SignalTransductionPathwaysin - ETH E

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Diss. ETH No.12980
Signal TransductionPathways in
Fas-mediated Apoptosis of Microglia
and Glioma Cells
A dissertation submitted to the
SWISS FEDERAL INSTITUTEOF TECHNOLOGY
for the
degree of Doctor of Natural Sciences
presented by
RALPH SCHLAPBACH
Dipl. Natw. ETH
born 25th May, 1969
Citizen of Steffisburg, BE
accepted
on
the recommendationof
Prof. Dr. C. Richter, examiner
Prof. Dr. A. Fontana, co-examiner
1998
1.
Zusammenfassung
komplexen Organismen müssen permanent einzelne Zellen gezielt eliminiert werden.
Dies ist notwendig, da sich einerseits viele Gewebe ständig erneuern müssen und
andererseits auf diese Weise, der Entstehung von Tumoren und der Entwicklung
autoimmunologischer Reaktionen vorgebeugt werden kann. Das Sterben der Zellen folgt
In
den genau definierten Wegen des programmierten Zelltodes. Bei diesem auch Apoptose
genannten Phänomen treten charakteristische morphologische Veränderungen auf: Die
schrumpft, der Zellkern verdichtet sich und Vesikel werden von der Plasmamembran
abgeschnürt. Apoptose kann sowohl durch zytotoxische Substanzen wie auch durch
Interaktion mit anderen Zellen, die auf ihrer Oberfläche pro-apoptotischeSignalmoleküle
tragen oder solche sezernieren, ausgelöst werden. Die Weiterleitung des Apoptose-Signals
hängt von der Expression und der Funktion einer Anzahl Faktoren, wie zum Beispiel
Rezeptoren an der Zelloberfläche, Adaptorproteinen, Caspasen und ihren Inhibitoren,
Botenstoffen wie Ceramid, sowie zur Bcl-2 Familie gehörenden Proteinen ab.
Im Rahmen dieser Dissertation wurden zwei unterschiedliche Zelltypen des
Zentralnervensystems untersucht, Gliomzellen und Mikroglia. Ein ungebremstes
Wachstum von Gliomzellen führt zur Entstehung maligner Tumoren, die unkontrollierte
Aktivität von mikroglialen Zellen spielt wahrscheinlich eine wichtige Rolle in der
Pathogenese autoimmunologischer Reaktionen im Zentralen Nervensystem. Intrazelluläre
Mechanismen,welche nach der Interaktion von Fas ligand (FasL) mit dem Fas Rezeptor zur
Apoptose führen wurden untersucht und mit den Signalwegen, die durch die zytotoxische
Verbindung Puromycin und den Botenstoff Ceramid induziert werden, verglichen.
Die Puromycin-induzierteApoptose von Gliomzellen war abhängig von der Synthese proapoptosischer Faktoren und wurde weder durch erhöhte Mengen an Bcl-2, noch durch die
Antioxidantien /V-Acetyl-cystein(NAC) und Glutathion (GSH) oder durch die Inaktivierung
von Caspasen beeinträchtigt. Vor dem Fas-vermittelten Zelltod dagegen wurden diese
Zelle
Zellen durch eine
Ueberexpression
von
Bcl-2 teilweise und durch
Hemmung
Hemmung
der
der
Caspaseaktivität vollständig geschützt. Zudem verstärkte eine
Proteinexpression auf der Stufe von Transkription (Actinomycin D) und Translation
(Cycloheximid) die durch anti-Fas Antikörper induzierte Apoptose. Während Gliomzellen
FasL-sensitiv waren, konnten Mikroglia nur nach Vorstimulation mit proinflammatorischen
Zytokinen wie TNF-a (tumor necrosis factor-a) und IFN-y (interferon-y) durch Behandlung
mit FasL in Apoptose gebracht werden. Dabei scheint ein komplexer Regelmechanismus
eine Rolle zu spielen: Fas wird verstärkt auf der Zelloberfläche exprimiert und die
Expression anti-apoptotischer Faktoren wie Bcl-2
TNF-ct-aktivierter Mikroglia mit FasL führt
und
zu
Bcl-xL wird
reduziert. Die Stimulation
einer erhöhten
Caspaseaktivität.
Bedeutung: NAC und GSH,
Substanzen die durch ihre Wirkung auf die Atmungsketteden Redoxzustand der Zelle
beeinflussen, schützten nahezu vollständig vor FasL-induzierter Apoptose. Das
antiinflammatorische Zytokin TGF-ß (transforming growth factor-ß) neutralisierte die
Sensibilisierung durch TNF-a und IFN-y zumindest teilweise und führte, vermutlich durch
die Reduktion von Fas, die verstärkte Expression von Bcl-2 und die Verhinderung der
Caspaseaktivierung, zu Resistenz gegenüber FasL. Ceramid führt zur direkten Aktivierung
der Effektorcaspasen. Auf die Ceramid-induzierteApoptose von Mikroglia hatten die
Mitochondrien-assoziierte Faktoren sind ebenfalls
genannten pro- und antiinflammatorischen
von
Zytokine
keinen
Einfluss. Die erhöhte
Expression von FLIP (FLICE inhibitory protein) nach Zytkokinstimulation könnte eine
mögliche Ursache für die Hemmung der FasL-induzierten Signalkaskade oberhalb von
Ceramid und am Anfangspunkt der Caspasenkaskade sein. Im Fall von TGF-ß korrelierte
die Reduktion des Apoptose-Signals mit der stärksten Induktion von FLIP. Die
Aufregulation von FasL auf der Zelloberfläche von TGF-ß-stimulierten Mikroglia und die
Resistenz dieser Zellen selbst gegenüber FasL zeigen einen möglichen Weg auf, durch
welchen sich Mikroglia der Elimination im Rahmen einer Immunreaktion entziehen
könnten.
2.
Summary
complex organism is governed by the need for
renewal and elimination of aged, supernumerary or potentially dangerous cells. In contrast
to necrotic cell death following traumatic injury, cell death by apoptosis follows well tuned
pathways and includes characteristic morphological features including cellular shrinkage,
nuclear condensation and membrane blebbing. Apoptosis can be induced by cytostatic
drugs acting at the Single cell level or by the interaction of different types of cells
equipped with pro-apoptotic ligands and their respective receptors. Intracellular signaling
of apoptosis may recruit multiple pathways leading to finally irreversible execution steps.
Transduction of the death signal depends on the levels and funetions of a variety of
factors including death receptors and adaptor proteins, caspases and their inhibitors,
second messengers like ceramide, and pro- and anti-apoptotic proteins of the Bcl-2 family.
In this thesis, the intracellular events which mediate apoptosis induced by Fas
ligand (FasL) were investigated using glioma cells and microglia, two different types of
The death of
an
individual cell within
compared to enforced elimination of
by exposure to the cytotoxic drug puromyein and by ceramide.The importance of
cells of the central
the cells
a
nervous
system. The data
were
well-tuned elimination of these cells is illustrated by the diseases evoked by uncontrolled
growth and funetion of glioma cells and microglia leading to the occurrence of malignant
a
tumors and autoimmune diseases in the
brain, respectively.
Puromycin-induced apoptosis of glioma cells was found to depend on protein synthesis
and was not inhibited by increased amounts of intracellular Bcl-2 nor by addition of the
antioxidants A/-acetyl-cysteine (NAC) and glutathion (GSH). Fas-mediated cell death of
glioma cells was characterized by reduced killing of Bcl-2 overexpressing cells and by a
complete prevention of apoptosis by caspase-inhibitors. Inhibition of protein expression
through interference with transcription (with actinomyein D) and translation (with
cycloheximide) enhanced Fas-mediated apoptosis induced by anti-Fas antibody. In
aecordance with the pathways induced by puromyein, antioxidants did not reduce FasLinduced killing of glioma cells. Microglia were found to be killed only upon activation of
the cells by the proinflammatory cytokines tumor necrosis factor-ct (TNF-a) or interferon-y
(IFN-y). Activation of microglia led to increased Fas cell surface expression and to reduced
levels of Bcl-2 and Bcl-xL, providing a potential explanation for the increase in
suseeptibility. Furthermore, TNF-a prestimulation induced higher caspase-activities upon
exposure of the cells to FasL. The importance of mitochondrial events was underlined by
the
high efficiency
with which NAC and GSH
protected from FasL-induced
cell death. The
anti-inflammatory cytokine transforming growth factor-ß (TGF-ß) reversed many of the
effects of TNF-a and IFN-y including sensitization to FasL and led to reduced Fas cell
surface expression, to upregulation of Bcl-2, and efficiently blocked the activation of
caspases in resting or cytokine-activated microglia. Apoptosis-signaling induced by
ceramide was independent of modulatory effects of the pro- and anti-inflammatory
cytokines and was found to lead to direct activation of the downstream effector caspases.
A possible explanation for the inhibition of caspase-activity in Fas-mediated apoptosis by
TGF-ß may be the upregulation of the FLICE inhibitory protein (FLIP) which was found to
be highest in presence of TGF-ß. Together with the TGF-ß-induced upregulation of FasL
on the surface of microglia these results may outline a strategy for microglia to escape
their elimination in the
course
of an immune response.
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