Zelluläre Veränderungen nicht-kleinzelliger Lungenkarzinome nach
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Aus dem Institut für Pathologie der Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil – Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. K.-M. Müller ________________________________ Zelluläre Veränderungen nicht-kleinzelliger Lungenkarzinome nach neoadjuvanter kombinierter Radio-/Chemotherapie Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Sandra Abker aus Dortmund 2002 1 Abstract Abker Sandra Zelluläre Veränderungen nicht-kleinzelliger Lungenkarzinome nach neoadjuvanter kombinierter Radio/Chemotherapie Ziel der vorliegenden Dissertation war die vergleichende Untersuchung von Tumorzell- und Kerngrößen nicht-kleinzelliger Lungenkarzinome vor und nach neoadjuvanter Strahlen- und Chemotherapie hinsichtlich therapieinduzierter Größenveränderungen. Weiterhin sollte geprüft werden, ob Zell- und Kerngrößen prognoserelevante Faktoren darstellen. Aus dem prä- und posttherapeutischen Gewebe von 24 Patienten (18 Plattenepithel-, 6 Adenokarzinome) im Stadium III A oder III B wurden pro Patient 100 bis 200 Zellen mittels Computer gestütztem Bildanalysesystem hinsichtlich Zell- und Kerngröße analysiert. Die Untersuchung führte zu folgenden Ergebnissen: 1. Im Resttumorgewebe von Plattenepithelkarzinomen zeigte sich posttherapeutisch eine Verkleinerung der Zellfläche von prätherapeutisch 101,8 + 4,1 µm² auf 99,6 + 5,8 µm² (p=0,72), der Kernfläche von 36,5 + 1,5 µm² auf 34,8 + 2,2 µm² (p=0,50), des Zelldurchmessers von 11,9 + 0,2 µm auf 11,6 + 0,3 µm (p=0,49) und des Kerndurchmessers von 7,0 + 0,1 µm auf 6,8 + 0,2 µm (p=0,34), ohne eine statistische Signifikanz zu erreichen. 2. Adenokarzinome hingegen wiesen posttherapeutisch signifikant vergrößerte Tumorzellen und Kerne auf. Prätherapeutisch betrug die Zellfläche im Mittel 105,2 + 16,8 µm², die Kernfläche 33,9 + 2,8 µm², der Zelldurchmesser 12,1 + 1,1 µm und der Kerndurchmesser 6,8 + 0,3 µm. Posttherapeutisch vergrößerte sich die Zellfläche auf 137,2 + 27,4 µm² (p=0,034), die Kernfläche auf 46,1 + 7,3 µm² (p=0,067), der Zelldurchmesser auf 13,2 + 1,3 µm (p=0,015) und der Kerndurchmesser auf 7,7 + 0,6 µm (p=0,063). 3. Die Kern-Plasma-Relation verringerte sich bei den Plattenepithelkarzinomen um 1% auf 58,4 + 0,9% (p=0,368), während sie sich bei den Adenokarzinomen um 1,5% auf 58,8 + 1,5% (p=0,547) erhöhte. Die Prüfung hinsichtlich einer signifikanten Größenveränderung erfolgte jeweils mittels t-Test für abhängige Variablen. 4. In dem analysierten Kollektiv konnte, bei einer medianen Überlebenszeit von 18 Monaten, durch den LogRank-Test für Patienten mit prätherapeutisch vergleichsweise großen Tumorzellen eine signifikant längere Überlebenszeit von 30 Monaten im Vergleich zu Tumoren mit vorwiegend kleinen Tumorzellen mit nur 14 Monaten nachgewiesen werden (p=0,002). Posttherapeutisch wurden auffallende Größenunterschiede der Tumorzellen innerhalb der einzelnen Tumoren aufgezeigt. Kausalpathogenetisch lassen sich die Befunde über eine vergleichsweise große Tumorheterogenität in bösartigen Lungentumoren erklären. Selektionsphänomene mit Residuen vorwiegend größerer Zellen können durch eine unterschiedliche Strahlen- und Chemosensibilität erklärt werden. Bei einer histologisch orientierten graduellen Festlegung der Tumorregression nach Therapie sind auch zytologische Kriterien der Zell- und Kerngröße bedeutsam, da sich aus diesen Befunden weitergehende Informationen zu prognostischen Gesichtspunkten ableiten lassen. 2 Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: Priv.-Doz. Dr. med. K. Junker Korreferent: Prof. Dr. med. Tiedjen Tag der mündlichen Prüfung: 22.10.2002 3 Inhaltsverzeichnis 1. 1.1. 1.2. 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3. 1.2.4. 1.3. 7 7 9 10 11 11 12 13 1.3.1. 1.3.2. 1.4. 1.5. Einleitung Epidemiologie des Lungenkarzinoms Klassifikation Plattenepithelkarzinome Adenokarzinome Großzellige Karzinome Kleinzellige Karzinome TNM-System und Stadieneinteilung auf der Basis der TNMKlassifikation TNM-Klassifikation Stadieneinteilung gemäß TNM-Klassifikation Diagnostik Therapie 2. Fragestellung 19 3. 3.1. 3.1.1. 3.1.2. 3.2. 3.2.1. Material und Methode Material Klinische Remission nach neoadjuvanter Therapie Regressionsgrading bei NSCLC Methode (eigene Untersuchungen) Statistische Methoden 21 21 23 24 26 27 4. 4.1. 4.2. 4.2.1. 4.2.2. 4.2.3. Ergebnisse Klinische Tumorremission Meßergebnisse der Plattenepithelkarzinome Plattenepithelkarzinome, prätherapeutisch Plattenepithelkarzinome, posttherapeutisch Vergleich der prä- und posttherapeutischen Meßergebnisse der Plattenepithelkarzinome Meßergebnisse der Adenokarzinome Adenokarzinome, prätherapeutisch Adenokarzinome, posttherapeutisch Vergleich der prä- und posttherapeutischen Meßergebnisse der Adenokarzinome Prüfung der morphometrischen Parameter sowie des Stadiums hinsichtlich einer Korrelation zum Regressionsgrad Zelldurchmesser Zellfläche Kerndurchmesser Kernfläche Kern-Plasma-Relation Erkrankungsstadium Überleben 28 28 30 30 34 36 4.3. 4.3.1. 4.3.2. 4.3.3. 4.4. 4.4.1. 4.4.2. 4.4.3. 4.4.4. 4.4.5. 4.4.6. 4.5. 4 13 15 15 16 52 52 54 55 60 60 61 61 62 63 63 65 5. 5.1. 73 73 5.7. 5.8. Diskussion Prätherapeutische Tumorzellund Kerngrößen bei Plattenepithel- und Adenokarzinomen Posttherapeutische Zell- und Kerngrößen bei Plattenepithelund Adenokarzinomen Entwicklung der Tumorzellen und Zellkerne bei Patienten mit Plattenepithelkarzinomen nach Radio- und Chemotherapie Simultane Abnahme der Zell- und Kerngröße bei Plattenepithelkarzinomen Simultane Zellund Kernvergrößerung bei Plattenepithelkarzinomen Divergierende Größenveränderungen von Tumorzellen und Kernen bei Plattenepithelkarzinomen Entwicklung der Zell- und Kerngröße bei Patienten mit Adenokarzinomen nach Radio- und Chemotherapie Abgrenzung der zytologischen Veränderungen von Apoptose und Nekrose Abhängigkeit der Zell- und Kerngrößen und des Stadiums vom Regressionsgrad Einfluß der Zell- und Kernparameter auf das Überleben Einfluß von Stadium und Regressionsgrad auf das Überleben 6. Zusammenfassung 93 7. Literaturverzeichnis 96 5.2. 5.3. 5.3.1. 5.3.2. 5.3.3. 5.4. 5.5. 5.6. 5 75 76 76 77 80 82 86 87 88 90 Abkürzungen Adeno Adenokarzinome CR Komplette Remission DMax Maximaler Durchmesser DMin Kleinster Durchmesser DMittel Mittlerer Durchmesser KPR Kern-Plasma-Relation MÜZ Mediane Überlebenszeit NC No Change NSCLC Non-small-cell-lung cancer Pat. Patient PD Progressive disease PE Plattenepithelkarzinome Post Posttherapeutisch PR Partielle Remission Prä Prätherapeutisch RG Regressionsgrad SCLC Small-cell-lung cancer Stad. Stadium UICC Union International Contre le Cancer ÜLZ Überlebenszeit 6 1. Einleitung 1.1. Epidemiologie des Lungenkarzinoms Das Lungenkarzinom gehört mit einer Inzidenz von ca. 45.000 zu den häufigsten malignen Tumoren in Deutschland. An bösartigen Lungengeschwülsten starben 1997 insgesamt 37.248 Menschen, davon 28.464 Männer und 8.784 Frauen (Statistisches Jahrbuch 1999). Das Erkrankungsalter hat einen Häufigkeitsgipfel zwischen dem 55. und 65. Lebensjahr, vor dem 50. Lebensjahr ist diese Erkrankung eher selten. Beim Mann sind die malignen Lungentumoren mit einem Anteil von 26,4% in Deutschland die häufigste zum Tode führende bösartige Neubildung, bei der Frau liegen sie bei einem deutlich geringeren Anteil von derzeit 8,6%, die Letalitätsrate nimmt jedoch seit Jahrzehnten einen progredienten Verlauf. 1952 starben in Westdeutschland noch 1356 Frauen an malignen Lungentumoren, bis 1995 hat sich diese Zahl mit 6972 Todesfällen bereits verfünffacht. Ein wesentlicher Grund dafür liegt wahrscheinlich in der steigenden Zahl der Raucherinnen. Das Rauchen ist der wichtigste tumorauslösende Faktor, circa 98% aller Patienten mit gesichertem malignem Lungentumor sind Raucher (Lorenz 1994). Weitere kanzerogene Substanzen sind Asbest, Nickel, Cadmium, polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe, Arsen, Radon und ionisierende Strahlen (Noltenius 1987). Einerseits repräsentiert das Lungenkarzinom den Prototyp eines exogen induzierten Tumors, andererseits spielen auch anlagebedingte Faktoren in der Genese eine Rolle (Rüdiger und Nowak 1994). 7 % 30 männl. weibl. 25 20 15 10 5 0 1 Magen 2Dickdarm 3Mastdarm 4Leber Bauch5 6 Lunge Gb speichelGw drüse 7 8 9 10 BrustProstata GebärNiere drüse mutter HarnAdnexe wege 11 lymph. hämtop. Gewebe Abb. 1: Häufigste Todesfälle durch bösartige Neubildungen 1997 in Deutschland Todesfälle durch bösartige Neubildungen nach Lokalisation der häufigsten Primärtumoren für 1997 in Prozent. (Statistisches Jahrbuch für Deutschland 1999) 8 1.2. Klassifikation Die pathologisch-anatomische Diagnostik der bösartigen Lungentumoren erfolgt gemäß der WHO-Klassifikation von 1999 nach lichtmikroskopisch faßbaren zytologischen Kriterien (Travis et al. 1999). Aufgrund klinischer und tumorbiologischer Besonderheiten des kleinzelligen Lungenkarzinoms mit einer kurzen Tumorverdopplungszeit und der Tendenz zur frühen Metastasierung, werden die malignen Tumoren in zwei große Gruppen eingeteilt: in kleinzellige (SCLC) und nicht-kleinzellige Lungenkarzinome (NSCLC), zu denen definitionsgemäß Plattenepithel-, Adeno- und großzellige Karzinome zählen und die, je nach Selektion des Untersuchungsgutes, mit 64-90% aller Lungenkarzinome den größten Teil der Lungentumoren darstellen (Müller et al. 1993). Kleinzelliges Karzinom Variante: kombiniertes kleinzelliges Karzinom Plattenepithelkarzinom Varianten: a. papillär b. klarzellig c. kleinzellig d. basaloid Adenokarzinom a. azinär b. papillär c. bronchioloalveoläres Karzinom (sog. Alveolarzellkarzinom) d. solide schleimbildend e. verschiedene Subtypen gemischt f. Varianten Großzelliges Karzinom Varianten: a. großzellig, neuroendokrin b. basaloid 9 c. lymphoepitheliom-ähnlich d. klarzellig e. mit rhabdoidem Phänotyp Desweiteren werden Adeno-squamöses Karzinom, Karzinome mit pleomorphen, sarkomatösen Anteilen, Karzinoid-Tumoren und Karzinome vom Speicheldrüsen-Typ sowie unklassifizierte Karzinome nach einer Nouvellierung der WHO-Klassifikation von 1999 unterschieden (Travis et al. 1999). Das für die Therapie entscheidende Kriterium ist die histologische Diagnose, insbesondere die Frage kleinzellig oder nicht-kleinzellig (Cohen und Mathews 1978). Bei der Klassifikation des Tumorgewebes aus einer 2 mm Durchmesser umfassenden Biopsie ergibt sich jedoch die Schwierigkeit der Festlegung eines einzigen Tumorzelltyps. Mikroskopische Untersuchungen mehrerer Gewebsproben aus verschiedenen Abschnitten eines bösartigen Lungentumors unter Einsatz verschiedener Zusatzuntersuchungen haben gezeigt, daß sich pulmonale bösartige Neubildungen durch besonders hohe Heterogenität mit variablen Expressionen biologisch verschiedener Tumortypen als Folge einer hohen genetischen Instabilität auszeichnen. Der lichtmikroskopische Tumorbefund spiegelt nur einen groben phänotypischen Tumorparameter ohne zuverlässige Rückschlüsse auf die Tumorbiologie wider (Müller et al. 1994). Die zelluläre Heterogenität der bösartigen Lungentumoren zeigte sich auch in anderen Studien (Dunnhill u. Gatter 1986, Hirsch et al. 1983, Yang 1995). In der Diagnose kann daher nur der führende Tumorzelltyp angegeben werden. 1.2.1. Plattenepithelkarzinome Die Plattenepithelkarzinome sind mit 41% im Biopsiegut nach Müller die größte Gruppe unter den Lungenkarzinomen. Sie entwickeln sich meist in den großen Bronchien als knotige Rundherde und wachsen bevorzugt intraluminal stenosierend (Müller u. Brinkmann 1993). Ein auffällig hoher Anteil der Patienten (98%) sind starke Raucher. Plattenepithelkarzinome haben eine mittlere Tumorverdopplungszeit von 103 Tagen. Histologisch sind sie aus epidermisähnlichen Zellkomplexen aufgebaut und werden in verhornende und nicht verhornende Karzinome eingeteilt. Wichtige Kriterien für die 10 Diagnose Plattenepithelkarzinom sind der Nachweis von Interzellularspalten, die durch Desmosomen überbrückt werden, und von intrazellulären Keratinbestandteilen, bis zur Ausbildung von Hornperlen. Die Diagnose Plattenepithelkarzinom kann durch den möglichen Nachweis sowohl kleinzelliger als auch großzelliger Anteile erschwert werden. 1.2.2. Adenokarzinome Die Adenokarzinome liegen im Biopsiegut nach Müller mit 23% nach den Plattenepithelkarzinomen und kleinzelligen Karzinomen an 3. Stelle. Sie sind bevorzugt in der Peripherie lokalisiert und infiltrieren aus diesem Grund bereits früh die Pleura. Bei Frauen werden Adenokarzinome sehr häufig beobachtet und es ist der häufigste Tumortyp unter Nichtrauchern (Pendleton et al. 1996, drüsenähnlichen Strukturen Schleimsubstanzen und aufgebaut. Es Sekretvakuolen Noltenius 1987). Sie sind aus atypischen, sind in neben über atypischen 50% auch Epithelzellen mit plattenepitheliale Zellansammlungen und Riesenzellen nachweisbar. Daher ist eine Abgrenzung zwischen Adeno- und Plattenepithelkarzinomen schwierig und der Nachweis von zytoplasmatischen Schleimvakuolen zur Abgrenzung von großzelligen Karzinomen unerläßlich (Müller et al. 1993). Die Prognose ist trotz guter Operabilität bei peripherer Lokalisation, hohen Differenzierungsgrades und einer vergleichsweise langen mittleren Tumorverdopplungszeit von 183 Tagen eher ungünstig. 1.2.3. Großzellige Karzinome Die großzelligen Karzinome haben mit 1% im Biopsiegut bisher den geringsten Anteil unter den nicht-kleinzelligen Tumoren. In der Klassifikation der WHO bilden sie eine eigenständige Gruppe. Die Zahl der großzelligen Karzinome wird nach Nouvellierung der Klassifikation wahrscheinlich wieder ansteigen, neuere Zahlen liegen derzeit noch nicht vor. Die Zeichen, daß es sich jedoch eher um Varianten besonders von Adeno- und von Plattenepithelkarzinomen handelt, werden durch neuere Untersuchungen immer deutlicher. Zur Abgrenzung zum Adenokarzinom ist der fehlende Nachweis von Schleimproduktion wichtig. Eine Produktion exokriner und/oder neuroendokriner Hormone ist möglich, die Helligkeit des Zytoplasmas beispielsweise entsteht durch gespeichertes Glykogen. 11 1.2.4. Kleinzellige Karzinome Die kleinzelligen Lungenkarzinome zeichnen sich durch einen besonders hohen Malignitätsgrad mit einer mittleren Tumorverdopplungszeit von 55 Tagen aus. Im Biopsiegut sind sie die zweithäufigste Tumorgruppe mit einem Anteil von 30%. Sie wachsen bevorzugt in zentralen Lungenabschnitten. Produktion hormonähnlicher Substanzen wie Immunhistochemisch läßt sich die neuronenspezifischer Enolase (NSE) nachweisen. Eine histomorphologische Einteilung in das sogenannte Grading ist bei kleinzelligen Tumoren nicht möglich, da hier ein organoider Vergleich fehlt (Müller et al. 1993). 12 1.3. TNM-System und Stadieneinteilung auf der Basis der TNM-Klassifikation Neben der histologischen Diagnose ist für den Kliniker das Stadium des Patienten, das durch die TNM-Klassifikation bestimmt wird, von entscheidender Bedeutung, Therapiemaßnahmen der nicht-kleinzelligen Karzinome stadienabhängig sind. da die Um eine international standardisierte Stadieneinteilung der malignen Tumoren, nach der sich das Therapieschema richtet, zu erhalten, wird in Übereinstimmung mit der Union International Contre le Cancer (UICC) das Tumorstadium (Staging) aufgrund folgender Kriterien beurteilt: Größe und Ausdehnung des Primärtumors (T), Befall der regionären Lymphknoten (N), Nachweis von Fernmetastasen (M). Es wird unterschieden, ob die TNM-Einteilung prätherapeutisch anhand klinischer Befunde erfolgt oder postoperativ anhand des Resektates und wird dann mit pTNM gekennzeichnet. 1.3.1. TNM-Klassifikation Primärtumor (T): Tx: Positive Zytologie im Bronchialsekret/Sputum Tis: Carcinoma in situ T1: Tumor <3cm, von Lungengewebe oder viszeraler Pleura umgeben, Hauptbrochus frei T2: Tumor >3cm oder mit Hauptbrochusbefall oder Beteiligung der Pleura viszeralis oder mit partieller Atelektase oder Pneumonie eines Lungenanteils, >2cm distal der Carina T3: Tumor jeder Größe mit Beteiligung parietaler Pleura oder mit Hauptbrochusbefall <2cm distal der Carina oder totaler Atelektase oder Pneumonie einer gesamten Lunge T4: Tumor jeder Größe mit Infiltration von Mediastinum, Herz, großen Gefäßen, Trachea, Carina, Oesophagus oder malignem Pleuraerguß Regionäre Lymphknoten (N): N0: Keine regionären LK-Metastasen N1: Ipsilaterale peribrochiale und/oder hiläre LK-Metastasen 13 N2: Ipsilaterale mediastinale und subkarinale LK-Metastasen N3: Kontralaterale hiläre und/oder mediastinale LK-Metastasen und/oder supraklavikuläre LK-Metastasen (ipsi- und/oder kontralateral) Fernmetastasen (M): M0: Kein Nachweis von Fernmetastasen M1: Fernmetastasen Abb. 2: Sitz des Primärtumors gemäß TNM-Klassifikation (aus Noltenius 1987) Neben der TNM-Klassifikation können Unterschiede der geweblichen und zytologischen Differenzierung als Tumorgrading mit den Symbolen G1 bis G4 benannt werden (G1=hoher, G2=mittlerer, G3=geringer, G4=entdifferenziert, GX=unbestimmter Grad der Differenzierung). Die Prognose des nicht-kleinzelligen Lungenkarzinoms hängt entscheidend vom Erkrankungsstadium ab. Auch die Planung entsprechender Therapiemaßnahmen wird anhand des Tumorstadiums und der funktionellen Reserven des Patienten getroffen und ist daher für den Kliniker von großer Bedeutung. 14 15 1.3.2. Stadieneinteilung gemäß TNM-Klassifikation, UICC (International Union against Cancer) Die Stadieneinteilung der nicht-kleinzelligen Lungenkarzinome erfolgt nach der TNMKlassifikation. Zu Beginn dieser Studie galt die Einteilung von 1988, die unten abgebildet ist und die dieser Studie zugrunde gelegt wurde. 1997 kam es zu einer Nouvellierung der Stadieneinteilung, in der eine Differenzierung der Stadien I und II vorgenommen wurde und hier zum Vergleich aufgeführt wird. alte Klassifikation (Mountain 1988) neue Klassifikation (Mountain 1997) Okkultes Okkultes Karzinom: Tx, N0, M0 Karzinom: Tx, N0, M0 Stad. 0: Tis, N0, M0 Stad. 0: Tis, N0, M0 Stad. I: T1, N0, M0 Stad. IA: T1, N0, M0 T2, N0, M0 Stad. IB: T2, N0, M0 T1, N1, M0 Stad. IIA: T1, N1, M0 T2, N1, M0 Stad. IIB: T2, N1, M0 Stad. II: T3, N0, M0 Stad. IIIA: T3, N0, M0 Stad. IIIA: T1, N2, M0 T3, N1, M0 T2, N2, M0 T1-3, N2, M0 T3, N1-2, M0 Stad. IIIB: jedes T, N3, M0 Stad. IIIB: jedes T, N3, M0 T4, jedes N, M0 T4, jedes N, M0 Stad. IV: jedes T, jedes N, M1 Stad. IV: jedes T, jedes N, M1 1.4. Diagnostik Entscheidend für die Prognose der Patienten sind histologischer Typ, Tumorstadium, und der Allgemeinzustand des Patienten zum Zeitpunkt der Diagnosestellung (Mountain et al. 1986). Das diagnostische Vorgehen soll Aufschluß über Tumortyp, Ausdehnung des Primärtumors, Befall der regionären Lymphknoten und Feststellung oder Ausschluß von Fernmetastasen geben. Zur Primärdiagnostik zählen neben Anamnese und 16 körperlicher Untersuchung, bildgebende Verfahren wie Röntgenaufnahmen und Computertomographie (CT) des Thorax, um Lage des Tumors und Infiltration von Nachbarorganen oder Gefäßen festzustellen. Mittels endoskopischer Verfahren wie Bronchoskopie oder Mediastinoskopie wird Gewebe zum exakten Staging und Grading entnommen. Zum Ausschluß von Fernmetastasen wird in der Regel eine Abdomensonographie, CT von Abdomen und Schädel und eine Skelettszintigraphie durchgeführt. Laboruntersuchungen, insbesondere die Untersuchungen der Tumormarker wie neuronenspezifische Enolase (NSE), karzinoembryonales Antigen (CEA) und einiger spezifischer Proteine wie CA 50, haben ihre Bedeutung weniger in der Primärdiagnostik, sind aber ebenso wie die bildgebende Diagnostik ein wichtiger Verlaufsparameter (Feddersen u. Wichert 1994). 1.5. Therapie Die Therapie der Lungenkarzinome richtet sich zunächst nach der Einteilung kleinzelliges oder nicht-kleinzelliges Karzinom. Während das kleinzellige Karzinom wegen seines sehr hohen Malignitätsgrades und der früh einsetzenden Metastasierung in der Regel mit einer Chemotherapie behandelt wird und die Operation hierbei eher palliativen Charakter hat, hängt das Behandlungsschema der nicht-kleinzelligen Tumore vom Stadium ab. Bei Diagnosestellung liegt nur in 25-30% der Fälle ein lokal begrenzter Tumor im Stadium I oder II vor (Thomas et al. 1995). In diesen Erkrankungsstadien wird die komplette Resektion des Tumorgewebes unter kurativen Gesichtspunkten angestrebt, mit 5-JahresÜberlebensraten von 55-70% im Stadium I und 30-40 bzw. 50% im Stadium II (Izbicki et al. 1992, Nesbitt et al. 1995). Kann eine chirurgische Resektion aufgrund funktioneller Inoperabilität oder bei Ablehnung durch den Patienten nicht durchgeführt werden, so gilt als therapeutische Alternative die Radiotherapie (Dosoretz et al. 1992). Durch kurativ intendierte hyperfraktionierte Radiatio können bei Patienten im Stadium I 5-JahresÜberlebensraten von bis zu 30%, bei einer medianen Überlebenszeit von 33 Monaten, erreicht werden (Jeremic et al. 1997). Für Patienten im Stadium I und II hängt die Prognose von der Größe des Primärtumors (T-Stadium) und vom Lymphknotenstatus ab (Martini et al. 1992). 17 In bis zu 40% der Fälle liegt bei Diagnosestellung das Stadium IV mit Fernmetastasen vor (Thomas et al. 1995, Fry et al. 1996). Die Prognose ist bei diesen Patienten, mit medianen Überlebenszeiten zwischen 4 und 6 Monaten und 5-Jahresüberlebensraten unter 5%, trotz palliativer Chemotherapie, besonders kritisch. Die Therapiemaßnahmen im Stadium III, von dem 25-30% der Patienten bei Diagnosestellung betroffen sind, befinden sich in permanenter Entwicklung. Hierbei stehen unterschiedliche Therapiemaßnahmen zur Verfügung. Bei funktioneller und technischer Operabilität wird die Resektion des Tumors wegen der höchsten Heilungschance mit 5Jahres-Überlebensraten von 20% angestrebt (Drings 1997). Nachdem sich in Studien unter anderem an postoperativ bestrahlten Plattenepithelkarzinomen gezeigt hatte, daß eine Radiotherapie nach Resektion zu einer verminderten Rezidivrate führte, ein signifikanter Überlebensvorteil jedoch ausblieb, wurden weitere Therapieansätze entwickelt (Weisenburger und Gail 1986). Patienten mit lokal fortgeschrittenen Lungenkarzinomen wurden mit alleiniger Chemotherapie behandelt. Hierbei zeigte sich in Studien, im Vergleich zu unbehandelten Kontrollgruppen eine deutliche Verbesserung der Prognose, die Auswirkung der Therapie auf die Länge der Überlebenszeit war jedoch eingeschränkt (Cormier et al. 1981, Grilli et al. 1993). Supportiv werden nun adjuvante Chemotherapie (Dautzenberg et al. 1995, Roth et al. 1994) oder neoadjuvante Radio-Chemotherapie (Choi et al. 1997, Eberhardt 1996, Shepherd et al. 1992) angewandt, die zu deutlich besseren Prognosen führen. Diese Therapieformen haben das Ziel den Tumor zu verkleinern, somit eine erhöhte Resektionsrate zu erreichen und potentielle Mikrometastasen zu zerstören (Martini et al. 1993, Elias et al. 1994). Einige Studien an NSCLC konnten zeigen, daß durch neoadjuvante Therapieschemata hohe Raten an R0-Resektionen erzielt werden (Choi et al. 1996, von Eiff et al. 1994, Pujol et al. 1990, Wagner et al. 1995). Bei Inoperabilität werden die Patienten im Stadium III entweder mit alleiniger Radiotherapie behandelt, dies gilt vor allem für Tumoren ohne mediastinale Beteiligung (Hayakawa et al. 1996) oder es kommt eine kombinierte Radio- und Chemotherapie zum Einsatz, bei der es zu einer signifikant geringeren Metastasierungsrate im Vergleich zur alleinigen Strahlenbehandlung kommt (Arriagada et al. 1991). Einige Studien konnten eine signifikant längere Überlebenszeit bei kombinierter 18 Chemo- und hyperfraktionierter Strahlentherapie, im Vergleich zu alleiniger Radiotherapie feststellen (Byhardt et al. 1995, Schaake-Koning et al. 1992, Jeremic et al. 1995, Jeremic et al. 1996, Sause et al. 1995). 19 2. Fragestellung Bisher sind zytologische Veränderungen nicht-kleinzelliger Lungenkarzinome nach neoadjuvanter kombinierter Radio-/Chemotherapie unter morphometrischen Aspekten nur wenig untersucht worden. In der vorliegenden Arbeit wurden an Plattenepithel- und Adenokarzinomen Parameter wie Zell- und Kernfläche, Zell- und Kerndurchmesser und die Kern-Plasma-Relation vor und nach einer neoadjuvanten Kombinationstherapie, bestehend aus einer Chemotherapie hyperfraktioniert-akzelerierter bestimmt und nach nach dem Strahlentherapie, histomorphologischen ICE-Schema Gesamtdosis 45 Regressionszeichen und und Gray, nachfolgender quantitativ Korrelation zum weiteren klinischen Verlauf untersucht. Es liegen einige Studien über unterschiedliche maligne Tumoren vor, die sich mit zytologischen Veränderungen nach Radio- und Chemotherapie befassen. Moll und Chumas stellten 1997 bei neoadjuvant chemotherapierten Mammakarzinomen in 51% ihres Studienkollektivs eine Kernvergrößerung fest. Helpap fand 1985, daß zu den typischen Kennzeichen histologischer Regression beim Prostatakarzinom nach Oestrogen- und Strahlentherapie unter anderem die Vakuolisierung des Zytoplasmas, Kernpyknosen, in einzelnen Fällen aber auch vakuolisierte Kerne gehören. Andere Autoren beschreiben neben diesen Phänomenen auch weitere Veränderungen, die eine Verkleinerung von Zellen und Kernen zur Folge haben. Leistenschneider-Nagel beobachtete 1984 in behandelten Prostatakarzinomen weder eindeutig histologische noch zytologische Regressionszeichen. Er trennte „deutliche Regressionszeichen“ wie abnehmende Kerngröße, Kernpyknosen und Verkleinerung oder Schwund von Nukleolen von „geringen Regressionszeichen“ Zytoplasmaschrumpfung. Mandard wie beschrieb Kern1994 und in Zytoplasmavakuolen ihrer Untersuchung und zu Oesophaguskarzinomen nach präoperativer Chemotherapie in der Gruppe der TherapieResponder deutliche Regressionszeichen wie Zytoplasmavakuolisierung, Kernpyknose und Nekrosen und konnte ein signifikant längeres Überleben in der Responder-Gruppe ihres Kollektivs nachweisen. 20 Die vorliegenden Studien zeigen hinsichtlich der Morphologie von Tumorzellen und Zellkernen nach Chemo-/Strahlentherapie sehr unterschiedliche Ergebnisse. Es wurden bisher jedoch keine vergleichenden quantitativen Untersuchungen an Tumorzellen vor und nach Therapie durchgeführt. Die vorliegende Dissertation befaßt sich mit morphometrischen Untersuchungen an nichtkleinzelligen Lungenkarzinomen vor und nach kombinierter Strahlen- und Chemotherapie. Die prä- und posttherapeutisch gewonnenen Tumorzellen und Zellkerne wurden hinsichtlich einer signifikanten therapieinduzierten Größenveränderung quantitativ erfaßt und mittels statistischer Verfahren ausgewertet. Dabei war von besonderem Interesse, ob sich eine zu erwartende Zell- und Kernvergrößerung, wie in vorherigen Studien beschrieben, mit morphometrischen Methoden an Plattenepithel- und Adenokarzinomen der Lunge verifizieren läßt. Es sollte geprüft werden, ob es sich um gleichsinnige Veränderungen von Zell- und Kerngröße handelt oder ob sich diese beiden Parameter unabhängig voneinander entwickeln. Desweiteren wurden die gemessenen Flächen und Durchmesser, sowie die Kern-Plasma-Relation und das Erkrankungsstadium hinsichtlich einer Korrelation zum Grad der therapieinduzierten Tumorregression untersucht. Außerdem wurde untersucht, ob die Größe von Tumorzellen und Zellkernen einen Einfluß auf die Länge der Überlebenszeit ausüben und somit einen prognoserelevanten Faktor darstellen. 21 3. Material und Methode 3.1. Material Im Rahmen einer Multicenterstudie wurden in der Zeit von April 1992 bis September 1995 54 Patienten mit lokoregionär fortgeschrittenen nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen in die Studie aufgenommen und mit einer neoadjuvanten Radio-/Chemotherapie nach dem ICE-Schema behandelt. Nach Abschluß der Kombinationsstherapie war bei 40 Patienten eine operative Resektion möglich. In 33 Resektaten war weiterhin vitales Tumorgewebe nachweisbar; eine vergleichende Untersuchung von prä- und posttherapeutischem Gewebe konnte bei 24 Patienten vorgenommen werden. Bei den Patienten handelte es sich um 2 Frauen und 22 Männer, im Alter zwischen 37 und 69 Jahren, median 57,8 Jahre. In die Studie aufgenommen wurden Patienten, die folgende Einschlußkriterien erfüllten: - Histologisch gesichertes nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom im - Stadium III A oder III B - Funktionelle Operabilität mit einer FEV >1,0 Liter - Allgemeinzustand nach Karnowsky mindestens 70% - Ausreichende Leber- und Nierenfunktion - Ausreichende Knochenmarksfunktion vor Therapiebeginn - Alter der Patienten max. 69 Jahre - Schriftliche Patienteneinwilligung Patienten, die bereits vorher eine StrahlenPrimärtumor bereits reseziert wurde, sowie oder Chemotherapie erhielten, deren Patienten mit bestehendem malignem Zweittumor und manifester Infektion vor Therapiebeginn, konnten nicht in die Studie aufgenommen werden. Neben bildgebender Diagnostik wie Röntgen-Thorax, Thorax-, Schädel- und Abdomen-CT und Skelettszintigraphie zum Ausschluß von Fernmetastasen, wurde den Patienten via Bronchusbiopsie und Mediastinoskopie Gewebe zum Staging und Grading entnommen. In diesem Patientenkollektiv wurde bei 18 Patienten ein Plattenepithelkazinom und bei 6 Patienten ein Adenokarzinom diagnostiziert. 22 Median 25 Tage nach Diagnosestellung wurde mit dem ersten Zyklus der Chemotherapie begonnen. Das Therapieschema bestand aus 3 Blöcken neoadjuvanter Therapie: Initial erfolgten 2 Blöcke Chemotherapie nach dem ICE-Schema mit den Substanzen Ifosfamid, Carboplatin und Etoposid. Ifosfamid und Etoposid wurden am 1., 3. und 5. Tag in einer Dosierung von 1500 mg/m² bzw. 100 mg/m², Carboplatin nur am 1. Tag in einer Dosierung von 300 mg/m² Körperoberfläche gegeben. Dieses Schema wurde ab dem 22. Tag wiederholt. Danach folgte die hyperfraktionierte, akzelerierte Bestrahlungstherapie mit einer Gesamtdosis von 45 Gray, die innerhalb von 3 Wochen, an 5 Tagen pro Woche, mit jeweils 2 Einzelfraktionen à 1,5 Gray, appliziert wurde. Simultan wurde an den Tagen 1, 8 und 15 zur Strahlentherapie eine Kombinationschemotherapie mit den Substanzen Carboplatin (100 mg/m²) und Vindesin (3 mg/m²) verabreicht. 23 3.1.1. Klinische Remission nach neoadjuvanter Therapie Drei bis sechs Wochen nach Abschluß der kombinierten Radio-Chemotherapie erfolgte ein Staging zur klinischen Überprüfung der Therapie mittels bildgebender Verfahren. Die Bewertung erfolgte nach den Kriterien der Southwest Oncology Group. Tab. 1: Klinische Remissionskriterien der Southwest Oncology Group (SWOG) (Green und Weiss 1992) CR Komplette Tumorremission: Verschwinden aller meßbaren Tumorparameter über zumindest 4 Wochen PR Partielle Tumorremission: Reduktion aller meßbaren Tumorparameter um mindestens 50% über zumindest 4 Wochen NC „no change“ (gleichbleibende Tumorerkrankung): Reduktion aller meßbaren Tumorparameter um weniger als 50% bzw. Größenzunahme um höchstens 25% über zumindest 4 Wochen PD Progressive Tumorerkrankung: Größenzunahme der meßbaren Tumorparameter um mindestens 25% oder Auftreten von Metastasen Median sieben Wochen nach Abschluß der Radio-/Chemotherapie, nach Rückbildung hämatologischer Operation unter und nicht-hämatologischer kurativer Zielsetzung. Nebenwirkungen, Das entnommene erfolgte die radikale Gewebe wurde nach makroskopischer Beurteilung in Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und die ehemalige Tumorzone stufenweise aufgearbeitet. Zur histologischen Beurteilung wurden Schnitte von 3-4 µm Dicke angefertigt und Hämatoxylin-Eosin (HE) gefärbt. 24 3.1.2. Regressionsgrading bei NSCLC Anhand der Histologie und Zytologie ist eine differenzierte Beurteilung der Karzinome im Hinblick auf ihren Therapie-Response möglich. Histologisch wird der Therapieerfolg durch Grad und Ausmaß vitalen Resttumorgewebes bestimmt, dabei wurden besonders Ausmaß der Tumorzellnekrosen und reaktive Veränderungen wie Schaumzellreaktion und Fibrosierung berücksichtigt und mit prätherapeutisch entnommenem Material verglichen. Danach erfolgte eine Zuordnung nach einem Regressionsgrading (Junker et al. 1997). Tab. 2: Regressionsgrading bei NSCLC Grad I Keine oder nur geringe (spontane) Tumorregression Grad II Morphologische Zeichen der therapieinduzierten Tumorregression mit: A >10% vitalem Tumorgewebe B <10% vitalem Tumorgewebe Grad III Komplette Tumorregression, kein vitales Tumorgewebe Im Hinblick auf die Einschätzung von Therapie-Response und Prognose, ist die Abgrenzung therapieinduzierter von spontanen Veränderungen von entscheidender Bedeutung. Einige morphologische Merkmale sind kennzeichnend für eine spontane Regression wie fokale Nekrosezonen neben vitalen Tumorsäumen, entlang kapillärer Gefäße wachsendes vitales Fremdgewebe im Randbereich größerer Nekrosezonen und eine diese umgebende granulozytäre Reaktion. Junker et al. haben 1997 die Morphologie therapieinduzierter Veränderungen bei nichtkleinzelligen Lungenkarzinomen herausgestellt: kennzeichnend ist ein zentraler Nekroseherd, umgeben von einem meist schmalem Schaumzellsaum und anschließendem Granulationsgewebe, das zur Peripherie hin einen Übergang in faserreiches Bindegewebe mit ausgedehnten Narbenfeldern aufweist. Er beschreibt außerdem das Auftreten von Cholesterinkristallen, die sich im Randbereich der Tumornekrosen oder der Schaumzellen befanden und denen mehrkernige Riesenzellen angelagert waren. Diese therapieinduzierten Regressionszeichen werden je nach Ausmaß Grad II A-III zugeordnet. 25 Weitere histologische Merkmale, die bei therapieinduzierter Regression vorkommen, sind Gefäßwandveränderungen, wie Endangiitis oder narbiger Lumenverschluß und bräunlich pigmentierte intraalveoläre Makrophagen in Nähe des ehemals vitalen Tumorgewebes. Ferner sind frische Einblutungen ins Lungenparenchym, interstitielle oder alveoläre Ödembildung und ein beginnender fibrosierender Umbau des Lungengewebes nachzuweisen (Junker et al. 1997). In Gewebe behandelter Lungentumoren liegen bei RG II A-III sowohl Zeichen einer therapieinduzierten als auch einer spontanen Regression vor. Bei Vorliegen eines RG I sind lediglich spontane Regressionszeichen festzustellen. Bei kleinzelligen Lungenkarzinomen histomorphologische Nekroseherden Veränderungen sind auch hier sind nach nachweisbar. Chemotherapie Neben Schaumzellen sowie ähnliche zentralen eosinophilen neugebildetes gefäßreiches Bindegewebe und fibröses Narbengewebe nachweisbar (Junker et al. 1995). Je nach Ausmaß der Veränderungen wird hierbei Grad I (keine oder geringe Regressionsphänomene) bis Grad III (komplette Tumorregression) unterschieden. Einige Autoren unterschiedlichen Regressionsgrading dissoziierte wiesen ebenfalls eine malignen Tumoren nach. des Prostatakarzinoms Karzinomkomplexe, therapieinduzierte Dhom und neben Zytoplasmaballonierung Tumorregression Degro wiesen in Fibrosierungsphänomenen und Kernvakuolisierung bei ihrem auf hin (Dhom und Degro 1982). Becker beobachtete an präoperativ chemotherapierten lokal fortgeschrittenen Adenokarzinomen des Magens zentral betonte Fibrosierung, regionale Nekroseherde, Ödem und Schaumzellen häufiger als in der nicht-chemotherapierten Kontrollgruppe (Becker et al. 1996). Fischer untersuchte maligne primäre und sekundäre Lebertumoren und stellte heraus, daß dem Tumorrand eine zentrale Bedeutung zukommt (Fischer 1985). Bei Plattenepithelkarzinomen im Kopf-Hals-Bereich stellten Böheim et al. 1982 und Sulfaro et al. 1989 eine Abhängigkeit der histomophologischen Veränderungen von der Tumorregression, ebenso wie Salzer-Kuntschik et al. 1983 bei malignen Knochentumoren und Roessner et al. 1986 bei Ewing-Sarkomen, fest. Jeder dieser Tumoren zeigt therapieinduziert spezifische Reaktionen, besondere Bedeutung kommt jedoch bei allen dem Granulationsgewebsbildung zu. 26 Nekroseausmaß, Fibrosierung und 3.2. Methode (eigene Untersuchungen) Den morphometrischen Untersuchungen lag das prätherapeutisch mittels Bronchoskopie oder Mediastinoskopie gewonnene Biopsiematerial von 24 Patienten, davon 6 Adeno- und 18 Plattenepithelkarzinome, und das posttherapeutische Resttumorgewebe aus den Operationsresektaten derselben Patienten zugrunde. Hierbei wurden die prätherapeutischen Zell- und Kerngrößen ermittelt und mit den Ergebnissen des posttherapeutisch regressiv veränderten Resttumorgewebes verglichen. Es wurden aus den HE-Schnitten pro Patient 100 bis 200 repräsentative, intakte Zellen aus Tumorzellansammlungen von verschiedenen Präparaten eines Patienten, jeweils von dem prätherapeutisch gewonnen Material und von den posttherapeutischen Resektaten herangezogen. Mit einem Mikroskop (Zeiss 47 30 28) wurden die Präparate zunächst gesichtet und bei 400facher Vergrößerung zur Messung geeignetes Material selektiert. Die morphometrischen Untersuchungen der histologischen Schnittpräparate erfolgten mit einer an vorher genanntes Mikroskop angeschlossenen Kamera (JVC TK-1070 E) mit KameraSteuereinheit (AC Adapter) und mit dem Computer gestützten Kontron Bildanalysesystem VIDAS Release 2.1. Die VIDAS-Hardware besteht aus einem AT-Rechner mit einem angeschlossenen Bild-Monitor sowie einem Digitalisierungstableau und Cross-hair-Cursor. Die Messungen erfolgten bei 1200-facher Vergößerung (Kamerafaktor 30, Objektiv x40) im Measurement-Menue anhand digitalisierter Monitorbilder nach vorhergehender Kalibration. Die Kalibration dient zur Definition der Meßfläche, wobei die mit dem Cursor abgefahrene Länge auf der x- und y-Achse mit einer Einheit in µm jeweils einer bestimmten Anzahl von Pixeln zugeordnet wird. Bei den Messungen wurden die intakten Tumorzellen mit dem Cursor umfahren, um die Zellfläche in µm² zu ermitteln. Zellen mit Artefakten wurden nicht gemessen. In gleicher Weise wurde bei der entsprechenden Tumorzelle der Zellkern zur Ermittlung der Kernfläche in µm² umfahren. Mit Hilfe des VIDAS-Systems konnte aus der Tumorzellund Kernfläche der maximale, minimale und mittlere Durchmesser in µm errechnet werden: der maximale Durchmesser ist definiert als längster Abstand der äußeren Projektbegrenzungen nach Projektion auf die HorizontalLängenbestimmung erfolgt durch Umrechnung der in bzw. Vertikalachse. Die der jeweiligen Projektion vorhandenen Pixel in der entsprechenden Skalierungseinheit. Der minimale Durchmesser 27 ist definiert als kürzester Abstand der Projektbegrenzungen und wird analog dem maximalen Durchmesser ermittelt. Anschließend wurden die Daten der prä- und posttherapeutisch gewonnen Gewebe miteinander verglichen, um festzustellen, ob die angewandte Therapie nicht nur einen Einfluß auf die Tumorgröße, sondern auch auf Zellund Kerngröße hat. Als Grundlage zur Bestimmung der Kern-Plasma-Relation dienten mittlerer Kern- und Zelldurchmesser. 3.2.1. Statistische Methoden Nach Abschluß der morphometrischen Untersuchungen wurden die prä- und posttherapeutisch gemessenen Mittelwerte der Zell- und Kernflächen, der Zell- und Kerndurchmesser sowie der Kern-Plasma-Relation, nach Plattenepithel- und Adenokarzinomen getrennt, mittels t-Test für abhängige Variablen hinsichtlich einer signifikanten Größenveränderung überprüft. Es lag eine Normalverteilung der Werte vor. Die Überlebenszeit und die Überlebenszeit in Abhängigkeit der zuvor genannten morphometrischen Parameter sowie des Regressionsgrades und des Erkrankungsstadiums wurden mit Hilfe der Überlebenskurven nach Kaplan-Meier berechnet (Kaplan und Meier 1958). Hierbei wurde das Datum der Erstdiagnose und das Ende der Nachbeobachtungszeit beziehungsweise das Todesdatum zugrunde gelegt. Die Überlebenszeit der Patienten in Abhängigkeit von der Größe der morphometrischen Parameter wurde durch den LogRank-Test untersucht. Ziel war hierbei, festzustellen, ob die Größe von Zellen und Kernen, die Kern-Plasma-Relation, sowie das Stadium und Regressionsgrad einen signifikanten Einfluß auf die Länge der Überlebenszeit ausüben. Die Prüfung einer Beziehung zwischen der Größe der gemessenen Parameter zum Regressionsgrad, erfolgte durch den exakten Test nach Fisher. 28 4. Ergebnisse Die vorliegende kleinzelliger Arbeit befaßt Lungenkarzinome sich mit nach den zytologischen neoadjuvanter Veränderungen Therapie. Es stand nichtein Patientenkollektiv von 2 weiblichen und 22 männlichen Patienten im Alter zwischen 37 und 69 Jahren, median 57,8 Jahre, zur Verfügung, die sich zum Zeitpunkt der Diagnosestellung im Stadium III A oder III B befanden. Ziel der Arbeit ist, zytologische Parameter der Tumorzellen wie Zellfläche und Zelldurchmesser, Kernfläche und Kerndurchmesser und die Kern-Plasma-Relation genau zu quantifizieren und im direkten Vergleich der prä- und posttherapeutischen Werte eine therapieinduzierte, gerichtete Größenveränderung der Plattenepithel- und Adenokarzinomzellen zu erkennen. Die Meßergebnisse sollten anschließend hinsichtlich einer Korrelation mit der Überlebenszeit und dem Regressionsgrad untersucht werden. 4.1. Klinische Tumorremission Im Rahmen eines multimodalen Therapiekonzepts mit kombinierter Radio-/Chemotherapie nach dem ICE-Schema und anschließender Resektion, wurde präoperativ die klinische Remission des Tumors mittels bildgebender Verfahren wie Computertomographie überprüft und nach den Kriterien der Southwest Oncology Group bewertet. Eine komplette Remission (CR) zeigte sich bei 4 Patienten, eine partielle Remission (PR) bei 13 Patienten, in 5 Fällen konnten keine klinischen Veränderungen der Erkrankung (NC, no change) festgestellt werden. Von 2 studienbegleitend therapierten Patienten (K.R. und H.T.) lagen keine klinischen Daten vor, so daß eine Beurteilung der klinischen TherapieResponse in diesen Fällen nicht erfolgen konnte. Eine Progression der Erkrankung (PD, progressive disease) ließ sich in diesem nachweisen. 29 Patientenkollektiv bei keinem Patienten Tab. 3: Klinisches Remissionsverhalten der Adeno- und Plattenepithelkarzinome nach präoperativ durchgeführter Radio- und Chemotherapie n=22 Pat. ges. Adeno-Ca Plattenepithel-Ca CR 4 0 4 PR 13 4 9 NC 5 2 3 n=Anzahl der Patienten gesamt CR=komplette Remission PR=partielle Remission NC=No change Median 7 Wochen nach Beendigung der Therapie erfolgte die Resektion unter kurativer Zielsetzung. Das entnommene Gewebe wurde zunächst makroskopisch beurteilt, anschließend wurde es für die histologische Untersuchung in Stufenschnitten aufgearbeitet und nach den bereits erläuterten histologischen und zytologischen Merkmalen des Resttumorgewebes einem Regressionsgrad I-III zugeordnet. Dabei zeigte sich folgende Verteilung der Regressionsgrade auf das Patientenkollektiv (n=24): Tab. 4: Verteilung der Regressionsgrade auf das Patientenkollektiv (n=24) Regressionsgrad Anzahl Pat. (n) Adeno-Ca Plattenepithel-Ca I 3 1 2 II A 7 3 4 II B 14 1 13 III 0 0 0 Von den vorliegenden 24 Patienten, ließen sich bei 3 Patienten (1 Adenokarzinom, 2 Plattenepithelkarzinome) lediglich spontane, keine therapieinduzierten Tumorregressionszeichen feststellen und wurden daher dem Regressionsgrad I zugeordnet. Bei 7 Patienten, darunter 3 Adeno- und 4 Plattenepithelkarzinome, waren therapieinduziert veränderte Gewebestrukturen, mit einem Anteil vitalen Tumorgewebes von mehr als 10% festzustellen und entsprachen somit dem Regressionsgrad II A. Weniger als 10% vitales Tumorgewebe, entsprechend Regressionsgrad II B, 30 zeigte sich bei 13 Patienten mit Plattenepithel- und bei 1 Patienten mit Adenokarzinom. Ziel dieser Dissertation ist der direkte Vergleich von prä- und posttherapeutischen Tumorzellen an Geweben derselben Patienten, daher wurden keine Patienten mit Regressionsgrad III untersucht, da in diesem Fall kein vitales Tumorgewebe nach Behandlung für eine vergleichende Analyse zu Verfügung stünde. Da die Regressionsphänomene histologisch in die Grade I bis III eingeteilt werden, wurde der RG III in die vorangegangene Tabelle mit aufgenommen. 4.2. Meßergebnisse der Plattenepithelkarzinome 4.2.1. Plattenepithelkarzinome, prätherapeutisch Die Gruppe der Patienten mit der Diagnose Plattenepithelkarzinom bestand aus 17 Männern und einer Frau, im Alter zwischen 37 und 69 Jahren. Zwölf Patienten befanden sich im Stadium III A, 4 Patienten im Stadium III B. Von 2 Patienten wurden klinische Daten nicht erhoben, studienbegleitend da behandelt diese wurden, Patienten so daß wegen nähere fehlender Informationen Einschlußkriterien bezüglich des Krankheitsstadiums von diesen Patienten fehlen. Aus den folgenden Tabellen sind die Ergebnisse der morphometrischen Untersuchungen, getrennt nach Plattenepithelkarzinomen (PE) und Adenokarzinomen (Adeno) ersichtlich. Mit der Abkürzung "prä" Messergebnisse an prätherapeutischem den sind Tabellen gekennzeichnet, bei denen es sich um zur Gewebe, Diagnosestellung handelt. Die gewonnenen tabellarisch Biopsaten, aufgeführten und Ergebnisse somit der Gewebeproben nach Therapie sind mit "post" beschriftet. Die ersten vier Tabellenspalten enthalten Informationen zur Patientenkennung, Alter der Patienten in Jahren, Geschlecht und Erkrankungsstadium. Die Untersuchungsergebnisse sind getrennt nach Zelle und Kern, jeweils mit der Fläche in µm² und dem maximalen (DMax), minimalen (DMin ) und mittleren Durchmesser (DMittel) in µm aufgeführt. Die Kern-Plasma-Relation ist mit der Abkürzung KPR gekennzeichnet. Für jeden Parameter (Zell- und Kernfläche, Zell- und Kerndurchmesser) wurde aus den Messungen (getrennt nach Plattenepithel- und Adenokarzinomen) der Mittelwert gebildet, 31 der ein repräsentatives Ergebnis der Karzinomsubtypen darstellt. Für die weitere statistische Auswertung wurden Standardfehler und Median errechnet. Die morphometrischen Messungen führten zu folgenden Ergebnissen: 32 Tab. 5: Meßergebnisse der Plattenepithelkarzinome, prätherapeutisch: PE - prä Zelle Kern KPR Pat. Alter m/w Stad. Fläche DMax DMin DMittel Fläche DMax DMin DMittel (µm²) (µm) (µm) (µm) (µm²) (µm) (µm) (µm) % W. B. 67 m III A 126,2 15,9 10,5 13,2 42,3 8,8 6,3 7,6 57,3 E. K. 51 m III A 126,2 15,7 11,0 13,3 36,7 8,2 5,9 7,1 53,4 K. R. 61 m 120,4 15,9 10,5 13,2 33,6 8,2 5,4 6,8 51,6 H. S. 52 m III A 116,9 14,7 10,5 12,6 32,8 8,2 5,2 6,7 53,1 G. O. 69 m III A 98,4 14,4 9,6 12,0 34,0 8,0 5,6 6,8 56,6 D. D. 57 m III A 101,1 14,4 9,5 11,9 38,7 8,9 5,8 7,3 61,4 E. L. 65 m III A 91,2 13,6 9,0 11,3 32,0 7,9 5,3 6,6 58,9 W.H. 43 m III B 69,6 11,7 8,1 9,9 26,9 7,1 5,0 6,0 60,8 A.W. 65 m III B 102,2 14,7 9,4 12,0 42,3 9,1 6,2 7,6 63,3 G. H. 45 m III A 101,8 14,3 9,5 11,9 37,7 8,8 5,7 7,3 60,9 H. L. 58 m III A 78,6 12,4 8,6 10,5 28,6 7,4 5,1 6,2 59,5 E. B. 59 m III A 82,7 12,3 8,9 10,6 35,1 8,1 5,7 6,9 64,9 U.W. 37 m III B 112,1 14,7 10,1 12,4 43,0 9,1 6,2 7,7 61,5 R. S. 37 w III A 102,3 13,6 10,0 11,8 40,5 8,4 6,3 7,3 62,3 Z. C. 58 m III A 84,9 12,9 8,8 10,8 32,1 8,1 5,2 6,6 61,3 A. S. 59 m III A 89,6 12,9 9,3 11,1 32,0 7,6 5,5 6,5 58,9 W.K. 63 m III B 96,7 13,4 9,6 11,5 34,3 7,9 5,7 6,8 59,2 H. T. 65 m * 130,8 15,7 10,9 13,3 54,0 10,0 7,0 8,5 63,7 101,8 14,1 9,7 11,9 36,5 8,3 5,7 7,0 59,4 4,1 0,3 0,2 0,2 1,5 0,2 0,1 0,1 0,9 101,5 14,4 9,5 11,9 34,7 8,2 5,7 6,8 60,2 Mittelwert Standardfehler Median * *zu diesen Patienten lagen keine klinischen Daten vor PE prä Stad. Pat. D DMax DMin DMittel KPR =Plattenepithelkarzinom =prätherapeutisch =Stadium =Patient =Durchmesser =maximaler Durchmesser =minimaler Durchmesser =mittlerer Durchmesser =Kern-Plasma-Relation 33 Der Mittelwert der Zellflächen aller 18 Patienten Plattenepithelkarzinomen betrug 101,8 + 4,1 µm² (Median 101,5). Die Spannweite lag zwischen 69,6 µm² und 130,8 µm². (+ Standardfehler) mit Der Mittelwert des maximalen Durchmessers betrug 14,1 + 0,3 µm (Median 14,4). Die maximalen Durchmesser lagen zwischen 11,7 µm und 15,9 µm. Der kleinste Zelldurchmesser lag zwischen 8,1 µm und 11,0 µm und wurde bei einem Mittelwert von 9,7 + 0,2 µm (Median 9,5) ermittelt. Aus dem maximalen und minimalen Zelldurchmesser wurde der mittlere Durchmesser von 11,9 + 0,2 µm (Median 11,9) errechnet, der zusammen mit dem mittleren Kerndurchmesser zur Ermittlung der Kern-Plasma-Relation (KPR) herangezogen wurde. Die Meßergebnisse zeigten für die Kernfläche einen Mittelwert von 36,5 + 1,5 µm² mit einem Median von 34,7 µm². Die einzelnen Flächen streuten dabei zwischen 26,9 µm² und 54,0 µm². Der maximale Kerndurchmesser betrug im Mittel 8,3 + 0,2 µm (Median 8,2), hierbei lagen die Werte zwischen 7,1 µm als kleinstem und 10,0 µm als größtem Wert. Der Mittelwert des minimalen Durchmessers wurde mit 5,7 + 0,1 µm (Median 5,7) bei einer Streuung zwischen 5,0 µm und 7,0 µm ermittelt. Der für die Erhebung der KPR benötigte mittlere Kerndurchmesser betrug 7,0 + 0,1 µm, Median 6,8 µm. Hierbei streuten die Meßergebnisse zwischen 6,0 µm und 8,5 µm. Nach Bestimmung der Kern-Plasma-Relation jedes Patienten, ergab sich für die gesamte Patientengruppe Plattenepithelkarzinom eine durchschnittliche KPR von 59,4 + 0,9% (Median 60,2). Die einzelnen KPR lagen in einem Bereich von 51,6% bis 64,9%. Es zeigte sich, daß die Größe der Tumorzellen keine Rückschlüsse auf die Kerngröße zuläßt. Bei einigen Patienten wurden große Zellen ermittelt, deren mittlere Zelldurchmesser über dem Mittelwert des Kollektivs lagen (Bsp. K.R., H.S.). Die Werte der mittleren Kerndurchmesser lagen bei diesen Patienten unterhalb des Mittelwertes aller 24 Patienten, so daß sich dieses Größenverhältnis in einer geringen Kern-Plasma-Relation von 51,6% bzw. 53,1% widerspiegelt. Hingegen zeigte sich bei dem Pat. H.T. mit dem größten Zelldurchmesser des Kollektivs, auch ein hoher Kernanteil von 63,7%. In der Gruppe der 24 Patienten konnte bei Patienten mit Zelldurchmessern unterhalb des Mittelwertes gleichermaßen hohe Kern-Plasma-Relationen (z.B. E.B. 64,9%, Z.C. 61,3%) wie verminderte KPR (Bsp. G.O. 56,6%) beobachtet werden. 34 Eine Korrelation zwischen Zellgrößen und Erkrankungsstadium ist nicht erkennbar. In der Patientengruppe im Stadium III A waren Gewebe mit großen (Beispiel 126,2 µm²) und mit kleinen Zellflächen (Beispiel 78,6 µm²) gleichermaßen vertreten. In der Gruppe der Patienten im Stadium III B war ebenfalls diesbezüglich keine einheitlich gerichtete Tendenz erkennbar. Von 2 Patienten lagen keine klinischen Daten vor, so daß eine Beurteilung bezüglich des Erkrankungsstadiums hier nicht erfolgen kann. 4.2.2. Plattenepithelkarzinome, posttherapeutisch Die Operationsresektate wurden unter den gleichen Gesichtspunkten wie die prätherapeutisch gewonnenen Biopsate untersucht. Vor den morphometrischen Messungen wurde das entnommene Gewebe hinsichtlich spontaner oder therapieinduzierter Tumorregression mikroskopisch beurteilt und dem entsprechenden Regressionsgrad (RG) zugeordnet. Die einzelnen RG sind den Patientendaten in der folgenden Tabelle hinzugefügt. In dieser Gruppe konnten bei 2 Patienten nur geringe, spontane Rückbildungsphänomene des Tumorgewebes beobachtet werden und sind daher RG I zugeordnet. Vier Patienten zeigten Zeichen der therapieinduzierten Regression mit mehr als 10% vitalem Tumorgewebe, entsprechend RG II A. Der größte Anteil der Gruppe mit 12 Patienten zeigte unter der Kombinationstherapie Tumorregressionszeichen, die eindeutig auf die durchgeführte Behandlung zurückzuführen sind, mit weniger als 10% vitalem Tumorgewebe und entsprechen demnach RG II B. Die Messungen der Tumorzellen nach neoadjuvanter Therapie zeigten folgende Ergebnisse: 35 Tab. 6: Meßergebnisse der Plattenepithelkarzinome, posttherapeutisch: PE - post Zelle Kern KPR Pat. Alter m/w Stad. RG Fläche DMax DMin DMittel Fläche DMax DMin DMittel (µm²) (µm) (µm) (µm) (µm²) (µm) (µm) (µm) % W. B. 67 m III A II B 128,3 16,4 10,7 13,5 40,3 8,6 6,2 7,4 54,8 E. K. 51 m III A II B 107,1 14,6 10,0 12,3 39,0 9,0 5,8 7,4 60,3 K. R. 61 m II B 139,4 17,3 10,8 14,0 42,3 8,9 6,1 7,5 53,6 H. S. 52 m III A II B 78,7 12,3 8,6 10,5 25,2 7,0 4,8 5,9 56,2 G. O. 69 m III A 81,3 12,8 8,7 10,7 27,7 7,3 5,1 6,2 57,5 D. D. 57 m III A II B 113,1 15,2 10,1 12,6 40,9 8,9 6,1 7,5 59,5 E. L. 65 m III A II B 93,4 14,2 8,9 11,5 29,7 7,6 5,2 6,4 55,3 W.H. 43 m III B 105,2 14,1 10,0 12,0 43,7 9,0 6,3 7,6 63,4 A.W. 65 m III B II B 58,7 10,7 7,3 9,0 21,0 6,2 4,5 5,3 59,1 G. H. 45 m III A II B 97,6 13,2 9,7 11,5 40,5 8,6 6,1 7,4 64,3 H. L. 58 m III A II A 95,9 13,7 9,4 11,5 41,5 8,9 6,1 7,5 64,7 E. B. 59 m III A II A 87,3 12,7 9,1 10,9 33,0 7,6 5,6 6,6 60,2 U.W. 37 m III B II A 96,0 13,4 9,3 11,4 38,4 8,3 5,8 7,1 62,4 R. S. 37 w III A II B 68,9 11,2 8,2 9,7 20,7 6,1 4,4 5,2 54,2 Z. C. 58 m III A II B 80,1 12,4 8,7 10,5 22,9 6,5 4,6 5,6 52,8 A. S. 59 m III A II B 144,9 15,6 10,9 13,2 40,3 8,4 6,0 7,2 54,2 W.K. 63 m III B II B 82,4 12,5 8,7 10,6 26,2 6,7 5,1 5,9 56,0 H. T. 65 m II A 134,7 16,1 10,9 13,5 54,1 9,9 7,1 8,5 62,8 Mittelwert 99,6 13,8 9,4 11,6 34,8 8,0 5,6 6,8 58,4 Standardfehler 5,8 0,4 0,2 0,3 2,2 0,3 0,2 0,2 0,9 Median 95,9 13,6 9,3 11,5 38,7 8,4 5,8 7,1 58,3 * * I I *zu diesen Patienten lagen keine klinischen Daten vor PE post Pat. Stad. RG D DMax DMin DMittel KPR =Plattenepithelkarzinom =posttherapeutisch =Patient =Stadium =Regressionsgrad =Durchmesser =maximaler Durchmesser =minimaler Durchmesser =mittlerer Durchmesser =Kern-Plasma-Relation 36 Nach Therapie betrug der Mittelwert aller Zellflächen 99,6 + 5,8 µm² (Median 95,9), bei einer Spannweite zwischen 58,7 µm² und 144,9 µm². Somit verringerte sich die Zellfläche um im Mittel 2,2 µm² im Vergleich zur prätherapeutisch ermittelten Fläche von 101,8 µm². Hierbei zeigt sich, mit unbehandeltem Gewebe verglichen, eine größere Streuung um den Mittelwert als zuvor. Maximaler, minimaler und mittlerer Durchmesser lagen mit Werten von 13,8 + 0,4 µm (Median 13,6), 9,4 + 0,2 µm (Median 9,3) und 11,6 + 0,3 µm (Median 11,5) nur geringfügig unter den prätherapeutischen Vergleichswerten. Eine ähnliche Entwicklung zeigte der Zellkern mit einer Verringerung der Kernfläche um 1,6 µm² auf 34,8 + 2,2 µm² (Median 38,7). Hier betrug die kleinste Fläche 20,7 µm² und 54,1 µm² die größte Kernfläche. Für den maximalen, minimalen und mittleren Kerndurchmesser wurden Werte von 8,0 + 0,3 µm (Median 8,4), 5,6 + 0,2 µm (Median 5,8) und 6,8 + 0,2 µm (Median 7,1) ermittelt, die somit unterhalb des prätherapeutisch gemessenen Niveaus lagen. Folglich reduzierte sich der Kernanteil nach Therapie im Mittel um 1% auf 58,4 + 0,9% (Median 58,3) und streute zwischen dem kleinsten Wert von 52,8% und dem größten Wert von 63,4%. 4.2.3. Vergleich der prä- und posttherapeutischen Meßergebnisse Untersuchungen, die der Plattenepithelkarzinome Nach Abschluß posttherapeutischen der morphometrischen Ergebnisse der wurden prä- und Tumorzellen und Zellkerne im Hinblick auf Größenveränderungen miteinander verglichen und analysiert. In der folgenden Tabelle sind die prä-/post-Meßergebnisse der Zell- Kerndurchmessers und der und Kernflächen, des mittleren Zell- Kern-Plasma-Relation und der einzelnen Patienten einander gegenübergestellt und die entsprechenden Veränderungen dokumentiert. Bei vergleichender Betrachtung der prä- und posttherapeutischen Ergebnisse der einzelnen Patienten zeigt sich bezüglich der morphologischen Veränderungen von Zelle und Kern ein deutlicher Polymorphismus. 37 Tab. 6a: Vergleich der Meßergebnisse der Plattenepithelkarzinome prä/post: PE - prä/post Zellfläche Pat. Alter m/w Stad. RG Kernfläche prä post Veränd. prä post Veränd. (µm²) (µm²) (µm²) (µm²) (µm²) (µm²) W. B. 67 m III A II B 126,2 128,3 2,0 42,3 40,3 -2,0 E. K. 51 m III A II B 126,2 107,1 -19,1 36,7 39,0 2,4 K. R. 61 m II B 120,4 139,4 19,0 33,6 42,3 8,7 H. S. 52 m III A II B 116,9 78,7 -38,2 32,8 25,2 -7,6 G. O. 69 m III A 98,4 81,3 -17,1 34,0 27,7 -6,3 D. D. 57 m III A II B 101,1 113,1 11,9 38,7 40,9 2,2 E. L. 65 m III A II B 91,2 93,4 2,2 32,0 29,7 -2,3 W. H. 43 m III B 69,6 105,2 35,5 26,9 43,7 16,8 A. W. 65 m III B II B 102,2 58,7 -43,5 42,3 21,0 -21,3 G. H. 45 m III A II B 101,8 97,6 -4,2 37,7 40,5 2,7 H. L. 58 m III A II A 78,6 95,9 17,4 28,6 41,5 12,9 E. B. 59 m III A II A 82,7 87,3 4,6 35,1 33,0 -2,0 U. W. 37 m III B II A 112,1 96,0 -16,1 43,0 38,4 -4,6 R. S. 37 w III A II B 102,3 68,9 -33,5 40,5 20,7 -19,9 Z. C. 58 m III A II B 84,9 80,1 -4,8 32,1 22,9 -9,2 A. S. 59 m III A II B 89,6 144,9 55,3 32,0 40,3 8,3 W. K. 63 m III B II B 96,7 82,4 -14,3 34,3 26,2 -8,0 H. T. 65 m II A 130,8 134,7 3,9 54,0 54,1 0,1 101,8 99,6 -2,2 36,5 34,8 -1,6 4,1 5,8 5,9 1,5 2,2 2,4 101,5 95,9 -1,1 34,7 38,7 -2,0 * * I I Mittelwert Standardfe hler Median PE prä post Pat. Stad. RG Veränd. =Plattenepithelkarzinom =prätherapeutisch =posttherapeutisch =Patient =Stadium =Regressionsgrad =Größenveränderung 38 Tab. 6b: Vergleich der Meßergebnisse der Plattenepithelkarzinome prä/post: PE - prä/post Pat. Alter m/w Stad. RG Zell- Kern- KPR KPR durchmesserMittel durchmesserMittel % % prä post Veränd. prä post Veränd. prä post (µm) (µm) (µm) (µm) (µm) (µm) W. B. 67 m III A II B 13,2 13,5 0,3 7,6 7,4 -0,1 57,3 54,8 E. K. 51 m III A II B 13,3 12,3 -1,0 7,1 7,4 0,3 53,4 60,3 K. R. 61 m II B 13,2 14,0 0,9 6,8 7,5 0,7 51,6 53,6 H. S. 52 m III A II B 12,6 10,5 -2,1 6,7 5,9 -0,8 53,1 56,2 G. O. 70 m III A 12,0 10,7 -1,2 6,8 6,2 -0,6 56,6 57,5 D. D. 57 m III A II B 11,9 12,6 0,7 7,3 7,5 0,2 61,4 59,5 E. L. 65 m III A II B 11,3 11,5 0,3 6,6 6,4 -0,3 58,9 55,3 W. H. 43 m III B 9,9 12,0 2,1 6,0 7,6 1,6 60,8 63,4 A. W. 65 m III B II B 12,0 9,0 -3,0 7,6 5,3 -2,3 63,3 59,1 G. H. 45 m III A II B 11,9 11,5 -0,4 7,3 7,4 0,1 60,9 64,3 H. L. 58 m III A II A 10,5 11,5 1,1 6,2 7,5 1,3 59,5 64,7 E. B. 59 m III A II A 10,6 10,9 0,3 6,9 6,6 -0,3 64,9 60,2 U. W. 37 m III B II A 12,4 11,4 -1,1 7,7 7,1 -0,6 61,5 62,4 R. S. 37 w III A II B 11,8 9,7 -2,1 7,3 5,2 -2,1 62,3 54,2 Z. C. 58 m III A II B 10,8 10,5 -0,3 6,6 5,6 -1,1 61,3 52,8 A. S. 59 m III A II B 11,1 13,2 2,1 6,5 7,2 0,6 58,9 54,2 W. K. 63 m III B II B 11,5 10,6 -0,9 6,8 5,9 -0,9 59,2 56,0 H. T. 65 m 13,3 13,5 0,2 8,5 8,5 0,0 63,7 62,8 Mittelwert 11,9 11,6 -0,3 7,0 6,8 -0,2 59,4 58,4 Standardfehler 0,2 0,3 0,3 0,1 0,2 0,2 0,9 0,9 Median 11,9 11,5 0,0 6,8 7,1 -0,2 60,2 58,3 * * I I II A *zu diesen Patienten lagen keine klinischen Daten vor PE prä post Pat. Stad. RG Veränd. KPR =Plattenepithelkarzinom =prätherapeutisch =posttherapeutisch =Patient =Stadium =Regressionsgrad =Größenveränderung =Kern-Plasma-Relation 39 Bei vergleichender Betrachtung der prä- und posttherapeutischen Mittelwerte der Zellflächen der Plattenepithelkarzinome ist nach Therapie eine Verringerung um 2,2 µm² auf 99,6 µm² erkennbar. Die Hälfte der Studienpatienten (E.K., H.S., G.O., A.W., G.H., U.W., R.S., Z.C., W.K.) zeigt nach Therapie eine Verringerung der Zellfläche um minimal 4,2 µm², maximal 43,5 µm², dies entspricht einer prozentualen Abnahme der Zellgröße zwischen 4% und 43%. Hiervon zeigen sieben Patienten Patienten eine Flächenminderung von mehr als 10%, zwei liegen mit 4% unter diesem Niveau. In den Tumorgeweben der anderen 9 Patienten war eine Flächenzunahme in minimaler Größenordnung von 2,0 µm² und maximal 55,3 µm², was prozentualen Zuwächsen von 2% bis zu 62% entspricht, festzustellen. Nach Abschluß der Messungen wurden die Ergebnisse der Größenveränderungen mit Hilfe des t-Test für abhängige Variablen statistisch untersucht. Für die Zellflächen konnte eine signifikante Größenveränderung nicht festgestellt werden (p=0,72). Der Mittelwert der posttherapeutisch gemessenen Kernflächen nimmt, im Vergleich zum prätherapeutischen MW, um 1,6 µm² ab, dies entspricht nicht einer signifikanten Kernflächenverminderung (p=0,50). Bei insgesamt 10 Patienten verringert sich die Kernfläche prozentual zwischen 4 und 50%, in Werten zwischen 2,0 und 21,3 µm². Das Ausmaß der beschriebenen Größenminderung prozentualen in Anteilen von Hundert ist hierbei dem zuvor Ausmaß der Zellflächenminderung vergleichbar. Eine Kernvergrößerung zeigte sich bei 8 Patienten zwischen 0,1 bzw. 2,2 µm² bis zu 16,8 µm², entspricht einer Zunahme um 6% bis 62%, bezogen auf den Ausgangswert. Innerhalb des Kollektivs der 18 Patienten mit Plattenepithelkarzinomen lassen sich bei Vergleich der prä- und posttherapeutisch gemessenen Parameter drei unterschiedliche Gruppen aufzeigen. Die erste Gruppe umfasst 7 Patienten, denen eine simultane Verkleinerung der Tumorzellen und -kerne in unterschiedlichem Ausmaß gemeinsam ist. Eine weitere Gruppe von 6 Patienten zeigt gleichsinnige Veränderungen der Zellen und Kerne in Form von Vergrößerung, während in einer 5 Patienten umfassenden Gruppe gegensinnige Veränderungen von Zellen und Kernen beobachtet werden konnten. Für eine detaillierte Untersuchung dieser unterschiedlichen Entwicklungsrichtungen werden die Veränderungen der Tumorzellen und Zellkerne, sowie deren Einfluß auf die Kern-Plasma40 Relation, im Folgenden, getrennt nach Flächen und Durchmesser, für die zuvor beschriebenen Gruppen, aufgeführt. Eine simultane Flächenminderung von Zelle und Kern zeigt sich bei sieben Patienten (H.S., G.O., A.W., U.W., R.S., Z.C., W.K.). Dabei nehmen Zell- und Kernflächen in unterschiedlich starkem Ausmaß ab, wie aus der folgenden Tabelle zu entnehmen ist. Vier dieser Patienten befanden sich im Stadium III A, hiervon zeigten 3 Patienten Regressionszeichen gemäß RG II B, ein Patient zeigte lediglich spontane Regressionszeichen (RG I). Drei Patienten mit Zell- und Kernflächenminderung befanden sich im Tumorstadium III B, das Resttumorgewebe von 2 dieser Patienten wurde dem RG II B, bei einem Patienten dem RG II A zugeordnet. 41 Tab. 7: Übersicht über die Gruppe von Patienten mit Plattenepithelkarzinomen mit posttherapeutisch simultaner Zell- und Kernflächenreduktion: Pat. Alter m/w Stad. RG Veränderung Veränderung Zellfläche (µm²) Kernfläche(µm²) H. S. 52 m III A II B -38,2 -7,6 G. O. 69 m III A I -17,1 -6,3 A. W. 65 m III B II B -43,5 -21,3 U. W. 37 m III B II A -16,1 -4,6 R. S. 37 w III A II B -33,5 -19,9 Z. C. 58 m III A II B -4,8 -9,2 W. K. 63 m III B II B -14,3 -8,0 Pat.=Patient, Stad.=Stadium, RG=Regressionsgrad In der folgenden Abbildung sind diese Veränderungen der Zell- und Kernflächen in prozentualen Werten graphisch dargestellt. Veränderungen in % 0% -6% -10% -11% -14% -15% -17% -18% -20% -23% -23% -30% -29% -33% -33% Zellfläche Kernfläche -40% -43% -50% -49% -50% H. S. G. O. A. W. U. W. R. S. Z. C. W. K. Patienten Abb. 3: Quantitative Auswertung der posttherapeutischen Zellveränderungen bei Patienten mit Plattenepithelkarzinomen mit simultaner Zell- und Kernflächenreduktion im Vergleich zu den prätherapeutischen Ausgangswerten in Prozent 42 Gleichgerichtete Veränderungen, im Sinne einer Zunahme von Zell- und Kernfläche, zeigte sich bei 6 Patienten, bei dem Patienten H.T. war die Zunahme der Kernfläche mit 0,1 µm² jedoch minimal. Tab. 8: Übersicht über die Gruppe von Patienten mit Plattenepithelkarzinomen mit posttherapeutisch simultaner Zell- und Kernflächenzunahme: Pat. Alter m/w Stad. RG Veränderung Veränderung Zellfläche (µm²) Kernfläche(µm²) K. R. 61 m * II B +19,0 +8,7 W. H. 43 m III B I +35,5 +16,8 D. D. 57 m III A II B +11,9 +2,2 H. L. 58 m III A II A +17,4 +12,9 A. S. 59 m III A II B +55,3 +8,3 H. T. 65 m * II A +3,9 +0,1 * zu diesen Patienten lagen keine klinischen Daten vor Pat.=Patient, Stad.=Stadium, RG=Regressionsgrad 70% 62% Veränderungen in % 60% 62% 51% 45% 50% 40% 26% 30% Zellfläche 26% 22% 18% Kernfläche 20% 12% 6% 10% 3% 0% 0% K. R. W. H. D. D. H. L. A. S. H. T. Patienten Abb. 4: Quantitative Auswertung der posttherapeutischen Zellveränderungen bei Patienten mit Plattenepithelkarzinomen mit simultaner Zell- und Vergleich zu den prätherapeutischen Ausgangswerten in Prozent 43 Kernflächenvergrößerung im Es ist zu erkennen, daß das Ausmaß der ansteigenden Flächen deutlich divergiert zwischen 3,9 µm² bei dem Patienten H.T. und 55,3 µm² als maximale Zellflächenzunahme bei dem Patienten A.S. Bemerkenswert ist, daß der höchste Kernflächenzuwachs nicht bei dem Patienten A.S., sondern bei dem Patienten W.H. mit 16,8 µm², bei Zellflächenzunahme um 35,5 µm², zu beobachten ist. Diesen Patienten ist das zytologische Merkmal der Flächenzunahme nach Chemo- und Strahlentherapie gemeinsam, Rückschlüsse auf den Regressionsgrad können hier jedoch nicht gezogen werden. Ein Patient (W.H.) zeigte lediglich spontan zu wertende Regressionszeichen, das Gewebe der Patienten H.L. und H.T. wurde gemäß den üblichen Kriterien mit RG II A, das Gewebe der Patienten K.R., D.D. und A.S. mit RG II B beurteilt. Bei folgenden 5 Patienten war eine gegensinnige Größenentwicklung von Zelle und Kern zu beobachten. Die Patienten W.B., E.L., E.B. wiesen posttherapeutisch zwischen 2,0 µm² und 4,6 µm² vergrößerte Zellflächen auf, währenddessen sich die Kernfläche um 2,0 µm² bis 2,3 µm² verminderte. Bei den Patienten E.K. und G.H. hingegen waren um 4,2 µm² bzw. 19,1 µm² verkleinerte Zellflächen, bei vergrößerten Kernflächen (2,4 µm² und 2,7 µm²) zu beobachten. In dieser Gruppe befanden sich alle Patienten im Stadium III A. Die Resttumorgewebe wurden bei 4 Patienten gemäß Regressionsgrad beurteilt. 44 II B, bei 1 Patienten gemäß RG II A Abb. 5: Posttherapeutisch regressiv verändertes Plattenepithelkarzinom mit deutlich aufgetriebenem Zytoplasma (HE-Färbung) Abb. 6: Nach Radio- und Chemotherapie regressiv verändertes Plattenepithelkarzinom mit vergrößerten, zum Teil bizarr geformten Zellkernen (HE-Färbung) 45 Tab. 9: Übersicht über die Gruppe von Patienten mit Plattenepithelkarzinomen mit posttherapeutisch gegensinniger Zell- und Kernflächenveränderung: Pat. Alter m/w Stad. RG Veränderung Veränderung Zellfläche (µm²) Kernfläche (µm²) W. B. 67 m III A II B +2,0 -2,0 E. L. 65 m III A II B +2,2 -2,3 E. B. 59 m III A II A +4,6 -2,0 E. K. 51 m III A II B -19,1 +2,4 G. H. 45 m III A II B -4,2 +2,7 Pat.=Patient, Stad.=Stadium, RG=Regressionsgrad 10% 6% Veränderungen in % 5% 2% 7% 6% 2% 0% -5% Zellfläche -4% -5% -7% -6% Kernfläche -10% -15% -15% W. B. E. L. E. B. E. K. G. H: Patienten Abb. 7: Quantitative Auswertung der posttherapeutischen Zellveränderungen bei Patienten mit Plattenepithelkarzinomen mit gegensinniger Veränderung von Zell- und Kernflächen im Vergleich zu den prätherapeutischen Ausgangswerten in Prozent 46 Die Größenveränderungen der Zell- und Kernflächen spiegeln sich in den Werten der mittleren Zell- und Kerndurchmesser wider und geben dadurch Auskunft über die Entwicklung der Kern-Plasma-Relation. Im Kollektiv der Plattenepithelkarzinome verringerte sich der Mittelwert der Zelldurchmesser von 11,9 µm prä-, auf 11,6 µm posttherapeutisch und entspricht einer nicht signifikanten Größenveränderung (p=0,49). Da der Mittelwert der Kerndurchmesser ebenfalls um 0,2 µm von 7,0 µm auf 6,8 µm abnahm, verminderte sich konsekutiv die KPR im Mittel um 1% auf 58,4%. Die posttherapeutische Verringerung des Kerndurchmessers ist statistisch nicht signifikant (p=0,34). Auch die Veränderung der Kern-Plasma-Relation lag außerhalb des Signifikanzbereichs (p=0,37). Die mittleren Zelldurchmesser dieser 7 Patienten verminderten sich nach Therapie zwischen 0,3 µm und 3,0 µm, bei simultaner Abnahme des Kerndurchmessers um minimal 0,3 µm und maximal 2,3 µm. Durch eine prozentual deutlichere Kernverkleinerung, nahm die Kern-Plasma-Relation bei den Patienten A.W., R.S., Z.C. und W.K. zwischen 3,2% und 8,5% ab, während bei den Patienten H.S., G.O. und U.W. ein um 0,9% bzw. 3,1% steigender Kernanteil festzustellen war. Die anschließende Übersicht zeigt die Veränderungen der Zell- und Kerndurchmesser der Patientengruppe, die posttherapeutisch verkleinerte Zell- und Kernflächen aufwiesen. 47 Tab. 10: Übersicht über die Gruppe von Patienten mit Plattenepithelkarzinomen mit posttherapeutisch simultaner Zell- und Kerndurchmesserreduktion: Pat. Alter m/w Stad. RG Veränderung Veränderung Zelldurchmesser Kerndurchmesser Veränd. KPR (µm) (µm) (%) H. S. 52 m III A II B -2,1 -0,3 +3,1 G. O. 70 m III A I -1,2 -0,6 +0,9 U. W. 37 m III B II A -1,1 -0,6 +0,9 A. W. 65 m III B II B -3,0 -2,3 -4,2 R. S. 37 w III A II B -2,1 -2,1 -8,1 Z. C. 58 m III A II B -0,3 -1,1 -8,5 W. K. 63 m III B II B -0,9 -0,3 -3,2 Pat.=Patient, Stad.=Stadium, RG=Regressionsgrad, KPR=Kern-Plasma-Relation 0% -3% Veränderungen in % -5% -7% -10% -15% -10% -9% -8% -9% -12% -13% -16% -20% -25% -17% -18% -25% -30% Zelldurchmesser Kerndurchmesser -29% -30% H. S. G. O. A. W. U. W. R. S. Z. C. W. K. Patienten Abb. 8: Quantitative Auswertung der posttherapeutischen Zellveränderungen bei Patienten mit Plattenepithelkarzinomen mit simultaner Abnahme der Zell- und Kerndurchmesser im Vergleich zu den prätherapeutischen Ausgangswerten in Prozent 48 Bei folgenden 6 Patienten mit posttherapeutischer Zell- und Kernflächenvergrößerung zeigte sich eine Erhöhung der Zelldurchmesser um Werte zwischen 0,2 µm und 2,1 µm und der Kerndurchmesser zwischen 0,2 µm und 1,6 µm. Eine Ausnahme war bei dem Patienten H.T. mit posttherapeutisch unverändertem Kerndurchmesser, bei um 0,2 µm vergrößertem Zelldurchmesser, zu beobachten. Tab. 11: Übersicht über die Gruppe von Patienten mit Plattenepithelkarzinomen mit posttherapeutisch simultaner Zell- und Kerndurchmesserzunahme: Pat. Alter m/w Stad. RG Veränderung Veränderung Zelldurchmesser Kerndurchmesser Veränd. KPR (µm) (µm) (%) K. R. 61 m * II B +0,9 +0,7 +2,0 W. H. 43 m III B I +2,1 +1,6 +2,6 D. D. 57 m III A II B +0,7 +0,2 -1,9 H. L. 58 m III A II A +1,1 +1,3 -5,2 A. S. 59 m III A II B +2,1 +0,6 -4,7 H. T. 65 m * II A +0,2 +0,0 -0,9 *zu diesen Patienten lagen keine klinischen Daten vor Pat.=Patient, Stad.=Stadium, RG=Regressionsgrad, KPR=Kern-Plasma-Relation 30% 26% 25% Veränderungen in % 21% 20% 19% 20% 15% 11% 10% 10% Zelldurchmesser 10% Kerndurchmesser 6% 6% 5% 3% 2% 0% 0% K. R. W. H. D. D. H. L. A. S. H. T. Patienten Abb. 9: Quantitative Auswertung der posttherapeutischen Zellveränderungen bei Patienten mit Plattenepithelkarzinomen mit simultaner Vergrößerung der Zell- und Kerndurchmesser 49 im Vergleich zu den prätherapeutischen Ausgangswerten in Prozent Bei zwei Patienten (K.R., W.H.) führte der zunehmende Kerndurchmesser gleichzeitig zu einer um 2,0% bzw. 2,6% ansteigenden Kern-Plasma-Relation. Die KPR sank bei den anderen 4 Patienten dieser Gruppe um Werte zwischen 0,9% und 5,2%, trotz simultaner posttherapeutischer Zell- und Kernvergrößerung. Gegensinnige Veränderungen der Zell- und Kerndurchmesser zeigten sich, wie aus der folgenden Tabelle zu entnehmen, bei 5 Patienten. Bei den Patienten W.B., E.L. und E.B. zeigten sich nach Kombinationstherapie im Durchmesser um 0,3 µm vergrößerte Zellen, bei gleichzeitig um 0,1 µm bis 0,3 µm verminderten Kerndurchmessern. Diese morphologischen Veränderungen hatten eine Verminderung des Kernanteils am Zelldurchmesser um 2,5%, 3,6% und 4,7% zur Konsequenz. Ein Anstieg der KPR war bei den Patienten E.K. und G.H. durch zunehmende Zellkerne um 0,1 µm bzw. 0,3 µm zu beobachten, während die Tumorzellen sich im Durchmesser um 0,4 µm bis 1,0 µm verminderten. 50 Tab. 12: Übersicht über die Gruppe von Patienten mit Plattenepithelkarzinomen mit posttherapeutisch gegensinniger Zell- und Kerndurchmesserveränderung: Pat. Alter m/w Stad. RG Veränderung Veränderung Zelldurchmesser Kerndurchmesser Veränd. KPR (µm) (µm) (%) W. B. 67 m III A II B +0,3 -0,1 -2,5 E. L. 65 m III A II B +0,3 -0,3 -3,6 E. B. 59 m III A II A +0,3 -0,3 -4,7 E. K. 51 m III A II B -1,0 +0,3 +6,9 G. H. 45 m III A II B -0,4 +0,1 +3,4 Pat.=Patient, Stad.=Stadium, RG=Regressionsgrad, KPR=Kern-Plasma-Relation 4% 3% 3% 4% 3% 2% Veränderungen in % 2% 0% -2% -2% Zelldurchmesser Kerndurchmesser -4% -4% -4% -4% -6% -8% -8% W. B. E. L. E. B. E. K. G. H: Patienten Abb. 10: Quantitative Auswertung der posttherapeutischen Zellveränderungen bei Patienten mit Plattenepithelkarzinomen mit gegensinniger Veränderung der Zell- und Kerndurchmesser im Vergleich zu den prätherapeutischen Ausgangswerten in Prozent 51 Der mittlere Zelldurchmesser verringerte sich insgesamt in 9 Fällen mit verminderter Zellfläche mit einer Spannbreite zwischen 0,3 µm und 3,0 µm. Bei den anderen 9 Patienten der Gruppe mit Plattenepithelkarzinomen nahm der mittlere Zelldurchmesser zwischen 0,3 µm und 2,1 µm zu. Eine Verringerung des Kerndurchmessers um minimal 0,1 µm, maximal 2,3 µm, zeigte sich bei den bereits mit abnehmender Kernfläche beschriebenen 10 Patienten, während sich bei 7 Patienten eine Zunahme des Kerndurchmessers bis 1,6 µm zeigte und bei einem Patienten keine Veränderung zu beobachten war. Hieraus resultiert eine steigende Kern-Plasma-Relation zwischen 0,9 und 6,9%. Die Kern-Plasma-Relation nahm bei 11 Patienten im Vergleich zur prätherapeutisch ermittelten KPR zwischen 0,9% und 8,5% ab. Hierfür liegen drei Ursachen vor: 1. Abnehmender Kerndurchmesser, gleichzeitig steigender Zelldurchmesser wie in den Beispielen W.B., E.L., E.B. 2. Prozentual stärkere Zunahme des Zelldurchmessers im Vergleich zum Kerndurchmesser wie bei D.D., A.S., H.T. 3. Verringerung beider Parameter, wobei der Anteil des Zelldurchmessers gegenüber dem Kern überwiegt, Beispiele A.W., R.S., Z.C., W.K. Die vorliegenden Ergebnisse veranschaulichen deutlich, die unterschiedliche Entwicklung der Tumorzellen dieser Plattenepithelkarzinome Chemotherapie. 52 nach kombinierter Radio- und 4.3. Meßergebnisse der Adenokarzinome 4.3.1. Adenokarzinome, prätherapeutisch Bei der Patientengruppe mit Adenokarzinomen handelte es sich um 5 Patienten und eine Patientin, im Alter zwischen 51 und 64 Jahren. Zwei Patienten befanden sich im Erkrankungsstadium III A, 4 Patienten im Stadium III B. Aus der folgenden Tabelle sind die Patienten bezogenen Daten wie Alter, Geschlecht, Erkrankungsstadium und die Ergebnisse der prätherapeutischen Messungen von Zellfläche und -durchmesser, Kernfläche und -durchmesser, sowie die Kern-Plasma-Relation zu entnehmen. Tab. 13: Meßergebnisse Adenokarzinome, prätherapeutisch: Adeno - prä Zelle Kern KPR Pat. Alter m/w Stad. Fläche DMax DMin DMittel Fläche DMax DMin DMittel (µm²) (µm) (µm) (µm) (µm²) (µm) (µm) (µm) % R.T. 58 m III B 130,7 17,6 10,4 14,0 29,7 8,0 4,9 6,4 45,8 A.W. 64 m III A 176,2 20,8 11,9 16,4 44,5 10,2 5,9 8,0 49,1 K.M. 60 m III A 93,4 14,5 8,7 11,6 39,2 9,3 5,6 7,4 63,8 H.U. 52 m III B 70,6 11,8 8,0 9,9 26,5 7,1 4,9 6,0 60,6 W.O. 61 m III B 71,0 11,5 8,2 9,9 28,9 7,5 5,1 6,3 63,7 I.W. 51 w III B 89,5 12,8 9,2 11,0 34,5 7,8 5,6 6,7 60,9 Mittelwert 105,2 14,8 9,4 12,1 33,9 8,3 5,3 6,8 57,3 Standardfehler 16,8 1,5 0,6 1,1 2,8 0,5 0,2 0,3 3,2 Median 91,5 13,6 9,0 11,3 32,1 7,9 5,3 6,6 60,8 Adeno prä Stad. Pat. D DMax DMin DMittel KPR =Adenokarzinom =prätherapeutisch =Stadium =Patient =Durchmesser =maximaler Durchmesser =minimaler Durchmesser =mittlerer Durchmesser =Kern-Plasma-Relation 53 Die Zellflächen der 6 Patienten betrugen im Mittel 105,2 + 16,8 µm² (Median 91,5). Innerhalb dieser Gruppe zeigte sich eine große Streubreite mit Werten zwischen 70,6 µm² und 176,2 µm². Dabei wiesen die Patienten R.T. und A.W. mit 130,7 µm² und 176,2 µm² durchschnittlich sehr große Zellen auf, während die anderen 4 Patienten mit Ergebnissen zwischen 70,6 µm² (H.U.) und 93,4 µm² (K.M.) deutlich unterhalb des Mittelwertes lagen. Der maximale Zelldurchmesser streute dementsprechend zwischen 11,5 µm und 20,8 µm um den Mittelwert von 14,8 + 1,5 µm (Median 13,6). Der Mittelwert des minimalen Zelldurchmessers betrug 9,4 + 0,6 µm (Median 9,0), die Spannbreite lag zwischen 8,0 µm und 11,9 µm. Insgesamt ergab sich ein mittlerer Zelldurchmesser von 12,1 + 1,1 µm (Median 11,3), mit einer Streuung zwischen 9,9 µm und 16,4 µm. Bei der Untersuchung der Zellkerne, zeigte sich im Mittel eine Fläche von 33,9 + 2,8 µm² (Median 32,1), die kleinste Kernfläche betrug hier 26,5 µm², die größte 44,5 µm². Der maximale Kerndurchmesser schwankte zwischen 7,1 µm und 10,2 µm, dies entspricht einem Mittelwert von 8,3 + 0,5 µm (Median 7,9). Der Mittelwert des minimalen Durchmessers betrug 5,3 + 0,2 µm (Median 5,3), mit einer Spannbreite von 4,9 µm bis 5,9 µm. Für den mittleren Kerndurchmesser ergab sich ein Mittelwert von 6,8 + 0,3 µm (Median 6,6), bei entsprechender Streuung zwischen 6,0 µm und 8,0 µm. In vorliegendem Studienkollektiv nahm der Kerndurchmesser im Mittel einen Anteil von 57,3 + 3,2% (Median 60,8) vom Zelldurchmesser ein. Innerhalb dieser Patientengruppe zeigte sich eine breite Streuung der Kern-Plasma-Relation zwischen dem kleinsten Wert von 45,8% und dem größten Wert von 63,8%. Dabei fällt auf, daß 2 Patienten (R.T., A.T.) mit sehr großen Zelldurchmessern durch verhältnismäßig kleine Kerndurchmesser eine geringe KPR von 45,8% bzw. 49,1% aufweisen, während die KPR der anderen 4 Patienten dieser Gruppe zwischen 60,6% und 63,7% lagen. Bei Vergleich der Mittelwerte der Plattenepithelkarzinome mit den Adenokarzinomen zeigt sich ein Größenunterschied. Der Mittelwert der Zellfläche der Plattenepithelkarzinome lag mit 101,8 µm² unter dem Wert der Adenokarzinome mit 105,2 µm², der Wert der Kernflächen hingegen lag mit 36,5 µm² über dem Niveau der Adenokarzinome mit 33,9 µm². Dadurch läßt sich die um 2,1% höhere KPR bei den Plattenepithelkarzinomen erklären. 54 4.3.2. Adenokarzinome, posttherapeutisch Nach Therapie war bei den Adenokarzinomen eine deutliche Größenveränderung festzustellen: Tab. 14: Meßergebnisse Adenokarzinome, posttherapeutisch: Adeno-post Zelle Kern KPR Pat. Alter m/w Stad. RG Fläche DMax DMin DMittel Fläche DMax DMin DMittel (µm²) (µm) (µm) (µm) (µm²) (µm) (µm) (µm) % R.T. 58 m III B 192,9 18,8 11,6 15,2 54,3 10,3 6,9 8,6 56,7 A.W. 64 m III A II A 243,4 23,0 14,3 18,6 75,7 11,5 8,0 9,7 52,3 K.M. 60 m III A II B 119,8 16,1 9,8 12,9 46,3 9,6 6,3 7,9 61,2 H.U. 52 m III B II A 71,4 11,4 8,4 9,9 27,6 7,2 5,0 6,1 61,8 W.O. 61 m III B II B 82,9 12,4 8,6 10,5 29,3 7,4 5,1 6,2 58,9 I.W. 51 w III B II A 112,6 14,0 10,4 12,2 43,2 8,6 6,5 7,5 61,5 Mittelwert 137,2 15,9 10,5 13,2 46,1 9,1 6,3 7,7 58,8 Standardfehler 27,4 1,8 0,9 1,3 7,3 0,7 0,5 0,6 1,5 Median 116,2 15,0 10,1 12,6 44,7 9,1 6,4 7,7 60,1 Adeno post Stad. Pat. D DMax DMin DMittel KPR I =Adenokarzinom =posttherapeutisch =Stadium =Patient =Durchmesser =maximaler Durchmesser =minimaler Durchmesser =mittlerer Durchmesser =Kern-Plasma-Relation Bei allen Patienten mit Adenokarzinomen wurde posttherapeutisch eine zum Teil erhebliche Zellvergrößerung festgestellt. Der Mittelwert der Zellflächen betrug nach Therapie 137,2 + 27,4 µm² (Median 116,2), bei einer Streuung zwischen 71,4 µm² als kleinste und 243,4 µm² als größte ermittelte Fläche. Dementsprechend stieg der maximale Zelldurchmesser auf 15,9 + 1,8 µm (Median 15,0), der minimale auf 10,5 + 0,9 µm (Median 10,1) und der mittlere Durchmesser auf 13,2 + 1,3 µm (Median 12,6). Alle Patienten wiesen nach der Therapie in den Resektaten vergrößerte Kernflächen zwischen 27,6 µm² und 75,7 µm² auf. Daraus ergab sich ein Mittelwert von 46,1 + 7,3 µm² (Median 55 44,7). Der Mittelwert des maximalen Kerndurchmessers erhöhte sich auf 9,1 + 0,7 µm (Median 9,1), der minimale auf 6,3 + 0,5 µm (Median 6,4) und der mittlere Durchmesser auf 7,7 + 0,6 µm (Median 7,7). Die Kern-Plasma-Relation nahm um 1,5% auf 58,8 + 1,5% (Median 60,1) zu, was vor allem auf die steigenden Kerndurchmesser der Patienten R.T. und A.W. zurückzuführen ist. 4.3.3. Vergleich der prä- und posttherapeutischen Meßergebnisse der Adenokarzinome Bei den Adenokarzinomen war nach kombinierter Radio- und Polychemotherapie eine gleichsinnige Zunahme aller Parameter zu verzeichnen. Beim prä- und posttherapeutischen Vergleich der Adenokarzinomzellen zeigte sich eine homogene Zunahme der Mittelwerte aller Parameter, die sich bei eingehender Beobachtung der einzelnen Patienten bestätigt. Die deutliche Zunahme des Mittelwertes der Zellfläche um 32,0 µm² auf 137,2 µm², entspricht einem Anstieg von 30%. Im t-Test ergab sich mit einem p=0,034 ein signifikanter Größenunterschied. Für die Zellfläche lag die Größenzunahme der einzelnen Patienten bei minimal 0,9 µm² (Pat. H.U.) und maximal 67,2 µm² (Pat. A.W.). Die beiden Patienten R.T. und A.W., die bereits prätherapeutisch große Zellen aufwiesen, wiesen auch den höchsten Zuwachs mit 62,2 µm² und 67,2 µm² auf. Auch die Kernflächen der Adenokarzinome nahmen posttherapeutisch im Mittel um 12,2 µm² zu, dies entspricht einer Zunahme um 36%. Hierbei lagen die Veränderungen zwischen 0,4 µm² (W.O.) und 31,2 µm² (A.W.). Dieser Anstieg der Kernfläche liegt mit p=0,067 außerhalb des Signifikanzbereichs, zeigt jedoch eine deutliche Tendenz. 56 Tab. 15a: Vergleich der Meßergebnisse der Adenokarzinome, prä/post: Adeno - prä/post Zellfläche Pat. Alter m/w Stad. RG Kernfläche prä post Veränd. prä post Veränd. (µm²) (µm²) (µm²) (µm²) (µm²) (µm²) 130,7 192,9 62,2 29,7 54,3 24,6 III A II A 176,2 243,4 67,2 44,5 75,7 31,2 m III A II B 93,4 119,8 26,4 39,2 46,3 7,1 52 m III B II A 70,6 71,4 0,9 26,5 27,6 1,0 W.O. 61 m III B II B 71,0 82,9 11,9 28,9 29,3 0,4 I.W. 51 w III B II A 89,5 112,6 23,1 34,5 43,2 8,7 105,2 137,2 32,0 33,9 46,1 12,2 R.T. 58 m III B A.W. 64 m K.M. 60 H.U. I Mittelwert Standardfehler 16,8 27,4 11,0 2,8 7,3 5,2 Median 91,5 116,2 24,8 32,1 44,7 7,9 Tab. 15b: Vergleich der Meßergebnisse der Adenokarzinome, prä/post: Adeno - prä/post Pat. Alter m/w Stad. RG Kern- KPR KPR durchmesserMittel durchmesserMittel % % prä post prä post Veränd. prä post Veränd. (µm) (µm) (µm) (µm) (µm) (µm) 14,0 15,2 1,2 6,4 8,6 2,2 45,8 56,7 R.T. 58 m III B A.W. 64 m III A II A 16,4 18,6 2,3 8,0 9,7 1,7 49,1 52,3 K.M. 60 m III A II B 11,6 12,9 1,3 7,4 7,9 0,5 63,8 61,2 H.U. 52 m III B II A 9,9 9,9 0,0 6,0 6,1 0,1 60,6 61,8 W.O. 61 m III B II B 9,9 10,5 0,7 6,3 6,2 -0,1 63,7 58,9 I.W. 51 w III B II A 11,0 12,2 1,2 6,7 7,5 0,8 60,9 61,5 Mittelwert 12,1 13,2 1,1 6,8 7,7 0,9 57,3 58,8 Standardfehler 1,1 1,3 0,3 0,3 0,6 0,4 3,2 1,5 Median 11,3 12,6 1,2 6,6 7,7 0,7 60,8 60,1 Adeno prä post Pat. Stad. RG Veränd. KPR I Zell- =Adenokarzinom =prätherapeutisch =posttherapeutisch =Patient =Stadium =Regressionsgrad =Größenveränderung =Kern-Plasma-Relation 57 Es fällt auf, daß innerhalb der 6 Patienten eine Rangordnung bezogen auf die Größe der Zellfläche besteht, die auch bei Messungen nach Therapie bestand. Weiterhin ist zu erkennen, daß die Größenveränderungen eine Verhältnismäßigkeit aufweisen: die größten Zellen (Pat. A.W., R.T.) haben, bezogen auf die Zellfläche den prozentual höchsten Größenzuwachs (38%, 48%). Die kleineren Zellen (Pat. K.M., H.U., W.O., I.W.) verzeichnen Größenzunahmen zwischen 1% (H.U.) und 28% (K.M.). Diese Aussage ist auch auf die Zunahme der Kernflächen anwendbar. Bei dem Pat. R.T. vergrößerte sich die Kernfläche um 83% auf 54,3 µm², die des Pat. A.W. ist um 70% auf 75,7 µm² angewachsen. Die anderen 4 Patienten zeigten Kernflächenvergrößerungen bis zu 25% (K.M. 18%, H.U. 3%, W.O. 2%, I.W. 25%). Die Zellvergrößerungen fanden bei 2 Patienten (K.M. und W.O.) in stärkerem Ausmaß statt als die Kernvergrößerungen und führten daher in diesen Fällen zu um 2,6% und 4,8% verminderten Kern-PlasmaRelationen. Zum Teil erhebliche Zunahmen der KPR, bis zu 10,9%, zeigten sich jedoch bei den anderen Patienten. 90% 83% 80% 70% Veränderungen in % 70% 60% 48% 50% 38% 40% 28% 26% 30% 18% 25% Zellfläche Kernfläche 17% 20% 4% 10% 1% 1% 0% R.T. A.W. K.M. H.U. W.O. I.W. Patienten Abb. 11: Quantitative Auswertung der posttherapeutischen Zell- und Kernflächenveränderungen bei Patienten mit Adenokarzinomen im Vergleich zu den prätherapeutischen Ausgangswerten in Prozent 58 Die Entwicklung der Zellfläche ist auf den mittleren Zelldurchmesser übertragbar. Er nahm im Vergleich zum unbehandelten Gewebe um durchschnittlich 1,1 µm, von 12,1 µm präauf 13,2 µm posttherapeutisch, zu. Diese Veränderung zeigt in der statistischen Überprüfung einen signifikanten Anstieg (p=0,015). Bei dem Pat. H.U. zeigte sich rechnerisch keine Veränderung des mittleren Durchmessers, bei den anderen Patienten zeigten sich die Tumorzellen zwischen 0,7 µm und 2,3 µm im Durchmesser vergrößert. In geringerem Ausmaß nahm der Mittelwert des Kerndurchmessers um 0,9 µm, bei einer Spannweite zwischen 0,1 µm und 2,2 µm, zu. Diese Größenzunahme lag knapp außerhalb des Signifikanzbereichs (p=0,063), zeigt jedoch einen Trend an. Da der mittlere Kerndurchmesser posttherapeutisch im Vergleich zum mittleren Zelldurchmesser in relativ stärkerem Ausmaß anstieg, erhöhte sich die Kern-Plasma-Relation um 1,5%, von 57,3% auf 58,8% (p=0,55). 35% 34% Veränderungen in % 30% 25% 21% 20% 15% Zelldurchmesser 14% 11% 9% 11% 10% 7% 12% Kerndurchmesser 7% 5% 2% 0% 0% 0% R.T. A.W. K.M. H.U. W.O. I.W. Patienten Abb. 12: Quantitative Auswertung der posttherapeutischen Zell- und Kerndurchmesserveränderungen bei Patienten mit Adenokarzinomen im Vergleich zu den prätherapeutischen Ausgangswerten in Prozent 59 Abb. 13: Nach kombinierter Radio- und Chemotherapie aufgetriebene Tumorzellen mit vakuolisiertem Zytoplasma und aufgetriebenen, vakuolisierten Zellkernen eines Adenokarzinoms (HE-Färbung) Abb. 14: Adenokarzinoms Posttherapeutisch mit wabiger stark vergrößerte Zytoplasmaauftreibung Kernpolymorphismus (HE-Färbung) 60 Tumorzellen und eines deutlichem 4.4. Prüfung der morphometrischen Parameter sowie des Stadiums hinsichtlich einer Korrelation zum Regressionsgrad Ein weiterer wichtiger Punkt dieser Dissertation war die Prüfung einer Korrelation zwischen dem Ergebnissen der Regressionsgrad als morphometrischen wichtigem prognostischen Untersuchung zu Parameter Zellfläche und und den -durchmesser, Kernfläche und -durchmesser sowie der Kern-Plasma-Relation. Von weiterem Interesse war die Frage nach einem Zusammenhang zwischen Regressionsgrad und Stadium. Daher wurde der exakte Test nach Fisher durchgeführt. Hierbei sind anhand von Kreuztabellen der jeweilige Parameter, zum Beispiel der Zelldurchmesser, getrennt in die Gruppe von Patienten mit kleinen und großen Zelldurchmessern, den beiden Gruppen von Regressionsgraden (RG I/II A versus RG II B/III) gegenübergestellt. 4.4.1. Zelldurchmesser Vier Patienten mit Zelldurchmessern unterhalb des Medians zeigten regressive Veränderungen des Resttumorgewebes gemäß RG I oder RG II A, 7 Patienten gemäß II B. Von den 11 Patienten mit großen Zelldurchmessern waren bei 5 Patienten geringfügige histologische Tumorregressionszeichen zu beobachten (RG I/II A). Sechs Patienten zeigten Regressionszeichen nach II B. Im Fisher-Test war eine Korrelation zwischen dem Regressionsgrad und dem Zelldurchmesser nicht nachweisbar (p=1,0). Tab. 16: Kreuztabelle-Zelldurchmesser, Prüfung einer Korrelation zwischen der Größe des Zelldurchmessers (posttherapeutisch) und dem Regressionsgrad Gruppe-Regressionsgrad RG I/II A Zelldurchmesser- klein posttherapeut.Median Anzahl Erwartete Anzahl groß Anzahl Erwartete Anzahl Gesamt Anzahl Erwartete Anzahl 61 RG II B Gesamt 4 7 11 4,5 6,5 11,0 5 6 11 4,5 6,5 11,0 9 13 22 9,0 13,0 22,0 4.4.2. Zellfläche Von insgesamt 9 Patienten mit Befunden der Tumorregression Grad I oder II A, waren bei 4 Patienten kleine Zellflächen, bei 5 Patienten große Zellflächen zu beobachten. Sieben Patienten mit kleinen und 6 Patienten mit großen Zellflächen hatten posttherapeutisch weniger als 10% Resttumor (RG II B). Eine Abhängigkeit der Zellfläche vom Regressionsgrad war in diesem Kollektiv nicht nachweisbar (p=1,0). Tab. 17: Kreuztabelle-Zellfläche, Prüfung einer Korrelation zwischen der Größe der Zellfläche (posttherapeutisch) und dem Regressionsgrad Gruppe-Regressionsgrad RG I/II A Zellfläche- klein posttherapeut.Median Anzahl Erwartete Anzahl groß Anzahl Erwartete Anzahl Gesamt Anzahl Erwartete Anzahl RG II B Gesamt 4 7 11 4,5 6,5 11,0 5 6 11 4,5 6,5 11,0 9 13 22 9,0 13,0 22,0 4.4.3. Kerndurchmesser Die Patientenverteilung auf die Regressionsgrade stellte sich wie folgt dar: 9 Patienten mit RG I/II A, davon 4 Patienten mit kleinen Kerndurchmessern. Dreizehn Patienten mit RG II B, davon 7 Patienten mit kleinen, 6 Patienten mit großen Kerndurchmessern. Nach dem Fisher-Test zeigte sich hierbei kein signifikanter Zusammenhang (p=1,0). 62 Tab. 18: Kreuztabelle-Kerndurchmesser, Prüfung einer Korrelation zwischen der Größe des Kerndurchmessers (posttherapeutisch) und dem Regressionsgrad Gruppe-Regressionsgrad RG I/II A Kerndurchmesser- klein Anzahl posttherapeut.- Erwartete Anzahl Median groß 7 11 4,5 6,5 11,0 5 6 11 4,5 6,5 11,0 9 13 22 9,0 13,0 22,0 Anzahl Gesamt Erwartete Anzahl Gesamt 4 Anzahl Erwartete Anzahl RG II B 4.4.4. Kernfläche In Präparaten des Tumorgewebes von 5 Patienten mit RG I/II A und 6 Patienten mit RG II B wurden kleine Kernflächen ermittelt. Dementsprechend verteilten sich 4 Patienten mit großen Kernflächen auf RG I/II A und 7 Patienten auf RG II B. Eine Abhängigkeit der Kernfläche vom Regressionsgrad war hier nicht festzulegen (p=1,0). Tab. 19: Kreuztabelle-Kernfläche, Prüfung einer Korrelation zwischen der Größe der Kernfläche (posttherapeutisch) und dem Regressionsgrad Gruppe-Regressionsgrad RG I/II A Kernfläche- klein posttherapeut.Median Anzahl Erwartete Anzahl groß Anzahl Erwartete Anzahl Gesamt Anzahl Erwartete Anzahl 63 RG II B Gesamt 5 6 11 4,5 6,5 11,0 4 7 11 4,5 6,5 11,0 9 13 22 9,0 13,0 22,0 4.4.5. Kern-Plasma-Relation Die Verteilung der Patienten auf die Regressionsgrade und die Gruppe kleine KernPlasma-Relation und große KPR verhielt sich folgendermaßen: Regression gemäß Grad I und II A zeigte sich bei 3 Patienten mit einer KPR unterhalb des Medians und bei 6 Patienten mit einem Kernanteil oberhalb des Medians. Insgesamt 9 Patienten mit RG II B hatte eine KPR unter dem Medianwert, 4 Patienten oberhalb dessen. Hier konnte keine Korrelation zwischen Kern-Plasma-Relation und Regressionsgrad ermittelt werden (p=0,192). Tab. 20: Kreuztabelle-Kern-Plasma-Relation, Prüfung einer Korrelation zwischen der Kern-Plasma-Relation (posttherapeutisch) und dem Regressionsgrad Gruppe-Regressionsgrad RG I/II A Kern-Plasma- klein Relation posttherapeut.- Anzahl Erwartete Anzahl groß Anzahl Erwartete Anzahl Gesamt Anzahl Erwartete Anzahl RG II B Gesamt 3 9 12 4,9 7,1 12,0 6 4 10 4,1 5,9 10,0 9 13 22 9,0 13,0 22,0 4.4.6. Erkrankungsstadium Ein weiterer wichtiger Punkt war die Prüfung einer Abhängigkeit des Regressionsgrades vom Stadium. Es lag eine starke Gewichtung vor, denn von 13 Patienten mit RG II B befanden sich 10 Patienten bei Diagnosestellung im Stadium III A, 3 Patienten im Stadium III B. Für den Regressionsgrad I/II A hingegen zeigte sich eine fast gleichmäßige Verteilung mit 4 Patienten im Stadium III A und 5 Patienten im Stadium III B. Im exakten Fisher-Test betrug der p-Wert p=0,187, sodaß eine statistisch signifikante Abhängigkeit zwischen Regressionsgrad und Tumorstadium nicht nachgewiesen werden konnte. 64 Tab. 21: Kreuztabelle-Stadium, Prüfung Erkrankungsstadium und dem Regressionsgrad einer Korrelation zwischen Gruppe-Regressionsgrad RG I/II A Stadiumposttherapeut.Median Gesamt III A Anzahl RG II B Gesamt 4 10 14 5,7 8,3 14,0 5 3 8 Erwartete Anzahl 3,3 4,7 8,0 Anzahl 9 13 22 Erwartete Anzahl 9,0 13,0 22,0 Erwartete Anzahl III B Anzahl 65 dem 4.5. Überleben Das gesamte Patientenkollektiv bestand aus 24 Patienten, 18 Patienten mit Plattenepithelkarzinomen, 6 Patienten mit Adenokarzinomen. Von 2 Patienten mit Plattenepithelkarzinomen lagen keine klinischen Daten vor, so daß von 22 Patienten der weitere klinische Verlauf beobachtet werden konnte. Die Studie begann im April 1992 und endete im Januar 1998. Mit Hilfe der Kaplan-Meier-Methode wurde für das Studienkollektiv eine mediane Überlebenszeit von 18 Monaten errechnet. Zum Ende der Nachbeobachtungszeit im Januar 1998, lebten noch sechs Patienten, 16 Patienten waren inzwischen verstorben. Der Patient W.B. hatte bereits vor follow-up-Ende die 5-Jahres-Überlebensgrenze rezidivfrei und ohne Auftreten von Fernmetastasen erreicht. Dieser Patient konnte R0-reseziert werden, das Resttumorgewebe zeigte therapieinduzierte Veränderungen im Rahmen Regressionsgrades II B. Gute Langzeitergebnisse zeigten sich auch bei folgenden Patienten: Tab. 22: Übersicht über lebende Patienten zum follow-up-Ende: Pat. TNM Stad. Resek. RG ÜLZ M W.B. T3N2 III A R0 II B 64 - G.H. T2N2 III A R0 II B 55 - A.W. T2N3 III B R0 II B 58 - D.D. T3N2 III A R0 II B 46 - R.S. T2N2 III A R0 II B 45 ja I.W. T2N3 III A R0 II A 17 ja Pat. = Patienten, TNM = TNM-Klassifikation, Stad. = Stadium Resek. = Residualtumor-Klassifikation n. UICC, RG = Regressionsgrad ÜLZ = Überlebenszeit in Monaten, M = Fernmetastasen 66 des Bei den Patienten G.H., A.W. und D.D. wurden 55, 58 bzw. 46 Monate nach Diagnosestellung am Ende der Beobachtungszeit weder Lokalrezidive noch Fernmetastasen festgestellt. Die Patientin R.S. wies 12 Monate nach Tumorresektion Fernmetastasen auf, follow-up-Ende war hier 45 Monate nach Diagnosestellung. Gemeinsam ist diesen 5 Patienten die histologische Diagnose Plattenepithelkarzinom, die R0-Resektion und der Regressionsgrad II B. Bei dem Patienten I.W. wurde ein Adenokarzinom (T2N3) diagnostiziert, auch bei diesem Patienten lagen histologisch tumorfreie Schnittränder vor (R0-Resektion), das restliche Tumorgewebe mußte jedoch aufgrund geringer Regressionszeichen dem RG II A zugeordnet werden. Acht Monate nach Erstdiagnose traten bei diesem Patienten Fernmetastasen auf, vom Zeitpunkt der Diagnosestellung bis Januar 1998 (follow-upEnde) waren 17 Monate vergangen. Insgesamt konnten bei 17 Patienten R0-Resektionen, bei 4 Patienten R1- und bei 1 Patienten R2-Resektionen vorgenommen werden. Aufgrund der geringen Fallzahlen für R1- und R2-Resektionen wurde auf eine gesonderte Auswertung der Überlebensdaten in diesem Punkt verzichtet. Nach Auswertung der allgemeinen Überlebensdaten, wurden die Überlebenszeiten der 22 Patienten in Abhängigkeit von Zell- und Kernfläche, Zell-, Kerndurchmesser und KernPlasma-Relation untersucht, um festzustellen, ob die prätherapeutischen Größen dieser Parameter prognoserelevante Faktoren darstellen. Als cut-off wurde der Median gewählt. Daraus entstanden 2 Gruppen mit jeweils 11 Patienten, wobei die Patienten, deren Werte unterhalb des Medians lagen, in die Gruppe 1 ("klein"), die Patienten mit Werten über dem Median in die Gruppe 2 ("groß") eingeteilt wurden. Für jedes Kollektiv wurde die mediane Überlebenszeit ermittelt und die entsprechenden Kaplan-Meier-Kurven erstellt. Anschließend wurden die Überlebenszeiten der beiden Gruppen miteinander verglichen und mit Hilfe des Log-Rank-Test auf Signifikanz überprüft. Für die Patienten mit einer Zellfläche unterhalb des Medians von 97,5 µm², wurde eine Überlebenszeit von 14 Monaten ermittelt, für die Patienten oberhalb dieses Wertes zeigte sich eine ÜLZ von 30 Monaten. Es zeigte sich auch, daß alle 5 Patienten, die zum Ende der Nachbeobachtungszeit gute Langzeitergebnisse zwischen 45 und 64 Monaten aufwiesen, 67 der Gruppe "große" Zellflächen zuzuordnen waren. Während in der Gruppe der 11 Patienten mit "kleinen" Zellflächen die ÜLZ zwischen 7 und 24 Monaten betrug. Zu dieser Gruppe gehört auch der Patient I.W., dessen Diagnose 17 Monate vor follow-up-Ende, gestellte wurde. Diese Beobachtung deutet daraufhin, daß Patienten mit prätherapeutisch großen Zellflächen einen Überlebensvorteil aufweisen, im Log-Rank-Test zeigte sich ein signifikanter Unterschied (p=0,002). Die folgende Abbildung zeigt die Überlebenszeit des Studienkollektivs, bezogen auf die prätherapeutische Zellfläche nach der Kaplan-MeierMethode. 1,0 Überleben nach Zellfläche Kum. Überleben ,8 ,6 Gruppe 2 (groß) ,4 Gruppe 1 (klein) ,2 0,0 0 10 20 30 40 50 60 70 Überlebenszeit - Monate Abb. 15: Überlebenskurven nach Kaplan-Meier für die prätherapeutisch ermittelte Zellfläche „groß“ versus „klein“ für 22 Patienten Plattenepithelkarzinomen (p=0,002), („groß“: >Median, „klein“: <Median) 68 mit Adeno- und 1,0 Überleben nach Zelldurchmesser Kum. Überleben ,8 ,6 Gruppe 2 (groß) ,4 Gruppe 1 (klein) ,2 0,0 0 10 20 30 40 50 60 70 Überlebenszeit - Monate Abb. 16: Überlebenskurven nach Kaplan-Meier für den prätherapeutisch errechneten mitteren Zelldurchmesser „groß“ versus „klein“ für 22 Patienten mit Adeno- und Plattenepithelkarzinomen (p=0,002), („groß“: >Median, „klein“: <Median) Die Prüfung der Abhängigkeit der Überlebenszeit vom Zelldurchmesser, zeigte der Zellfläche entsprechende Ergebnisse. Die mediane ÜLZ für Zelldurchmesser < 11,7 µm betrug 14 Monate, für Durchmesser > 11,7 µm, 30 Monate. Im Log-Rank-Test wurde ein signifikanter Überlebensvorteil für Patienten (p=0,002). 69 mit großen Zelldurchmessern ermittelt 1,0 Überleben nach Kerndurchmesser Kum. Überleben ,8 ,6 Gruppe 2 (groß) ,4 Gruppe 1 (klein) ,2 0,0 0 10 20 30 40 50 60 70 Überlebenszeit - Monate Abb. 17: Überlebenskurven nach Kaplan-Meier für den prätherapeutisch errechneten mittleren Kerndurchmesser „groß“ versus „klein“ für 22 Patienten mit Adeno- und Plattenepithelkarzinomen (p=0,039), („groß“: >Median, „klein“: <Median) Bei Betrachtung der Überlebenskurven für den Kerndurchmesser wiederum fällt auf, daß der Patient I.W. hierbei durch seinen Durchmesser von 6,7 µm knapp unterhalb des Medians von 6,8 µm lag und daher der Gruppe "kleine" Durchmesser zugerechnet wurde. Aus diesem Grund zeigen die ÜLZ gemessen am Kerndurchmesser Abweichungen von denen der Kernfläche mit 16 Monaten für die Gruppe 1 und median 28 Monate für die Gruppe 2. Der Log-Rank-Test zeigte einen Überlebensvorteil für Patienten mit großen Kerndurchmessern (p=0,039). 70 1,0 Überleben nach Kernfläche Kum. Überleben ,8 ,6 Gruppe 2 (groß) ,4 Gruppe 1 (klein) ,2 0,0 0 10 20 30 40 50 60 70 Überlebenszeit - Monate Abb. 18: Überlebenskurven nach Kaplan-Meier für die prätherapeutisch ermittelte Kernfläche „groß“ versus „klein“ für 22 Patienten mit Adeno- und Plattenepithelkarzinomen (p=0,004), („groß“: >Median, „klein“: <Median) Für die Kernfläche betrug in der Gruppe 1 (Fläche < 34,4 µm²) die mediane Überlebenszeit 15 Monate, in der Gruppe 2 (Fläche > 34,4 µm²) konnte eine mediane Überlebenszeit aufgrund der 6 zensierten Fälle nicht ermittelt werden, die mittlere ÜLZ betrug 42 Monate. Hierbei war festzustellen, daß alle 6 Patienten, die das Ende der Nachbeobachtungszeit erreicht hatten, große Kernflächen aufwiesen. In der statistischen Untersuchung wurde ein signifikanter Unterschied der Überlebenszeiten für beide Gruppen festgestellt (p=0,004). Bei Auswertung der Überlebensdaten in Abhängigkeit von der Kern-Plasma-Relation, lassen sich für die Patienten mit einem Kernanteil < 60,7 % median ebenfalls 16 Monate, für die Patientengruppe > 60,7 % median 23 Monate ermitteln (p=0,209). Der Grund für den Unterschied in der ÜLZ der beiden Gruppen liegt darin, daß der Patient W.B., mit der längsten ÜLZ von 64 Monaten, durch eine KPR von 57,3 % hier in die kleine Gruppe einzuordnen ist. Im Gegensatz dazu wurde der Patient I.W., bei entgegengerichtetem Kernund Zellflächenverhalten, durch eine KPR von 60,9 % der Gruppe "groß", trotz deutlicher Zunahme von Zell- und Kernfläche durch eine Relativverschiebung der KPR, zugeordnet. 71 Art und Ausmaß der therapieinduzierten Veränderungen und die Menge des RestTumorgewebes sind von entscheidender prognostischer Bedeutung. Daher wurde die Überlebenszeit jeweils für die Patienten mit dem Regressionsgrad I und II A (insgesamt 9 Patienten) und für Regressionsgrad II B und III (13 Patienten mit RG II B, kein Patient mit RG III) ermittelt. Für die Gruppe RG I/II A wurde eine mediane ÜLZ von 14 Monaten, für die Patienten mit RG II B/III 23 Monate festgestellt. Der Log-Rank-Test konnte für dieses Kollektiv keinen signifikanten Unterschied zwischen diesen beiden Gruppen aufzeigen (p=0,096). Unten abgebildete Graphik zeigt, daß alle Patienten mit guten langfristigen Überlebensergebnissen zwischen 45 und 64 Monaten Veränderungen nach RG II B zeigten. 1,0 Überleben nach Regressionsgrad Kum. Überleben ,8 ,6 RG II B und III ,4 RG I und II A ,2 0,0 0 10 20 30 40 50 60 70 Überlebenszeit - Monate Abb. 19: Überlebenskurven nach Kaplan-Meier für den posttherapeutisch ermittelten Regressionsgrad (RG I und II A versus RG II B und III) für 22 Patienten mit Adeno- und Plattenepithelkarzinomen (p=0,096) Auch das Erkrankungsstadium kann einen prognoserelevanten Faktor darstellen. 14 Patienten befanden sich bei Diagnosestellung im prognostisch günstigeren Stadium III A und zeigten mediane ÜLZ von 24 Monaten, 8 Patienten im Stadium III B lebten median lediglich 12 Monate nach Diagnosestellung. Einen signifikanten Unterschied im Überlebensvorteil konnte anhand dieses Kollektivs nicht eruiert werden (p=0,208), das 72 Ergebnis dieser Untersuchung für das Gesamtkollektiv war ähnlich mit median 25 Monaten für Patienten im Stadium III A und 17 Monaten Überlebenszeit für Patienten im Stadium III B (p=0,33). 1,0 Überleben nach Stadium Kum. Überleben ,8 ,6 ,4 Stadium III A Stadium III B ,2 0,0 0 10 20 30 40 50 60 70 Überlebenszeit - Monate Abb. 20: Überlebenskurven nach Kaplan-Meier für das Stadium (Stadium III A versus III B) für 22 Patienten mit Adeno- und Plattenepithelkarzinomen (p=0,208) Die Auswertung der Überlebensdaten mit dem Log-Rank-Test haben für dieses Kollektiv gezeigt, daß Patienten mit prätherapeutisch großen Tumorzellen und Zellkernen einen signifikanten Überlebensvorteil aufweisen. 73 5. Diskussion Der zentrale Punkt der Dissertation war die Beobachtung der Größenveränderungen nichtkleinzelliger Lungenkarzinome nach neoadjuvanter Strahlen- und Chemotherapie nach dem ICE-Schema. Das Gewebe von 24 Patienten, die sich diesem Behandlungschema unterzogen, wurde prä- und posttherapeutisch hinsichtlich zytologischer Veränderungen untersucht. Durch morphometrische Untersuchungen konnten mit Hilfe von Videogestützten Meßverfahren die lichtmikroskopisch festgestellten Veränderungen quantitativ erfaßt und evaluiert werden. Ziel der Vergleichsuntersuchungen war, aufzuzeigen, ob den zuvor erläuterten Regressionsgraden bestimmte therapieinduzierte zytologische Größenveränderungen zuzuordnen sind und ob diese einen Einfluß auf die Überlebenszeit der Patienten und damit auf die Prognose ausüben. In der Literatur wurde bereits bei unterschiedlichen bösartigen Tumoren die Größe von Tumorzellen und Zellkernen anhand der jeweiligen Durchmesser erfaßt, die entsprechenden Zell- und Kernflächen wurden jedoch wenig berücksichtigt. Diese stellen jedoch wichtige Parameter für die Größenbeurteilung von Tumorzellen dar, da durch das angewandte Meßverfahren die gesamte Zellfläche einschließlich Zellausläufer ermittelt werden kann und dadurch eine genaue Erfassung der Tumorzellgröße möglich ist. Um die eigenen Untersuchungsergebnisse mit den Literaturdaten vergleichen zu können, wurden die entsprechenden Durchmesser aus den Daten der Flächenmessung errechnet. Dabei wurden maximaler, minimaler und mittlerer Durchmesser ermittelt. In dieser Dissertation wird für die Beurteilung der Zell- und Kerndurchmesser, zum besseren Vergleich mit Literaturangaben, der mittlere Durchmesser zugrunde gelegt. 5.1. Prätherapeutische Tumorzell- und Kerngrößen bei Plattenepithel- und Adenokarzinomen Bei Messung der durch Bronchusbiopsie oder Mediastinoskopie gewonnenen Tumorzellen wurde prätherapeutisch eine durchschnittliche Zellfläche der 18 Patienten mit Plattenepithelkarzinomen von 101,8 + 4,1 µm², bei einem mittleren Durchmesser von 11,9 + 0,2 µm und eine durchschnittliche Kernfläche von 36,5 + 1,5 µm², mit einem Kerndurchmesser von 7,0 + 0,1 µm, ermittelt. Zu sehr ähnlichen Ergebnissen kamen 74 Müller und Mitarbeiter in einer Studie 1986. Darin wurden Zellen unbehandelter Lungenkarzinome, nach Tumortyp Kerndurchmesser untersucht. In getrennt, der hinsichtlich Studie ihrer waren in mittleren der Zell- und Gruppe der Plattenepithelkarzinome Zelldurchmesser mit 13,7 + 2,4 µm, Kerndurchmesser mit 9,2 + 1,4 µm und ein Kernanteil von 68 + 8% gemessen worden. Unter Berücksichtigung der Einschränkung des vorliegenden Studienkollektivs auf Patienten der Stadien III A und III B, ergibt sich eine gute Korrelation zwischen beiden Untersuchungen. Für die sechs Patienten mit Adenokarzinomen wurde prätherapeutisch mit 105,2 + 16,8 µm² im Mittel eine um 3% größere Zellfläche im Vergleich zu den Plattenepithelkarzinomen festgestellt. Der Zelldurchmesser betrug hier 12,1 + 1,1 µm. Die mittlere Kernfläche lag mit 33,9 + 2,8 µm² im Vergleich jedoch, ebenso wie der Kerndurchmesser mit 6,8 + 0,3 µm, unter dem Niveau der Plattenepithelkarzinome. Diese Größenunterschiede finden in der Kern-Plasma-Relation von 59,4% für die PlattenepithelGruppe und 57,3% für die Gruppe der Adenokarzinome Entsprechung. Die vorgenannten Werte zeigen eine gute Korrelation zu den Meßergebnissen der Adenokarzinome von Müller und Mitarbeitern 1986. In deren Studie wurde ein mittlerer Zelldurchmesser von 13,2 + 2,3 µm, ein mittlerer Kerndurchmesser von 8,5 +1,3 µm und ein Kernanteil von 65 + 8% gemessen (Müller et al.1986). Burns und Mitarbeiter untersuchten an Tumorgeweben von 20 Patienten mit großzelligen Karzinomen (10 Pat.) und Adenokarzinomen (10 Pat.) Kernfläche und Kerndurchmesser. In seiner Studie wurden bei den Adenokarzinomen mit einer mittleren Kernfläche von 58,84 µm² und 6,42 µm Durchmesser deutlich größere Kerne im Vergleich zur vorliegenden Studie ermittelt. In der Untersuchung von Burns und Mitarbeitern zeigten sich für die mittlere Kernfläche und den Durchmesser der großzelligen Karzinome geringere Werte mit 47,38 µm² und 5,82 µm. Der Größenunterschied der beiden Tumorgruppen war hier nicht signifikant (Burns et al. 1993). Vollmer untersuchte 197 Patienten mit klein- oder großzelligen Karzinomen und stellte fest, daß sich hinsichtlich der Zell- und Kerngröße bei diesen Tumoren Überschneidungen ergaben, sodaß eine alleinige Diagnose anhand morphologischer Größen unsicher erscheint. Er zeigte, daß Unterschiede in der Zell- oder Kerngröße zwischen den Karzinomsubtypen klein- und großzellig teilweise auf die Größe des Biopsats zurückzuführen waren (Vollmer 1981). Dies ist als eine Ursache für die dargestellten Größenunterschiede der Tumorzellen und 75 Zellkerne anzusehen, die sich zwischen den eigenen Untersuchungen und den Ergebnissen in der Literatur ergeben. Zudem hat Müller in seinen Studien in mehr als 50% der nichtkleinzelligen bösartigen Lungentumoren mehr als einen führenden histologischen Tumortyp beobachtet, sodaß intra- und interindividuellen Unterschiede der Zell- und Kerngrößen, wie sie diese Untersuchung gezeigt hat, nachvollziehbar sind (Müller 1999). 5.2. Posttherapeutische Zell- und Kerngrößen bei Plattenepithel- und Adenokarzinomen Die weiteren morphometrischen Untersuchungen erfolgten nach neoadjuvanter Chemound Radiotherapie sowie kurativ intendierter Operation, wobei sich für die Plattenepithelkarzinome im prä- und posttherapeutischen zytologischen Vergleich, durch starke individuelle Streuung der Meßwerte, insgesamt eine nicht signifikante Verkleinerung der Tumorzellen zeigte. Dabei verminderte sich die mittlere Zellfläche um 2% auf 99,6 + 5,8 µm² (p=0,72), die mittlere Kernfläche um 4% auf 34,8 + 2,2 µm² (p=0,50). Nach einer nicht signifikanten Verringerung betrugen posttherapeutisch der mittlere Zell- und Kerndurchmesser für die Plattenepithelkarzinome 11,6 + 0,3 µm (p=0,49) und 6,8 + 0,2 µm (p=0,34). Bei den Adenokarzinomen war im Gegensatz zu den Plattenepithelkarzinomen eine erhebliche, synchrone Zunahme der Zell- und Kerngrößen zu beobachten. Es ließ sich eine signifikante Zellflächenzunahme um 30% auf 137,2 + 27,4 µm² (p=0,034) und eine Kernflächenzunahme um 36% auf 46,1 + 7,3 µm² (p=0,067) feststellen, die einen deutlichen Trend anzeigte. Nach Therapie kam es zu einem signifikanten Anstieg des Zelldurchmessers auf 13,2 + 1,3 µm (p=0,015). Der Kerndurchmesser wurde mit 7,7 + 0,6 µm ermittelt und zeigte ebenso eine deutlich ansteigende Tendenz (p=0,063). Im Vergleich zu einer Untersuchung von Lee und Mitarbeitern, in der jeweils der größte Zell- und Kerndurchmesser 30 nicht-kleinzelliger Lungenkarzinome nach kombinierter Radio- und Chemotherapie mit Cisplatin und 5-Fluoruracil, gemessen wurde, zeigten sich in seiner Studie mit einem gemittelten Zelldurchmesser von 18,4 + 0,5 µm und einem Kerndurchmesser von 12,8 + 0,4 µm deutlich größere Zellen (Lee et al. 1988). Ursächlich hierfür scheint die Tatsache zu sein, daß in der Studie von Lee neben Plattenepithel- und 76 Adenokarzinomen auch großzellige Karzinome untersucht wurden, die zu einem überproportionalen Anstieg der gemittelten Zell- und Kerndurchmesser führen können. In der vorliegenden Untersuchung verminderte sich die Kern-Plasma-Relation nach Therapie bei den Plattenepithelkarzinomen um 1% (p=0,368), wohingegen bei den Adenokarzinomen der Kernanteil um 1,5% zunahm (p=0,547 ). Kayser und Mitarbeiter stellten in Lungenkarzinome, einer die Untersuchung zuvor mit an einer Operationsresektaten Cisplatin-haltigen nicht-kleinzelliger Chemotherapie behandelt wurden, insgesamt eine erhöhte Kern-Plasma-Relation fest, ohne dies genauer zu quantifizieren (Kayser et al. 1994). 5.3. Entwicklung der Tumorzellen und Zellkerne bei Patienten mit Patienten mit Plattenepithelkarzinomen nach Radio- und Chemotherapie Wie bereits vorbeschrieben, läßt sich das Kollektiv der Plattenepithelkarzinomen in drei Gruppen unterteilen: 7 Patienten mit posttherapeutischer Verminderung der Größe von Tumorzellen und Kernen, 6 Patienten mit Zell- und Kernvergrößerungen und 5 Patienten mit gegensätzlichen Veränderungen von Zellen und Kernen, bei denen sowohl Vergrößerungs- als auch Verkleinerungstendenzen festzustellen waren. 5.3.1. Simultane Abnahme der Zell- und Kerngröße bei Plattenepithelkarzinomen Bei 7 Patienten mit Plattenepithelkarzinomen zeigte sich eine simultane Zell- und Kernflächenabnahme, in einer Größenordnung von 6% bis 50%. Der Zelldurchmesser nahm zwischen 3% und 25%, der Kerndurchmesser zwischen 7% und 30% ab. Aus diesem Kollektiv war bei 4 Patienten eine prozentual stärkere Abnahme des Kerns im Vergleich zum Zelldurchmesser zu beobachten. Konsekutiv verringerte sich in diesen Fällen die Kern-Plasma-Relation zwischen 4,2% und 8,5%. Bei 3 Patienten hingegen nahm, durch prozentual stärkeren Verlust des Zelldurchmessers, im Vergleich zum Kerndurchmesser, die Kern-Plasma-Relation um Werte zwischen 0,9% und 3,1% zu. Fünf dieser Patienten zeigten Regressionszeichen im Sinne eines RG II B, ein Patient wurde dem RG II A 77 zugeordnet. Bei einem Patienten waren lediglich spontane Regressionszeichen, wie den Nekrosezonen unmittelbar angrenzende vitale Tumorsäume und fehlende Schaumzellreaktion, zu erkennen (RG I). Um so bemerkenswerter erscheint, daß die Überlebenszeit dieses Patienten mit 30 Monaten deutlich über dem Median von 18 Monaten liegt. Die anderen Patienten der Gruppe abnehmender Zell- und Kernflächen lebten zwischen 7 und 58 Monaten. Eine Abnahme der Kerngröße beobachteten ebenfalls Leistenschneider und Nagel in einer Untersuchung zum Grading des Prostatakarzinoms und bezeichneten sie als deutliches Regressionszeichen. Zu den geringen Regressionszeichen zählten sie Kern- und Zytoplasmavakuolen, aber auch Zytoplasmaschrumpfung. Im Gegensatz zur Abnahme der Zellkerngröße, konnten sie jedoch kein typisches Regressionsverhalten des Zytoplasmas erkennen (Leistenschneider und Nagel 1984). Helpap et al. untersuchten ebenfalls Kennzeichen der histologischen Regression bei Prostatakarzinomen nach Hormon- oder Strahlentherapie Zytoplasmas und stellten und bei den Drüsenzellen Kernpyknosen fest. eine starke Ballonierung Zellverkleinerungen des durch Zytoplasmaschrumpfungen, wie vorher beschrieben, zeigten sich in ihrer Studie nicht (Helpap et al. 1985). 5.3.2. Simultane Zell- und Kernvergrößerung bei Plattenepithelkarzinomen Ein einheitlicher Trend der Zell- und Kernflächenzunahme, zeigte sich bei 6 Patienten mit Plattenepithelkarzinomen. Die Zellflächen vergrößerten sich um Werte zwischen 3% und 62%, die Kernflächen zeigten dabei korrespondierende Größenzunahmen bei 5 Patienten zwischen 6% und 62%. Die Kernfläche eines Patienten blieb, bei gering vergrößerter Zellfläche, nach Therapie unverändert. Es zeigten sich auch bei den Durchmessern entsprechende Zuwächse. Der Zelldurchmesser stieg zwischen 2% und 21%, der Kerndurchmesser zwischen 3% und 26%. Es ist hinzuzufügen, daß sich der Kerndurchmesser bei einem Patienten, im Vergleich zum unbehandelten Gewebe, nicht veränderte, die Zelle sich im Durchmesser um 2% vergrößerte. Diese Entwicklung zeigte sich bereits bei den Ergebnissen der Flächenuntersuchung. Die Kern-Plasma-Relation veränderte sich posttherapeutisch zugunsten des Kerns bei 3 Patienten um Werte zwischen 2,0% und 5,2%. Durch den relativ geringeren Anstieg des Kerndurchmessers bei den 78 anderen 3 Patienten, sank der Anteil des Kerns am Zelldurchmesser um Werte zwischen 0,9% und 4,7%. In diesem Kollektiv simultaner Zell- und Kernveränderungen zeigten sich bei einem Patienten geringe Regressionszeichen (RG I), zwei Patienten zeigten eine therapieinduzierte Tumorregression mit mehr als 10% vitalem Resttumorgewebe (RG II A), drei Patienten wiesen nach Therapie weniger als 10% Tumorgewebe auf (RG II B). Die Überlebenszeiten dieser Patienten lagen zwischen 12 Monaten (Patient mit RG I) und 46 Monaten (Patient mit RG II B) und wiesen damit deutliche Unterschiede auf. Von den beiden studienbegleitend therapierten Patienten liegen keine Informationen über die Überlebenszeit vor. Auch in anderen Studien an unterschiedlichen malignen Tumoren wurden posttherapeutisch Zell- und Kernvergrößerungen beobachtet. In einer Untersuchung von Kuo und Luh Brochialkarzinomen an drei wurden Patienten ebenfalls mit stark histologisch vergrößerte gesicherten Tumorzellen kleinzelligen und Zellkerne festgestellt. Unter laufender Chemotherapie mit Cyclophosphamid, Doxorubicin und Vincristin wurden Aspirations-Biopsien von Lymphknoten-Metastasen entnommen und die Tumorzellen hinsichtlich regressiver Veränderungen untersucht. Dabei zeigten sich starke morphologische Veränderungen zwischen dem dritten und siebten Tag nach Chemotherapie in Form von um 50% bis 69% vergrößerten Kernflächen (Kuo und Luh 1993). Hier zeigt sich, daß Vergrößerungstendenzen von Tumorzellen und Kernen durchaus derart hohe Werte in Abhängigkeit von Tumorzellart, Therapie und Zeitpunkt der histomorphologischen Untersuchung, erreichen können. Baak und Mitarbeiter stellten an 73 Resektaten chemotherapierter Ovarialkarzinome in mehr als einem Drittel ihres Kollektivs ebenfalls große Kernflächen fest, die in dieser Untersuchung auf einen unterschiedlichen DNA-Gehalt (Aneuploidie) zurückgeführt wurden (Baak et al. 1988). Albrectsen und Rygaard beobachteten an heterotransplantierten malignen Blasentumoren bereits nach 1 und 3 Tagen Chemotherapie Kernvergrößerungen bei den Tumorzellen, während die Zellkerne in der unbehandelten Kontrollgruppe unverändert blieben (Albrectsen und Rygaard 1995). Brifford und Mitarbeiter untersuchten 35 Mammakarzinome, die präoperativ mit einer mehrere Zyklen umfassenden Polychemotherapie (AVCMF) behandelt wurden. Die 79 Tumoren wurden unter der Therapie mehrfach punktiert und hinsichtlich morphologischer Veränderungen untersucht. Während bei 15 Tumoren keine deutliche, histologische Entwicklung festzustellen war, zeigten sich bei 20 Karzinomen Chemotherapie-induzierte Veränderungen in Form von Zell- und Kernvergrößerungen, die bereits nach dem ersten Zyklus auftraten. Sie betrachteten dies als einen Ausdruck der Chemosensibilität der Tumorzellen, da sie auch feststellten, daß bei diesen Fällen auch die maximale Regression der Tumorgröße auftrat (Brifford et al. 1989). Ähnliche Beobachtungen machten Moll und Chumas 1997 in einer Studie über morphologische Veränderungen lokal fortgeschrittener Mammakarzinome nach neoadjuvanter Strahlen- und Chemotherapie. Sie untersuchten Tumorgewebe von 50 Patientinnen vor und nach Behandlung und beobachteten in 51% ihres Kollektivs eine Kernvergrößerung, die jedoch lediglich in 49% gleichzeitig mit einer Zellvergrößerung einher ging. Im vorliegenden Kollektiv zeigte sich bei 13 von insgesamt 24 Patienten mit nichtkleinzelligen Lungenkarzinomen Zellvergrößerung eine vergesellschaftet war. Kernvergrößerung, Ursächlich die erscheint in eine 85% mit einer chemotherapeutisch induzierte blasige Kernauftreibung, wie sie auch von Abeloff und Eggleston 1981 beschrieben wurde. Moll und Chumas stellten zudem Zytoplasmavakuolisierungen fest, die sie als allgemeine Reaktion auf strahlen- und chemotherapeutische Maßnahmen werteten, ohne daß sie einem bestimmten Medikament zugeordnet werden könne (Moll und Chumas 1997). Weitere Studien an Mammakarzinomen zeigten die folgenden histomorphologischen Beobachtungen: Sharkey et al. beobachteten bei 43 Patientinnen, die zuvor chemotherapiert wurden, eine Zunahme sich bizarr vergrößernder Tumorzellen und in 32% eine Zunahme der Kerngröße (Sharkey et al. 1996). Kennedy und Mitarbeiter beschrieben an chemotherapierten Resektaten extreme Vakuolisierungsphänomene an den Tumorzellen, die an Histiozyten erinnerten (Kennedy et al. 1990). Auch eine Arbeitsgrupe um Rasbridge stellte bei Mammakarzinomen nach zytostatischer Therapie eine Zell- und Kernvergrößerung durch Vakuolisierung fest, die auch hier auf die Chemotherapie zurückgeführt wird, da vergleichbare morphologische Zellveränderungen im physiologischen Brustgewebe nicht nachweisbar waren (Rasbridge et al. 1994). Der 80 Nachweis eines pathophysiologischen Zusammenhangs zwischen der zytostatischen Therapie und der beschriebenen Vakuolisierung steht derzeit noch aus. 5.3.3. Divergierende Größenveränderungen von Tumorzellen und Kernen bei Plattenepithelkarzinomen Eine divergierende Entwicklung von Zellen und Kernen zeigte sich in der vorliegenden Untersuchung bei 5 Patienten. Bei zwei Patienten war eine Verminderung der Zellfläche bei Zunahme der Kernfläche zu beobachten. Bei diesen Patienten stieg, durch Verminderung des Zelldurchmessers, bei gleichzeitiger Kernvergrößerung, die KernPlasma-Relation um 3,4% bzw. 6,9%. Posttherapeutisch wurde bei beiden Patienten ein Regressionsgrad II B festgestellt. Ein Patient war 28 Monate nach Diagnosestellung verstorben, bei dem anderen Patienten waren am follow-up-Ende bereits 55 Monate seit Erstdiagnose vergangen. Die anderen 3 Patienten zeigten in den Resektaten vergrößerte Zellflächen und Zelldurchmesser, bei verminderten Kernflächen und Kerndurchmessern. Diese Entwicklung führte zu einer um 2,5% bis 4,7% verminderten Kern-Plasma-Relation. Regressionsgrad II B konnte bei zwei dieser Patienten beobachtet werden. Hiervon verstarb ein Patient nach 7 Monaten, der andere Patient hatte zum Ende der Nachbeobachtungszeit bereits 64 Monate rezidivfrei gelebt. Der dritte Patient mit dem Regressionsgrad II A verstarb ebenfalls nach 7 Monaten. Im Rahmen der eigenen Untersuchungen war zu beobachten, daß die Größenveränderungen bei gleichsinniger Entwicklung von Zelle und Kern, sowohl bei Flächenverminderung als auch bei Vergrößerung, in der Regel deutlich über 10% angesiedelt sind, während die Veränderungen bei diesen 5 Patienten mit divergierender Flächenentwicklung, mit Ausnahme eines Patienten, deutlich unter dem Niveau von 10% liegen. In den Gruppen simultaner Größenentwicklung schien ein hohes Ausmaß an Zellund insbesondere Kernflächenminderung (>40%) oder ein geringes Ausmaß an Zell(<15%) und Kernflächenzunahme (<10%) günstige Einflüsse auf die Länge des Überlebens zu haben, wie an den Patienten R.S., A.W. und D.D. mit 45, 58, und 46 Monaten Überlebenszeit zu beobachten war, ohne daß sich hier statistisch signifikante Aussagen ergeben hätten. 81 Close und Mitarbeiter veröffentlichten 1987 eine Studie über histomorphologische Untersuchungen an Mammakarzinomen, in der ein Kollektiv von 16 Patientinnen mit einer Polychemotherapie vor Mastektomie behandelt wurden. Es zeigte sich in 9 Resektaten eine Kernvergrößerung im Vergleich zu den prätherapeutisch gewonnenen Biopsaten, eine Kernverkleinerung wurde nur in einem Fall festgestellt. In den Geweben von 6 Patientinnen konnten keine Veränderungen an der Kerngröße beobachtet werden (Close et al. 1987). Dies ist, wie die zuvor beschriebenen Untersuchungen, ein weiteres Beispiel dafür, daß Tumorgewebe eine sehr heterogene histomorphologische Reaktion auf die angewandten Therapieschemata (in den Studien wurden Chemo-, Strahlen- oder eine kombinierte Therapie verabreicht) zeigt. Insbesondere bestätigen dies die Ergebnisse an den 18 Plattenepithelkarzinomen des vorliegenden Kollektivs, wo sich, wie vorgenannt, keine eindeutig erkennbar gerichtete signifikante therapieinduzierte Größenänderung ergibt. Auch wenn mit 72% dieses Kollektivs (Plattenepithelkarzinome) die Tumorzellen und Zellkerne eine synchrone Veränderung auf die Therapie zeigen, wobei Größenzu- sowie Größenabnahme möglich sind, läßt sich bei 28% eine divergierende Entwicklung von Zell- und Kerngröße beobachten. Einige Präparate wiesen ein Mischbild auf, hierbei waren wabige, vakuolig aufgetriebene Zellen mit blasigen und bizarr geformten Zellkernen neben kleinen, geschrumpft erscheinenden Zellen mit pyknotischen Kernen zu beobachten. Dies ist jedoch unter Berücksichtigung der chromosomalen Instabilität nachvollziehbar. Sie wird durch Veränderungen des genetischen Materials durch Mutationen (Punktmutationen, Deletionen, Insertionen) hervorgerufen. Es liegen noch keine gesicherten Erkenntnissse vor, daß eine spezifische Mutation zu einem bestimmten histomorphologischen Bild führt. Jedoch finden sich bestimmte Veränderungen der DNA gehäuft bei Tumoren mit einer typischen histologischen Differenzierung (Bsp. K-ras-Mutation bei Adenokarzinomen) (Wiethege et al. 2000). Petersen veröffentlichte eine Studie, in der in molekulargenetischen Untersuchungen mittels CGH („comparative genomic hybridization) chromosomale Imbalanzen an kleinund nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen aufgedeckt wurden. Er konnte in vergleichenden Untersuchungen zeigen, daß Tumoren die Fähigkeit zur Metastasierung durch genetische Veränderungen erwerben. Hierbei zeigten sich sowohl Deletionen als auch DNA-Gewinne in Form von DNA-Überrepräsentationen bei beiden Tumorsubtypen, 82 bei denen eine „genetische Instabilität in der morphologischen Heterogenität (in Form von Kombinationstumoren) zum Ausdruck kommt“. Petersen stellt sogar das Modell auf, daß sich ein kleinzelliger Lungentumor sowohl primär als auch sekundär aus einem nichtkleinzelligen Tumor über chromosomale Veränderungen entwickeln kann (Petersen 1999). Im Gegensatz zu den im Folgenden aufgeführten Veränderungen von Adenokarzinomen, zeigen sich bei histomorphologischen den Vergleich Plattenepithelkarzinomen divergierende im Veränderungen prä-/posttherapeutischen von Tumorzellen und Zellkernen, die in den meisten Fällen mit Zeichen der therapieinduzierten Tumorregression vergesellschaftet waren, da hier die typische zentrale Nekrosezone mit umliegender Schaumzellbildung und angrenzendem Granulationsgewebe zu sehen war (Junker et al 1997). Ursächlich für die beschriebenen Phänomene ist wahrscheinlich insbesondere eine ausgeprägte genetische Instabilität der Tumorzellen. Diese Instabilität kann durch einen Verlust der Apoptose (programmierter Zelltod) bei einem durch Mutation hervorgerufenem Verlust des Tumorsuppressorgens p53 hervorgerufen werden. Dabei kommt es zu einer Akkumulation von genetischen Defekten und somit zu genetisch instabilen Tumorzellen, die einen Selektionsvorteil durch eine erhöhte Therapieresistenz erhalten. Hierbei könnte ein Zusammenhang zwischen der genetischen Instabilität und den posttherapeutischen Zell- und Kerngrößenveränderungen bestehen. 5.4. Entwicklung der Zell- und Kerngröße bei Patienten mit Adenokarzinomen nach Radio- und Chemotherapie Die große Spannbreite in der Größe der Zell- und Kernflächen fällt besonders bei Auswertung der Adenokarzinome auf. Es zeigt sich bereits prätherapeutisch eine Diskrepanz der Zellflächen innerhalb der Patientengruppe mit einer kleinsten Fläche von 70,6 µm² und einer größten Fläche von 176,2 µm². Dieser Größenunterschied bleibt posttherapeutisch weiter bestehen mit einer minimalen Fläche von 71,4 µm² und 243,4 µm² maximal, dies entspricht einem Größenzuwachs zwischen 1% und 48%. Die Patienten mit bereits prätherapeutisch großen Zellflächen zeigten nach Therapie den höchsten Zuwachs von 48% bzw. 38%. Dabei fällt vor allem die überproportionale Zunahme der Kernfläche 83 im Verhältnis zur Zellfläche auf, sie beträgt zwischen 1% und 83%. Diese Größenzunahme muß als überproportionale Kombinationstherapie gewertet Reaktion werden. des Die Zellkerns auf Zelldurchmesser die der angewandte Adenokarzinome nahmen bei 5 Patienten zwischen 7% und 14% zu, bei einem Patienten konnte rechnerisch keine Veränderung des Zelldurchmessers festgestellt werden. Die Zellkerne vergrößerten sich zwischen 2% und 34%, bei einem Patienten ergaben die Messungen des Kerndurchmessers für das behandelte und unbehandelte Gewebe rechnerisch den gleichen Wert. Aus diesen Größenverhältnissen ergab sich bei vier Patienten posttherapeutisch eine höhere Kern-Plasma-Relation, während bei zwei Patienten der Kernanteil durch prozentual stärkere Zunahme des Zelldurchmessers im Vergleich zum Kerndurchmesser oder durch unveränderte Kerngröße, bei zunehmendem Zelldurchmesser, abnahm. Im Gegensatz zu den Plattenepithelkarzinomen zeigt sich für die Adenokarzinome beim prä-/posttherapeutischen Vergleich der Tumorzellen eine signifikante Zunahme der Zellgröße in der Fläche (p=0,034) sowie im Durchmesser (p=0,015), wobei auch hier innerhalb des Untersuchungsgutes eine deutliche individuelle Streuung feststellbar ist. Die Veränderungen der Zellkerne zeigten für Fläche und Durchmesser einen deutlichen Trend an (p=0,067 und p=0,063). Bei zwei Patienten war weniger als 10% Resttumor nachweisbar, sodaß eine Zuordnung zu dem Regressionsgrad II B erfolgte, während in den Resektaten von drei Patienten mehr als 10% Tumorgewebe nachweisbar war (RG II A). Bei einem Patienten waren die Regressionszeichen lediglich im Sinne spontaner Veränderungen anzusehen (RG I). Die Überlebenszeit dieser Patientengruppe betrug zwischen 6 und 25 Monaten, am follow-up-Ende waren fünf Patienten verstorben, ein Patient wies zu diesem Zeitpunkt, 17 Monate nach Diagnosestellung, Fernmetastasen auf. Unter der Berücksichtigung der Anzahl von 6 Patienten für diese Gruppe, läßt sich feststellen, daß die Adenokarzinome dieses Kollektivs bei 5 Patienten eine einheitliche Vergrößerung der Tumorzellen und Zellkerne zeigen, die als therapieinduziert zu werten ist, da sich histopathologisch deutliche Zeichen einer Zytostatika- und Strahleninduzierten Tumorregression fanden. Dazu gehören, neben den zentralen Nekroseherden und Schaumzellbildung sowie angrenzendem Granulationsgewebe, auch zytologische Zeichen, die zum Teil, jedoch in unterschiedlicher Ausprägung, auch bei den Plattenepithelkarzinomen beobachtet werden 84 konnten. Bei lichtmikroskopischer Betrachtung kann ein Nebeneinander heterogener Tumorzellen mit unterschiedlichen morphologischen Aspekten beobachtet werden. Die Tumorzellen zeigen in ihrer posttherapeutischen Resektaten pyknotisch erscheinenden Größe der Zellen und Form Adenokarzinome mit dicht deutliche fanden gepackten Variationen. sich, und In neben dunklen den vereinzelt Zellkernen (Kondensationsphänomen) in Analogie zu den Plattenepithelkarzinomen, hier insbesondere große, blasse bis Zytoplasmaauftreibung anaplastisch und erscheinende Tumorzellen. Vakuolisierungsphänomene erschien Durch das eine wabige Zytoplasma bei diesen Zellen klar und hell. Ursächlich scheint eine therapieinduzierte Sekretionsstörung schleimproduzierender Tumorzellen zu sein (Fischer 1985). Derartige Zytoplasmavakuolisierung und Ballonierung mit konsekutiver Zellvergrößerung wurde posttherapeutisch unter anderem auch an Prostatakarzinomen, und Leberkarzinomen beobachtet Mammakarzinomen und als therapieinduziert gewertet (Helpap et al. 1985, Leistenschneider und Nagel 1984, Moll und Chumas 1997, Kennedy et al. 1990, Rasbridge et al. 1994, Fischer 1985). In ihren Untersuchungen zu Urothelkarzinomen wiesen Albrectsen und Rygaard ebenfalls ein vergrößertes Kernvolumen nach und werteten es als zytostatischen Effekt, da Zytostatika die G2-Phase des Zellzyklus blockieren und daraus eine Kernvergrößerung resultiert (Albrectsen und Rygaard 1995). Die lichtmikroskopischen Beobachtungen machen deutlich, daß es sich bei den malignen Lungentumoren um biologisch sehr heterogenes Tumorgewebe handelt. Die Ursache liegt wahrscheinlich vor allem in der Polyklonalität von malignen Tumoren, die nach einer Untersuchung von Müller und Mitarbeitern in 64% der Lungenkarzinome anzutreffen ist (Müller et al. 1986). Dunnill und Gatter zeigten ebenfalls eine zelluläre Heterogenität in einer Studie an 66 Lungenkarzinomen, in der nur in 18 Fällen eine einzige Tumorzellreihe nachweisbar war (Dunnill und Gatter 1986). Höring fand in einer Studie an 27 Lungenkarzinomen heraus, daß Plattenepithelkarzinome dazu neigen mehrere Zellklone in einem Tumor zu entwickeln und betrachtet 30% der Lungenkarzinome als „kombinierte“ Tumoren (Höring et al. 1983), daher erscheint nicht verwunderlich, daß sich nach therapeutischen Maßnahmen durch Selektionsmechanismen in Größe und Anfärbbarkeit morphologisch differente Tumorzellen zeigen. 85 Ishikawa, Kato und Kitagawa veröffentlichten in einer Studie 1999 die These, daß maligne Tumoren aus mehr als einer Komponente bestehen und daher auch eine unterschiedliche Sensitivität aufweisen therapeutischen können. Sie Maßnahmen, beobachteten insbesondere an einem Chemotherapie, kleinzelligen gegenüber Lungenkarzinom prätherapeutisch führende Kennzeichen eines Oat-cell-Typs mit kleinen Kernen und spärlichem Zytoplasma. Nach Chemotherapie jedoch zeigten sich bei gutem klinischem Therapieerfolg fusiforme Zellen. Daher gingen sie davon aus, daß der Tumor bereits primär aus einer Oat-cell- und einer fusiformen Komponente bestand, die Oat-cell-Linie jedoch chemosensitiver war, sodaß schließlich posttherapeutisch die fusiformen Zellen noch nachweisbar waren. Die Autoren sind der Ansicht, daß jedoch nicht die Schlußfolgerung gezogen werden sollte, daß ein Tumor als „chemoresistent“ zu bezeichnen ist, wenn posttherapeutisch maligne Zellen eines anderen Subtyps persistieren (Ishikawa, Kato und Kitagawa 1999). Yang beobachtete in einer Fallstudie eines gemischten klein-/großzelligen Lungenkarzinoms kleine Zellen mit pyknotischen Kernen, spärlichem Zytoplasma und große Zellen mit vesikulären Kernen und reichlich Zytoplasma. Die Form und Größe der Zellkerne waren äußerst variabel. Sie betrachtete dies jedoch nicht als ein Nebeneinander zwei verschiedener Zelltypen, sondern vermutete, daß es sich bei den kleinen Zellen um degenerativ veränderte „große“ Zellen handelt, die sie für die vitale Zellform hält (Yang 1995). Es soll nochmals darauf hingewiesen werden, daß in dem dieser Dissertation zugrunde liegendem Kollektiv gemäß den Ein- bzw. Ausschlußkriterien keine Tumoren mit kleinzelligen Anteilen untersucht wurden. 86 5.5. Abgrenzung der zytologischen Veränderungen von Apoptose und Nekrose Prinzipiell muß beim Untergang von Tumorzellen zwischen 2 Mechanismen unterschieden werden: 1. Die Tumorzellnekrose Koagulationsnekrose. imponiert Typisch sind als fokal hierbei angelegte den Kolliquations- Nekroseherden oder unmittelbar angrenzende Tumorsäume mit guter kapillärer Versorgung sowie eine kennzeichnende granulozytäre Reaktion. Sie ist ein rasch ablaufender pathologischer Zelltod. 2. Die Apoptose ist demgegenüber als programmierter Zelltod abzugrenzen, der sowohl physiologisch, spontan in neoplastischem Gewebe als auch bei der therapieinduzierten Tumorregression nachweisbar ist (Kerr et al. 1972). Wichtiges Merkmal der Apoptose ist der stadienhafte Verlauf. Über Zellschrumpfung mit Auffaltung der Oberfläche durch Volumenverlust und DNA-Fragmentierung bilden sich sogenannte „apoptotic bodies“. Außerdem fehlt im Gegensatz zur spontanen Nekrose die granulozytäre Reaktion. Die von Kerr et al. bereits 1972 beschriebene Beteiligung der Apoptose an der therapieinduzierten Tumorregression wird von zahlreichen Autoren gestützt (Barry et al. 1990, Eastman 1990, Fisher 1994, Vermes und Haanen 1994). Die Erkenntnisse zeigen, daß die Apoptose durch eine mittels Zytostatika oder Bestrahlung induzierte DNASchädigung eingeleitet wird und somit als therapieinduziert zu werten ist. Vor allem Alkylantien wie die Platinkomplexe Cis- oder Carboplatin und der Topoisomerasehemmer Etoposid gelten als Induktoren. Beide Substanzgruppen wurden bei vorliegendem Patientenkollektiv eingesetzt. Die unter 5.4 diskutierten zytologischen Veränderungen der Tumorzellen und Zellkerne nach neoadjuvanter Therapie wiesen nur ganz vereinzelt mophologische Zeichen der Apoptose auf wie z.B. Kernpyknosen. Ebenso liessen sich Zeichen der Tumornekrose mit Nekrosefeldern und typischer granulozytärer Umgebungsreaktion nachweisen. Junker konnte jedoch in seiner Habilitationsarbeit zur Tumorregression bösartiger Lungentumoren anhand immunhistochemischer Untersuchungen mit der ISEL- und TUNEL-Methode im prä-post Vergleich der nicht-kleinzelligen Karzinome zeigen, daß es sich bei diesen Tumorzellen weder um apoptotische noch um nekrobiotische Zellen handelt (Junker 1998). 87 Vielmehr handelt es sich um vitale Tumorzellen, die möglicherweise durch therapieinduzierte Selektionseffekte eine andere Morphologie erhalten. 5.6. Abhängigkeit der Zell- und Kerngrößen und des Stadiums vom Regressionsgrad Nachdem sich für dieses Studienkollektiv herausstellte, daß ein erheblicher Unterschied in der Länge der medianen Überlebenszeit bei Patienten mit therapieinduzierten regressiven Veränderungen und einem Resttumor von weniger als 10%, gegenüber Patienten mit einem deutlich höheren Anteil vitalen Tumorgewebes vorliegt, wurde ein Zusammenhang zwischen den Regressionsgraden und den Zell- und Kernparametern sowie dem Erkrankungsstadium geprüft. Dabei ließ sich ein linearer Zusammenhang zwischen der posttherapeutischen Zell- oder Kerngröße und dem Regressionsgrad nicht herstellen, da das Kollektiv der Patienten mit RG I/II A nahezu äquivalent auf die Gruppen "kleine" und "große" Flächen bzw. Durchmesser mit jeweils 4 bzw. 5 Patienten verteilt war. Ähnlich verhielt es sich bei den Patienten mit RG II B, die sich mit 7 bzw. 6 Patienten auf die beiden Gruppen der großen und kleinen Durchmesser oder Flächen verteilten. Eine signifikante Beziehung zwischen der Kern-Plasma-Relation und dem Regressionsgrad ließ sich anhand dieses Patientenkollektivs nicht aufzeigen (p=0,192). Für die Verteilung des Stadiums auf die Regressionsgrade zeigte sich ein Schwerpunkt mit 10 von 14 Patienten im prognostisch günstigeren Stadium III A auf den RG II B (gute TherapieResponse), während von den 8 Patienten im ungünstigen Stadium III B nur 3 Patienten Zeichen der Tumorregression gemäß RG II B aufwiesen und der größere Teil somit posttherapeutisch einen deutlich höheren Resttumoranteil hatte. Hierbei handelt es sich um Beobachtungen, über die bei der für eine Vier-Feldertafel geringen Patientenzahl, keine statistisch signifikanten Aussagen getroffen werden können (p=0,187). Ein diesbezüglicher Vergleich mit anderen Studienergebnissen entsprechenden Publikationen vorliegen. 88 war nicht möglich, da hierzu keine 5.7. Einfluß der Zell- und Kernparameter auf das Überleben Für das Studienkollektiv wurde unter der angewandten Kombinationstherapie eine mediane Überlebenszeit von 18 Monaten festgestellt. Ein Ziel der Arbeit war, herauszufinden ob eine Beziehung zwischen der Größe morphologischer Parameter wie Zell- oder Kerngröße und der Länge der Überlebenszeit besteht. Zu diesem Zweck wurde für jeden Parameter aus den Meßergebnissen der Patienten jeweils eine Gruppe „klein“ und eine Gruppe „groß“ gebildet. Als cut-off diente jeweils der Median. Es zeigte sich für dieses Kollektiv, daß Patienten mit prätherapeutisch großen Tumorzellen und großen Zellkernen einen signifikanten Überlebensvorteil hatten. Für Zellfläche und Zelldurchmesser wurden jeweils für die Gruppe 1 (klein) eine mediane Überlebenszeit von 14 Monaten, für die Gruppe 2 (groß) eine MÜZ von 30 Monaten ermittelt (p=0,002). Patienten mit einer kleinen Kernfläche überlebten median 15 Monate, Patienten mit einer großen Kernfläche hatten mit median 42 Monaten eine signifikant günstigere Prognose (p=0,004). Einen signifikanten Unterschied zeigte ebenso die nach Größen getrennte mediane Überlebenszeit des Kerndurchmessers von 16 Monaten für die Gruppe "kleine" und "große" Durchmesser von 28 Monaten (p=0,039). In der Literatur wird über eine Korrelation zwischen morphologischen Merkmalen, wie z.B. dem Kerndurchmesser, und der Überlebenszeit für verschiedene maligne Tumoren kontrovers berichtet. Einige Autoren konnten einen Zusammenhang zwischen dem Zellkern und dem weiteren klinischen Verlauf herstellen. Dazu zählen van Bogaert und Mitarbeiter, die den mittleren Kerndurchmesser bei 100 Mammakarzinomen anhand von Operationspräparaten untersuchten, die Kerngrößen in drei Gruppen unterteilten (klein, mittel, groß) und dabei eine höhere Mortalität bei steigendem Kerndurchmesser feststellten (van Bogaert et al. 1980). Vergleichbare Beobachtungen bei Mammakarzinomen machten Zajdela et al. mit 245 Aspirationspräparaten, an denen die Kerndurchmesser ausgemessen, und in "klein" (Durchmesser kleiner 12 µm) und "groß" (>12 µm) typisiert wurden. Für die Gruppe der kleinen Zellkerne betrug die 5-Jahres-Überlebensrate 90%, für die Gruppe mit großen Kernen 58%. Außerdem war das Intervall zwischen Therapie und dem Auftreten von Fernmetastasen in der Gruppe "kleine Durchmesser" signifikant länger als in der anderen Gruppe (Zajdela et al. 1979). Die Beobachtungen dieser beiden Autoren an Mammakarzinomen stehen somit im Gegensatz zu den untersuchten NSCLC, denn im 89 vorliegenden Kollektiv zeigte sich für Patienten mit großen Zellkernen eine signifikant längere Überlebenszeit. An Schilddrüsenkarzinomen stellten Lee et al. fest, daß Patienten mit kleinen Kernen die 5-Jahres-Grenze erreichten, während Patienten mit großen Kernen zuvor verstarben. Jedoch zeigte sich, daß die Größe der Zellkerne der Patienten, die die 10-Jahres-Grenze überschritten, am Übergang zwischen kleinen und großen Kernen lag (Lee et al. 1987). An medullären Schilddrüsenkarzinomen beobachteten Galera-Davidson und Mitarbeiter ebenfalls eine günstigere Prognose bei Patienten mit kleinen Tumorzellen und Zellkernen (Galera-Davidson et al. 1990). Andere Autoren konnten keine Beziehung zwischen morphologischen Parametern und dem Überleben herstellen. Hierzu gehören auch Close und Mitarbeiter, die in ihrer Studie an chemotherapierten Kernvergrößerungen Mammakarzinomen feststellten. Eine (16 Patientinnen) Korrelation in zwischen über diesen 50% ebenfalls morphologischen Veränderungen und dem krankheitsfreien Überleben war hier jedoch nicht zu belegen (Close et al. 1987). Heimann et al. untersuchten an 39 Rektumkarzinomen Kernfläche, Umfang und den längsten Durchmesser, konnten jedoch ebenfalls keine Abhängigkeit dieser Parameter vom krankheitsfreien Überleben erkennen (Heimann et al. 1991). Eine Arbeitsgruppe um Lee untersuchte SCLC (1990) und NSCLC (1989) im Hinblick auf diese Fragestellung. Der mittlere Zelldurchmesser von 42 kleinzelligen Lungenkarzinomen wurde durch Messungen an median 110 Zellen pro Patient festgestellt und zum Erkrankungsstadium, Therapie-Response und Überlebenszeit in Beziehung gesetzt. Eine Korrelation zwischen Kerndurchmesser, klinischer Therapieantwort und Überleben ließ sich in seinem Untersuchungsgut nicht verifizieren, jedoch korrelierten Stadium und Kerndurchmesser miteinander (Lee et al. 1990). Im Vergleich zur vorliegenden Studie an nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen zeigten sich bei Lee Kerndurchmesser. Sie betrugen im Mittel 8,2 µm, mit einer Streuung deutlich größere zwischen 7,3 µm und 10,1 µm. Ein weiterer Unterschied zu Lee et al. ist im Tumorstadium zu sehen, da in der Kleinzeller-Studie sowohl Patienten mit fortgeschrittenem als auch mit lokal begrenztem Tumorstadium aufgenommen wurden, wohingegen in vorliegendem Kollektiv nur Patienten mit Tumorstadium III A und III B eingeschlossen waren (Lee et al. 1990). 90 In Lee`s Studie über nicht-kleinzellige Lungenkarzinome wurden 30 Patienten (8 Adenokarzinome, 18 Plattenepithelkarzinome, 4 großzellige Karzinome) im Stadium III mit Cisplatin-haltiger Chemotherapie und Radiatio behandelt. Anschließend wurde der größte Durchmesser von Kern und Zytoplasma gemessen und daraus eine Kern-PlasmaRelation errechnet. Diese morphometrischen Parameter an posttherapeutischen Resektaten zeigten bei Lee keine signifikante Beziehung zur Überlebenszeit (Lee et al. 1989). 5.8. Einfluß von Stadium und Regressionsgrad auf das Überleben Der Regressionsgrad stellt für die Beurteilung der Prognose einen weiteren wichtigen Baustein dar, denn er zeigt die Sensibilität des Tumorgewebes auf die stattgehabte Therapie. Dies ist quantitativ nachweisbar, als Marker gilt eine Grenze von 10% Resttumor, und zeigt sich deutlich an den bereits dargestellten therapieinduzierten histologischen Regressionszeichen. Der Grad der Tumorregression ist ein wichtiger prognostischer Faktor für jeden einzelnen Patienten (Junker et al. 1997). Im vorliegenden Kollektiv zeigte sich für die Patienten mit dem RG II B ein deutlicher Überlebensvorteil von 23 Monaten gegenüber 14 Monaten für die Patienten mit dem RG I oder II A. Der signifikante Unterschied in der Länge der medianen Überlebenszeit von Patienten mit RG II B/III gegenüber Patienten mit RG I/II A kommt aufgrund der Studienkriterien (Patienten mit RG III wurden wegen des fehlenden Tumorgewebes in den Resektaten nicht untersucht) hier nicht zum Tragen (p=0,096), konnte jedoch unter Einbeziehung der RG III-Patienten im Gesamtkollektiv ermittelt werden (p=0,02). Hierbei zeigte sich ein signifkanter Überlebensvorteil von 27,9 Monaten versus 12,7 Monaten (Junker et al. 1997). Mandard und Mitarbeiter konnten bei 93 an Oesophaguskarzinomen erkrankten Patienten, die präoperativ mit ChemoTumorregressionsverhaltens und Strahlentherapie behandelt und hinsichtlich ihres untersucht wurden, mit zunehmendem Regressionsgrad ebenfalls eine Korrelation zur Überlebenszeit aufzeigen (Mandard et al. 1994). Auch Pisters und Mitarbeiter bewiesen den Einfluß der Tumorregression bei Patienten mit nichtkleinzelligen Lungenkarzinomen auf die Überlebenszeit. Sie stellten bei Patienten, die präoperativ eine Chemotherapie erhielten, 91 eine Korrelation zwischen kompletter Tumorregression und einer langen Überlebenszeit fest (Pisters et al. 1993). Es zeigt sich, daß das Ausmaß der Tumorregression, obgleich differierende Forschungsergebnisse vorliegen, ein wichtiger Faktor für das Überleben ist, weitere Parameter aber mit einbezogen werden müssen. Dazu gehört auch das Ausmaß der Resektion, denn kann das Tumorgewebe in toto reseziert werden (=R0-Resektion), werden nach einer Untersuchung von Izbicki bei erweiteter Resektion 2-Jahres-Überlebensraten von 65% bei Patienten im T3 und T4 Stadium erreicht. Die 2-Jahres-Überlebensrate betrug bei Patienten mit Resttumor (R1- oder R2-Resektion) in seiner Studie hingegen 22% (Izbicki et al. 1992). Desweiteren ist entscheidend, welches Operationsverfahren aufgrund der Lokalisation des Primärtumors angewandt wurde. Prinzipiell ist davon auszugehen, daß die Prognose für Patienten mit möglichst geringem Verlust funktionstüchtigen Gewebes günstiger ist. Ein weiterer Überlebensfaktor ist das Tumorstadium bei Diagnosestellung. Das Patientenkollektiv wurde daher auch für das Stadium III A und Stadium III B getrennt hinsichtlich der medianen Überlebenszeit untersucht. Für die 14 Patienten im Stadium III A wurde eine ÜLZ von 24 Monaten, für die 8 Patienten im Stadium III B eine Überlebenszeit von 12 Monaten errechnet. Ein signifikanter Unterschied ließ sich hier, trotz Halbierung der medianen Überlebenszeiten für Patienten mit Stadium III B, nicht nachweisen (p=0,208). Zu dem gleichen Ergebnis kam ein Vergleich der Überlebenszeiten aller 54 Studienpatienten. Patienten im Stadium III A des Gesamtkollektivs lebten median 25 Monate, Patienten im Stadium III B 17 Monate (p=0,33). Albain et al. konnten 1995 bei 126 Patienten mit NSCLC, die mit Cisplatin/Etoposid chemotherapiert und bestrahlt wurden, für das Stadium III A/III B ebenfalls keinen signifikanten Unterschied hinsichtlich des Überlebens feststellen. Weiterhin waren in dieser Studie der histologische Typ und die Größe des Primärtumors ohne Einfluß auf das Überleben. Als wichtigster prognostischer Parameter für die mediane Überlebenszeit wurde der Lymphknotenstatus festgestellt. Ähnliche Beobachtungen machten auch Choi und Mitarbeiter bei 42 Patienten mit NSCLC im Stadium III A, die mit Cisplatin-haltiger Chemo- und Radiotherapie behandelt wurden. Sie konnten ebenfalls keine Korrelation zwischen Alter, Geschlecht, histologischem Typ oder Größe des Primärtumors (T1,T2 vs. T3) zur Länge der Überlebenszeit aufzeigen (Choi et al. 1996). Harpole et al. hingegen untersuchten 271 Resektate von nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen im Stadium I und stellten mit zunehmender Tumorgröße (T1, T2) eine abnehmende Überlebenszeit fest 92 (Harpole et al. 1995). Eine Ursache für die unterschiedlichen Ergebnisse dieser Studien könnte im unterschiedlichen Tumorstadium liegen oder in der präoperativen Therapie, die bei fortgeschrittenen Lungentumoren eingesetzt wird, sodaß hierbei die Tumorgröße bereits präoperativ beeinflußt wird. Fraire und Mitarbeiter hingegen stellten in einer Untersuchung an 100 Lungenkarzinomen einen statistisch signifikanten Unterschied der MÜZ bezüglich des Tumorstadiums fest (Fraire et al. 1987). In einer Studie von Barthlen et al. 1993 an 1325 Patienten mit kleinund nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen zeigte sich für Patienten mit T1N0M0 Adenokarzinomen eine bessere 5-Jahres-Überlebensrate als für die entsprechenden Plattenepithelkarzinome. Auch in dieser Untersuchung konnte der Lymphknotenstatus Hinweise für die Prognose aufzeigen: Patienten mit T3N2 Tumoren hatten eine ungünstigere Prognose als Patienten mit T3-4, aber N0-1. So scheint weiterhin die Wertigkeit des Stadiums für die Prognose der Patienten ungewiß zu sein, während die Bedeutung des Lymphknotenstatus für die Prognose unumstritten ist (Höpker und Lüllig 1987). 93 6. Zusammenfassung Zur Analyse zellulärer Veränderungen nicht-kleinzelliger Lungenkarzinome nach neoadjuvanter Radio- und Chemotherapie, wurden Proben von vitalem Tumorgewebe von 24 Patienten mit nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen (18 Plattenepithel-, 6 Adenokarzinome) zum Zeitpunkt der Diagnosestellung und variabel regressiv verändertes Tumorgewebe in Operationsresektaten dieser Patienten nach Bestrahlungs- und Chemotherapie hinsichtlich einer therapieinduzierten Größenveränderung der Tumorzellen und Zellkerne untersucht. Alle Patienten befanden sich den Studienkriterien entsprechend bei Diagnosestellung im Tumorstadium III A oder III B. Pro Patient wurden 100 bis 200 vollständig erfasste Zellen mittels Computer gestütztem Bildanalysesystem hinsichtlich der Zell- und Kernfläche, des Zell- und Kerndurchmessers und der Kern-Plasma-Relation untersucht. Prätherapeutisch wurde in Biopsien für die Plattenepithelkarzinome im Mittel eine Zellfläche von 101,8 + 4,1µm², eine Kernfläche von 36,5 + 1,5 µm², ein Zelldurchmesser von 11,9 + 0,2 µm und ein Kerndurchmesser von 7,0 + 0,1 µm festgestellt. Die Zellen der Adenokarzinome waren mit einer Fläche von 105,2 + 16,8 µm² und einem Durchmesser von 12,1 + 1,1 µm etwas größer. Die Kernfläche lag mit 33,9 + 2,8 µm² im Vergleich jedoch, ebenso wie der Kerndurchmesser mit 6,8 + 0,3 µm, unter dem Niveau der Plattenepithelkarzinome. Die Kern-Plasma-Relation betrug 59,4% für die Plattenepithelkarzinom-Gruppe und 57,3% für die Gruppe der Adenokarzinome. Nach kombinierter Chemo- und Radiotherapie zeigte sich im Resttumorgewebe von Operationsresektaten der Plattenepithelkarzinome insgesamt eine Verkleinerung der Tumorzellen. Die Mittelwerte betrugen für die Zellfläche 99,6 + 5,8 µm² (p=0,72), Kernfläche 34,8 + 2,2 µm² (p=0,50), Zelldurchmesser 11,6 + 0,3 µm (p=0,49) und für den Kerndurchmesser 6,8 + 0,2 µm (p=0,34). Die Adenokarzinome hingegen wiesen posttherapeutisch vergrößerte Tumorzellen und Kerne auf. Im Mittel betrug die Zellfläche 137,2 + 27,4 µm² (p=0,034), die Kernfläche 46,1 + 7,3 µm² (p=0,067), der Zelldurchmesser 13,2 + 1,3 µm (p=0,015) (p=0,063). Auch die und der Kerndurchmesser 7,7 + 0,6 µm Kern-Plasma-Relation 94 verringerte sich bei den Plattenepithelkarzinomen um 1% auf 58,4% (p=0,368), während sie sich bei den Adenokarzinomen um 1,5% auf 58,8% (p=0,547) erhöhte. Nach Abschluß der Therapie wurden Tumorreste in Operationsresektaten hinsichtlich der Tumorregression untersucht und einem Regressionsgrading (RG) zugeordnet. Hierbei zeigten 3 Patienten keine therapieinduzierten Regressionszeichen (RG I), bei 7 Patienten zeigten sich bei therapieinduzierter Tumorregression mehr als 10% Resttumor (RG II A). Regressionsgrad II B mit weniger als 10% Resttumor bei therapieinduzierter Regression war bei 14 Patienten zu beobachten, Patienten mit RG III (kein vitales Tumorgewebe) wurden gemäß der Fragestellung nicht untersucht. Eine statistisch signifikante Korrelation der posttherapeutisch ermittelten Zell- und Kerngrößen mit dem Regressionsgrad ließ sich nicht nachweisen. In diesem Studienkollektiv war ein Zusammenhang zwischen dem Tumorstadium und dem Ausmaß der Tumorregression nicht festzustellen (p=0,187). Die mediane Überlebenszeit für das untersuchte Patientenkollektiv betrug 18 Monate. Es zeigte sich für die Plattenepithel- und Adenokarzinome, daß Patienten mit initial großen Tumorzellen eine signifikant längere Überlebenszeit (30 Monate) als Patienten mit prätherapeutisch kleinen Tumorzellen (14 Monate) hatten. Dies war anhand der prätherapeutisch ermittelten Parameter Zellfläche (p=0,002), Zelldurchmesser (p=0,002), Kerndurchmesser (p=0,039) und Kernfläche (p=0,004) nachweisbar. Ein statistisch signifikanter Überlebensvorteil für Patienten im Stadium III A (25 Monate) gegenüber Stadium III B (17 Monate) oder für die Regressionsgrade I und II A gegenüber RG II B konnte trotz deutlichem Unterschied von 14 Monaten versus 23 Monaten in diesem Kollektiv nicht nachgewiesen werden. Ein linearer Zusammenhang zwischen der posttherapeutisch ermittelten Zell- und Kerngröße und dem Regressionsgrad ließ sich nicht herstellen. Es konnte gezeigt werden, daß das Ausmaß der Tumorregression ein wichtiger Faktor für die Überlebenszeit ist, weitere Faktoren wie beispielsweise das Ausmaß der Tumorresektion jedoch mit einbezogen werden müssen. Im untersuchten Kollektiv wurde deutlich, daß insbesondere posttherapeutisch auffällige Größenunterschiede der Plattenepithelkarzinomen Tumorzellen vorliegen. Es und konnte 95 Zellkerne zwischen nachgewiesen Adeno- werden, daß und die prätherapeutische Größe der Tumorzellen und deren Kerne eine direkte Korrelation zur Überlebenszeit aufwiesen und Patienten mit großen Tumorzellen sowie Zellkernen einen erheblichen Überlebensvorteil (16 Monate) gegenüber Patienten mit kleinen Zellen und Kernen hatten. Der Einfluß der Therapie auf die Größe der Zellen war unterschiedlich, während sich bei den Plattenepithelkarzinomen Gruppen von Patienten mit simultaner Tumorzellverkleinerung und Vergrößerung sowie divergierende Größenveränderungen von Zellen und Kernen beobachten ließen, konnte für die Gruppe der Adenokarzinome posttherapeutisch eine signifkante einheitliche Tumorzell- und Kernvergrößerung gezeigt werden. Ursächlich für die beobachteten Veränderungen könnte eine ausgeprägte Tumorheterogenität sein, die sich nach Therapie morphologisch in einem Nebeneinander von kleinen, pyknotischen und vakuolisierten Zellen äußert. Möglicherweise kommt es so bei unterschiedlicher Strahlen- und Chemosensibilität der Tumorzellen zu Selektionsphänomenen mit einer Akkumulation größerer Zellen bei den untersuchten Adenokarzinomen. Die Beobachtung der posttherapeutischen Größenzunahme durch Vakuolisierungsphänome, wie sie bei unterschiedlichen Tumoren von mehreren Autoren beobachtet wurden, konnte in diesem Studienkollektiv an den Adenokarzinomen mit den morphometrischen Untersuchungen eindeutig quantitativ erfaßt und objektiviert werden. 96 7. Literaturverzeichnis 1. Abeloff, M.D., Eggleston, J.C. Morphologic changes following therapy. in: Greco, F.A., Oldham, R.K., Bunn, P.A. (eds) Small cell lung cancer 235-259 Grune & Stratton, New York 1981 2. Albain, K.S., Rusch, V.W., Crowly, J.J., Rice, T.W., Turrisi, A.T., Weick, J.K., Lonchyna, V.A., Presant, C.A., McKenna, R.J., Gandara, D.R., Fosmire, H., Taylor, S.A., Stelzer, K.J., Beasley, K.R. and Linvingston, R.B. Concurrent cisplatin/etoposide plus chest radiotherapy followed by surgery for stages III A (N2) and III B non-small-cell lung cancer: mature results of southwest oncology group Phase II Study 8805. J Clin Oncol. 13, 1880-1892 (1995) 3. 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The relation of prognosis to the nuclear diameter of breast cancer cells obtained by cytologic aspiration. Acta Cytol 23, 75-80 (1979) 114 Herrn Privat-Dozent Dr. med. K. Junker danke ich herzlich für seine Hilfsbereitschaft und fortwährende Unterstützung, die stets mit fachkundiger Beratung bei der Umsetzung des Themas verbunden war. Herrn Professor Dr. med. K-M. Müller danke ich herzlich für die Vergabe des Themas und für die kritischen Anmerkungen und Ratschläge. Ebenso danke ich den Mitarbeitern des Instituts für Pathologie der Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil-Universitätsklinik, die mich bei der Dissertation unterstützt haben. Meinen Eltern danke ich herzlich für ihre Unterstützung. Ein besonderer Dank gilt meinem Mann, Dr. U. M. Abker, der mir immer beratend und unterstützend zur Seite gestanden hat. 115 Lebenslauf Persönliche Daten Name: Vorname: Geburtsdatum/-ort: Anschrift: Familienstand: Schulbildung 1977 - 1981 1981 - 1982 1982 - 1983 1983 - 1990 Hochschulbildung 1993 - 2000 1995 1997 1999 1999 - 2000 Beruflicher Werdegang 1990 - 1993 1993 - 1993 Juni 2000 - November 2001 seit Dezember 2001 Abker, geb. Paluszynski Sandra 10.03.1971 in Dortmund Trapphofstr. 165 44287 Dortmund verheiratet Grundschule in Dortmund Käthe-Kollwitz-Gymnasium, Dortmund Gymnasium Ottobrunn, München Käthe-Kollwitz-Gymnasium, Dortmund Abschluß: Allgemeine Hochschulreife Studium der Humanmedizin an der Ruhr-Universität Bochum Ärztliche Vorprüfung 1. Abschnitt der ärztlichen Prüfung 2. Abschnitt der ärztlichen Prüfung Praktisches Jahr im Allgemeinen Krankenhaus gem. GmbH, Hagen, Wahlfach Anästhesie Berufsausbildung zur Bankkauffrau, BfG Bank AG, Dortmund Berufstätigkeit als Bankkauffrau, Stadtsparkasse Dortmund Ärztin im Praktikum, Katharinen-Hospital Unna, Innere Abteilung II (Kardiologie) Assistenzärztin, Katharinen-Hospital Unna, Innere Abteilung II (Kardiologie) 116
