Funktionelle Genpolymorphismen von apoptose
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Diplomarbeit Funktionelle Genpolymorphismen von apoptosebeteiligten Proteinen beim Primären Offenwinkelglaukom eingereicht von Kilian Höfer zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der gesamten Heilkunde (Dr. med. univ.) an der Medizinischen Universität Graz ausgeführt an der Universitäts-Augenklinik unter der Anleitung von PD Dr. Georg Mossböck Graz, am 16.Oktober 2014 Eidesstattliche Erklärung Ich erkläre ehrenwörtlich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und ohne fremde Hilfe verfasst habe, andere als die angegebenen Quellen nicht verwendet habe und die den benutzten Quellen wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen als solche kenntlich gemacht habe. Graz, am 16. Oktober 2014 Kilian Höfer Anmerkung Um das Lesen der vorliegenden Arbeit zu erleichtern, wurde aus praktischen Überlegungen das generische Maskulinum verwendet. Diese Schreibweise bezieht sich sowohl auf männliche als auch auf weibliche Personen. i Danksagung Danksagung Ich möchte mich vor allem bei PD Dr. Georg Mossböck, der mich tatkräftig bei meiner Arbeit unterstützte und immer bereit war meine Fragen mit viel Geduld zu beantworten, bedanken. Weiters möchte ich mich auch bei meinen Eltern, Werner und Elisabeth, bei meiner ganzen Familie, sowie allen Freunden bedanken, ohne deren Unterstützung mein Studium nicht möglich gewesen wäre. ii Zusammenfassung Einleitung Das Glaukom umfasst eine Anzahl ätiologisch unterschiedlicher Krankheiten, deren gemeinsames Kennzeichen der apoptotische Untergang retinaler Ganglienzellen (RGZ) ist, und ist weltweit die häufigste irreversibel Erblindungsursache. Die häufigste Form des Glaukoms ist das Primäre Offenwinkelglaukom (POWG). Familiäre Assoziationen, sowie die Tatsache, dass bestimmte ethnische Gruppen vermehrt am Glaukom erkranken, weisen auf eine deutliche genetische Komponente hin. Mehrere Polymorphismen, die in einer Assoziation mit dem Glaukom stehen, wurden bereits beschrieben, jedoch kann damit nur ein geringer Teil der Glaukomerkrankungen erklärt werden. Im Rahmen dieser Studie wurden funktionelle Polymorphismen apoptosebeteiligter Proteine beim POWG untersucht. Methoden Für diese Studie wurden Patienten im Zeitraum vom Jänner 1999 bis zum März 2011 an der Universitäts-Augenklink Graz akquiriert. Die Gruppe der Patienten mit POWG sowie die Kontrollgruppe wurden nach dem Alter (+/- 3 Jahre) und Geschlecht gematcht. Es wurden insgesamt 668 Probanden eingeschlossen: je 334 in der Glaukomgruppe beziehungsweise in der Kontrollgruppe. Alle Patienten gaben eine schriftliche Einverständniserklärung für die Teilnahme an der Studie ab. Die Studie wurde von der Ethikkommission bewilligt. Es wurden funktionelle Polymorphismen folgender Gene untersucht: AKT1: rs1130233; BAX: rs4645878; FAS: rs2234767; FASL: rs763110. Die Determinierung der Polymorphismen erfolgte durch die High Resolution Melting Curve Methode im Labor der Universitäts-Augenklinik Graz. Zur Analyse der Daten wurde der Chi2 Test herangezogen. iii Zusammenfassung Ergebnisse Es zeigte sich, dass in dieser Population keiner der Polymorphismen eine Assoziation mit dem POWG hat. Lediglich für AKT1 wurde für den Gentyp A/A eine grenzwertige Assoziation errechnet (p=0.031), welche nach Korrektur für multiples Testen nicht mehr signifikant war. Die vorliegende Studie ist die Erste, welche die Rolle der genannten Polymorphismen beim primären Offenwinkelglaukom untersucht hat. iv Abstract Background Glaucoma is a neurodegenerative disease, characterized by a slow and progressive degeneration of retinal ganglion cells and the leading cause of irreversible blindness worldwide. The most common form of the glaucoma is the primary open angle glaucoma (POAG). A known family association for POAG and the fact, that POAG is endemic in certain ethnical groups, suggests a genetic origin of the disease. Some genetic polymorphisms associated with POAG have been identified, yet these account only for 5-6% of POAG. The goal of this work was to identify new genetic polymorphisms associated with POAG. We decided to analyze functional polymorphisms of apoptotic-related proteins. Methods 668 patients were included, recruited from the department of ophthalmology at the Medical University of Graz between January 1999 and March 2011. The participants were divided into two groups: patients with POAG and a control group with no signs of elevated intraocular pressure or glaucomatous damage. Both groups were age- (+/- 3 years) and sexmatched. The study was approved by the ethical review committee and all patients signed a content form. Following polymorphisms of apoptosis-related proteins were investigated: AKT1: rs1130233; BAX: rs4645878; FAS: rs2234767; FASL: rs763110. A high resolution melting curve method was used for the determination of the polymorphisms in the laboratory of the department of ophthalmology. We used the Chi2 test for statistical analysis. v Abstract Conclusion No association was observed between the investigated polymorphisms and the development of a POAG. Genotype A/A in rs1130233 revealed a borderline association with POAG (p= 0.031), which failed to be significant after correcting for multiple testing. To our knowledge this is the first study investigating these polymorphisms in POAG. vi Inhaltsverzeichnis Eidesstattliche Erklärung .......................................................................................................... i Danksagung ...................................................................................................................................ii Zusammenfassung .................................................................................................................... iii Abstract ........................................................................................................................................... v Inhaltsverzeichnis .................................................................................................................... vii Abkürzungsverzeichnis............................................................................................................. x Abbildungsverzeichnis ........................................................................................................... xii Tabellenverzeichnis ............................................................................................................... xiii 1. Einleitung ............................................................................................................................... 1 2. Einführung ............................................................................................................................. 2 2.1 Das Auge – Anatomie und Physiologie ................................................................................ 2 2.1.1 Aufbau der Netzhaut.........................................................................................................................3 2.1.2 Papilla Nervi Optici............................................................................................................................3 2.1.3 Kammerwasser Zyklus ....................................................................................................................4 2.1.4 Regulation der Kammerwasserbildung ....................................................................................4 2.1.5 Kammerwasser Abfluss ...................................................................................................................5 2.1.6 Das Trabekelwerk ..............................................................................................................................5 2.1.7 Intraokulare Druck ............................................................................................................................6 2.2 Untersuchungsmethoden ........................................................................................................ 7 2.2.1 Tonometrie ...........................................................................................................................................7 2.2.2 Pachymetrie .........................................................................................................................................8 2.2.3 Perimetrie .............................................................................................................................................8 2.2.4 Papillenbeurteilung...........................................................................................................................9 2.3 Therapieformen ....................................................................................................................... 11 2.3.1 Medikamentös .................................................................................................................................. 11 2.3.2 Lasertherapie.................................................................................................................................... 11 2.3.3 Chirurgische Therapie .................................................................................................................. 11 2.4 Glaukom Formen ..................................................................................................................... 12 2.4.1 Das Sekundäre Glaukom .............................................................................................................. 12 vii Inhaltsverzeichnis 2.4.2 Primäre Glaukome .......................................................................................................................... 13 2.4.2.1 Winkelblock Glaukom ............................................................................................................................. 13 2.4.2.2 Das Primäre Kongenitale Glaukom/ Infantiles Glaukom......................................................... 13 2.4.2.3 Okuläre Hypertension (OHT) ............................................................................................................... 13 2.4.2.4 Primäres Chronisches Offenwinkelglaukom ................................................................................. 14 2.5 Epidemiologie ........................................................................................................................... 15 2.6 Risikofaktoren für die Entstehung eines POWG........................................................... 16 2.7 Die Rolle der Apoptose .......................................................................................................... 18 2.7.1 2.7.1.1 Der Extrinsische Weg .............................................................................................................................. 19 2.7.1.2 Der Perforin/Granzym Weg.................................................................................................................. 19 2.7.1.3 Der Intrinsische Weg ............................................................................................................................... 19 2.7.1.4 Der Exekutive Weg.................................................................................................................................... 20 2.7.2 2.8 Aktivierung der Apoptose ........................................................................................................... 18 Aktivierung der Apoptose ........................................................................................................... 20 2.7.2.1 Versagen des Axonalen Transportes ................................................................................................ 20 2.7.2.2 Neurotrophe Faktoren ............................................................................................................................ 21 2.7.2.3 Mitochondriale Dysfunktion ................................................................................................................. 21 2.7.2.4 Oxidativer Stress ........................................................................................................................................ 21 2.7.2.5 Aktivierung des Intrinsischen Apoptotischen Weges ............................................................... 22 2.7.2.6 Aktivierung des Extrinsischen Apoptotischen Weges .............................................................. 22 2.7.2.7 Exzitotoxischer Schaden ........................................................................................................................ 22 Genetik des POWG ................................................................................................................... 23 2.8.1 Genetik Allgemein ........................................................................................................................... 23 2.8.2 Methoden der Genanalyse ........................................................................................................... 23 2.8.2.1 Linkage Analyse ......................................................................................................................................... 23 2.8.2.2 Candidate Gene Aproach ........................................................................................................................ 24 2.8.2.3 Genomweite Assoziationsstudien (GWAS) .................................................................................... 24 2.8.3 POWG assoziierte Gene ................................................................................................................ 25 2.8.3.1 Myocilin (MYOC) ........................................................................................................................................ 25 2.8.3.2 Optineurin (OPTN) ................................................................................................................................... 26 2.8.3.3 WD40-repeat 36 Gen (WDR36) .......................................................................................................... 27 2.8.3.4 Cytochrome P450 family1, subtypeB, polypeptide1 (CYP1B1) ............................................ 28 2.8.3.5 Ankyrin repeats and suppressor of cytokine signalling box-containing protein 10 (ASB10) 28 2.8.4 Untersuchte Gen-Polymorphismen ......................................................................................... 29 2.8.4.1 Bcl-2-assoziiertes X Protein .................................................................................................................. 29 2.8.4.2 Fas Rezeptor und Fas Ligamente........................................................................................................ 30 2.8.4.3 V-AKT murine thymoma viral oncogene homolog 1 (Akt 1) ................................................. 31 viii 3. Methoden............................................................................................................................. 32 3.1 Patienten..................................................................................................................................... 32 3.2 Alter .............................................................................................................................................. 33 3.3 Geschlecht .................................................................................................................................. 34 3.4 Geräte, Materialien, Reagenzien ........................................................................................ 34 3.4.1 3.5 Genetische Analyse......................................................................................................................... 36 Statistik ....................................................................................................................................... 37 3.5.1 Statistische Analyse: Chi2 Test ................................................................................................... 37 3.5.2 Bonferroni Korrektur .................................................................................................................... 37 4. Ergebnisse ........................................................................................................................... 38 5. Diskussion ........................................................................................................................... 40 6. Literaturverzeichnis........................................................................................................ 42 ix Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis AML Akute Myeloische Leukämie ASB10 Ankyrin repeats and Suppressor of cytokine signalling Box-containing protein 10 ASK1 Apoptosis Signal-regulating Kinase 1 ATP Adenosintriphosphat BAX Bcl-2-assoziiertes X Protein BDNF Brain Derived Neurotrophic Factor Ca2+ Kalzium ++ Ionen C/D Cup/Disc Ratio CGA Candidate Gene Aproach CYP1B CytochromeP450family1, subtypeB, Polypeptide1 DNA Desoxyribonucleic Acid FAS Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily, Member 6 G2 Gesichtsfelduntersuchung, Programm G2 des Gerätes „OCTOPUS“ GWAS Genomwide Association Study HRMC High Resolution Melting Curve IOD Intraokularer Druck MAPK Mitogen-aktivierte Proteinkinase x Mill. Million Mrd. Milliarde mRNA Messenger Ribonucleic Acid mV Millivolt MYOC Myocillin NGF Nerve Growth Factor OCT Optische Kohärenztomographie OHT Okuläre Hypertension OPTN Optineurin POAG Primary Open Angle Glaucoma POWG Primäres Offenwinkelglaukom RGZ Retinale Ganglienzellen SNP Single Nucleotid Polymorphism SPSS Statistical Package for the Social Sciences TNF-α Tumornekrosefaktor α TW Trabekelwerk WDR36 WD40-Repeat 36 Gen ZNS Zentrales Nervensystem xi Abbildungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Abb. 1: Menschliches Auge im sagittal Schnitt; Jakov T, colorized by. Deutsch: Anatomie des Auges [Internet]. 2008 [zitiert 12. Dezember 2013]. Verfügbar unter: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Eye_scheme.svg................2 Abb.2: zentaler Augenhintergrund: Makula lutea (1), Papilla Nervis Optici mit austretenden Gefäßen (2); Netzhaut [Internet]. Wikipedia. 2014 [zitiert 14. August 2014]. Verfügbar unter: http://de.wikipedia.org/w/index.php?title=Netzhaut&oldid=132856 332......................................................................................................3 Abb.3: Gonioskopie des Augenwinkels, Gonioskopie des Augenwinkels: von posterior nach anterior: Ziliarkörper (1), Skleralsporn (2), pigmentiertes TW (3), nichtpigmentiertes TW (4), Schwalbesche Linie (5); Fotoarchiv der Universitäts-Augenklinik Graz, 2014....... 5 Abb.4: Applationstonometrie nach Goldmann, Blick durch den Tonometer während der Messung. Das Fluoreszenzmittel leuchtet im Blaulicht gelb.; Fotoarchiv der Universitäts-Augenklinik Graz, 2014............. 7 Abb.5: Beispiel einer Perimetrie: parazentrale Ausfälle, im Zeitverlauf zunehmend; Fotoarchiv der Universitäts-Augenklinik Graz, 2014...9 Abb. 6: Beispiel einer Papille mit deutlichen glaukomatösen Veränderungen: vergrößerte zentrale Exkavation mit typischen bajonettartigen Verlauf der Gefäße sowie temporale peripapilläre Pigmentepithelatrophie; ; Fotoarchiv der Universitäts-Augenklinik Graz, 2014....................................................................................... 10 xii Tabellenverzeichnis Tabelle 1: POWG und Kontrollgruppe mit Standartabweichung, Minimum und Maximum des Alters .....................................33 Tabelle 2: Verteilung der Geschlechter in den Gruppen: POWG und Kontrollgruppe.....................................................................34 Tabelle 3: Bezeichnung der Primer und ihre Nukleotidsequenz ..........35 Tabelle 4: Ergebnisse des Chi2 Tests....................................................38 Tabelle 5: Anzahl der Genotypen N (%), Genallelfrequenz..................39 xiii 1. Einleitung Der Begriff Glaukom umfasst eine Anzahl ätiologisch unterschiedlicher Krankheiten, deren gemeinsames Kennzeichen der apoptotische Untergang retinaler Ganglienzellen ist. Deren Axone bilden in ihrer Gesamtheit den Randsaum des Sehnervenkopfes (Papilla nervi optici) und in weiterer Folge den Sehnerven. (1) Pathognomonisch für alle Glaukomerkrankungen ist dementsprechend die kontinuierliche Abnahme des Randsaumes bei gleichzeitiger Zunahme der zentralen Exkavation der Papille. Durch den Ausfall der Nervenfasern kommt es zu charakteristischen Gesichtsfelddefekten, wobei das Endstadium eine irreversible Erblindung sein kann. (1, 2) Weltweit sind etwa 33 Millionen Menschen vom Glaukom betroffen. Es ist damit nach der Katarakt die zweithäufigste Erblindungsursache, aber die häufigste irreversible Erblindungsursache. (8) Viele pathophysiologische Vorgänge, die zu dieser Krankheit führen, sind noch immer ungeklärt. Es scheint so, als ob mehrere neurodegenerative Ursachen schlussendlich zur glaukomatösen Schädigung führen. Eine familiäre Assoziation und die Tatsache, dass bestimmte ethnische Gruppen vermehrt am Glaukom erkranken, weisen auf eine deutliche genetische Komponente hin. Mehrere Polymorphismen, die in einer Assoziation mit dem Glaukom stehen, wurden schon entdeckt, jedoch können damit nur rund 5% der Glaukome erklärt werden. (58) Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konzentrierten wir uns auf Gene, die im Zusammenhang mit der Apoptose stehen und deren Produkte experimentell mit dem Glaukom in Verbindung gebracht wurden. Diese waren Akt-1, Fas, Fas-R und BAX. Bekannte funktionelle Polymorphismen innerhalb dieser Gene wurden für unsere Assoziationsstudie verwendet. 1 Einführung 2. Einführung 2.1 Das Auge – Anatomie und Physiologie Die Lederhaut bildet gemeinsam mit der Hornhaut die straffe, äußere Schicht des Auges. Licht tritt durch die klare, stark brechende Hornhaut (+43dpt) in die Vorderkammer des Auge ein. Die Vorderkammer reicht von der Hornhaut über die pigmentierte Iris bis zur Linse und ist mit Kammerwasser gefüllt. Die Linse ist über die Zonulafasern mit den Ziliarmuskeln verbunden. Durch die Kontraktion dieser Muskeln kann die Linse ihre Brechkraft nach Bedarf verändern. Rückseitig liegt die Linse dem Glasköper an. Dieser hyaline Gelkörper füllt den Großteil des Auges. Durch ihn tritt das Licht bis an die Netzhaut. (1) Abbildung 1: Menschliches Auge im sagittal Schnitt 2 2.1.1 Aufbau der Netzhaut Die Netzhaut besteht aus etwa 127 Mill. Fotorezeptoren, welche in Zapfen und Stäbchen unterschieden werden. Erstere sind für das Farbsehen zuständig und befinden sich hauptsächlich in den zentralen Regionen der Netzhaut. Die Makula lutea, die sich genau im Zentrum der Retina befindet, besteht nahezu ausschließlich aus Zapfen. Stäbchen sind vermehrt in den peripheren Zonen der Netzhaut zu finden. Ihre Aufgabe ist das SchwarzWeiß Sehen. (1) Werden diese Zellen (1. afferentes Neuron) durch Lichtimpulse angeregt, geben sie eine Potentialänderung ihrer Membran über bipolare Zellen (2. afferentes Neuron) an die retinalen Ganglienzellen (3. afferentes Neuron) weiter. Deren Axone vereinen sich an der Papilla nervi optici zum Nervus opticus und treten durch die Lamina cribrosa aus dem Auge aus. (1) 2.1.2 Papilla Nervi Optici Da an dieser Stelle keine Fotorezeptoren vorkommen, wird sie auch als „Blinder Fleck“ bezeichnet. Ihr durchschnittlicher Durchmesser beträgt 1,8 mm. Eine Papille unter 1,5 mm wird als Mikropapille und ab 2,2 mm als Makropapille bezeichnet. Sie besitzt in der Mitte eine Exkavation, aus der die zentralen Blutgefäße austreten. Der neuroretinale Randsaum ist eine wallartige Erhöhung um die Exkavation, die aus durchtretenden Axonen gebildet wird. (1, 17, 18) Abbildung 2: zentraler 1 2 Augenhintergrund: Makula lutea (1), Papilla nervi optici mit austretenden Gefäßen (2) 3 Einführung 2.1.3 Kammerwasser Zyklus Die Vorder- und Hinterkammer des Auges verfügt über eine Zirkulation an Kammerwasser um die Linse und Hornhaut, welchen eine eigene Blutversorgung fehlt, mit Nährstoffen zu versorgen. Gebildet wird diese Flüssigkeit durch Ultrafiltration von den Ziliarkörpern an der Rückseite der Iris. Es werden ungefähr 2μl pro Minute produziert. (1) Der Na+/K+-Cl - Kotransporter und der Na+/K+ - Kotransporter führen zur Verschiebung des elektrochemischen Gradienten auf mindestens – 1mV. Dadurch fließt Flüssigkeit hauptsächlich transzellulär in die Augenkammer. (2, 30) 2.1.4 Regulation der Kammerwasserbildung Es wird vermutet, dass die Kammerwasserbildung einer neuronalen Regulation unterliegt, doch konnten bis jetzt keine Barorezeptoren im Auge gefunden werden. Es wird angenommen, dass freie Nervenendigungen als Sensoren dienen. α1- und β-adrenerge Interaktionen scheinen die stärkste Regulation des intraokularen Druckes (IOD) zu sein. Die Aktivierung von α-Rezeptoren an den Ziliarfortsätzen führt zu einer verminderten Ultrafiltration von Plasma, wohingegen die Aktivierung der βadrenergen Rezeptoren die Produktion von Kammerwasser durch eine verstärkte Aktivität des Na+/K+ - Cl - Kotransporters und des Na+/K+ -Kotransporters erhöht. (1, 30) 4 2.1.5 Kammerwasser Abfluss Von dem Ziliarepithel aus umfließt das Kammerwasser die Linse und tritt durch die Pupille in die Vorderkammer ein. Ein kleiner Teil des Kammerwassers kann durch den Ziliarmuskel oder durch die Iriswurzel abfließen. Dies nennt man den unkonventionellen Weg. Konventionell fließt das Kammerwasser zu 80% bis 90% durch das Trabekelmaschenwerk (TW) in den ringförmigen Schlemm’schen Kanal, welcher zwischen Iris und Hornhaut liegt und fließt von dort über transsklerale Sammelkanälchen in das episklerale Venensystem ab. (30) 2.1.6 Das Trabekelwerk Das TW ist aus drei Schichten aufgebaut. Durch die beiden inneren Schichten (uveales und korneosklerales Maschenwerk) kann das Kammerwasser aufgrund deren Porengröße leicht hindurchtreten. Das juxtakanalikuläre Maschenwerk stellt aufgrund seiner verringerten Porengröße und seiner Basalmembran den größten Teil des Abflusswiderstandes dar. (1, 30) Abbildung 3: Gonioskopie des Augenwinkels: von posterior nach anterior: Zilliarkörper (1), Skleralsporn (2), pigmentiertes TW 4 5 2 3 (3), nichtpigmentiertes TW (4), Schwalb´sche Linie (5) 1 5 Einführung 2.1.7 Intraokulare Druck Der intraokulare Druck (IOD) sorgt für eine stabile Kugelform des Auges, welche eine Voraussetzung für deren Mobilität und der Ausrichtung der Fotorezeptoren ist. Er regelt ebenso die Abstände zwischen Hornhaut, Linse und Netzhaut. Bei der Geburt liegt der IOD bei 6 bis 8 mmHg, steigt im Laufe der ersten Lebensjahre kontinuierlich an und umfasst beim Erwachsenen einen statistischen Normalbereich zwischen 10 bis 21mmHg. Eine Erhöhung des IOD erfolgt nicht durch eine Überproduktion des Kammerwassers, sondern durch strukturelle Veränderungen im TW, die zur Behinderung des Abflusses aus der Vorderkammer führen. (1,4) 6 2.2 Untersuchungsmethoden Das Glaukom ist im Allgemeinen eine langsam progrediente Erkrankung. Gesichtsfeldausfälle treten meist erst spät auf und können lange Zeit vom Patienten unbemerkt bleiben. Daher ist eine genau Inspektion und Untersuchung vom behandelnden Augenarzt nötig, um eine passende Therapie anbieten zu können. 2.2.1 Tonometrie Als Referenzstandard gilt die Applationstonometrie nach Goldmann. Diese Methode verwendet einen Messkopf mit einer definierten Oberfläche von 7.35 mm2, der mit einem variablen Druck gegen die Hornhaut gepresst wird. Die Hornhaut flacht sich dadurch ab und der Druck des Messgerätes gleicht sich dem des IOD an. Diese Methode ist nur bedingt von den Eigenschaften der Skleren und der Hornhaut beeinflusst. Sie hat eine Messgenauigkeit von ± 1mmHg. (1, 19) Abbildung 4: Applationstonometrie nach Goldmann, Blick durch den Tonometer während der Messung. Das Fluoreszenzmittel leuchtet im Blaulicht gelb. 7 Einführung 2.2.2 Pachymetrie Die Messung der Hornhautdicke erfolgt normalerweise mit einem Handultraschallgerät. Ein kleiner Kopf wird dabei auf die betäubte Hornhaut aufgesetzt. Zentral hat sie eine durchschnittliche Dicke von 520 µm, peripher bis zu 700 µm. (1) 2.2.3 Perimetrie Das Gesichtsfeld ist der Bereich, den das fixierte Auge wahrnimmt. Die Gesichtsfelduntersuchung ist eine Untersuchung mit subjektivem Ergebnis, da die Mitarbeit und völlige Konzentration des Patienten gefragt ist. Ebenso ist sie von der Sehkraft des Untersuchten abhängig. Der Patient fixiert einen Punkt in der Mitte einer Halbkugel. Nun werden Lichtpunkte in diese Kugel projiziert und der Patient gibt an, ob er diese sieht. Unterschiedliche Lichtintensitäten der Punkte geben nun ein Bild der Lichtunterschiedsempfindlichkeit an unterschiedlichen retinalen Orten. Durch diese Untersuchung lassen sich Ausfälle feststellen, die im Alltag durch die Bewegungen des Auges sowie die Binokularität kompensiert werden können. Am häufigsten wird heutzutage die computergesteuerte statistische Perimetrie verwendet, die das Gesichtsfeld des Patienten als Zahlenwerte oder in Graustufen darstellt. Durch die Gesichtsfelduntersuchung kann erhoben werden, wie stark das Glaukom die Netzhaut bereits geschädigt hat. Sie ist sowohl für die momentane Lebensqualität als auch für den Zeitverlauf der Krankheit wichtig. (1, 4) 8 Abbildung 5: Beispiel einer Perimetrie: parazentrale Ausfälle, im Zeitverlauf zunehmend 2.2.4 Papillenbeurteilung Sowohl die Größe der Papilla nervi optici als auch die Größe der zentralen Exkavation, respektive die Breite des neuroretinalen Randsaumes variieren physiologisch in der Bevölkerung. Die Papillen können mittels einer direkten oder indirekten Ophtalmoskopie untersucht werden. Dabei kann die Papille in ihrer Größe, Farbe und Form beurteilt werden. Weiters kann hierbei die Beurteilung des neuroretinalen Randsaumes erfolgen. Anzeichen für eine 9 Einführung Ausdünnung des neuroretinalen Randsaumes kann ein bajonettartiger Verlauf der Blutgefäße sein. (4) Das HRT (Heidelberger Retinale Tomographie) und das OCT (Optische Kohärenztomographie) haben sich dabei als wichtige Untersuchungsmethoden der Papillen etabliert. Das OCT stellt eine Schichtaufnahme mittels Laser her. Das HRT erzeugt ein dreidimensionales Oberflächenbild. Beide Techniken erlauben eine objektive Darstellung und Dokumentation der Papille, sowie des Randsaumes und der Exkavation. (1, 4) Eine verstärkte Exkavation der Papille mit einhergehender Ausdünnung des neuroretinalen Randsaumes sind typische Befunde für eine glaukomatöse Schädigung der Papille. Weiters ist eine peripapilläre Pigmentepithelatrophie in der Normalbevölkerung relativ häufig, tritt jedoch bei Patienten mit Glaukom gehäuft und verstärkt auf. (6) Die Papille sollte in regelmäßigen Abständen kontrolliert und exakt dokumentiert werden. Der C/D Wert, welcher sich aus der Größe der Exkavation und der Größe der Papille berechnet, stellt dabei einen wichtigen Progressionsfaktor dar. Abbildung 6: Beispiel einer Papille mit deutlichen glaukomatösen Veränderungen: vergrößerte zentrale Exkavation mit typischen bajonettartigen Verlauf der Gefäße sowie temporale peripapilläre Pigmentepithelatrophie 10 2.3 Therapieformen Die derzeitig einzig evidente Therapie, um den Verlauf der Krankheit zu verzögern oder zu stoppen, ist die Senkung des IOD. Hierbei gibt es im wesentlichen 3 Möglichkeiten. 2.3.1 Medikamentös Meist beginnt man mit einer medikamentösen Therapieform. Es gibt 5 Wirkstoffgruppen, die alleine oder kombiniert verwendet werden können. Prostaglandinderivate erhöhen den Kammerwasserabfluss über den unkonventionellen Weg, Betablocker und Karboanhydrasehemmer senken die Kammerwasserproduktion. α-Sympathomimetika senken die Kammerwasserproduktion, verbessern aber auch den Kammerwasserabfluss, wohingegen Parasympatomimetika nur den Kammerwasserabfluss verbessern. (1) 2.3.2 Lasertherapie Sollte die medikamentöse Therapie nicht ausreichend oder die Nebenwirkungen nicht tragbar sein, kann unterstützend eine Lasertherapie angeboten werden. Bei einer Trabekuloplastik wird das TW mittels eines Argonlasers verödet, wodurch das Kammerwasser leichter durch das juxtakanalikuläre TW abfließen kann. Es kann aber auch das Ziliarkörperepithel gelasert werden und somit die Kammerwasserproduktion verringert werden. (1) 2.3.3 Chirurgische Therapie Als letzte Therapieform kommt die Filtrationsoperation zum Tragen. Hierbei wird ad externo das TW eröffnet und ein Abfluss unter die Bindehaut geschafft, damit das Kammerwasser leichter abfließen kann. Diese Therapie senkt den IOP zwar sehr gut, ist aber als operative Intervention mit einem erhöhtem Risiko vergesellschaftet. (1) 11 Einführung 2.4 Glaukom Formen 2.4.1 Das Sekundäre Glaukom Das sekundäre Glaukom folgt anderen Augen- oder auch Allgemeinerkrankungen. So kann ein Glaukom durch eine längerfristige Kortisontherapie oder durch vorangegangene Entzündungsprozesse im Auge, wie zum Beispiel durch eine Herpes-Zoster Infektion, hervorgerufen werden. In manchen Fällen führen retinale Gefäßerkrankungen, wie eine Zentralvenenthrombose, ein Zentralarterienverschluss oder eine fortgeschrittene diabetische Retinopathie zu einem Neovaskularisationsglaukom. Bei diesem kommt es aufgrund einer verstärkten Gefäßeinsprossung im Kammerwinkel zu einer IOD- Erhöhung. Bei einem Pigmentdispersionsglaukom führen Pigmentpartikel, die von der Rückseite der Iris abgetragen werden und das TW verlegen, zu einem erhöhten Augeninnendruck. Es kommt bei einem Pseudoexfoliationsglaukom durch Ablagerung eines feinfibrillären Material, welches vermutlich aus dem Ziliarepithel stammt, zu einem erhöhten Widerstand im juxtakanalikulärem Maschenwerk und damit zur IOD- Erhöhung. (1, 2, 4) 12 2.4.2 Primäre Glaukome Sie werden nach dem irido-kornealem Winkel unterteilt. 2.4.2.1 Winkelblock Glaukom Diese Form des Glaukoms unterteilt man in einen akuten Winkelblock, sowie in ein chronisches Winkleblockglaukom. Beide Arten werden durch eine Verengung des Kammerwinkels hervorgerufen, wodurch es im Falle des akuten Winkelblockes zu rasch einsetzender IOD- Erhöhung mit Schmerzsymptomatik und beim chronischen Winkelblockglaukom zu langsam steigenden IOD mit typischer glaukomatöser Papillenschädigung kommt. 2.4.2.2 Das Primäre Kongenitale Glaukom/ Infantiles Glaukom Es entsteht durch eine Entwicklungsstörung des Kammerwinkels im 7. – 8. Fetalmonat und ist mit 1 aus 10.000. Geburten insgesamt betrachtet selten. Embryonales Gewebe überdeckt das Trabekelwerk und führt somit zu einem IOD- Anstieg. Es tritt bei 70% der Fälle bilateral auf. Durch eine chirurgische Therapie kann der IOD oftmals sehr gut reguliert werden. (1) 2.4.2.3 Okuläre Hypertension (OHT) Bei einer OHT ist der IOD dauerhaft über den statistischen Normbereich erhöht, ohne dass sich eine glaukomatöse Schädigung an der Papille zeigt. Da der erhöhte Augeninnendruck ein Risikofaktor für die Entwicklung eines Glaukoms ist, sollten deutlich erhöhte Druckwerte laut der European Glaucoma Society behandelt werden, um eine Entwicklung eines Glaukoms zu vermeiden. (1, 13) 13 Einführung 2.4.2.4 Primäres Chronisches Offenwinkelglaukom Das primäre chronische Offenwinkelglaukom ist eine chronische, neurodegenerative Erkrankung des Auges, die mit einer Abnahme der retinalen Nervenfaserschicht sowie typischem Papillenbefund einhergeht, ohne dass okuläre Erkrankungen oder kongenitale Anomalien vorliegen. Dies kann zu progressiven Gesichtsfelddefekten, bis hin zur irreversiblen Erblindung führen. Der IOD liegt hierbei ohne Therapie bei ≥ 21 mmHg. Besonders sensitiv auf die IOD- Erhöhung reagieren die retinalen Ganglienzellen (RGZ). (1, 7) Die Patienten bleiben oft jahrelang asymptomatisch, da die typischen Gesichtsfelddefekte nur langsam progredient sind und sich von der Peripherie ins Zentrum ausbreiten. Auch kommt es bei einem stetig leicht erhöhten IOD nicht zu der ausgeprägten Schmerzsymptomatik wie bei einem akuten Winkelblock. Wie der Name sagt, präsentiert sich das POWG mit einem physiologisch offenen Winkel zwischen Hornhaut und Linse. (1) Das primäre Offenwinkelglaukom kann auch mit Druckwerten im Bereich der statistischen Norm einhergehen (Normaldruckglaukom), aber auch hierbei ist die Senkung des IOD die einzig evidente Therapie. Grundsätzlich nimmt das Risiko für die Entwicklung eines POWG mit der Erhöhung des IOD kontinuierlich zu. Es hat sich jedoch gezeigt, dass kein Schwellen-IOD, ab dem unweigerlich ein POWG entsteht, existiert. Somit liegt die Vermutung nahe, dass andere Risikofaktoren (z.B. vaskuläre) für die Entstehung des POWG verantwortlich sind. Papillenrandblutungen, die in der Normalbevölkerung sehr selten sind, sind deutlich mit dem Normaldruckglaukom assoziiert. (5) 14 2.5 Epidemiologie Die Glaukome stehen weltweit nach der Katarakt an zweiter Stelle der Erblindungsursachen. Da die Katarakt aber im allgemeinen durch eine Operation reversibel ist, sind die Glaukome die häufigsten irreversiblen Erblindungsursachen weltweit. (52, 59) Derzeit sind rund 60 Mill. Menschen an einer Form des Glaukoms erkrankt. Diese Zahl wird sich nach Schätzungen in den kommenden Jahren auf weitere 80 Mill. erhöhen. (8, 59) Es konnte gezeigt werden, dass bestimmte Populationen ein erhöhtes Risiko haben, ein Glaukom zu entwickeln, selbst wenn sie in andere geographische Regionen ausgewandert sind. (58) Gehäuft tritt es vor allem bei Westafrikanern, Afroamerikaner, sowie Teilen der Bevölkerung westindischer Inseln mit afrikanischen Wurzeln auf. (53) Bevölkerungsgruppen mit schwarzer Hautfarbe haben mit 4,7% eine deutlich höhere Prävalenz als Kaukasier (Prävalenz 1,3%) (2) Ebenso ist in Indien die Prävalenz mit 2,6 – 4,1% recht hoch. Dementsprechend nimmt man an, dass rund 12 Mill. Menschen in Indien vom Glaukom betroffen sind. (60, 61) Verwandte eines POWG Patienten ersten Grades haben ein lebenslanges Risiko von 22% ein Glaukom zu entwickeln, wohingegen Patienten der entsprechenden Kontrollgruppe nur ein 2 -3%iges Risiko haben. (97) 15 Einführung 2.6 Risikofaktoren für die Entstehung eines POWG Die Rotterdam Eye Study (RES) (9), das Melbourne Visual Impairment Project (VIP) (10) und die Barbados Incidence Study of Eye Disease (BISED) (11) haben ein großes Patientengut auf die Inzidenz und Risikofaktoren zur Entwicklung eines POWG untersucht. In allen drei Studien hat sich gezeigt, dass das Alter ein wichtiger Risikofaktor ist. Patienten, die zwischen 70 und 80 Jahren waren, hatten im Gegensatz zu 40- bis 50Jährigen das 12-fache Risiko ein Glaukom in den kommenden 5 Jahren zu entwickeln. (9, 10, 11) Ebenso wurde der IOD als starker Risikofaktor identifiziert. So zeigten Patienten, die einen um 1 mmHg höheren Druck als der Durchschnitt hatten, ein 10 - 14% erhöhtes Risiko, ein Glaukom zu entwickeln. (11, 10) Die RES zeigte auch, dass Patienten die einen Verwandten ersten Grades mit Glaukom haben, ein 10-fach erhöhtes Risiko hatten, ebenso ein Glaukom zu entwickeln. (7) Analysen der RES deuten weiters darauf hin, dass ein veränderter C/D Wert ein frühes Zeichen für die Entwicklung eines Glaukom darstellt. Die Ocular Hypertension Treatment Study (OHTS) konnte zeigen, dass sowohl der erhöhte horizontale als auch der erhöhte vertikale C/D Wert und eine Asymmetrie der Exkavation beider Papillen Risikofaktoren sind. (12) Ein niedriger diastolischer Perfusionsdruck (diastolischer Blutdruck minus IOD) im Auge wurde von mehreren Studien als Risikofaktor identifiziert. Bei einem diastolischem Perfusionsdruck unter 51 mmHg steigt die Chance ein Glaukom zu entwickeln, bei unter 30 mmHg steigt diese sogar auf das 6-fache an. (2, 3, 13) Die zentraler Hornhautdicke liegt bei durchschnittlich 520μm. Die European Glaucoma Preventions Study (EGPS) hat gezeigt, dass schon bei einer 40μm dünneren Hornhaut eine starke Assoziation mit dem Glaukom gegeben ist. (4, 13, 3) 16 Eine Myopie ab -3 Dioptrie führt zu einer 3,3 Fach erhöhten Wahrscheinlichkeit, ein Glaukom zu entwickeln. (11) Männer haben laut einer Studie überdies ein höheres Risiko als Frauen im Laufe ihres Lebens an einem Glaukom zu erkranken. (11) Diabetes mellitus, erhöhter systemischer Blutdruck und Migräne zeigen nur geringe bis keine Assoziation mit dem Glaukom. (2) Es konnte bisher kein eindeutiger Einfluss auf die Entstehung eines Glaukom durch den Lebensstil, das Ausmaß an körperlichen Bewegung, Rauchen, Alkoholkonsum, sowie Ernährung festgestellt werden. (54, 55) 17 Einführung 2.7 Die Rolle der Apoptose Das Absterben der retinalen Ganglienzellen mitsamt ihren Nervenfasern und somit die Ausdünnung des Randsaumes, erfolgt durch Apoptose und nicht durch Nekrose. (20) Die Nekrose ist ein toxischer Prozess, bei dem Zellen geschädigt werden und durch eine passive Zellschwellung zugrunde gehen. Inhalte aus dem Zytoplasma werden in den Extrazellularraum frei gegeben und fördern so einen immunologischen Entzündungsprozess. (15, 16, 20) Apoptose tritt normalerweise als ein Prozess auf, um Zellpopulationen im Gleichgewicht zu halten. Beide Formen des Zelltodes zeigen Gemeinsamkeiten, doch unterscheiden sie sich in einigen wichtigen Punkten. Während bei der Nekrose die Zellen durch einen Energiemangel absterben, ist die Apoptose eine aktive Form des Zelltodes, für den sie ATP benötigt. Der Zelle wird, entweder von innen oder von außen, ein Signal zum Absterben gegeben. Darauf beginnt die Zelle Enzyme zu bilden, die ihren eigenen Abbau fördern. Es gibt aber auch Situationen, in denen die Zelle sich gegen die Apoptose entscheidet, oder in denen die Apoptose in eine Nekrose übergeht, z.B. bei einem ATP Mangel. (15, 16, 20) 2.7.1 Aktivierung der Apoptose Derzeit sind 3 Wege zur Aktivierung der Apoptose bekannt, welche allesamt mit der Aktivierung von Caspase 3 enden. Ab diesem Zeitpunkt spricht man vom gemeinsamen exekutiven Weg. 18 2.7.1.1 Der Extrinsische Weg Die Aktivierung des extrinsischen Weges erfolgt meist durch eine Ankoppelung von Tumor Nekrose Faktoren an einen transmembranösen Rezeptor. Dadurch wird Caspase 8 aktiviert, welche zur Abspaltung von Caspase 3 führt. (15) 2.7.1.2 Der Perforin/Granzym Weg Normalerweise zwingen zytotoxische T-Zellen ihre Opfer durch die Aktivierung des extrinsischen Weges zur Apoptose. Zellen, die darauf nicht reagieren (z.B. Tumor Zellen, Virus infizierte Zellen) können durch Granula, welche durch Zellporen geschleust werden, zur Apoptose gezwungen werden. Großteils bestehen diese Granula aus Granzym A und Granzym B. Granzym B aktiviert Caspase 10, welche im Verlauf Caspase 3 aktiviert. Granzym A hat zur Folge, dass DNAse NM23-H1 inaktiviert wird und DNA Schäden nicht mehr ausgebessert werden. (15, 16) 2.7.1.3 Der Intrinsische Weg Durch die Abstinenz von Hormonen, Wachstumsfaktoren oder Cytokinen, welche eine Apoptose unterdrücken, wird das Absterben der Zelle getriggert. Dieser Weg kann zum Beispiel durch Strahlung, Virusinfektionen etc. verursacht werden. Daraus folgt die Lösung von proapoptotischen Stoffen aus den Mitochondrien, wodurch Caspase 9 aktiviert wird, welche wiederum Caspase 3 abspalten. (15,16) 19 Einführung 2.7.1.4 Der Exekutive Weg Alle drei Wege führen zur intrazellulären Abspaltung von Caspase 3. Es kommt zu einer Auflösung der DNA und dem Abbau des Zytoskelett. Die Zelle ist somit teilungsunfähig und beginnt ihre eigenen Bestandteile abzubauen. Durch die Inaktivierung der Elektrolytpumpen und ohne Zytoskelett schrumpft die Zelle zu einem kleineren apoptotischen Körperchen, dessen Membranrezeptoren es ermöglichen, von Phagozyten geschluckt zu werden, ohne einen Entzündungsprozess hervor zu rufen. (15,16) 2.7.2 Aktivierung der Apoptose Eine große Anzahl von Studien konnten Signale definieren, welche alleine oder in Kombination, das Absterben von RGZ beim Glaukom vorantreiben. (16) 2.7.2.1 Versagen des Axonalen Transportes Die Hyopthese, dass Störungen des axonalen Transportes zum Absterben von RGZ führen können, wurde in mehreren Versuchen im Tiermodell und auch beim Sekundärglaukom beim Menschen überprüft. Es zeigte sich, dass bei einer Erhöhung des IOD vermehrt Dynein, ein Motorprotein, in den Nervenköpfen der RGZ gefunden wurde, was auf ein Versagen der axonalen Transportmechanismen zurückzuführen wäre. (39, 40) 20 2.7.2.2 Neurotrophe Faktoren Neurotrophe Faktoren spielen eine wichtige Rolle, wenn es um das Überleben von geschädigten adulten Nervenzellen geht. Sie haben die Fähigkeit aktivierte apoptotische Prozesse zu inhibieren. Es handelt sich um kleine Peptide, von denen BDNF (Brain Derived Neurotropic Factor) die wohl wichtigste Rolle für die RGZ spielt. Es konnte gezeigt werden, dass BDNF-mRNA verstärkt in frühen Stadien von OHT exprimiert wird. Nach einer Schädigung der RGZ ist das Überleben dieser von neurotrophen Faktoren abhängig. (41) 2.7.2.3 Mitochondriale Dysfunktion Mitochondrien spielen in der Apoptose eine wichtige Rolle. Sie üben sowohl pro- als auch antiapoptotische Funktionen aus. Sobald der Weg in Richtung Apoptose eingeschlagen ist, verstärkt sich die Membranpermeabilität der Mitochondrien und entlässt als erstes Cytochom C in das Zytoplasma der Zelle, welches den Abbau von Zellbestandteilen fördert. Die Produktion von ATP in den Mitochondrien verringert sich im Laufe des Lebens. Ein erhöhter IOD wirkt sich ebenso negativ auf die Produktion von ATP aus, wie auch ein verringerter Blutfluss. Dies könnte ein Erklärungsmodell sein, warum das Alter ein so entscheidender Risikofaktor für die Entstehung eines Glaukoms ist. (42, 43) 2.7.2.4 Oxidativer Stress Oxidativer Stress entsteht durch eine fehlende Balance zwischen dem Entstehen von reaktiven oxidativen Molekülen und deren Elimination durch Antioxidantien. Zellen besitzen mehrere Proteine und Enzyme, die sie vor einem Schaden durch oxidativen Stress schützen. Es besteht Evidenz dafür, dass in den RGZ von Glaukompatienten ein Mangel an Antioxidantien besteht. (44, 45) 21 Einführung 2.7.2.5 Aktivierung des Intrinsischen Apoptotischen Weges Die große Familie der MAPK (Mitogen-aktivierte Protein Kinase) Proteine, welche extrazelluläre Signale in die Zelle weiterleiten, sind ein zentraler Regulator für das Milieu der Zelle. Eine Fehlregulation dieser Proteine führt zu einem Mangel an ASK1 Proteinen. ASK1 Mangel wurde im Mausmodell als ein Faktor für das Absterben von RGZ ohne erhöhtem IOD identifiziert. (51) 2.7.2.6 Aktivierung des Extrinsischen Apoptotischen Weges Hierfür scheint TNFα eine wichtige Rolle zu spielen. TNFα wurde verstärkt in neurodegenerativen Prozessen wie zum Beispiel bei Morbus Alzheimer gefunden. TNFα Rezeptoren werden im Verlauf einer Glaukomerkrankung vermehrt von RGZ exprimiert. Diese erhöhte Sensitivität der RGZ führt zu einer Aktivierung des extrinsischen apoptotischen Weges. (16) 2.7.2.7 Exzitotoxischer Schaden Glutamat stellt eines der wichtigsten Neurotransmitter im ZNS und auch der Retina dar. Eine der Hypothesen zum Untergang von RGZ besagt, dass Glutamat verstärkt an Rezeptoren in der Retina bindet. Somit kommt es zu einem vermehrten Einstrom von Ca2+ und einer vermehrten Aktivierung von proapoptotischen Signalen. Erhöhte endogene Glutamat Konzentrationen wurden in vielen akuten und chronischen ZNS Schädigungen nachgewiesen. Die Müller Zellen in der Retina reagieren besonders sensitiv auf Glutamat mit einer erhöhten Produktion von TNFα. Es wird vermutet, dass ein Zusammenhang mit dem Glaukom besteht. (49, 50) 22 2.8 Genetik des POWG 2.8.1 Genetik Allgemein Von den 3.08 Mrd. Basenpaaren eines menschlichen Genoms kodieren rund 25.000 Gene für ein Protein. Rund 10 Mill. Einzelnukleotidpolymorphismen [Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs)] konnten im humanen Genom bisher identifiziert werden. Die Variation einzelner Basenpaaren wird mit einer Frequenz von bis zu 0.1% angegeben, wobei die Substitution eines SNPs am häufigsten vorkommt. (91) Nur eine geringe Anzahl der Polymorphismen haben jedoch eine funktionelle Auswirkung. Polymorphismen, die im Exon (dem kodierenden Bereich eines Gens) oder in der Promotor-Region (der eine regulatorische Funktion der Genexpression zukommt) liegen, können Einfluss auf die Funktion, Syntheserate und Abbau eines Proteins haben. (91, 90) Eine klare Genkoppelung, in der ein Genotyp dem Phänotyp gleichgesetzt werden kann, ist bei komplexeren Erkrankungen wie dem POWG, nicht gegeben. Eine Erkrankung wird als „komplex“ bezeichnet, wenn der Phänotyp polygenetisch vererbt wird, also keinen Mendel´schen Erbgang hat, oder durch eine inkomplette Penetranz und Heterogenität der Genotypen beeinflusst wird. (95) 2.8.2 Methoden der Genanalyse 2.8.2.1 Linkage Analyse Linkage Analysen sind die älteste Form der genetischen Ursachenfindung. Es werden Familien, in denen bestimmte Erkrankungen gehäuft vorkommen, untersucht. Üblicherweise benötigt man zumindest 10 erkrankte Individuen in einer Familie über maximal 3 Generationen verteilt, um eine statistisch signifikante Aussage zu machen. Meist werden größere chromosomale Regionen identifiziert. (96, 97) 23 Einführung MYOC war das erste Gen, welches durch diese Methode identifiziert werden konnte. (21) 2.8.2.2 Candidate Gene Aproach Der Candidate Gene Aproach (CGA) wird verwendet, um die Auswirkungen eines Polymorphismus im Zusammenhang mit einer Krankheit zu bestätigen. Zuerst muss ein mögliches Gen definiert werden. Dies passiert meist über vorliegende Studien, die einen oder mehrere Kandidaten als möglichen Verursacher beschreiben. Diese Hypothesen können in CGAs verifiziert werden. Es werden spezifische Polymorphismen auf einen Zusammenhang mit der Krankheitsentwicklung hin untersucht. Oft werden Gene gewählt, die für ein Enzym oder Protein codieren, welche in den biochemischen Prozessen rund um die Krankheit eine Funktion erfüllen. Ein fundiertes Wissen über die Involvierung des Genes muss dabei vorausgesetzt werden. Ist die Pathophysiologie einer Krankheit nicht gewiss, können CGAs nur bedingt Aussagen über den genetischen Einfluss machen. (92) Hierbei wird eine große Gruppe an Probanden benötigt, um eine Assoziation zu bestätigen. (92) 2012 konnten Ting et al. mittels einer CGA-Studie FBXo11, VRK2, MSH2, RTN4 und CALM2 als mögliche genetische Faktoren in der Glaukomentwicklung identifizieren. (93) 2.8.2.3 Genomweite Assoziationsstudien (GWAS) Auf der Suche nach Verbindungen zwischen genetischen Variationen und bestimmten Krankheiten haben sich genomweite Assoziationsstudien [Genomwide Association Studies (GWAS)] in den letzten Jahren etabliert. Sie ermöglichen einen Vergleich von vielen tausenden SNPs in einer großen Anzahl von Patienten. Heutzutage lassen sich Millionen SNPs in einer Sitzung untersuchen. Es müssen daher, um eine statistisch signifikante Aussage machen zu können, eine große Anzahl an Patienten untersucht werden. (25) 24 Der Nachteil dieser Untersuchung ist jedoch, dass eine reine Assoziation gefunden wird, welche noch keine Kausalität beweist. Daher ist es üblich, Ergebnisse von GWAS in weiteren Untersuchungen auf ihre Funktionalität zu überprüfen. Auch können seltene SNPs aufgrund der extrem hohen Probandenanzahl unentdeckt bleiben. (26) CDKN2B auf Chromosom 9p21 wurde von mehreren GWAS mit dem POWG assoziiert. Ebenso wurde SIX1/SIX6 in der Auswertung der selben Daten gefunden und in weiteren Untersuchungen bestätigt. Die derzeit gefunden Genvarianten treffen nur auf unter 10% der Glaukome zu. (25) 2.8.3 POWG assoziierte Gene 2.8.3.1 Myocilin (MYOC) Das erste Gen, welches dem Glaukom zugeordnet werden konnte, war das 1997 entdeckte MYOC Gen im Bereich GLC1A, welches für das Protein Myocilin transkribiert. Entdeckt wurde es in einer Familie mit starker Prävalenz von juvenilen Offenwinkelglaukomen (62). Das Myocilin-Gen beinhaltet zwei Introns und drei Exons. Es hat eine Spanne von 17kb und ist auf dem Chromsom 1q24.3−1q25.2 lokalisiert. (64, 65) Die Funktion des vom Ziliarkörper und dem Trabekelwerk sezernierten Proteins ist weitgehend unbekannt. Es gibt jedoch Hinweise, dass die Akkumulation von verändertem Myocilin die Trabekelzellen an der Umstrukturierung hindern. (21, 2, 58). Weiteres konnte gezeigt werden, dass im Rattenmodell ein erhöhter IOD mit einem bis zu 4-fach erhöhten Wert von Myocilin im Kammerwasser einhergeht. (64) 2000 ermittelte Fautsch et al., dass eine Myocilin Überexpression im Kammerwasser zu einem um > 90% erhöhten Abflusswiderstand führen kann. (66) Jedoch konnten diese Ergebnisse nicht in allen Studien reproduziert werden. (64) Ein erhöhter IOD führt zu einer vermehrten Expression von Myocilin, jedoch werden Spitzenwerte erst nach 24 Stunden gemessen. Diese Verzögerung kann ein Hinweis darauf sein, dass Myocilin reaktiv auf 25 Einführung einen erhöhten IOD produziert wird und kein Ursprung der Druckwerte ist. (67) Weiter konnte gezeigt werden, dass ein Großteil des Myocilin nicht sezerniert wird, sondern sich im Endoplasmatischen Retikulum ansammelt. (64) Veränderungen in diesem Gen, haben große Auswirkungen auf den IOD. Typisch für Mutationen, die ein Juveniles Glaukom hervorrufen, sind Spitzenwerte von über 40mmHg. Nur wenige Varianten des Gens sind mit dem Glaukom assoziiert. Meist liegen Veränderungen auf dem 3. Exon vor. Die häufigste Mutation in Kaukasiern ist Gln368Stop, weiters fand Cheng et al. 2012 eine starke Assoziation zwischen den Varianten Q368X bei Kaukasiern und T353I bei Asiaten. (22, 23, 56) Soweit bekannt sind Myocilin Mutationen für bis zu 3% der adulten POWG verantwortlich. Doch konnten in 36% der juvenilen Glaukome eine genetische Veränderung im Myocilin-Gen festgestellt werden. (21, 56, 63) 2.8.3.2 Optineurin (OPTN) In der Gruppe der familiären Normaldruckglaukome wurde 2002 das Optineurin Gen (OPTN) in dem Bereich GLC1E gefunden. Es wurde für bis zu 16% dieser Fälle verantwortlich gemacht. Man vermutet, dass es eine Rolle bei der Exocytose und/oder der Apoptose spielt, wobei die exakten Mechanismen nicht klar sind. (57) Das humane Optineurin Gen (OPTN) ist lokalisiert auf Chromosom 10, Lokus 10p13. Es besitzt 13 Exons, die für 577 Aminosäuren kodieren. (70) Experimentell schützt OPTN bestimmte Zellen vor einem oxidativen Schaden. Eine Mutation des Gens ist, laut einigen Studien, unter anderem mit der Entwicklung einer Amylotrophen Lateralsklerose (ALS) assoziiert (71). Seine Transkription wird vermutlich von TNFα getriggert. In Verbindung mit Huntingtin ist es an der Vesikelbildung beteiligt. Eine Beteiligung an der Aktivierung der Transkription von mehreren Proteinen wird ebenso diskutiert. (72, 73, 76). Im Mäusemodell konnte gezeigt werden, dass eine Überexpression von mutierten OPTN zu einer erhöhten Apoptoserate in RGZ führt, ohne den IOD zu steigern. Diese Ergebnisse bestätigten die beobachtete Vergesellschaftung von OPTN Mutationen und 26 Normaldruckglaukome. (73) Die häufigste Frequenz hat die Mutation E50K mit 13,5%. (70) H486R ist mit einem seltenen juvenilen POWG assoziiert (74). Es wird vermutet, dass OPTN zum Schutz der Zelle gebildet wird. Es hat die Eigenschaft Zytochrom C und den Peroxidase-induzierten Zelltod zu blockieren. Mutationen auf E50K führten zu einem Protein, das diese Eigenschaft nicht mehr adäquat erfüllen kann. Die Zelle wird dadurch vulnerabler gegen oxidativen Stress.(75) Vermutlich führt OPTN zu einer Kaskade an intra- und extrazellulären Signalen. TNFα oder FasL könnten als Schlüsselmediatoren zur Einleitung einer Apoptose, eines Entzündungsprozesses oder einer Vasokonstriktion führen. (76) 2.8.3.3 WD40-repeat 36 Gen (WDR36) 951 Proteine können aus den 23 Exons, welche WDR36 bilden, am Lokus 5q22.1 (GLC1G) kodiert werden. Die Expression wurde bis jetzt in der Linse, der Iris, der Sklera, der Papilla und auch der Retina, nachgewiesen. WDR36 gehört zu der Familie der WD40 repeat-containing Proteinen und ist als Gerüstprotein an vielen Prozessen (Signaltransduktion, genetische Regulation und Apoptose) beteiligt. (24, 77) Chi et al. konnte 2010 zeigen, dass Mäuse mit einer Mutation an WDR36 einen erhöhten Verlust an RGZ zeigten. (78) 2005 konnte Monemi et al. mehrere genetische Loci entdecken und fand in seiner Studie, dass 6% der Patienten mit POWG eine Mutation des WDR36 hatten. (24) Diese Ergebnisse konnte in mehreren Studien wiederholt werden. (79) Andererseits konnten einige Studien keinen Zusammenhang von WDR36 Mutationen mit der Entwicklung eines Glaukoms feststellen. Es wird somit vermutet, dass WDR36 Mutationen das Risiko für ein POWG erhöhen, jedoch nicht allein zur Entstehung eines POWGS führen. (80) Eine Hypothese besagt, dass eine Veränderung von WDR36 zu einer gestörten Immunantwort über IL-2 führt und somit zur Entwicklung eines POWG beiträgt. (81, 82) 27 Einführung 2.8.3.4 Cytochrome P450 family1, subtypeB, polypeptide1 (CYP1B1) CYP1B1 beinhaltet drei Exons auf zwei kodierenden Regionen, die sich auf dem Lokus 2p22-p21 befinden. Es konnte vor allem während der Entwicklung des Auges in der Retina, der Iris und der Cornea gefunden werden, jedoch nicht im TW. Nur das adulte Auge scheint CYP1B1 im TW zu sezernieren. Mutationen in dieser Region können zu einem unstabilen Protein führen, welches seine Enzymtätigkeit nicht ausführen kann. (77, 84) Man kann annehmen, dass Mutationen in CYP1B1 zu einer Veränderung im Maschenwerk führen können und somit den IOD erhöhen. (77) Es hat sich gezeigt, dass Patienten die sowohl MYOC als auch CYP1B1 Mutationen haben, früher Auswirkungen eines POWG zeigen. (85, 86) Es gibt jedoch auch Studien, welche zeigten, dass CYP1B1 Mutationen ohne MYOC Mutationen ebenso zu einem POWG führen können. (83) 2.8.3.5 Ankyrin repeats and suppressor of cytokine signalling box-containing protein 10 (ASB10) Proteine der ASB Familie fungieren als Zytokin Regulator und stehen mit dem Zellzerfall in Verbindung. Es wurde in vielen Teilen des Auges festgestellt, unter anderem im TW, der Iris und der Retina. (77) Es konnte gezeigt werden, das Mutationen im ASB10 eine Veränderung des TW zur Folge haben, was zu einem erhöhten IOD führen kann. ASB10 wird jedoch auch von der Retina gebildet, was seine Rolle am Untergang der RGZ nahelegt. (87,77) 28 2012 konnte Passuto et al. Varianten im Gen ASB10 in einer Familie mit starker POWG Präsenz nachweisen, wohingegen Fingert et al. 2012 ASB10 Polymorphismen nicht als Risikofaktor identifizieren konnte. (87, 89) 2.8.4 Untersuchte Gen-Polymorphismen Im Rahmen der vorliegenden Studie wurden funktionelle SNPs in Genen von Proteinen, denen eine Rolle bei der Apoptose zugesprochen wurde und welche in vorhergehenden Studien mit dem Glaukom in Verbindung gebracht wurden, auf eine etwaige Assoziation mit dem POWG untersucht. 2.8.4.1 Bcl-2-assoziiertes X Protein Das Gen des Bcl-2-assoziierte X Proteins (BAX) ist auf Chromosom 19 lokalisiert. Es beinhaltet 6 Exons und die Expression wird vom Protein p53 geregelt. BAX ähnelt strukturell dem Bcl-2 Protein. Ihre Wirkung ist jedoch antagonistisch zueinander. Bcl-2 Proteine schützen die Zelle vor der Apoptose, BAX hingegen ist ein Schritt zur Aktivierung des Zelluntergangs. Es führt zum Verlust des mitochondrialen Membranpotentiales, was wiederum eine Freisetzung von Zytochrom C und anderen proapoptotischen Proteinen in das Zytoplasma fördert. Dadurch werden Caspasen aktiviert und der Weg Richtung Apoptose eingeschlagen. Studien haben gezeigt, dass ein hohes Verhältnis von Bcl-2/BAX zu einem verlängerten Zellüberleben führt. (32) So wurden von Charles et al. 2005 eine erhöhte Produktion von BAX Proteinen von RGZ festgestellt, denen Serum entzogen wurde. (33) Säugetiere produzieren in der Entwicklungsphase der Netzhaut zweimal mehr RZG als schlussendlich übrig bleiben, wobei BAX für das Überleben der RGZ eine wichtige Rolle zu spielen scheint. 29 Einführung Mehrere Experimente an DBA/2J Mäusen haben gezeigt, dass es bei einer völligen Abstinenz von BAX zu einer Verdickung von RGZ Schichten um bis zu 220% kommt. (28) Dies traf aber nur auf homozygote BAX negative Mäuse (BAX-/-) zu. Heterozygote BAX Mäuse (BAX+/-) zeigten eine ähnliche Rate an abgestorbenen RGZ wie homozygot negative BAX Mäuse (BAX-/-). BAX-/- Mäuse zeigten auch einen erheblich niedrigeren IOD als BAX+/- oder BAX+/+. Ein Mangel an BAX kann das Absterben von RGZ in Mäusen mit Glaukom nur verzögern. Ein Grund dafür könnte sein, dass nach einiger Zeit andere Proteine eine Apoptose induzieren. Eine Reduktion des proapoptotischen Effektes wurde in BAX Genen nachgewiesen, in deren Promotorregion ein Guanin zu einem Adenosin substituiert war (BAX -248G>A; rs4645878). Durch diesen Polymorphismus konnte das Protein nur mehr vermindert produziert werden. (99) 2.8.4.2 Fas Rezeptor und Fas Ligamente Die Familie der Tumor Necrosis Factor/Nerve Growth Factor (TNF/NGF) Rezeptoren, stellt eine der am besten untersuchten Faktoren der Apoptose dar. Ihre Gemeinsamkeit besteht in einem transmembranösen Protein, welches die Fähigkeit besitzt, intrazellulär Caspasen zu aktivieren. FAS Rezeptoren sind Teil dieser Familie und werden von unterschiedlichen Zellen in großer Anzahl exprimiert. Zum Beispiel werden sie häufig in aktivierten T- oder B-Zellen, aber auch teilweise von Tumorzellen gebildet. An den FAS Rezeptoren (FAS-R) binden die FAS Ligamente (FAS-L), welche hauptsächlich an natürlichen Killerzellen und TZellen, aber auch an retinalen und kornealen Zellen vorkommen. Die Bindung von FAS–L an FAS–R führt in den meisten Fällen zu eine rapiden Proteolyse und im weiteren Verlauf zur Apoptose der Zellen. (31, 37) 1999 konnten Agarwar et al. zeigen, dass Zellen des TW durch eine Stimulation des FASR zur Apoptose gezwungen werden. (31) Vermehrter apoptotischer Zelluntergang im Bereich des Trabekelwerks konnte im Verlauf einer Glaukomerkrankung gezeigt werden. 30 Eine Mutation in der Promotor Region von FAS wurden als Risikofaktoren für die Entwicklung von Alzheimer identifiziert. (37) Ein Polymorphismus in der Promotorregion von Fas (1377G>A = rs2234767) vermindert die Expression von Fas, indem Bindestellen für Transkriptionsfaktoren in ihrer Funktion beeinträchtigt werden. (37, 100, 101) 2.8.4.3 V-AKT murine thymoma viral oncogene homolog 1 (Akt 1) In den unterschiedlichen Mechanismen, die zur Aufrechterhaltung der Homöostase der Zelle führen, spielt einer der neurotrophischen Wege eine wichtige Rolle. Dieser beinhaltet PI3K und Akt als Schlüsselproteine. Sobald diese Proteine an eine Zelle gebunden werden, können sie Prozesse der Apoptose stoppen. Unter anderem inhibieren sie die Bildung von Caspase 3 und 9. Studien haben gezeigt, dass im Tiermodell eine Erhöhung des IOD mit einer gesteigerten Bildung von Akt einhergeht. Insulin und IGF-1 scheinen bei der Aktivierung von Akt eine wichtige Rolle zu spielen und wurde vermehrt bei erhöhtem IOD identifiziert. Es zeigte sich jedoch, dass der neuroprotektive Effekt in den RGZ zu gering war, um die Zellen vor dem Absterben zu bewahren. (36) Entsprechend einer rezenten Studie führt der Polymorphismus rs1130233 im Gen AKT1 zu einer veränderten Syntheserate des Proteins. (38) 31 Methoden 3. Methoden 3.1 Patienten Insgesamt wurden für diese Studie 668 Probanden im Zeitraum von Jänner 1999 bis März 2011 an der Universitäts- Augenklink Graz akquiriert. Folgende Untersuchungen wurden durchgeführt: Untersuchung des gesamten Auges an der Spaltlampe inklusive Gonioskopie Korrigierter Sehtest Goldmann-Applanationstonometrie Pachymetrie der Hornhaut Standardisierte Automatische Perimetrie (Interzeag Octopus 101, Programm G2), in Fällen von stark geminderter Sehfähigkeit eine Goldmann Perimetrie Fotographie des Sehnervenkopfes POWG wurde definiert als: IOD von mindestens 21mmHg (ohne drucksenkende Medikamenten) offener Kammerwinkel glaukomtypische Sehnervenkopfveränderungen glaukomtypische Gesichtsfelddefekte Ausschluss eines Sekundärglaukoms Probanden der Kontrollgruppe zeigten keinen morphologischen oder funktionellen Schaden, der auf ein primäres oder sekundäres Winkelblock- oder Offenwinkelglaukom deuten würde. Die Gruppen wurden geschlechts- und altersgematcht (± 3 Jahre). 32 Alle Probanden sind Kaukasier und stammen aus der selben geographischen Region (südliches Österreich). Vor den Untersuchungen wurden die Patienten ausführlich über die Studie und das Prozedere informiert und gaben eine schriftliche Einverständniserklärung ab. Die Studie wurde von der Ethikkommission bewilligt und erfüllte die Standards des österreichischen Gendiagnosegesetzes. 3.2 Alter Das Alter beider Gruppen betrug im Mittel 73,6 Jahre (± 8,1 Jahre) mit einem Minimum von 43,7 Jahren und einem Maximum von 92,9 Jahren. Das Alter der POWG Gruppe betrug im Mittelwert 74,1 Jahre (± 8,3 Jahre) mit einem Minimum von 43,7 Jahren und einem Maximum von 92,9 Jahren. Das Alter der Kontrollgruppe betrug im Mittelwert 73,2 Jahre (± 7,8 Jahre) mit einem Minimum von 45,2 Jahren und einem Maximum von 92,1 Jahren. Tabelle 1: Das Alter der POWG- sowie der Kontrollgruppe mit Standardabweichung, sowie Minimum und Maximum in Jahren Mittelwert N Standardabweichung Minimum Maximum Kontrollgruppe 73,23 334 7,87 45,2 92,0 POWG 74,15 334 8,33 43,7 92,9 Gesamt 73,69 668 8,11 43,7 92,9 33 Methoden 3.3 Geschlecht Insgesamt nahmen je Gruppe 187 Frauen sowie 147 Männer an der Studie teil. Tabelle 2: Verteilung der Geschlechter in den Gruppen: POWG und Kontrollgruppe Häufigkeit Prozent Männlich 147 44% Weiblich 187 56% Männlich 147 44% Weiblich 187 56% Gesamt 668 100% Kontrollgruppe POWG 3.4 Geräte, Materialien, Reagenzien Folgende Gene wurden untersucht: AKT1 Lokus: rs 1130233 BAX Lokus: rs 4645878 FAS Lokus: rs 2234767 FAS-L Lokus: rs 763110 Die genetische Analyse wurde im molekularbiologischen Labor der UniversitätsAugenklinik Graz durchgeführt. 34 Venöses Blut wurde in 3ml EDTA Röhrchen gesammelt. Die DNA der peripheren Lymphozyten wurde mit dem QIAamp DNA Mini and Blood Kit (Quiagen, Venlo, Niederlande) laut Protokoll extrahiert. Die Lagerung bis zur endgültigen Analyse erfolgte bei -20°C. Die Determinierung der SNPs erfolgte vermittels High Resolution Melting Curve (HRMC) durch ein LightCycler © 480 System (Roche Diagnostics Ag, Schweiz). Bestandteile des Reaktions Mix: High resolution Melting Master: o FastStart DNA Polymerase, o Reaktionspuffer o dNTP Mix o High Resolution Melting Farbe MgCl: 3,0 mM Primers: o Oligos: Fa. GenXpress o Primer Konzentration: 0,2 yM o Amplifizierungslänge: 95 – 118bp o Anlagerungstemperatur: 57°C – 63°C (an den Primer angepasst) Tabelle 3: Bezeichnung der Primer und ihre Nukleotidsequenz AKT1 BAX FAS FAS L Primer Name Nukleotidsequenz des Primers AKT1, rs1130233, left 5` agc tgt tct tcc acc tgt cc - -3` AKT1, rs1130233, right 5` tct ccg agt gca ggt agt cc - - 3 BAX, rs4645878, left 5` acc ctg ccc gaa act tct aa - - 3` BAX, rs 4645878, right 5` gag cat ctc ccg ata agt gc - - 3 FAS, rs 2234767, left 5´ cct tat ccc act tct ttt tgt gtc - - 3` FAS, rs 2234767, right 5` ggc ttg tct ctg ttc cac ct - - 3 FASL, rs 763110 left 5` ctg ggc aaa caa tga aaa tg - - 3` FASL, rs763110 right 5` acc cac ttt aga aat tag atc a - - 3 35 Methoden Protokol des LightCycler© 480: Pre-Inkuabtion: 95°C für 10 min Amplifizierung: 95°C für 10 sek 57°C – 63°C für 10 sek 72°C für 4 – 8 sek (Abhängig von der Amplifizierungslänge) 45 – 60 Zyklen Melting curve: 95°C für 1 min 40°C für 1 min 70°C für 1 min 95°C kontinuierlich = 25 Akquisitionen /°C 3.4.1 Genetische Analyse Die Differenzierung von homozygoten und heterozygoten Polymorphismen erfolgte durch die Unterschiede in der Schmelzkurve (Melting curve). Als Schmelzpunkt wird die Temperatur definiert, an der die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den DNA Strängen bricht. Da G-C eine 3 Fachbindung und A-T nur eine Zweifachbindung hat besitzen sie einen unterschiedlichen Denaturierungspunkt. Diese Unterschiede können über UV-Absorption oder durch Unterschiede in der Fluoreszenz gemessen werden. (98) Homozygote Polymorphismen konnten 1:1 vom Wildtyp unterschieden werden. Zur Detektion der Sequenzunterschiede wurde die Gene Scanning Software 1.5 von Roche Diagnostics GmbH verwendet. Zur Qualitätskontrolle erfolgte ein Vergleich von 3 Analysemethoden. 36 3.5 Statistik Es wurde untersucht, ob sich SNPs im Bereich der Gene AKT1, BAX, FAS, sowie FASL in einer Gruppe von Patienten mit POWG von einer geschlechts- und alters-gematchten Kontrollgruppe unterscheiden. Zur Berechnung der Statistik wurde SPSS© Version 18 und Microsoft Excel Version 2011 herangezogen. 3.5.1 Statistische Analyse: Chi2 Test Der Chi2 Test eignet sich für dieses Beispiel am besten, da er Merkmale zweier Gruppen miteinander vergleicht. Er gilt nach wie vor als zuverlässig, vor allem bei großen Stichproben (n > 30). (94) Die beobachteten Häufigkeiten werden dabei in eine Kreuztabelle eingetragen. Es wird eine erwartete Häufigkeit errechnet, die man bekommen würde, wenn die Merkmale unabhängig voneinander wären. Diese Werte werden dann miteinander verglichen. (94) Als signifikant werden P-Werte von unter 0,05 (p ≤ 0,05) bezeichnet. Als sehr signifikant werden P-Werte von unter 0,01 (p ≤ 0,01) bezeichnet. 3.5.2 Bonferroni Korrektur Um einen statistischen Alphafehler, bzw. falsch positive Ergebnisse, reduzieren zu können, sollten multiple Hypothesen (m), die unabhängig voneinander an einem Datensatz getestet werden, auf ihre reale Signifikanz (α´) korrigiert werden. Das Gesamtrisiko (α) wird dabei durch die Anzahl der Hypothesen (m) dividiert. Die Bonferroni Methode ist eine grobe Annäherung an das reale Risiko. (102) 37 Ergebnisse 4. Ergebnisse Tabelle 4 zeigt als Ergebnis, dass die untersuchten SNPs nicht statistisch signifikant mit dem Vorkommen eines POWG vergesellschaftet sind. Für rs1130233 im Gen AKT1 ist der Genotyp A/A mit einem p-Wert von 0.031 grenzwertig signifikant. Wird allerdings nach Bonferroni-Korrektur mit einem Signifikanzniveau von p<0.0125 nicht signifikant. Tabelle 4: Frequenzen der einzelnen Genotypen der jeweiligen SNPs in Glaukompatienten sowie Kontrollprobanden, Chi2 Werte sowie P- Werte Gene Mutationen POWG Kontrollgruppe Chi2 (=x2) P-Wert Akt1 G/G 216 206 0,643 0,422 A/G 99 116 1,982 0,159 A/A 19 8 4,670 0,031 G/G 259 254 0,210 0,647 A/G 66 75 0,728 0,393 A/A 9 5 1,167 0,280 G/G 275 265 0,966 0,326 A/G 54 65 1,237 0,266 A/A 5 4 0,113 0,737 G/G 132 150 1,988 0,159 A/G 159 145 1,183 0,277 A/A 43 39 0,222 0,637 Bax Fas FasL 38 Tabelle 5: Frequenzen der Genotypen N (%) mit Allelfrequenzen Gene Patienten POWG (N=334) (n= 334) G/G 216 (64,7%) 206 (61,7%) A/G 99 (29,6%) 116 (34,7%) A/A 19 (5,7%) 8 (2,4%) 0,795 0,790 G/G 259 (77,5%) 254 (76,0%) A/G 66 (19,8%) 75 (22,5%) A/A 9 (2,7%) 5 (1,5%) 0,874 0,873 G/G 275 (82,3%) 265 (79,3%) A/G 54 (16,2%) 65 (19,5%) A/A 5 (1,5%) 4 (1,2%) 0,904 0,864 G/G 132 (39,5%) 150 (44,9%) A/G 159 (47,6%) 145 (43,4%) A/A 43 (12,9%) 39 (11,7%) 0,633 0,666 Allele Frequenzen AKT1 G Allele Frequenz BAX G Allele Frequenzen FAS G Allele Frequenz FAS- L G Allele Frequenz mit Kontrollgruppe 39 Diskussion 5. Diskussion Einführung Das POWG ist die häufigste Ursache für eine irreversible Erblindung weltweit. Der erhöhte IOD, hervorgerufen durch eine Abflussbehinderung im TW, ist dabei die häufigste Ursache für den Untergang der RGZ. (4, 8) Dabei hat sich gezeigt, dass die RGZ nicht durch Nekrose, sondern durch Apoptose zugrunde gehen. Die Aktivierung des programmierten Zelltodes in RGZ ist nach wie vor das Ziel vieler Studien und ist in seinen Einzelheiten noch nicht ganz verstanden. (16) Der Lebensstil scheint kaum Einfluss auf die Entwicklung eines Glaukoms zu haben. (55) Es wurde jedoch in einigen Studien eine Vererbbarkeit und familiäre Häufung festgestellt. (7) Ebenso zeigten einige Populationen eine gehäufte Glaukom Prävalenz. (53) All diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das POWG genetisch zumindest mitbedingt ist. Jedoch konnten bis heute nur eine geringe Anzahl der Glaukomerkrankungen mit einer genetischen Variante in Verbindung gebracht werden. (25, 56) Methoden Insgesamt nahmen 668 Probanden, alters- und geschlechtsgematcht, an dieser Studie teil. Um ein Glaukom ausschließen zu können, wurde die Kontrollgruppe genau inspiziert. Als Einschlusskriterium wurden unter anderem ein normaler IOD und ein unauffälliger Papillenbefund gewählt. Unsere Untersuchungen spiegeln den weltweiten Standard der Glaukomdiagnostik wieder. Glaukome, die in einem sehr frühen Stadium weder IOD Erhöhung noch Gesichtsfeldausfälle zeigen (präperimetrisch), können naturgemäß nicht erfasst werden. 40 Das mittlere Alter der POWG Gruppe betrug 74,1 Jahre (± 8,3 Jahre). Dieses Durchschnittsalter spiegelt den Häufungsgipfel der POWG Erkrankungen wider. Es zeigt auch, dass das Alter einen starken Risikofaktor darstellt. (9, 10, 11) Um exakte Aussagen machen zu können, wurden funktionelle SNPs von Genen gewählt, deren Produkte an der Apoptose beteiligt sind, sowie in Studien mit dem Glaukom in Verbindung gebracht wurden. Das Bax Protein weist eine proapoptotische Funktion auf. Es wurden im Mäusemodell Polymorphismen entdeckt, die das Absterben von RGZ fördern. (28) Akt1 Mutationen wurden als ein Faktor für das Überleben von B-Zellen ermittelt. (36) FAS-R, die an Zellen des TW vorkommen, kann das Absterben dieser Zellen fördern, wenn dieser mutiert ist. (31) Mutationen an FAS-L Regionen konnten im Zusammenhang mit mehreren Tumoren sowie neurodegenerativen Krankheiten festgestellt werden. (37) Ergebnisse Nach Anpassung des Signifikanzniveaus durch eine Bonferroni Korrektur zeigte kein SNPs in den untersuchten Genen eine Assoziation mit dem POWG. Alleine der homozygote Genotyp A/A im SNP rs1130233 im Gen AKT1 zeigte in einer univariaten Analyse eine grenzwertige Signifikanz (p=0,031). Nach bestem Wissen ist dies die erste Studie, die einen Zusammenhang zwischen den funktionellen SNPs der erwähnten Gene und dem POWG untersucht hat. 41 Literaturverzeichnis 6. Literaturverzeichnis 1 Grehn. Augenheilkunde, 31.Auflage, Springer Verlag 2012 2 Kwon YH, Fingert JH, Kuehn MH, Alward WLM. Primary Open-Angle Glaucoma. N Engl J Med. 12. März 2009;360(11):1113–24. 3 Coleman AL, Miglior S. „Risk Factors for Glaucoma Onset and Progression“. Survey of Ophthalmology 53, Nr. 6 .November 2008: 3–10. 4 Heijl A., Traverso C. E., Terminologie und Handlungsrichtlinien für die Glaukome, 3. Auflage, European Glaucoma Society, 2008 5 Healey PR, Mitchell P, Smith W, Wang JJ. Optic disc hemorrhages in a population with and without signs of glaucoma. Ophthalmology. Februar 1998;105(2):216– 23. 6 Jonas JB, Nguyen XN, Gusek GC, Naumann GO. Parapapillary chorioretinal atrophy in normal and glaucoma eyes. I. Morphometric data. Invest Ophthalmol Vis Sci. Mai 1989;30(5):908–18. 7 Wolfs RC, Klaver CC, Ramrattan RS, et al (1998) Genetic risk of primary openangle glaucoma. Population-based familial aggre- gation study. Arch Ophthalmol 116: 1640–1645 8 Quigley HA, Broman AT. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. Br J Ophthalmol. März 2006;90(3):262–7. 9 Czudowska MA, Ramdas WD, Wolfs RCW, Hofman A, De Jong PTVM, Vingerling JR, u. a. Incidence of glaucomatous visual field loss: a ten-year follow-up from the Rotterdam Study. Ophthalmology. September 2010;117(9):1705–12. 10 Le A, Mukesh BN, McCarty CA, Taylor HR. Risk factors associated with the 42 incidence of open-angle glaucoma: the visual impairment project. Invest Ophthalmol Vis Sci. September 2003;44(9):3783–9. 11 Leske MC, Connell AM, Wu SY, Hyman LG, Schachat AP. Risk factors for openangle glaucoma. The Barbados Eye Study. Arch Ophthalmol. Juli 1995;113(7):918–24. 12 Gordon MO, Beiser JA, Brandt JD, Heuer DK, Higginbotham EJ, Johnson CA, u. a. The Ocular Hypertension Treatment Study: baseline factors that predict the onset of primary open-angle glaucoma. Arch Ophthalmol. Juni 2002;120(6):714– 720; discussion 829–830. 13 Miglior S, Zeyen T, Pfeiffer N, Cunha-Vaz J, Torri V, Adamsons I, u. a. Results of the European Glaucoma Prevention Study. Ophthalmology. März 2005;112(3):366–75 14 Mitchell P, Hourihan F, Sandbach J, Wang JJ. The relationship between glaucoma and myopia: the Blue Mountains Eye Study. Ophthalmology. Oktober 1999;106(10):2010–5. 15 Elmore S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicol Pathol. 2007;35(4):495–516. 16 Almasieh M, Wilson AM, Morquette B, Cueva Vargas JL, Di Polo A. The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma. Prog Retin Eye Res. März 2012;31(2):152–81. 17 Mackenzie PJ, Mikelberg FS. Evaluating optic nerve damage: pearls and pitfalls. Open Ophthalmol J. 2009;3:54–8. 18 Spaeth GL, Lopes JF, Junk AK, Grigorian AP, Henderer J. Systems for staging the amount of optic nerve damage in glaucoma: a critical review and new material. Surv Ophthalmol. August 2006;51(4):293–315. 19 Kanngiesser H, Kniestedt C. Tonometry in change. From indentation and applanation to contour adaptation. Ophthalmologe. September 2005;102(9):849– 55. 43 Literaturverzeichnis 20 Quigley HA, Nickells RW, Kerrigan LA, Pease ME, Thibault DJ, Zack DJ. Retinal ganglion cell death in experimental glaucoma and after axotomy occurs by apoptosis. Invest Ophthalmol Vis Sci. April 1995;36(5):774–86. 21 Stone EM, Fingert JH, Alward WL, Nguyen TD, Polansky JR, Sunden SL, u. a. Identification of a gene that causes primary open angle glaucoma. Science. 31. Januar 1997;275(5300):668–70. 22 Mossböck G, Faschinger C, Weger M, Renner W. Die Rolle genetischer Faktoren bei den Glaukomen. Spektrum der Augenheilkunde. September 2008;22(4):227–32. 23 Cheng J-W, Cheng S-W, Ma X-Y, Cai J-P, Li Y, Lu G-C, u. a. Myocilin Polymorphisms and Primary Open-Angle Glaucoma: A Systematic Review and Meta-Analysis. PLoS ONE. 28. September 2012;7(9):e46632. 24 Monemi S, Spaeth G, DaSilva A, Popinchalk S, Ilitchev E, Liebmann J, u. a. Identification of a novel adult-onset primary open-angle glaucoma (POAG) gene on 5q22.1. Hum Mol Genet. 15. März 2005;14(6):725–33. 25 Burdon KP. Genome-wide association studies in the hunt for genes causing primary open-angle glaucoma: a review. Clin Experiment Ophthalmol. Juni 2012;40(4):358–63. 26 Manolio TA. Genomewide Association Studies and Assessment of the Risk of Disease. New England Journal of Medicine. 2010;363(2):166–76. 27 Deckwerth TL, Elliott JL, Knudson CM, Johnson EM Jr, Snider WD, Korsmeyer SJ. BAX is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development. Neuron. September 1996;17(3):401–11. 28 Libby RT, Li Y, Savinova OV, Barter J, Smith RS, Nickells RW, u. a. Susceptibility to Neurodegeneration in a Glaucoma Is Modified by Bax Gene Dosage. PLoS Genet [Internet]. Juli 2005 [zitiert 28. November 2013];1(1). Verfügbar unter: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1183523/ 29 Sharma K, Wang R., Zhang L., Yin D., Luo X., Solomon J., u. a. Death the Fas way: regulation and pathophysiology of CD95 and its ligand. Pharmacology & 44 Therapeutics. Dezember 2000;88(3):333–47. 30 Grüb M, Mielke J. Kammerwasserdynamik: Kammerwasserbildung und Kammerwasserabfluss. Der Ophthalmologe. 1. April 2004;101(4):357–65. 31 Agarwal R, Talati M, Lambert W, Clark AF, Wilson SE, Agarwal N, u. a. Fasactivated apoptosis and apoptosis mediators in human trabecular meshwork cells. Exp Eye Res. Mai 1999;68(5):583–90. 32 Saxena A, Moshynska O, Sankaran K, Viswanathan S, Sheridan DP. Association of a novel single nucleotide polymorphism, G(-248)A, in the 5’-UTR of BAX gene in chronic lymphocytic leukemia with disease progression and treatment resistance. Cancer Lett. 10. Dezember 2002;187(1-2):199–205. 33 Charles I, Khalyfa A, Kumar DM, Krishnamoorthy RR, Roque RS, Cooper N, u. a. Serum deprivation induces apoptotic cell death of transformed rat retinal ganglion cells via mitochondrial signaling pathways. Invest Ophthalmol Vis Sci. April 2005;46(4):1330–8. 34 Hwa Sun Kim CKP. Retinal ganglion cell death is delayed by activation of retinal intrinsic cell survival program. Brain research. 2005;1057(1-2):17–28. 35 Buechler C, Bared SM, Aslanidis C, Ritter M, Drobnik W, Schmitz G. Molecular and Functional Interaction of the ATP-binding Cassette Transporter A1 with Fasassociated Death Domain Protein. J Biol Chem. 11. Januar 2002;277(44):41307– 10. 36 Kanamori A, Nakamura M, Nakanishi Y, Nagai A, Mukuno H, Yamada Y, u. a. Akt is activated via insulin/IGF-1 receptor in rat retina with episcleral vein cauterization. Brain Res. 1. Oktober 2004;1022(1-2):195–204. 37 Sibley K, Rollinson S, Allan JM, Smith AG, Law GR, Roddam PL, u. a. Functional FAS Promoter Polymorphisms Are Associated with Increased Risk of Acute Myeloid Leukemia. Cancer Res. 1. August 2003;63(15):4327–30. 38 Harris SL, Gil G, Robins H, Hu W, Hirshfield K, Bond E, u. a. Detection of functional single-nucleotide polymorphisms that affect apoptosis. Proc Natl Acad 45 Literaturverzeichnis Sci U S A. 8. November 2005;102(45):16297–302. 39 Knox DL, Eagle RC Jr, Green WR. Optic nerve hydropic axonal degeneration and blocked retrograde axoplasmic transport: histopathologic features in human highpressure secondary glaucoma. Arch Ophthalmol. März 2007;125(3):347–53. 40 Quigley H, Anderson DR. The dynamics and location of axonal transport blockade by acute intraocular pressure elevation in primate optic nerve. Invest Ophthalmol. August 1976;15(8):606–16. 41 Wang DY, Ray A, Rodgers K, Ergorul C, Hyman BT, Huang W, u. a. Global Gene Expression Changes in Rat Retinal Ganglion Cells in Experimental Glaucoma. Invest Ophthalmol Vis Sci. August 2010;51(8):4084–95. 42 Kroemer G, Galluzzi L, Brenner C. Mitochondrial membrane permeabilization in cell death. Physiol Rev. Januar 2007;87(1):99–163. 43 Navarro A, Boveris A. The mitochondrial energy transduction system and the aging process. Am J Physiol, Cell Physiol. Februar 2007;292(2):C670–686. 44 Halliwell B. Oxidative stress and neurodegeneration: where are we now? J Neurochem. Juni 2006;97(6):1634–58. 45 Andersen JK. Oxidative stress in neurodegeneration: cause or consequence? Nat Med. Juli 2004;10 Suppl:S18–25. 46 Morgan JE, Datta AV, Erichsen JT, Albon J, Boulton ME. Retinal ganglion cell remodelling in experimental glaucoma. Adv Exp Med Biol. 2006;572:397–402. 47 Liu M, Duggan J, Salt TE, Cordeiro MF. Dendritic changes in visual pathways in glaucoma and other neurodegenerative conditions. Exp Eye Res. April 2011;92(4):244–50. 48 Shou T, Liu J, Wang W, Zhou Y, Zhao K. Differential dendritic shrinkage of alpha and beta retinal ganglion cells in cats with chronic glaucoma. Invest Ophthalmol Vis Sci. Juli 2003;44(7):3005–10. 49 Lukasiewicz PD. Synaptic mechanisms that shape visual signaling at the inner retina. Prog Brain Res. 2005;147:205–18. 46 50 Bertram KM, Bula DV, Pulido JS, Shippy SA, Gautam S, Lu M-J, u. a. Amino-acid levels in subretinal and vitreous fluid of patients with retinal detachment. Eye (Lond). April 2008;22(4):582–9. 51 Cargnello M, Roux PP. Activation and function of the MAPKs and their substrates, the MAPK-activated protein kinases. Microbiol Mol Biol Rev. März 2011;75(1):50–83. 52 Resnikoff S, Pascolini D, Etya’ale D, Kocur I, Pararajasegaram R, Pokharel GP, u. a. Global data on visual impairment in the year 2002. Bull World Health Organ. November 2004;82(11):844–51. 53 Leske MC. Open-Angle Glaucoma—An Epidemiologic Overview. Ophthalmic Epidemiology. Januar 2007;14(4):166–72. 54 Klein BE, Klein R, Ritter LL. Relationship of drinking alcohol and smoking to prevalence of open-angle glaucoma. The Beaver Dam Eye Study. Ophthalmology. November 1993;100(11):1609–13. 55 Klein BEK, Klein R. Lifestyle Exposures and Eye Diseases in Adults. Am J Ophthalmol. Dezember 2007;144(6):961–9. 56 Fingert JH, Héon E, Liebmann JM, Yamamoto T, Craig JE, Rait J, u. a. Analysis of myocilin mutations in 1703 glaucoma patients from five different populations. Hum Mol Genet. Mai 1999;8(5):899–905. 57 Rao KN, Nagireddy S, Chakrabarti S. Complex genetic mechanisms in glaucoma: An overview. Indian J Ophthalmol. Januar 2011;59(Suppl1):S31–S42. 58 Rao KN, Nagireddy S, Chakrabarti S. Complex genetic mechanisms in glaucoma: An overview. Indian J Ophthalmol. Januar 2011;59(Suppl1):S31–S42. 59 Thylefors B, Negrel AD, Pararajasegaram R, Dadzie KY. Global data on blindness. Bull World Health Organ. 1995;73(1):115–21. 60 Ramakrishnan R, Nirmalan PK, Krishnadas R, Thulasiraj RD, Tielsch JM, Katz J, u. a. Glaucoma in a rural population of southern India: the Aravind comprehensive eye survey. Ophthalmology. August 2003;110(8):1484–90. 47 Literaturverzeichnis 61 Dandona L, Dandona R, Srinivas M, Mandal P, John RK, McCarty CA, u. a. Openangle glaucoma in an urban population in southern India: the Andhra Pradesh eye disease study. Ophthalmology. September 2000;107(9):1702–9. 62 Sheffield VC, Stone EM, Alward WL, Drack AV, Johnson AT, Streb LM, u. a. Genetic linkage of familial open angle glaucoma to chromosome 1q21-q31. Nat Genet. Mai 1993;4(1):47–50. 63 Gong G, Kosoko-Lasaki O, Haynatzki GR, Wilson MR. Genetic dissection of myocilin glaucoma. Hum Mol Genet. 1. April 2004;13 Spec No 1:R91–102. 64 Resch ZT, Fautsch MP. Glaucoma-associated myocilin: a better understanding but much more to learn. Exp Eye Res. April 2009;88(4):704–12. 65 Kubota R, Noda S, Wang Y, Minoshima S, Asakawa S, Kudoh J, u. a. A novel myosin-like protein (myocilin) expressed in the connecting cilium of the photoreceptor: molecular cloning, tissue expression, and chromosomal mapping. Genomics. 1. Mai 1997;41(3):360–9. 66 Fautsch MP, Bahler CK, Jewison DJ, Johnson DH. Recombinant TIGR/MYOC increases outflow resistance in the human anterior segment. Invest Ophthalmol Vis Sci. Dezember 2000;41(13):4163–8. 67 Polansky JR, Fauss DJ, Chen P, Chen H, Lütjen-Drecoll E, Johnson D, u. a. Cellular pharmacology and molecular biology of the trabecular meshwork inducible glucocorticoid response gene product. Ophthalmologica. 1997;211(3):126–39. 68 Wentz-Hunter K, Kubota R, Shen X, Yue BYJT. Extracellular myocilin affects activity of human trabecular meshwork cells. J Cell Physiol. Juli 2004;200(1):45– 52. 69 Tamm ER. Myocilin and glaucoma: facts and ideas. Prog Retin Eye Res. Juli 2002;21(4):395–428. 70 Kachaner D, Génin P, Laplantine E, Weil R. Toward an integrative view of Optineurin functions. Cell Cycle. 1. August 2012;11(15):2808–18. 48 71 Maruyama H, Morino H, Ito H, Izumi Y, Kato H, Watanabe Y, u. a. Mutations of optineurin in amyotrophic lateral sclerosis. Nature. 13. Mai 2010;465(7295):223– 6. 72 Chi Z-L, Akahori M, Obazawa M, Minami M, Noda T, Nakaya N, u. a. Overexpression of optineurin E50K disrupts Rab8 interaction and leads to a progressive retinal degeneration in mice. Hum Mol Genet. 1. Juli 2010;19(13):2606–15. 73 Sudhakar C, Nagabhushana A, Jain N, Swarup G. NF-kappaB mediates tumor necrosis factor alpha-induced expression of optineurin, a negative regulator of NFkappaB. PLoS ONE. 2009;4(4):e5114. 74 Kumar A, Basavaraj MG, Gupta SK, Qamar I, Ali AM, Bajaj V, u. a. Role of CYP1B1, MYOC, OPTN and OPTC genes in adult-onset primary open-angle glaucoma: predominance of CYP1B1 mutations in Indian patients. Mol Vis. 30. April 2007;13:667–76. 75 De Marco N, Buono M, Troise F, Diez-Roux G. Optineurin increases cell survival and translocates to the nucleus in a Rab8-dependent manner upon an apoptotic stimulus. J Biol Chem. 9. Juni 2006;281(23):16147–56. 76 Sarfarazi M, Rezaie T. Optineurin in primary open angle glaucoma. Ophthalmol Clin North Am. Dezember 2003;16(4):529–41. 77 Sarah F Janssen TGMFG. The Vast Complexity of Primary Open Angle Glaucoma: Disease Genes, Risks, Molecular Mechanisms and Pathobiology. Progress in retinal and eye research. 2013; 78 Chi Z-L, Yasumoto F, Sergeev Y, Minami M, Obazawa M, Kimura I, u. a. Mutant WDR36 directly affects axon growth of retinal ganglion cells leading to progressive retinal degeneration in mice. Hum Mol Genet. 1. Oktober 2010;19(19):3806–15. 79 Mookherjee S, Chakraborty S, Vishal M, Banerjee D, Sen A, Ray K. WDR36 variants in East Indian primary open-angle glaucoma patients. Mol Vis. 8. Oktober 2011;17:2618–27. 49 Literaturverzeichnis 80 Hauser MA, Allingham RR, Linkroum K, Wang J, LaRocque-Abramson K, Figueiredo D, u. a. Distribution of WDR36 DNA sequence variants in patients with primary open-angle glaucoma. Invest Ophthalmol Vis Sci. Juni 2006;47(6):2542–6. 81 Yang J, Patil RV, Yu H, Gordon M, Wax MB. T cell subsets and sIL-2R/IL-2 levels in patients with glaucoma. Am J Ophthalmol. April 2001;131(4):421–6. 82 Mao M, Biery MC, Kobayashi SV, Ward T, Schimmack G, Burchard J, u. a. T lymphocyte activation gene identification by coregulated expression on DNA microarrays. Genomics. Juni 2004;83(6):989–99. 83 Melki R, Colomb E, Lefort N, Brezin A, Garchon H. CYP1B1 mutations in French patients with early-onset primary open-angle glaucoma. J Med Genet. September 2004;41(9):647–51. 84 López-Garrido M-P, Blanco-Marchite C, Sánchez-Sánchez F, López-Sánchez E, Chaqués-Alepuz V, Campos-Mollo E, u. a. Functional analysis of CYP1B1 mutations and association of heterozygous hypomorphic alleles with primary openangle glaucoma. Clin Genet. Januar 2010;77(1):70–8. 85 Acharya M, Mukhopadhyay A, Bhattacharjee A, Thakur SKD, Bandyopadhyay AK, Ray K. Complex genetics of glaucoma: defects in CYP1B1, and not MYOC, cause pathogenesis in an early-onset POAG patient with double variants at both loci. J Genet. Dezember 2008;87(3):265–9. 86 Su C-C, Liu Y-F, Li S-Y, Yang J-J, Yen Y-C. Mutations in the CYP1B1 gene may contribute to juvenile-onset open-angle glaucoma. Eye (Lond). Oktober 2012;26(10):1369–77. 87 Pasutto F, Keller KE, Weisschuh N, Sticht H, Samples JR, Yang Y-F, u. a. Variants in ASB10 are associated with open-angle glaucoma. Hum Mol Genet. 15. März 2012;21(6):1336–49. 89 Fingert JH, Roos BR, Solivan-Timpe F, Miller KA, Oetting TA, Wang K, u. a. Analysis of ASB10 variants in open angle glaucoma. Hum Mol Genet. 15. Oktober 2012;21(20):4543–8. 50 90 Den Dunnen JT, Antonarakis SE. Nomenclature for the description of human sequence variations. Hum Genet. Juli 2001;109(1):121–4. 91 Lander ES, Linton LM, Birren B, Nusbaum C, Zody MC, Baldwin J, u. a. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 15. Februar 2001;409(6822):860–921. 92 Tabor HK, Risch NJ, Myers RM. Candidate-gene approaches for studying complex genetic traits: practical considerations. Nat Rev Genet. Mai 2002;3(5):391–7. 93 Liu T, Xie L, Ye J, Liu Y, He X. Screening of candidate genes for primary open angle glaucoma. Mol Vis. 26. Juli 2012;18:2119–26. 94 Weiß C. Basiswissen Medizinische Statistik. Springer; 2008. 95 Lander E, Kruglyak L. Genetic dissection of complex traits: guidelines for interpreting and reporting linkage results. Nat Genet. November 1995;11(3):241– 7. 96 Gemenetzi M, Yang Y, Lotery AJ. Current concepts on primary open-angle glaucoma genetics: a contribution to disease pathophysiology and future treatment. Eye (Lond). März 2012;26(3):355–69. 97 Wolfs RC, Klaver CC, Ramrattan RS, van Duijn CM, Hofman A, de Jong PT. Genetic risk of primary open-angle glaucoma. Population-based familial aggregation study. Arch Ophthalmol. Dezember 1998;116(12):1640–5. 98 Wittwer CT, Herrmann MG, Gundry CN, Elenitoba-Johnson KS. Real-time multiplex PCR assays. Methods. Dezember 2001;25(4):430–42. 99 Starczynski J, Pepper C, Pratt G, Hooper L, Thomas A, Milligan D, Bentley P, Fegan C. Common polymorphism G(-248)A in the promoter region of the bax gene results in significantly shorter survival in patients with chronic lymphocytic Leukemia once treatment is initiated. J Clin Oncol. 2005 Mar 1;23(7):1514-21 100 Krippl P, Langsenlehner U, Renner W, Köppel H, Samonigg H. Re: Polymorphisms of death pathway genes FAS and FASL in esophageal squamous-cell carcinoma. J Natl Cancer Inst. 6. Oktober 2004;96(19):1478–1479; author reply 1479. 51 Literaturverzeichnis 101 Wu J, Metz C, Xu X, Abe R, Gibson AW, Edberg JC, u. a. A novel polymorphic CAAT/enhancer-binding protein beta element in the FasL gene promoter alters Fas ligand expression: a candidate background gene in African American systemic lupus erythematosus patients. J Immunol. 1. Januar 2003;170(1):132–8. 102 Bland JM, Altman DG. Multiple significance tests: the Bonferroni method. BMJ. 21. Januar 1995;310(6973):170. 52
