radiation-induced signal transduction cascades - ETH E
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Diss. ETH No. 14928 RADIATION-INDUCED SIGNAL TRANSDUCTION CASCADES - TARGETS FOR RADIOSENSITIZATION a thesis submitted to the Swiss Federal Institute ofTechnology (ETH) Zurich for the degree of DOCTOR OF NATURAL SCIENCES presented by ANGELA TENZER Dipl. Natw. ETH Zurich born 17th ofJanuary 1975 citizen of Germany accepted upon the recommendation of PROF. DR. P. A. SCHUBIGER, EXAMINER DR. M. PRUSCHY, CO-EXAMINER 2002 ABSTRACT ABSTRACT Cancer is still a major cause of death. Thus an important interest of cancer research is to find and improve new treatment strategies. Ionizing radiation (IR) along with surgery and chemotherapy belongs to the three major cancer treatment modalities. IR can be applied as single therapy, as concomitantlcombined therapy with chemotherapy or as palliative therapy, but it is also often applied as an adjuvant therapy after surgical removal of a tumor to prevent the growth of new tumor tissue from residual sites (rezidive). A benefit of ionizing radiation as a therapeutic tool is the possibility to apply it locoregionally thereby preventing systemic toxicity. However, like chemotherapeutics, IR does affect all the targeted cells. This can lead to severe side effects in the surrounding tissue after therapy. In addition there is a large number of human malignant tumor cells showing a very poor response to IR. However, the applied dose to the tumor can not be increased as needed because of the neighbouring tissue and sensitive organs located in the radiation field. Thus, a major goal of cancer research is to gain more knowledge about the mechanisms of radiotherapy in order to optimize therapies and to overcome treatment failures. DNA double strand breaks are the pivotal cellular damage induced by ionizing radiation. As reaction to IR a plethora of molecular and cellular processes is activated which then results in cell cycle arrest, the induction of the DNA-repair-machinery (to restore damage of DNA) or to activate a cell death programme. However, IR also initiates signal transduction cascades that are generated at cellular sites distant from and independent of DNA-damage. These signaling processes are similar to signal transduction cascades controlled by hormone activated growth factor receptors 'and represent interesting targets for anticancer treatment modalities which combine ionizing radiation with molecular defined pharmacological compounds. Inhibiting specific key-entities of these signal transduction cascades potently sensitizes for radiation induced cell death. IR for example activates the EGF-receptor and the phophatidylinositol3'-kinase (PI3K) / Akt survival pathway that protects against apoptotic stress stimuli. This pathway is overexpressed in many human carcinomas and has been linked to tumorigenesis, tumor progression, invasion and metastasis as well as poor treatment outcome and resistance to different cytotoxic drugs and IR. Therefore compounds that down-regulate this pathway are of c1inical interest for single and combined anticancer treatment modalities. In part A of this thesis we demonstrate that the PI3K1Akt-pathway is a target for the cytotoxic and radiosensitizing protein kinase C (PKC)-inhibitor N-benzoylated staurosporine (PKC4l2). Dose-dependent downregulation of the proliferative activity, activation ofthe apoptotic machinery and cell killing by PKC4l2 in Ratla-fibroblasts and H-ras-oncogene-transformed fibroblasts correlated with a decrease of Akt phosphorylation and a reduced phosphorylation of the endogenous Akt-substrate GSK3Cl Expression of the dominant-active myristoylated form of Akt abrogated this cytotoxic effect of PKC412. Comparative experiments indicate that PKC4l2 downregulates this survival pathway by a different mechanism than the PI3K-inhibitor LY294002, but both compounds sensitised tumor cells to IR. In addition the EGFR-tyrosine kinase-inhibitor PKI-l66 was tested in different celllines for its potential to sensitize tumor cells to ionizing radiation. Experiments measuring the proliferative activity and clonogenic survival of the investigated cell lines showed that cell ) lines overexpressing the EGFR were sensitized to IR by this EGFR-blocker. This effect was' not observed in cells with a normal expression-status of EGFR. The compound PKI-166 was further shown to inhibit the activation ofthe PI3K1Akt-survival pathway. Our studies demonstrate, that inhibition of the PI3K1Akt-pahtway is relevant for radiosensitization. I ABSTRACT These and many other studies illustrate that a broad knowledge exists of specific molecular elements and their role in the cellular response after radiation. But conventional research is focused on the analysis and regulation of a single component on the level of DNA, mRNA and proteins in a specific pathway. But improvements in radiation therapy require that the therapeutic index will be further enlarged. This is highly dependent not only on a singular signal transduction cascade but on the manipulation of a complex biological network. This could be attained if treatment-induced and tumor-specific processes could be elucidated. Therefore research is nowadays complemented with the functional genomic research that tries to gain information on a whole cellular activation pattern of genes (genomics) or proteins (proteomics) after treatment. However many of the so far identified IR-induced stress responses are mediated and regulated by posttranslational modifications as described for IRinduced proteases or kinases. Further a differential expression level of proteins only partially corresponds with the respective enzyme activation profile. Thus the identification of IRmediated and tumor- andlor healthy tissue-specific posttranslational modifications in response to IR will contribute to a further understanding of a specific IR-induced enzyme activity profile and will reveal potential targets for novel combined treatment modalities. We established, as described in part B of this thesis, a method to determine treatment-induced posttranslational modifications in cellular lysates. The analysis of a radiation-induced enzyme-activity profile in tumor cells and untransformed cells was performed with a peptidephage-display-library specifically constructed to detect posttranslational peptide modifications. In contrast to conventional applications of peptide libraries to determine the interaction of a singular enzyme or receptor with a combinatorial library, a characteristic enzyme activity pattern in a complex biological system can be identified. With a subtractive and iterative screening procedure treatment- and cell type-specific posttranslationally modified peptides will be selected. To achieve this goal a biased approach with purified proteases and cellular extracts with pre-identified proteolytic activities (caspases of the apoptotic machinery induced by combined treatment with staurosporine and ionizing radiation) was used. We worked under controlled conditions to monitor the various different stepsduring the establishment of the method. With this biased approach the substrate peptide phage display library was screened against extracts derived from untreated (background activities) and STP+IR-treated cells (caspase-activities). After four rounds of subtractive screening a specific caspase-substrate-sequence (WAVEIDF - targetsequence for the c1eavage by caspase-6) was selected. The quality and sequence-specificity of the identified peptidesubstrates were verified to be treatment-specifically c1eaved with mono-phage cultures and synthetic peptides. The outcome of this project is the monitoring of a tumor cell-specific, IR-dependent posttranslational modification profile and of treatment-specific enzyme activity changes. Overall this will lead to an improved understanding of the cellular response to irradiation that is to a large part controlled on the posttranslational level. The identification of treatmentspecific substrates and the corresponding enzymes involved in the IR-induced signal transduction processes will pinpoint to potential novel targets to modulate the radiation sensitivity. 11 ZUSAMMENFASSUNG ZUSAMMENFASSUNG Krebs gehört heute immer noch zu den häufigsten Todesursachen. Deshalb ist in der aktuellen Krebsforschung das Interesse gross, neue Behandlungsansätze zu finden, um die Krebstherapie zu verbessern. Ionisierende Strahlung (IR, ionizing radiation) gehört mit der Chemotherapie und der Chirurgie zu den drei wichtigsten Behandlungsmethoden bei Krebs. Die Bestrahlungstherapie wird als selbständige Therapie, als Begleittherapie mit Chemotherapie oder als Palliativtherapie angewendet. Oft wird sie auch als Folgetherapie nach chirurgischer Entfernung eines Tumors verordnet, um das Heranwachsen neuen Tumorgewebes von verbliebenen Tumorzellen (Rezidive) zu verhindern. Die Radiotherapie hat den Vorteil, dass sie örtlich begrenzt angewendet werden kann; so kann eine systemische Toxizität verhindert werden. Dennoch schädigen die Strahlen alle Zellen, die sie erreichen, was zu ernsthaften Nebenwirkungen im umliegenden Gewebe führen kann. Dazu kommt, dass viele humane Tumorzellen schlecht auf die Bestrahlung ansprechen. Wegen der benachbarten Gewebe und empfindlichen Organe, die sich im Bestrahlungsfeld befinden, kann die Dosis jedoch nicht nach Belieben erhöht werden. Deshalb bemüht sich die modeme Krebsforschung, die Kenntnisse über die Bestrahlungsmechanismen zu erweitern, um Therapien zu verbessern und Nebenwirkungen möglichst zu vermeiden. DNA-Doppelstrangbrüche sind die zentralen Schädigungen, die in bestrahlten Zellen auftreten. Als Reaktion auf die ionisierende Strahlung wird eine Fülle von molekularen und zellulären Prozessen aktiviert, die zum Zellzyklusarrest, zur Einleitung von DNAReparaturmechanismen oder zur Aktivierung eines Zelltodprogrammes (Apoptose) führen. IR aktiviert aber auch Signalübermittlungskaskaden unabhängig von der DNA-Schädigung, vergleichbar mit Prozessen ausgelöst durch Hormon-aktivierte Wachstumsrezeptoren. Diese sind interessante Zielstrukturen für die kombinierte Krebstherapie von molekular definierten Substranzen (Chemotherapeutika) und Bestrahlung. Die Hemmung spezifischer Schlüssele1emente solcher Signalübermittlungskaskaden sensibilisieren Zellen sehr effektiv für den Bestrahlungs-induzierten Zelltod. Ionisierende Strahlen aktivieren zum Beispiel den EGF-Rezeptor und damit die Phosphatidylinositol 3'-Kinase (PI3K)/Akt-Signalübermittlungskaskade, die die Zellen gegen apoptotische Stressfaktoren schützt. Diese Kaskade ist in vielen humanen Tumoren überexprimiert und ist verantwortlich für aggressiveres Wachstum, Infiltration und Metastasierung, was letztendlich zur Resistenz gegen verschiedene zelltoxische Substanzen und Strahlung führt. Aus diesen Gründen sind Substranzen, die diesen spezifischen Weg hemmen, von grossem klinischen Interesse für die kombinierte Krebstherapie. Im Teil A dieser Dissertation zeigen wir, dass die PI3K1Akt-Signalübermittlungskaskade Zielstruktur des zytotoxischen und radio sensibilisierenden Proteinkinase C (PKC)-inhibitor N-benzoyl-staurosporin (PKC412) ist. Der Effekt von PKC412 wurde in Ratla-Fibroblasten und in H-ras-onkogen-transformierten Fibroblasten untersucht. Die dosisabhängige Zellproliferationshemmung, die Aktivierung der apoptotischen Maschinerie und der induzierte Zelltod korrelierten dabei mit der Hemmung der Akt-phosphorylierung und einer verminderten Phosphorylierung des Akt-substrates GSK3-a. Diese zum Zelltod führenden Faktoren wurden durch die konstitutiv aktivierte Form von Akt (myrAkt) aufgehoben. Vergleichbare Experimente, die mit dem spezifischen Inhibitor für die PI3-Kinase,) LY294002, durchgeführt wurden, zeigten, dass PKC412 und LY294002 diese Kaskade durch einen unterschiedlichen Mechanismus hemmen. Beide Verbindungen vermochten jedoch die Zellen für Bestrahlung zu sensibilisieren. Weiter wurde der EGFR-Tyrosin-Kinase-Inhibitor PKI-166 auf seine radio sensibilisierenden Eigenschaften untersucht. In verschiedenen ZellIinien wurde die Proliferationsfähigkeit und die Klonogenizität gemessen. ZellIinien, die den EGFR überexprimierten, wurden von diesem III ZUSAMMENFASSUNG EGFR-Blocker für ionisierende Strahlung sensibilisiert. Dieser Effekt konnte in Zellen mit normalem Expressionsgrad von EGFR nicht beobachtet werden. Auch diese Substanz hemmte die PI3K/Akt-Signalübermittlungskaskade, was die Wichtigkeit dieses Weges für die Radiosensibilisierung bestätigt. Unsere und andere Studien zeigen dass die Hemmung der PI3K/Akt-Signalübermittlungskaskade zur Radiosensibilisierung führt. Die grosse Zahl an Publikationen zeigt, dass bereits eine breite Kenntnis besteht über spezifische molekulare Elemente und ihre Rolle in der Zellantwort nach Bestrahlung. Die konventionelle Forschung konzentriert sich aber auf die Untersuchung von einzelnen Komponenten auf der Ebene von DNA, mRNA und Proteinen in einer spezifischen Kaskade. Die Verbesserung in der Radiotherapie setzt aber voraus, dass das therapeutische Fenster vergrössert wird und dies hängt nicht nur von einzelnen Signalübermittlungskaskaden ab, sondern von der Manipulation eines komplexen biologischen Netzwerkes. Dazu müssen Behandlungs- und Tumor-spezifische Prozesse aufgeschlüsselt würden. Die Forschung wird heutzutage durch die funktionelle Genomik-Forschung ergänzt, welche versucht, eine Idee über ein komplexes Aktivitätsmuster von Genen oder Proteinen nach Behandlung der Zellen zu bekommen. Dieses führt zu Stressantworten, welche auf der posttranslationalen Ebene reguliert werden (zum Beispiel Kinasen und Proteasen). Dabei stimmt das Expressionsmuster nur teilweise mit dem eigentlichen Aktivitätsmuster überein. Die Identifizierung von Bestrahlungs-induzierten und Tumor- (oder Normalgewebe-) spezifischen posttranslationalen Modifikationen würde erheblich zum Verständnis von Enzymaktivitätsprofilen nach Bestrahlung beitragen und neue Ansatzpunkte für kombinierte Therapiemodalitäten liefern. Wir etablierten, wie beschrieben im Teil B dieser Arbeit, eine Methode, um Behandlungsinduzierte posttranslationale Modifikationen in Zelllysaten nachzuweisen. Die Analyse dieser Bestrahlungs-induzierten Enzymaktivitäten in Tumorzellen und Normalzellen wurde mit einer Peptid-Phage-Display-Biobliothek durchgeführt, welche speziell für die Detektion von posttranslationalen Modifikationen hergestellt wurde. Im Gegensatz zur konventionellen Anwendung, bei welcher die Interaktion von gereinigten Enzymen oder einzelnen Rezeptoren mit einer kombinatorsiche Bibliothek eingesetzt werden, kann in unserem Ansatz ein charakteristisches Enzymaktivitätsmuster in einem komplexen biologischen System identifiziert werden. Mit einem subtraktiven und iterativen Screening-Prozess können Behandlungs- und Zelltyp-spezifische posttranslational modifizierte Peptide selektioniert werden. Um das zu erreichen, wurde ein kontrollierter Versuch mit gereinigten Enzymen und Zellextrakten mit schon bekannten proteolytischen Aktivitäten (Caspase-Aktivitäten der apoptotischen Maschinerie nach Behandlung mit Staurosporin und Bestrahlung) benutzt. So konnten die verschiedenen Stufen während dem Aufbau der Methode kontrolliert werden. Die Qualität und Sequenz-Spezifität der identifizierten Peptid-Substrate wurden mit PhagenMonokulturen und synthetischen Peptiden überprüft. Im biased Screening wurde die PhagenBibliothek gegen Zellextrakte aus unbehandelten Zellen (Hintergrundaktivitäten) und aus STP+IR-behandelten Zellen (Caspase-Aktivitäten) getestet. Nach vier iterativen Screeningrunden konnte eine spezifische Caspase-Substratsequenz herausselektioniert werden (WAVEIDF - Erkennungssequenz für Caspase-6). Die Daten, die sich mit Hilfe dieser neuen Methode erheben lassen, tragen massgeblich zum Verständnis der Zellantwort auf Bestrahlung bei, welche auf posttranslationaler Ebene reguliert werden. Die Identifikation von neuen Strukturen in Bestrahlungs-induzierten r' Siganlübermittlungskaskaden, verweisen auf neue Zielstrukturen, um die Radiosensibilität zu beeinflussen. IV
