Targeting the L1 cell adhesion molecule in cancer - ETH E

DISS. ETH No. 17859
Targeting the L1 cell adhesion molecule in cancer:
mechanisms involved in the antiproliferative
properties of anti-L1 antibodies
A dissertation submitted to
ETH ZURICH
for the degree of
Doctor of Sciences
presented by
ALEXANDRA ANITA FRIEDLI
Eidg. dipl. Apothekerin
born 04.01.1978
citizen of Schmiedrued AG
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. P.A. Schubiger, examiner
Prof. Dr. R. Schibli, co-examiner
Dr. J. Grünberg, co-examiner
2008
Summary
Overexpression of the L1 cell adhesion molecule (L1) was found in a variety of tumors
such as neuroblastoma, renal cell carcinoma, melanoma, ovarian and uterine carcinoma.
The L1 was identified as a signaling molecule directly or indirectly transmitting signals
for the regulation of proliferation, migration and invasion of tumor cells. Inhibition of
tumor cell proliferation in vitro as well as in vivo using anti-L1 antibodies has been reported. A recent study indicated increased efficiency of antibody treatment of metastatic
ovarian carcinoma with a combination of anti-L1 directed growth inhibition and
67
Cu-
radioimmunotherapy. In order to optimize this therapeutic strategy or to develop other
combination therapies using for example drugs interacting in L1 functions and signaling
pathways we investigated the mechanisms of growth inhibition of tumor cells mediated
by anti-L1 antibodies.
Responses of SKOV3ip human ovarian cancer cells in vitro to anti-L1 mAb chCE7 and
Genistein were investigated in this thesis. Genistein, a commonly used tyrosine kinase inhibitor, enhanced the efficacy of cancer therapeutics in other systems. We found that
Genistein potentiated the antiproliferative and proapoptotic effect of mAb chCE7 in
SKOV3ip cells. The soluble form of L1 (sL1) which is released from tumor cells stimulated
growth and protected cells from apoptosis induced by Genistein. MAb chCE7 inhibited
this growth-promoting and apoptosis-protecting function of sL1. We found that the L1
cytoplasmic domain containing phosphorylation sites for associated kinases was required
for the antiproliferative effect of mAb chCE7. A combination of mAb chCE7 and Genistein strongly reduced the sensitivity of several protein kinases involved in proliferation
and apoptosis to extracellular stimulation with growth and survival factors, such as HGF.
In addition to other studies demonstrating an important role of the c-Met/HGF system
in the tumor biology of ovarian cancer, we found that L1 was involved in the growthVII
promoting and antiapoptotic effect of HGF which could be overcome with increasing
doses of mAb chCE7.
Soluble L1 was detected in serum and ascites fluid from ovarian cancer patients. sL1 was
earlier described to promote migration and invasion of tumor cells through the interaction with integrins. In this thesis, the binding region of two growth-inhibiting anti-L1
antibodies, mAb chCE7 and L1-11A on the L1 ectodomain was determined. Different
recombinant L1 ectodomain constructs were produced and used as substrates for the antibodies in western blot analysis. The anti-L1 mAb chCE7 was found to bind to the 6th
Ig-like domain whereas L1-11A bound to the FN-part of the L1 ectodomain. MAb chCE7
inhibited the RGD-dependent heterophilic ligation of L1 to integrins in trans. Both antiL1 antibodies inactivated integrins on SKOV3ip cells in cis, in particular αvβ3 integrin
which was known to be involved in tumor proliferation. Furthermore, as integrins were
found to play a role in angiogenesis, effects of the physiologically relevant sL1 on endothelial cells were investigated. A close cooperation of L1 with the vascular endothelial
growth factor (VEGF) was found on endothelial cells and on cancer cells. sL1 and VEGF
synergized the activation of VEGFR-2 on endothelial cells. A novel function of sL1 as a
potential angiogenic factor was illustrated in the in vivo chicken choriallantoic membrane
angiogenesis assay and moreover chCE7 inhibited the sL1-induced angiogenesis.
The observed synergy of mAb chCE7 directed against L1 with Genistein or other combinations using drugs synergizing with growth inhibition could lead to new options for
consolidation therapy of ovarian cancer recurrency after a firstline treatment. The property of anti-L1 antibodies to inactivate integrins on cancer cells indicated an important
cooperation of L1 and integrins on the cell membrane which might influence survival and
proliferation pathways. The new function of sL1 as a proangiogenic factor and inhibition
of sL1-induced angiogenesis by chCE7 may increase the interest of using this antibody
for antivascular therapies. In particular, as VEGF and sL1 are both released from tumor
cells and sL1 was found in serum and ascites fluid of ovarian cancer patients, the anti-L1
antibody chCE7 might have the potential to inhibit the synergistic property of sL1 and
VEGF in patients.
VIII
Zusammenfassung
Eine Überexpression des Zelladhäsionsmoleküls L1 wurde in verschiedenen Tumoren wie
im Neuroblastom, im Nierenzellkarzinom, im Melanom und in Ovarial- und Uteruskarzinomen gefunden. Das L1 wurde als Signalmolekül beschrieben, welches Signale zur Regulation des Wachstums, der Migration und der Invasion von Tumorzellen direkt oder indirekt weiterleitet. Eine Hemmung des Wachstums von Tumorzellen mittels Antikörpern
gegen L1 wurde in vitro und in vivo beschrieben. Eine kürzlich erschienene Studie
zeigte eine verbesserte Wirksamkeit der Antikörperbehandlung von metastasierendem
Ovarialkarzinom mit einer Kombination von gegen L1 gerichteter Wachstumshemmung
und
67
Cu-Radioimmuntherapie. Um diese therapeutische Strategie zu optimieren und
um weitere Kombinationstherapien zu entwickeln, bei welchen zum Beispiel Arzneistoffe
eingesetzt werden, die in die Funktionen und die Signalwege des L1 eingreifen, untersuchten wir die Mechanismen der Wachstumshemmung von Tumorzellen, die durch antiL1 Antikörper vermittelt werden.
Reaktionen von menschlichen Ovarialkarzinomzellen (SKOV3ip) auf den chimären antiL1 Antikörper chCE7 und Genistein wurden in dieser Doktorarbeit in vitro untersucht.
Genistein ist ein gebräuchlicher Tyrosinkinaseinhibitor, der die Wirksamkeit von Krebstherapeutika in anderen Systemen verstärkte. Genistein potenzierte den wachstumshemmenden und proapoptotischen Effekt des chCE7 in den SKOV3ip Zellen. Die lösliche
Form des L1 (sL1), welche von Tumorzellen abgegeben wird, stimulierte das Zellwachstum
und schützte die Zellen vor der durch Genistein ausgelösten Apoptose. Der Antikörper
chCE7 hemmte diese wachstumsstimulierende und vor Apoptose schützende Funktion des
sL1. Die zytoplasmatische Domäne des L1, welche Phosphorylierungstellen für assoziierte
Kinasen enthält, war für die Wachstumshemmung mit dem chCE7 notwendig. Eine Kombination von chCE7 mit Genistein zeigte eine verstärkte Reduktion der Sensitivität von
IX
einigen in das Zellwachstum involvierten Proteinkinasen gegenüber extrazellulärer Stimulation durch Wachstums- und Überlebensfaktoren, wie zum Beispiel HGF. Wir fanden in
Ergänzung zu anderen Studien, welche dem c-Met/HGF System eine wichtige Rolle in der
Tumorbiologie des Ovarialkarzinoms zuschrieben, dass L1 in den wachstumsstimulierenden und antiapoptotischen Effekt des HGF involviert war und dieser mittels erhöhten
Dosen an chCE7 überwunden werden konnte.
Lösliches L1 (sL1) wurde im Serum und in der Aszitesflüssigkeit von Ovarialkarzinompatienten nachgewiesen. Eine Förderung der Migration und Invasion von Krebszellen
durch sL1 über die Interaktion mit Integrinen wurde in früheren Studien beschrieben.
In dieser Doktorarbeit wurde die Bindungsregion von zwei wachstumshemmenden antiL1 Antikörpern, chCE7 und L1-11A, an der L1 Ektodomäne bestimmt. Verschiedene
rekombinante Konstrukte der L1 Ektodomäne wurden produziert und als Substrate für
die Antikörper in der Western Blot Analyse verwendet. Es wurde gezeigt, dass der antiL1 Antikörper chCE7 and die 6. Ig Domäne und der L1-11A an den FN-Teil der L1
Ektodomäne bindete. Der chCE7 unterdrückte die RGD-abhängige heterophile Ligation
von L1 und Integrinen in trans. Beide anti-L1 Antikörper inaktivierten Integrine auf
den SKOV3ip Zellen in cis, im Besonderen das in die Tumorzellproliferation involvierte
αvβ3 Integrin. Aufgrund der Rolle von Integrinen in der Angiogenese wurden Effekte des
physiologisch relevanten sL1 auf Endothelzellen untersucht. Ein enges Zusammenspiel
von L1 und dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) konnte sowohl auf
Endothelzellen als auch auf Krebszellen gefunden werden. Das sL1 und VEGF verstärken
sich in der Aktivierung des VEGF Rezeptors 2 auf Endothelzellen. Eine neue Funktion des sL1 als potenzieller blutgefässbildender Faktor wurde mit dem in vivo HühnerChorioallantois-Membran (CAM) Angiogenese Assay illustriert. Darüberhinaus konnte
die durch sL1 stimulierte Angiogenese mit dem chCE7 inhibiert werden.
Die beobachtete Synergie von chCE7 und Genistein als auch andere Kombinationen mit
Arzneistoffen, die die Wachstumshemmung verstärken, könnten neue Optionen für Konsolidationstherapie von Ovarialkarzinomrückfällen nach einer First-Line-Therapie darstellen. Die Eigenschaft von anti-L1 Antikörpern, Integrine auf Krebszellen zu inaktivieren, wies auf ein wichtiges Zusammenspiel von L1 und Integrinen auf der Zellmembran hin, welches Überlebens- und Wachstumssignalwege beeinflussen könnte. Die neue
X
Funktion des sL1 als ein Pro-Angiogenese Faktor und die Hemmung von der durch sL1
induzierten Angiogenese mittels chCE7 könnte Interesse an diesem Antikörper zur Anwendung in der antivaskulären Therapie wecken. Im Besonderen, da VEGF und sL1 von
Tumorzellen abgegeben werden und das sL1 im Serum und in der Aszitesflüssigkeit von
Ovarialkarzinompatienten gefunden wurde, ist es denkbar, dass der anti-L1 Antikörper
chCE7 ein Potenzial hat, die synergistische Eigenschaft von sL1 und VEGF in Patienten
zu hemmen.
XI