Inhibitionoftumorinducedangiogenesis - ETH E
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Diss. ETHNo. 13409 Inhibitionof tumor induced angiogenesis A dissertation submitted to the SWISS FEDERALINSTITUTEOF TECHNOLOGYZÜRICH for the degree of DOCTOROF NATURALSCIENCES Presentedby AlessandraVitaliti Dipl. Natw. ETH born December 9, 1970 from Bedigliora. TI aeeepted on the recommendationof Prof. Dr. D. Neri, examiner Prof. Dr. R. Klemenz,co-examiner Zürich, November 1999 1. Summary development of a malignant, life-threatening tumor is a multistep process. One critical step thereby is the conversion of the nonangiogenic to the angiogenic The state. The ingrowth of blood vessels into a solid tumor allows the tumor to grow mm3. In addition, tumor-penetratingvessels are the entry site of metastatic cells and, are therefore, crucially involved in the beyond the critical size dissemination of of 1 to 2 malignant Interfering with this process of neovascularizationshould prevent progression of tumor growth and might even lead to its regression. Two basically different concepts have been developed to abrogate tumor angiogenesis: angiogenesis can be inhibited by antiangiogenic Compounds, or the tumor vasculature could be destroyed by therapeutic agents that are speeifieally targeted to tumor derived endothelial cell surface proteins. For the inhibition of tumor vascular endothelial tumors. angiogenesis, we growth factor (VEGF), chose one the target molecule the of the critical triggers of as angiogenesis. Recombinant mouse VEGF was produced in E. coli and purified. This protein was used to isolate single chain antibodies (scFv) from a human semi-synthetic phage- display library. Two out of four selected scFv showed the chicken chorioallantoic membrane assay these antibodies into tumor an antiangiogenic effect in (CAM). Daily injection of one of bearing mice reduced tumor growth by 50%. In order to improve the inhibitory efficiency I generated scFvs with higher affinity to VEGF by introducing mutations in the CDR3 of the variable light chain domain, which was constant in the original library. Two of these new antibodies showed a stronger antiangiogenic activity in the CAM assay compared to V65. To prolong the half-life of the antibodies in the body, we fused the anti-VEGF scFv to the Fe part of a human IgG and generated a cell line that synthesizes and secretes this protein. One way to neutralize VEGF, which is constantly producedby tumors, is the constant delivery of anti-VEGF scFv in the blood. For this reason it is planned to encapsulate the anti-VEGF scFv-Fc producing capsules and to cell line into semipermeable implant them into animals. Alternatively we will generate recombinant adenoviruses, which will direct the in vivo production of anti-VEGF scFv. These strategies will enable us to test the anti-VEGF scFv antibody and derivates thereof more extensively, without having to produce these proteins in large quantities. A protein marker, which is exclusively expressed on endothelial cells that line the tumor targeting. part of penetrating blood vessels my doctoral work focused were on subjected to a isolated from Lewis subtractive is tumor vessel known; thus, a major identifying such a marker. CD31 positive metastases as well as from normal lung were required for specific only one marker with this property At present endothelial cells is Lung Carcinoma (LLC) lung tissue. cDNAs derived from these cells hybridization procedure and cDNA clones overrepresented in the tumor derived endothelial cells were isolated. cDNAs encoding surface proteins were selected using the signal peptide sequence trap method. Different cDNAs sequence and which were were identified which encode differentially expressed in a signal peptide tumor derived endothelial cells. One of the isolated cDNAs encodes H-cadherin. Immunohistochemical analysis of the expression pattern of H-cadherin revealed an overexpression on endothelial cells in several tumors. Interestingly, H-cadherin was expressed by endothelial cells of LLC lung metastases, but not by those of B16F10 melanoma lung metastases, demonstrating that different tumors can influence the expression of surface proteins in endothelial cells differently. In some normal organs, the expression of H-cadherin is restricted to a subset of endothelial cells while it is absentin others. We speculate that this differential expressioncould be exploited for tumor blood vessel targetine. 2. Zusammenfassung Entwicklung eines malignen, lebensbedrohlichen Tumors ist ein mehrstufigerProzess. Einer der kritischen Schritte in der Tumorentwicklungist der Uebergang vom nichtangiogenen zum angiogenen Stadium. Das Einwachsen Die neuer von Blutgefässe in den soliden Tumor ermöglicht diesem die kritische Grösse 1-2 mm3 zu überschreiten. Zusätzlich erlauben die Tumor-infiltrierenden Gefässe das somit bei Eindringen von metastasierendenZellen in die Zirkulation und sind der Ausbreitung des malignen Tumors massgeblich beteiligt. Die Hemmung der Tumor Neovaskularization sollte das Wachstum der Tumore hemmen oder gar zu Tumorregression führen. Zwei grundsätzlich verschiedene Konzepte wurden enwickelt um Tumorangiogenese zu verhindern: Entweder kann die Angiogenese mit antiangiogenenSubstanzen gehemmt werden oder die in den Tumor eindringenden Blutgefässe können mit therapeutischen Substanzen zerstört werden, indem Proteine, die spezifisch nur auf der Oberfläche von Endothelzellenvorhanden sind, als Angriffspunktebenutzt werden. Zur Hemmung der Tumor Angiogenese haben wir den Vaskulären-Endothel Wachstums Faktor (VEGF) gewählt. Dieses Protein ist eines der essentiellen Promotoren der Angiogenese. RekombinantesMaus-VEGF wurde in Bakterien produziert. Dieses Protein wurde dann für die Selektion von EinzelkettenAntikörper (scFv) aus einer menschlichen, halb-synthetischen Phagen-Bibliothek benützt. Zwei Wirkung im vier isolierten Antikörpern zeigten antiangiogene Huhn-Chorioallantoischen-Membran-Test (CAM). Tägliche von Injektionen einer dieser Antikörper in Tumorwachstum etwa Tumor eine tragende Mäuse reduzierte das 50%. Um diesen Effekt zu verbessern haben wir Antikörper mit höherer Affinität an VEGF hergestellt, indem wir Mutationenin der CDR3 derjenigen Domäne eingeführt haben, welche von der variablen zu leichten Kette abstammt. Diese Wirkung in CAM Test als Antikörper zeigen höhere antiangiogene V65. Um die Halbwertszeitder Antikörper im Blut zu neuen verlängern, haben wir den anti-VEGF scFv an den Fc-Teil eines menschlichen IgG gekoppelt und einr Zellliniegeneriert, welch dieses Protein synthetisiert und sezerniert. Eine Art, das VEGF zu neutralisieren, welches ständing von Tumoren ausgeschüttet wird, ist die konstante Zugabe von anti-VEGF scFv ins Blut. Aus diesem Grund planen wir, semipermeable Kapseln mit anti-VEGF scFv-Fc produzierenden Zellinen zu füllen und in Mäuse zu implantieren. Eine alternative Methode besteht darin, ein rekombinantes Adenovirus hergestellen, welches die in vivo Synthese von anti-VEGF scFv steuert. Diese Strategien sollten es erlauben, den anti-VEGF scFv und deren Derivate extensiv zu testen ohne Mengen dieser Proteine herstellen zu müssen. Für den spezifischen Angriff auf tumorinfiltierende Gefässe ist dazu grosse Protein zu es wichtig, ein finden, welches nur auf der Oberfläche dieser Gefässe exprimiert ist. Deshalb habe ich einen Grossteil meiner Dissertation der Identifizierung eines solchen Proteins gewidmet. CD31 positive Endothelzellenwurden von Lewis Lung Carcinoma (LLC) Lungen-Metastasen sowie von normalem Lungengewebe isoliert. cDNAs, die von diesen Zellen stammen, wurden einer subtraktiven Hybridsierung unterzogen, um Endothelzellen von Tumoren Oberflächenproteine kodieren, diejenigen cDNAs, zu isolieren die in überexprimiert sind. cDNAs, die für nur wurden mit der Signalpeptidsequenz-Trap Methode selektioniert. Verschiedene cDNAs wurden gefunden, welche für Oberflächenmoleküle oder sezernierte Proteine kodieren und in Endothelzellen, die aus gereinigt wurden, überexprimiert sind. Tumoren Eine von diesen isolierten cDNA codiert für H-Cadherin. ImmunohistochemischeAnalysen des Expressionsmusters von H-Cadherin zeigte eine Ueberexpression Endothelzellenvon verschiedenen Tumoren. Interessanterweise auf Endothelzellen von LLC war auf H-Cadherin Lungen-Metastasen, nicht aber auf solchen von B16F10 Melanom-Lungen-Metastasen,exprimiert, was zeigt, dass verschiedene Tumore die Expression von Oberflächenproteinen in Endothelzellen unterschiedlich beeinflussen können. In gewissen normalen Organen beschränkt sich die Expression von H-Cadherin auf einen kleinen Teil der Endothelzellen während es in anderen Organen überhaupt nich exprimiert ist.. Wir "vermuten, dass diese unterschiedliche Expression für einen Gefässe ausgenütztwerden könnte. Angriff auf tumorinfiltierende
