Dokument_37.

Transfer und Freisetzung von Episomen für die somatische
Gentherapie durch einen Herpesvirus/Adenovirus Hybridvektor
Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades
vorgelegt von
Frank Wucherpfennig
aus Bad Neuenahr-Ahrweiler
Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der FriedrichAlexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung:
12.01.2007
Vorsitzender der Promotionskommission:
Prof. Dr. E. Bänsch
Erstberichterstatter:
Prof. Dr. A. Burkovski
Zweitberichterstatter:
Prof. Dr. B. Fleckenstein
Für meine Familie
Inhaltsverzeichnis
I. Zusammenfassung................................................................................................................1
1. Summary.......................................................................................................................1
2. Zusammenfassung........................................................................................................2
II. Einleitung..............................................................................................................................3
1. Somatische Gentherapie...............................................................................................3
2. Virale Vektoren..............................................................................................................3
2.1. Integrierende Vektoren ...........................................................................................3
2.2. Nicht-integrierende Vektoren..................................................................................4
3. Gesteuerte Expression therapeutischer Gene ..............................................................8
III. Ziel der Arbeit ....................................................................................................................11
IV. Ergebnisse ........................................................................................................................12
1. Herstellung rekombinanter Herpesvirus saimiri / Adenovirus-Konstrukte ...................12
2. Funktionsanalyse des partiell invertierten CMVie-Promotors .....................................16
3. Verifizierung der klonierten Konstrukte .......................................................................17
4. Funktionsanalysen rekombinanter pAD-HVS Konstrukte ...........................................18
4.1. Expression der Transgene orf73/LANA und switch..............................................18
4.2. Homologe Rekombination an FRT-Sequenzen....................................................19
4.3. Induzierbare Expression additiver Transgene ......................................................20
4.4. Zeitverlauf der Luziferaseexpression von pAD-HVS1 ..........................................21
5. Die spezifische Verpackungszelllinie 293Cre-tTS.......................................................22
5.1. Expressions- und Funktionsanalyse des stabil transfizierten Transsilencers.......22
5.2. Ansprechverhalten auf zellulär exprimierten Transsilencer..................................23
5.3. Transgenexpression der Verpackungszelllinie 293Cre-tTS SP4..........................24
6. Herstellung und Aufreinigung rekombinanter AD-HVS-Partikel ..................................25
7. Analyse viraler Nukleinsäuren.....................................................................................25
8. Funktionsanalyse viraler Partikel ................................................................................27
8.1. Infektion und homologe Rekombination an FRT-Sequenzen...............................27
8.2. Expression der Transgene orf73/LANA und switch nach Infektion ......................28
8.3. Induzierbare Expression additiver Transgene nach Infektion...............................29
V. Diskussion..........................................................................................................................31
VI. Material und Methoden .....................................................................................................39
1. Chemikalien ................................................................................................................39
2. Puffer und Lösungen...................................................................................................40
3. Größenmarker für die Gelelektrophorese ...................................................................41
4. Eukaryote Zellen und Zelllinien ...................................................................................41
4.1. Zellkulturverfahren................................................................................................42
4.2. Medien und Reagenzien für die Kultur eukaryoter Zellen ....................................42
4.3. Weitere Lösungen für die Zellkultur......................................................................43
5. Bakterien .....................................................................................................................43
5.1. Bakterielle Verfahren ............................................................................................43
6. Viren............................................................................................................................44
6.1. Virale Verfahren....................................................................................................45
7. Nukleinsäure-Methoden ..............................................................................................46
7.1. Standardmethoden ...............................................................................................46
7.2. Polymerasekettenreaktion (PCR) .........................................................................47
7.3. Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR)................................................................47
7.4. Quantitative Real-Time PCR (TaqMan)................................................................47
8. Vektorsysteme und Ausgangsplasmide ......................................................................48
9. Enzyme .......................................................................................................................49
10. Oligonukleotide .........................................................................................................49
11. Proteinmethoden und immunologische Verfahren ....................................................50
11.1. Immunblot...........................................................................................................50
11.2. Immunadsorptionstest (ELISA)...........................................................................51
12. Antikörper..................................................................................................................51
12.1 Monoklonale Antikörper.......................................................................................51
12.2 Polyklonale Antikörper.........................................................................................52
13. Software ....................................................................................................................52
VII. Abkürzungen....................................................................................................................53
VIII. Literatur...........................................................................................................................55
IX. Anhang..............................................................................................................................61
Zusammenfassung
I. Zusammenfassung
1. Summary
The currently available viral vectors do not meet all the requirements for a successful gene
therapy. Specific properties of different virus types are therefore combined within a novel
hybrid vector system. In this approach, two recognition sites for the Flp-recombinase (FRT)
separated by a polylinker-region were inserted into a gutless adenoviral vector. The flp
recombinase gene controlled by seven tet operator sequences (tetO) and a CMVenhancer/SV40 minimal promoter hybrid was then cloned into the same molecule.
Furthermore, defined sequences of Herpesvirus saimiri, which shall ensure replication and
episomal persistence as well as a reporter-gene and cytokine genes relevant for the therapy
e.g. of Rheumatoid Arthritis (RA), were inserted between the FRT-sites, creating a hybrid
vector composed of Herpesvirus saimiri and Adenovirus Type 5 (Ad5) in this final step.
A specific packaging cell line based on HEK293Cre was established to avoid the premature
excision and circularization of the replicon during the packaging of adenoviral particles. The
gene of the transsilencer-protein TetR(sB)-KRAB was stably introduced into 293Cre cells by
selective pressure of Hygromycin B, for the purpose of repressing the Flp-Recombinase
expression during vector production. Absence of TetR(sB)-KRAB or derepression by adding
tetracycline allows for Flp-expression. Homologous recombination at the FRT-sites takes
place and results in excision and circularisation of the sequences located inbetween. By this
means, the HVS-sequences and adjacent genes are released as an episome. This could be
shown by luciferase reporter gene assay which is dependent on circularisation after transient
transfection of HEK293Cre as well as infection of HFF-, A549-, HeLa and Vero-cells.
Improved versions of the system have been extended by the GeneSwitchTM-System that
allows conditional expression of IL-10 or IL1-RA, induced by addition of Mifepristone, in
experimental target cells such as HFF-, A549- and Vero-cells.
This particular system employs a single construct for transfer and deliberate release of our
Rhadinovirus-based episome as well as inducible expression of therapeutical genes within a
target cell population.
1
Zusammenfassung
2. Zusammenfassung
Derzeit verfügbare virale Vektoren sind nicht in der Lage, sämtliche Anforderungen einer
gentherapeutischen Anwendung zu erfüllen. Daher werden zunehmend individuelle
Eigenschaften verschiedener Viren in Hybridvektorsystemen vereint. In der vorliegenden
Arbeit wurden zunächst zwei durch eine Mehrfachklonierungsstelle (multiple cloning site,
mcs) getrennte Erkennungssequenzen der Flp-Rekombinase (Flp Recognition Target, FRT)
aus Saccharomyces cerevisiae in einen „gutless“ Adenovirus-Vektor eingebracht. In einem
zweiten Schritt wurde das Gen der Flp-Rekombinase unter Kontrolle des Tet-ON-Systems
(CMVenhancer, 7xTet-Operator-Sequenz, SV40 Minimal-Promotor) in dasselbe Molekül
kloniert. Weiterhin wurden definierte Genabschnitte von Herpesvirus saimiri, die eine
tragende Rolle bei der Replikation und der Ausbildung der episomalen Persistenz des Virus
spielen, sowie ein Reportergen und therapeutisch wirksame Gene zwischen die FRTErkennungssequenzen kloniert. Auf diese Weise wurden Hybridvektoren aus Herpesvirus
saimiri und dem humanen Adenovirus Typ 5 (Ad5) geschaffen. Zur Prävention der
vorzeitigen Exzision des Replikons während der Verpackungsphase der adenoviralen
Partikel wurde auf Basis von 293Cre Zellen eine spezialisierte Verpackungszelllinie etabliert.
Dazu wurde unter Selektionsdruck von Hygromycin B das Gen des Transsilencer-Proteins
TetR(sB)-KRAB stabil transfiziert, wodurch die Expression der Flp-Rekombinase in diesen
Zellen reprimiert ist. Bei Expression der Flp Rekombinase durch Derepression mit
Tetrazyklin (Tc) oder in Zellen ohne TetR(sB)-KRAB erfolgt die homologe Rekombination an
deren spezifischen Erkennungssequenzen, was zur Exzision und Zirkularisierung der
zwischen ihnen liegenden Nukleinsäureabschnitten führt. Auf diese Weise wurden die HVSSequenzen in episomaler Form freigesetzt. Dies konnte durch Reportergenanalyse nach
transienter Transfektion in 293Cre-Zellen gezeigt werden. Weiterentwickelte Versionen des
Systems wurden mit dem GeneSwitchTM-System ausgestattet. Hier steht der molekulare
Schalter (Switch) unter Kontrolle des HVS ORF14-Promotors bzw. des Promotors des
Elongationsfaktors 1 alpha (EF1a); durch Induktion mit Mifepriston (RU486) erfolgte vom
konditionalen Promotor die Expression von humanem Interleukin-10 (hIL-10) oder
Interleukin-1 Rezeptor Antagonist (IL-1RA) nach experimenteller Infektion von Zellen
menschlicher Herkunft und anderer Primaten (HFF, A549, Vero).
Mit diesem auf nur einem Plasmid basierenden System ist es gelungen, sowohl den Transfer
und die Freisetzung eines rhadinoviralen Episoms als auch die gezielte Expression
therapeutischer Gene zu realisieren.
2
Einleitung
II. Einleitung
1. Somatische Gentherapie
Unter dem Begriff somatische Gentherapie versteht man das Einbringen von Nukleinsäuren
in somatische Zellen sowie bestimmte Gewebe, um dort durch die Expression therapeutisch
wirksamer Proteine genetisch bedingte Defekte zu kompensieren bzw. bestehende
Symptomatiken zu mildern. Seit den frühen Ansätzen, die sich auf definierte monogene
Defekte bezogen, wurde das Spektrum der möglichen Anwendungen bis heute auf
multifaktoriell
ausgelöste
Erbkrankheiten
sowie
durch
herkömmliche
Therapie
nur
unzureichend behandelbare Gebrechen ausgedehnt. Es besteht eine strikte Abgrenzung zur
sog. Keimbahntherapie. Hier sind Gameten Ziel der Manipulation, wodurch systematisch
herbeigeführte, jedoch auch unbeabsichtigt entstandene Veränderungen der genetischen
Information an die Nachkommen vererbt werden können. Prinzipiell kann man bei der
Gentherapie zwischen zwei Verfahren unterscheiden. Bei der ex vivo Anwendung werden
dem Körper entnommene Zellen nach genetischer Modifikation reinfundiert. Die additive
genetische Information kann hierbei durch verschiedene Methoden z. B. durch Liposomen,
DNA-Ligandenkomplexe oder Partikelbeschuss in die Zellen eingebracht werden. Auch virale
Vektoren kommen bei der ex vivo Anwendung zum Einsatz. Ziel der in vivo Methode ist es,
die additive genetische Information in Form einer Nukleinsäure innerhalb des Körpers in
bestimmte Zellen einzuschleusen. Für dieses Verfahren werden mangels Alternativen und
trotz erheblicher Sicherheitsbedenken virale Vektoren eingesetzt. Zur Reduktion der Risiken
und unerwünschter Nebenwirkungen werden virale Vektoren auf Basis profunder
Grundlagenforschung laufend modifiziert und weiterentwickelt. Dabei steht häufig die
Eliminierung der für eine Transduktion nicht essenziellen Sequenzen im Vordergrund.
2. Virale Vektoren
Viele Erkrankungen erfordern eine nachhaltige und ggf. gesteuerte Expression der
eingesetzten therapeutischen Gene. Dazu sollte die eingebrachte Nukleinsäure nach
Möglichkeit lange innerhalb der Zielzellpopulation verbleiben, was in der Praxis durch zwei
unterschiedliche Gruppen von Vektoren erreicht wird. Diese basieren auf Viren, die sich
hinsichtlich ihres Vermehrungszyklus deutlich voneinander abgrenzen.
2.1. Integrierende Vektoren
Die erste Gruppe umfasst Viren, die das eigene Genom in das der Zelle integrieren. Die
Mehrheit dieser zu gentherapeutischen Zwecken herangezogen Vektoren entstammen dem
Genus Dependovirus der Familie der Parvoviridae sowie den Genera Gammaretrovirus,
3
Einleitung
Lentivirus und Spumavirus der Retroviridae. Der Prozess der Integration basiert bei Viren der
verschiedenen Familien auf sehr unterschiedlichen Prinzipien. Bei Adenoassoziierten Viren
(AAV) als Vertreter der Parvoviridae erfolgt die Integration in der Regel sequenzspezifisch
über eine nichthomologe Rekombination. Die Initiation erfolgt dabei durch simultane Bindung
der Proteine Rep78 und Rep68 an eine definierte Sequenz in den endständigen
Wiederholungen des Virus sowie eines bestimmten Motivs innerhalb des humanen
Chromosom 19 (McCarty et al., 2004; Weitzman et al., 1994).
Im Gegensatz dazu erfolgt nach dem Eindringen in die Zelle und dem Umschreiben des
einzelsträngigen RNA-Genoms (single stranded RNA, ssRNA) in dsDNA durch die virale
Reverse
Transkriptase
die
Integration
retroviraler
Sequenzen
in
das
Chromatin
sequenzunspezifisch. Eine Besonderheit der Lentiviren gegenüber anderen Retroviridae ist
die Möglichkeit, die Nukleinsäure über einen aktiven, u. a. durch das Matrixprotein p17
vermittelten Prozess in den Zellkern einzuschleusen. Daher können diese auch ruhende
Zellen transduzieren (Lever et al., 2004). Im Bezug auf gentherapeutische Anwendungen
wurde die Integration und die damit verbundene Nachhaltigkeit der Transduktion einer
Zielzellpopulation zunächst uneingeschränkt positiv bewertet. Später wurde jedoch
festgestellt, dass ein in dieser Form vorliegendes Provirus Einfluss auf die Struktur des
zellulären Genoms nimmt. Es ist vorstellbar, dass Gene am Ort der Integration unterbrochen
werden (Coffin, 1992; Lower, 1999). Auch die Aktivierung von Genen, die nach Integration
beispielsweise unter Kontrolle des retroviralen 3´-LTR-Promotors gelangen, ist ein bekanntes
Phänomen (Coffin, 1992; Raineri und Senn, 1992).
2.2. Nicht-integrierende Vektoren
Die zweite Gruppe beinhaltet Vektoren, deren Genom extrachromosomal in der Wirtszelle
vorliegt. Adenoviren wurden bereits in den fünfziger Jahren als Vakzine gegen
respiratorische Syndrome eingesetzt (Hilleman et al., 1956; Tint und Stone, 1961) und
werden seit geraumer Zeit als Vektoren zur somatischen Gentherapie herangezogen. Daher
ist ihre Biologie wie auch die Mechanismen der durch sie verursachten Immunreaktionen
bestens bekannt. Adenoviren infizieren ruhende als auch in Teilung befindliche
Zellpopulationen unterschiedlicher Herkunft und Differenzierungsstadien mit z. T. großer
Effizienz und schleusen dabei ihr Genom in den Zellkern ein. Die Integration viraler DNA in
das Genom der Wirtszelle findet in der Regel nicht statt, wobei jedoch Ausnahmen
beschrieben wurden (Doerfler, 1970; Harui et al., 1999; Hillgenberg et al., 2001). Darüber
hinaus zeichnen sich Adenoviren durch die Möglichkeit zur Herstellung hochtitriger
Virusstocks (Mitani et al., 1995) sowie durch eine verhältnismäßig große Kapazität zur
Klonierung von Transgenen aus (Parks et al., 1996; Volpers und Kochanek, 2004). Speziell
in den Jahren 1999 - 2004 wurde der Großteil klinischer Studien unter Anwendung
4
Einleitung
adenoviraler Vektoren (AdV) vorgenommen (Abb. 1). Die schrittweise Deletion kodierender
viraler Bereiche führte über die erste (∆ E1, ~ 8 kb Kapazität) und zweite (∆ E1/E3 und
∆ E2/E4, ~ 14 kb Kapazität) Generation adenoviraler Vektoren zu den „high-capacity“ oder
„gutless“ adenoviralen Vektoren der dritten Generation. Durch Entfernung sämtlicher
kodierender Sequenzen wurde die Kapazität zur Aufnahme von Transgenen auf bis zu 36 kb
erweitert. Die verbleibenden adenoviralen Abschnitte umfassen lediglich die repetitiven
Sequenzen
der
5´-
und
3´-Enden
(inverted
terminal
repeats,
ITR)
sowie
das
Verpackungssignal (Ψ). Die Abwesenheit vektorkodierter Adenovirusproteine führte aufgrund
deutlich
reduzierter
Immunogenität
zu
einer
gesteigerten
Nachhaltigkeit
der
Transgenexpression (Yang et al., 1994b; Yang et al., 1994a). In Verbindung mit sog. StufferDNA kann die Größe rekombinanter Nukleinsäuren sehr variabel auf eine zur Verpackung in
Kapside ideale Größe von 28-38 kb gebracht werden. Stuffer-Sequenzen humaner Introns
wie z. B. der Hypoxantin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase (HPRT) verursachen im
Vergleich zu den ursprünglich verwendeten Sequenzen aus Hefe, Bakterien oder Phagen
verhältnismäßig geringe Immunreaktionen (Parks et al., 1999). Die Dritte-Generation
Adenovirus
Vektoren
erfüllt
weite
Teile
der
Anforderungen
an
einen
idealen
Gentherapievektor, jedoch ist ein Helfervirus erforderlich, das die zur Replikation und
Verpackung notwendigen viralen Genprodukte in trans zur Verfügung stellt. Dies bedingt bis
heute den wesentlichen Nachteil einer komplexeren Herstellung und Vektorreinigung. Trotz
des Einsatzes von Helferviren (2. Generation AdV), deren Verpackungssignal von
spezifischen Erkennungssequenzen der Cre-Rekombinase (loxP) flankiert ist und somit
innerhalb einer Cre-exprimierenden Verpackungszelllinie deletiert wird, ist es bisher nicht
gelungen, eine völlig stringente Trennung von rekombinantem und Helfervirus zu realisieren
(Sandig et al., 2000; Steinwaerder et al., 1999).
Abb. 1, Vektoren in klinischen Studien bis
2004. Dargestellt ist die Anzahl dokumentierter
klinischer
Studien
unter
Anwendung
verschiedener Vektoren (Phase I 62,4 %; Phase
I/II 20,4 %, Phase II 14,1 %, Phase II/III 1,0 %,
Phase III 2,1 %). Anteilig in dunkelgrau sind die
klinischen Studien bis 1999 dargestellt. Hellgrau
gibt den Anteil am Gesamt der Studien zwischen
1999 und 2004 wieder. Im Vergleich zu anderen
viralen
Vektoren
[Adenoassoziierte
Viren,
Poxvirus, Vacciniavirus, Herpes Simplex Virus
HSV)], die in einer Gruppe zusammengefasst
wurden, sind adeno- und retrovirale Vektoren
deutlich überrepräsentiert. Besonders in den
Jahren nach 1999 wurden viele Studien unter
Anwendung adenoviraler Vektoren vorgenommen.
Alternative Systeme zum Gentransfer (andere)
wurden bei rund ¼ aller Studien eingesetzt
(modifiziert nach Wiley.co.uk).
5
Einleitung
Obwohl Herpesviren hinsichtlich ihres Einsatzes in klinischen Studien eine untergeordnete
Rolle spielen (in Abb.1, in der Gruppe „andere virale“ sind HSV-Vektoren mit n = 30
enthalten), bieten sie als nicht-integrierende Viren spezifische, für gentherapeutische
Ansätze vorteilhafte Eigenschaften. Die meisten Herpesviridae von Säugetieren verfügen
über hocheffiziente Mechanismen zur Etablierung einer lebenslangen latenten Infektion,
wobei die virale Nukleinsäure episomal vorliegt. Dabei verfolgen Herpes Simplex Virus als
auch das Varicella Zoster Virus die Strategie, im Anschluss an die Primärinfektion und
lytische Replikation in epithelialen Schleimhautzellen als nicht-replizierendes Genom in nicht
teilungsfähigen Zellen wie den Neuronen des peripheren Nervensystems bzw. den
sensorischen Ganglien des Rückenmarks zeitlebens zu persistieren. Das γ1-Herpesvirus
Epstein Barr Virus breitet sich im Anschluss an die Primärinfektion auf B-Zellen aus. In Folge
einer massiven Immunantwort wird ein Großteil der initial infizierten B-Zellen eliminiert. Die
verbleibenden Zellen bilden ein Reservoir nicht proliferierender Gedächtnis B-Zellen, in
denen das latente Virus episomal vorliegt. Das Protein EBNA-1 (Epstein Barr nuklear antigen
1) ist für die Aufrechterhaltung der latenten Infektion unabdingbar. Oligomere von EBNA-1
ermöglichen bei gleichzeitiger Bindung des DNA-Elements zweiheitlicher Symmetrie (dyad
symmetry, DS) sowie repetitiver FR-Sequenzen (family of repeats) in der oriP-Region des
Virus eine Dehnung der DNA, an der die Replikation ansetzen kann (Chittenden et al., 1989;
Reisman et al., 1985; Yates und Guan, 1991). Für die Segregation der episomalen
Virusgenome scheint die Rekrutierung des zellulären Proteins EBP2 durch EBNA-1 von
entscheidender Bedeutung zu sein (Wu et al., 2002). Ähnliche Funktionen sind auch für das
LANA- (latency associated nuclear antigen) Protein des Kaposi Sarkom assoziierten
Herpesvirus (KSHV, HHV8) beschrieben. (Ballestas et al., 1999; Ballestas und Kaye, 2001;
Cotter und Robertson, 1999; Garber et al., 2001). Für das analoge Protein des Herpesvirus
saimiri (HVS), ORF73/LANA, wurde die simultane Kolokalisation sowohl mit viralen
Genomen als auch mitotischen Chromosomen nachgewiesen (Calderwood et al., 2004b;
Verma und Robertson, 2003). Außerdem sicherte es in vitro den Erhalt von Plasmiden, die
Wiederholungen der H-DNA von HVS enthielten (Collins et al., 2002; Collins und Johnson,
2003; Verma und Robertson, 2003). Diese Erkenntnisse legen nahe, dass der H-DNA eine
essentielle Bedeutung für die Latenz zuzuschreiben ist und das ORF73/LANA als Mediator
zur Ausbildung der Persistenz in Frage kommt.
Herpesvirus saimiri verfügt über weitere Eigenschaften, die es prinzipiell als viralen Vektor
qualifizieren, wie die extrachromosomale Persistenz in hoher Kopienzahl (Grassmann und
Fleckenstein, 1989; Simmer et al., 1991; Werner et al., 1977), die verhältnismäßig große
Kapazität zur Aufnahme von Fremdgenen (Stevenson et al., 1999) oder die Möglichkeit
ruhende primäre menschliche Zellen zu infizieren (Frolova-Jones et al., 2000; Stevenson et
6
Einleitung
al., 2000b; Stevenson et al., 2000a). Bisher gibt es keinerlei Hinweise auf die Assoziation
einer HVS-Infektion mit Erkrankungen im Menschen (Ablashi et al., 1988).
Herpesvirus saimiri wurde der Gattung Rhadinovirus (γ2-Herpesvirus) der Unterfamilie
Gammaherpesvirinae
der
Herpesviridae
zugeordnet.
Es
zeigt
signifikante
Sequenzhomologie zu dem einzigen humanpathogenen Vertreter dieses Genus, dem Kaposi
Sarkom assoziierten Herpesvirus (Chang et al., 1994; Moore et al., 1996). Das bis zu 155 kb
umfassende Genom der γ2-Herpesviren besteht aus einem zentralen, kodierenden,
AT-reiche Bereich geringer Dichte (low density DNA, L-DNA), der von nichtkodierenden,
repetitiven Sequenzen großer Dichte und hohem GC-Gehalt (high density DNA, H-DNA)
flankiert wird (Bankier et al., 1985; Bornkamm et al., 1976). Die lineare, doppelsträngige
Desoxyribonukleinsäure
(dsDNA)
bildet
zusammen
mit
einer
daran
assoziierten
Proteinmatrix den Kern (core) des ca. 100 - 110 nm durchmessenden Kapsids. Neben dem
Tegument wird das Virus nach außen von einer Lipid-Doppelmembran begrenzt, welche
verschiedene virale Oberflächenproteine trägt. Herpesvirus saimiri etabliert in seinem
natürlichen Wirt, dem Totenkopfäffchen (Saimiri sciureus), eine lebenslange, apathogene
Persistenz (Melendez et al., 1968). Bei anderen, experimentell infizierten Neuweltprimaten,
wie dem Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus), Tamarin-Affen (Saguinus spp.) oder
Eulenaffen (Aotus trivirgatus) induziert das Virus rasch progrediente T-Zell Lymphome und
lymphatische Leukämien, die in der Regel letal verlaufen (Fleckenstein und Desrosiers,
1982). Basierend auf Sequenzvariabilitäten, die vor allem im linken Teil der kodierenden
L-DNA lokalisiert sind, wurde eine weitere Gliederung von Herpesvirus saimiri in die
Subgruppen A, B und C vorgenommen (Medveczky et al., 1989; Medveczky et al., 1984), die
in Korrelation zu dem transformierenden Potenzial steht (Desrosiers et al., 1986; Duboise et
al., 1998). Die Eigenschaft, humane T-Zellen in vitro zu stabilem Wachstum zu
transformieren, konnte bisher nur für Viren der Subgruppe C nachgewiesen werden
(Biesinger et al., 1992). Unabdingbar für die Transformation, aber entbehrlich für die
Replikation, sind dabei die Produkte zweier linksterminal gelegener Gene, stpC (Saimiri
transformationsassoziiertes Protein der Subgruppe C) und tip (Tyrosinkinase interagierendes
Protein) (Albrecht et al., 2004; Duboise et al., 1998; Fickenscher et al., 1996). Das Genom
von HVS liegt in transformierten menschlichen T-Zellen, die einen unveränderten Karyotyp
zeigen, in episomaler Form vor. Die Integration in zelluläre Chromosomen wurde bisher nicht
beobachtet (Troidl et al., 1994).
Neben den Vorteilen, die ein auf HVS basierender viraler Vektor bieten kann, gibt es aber
auch gewisse Einschränkungen hinsichtlich einer gentherapeutischen Anwendung. Die
komplexe Struktur herpesviraler Genome mit einer Vielzahl offener Leserahmen (open
reading frame, ORF) und korrespondierenden Proteinen, deren Funktion im Einzelnen als
auch in Kombination miteinander noch nicht völlig geklärt ist, verkompliziert die gezielte
7
Einleitung
Modifikation in Richtung eines sicheren und effizienten viralen Vektors. Ein für Herpesvirus
saimiri spezifisches Problem ist der Mangel einer effizienten Verpackungszelllinie. Bis dato
stehen als permanentes und effektives permissives System nur die Nierenepithelzellen (Owl
Monkey Kidney, OMK) des Eulenaffen zur Verfügung. Vero-Zellen sind nur minder permissiv
und erlauben nicht die Herstellung hochtitriger Virusstocks, was die Produktion von HVSVektoren in größerem Maßstab stark limitiert. Um derartige Einschränkungen zu umgehen
und damit den Bereich klinischer Anwendungen eines herpesviralen Gentransfers zu
erweitern, verlegten sich einige Arbeitsgruppen darauf, die in der Gentherapie erwünschten
Eigenschaften
verschiedener
Virustypen
in
sog.
Hybridvektoren
oder
chimären
Vektorsystemen zu kombinieren. Mit einer Verbindung aus einem E1-deletierten Adenovirus
und einem auf dem Epstein Barr Virus basierenden Episom konnte in vitro die stabile
Transformation von D17-Zellen (Canis familiaris) über einen Zeitraum von 14 Wochen
erreicht werden. Die Zellen wurden mit einem adenoviralen Vektor infiziert, der das EBVEpisom zwischen zwei parallel angeordneten loxP-Sequenzen trägt. Die Freisetzung des
Episoms innerhalb des Zellkerns wurde durch Infektion derselben Zellkultur mit einem
zweiten, die Cre-Rekombinase exprimierenden adenoviralen Vektor induziert. (Tan et al.,
1999). In einem ähnlichen System wurden Herpes Simplex Typ1 und Epstein Barr Virus
kombiniert. Nach einer sehr effizienten Infektion von Zellen diverser Herkunft (Haut, Lunge,
Leber, Niere, Nerven) mit rekombinanten Herpes Simplex
Partikeln wurde eine
Transgenexpression von durchschnittlich zwei Wochen nachgewiesen (Wang und Vos,
1996).
Nach mehr als 30 Jahren gentherapeutischer Anwendungen scheint sich die Erkenntnis zu
manifestieren, dass ein viraler Vektor mit idealen Eigenschaften vielleicht durch Kombination
geeigneter Charakteristika verschiedener Viren erreicht werden kann.
3. Gesteuerte Expression therapeutischer Gene
Insbesondere in Anbetracht des angestrebten nachhaltigen Verbleibs der eingebrachten
Erbinformation in der Zielzellpopulation ist eine von außen steuerbare Expression des
Transgens
hochrelevant.
Diese
wird
durch
den
Einsatz
regulierbarer
eukaryoter
Expressionssysteme realisiert. Derartige Systeme basieren meist auf Proteinen, die unter
An- bzw. Abwesenheit eines niedermolekularen Moleküls die Eigenschaft haben,
Nukleinsäuren zu binden und in diesem Fall als Transaktivator bzw. Transsilencer auf die
Expression wirken. Namentlich erwähnt seien hier das an eukaryoten Zellen angepasste
Quorum-sensing-System aus Agrobacterium tumefaciens (Neddermann et al., 2003) und
steroidbasierte Systeme wie das Östrogen- und das Ecdyson-System. Der Transaktivator
des
1994
etablierten
GeneSwitchTM-Systems
8
umfasst
eine
C-terminal
verkürzte
Einleitung
Ligandenbindedomäne des humanen Progesteronrezeptors (hPR-LBD), die zwischen die
GAL4 DNA bindende Domäne (GAL4DBD) aus Saccharomyces cerevisiae und die
Transaktivierungsdomäne p65 des starken humanen Transkriptionsfaktors NF-κB eingefügt
wurde. Die selektive Induktion erfolgt durch das Antiprogestin Mifepriston (RU486), nicht
aber durch natürliches Progestin oder andere Steroide in physiologischen Konzentrationen.
Im Ruhezustand liegt aufgrund der Basalaktivität des vorangestellten Promotors der
Thymidinkinase (PTK) aus Herpes Simplex eine geringe Menge des Transaktivatorproteins in
monomerer Form im System vor. Die Zugabe von Mifepriston resultiert in einer
Dimerisierung, was die Bindung an den regulierbaren Promotor ermöglicht, der sich aus
sechs Gal4-Upstream-Activating-Sequences (GAL4UAS) und einer adenoviralen E1b TATABox zusammensetzt und das System aktiviert. Die Funktionalität dieses Systems konnte in
verschiedenen Studien im adenoviralen und herpesviralen Kontext nachgewiesen werden
(Burcin et al., 1998; Burcin et al., 1999; Tsai et al., 1998; Wang et al., 1999; Wieser et al.,
2005).
Abb. 2, Schematische Darstellung des GeneSwitchTM-Systems. Ausgehend von dem Plasmid
pSwitch erfolgt eine schwach-konstitutive Expression des aus drei Domänen bestehenden
GeneSwitchTM-Transaktivatorproteins unter der Basalaktivität eines verkürzten Thymidinkinase
Promotors (PTK) aus Herpes Simplex. Im Ruhezustand liegt es in Form inaktiver Monomere vor. Die
Zugabe des Induktors Mifepriston vermittelt eine Dimerisierung, was die spezifische Interaktion
zwischen den GAL4-DNA-Binding-Domains (GAL4DBD) des Transaktivators und den GAL4-Upstream
Activating Sequences (GAL4UAS) innerhalb beider Plasmide ermöglicht und in der Expression des
Zielgens, ausgehend von dem Plasmid pGene, resultiert. Ein positiver Rückkopplungsmechanismus
steigert das Expressionsniveau sowohl des Switch- als auch das des Zielproteins. Das Absinken der
Aktivität tritt mit sinkender Konzentration des Induktors ein.
Der nach wie vor bedeutendste Vertreter unter diesen Systemen ist das Tetrazyklin
gesteuerte Tet-System,
welches
auf
dem
Mechanismus
der Tetrazyklin-Resistenz
gramnegativer Bakterien basiert. Das Resistenzgen tetA kodiert für einen membranständigen
Protonenantiporter, der den aktiven Efflux eines Tetrazyklin-Magnesium-Komplexes [MgTc]+
steuert. Im natürlichen Kontext resultiert überhöhte TetA-Expression in einem unspezifischen
Kationenexport und einer Minderung der Integrität des Membranpotentials; dem gegenüber
9
Einleitung
ist er für die Zelle essentiell, da er die Menge antibiotisch aktiver Substanz unterhalb einer
die Proteinbiosynthese inhibierenden Konzentration hält. Der molekulare Mechanismus der
stringenten Expressionskontrolle dieses sehr fein abgestimmten Systems beruht auf der
Fähigkeit eines Repressorproteins, welches sich aus zwei identischen Untereinheiten
zusammensetzt, zur Bindung palindromisch angeordneter DNA-Abschnitte, den sog.
Operator-Sequenzen (tetO). Jedes der Peptide des klassischen Tet-Repressors (TetR)
besteht aus zehn α-Helices mit definierten Funktionen (Saenger et al., 2000). In
Abwesenheit
von
Tetrazyklin
binden
beide
Untereinheit
des
Dimers
die
jeweils
korrespondierende „große Furche“ im Bereich der 15 bp umfassenden Operator-Sequenz
und blockiert die Transkription von tetA. Eine Anpassung an die Genregulation in eukaryoten
Zellen erfolgte durch die Fusion des klassischen Repressors entweder an eine
Aktivierungsdomäne resultierend in einem Transaktivator-Protein (tTA), oder an eine
Repressionsdomäne, was zur Bildung eines Transsilencers (tTS) führte. Ersteres stellt das
sog. Tet-OFF-System dar. In Anwesenheit von Tetrazyklin verliert das Fusionsprotein die
DNA-bindenden Eigenschaften, weshalb die auf den Promotor transaktivierende Wirkung
ausbleibt. Bei tTS hingegen ist die Transkription in Anwesenheit von Tetrazyklin aktiviert, da
der Verlust der DNA-bindenden Eigenschaft des Transsilencers mit dem Verlust der
inhibierenden Wirkung einhergeht (Tet-ON). Der reverse Transaktivator (rtTA) ist eine dritte
Variante; hier verhält sich das tTA-Protein umgekehrt zu jenem des Tet-OFF-Systems:
Anwesenheit von Tetratzyklin induziert hier nicht die Dissoziation von der DNA, sondern
vielmehr deren Bindung und damit die Transaktivierung des Promotors (Urlinger et al.,
2000).
Abb. 3, Darstellung des Tet-ON-Systems.
In Abwesenheit des Induktormoleküls (oben)
bindet das Transsilencer-Protein (tTS) an die
Operator-Sequenzen und reprimiert die
Transkription des Zielgens. Anwesenheit von
Tetrazyklin/Doxyzyklin (unten) resultiert in
der Dissoziation von tTS und der Expression
des Zielgens (Modifiziert nach Berens und
Hillen, Eur. J. Biochem., 2003).
10
Ziel der Arbeit
III. Ziel der Arbeit
Ziel der Arbeit war die Entwicklung eines neuen Hybridvektors für die somatische
Gentherapie. Auf Basis eines sog. gutless oder high-capacity adenoviralen Vektorsystems
(Typ 5) sollte ein Ein-Plasmid-Transfersystem etabliert werden. Dieses sollte es erlauben,
eine Zielzellpopulation mit einem persistierenden Episom auszustatten, von dem ausgehend
zu beliebigen Zeitpunkten wiederholt therapeutisch wirksame Proteine exprimiert werden
können. Dazu sollten definierte Bereiche des Herpesvirus saimiri, die für Replikation und
episomale Persistenz verantwortlich zu sein scheinen, so innerhalb des adenoviralen
Genoms platziert werden, dass sie unter dem Einfluss einer auf demselben DNA-Molekül (in
cis) befindlichen Rekombinase homolog rekombiniert und zirkularisiert werden. Die
exemplarisch eingesetzten rekombinanten Zytokine Interleukin-10 und Interleukin-1 Rezeptor
Antagonist haben in verschiedenen Tiermodellen der Rheumatoiden Arthritis (RA) bereits
therapeutisches Potenzial gezeigt. Ihre Expression wird entweder konstitutiv nach
erfolgreicher
Zirkularisierung
Expressionssystems
oder
GeneSwitch
TM
durch
Induktion
realisiert.
Nach
des
konditionalen
Herstellung
der
eukaryoten
rekombinanten
Nukleinsäuren sollte deren Funktionalität durch transiente Transfektion in eukaryoten Zellen
analysiert werden. Anschließend sollten unter Verwendung einer eigens konstruierten
Verpackungszelllinie rekombinante, adenovirale Partikel generiert und aufgereinigt werden.
Eine umfassende Analyse in Bezug auf Infektiösität sowie auf die Fähigkeit, innerhalb einer
Zielzellpopulation ein Replikon freizusetzen und die eingesetzten therapeutischen Gene zu
exprimieren, sollte durchgeführt werden. Letztlich sollten Daten im Hinblick auf die
Persistenz in eukaryoten Zellen, besonders in humanen Fibroblasten als potenzielle
Zielzellen im Bezug auf die Therapie einer RA, gewonnen werden.
11
Ergebnisse
IV. Ergebnisse
1. Herstellung rekombinanter Herpesvirus saimiri / Adenovirus-Konstrukte
Auf der Basis eines Helper Dependent (HD, auch high capacity, hc oder gutless) Adenovirus
wurden anhand folgender Strategie verschiedene HVS/Ad5-Hybridkonstrukte hergestellt
(graphisch dargestellt im Anhang ab S. 61):
Ausgangsbasis für sämtliche Konstrukte war das Plasmid pSTK68. Dieses umfasst als cisaktive Elemente das Verpackungssignal (Ψ) sowie die endständigen Wiederholungen
(inverted terminal repeats, ITR) des humanen Adenovirus Typ 5. Weiterhin verfügt es über
rund 16 kb des Genlocus der humanen Hypoxantin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase
(HPRT), als sog. Stuffer-DNA. Über die Erkennungssequenzen für die Endonuklease PmeI
kann das adenovirale Vektorgenom zur Produktion von Viruspartikeln aus dem Hintergrund
des
Plasmids
pBluescribe
komplementären
(pBS)
freigesetzt
werden.
eine
Sequenz
Oligonukleotiden
Zunächst
wurde
bestehend
aus
aus
zwei
einer
Mehrfachklonierungsstelle (multiple cloning site, mcs), flankiert von zwei unidirektional
orientierten Flp Recognition Target Sites (FRT) generiert und in die SwaI-Erkennungsstelle in
dem Plasmid pSTK68 inseriert (Æ pSTK68-FRT). Weiterhin wurde das Luziferase-Gen (luc+)
in dem Plasmid pWHE281 durch die Wildtyp-Variante der FLP-Rekombinase aus
Saccharomyces
cerevisiae
substituiert.
Dabei
wurde
luc+ mittels
HindIII
x
XbaI
ausgeschnitten. Das Gen der Flp-Rekombinase wurde durch PCR aus dem Plasmid pCP20
amplifiziert. Die verwendeten Oligonukleotide waren dabei so gewählt, dass das Amplifikat
von EagI-Sequenzen flankiert vorlag. Nach dem Glätten der DNA-Überhänge wurden beide
Moleküle ligiert (Æ pWHE281-flp). Die resultierende Expressionskassette der Tet-regulierten
Flp-Rekombinase
wurde
über
SmaI
x
Eco47III
freigesetzt
und
in
die
EcoRV-
Erkennungsstelle in dem Plasmid pSTK68-FRT kloniert (Æ pSTK68-FRT-pWHE281CP20flp-fwd).
Abb. 4, Modifiziertes helper dependent Adenovirus Rückgrat. Ausgehend von dem Plasmid
pSTK68 wurde das vorliegende Konstrukt sowohl durch ein Tetrazyklin reguliertes Gen der FlpRekombinase (tet-regulierte flp) als auch durch eine Mehrfachklonierungsstelle (mcs), die von den
Zielsequenzen der Flp-Rekombinase flankiert ist (FRT-Linker), ergänzt. Zur Produktion viraler Partikel
wurde der adenovirale Anteil aus dem pBluescribe (pBS) -Hintergrund durch die Endonuklease PmeI
freigesetzt. Die Erkennungssequenzen von BsiWI und Eco47III wurden zur Aufnahme definierter
herpesviraler Vektorsequenzen verwendet. (Grafik nicht maßstäblich).
12
Ergebnisse
Zur Erzeugung einer mittels Bleomycin selektionierbaren Expressionskassette der
Luziferase, die ihre Aktivität erst nach homologer Rekombination an den FRT-Sequenzen
entfaltet, wurden in einem ersten Schritt rund zwei Drittel des immediate early-Promotors des
Cytomegalovirus (CMVie) in dem Plasmids pIRES-BleoFRT mittels NdeI und SstI exzidiert
und in umgekehrter Orientierung mit demselben Plasmidrest ligiert (Æ pIRES-BleoFRTinvCMV). In einem zweiten Schritt wurde das Luziferase-Gen samt PolyA-Sequenz mittels
BamHI x NheI aus pGL3Basic freigesetzt und in die BstZ17I-Erkennungsstelle von pIRESBleoFRT-invCMV kloniert (Æ pIRES-BleoFRT-invCMV-pGL3luc-right). Daraufhin wurde die
Kassette
mittels
flankierender
BglII-Sequenzen
ausgeschnitten
und
in
die
Erkennungssequenz von Eco47III in pSTK68-FRT-pWHE281CP20-flp-fwd überführt. (Æ
pSTK68-FRT-pWHE281CP20-flp-fwd-CMVluc-rev). Um dieses Konstrukt auf eine zur
Verpackung in adenovirale Partikel notwendige Größe zu bringen, wurden ~ 5,4 kb HPRTDNA aus pSTK134 durch Verdau mit SmaI freigesetzt und in die Erkennungsstelle von StuI
in pSTK68-FRT-pWHE281CP20-flp-fwd-CMVluc-rev kloniert. Diese beiden Moleküle wurden
generiert, jedoch nach der Fertigstellung des alternativen Konstruktes pAD-HVS1 nicht mehr
eingesetzt. Beide können bei Bedarf als universelle, exzisions-abhängige Reporterplasmide
zum Nachweis der Expression einer Flp-Rekombinase dienen.
Zur Erzeugung eines HVS-Replikons, welches ebenfalls über eine Expressionskassette der
Luziferase verfügt, deren Aktivität nach homologer Rekombination an FRT-Sequenzen
eintritt, wurde in einem ersten Schritt ein HindIII x EcoRI-verdautes pUC18-Plasmid mit
einem durch Anlagerung zweier komplementärer Oligonukleotide entstandenen Linker
(hvsamplink) zur Aufnahme der HVS-Anteile versehen. Die Sequenz der Oligonukleotide war
dabei so gewählt, dass bei der Anlagerung der komplementären Stränge die analogen
Erkennungssequenzen (HindIII und EcoRI) entstanden, mit denen das pUC18-Plasmid zur
Vorbereitung auf die Aufnahme des Linkers geschnitten wurde (Æ pUC18Linker). Im
weiteren Verlauf wurde das BglII-Fragment aus pIRES-BleoFRT-invCMV in die SwaIErkennungsstelle von pUC18Linker eingesetzt (Æ pUC18Linker-CMVluc-rev). Nachdem der
durch HA- und Myc-His-Epitope markierte offene Leserahmen 73 (ORF73) aus dem Plasmid
pCDNA3.1(-)HA-MVL73MHBd23 in das Plasmid pPGK-P&T umgesetzt worden war, konnte
die entstandene Expressionskassette (PGK-HAORF73MH) über ApaI x EcoRV freigesetzt
und in das SwaI x PmeI-gespaltene uc3HO-Plasmid kloniert werden (Æ uc3HO-PGK73MHrev-rev). Letzteres enthält drei Wiederholungen der H-DNA von Herpesvirus saimiri und
AT-reiche, repetitive Sequenzen aus dem Bereich zwischen den offenen Leserahmen 70 und
71, die einem Replikationsursprung während der lytischen Phase von HVS entsprechen, und
prinzipiell auch während der Latenz als Ursprung der Replikation fungieren könnten
(Schofield, 1994). Danach wurde das BsiWI x ZraI-Fragment von uc3HO-PGK73MH-rev-rev
in die Erkennungsstelle von PstI in pUC18Linker-CMVluc-rev gesetzt (Æ pUC18Linker13
Ergebnisse
CMVluc-rev-uc3HO-PGK73MH-rev-rev). Abschließend wurde das BsiWI x EcoRV-Fragment
dieses Intermediats in einen BsiWI x Eco47III-gespaltenen pSTK68-FRT-pWHE281CP20-flpfwd inseriert (Æ pAD-HVS1).
In den Konstrukten pAD-HVS2 und 3 wurde das Gen der Luziferase durch das IL-1RA-Gen
bzw. das Gen des humanen IL-10 substituiert: Zunächst wurde das Gen der Luziferase aus
dem Plasmid pUC18Linker-CMVluc-rev durch Verdau mit BstZ17I x XbaI eliminiert. Nach
vorhergehender Deletion einer BstBI-Erkennungsstelle aus dem Plasmid pGeneV5-IL-10
wurden die Gene für IL-1RA bzw. IL-10 samt dem voranstehenden synthetischen Intron IVS8
durch PacI x BamHI- bzw. PacI x ApaI-Verdau aus pGeneV5HisA-dN-IL1RA und
pGeneV5HisA-dN-IL10 freigesetzt und mit dem BstZ17I x XbaI verdauten Plasmid
pUC18Linker-CMVluc-rev ligiert (Æ pUC18Linker-CMVIL1RA-rev; pUC18Linker-CMVIL10rev). Danach wurde das bereits aus der Klonierung von pAD-HVS1 bestehende BsiWI x ZraIFragment
von
uc3HO-PGK73MH-rev-rev
in
die
Erkennungsstellen
von
BstBI
in
pUC18Linker-CMVIL1RA-rev bzw. pUC18Linker-CMVIL10-rev gesetzt (Æ pUC18LinkerCMVIL1RA-rev-uc3HO-PGK73MH; pUC18Linker-CMVIL10-rev-uc3HO-PGK73MH).
Abschließend wurde analog der Klonierung von pAD-HVS1 das jeweilige BsiWI x EcoRVFragment in den BsiWI x Eco47III-gespaltenen pSTK68-FRT-pWHE281CP20-flp-fwd
inseriert (Æ pAD-HVS2; pAD-HVS3).
Die Konstrukte pAD-HVS4 und 5 und 6 basieren auf pAD-HVS1. Additiv enthalten sie die
regulativen Elemente des GeneSwitchTM-Systems, das eine induzierbare Expression von
IL-1RA bzw. IL-10 ermöglicht. Die Konstrukte 4 und 5 unterscheiden sich hinsichtlich des
Promotors, welche die Expression des Switch-Proteins treibt. pAD-HVS4 verfügt über den
Promotor des Leserahmens 14 von HVS (ORF14), das Konstrukt 5 hat in gleicher Position
den Promotor des Elongationsfaktors-1 alpha (EF1a). Konstrukt 6 exprimiert IL-10 unter
Kontrolle des ORF14-Promotors. (Das logisch folgende Konstrukt 7 mit IL-10 unter Kontrolle
des EF1a-Promotors überschreitet die theoretisch verpackbare Größe und wurde nicht
hergestellt). Zur Vorbereitung der Klonierung mussten in den Plasmiden pGeneV5HisA-dNIL1RA und pGeneV5HisA-dN-IL10 zunächst die Erkennungssequenzen für PmeI und EcoRV
deletiert werden. Experimentell erfolgte dies im Fall von pGeneV5HisA-dN-IL1RA durch
Verdau mit EcoRI x PmeI. Nach der Religation erfolgte ein EcoRV x XhoI-Verdau und
abermals die Religation (Æ pGeneV5HisA-dN-dP-dE-IL1RA). Bei pGeneV5HisA-dN-IL10
folgte auf einen AgeI x PmeI-Verdau mit anschließender Religation, in separaten Ansätzen
ein EcoRV x EcoRV- sowie ein XhoI x XhoI-Verdau. Aus dem EcoRV-Verdau wurde das
Insert, aus dem XhoI-Verdau wurde der Vektorrest aufgereinigt. Beide Fragmente wurden
ligiert. Es wurden Klone ausgewählt, in der das IL-10-Gen in ursprünglicher Orientierung
enthalten war (Æ pGeneV5HisA-dN-dP-dE-IL10). Anschließend wurde eine Kassette, die
6xGal4DBS E1bTATA IVS8-IL1RA bGH-polyA bzw. 6xGal4DBS E1bTATA IVS8-IL10 bGH14
Ergebnisse
polyA umfasste, über ZraI x DraIII freigesetzt und in ein BsaBI-geschnittenes pUC18LinkerCMVluc-rev-uc3HO-PGK73MH inseriert. (Æ pUC18Linker-CMVluc-rev-uc3HO-PGK73mhrev-rev-Gal4-IL1RA-fwd;
pUC18Linker-CMVluc-rev-uc3HO-PGK73mh-rev-rev-Gal4-IL10-
fwd). Die entstandenen Plasmide wurden mit SbfI linearisiert und mit den Kassetten von
ORF14-Switch (∆ EcoRV x BsrBI aus pSwitch14) bzw. EF1a-Switch (∆ EcoRV x DrdI aus
pSwitchEF1a) versehen. Abschließend erfolgte erneut die Klonierung der BsiWI x EcoRVFragmente in den BsiWI x Eco47III-gespaltenen pSTK68-FRT-pWHE281CP20-flp-fwd
(Æ pAD-HVS4, pAD-HVS5, pAD-HVS6).
Die Konstrukte 8 und 9 basieren auf pAD-HVS2. Additiv wurden die regulativen Elemente
des GeneSwitchTM-Systems mit induzierbarer IL-10-Expression unter Kontrolle des ORF14bzw. des EF1a-Promotors analog der Konstruktion von pAD-HVS6 kloniert. Konstrukt 10 ist
ein Derivat von pAD-HVS3. Zusätzlich verfügt es über die Elemente zur induzierbaren
IL-1RA-Expression unter Kontrolle des ORF14-Promotors. Diese wurden analog der
Konstruktion von pAD-HVS4 kloniert.
Abb. 5, Übersicht der HVS-Replikons. Die einzelnen Konstrukte wurden über die Erkennungsstellen
von BsiWI und EcoRV aus ihrem Hintergrund freigesetzt und in das modifizierte HD-AD Rückgrat (vgl.
Abb. 4) inseriert. Die gegebene Bezeichnung (pAD-HVS1 - 10) bezieht sich auf das jeweils durch
Klonierung in den adenoviralen Hintergrund entstehende Konstrukt. Im unteren Bereich ist die
ungefähre Größe der Replikon-Konstrukte angezeigt (hIL-10 = cDNA des humanen Interleukin-10;
IL-1RA = cDNA des humanen Interleukin 1 Rezeptor Antagonist; luc+ = Gen der Luziferase; Gal4UAS
= Gal4 upstream activating sequences; HVS ORI = Rplikationsursprung von HVS; PGK = Promotor
der Phosphoglyceratkinase; ORF73 = Leserahmen 73 von HVS; switch = Transaktivator-Protein des
GeneSwitchTM-Systems; ORF14 = Promotor des HVS Leserahmens 14; EF1a = Promotor des
Elongationsfaktors 1 alpha; H = wiederholte H-DNA-Sequenz aus HVS; CMV = partiell invertierter
CMVie-Promotor, pa = Polyadenylierungssequenz).
15
Ergebnisse
2. Funktionsanalyse des partiell invertierten CMVie-Promotors
Abb. 6, Partiell invertierter CMViePromotor. Auf dem Weg zur Herstellung
einer Expressionskassette, deren Zielgen
nach Zirkularisierung unter Kontrolle des
Promotors gelangt, wurde der CMViePromotor innerhalb des Plasmids pIRESBleoFRT mit NdeI x SstI gespalten (A)
und das entstehende Fragment in
umgekehrter Orientierung wieder in den
ursprünglichen Hintergrund gesetzt (B).
Für weitere Klonierungsschritte wurde
der invertierte Teil des Promotors durch
BglII freigesetzt.
Um zu prüfen, ob der um mehr als ein Drittel verkürzte und invertierte CMVie-Promotor seine
Aktivität beibehalten hatte, wurde das später zu klonierende BglII-Fragment (umfasst
invCMV, EM7-Promotor-Zeocin-R., Luziferase) aus dem Hintergrund ausgeschnitten und
nach Religation in 293T-Zellen transfiziert (invCMV-luc zirk.). Als Kontrollen dienten das
pGL3Basic-Plasmid, welches das Gen der Luziferase ohne vorangestellten Promotor enthält,
das nicht rückligierte BglII-Fragment (invCMV-luc lin.) sowie das Plasmid mit invertiertem
CMV-Promotor vor der Insertion des luc+-Gens (pIRES-BleoFRT-invCMV). Das Plasmid
pGL3Basic zeigte die Basalaktivität der Luziferase ohne Promotor. In etwa diesem Wert
entsprach auch die Aktivität der Luziferase des linearen BglII-Fragments. Das nach
Religation zirkulär vorliegende BglII-Fragment, in dem der um ein Drittel verkürzte CMVPromotor unmittelbar vor die Luziferase verlagert wurde, war der Wert um ca. Faktor sechs
gesteigert. Nach Transfektion des Plasmids pIRES-BleoFRT-invCMV, das den invertierten
CMV-Promotor, jedoch keine Luziferase beinhaltet, konnte keine Aktivität der Luziferase
festgestellt werden.
Abb. 7, Aktivität des partiell
invertierten CMVie-Promotors.
Die Expressionskassette, die nach
Zirkularisierung durch homologe
Rekombination an den FRTSequenzen Luziferase exprimieren
soll, wurde über BglII aus pIRESBleoFRT-invCMV-luc
exzidiert.
Sowohl das lineare Fragment
(invCMV-luc lin.), das Fragment
nach Religation (invCMV-luc zirk.)
als auch die Plasmide pIRESBleoFRT-invCMV und pGL3Basic
wurden transient in 293T-Zellen
transfiziert. Lysate wurden 24 h
nach Transfektion gefertigt.
16
Ergebnisse
3. Verifizierung der klonierten Konstrukte
Nach der Fertigstellung sämtlicher Konstrukte wurde eine Testspaltung mit BamHI
durchgeführt. Dabei konnte für alle Nukleinsäuren das theoretisch berechnete Bandenmuster
nachvollzogen werden.
Abb. 8, Testspaltung von pAD-HVS-Konstrukten. Die durch Verdau mit BamHI entstehenden
Fragmente wurden im 1 % Agarosegel der Größe nach aufgetrennt und nach Färbung mit
Ethidiumbromid unter UV-Licht sichtbar gemacht (links). Rechts neben dem Verdau ist das theoretisch
errechnete Bandenmuster der jeweiligen Spaltung abgebildet (unter Anwendung von Vector NTI
AdvanceTM 9.1 simulierter Restriktionsverdau).
Zusätzlich wurde das Vorhandensein verschiedener Motive innerhalb der Konstrukte durch
Polymerasekettenreaktion mit Matrizen-DNA aus Plasmidpräparationen überprüft. Die Motive
Zeocin, Switch und ORF73 liegen dabei zwischen den FRT-Sequenzen und repräsentieren
somit Teile des HVS-Replikons. Das PolyA-Signal von SV40 ist unmittelbar hinter dem Gen
der Flp-Rekombinase lokalisiert und repräsentiert einen Teil des modifizierten, adenoviralen
Hintergrundes. Sämtliche Konstrukte zeigten im Bezug auf die Motive Zeocin, ORF73 sowie
SV40pA ein spezifisches Signal. Hinsichtlich des Transaktivatorproteins Switch zeigten die
Konstrukte pAD-HVS4 - 10 ein spezifisches Produkt. Die Konstrukte pAD-HVS1 - 3 tragen
nicht die Elemente des GeneSwitchTM-Systems und waren in dieser PCR folglich negativ. In
der
Reaktion
auf
SV40pA
wurde
keine
Negativkontrollen zeigten kein Signal (Abb. 9).
17
Positivkontrolle
mitgeführt.
Sämtliche
Ergebnisse
Abb. 9, Nachweis verschiedener Motive
innerhalb der pAD-HVS-Konstrukte.
DNA aus Plasmidpräparationen wurde in
unterschiedlichen PCR-Reaktionen auf das
Vorhandensein der am rechten Rand
angegebenen Motive untersucht. Dabei
befinden sich die Zeocin-Resistenz, das
Switch-Gen, sowie der offene Leserahmen
73 innerhalb der FRT-Erkennungsstellen.
SV40pA liegt im direkten Anschluss an das
Gen der Flp-Rekombinase und damit
außerhalb der FRT-Erkennungsstellen.
4. Funktionsanalysen rekombinanter pAD-HVS Konstrukte
4.1. Expression der Transgene orf73/LANA und switch
Nachdem somit sämtliche Konstrukte sowohl im Restriktionsverdau als auch in den
durchgeführten PCR-Reaktionen keine Fehler aufwiesen, wurden sie hinsichtlich der
Transgenexpression untersucht. Dazu wurden die Konstrukte pAD-HVS1 - 6 in 293CreZellen transfiziert. Nach der Lyse, denaturierender Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDSPAGE) und Membrantransfer erfolgte ein Nachweis des c-Myc-markierten ORF73. Als
Kontrolle diente das Lysat von Zellen, die mit dem Konstrukt pAD-EBV1, welches kein orf73
trägt, transfiziert wurden. Im Vergleich zur Negativkontrolle zeigten die Lysate der Konstrukte
pAD-HVS1, 2 und 3 neben einer unspezifischen Bande bei ~ 40 kDa ein weiteres Signal
etwas oberhalb von 60 kDa. Dieses Signal war in den Proben aus pAD-HVS4, 5 und 6 nicht
erkennbar. Das mit einem HA-Epitop als auch mit Myc-His-Epitopen versehene ORF73Protein hat eine theoretische Masse von etwa 66 kDa (Abb. 10B).
Weiterhin wurden die Konstrukte pAD-HVS4 - 6 auf die Fähigkeit zur Expression des SwitchProteins im induzierten Zustand untersucht. Als Positivkontrollen wurden die Plasmide
pSwitch14 und pSwitchEF1a hinzugezogen, als Negativkontrolle dient pAD-HVS1, welches
nicht über das GeneSwitchTM-System verfügt (Abb. 10A). In sämtlichen Lysaten waren die
~ 65 kDa-Banden präsent, die dem p65 des endogenen NF-κB entsprechen. Die
Positivkontrolle pSwitchEF1a zeigte darüber hinaus eine weitere Bande, die ein etwas
massereicheres Protein repräsentiert. Dabei handelt es sich um das Switch-Protein, das eine
Masse von etwa 73 kDa hat und anhand seines p65-Anteiles nachgewiesen werden kann. In
den Lysaten der mit pAD-HVS3 - 6 transfizierten Zellen war auf gleicher Höhe ebenfalls die
18
Ergebnisse
Bande des Switch-Proteins erkennbar. Die zweite Positivkontrolle pSwitch14 und die
Negativkontrolle zeigten die entsprechende Bande nicht.
Abb. 10, Nachweis der Expression von ORF73 und Switch-Protein. Elf Tage nach Transfektion
der angegebenen Konstrukte in 293Cre-Zellen wurden die Lysate mittels Westernblot-Analysen auf
die Expression der Proteine ORF73/LANA und Switch (im induzierten Zustand) überprüft.
4.2. Homologe Rekombination an FRT-Sequenzen
Weiterhin
wurden
die
Konstrukte
auf
Funktionalität
hinsichtlich
der
homologen
Rekombination an den Flp-Erkennungssequenzen, die durch die in cis lokalisierte
Rekombinase vermittelt wird, untersucht. Elf Tage nach transienter Transfektion von 293CreZellen mit den angegebenen Plasmiden wurden Lysate gefertigt und die Luziferaseaktivität
quantifiziert. Als Negativkontrolle wurde pAD-HVS2 mitgeführt, das anstelle des Gens der
Luziferase jenes des IL-1RA trägt.
Die Konstrukte pAD-HVS1, 4 und 6 zeigten elf Tage nach Transfektion in 293Cre-Zellen,
eine im Vergleich zur Kontrolle pAD-HVS2 deutlich gesteigerte Luziferaseaktivität. Im
Konstrukt pAD-HVS5 war die Aktivität auf einem basalen Level.
19
Ergebnisse
Abb.11, Exzision und Zirkularisierung der
Konstrukte pAD-HVS1, 4, 5 und 6. Elf Tage nach
Transfektion der angegebenen Konstrukte in
293Cre-Zellen wurden diese lysiert und die Aktivität
der Luziferase vermessen. Als Negativkontrolle
wurde pAD-HVS2 mitgeführt, das keine Luziferase
beinhaltet.
In den Konstrukten pAD-HVS2, 3, 8, 9 und 10, die anstelle des Gens der Luziferase das Gen
eines Zytokins tragen, erfolgte der Nachweis der Zirkularisierung nicht über die
Luziferaseaktivität, sondern über den Nachweis der Zytokinexpression. Die Kulturüberstände
der mit den Konstrukten pAD-HVS2 und 3 transfizierten 293Cre-Zellen zeigten am elften Tag
nach Transfektion im Vergleich zu der mitgeführten Kontrolle pAD-HVS1 deutlich gesteigerte
Zytokinkonzentrationen (Abb. 12 links). Gleiches gilt im Hinblick auf die Konstrukte pADHVS8, 9 und 10 (Abb. 12 rechts). Die Differenz zu den mitgeführten Kontrollen dieser
Konstrukte war verglichen mit den Konstrukten pAD-HVS2 und 3, weniger deutlich. Sowohl
pAD-HVS5 (Kontrolle für IL-1RA) als auch pAD-HVS9 (Kontrolle für IL-10) tragen das
jeweilige Zytokingen im Kontext des GeneSwitchTM-Systems und zeigten daher relative
Basalaktivitäten.
Abb. 12, Exzision und Zirkularisierung der Konstrukte pAD-HVS2, 3, 8, 9 und 10. Elf Tage nach
Transfektion der angegebenen Konstrukte in 293Cre-Zellen wurden die Konzentrationen der
betreffenden Zytokine in den Kulturüberständen mittels ELISA quantifiziert. In den Untersuchungen zu
pAD-HVS2 und 3 diente pAD-HVS1 als Negativkontrolle. In den Versuchen zu pAD-HVS8, 9 und 10
dienten pAD-HVS5 als Kontrolle der IL-1RA- und pAD-HVS9 als Kontrolle der IL-10-Expression.
4.3. Induzierbare Expression additiver Transgene
Die Konstrukte pAD-HVS4, 5 und 6 sowie 8, 9 und 10, tragen neben dem Gen, welches nach
Zirkularisierung konstitutiv aktiv ist (luc+, hIL-10, IL-1RA), jeweils das Gen eines weiteren
Zytokins im Kontext des GeneSwitchTM-Systems. Zur Analyse der Induzierbarkeit wurden die
betreffenden Konstrukte in parallelen Ansätzen in 293Cre-Zellen transfiziert. 24 Stunden
20
Ergebnisse
später wurde jeweils die Hälfte der Proben mit Mifepriston (40 nM) induziert. Die zweite
Hälfte blieb unverändert. Weitere 48 Stunden darauf wurden Kulturüberstände entnommen
und
die
Zytokinkonzentrationen
in
Abhängigkeit
des
Induktors
quantifiziert.
Die
Zellkulturüberstände, die mit den Konstrukten 4, 5, 6, 8 und 9 transfiziert wurden, zeigten in
Anwesenheit von Mifepriston eine im Vergleich zum uninduzierten Zustand erheblich
gesteigerte Zytokinkonzentration. Dieser Effekt blieb bei dem Konstrukt pAD-HVS10 aus.
Hier lag die Konzentration im induzierten wie uninduzierten Zustand auf gleichem Niveau.
Abb. 13, Induzierbare Zytokinexpression der Konstrukte pAD-HVS4, 5, 6, 8, 9 und 10. Die
angegebenen Konstrukte wurden in 293Cre-Zellen transfiziert und nach 24 Stunden teilweise mit
Mifepriston induziert. Weitere 48 Stunden später wurden Überstände entnommen und die enthaltene
Zytokinkonzentration per ELISA analysiert.
4.4. Zeitverlauf der Luziferaseexpression von pAD-HVS1
Nachdem das Konstrukt pAD-HVS1 nach transienter Transfektion in 293Cre-Zellen im
Vergleich zur Negativkontrolle pAD-HVS2 gesteigerte Luziferaseaktivität gezeigt hatte (Abb.
11), wurde das Expressionsniveau über die Zeit näher betrachtet. Danach erreichte die
Aktivität in 293T-Zellen nach bereits am zweiten Tag messbaren Werten, am fünften Tag
nach Transfektion ein Maximum, um danach innerhalb der folgenden drei Tage mäßig sowie
der darauf folgenden vier und acht Tage deutlich abzunehmen. In der mitgeführten
Negativkontrolle (pSTK68) bestand zu keinem der Zeitpunkte eine messbare Aktivität.
Abb.
14,
Zeitverlauf
der
Luziferaseexpression
von
pADHVS1 in HEK293T. Sowohl pAD-HVS1
als auch pSTK68 wurden transient in
293T-Zellen transfiziert. Zu den
angegebenen Zeitpunkten (d2 ,5, 8, 12
und 16 nach Transfektion) wurden die
Zellen trypsiniert und verdünnt. Das
abgenommene Zellmaterial wurde
lysiert und hinsichtlich der Expression
der Luziferase untersucht.
21
Ergebnisse
5. Die spezifische Verpackungszelllinie 293Cre-tTS
Die Anordnung der Flp-Rekombinase sowie der entsprechenden Zielsequenzen innerhalb
derselben Nukleinsäure erfordert eine stringente Kontrolle der Expression. Einerseits sollte
die Aktivität der Rekombinase während der Replikations- und Verpackungsphase
rekombinanter Viruspartikel auf ein Minimum reduziert sein, um der vorzeitigen Freisetzung
des HVS-Replikons vorzubeugen. Andererseits muss die Expression der Rekombinase
innerhalb der Zielzellpopulation ein Maß erreichen, welches die homologe Rekombination an
den FRT-Sequenzen und damit die Freisetzung des HVS-Replikons gewährleistet. Um
diesem Anspruch zu genügen, wurde auf das Tet-ON-System zurückgegriffen. Die
verwendete Kombination aus CMVenhancer und SV40 Minimal-Promotor lässt in
dereprimiertem Zustand ein relativ moderates Expressionsniveau zu, welches sich unter
Anwesenheit eines Transsilencers weiter reduzieren lässt.
Zur Kontrolle des Tet-Systems während der Verpackungsphase, wurde die auf der mit
adenoviralem
E1
transformierte
Zelllinie
HEK293
basierende,
bereits
bestehende
Verpackungszelllinie 293Cre durch stabile Transfektion um das Gen des Transsilencers
TetR(sB)-KRAB erweitert und somit eine Mischpopulation (MP) der Verpackungszelllinie
293Cre-tTS geschaffen. Im Anschluss an die Transfektion erfolgte durch Zugabe von
400 µg/ml Hygromycin B eine Selektion auf jene Zellen, die das Transgen tragen.
5.1. Expressions- und Funktionsanalyse des stabil transfizierten Transsilencers
Zunächst wurde die nach Selektion erhaltene Mischpopulation von 293Cre-tTS untersucht.
Dies erfolgte durch transiente Transfektion des Plasmids pWHE281, bei dem das
Expressionsniveau
der
Luziferase
durch
das
Transsilencer-Protein
TetR(sB)-KRAB
reprimiert werden kann. Durch Zugabe von Tetrazyklin wird das System dereprimiert. In der
293Cre-tTS
MP
wurde
eine
um
den
Repressionsfaktor
(RF)
8,8
reduzierte
Luziferaseexpression im Vergleich zum dereprimierten Zustand gemessen (Abb. 8 oben).
Um Zelllinien mit gesteigertem RF zu erhalten, wurde eine Einzelzellklonierung aus 293CretTS MP durchgeführt. Ausgehend von einer verdünnten Einzelzell-Suspension wurden je 0,1
Zellen in die Vertiefungen einer 96-Napf-Platte überführt und weiterhin in DMEM10GG 800
µg/ml Hygromycin B kultiviert. Immer wenn der Boden des Kulturgefäßes konfluent bedeckt
war, wurden die Zellen trypsiniert und in ein größeres Gefäß überführt. Bei dieser Prozedur
wurden sieben Subpopulationen (SP1-7) erhalten, die der gleichen Funktionsanalyse wie die
Mischpopulation unterzogen wurden. Es stellte sich heraus, dass in einigen der
Subpopulationen der RF auf rund 400 gesteigert werden konnte. Bei diesem Effekt war eine
reduzierte Basalaktivität in reprimiertem Zustand ausschlaggebend, was vermutlich auf die
22
Ergebnisse
Integration des Transgens in eine Region mit geringerer basaler Transkriptionsaktivität
zurückzuführen ist.
Abb.
15,
Funktionsanalyse
von
293Cre-tTS. Die basale und konditionale
Expression des tet-regulierten FlpRekombinase-Plasmids pWHE281 in
Gegenwart des zellulär exprimierten
Transsilencers
wurde
in
einer
Mischpopulation (obere Grafik) und in
mehreren von dieser abgeleiteten
Subpopulationen
überprüft
(untere
Grafik).
5.2. Ansprechverhalten auf zellulär exprimierten Transsilencer
Zur funktionellen Analyse wurde pAD-HVS1 in Addition zu weiteren Plasmiden kotransfiziert.
Zum Vergleich der Effekte von 293Cre-tTS SP4 wurden dieselben Konstrukte in 293CreZellen transfiziert. Vergleicht man das Verhalten korrespondierender Ansätze in den
unterschiedlichen Zellen, so fällt auf, dass sich die Luziferaseaktivität von pAD-HVS1 alleine,
als auch in Kotransfektion mit dem ebenfalls auf tTS ansprechenden Plasmid pWHE-flp nur
in 293Cre-tTS SP4 reprimieren ließt. 293Cre, die keinen Transsilencer exprimieren, zeigten
im reprimierten wie im dereprimierten Zustand in etwa gleiche Aktivität (pAD-HVS1,
+ pWHE-flp). Eine von Tetrazyklin unabhängige, CMV-getriebene Überexpression der FlpRekombinase führte in beiden Zelltypen zu einer Aktivität der Luziferase, die auch durch den
Transsilencer in 293Cre-tTS im reprimierten Zustand nicht kompensiert werden konnte
(+ CMV-flp). Umgekehrt resultierte die Tetrazyklin-unabhängige Überexpression des
Transsilencers in beiden Zelltypen in einer auf einen basalen Level reduzierten
Luziferaseexpression, die auch durch Zugabe des Induktors nicht aufgehoben werden
konnte (+ CMV-tTS). In der Kontrolle (pSTK68) war keine Luziferaseaktivität messbar.
23
Ergebnisse
Abb. 16, Luziferaseexpression von pAD-HVS1. Im Anschluss an die Kotransfektion von pAD-HVS1
mit verschiedenen weiteren Plasmiden in 293Cre- und 293Cre-tTS SP4-Zellen, erfolgte die Lyse der
Zellen und die Quantifizierung der Luziferaseaktivität. In der linken Grafik sind die Daten aus
Transfektionen in 293Cre, in der rechten Grafik jene aus Transfektion in 293Cre-tTS SP4 dargestellt.
Als Negativkontrolle wurde pSTK68 mitgeführt.
5.3. Transgenexpression der Verpackungszelllinie 293Cre-tTS SP4
Nach drei Monaten kontinuierlicher Kultur wurde eine erneute Analyse der Transkription des
Transsilencers in der Verpackungszelllinie durchgeführt, da diese für eine erfolgreiche
Generation rekombinanter AD-HVS-Hybride unabdingbar ist. Dabei wurde der mRNA-Status
der Cre-Rekombinase und TetR(sB)-KRAB in 293Cre und 293Cre-tTS SP4 überprüft. Als
Negativkontrolle diente RNA aus HEK293-Zellen. Zur Kontrolle der reversen Transkription
wurde eine PCR auf GAPDH durchgeführt. In 293-Zellen war lediglich das spezifische
Produkt der GAPDH-PCR zu erkennen. 293Cre-Zellen zeigten ein Signal im Bezug auf
GAPDH und Cre. 293Cre-tTS-Zellen zeigten hinsichtlich aller untersuchten mRNAs ein
spezifisches Produkt. Signale waren nur in solchen Ansätzen vorhanden, in denen die
Reverse Transkriptase eingesetzt wurde; somit sind die Signale nicht auf kontaminierende
genomische DNA zurückzuführen, welche an sich nicht unterscheidbar wäre, da die
Transgene keine Introns enthalten. Sämtliche Negativkontrollen, in denen die cDNA durch
Wasser substituiert wurde, waren negativ.
Abb. 17, Transgenexpression von HEK293, 293Cre und 293Cre-tTS SP4. Mittels RT-PCR wurde
die Expression der Transgene Cre und TetR(sB)-KRAB (tTS) nach kontinuierlicher Kultur in
Selektionsmedium über drei Monate untersucht. Als interne Kontrolle diente GAPDH. Der Status der
Reversen Transkriptase in den RT-PCR-Ansätzen ist durch +/- gekennzeichnet.
24
Ergebnisse
6. Herstellung und Aufreinigung rekombinanter AD-HVS-Partikel
Nach Transfektion und anschließender Mehrfachpassage der unterschiedlichen pAD-HVS
Hybridvirus-Konstrukte
in
den
Verpackungszelllinien
293Cre
und
293Cre-tTS
bei
gleichzeitiger Überinfektion mit Helfervirus H14 wurden die Partikel nach Lyse der Zellen in
einem CsCl-Gradient ihrer Dichte folgend separiert. Dabei traten nicht wie erwartet lediglich
zwei, sondern bis zu sechs teilweise in großer Nähe zueinander befindliche Banden auf.
Daher konnte nicht jede der Banden separat aus dem Zentrifugenröhrchen abgezogen
werden. Teilweise sind bis zu zwei Banden in einer Fraktion (F) zusammengefasst.
Fraktionen
mit
niedriger
Nummer
befanden
sich
im
unteren
Bereich
des
Zentrifugenröhrchens.
Vektor
Zelltyp
AD-HVS6
293Cre
AD-HVS1
293Cre
AD-HVS6
293Cre-tTS
AD-HVS4
293Cre-tTS
AD-HVS1
293Cre-tTS
Fraktion
1
2
3
1
2
3
4
1
2
1
2
1
2
3
4
Banden
1.
2.
3. + 4.
1. + 2.
3. + 4.
5.
6.
1. + 2.
3. + 4.
1. + 2.
3. + 4.
1. + 2.
3.
4.
5.
Abb. 18, Viruspartikel nach Aufreinigung im CsCl-Gradient. Aus verschiedenen Präparationen
hervorgegangene Viruspartikel wurden über CsCl-Gradienten ihrer Dichte folgend separiert.
Beispielhaft ist hier die Aufreinigung von AD-HVS1 aus 293Cre-tTS-Zellen dargestellt. Die dabei
entstandenen Banden sind durch Pfeile gekennzeichnet. Die dabei gewonnenen Fraktionen und die in
ihnen enthaltenen Banden sind in der Tabelle zusammengefasst.
7. Analyse viraler Nukleinsäuren
Zur Überprüfung der in den Virionen befindlichen DNA wurden PCR-Reaktionen auf
verschiedene
Zielsequenzen
durchgeführt.
Dabei
wurden
Bereiche
des
offenen
Leserahmens 73 von HVS (ORF73), des Switch-Proteins (Switch), des ZeocinResistenzgens (Zeocin), sowie des Gens der Luziferase (Luci) amplifiziert. Diese liegen
innerhalb der herpesviralen Replikon-DNA. SV40pA befindet sich unmittelbar hinter dem
Gen der Flp-Rekombinase und somit im Bereich außerhalb des Replikons. AD H14 diente
dem spezifischen Nachweis von Sequenzen des Helfervirus. Dieser Vergleich zwischen den
beiden Verpackungszelllinien offenbarte deutlich mehr spezifische Produkte in den
Fraktionen, die in 293Cre-tTS Zellen propagiert wurden. Neben den Signalen für H14 in den
Fraktionen 2 und 3 des Vektors AD-HVS6 und Fraktion 1 des Vektors AD-HVS1 aus 293Cre
25
Ergebnisse
sowie der Signale in der SV40pA-PCR in den Fraktionen 2 und 3 von AD-HVS6 waren keine
spezifischen Produkte aus den Motiven hervorgegangen, insbesondere nicht derjenigen, die
sich innerhalb des HVS-Replikons befinden. Im Unterschied dazu zeigten die Fraktionen 1
der Vektoren AD-HVS6, 4 und 1 aus 293Cre-tTS in sämtlichen Reaktionen ein spezifisches
Produkt. Das fehlende Signal in der Switch-PCR in AD-HVS1 aus 293Cre-tTS ist durch das
nichtvorhandene Motiv in diesem Konstrukt zu erklären. Für die weiteren Versuche wurden
jeweils die Fraktionen der Partikel, die in 293Cre-tTS propagiert wurden, herangezogen.
Ebenfalls war ersichtlich, dass besonders in den Fraktionen, die konsistent ein Signal in den
für AD-HVS-Hybride spezifischen PCR-Reaktionen lieferten (F1 aus AD-HVS6, 4, 1), auch in
der für das Helfervirus spezifischen PCR sehr starke Signale zeigten (Abb. 19A).
Durch analoge PCR-Reaktionen unter Verwendung von Matrizen-DNA des Helfervirus
erfolgte der Ausschluss, dass die Produkte auch auf Basis nur dieser DNA entstehen können
und damit unspezifisch für die rekombinanten Viren sind. Aus Abb. 19B ist ersichtlich, dass
ausgenommen der H14-spezifischen Reaktion sämtliche Proben der DNA des Helfervirus
negativ auf die getesteten Motive waren. Dieses Ergebnis lässt eine qualitative Aussage auf
das Vorhandensein rekombinanter Partikel in einigen der gewonnenen Fraktionen zu.
Abb. 19, Nachweis verschiedener Motive
im Genom rekombinanter Viren sowie des
Helfervirus. Mittels PCR wurde der
Nachweis verschiedener Motive innerhalb der
DNA
verschiedener
Adenovirus-HVSHybridvektoren
die
in
den
Verpackungszelllinien 293Cre und 293CretTS propagiert wurden, untersucht. Am
rechten Rand ist die jeweilige Zielsequenz für
die PCR verzeichnet (A).
PCR mit den am unteren Rand angegebenen
Zielsequenzen wurden durchgeführt. Als
Probe
fungierten
mittels
K-Lyse
aufgeschlossene Virionen des Helfervirus
H14 (B). Als Positivkontrollen (Positiv)
dienten Plasmide, die das jeweilige Motiv
tragen. In den Negativkontrollen wurde das
Probenmaterial durch Wasser substituiert
(H2O). M = Größenstandard (bp).
26
Ergebnisse
8. Funktionsanalyse viraler Partikel
8.1. Infektion und homologe Rekombination an FRT-Sequenzen
Die residuale Kontamination mit E1-deletierten H14 Helfervirus wurde für die weiteren
Versuche als unkritisch eingestuft, da dieses in den eingesetzten Zelllinien minder
replikationsfähig ist. Zur Überprüfung der Infektiösität und der Fähigkeit, innerhalb der
Zielzellpopulation die homologe Rekombination an den FRT-Sequenzen zu vollziehen und
damit die Freisetzung des HVS-Replikons zu gewährleisten, wurden humane Vorhaut
Fibroblasten (human foreskin fibroblasts, HFF), humane Lungenkarzinomzellen (A549),
humane Epithelzellen eines Zervixkarzinoms (HeLa) und Nierenepithelzellen (Vero) der
Grünen Meerkatze (Cercopithecus aethiops) mit den verschiedenen Fraktionen der Viren
versetzt und die Luziferaseaktivität 48 Stunden nach Infektion ermittelt. In allen getesteten
Zelltypen konnte eine Aktivität der Luziferase in der jeweils ersten Fraktion (F1)
nachgewiesen werden. AD-HVS1 zeigte in den HFF, HeLa und Vero-Zellen die größte
Luziferaseaktivität. AD-HVS4 liegt in diesen Zellen unterhalb AD-HVS1, hatte jedoch in
A549-Zellen die maximale Aktivität. Der Vektor AD-HVS6 scheint in allen Zellen am
wenigsten effizient zu agieren. Die Partikel in den Fraktionen, die den weiter oben
befindlichen Banden des Gradienten entstammten, zeigten allesamt eine nicht messbare
Aktivität der Luziferase.
Abb. 20, Exzision und Zirkularisierung der Konstrukte AD-HVS1, 4 und 6. Zwei Tage nach
Infektion mit Viren aus den Fraktionen F1 bis F4 von AD-HVS1, als auch F1 und F2 von AD-HVS4
und 6 (vgl. Abb. 18) wurde die Luziferaseaktivität in den Lysaten als Maß der homologen
Rekombination an den FRT-Erkennungsstellen quantifiziert.
27
Ergebnisse
8.2. Expression der Transgene orf73/LANA und switch nach Infektion
Die Analyse der Transgenexpression erfolgte auf Basis der bereits im vorigen Experiment
verwendeten infizierten Zellen, die jedoch für den Proteinnachweis in RIPA-Puffer lysiert
wurden. ORF73/LANA steht unter Kontrolle des konstitutiv aktiven PGK-Promotors. Folglich
ist der Status an RU486 in diesem Zusammenhang irrelevant. Da dieselben Lysate jedoch
ebenfalls dem Antikörpernachweis von p65 im unindizierten wie induzierten Zustand
zugeführt wurden, sind sämtliche Lysate auch in diesem Zusammenhang getestet worden.
HVS ORF73 ist in den Lysaten von Vero- und A549-Zellen, die mit der jeweiligen Fraktion 1
der Vektoren AD-HVS1 und 4 infiziert wurden, am deutlichsten nachweisbar. Schwache
Banden zeigten sich sowohl in den Lysaten von Vero-Zellen, infiziert mit Fraktion 2 von
AD-HVS4 als auch in A549-Zellen, infiziert mit Fraktion 2 von AD-HVS1. Uninfizierte Zellen
zeigten keine Signale (Abb. 21B).
In Analogie erfolgte der Nachweis der p65-Untereinheit von NF-κB. Dieses Peptid existiert
sowohl innerhalb des endogenen NF-κB, als auch innerhalb des synthetischen
Transaktivatorproteins Switch. Eine Differenzierung der verschiedenen Proteine ist aufgrund
der unterschiedlichen Molekülmassen möglich. Endogenes NF-κB stellt sich als spezifische
Bande bei ~ 65 kDa dar, das Switch-Protein also solche von ~ 73 kDa. In Vero-Zellen war
lediglich in den mit F1 von AD-HVS4 und 1 der Nachweis des zellulären NF-κB möglich, so
dass in den übrigen Proben der Verlust der Zellen angenommen werden muss. Banden, die
dem Switch-Protein entsprechen, waren hier in den mit F1 von AD-HVS4 infizierten Zellen
sichtbar. Der Einfluss von RU486 war nicht ersichtlich. Uninfizierte Zellen (ui) zeigten
kleinerlei Signale (Abb. 21A). In sämtlichen Lysaten der A549-Zellen konnte das zelluläre
NF-κB nachgewiesen werden. Das Switch-Protein konnte in Analogie zu den Vero-Zellen
ebenfalls nur in den Lysaten der mit F1 von AD-HVS4 infizierten Proben sichtbar gemacht
werden. Ein Unterschied zwischen uninduziertem und induziertem Zustand war auch hier
nicht zu erkennen (Abb. 21A).
28
Ergebnisse
Abb. 21, Nachweis von ORF73 und Switch-Protein in den Lysaten infizierter Vero- und A549Zellen. 48 Stunden nach Infektion wurden die Zellen lysiert und mittels Westerblot-Analysen auf die
Expression des ORF73- und des Switch-Proteins im induzierten wie uninduzierten Zustand
untersucht.
8.3. Induzierbare Expression additiver Transgene nach Infektion
Weiterhin wurde die Induzierbarkeit der unter Kontrolle des GeneSwitchTM-Systems
stehenden Zytokine IL-1RA und IL-10 nach Infektion von HFF-, A549-, HeLa- und VeroZellen mit den jeweiligen Fraktionen 1 und 2 der Vektoren AD-HVS4 und 6 untersucht. Außer
in HeLa-Zellen konnte die Expression von IL-1RA und IL-10 in den mit F1 beider Vektoren
transduzierten Zellen im induzierten Zustand nachgewiesen werden. Sowohl in den Lysaten
uninduzierter, mit F1 und F2 beider Vektoren infizierter Zellen als auch in den Lysaten
uninfizierter Kontrollzellen konnte, abgesehen von einer Restaktivität im uninduzierten
Zustand in A549-Zellen, keine Transgenexpression detektiert werden.
29
Ergebnisse
Abb. 22, Induzierbare Zytokinexpression nach Infektion mit AD-HVS4 und 6. Drei Tage nach
Infektion und zwei Tage nach Induktion des GeneSwitchTM-Systems wurden die Konzentrationen von
IL-1RA sowie IL-10 in den Kulturüberständen infizierter Zellen ermittelt. Als Kontrolle dienten
Kulturüberstände uninfizierter Zellen. Der Status des Induktors Mifepriston (RU486) ist mit +/gekennzeichnet. (A) Expression von IL-1RA nach Infektion mit AD-HVS4. (B) IL-10-Expression nach
Infektion mit AD-HVS6.
30
Diskussion
V. Diskussion
Die zukünftige Entwicklung der Gentherapie als alternative Behandlungsmethode ist
maßgeblich von der Qualität der zur Anwendung kommenden Vektoren abhängig. Obwohl
seit Beginn der gentherapeutischen Forschung deutliche Fortschritte in der Entwicklung
viraler Vektoren zu verzeichnen sind, ist es bisher nicht gelungen, folgende Kriterien
funktionell auf einen idealen Gentherapievektor zu vereinen:
1) zügige und reproduzierbare Herstellung
2) breites Zielzellspektrum
3) hohe Partikelkonzentration
4) umgehen einer Immunantwort
5) große Kapazität zur Aufnahme therapeutisch relevanter Expressionskassetten
6) nachhaltiger Verbleib in der Zielzellpopulation
7) regulierbare Expression therapeutisch wirksamer Gene
Auch die in dieser Arbeit entwickelten Hybridvektoren aus
Herpesvirus saimiri und
Adenovirus Typ 5 erfüllen noch nicht sämtliche Anforderungen an einen idealen Vektor. Sie
zeigen aber, wie durch geschickte Kombination spezifischer Eigenschaften verschiedener
Viren eine Annäherung stattfinden kann. Einmal auf DNA-Ebene konstruiert, lässt sich ein
definiertes Konstrukt durch Passage in einer geeigneten Verpackungszelllinie wiederholt
generieren. Der Einsatz adenoviraler Partikel gewährleistet ein breites Zielzellspektrum und
bietet die Möglichkeit, sehr hochtitrige Viruspräparationen zu erreichen (Mitani et al., 1995).
Eine bis auf ein Minimum reduzierte Immunantwort resultiert dabei aus dem Ausschluss
sämtlicher adenoviraler Gene (Morral et al., 1998; Morsy et al., 1998; Schiedner et al., 1998),
was sich ebenfalls in der beachtlichen Klonierungskapazität von bis zu 36 kb derartiger
Vektorsysteme niederschlägt (Parks et al., 1996; Volpers und Kochanek, 2004). Die
Etablierung einer latenten Infektion soll in dem vorliegenden System auf den episomalen
Persistenzmechanismen von Herpesvirus saimiri beruhen. Im Bezug auf die hierfür
essentiellen Genprodukte gibt es zahlreiche Vorergebnisse. Dabei wird dem KSHV-Homolog
ORF73/LANA von HVS eine zentrale Rolle bei der Assoziation von episomaler Virus-DNA an
mitotische Chromosomen zugeschrieben, was den Erhalt viraler Genome über die Zellteilung
hinaus garantiert (Calderwood et al., 2005; Calderwood et al., 2004a). Die Bindungsstelle
innerhalb der Episomen scheint in den sich wiederholenden Sequenzen der H-DNA
lokalisiert zu sein (Collins et al., 2002; White et al., 2003). Der Ursprung der Replikation
viraler DNA unter einer latenten Infektion (oriP) liegt im Fall von HVS möglicherweise
ebenfalls im Bereich der H-DNA. Dafür spräche die homologe Situation bei KSHV. Hier ist
die
Interaktion
zwischen
KSHV/LANA
und
bestimmten
Sequenzen
innerhalb
der
endständigen Wiederholungen (terminal repeats, TR) für den Erhalt der Episomen über die
31
Diskussion
Zellteilung hinweg und für die effiziente Segregation auf die Tochterzellen unabdingbar
(Ballestas und Kaye, 2001; Hu und Renne, 2005). Alternativ denkbar wären auch AT-reiche
repetitive Sequenzen, die zwischen den offenen Leserahmen 70 und 71 lokalisiert sind, und
einem Replikationsursprung während der lytischen Phase von HVS entsprechen. Prinzipiell
kommt dieser Bereich auch als Ursprung der Replikation während der Latenz in Frage
(Schofield, 1994)). Auf Basis dieser Arbeiten wurden als Persistenzmediatoren das KSHVHomolog ORF73/LANA von HVS unter Kontrolle des Phosphoglyceratkinase (PGK)Promotors, drei Wiederholungen der H-DNA, sowie der zwischen orf70 und orf71 lokalisierte
Sequenzabschnitt ausgewählt. Das effiziente Tet-ON-System diente der Minimierung
unerwünschter
flp-Expression
während
der
Verpackung.
Die
gezielte
Expression
therapeutisch wirksamer Gene sollte durch Einsatz des konditionalen GeneSwitchTMSystems, welches sich sowohl im adenoviralen Kontext (Burcin et al., 1999), als auch unter
Verwendung Herpesvirus saimiri-basierter Vektoren (Wieser et al., 2005) bereits als
funktionell erwiesen hat, realisiert werden. Als künftiges Modellsystem einer potentiellen
Anwendung der vorgestellten Vektoren soll die Rheumatoide Arthritis (RA) dienen, deren
Pathogenese im wesentlichen durch die Invasion und Destruktion artikulären Knorpels durch
die
Expression
von
Matrixmetalloproteasen
(MMP)
durch
synoviale
Fibroblasten
gekennzeichnet ist (Feldmann et al., 1996; Gay et al., 1993). Dabei wurden die
antiinflammatorisch/antirheumatisch aktiven Zytokine IL-10 und IL-1RA ausgewählt, die den
Krankeitsverlauf
positiv
beeinflussen.
Prinzipiell
konnte
dieser
Effekt
bereits
in
verschiedenen in vitro- und Tiermodellen nachgewiesen werden (Müller-Ladner et al., 1997;
Müller-Ladner und Gay, 1999; Whalen et al., 1999; Wieser et al., 2005). Basierend auf dem
modifizierten Genom eines gutless Adenovirus wurden verschiedene rekombinante
Hybridkonstrukte gefertigt. Vor deren endgültiger Fertigstellung musste ein zentrales
Intermediat (pIRES-BleoFRT-invCMV) auf seine Funktion hin untersucht werden. Dabei
stellte sich heraus, dass ein um ca. ein Drittel verkürzter CMV immediate early Promotor
weiterhin Aktivität aufweist, was die Funktionalität innerhalb der Konstrukte gewährleisten
sollte (Abb. 6 und 7). Nach Fertigstellung der Konstrukte auf DNA-Ebene wurden diese durch
Testverdau und Polymerasekettenreaktion auf ihre Korrektheit überprüft. Dabei konnte in
allen Konstrukten eine Übereinstimmung mit dem vorhergesagten Bandenmuster gezeigt
werden, welches mittels der für die Versuchsplanung verwendeten Software Vector NTI
AdvanceTM 9.1 errechnet wurde (Abb. 8). Durch die Polymerasekettenreaktion wurde das
Vorhandensein verschiedener Motive innerhalb der rekombinanten Nukleinsäuren bestätigt
(Abb. 9). Beide Ergebnisse zeigen, dass die Klonierungsarbeiten ohne erkennbare Fehler
durchgeführt wurden.
Anschließend wurden verschiedene Versuche zur Analyse zentraler Funktionen der
Konstrukte durchgeführt: Expression von ORF73/LANA, Expression von Switch im
32
Diskussion
induzierten Zustand, homologe Rekombination an den FRT-Sequenzen und konditionale
Expression therapeutischer Gene.
Dazu wurden die rekombinanten Nukleinsäuren (in zirkulärer Form) in sämtlichen Ansätzen
in 293Cre-Zellen transfiziert und je nach Analyseverfahren zu variablen Zeitpunkten in
unterschiedlichen Puffern lysiert bzw. Kulturüberstände entnommen. Die Expression von
ORF73/LANA durch die Konstrukte pAD-HVS1, 2 und 3 konnte mittels Westernblot elf Tage
nach Transfektion nachgewiesen werden. pAD-HVS4, 5 und 6 sind diesbezüglich negativ.
(Abb. 10B).
Da ORF73/LANA in Verbindung mit repetitiven H-DNA-Sequenzen den Erhalt und die
Segregation episomaler HVS-Genome zu vermitteln scheint (Calderwood et al., 2004b;
Collins et al., 2002; Verma und Robertson, 2003), wurde in diesem Zusammenhang die
Fähigkeit eines HVS-Replikons innerhalb einer Zellpopulation persistieren zu können
untersucht (Abb. 14). Am fünften Tag nach Transfektion von pAD-HVS1 in 293T-Zellen
wurde ein Maximum der Luziferaseaktivität, induziert durch homologe Rekombination an
FRT-Sequenzen, erreicht. Bereits am 12. Tag nach Transfektion hatte die Aktivität wieder
deutlich abgenommen, blieb jedoch bis zum 16. Tag (Ende der Messung) auf gleichem
Niveau. Ähnliche Ergebnisse wurden auch für Plasmide gezeigt, die oriP von EBV
beinhalten. In verschiedenen humanen Zellen, sowohl in Abwesenheit von EBNA-1, als auch
in Zellen, die dieses Protein in trans zur Verfügung stellen, wurde ein Verlust der Plasmide
bei einem Großteil der Zellen in einem Zeitraum von rund zwei Wochen nachgewiesen. Der
Verbleib der Plasmide in der Minorität der Zellen wurde in Zusammenhang mit sporadisch
auftretenden epigenetischen Phänomenen gebracht (Leight und Sugden, 2001). Für eine
präzise Beurteilung, ob die Aktivität der Luziferase in etwa auf dem zuletzt gemessenen
Niveau stagniert, oder aber mit zunehmender Dauer und inkrementierender Anzahl an
Zellteilungen gegen Null strebt, hätte der Versuch über einen größeren Zeitraum fortdauern
müssen. Da ebenfalls unbekannt ist, auf welchen Mechanismen die Abnahme der
Expression beruht, gibt dieser Versuch nur bedingt Auskunft über den Verbleib des
herpesviralen Replikons innerhalb der Zellpopulation. Denkbar ist eine fortschreitende
Verringerung der Kopienzahl nach der Transfektion oder zelluläre Mechanismen der
Herabregulierung des CMVie-Promotors. Weiterhin könnte aus der Transfektion ein
Wachstumsnachteil transfizierter Zellen im Vergleich zu untransfizierten Zellen entstehen, so
dass sich die Anzahl der Zellen, die das Replikon tragen, mit zunehmender Dauer verringert.
Um diesen Punkt intensiver zu beleuchten, würde sich die direkte Quantifizierung der
Kopienzahl viraler DNA mittels quantitativer Realtime PCR anbieten, was in zukünftigen
Arbeiten durchgeführt werden soll.
Die Expression des Switch-Proteins in Anwesenheit des Induktors durch pAD-HVS4, 5 und 6
konnte nach Transfektion in 293Cre-Zellen ebenfalls gezeigt werden (Abb. 10A).
33
Diskussion
Dieser Befund äußert sich auch in der konditionalen Expression zusätzlicher Zytokine,
ausgehend von den Konstrukten pAD-HVS4, 5, 6, 8 und 9, durch das GeneSwitchTM-System
(Abb. 13). Alle Plasmide, die die Komponenten dieses Systems tragen, zeigten in
Anwesenheit des Induktors gesteigerte Konzentrationen an IL-10 bzw. IL-1RA. In
nichtinduzierten Proben waren diese Zytokine mittels ELISA in keinem Fall nachweisbar.
Eine Ausnahme sind diesbezüglich Kulturüberstände von Zellen die mit pAD-HVS10
transfiziert wurden.
Die Analyse der Flp-vermittelten homologen Rekombination an den FRT-Sequenzen erfolgte
je nach Beschaffenheit der Konstrukte durch Nachweis der Zytokine IL-10 oder IL-1RA bzw.
der Luziferaseaktivität. Dabei konnte den Konstrukten eine im Vergleich zur jeweiligen
Kontrolle gesteigerte Aktivität bzw. Konzentration des nachzuweisenden Proteins zugeordnet
werden (Abb. 11 und 12). Dies ist ein Beleg des funktionalen Zusammenspiels zwischen der
Flp-Rekombinase und deren in cis lokalisierten Zielsequenzen, das zur Freisetzung des
HVS-Replikons innerhalb der Zielzelle notwendig ist.
Die in der Zielzelle erwünschte Exzision des HVS-Replikons muss dagegen innerhalb der
Verpackungszelllinie unterdrückt werden, um einen vorzeitigen Verlust des Replikons
während der Herstellung rekombinanter Viruspartikel zu vermeiden. Die spezifische
Besonderheit des hier vorliegenden Systems, sowohl eine Rekombinase, als auch deren
Erkennungssequenzen auf demselben Molekül zu vereinen, machte die Neuentwicklung
einer spezialisierten Verpackungszelllinie notwendig. 293Cre-Zellen wurden stabil mit dem
Gen des Transsilencers TetR(sB)-KRAB transfiziert, um die Expression der FlpRekombinase durch Bindung an die dem flp-Gen vorgelagerten tet-Operator-Sequenzen zu
reprimieren. Diese Funktion wurde durch transiente Transfektion des Plasmids pWHE281
überprüft. pWHE281 trägt dieselben regulativen Elemente des Tet-ON-Systems wie die
Expressionskassette der Flp-Rekombinase innerhalb der pAD-HVS-Konstrukte, verfügt aber
in homologer Position über das Luziferase-Gen.
In einer Mischpopulation von 293Cre-tTS-Zellen wurde ein Repressionsfaktor (RF;
dereprimiert/reprimiert) von 8,8 ermittelt. Derivate dieser Mischpopulation, die aus
Einzelzellklonierungen hervorgegangen sind und als Subpopulationen bezeichnet werden,
zeigten in analogen Versuchen einen bis zu 400 gesteigerten RF. Dieser Effekt ist auf eine
im Vergleich zur Situation in der Mischpopulation reduzierte Basalaktivität zurückzuführen
und beruht wahrscheinlich auf der Integration des Transgens in einer Region mit geringerer
basaler Transkriptionsaktivität (Abb. 15). Aufgrund eines hohen Repressionsfaktors in
Verbindung mit guten Wachstumseigenschaften wurde die Subpopulation 4 für alle weiteren
Versuche ausgewählt.
Im Unterschied zu der Zelllinie 293Cre wird die Aktivität der Luziferase ausgehend von
pAD-HVS1 in 293Cre-tTS SP4 wegen des zellulär exprimierten Transsilencers auf das
34
Diskussion
basale Niveau (+ CMV-tTS) minimiert. Dies gilt ebenfalls in der Situation, in der ein zweites,
auf
TetR(sB)-KRAB
und
Tetrazyklin
ansprechendes
Plasmid
kotransfiziert
wurde
(+ pWHE-flp). Durch Zugabe von Tetrazyklin kann das System innerhalb der 293Cre-tTSZellen dereprimiert werden. Anhand dieser Probe im Vergleich zur singulären Transfektion
von pAD-HVS1 ist ebenfalls ersichtlich, dass die homologe Rekombination an den FRTSequenzen in Abhängigkeit zu der Konzentration der Flp-Rekombinase zu stehen scheint,
denn die Expression der Rekombinase, ausgehend von pAD-HVS1 und pWHE-flp, resultiert
in einer gesteigerten Luziferaseaktivität (Abb. 16). Auch nach mehrmonatiger Passage
konnte die Transkription der jeweiligen Transgene cre und tTS innerhalb der Zelllinien
293Cre und 293Cre-tTS nachgewiesen werden (Abb. 17). Zusammenfassend kann
festgehalten werden, dass nur 293Cre-tTS-Zellen in der Lage sind, die Expression der FlpRekombinase in den notwendigen Grenzen zu kontrollieren. Mit dieser Eigenschaft könnte
diese
eigens
hergestellte
Verpackungszelllinie
hinsichtlich
der
hier
verwendeten
rekombinanten Konstrukte im Vergleich zu 293Cre einen erheblichen Vorteil bieten .
Die Aufreinigung der in den Verpackungszelllinien 293Cre und 293Cre-tTS propagierten
Virionen durch Zentrifugation im Cäsiumchlorid-Gradienten resultierte regelmäßig in der
Konzentration mehrerer Banden (Abb. 18), wobei sich die Definition der Bestandteile
schwierig gestaltete. Prinzipiell ist nicht auszuschließen, dass die homologe Rekombination
an den FRT-Sequenzen nicht vollständig unterdrückt werden konnte und es partiell zur
Exzision von HVS-Replikons gekommen ist. Die verbleibenden Fragmente mit weniger als
20 kb sollten jedoch aufgrund mangelnder Größe nur sehr ineffizient, oder aber nach
massiven Um- und Anlagerungsprozessen in virale Kapside verpackt werden (Parks und
Graham,
1997).
Auch
liegt
es
im
Bereich
des
Möglichen,
dass
während
der
Verpackungsphase weitere, nicht näher charakterisierbare Rekombinationsereignisse
stattgefunden haben, die dazu führten, dass Nukleinsäuren unterschiedlicher Größe in die
viralen Partikel gelangen konnten. Prinzipiell ist auch denkbar, dass sowohl Helfervirus-DNA
mit erfolgreich eliminiertem, aber auch solche mit verbleibendem Verpackungssignal mit
gewisser Wahrscheinlichkeit verpackt wurden und in Form unterschiedlicher Virusbanden in
der Präparation auftreten (Ng et al., 2002). Natürlich können auch zelluläre Fragmente mit
etwa gleicher Dichte als sichtbare Banden in einer solchen Präparation auftreten.
Die Analyse der erhaltenen Fraktionen mittels PCR lässt den Schluss zu, dass die Banden
teilweise virale Partikel enthalten und dass die Verpackung regulärer rekombinanter
Nukleinsäuren durch 293Cre-tTS-Zellen sehr viel effizienter ist als jene durch 293Cre. PCRReaktionen mit Zielsequenzen innerhalb der HVS-Replikons lieferten in den Präparationen
aus 293Cre-Zellen in keinem Fall spezifische Signale. Unter Berücksichtigung der Tatsache,
dass das außerhalb des Replikons lokalisierte Motiv SV40pA in zweier der Fraktionen von
AD-HVS6 nachgewiesen werden konnte, ist davon auszugehen, dass die Assemblierung von
35
Diskussion
Virionen in diesen Zellen stattgefunden hat, das Replikon jedoch vor der Verpackung aus
dem viralen Hintergrund exzidiert wurde. Dieses Ergebnis lässt ebenfalls auf eine etwaige
Kreuzkontamination der Banden schließen und zeigt, dass durch den angewandten
Gradienten keine saubere Trennung viraler Partikel zu erzielen ist (Abb. 19). Im Gegensatz
dazu sind die untersten Fraktionen des Gradienten aus 293Cre-tTS SP4 bezüglich
sämtlicher untersuchter Motive innerhalb der rekombinanten DNA positiv. Speziell in diesen
Fraktionen ist auch eine Kontamination mit Helfervirus zu verzeichnen (Abb. 19A). Es liegt im
Bereich des Möglichen, dass das Helfervirus eine ähnliche Dichte wie die rekombinanten
Vektoren aufweist und daher die Trennung durch Zentrifugation im CäsiumchloridGradienten mangelhaft ist. Falls dies zutrifft, könnte durch Reduktion der Stuffer-DNA in den
rekombinanten Nukleinsäuren eine größere Differenz in der Dichte und damit eine
verbesserte Trennung der unterschiedlichen Virionen realisiert werden. Durch das Ergebnis
der in Abb. 19B dargestellten PCR-Reaktionen konnte ausgeschlossen werden, dass
spezifische Produkte der Zielsequenzen rekombinanter Nukleinsäuren auch auf Basis der
DNA des Helfervirus amplifiziert werden können. Diese Ergebnisse können als Indiz für die
erfolgreiche Produktion rekombinanter Hybridvektoren gelten.
Die funktionelle Analyse der hergestellten Vektoren erfolgte durch die analogen
Experimente, die bereits auf die rekombinanten Nukleinsäuren angewandt wurden (Abb. 10,
11, 12, 13), wobei das Spektrum der eingesetzten Zellen erweitert wurde. Sowohl humane
Fibroblasten (HFF), epitheliale Zellen verschiedener Karzinome (HeLa, A549), als auch
Nierenepithelzellen der Grünen Meerkatze (Vero) scheinen durch die entwickelten Vektoren
infizierbar zu sein (Abb. 20). Indizien für den korrekt ablaufenden Mechanismus der
homologen Rekombination an den FRT-Sequenzen liefern die in Abb. 20 dargestellten
Ergebnisse. Im Gegensatz zu den Lysaten uninfizierter Zellen, zeigen sämtliche Lysate der
Zellen,
die
mit
den
jeweiligen
F1
aller
Vektoren
infiziert
wurden,
gesteigerte
Luziferaseaktivitäten.
Ähnliches gilt für die konditionale Expression der Zytokine IL-1RA durch AD-HVS4 (Abb.
22A) und IL-10 durch AD-HVS6 (Abb. 22B). In allen getesteten Zellen, außer in HeLa,
erfolgte die Expression des entsprechenden Zytokins in Anwesenheit des Induktors nach
Infektion mit den jeweiligen Fraktionen 1 der Vektoren. Über den Grund des negativen
Ergebnisses innerhalb der HeLa Zellen kann nur spekuliert werden. Mangelnde
Infizierbarkeit ist angesichts des in Abb. 20 dargestellten Ergebnisses wahrscheinlich
auszuschließen. Eine mangelnde Aktivität des GeneSwitchTM-Systems unter Verwendung
des Promotors des offenen Leserahmens 14 von HVS, der in beiden Vektoren eingesetzt
wurde, kann hingegen in Betracht kommen. Um dies zu überprüfen, wäre es möglich, HeLaZellen mit dem Vektor AD-HVS9 zu infizieren. Hier erfolgt die konditionale Expression von
humanem IL-10 unter Einfluss des EF1a-Promotors.
36
Diskussion
Der Nachweis der Transgenexpression von ORF73/LANA als auch jene des Switch-Proteins
durch Westernblot-Analysen stellt sich, wie schon nach transienter Transfektion in 293CreZellen, auch in der Analyse infizierter Zellen als nicht unproblematisch dar. Der Nachweis
von ORF73/LANA gelang nur in Vero- und in A549-Zellen, die mit den Fraktionen 1 von
AD-HVS4 und 1 infiziert wurden. Das Switch-Protein ist lediglich in den Lysaten mit F1 von
AD-HVS4 infizierter A549-Zellen nachzuweisen, dort jedoch im induzierten wie uninduzierten
Zustand. Lysate, aus mit derselben Probe infizierten Vero-Zellen, zeigen ein Signal im
uninduzierten Zustand, wobei auch das zelluläre p65 nicht in allen Proben nachzuweisen ist.
Dies lässt auf mangelnde Effizenz des Blotvorganges oder aber auf den Verlust der Zellen
im Vorfeld der Analyse schließen (Abb. 21). Vermutlich wird eine gesteigerte Konsistenz
hinsichtlich des Nachweises dieser Transgene durch den Einsatz quantifizierter Virusstocks
zu erzielen sein.
Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass die Fraktionen, welche in den für
AD-HVS-Hybride spezifischen PCR-Reaktionen deutliche Signale liefern (Abb. 19A), auch in
den Funktionsanalysen sehr konsistente Ergebnisse zeigen. In Bezug auf AD-HVS1, 4 und 6
bedeutet dies in erster Linie die Expression der Luziferase nach erfolgter Exzision des HVSReplikons (Abb. 20). Für pAD-HVS4 und 6 konnte darüber hinaus auch die induzierbare
Expression eines in der Therapie der RA einzusetzenden Zytokins (IL-1RA oder IL-10)
nachgewiesen werden (Abb. 22). Bei einer zukünftigen Produktion der Vektoren sollte durch
Anpassung der Protokolle (optimierte CsCl-Gradienten mit höherer Auflösung, Einsatz eines
alternativen Helfervirus, Reduktion der Dichte rekombinanter Partikel) versucht werden, die
verbleibende Helfervirus-Kontamination deutlich zu reduzieren. Zudem ist es ratsam, die
Exzisionseffizienz in Relation zum transduzierten Hybridvektor mit einer zweiten Methode,
z. B. einer (quantitativen) Polymerasekettenreaktion, die den Bereich der homologen
Rekombination überspannt, nachzuweisen. Weiterhin sollte die Fähigkeit zur Etablierung
einer langfristigen Persistenz der freigesetzten HVS-Replikons untersucht werden. In diesem
Zusammenhang
wäre
ebenfalls
eine
Analyse
der
Nachhaltigkeit
bzw.
Induzierbarkeit/Reinduzierbarkeit der Expression Switch-kontrollierter Transgene sinnvoll.
Dies sind nicht zuletzt entscheidende Faktoren bei der Erzeugung eines effizienten
Gentherapievektors.
Die in dieser Arbeit entwickelten Hybridvektoren aus Herpesvirus saimiri und Adenovirus
Typ 5 können in der eigens hergestellten spezifischen Verpackungszelllinie 293Cre-tTS SP4
propagiert und über einen Cäsiumchlorid-Gradienten angereichert werden. Die präparierten
Partikel sind in der Lage, Zellen verschiedener Herkunft zu infizieren. Ein qualitativer
Nachweis für die homologe Rekombination an den Zielsequenzen einer in cis lokalisierten
Rekombinase wurde erfolgreich geführt. Somit stellen die entwickelten Hybridvektoren in
Verbindung mit der spezifischen Verpackungszelllinie das bisher erste auf nur einem
37
Diskussion
Plasmid basierende System dar, welches den Transfer und die Freisetzung der hier
vorgestellten Rhadinovirus-basierten Episomen ermöglicht. Die praktische Bedeutung dieser
Entwicklung für gentherapeutische Anwendungen liegt auch in der hohen Flexibilität, da sie
sich ebenfalls für den Einsatz anderer zirkulärer Replikons eignet. Im Gegensatz zu
Exzisionssystemen, die den parallelen Einsatz mehrerer Vektoren erfordern, bietet dieses
System den Vorteil einer verhältnismäßig einfachen Handhabung und Applikation. Zur
Transduktion der Zielzelle wird lediglich ein einziges Infektionsereignis benötigt.
38
Material und Methoden
VI. Material und Methoden
1. Chemikalien
Stoffbezeichnung
Acrylamid/Bisacrylamid 30 % (37,5:1)
Adenosintriphosphat
Agar
Agarose
Ammoniumpersulfat
Ampicillin
Aprotinin
Bacto-Trypton
BCA Reagenz A / B
Bleomycin
β-Mercaptoethanol
Bromphenolblau
Cäsiumchlorid
Chloroform
Ciprofloxacin
Coomassie-Blau (Serva-Blau G250)
Desoxyribonukleosidtriphosphat (dNTPs)
Dimethylsulfoxid (DMSO)
Dinatriumhydrogenphosphat
Dithiothreitol (DTT)
D-Luziferin
Ethanol
Ethidiumbromid (EtBr)
Ethylendiamin-Tetraessigsäure, EDTA
Fötales Kälberserum (FKS)
Geneticin (G418)
Gentamicin
Glucose
Glycerin
Glycin
Hefeextrakt
Hygromycin B
Isoamylalkohol
Isopropanol
Kaliumacetat
Kaliumchlorid
Kanamycin
Leupeptin
L-Glutamin
Lipofectamine®
Lipofectamine2000®
Lithiumchlorid
Luminol
Magermilchpulver
Magnesiumchlorid
Bezugsquelle
Roth, Karlsruhe
Roche Diagnostics, Mannheim
Invitrogen, Karlsruhe
Invitrogen, Karlsruhe
Serva, Heidelberg
Binotal, Grünenthal, Aachen
Sigma, Taufkirchen
Difco, Detroit, USA
Pierce, Rockford, USA
Calbiochem, La Jolla, USA
Sigma, Taufkirchen
Serva, Heidelberg
Biomol, Hamburg
Merck, Darmstadt
Gerbu Biotechnik, Gaiberg
Serva Heidelberg
Amersham Biosciences, Freiburg
Sigma, Taufkirchen
Merck, Darmstadt
Biomol, Hamburg
Roche Diagnostics, Mannheim
Merck, Darmstadt
Sigma, Taufkirchen
Merck, Darmstadt
Biochrom, Berlin; Cambrex
Invitrogen, Karlsruhe
Serva, Heidelberg
Merck, Darmstadt
Merck, Darmstadt
Serva, Heidelberg
Difco, Detroit
Calbiochem, La Jolla, USA
Merck, Darmstadt
Merck, Darmstadt
Merck, Darmstadt
Fluka, Neu-Ulm
Gerbu Biotechnik, Gaiberg
Sigma, Taufkirchen
Invitrogen, Karlsruhe
Invitrogen, Karlsruhe
Invitrogen, Karlsruhe
Merck, Darmstadt
Sigma, Taufkirchen
Gabler-Saliter, Obergünzburg
Serva, Heidelberg
39
Material und Methoden
Methanol
Mifepriston (RU486)
N,N,N',N' Tetramethylethylendiamin (TEMED)
Natriumacetat
Natriumchlorid
Natriumdeoxycholsäure
Natriumdihydrogenphosphat
Natriumdodecylsulfat (SDS)
Natriumlaurylsarkosin (Sarcosyl)
Nonidet P40
Parahydroxycumarsäure
Phenol, gepuffert
Phenyl-Methyl-Sulfonylfluorid (PMSF)
Polyethylenglycol (PEG)
Salzsäure 37%
Schwefelsäure konz.
Serumalbumin
Tetrazyklin
Trichloressigsäure (TCA)
Tris
Triton X-100
Tween20
Wasserstoffperoxid 30%
Merck, Darmstadt
Sigma, Taufkirchen
Roth, Karlsruhe
Merck, Darmstadt
Merck, Darmstadt
Fluka, Neu-Ulm
Merck, Darmstadt
Serva, Heidelberg
Sigma, Taufkirchen
Calbiochem, La Jolla, USA
Merck, Darmstadt
Biomol, Hamburg
Sigma, Taufkirchen
Sigma, Taufkirchen
Merck, Darmstadt
Merck, Darmstadt
Roche Diagnostics, Mannheim
Serva, Heidelberg
Merck, Darmstadt
Roth, Karlsruhe
Invitrogen, Karlsruhe
Sigma, Taufkirchen
Fluka, Neu-Ulm
2. Puffer und Lösungen
K-Puffer
50 mM KCl, 15 mM Tris, 2,5 mM MgCl2,
0,5% Tween 20, 10 µg/ml Proteinase K
RIPA-Puffer (2x)
50 mM Tris/Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM
EDTA, 1 mM PMSF, 1 % Nonidet P40, 0,5 %
Na-deoxycholat, 0,1 % SDS, 1 µg/ml Leupeptin,
5 µg/ml Aprotinin (frisch zugegeben)
Lyse-Puffer für Luziferase-Assay
62,5 ml 100 mM Tris, pH 7,8, 500 µl 1 M DTT,
0,1723 g DCTA, 2,5 ml Triton X-100, 25 ml
Glycerin, H2O ad 125 ml
Auftragepuffer für Agarosegele
30 % Glycerin, 0,25 % Bromphenolblau,
0,25 % Xylencyanol
Proteinauftragepuffer (2x)
62,5 mM Tris/HCl, pH 6,8, 1 mM EDTA, 10 %
Glycerin, 2% SDS, 5 % β-ME, 0,0005 %
Bromphenolblau
Proteinauftragepuffer (6x)
5 ml 4x Tris-HCl/SDS pH 6,8, 15 ml Glycerin,
5 g SDS, 4,65 g DTT, 6 mg Bromphenolblau,
H2O ad 50 ml
40
Material und Methoden
Laufpuffer (PAGE)
25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1 % SDS
Transferpuffer (Westernblot)
25 mM Tris, 200 mM Glycin, 20 % Methanol
Waschpuffer (Westernblot)
PBS/0,1 % Tween20
Blockierungslösung (Westernblot)
PBS/0,1 % Tween20, 5 % Magermilchpulver
ECL (Lösung A)
0,1 M Tris/HCl, pH 8,6, 0,025 % Luminol
ECL (Lösung B)
0,11 % p-Coumarinsäure in DMSO
Entwicklungslösung
98,9 % ECL-A, 1 % ECL-B, 0,031 % H2O2
Tris-gepufferte Salzlösung (TBE, 10x)
890 mM Tris/HCl, pH 8,0, 890 mM Borsäure,
0,5 mM EDTA
Waschpuffer (ELISA)
0,1 % Tween20 in PBSo
Blockpuffer (ELISA)
2 % FKS, 5 % Saccharose in PBSo
Verdünnungspuffer (ELISA)
0,2 % FKS, 0,1 % Tween20 in PBS
1 M H2SO4
Stoplösung (ELISA)
3
Cäsiumchloridlösung (1,2502 g/cm )
Refraktionsindex 1,3572
(1,3496 g/cm3)
Refraktionsindex 1,3670
(1,450 g/cm3)
Refraktionsindex 1,3764
Dialysepuffer
10
mM
Tris-Cl
pH
7,5,
1
mM
MgCl2,
10 % Glycerin
3. Größenmarker für die Gelelektrophorese
Benchmark Prestained Protein Ladder
Fermentas, St. Leon-Rot
Biotinylierter Proteinmarker
Cell-Signaling, Beverly, USA
GeneRuler™ 1kb DNA Ladder
Fermentas, St. Leon-Rot
4. Eukaryote Zellen und Zelllinien
Bezeichnung
293T
293
293Cre
293Cre-tTS
HeLa
A549
HFF
Vero
Herkunft / Merkmale
Humane embryonale Nierenzelllinie, die durch Adenovirus Typ 5 (Ad5) transformiert
wurde. Neben der Ad5 E1 Region enthalten 293T zusätzlich stabil integriert das
SV40
(Simian
Virus
40)
T-Antigen,
sowie
ein
Gen
für
die
Neomycinphosphotransferase (DuBridge et al., 1987; Pear et al., 1993)
Humane embryonale Nierenzelllinie
Derivat der HEK293. Stabil transfiziert mit der Cre-Rekombinase des
Bakteriophagen P1, Selektion unter 400 µg/ml Geneticin (Chen et al., 1996)
Derivat der HEK293Cre. Stabil transfiziert mit dem Transsilencer-Protein TetR(sB)KRAB, Selektion unter 400 µg/ml Geneticin und 400 µg/ml Hygromycin B
humane epitheliale Zervixkarzinomzellen
humane epitheliale Lungenkarzinomzellen
Primäre menschliche Vorhautfibroblasten (human foreskin fibroblasts), etabliert aus
Vorhautgewebe
Nierenepithelzellen der Grünen Meerkatze (Cercopithecus aethiops)
41
Material und Methoden
4.1. Zellkulturverfahren
4.1.1. Kultivierung von Zellen
Eukaryote Zellen wurden im Brutschrank (Steri-Cult 200, Labotect, Göttingen) bei 37 °C
unter 5 % CO2-Gehalt und 80 % relativer Luftfeuchtigkeit gehalten. 293T, 293Cre, 293CretTS, HFF, HeLa, A549 und Vero Zellen wachsen als Adhäsionskultur und wurden je nach
Verdopplungsrate ein- bis dreimal wöchentlich trypsiniert und im Verhältnis 1:3 bis 1:6
passagiert. Zur langfristigen Lagerung wurden die Zellen in FKS/10 % DMSO resuspendiert
und bei –80°C gelagert.
4.1.2. Transfektion
Das Einbringen von Plasmid-DNA in die verwendeten eukaryoten Zellen erfolgte mittels
Lipofektion (Lipofectamine® bzw. Lipofectamine2000®, Invitrogen, Karlsruhe) gemäß
Herstellerangaben in serumfreiem OPTI-MEM® - Medium. Das Transfektionsmedium wurde
nach 4h durch serumhaltiges Medium ersetzt. Eine eventuelle Induktion des GeneSwitchTMSystems erfolgte nach weiteren 24 h mit einer Endkonzentration von 20 – 40 nM Mifepriston.
Eine eventuelle Derepression des Tet-ON-Systems wurde durch Zugabe von 5 µg/ml Tc
Endkonzentration herbeigeführt. Proben der Kulturüberstände wurden zu unterschiedlichen
Zeitpunkten entnommen. Die Herstellung von Lysaten erfolgte ebenfalls nach variablen
Zeiten.
4.2. Medien und Reagenzien für die Kultur eukaryoter Zellen
HFF/HeLa
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) mit Zusatz von
10 % FKS, 100 µg/ml Gentamycin, 350 µg/ml Glutamin und
10 µg/ml Ciprofloxacin
293(T)/Vero/A549
DMEM mit Zusatz von 10 % FKS, 100 µg/ml Gentamycin und
350 µg/ml Glutamin
293Cre
DMEM mit Zusatz von 10% FKS, 100 µg/ml Gentamycin und
350 µg/ml Glutamin und 400 µg/ml Geneticin
293Cre-tTS
DMEM mit Zusatz von 10% FKS, 100 µg/ml Gentamycin und
350 µg/ml Glutamin und je 400 µg/ml Geneticin und
Hygromycin B
Die Medien wurden in Pulverform von der Firma Invitrogen bezogen und mit sterilem H2O
(AMPUWA, Fresenius, Bad Homburg) angesetzt.
42
Material und Methoden
4.3. Weitere Lösungen für die Zellkultur
Trypsin
0,25 %-ige Lösung in 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,56 mM
Na2HPO4, 5 mM D-(+)-Glukose, 25 mM Tris/HCl
Trypsin/EDTA
0,25 %-ige Lösung in 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,56 mM
Na2HPO4, 5 mM D-(+)-Glukose, 25 mM Tris/HCl, 0,01 % EDTA
pH 7,0
Phosphat gepufferte Salzlösung ohne Mg2+/Ca2+; 138 mM
PBSo.
NaCl, 2,68 mM KCl, 6,5 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4
5. Bakterien
Bezeichnung
E. coli DH10B
Genotyp
F- mcrA
φ80lacZCM15
C(mrr-hsdRMS-mcrBC)
ClacX74
recA1
endA1
-
araD139C(ara, leu)7697 galU galK λ rpsL nupG (Invitrogen, Karlsruhe)
E. coli XL-1blue
recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F´ proAB lacIqZCM15
Tn10 (Tetr)] (Stratagene, La Jolla, USA)
E. coli K-12
GM33
F- LAM- IN(rrnD-rrnE)1 dam-3 sup-85(Am) (Marinus und Morris, 1973)
5.1. Bakterielle Verfahren
5.1.1. Kultivierung von Bakterien
Sämtliche Bakterien wurden in Luria-Bertani (LB) Flüssigmedium bzw. auf LB-Agarplatten
kultiviert. Die transformierten Plasmide enthielten die Resistenzgene gegen Ampicillin,
Kanamycin oder Zeocin, so dass durch Zugabe von 50 - 100 µg/ml Ampicillin, 30 mg/ml
Kanamycin oder 2 µg/ml Bleocin selektiert werden konnte. Die Inkubation erfolgte auf LBPlatten bei 37°C im Wärmeschrank, in Flüssigmedium bei 37 °C und 200 rpm im
Bakterienschüttler.
5.1.2. Transformation durch Hitzeschock
Je 20 µl chemisch kompetenter E. coli XL-1 wurden auf Eis aufgetaut, mit 0,35 µl
β-Mercaptoethanol versetzt und 10 min auf Eis inkubiert, wobei in Intervallen von 2 min
gemischt wurde. 2 µl DNA (aus Ligation) wurde in 1,5 ml-Reaktionsgefäße auf Eis vorgelegt
und die Bakterien zugegeben. Nach Inkubation von 30 min auf Eis erfolgte ein Hitzeschock
im Wasserbad bei 42 °C für 45 - 55 s und erneute Inkubation für 2 min auf Eis. Anschließend
wurden 250 µl auf 37 °C vortemperiertes SOC-Medium zugegeben und 55 min bei 37 °C im
Thermomixer geschüttelt. Von den so behandelten E. coli XL-1 wurden je 100 µl, 50 µl und
der Rest auf LB-Agarplatten ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.
43
Material und Methoden
5.1.3. Herstellung elektrokompetenter E. coli DH10B:
400 ml vortemperiertes LB-Medium wurde mit 5 ml einer Vorkultur inokuliert und bis zu einer
OD600 von 0,5 - 0,6 kultiviert. Nach einer Inkubation von 15 min auf Eis wurden die Bakterien
dreimal 20 min bei 4200 rpm abzentrifugiert. Der Überstand einjeder Zentrifugation wurde
verworfen und das Pellet jeweils in eiskaltem zweifach destilliertem Wasser resuspendiert,
wobei dem Wasser im letzten Schritt 10 % Glycerin zugefügt wurden. Nach einer weiteren
Zentrifugation von 30 min bei 3000 rpm wurde der Überstand erneut verworfen, das Pellet in
~ 500 µl H2O 10 % Glycerin resuspendiert und in Portionen zu 75 µl bei – 80 °C eingefroren.
5.1.4. Elektroporation
Für die Transformation einer DNA durch Elektroporation wurden 75 µl elektrokompetenter E.
coli DH10B auf Eis aufgetaut, mit 1 – 2 µl DNA (aus Ligationen) versetzt und in vorgekühlte
Elektroporationskuvetten
(PeqLab,
Erlangen)
überführt.
Nach
dem
Anlegen
eines
elektrischen Feldes (2,5 kV, 329 Ohm, 25 Farad) wurden die Bakterien in 150 µl SOCMedium aufgenommen und 50 min bei 37°C geschüttelt. Anschließend wurden variable
Volumina der Suspension auf entsprechende Selektionsmedien ausplattiert und über Nacht
bzw. bis zu 24 Stunden bei 37°C inkubiert.
5.2. Medien und Reagenzien für die Bakterienkultur
LB-Agar
15 g Bacto-Agar in 1l LB-Medium, gegebenenfalls Zusatz von
50 bzw. 100 µg/ml Ampicillin
10 g Casein, 5 g Bacto-Hefe-Extrakt, 5 g NaCl in 1l H2O,
LB-Medium
pH 7,2
SOC-Medium
20 g Bacto-Trypton, 5 g Bacto-Hefe-Extrakt, 2,5 mM NaCl,
2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM Glukose in 1 l H2O, pH 7,0
6. Viren
Bezeichnung
AD-HVS1
Merkmale
AD-HVS2
Ψ und ITR des humanen Ad5; CMVie-il-1ra, HVS oriLyt, PGK-orf73, 3 x H-DNA
AD-HVS3
Ψ und ITR des humanen Ad5; CMVie-il-10, HVS oriLyt, PGK-orf73, 3 x H-DNA
AD-HVS4
Derivat von AD-HVS1 + ORF14-switch-il-1ra
AD-HVS5
Derivat von AD-HVS1 + EF1a-switch-il-1ra
AD-HVS6
Derivat von AD-HVS1 + ORF14-switch-il-10
AD-HVS8
Derivat von AD-HVS2 + ORF14-switch-il-10
AD-HVS9
Derivat von AD-HVS2 + EF1a-switch-il-10
AD-HVS10
Derivat von AD-HVS3 + ORF14-switch-il-1ra
Ad H14
Derivat des humanen Adenovirus Typ 5, E1 deletiert, Stuffer in E3 (Merck, Darmstadt)
Ψ und ITR des humanen Ad5; CMVie-luc+, HVS oriLyt, PGK-orf73, 3 x H-DNA
44
Material und Methoden
6.1. Virale Verfahren
6.1.1. Anzucht von H14 Helferviren
Die Herstellung von Helferviren des Typs H14 erfolgte durch Passage in HEK293-Zellen.
Etwa 1 x 106 Zellen in einer Zellkulturflasche mit 25 cm2 Kulturfläche wurden initial mit einer
MOI von ca. 1 infiziert. Fünf Tage nach Infektion wurden die Zellen vom Boden der Flasche
gelöst und 15 min bei 400 x g zentrifugiert. Anschließend erfolgte die Lyse durch fünfmaliges
Einfrieren / Auftauen. Durch Testinfektionen von 2 x 106 am Vortag ausgesähter 293-Zellen
mit unterschiedlichen Volumina des gewonnenen Lysats wurde das Volumen ermittelt,
welches rund 72 Stunden nach Infektion einen deutlichen zytopathogenen Effekt
(cytophathic effect, CPE) liefert. Zehn Kulturflaschen mit je ~ 15 x 106 293-Zellen wurden
jeweils mit dem ermittelten Volumen, hochgerechnet für die Infektion von 15 x 106 Zellen,
infiziert. Drei Tage nach Infektion erfolgte die Lyse der Zellen und die Aufreinigung des
Virusstocks.
6.1.2. Anzucht rekombinanter HD Adenoviren
Die Herstellung rekombinanter Adenovirus Partikel erfolgte durch Mehrfachpassage in den
Verpackungszelllinien 293Cre und 293CretTS SP4. 2 x 106 Zellen wurden am Vortag in eine
Zellkulturflasche mit 25 cm2 Kulturfläche ausgesät. Vier bis sechs Stunden nach Transfektion
von 5 µg PmeI-gespaltener Plasmid-DNA der entsprechenden Konstrukte in erfolgte eine
Überinfektion mit einer MOI von 5 mit dem H14 Helfervirus. 48-72 Stunden nach Infektion
und deutlich ausgeprägtem CPE wurden die Zellen vom Boden der Kulturgefäße gelöst, in
Reagiergefäße überführt und 15 min bei 400 x g abzentrifugiert. Anschließend wurde das
Zellpellet in 700 µl PBS resuspendiert und fünfmal auf Trockeneis eingefroren und im
Wasserbad (RT) aufgetaut. In dem gesamten des so gewonnenen Lysat wurde eine MOI von
5 des Helfervirus eingestellt und für weitere zwei Infektionszyklen in Kulturflaschen mit
25 cm2 Fläche verwendet. Jeweils 48 - 72 Stunden nach Infektion wurden Lysate wie oben
beschrieben gefertigt. In dem gesamten zuletzt generierten Lysat wurde eine MOI von 5 an
Helfervirus eingestellt und damit ~ 15 x 106 am Vortag in eine Flasche mit 175 cm2
Kulturfläche ausgesäte Zellen infiziert. Wiederum nach 48 -72 Stunden wurde das Lysat
gefertigt, mit Helfervirus auf MOI von 5 eingestellt und komplett zur Infektion von ~ 30 x 106
am Vortag in zwei 175 cm2-Flaschen ausgesäte Zellen verwendet. Nach Lyse der Zellen
wurden die erhaltenen Stocks aufgereinigt.
6.1.3. Aufreinigung rekombinanter Vektoren
Das aus der letzten Amplifikation stammende Lysat wurde mit PBS auf ein Volumen von 4 ml
aufgefüllt, auf einen dreistufigen Cäsiumchlorid-Gradienten (3,5 ml 1,2502 g/cm3, 3,5 ml
1,3496 g/cm3, 0,5 ml 1,450 g/cm3) pipettiert und 4 Stunden bei 32.000 rpm und 16°C in
45
Material und Methoden
einem zentrifugiert (SW41-Rotor, Beckman Coulter, Krefeld). Die dabei eingesetzten CsClLösungen wurden anhand des Refraktionsindex, ausgehend von einer gesättigten Lösung
mit Wasser auf die Lösungen gewünschter Dichte verdünnt. Anschließend wurden sämtliche
Banden der mutmaßlich viralen Partikel großzügig mit einer Kanüle abgezogen, mit PBS auf
5 ml aufgefüllt und auf 6 ml einer 1,35 g/ml CsCl-Lösung pipettiert. Nach einer Zentrifugation
von 16 – 20 Stunden bei 32.000 rpm und 16 °C wurden die Virusbanden (nach Möglichkeit
separat) mit einer Kanüle aus dem Zentrifugenröhrchen entnommen. Die Fraktionen wurden
zweimal gegen sterilfiltriertes Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM MgCl2, 10 % Glycerin dialysiert und in
Portionen zu je 10 – 30 µl bei -80°C eingefroren.
6.1.4. Infektion mit rekombinanten Vektoren
Die zur Infektion von HFF-, A549-, HeLa- und Vero-Zellen herangezogenen Stocks
rekombinanter Viren waren zum Zeitpunkt der Infektionen nicht quantifiziert. Pauschal
wurden 5 µl der entsprechenden Stocks zur Infektion der Zellen in je einer Vertiefung einer
Sechs-Napf-Platte verwendet.
7. Nukleinsäure-Methoden
7.1. Standardmethoden
Folgende Methoden wurden nach Standardprotokollen entsprechend den angegebenen
Literaturstellen oder nach Herstellerangaben durchgeführt:
•
Ethanol- und Isopropanol-Fällung von Nukleinsäuren, Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Extraktion, Restriktionsenzymspaltungen, Klenow-Auffüllreaktion, Transformation
von Bakterien, andere grundlegende Klonierungsschritte, photometrische Nukleinsäurekonzentrationsmessungen und Agarosegelelektrophorese (Ausubel et al., 2003;
Sambrook et al., 1989)
•
DNA-Ligation mittels des Takara Ligation Kits Ver.2 (Cambrex Bioscience, Apen)
•
DNA-Gelextraktion mit Hilfe des NucleoSpin Extract Kits (Macherey-Nagel, Düren)
•
Kleine Plasmidpräparationen durch alkalische Lyse nach Birnboim (Birnboim und Doly,
1979)
•
Große Plasmidpräparationen durch alkalische Lyse und anschließende AnionenAustauschchromatographie mittels Nucleobond-PC Kit (Macherey-Nagel, Düren)
•
Isolation zellulärer Gesamt-RNA mit Nucleospin RNA II Kit (Macherey-Nagel, Düren)
•
Die Sequenzierung von DNA wurde nach der fluoreszenzmarkierten Farb-TerminatorenMethode mit dem PRISM® Ready Reaction Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit
(ABI, Weiterstadt) an einem ABI PRISM 3100 DNA-Sequenzier-Gerät (ABI, Weiterstadt)
durchgeführt.
46
Material und Methoden
7.2. Polymerasekettenreaktion (PCR)
Ein typischer PCR-Ansatz enthielt 10 ng (Plasmid-DNA) bis 500 ng (genomische DNA)
Matrizen-DNA, je 20 pmol Oligonukleotide, 200 µM dNTPs, 3 U DNA-Polymerase und 5 µl
10x-PCR-Puffer in einem Gesamtvolumen von 50 µl. Zu Beginn der Amplifikation wurde die
Matrizen-DNA durch Erhitzen auf 95 °C für 1 min denaturiert. Es wurden 35-40
Amplifikationszyklen mit den Schritten 95 °C, 15 s (Denaturierung), x °C, 20s (OligonukleotidHybridisierung) und 72 °C, x s (Elongation) durchgeführt. Hybridisierungstemperatur und
Elongationszeit richteten sich nach den jeweils verwendeten Oligonukleotiden und der Länge
des zu amplifizierenden DNA-Abschnitts. Die Effizienz der PCR-Reaktion wurde durch eine
anschließende gelelektrophoretische Auftrennung von 3-5 µl der Probe überprüft. Es wurde
ein Peltier Thermal Cycler-200 mit Deckelheizung der Firma MJ Research (Watertown, MA,
USA) verwendet.
7.3. Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR)
Die cDNA Synthese wurde mittels des ThermoScript™ RT-PCR Systems (Invitrogen,
Karlsruhe) durchgeführt. Dabei wurden zunächst 1,5 µg gesamtzelluläre RNA, 8 µl cDNA
Synthese Puffer, 40 U RNaseOUT und 2 µl DNaseI (20 U) in einem Volumen von 29 µl für 30
min bei 37 °C inkubiert und damit von einer eventuellen Verunreinigung durch genomische
DNA befreit. Nach Abstoppen der Reaktion bei 70 °C für 10 min wurden die Ansätze halbiert
und mit jeweils 0,5 µl Hexamer-Primern und poly-dT-Primern, 1 µl 0,1 M DTT, 20 U
RNaseOUT, 2 µl 10 mM dNTPs und 1 µl Reverser Transkriptase bzw. H2O als
Kontrollreaktion versetzt. Nach 10 min Inkubation bei 25 °C und 45 min Inkubation bei 37 °C
wurde die Reaktion durch 5-minütiges Erhitzen auf 85 °C gestoppt. Der komplementäre
RNA-Anteil des entstandenen cDNA-RNA Hybrids wurde durch einen anschließenden
Verdau mit 1 µl RNaseH (2 U/µl, 20 min, 37 °C) aus der Lösung entfernt. Jeweils 2 µl dieser
einzelsträngigen cDNA wurden für die nachfolgenden DNA-PCR-Reaktionen verwendet.
7.4. Quantitative Real-Time PCR (TaqMan)
Die Quantifizierung der DNA-Kopienzahl in Adenovirus-Stocks erfolgte mittels quantitativer
Real-Time PCR unter Verwendung eines ABI PRISM 7500 Sequence Detection System
(ABI, Weiterstadt). Dabei wurden 250 ng Matrizen-DNA (in einem Volumen von 5 µl)
eingesetzt. Zur Bestimmung der Referenz-CT-Werte wurde eine Verdünnungsreihe eines
jeweiligen Standards (1010 - 101 Moleküle) in parallelen PCR-Reaktionen mitgeführt. Die 50
µl Reaktionsansätze enthielten je 0,2 µM 6-ROX, 0,01 % (v/v) PCR-Puffer, 5 mM MgCl2, 0,2
mM dNTPs, 2,5 U Taq Polymerase (Perkin Elmer, Darmstadt), 0,1 µM der entsprechenden
Sonde
und
jeweils
0,3 µM
der
entsprechenden
Primer.
Einem
einmaligen
Denaturierungsschritt von 5 min bei 95 °C folgten 40 Amplifikations-Zyklen mit Denaturierung
47
Material und Methoden
(95 °C, 15 s), Oligonukleotid-Hybridisierung (60 °C, 30 s) und Elongation (68 °C, 30 s). Die
Kopienzahl der eingesetzten Proben wurde anschließend über den probenspezifischen CTWert mit der Auswertungsprogramm (Sequence Detection System Software, Version 1.6.3)
berechnet und durch Vergleich mit der Standard-Verdünnungsreihe ermittelt. Dabei wurden
Mittelwerte aus jeweils zwei unabhängigen Messreihen mit je zwei Messwerten gebildet.
8. Vektorsysteme und Ausgangsplasmide
Bezeichnung
pCP20
pSTK134
pSTK68
pWHE281
pWHE122(sB)
pSTBlue-1 AccepTor
pIRES-BleoFRT
pGL3Basic
pUC18
uc3HO
pcDNA3.1(-)-HAMVL73MHBd23
GeneSwitchTM
pGeneV5HisAdN-IL1RA
pGeneV5HisAdN-IL10
pSwitch14
pSwitchEF1a
pPGK-P&T
pAD-EBV1
pCEP4-lambeta3
Merkmale
Plasmid mit Flp-Rekombinase aus S. cerevisiae (Buchholz et al., 1996)
Helper dependent adenovirales Genom incl. 20 kb HPRT Stuffer- DNA,
flankiert von PmeI-Erkennungsstellen in pBluescribe
Helper dependent adenovirales Genom incl. 16 kb HPRT Stuffer- DNA,
flankiert von PmeI-Erkennungsstellen in pBluescribe
CMVenhancer (tetO2)7 SV40Promotor Luziferase
Plasmid mit CMV-getriebenem TetR(sB)-KRAB
Vektor zur Insertion von PCR-Produkten mit Blau-Weiß-Selektion
(Novagen, Madison, USA)
Derivat von pIRESbleo (Clontech, Palo Alto, USA); Modifiziert von
C. Grillhösl
Plasmid zur Quantifizierung der basalen Luziferaseaktivität (Promega,
Mannheim)
Stratagene, La Jolla, USA
Derivat von pUC18; 3 x H-DNA, HVS-ORI; Von Jens C. Albrecht
Derivat von pcDNA3.1(-), Trägt den HA-, als auch Myc- und 6xHismarkierten Leserahmen 73 von HVS
System bestehend aus den Plasmiden pSwitch und pGene zur
Mifepriston-induzierten Überexpression in eukaryoten Zellen
(Invitrogen, Karlsruhe)
Derivat von pGeneV5HisA mit deletierter NotI-Sequenz und dem Gen
von il-1ra
Derivat von pGene mit deletierter NotI-Sequenz und dem Gen von il-10
Derivat von pSwitch, HSV TK-Promotor durch HVS orf14-Promotor
substituiert
Derivat von pSwitch, HSV TK-Promotor durch EF1a-Promotor
substituiert
Derivat von pBluescribe (Stratagene, La Jolla, USA); Modifiziert von
M. Kummer
Derivat von pSTK68-FRT-pWHE281CP20flp-fwd.; Trägt pCEP4lambeta3 zwischen den FRT-Sequenzen
Derivat von pCEP4 (Invitrogen, Karlsruhe); Erweitert um das Gen von
Laminin-β3; Entwickelt von F. Pacho
48
Material und Methoden
9. Enzyme
Alle verwendeten Restriktions- und modifizierenden Enzyme wurden bei New England
Biolabs (Frankfurt/Main), Roche Diagnostik (Mannheim), Invitrogen (Karlsruhe), Perkin Elmer
(New Jersey, USA), Fermentas (St. Leon-Rot) und Amersham Biosciences (Freiburg)
bezogen und mit den dazugehörigen mitgelieferten Puffern laut Herstellerangeben
verwendet. Für die PCR bzw. RT-PCR wurde die DNA-Polymerase Ampli-Taq (Perkin
Elmer), sowie DNase-freie RNaseH (Roche Diagnostik), RNase-freie DNaseI (Boehringer,
Mannheim), RNaseOUT (Invitrogen) und der ThermoScript™RT-PCR System Kit (Invitrogen)
verwendet.
10. Oligonukleotide
Die Oligonukleotide wurden von den Firmen Sigma-ARK (Darmstadt), sowie biomers.net
(Ulm) bezogen.
Motiv/Gen
Verwendung
Name
Linker
FRTlinker
FRTlinker comp
Linker
pWHE281-flp
Sequenzierung
pSTK68 (Ψ)
Sequenzierung
pIRES_invCMV-luc
Sequenzierung
Adenovirus H14
qRT-PCR
Luziferase
qRT-PCR
GAPDH (cDNA)
RT-PCR
tTS (cDNA)
RT-PCR
Cre (cDNA)
RT-PCR
IL-10
RT-PCR
IL-1RA
RT-PCR
flp-Rekombinase
Amplifikation
hvsamplink
hvsamplink-rev
flp1
flp2
flp3
T3
T7
ARVcmvf
P1et
HP-II-F
HP-II-R
HP-II-P
LuciFP
LuciRP
LuciTM
gapdh1c
gapdh1n
122(sB)-fp
122(sB)-rp
cre-fp
cre-rp
il10n
il10c
Il1ran
Il1rac
flpCeag
flpNeag
49
Sequenz (5’- 3’)
GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCA
GCGCTACCGGTCGTACGACGCGTGAAGTTCCTATA
CTTTCTAGAGAATAGGAACTTC
GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCA
CGCGTCGTACGACCGGTAGCGCTGAAGTTCCTATT
CTCTAGAAAGTATAGGAACTTC
AGCTGATATCATTTAAATGTATACCGTACGAATTC
AATTGAATTCGTACGGTAGACATTTAAATGATATC
CGAACTGTAATTGCAAACTAC
GGAAGACATTTGATGACCTC
AAGAAATTGATTCCTGCTTG
ATTAACCCTCACTAAAGGGA
TAATACGACTCACTATAGGG
CGGGGTCATTAGTTCATAGCCC
GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
TCTGAGTTGGCACCCCTATTC
GTTGCTGTGGTCGTTCTGGTA
TTCAGGGATGCCACATCCGTTGA
TTGCACTGATCATGAACTCCTCTGG
CAGTATCCGGAATGATTTGATTGCC
CTGGTCTGCCTAAAGGTGTCGCTCTGCCT
TGCCAGCCCCAGCGTCAAAG
GCAGGGGGGAGCCAAAAGGG
GCTGGGAGTTGAGCAGCCTACCC
CCAACCGGAGGATCACATCTGGC
ATGCTTCATCGTCGGTCCGG
CCAGGGCGCGAGTTGATAGC
ATGCACAGCTCAGCACTGCTCTG
GTTTCGTATCTTCATTGTCATG
GGAAATCTGCAGAGGCCTCC
CTCAAAACTGGTGGTGGGGC
CGGCCGTTATATGCGTCTATTTATGTAGGATG
CGGCCGCCATGCCACAATTTGATATATTATG
Material und Methoden
orf73
Virusnachweis
switch
Virusnachweis
SV40 late polyA
Virusnachweis
Zeocin-R.
Virusnachweis
Luziferase
Virusnachweis
Adenovirus H14
Virusnachweis
Ark61
73d7
Switchi1
Switchi2
Ark175
HPRT16K
ARVblef
ARVbler
LuciFP
LuciRP
ad5-c
ad5-n
CTAAAAATGCAGCATCGTCACC
CTGGGCTGTTATAATCTCTTTAGC
TCAACCTGTTAATGAGCATTGAACC
TTGGCTAACTTGAAGCTTGACAAAC
TGATGAGTTTGGACAAACCACAAC
TGATTGGGCAGCCATTTAAG
CCAAGTTGACCAGTGCCGTTC
ACGAAGTGCACGCAGTTGCC
TTGCACTGATCATGAACTCCTCTGG
CAGTATCCGGAATGATTTGATTGCC
AGTGCTCCACGATCGCGTTG
CAACCCGTTTGCGCACCTTC
11. Proteinmethoden und immunologische Verfahren
11.1. Immunblot
Westernblot-Analysen zum Nachweis von Antikörperbindung an rekombinant exprimierte
Proteine wurden nach Burnette (Burnette et al., 1981) durchgeführt. Dazu wurden ca. 1 x 106
Zellen für 20 min auf Eis in RIPA-Puffer inkubiert. Durch Zentrifugation (13000 rpm, 15 min,
4°C) wurde der zytoplasmatische Anteil von den Kernen und Membrananteilen abgetrennt.
Die Auftrennung der Proteine erfolgte durch diskontinuierliche vertikale SDS-PolyacrylamidGelelektrophorese nach Lämmli (Lämmli 1970). Der Vernetzungsgrad des Trenngels lag bei
10-12 %. Nach dessen Polymerisation wurde es mit einem 5 %-igen Sammelgel
überschichtet. Die Proteinproben wurden 5 min bei 95 °C in 1 x SDS-Probenpuffer inkubiert
und bei 200 V für ca. 50 min aufgetrennt. Bei Verwendung von Hoefer-Kammern erfolgte die
Auftrennung über Nacht bei 50 V. Anschließend wurden die Proteine im semi dry-Verfahren
durch Elektrotransfer (Hoefer TE77, Amersham Biosciences) auf PolyvinyldifluoridMembranen (Millipore, Bedford, USA) übertragen (0,8 mA/cm2, 75 min). Zur Kontrolle des
Proteintransfers diente der direkt sichtbare vorgefärbte Benchmark Prestained ProteinLadder-Größenstandard (Fermentas, St. Leon-Rot). Unspezifische Bindungsstellen der
Membranen wurden durch Inkubation in Blockierlösung für 1 h bei RT bzw. über Nacht bei
4 °C abgesättigt. Die Inkubation mit dem in Blockierungslösung verdünnten Primärantikörper,
sowie dem HRP-gekoppelten Sekundärantikörper, erfolgte für jeweils 1 h unter Schwenken
bei Raumtemperatur. Nicht gebundener Antikörper wurde durch dreimal zehnminütiges
Waschen entfernt. Der Nachweis spezifisch gebundener Antikörper erfolgte durch die
Detektion der bei einer enzymatischen Reaktion emittierten Chemolumineszenz (enhanced
chemoluminescence
System,
ECL)
durch
eine
CCD-Kamera
Chemolumineszenz Detektionssystem, Raytest, Straubenhardt).
50
(Fuji
LAS-1000
Material und Methoden
11.2. Immunadsorptionstest (ELISA)
96-Napf-Polystyren-Mikrotiterplatten (Nunc, Naperville, USA) wurden mit je 100 µl/Napf in
PBSo. gelösten monoklonalen Antikörpern über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Nach
dreimaligem Waschen mit Waschpuffer wurden unspezifische Bindungsstellen durch
Inkubation mit 200 µl/Napf Blockpuffer für 1 h bei Raumtemperatur abgesättigt. Nach
erneutem dreimaligen Waschen erfolgte die Inkubation mit den Proteinproben und einer
Verdünnungsreihe der entsprechenden rekombinanten Interleukinstandards in einem
Volumen von 100 µl/Napf für 2 h bei Raumtemperatur. Die Proteinproben wurden dabei in
einer Verdünnung zwischen 1:3 und 1:100 in Verdünnungspuffer eingesetzt. Nach
dreimaligem Waschen erfolgte die Inkubation von 100 µl/Napf der biotinylierten polyklonalen
Antikörper für 2 h bei Raumtemperatur. Nach erneutem dreimaligen Waschen wurde mit
100 µl/Napf Peroxidase-konjugiertem Streptavidin (1 µg/ml) in einer Verdünnung von 1:200
(v/v) für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach drei weiteren Waschschritten wurde die
Peroxidaseaktivität als Maß für die Menge an gebundenem Antikörper durch Zugabe von je
100 µl/Napf des TMB-Peroxidase-Substrates nach Angaben des Herstellers bestimmt. Nach
einer variablen Zeitspanne von 5-20 min (je nach erreichter Farbintensität) wurde die
Farbreaktion durch Zugabe von 50 µl/Napf 1 M H2SO4 gestoppt und photometrisch bei
450 nm mit einem ELISA-Reader (MWG Biotech, Ebersberg) quantifiziert. Die gewonnenen
Daten wurden mit dem Programm SOFTmax® (MWG Biotech, Ebersberg) ausgewertet.
12. Antikörper
12.1 Monoklonale Antikörper
Spezifität
anti-human-IL-1RA
Klon
10309.211
Methode, Verdünnung
ELISA, 5-10 µg/ml
anti-human-IL-10
23738.111
ELISA, 1-4 µg/ml
51
Markierung
Hersteller
R&D Systems,
Wiesbaden
R&D Systems,
Wiesbaden
Material und Methoden
12.2 Polyklonale Antikörper
Spezifität
Methode, Verdünnung
Westernblot, 1:500
Markierung
anti-human-NFκB-p65
Spezies
Kaninchen
anti-Kaninchen-IgG
anti-HA
Schwein
Maus
Westernblot, 1:2000
Westernblot, 1:1000
HRP
anti-Maus
anti-Biotin
Kaninchen
Ziege
Westernblot, 1:1000
Westernblot, 1:1000
HRP
HRP
anti-human-IL-1RA
Ziege
ELISA, 100 ng/ml
Biotin
anti-human-IL-10
Ziege
ELISA,125-500 ng/ml
Biotin
ELISA-Duosets:
Hersteller
Santa Cruz,
Santa Cruz, USA
DAKO, Hamburg
Covance,
Münster
DAKO, Hamburg
Cell Signaling,
Beverly, USA
R&D Systems,
Wiesbaden
R&D Systems,
Wiesbaden
IL-1RA
R&D Systems, Wiesbaden
IL-10
R&D Systems, Wiesbaden
Streptavidin-HRP konjugiert
Dianova, Hamburg
TMB Microwell Peroxidase Substrate System
KPL, Gaithersburg, USA
13. Software
Vector NTI AdvanceTM 9.1
Sequenzanalyse- und Daten-Management-Software
für molekularbiologische und genetische Forschung
(Invitrogen, Karlsruhe)
SOFTmax®
ELISA-Analysesoftware (MWG Biotech, Ebersberg)
Aida Image Analyzer 3.10
Bildbearbeitungsprogramm (Raytest, Straubenhardt)
52
Abkürzungen
VII. Abkürzungen
Abb
Ad5
AdV
APS
ATP
bp
β-ME
BSA
CIP
CMV
CPE
d
DMEM
DNA
DS
dsDNA
E. coli
EBV
EDTA
EGFP
ELISA
EtBr
EtOH
F
FCS
FRT
GAL4DBD
h
HD
H-DNA
HPRT
HRP
HSV
HVS
IL-10
IL-1RA
IPTG
ITR
kb
kDa
KSHV
LB
L-DNA
loxP
MMP
MP
o/n
OD
Abbildung
Adenovirus Typ 5
Adenoviraler Vektor
Ammoniumpersulfat
Adenosintriphosphat
Basenpaare
Beta-Mercaptoethanol
Albumin aus Rinderserum (bovine serum albumin)
Alkalische Phosphatase (calf intestine phosphatase)
Cytomegalovirus
zytopathogener Effekt (cytopathic effect)
Tage (days)
Dulbecco’s Modified Eagle Medium
Desoxyribonukleinsäure
DNA-Elemente zweiheitlicher Symmetrie (dyad symmetry)
Doppelsträngige Desoxyribonukleinsäure (double stranded DNA)
Escherichia coli
Epstein Barr Virus
Ethylendiamintetraacetat
enhanced green fluorescent protein
Enzyme-linked Immunosorbant Assay
Ethidiumbromid
Ethanol
Fraktion
fötales Rinderserum (fetal calf serum)
Erkennungssequenzen der Flp-Rekombinase (Flp recombination target)
Gal4 DNA bindende Domäne
Stunde (hour)
Helfer-abhängig (helper dependent)
high density DNA
Hypoxantin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase
Meerrettich-Peroxidase (horseradish peroxidase)
Herpes Simplex Virus
Herpesvirus saimiri
Interleukin-10
Interleukin-1 Rezeptor Antagonist
Isopropyl-ß-D-Galaktopyranosid
invertierte endständige Wiederholungen (inverted terminal repeats)
Kilobasenpaare
Kilodalton
Kaposi Sarkom assoziiertes Herpesvirus
Luria-Bertani
low density DNA
Spezifische Erkennungssequenz der Cre-Rekombinase
Matrixmetalloproteasen
Mischpopulation
über Nacht (over night)
optische Dichte
53
Abkürzungen
OMK
ORF
Ori
PAA
PAGE
PBS
PCR
PNK
PTK
RA
RF
RLU
rpm
RT
rtTA
SDS
SP
ssRNA
StpC
Tc
TCA
TEMED
tetO
TetR
Tip
TR
tTA
tTS
TWEEN
U
UAS
ui
Nachtaffen-Nierenzellen (owl monkey kidney cells)
offener Leserahmen (open reading frame)
Replikationsursprung
Polyacrylamid
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Phosphat-gepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline)
Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction)
Polynukleotid-Kinase
Promotor der Thymidinkinase aus Herpes Simplex Virus
Rheumatoide Arthritis
Repressionsfaktor
relative Lichteinheiten (relative light units)
Umdrehungen pro Minute (rotations per minute)
Raumtemperatur
reverser Transaktivator
Natriumdodecylsulfat (sodium-dodecylsulphate)
Subpopulation
Einzelsträngige Ribonukleinsäure (single stranded RNA)
Saimiri transformationsassoziiertes Protein der Subgruppe C
Tetrazyklin (tetracycline)
Trichloressigsäure
N, N, N´, N´Tetramethylethylendiamin
Tet Operator Sequenzen
Tetrazyklin-Repressor
Tyrosinkinase interagierendes Protein
Endständige Wiederholungen (terminal repeats)
Transaktivator
Transsilencer
Polyoxyethylensorbitanmonolaurat
Einheit (unit)
upstream activating sequences
Uninfiziert
54
Literatur
VIII. Literatur
Ablashi,D.V., Dahlberg,J.E., Cannon,G.B., Fischetti,G., Loeb,W., Hinds,W., Schatte,C., and
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Fleckenstein,B., and Ensser,A. (2004). Herpesvirus ateles Tio can replace herpesvirus
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repeat (TR) sequence and specifically binds TR DNA. J. Virol. 75, 3250-3258.
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lymphocytes by herpesvirus saimiri. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 89, 3116-3119.
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60
Anhang
IX. Anhang
Klonierungsstrategie Schritt 1
61
Anhang
Schritt 2
62
Anhang
Schritt 3
63
Anhang
Bypass 1
64
Anhang
Schritt 4
65
Anhang
Bypass 2
66
Anhang
Schritt 5
67
Anhang
Schritt 6
68
Anhang
Molekulare Mechanismen während der Herstellung rekombinanter Partikel
1. Transfektion PmeI-gespaltener pAD-HVS DNA
2. Überinfektion mit Helfervirus.
3. Zellulär exprimiertes E1 ermöglicht die Replikation des Helvervirus-Genoms;
Damit stehen alle Faktoren zur Replikation der rekombinanten Nukleinsäure
zur Verfügung.
4. Der Transsilencer (tTS) reprimiert die Expression der Flp-Rekombinase,
wodurch die Exzision des HVS-Replikons unterdrückt wird.
5. Die Cre-Rekombinase vermittelt homologe Rekombination an loxP-Sequenzen;
das Verpackungssignal des Helfervirus wird deletiert.
69
Anhang
Verlaufsmodus an der Zielzelle
1. Kontaktaufnahme mit CAR oder MHCa2 über Fiberproteine / Bindung an Integrine als
Korezeptoren
2. Rezeptorvermittelte Endozytose (Æ Endosom)
3. pH-abhängige Freisetzung des Partikels in das Zytosol
4. Assoziation mit Mikrotubuli
5. Transport zum Kernporenkomplex
6. Import der DNA nach Bindung von Hexon-Protein, Importin-7 und Importin-β an Histon HI
7. Expression der Flp-Rekombinase ausgehend von AD-HVS
8. Flp-vermittelte homologe Rekombination an FRT-Sequenzen
9. Exzision und Zirkularisierung des HVS-Replikons
10. Replikation des Replikons
11. Expression von ORF73/LANA, ausgehend vom Replikon
12. ORF73/LANA-vermittelte Bindung von HVS-Replikons an mitotische Chromosomen über
H-DNA-Wiederholungen
13. Verteilung von HVS-Replikons auf Tochterzellen
70
Ein herzliches Dankeschön geht an…
…Prof. Dr. A. Burkovski für die Bereitschaft zur Betreuung dieser Arbeit seitens der
Naturwissenschaftlichen Fakultät.
…Prof. Dr. B. Fleckenstein für die Möglichkeit zur Durchführung dieser Promotion an
seinem Institut.
…PD Dr. A. Ensser für die Überlassung des hochinteressanten Themas und die
wissenschaftliche Beratung.
…meine Kollegen Doris, Brigitte, Alexandra, Elke, Carsten, Barbara, Florian, Sandra,
Christian, Steffi, Mirko, Anja und Stefan für das prima (Arbeits-) Klima.
…Stefan Kochanek und Florian Kreppel für die Bereitstellung der Plasmide pSTK68,
pSTK134 und pFK7, sowie geeigneter Protokolle und weiterer Tips und Tricks…
…Chirstian Berens und Lars Drüppel für die Bereitstellung der Plasmide pWHE280,
pWHE281, pWHE286 und pWHE122(sB).
…meine Eltern, die mir durch stete Unterstützung in jeglicher Hinsicht diesen Weg
ermöglicht haben.
…meine Familie Silke, Jefta und Luca für den grenzenlosen Rückhalt und die Freude,
die ich durch euch erfahre.
Lebenslauf
Persönliche Daten
Name
Frank Wucherpfennig
Geburtsdatum
20.08.1973
Geburtsort
Bad Neuenahr-Ahrweiler
Schulausbildung
1980-1984
Christian Bitter Grundschule Melsungen
1984-1990
Gesamtschule Melsungen (Gymnasialzweig)
1990-1993
Geschwister Scholl Gymnasium Melsungen
Abschluss: Allgemeine Hochschulreife
Studium
1996-1999
Diplomstudiengang Biologie, Grundstudium an der
Georg-August-Universitä Göttingen
1999-2002
Diplomstudiengang Biologie, Hauptstudium an der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen
2001-2002
Diplomarbeit, Institut für Klinische und Molekulare Virologie Erlangen,
Arbeitsgruppe PD Dr. A. Ensser
Thema: Die Rolle zellulärer Glykosaminoglykane als Bindungspartner
der Herpesvirus saimiri Glykoproteine gB, gH und ORF51
Betreuer: Prof. Dr. W. Hillen
Prof. Dr. B. Fleckenstein
Abschluss: Diplom-Biologe
Promotion
Seit Sept. 2002
Promotion, Institut für Klinische und Molekulare Virologie Erlangen,
Arbeitsgruppe PD Dr. A. Ensser
Thema: Transfer und Freisetzung von Episomen für die somatische
Gentherapie durch einen Herpesvirus/Adenovirus Hybridvektor
Betreuer: Prof. Dr. A. Burkovski
Prof. Dr. B. Fleckenstein