.
Um mögliche zellspezifische Unterschiede in der Antigenpräsentation aufzudecken, wurden diese
Untersuchungen in pAPC und nicht-pAPC durchgeführt. Als Vertreter dieser beiden Klassen wurde
die EBV-transformierte B-Zelllinie LCL1:11 bzw. die Nierenzellkarzinomlinie RCC1:24 verwendet.
74
IV. Diskussion
Im Gegensatz zu LCL1:11 exprimieren RCC1:24 MHC-II-Moleküle nicht konstitutiv, sondern erst
nach Induktion mit IFNγ. Da antigenbeladene MHC-II-Moleküle für durchschnittlich 24h auf der
Zelloberfläche präsentiert werden und nach Internalisierung erneut an die Zelloberfläche gelangen
können (MHC-Recycling), werden antigenbeladene Zellen auch Tage nach Entfernung des Antigens
noch von antigenspezifischen CD4+ T-Zellen erkannt (Pinet et al., 1995; Pinet et al., 1998). Viele der
bislang zur Untersuchung der Antigenpräsentation zur Verfügung stehenden Inhibitoren sind
zelltoxisch und können nur zeitlich begrenzt eingesetzt werden. Eine eingehende Untersuchung der
endogenen MHC-II-restringierten Antigenpräsentation in pAPC wie z.B. LCL1:11 war deshalb nur
möglich, wenn die Synthese des Antigens und damit die Beladung der MHC-II-Moleküle zu Beginn
des Versuchs neu einsetzte. In nicht-pAPC wie z.B. den RCC1:24-Zellen konnte die
Antigenpräsentation auch bei konstitutiver Expression des Antigens untersucht werden, da es möglich
war, diese Zellen durch IFNγ-Behandlung innerhalb von 24h zur MHC-II-Synthese zu induzieren.
Da
virale
Proteine
häufig
mit
physiologischen
Prozessen
wie
Proteinbiosynthese
oder
Antigenpräsentation interferieren, wurde in dieser Arbeit von der Verwendung viraler Vektoren zur
Antigenexpression abgesehen (Alcami und Koszinowski, 2000). Initial wurden die Modellantigene in
LCL durch die transiente Transfektion mit konstitutiv aktiven Plasmiden exprimiert. Nachteilig war
hierbei allerdings eine von Experiment zu Experiment schwankende und meist sehr niedrige
Transfektionseffizienz. Zudem war eine Abschaltung der Antigenexpression nicht möglich. Aus
diesem Grund wurde in späteren Versuchen ein induzierbares Vektorsystem verwendet, welches eine
konditionale Antigenexpression erlaubte. Wegen der mit zunehmender Größe der Vektoren
abnehmenden Transfektionseffizienz konnten diese Untersuchungen nicht nach transienter
Transfektion der Zielzellen erfolgen, sondern erforderten die Etablierung stabiler Transfektanten.
Neben den bakteriellen Modellantigenen NeoR und NucNeoR wurden diese Untersuchungen auch mit
dem nukleär lokalisierten viralen Antigen EBNA3C durchgeführt. Da LCL EBNA3C konstitutiv
exprimieren, und EBNA3C an wichtigen physiologischen Prozessen wie z.B. der Immortalisierung
von EBV-infizierten B-Zellen beteiligt ist, sollten die mechanistischen Untersuchungen primär mit
NucNeoR durchgeführt und die Ergebnisse abschließend mit EBNA3C verifiziert werden.
3.
Die nukleäre Variante von NeoR wird über Autophagie präsentiert
Wie bereits von Nimmerjahn (Nimmerjahn, 2001) für NeoR beschrieben, wurde auch die Präsentation
von NucNeoR in LCL1:11-Zellen und RCC1:24-Zellen durch Behandlung mit 3-MA fast vollständig
inhibiert. Diese Ergebnisse wiesen auf eine Beteiligung des autophagischen Abbaus an der
Präsentation nukleärer Antigene hin. Sie sprachen gegen eine Chaperon-vermittelte Aufnahme ins
vesikuläre System über Lamp2A, da Chaperon-vermittelte Autophagie nicht durch 3-MA inhibiert
wird. Durch Transfer von Zellkulturüberstand und Kokulturexperimente wurde ausgeschlossen, dass
signifikante Mengen von NeoR- und NucNeoR-Protein in den Kulturüberstand sezerniert wurden und
somit in den klassischen MHC-II-Präsentationsweg gelangten. Anders als für EBNA2 und EBNA3C
75
IV. Diskussion
von anderen Autoren beschrieben (Taylor et al., 2006) mussten die Antigene NeoR und NucNeoR
somit einen direkten Zugang zu einem endogenen MHC-II-Präsentationsweg haben.
Die Ergebnisse mit den Inhibitoren Leupeptin und Chloroquin zeigten eine verminderte MHC-IIrestringierte Präsentation der Modellantigene NeoR und NucNeoR und wiesen somit auf eine
Beteiligung lysosomaler Proteasen an der NeoR-Präsentation hin. Um auszuschließen, dass die
Inhibitoren zytotoxische Effekte auf die MHC-Reifung oder die Zellen selbst hatten, wurden in
Kontrollexperimenten unspezifische Nebeneffekte der Inhibitoren auf die Antigenpräsentation
ausgeschlossen.
Da Autophagie ausschließlich ein im Zytoplasma stattfindender Mechanismus ist, bei dem Zytosol
und Organellen wie Mitochondrien oder Ribosomen aufgenommen werden, wurden verschiedene
Möglichkeiten untersucht, wie nukleär lokalisierte Antigene in den Autophagie-vermittelten
Präsentationsweg gelangen könnten.
4.
Die endogene Präsentation der nukleären NeoR-Variante (NucNeoR) erfolgte
unabhängig vom aktiven CRM1-vermittelten nukleären Export
Eine Möglichkeit, wie Kernantigene in den zytoplasmatischen Prozess der Autophagie gelangen
konnten, war ein hin und her Wandern des Antigens zwischen Zellkern und Zytoplasma auf der Basis
eines aktiven Shuttle-Mechanismus. Durch eine transiente zytoplasmatische Lokalisation konnte
NucNeoR theoretisch in das vesikuläre Kompartiment und damit in den Autophagie-vermittelten
Präsentationsweg gelangen.
Aktiver nukleärer Export von Proteinen wird durch Transportproteine vermittelt. Das am besten
charakterisierte Kernexportmolekül ist CRM1, das an leucinreiche NES von Proteinen bindet und sie
anschließend aus dem Kern exportiert (Fornerod et al., 1997). CRM1-vermittelter Kernexport wird
durch LMB unterbunden (Kudo et al., 1999). Im NeoR Protein konnten zwar mit den verfügbaren
Vorhersageprogrammen keine Aminosäureabfolgen identifiziert werden, die als Kernexportsignal
fungieren könnten, jedoch sind die verwendeten Algorithmen möglicherweise nicht ausreichend.
Deshalb wurde die mögliche Beteiligung des CRM1-vermittelten Exports von nukleärem NeoR und
EBNA3C an der MHC-II-Präsentation experimentell untersucht. Die stabil transfizierten
Modellzelllinien LCL1:11-NeoR und LCL1:11-NucNeoR zeigten nach Doxycyclin- und LMBBehandlung beide eine geringe Beeinträchtigung der T-Zellstimulation, die auf unspezifische Effekte
des LMB zurückzuführen waren. Die Inhibition des CRM1-vermittelten Kernexports hatte somit
keinen signifikanten Einfluss auf die endogene Präsentation von nukleären Antigenen auf MHC-IIMolekülen. CRM1 ist allerdings nicht das einzige Protein, das den Kernexport von Proteinen
vermittelt. So wurde beispielsweise für den thyroid hormone receptor α (TRα) ein CRM1unabhängiger Export aus dem Zellkern beschrieben. Die daran beteiligten Proteine konnten jedoch bis
jetzt noch nicht näher charakterisiert werden (Bunn et al., 2001; Delong et al., 2004). Somit kann
momentan ein Export von NucNeoR mit Hilfe eines CRM1-unabhängigen aktiven Transportweges
76
IV. Diskussion
nicht ausgeschlossen werden. Bislang sind keine experimentellen Systeme verfügbar, mit dem sich die
alternativen Wege des aktiven Kernexports überprüfen lassen.
Die Tatsache, dass NucNeoR ähnlich effizient auf MHC-II-Molekülen präsentiert wurde wie NeoR,
aber immunfluoreszenzmikroskopisch ausschließlich im Kern nachweisbar war, sprach dafür, dass
entweder der Abbau von zytoplasmatischem NucNeoR nach einem aktiven Kernexport extrem
effizient war, oder dass der aktive Kernexport keine wesentliche Rolle in der endogenen
Antigenpräsentation auf MHC-II-Molekülen spielte.
5.
Die Auflösung der Kernmembran in der Mitose ist keine Voraussetzung für die
endogene Präsentation nukleärer Antigene auf MHC-II-Molekülen
Durch die Auflösung der Kernmembran während der Mitose und der damit verbundenen
Durchmischung von Nukleo- und Zytoplasma könnten Proteine aus dem Zellkern in den Autophagieabhängigen MHC-II-Präsentationsweg gelangen, vorausgesetzt autophagischer Abbau findet in dieser
Phase des Zellzyklus statt. Die mögliche Rolle der Zellteilung an der Präsentation nukleärer Antigene
auf MHC-II-Molekülen wurde im Rahmen dieser Arbeit durch zwei verschiedene Ansätze untersucht,
die Zellzyklusinhibition durch Aphidicolin und die Auftrennung von Zellen nach Zellzyklusphasen
durch Elutriationszentrifugation.
Die Inhibition des Zellzyklus durch den DNA-Synthesehemmer Aphidicolin führte zu einer um etwa
30% verminderten Präsentation der Antigene auf MHC-II-Molekülen. Da diese Inhibition nicht nur
bei den nukleär lokalisierten Antigenen NucNeoR und EBNA3C, sondern ähnlich stark ausgeprägt bei
der zytosolisch und nukleär lokalisierten NeoR-Variante beobachtet wurde, war diese Inhibition der
Antigenpräsentation vermutlich auf unspezifische Nebeneffekte des Inhibitors und nicht auf eine
verminderte Umverteilung von NucNeoR durch die Inhibition der Zellteilung zurückzuführen.
Auch die Auftrennung Doxycyclin-induzierter LCL1:11-NeoR- und -NucNeoR-Zellen nach
Zellzyklusphasen ergab keine Hinweise auf eine Mitose-abhängige Präsentation der nukleären
Antigene. So stimulierten nicht etwa Zellen in der G2/M-Phase, sondern Zellen in der G1/0-Phase die
T-Zellen am stärksten. Diese Ergebnisse wären zwar mit einer Umverteilung der Antigene während
der Mitose und einer erst in der G1/0-Phase einsetzenden Autophagie kompatibel gewesen, es konnten
aber keine zellzyklusabhängigen Unterschiede in der Autophagie-Aktivität festgestellt werden. Die TZellstimulation nahm darüber hinaus von der G1/0- bis hin zur G2/M-Phase kontinuierlich ab, wofür
weder Unterschiede in der Antigenmenge noch zellzyklusabhängige Unterschiede in der MHC-IIOberflächenexpession verantwortlich waren. Zellen in der G2/M-Phase exprimierten sogar mehr
MHC-II-Moleküle auf ihrer Oberfläche als G1/0-Phase Zellen. Durch die exogene Beladung von Zellen
mit Protein konnte zudem eine verminderte Endozytoseaktivität bzw. Antigenprozessierungsrate der
Zellen in der S/G2/M-Phase ausgeschlossen werden. Vielmehr korrelierte die Antigenpräsentation
sowohl nach Protein- und Peptidbeladung als auch nach Transkriptionsstopp mit der MHC-IIOberflächenexpression. Die Tatsache, dass sich die Präsentation von NeoR und NucNeoR auf MHC-
77
IV. Diskussion
II-Molekülen in diesen Experimenten ähnlich verhielt, sprach darüber hinaus gegen eine
entscheidende Rolle der mitotischen Antigenumverteilung bei der Präsentation nukleärer Antigene auf
MHC-II-Molekülen. Nach Elutriation von Wildtyp LCL wurde endogenes EBNA3C am besten von
G2/M-Phase-Zellen auf MHC-II-Molekülen präsentiert. Allerdings sprach der kontinuierliche Anstieg
der T-Zellerkennung bereits in der S-Phase gegen eine wesentliche Rolle der Mitose-assoziierten
Auflösung der Kernmembran. Auch für EBNA3C musste somit ein alternativer Mechanismus der
MHC-II-assoziierten Antigenpräsentation postuliert werden.
6.
Die endogene Präsentation intrazellulärer Antigene auf MHC-II-Molekülen korreliert
wahrscheinlich mit der Antigentranslation
Sowohl für NucNeoR als auch für EBNA3C wurde deshalb mit Hilfe der induzierbaren Vektoren
geprüft, ob die Antigenpräsentation möglicherweise direkt mit der Translationsaktivität gekoppelt ist.
Vorteilhaft war hier die Tatsache, dass das virale Antigen EBNA3C normalerweise auf niedrigem
Niveau in LCL exprimiert wird (Bernasconi et al., 2006). Die Analyse der NeoR mRNA und
Proteinmengen sowie der GFP-Fluoreszenz elutriierter und nachträglich induzierter Zellen legte nahe,
dass G1/0-Phase-Zellen eine höhere Transkriptions- /Translationsaktivität aufwiesen als Zellen in der
S-Phase oder der G2/M-Phase, und deshalb am besten von antigenspezifischen T-Zellen erkannt
wurden.
Ähnliche Ergebnisse wurden auch im Versuch mit EBNA3C erzielt. Nach Doxycyklin-induzierter
Überexpression in den elutriierten Zellen kam es wie bei NeoR-exprimierenden Zellen zur stärksten
Antigenpräsentation in den G1/0-Phase Zellen, was auch für EBNA3C eine transkriptions/translationsabhängige Präsentation über Autophagie nahe legte. Nicht auszuschließen war, dass neben oder
anstelle einer erhöhten translationalen Aktivität eine höhere Stabilität der NeoR-Antigene in der G1/0Phase für die höhere Präsentation verantwortlich war. Diese Möglichkeit muss in zukünftigen
Experimenten mit einem Proteasominhibitor näher untersucht werden.
7.
Eine mögliche Rolle von DRiPs in der endogenen Präsentation von Antigenen auf
MHC-II-Molekülen
Die endogene Präsentation von NeoR und EBNA3C bedarf also keiner Auflösung der Kernmembran,
sie ist nicht von der intrazellulären Lokalisation oder absoluten Antigenmenge abhängig, sondern
korreliert höchstwahrscheinlich ausschließlich mit der Aktivität der Translation.
Eine ähnliche Korrelation von Translationsaktivität mit der Antigenpräsentation wurde in den letzten
Jahren von der Arbeitsgruppe um J. Yewdell für MHC-I-restringierte Antigene beschrieben. In pulsechase Experimenten mit radioaktiv markiertem
Proteasominhibitoren
(MG132
und
35
Lactacystin)
S-Methionin in An- oder Abwesenheit von
beobachteten
sie,
dass
etwa
30%
der
neusynthetisierten Proteine innerhalb von 10min durch das Proteasom wieder abgebaut wurden. Als
Ursache für diese Instabilität eines großen Anteils der translatierten Genprodukte wurden
78
IV. Diskussion
Translationsfehler, eine fehlerhafte post-translationale Modifikation oder eine falsche Faltung
postuliert und die fehlerhaften Translationsprodukte als defective ribosomal products (DRiPs)
bezeichnet.
Dass DRiPs die wichtigste Quelle für MHC-I-assoziierte Peptide darstellen könnten, wurde durch
zwei unabhängige Untersuchungen impliziert, in denen jeweils die Auswirkungen einer kurzzeitigen
Inhibition der Proteinsynthese auf die Antigenpräsentation untersucht wurden. Eine Behandlung mit
dem Translationsinhibitor Cycloheximid resultierte einerseits in einem verlangsamten Export
neusynthetisierter MHC-I-Moleküle aus dem ER ins Trans-Golgi-Netzwerk, was wahrscheinlich auf
die fehlende Beladung mit Peptiden zurückzuführen war (Schubert et al., 2000). Andererseits führte
sie zu einer reduzierten TAP-Mobilität in der ER-Membran, welche als Maß für den Peptidtransfer aus
dem Zytoplasma ins ER gilt (Reits et al., 2000).
Ein Zusammenhang zwischen der Faltung nasziernder Polypeptide und der Präsentation von
Spaltprodukten auf MHC-I-Molekülen wurde kürzlich auch am Beispiel des tumorassoziierten
Melanom-Antigens
Tyrosinase
hergestellt.
Die
Translation
dieses
Glykoproteins
erfolgt
normalerweise ins ER, falschgefaltete oder fehlerhaft glykosylierte Proteine werden allerdings aus
dem ER ins Zytoplasma transloziert, durch das Proteasom zu Peptiden abgebaut und diese
anschließend TAP-abhängig auf MHC-I-Molekülen präsentiert (Negroiu et al., 2000; Toyofuku et al.,
2001). Bei der Faltung der Tyrosinase fungieren die natürlichen Substrate L-Dopamin und L-Tyrosin
als chemische Chaperone (Halaban et al., 2001). Nach Zugabe dieser Chaperone zu Melanomzellen
beobachteten Engelhard und Mitarbeiter eine bis zu 40% schlechtere MHC-I-restringierte TZellerkennung, die mit einem verminderten Abbau der Tyrosinase durch das Proteasom korrelierte
(Ostankovitch et al., 2005). Diese Versuche zeigten, dass fehlerhaft gefaltete Proteine eine bedeutende
Quelle für MHC-I-Peptide darstellen können.
Eine Untergruppe der DRiPs scheinen kryptische Translationsprodukte darzustellen, die von 5’ oder 3’
„untranslatierten“ Regionen (UTR) der RNA oder anderen alternativen offenen Leserahmen kodiert
werden. Seit ihrer Entdeckung im Rahmen der Tumorantigensuche wächst die Liste an Beispielen
stetig an (Boon et al., 1989; Malarkannan et al., 1995). Besonders in virusinfizierten und
transformierten Zellen wurden viele kryptische Translationsprodukte detektiert. Aber auch nichttransformierte Zellen exprimieren kryptische Translationsprodukte und präsentieren deren
Spaltprodukte auf MHC-I-Molekülen. Peptide kryptischer Genprodukte wurden als Zielstrukturen von
CD8+ T-Zellen identifiziert, die Tumorzellen oder virusinfizierte Zellen erkennen. Aus diesem Grund
wird diesen Proteinen eine hohe immunologische Relevanz beigemessen (Schwab et al., 2003). Wie
diese kryptischen Translationsprodukte generiert werden, ist bis heute noch weitgehend unverstanden.
Manchen der kryptischen Leserahmen fehlt ein konventionelles AUG-Startcodon. In diesen Fällen
beginnt die Translation wahrscheinlich an alternativen Startcodons wie CUG, das in Methionin oder
Leucin translatiert wird (Hann et al., 1988; Peabody et al., 1989; Schwab et al., 2004). Während der
Methionin-Translationsstart vom eukaryonten Translations-Initiationsfaktor 2α (eIF2α) abhängig ist,
79
IV. Diskussion
führt die Inhibition dieses Faktors zu einer Verstärkung der Leucin-initiierten Translation (Schwab et
al., 2004). Der Leucin-Translationsstart wird durch stromaufwärts gelegene CUG-, nicht aber durch
AUG-Codons beeinträchtigt, was als Hinweis auf funktionell unterschiedliche Ribosomen angesehen
wird (Schwab et al., 2004; Shastri et al., 2005; Shastri, 2006).
Interessanterweise kann die Bildung von DRiPs durch Virusinfektionen induziert werden. So konnten
Yewdell und Mitarbeiter kürzlich zeigen, dass die Transduktion mit Semliki Forest Virus (SFV)Vektoren zu einer Phosphorylierung des eIF2α, darüber zu einer vermehrten Mistranslation der
inserierten Gene von stromabwärts gelegenen Methionin-Startcodons und somit zu einem erhöhten
Anteil von DRiPs führte (Berglund et al., 2007). Außerdem zeigte diese Arbeit, dass es durch eine
SFV-Infektion zu einer stark verminderten Phosphorylierung des eIF-4E und der ribosomalen
Untereinheit S6 kommt, was wiederum zu einer verminderten Translation von wirtspezifischen
mRNAs und zur allgemeinen Translationsinhibition führt (Montgomery et al.; 2006). Wie oben bereits
eingeführt (Abb. 7) kann durch eine verminderte S6-Phosphorylierung auch Autophagie induziert
werden, was beide Mechanismen möglicherweise untereinander verknüpft.
8.
Das Modell der Immunribosomen
Die Kopplung der Antigenpräsentation an die Proteinsynthese erscheint besonders im Kontext von
Virusinfektionen einleuchtend, denn dadurch können virusinfizierte Zellen schnell erkannt werden.
Untermauert wird die enge Kopplung dieser Prozesse durch Ergebnisse, die bei der Quantifizierung
von Proteinsynthese, -degradation und Antigenpräsentation von Yewdell und Mitarbeitern erzielt
wurden (Princiotta et al., 2003). Berechnungen in dieser Arbeitsgruppe zeigten, dass pro Zelle in einer
Minute etwa 3x106 Proteine mit einer mittleren Länge von 450 AS synthetisiert werden, aber nur etwa
100 MHC-I-Moleküle für eine Beladung mit Peptiden zu Verfügung stehen. Unter der Annahme, dass
nur 1% aller neu translatierten Proteine als Quelle für MHC-I-Peptide fungiert, würden ca. 1,5x106
Nonamere gebildet von denen wiederum nur etwa 1% (1,5x104) Sequenzmotive besitzen, die eine
Bindung an MHC-I-Molekülen erlauben. Somit stünden ca. 150 Liganden für jedes MHC-I-Molekül
zur Verfügung (Yewdell und Bennink, 1999). Folglich würde eine effiziente Antigenpräsentation
bereits durch Degradation von lediglich 1% der Translationsprodukte gewährleistet. Diese Aufgabe
könnte von spezialisierten Immunribosomen übernommen werden, die wohlmöglich eng mit den
Proteasomen verknüpft sind und so eine schnelle und effiziente Degradation der gebildeten DRiPs und
eine effiziente Beladung von MHC-I-Molekülen ermöglichen. Bislang gibt es jedoch für die Existenz
dieser Immunribosomen noch keine gesicherten Evidenzen (Yewdell und Nicchitta, 2006; Yewdell,
2007).
Ungeklärt ist auch, wie kryptische Translationsprodukte von alternativen offenen Leserahmen mit der
überwältigenden Menge an DRiPs von Standardleserahmen um die wenigen verfügbaren MHCMoleküle konkurrieren. Entweder ist die Rate an DRiPs von Standardberechnungen viel niedriger als
80
IV. Diskussion
angenommen, oder die Immunribosomen können Translationsprodukte von alternativen Leserahmen
speziell erkennen.
Eine weitere Quelle von DRiPs für die Immunribosomen könnten Translationsprodukte von
Pseudogenen darstellen. Es gibt inzwischen erste Hinweise darauf, dass prozessierte Pseudogene
Tumorantigene kodieren können (Moreau-Aubry et al., 2000). Transkripte von Pseudogenen sind
wahrscheinlich sehr viel seltener als Transkripte von regulären Genen und haben oftmals eine kurze
Halbwertszeit (Holbrook et al., 2006). Sie werden in der Regel schnell über nonsense-mediated decay
(NMD) abgebaut. NMD erfolgt wahrscheinlich während der ersten (pioneer) Translation der noch
„jungfräulichen“ Transkripte. Diese unterscheiden sich von älteren Transkripten durch ihre
Assoziation mit diversen Proteinen wie z.B. dem exon-junction complex (EJC) (Chang et al., 2007).
Man könnte generell spekulieren, dass Immunribosomen bevorzugt pioneer-Transkripte translatieren.
Dadurch würde eine relativ effiziente Einschleusung von Produkten kryptischer Gene oder alternativer
Leserahmen neben den klassischen DRiPs von regulären offenen Leserahmen gewährleistet, und
zusätzliche Faktoren wie z.B. mRNA-Stabilität oder Menge der Translationsprodukte pro mRNA
hätten keinen Einfluss.
9.
DRiPs und die endogene Antigenpräsentation auf MHC-II-Molekülen
Auch wenn die mechanistischen Grundlagen noch weitgehend ungeklärt sind, so gelten DRiPs derzeit
als die möglicherweise wichtigste Quelle für Peptide, die auf MHC-I-Molekülen präsentiert werden.
Die translationsabhängige Präsentation von NeoR und EBNA3C impliziert, dass neusynthetisierte
Proteine auch eine wichtige Quelle für Antigene auf MHC-II-Molekülen darstellen könnten.
Um die mögliche Bedeutung von DRiPs für die NeoR-Präsentation näher zu untersuchen, wurde in
späteren, eigenen Untersuchungen die Bildung von DRiPs durch das Arginin-Analogon Canavanin
induziert, welche nach Einbau anstelle von Arginin eine fehlerhafte Proteinfaltung auslöst. Sollten
DRiPs eine wichtige Quelle für das NeoR-Antigen darstellen, sollte es unter Canavanin-Behandlung
zu einem Anstieg in der T-Zellstimulation kommen, wie für MHC-I-restringierte Antigene
beschrieben (Qian et al. 2006). Dies war nicht der Fall (Daten nicht gezeigt), allerdings sprach unsere
Beobachtung aus zwei verschiedenen Gründen nicht notwendigerweise gegen eine Beteiligung der
DRiPs an der endogenen Antigenpräsentation auf MHC-II-Molekülen. Erstens könnte der Einbau von
Canavanin die Funktion wichtiger, an der Antigenpräsentation beteiligter Moleküle beeinträchtigen
und so einen positiven Effekt auf die Antigenpräsentation maskieren. Zweitens enthält das NeoREpitop an Position zwei und elf ein Arginin. Werden diese durch Canavanin ersetzt, so könnte dies die
Bindung des Peptids an das MHC-II-Molekül bzw. die Erkennung des Peptids durch den TZellrezeptor des NeoR-spezifischen T-Zellklons 20-4/A4 beeinträchtigen (Hemmer et al., 2000). In
zukünftigen Experimenten sollten deshalb MHC-II-restringierte Epitope untersucht werden, die kein
Arginin enthalten.
81
IV. Diskussion
Für eine mögliche Rolle von DRiPs sprachen die Versuche der eigenen Arbeitsgruppe mit ProteasomInhibitoren. Ähnlich wie bei Nimmerjahn und Kollegen kam es auch in den eigenen Untersuchungen
nach Inhibition des Proteasoms mit MG132 zu einer verstärkten Präsentation des NeoR-Antigens.
Dies wurde zunächst damit erklärt, dass das normalerweise über das Proteasom abgebaute
zytosolische Antigen nach MG132-Behandlung im Zytoplasma akkumulierte und dann verstärkt in
den Autophagie-vermittelten MHC-II-Präsentationsweg gelangte. Dieser Hypothese entsprechend
müsste die Menge an NucNeoR-Protein unter MG132-Behandlung unbeeinflusst bleiben, weil es im
Zellkern vor dem proteasomalen Abbau geschützt wäre und somit auch nicht verstärkt auf MHC-IIMolekülen präsentiert wird. In den Experimenten führte eine MG132-Behandlung jedoch zu einer
verstärkten Antigenpräsentation von NucNeoR (Daten nicht gezeigt). Diese jüngsten Ergebnisse
wiesen zum einen darauf hin, dass instabile und mit AK nicht detektierbare, zytoplasmatische
Translationsprodukte eine bedeutende Quelle für MHC-II-assoziierte Peptide darstellen. Zum anderen
deutete dies darauf hin, dass DRiPs sowohl durch Autophagie als auch durch das Proteasom abgebaut
werden und somit in den MHC-I- und MHC-II-Präsentationsweg einmünden können.
Diese Ergebnisse werfen die Frage auf, welchen Beitrag stabile native Proteine zur
Antigenpräsentation leisten bzw. ob Peptide, die auf MHC-II-Molekülen präsentiert werden,
überhaupt von stabilen nativen Genprodukten abstammen. Für MHC-I-restringierte Antigene wurde
kürzlich gezeigt, dass die Präsentation von der spezifischen Translationsaktivität abhängt und nicht
von der Antigenmenge im Zytoplasma (Donohue et al., 2006). Die vergleichenden Ergebnisse mit
NeoR und NucNeoR könnten darauf hindeuten, dass die Menge an stabilem Protein auch zur
Antigenpräsentation auf MHC-II-Molekülen kaum beiträgt, da sonst für NeoR eine deutlich bessere
Erkennung zu erwarten gewesen wäre. Um diese Hypothese zu überprüfen, wären folgende
Experimente vorzuschlagen. Zum einen sollte die Transkription des NeoR-Gens und somit die Bildung
neuer DRiPs nach Expression des NeoR-Proteins durch Auswaschen des Doxycyclins abgeschaltet
und die NeoR-spezifische T-Zellerkennung im Vergleich zu Protein-gepulsten Zellen zu
verschiedenen nachfolgenden Zeitpunkten untersucht werden. Eine vergleichsweise verzögerte
Abnahme in der T-Zellerkennung nach Doxycyclin-Entzug würde auf eine Beteiligung von stabilem,
nativen Protein an der endogenen Antigenpräsentation hinweisen. Außerdem wäre es interessant,
NeoR
durch
Anfügen
von
entsprechenden
Lokalisationssignalen
in
weitere
subzelluläre
Kompartimente wie z.B. in Mitochondrien oder ins ER zu dirigieren. Eine ähnlich effiziente
Präsentation von NeoR aus Kompartimenten mit oder ohne direkten Zugang zur Autophagie würde
gegen eine bedeutende Rolle von stabilen, nativen Proteinen in der Antigenpräsentation sprechen.
Diese Experimente könnten darüber hinaus eventuell die Frage klären, ob Proteine aller subzellulären
Kompartimente einer Immunüberwachung unterliegen.
82
IV. Diskussion
10.
Möglichkeit einer Assoziation von Proteinsynthese und Autophagie
Wie ein Teil der neusynthetisierten Proteine effizient in den Autophagie-abhängigen Präsentationsweg
gelangt, ist momentan unklar. Das Modell der Immunribosomen impliziert eine enge räumliche oder
funktionelle Nähe zwischen Proteinsynthese und -abbau. Eine Möglichkeit wäre die Aufnahme von
Immunribosomen zusammen mit den wachsenden Polypeptidketten in die Autophagosomen. Diese
könnten dann mit dem endosomal/lysosomalen Kompartiment verschmelzen und Abbauprodukte auf
MHC-II-Moleküle geladen werden. Dieser Weg wäre sehr selektiv und effizient, da nur wenige
Immunribosomenkomplexe aufgenommen werden müssten, um eine effektive Präsentation zu
gewährleisten. Zwar wurden Ribosomen in Autophagosomen nachgewiesen, dennoch scheint dieser
Präsentationsweg aus drei Gründen eher unwahrscheinlich. Erstens wäre bei diesem Modell zu
erwarten, dass viele ribosomale Antigene auf MHC-II-Molekülen präsentiert werden, was aber in den
bisherigen MHC-II-Peptid-Elutions- und Identifikationsanalysen nicht beobachtet wurde. Zweitens
kann dieses Modell nicht die verstärkte NeoR-Antigenpräsentation auf MHC-II-Molekülen nach
Inhibition des Proteasoms erklären. Drittens haben Autophagosomen einen Durchmesser von nur
ungefähr 0,4µm und können somit jeweils nur etwa 0,01% des zytosolischen Volumens einer Zelle
aufnehmen (Menendez-Benito und Neefjes, 2007). Das bedeutet, dass eine entsprechend große Anzahl
an Autophagosomen pro Zelle vorliegen oder die Antigene selektiv in die Autophagosomen dirigiert
werden müssen, um eine effiziente Präsentation zu gewährleisten. Bisher sind aber unter normalen
Kuturbedingungen weder entsprechend viele Autophagosomen beobachtet worden, noch wurden im
Rahmen der Autophagie in vivo relevante Signalsequenzen für die Aufnahme von Proteinen in
Autophagosomen beschrieben (Schmid et al., 2007). Für die beobachtete effiziente Präsentation von
NeoR
und
EBNA3C
scheint
vielmehr
eine räumliche
Nähe
von
Proteinsynthese
und
Autophagosomenbildung unabdingbar.
11.
Ausblick
Die in dieser Arbeit aufgezeigte Korrelation von Translation und Autophagie-vermittelter
Antigenpräsentation und die damit verbundene Ausdehnung des Antigenspektrums auf Antigene des
Zellkerns und womöglich weiterer subzellulärer Kompartimente, lieferten wichtige neue Hinweise auf
eine bedeutende Rolle des endogenen Antigenpräsentationswegs auf MHC-II-Molekülen in der
antigenspezifischen Immunabwehr.
Ob es sich bei der postulierten Assoziation von Translation und Antigenpräsentation um den gleichen
Abbauweg handelt, durch den langlebige Proteine und Zellorganellen degradiert werden, oder um eine
spezielle Form der Autophagie, ist noch unbekannt. Obwohl sowohl die klassische Makroautophagie
als auch die Autophagie-abhängige Antigenpräsentation durch 3-MA inhibiert werden, könnte es sich
um distinkte und unterschiedlich regulierte Prozesse handeln. Autophagie beschreibt den Abbau
zytoplasmatischen Materials in Lysosomen, der auf unterschiedlichen Wegen erfolgen kann, in
83
IV. Diskussion
verschiedenen Geweben durch unterschiedliche Signalwege reguliert wird und diverse Aufgaben
erfüllt.
Die Aufklärung der Autophagie-vermittelten Antigenpräsentationswege sollte nicht nur Rückschlüsse
auf deren Bedeutung im Rahmen antigenspezifischer Immunantworten erlauben, sondern auch die
Möglichkeit der Modulation dieser Prozesse im Sinne einer verbesserten Erkennung durch CD4+ TZellen eröffnen.
84
V. Literaturverzeichnis
V.
Literaturverzeichnis
Ackerman, A.L., and P. Cresswell. (2004). Cellular mechanisms governing cross-presentation of
exogenous antigens. Nat Immunol 5:678-684.
Aderem, A., and D.M. Underhill. (1999). Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annu Rev
Immunol 17:593-623.
Adhikary, D., U. Behrends, A. Moosmann, K. Witter, G.W. Bornkamm, and J. Mautner. (2006).
Control of Epstein-Barr virus infection in vitro by T helper cells specific for virion
glycoproteins. J Exp Med 203:995-1006.
Afzali, B., G. Lombardi, R.I. Lechler, and G.M. Lord. (2007). The role of T helper 17 (Th17) and
regulatory T cells (Treg) in human organ transplantation and autoimmune disease. Clin Exp
Immunol 148:32-46.
Aita, V.M., X.H. Liang, V.V. Murty, D.L. Pincus, W. Yu, E. Cayanis, S. Kalachikov, T.C. Gilliam,
and B. Levine. (1999). Cloning and genomic organization of beclin 1, a candidate tumor
suppressor gene on chromosome 17q21. Genomics 59:59-65.
Albert, M.L., B. Sauter, and N. Bhardwaj. (1998). Dendritic cells acquire antigen from apoptotic cells
and induce class I-restricted CTLs. Nature 392:86-89.
Albiger, B., S. Dahlberg, B. Henriques-Normark, and S. Normark. (2007). Role of the innate immune
system in host defence against bacterial infections: focus on the Toll-like receptors. J Intern
Med 261:511-528.
Alcami, A., and U.H. Koszinowski. (2000). Viral mechanisms of immune evasion. Immunol Today
21:447-455.
Anderson, R.G. (1998). The caveolae membrane system. Annu Rev Biochem 67:199-225.
Appay, V. (2004). The physiological role of cytotoxic CD4(+) T-cells: the holy grail? Clin Exp
Immunol 138:10-13.
Ashford, T.P., and K.R. Porter. (1962). Cytoplasmic components in hepatic cell lysosomes. J Cell Biol
12:198-202.
Askjaer, P., T.H. Jensen, J. Nilsson, L. Englmeier, and J. Kjems. (1998). The specificity of the CRM1Rev nuclear export signal interaction is mediated by RanGTP. J Biol Chem 273:33414-33422.
Bakke, O., and T.W. Nordeng. (1999). Intracellular traffic to compartments for MHC class II peptide
loading: signals for endosomal and polarized sorting. Immunol Rev 172:171-187.
Berg, T.O., M. Fengsrud, P.E. Stromhaug, T. Berg, and P.O. Seglen. (1998). Isolation and
characterization of rat liver amphisomes. Evidence for fusion of autophagosomes with both
early and late endosomes. J Biol Chem 273:21883-21892.
Berglund, P., D. Finzi, J.R. Bennink, and J.W. Yewdell. (2007). Viral alteration of cellular
translational machinery increases defective ribosomal products. J Virol 81:7220-7229.
Bernasconi, M., C. Berger, J.A. Sigrist, A. Bonanomi, J. Sobek, F.K. Niggli, and D. Nadal. (2006).
Quantitative profiling of housekeeping and Epstein-Barr virus gene transcription in Burkitt
lymphoma cell lines using an oligonucleotide microarray. Virol J 3:43.
85
V. Literaturverzeichnis
Beugnet, A., X. Wang, and C.G. Proud. (2003). Target of rapamycin (TOR)-signaling and RAIP
motifs play distinct roles in the mammalian TOR-dependent phosphorylation of initiation
factor 4E-binding protein 1. J Biol Chem 278:40717-40722.
Bevan, M.J. (1976). Minor H antigens introduced on H-2 different stimulating cells cross-react at the
cytotoxic T cell level during in vivo priming. J Immunol 117:2233-2238.
Bevan, M.J. (2006). Cross-priming. Nat Immunol 7:363-365.
Blommaart, E.F., U. Krause, J.P. Schellens, H. Vreeling-Sindelarova, and A.J. Meijer. (1997). The
phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors wortmannin and LY294002 inhibit autophagy in
isolated rat hepatocytes. Eur J Biochem 243:240-246.
Bodmer, H., S. Viville, C. Benoist, and D. Mathis. (1994). Diversity of endogenous epitopes bound to
MHC class II molecules limited by invariant chain. Science 263:1284-1286.
Boon, T., and A. Van Pel. (1989). T cell-recognized antigenic peptides derived from the cellular
genome are not protein degradation products but can be generated directly by transcription
and translation of short subgenic regions. A hypothesis. Immunogenetics 29:75-79.
Braciale, T.J., L.A. Morrison, M.T. Sweetser, J. Sambrook, M.J. Gething, and V.L. Braciale. (1987).
Antigen presentation pathways to class I and class II MHC-restricted T lymphocytes. Immunol
Rev 98:95-114.
Bunn, C.F., J.A. Neidig, K.E. Freidinger, T.A. Stankiewicz, B.S. Weaver, J. McGrew, and L.A.
Allison. (2001). Nucleocytoplasmic shuttling of the thyroid hormone receptor alpha. Mol
Endocrinol 15:512-533.
Busch, R., R.C. Doebele, N.S. Patil, A. Pashine, and E.D. Mellins. (2000). Accessory molecules for
MHC class II peptide loading. Curr Opin Immunol 12:99-106.
Busch, R., C.H. Rinderknecht, S. Roh, A.W. Lee, J.J. Harding, T. Burster, T.M. Hornell, and E.D.
Mellins. (2005). Achieving stability through editing and chaperoning: regulation of MHC
class II peptide binding and expression. Immunol Rev 207:242-260.
Carroll, M.C., and A.P. Prodeus. (1998). Linkages of innate and adaptive immunity. Curr Opin
Immunol 10:36-40.
Castellino, F., and R.N. Germain. (1995). Extensive trafficking of MHC class II-invariant chain
complexes in the endocytic pathway and appearance of peptide-loaded class II in multiple
compartments. Immunity 2:73-88.
Castellino, F., F. Zappacosta, J.E. Coligan, and R.N. Germain. (1998). Large protein fragments as
substrates for endocytic antigen capture by MHC class II molecules. J Immunol 161:40484057.
Chang, Y.F., J.S. Imam, and M.F. Wilkinson. (2007). The nonsense-mediated decay RNA surveillance
pathway. Annu Rev Biochem 76:51-74.
Chen, B.P., A. Madrigal, and P. Parham. (1990). Cytotoxic T cell recognition of an endogenous class I
HLA peptide presented by a class II HLA molecule. J Exp Med 172:779-788.
Chicz, R.M., R.G. Urban, W.S. Lane, J.C. Gorga, L.J. Stern, D.A. Vignali, and J.L. Strominger.
(1992). Predominant naturally processed peptides bound to HLA-DR1 are derived from MHCrelated molecules and are heterogeneous in size. Nature 358:764-768.
86
V. Literaturverzeichnis
Cresswell, P. (1996). Invariant chain structure and MHC class II function. Cell 84:505-507.
Codogno, P., and A.J. Meijer. (2005). Autophagy and signaling: their role in cell survival and cell
death. Cell Death Differ 12 Suppl 2:1509-1518.
Conner, S.D., and S.L. Schmid. (2003). Regulated portals of entry into the cell. Nature 422:37-44.
Corradetti, M.N., K. Inoki, N. Bardeesy, R.A. DePinho, and K.L. Guan. (2004). Regulation of the TSC
pathway by LKB1: evidence of a molecular link between tuberous sclerosis complex and
Peutz-Jeghers syndrome. Genes Dev 18:1533-1538.
Corradetti, M.N., and K.L. Guan. (2006). Upstream of the mammalian target of rapamycin: do all
roads pass through mTOR? Oncogene 25:6347-6360.
Cuervo, A.M. (2004). Autophagy: many paths to the same end. Mol Cell Biochem 263:55-72.
Cuervo, A.M., and J.F. Dice. (1996). A receptor for the selective uptake and degradation of proteins
by lysosomes. Science 273:501-503.
Delmas, S., L. Martin, M. Baron, J.A. Nelson, D.N. Streblow, and J.L. Davignon. (2005).
Optimization of CD4+ T lymphocyte response to human cytomegalovirus nuclear IE1 protein
through modifications of both size and cellular localization. J Immunol 175:6812-6819.
DeLong, L.J., G.M. Bonamy, E.N. Fink, and L.A. Allison. (2004). Nuclear export of the oncoprotein
v-ErbA is mediated by acquisition of a viral nuclear export sequence. J Biol Chem 279:1535615367.
Del Prete, G. (1998). The concept of type-1 and type-2 helper T cells and their cytokines in humans.
Int Rev Immunol 16:427-455.
Deng, H., R. Apple, M. Clare-Salzler, S. Trembleau, D. Mathis, L. Adorini, and E. Sercarz. (1993).
Determinant capture as a possible mechanism of protection afforded by major
histocompatibility complex class II molecules in autoimmune disease. J Exp Med 178:16751680.
Dengjel, J., O. Schoor, R. Fischer, M. Reich, M. Kraus, M. Muller, K. Kreymborg, F. Altenberend, J.
Brandenburg, H. Kalbacher, R. Brock, C. Driessen, H.G. Rammensee, and S. Stevanovic.
(2005). Autophagy promotes MHC class II presentation of peptides from intracellular source
proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 102:7922-7927.
Diederichsen, A.C., A.C. Stenholm, O. Kronborg, C. Fenger, J.C. Jensenius, J. Zeuthen, P.B.
Christensen, and T. Kristensen. (1998). Flow cytometric investigation of immune-responserelated surface molecules on human colorectal cancers. Int J Cancer 79:283-287.
Donohue, K.B., J.M. Grant, E.F. Tewalt, D.C. Palmer, M.R. Theoret, N.P. Restifo, and C.C. Norbury.
(2006). Cross-priming utilizes antigen not available to the direct presentation pathway.
Immunology 119:63-73.
Dorfel, D., S. Appel, F. Grunebach, M.M. Weck, M.R. Muller, A. Heine, and P. Brossart. (2005).
Processing and presentation of HLA class I and II epitopes by dendritic cells after transfection
with in vitro-transcribed MUC1 RNA. Blood 105:3199-3205.
Dunn, W.A., Jr. (1990). Studies on the mechanisms of autophagy: formation of the autophagic
vacuole. J Cell Biol 110:1923-1933.
87
V. Literaturverzeichnis
Dunn, W.A., Jr. (1990). Studies on the mechanisms of autophagy: maturation of the autophagic
vacuole. J Cell Biol 110:1935-1945.
Edinger, A.L., and C.B. Thompson. (2003). Defective autophagy leads to cancer. Cancer Cell 4:422424.
Fingar, D.C., S. Salama, C. Tsou, E. Harlow, and J. Blenis. (2002). Mammalian cell size is controlled
by mTOR and its downstream targets S6K1 and 4EBP1/eIF4E. Genes Dev 16:1472-1487.
Fingar, D.C., C.J. Richardson, A.R. Tee, L. Cheatham, C. Tsou, and J. Blenis. (2004). mTOR controls
cell cycle progression through its cell growth effectors S6K1 and 4E-BP1/eukaryotic
translation initiation factor 4E. Mol Cell Biol 24:200-216.
Fingar, D.C., and J. Blenis. (2004). Target of rapamycin (TOR): an integrator of nutrient and growth
factor signals and coordinator of cell growth and cell cycle progression. Oncogene 23:31513171.
Fornerod, M., M. Ohno, M. Yoshida, and I.W. Mattaj. (1997). CRM1 is an export receptor for leucinerich nuclear export signals. Cell 90:1051-1060.
Geenen, V., and P.J. Lefebvre. (1998). The intrathymic expression of insulin-related genes:
implications for pathophysiology and prevention of Type 1 diabetes. Diabetes Metab Rev
14:95-103.
Gordon, P.B., and P.O. Seglen. (1988). Prelysosomal convergence of autophagic and endocytic
pathways. Biochem Biophys Res Commun 151:40-47.
Gozuacik, D., and A. Kimchi. (2004). Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism.
Oncogene 23:2891-2906.
Gutierrez, M.G., S.S. Master, S.B. Singh, G.A. Taylor, M.I. Colombo, and V. Deretic. (2004).
Autophagy is a defense mechanism inhibiting BCG and Mycobacterium tuberculosis survival
in infected macrophages. Cell 119:753-766.
Halaban, R., E. Cheng, S. Svedine, R. Aron, and D.N. Hebert. (2001). Proper folding and endoplasmic
reticulum to golgi transport of tyrosinase are induced by its substrates, DOPA and tyrosine. J
Biol Chem 276:11933-11938.
Hamamoto, T., H. Seto, and T. Beppu. (1983). Leptomycins A and B, new antifungal antibiotics. II.
Structure elucidation. J Antibiot (Tokyo) 36:646-650.
Hann, S.R., M.W. King, D.L. Bentley, C.W. Anderson, and R.N. Eisenman. (1988). A non-AUG
translational initiation in c-myc exon 1 generates an N-terminally distinct protein whose
synthesis is disrupted in Burkitt's lymphomas. Cell 52:185-195.
Hay, N., and N. Sonenberg. (2004). Upstream and downstream of mTOR. Genes Dev 18:1926-1945.
Heath, W.R., and F.R. Carbone. (2001). Cross-presentation in viral immunity and self-tolerance. Nat
Rev Immunol 1:126-134.
Heemels, M.T., and H. Ploegh. (1995). Generation, translocation, and presentation of MHC class Irestricted peptides. Annu Rev Biochem 64:463-491.
Heller, K.N., C. Gurer, and C. Munz. (2006). Virus-specific CD4+ T cells: ready for direct attack. J
Exp Med 203:805-808.
88
V. Literaturverzeichnis
Hemmer, B., M. Jacobsen, and N. Sommer. (2000). Degeneracy in T-cell antigen recognition implications for the pathogenesis of autoimmune diseases. J Neuroimmunol 107:148-153.
Hilders, C.G., J.G. Houbiers, H.H. van Ravenswaay Claasen, R.W. Veldhuizen, and G.J. Fleuren.
(1993). Association between HLA-expression and infiltration of immune cells in cervical
carcinoma. Lab Invest 69:651-659.
Holbrook, J.A., G. Neu-Yilik, N.H. Gehring, A.E. Kulozik, and M.W. Hentze. (2006).
Internal ribosome entry sequence-mediated translation initiation triggers nonsensemediated decay. EMBO Rep 7:722-726.
Hunt, D.F., H. Michel, T.A. Dickinson, J. Shabanowitz, A.L. Cox, K. Sakaguchi, E. Appella, H.M.
Grey, and A. Sette. (1992). Peptides presented to the immune system by the murine class II
major histocompatibility complex molecule I-Ad. Science 256:1817-1820.
Inoki, K., T. Zhu, and K.L. Guan. (2003). TSC2 mediates cellular energy response to control cell
growth and survival. Cell 115:577-590.
Jackson, P.A., M.A. Green, C.G. Marks, R.J. King, R. Hubbard, and M.G. Cook. (1996). Lymphocyte
subset infiltration patterns and HLA antigen status in colorectal carcinomas and adenomas.
Gut 38:85-89.
Jacobson, S., R.P. Sekaly, C.L. Jacobson, H.F. McFarland, and E.O. Long. (1989). HLA class IIrestricted presentation of cytoplasmic measles virus antigens to cytotoxic T cells. J Virol
63:1756-1762.
Janeway, C.A., Jr., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. (2005). Immunobiology. GS Garland
Science Publishing, New York, USA
Kabeya, Y., N. Mizushima, T. Ueno, A. Yamamoto, T. Kirisako, T. Noda, E. Kominami, Y. Ohsumi,
and T. Yoshimori. (2000). LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in
autophagosome membranes after processing. Embo J 19:5720-5728.
Kihara, T., S. Shimohama, H. Sawada, K. Honda, T. Nakamizo, H. Shibasaki, T. Kume, and A.
Akaike. (2001). alpha 7 nicotinic receptor transduces signals to phosphatidylinositol 3-kinase
to block A beta-amyloid-induced neurotoxicity. J Biol Chem 276:13541-13546.
Kim, J., and D.J. Klionsky. (2000). Autophagy, cytoplasm-to-vacuole targeting pathway, and
pexophagy in yeast and mammalian cells. Annu Rev Biochem 69:303-342.
Klein, L., and B. Kyewski. (2000). Self-antigen presentation by thymic stromal cells: a subtle division
of labor. Curr Opin Immunol 12:179-186.
Koopmann, J.O., J. Albring, E. Huter, N. Bulbuc, P. Spee, J. Neefjes, G.J. Hammerling, and F.
Momburg. (2000). Export of antigenic peptides from the endoplasmic reticulum intersects
with retrograde protein translocation through the Sec61p channel. Immunity 13:117-127.
Kudo, N., N. Matsumori, H. Taoka, D. Fujiwara, E.P. Schreiner, B. Wolff, M. Yoshida, and S.
Horinouchi. (1999). Leptomycin B inactivates CRM1/exportin 1 by covalent modification at a
cysteine residue in the central conserved region. Proc Natl Acad Sci U S A 96:9112-9117.
Landais, E., X. Saulquin, M. Bonneville, and E. Houssaint. (2005). Long-term MHC class II
presentation of the EBV lytic protein BHRF1 by EBV latently infected b cells following
capture of BHRF1 antigen. J Immunol 175:7939-7946.
89
V. Literaturverzeichnis
Lanzavecchia, A., and F. Sallusto. (2007). Toll-like receptors and innate immunity in B-cell activation
and antibody responses. Curr Opin Immunol 19:268-274.
Lazzaro, B., A.E. Anderson, A. Kajdacsy-Balla, and M.J. Hessner. (2001). Antigenic characterization
of medullary carcinoma of the breast: HLA-DR expression in lymph node positive cases. Appl
Immunohistochem Mol Morphol 9:234-241.
Lechler, R., G. Aichinger, and L. Lightstone. (1996). The endogenous pathway of MHC class II
antigen presentation. Immunol Rev 151:51-79.
Lee, H.K., J.M. Lund, B. Ramanathan, N. Mizushima, and A. Iwasaki. (2007). Autophagy-dependent
viral recognition by plasmacytoid dendritic cells. Science 315:1398-1401.
Levine, B., and D.J. Klionsky. (2004). Development by self-digestion: molecular mechanisms and
biological functions of autophagy. Dev Cell 6:463-477.
Levine, B., and J. Yuan. (2005). Autophagy in cell death: an innocent convict? J Clin Invest 115:26792688.
Liang, X.H., S. Jackson, M. Seaman, K. Brown, B. Kempkes, H. Hibshoosh, and B. Levine. (1999).
Induction of autophagy and inhibition of tumorigenesis by beclin 1. Nature 402:672-676.
Lich, J.D., J.F. Elliott, and J.S. Blum. (2000). Cytoplasmic processing is a prerequisite for presentation
of an endogenous antigen by major histocompatibility complex class II proteins. J Exp Med
191:1513-1524.
Liou, W., H.J. Geuze, M.J. Geelen, and J.W. Slot. (1997). The autophagic and endocytic pathways
converge at the nascent autophagic vacuoles. J Cell Biol 136:61-70.
Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S.L., Matsudaira, P., Baltimore, D., Darnell, J.E. . (2001). Molekulare
Zellbiologie. Spectrum Akademischer Verlag, Berlin, Deutschland
Majeski, A.E., and J.F. Dice. (2004). Mechanisms of chaperone-mediated autophagy. Int J Biochem
Cell Biol 36:2435-2444.
Malarkannan, S., M. Afkarian, and N. Shastri. (1995). A rare cryptic translation product is presented
by Kb major histocompatibility complex class I molecule to alloreactive T cells. J Exp Med
182:1739-1750.
Malnati, M.S., M. Marti, T. LaVaute, D. Jaraquemada, W. Biddison, R. DeMars, and E.O. Long.
(1992). Processing pathways for presentation of cytosolic antigen to MHC class II-restricted T
cells. Nature 357:702-704.
Matsuno, K., T. Ezaki, S. Kudo, and Y. Uehara. (1996). A life stage of particle-laden rat dendritic
cells in vivo: their terminal division, active phagocytosis, and translocation from the liver to
the draining lymph. J Exp Med 183:1865-1878.
Mautner, J., E.M. Jaffee, and D.M. Pardoll. (2005). Tumor-specific CD4+ T cells from a patient with
renal cell carcinoma recognize diverse shared antigens. Int J Cancer 115:752-759.
Mayor, S., and R.E. Pagano. (2007). Pathways of clathrin-independent endocytosis. Nat Rev Mol Cell
Biol
McEwen, C.R., R.W. Stallard, and E.T. Juhos. (1968). Separation of biological particles by centrifugal
elutriation. Anal Biochem 23:369-377.
90
V. Literaturverzeichnis
Meijer, A.J., and P. Codogno. (2004). Regulation and role of autophagy in mammalian cells. Int J
Biochem Cell Biol 36:2445-2462.
Mellman, I., and R.M. Steinman. (2001). Dendritic cells: specialized and regulated antigen processing
machines. Cell 106:255-258.
Menendez-Benito, V., and J. Neefjes. (2007). Autophagy in MHC class II presentation: sampling from
within. Immunity 26:1-3.
Mijaljica, D., M. Prescott, D.J. Klionsky, and R.J. Devenish. (2007). Autophagy and Vacuole
Homeostasis: A Case for Self-Degradation? Autophagy 3:
Mizushima, N., T. Noda, T. Yoshimori, Y. Tanaka, T. Ishii, M.D. George, D.J. Klionsky, M. Ohsumi,
and Y. Ohsumi. (1998). A protein conjugation system essential for autophagy. Nature
395:395-398.
Mizushima, N., A. Yamamoto, M. Hatano, Y. Kobayashi, Y. Kabeya, K. Suzuki, T. Tokuhisa, Y.
Ohsumi, and T. Yoshimori. (2001). Dissection of autophagosome formation using Apg5deficient mouse embryonic stem cells. J Cell Biol 152:657-668.
Mizushima, N., T. Yoshimori, and Y. Ohsumi. (2003). Role of the Apg12 conjugation system in
mammalian autophagy. Int J Biochem Cell Biol 35:553-561.
Mizushima, N. (2004). Methods for monitoring autophagy. Int J Biochem Cell Biol 36:2491-2502.
Monney, L., C.A. Sabatos, J.L. Gaglia, A. Ryu, H. Waldner, T. Chernova, S. Manning, E.A.
Greenfield, A.J. Coyle, R.A. Sobel, G.J. Freeman, and V.K. Kuchroo. (2002). Th1-specific
cell surface protein Tim-3 regulates macrophage activation and severity of an autoimmune
disease. Nature 415:536-541.
Montgomery, S.A., P. Berglund, C.W. Beard, and R.E. Johnston. (2006). Ribosomal protein S6
associates with alphavirus nonstructural protein 2 and mediates expression from alphavirus
messages. J Virol 80:7729-7739.
Moreau-Aubry, A., S. Le Guiner, N. Labarriere, M.C. Gesnel, F. Jotereau, and R. Breathnach. (2000).
A processed pseudogene codes for a new antigen recognized by a CD8(+) T cell clone on
melanoma. J Exp Med 191:1617-1624.
Moretti, S., C. Pinzi, E. Berti, A. Spallanzani, A. Chiarugi, V. Boddi, U.M. Reali, and B. Giannotti.
(1997). In situ expression of transforming growth factor beta is associated with melanoma
progression and correlates with Ki67, HLA-DR and beta 3 integrin expression. Melanoma Res
7:313-321.
Moretti, L., Y.I. Cha, K.J. Niermann, and B. Lu. (2007). Switch between apoptosis and autophagy:
radiation-induced endoplasmic reticulum stress? Cell Cycle 6:793-798.
Mukherjee, P., A. Dani, S. Bhatia, N. Singh, A.Y. Rudensky, A. George, V. Bal, S. Mayor, and S.
Rath. (2001). Efficient presentation of both cytosolic and endogenous transmembrane protein
antigens on MHC class II is dependent on cytoplasmic proteolysis. J Immunol 167:2632-2641.
Murakami, M., K. Kataoka, S. Fukuhara, O. Nakagawa, and H. Kurihara. (2004). Akt-dependent
phosphorylation negatively regulates the transcriptional activity of dHAND by inhibiting the
DNA binding activity. Eur J Biochem 271:3330-3339.
91
V. Literaturverzeichnis
Negroiu, G., R.A. Dwek, and S.M. Petrescu. (2000). Folding and maturation of tyrosinase-related
protein-1 are regulated by the post-translational formation of disulfide bonds and by N-glycan
processing. J Biol Chem 275:32200-32207.
Nelson, C.A., I. Vidavsky, N.J. Viner, M.L. Gross, and E.R. Unanue. (1997). Amino-terminal
trimming of peptides for presentation on major histocompatibility complex class II molecules.
Proc Natl Acad Sci U S A 94:628-633.
Nimmerjahn, F. (2001). Untersuchung zum Mechanismus endogener MHC-Klasse-II restringierter
Antigenpräsentation. Dissertation an der LMU München
Nimmerjahn, F., S. Milosevic, U. Behrends, E.M. Jaffee, D.M. Pardoll, G.W. Bornkamm, and J.
Mautner. (2003). Major histocompatibility complex class II-restricted presentation of a
cytosolic antigen by autophagy. Eur J Immunol 33:1250-1259.
Nishi, K., M. Yoshida, D. Fujiwara, M. Nishikawa, S. Horinouchi, and T. Beppu. (1994). Leptomycin
B targets a regulatory cascade of crm1, a fission yeast nuclear protein, involved in control of
higher order chromosome structure and gene expression. J Biol Chem 269:6320-6324.
Norbury, C.C. (2001). Tracing the route taken by peptides and major histocompatibility complex class
I molecules in presentation of exogenous antigens. Methods Mol Biol 156:33-48.
Norbury, C.C. (2006). Drinking a lot is good for dendritic cells. Immunology 117:443-451.
Nuchtern, J.G., W.E. Biddison, and R.D. Klausner. (1990). Class II MHC molecules can use the
endogenous pathway of antigen presentation. Nature 343:74-76.
Ogier-Denis, E., and P. Codogno. (2003). Autophagy: a barrier or an adaptive response to cancer.
Biochim Biophys Acta 1603:113-128.
Ohsumi, Y. (2001). Molecular dissection of autophagy: two ubiquitin-like systems. Nat Rev Mol Cell
Biol 2:211-216.
Ossareh-Nazari, B., F. Bachelerie, and C. Dargemont. (1997). Evidence for a role of CRM1 in signalmediated nuclear protein export. Science 278:141-144.
Ostankovitch, M., V. Robila, and V.H. Engelhard. (2005). Regulated folding of tyrosinase in the
endoplasmic reticulum demonstrates that misfolded full-length proteins are efficient substrates
for class I processing and presentation. J Immunol 174:2544-2551.
Oukka, M., E. Colucci-Guyon, P.L. Tran, M. Cohen-Tannoudji, C. Babinet, V. Lotteau, and K.
Kosmatopoulos. (1996). CD4 T cell tolerance to nuclear proteins induced by medullary
thymic epithelium. Immunity 4:545-553.
Paludan, C., D. Schmid, M. Landthaler, M. Vockerodt, D. Kube, T. Tuschl, and C. Munz. (2005).
Endogenous MHC class II processing of a viral nuclear antigen after autophagy. Science
307:593-596.
Pamer, E., and P. Cresswell. (1998). Mechanisms of MHC class I--restricted antigen processing. Annu
Rev Immunol 16:323-358.
Pardoll, D.M., and S.L. Topalian. (1998). The role of CD4+ T cell responses in antitumor immunity.
Curr Opin Immunol 10:588-594.
92
V. Literaturverzeichnis
Pattingre, S., A. Tassa, X. Qu, R. Garuti, X.H. Liang, N. Mizushima, M. Packer, M.D. Schneider, and
B. Levine. (2005). Bcl-2 antiapoptotic proteins inhibit Beclin 1-dependent autophagy. Cell
122:927-939.
Peabody, D.S. (1989). Translation initiation at non-AUG triplets in mammalian cells. J Biol Chem
264:5031-5035.
Petiot, A., E. Ogier-Denis, E.F. Blommaart, A.J. Meijer, and P. Codogno. (2000). Distinct classes of
phosphatidylinositol 3'-kinases are involved in signaling pathways that control
macroautophagy in HT-29 cells. J Biol Chem 275:992-998.
Pieper, R., R.E. Christian, M.I. Gonzales, M.I. Nishimura, G. Gupta, R.E. Settlage, J. Shabanowitz,
S.A. Rosenberg, D.F. Hunt, and S.L. Topalian. (1999). Biochemical identification of a
mutated human melanoma antigen recognized by CD4(+) T cells. J Exp Med 189:757-766.
Pierre, P., and I. Mellman. (1998). Exploring the mechanisms of antigen processing by cell
fractionation. Curr Opin Immunol 10:145-153.
Pieters, J. (2000). MHC class II-restricted antigen processing and presentation. Adv Immunol 75:159208.
Pinet, V., M. Vergelli, R. Martin, O. Bakke, and E.O. Long. (1995). Antigen presentation mediated by
recycling of surface HLA-DR molecules. Nature 375:603-606.
Pinet, V.M., and E.O. Long. (1998). Peptide loading onto recycling HLA-DR molecules occurs in
early endosomes. Eur J Immunol 28:799-804.
Princiotta, M.F., D. Finzi, S.B. Qian, J. Gibbs, S. Schuchmann, F. Buttgereit, J.R. Bennink, and J.W.
Yewdell. (2003). Quantitating protein synthesis, degradation, and endogenous antigen
processing. Immunity 18:343-354.
Prlic, M., M.A. Williams, and M.J. Bevan. (2007). Requirements for CD8 T-cell priming, memory
generation and maintenance. Curr Opin Immunol 19:315-319.
Qian, S.B., E. Reits, J. Neefjes, J.M. Deslich, J.R. Bennink, and J.W. Yewdell. (2006). Tight linkage
between translation and MHC class I peptide ligand generation implies specialized antigen
processing for defective ribosomal products. J Immunol 177:227-233.
Rammensee, H.G., K. Falk, and O. Rotzschke. (1993). MHC molecules as peptide receptors. Curr
Opin Immunol 5:35-44.
Rammensee, H.G., Bachmann, J., Stevanovic, S. (1997). MHC Ligands and Peptide Motifs. Springer
Verlag
Reits, E.A., J.C. Vos, M. Gromme, and J. Neefjes. (2000). The major substrates for TAP in vivo are
derived from newly synthesized proteins. Nature 404:774-778.
Rock, K.L., and A.L. Goldberg. (1999). Degradation of cell proteins and the generation of MHC class
I-presented peptides. Annu Rev Immunol 17:739-779.
Rodriguez, A., A. Regnault, M. Kleijmeer, P. Ricciardi-Castagnoli, and S. Amigorena. (1999).
Selective transport of internalized antigens to the cytosol for MHC class I presentation in
dendritic cells. Nat Cell Biol 1:362-368.
Roux, P.P., B.A. Ballif, R. Anjum, S.P. Gygi, and J. Blenis. (2004). Tumor-promoting phorbol esters
and activated Ras inactivate the tuberous sclerosis tumor suppressor complex via p90
ribosomal S6 kinase. Proc Natl Acad Sci U S A 101:13489-13494.
93
V. Literaturverzeichnis
Rudensky, A., P. Preston-Hurlburt, S.C. Hong, A. Barlow, and C.A. Janeway, Jr. (1991). Sequence
analysis of peptides bound to MHC class II molecules. Nature 353:622-627.
Rudolph, M.G., R.L. Stanfield, and I.A. Wilson. (2006). How TCRs bind MHCs, peptides, and
coreceptors. Annu Rev Immunol 24:419-466.
Sallusto, F., M. Cella, C. Danieli, and A. Lanzavecchia. (1995). Dendritic cells use macropinocytosis
and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocompatibility
complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products. J Exp
Med 182:389-400.
Sambrook and Russell (2001). Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, New York, USA
Saric, T., S.C. Chang, A. Hattori, I.A. York, S. Markant, K.L. Rock, M. Tsujimoto, and A.L.
Goldberg. (2002). An IFN-gamma-induced aminopeptidase in the ER, ERAP1, trims
precursors to MHC class I-presented peptides. Nat Immunol 3:1169-1176.
Schmid, D., J. Dengjel, O. Schoor, S. Stevanovic, and C. Munz. (2006). Autophagy in innate and
adaptive immunity against intracellular pathogens. J Mol Med 84:194-202.
Schmid, D., M. Pypaert, and C. Munz. (2007). Antigen-loading compartments for major
histocompatibility complex class II molecules continuously receive input from
autophagosomes. Immunity 26:79-92.
Schubert, U., L.C. Anton, J. Gibbs, C.C. Norbury, J.W. Yewdell, and J.R. Bennink. (2000). Rapid
degradation of a large fraction of newly synthesized proteins by proteasomes. Nature 404:770774.
Schwab, S.R., K.C. Li, C. Kang, and N. Shastri. (2003). Constitutive display of cryptic translation
products by MHC class I molecules. Science 301:1367-1371.
Schwab, S.R., J.A. Shugart, T. Horng, S. Malarkannan, and N. Shastri. (2004). Unanticipated antigens:
translation initiation at CUG with leucine. PLoS Biol 2:e366.
Seglen, P.O., and P. Bohley. (1992). Autophagy and other vacuolar protein degradation mechanisms.
Experientia 48:158-172.
Shastri, N., S. Cardinaud, S.R. Schwab, T. Serwold, and J. Kunisawa. (2005). All the peptides that fit:
the beginning, the middle, and the end of the MHC class I antigen-processing pathway.
Immunol Rev 207:31-41.
Shastri, N. (2006). Cell biology. Peptides, scrambled and stitched. Science 313:1398-1399.
Sloan, V.S., P. Cameron, G. Porter, M. Gammon, M. Amaya, E. Mellins, and D.M. Zaller. (1995).
Mediation by HLA-DM of dissociation of peptides from HLA-DR. Nature 375:802-806.
Sowa, G., M. Pypaert, and W.C. Sessa. (2001). Distinction between signaling mechanisms in lipid
rafts vs. caveolae. Proc Natl Acad Sci U S A 98:14072-14077.
Stockinger, B. (1992). Capacity of antigen uptake by B cells, fibroblasts or macrophages determines
efficiency of presentation of a soluble self antigen (C5) to T lymphocytes. Eur J Immunol
22:1271-1278.
94
V. Literaturverzeichnis
Taylor, G.S., H.M. Long, T.A. Haigh, M. Larsen, J. Brooks, and A.B. Rickinson. (2006). A role for
intercellular antigen transfer in the recognition of EBV-transformed B cell lines by EBV
nuclear antigen-specific CD4+ T cells. J Immunol 177:3746-3756.
Teter, S.A., and D.J. Klionsky. (2000). Transport of proteins to the yeast vacuole: autophagy,
cytoplasm-to-vacuole targeting, and role of the vacuole in degradation. Semin Cell Dev Biol
11:173-179.
Thompson, B.J., J. Mathieu, H.H. Sung, E. Loeser, P. Rorth, and S.M. Cohen. (2005). Tumor
suppressor properties of the ESCRT-II complex component Vps25 in Drosophila. Dev Cell
9:711-720.
Townsend, A., C. Ohlen, J. Bastin, H.G. Ljunggren, L. Foster, and K. Karre. (1989). Association of
class I major histocompatibility heavy and light chains induced by viral peptides. Nature
340:443-448.
Toyofuku, K., I. Wada, R.A. Spritz, and V.J. Hearing. (2001). The molecular basis of oculocutaneous
albinism type 1 (OCA1): sorting failure and degradation of mutant tyrosinases results in a lack
of pigmentation. Biochem J 355:259-269.
Trieb, K., T. Lechleitner, S. Lang, R. Windhager, R. Kotz, and S. Dirnhofer. (1998). Evaluation of
HLA-DR expression and T-lymphocyte infiltration in osteosarcoma. Pathol Res Pract
194:679-684.
Tsukada, M., and Y. Ohsumi. (1993). Isolation and characterization of autophagy-defective mutants of
Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett 333:169-174.
Turley, S.J., K. Inaba, W.S. Garrett, M. Ebersold, J. Unternaehrer, R.M. Steinman, and I. Mellman.
(2000). Transport of peptide-MHC class II complexes in developing dendritic cells. Science
288:522-527.
van Bergen, J., F. Ossendorp, R. Jordens, A.M. Mommaas, J.W. Drijfhout, and F. Koning. (1999). Get
into the groove! Targeting antigens to MHC class II. Immunol Rev 172:87-96.
Viret, C., and C.A. Janeway, Jr. (1999). MHC and T cell development. Rev Immunogenet 1:91-104.
Vogt, A.B., and H. Kropshofer. (1999). HLA-DM - an endosomal and lysosomal chaperone for the
immune system. Trends Biochem Sci 24:150-154.
Wang, R.F., and S.A. Rosenberg. (1999). Human tumor antigens for cancer vaccine development.
Immunol Rev 170:85-100.
Wang, R.F. 2001. The role of MHC class II-restricted tumor antigens and CD4+ T cells in antitumor
immunity. Trends Immunol 22:269-276.
Wang, H.Y., and R.F. Wang. (2007). Regulatory T cells and cancer. Curr Opin Immunol 19:217-223.
Watts, C. (1997). Capture and processing of exogenous antigens for presentation on MHC molecules.
Annu Rev Immunol 15:821-850.
Wen, W., A.T. Harootunian, S.R. Adams, J. Feramisco, R.Y. Tsien, J.L. Meinkoth, and S.S. Taylor.
(1994). Heat-stable inhibitors of cAMP-dependent protein kinase carry a nuclear export
signal. J Biol Chem 269:32214-32220.
Yewdell, J.W., J.R. Bennink, and Y. Hosaka. (1988). Cells process exogenous proteins for recognition
by cytotoxic T lymphocytes. Science 239:637-640.
95
V. Literaturverzeichnis
Yewdell, J.W., and J.R. Bennink. (1999). Mechanisms of viral interference with MHC class I antigen
processing and presentation. Annu Rev Cell Dev Biol 15:579-606.
Yewdell, J.W., and C.V. Nicchitta. (2006). The DRiP hypothesis decennial: support, controversy,
refinement and extension. Trends Immunol 27:368-373.
Yewdell, J.W. (2007). Plumbing the sources of endogenous MHC class I peptide ligands. Curr Opin
Immunol 19:79-86.
Zhang, P., W.R. Summer, G.J. Bagby, and S. Nelson. (2000). Innate immunity and pulmonary host
defense. Immunol Rev 173:39-51.
Zhou, D., P. Li, Y. Lin, J.M. Lott, A.D. Hislop, D.H. Canaday, R.R. Brutkiewicz, and J.S. Blum.
(2005). Lamp-2a facilitates MHC class II presentation of cytoplasmic antigens. Immunity
22:571-581.
Zinkernagel, R.M., and P.C. Doherty. (1979). MHC-restricted cytotoxic T cells: studies on the
biological role of polymorphic major transplantation antigens determining T-cell restrictionspecificity, function, and responsiveness. Adv Immunol 27:51-177.
96
VI. Anhang
VI.
Anhang
1.
Vektorkarten
a) pINCO-NeoR
ScaI
Eco47III
PshAI
SrfI
5´ LTR
AmpR
MluI
BsrGI
BglII
BamHI
EcoRI
psi
oriP
12000
SfiI
XhoI
pCMV
2000
NsiI
BfrBI
pINCO-NeoR
10000
Neomycin
12976 bp
4000
myc
NaeI
NgoMIV
NotI
8000
SgrAI
3` LTR
6000
EBNA-1
Puromycin
pPGK
ClaI
SbfI
BsiWI
b) pINCO-NucNeoR
ScaI
Eco47III
PshAI
SrfI
AmpR
5´ LTR
BsrGI
BglII
MluI
BamHI
EcoRI
psi
oriP
12000
pINCO-NucNeoR
10000
Neomycin
13077 bp
4000
3xNL
myc
8000
SgrAI
SfiI
XhoI
pCM
2000
NsiI
BfrBI
6000
EBNA-1
NaeI
NgoMIV
NotI
3`
Puromycin
pPGK
ClaI
SbfI
BsiWI
c) pINCO-GFP
Sca
Fsp
Eco47II
PshAI
Srf
AmpR
5´ LTR
BglI
PmlI
BamH
EcoRI
psi
oriP
12000
SnaBI
2000
NsiI
BfrBI
HindII
BstBI
pCMV
pINCO-GFP
10000
12886 bp
GFP
4000
8000
SgrAI
6000
Not
3` LTR
EBNA-1
Puromycin
Sap
pPGK
Sbf
RsrI
BsiWI
97
VI. Anhang
d) pRTS-NeoR
XhoI
PacI
AflII
PmeI
SwaI
myc
poly
Neomycin
BI-tet07
NGF-R
chicken beta actin
NheI
BmtI
NruI
IRES
BglII
18000
FseI
eGFP
2000
rtTA2s-M2
16000
AscI
sv40 polyA
pRTS-NeoR4000
IRES
14000
tetR
19211 bp
ampR
6000
PvuI
pA
12000
8000
10000
ColE1
oriP
EcoRV
puro
ebna1
MluI
BfrBI
NsiI
e) pRTS-NucNeoR
XhoI
PacI
AflII
PmeI
Neomycin
myc 3xNLS BI-tet07
IRES
NGF-R
polyA
eGFP
E
BglII
AscI
sv40 polyA
18000
chicken beta actin
NheI
BmtI
SwaI
2000
PvuI
16000
NruI
pRTS-NucNeoR4000
rtTA2s-M2
FseI
14000
IRES
19295 bp
ampR
6000
12000
tetR
EcoRV
oriP
8000
10000
pA
MluI
ColE1
ebna1
puro
BfrBI
NsiI
f) pRTS-EBNA3C
SwaI
BstBI
SnaBI
BI-tet07
IRES NGF-R
EBNA3C
AscI
XhoI
Tth111I
eGFP
sv40 polyA
20000
SbfI
PacI
polyA
MluI
oriP
pRTS-EBNA3C
15000
pA
EBNA1
20803 bp
rtTA2s-M2
10000
pA
IRES
bla'
'AmpR rat
pSV4
AccIII
AflII
PmeI
pCMV
chicken beta actin
5000
tetR
BmtI
NheI
NruI
FseI
pA
SVpA
PvuI
FspI
98
VI. Anhang
g) pRTS-NeoR-EBNA3C
BstBI
RsrII
SnaBI
BI-tet07
myc
Neomycin
IRES'
AscI
EBNA3C
eGFP
sv40 polyA
20000
PacI
polyA
MluI
oriP
pRTS-NeoR-EBNA3C
15000
AflII
PmeI
pCMV
5000
chicken beta actin
20812 bp
pA
rtTA2s-M2
EBNA1
BmtI
NheI
NruI
FseI
10000
IRES
pA
tetR
bla'
'AmpR
pA
rat CD2
SVpA
pSV40
AccIII
PvuI
h) pCMV-NES-GFP-NeoR-GFP-NLS
PmlI
EcoR
Kpn
Acc65
SspI
Age
HincI
Sal
XhoI
pCMV
NES
Sca
Pvu
GFP
7000
AmpR
Neomyci
BtgI
Nco
1000
Ahd
6000
pCMV-NES-GFP-Neo-GFP-NLS
5000
2000
7227 bp
GFP
ColE1
3000
4000
NLS
BGHpoly
BamH
HindII
Xba
BclI
SVpA
Pci
f
Neo'
BsmI
Bbs
Srf
pSV40
DraII
SexA
StuI
i) pCMV-NGF-R
Kpn
Acc65I EcoR
SacII
Nco
Stu
pCMV
AmpR
Pml
6000
1000
NGF-R
pCMV-NGF-R
5000
ColE1
Msc
6296 bp
2000
4000
3000
SVpA
my
BGHpolyA
Nco
Xba
Neo
pSV40
f1
Msc
Stu
99
VI. Anhang
j) pCMV-Trc-His-NeoR-myc
NheI
BmtI
NcoI
BtgI
BamHI
Ecl136II
SacI
NdeI
EcoRI
KpnI
Acc65I
'polyHis
'mini cistron
pCMV
SspI
NotI
XbaI
BclI
Neomycin
myc
ScaI
BbsI
SrfI
BGHpolyA
5000
1000
pCMV-Trc-His-NeoR-myc
AmpR
f1
5784 bp
4000
BsaI
AhdI
DraIII
2000
pSV40
SexAI
3000
ColE1
BseRI
StuI
Neo
AlwNI
SVpA
PciI
Bst1107I
AccI
BsmI
BstBI
k) pCMV-Trc-His-NucNeoR-myc
SacI
Ecl136II
BamHI
NheI
BmtI
NcoI
BtgI
EcoRI
KpnI
Acc65I
NdeI
polyHis
pCMV
SspI
NotI
XbaI
BclI
Neomycin
NLSx3
myc
BGHpolyA
ScaI
5000
AmpR
BbsI
SrfI
1000
pCMV-Trc-His-NucNeoR-myc
f1
5868 bp
DraIII
4000
2000
BsaI
AhdI
pSV40
3000
ColE1
AlwNI
Neo
SexAI
BseRI
StuI
SVpA
PciI
Bst1107I
AccI
BsmI
BstBI
100
VI. Anhang
2.
Abkürzungsverzeichnis
3-MA
4E-BP1
Abb.
ampR
APC
Apg
APS
AK
AS
bp
BSA
CIIV
cDNA
CMV
Cy3
DC
DEPC
DRiPs
dNTP
DOC
EBV
ECL
E. coli
EDTA
eIF-4E
ELISA
FACS
FCS
FITC
GAPDH
GFP
GM-CSF
HEPES
HLA
HRP
Hsp
IFNγ
Lamp
LC3
LCL
LB-Medium
li
MIIC
MHC
mTOR
mRNA
NES
NLS
3-Methyladenin
eukaryotic initiations factor 4E binding protein 1
Abbildung
Ampicillin-Resistenz
Antigen-präsentierende Zelle (antigen presenting cell)
autophagy related protein
Ammoniumperoxidsulfat
Antikörper
Aminosäure
Basenpaare
Rinderserumalbumin (bovine serum albumin)
MHC-II-Vesikel
komplementäre DNA (complementary DNA)
Cytomegalievirus
Cytochrom 3 Fluoreszenzfarbstoff
Dendritische Zelle (dendritic cell)
Diethylpyrocarbonat
defective ribosomal products
2’-Desoxy-Nukleosid-5’-Triphosphat
Deoxycholin-Essigsäure
Epstein-Barr-Virus
enhanced chemoluminescence
Escherichia coli
Ethylendiamintetraacetat
eukaryotic initiations factor 4E
enzyme linked immunosorbent assay
Fluorescence activated cell sorting
fötales Kälberserum (fetal calf serum)
Fluoreszeinisothiocyanat
Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase
green fluorescent protein
Granulozyten-Makrophagen koloniestimulierender Faktor
2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethansulfonsäure
Humane Leukozytenantigene
horse reddish phosphatase (Meerrettich-Peroxidase)
Hitzeschockprotein
Interferon-γ
Lysosomen assoziiertes Membranprotein
microtubule associated protein 1 light chain 3 protein
lymphoblastoide Zelllinie (lymphoblastoid cell line)
Luria-Bertani-Medium
invariante Kette
MHC-II-Kompartiment
Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompatibility complex)
mammalian target of rapamycin
Boten (messenger) RNA
Kernexportsignall (nuclear export signal)
Kernlokalisationssignal (nuclear localisation signal)
101
VI. Anhang
NeoR
neoR
OD
pAPC
PBS
PBMC
PCR
pCMV
PeI
PFA
PI
RCC
RNA
RNase
RT
rtPCR
RT-PCR
SDS
TAA
TAE
TAP
Taq
TBE
cTEC
TBS
tetR
Tris
TCR
rpm
RPMI
U
V
Neomycin-Phosphotransferase II
Neomycin-Resistenz
Optische Dichte
professionelle APC
Phosphat-gepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline)
peripheral blood mononuclear cells
Polymerasekettenreaktion
Promotor des CMV
Polyethylenimin
Paraformaldehyd
Propidium-Iodid
Nierenzellkarzinom (renal cell carcinoma)
Ribonukleinsäure
Ribonuklease
Raumtemperatur
real time PCR
Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion
Natriumdodecylsulfat
Tumor-assoziiertes Antigen
Tris-Acetat-EDTA Puffer
transporter associated with antigen processing
hitzestabile Polymerase von Thermophilus aquaticus
Tris-Borat-EDTA Puffer
Thymuskortex-Epithelzellen (cortical thymus epithelial cell)
Tris-gepufferte Saline (Tris-buffered saline)
Tetracyclin-Resistenz
Tris-(hydroxymethyl)aminomethan
T-Zell-Rezeptor (T-cell receptor)
Umdrehungen pro Minute (revolutions per minute of rotor)
„Roswell Park Memorial Institute“
Einheit für die Enzymaktivität (unit)
Volt
102
Erklärung gemäß §4 Abs. 3 S. 3, 5, 8 der Promotionsordnung für Biologie
Hiermit erkläre ich ehrenwörtlich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig angefertigt habe
und keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe. Sämtliche
Experimente wurden von mir selbst durchgeführt, sofern nicht explizit auf Dritte verwiesen wird.
Diese Dissertation hat weder in gleicher oder ähnlicher Form einem anderen Prüfungsverfahren
vorgelegen. Ich habe weder bereits früher akademische Grade erworben noch versucht zu erwerben.
Alexander Riedel
München, 01.08.2007
Lebenslauf
Vorname:
Alexander
Nachname:
Riedel
Geburtsdatum:
27. September 1977
Geburtsort:
Uslar
Schule:
08/1990 – 06/1997
Gymnasium Uslar
Studium:
04/1998 – 09/2000
Grundstudium der allgemeinen Biologie
28.09.2000
Vordiplom Biologie
10/2000 – 05/2003
Hauptstudium mit den Schwerpunkten Zell- und
Entwicklungsbiologie, Humangenetik und Mikrobiologie
07/2002 – 05/2003
Diplomarbeit am Lehrstuhl für Humangenetik
in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. C. R. Müller-Reible
mit dem Thema: Entwicklung von Nachweismethoden der
Myotonen Dystrophie 2
02.05.2003
Diplom Biologie
Promotion:
11/2003 – heute
Promotion an der GSF-Forschungszentrum für Umwelt und
Gesundheit in München, Großhadern, am Institut für Klinische
Molekularbiologie und Tumorgenetik,
Arbeitgruppe von Dr. rer. nat. Josef Mautner
Thema: Untersuchungen zur endogenen MHC-Klasse-II-restringierten
Präsentation nukleärer Antigene
München, 01.08.2007
Publikationen
Nimmerjahn, F., D. Dudziak, U. Dirmeier, G. Hobom, A. Riedel, M. Schlee, L.M. Staudt, A.
Rosenwald, U. Behrends, G.W. Bornkamm, and J. Mautner. (2004). Active NF-kappaB signalling is a
prerequisite for influenza virus infection. J Gen Virol 85:2347-2356.
Teile dieser Arbeit werden wie folgt veröffentlicht:
Riedel, A., F. Nimmerjahn, A. Thomae, A. Schepers, U. Behrends, G.W. Bornkamm, and J. Mautner.
(2007). Endogenous presentation of nuclear antigens on MHC class II molecules is translation
dependent. Manuskript in Vorbereitung
Riedel A., F. Nimmerjahn, U. Behrends, G. W. Bornkamm, and J. Mautner (2007). Endogenous
presentation of a nuclear antigen on MHC II by autophagy in the absence of CRM1-mediated nuclear
export. Manuskript eingereicht bei Eur J Immunol
Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen
haben.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. Josef Mautner für die Bereitstellung des interessanten Themas,
für die intensive Betreuung und das große Interesse, dass er dieser Arbeit entgegenbrachte. Seine
kritische Beurteilung der Ergebnisse und sein enormes immunologisches Wissen haben mich bei jeder
Frage stets weitergebracht.
Vielen Dank für die schöne und lehrreiche Zeit in Deinem Labor.
Bedanken möchte ich mich auch bei Herrn Prof. Georg Bornkamm für die Betreuung und
Begutachtung der Arbeit innerhalb der GSF am Institut für klinische Molekularbiologie und
Tumorgenetik in München, Großhadern.
Bei Herrn Prof. Georg Krohne bedanke ich mich für die Begutachtung und Vertretung der Arbeit
seitens der Universität Würzburg.
Bedanken möchte ich mich auch bei Frau Dr. Uta Behrends bei der Mithilfe der schriftlichen
Ausarbeitung dieser Arbeit und ihrem Organisationstalent.
Mein ganz besonderer Dank gilt Dr. Dinesh Adhikary für seine Unterstützung im Labor und die
anregenden Gespräche fachlicher und privater Art.
Danken möchte ich auch den Laborfrauen Frau Lechner und Olivia Wolf und meinen Mitstreitern
Thorsten Krause und Thomas Jandl für ihre Unterstützung und die angenehme Arbeitsatmosphäre.
Bei Dr. Aloys Schepers bedanke ich mich für die Einführung in die Elutriationszentrifugation und bei
Herrn Dr. Reinhard Mailhammer für die Bereitstellung der rtPCR Materialien und Primer.
Großer Dank gilt auch meiner Mutter und meinen Geschwistern, die stets hinter mir stehen und mich
immer unterstützen.
Nicht zuletzt gilt mein besonderer Dank meiner Freundin Sabine, ohne die diese Zeit nicht so schön
gewesen wäre. Vielen Dank für Deine große Unterstützung.