NOVEL IMMUNOCYTOKINES FOR VASCULAR TUMOR

DISS. ETH NO. 17053
NOVEL IMMUNOCYTOKINES FOR VASCULAR TUMOR TARGETING
A dissertation submitted to the
ETH Zurich
for the degree of
Doctor of Sciences
presented by
MANUELA KASPAR
Eidg. Dip!. Pharm., ETH Zurich
born 17.08.1978
citizen of Oberkulm (AG)
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Dario Neri, examiner
Prof. Dr. Pius August Schubiger, co-examiner
Zurich, 2007
1 Summary
Many pro-inflammatory recombinant cytokines display potent anti-cancer activities,
but their preclinical and clinical use is often limited by the fact that unacceptable
toxicities can be observed already at very low cytokine doses, preventing escalation
to therapeutically active concentrations. In most cases, cytokines do not preferentially
accumulate at the tumor site following intravenous administration. For this reason,
the antibody-based targeted delivery of cytokines to the tumor environment appears
to be a promising strategy, for enhancing the therapeutic index of these potent anticancer agents. The targeted delivery of bioactive agents to the tumoral neovasculature seems to be a particularly promising anti-cancer therapeutic modality,
considering the fact that a vigorous neo-vasculature development ls a characteristic
feature of aggressive solid tumors and that tumor blood vessels are readily
accessible for intravenously-administered therapeutic agents.
In this thesis, I have studied the anti-cancer properties of interleukin-15 and GMCSF, fused to the human antibody fragment scFv(L19) specific to the EDB domain of
fibronectin, a marker of angiogenesis.
IL15 is a potent pro-inflammatory cytokine, whose mechanism of action partially
overlaps with the one of IL2. Both cytokines stimulate the proliferation of T cells,
induce the generation of cytotoxic T Iymphocytes (CTLs), facilitate the proliferation of
and the synthesis of immunoglobulin by B cells and induce the generation and
persistence of natural killer (NK) cells (Waldmann 2006). However, in many adaptive
immune responses, IL-2 and IL-15 have distinct, and often competing roles. IL-15 is
important in the maintenance of long-Iasting, high avidity T cell responses and it
achieves this by supporting the survival of CD8+ memory T cells.
GM-CSF is a cytokine associated with the growth and differentiation ot hematopoietic
cells. Furthermore, it is a potent immunostimulator with pleiotropic effects, including
the augmentation of antigen presentation in a variety of cells, increased expression
of MHC class 11 on monocytes and adhesion molecules on granulocytes and
monocytes, and amplification of T cell proliferation.
5
The fusion proteins L19-IL15 and L19-GMCSF were expressed in mammalian cells
and purified to homogeneity, revealing no loss of cytokine activity in in vitra assays.
Furthermore, the ability of the two immunocytokines to selectively localize to tumors
in vivo was confirmed by biodistribution analysis with radioiodinated protein
preparations. L19-IL15 and L19-GMCSF displayed a potent anti-tumor activity both in
subcutaneous and in metastatic F9 and C51 murine models of cancer in
immunocompetent mice. This therapeutic action was superior compared to IL15- and
GMCSF-based fusion proteins, containing antibodies of irrelevant specificity in the
mouse, which were used as non-tumor-targeting controls. For both L19-IL15 and
L19-GMCSF immunocytokines, CD8+ T cells appeared to mostly contribute to the
therapeutic action, as demonstrated by in vive cell depletion experiments.
The results presented in this thesis are of c1inical significance, considering the fact
that the sequence of EDB is identical in mouse and man, and that the tumor-targeting
ability of the L19 antibody has been extensively demonstrated in c1inical trials in
patients with cancer.
6
Zusammenfassung
Viele rekombinante pro-inflammatorische Zytokine weisen starke antitumor Wirkung
auf. Ihr präklinischer und klinischer Gebrauch wird jedoch oft durch die hohe Toxizität
limitiert,
die meist
schon
bei niedrigen
Dosen auftritt,
und dadurch
eine
Dosiserhöhung zu therapeutischen Konzentrationen verunmöglicht. In den meisten
Fällen reichern sich Zytokine nach intravenöser Applikation nicht bevorzugt am
Tumor an. Daher scheint die gezielte Anreicherung von Zytokinen am Tumor mittels
Antikörper ein vielversprechendes Konzept, um den therapeutischen Index dieser
sehr wirksamen Krebs-Therapeutika zu verbessern. Die gezielte Anreicherung
bioaktiver Substanzen an neugebildeten Blutgefässen des Tumors scheint eine
besonders Erfolg versprechende Therapiemöglichkeit zu sein, da die Neubildung von
Blutgefässen charakteristisch für solide Tumore ist, und diese für intravenöse
applizierte Therapeutika leicht erreichbar sind.
In dieser Dissertation werden die Effekte von Interleuin-15 und GM-CSF, gekoppelt
an das humane Antikörperfragment scFv(L19), auf das Tumorwachstum untersucht.
L19 erkennt spezifisch die EDB Domäne von Fibronektin, einen Marker für
Angiogenese.
Interleukin-15
ist ein sehr wirksames pro-inflammatorisches Zytokin, dessen
Wirkungen teilweise mit denen von Interleukin-2 übereinstimmen. Beide Zytokine
stimulieren die Proliferation von T Zellen, induzieren die Bildung von zytotoxischen T
Lymphozyten, erleichtern die Vermehrung von B Zellen sowie deren Synthese von
Antikörpern, und ermöglichen die Bildung, sowie das Überleben von natürlichen Killer
(NK) Zellen. Trotzdem haben IL-2 und IL-15 in vielen adaptiven Immunanworten
verschieden
und oft auch kompetitve Funktionen. IL-15 ist wichtig für die
Aufrechterhaltung einer lang anhaltenden, hoch affinen T Zell Antwort. Dies erreicht
IL-15, indem es das Überleben von CD8+ memory T Zellen unterstützt.
GM-CSF ist ein Zytokin das mit dem Wachstum und der Differenzierung von
hämatopoetischen Zellen
assoziiert
ist. Zudem
ist es ein sehr wirksamer
Immunostimmulator mit pleiotropischen Effekten, wie der Steigerung der Antigen
7
Präsentierung in verschiedensten Zellen, einer erhöhten Expression von MHC
Klasse 11 Molekülen auf Monozyten und Adhäsionsmolekülen auf Granulozyten und
Monozyten, sowie der Vervielfältigung der T Zell Proliferation.
Die Fusionsproteine L19-IL15 und L19-GMCSF wurden in Säugetierzellen exprimiert,
bis zur Homogentiät gereinigt, und zeigten keinen Aktivitäts-Verlust in in vitro Tests.
Zudem konnte mittels Biodistributions-Experimenten mit radioaktiv markierten
Proteinen die selektive Anreicherung der zwei Fusionsproteine in Tumoren in vive
bestätigt werden. L19-IL15 und L19-GMCSF zeigten eine starke therapeutische
Wirkung in subkutanen, sowie auch in metastatischen F9 und C51 murinen
Tumormodeln in immunokompetenten Mäusen. Diese therapeutische Wirkung war
überlegen im Vergleich zu IL-15 und GMCSF basierenden Fusionsproteinen, die aus
Antikörpern mit irrelevanter Spezifität bestehen und als nicht selektive Kontrollen
gebraucht wurden. Für beide Immunozytokine, L19-IL15 und L19-GMCSF, scheinen
hauptsächlich CD8+ T Zellen zur Therapie beizutragen, wie mit in vive T Zell
Depletions Experimenten gezeigt werden konnte.
Die Resultate, welche in dieser Dissertation präsentiert werden, sind von klinischer
Signifikanz, da einerseits die Sequenz von EDB von Maus zu Mensch identisch ist,
und sich der L19 Antikörper andererseits selektiv im Tumor anreichert, wie in
klinischen Versuchen mit Patienten gezeigt wurde.
8