Albumin als Carrier zur laserinduzierten Fluoreszenz

Abteilung für Neurochirurgie
der Universitätsklinik Heidelberg
(Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. Stefan Kunze)
Albumin als Carrier zur laserinduzierten Fluoreszenzdiagnostik und Chemotherapie maligner Tumoren
Habilitationsschrift
zur Erlangung der Venia Legendi
für das Fach Neurochirurgie
der Medizinischen Fakultät Heidelberg
der Ruprecht-Karls-Universität
vorgelegt von
Dr. Paul Kremer
aus
Bad Säckingen
2002
Euntes eunt et plorant
semen spargendum portantes:
Venientes venient cum exsultatione,
portantes manipulos suos.
Psalm 126
2
Inhaltsverzeichnis
Kapitel 1
Einleitung und Fragestellung
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
Das Konzept der gezielten Tumortherapie mit makromolekularen Trägerstoffen
Die Eigenschaften von Serum-Albumin
Der Albuminmetabolismus in malignen Tumoren
Die Entwicklung von Albuminkonjugaten
Methotrexat-Albumin
Aufgabenstellung und Zielsetzung der Arbeit
Kapitel 2
Intraoperative Fluoreszenzdiagnostik maligner Gliome mit 5-Aminofluorescein - HSA (AFLc-HSA)
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
2.8
2.9
2.10
2.11
2.12
2.13
Einführung
Physikalische Eigenschaften von 5-Aminofluorescein (AFL)
Die kovalente Bindung von 5-Aminofluorescein an Albumin (AFLc-HSA)
Die Makierung von AFLc-HSA mit radioaktivem 111Indium
Das C6-Gliom Modell
Plasmaclearance von AFLc-HSA
Die Aufnahme von 111In-DTPA-AFLc-HSA in das C6-Gliom
Fuoreszenzdiagnostik von AFLc-HSA und AFL am C6-Gliom der Ratte
Fluoreszenzdiagnostik von AFLc-HSA in Zellkultur
Konfokale Mikroskopie mit AFLc-HSA und an C6-Gliomzellen
Klinische Studien mit 111In-DTPA-HSA
Klinische Studien mit AFLc-HSA
Diskussion
Kapitel 3
3.1 Albuminvermittelte Chemotherapie mit Aminopterin-HSA
(AMPT-HSA) in vivo
3.1.1
3.1.2
3.1.3
3.1.4
3.1.5
3.1.6
3.1.7
Einführung
Die Koppelung von Aminopterin (AMPT) an Albumin (HSA)
Die Markierung von Aminopterin-Albumin (AMPT-HSA) mit 111Indium
Tumormodell (Walker-256-Karzinom) und Versuchstiere
Die Plasmaclearance von AMPT-HSA
Die Bioverteilung und Tumoraufnahme von AMPT-HSA
Vergleichende Toxizität von AMPT-HSA versus AMPT an Walker-256 Karzi
nom tragenden Ratten
3.1.8 Wirksamkeit von AMPT-HSA versus AMPT an Walker-256-Karcinom tragenden Ratten
3
3.2
Untersuchungen von AMPT-HSA in Zellkultur
3.2.1 Einführung
3.2.2 Optimierung der Kulturbedingungen
3.2.3 Das Wachstumsverhalten von C6-Gliomzellen unter dem Einfluß von AMPTHSA
3.2.4 Der Einfluß von lysosomalen Proteaseinhibitoren auf die Wirkung von
AMPT-HSA
3.2.5 Der Einfluß von AMPT-HSA auf die Walker-256-Karzinomzelllinie
3.2.6 Diskussion
Kapitel 4
Klinische Phase-I und II-Studien mit Methotrexat-Albumin (MTXHSA) bei Patienten mit rezidivierenden malignen Gehirntumoren
3.3
3.4
4.3
4.4
Einleitung
Klinische Phase-I-Studie mit zweiwöchentlichen Applikationen von MTX-HSA
bei Patienten mit rezidivierenden malignen Gehirntumoren
Vergleichende Phase-II-Studie von MTX-HSA und Carmustin/Lomustin bei
Patienten mit primären und sekundären Glioblastomrezidiven
Diskussion
Kapitel 5
Albuminvermittelte Lymphdiagnostik mit TCPC- oder TCPP-HSA
und Gadolinium-HSA
5.1
5.2
5.3
5.4
5.5
Einleitung
Die Diagnostik von Lymphwegen mit TCPC – HSA
Diagnostik von Lymphwegen und reaktiv veränderten Lymphknoten des
Kaninchens mit TCPC – HSA
Die Darstellung von Lymphbahnen und Lymphknoten mit Gd-HSA
Diskussion
Kapitel 6
Perspektiven
6.1
6.2
6.3
Tumordiagnostik mit Gadolinium-HSA
Die Behandlung der rheumatoiden Arthitis mit Methotrexat-Albumin
Die Konjugierung von Hydrocortison, Prednison und Dexamethason an HSA
4
Kapitel 7
Zusammenfassung
7.1.1 Laserfluoreszenzdiagnostik mit 5-Aminofluorescein - Albumin (AFLc-HSA)
7.1.2 Albuminvermittelte Chemotherapie
7.1.3 Albuminvermittelte Sentinel-Lymph-Node-Diagnostik
7.2
Schlußfolgerung
Kapitel 8
Literatur
Kapitel 9
Danksagung
5
Kapitel 1
Einleitung und Fragestellung
1.1
Das Konzept der gezielten Tumortherapie mit makromolekularen Trägerstoffen
Paul Ehrlich (1854 – 1915) prägte als erster den Begriff der Chemotherapie (1). Chemi-
sche Substanzen sollten ohne Mithilfe körpereigener Abwehrvorgänge im Stande sein,
Mikroorganismen zu töten, ohne den Makroorganismus zu schädigen ( = Therapia
magna sterilisans). Gewarnt durch Nebenwirkungen erster Präparate und angeregt durch
die Entdeckung von Antitoxinen im Serum, entwickelte Ehrlich schon damals Vorstel-
lungen einer gezielten medikamentösen Therapie, welche über den Einsatz von Träger-
stoffen, der „Haptophore“, den Wirkstoff, die „Toxophore“, in den Tumor einschließen
soll. Dieses Prinzip wurde von ihm mit dem einer Zauberkugel ( = magic bullet) verglichen.
Heutzutage wird dieses Prinzip des gezielten Einschließens von Wirksubstanzen im
Tumorgewebe „drug targeting“ genannt. Jedoch ist bislang aber nur wenig realisiert.
Die meisten der zur Tumortherapie verwendeten Substanzen sind niedermolekular
(Molmasse < 1000 g/Mol) und passieren Tumorgewebe nur über einen kurzen Zeit-
raum. Zudem bewirkt das geringe Molekulargewicht eine weite Verbreitung im gesundem Organismus mit einer dadurch bedingten Schädigung physiologisch proliferieren-
den Gewebes. Auch werden die meisten Wirksubstanzen rasch eleminiert, was zur Folge hat, daß die Plasmazeiten der meisten Zytostatika unter einer Stunde liegen (2-5).
Dies wiederum hat zur Folge, daß das Zeitdauer, in dem niedermolekulare Substanzen
in das Tumorgewebe eindringen und dort ihre Wirkung entfalten sollten, sehr kurz ist
(6). Eigentlich müßte in Kenntnis der pharmakokinetischen Eigenschaften niedermole-
kularer Substanzen die Applikation wiederholt und in kurzzeitigen Abständen erfolgen,
doch gerade bei den meisten Chemotherapeutika verbietet die systemische Toxizität ein
solches Behandlungsschema.
6
Daher wurde schon in den 60er Jahren versucht, die Wirkung von Zytostatika durch
Koppelung an makromolekulare Trägersysteme zu verbessern (7-9). Doch bislang blieb
ein durchschlagender Erfolg in der Tumortherapie aus.
Eine wesentliche Eigenschaft maligner Tumoren ist die Neoangiogenese. Induziert wird
sie durch das Tumorwachstum selbst, denn ohne eine Einsprossung neuer Gefäße würde
die Tumorversorgung bald zum Erliegen kommen. Bereits ab einer Tumorgröße von 3
mm3 ist die Ernährung des Tumores durch Diffusion nicht mehr gewährleistet (10).
Durch eine Vielzahl von Mediatoren, wie z. B. dem „basic fibroblast growth factor“
(BFGF) oder dem „vascular endothelial growth factor „(VEGF) wird die Ge-
fäßeinsprossung in das Tumorgewebe induziert (11-14). Aber nicht alle Tumorareale
werden gleichmäßig durchblutet. Gerade in den zentralen Tumoranteilen bilden sich
Nekrosen. Denn hier übersteigt der deutlich erhöhte interstitielle Druck im Tumor von
bis zu 50 mm Hg den intravasalen Druck (15-17), was wiederum zu einer Verminde-
rung des Blutflusses und zu einem Gefäßkollaps führt (18). Begünstigt wird dieses Phänomen durch das in der Regel weitgehende Fehlen funktionierender Lymphdrainagen,
welches einen Rückstau makromolekularer Substanzen im Tumor bewirkt.
Ganz anders ist die Situation in der Tumorperipherie, den Arealen höchster Zellproliferation. Hier übersteigt der intravasale Druck den interstitiellen. Eine Vielzahl von fe-
nestrierten Kapillaren fördert hohe kapilläre Filtrationsraten, welche 10 - 1000fach höher sein können als im normalen Gewebe (19). So werden bei verschiedenen Rattentu-
moren 6 – 14 % des Plasmas in den extravasalen Raum der Tumorperipherie abgegeben
(20-21).
Mit dieser hohen Filtrationsrate geht die Besonderheit einher, daß fenestrierte Tumorkapillare Makromoleküle nicht zurückhalten. Und weil bei malignen Tumoren in der
Regel ein funktionstüchtiges lymphatisches System fehlt (22), kommt es zu einer Ak-
kulumation von Makromolekülen im Tumorgewebe, im Englischen „enhanced permeability and retention“ genannt (23).
7
Während für den Eintritt der Makromoleküle in das Interstitium des Tumors der Blutfluß (Konvektion) verantwortlich ist, bestimmt nun die Diffusion die weitere Vertei-
lung. Diese ist in erster Linie abhängig von der Molekülgröße (24-25). Makromoleküle,
wie z. B. Liposomen (400 – 1.000 kDa) oder Immunglobuline (ca. 150 kDa) diffun-
dieren nur sehr langsam. Ein IgG benötigt für die Überwindung einer Strecke von 1 mm
ca. 2 Tage, ein kleineres Makromolekül wie Albumin (66439 Da) diffundiert ca. 10fach
schneller (26-28). Niedermolekulare Substanzen diffundieren jedoch weitaus schneller.
Substanzen mit einem MG von bis zu 1.000 diffundieren binnen weniger Minuten bis
Stunden aus dem Bereich der Tumorproliferationszone entweder zurück in die Blutzir-
kulation oder werden aus dem umgebenden Interstitium abgeschwemmt. Zusammenfassend gilt jedoch, daß gerade in den proliferationsaktiven Arealen solider Tumoren Makromoleküle akkumulieren.
Das Konzept der makromolekularen Trägersysteme wurde an zahlreichen Verbindungen
erprobt, von denen allerdings nur wenige Eingang in die klinische Prüfung erfuhren.
Grundsätzlich lassen sich zwei verschiedene Trägersysteme unterscheiden.
Partikuläre Trägerssysteme
Eine klinische Bedeutung für partikuläre Trägersysteme haben Liposomen erlangt, welche mit ihrer Doppelschichtmembran die eigentliche Wirksubstanz umschließen (29-
32). Je nach Herstellungsverfahren haben diese Partikel einen Durchmesser von 50 nm
bis 1 µm. Liposomen können mit der Zellmembran verschmelzen und so die in der inneren wässrigen Phase enthaltene Wirksubstanzen in die Tumorzellen einschleusen. Durch
eine selektive Instillation von Liposomen soll dadurch eine gezielte Abgabe von Substanzen in den Tumor erreicht werden.
Polymere Trägersysteme
Polymere Trägersysteme sind entweder biologische Makromoleküle, wie z. B. monoklonale Antikörper, oder synthetische Makromoleküle, wie z. B. Polysaccaride oder
Polyäthylenglycol. Monoklonale Antikörper, 1975 von Köhler und Milstein erstmals
hergestellt (33), sollen im Rahmen einer passiven Immuntherapie im Patienten spezifisch Tumorzellen auffinden und zerstören. Ihre Aktivität entfalten Antikörper nach
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Bindung an der Tumorzelle über die Blockierung von Signaltransduktionswegen, wie z.
B. Inhibierung von Proliferationsreizen, lokale Initiierung der Komplementkaskade oder
durch Rekrutierung von Effektorzellen (34-36). Trotz zahlreicher Therapiestudien blieben die Erfolge jedoch aus. Probleme bereiteten vor allem die nach wiederholter An-
wendung regelmäßig auftretenden blockierenden humanen Anti-Maus-Antikörper. Erst
die Entwicklung rekombinanter humanisierter Antikörper Mitte der 90er Jahre ermög-
lichte wiederholte Therapiezyklen. Zwischenzeitlich sind von der amerikanischen Food
and Drug Administration (FDA) neun Antikörper mit unterschiedlicher Indikation zu-
gelassen. Auch in Europa wurde der humanisierte Antikörper Tratuzumab (Herceptin)
zugelassen, welcher HER2-überexprimierende Mammakarzinome erkennt. Während
hingegenen dieser Antikörper als Monotherapeutikum in ca. 15% ein Ansprechen zeigt
(37), kann dieser Effekt durch gleichzeitige Verwendung verschiedener Chemothera-
peutika auf ca. 60% gesteigert werden (38). Ähnliches gilt für einen weiteren Antikörper C225, der den von vielen epithelialen Tumoren überexprimierenden „epidermal
growth factor receptor“ (EGF-R) erkennt (39). Auch hier kann die alleinige Wirkung
des Antikörpers durch den gleichzeitigen Einsatz chemotherapeutischer Substanzen
deutlich gesteigert werden (40). Ein generelles Problem der Antikörpertherapie solider
Tumoren liegt aber zum einen in der unzureichenden Zugänglichkeit des Zielantigens
und zum anderen dem fehlenden Vorhandensein eines tumorassoziierten Antigens überhaupt. Ebenfalls ist die Verwendung von Antikörperkonjugaten, bei denen der Antikör-
per als Vehikel für Chemotherapeutika oder Radionukleide dient, Gegenstand klinischer
Studien an verschiedenen Tumorentitäten (41-42).
Bei den synthetischen Makromolekülen konnte ein Polyethylenglycolkonjugat, die
PEG-L-Asparaginase, bis zur klinischen Zulassung entwickelt werden. Hierbei wird
Asparaginase kovalent an Polyethylenglykol (PEG) gebunden, wodurch eine verlän-
gerte Halbwertszeit und ein verbessertes Ansprechen auf Lymphosarkome und andere
Mäusetumore erreicht werden konnte (43). Inzwischen ist L-Asparaginase-PEG (Oncaspar) bei akuten lymphoblastischen Leukämien im Kindesalter als therapeutische
Option etabliert (44-46), wobei auch hier über eine Wirkungsverstärkung in Kombination mit Methotrexat, Vincristin und Prednison berichtet wird (47). Auch eine kovalente
Bindung von PEG an Interferon α2a (Pegasys) oder PEG-Interferon α2b (PegIntron)
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bewirkt eine Wirkungsverstärkung in der Behandlung der chronischen Hepatitis C gegenüber der Kombinationstherapie ohne PEG (48-49).
Weitere synthetische Makromoleküle stellen die supramagnetischen monocristallinen
Eisenoxide (MION) oder ultrakleine supramagnetische Eisenoxidpartikel (USPIO) dar.
MIONs bestehen aus einem kristallinen Eisenoxidkern (Durchmesser ca. 6,5 nm) und
einer Carboxydextranhülle. Der hydrodynamische Durchmesser der Partikel beträgt ca.
20 – 40 nm. MIONs werden von der Tumorzelle phagozytiert, wobei das dadurch ein-
geschleuste Eisenoxid kernspintomographisch nachgewiesen werden kann. Allerdings
sind die Zirkulationszeiten kurz, da die Polysaccharide effektiv vom retikuloendothelischen System (RES) oder der Leber abgefangen werden (50-51).
Auf Grund der bisherigen Erfahrungen mit makromolekularen Trägersystemen sollte
ein Konjugat, welches als „drug carrier“ fungieren soll, folgende Eigenschaften besitzen
(52):
•
•
•
•
•
1.2
Keine Immunogenität oder Toxizität des Trägermoleküles
Gewährleistung einer stabilen chemischen Koppelung zwischen Trägermolekül und
Wirksubstanz
Lange Verweildauer des Trägermoleküles im Kreislauf
Hohe Aufnahmerate des Trägermoleküles im Tumor
Die Wirksubstanz soll erst im Tumorgewebe freigesetzt werden.
Die Eigenschaften von Serum-Albumin
Humanes Serumalbumin besteht aus 585 Aminosäuren. Sein Molekulargewicht beträgt
66.439 Dalton (D). Albumin hat die Form eines rotationselipsoiden Körpers ähnlich
dem einer Zigarre. Die Längsachse mißt 14 nm, die Querachse 4 nm. Im Inneren befin-
det sich ein hydrophober Kanal. Während an den Öffnungen positive Ladungen vorherrschen, so befinden sich an der Gesamtoberfläche negative Ladungen (53).
Albumine sind gut wasserlösliche Proteine mit einem isoelektrischen Punkt bei pH 4,8.
Im Blutplasma zirkulieren ca. 100 weitere Proteine, jedoch stellt Albumin mit ca. 60 %
10
den größten Anteil dar. Beim Menschen schwankt der Serumalbuminspiegel zwischen
3,5 – 5,5 g/dl.
Bereits kurze Zeit nach intravenöser Injektion sind ca. 50 % der applizierten Albuminmenge ins Interstitium diffundiert. Von dort gelangt Albumin über das Lymphbahnsy-
stem in das Blut zurück. Im Schnitt zirkuliert jedes Albuminmolekül 15.000 mal durch
den Kreislauf, macht dabei 15 Passagen durch das Gefäßendothel um über das lymphatische Gewebe innerhalb weniger Tage wieder in die systemische Zirkulation zu gelangen (54-56). Die Halbwertszeit von humanem Serumalbumin beträgt ca. 19 Tage. Täg-
lich müssen ca. 2,5 % Albumin durch Neusynthese ersetzt werden. Der Albuminverlust
ist vor allem durch Verstoffwechselung bedingt, die renale Filtration ist ohne Belang
(57). Der Hauptteil des physiologischen Albuminabbaues findet in den Lysosomen von
Fibroblasten der Haut und der Muskulatur statt (58-59). Hauptsyntheseort von Albumin
sind die Hepatozyten der Leber. Täglich produziert eine gesunde Person ca. 11 ±3 g
Albumin (60-64).
Bereits 1839 entdeckte H. Ancell, daß Albumin bei der Verhinderung von Ödemen eine
Rolle spielt und in die Transportprozesse im Blut involviert sei (65). In der Tat tragen
die Plasmaproteine und davon vor allem Albumin mit 60 % wesentlich zur Aufrechterhaltung des kolloidosmotischen Druckes bei. Ein Mangel an Albumin reduziert somit
den onkotischen Druck im Plasma, was zu einer generellen Ödemneigung führt.
Schließlich stellen Plasmaproteine, und damit vor allem Albumine, als schwache Säuren
eine Pufferkapazität dar, welche stärkere pH-Schwankungen des Blutes zu verhindern
helfen (66). Eine weitere wichtige Eigenschaft von Albumin ist der Transport von verschiedenen Stoffen im Blut. Die zu transportierenden Substanzen werden dabei aber
nicht kovalent, sondern adhäsiv gebunden. Eine Vielzahl von Liganden, wie z. B. Fettsäuren, Bilirubin, Gallensäure, Hämatin, Histamin, Thyroxin oder Thryptophan, sind
beschrieben. Auch Kalzium oder Chlorid werden durch Albumin gebunden. Ebenfalls
werden über 90 % der niedermokelularen Medikamente, wie z. B. Penizillin, Sulfonamide, Diazepan, Digitoxin, Methotrexat, Indozyanin, temporär durch Albumin im
Plasma transportiert (67). Die Liganden werden vorwiegend in der Leber oder den
Glomeruli der Nieren von Albumin abgelöst. Gerade in der Leber wird dann ein Großteil der so freigesetzten Medikamente metabolisiert und ausgeschieden (68).
11
Albumin stellt mit 150 – 200 g im Plasma eine wichtige Eiweißreserve dar. Ein Molekül
Albumin beinhält dabei 779 Stickstoffatome. Diese Menge stellt eine bei Bedarf sehr
schnell verfügbare Eiweiß- und Stickstoffreserve im Organismus dar (54). Die Ami-
nosäuren des dominierenden Plasmaproteins Albumin enthalten insgesamt ca. 30 mal
mehr Energie als das Glucoseangebot des Blutes. Etwa 200 mal mehr Aminosäuren sind
albumingebunden verfügbar als frei zirkulierende Aminosäuren (57).
1.3
Der Albuminmetabolismus in malignen Tumoren
Die Vorstellung, daß Eiweiße, wie z. B. Albumin, eine wichtige Rolle in der Versorgung maligner Tumoren darstellen, wurde bereits 1948 von Mider (69) beschrieben.
Ihnen war aufgefallen, daß sich maligne Tumoren wie Stickstofffallen verhalten, d. h.
mehr stickstoffhaltige Substrate, wie z. B. Aminosäuren, aufnehmen als abgeben. We-
nige Jahre später zeigte Babson und Winnick (70), daß maligne Tumoren eher Plasma-
proteine als Aminosäuren verstoffwechseln, und folgerten daraus, daß die Tumorkachexie erkrankter Patienten durch den erhöhten Eiweißstoffwechsel maligner Tumoren be-
dingt ist. Erstmals wurde von diesen Autoren auf die Möglichkeit, Medikamente an Albumin zu binden und in maligne Tumoren einzuschleusen, hingewiesen (71-72). Allerdings wurde dem Plasmaeiweißkatabolismus maligner Tumoren im weiteren nicht viel
Beachtung geschenkt. In Übersichtsarbeiten über Tumorkachexie finden sich diesbezüglich nur wenig Hinweise (73-77). Möglicherweise war dies methodisch bedingt,
denn nach Markierung von Plasmaeiweißen mit Radiojod, 3H oder 14 C entstehen nach
Abbau des Proteins sehr rasch eine Vielzahl niedermolekularer Katabolite, die eine exakte Zuordnung und Verteilung des Proteins im Körper nicht möglich machen (78-81).
Diese radioaktiv markierten Aminosäuren oder Proteinspaltprodukte unterliegen dann
normalen niedermolekularen Verteilungsvorgängen und werden entweder ausgeschieden oder in die Neusynthese anderer Proteine eingeschleust (82-83).
Um diesen Schwierigkeiten zu begegnen, wurden in den letzten Jahren metabolisch stabile sog. „kumulative“ Markierungstechniken entwickelt (84-87). Wesentliches Merk-
mal dieser stabilen Markierung ist, daß der radioaktive Marker am Ort des Abbaus, also
12
bei Proteinen am Lysosom, verbleibt. Diese metabolisch stabilen Marker bestehen meist
aus einem Kohlenhydrat, welches mit dem radioaktiven Marker verknüpft ist. Mit Hilfe
dieser metabolischen Marker war es möglich, den Nachweis des Plasmaabaues von Gesunden zu untersuchen (88-89). Hierbei wurden Fibroblasten als wesentlicher Ort des
Albuminabbaues erkannt (59).
1.4
Die Entwicklung von Albuminkonjugaten
Ende der 80er Jahre übernahmen Hansjörg Sinn und seine Mitarbeiter das Prinzip der
metabolisch stabilen bwz. kumulativen Markierungstechniken, um der Frage nachzuge-
hen, ob und in welcher Weise Albumin als Trägersubstanz genutzt werden kann. Zudem
sollte untersucht werden, ob Albumin durch die Koppelungstechnik in seiner pharmakokinetischen und biologischen Funktion beeinflußt wird und wie hoch Albumin als
Trägersubstanz beladen werden darf. Ausgehend von den Untersuchungen von Pitman
(84), welcher Tyraminzellobiose (TCB) zur Markierung von Low-Density-Lipoproteinen in der Arterioskleroseforschung genutzt hatte, wurde ein kumulativer 131Jod-
Label mit Tyramindesoxysorbitol (TDS) entwickelt, welcher kovalent an Albumin gebunden werden konnte (87). Nach intravenöser Injektion dieses kumulativ radioaktiv
markierten 131I-TDS-Albumins zeigte sich bei O-342 (tierexperimenteller Ovarialtumor)
tragenden Ratten auch 72 h nach i. v. Applikation eine deutlich erhöhte Aufnahme des
markierten Albumins im Tumor. In weiteren Untersuchungen mit 131I-TDS-Albumin
fand sich gegenüber nativem Albumin keine Veränderung in der Plasmahalbwertszeit.
Auch war als Ausdruck der stabilen kovalenten Bindung und alleinigen intrazellulären
Metabolisierung von 131I-TDS-Albumin gegenüber konventionell markiertem 131I-
Albumin keine Aufnahme von 131 I-Albumin-Spaltprodukten in der Schilddrüse der
Versuchstiere zu finden (90). Diese Ergebnisse wurden auch mit einem weiteren kumulativen Marker, dem 111Indium-Diethylentriamin-Pentaessigsäure (111 In-DTPA) bestä-
tigt. So zeigte sich bei Walker-256-Karzinom tragenden Ratten 48 h nach intravenöser
Applikation ca. 20 % der initial verabreichten Substanz im Tumor (91). Sowohl 131JodTDS wie auch 111Indium-DTPA markiertes Albumin war in der Lage, den Albumin-
stoffwechsel im tumortragenden Tier darzustellen. Die Pharmakokinetik entsprach dabei natürlichem Albumin, wobei sich bei der Ratte keine Unterschiede in den Zirkula-
13
tionzeiten zwischen mit 111Indium markiertem Ratten-Serumalbumin, humanem Serum-
albumin oder bovinen Serumalbumin zeigte (92) . Allerdings erwies sich, daß lediglich
eine schonende Beladung von 1 : 1 molar eine stabile Markierung und eine dem natürlichen Albumin entsprechende Zirkulation im Plasma erlaubt (93). Werden mehr Moleküle an Albumin gebunden, so verkürzen sich die Zirkulationszeiten erheblich, d. h.
Albumin verändert seine Tertiärstruktur und wird als Fremdprotein vom retikuloen-
dothelialen System (RES) erkannt und abgefangen. Immunologische Reaktionen wer-
den ausgelöst, was eine wiederholte Injektion unmöglich macht. Dies gilt auch für Koppelungsverfahren, wie z. B. der Bindung von Fluorescein-Isothiozyanat an Albumin
(Fa. Sigma, Deisenhofen), bei denen höhere Beladungsraten für Albumin vorgenommen
wurden (Abb. 1).
111In-DTPA-RSA (Ratten-Serumalbumin)
111In-DTPA-HSA (Humanes Serumalbumin)
cpm
111In-DTPA-BSA (Bovines Serumalbumin)
1000000
111In-DTPA-AFLc-HSA (5-Aminofluorescein-HSA)
111In-DTPA-FITC-BSA (Fluorescein-Isothiozyanat-Albumin)
100000
10000
1000
100
1 0
1
0
1
4
h
2 4
4 8
9 6
Abb. 1: Die Zirkulationszeiten 1 : 1 molarer Beladungen mit 111Indium-DTPA an verschiedene
Albumine, sowie die 1 : 1 molare Beladung von 5-Aminofluorescein an HSA und die hochmolare
Beladung von FITC-Albumin.
14
1.5
Methotrexat-Albumin
Präklinische Untersuchungen
Schon seit Ende der 60er Jahre hatte eine Vielzahl von Arbeitsgruppen Methotrexat-
Albumin-Konjugate synthetisiert und in der Regel, um einen besseren therapeutischen
Effekt zu erzielen, hohe Beladungsraten (bis zu 56 Methotrexat-Moleküle pro Albumin)
gewählt (Tabelle 1).
Tabelle 1: Die Beladungsraten von 1 Mol Albumin mit x Mol MTX
Magenat et al. 1969 (94)
MTX-(6, 11, 17) - HSA
Shen et al. 1984 (95)
MTX-(17) - HSA
Bures et al. 1988 (96)
MTX-(26) - HSA
Bures et al. 1990 (97)
MTX-(56) - HSA
Kim et al. 1993 (98)
MTX-(17) - HSA
Sett et al. 1993 (99)
MTX-(30) – mannosyl - HSA
Diese Konjugate waren in Zellkultur wie auch im Tierexperiment teilweise erfolgreich,
doch wurde über eine klinische Anwendung nicht berichtet. Es bleibt zu vermuten, daß
die hohen Beladungsraten bei Albumin zu verkürzten Zirkulationszeiten führten und
auch allergische Reaktionen eine weitere Anwendung verhinderten.
Nach seinen Erfahrungen mit kumulativen Marken entschlossen sich Sinn und seine
Mitarbeiter zu einer möglichst schonenden Koppelung von Methotrexat an Albumin.
Dabei wurde die γ-Carboxylgruppe von Methotrexat durch eine Reaktion mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und Hydroxysuccinimid (HSI) aktiviert, um dann kovalent
eine Säureamidbindung mit einem Lysinrest des Albumins zu knüpfen (100). Die Koppelungstechnik wurde so verfeinert, daß Quervernetzungen (cross-linking) des Albu-
mins, welche eine Veränderung des Proteins zur Folge hätte, vermieden werden konn-
ten. Entsprechend der Konzentrationsverhältnisse gelang so eine Beladung von 1,3 Mol
15
Methotrexat auf 1 Mol Albumin. In pharmakokinetischen Studien an Ratten zeigte sich,
daß die Verweildauer von MTX-HSA natürlichem HSA entsprach. Auch konnte 1 - 2
Tage nach intravenöser Applikation des Albuminkonjugates an verschiedenen tierexperimentellen Tumoren eine bis zu 20%ige Aufnahme im Tumor nachgewiesen werden.
Diese Konjugateigenschaften konnten jedoch durch eine höhere Beladungsrate des Al-
bumin deutlich beeinflußt werden. Waren nach Applikation von MTX-RSA 1 : 1 molar
15 % der Substanz nach 24 h in Zirkulation, so wurde dies bei einer 10 : 1 molaren Beladung auf 3 % verkürzt (93). Entsprechend zeigte die Leber eine 7fach erhöhte Aufnahme des durch die höhere Beladung denaturierten Proteins, wie Analysen in der
hochauflösenden Flüssigkeitschromatographie (High Performance Liquid Chromatographie, HPLC) bestätigten. Denn je höher Albumin beladen wird, desto breiter und
atypischer ist das Albuminsignal in der HPLC verglichen mit nativem Albumin. Auch
die Aufnahme des Konjugates im Tumor wurde durch die hohe Beladung beeinflußt.
Aufgrund dieser Ergebnisse wurden für weitere präklinische Untersuchungen das MTXAlbumin (MTX-SA) Konjugat mit der nahezu 1 : 1 molaren Beladungsrate gewählt, da
hier lange Zirkulationszeiten, hohe Tumoraufnahmeraten und fehlende allergische Reaktionen zu vermuten waren.
Die in-vivo Prüfung des Konjugates erfolgte am Walker-256-Karzinom der Ratte, wo-
bei die Wirkung des Konjugates mit der von freiem MTX verglichen wurde. Als Dosis
limitierende Toxizität (DLT) wurde für beide Gruppen eine 4fach wiederholte i. v. Injektion an den Tagen 1, 3, 8 und 10 festgestellt. Danach traten typische MTX-Neben-
wirkungen, wie Durchfall, Mukositis und struppiges Fell auf. Somit wurde die Effekti-
vität in Höhe der maximal tolerablen Dosis (MTD) für beide Gruppen als repetitive Injektionen von 3 x 2mg MTX/kg Körpergewicht (KG) oder 3 x 2mg MTX-SA/kg KG
untersucht. MTX erreichte dabei eine Heilrate von 55 %, während hingegen sie für
MTX-SA bei 60 % lag. Durch eine Mischung von freiem MTX mit MTX-SA wurde bei
gleichem Applikationsschema und gleicher Dosis eine Heilrate von 70 % erreicht (101).
Die Effektivität von MTX-Konjugaten gegenüber freiem MTX bestätigte sich ebenfalls
bei Dunning R 3327 Prostataadenokarzinomen an Copenhagen-Ratten, wo in einer Dosierung 4 x 2 mg/MTX-SA/kg KG eine deutlich verzögerte Tumorprogression gegen-
16
über freiem MTX erreicht wurde (102). Auch an verschiedenen Xenograft-Tumoren,
wie z. B. Nierenzell-, Blasen-, Kolon-, Bronchial-, Pankreas-, Mamma-Karzinomen wie
auch bei Mesotheliomen und malignen Melanomen, konnte eine verbesserte Wirksamkeit von MTX-HSA gegenüber freiem MTX nachgewiesen werden. Zwischenzeitlich
fand sich auch eine verbesserte Wirksamkeit von MTX-HSA an 2 von 4 malignen
Gliomxenografts (103-104).
Klinische Studien mit MTX-HSA
Ermutigt durch zahlreiche präklinische Untersuchungen mit MTX-HSA erfolgte 1997
eine erste klinische Phase-I-Studie an 17 Tumorpatienten mit MTX-HSA. Es erfolgte
eine vorsichtige Dosiseskalation mit wöchentlichen Injektionen ab 20 mg/m2. Ab einer
Dosis von 40 mg/m2 pro Woche wurden erste Toxizitätssymptome (Common-Toxic-
Criteria: CTC Grade) beobachtet. Insgesamt erschien eine wöchentliche Applikation
von 50 – 60 mg/m2 als gut verträglich.
Unerwünschte Arzneimittelreaktionen, wie z. B. leichte Übelkeit, Diarrhoe, Obstipation,
Epistaxis, Mukositis oder Müdigkeit, bildeten sich durch eine Therapieunterbrechung
innerhalb von 1 – 2 Wochen komplett zurück. In keinem Fall war die Gabe von Folinsäure (Leucovorin) notwendig. An hämatologischen oder laborchemischen Veränderungen fanden sich dreimal eine Thrombozytopenie (2 x Grad 2, 1 x Grad 4) sowie
viermal ein Anstieg der Transaminasen auf Grad 3. Auch hier konnte eine Rückbildung
der Veränderungen durch eine Spreizung des Applikationsschemas erreicht werden.
Bei den 10 Patienten, welche mit einer wöchentlichen Applikation von 50 bzw. 60
mg/m2 behandelt wurden, kam es in drei Fällen (1 x Pleuramesotheliom, 2 x Hyperne-
phrom) zu einer langanhaltenden Remission (105).
Die Ergebnisse der präklinischen und klinischen Erfahrungen mit MTX-HSA bildeten
die Grundlage für eine Lizenzvergabe von MTX-HSA an Klinge-Pharma, München,
jetzt Fujisawa-Deutschland, um MTX-HSA im Rahmen eines Zulassungsverfahrens
weiter zu untersuchen.
17
1.6
Fragestellung und Zielsetzung der Arbeit
Aufgabe dieser Arbeit war es, die Möglichkeit von Albumin als vielfach verwendbarer
Trägerstoff in der Diagnostik und Therapie maligner Tumoren aufzuzeigen. Albumin
wurde hierzu bei verschiedenen Aufgabestellungen eingesetzt:
1.6.1 Die laserinduzierte Fluoreszenzdiagnostik mit 5-Aminofluorescein-HSA bei
malignen Gliomen
Es sollte die Frage geklärt werden, ob durch eine albuminvermittelte Fluoreszenzanfärbung bei malignen Gliomen eine intraoperative Tumordarstellung möglich sei, wobei
folgende Eigenschaften an den albumingebundenen Farbstoff gestellt wurden:
•
•
•
•
Fehlende Toxizität
Hohe, selektive und langanhaltende Anreicherung des Farbstoffkonjugates im
Tumorgewebe
Keine oder nur unwesentliche Ausbleichung des Farbstoffes
Hohe Kontrastierung und Detektion des Farbstoffes ohne Zuhilfenahme optischer
Verstärkersysteme.
1.6.2 Albuminvermittelte Chemotherapie mit Aminopterin-HSA
Gerade besonders toxische Chemotherapeutika erscheinen für eine Albuminbeladung
interessant, da durch die kovalente Bindung des Chemotherapeutikums an den Träger-
stoff Albumin ein „pro-drug“ ensteht, welcher dadurch bedingt eine reduzierte systemi-
sche Toxizität aufweist und die Wirksubstanz erst im Lysosom der Tumorzelle freisetzt.
Ziel war es, das bereits Mitte der 50er Jahre verwendete hochwirksame aber systemisch
zu toxische Antifolat Aminopterin an Albunim zu binden und es im Tierexperiment auf
seine pharmakokinetischen Eigenschaften, seine Verteilung, seine Verträglichkeit und
Wirksamkeit zu untersuchen.
18
1.6.3 Klinische Phase-I und II-Studien mit Methotrexat-Albumin (MTX-HSA)
bei Patienten mit rezidivierenden malignen Gehirntumoren
Nach Auslizensierung der von Sinn entwickelten Patente (MTX-HSA; AFlc-HSA etc.)
an Firma Klinge-Pharma, jetzt Fujisawa-Deutschland, wurde entsprechend dem Arzneimittelgesetz eine zweite Phase-I-Studie mit aufsteigenden Dosierungen von 50
mg/m2; 70 mg/m2; 80 mg/m2 und 90 mg/m2 MTX-HSA in zweiwöchentlichen Abstän-
den bei insgesamt 23 Karzinompatienten initiiert. Wir selbst nahmen an dieser Studie
mit vier Patienten teil. Danach wurde unter der Leitung der Neurochirurgischen Universitätsklinik Heidelberg eine vergleichenden Phase-II-Studie bei Patienten mit primären
und sekundären Glioblastomrezidiven veranlaßt.
1.6.4
Albuminvermittelte Lymphdiagnostik mit Tetra(4-Carboxy-PhenylChlorin- (TCPC) oder Tetra(4-Carboxy-Phenyl-Porphyrin (TCPP) HSA
und Gadolinium-HSA
Durch Einführung des „sentinel lymph note“ (SLN) Konzeptes hat die Diagnostik und
Therapie von tumordrainierende Lymphbahnen und deren Lymphknoten eine Renais-
sance erfahren. Mit 99mTc-HSA ist präoperativ eine Lymphabstromszintigraphie möglich, intraoperativ kann dann der SLN mit speziellen Gammasonden und auch unter
Zuhilfenahme von intraoperativ appliziertem Patentblau aufgesucht werden. Da bislang
hauptsächlich kolloidales 99mTc-HSA mittels der Lymphabstromszintigraphie und in-
traoperativ Gammasonden zum Einsatz kommen, sollte versucht werden, ob nicht auch
durch eine Fluoreszenzbeladung von HSA eine direkte Darstellung von Lymphwegen
und von im Abstromgebiet liegenden Lymphknoten (SLN) möglich sei. Dies sollte
tierexperimentell durch eine Beladung von Tetra(4-Carboxy-Phenyl-Chlorin (TCPC)
oder Tetra(4-Carboxy-Phenyl-Porphyrin (TCPP) an HSA und auch kernspintomographisch mit Gadolinium-HSA untersucht werden.
19
Kapitel 2
Intraoperative Fluoreszenzdiagnostik maligner Gliome mit
5-Aminofluorescein-HSA (AFLc-HSA)
2.1
Einführung
Als Anfang der 90er Jahre in unserer Klinik unter Leitung von Albert (1-2) das frühe
postoperative Kernspintomogramm vermehrt zur Beurteilung der Radikalität nach mikrochirurgischer Resektion von Glioblastomen herangezogen wurde, stellten er und
seine Mitarbeiter fest, daß in vielen Fällen solide kontrastmittelaufnehmende Tumoranteile verblieben waren, die der intraoperativen Wahrnehmung des Neurochirurgen trotz
Verwendung moderner Operationsmikroskope entgangen waren. Diese soliden und im
frühen postoperativen Kernspintomogramm entdeckten Tumoranteile stellten dann im
weiteren Verlauf den Ursprung des klinisch manifesten Tumorrezidives dar und waren
statistisch gesehen prognostisch von entscheidender Bedeutung.
Aus diesen Beobachtungen heraus ergab sich unmittelbar die Konsequenz einer verbesserten intraoperativen Darstellung von solidem Tumorgewebe. Auch wenn andere Verfahren, wie z. B. Neuronavigation, intraoperatives CT oder Kernspintomogramm und
Ultraschall (3-9), ebenfalls Gegenstand intensiver wissenschaftlicher Betrachtungen
bezüglich der verbesserten intraoperativen Tumordarstellung sind, so galten unsere
Überlegungen der Verwendung fluoreszenzaktiver Substanzen, wie z. B. dem Fluore-
scein, welches bereits 1948 seinen Einsatz zur intraoperativen Darstellung von Gehirntumoren fand (10). Ähnlich den sonst zur Tumordiagnostik applizierten Kontrastmittel
passiert das Fluroescein-Natriumsalz die bei malignen Gliomen gestörte Blut-Hirn-
Schranke und lagert sich dann interstitiell im Tumorgewebe ab. Auf Grund der aber
schon im Jahre 1948 beschriebenen Penetration von Fluorescein ins umliegende Tumorödem ist eine lang anhaltende und selektive Darstellung von Tumorgewebe jedoch nur
bedingt möglich.
20
2.2
Physikalische Eigenschaften von 5-Aminofluorescein (AFL)
5([4,6-Dichlorotriazin-2-YL]Amino)-Fluorescein (5-Aminofluorescein, AFL) ist ein
hell leuchtender Fluoreszenzfarbstoff mit einem Molekulargewicht von 531,7 Dalton.
Folgende chemische Strukturformel liegt ihm zu Grunde (Abb.1):
Abb. 1: Chemische Struktur von 5-Aminofluorescein
AFL zeigt im Bereich von 200 bis 700 nm drei Absorptionsmaxima (238 nm, 269 nm
und 490 nm), wobei das Absorptionsmaximum bei 490 nm am größten ist. Sein Emis-
sionsmaximum liegt mit 519 nm nur wenig neben dem Absorptionsmaximum von 490
nm. Im Gegensatz zu vielen anderen fluoreszenzaktiven Substanzen ist AFL nicht photoaktiv im Sinne der Photodynamischen Therapie und zeichnet sich durch einen nur
geringen Ausbleicheffekt (sog. bleaching) aus (Abb. 2). AFL ist ähnlich dem in der
Humanmedizin verwendeten Dinatriumsalz-Fluorescein wasserlöslich und wird hauptsächlich renal eleminiert.
100
90
80
70
60
50
5-Aminofluorescein
40
30
20
10
0
1
5
10
15
20
25
30
Minuten
40
50
60
Abb.2: Ausbleichverhalten (sog. bleaching) von 5-Aminofluorescein bei einer maximalen Anregung bei 490 nm.
21
2.3
Die kovalente Bindung von 5-Aminofluorescein an Albumin (AFLc-HSA)
Ein Volumen von 65 mg 5-([4,6-Dichlorotriazin-2-yl]-Amino)-Fluorescein (AFL, Sig-
ma, Deisenhofen) wird in 3 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und wird unter kontinuierlichem langsamen Rühren zu 4 g humanem Serumalbumin 20 % (Pharma Dessau
GmbH, Dessau), in 20 ml Albuminlösung und 60 ml 0,34 Mol NaHCO3 gelöst, hinzugefügt. Während des Hinzufügens von AFL zur Proteinlösung färbt diese sich grün-gelb,
bleibt aber absolut klar. Ungefähr 45 Minuten später wird die Proteinlösung mit 350 ml
Ampuwa verdünnt. Verunreinigungen, wie z. B. ungebundenes Fluorescein oder
DMSO, werden dann vom gebundenen Protein AFLc-HSA durch Ultrafiltration (YM
30 Millipore) abgetrennt. Die Reinheit des hergestellten Proteinkonjugates wurde mittels der hochauflösenden Flüssigkeitschromatographie (HPLC) überprüft:
HPLC Bedingungen:
Vorsäule:
Phenomenex GFC - 4000, 4 mm L x 3 mm ID
1. Laufmittel:
0,25 Mol Li-acetat, 0,05 Mol Li-citrate pH 7,4 (Ampuwa)
Säule:
2. Laufmittel:
Fluß:
Gradient:
Zorbax GF 250
95% Methanol, 5% Wasser (HPLCgrad/Am-puwa)
0 -15 min Laufmittel 1 (100%); 1,0 ml/min
15 - 30 min Laufmittel 2 (von 0 auf 100%); 1,3 ml/min
30 - 45 min Laufmittel 2 (100%)
45 - 50 min Laufmittel 2 (von 100 auf 0%)
Druck:
Retentionszeiten für
AFLc-HSA:
50 - 60 min Laufmittel 1 (100%); 1,0 ml/min
ungefähr 65 Bar
dimere Albuminfraktion
monomere Albuminfraktion
ungebundene Albuminfraktion
22
8,25 min
9,16 min
31,34 min
100
µ V (%)
AFLc-HSA
80
60
40
20
0
0
10
20
30
Minuten
Abb. 3: Die Retetentionszeiten von AFLc-HSA in der HPLC
Bei der Überprüfung der Retentionszeiten für AFLc-HSA durch HPLC-SEC lag die
dimere Fraktion bei 8,53 Minuten, die monomere Fraktion bei 9,35 Minuten und ungebundenes AFL bei 33,3 Minuten. Die prozentualen Anteile betrugen für die dimere
Fraktion 1,63%, für die Albuminfraktion 99,81% und für ungebundenes AFL 1,57%
(Abb.3).
2.4
Die Markierung von AFLc-HSA mit radioaktivem 111Indium
Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) wird in DMSO in einer Konzentration von 20
mg/ml unter Erwärmung aufgelöst. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wird eine
1,2fache molare Menge Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und eine 10fache molare
Menge Hydroxysuccinimide (HSI) zugefügt. Über Nacht ist bei Raumtemperatur die
Reaktion zum Succinimidylester (DTPA-HSIE) vollzogen. Die klare, farblose DMSOLösung wird langsam einem zweifachen molarem Überschuß zu der Proteinlösung (10
mg AFLc-HSA/ml 0.17 M NaHCO3, pH 8.5) hinzugefügt. Über 15 Minuten bilden sich
weiße kolloidale Aggregate, welche nicht reagiertem DCC und noch in DMSO gelö-
23
stem di-Cyclohexyl-Harnstoff (DCH) entsprechen. Diese werden mit Hilfe eines Filters
entfernt (0,22 µm Millipore), während hingegen DMSO und freies DTPA durch Ultrafiltration (C30 Millipore) abgetrennt werden. DTPA-aktiviertes AFLc-HSA wird dann
mit 111InCl3 durch Hinzufügen einer entprechenden Menge Radioaktivität als ein 111In-
Citrat-Komplex an10 mg Protein gebunden. Direkt nach Hinzufügens des 111In-Citrat-
Komplexes werden ungebundenes 111In durch Ultrafiltration mit einer C30 Millipore
Einheit abgetrennt. Mit Hilfe dieser Technik können 98 % des verwendeten 111In kova-
lent an DTPA-AFLc-HSA gebunden werden. Um die Plasmazirkulationszeiten zu vergleichen, wurde AFLc-HSA auch in einer 3:1 molaren Beladung mit 111In-DTPA markiert. Ebenfalls wurde das käuflich zu erwerbende Fluorescein-Isothiozyanat (FITCSA) mit 111In-DTPA beladen.
2.5
Das C6-Gliom Modell
Weibliche, pathogenfreie (specific pathogen free, SPF) Sprague-Dawley-Ratten (n = 25)
mit einem Körpergewicht von 180 - 200 g wurden für die Fluoreszenzuntersuchungen
mit AFLc-HSA verwendet. Die Tiere wurden unter standardisierten SPF Bedingungen
in einem Mikroisolator gehalten.
Die C6-Gliom Zelllinie (11) wurde in Gewebekultur in 90 % DMEM Medium (PAA
Laboratories, Östereich) und 10 % fetalen Kälberserum (Gibco, Eggenstein) gehalten.
Die Analgosedierung der Versuchstiere erfolgte durch intraperitoneale Injektionen von
Ketanest (Park-Davis & Company, Berlin) und Rompun (Bayer, Leverkusen), danach
konnte der Kopf in einem stereotaktischen Ringsystem (David Kopf Instruments, USA)
fixiert werden. Nach Bohrlochtrepanation wurde in einer Geschwindigkeit von 2
mm/Minute eine 10 µl Hamilton Spritze, versehen mit einer 26-Gauge Nadel, in das
linke frontale Marklager der Ratte in einer Tiefe von 6 mm, 4 mm lateral des Bregmas
eingebracht. Nach Zurückziehen der Nadel um einen Millimeter erfolgte die intrazerebrale Injektion in einer Dosierung von 1 x 105 C6-Gliomzellen in 5 µl serumfreiem
DMEM Medium über einen Zeitrahmen von 5 Minuten (1 µl/Minute). Nach langsamem
Zurückziehen der Nadel (2 mm/Minute) wurde das Bohrloch mit Knochenwachs ver-
schlossen und die Haut vernäht. In mehr als 90 % der Tiere entwickelte sich ein solider
Tumor im linken frontalen Marklager. Typischerweise war eine Gewichtsstagnation ein
24
Frühsymptom bei ausreichender Tumorgröße von 4 - 5 mm im Durchmesser. Die
Tumorgewichte lagen zwischen 80 - 120 mg.
2.6
Die Plasmaclearance von AFLc-HSA
Diese pharmakokinetischen Untersuchungen von AFLc-HSA wurden an 7 nicht tumortragenden Tieren durchgeführt, welche 3,7 MBq 111In-DTPA-ALFc-HSA intravenös
appliziert bekamen. Die Plasmahalbwertszeit wurde durch Blutproben von 20 µl aus der
Schwanzvene nach 5 Minuten, 1 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h und 96 h ermittelt, wobei das
Blutvolumen der Tiere nach der Formel (0,06 x Körpergewicht x 0,77) berechnet wurde
(12). Die Plasmaproben wurden auf ihre Radioaktivität in einem γ–Zähler (Berthold,
Wildbad) untersucht. Insgesamt zeigte sich kein Unterschied in der Plasmahalbwertszeit
zwischen 111In-DTPA-ALFc-HSA und 111In-DTPA-HSA, was als Ausdruck einer der
nicht das Protein alterierenden und stabilen Beladung zu werten ist. Die Halbwertszeit
des Albuminkonjugates AFLc-HSA wurde mit 2,5 Tagen angegeben und entspricht der
normalen Halbwertszeit von Albumin bei der Ratte. Bereits bei eine Beladung von 3 : 1
molar AFLc-HSA wurden verkürzte Zirkulationszeiten beobachtet. Am deutlichsten
war der Unterschied bei Fluorescein-Isothiozyant-Albumin (FITC-Albumin, Fa. Sigma,
Deisenhofen), welches durch die Belandung deutlich verändert und 24 Stunden nach
intravenöser Applikation fast nicht mehr nachweisbar war (Abb. 4).
1000000
cpm
111In-DTPA-SA
100000
111In-DTPA-AFLc-SA 1:1
111In-DTPA -AFLc-SA 3:1
111In-DTPA-FITC-SA
10000
1000
100
10
1
0
1
4
8
h
24
48
72
96
Abb.4: Semilogarithmische Darstellung der Plasmahalbwertszeit vom AFLc-HSA in verschiedenen Beladungsraten verglichen mit nativem Albumin und FITC-SA
25
2.7
Die Aufnahme von 111In-DTPA-AFLc-HSA in das C6-Gliom
Szintigraphische Untersuchungen sollten die Aufnahme des Proteinkonjugates im Tu-
mor sowie seine Bioverteilung aufzeigen. Dazu wurden die Versuchstiere (n=5) 5 Minuten, 1 h, 4 h, 8 h und 24 h nach Applikation von 3,7 MBq 111In-DTPA-ALFc-HSA
szintigraphisch untersucht. Zudem wurden 24 h nach Applikation des radioaktiv mar-
kierten Proteinkonjugates die Rattengehirne entnommen, um die Radioaktivität im Ge-
hirn selbst im γ-Zähler untersuchen zu können. Die Aufnahme der Radioaktivität wurde
sowohl im gesamten Gehirn wie auch der rechten nicht tumortragenden Hemisphäre,
der linken tumortragenden Hemissphäre und nach Entnahme des Tumors in ihm selbst
gemessen.
Szintigraphisch fand sich kein Unterschied zwischen tumortragenden und nicht tumortragenden Tieren, so daß die Bestimmung der Aufnahme der Radioaktivität im C6-
Gliom der Rattengehirne nur im γ-Zähler möglich war. Insgesamt war der Anteil an
Radioaktivität mit 0,04 – 0,34 % an der Gesamtverteilung im Körper gering. Dennoch
fanden sich deutliche Unterschiede bei den einzelnen Gewebeproben zwischen den Tieren mit Tumor und denen ohne Tumor. Die Messung der gesamten Rattengehirne ohne
Tumor ergab lediglich eine Aufnahme 0,1 % an Radioaktivität. Bei den tumortragenden
Rattengehirnen dagegen steigerte sich die Aufnahme der applizierten Radioaktivität auf
0,23 % (Probe A). Die Messung der linken Gehirnhemisphären (Probe B) ergab dann
aber eine Steigerung der Aufnahme an Radioaktivität bei den tumortragenden Tieren
um das Dreifache. Kein Unterschied ergab sich bei der Messung der rechten Gehirnhälften (Probe C).
Der spezifische Aktivitätsquotient berechnet den Anteil der applizierten Radioaktivität
in Relation zum Tumorgewicht und dem Gewicht der Versuchstiere. Bei einer homogenen Verteilung berechnet sich somit ein spezifischer Aktivitätsquotient von 1, während
hingegen ein Quotient von > 1 eine spezifische Aufnahme beweist.
Die spezifischen Aktivitätsquotienten bei den nicht tumortragenden Rattengehirnen lag
bei 0,12, bei den tumortragenen Rattengehirnen bei 0,26 und bei den linken Tumor
tragenden Hemissphären bei 0,4. Die Berechnung des spezifischen Aktivitätsquotienten
im Tumor selbst wies mit 2,8 eine 23fach höhere Aufnahme gegenüber dem normalen
Gehirn nach (Abb.5).
26
0,3
3
Spezifischer
Aktivitätsquotient
Anteil (%)
0,25
2,5
0,2
2
0,15
1,5
0,1
1
0,05
0,5
0
Probe1 A
Probe B
Probe C
0
Tumor
Probe 1A
Probe B
Probe C
Probe A: Rattengehirne gesamt Probe B: Tumotragende Gehirnhälften Probe C: Nicht tumortragendeGehirnhälften.
Abb.5: Anteile der aufgenommenen Radioaktivität von 111In-DTPA-AFLc-HSA an verschiedenen Rattenhirnen. Die schwarzen Balken entsprechen der Kontrolltieren ohne Tumor, die grauen Balken den
Tumortieren, die weißen Balken den entnommenen C6-Gliomen.
2.8
Fluoreszenzdiagnostik mit AFLc-HSA und AFL am C6-Gliom der Ratte
Das mit dem Fluoreszenzfarbstoff 5-Aminofluorescein kovalent konjugierte humane
Serumalbumin wurde vergleichend zu freiem AFL für die laserinduzierte Fluoreszenz-
diagnostik am C6-Gliom der Ratte herangezogen. Durch die kovalente Bindung an humanes Serumalbumin in einer 1 : 1 molaren Beladung ergab sich eine minimale Ver-
schiebung des Absorptionsmaximums auf 497 nm (freies AFL 490 nm) und ebenfalls
eine Verschiebung des Emissionsmaximums von 519 nm auf 523 nm (Abb. 6).
3
519 nm/
523 nm
Laser
488
nm
2,5
AFLc-HSA
496
nm
AFL
2
1,5
1
0,5
0
400
450
495
545
Wellenlänge (nm)
595
645
695
Abb. 6: Absorptions- und Emissionsspektren von AFL und AFLc-HSA. Das Anregungslicht des
Argonlasers liegt bei 488 nm.
27
Tumo
Das Farbstoffkonjugat wurde den tumortragenden Tieren in Konzentrationen von 0,5
mg/kg Körpergewicht sowie 1,0 und 2,0 mg/kg Körpergewicht (5 Tiere pro Dosie-
rungsgruppe) intravenös appliziert und die Rattenhirne 24 Stunden später in toto entnommen und bei - 70 ° C tiefgefroren. Vergleichend zur Fluoreszenzdarstellung mit
AFLc-HSA wurde ungebundenes AFL bei 5 Tieren in einer Konzentration von 2,0
mg/kg Körpergewicht ebenfalls intravenös appliziert und ebenfalls die Rattengehirne 24
h danach entnommen.
Als Anregungsquelle diente ein 10 Watt Argonlaser (Spectra Physics, USA). AFLc-
HSA oder AFL wurden bei 488 nm angeregt (Ausgang Argonlaser 1,2 Watt, Beschei-
nung bei 150 – 200 mWatt/cm2). Zur Fluoreszenzbetrachtung wurde das Anregungslicht
des Lasers durch einen Langwellengelbfilter bei 515 nm abgeschnitten.
Makroskopische Fluoreszenzbetrachtung
An koronaren Schnitten der 24 Stunden nach intravenöser Farbstoffapplikation ent-
nommenen Gehirne wurden die tiefgefrorenen Proben in Höhe des maximalen Tumordurchmessers untersucht. Bei allen C6-Gliomen zeigte sich unter der laserinduzierten
Fluoreszenzanregung eine gute Darstellung des durch AFLc-HSA markierten Tumors,
wobei die Betrachtung der Fluoreszenzemission bereits mit bloßem Auge möglich war.
Subjektiv war kein Unterschied in der Fluoreszenz zwischen den verschiedenen Konzentrationen bemerkbar. Im Gegensatz zu der sehr deutlichen Tumordarstellung mit
AFLc-HSA fehlte diese 24 Stunden nach intravenöser Applikation von freiem AFL
gänzlich (Abb. 7 a und b). Eine Autofluoreszenz des Gehirns wurde bei einer Anregung
von 488 nm nicht beobachtet.
Mikroskopische Fluoreszenzbetrachtung
Um die Fluoreszenzdarstellung mit AFLc-HSA der histopathologischen Tumorgrenze
zuordnen zu können, wurden koronare Kryostatschnitte in einer Dicke von 10 µm angefertigt. Die so gewonnenen Kryostatschnitte wurden im Fluoreszenzmikroskop be-
trachtet und mit einem direkt benachbarten H & E gefärbten Kryostatschnitt verglichen.
28
Dabei zeigte sich ein gutes Übereinstimmen der fluoreszenzoptischen Tumordarstellung
mit der durch H & E markierten histopathologischen Tumorgrenze (Abb. 8 a und b).
2.9
Fluoreszenzlokalisation von AFLc-HSA in der C6-Gliom Zellkultur
Um die Lokalisation des Farbstoffkonjugates in der Tumorzelle selbst genauer definie-
ren zu können, wurden C6-Gliom Zellkulturen über 72 Stunden mit AFLc-HSA in einer
Konzentration von 10 µg/ml inkubiert. Der nicht zellulär verbliebene Farbstoff wurde
dann durch zweimaliges Waschen der Zellkultur mit Phosphatpuffer entfernt. Danach
konnten die C6-Gliomzellen im Fluoreszenzmikroskop bei einer 1.000fachen Vergrößerung betrachtet werden. Dabei zeigte sich eine punktuelle, den Lysosomen entsprechende Akkumulation des Farbstoffkonjugates in den C6-Gliomzellen (Abb. 9). Somit kann
vermutet werden, daß das Albuminkonjugat via Endozytose intrazellulär aufgenommen
wird und sich dann im Lysosom der Zelle anreichert (Abb. 10). Trotz des sauren pHWertes im Lysosom (die Fluoreszenzemission ist pH abhängig) fand sich eine gute
Fluoreszenz von AFLc-HSA in der Tumorzelle. Somit war die aktive Aufnahme des
Farbstoffkonjugates in die Tumorzelle bewiesen, welche im Gegensatz zu den meisten
gängigen Kontrastmitteln AFLc-HSA als intrazelluläres Kontrastmittel aufweist.
29
A
B
Abb. 7 a und b: Makroskopische Darstellung eines C6-Glioms der Ratte in Höhe des maximalen Tumordurchmessers einerseits gefärbt durch H&E (A), andererseits durch Fluoreszenzanregung mit Argonlaser (488 nm, 150 mW/cm2) 24 h nach intravenöser Applikation von AFLcHSA (B). Die Fluoreszenzbetrachtung wird ermöglicht durch Verwendung eines Langwellenfilters.
30
A
B
Abb. 8 a und b: Mikroskopische Tumordarstellung (Vergrößerung 200 fach) am
Kryostatschnitt im Bereich der C6-Gliomtumorgrenze, einerseits dargestellt durch H&E
(A), andererseits dargestellt durch AFLc-HSA (B).
31
Abb. 9: C6-Gliomzellen in Zellkultur 72 h nach Inkubation mit AFLc-HSA (10 µg/ml)
bei einer 1000 fachen Vergrößerung. Der schwarze Pfeil gibt die Lokalisation des
Farbstoffkonjugates im Lysomom der C6-Gliomzellen an.
Abb. 10: Schematische Darstellung der Aufnahme von AFLc-HSA in maligne Gliomzellen.
32
2.10
Konfokale Mikroskopie mit AFLc-HSA und lysosomaler Markierung an
C6-Gliomzellen
Die Kultivierung der C6-Gliomzellen erfolgte in RMPI 1640 mit 10 % FCS und 1 %
Glutamin. Für die konfokale Laserscanningmikroskopie (cLSM, Fa. Zeiss, Oberkochen)
wurden die Zellen abtrypsiniert, in einer Neubauer Kammer gezählt und auf 5 x 104
Zellen/ml eingestellt. Davon wurden 50 – 100 µl auf Deckgläschen ausgesät (Durch-
messer 12 mm) und für 24 Stunden bei 37°C mit 5 % CO2 inkubiert. Auf 1 % reduziertem FCS Medium wurden die Zellen mit 50 µg/ml AFLc-HSA bzw. 50 µg/ml AFL
überflutet und für weitere 24h kultiviert.
Für die Lysosomenmarkierung wurden die C6-Gliomzellen dreimal mit RMPI ohne
Zusätze gewaschen. Danach wurde Lyso Tracker Red (Absorption: 577 nm; Emission:
590 nm; Molecular Probes, USA) in einer Konzentration von 50 nM über 40 Minuten
hinzugefügt. Wiederum wurden die Zellen dreimal mit RMPI ohne Zusätze gewaschen
und anschließend am konfokalen Laserscanningmikroskop untersucht.
Einerseits wurden die Zellen im Differentialkontrast inspiziert, andererseits wurde der
Lyso Tracer bei 577 nm (rote Fluoreszenz) und AFL oder AFLc-HSA bei 488 nm (grüne Fluoreszenz) angeregt. Werden beide Fluoreszenzen übereinandergelegt, zeigen Orte, an denen beide Farstoffe lokalisiert sind, eine gelbe Fluoreszenz (Abb. 11 a). Somit
war die Aufnahme von AFLc-HSA im Lysosom der C6-Gliomzellen bewiesen. Dagegen war nach Inkubation der Zellen mit freiem AFL keine punktförmige, den Lysosomen entsprechende Aufnahme zu erkennen. Hier konnte man eine unspezifische Verteilung von AFL im Zytoplasma beobachten (Abb. 11b).
33
A
A
A
LsoTracker
Lyso
Tracerred
red
AFLc-HSA
AFLc-HSA
AFLc-HSA
Lyso-tracer rot
Differentialkontrast
Differentialkontrast
Lyso-tracer + AFLc-HSA
B
B
AFL
Lyso-tracer
rot red
Lyso
Tracer
Lyso Tracer
red
AFL
AFL
AFL
Lyso-tracer + AFL
Differentialkontrast
Abb 11 a und b: Konfokale Laserscanningmikroskopie von C6-Gliomzellen nach Inkubation mit Lyso Tracker rot, AFLc-HSA (A) oder AFL (B).
34
2.11
Präklinische Studien mit 111In-DTPA-HSA bei Patienten mit Glioblastomen
Zunächst wurde die Aufnahme des mit 111In-DTPA-Farbstoffkonjugates bei Patienten
mit Glioblastomen im SPECT (Single-Photon-Emmissions-Tomogramm) untersucht.
Bei drei Patienten, welche nach MR-Kriterien an einem Glioblastom erkrankt waren,
wurden 70 MBq 111In-DTPA-ALFc-HSA intravenös appliziert. Über einen Beobachtungszeitraum von drei Tagen (die Halbwertszeit von 111In beträgt 2,7 Tage) wurden
wiederholt Untersuchungen im SPECT wie auch Blutproben zur Bestimmung der Plasmahalbwertszeit vorgenommen (Abb. 12).
Dabei zeigte sich ein Maximum an Aufnahme von 111In-DTPA-ALFc-HSA nach 48 h.
Ebenfalls waren zu diesem Zeitpunkt die Tumoren im SPECT sehr deutlich zu erken-
nen. Die Bestimmung der Plasmahalbwertszeit erfolgte durch Proben aus 5 ml Vollblut.
Hier stellte sich ein langsamer und kontinuierlicher Abfall der Konzentration an 111In-
DTPA-ALFc-HSA dar. Die Halbwertszeit des Proteinkonjugates wurde bei den drei
Patienten im Mittel mit 4,7 Tagen angegeben. Somit bestätigte sich die hohe und langanhaltende Aufnahme des Farbstoffkonjugates AFLc-HSA bei Patienten mit Glioblastomen. Allerdings waren die Untersuchungen wegen der kurzen Halbwertszeit von
111
In in ihrer Dauer und Aussage nur eingeschränkt verwertbar.
Abb. 12: Darstellung eines links temporalen Glioblastoms 48 h nach intravenöser Injektion von
70 MBq 111In-DTPA-AFLc-HSA im SPECT
35
1,4
1,2
1
0,8
111In-DTPA-AFLc-SA
0,6
0,4
0,2
A
0
0
18
24
42
h
48
72
1000000
cpm
111In-DTPA-AFLc-SA
B
100000
0
18
24
42
h
48
72
Abb. 13: Aufnahme von 111In-DTPA-AFLc-HSA in ein Glioblastom (A) und Darstellung der
Plasmaclearance (B) von 111In-DTPA-AFLc-HSA nach intravenöser Injektion von 70 Mbq 111InDTPA-AFLc-HSA.
36
2.12
Präklinische Studien zur laserinduzierten Fluoreszenzdiagnostik mit AFLcHSA
Drei weitere Patienten, welche gemäß MRT-Untersuchungen an einem Glioblastom
erkrankt waren, wurden nach Einwillligung für die laserinduzierte Fluoreszenzdiagno-
stik mit AFLc-HSA zur intraoperativen Tumordarstellung vorgesehen. Die intravenöse
Applikation des Farbstoffkonjugates erfolgte in einer Dosierung von 0,5 mg/kg Körpergewicht in einem Zeitraum von 3 - 5 Tagen vor der geplanten Operation. Alle drei Pati-
enten wurden unter Neuronavigation und einer Radikalitätskontrolle durch ein intraoperatives MRT und frühes postoperatives MRT operiert. Die Aktivierung des Farbstoffkonjugates erfolgte durch einem dem OP benachbarten Argon-Laser bei einer Anre-
gungswelle von 488 nm. Die Ausleuchtung des OP-Gebietes wurde mit Hilfe eines sterilisierbaren FD1-Applikators bei einer Leistung von 150 – 200 mWatt/cm2 gewährlei-
stet. Die Fluoreszenzbetrachtung erfolgte dann über einen im Operationsmikroskop ein-
gebrachten Schwenkfilter, welcher das Anregungslicht des Lasers bei einer Wellenlänge
von 515 nm abschnitt und nur Fluoreszenzlicht über 515 nm passieren ließ (Abb. 14).
Die Bestimmung der Plasmahalbwertszeit erfolgte aus Proben von 5 ml Vollblut über
einen Zeitraum von bis zu 20 Tagen nach der Operation.
Abb. 14: Integrierbarer Langwellen-Schwenkfilter für das Operationsmikroskop MKM, Zeiss.
Bei allen drei Patienten gelang eine intraoperative Fluoreszenzdarstellung der Tumoren
mit AFLc-HSA über die gesamte Dauer der Operation. Vor allem im Bereich der
Tumorgrenze, d. h. der proliferationsaktiven Zone, waren die Tumoren fluoreszenzoptisch gut erkennbar. Gegenüber normalem Gehirngewebe zeigte sich eine scharfe Ab-
37
grenzung in der Fluoreszenzdarstellung. Dagegen war in den zentralen nekrotischen
Tumoranteilen keine Fluoreszenzdarstellung erkennbar. Ein Übertritt von AFLc-HSA
aus eröffneten Gefäßen führte zu einer Kontamination der Resektionshöhle. Allerdings
konnte dies durch ein sorgfältiges Absaugen vor der Fluoreszenzbetrachtung verhindert
werden. Üblicherweise erfolgte die Fluoreszenzbetrachtung wiederholt während der
Tumorpräparation und abschließend nach Entfernung des Tumors. Nur in einem Fall
mußte wegen einer beginnenden Infiltration des Tumors in das Wernicke-Sprachzen-
trum ein kleiner solider durch AFLc-HSA wie auch durch das intraoperative MRT zu
erkennender Tumorrest belassen werden. Die histopathologischen Untersuchungen wiesen in allen Fällen fluoreszenzpositiver Proben ein Glioblastom oder seine Infiltrationszone nach. Entsprechend den Kriterien der intraoperativen Radikalitätskontrolle durch
ein intraoperatives und frühes postoperatives Kernspintomogram konnte bei zwei Patienten eine radikale Tumorresektion unter Zuhilfenahme der intraoperativen Laserfluoreszenz erreicht werden. Trotz mehrfacher Bescheinung und langanhaltender Tumoroperation war ein Ausbleichen des Farbstoffes oder eine Penetration des Konjugates in
umgebendes Gehirngewebe nicht beobachtet worden (Abb.15).
Ein Patient entwickelte eine Woche nach der Applikation von AFLc-HSA ein generalisiertes allergisches Hautexanthem, welches mit Antihistaminika behandelt werden
mußte. Nach Abklingen des Hautexanthems konnte die allergische Reaktion im Intra-
kutantest durch AFLc-HSA provoziert werden. Weitere Nebenwirkungen oder Laborveränderungen wurden nicht beobachtet.
Ebenfalls wurden in der Abteilung für Mund- Zahn- und Kieferchirurgie der Universität
Heidelberg drei Patienten mit Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle mit AFLc-HSA
behandelt. Auch hier gelang durch AFLc-HSA eine Darstellung der Mundhöhlenkarzi-
nome, wobei die Fluoreszenzdarstellung der Tumoren nach Abklingen der Hintergrundfluoreszenz in der Schleimhaut ca. 1 – 2 Wochen nach der i. v. Applikation von AFLcHSA deutlich verbessert werden konnte.
38
Abb. 15: Laserinduzierte Fluoreszenzdarstellung eines Glioblastoms während einer mikrochirurgischen Tumoroperation im Bereich der Tumorgrenze 5 Tage nach intravenöser Injektion
von AFLc-HSA (0,5 mg/kg KG).
39
2.13
Diskussion
Die fluoreszenzoptische Darstellung von Gehirntumorgewebe findet sich erstmals 1948
bei Moore (10). Zu dieser Zeit war die Lokalisation eines Gehirntumors nur auf Grund
von neurologischen, einige Jahre später durch ventrikulographische Untersuchungen
vermutbar. In der Regel erfolgte eine ausgedehnte Trepanation, bei der Veränderungen
am Cortex aufgesucht wurden, oder es erfolgten vorsichtige Punktionen in das Gehirn,
sogenannte Dandy-Nadel, welche eine Lokalisation vor allem subkortikaler Läsionen
vermuten ließ. Verständlich, daß man nach Wegen suchte, Gehirngeschwülste selbst
sichtbar zu machen.
Grundlage des von Moore verwendeten Dinatriumfluoresceins ist die Tatsache, daß
maligne Gehirntumoren eine Störung der Blut-Hirn-Schranke aufweisen und somit Substanzen, wie das Fluorescein, in den Tumor penetrieren lassen. Eine Fenestration von
Blutgefäßen im Tumor (sog. Blut-Tumor-Schranke) findet sich aber auch bei extraaxi-
alen Gehirntumoren. Somit konnte Moore bei einer Vielzahl unterschiedlicher Gehirntumoren (Glioblastome, Astroblastome, Meningiome, Akustikusneurinome, Ependy-
mome und Hypophysenadenome) eine ausreichende Fluoreszenzdarstellung während
der Operation beobachten. Verwendet wurde das Dinatriumfluorescein 20 % in 5 ml
Lösung, was einer Gesamtapplikation von 1 g entspricht. Der Farbstoff wurde unmittelbar präoperativ intravenös injiziert und während der Operation mit einer Quecksilber-
dampflampe angeregt. Die Fluoreszenzbetrachtung erfolgte mit einem entsprechenden
Langwellenfilter (Wood‘s-Filter). Das Maximum an Fluoreszenz wurde 2 Stunden nach
intravenöser Applikation erreicht, jedoch war die Fluoreszenzdarstellung nach 5 Stun-
den deutlich vermindert. Wenn auch Moore eine sehr gute Fluoreszenzdarstellung von
Tumorgewebe beobachtete, so wies er in seiner Publikation von 1948 bereits auf das
Problem der Penetration des Farbstoffes ins umgebende ödematös veränderte Gehirngewebe hin.
Auch andere fluoreszenzaktive Substanzen, wie z. B. Atebrin oder Trypaflavin (13),
wurden zu dieser Zeit zur intraoperativen Fluoreszenzdiagnostik bei Gehirntumoren
herangezogen. Auch mit diesen Substanzen gelang eine intraoperative Fluoreszenzdar-
40
stellung, aber auch hier wiesen die Autoren wiederum auf eine unscharfe Begrenzung
der Fluoreszenz, vor allem bei den infiltrativ wachsenden maligen Gliomen, hin.
Warum durch fluoreszierende Substanzen eine optische Anfärbung von Gehirntumoren
möglich war, war den Autoren Anfang der 50er Jahre nicht ganz klar. Zwar wurde eine
Fenestrierung von Tumorgefäßen vermutet, doch erst die ausgedehnten Untersuchungen
von Klatzo Anfang der 60er Jahre zeigten den Übertritt von nieder- und hochmolekula-
rem Fluorescein als Ausdruck einer Störung der Blut-Hirn-Schranke (14). Dieser Übertritt nieder- und hochmolekularer Substanzen in Gehirntumoren wurden im weiteren
auch zur Isotopendarstellung von Gehirntumoren verwendet (15-16).
Erst 34 Jahre nach Moores Publikation wurde die intraoperative Fluoreszenzdarstellung
mit Na-Fluorescein von Murray (17) wieder aufgegriffen, welcher sich in dieser Methode eine Verbesserung der operativen Radikalität bei malignen Gliomen erhoffte. Weiter
verbessert wurde die Methode der intraoperativen Fluoreszenzdarstellung mit Na-
Fluorescein Ende der 90er Jahre durch zwei japanische Arbeitgruppen (18-20), welche
eine Xenonlampe als Lichtquelle zur Anregung des Farbstoffes in ein Operationsmikroskop integrierten.
Zwischenzeitlich sind auch andere Farbstoffe zur optischen Darstellung von Gehirntu-
moren untersucht worden. Zu erwähnen ist der nicht fluoreszierende Farbstoff Indozyanin, welcher ebenfalls eine gestörte Blut-Hirn-Schranke passiert und sich im Tumorge-
webe anreichert. Nach tierexperimentellen Untersuchungen am C6-Gliom der Ratte (21)
wurde der Farbstoff auch am Menschen untersucht. Allerdings mußte die ursprünglich
am Tiermodell verwendete Dosis von 60 – 120 mg/kg wegen zu erwartender Nebenwirkungen deutlich auf 2 mg/kg reduziert werden, weswegen zur intraoperativen Farbstofferkennung eine Restlichtverstärkerkamera verwendet werden mußte (22-23). Ein weiterer Farbstoff ist das Phthalozyanin. Auch Phthalozyanin erlaubt eine Darstellung bei
malignen Gehirntumoren. Seine Verwendung wurde aber bislang nur tierexperimentell
am C6-Gliom der Ratte untersucht (24).
Von größerer Bedeutung in der optischen Darstellung von Gehirntumoren ist die Verwendung photoaktiver Substanzen, welche den Porphyrinen zuzuordnen sind (25-27).
41
Diese besitzen neben fluoreszierenden vor allem photoaktive Eigenschaften, wie sie bei
der Photodynamischen Therapie (PDT) erwünscht sind. Hier bilden sich nach Anregung
des Farbstoffes toxische Metabolite (Phase-I-Reaktion) oder Sauerstoffradikale (Phase-
II-Reaktion), die das umgebende Tumorgewebe zerstören. Die am häufigsten bei malignen Gehirntumoren verwendete Substanz ist das lipophile Porphyringemisch Hämato-
porphyrinderivat (HPD, Photofrin), welches sich im Tumorgewebe anreichert und dann
nach Anregung durch eine Lichtquelle aktiviert werden kann. Da die photoaktiven Eigenschaften die fluoreszierenden Eigenschaften überwiegen, ist seine Anwendung im
wesentlichen auf die photodynamische Therapie konzentriert. Derzeit wird diese Sub-
stanz in einer prospektiven, randomisierten Phase-III-Studie bei Patienten mit Glioblastomrezidiven untersucht, wobei die Bestrahlung nach Abschluß der Resektion noch
vorhandenes Resttumorgewebe zerstören soll (28).
Eine weitere zur Zeit vielfach untersuchte Substanz ist die 5-Aminolävulinsäure (5-
ALA). Diese Substanz wird intrazellulär im Tumorgewebe zur eigentlichen Wirksub-
stanz Protoporphyrin IX metabolisiert, welche fluoreszenzaktiv ist. Ursprünglich wurde
5-ALA zur Diagnostik von Blasenkarzinomen eingesetzt (29), jedoch findet diese Substanz zwischenzeitlich bei oberflächlich liegenden Tumoren eine immer breitere An-
wendung. Es ist der Münchener Arbeitsgruppe zu verdanken, daß 5-ALA zur intraoperativen Fluoreszenzdiagnostik bei malignen Gliomen eingesetzt wurde. Auch hier wird
zur Anregung des Fluoreszenzfarbstoffes eine Xenonlampe verwendet, welche im OPMikroskop integriert ist. Somit ist eine direkte Betrachtung der Fluoreszenzemission
durch das Operationsmikroskop möglich. Nach tierexperimenteller Testung befindet
sich 5-ALA zwischenzeitlich in einer multizentrischen Phase-III-Studie. Die bisherigen
Ergebnisse bestätigen eine Verbesserung der durch 5-ALA bedingten Operationsradika-
lität mit Verbesserung der Überlebenszeit bei Patienten mit Glioblastomen (30-34). Wie
alle Porphyrinderivate besitzt Protoporphyrin IX die Eigenschaft des raschen Ausbleichens, weswegen im OP-Mikroskoplicht gezielt eine Wellenlänge ausgefiltert werden
muß. Seine phototoxischen Eigenschaften sind gegenüber anderen Porphyrinderivaten
deutlich geringer ausgeprägt.
42
Bei der Frage der selektiven Darstellung von Gehirntumoren während einer mikrochirurgischen Tumoroperation sollten unseren Überlegungen nach folgende Eigenschaften
von dem zu verwendeten Farbstoff erfüllt werden:
•
Gute Kontrastierung des Tumorgewebes
•
Fehlende Toxizität
•
•
•
Selektive und langanhaltende Aufnahme des Fluoreszenzfarbstoffes im Tumor
Stabile Fluoreszenzintensität
Geringe Penetration ins umgebende Gewebe.
Aus den genannten Anforderungen entschlossen wir uns zu dem bekannten Fluores-
zenzfarbstoff Fluorescein. Dieser Fluoreszenzfarbstoff zeichnet sich durch eine hohe
Lichtquantenausbeute aus und ist auch nach langanhaltender Anregung weitgehend
farbstoffstabil. Seine fehlenden photoaktiven Eigenschaften bedingen eine geringe lokale und systemische Toxizität. Durch die kovalente Koppelung von Fluorescein an
humanes Serumalbumin (AFLc-HSA) konnte die sonst durch die niedermolekularen
Eigenschaften bedingte Pharmakokinetik des Farbstoffes gänzlich im Sinne eines intra-
zellulären und lange im Tumorgewebe verbleibenden Kontrastmittels verändert werden.
In unseren tierexperimentellen Untersuchungen, den Untersuchungen in Zellkultur und
der konfokalen Mikroskopie, wie auch in den individuellen Heilversuchen bei Glio-
blatompatienten zeigte AFLc-HSA eine selektive und langanhaltende Fluoreszenzanfärbung im malignen Tumorgewebe (35). Mit hoher Wahrscheinlichkeit verbleibt dieser
Farbstoff auch nach lysosomaler Abspaltung vom Albumin sehr lange in der Tumor-
zelle, so daß ein Auswaschen der Fluoreszenz verhindert wird. Sein klinischer Einsatz
in einer dafür notwendigen Phase-I/II-Studie ist, nachdem die Voraussetzungen bewäl-
tigt werden konnten, inzwischen von der hiesigen Ethikkommission genehmigt worden.
Wie gut die Tumordarstellung mit AFLc-HSA ist und welche Information sie für den
operativ tätigen Neurochirurgen bringt, soll im direkten Vergleich der Tumordarstellung
durch Systeme der Neuronavigation, der Tumordarstellung im intra- und frühen postoperativen MR und dem intraoperativen Ultraschall untersucht werden.
43
Kapitel 3
3.1
Albuminvermittelte Chemotherapie mit Aminopterin-HSA
(AMPT-HSA) in vivo
3.1.1 Einführung
Bereits 1940 fand das Antifolat Aminopterin (AMPT) seine erste klinische Anwendung
bei Kindern, welche an Leukämie erkrankt waren (1-2). Es zeigte einen guten zytostatischen Effekt und leitete die Entwicklung der modernen Chemotherapie ein. Wenige
Jahre später wurde AMPT durch ein ähnliches Antifolat, Methotrexat (MTX), ersetzt,
nachdem tierexperimentelle Untersuchungen eine ähnliche Wirksamkeit, aber bessere
Verträglichkeit gegenüber AMPT bestätigten (3). MTX, meist in Kombination mit an-
deren zytostatischen Substanzen, findet heutzutage eine breite klinische Anwendung in
der Behandlung akuter Leukämien im Kindesalter, bei Osteosarkomen, Choriokar-
zinomen, Lymphomen, Kopf-Hals-Tumoren und anderen soliden Tumoren. Aber auch
chronisch entzündliche Prozesse, wie z. B. die der rheumatoiden Arthritis oder der Psoriasis, stellen eine Indikation für die Verwendung von MTX dar. Vergleicht man aber
die Wirksamkeit von AMPT gegenüber MTX, so findet sich für AMPT eine 20fach
höherer Vmax/Km Quotient für das Enzym Folylpolyglutamatsynthetase (4) und eine
stärkere Aufnahme und Polyglutamierung in Lymphoblasten und Myeloblasten (5). So
ist es nicht verwunderlich, daß AMPT wieder Einzug in eine klinische Studie fand. Ratliff (6) untersuchte AMPT bei 20 therapieresistenten Malignompatienten und konnte
eine komplette Remission bei einem Patienten mit Endometriumkarzinom und eine Stabilisierung des Krankheitsverlaufes bei 7 weiteren Patienten beobachten.
Nachdem die präklinischen und klinischen Ergebnisse mit dem Albuminkonjugat MTXHSA eine gegenüber MTX zumindest gleichwertige, wenn nicht sogar leicht bessere,
Wirkung zeigten, galt unser Interesse der Albuminkonjugierung eines anderen Antifo-
lates, dem AMPT (Abb. 1). Es sollte, ähnlich wie MTX-HSA, in seiner Verteilung, seiner Plasmahalbwertszeit, seiner Aufnahme in den Tumor, wie auch in seiner Verträglichkeit und Effektivität untersucht werden.
44
Abb. 1: Die Antifolate Aminopterin und Amethopterin (MTX)
45
3.2.1 Die Koppelung von Aminopterin (AMPT) an Albumin (HSA)
Aminopterin Aktivierung
Aminopterin-Hydrat (AMPT; Molekulargewicht 440.42 Dalton; Aldrich, Steinheim)
wird in einer Konzentration von 10 mg/ml in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst. Zu der
klaren gelben Lösung wird eine 1,5fach molare Menge von Dicyclohexyl-carbodiimid
(DCC) und eine 10fach molare Menge an Hydroxysuccinimid (HSI) hinzugefügt. Nach
14 – 15 Stunden ist die Reaktion bei Raumtemperatur zum Succinimidylester (AMPTHSIE) weitgehend abgeschlossen, was durch die auskristallierte Menge an Dicyclohexyl-Harnstoff (DCHU) zu erkennen ist.
Kovalente Koppelung des aktivierten Aminopterin an humanes Serumalbumin
Zu einer Lösung von humanem Serumalbumin (HSA, 66.439 Da, Pharma Dessau
GmbH, Dessau, 50 mg HSA/ml 0.17 M NaHCO3, pH 8.5) wird die klare gelbe AMPT-
HSI Lösung in DMSO wird unter langsamem Rühren in einem 1,5 : 1 molaren Verhältnis hinzugefügt. Nicht reagiertes DCC und noch in DMSO gelöstes DCHU trübt 15
Minuten später die ursprünglich klare Lösung durch Bildung kolloidaler Aggregate.
Nach weiteren 30 Minuten Reaktionszeit werden die kolloidalen Aggregate mit einem
sterilen Filter (0.22 µm; Millipore, Molsheim) abgetrennt, während hingegen DMSO
and nicht kovalent gebundenes AMPT durch Ultrafiltration über eine Druckrührzelle
mit passendem Membranfilter (YM 30, Millipore) abgetrennt werden. Die Reinheits-
kontrolle erfolgt dann durch die hochauflösende Flüssigkeitschromatographie (HPLC):
HPLC Bedingungen:
Vorsäule:
Phenomenex GFC - 4000, 4 mm L x 3 mm ID
1. Laufmittel:
0.25 M Li-acetat, 0,05M Li-citrat pH 7,4 (Ampuwa)
Säule:
2. Laufmittel:
Fluß:
Gradient:
Zorbax GF 250,
95% Methanol (HPLC-grade), 5% Wasser (Ampuwa)
0 -15 min Laufmittel 1 (100%); 1.0 ml/min
15 - 30 min Laufmittel 2 (von 0 auf 100%); 1.3 ml/min
46
30 - 45 min Laufmittel 2 (100%)
45 - 50 min Laufmittel 2 (von 100 auf 0%)
Detection:
Druck:
50 - 60 min Laufmittel 1 (100%); 1.0 ml/min
370 nm
ungefähr 65 Bar
Bei der Überprüfung des Albuminkonjugates AMPT-HSA durch die HPLC waren die
dimere Fraktion bei 8,17, die monomere Fraktion bei 9,06 und ungebundenes AMPT
bei 15,78 Minuten zu erkennen. Die prozentualen Anteile betrugen für die dimere Frak-
tion 4,99%, für die Albuminfraktion 91,68% und für ungebundenes AMPT 3,33% (Abb.
2). Ungefähr 80% des aktivierten AMPT wurde an Albumin kovalent gebunden. Ähnlich wie bei MTX lagert sich das aktivierte AMPT über die ε-Aminogruppe des Lysin
kovalent an das Protein. Das molare Bindungsverhältnis von AMPT an Albumin liegt
bei ca. 1,3 : 1.
100
µ V (%)
80
AMPT-HSA
60
40
20
0
0
10
min
20
Abb. 2: Chromatogramm von AMPT-HSA in der HPLC
47
30
3.1.3 Die Markierung von Aminopterin-Albumin (AMPT-HSA) mit 111Indium
Man löst Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) mit einer Konzentration von 20
mg/ml unter Erhitzung in DMSO. Nach dem Abkühlen dieser Lösung auf Zimmertemperatur fügt man die 1,2fache molare Menge an Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und
die 10fache molare Menge an Hydroxysuccinimid (HSI) hinzu. Nach einer Reaktions-
zeit von etwa 24 Stunden ist die Aktivierung zum Succinimidylester weitgehend abgeschlossen und an der auskristallisierten Menge von Dicyclohexylharnstoff (DCH) er-
kennbar. Die klare DMSO-Lösung wird nun im 3fach molaren Überschuß zum Protein
unter ständigem Rühren sehr langsam (10 mg AMPT-HSA/ml in 0,17 M NaCO3, pH
7,9 - 8,0) zugegeben, wobei nach einiger Zeit eine weiße Trübung von nicht umgesetztem DCC und noch in DMSO gelöstem DCH auftritt. Nach einer Reaktionszeit von etwa 30 Minuten wird die Reaktionslösung mit 0,17 M NaHCO3 verdünnt, die weiße
Trübung über einen Sterilfilter (0,22 µm, Millipore) und das DMSO und nicht gebunde-
nes DTPA durch Ultrafiltration über eine C 30 Mikrokonzentratoreinheit (Millipore)
abgetrennt.
Die Markierung des mit DTPA geladenem AMPT-HSA mit 111In erfolgt durch Zugabe
von der gewünschten Radioaktivitätsmenge in Form des 111In-Citratkomplexes (herge-
stellt aus 111InCl3 und 10 µl einer 0,2 M Na-Citratlösung, pH 7,5) zu 10 mg Protein.
Schon unmittelbar nach Zugabe des 111In-Citrats kann das nicht an AMPT-HSA gebundene 111In durch Ultrafiltration über eine C30 Einheit abgetrennt werden. Die Markierungsausbeute beträgt über 98 % und entpricht einem „residualizing label“ (7, 8, 9).
3.1.4 Tumormodell und Versuchstiere
Walker-256 Karzinom (W-256)
Wegen seiner Eigenschaft als rasch proliferierender und antifolat-sensitiver Tumor
wurde für unsere Versuche das Walker-256 Karzinom (W-256) ausgewählt (10) . Die
Tumorzellen wurden aus der Tumorbank des Deutschen Krebsforschungszentrums Heidelberg gewonnen, wo sie bei -196 °C aufbewahrt wurden. Nach Auftauen der W-256Karzinomzellen wurden diese mit RPMI Medium, welches mit 10 % Hitze inaktivier-
48
tem fätalen Kälberserum (FCS) und 1 % L-Glutamin angereichert war, kultiviert. Das
Kulturmedium wurde alle 48 Stunden ausgetauscht. Die Endkonzentration der Zellkul-
tur betrug 106 Zellen/ml in PBS. Zur intramuskulären Tumorzellimplantation wurden 5
x 106 W-256 Zellen in ein Volumen von 200 µl RPMI appliziert.
Versuchstiere und Datenerhebung
Insgesamt wurden 139 weibliche, apathogene (SPF) Sprague-Dawley (SD) Ratten für
die tierexperimentellen Untersuchungen herangezogen. Die Tiere wurden standardisiert
in Mikroisolatoren gehalten. Nach intramuskulärer Tumorimplantation im rechten Hinterbein wurden die Tumorradii täglich mit Meßschablonen bestimmt. Das Tumorvolu-
men wurde aus der Formel (Länge x Breite2)/2 errechnet, wobei die Länge (a) die grö-
ßere Seite und die Breite (b) die kürzere Seite darstellt (11). Die Datenerhebung erfolgte
durch eine Software, in der die Tumorvolumina gegenüber der Zeit aufgelistet wurden.
Die Wachstumskurven der Tumoren bezüglich der maximalen Tumorinhibierung wurden folgendermaßen analysiert: Behandlungsgruppe/Kontrollgruppe (treated/control,
T/C), errechnet als medianes Tumorgewicht in der behandelten Rate/medianes Tumor-
gewicht in der unbehandelten Ratte x 100. Die Tumorverdoppelungszeit nach intramuskulärer Implantation lag bei 48 Stunden. Sie entspricht im wesentlichen den Angaben
der Literatur (12). Statistische Berechnungen bezüglich der Tumorinhibition, Tumorheilung oder Tumorrezidivrate erfolgten im Fisher‘s Exakttest.
3.1.5
Plasmaclearence von 111In-DTPA-HSA und 111In-DTPA-AMPT-HSA
Die Plasmaclearance der Proteinkonjugates erfolgte nach Markierung mit radioaktivem
111
In-DTPA. Zwei Tieren wurde 111In-DTPA-HSA (3,7 MBq) intravenös appliziert,
zwei weitere Tiere erhielten die gleiche Menge an 111In-DTPA-AMPT-HSA. Die Plas-
mahalbwertszeit wurde aus Blutproben von 20 µl nach 5 Minuten, 1 Stunde, 4, 8, 24,
48, 72 und 96 Stunden bestimmt. Die so aus der Schwanzvene der Versuchstiere ge-
wonnenen Blutproben wurden im γ-Zähler (Berthold, Wildbad) untersucht. Dabei zeigte
sich kein Unterschied in der Plasmahalbwertszeit von 111In-DTPA-AMPT-HSA und
111
In-DTPA-HSA (Abb. 3). Die errechnete Plasmahalbwertszeit lag bei 2,5 Tagen und
entspricht der Halbwertszeit von nativem Albumin bei der Ratte.
49
1000000
cpm
100000
10000
1000
111In-AMPT-DTPA-SA
100
111In-DTPA-SA
10
1
0
1
4
h
24
48
96
Abb. 3: Plasmaclearance von 111In-DTPA-HSA und 111In-DTPA-AMPT-HSA bei der Ratte
3.1.6 Die Bioverteilung und Tumoraufnahme von 111In-DTPA-AMPT-HSA
Die Bioverteilung und Tumoraufnahme wurde bei drei W-256 Karzinom tragenden
Versuchstieren durch eine sequentielle Ganzkörperszintigraphie bestimmt, welche 5
Minuten, 1 h, 4 h, 24 h und 48 h nach intravenöser Applikation von 7,4 MBq 111In-
DTPA-AMPT-HSA durchgeführt wurde. Dazu wurden die Tiere mit einem Gemisch
von Halothan, N2O und O2 (1,5 %, 60 % und 38%) anästhesiert und in liegender Positi-
on auf einem Multihole Kollimator (420 kV) versehen mit einer 10-Inch γ-Kamera (Searle-Siemens, Pho-Gamma IV, Erlangen) gelegt. Zur Evaluierung der Daten wurde ein
Computersystem an die γ-Kamera adaptiert (Gaede Medworker, Gaede, Freiburg). Die
Zählraten des gesamten Körpers und die Zählraten über „regions of interest“ (ROI) über
der Schilddrüse, der Leber, dem Herzen, den Nieren, der Harnblase und den Tumoren
wurden somit gesammelt, um die Bioverteilung und die Tumoraufnahme von 111In-
DTPA-AMPT-HSA zu bestimmen (Tabelle 1). Dabei zeigte sich eine homogene Ver-
teilung von 111In-DTPA-AMPT-HSA im gesamten Körper der Versuchstiere. Allerdings
wurde vor allem auch eine deutliche Aufnahme des Konjugates im Tumor beobachtet,
welche von 8,4 % nach einer Stunde auf über 20,1 % nach zwei Tagen anstieg (Abb. 4).
50
Zeit
5 min
1h
4h
24 h
48 h
103635
(100%)
101751
(100%)
96050
(100%)
72274
(100%)
48361
(100%)
Herz
8868
(8.6%)
10345
(10.2%)
7037
(7.3%)
3983
(5.5%)
2325
(4.8%)
Leber
20212
(19.5%)
21509
(21.1%)
13434
(14.0%)
8737
(12.1%)
5273
(10.9%)
Tumor
4930
(4.8%)
8535
(8.4%)
18143
(18.8%)
14279
(19.7%)
9720
(20.1%)
Aktivität im
gesamten
Körper
Tabelle 1: Sequentielle Szintigraphie nach i. v. Applikation von 111In-DTPA-AMPT-HSA (7.4 MBq) in
Walker-256-Karzinom tragenden Ratten. Die ROI über dem Herzen, der Leber und dem Tumor
wurden als counts per minutes (cpm) bestimmt und in Relation zur Gesamtkörperaktivität gesetzt.
Abb. 4: Bildliche Darstellung der sequentiellen Szintigraphie bei Walker-256-Karzinom tragenden Ratten
nach i. v. Injektion von 111In-DTPA-AMPT-HSA (7,4 MBq).
51
3.1.7 Vergleichende Toxizität von AMPT-HSA versus AMPT
Daten über die maximal tolerable Dosis für wiederholte Injektionen von AMPT oder
AMPT-HSA in SD-Ratten lagen nicht vor. Aus diesem Grunde entschlossen wir uns, in
Anlehnung an vorbestehende tierexperimentelle Untersuchungen mit MTX-HSA bei
SD-Ratten auf ein ähnliches Applikationsschema von drei bis vier intravenösen Appli-
kationen zurückzugreifen. Aufgrund der bekannten erhöhten Toxizität von AMPT verglichen mit aequimolaren Dosen von MTX wurde zunächst eine reduzierte Dosis von
0,5 mg AMPT/kg oder 0,5 mg/AMPT-HSA/kg gewählt. Die intravenösen Injektionen
erfolgten an den Tagen 1, 3, 7 und dann, wenn möglich, drei Tage später am Tag 10, bis
typische durch das Antifolat bedingte Nebenwirkungen, wie z. B. Gewichtsverlust, Mukositis, Diarrhoe oder struppiges Fell, beobachtet wurden. Während der Behandlung
wurden das Körpergewicht, das Verhalten und die Gesundheit der Versuchstiere als
Ausdruck einer möglichen Toxizität wie auch die Tumorvolumina täglich festgehalten.
Die MTD für AMPT und AMPT-HSA wurde bei tumortragenden Tieren in einer Gruppengröße von 10 Tieren/Dosis bestimmt. Eine Dosiseskalation auf 1,0 mg/kg Körper-
gewicht entsprechend des oben genannten Applikationsschemas wurde nur dann in Erwägung gezogen, wenn keine schwerwiegenden Nebenwirkungen beobachtet wurden.
Die MTD bei tumortragenden Ratten, welche wiederholte intravenöse Applikationen
der Prüfsubstanzen erhielten, wurde definiert als die Dosis, bei welcher 20 % der Versuchstiere starben (LD 20) und/oder ein Gewichtsverlust von 20 % auftrat.
Insgesamt wurde die Verträglichkeit von AMPT-HSA und ungebundenem AMPT bei
60 Versuchstieren (10 Tiere/Substanzgruppe und Dosis) untersucht. Im ersten Ver-
suchsansatz erhielten die Tiere wiederholte intravenöse Applikationen in einer Dosie-
rung von 0,5 mg AMPT oder 0,5 mg AMPT-HSA. Bereits nach der dritten intravenösen
Injektion von 0,5 mg AMPT zeigten 2/3 der Tiere typische durch das Antifolat indu-
zierte Nebenwirkungen, wie Mukositis, Diarroe und struppiges Fell, während hingegen
die Tiere, die drei wiederholte intravenöse Applikationen von 0,5 mg AMPT-HSA er-
hielten, keinerlei Nebenwirkungen aufwiesen. Die Fortführung der Behandlung mit einer vierten intravenösen Injektion von 0,5 mg AMPT ging mit einer deutlichen Steige-
rung der Toxizität einher. Alle Tiere erkrankten und zeigten einen deutlichen Gewichtsverlust, so daß drei von ihnen starben. Im Gegensatz dazu wiesen alle Tiere, die vier
52
intravenöse Injektionen von 0,5 mg AMPT-HSA erhielten, keine schwerwiegenden Nebenwirkungen auf. Dieser Unterschied in der Verträglichkeit ist statistisch hochsignifikant (p = 0,0006, Fischer’s Exact). Über einen Zeitraum von vier Tagen erholten sich
die überlebenden Tiere vollständig. Aufgrund der gewonnenen Ergebnisse bezüglich der
Verträglichkeit von AMPT konnte hierfür die MTD für drei wiederholte intravenöse
Injektionen in einer Dosierung von 0,5 mg AMPT/kg Körpergewicht appliziert an den
Tagen 1, 3 und 7 festgelegt werden. Wegen der fehlenden Toxizität in der AMPT-HSA
Gruppe wurde eine Dosiseskalation zu wiederholten intravenösen Injektionen auf 1,0
mg AMPT-HSA/kg Körpergewicht vorgenommen. Ähnlich den Injektionen bei 0,5 mg
AMPT fand sich nun nach dreifacher Applikation von 1,0 mg AMPT-HSA auch eine
Nebenwirkungsrate bei 70 % der Versuchstiere. Eine Steigerung der Toxizität mit einer
Letalität bei vier Versuchstieren wurde nach der vierten intravenösen Applikation beobachtet, so daß die MTD für AMPT-HSA bei drei wiederholten intravenösen Applikatio-
nen in einer Dosierung von 1,0 mg/kg Körpergewicht, gegeben an den Tagen 1, 3 und 7,
festgelegt wurde. Dies entspricht einer Verdoppelung der Verträglichkeit gegenüber
ungebundenem AMPT (Tabelle 2).
53
Letalität
(bis zu 7 Tagen nach der letzten
Administration)
Nebenwirkungen
Körpergewicht
Evaluierung
Max. Gewichtsverlust (%)
Körpergewicht
(%)
(7 Tagen nach
der letzten Administration)
30
1.3 ± 5.8
105.5 ± 56.7
MTD/2
0
66
7.3 ± 7,6
103.5 ± 5,3
MTD
3/10
30
100
22 ± 13.1
95.1 ± 8.1
Toxisch
AMPT-HSA2)
4x0.5 mg/kg
0/10
0
20
0.3 ± 6.2
108.4 ± 5.9
MTD/2
AMPT-HSA1)
3x1,0 mg/kg
0/10
0
70
6.9 ± 3.8
102.7 ± 6.9
MTD
AMPT-HSA2)
4x1,0 mg/kg
4/10
40
100
17.2 ± 12.2
93.4 ± 8.5
Toxisch
Insgesamt
Insgesamt
(%)
AMPT1)
3x0.25 mg/kg
0/10
0
AMPT1)
3x0.5 mg/kg
0/10
AMPT2)
4x0.5 mg/kg
(Mukositis, Diarrhoe, struppiges
Fell)
(%)
Tabelle 2: Toxizität von AMPT und AMPT-SA an Walker-256-Karzinom tragenden SD Ratten.
1)
Applikation der Substanz an den Tagen 1, 3 und 7. 2) Applikation der Substanz an den Tagen 1, 3,
7 und 10.
3.1.8 Wirksamkeit von AMPT-HSA versus AMPT am Walker-256 Karzinom
In der Regel wird der zytostatische Effekt in der chemotherapeutischen Behandlung
maligner Tumoren in Nähe der MTD erwartet, vor allem dann, wenn, wie es bei Anti-
folaten zu erwarten ist, die Substanzen direkt mit der DNA oder DNA-Synthese intera-
gieren. Die Überprüfung der antitumoralen Wirksamkeit bei Walker-256-Karzinom tragenden Ratten wurde deswegen in Höhe der MTD oder MTD/2 untersucht. Gruppen
von jeweils 15 Tieren wurden nach Randomisierung der entsprechenden Behandlungsgruppe für wiederholte Injektionen für AMPT oder AMPT-HSA zugeführt. Die Kon-
trollgruppe bildeten 12 Tiere, welche Kochsalzinjektionen nach dem gleichen Behand-
54
lungsschema erhielten. Die Behandlung wurde initiiert, nachdem die Tumoren ein Vo-
lumen von ≥ 1.500 mm3 erreichten, was normalerweise 3 - 4 Tage nach der muskulären
Tumorimplantation geschah. Die Körpergewichte, Nebenwirkungen und Tumorvolu-
mina wurden täglich kontrolliert. Die Studien wurden dann beendet, wenn die Tumoren:
a) Eine kritische Größe von mehr als 3 cm im Durchmesser erreichten
b) Eine lang anhaltende Tumorremission bis zum Wiederauftreten des Tumors beobachtet wurde
c) Bis zu vier Wochen nach der letzten Applikation.
Wiederholte intravenöse Injektionen an den Tagen 1, 3 und 7 wurden bei insgesamt 60
Walker-256-Karzinom tragenden Ratten in der Höhe der MTD oder MTD/2 durchgeführt. Unter diesem Behandlungsschema wurden keine schwerwiegenden Nebenwir-
kungen beobachtet. Allerdings entwickelten die Tiere in der Kontrollgruppe innerhalb
von 10 Tagen nach der Tumorimplantation sehr rasch eine deutliche Tumorprogression,
so daß 11 von 12 Kontrolltieren entsprechend der Empfehlung der Tierschutzkommission getötet werden mußten.
In Höhe der MTD und MTD/2 zeigte das Antifolatkonjugat AMPT-HSA eine sehr hohe
Wirksamkeit, welche mit langanhaltenden Tumorremissionen und einer sehr guten Verträglichkeit einherging (Tabelle 3). Dagegen zeigte ungebundenes AMPT lediglich in
der MTD-Gruppe eine hohe antitumorale Wirksamkeit, während hingegen AMPT in
Höhe der MTD/2 eine signifikant niedrigere Tumorremissionsrate (53.3 %) verglichen
mit der MTD/2 bei AMPT-HSA aufwies. Dieser Unterschied in der Wirksamkeit in
Höhe der MTD/2 beider Prüfsubstanzen zeigte sich als statistisch signifikant (p =
0,0032). Ebenfalls war das Albuminkonjugat in der Tumorrezidivrate dem niedermolekularen AMPT überlegen. So wurden für AMPT-HSA im aequimolaren Vergleich bei
0,5 mg/kg KG nur 2 Tumorrezidive an den Tagen 10 und 24 gegenüber 4 Tumorrezidi-
ven am Tag 14 für AMPT beobachtet. Vergleicht man die Tumorrezidivrate in Höhe der
MTD/2 so findet sich wiederum ein statistisch signifikanter Vorteil für AMPT-HSA (p
= 0,05). In Höhe der MTD zeigte AMPT-HSA wiederum eine 100%ige Heilrate 7 Tage
nach der letzten Applikation. Hier wurde nur bei einem Tier ein Tumorrezidiv 22 Tage
nach der letzten Applikation beobachtet (Abb. 5).
55
MTDSpiegel
Optimaler
T/C-Quotient
(Tage) [%]
Tumorremissionsrate [%]
p Wert
AMPT-SA
vs. AMPT
(7 Tage nach der
letzten Administration)
Tumorrezidivrate
[%]
p Wert
AMPT-SA
vs. AMPT
(innerhalb 4
Wochen nach der
letzten Administration), (Tage)
AMPT
3x0.25 mg/kg
MTD/2
16,5 (7)
53.3
N.S.
46.6 (2-6)
Nicht signifikant
AMPT-HSA
3x0.5 mg/kg
MTD/2
8.3 (7)
100
0.0032
13.3 (10/24)
0.05
AMPT
3x0.5 mg/kg
MTD
8.2 (7)
100
0.0032
26.6 (14)
Nicht signifikant
AMPT-HSA
3x01.0 mg/kg
MTD
8.0 (7)
100
0.0032
6.6 (22)
Nicht signifikant
Tabelle 3: Die Wirksamkeit von AMPT-HSA und AMPT bei der MTD and MTD/2 in Walker-256
Karzinom tragenden SD-Ratten
12000,0
control
Tumor volume
( m m 3)
AMPT 3x0.25 mg/kg (MTD/2)
10000,0
AMPT 3x0.5 mg/kg (MTD)
AMPT-SA 3x0.5 mg/kg (MTD/2)
AMPT-SA 3x1.0 mg/kg (MTD)
8000,0
6000,0
4000,0
2000,0
0,0
1
6
11
16
21
d
26
32
Abb. 5: Die Aktivität von AMPT-HSA verglichen mit der von AMPT in Walker-256Karzinom tragenden Ratten. Die Applikation der Prüfsubstanzen ist durch Pfeile angezeigt. Aufgeführt werden die mittleren Tumorvolumina während des Versuchsvorhabens.
56
3.2
Untersuchungen von AMPT-HSA in Zellkultur
3.2.1 Einführung
Neben den Anwendungen am Walker-256 Karzinom der Ratte sollte der Effekt des
Proteinkonjugates AMPT-HSA aber auch in Zellkultur untersucht werden. Erstmals
hatte Stehle (13) einen Effekt von MTX-HSA in Zellkultur nachweisen können, dabei
fiel allerdings ein höherer Konzentrationsbedarf gegenüber ungebundenem MTX auf.
Diese Ergebnisse wurden auch durch andere Arbeitsgruppen bestätigt (14, 15). Gründe
hierfür liegen wohl an den Bedingungen in der Zellkultur selbst, in der in der Regel ein
gesättigtes Nährmedium vorliegt, so daß eine Albuminaufnahme in die Tumorzelle zu
deren Energieabdeckung gar nicht notwendig ist.
3.2.2 Optimierung der Kulturbedingungen
Die Zusammensetzung herkömmlicher Zellkulturmedien ist so gewählt, daß Tumorzellen darin optimal mit Nährsubstraten versorgt werden und somit bestmögliche Wachstumsbedingungen vorfinden. In der Regel setzen sich die Zellkulturmedien aus soge-
nannten Basismedien (z. B. RPMI 1640) und einem Anteil von 5 - 10 % fetalem Käl-
berserum (FCS) oder anderen Seren, wie z. B. Pferdeserum, zusammen, welche die für
die Zellproliferation notwendigen Wachstumsfaktoren enthalten. Da es sich bei Zell-
kulturen um ein geschlossenes System ohne Austausch, d. h. ohne Blutzirkulation, handelt, enthalten die Basismedien im Vergleich zum menschlichen Blut einen bis zu
20fachen Überschuß an freien Aminosäuren, Glucose, Hormonen und Vitaminen. Allerdings hat dies zur Folge, daß die kultivierten Tumorzellen zunächst auf einfach zu
verstoffwechselnde, d. h. auf die niedermolekularen Substrate zugreifen, und weniger
makromolekulare Substanzen, wie z. B. Proteine, verstoffwechseln, die ja erst intrazellulär zu Aminosäuren degradiert werden müssten. Die Arbeitsgruppe von Rannels (1617) beschrieb bereits in den 80er Jahren, daß durch Verminderung überhöhter Ami-
nosäurenkonzentrationen in den Kulturmedien verschiedene Zelllinien gezwungen werden, vermehrt auf die im Medium vorhandenen Eiweiße als Nährstoffquelle zuzugreifen.
57
3.2.3 Das Wachstumsverhalten von C6-Gliomzellen unter dem Einfluß von
AMPT-HSA
Um die zytostatische Wirkung von AMPT-HSA in der C6-Gliomkultur zu untersuchen,
wurde der nicht radioaktive Proliferations Assay MTS (Promega, USA) ausgewählt, bei
der der Anteil an vitalen Zellen durch eine aktive Metabolisierung von Tetrazolium
(Owen’s Reagenz) zu Formazan bei einer Absorption von 490 nm gemessen werden
kann. Das von den vitalen Zellen gebildete Formazan verhält sich direkt proportional
zu der Anzahl an Lebendzellen.
Die Zellkulturen wurden in steigenden Konzentrationen mit AMPT-HSA inkubiert und
der Anteil an Lebendzellen nach 24, 48, 72 und 96 h bestimmt. Dabei zeigte sich eine
deutliche Toxizität von AMPT-HSA ab einer Konzentration von 5,0 und 10,0 µg bezogen auf AMPT gebunden an HSA.
2,000
1,800
1,600
Ko leb
1,400
Ko tot
0.1µg
1,200
0.5µg
1.0µg
1,000
5.0µg
10.0µg
0,800
0,600
0,400
0,200
-
24h
48h
Zeit
72h
96h
Abb. 6: Wachstumsverhalten von C6-Gliomzellen unter dem Einfluß von AMPT-HSA
58
3.2.4 Der Einfluß von lysosomalen Proteaseinhibitoren auf die Wirkung von
AMPT-HSA
Durch Hinzufügen von 3 molarem Methylamin, einem lysosomalen Proteaseinhibitor,
konnte der zytotoxische Effekt von AMPT-HSA in der C6-Gliomzellkultur teilweise
aufgehoben werden, was die Annahme stützt, daß das Antifolat AMPT erst nach Ab-
spalten vom Albumin im Lysosom der Zelle wirksam wird. Dieses Ergebnisse wurden
auch durch Verwendung des lysosomalen Proteaseinhibitors Chloroquin (10µM) bestätigt.
2,000
1,800
1,600
Ko leb
Ko tot
1,400
0.1µg
1,200
0.5µg
1,000
5.0µg
1.0µg
10.0µg
0,800
0,600
0,400
0,200
-
24h
48h
Zeit
72h
96h
Abb. 6: Wachstumsverhalten von C6-Gliomzellen unter dem Einfluß von AMPT-HSA und lysosomaler Blockade mit Methylamin.
59
3.2.5
Der Einfluß von AMPT-HSA an der Walker-256 Karcinomzelllinie
Da der MTS-Test vor allem adhärente Zellen erfaßt, wurde die Wirkung von AMPT-HSA in
Zellkultur bei Walker-256 Zellen mit dem Flowcytometer (DAKO Galaxy, Hamburg)
bestimmt. Hier wurden ebenfalls vitale Zellen durch die quantitative Bestimmung von
Fluoresceindiacetat bei 488 nm von toten Zellen (Bestimmung von Propidiumjodit) unterschieden.
Im Gegensatz zu den C6-Gliomzellen zeigte sich hier bei schon sehr geringen Konzentrationen von 0,1 µg/ml ein deutlicher zytostatischer Effekt mit einer nur sehr geringen Erholung
nach 72 oder 96 Stunden. Ab einer Konzentration von 0,5 µg/ml konnten keine vitale Zellen
im Flowcytometer mehr nachgewiesen werden.
60000
50000
40000
Ko
0.1µg/ml
0.5µg/ml
1.0µg/ml
5.0µg/ml
10µg/ml
30000
20000
10000
0
24h
48h
Zeit
72h
96h
Abb. 7: Wachstumsverhalten von Walker-256-Karzinomzellen unter dem Einfluß von AMPTHSA.
60
3.2.6 Diskussion
Mehrfach war in den letzten Jahren versucht worden, Albumin als Carrier für zytosta-
tisch aktive Substanzen zu verwenden. Die Aktivitäten, zytostatische Albuminkonjugate
zu entwickeln, konzentrierten sich im Wesentlichen auf Methotrexat (MTX), wobei
versucht wurde, den zu erhoffenden therapeutischen Effekt durch höhere Beladungsraten von bis zu 56 Mol MTX/ 1 Mol Albumin zu steigern. Dies hatte jedoch zur Folge,
daß die räumliche Tertiärstruktur von Albumin und somit seine biologische Integrität
verändert wurde, weswegen allergische Reaktionen gegenüber nativem Albumin, ver-
kürzte Zirkulationszeiten und ein Abfangen des hoch beladenen Albumins im retikulo-
endothelialen System (RES) beobachtet wurden (18 - 22). Kaum eine dieser AlbuminMTX-Konjugate erreichte das Stadium einer klinischen Studie. Wie zuvor in Kapitel 1
berichtet, sollte Albumin aber nur in einem Verhältnis von nahezu 1 : 1 beladen werden,
um seine physiologischen Eigenschaften nicht zu verändern. Dann aber bietet Albumin
die Vorteile eines biologisch verfügbaren Carriersystemes:
•
lange Zirkulationszeiten
•
hohe Aufnahme im Tumor.
•
niedrige Toxizität
Mittlerweile wurde MTX-HSA in einer Phase-I/II-Studie am Städtischen Klinikum
Mannheim untersucht, wobei neben der guten Verträglichkeit bei 3/17 Patinten lang
anhaltende Remissionen beobachtet wurden (23). MTX-HSA befindet sich zwischen-
zeitlich in einer multizentrischen Phase-II-Studie (Fujisawa-Deutschland) bei Hypernephromen, Pleuramesotheliomen und Glioblastomen. Die viel versprechenden Ergebnis-
se mit MTX-HSA wie auch die erfolgreiche und lang anhaltende Aufnahme von AFLcHSA in malignen Gehirntumoren (24) ermutigte uns, die Albuminkoppelungstechnik
für ein weiteres Antifolat, wie dem des Aminopterins, einzusetzen. In den 40er Jahren
war Aminopterin das erste Antifolat, welches in der Behandlung akuter Leukämien bei
Kindern eingesetzt wurde. Seine Remissionsrate war in der damaligen Zeit für die behandelnden Ärzte sehr eindrucksvoll und läutete die Entwicklung der modernen Che-
motherapie ein. Jedoch wurde Aminopterin in den 50er Jahren wegen seiner doch deut-
61
lichen systemischen Toxizität durch ein ähnliches Antifolat, dem MTX, ersetzt. Im Gegensatz zu MTX weist AMPT jedoch eine erhöhte therapeutische Wirksamkeit auf, da
durch AMPT ein 20fach höherer Vmax/Km Quotient für das Enzym Folylpolyglutamat
Synthetase erreicht wird (4). Zudem zeigt sich für Lymphoblasten und Myeloblasten
eine größere Aufnahmerate und Polyglutamatbildung (5). In jüngster Zeit wurde AMPT
erneut in einer Phase-I-Studie bei 20 Patienten mit therapieresistenten Karzinomerkrankungen eingesetzt und erreichte bei einer Patientin mit einem Endometriumkarzinom
eine komplette Remission. Bei 7 Patienten wurde zwischen zwei und neun Monaten ein
Stillstand der initial vorhandenen Tumorprogression beobachtet (6). Die initial applizierte Dosis von 2,5 mg/m2 alle 12 Stunden (2 Applikationen pro Woche) mußte vor
allem wegen einer beobachteten Mukositis auf 2 mg/m2 reduziert werden. Zudem war
eine Gabe von Leukoverin in einer Dosierung von 5 mg/ m2 notwendig.
In unserer Studie wurde AMPT in einem 1 : 1 molaren Verhältnis an Albumin gebunden und wurde bezüglich seiner Plasmahalbwertszeit, Bioverteilung, Verträglichkeit
und Wirksamkeit am Walker-256 Karzinom der Ratte untersucht (25). Wie erwartet,
zeigte sich im Vergleich zu nativem Albumin eine unveränderte Plasmahalbwertszeit
von ungefähr 2,5 Tagen bei der Ratte. Auch war in der Ganzkörperszintigraphie eine
normale Verteilung des Proteinkonjugates erkennbar. Jedoch wurde über dem Walker256 Karcinom eine hohe und lang anhaltende Aufnahme von bis zu 20,1 % der nach 2
Tagen im ganzen Körper verbliebenen Dosis beobachtet.
Bezüglich der Verträglichkeit fanden sich nach wiederholten Applikationen von 0,5 mg
AMPT/kg KG typische durch das Antifolat induzierte Nebenwirkungen. Nach viermaligen Applikationen von 0,5 mg AMPT/kg KG wurde eine schwere Toxizität (maximaler
Gewichtsverlust 17,2 %) und einer Letalität von 30 % beobachtet. Dagegen waren vier
Applikationen von 0,5 mg AMPT-HSA/kg KG vollkommen nebenwirkungsfrei, so daß
das Konjugat höher dosiert werden konnte. Erst nach vier Applikationen von 1,0 mg
AMPT-HSA/kg Körpergewicht erreichte das Konjugat eine Toxizität. Die MTD für das
niedermolekulare AMPT lag bei 3 x 0,5 mg/kg, für das Konjugat aber bei 3 x 1,0
mg/kg KG. Somit wurde durch die Konjugierung des Antifolates eine Verdoppelung in
der MTD erreicht. Diese Untersuchungen bestätigen eine Reduzierung der systemischen
62
Toxizität von AMPT durch die kovalente Koppelung an Albumin, obwohl das Konjugat
verglichen mit dem ungebundenen, niedermolekularen AMPT weitaus länger in Zirkulation bleibt. Mit hoher Wahrscheinlichkeit läßt sich vermuten, daß das Konjugat
AMPT-HSA normal proliferierendes Gewebe nicht in der gleichen Art und Weise erreicht oder belastet wie niedermolekular zirkulierendes AMPT.
Sowohl in der MTD und MTD/2 Dosierung war AMPT-HSA sehr wirksam und erreichte lang anhaltende Tumorremissionen. Im Gegensatz dazu war AMPT in der
MTD/2 Dosierung deutlich weniger wirksam und wies frühere Tumorrezidive auf. Dieser Unterschied in den T/C-Werten (p = 0,0032) und Tumorrezidiven (p = 0,05) erwies
sich als statistisch signifikant. Der Vergleich beider Substanzen in einer aequimolaren
Dosierung von 0,5 mg/kg Körpergewicht für AMPT (MTD) und AMPT-HSA (MTD/2)
zeigte für beide Substanzen eine komplette Remissionsrate über 7 Tage nach der letzten
Applikation. Allerdings wurde für das Konjugat eine niedrigere und spätere Tumorrezidivrate (AMPT: 4 Rezidive am Tag 14 nach der letzten Applikation versus 2 Rezidive
für AMPT-HSA an den Tagen 10 und 24 nach der letzten Applikation) beobachtet. Im
Hinblick auf die hohe Wirksamkeit und die deutlich reduzierte systemische Toxizität
des Konjugates AMPT-HSA gegenüber ungebundenem AMPT läßt sich vermutetn, daß
die eigentliche Wirksubstanz erst nach intrazellulärer Abspaltung von Albumin durch
lysosomale Proteasen in der Tumorzelle entfaltet wird, um dann, wie bereits beschrie-
ben, mit hoher Affinität die Folylpolyglutamatsynthetase zu inhibieren. Insgesamt im-
poniert AMPT-HSA verglichen mit dem Albuminkonjugat MTX-HSA als die aktivere
Substanz, denn lang anhaltende Remissionen für MTX-HSA in einer Höhe von 60 %
beim Walker-256 Karzinom der Ratte wurden erst in einer Dosierung von 3 x 2,0 mg/kg
KG beobachtet. Gerade aber bei den Karzinomen, welche eine erhöhte Tumorpermeabilität aufweisen (27 – 29), verspricht AMPT-HSA aufgrund seiner pharmakokinetischen Eigenschaften eine mögliche Wirksamkeit. Neben MTX-HSA und dem von
Pommerenke untersuchten Doxorubicin-HSA an Doxorubicin-resistenten L1210 Tumoren bei Mäusen (30) liegt nun mit AMPT-HSA ein weiteres Albuminkonjugat vor, welches für weitere präklinische und klinische Studien auf Grund der durch die Albuminkonjugierung deutlich erniedrigten systemischen Toxizität als geeignet erscheint.
63
Kapitel 4
Klinische Phase-I und II-Studien mit Methotrexat-Albumin (MTXHSA) bei Patienten mit rezidivierenden malignen Gehirntumoren
4.1
Einleitung
Auf die tierexperimentellen Untersuchungen mit MTX-RSA und die erste klinische
Phase-I-Studie mit MTX-HSA am Onkologischen Zentrum des Städtischen Klinikums
Mannheim wurde bereits in Kapitel 1 verwiesen. Sowohl die tierexperimentellen Ar-
beiten wie auch die klinische Phase-I-Studie waren die Grundlage für eine Auslizensierung der von Sinn entwickelten Patente (MTX-HSA; AFlc-HSA etc.) an Firma KlingePharma, jetzt Fujisawa-Deutschland. Nach Übernahme der Patente erfolgte eine zweite
von Klinge-Pharma initiierte, dem Arzneimittelgesetz entsprechende Phase-I-Studie mit
aufsteigenden Dosierungen von 50 mg/m2, 70 mg/ m2, 80 mg/ m2 und 90 mg/ m2 MTX-
HSA in zweiwöchentlichen Abständen bei insgesamt 23 Karzinompatienten. Die Studiendauer verlief über vier Administrationen, d. h. die Behandlungsdauer betrug insge-
samt zwei Monate. Bei Studienende war bei 10 von 23 Patienten keine weitere Tumorprogression mehr zu beobachten. Die akute Toxizität der ambulant behandelten Patienten war gering. Erst ab zweiwöchentlichen Dosierungen von 80 mg MTX-HSA/m2 tra-
ten typische MTX-induzierte Nebenwirkungen (CTC-Grade gemäß der common-toxiccritera) auf:
•
Thrombozytopenie:
•
Stomatitis:
•
Bilirubinämie:
•
2 x Grad 4 bei 80 mg/m2; 1 x Grad 3 und 1 x Grad 4 bei
90 mg/m2.
1 x Grad 3 und 1 x Grad 4 bei 80 mg/ m2; 1 x Grad 3 bei
90 mg/ m2
1 x Grad 3 bei 80 mg/m2;
Transaminasenerhöhung: 1 x Grad 3 bei 90 mg/m2.
64
4.2
Klinische Phase-I-Studie mit zweiwöchentlichen Applikationen von MTXHSA bei Patienten mit rezidivierenden malignen Gehirntumoren
In diese Studie wurden von der Neurochirurgischen Universitätsklinik Heidelberg insgesamt vier Patienten (1 x malignes Meningiom WHO III, 58 Jahre alte Patientin; 1 x
rezidivierendes primäres Glioblastom, 76 Jahre alter Patient; 2 x rezidivierende sekun-
däre Glioblastome, eine Patientin und ein Patient von jeweils 36 Jahren). Alle Patienten
waren ausbestrahlt, eine weitere chirurgische Option bestand nicht. Ebenfalls waren die
drei Gliompatienten mit Carmustin vorbehandelt. Es erfolgten zweiwöchentliche am-
bulante Applikationen von MTX-HSA in einer Dosierung von 70 mg/m2. Die Studien-
medikation wurde gut vertragen, eine antiemetische Zusatzmedikation war bei keinem
Patienten erforderlich. Einmal wurde ein Patient wegen einer Stomatitis stationär behandelt. In folgender Tabelle sind die Nebenwirkungen gemäß der „common-toxiccritera“ (CTC) aufgelistet.
Dosis
70 mg/ m2 Leukozytopenie
70 mg/ m2 Thrombozytopenie
70 mg/ m2 Transaminasenerh.
0
1
1
1
3
1
1
CTC-Grade
2
3
4
1
-
1
-
-
-
-
-
-
-
-
2
1
1
-
-
70 mg/ m2 Alk. Phosphatase
2
2
70 mg/ m2 Erbrechen
3
1
-
70 mg/ m2 Appetit
3
-
1
70 mg/ m2 Übelkeit
70 mg/ m2 Stomatitis
70 mg/ m2 Gewichtsverlust
3
3
-
3
-
-
-
-
1
1
-
-
-
-
-
Tabelle 1: Nebenwirkungen während der Phase-I-Studie mit MTX-HSA (70 mg/m2 zweiwöchentlich).
65
Bei Studienende zeigten beide sekundäre Glioblastompatienten über 2,5 bzw. drei Mo-
nate einen Stillstand der zuvor kernspintomographisch nachgewiesenen Tumorprogression. Bei der Patientin mit dem multifokalen malignen Meningiom wie auch bei dem
Patienten mit dem primären Glioblastomrezidiv war eine weitere Tumorprogression
nach Abschluß der Studiendauer jedoch nicht aufhaltbar. Erfreulicherweise konnte dann
aber in der Extension-Studie bei dem Patienten mit dem progredienten primären Glio-
blastomrezidiv ein weiteres Tumorwachstum unter sechs weiteren MTX-HSA Applikationen über vier Monate verhindert werden.
Patienten
01
sekund. Glioblastom
Tumorprogression
während der Studiendauer (Monate)
NC über 2,5 Monate
Extension-Studie
PD nach 1,5 Monaten
02
malignes Meningeom
PD
03
sekund. Glioblastom
NC über 3 Monate
PD nach 1 Monat
PD
NC über 4 Monate, dann
PD
04
primäres Glioblastom
Tabelle 2: Kernspintomographisch nachgewiesene Tumorprogression unter der Phase-IStudie mit MTX-HSA (NC = no change; PD = progressive disease)
Im Gegensatz zur ersten Phase-I-Studie in Mannheim, in der die Halbwertszeit von
MTX-HSA mit 21± 12 Tagen angegeben wurde (1), lag diese nun nach pharmakokine-
tischen Bestimmungen durch Klinge-Pharma bei 9,96 ± 5.65 Tagen. Insgesamt ermu-
tigten uns die Ergebnisse in der Phase-I-Studie, MTX-HSA in einer vergleichenden
Phase-II-Studie bei Patienten mit primären und sekundären Glioblastomrezidiven zu
untersuchen. Zudem wurden von Klinge-Pharma weitere klinische Phase-II-Studien,
sowohl für das malignen Hypernephrom (2) wie auch für das maligne Mesotheliom (3),
veranlaßt.
66
4.3
Vergleichende Phase-II-Studie von MTX-HSA und Carmustin/Lomustin
bei Patienten mit primären und sekundären Glioblastomrezidiven
Um die Wirkung von MTX-HSA bei primären und sekundären Glioblastompatienten
nachzuweisen, wurde eine randomisierte Vergleichsstudie mit den Nitrosoharnstoffen
Carmustin (BCNU; Carmubris) bzw. Lomustin (CCNU; Cecenu) als weitere Prüfsubstanzen konzipiert. Dabei galten folgende Einschlußkriterien:
•
•
•
Kernspintomographisch nachgewiesenes Tumorrezidiv eines primären Glioblastoms
Solider Tumorrest nach mikrochirurgischer Resektion oder bioptischer Sicherung
eines primären Glioblastoms
Kernspintomographisch nachgewiesene, eindeutige maligne Transformation eines
ursprünglich niedergradigen Glioms zum sekundären Glioblastom.
Als Ausschlußkriterien wurden formuliert:
•
Vorbehandlung mit Nitrosoharnstoffen
•
Hormontherapie < 4 Wochen oder Immuntherapie < 2 Wochen
•
•
•
•
Operation vor < 2 Wochen, Radiotherapie < 4 Wochen
Zweitkarzinomerkrankung oder akute/chronische Infektionen
Schwangerschaft
Allergische Reaktionen gegenüber Nitrosoharnstoffen oder MTX
MTX-HSA wurde wöchentlich in einer Dosierung von 50 mg/ m2 ambulant, BCNU
(Carmustin) bzw. CCNU (Lomustin) sechswöchentlich in einer Dosierung von 200
mg/m2 kurzstationär verabreicht. Ab dem 01.05.01 wurde das MTX-HSA Dosierungs-
schema wie folgt geändert: Initialdosis (loading-dose) von 110 mg/m2, gefolgt von wöchentlichen Applikationen mit 40 mg/m2 oder bei fehlender Toxizität von wöchentlichen Applikationen mit 50 mg/m2.
Mit dem Stand vom 30.08.02 sind nun 17 Patienten in diese Vergleichstudie einge-
schleust (10 x primäre Glioblastome; 4 x sekundäre Glioblastome, 3 x Gliosarkome).
67
Alle Patienten hatten einen Karnofsky-Index von > 70 %, das mittlere Alter lag bei 47
Jahren. Wiederum wurde der Effekt der Therapie kernspintomographisch in zwei- bis
dreimonatigen Abständen kontrolliert. Mit dem Stand vom 31.08.02 ergibt sich folgende Nebenwirkungsrate:
CTC-Grade
1
2
3
4
Leukozytopenie
1
1
-
-
Anämie
1
BCNU/CCNU
Transaminasen
Thrombozytopenie
MTX-HSA
Leukozytopenie
Transaminasen
Anämie
Thrombozytopenie
Stomatitis
Nausea
-
3
1
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
1
2
2
1
1
-
-
-
-
2
1
1
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Tabelle 3: Nebenwirkungsrate von Carmustin und Lomustin im Vergleich zu MTX-HSA
Gegenwärtig ergibt sich mit dem Stand vom 31.08.02 folgende Wirksamkeit für die
beiden Substanzgruppen, welche bei nachgewiesener Tumorprogression auch gegeneinander ausgetauscht werden konnten (cross-over):
68
Patient- Alen
ter
IB
41
PrüfzenTumorentität
trum
H
Prim. Glioblastom
Chemotherapieschema
HT
65
H
Prim. Glioblastom
14 x MTX-HSA
2 x PD
HH
50
H
Sek. Glioblastom
10 x BCNU
5 x NC
FS
56
H
Prim. Glioblastom
1 x BCNU
1 x PD
RW
63
H
Gliosarkom
2 x MTX-HSA
1 x PD
HG
62
H
Prim. Glioblastom
5 x MTX-HSA
1 x PD
MH
37
H
Prim. Glioblastom
RM
39
H
Sek. Glioblastom
8 x MTX-HSA
4 x BCNU
3 x BCNU
1 x PD (cross over)
1 x MR; 1 x PD
1 x NC; 1 x PD
HR
62
H
Sek. Glioblastom
JI
39
H
Gliosarkom
GM
33
O
Prim. Glioblastom
5 x BCNU
5 x MTX-HSA*
5 x MTX-HSA
5 x BCNU
5 x CCNU
2 x NC; 1 x PD (cross over)
1 x PR; 1 x PD
1 x PD (cross over)
1 x PD
1 x PD (cross over)
CP
65
H
Prim. Glioblastom
RR
45
H
Sek. Glioblastom
15 x MTX-HSA*
3 x BCNU
6 x BCNU
1 x NC; 1 x PD (cross over)
1 x NC; 1 x PD
2 x NC
TV
46
H
Gliosarkom
JR
57
H
Prim. Glioblastom
5 x MTX-HSA*
3 x BCNU
2 x BCNU
10 x MTX-HSA*
1 x PD (cross over)
1 x NC; 1 x PD
1 x PD (cross over)
2 x NC
JH
51
G
Prim. Glioblastom
11 x MTX-HSA*
1 x NC; 1 x PD
AD
32
H
Prim. Glioblastom
No treatment received
2 x BCNU
Wirksamkeit
(MRT-Untersuchungen in 2-3 monatlichen Abständen)
1 x PD
Tabelle 4: Die Wirksamkeit von Carmustin/Lomustin im Vergleich zu MTX-HSA; MTXHSA* mit loading dose; H = Heidelberg; O = Osnabrück; G = Gießen
(CR:complete response; PR=partial response; MR=mixed response; NC=no change; PD=progressive disease)
69
Als Prüfzentren dienten neben der Neurochirurgischen Universitätsklinik Heidelberg
(15 Patienten) die Neurochirurgische Abteilung der Paracelsus-Klinik Osnabrück (1
Patient), die Neuroonkologische Abteilung des AKH Wien (kein Patient), die Neuro-
chirurgische Universitäsklinik Giessen (1 Patient) und erst seit kurzem die Onkologische Abteilung der Universitätsklinik Rostock (bislang noch kein Patient). Alle vier
Patienten mit sekundären Glioblastomen zeigten initial ein Ansprechen auf die chemo-
therapeutische Behandlung mit BCNU mit einem unveränderten Tumorstatus über 3, 5,
6 und 10 Behandlungszyklen. Somit erscheinen gerade sekundäre Glioblastome im Gegensatz zu den primären Glioblastom- oder Gliosarkomrezidiven als besonders sensitiv
gegenüber einer Chemotherapie mit Nitrosoharnstoffen (p = 0,0082; Fischer’s Exact
Test). Bei den vier Patienten mit primären Glioblastomrezidiven, welche mit BCNU
behandelt wurden, fand sich bei keinem ein Stillstand des Tumorwachstums. Dagegen
zeigten zwei von vier Patienten mit primären Glioblastomrezidiven, welche mit MTX-
HSA behandelt wurden, ein „no change“ über jeweils 3 Monate. Allerdings wies dieser
Unterschied in der Prüfmedikation zwischen MTX-HSA und den Nitrosoharnstoffen
keine statistische Signifikanz auf (p = 0,42; Fischer’s Exact Test). Überraschend war
das Ansprechen auf die chemotherapeutische Behandlung unter einem Wechsel der Studienmedikation, sog. „cross over“, welches bei 7 Patienten angeboten, aber nur bei 6
Patienten durchgeführt wurde. Hierbei fand sich bei 5 der 6 Patienten ein Ansprechen
auf die chemotherapeutische Behandlung: 1 Patient mit MR (mixed response) von
MTX-HSA zu BCNU (prim. Glioblastom); 1 Patient mit PR (partial response) von
BCNU auf MTX-HSA (sek. Glioblastom); 2 Patienten mit NC (no change) von MTXHSA auf BCNU (prim. Glioblastome); 1 Patient mit NC von BCNU auf MTX-HSA
(prim. Glioblastom). Auch hier zeigte sich eine statistische Signifikanz (p = 0,0014;
Fischer’s Exact Test) gegenüber den Patienten, bei denen kein „cross over“ stattfand.
70
4.4
Diskussion
Immer noch wird die chemotherapeutische Behandlung von Glioblastomen kontrovers
diskutiert. Manche Autoren geben eine Ansprechrate von 20 – 25 % an (4, 5). Insgesamt
aber wird eine durch die Chemotherapie bedingte Verlängerung der Überlebenszeit für
einen Zeitraum von nur wenigen Wochen erreicht (6, 7). Erschwerend kommt hinzu,
daß in vielen klinischen Studien nicht zwischen primären und sekundären Glioblastomen unterschieden wird. Auch findet sich unter der Bezeichnung „maligner Gliome“
eine Vermischung von anaplastischen Astrozytomen WHO III, anaplastischen Oligodendrogliomen WHO III und Glioblastomen, WHO Grad IV (5, 8). Zudem kann ver-
mutet werden, daß ein gewisser Anteil der Ansprechrate unter der Chemotherapie mit
Nitrosoharnstoffen auf das Vorhandensein von nicht diagnostizierten, aber chemosensitiven anaplastischen Oligodendrogliomen zurückzuführen ist (9). Vielen Studien fehlt
eine Vergleichsgruppe nach Randomisierung, so daß eigentlich in den meisten Fällen
nur gesammelte Fallberichte vorliegen. Auch findet die Radikalität der Operation und
der dadurch bedingte Einfluß auf die Prognose bei Glioblastomen nur wenig Beachtung
(10, 11).
Die am häufigsten verwendeten Substanzen sind die seit den 80er Jahren eingesetzten
Nitrosoharnstoffe (BCNU, Carmustin; CCNU, Lomustin und ACNU, Fotemustin), welche als Anti-Alkylantien direkt in die DNA- Synthese eingreifen (12). Trotz ihrer guten
Verträglichkeit hat die, wenn auch immer wieder Einzelerfolge beobachtet werden, ge-
ringe Ansprechrate nur wenige Zentren veranlaßt, diese Substanzen, zumindest bei Glioblastompatienten, regelmäßig einzusetzen. Mit Temozolamid, einem ebenfalls alkylierendem Wirkstoff, hat die chemotherapeutische Behandlung von Glioblastomen eine
gewisse Renaissance erfahren, obwohl in einer vergleichenden Phase-II-Studie von Temozolamid versus Procarbazin nur ein leichter Überlebensvorteil bei einem Zeitpunkt
von sechs Monaten nachgewiesen werden konnte (13).
Methotrexat ist ein Folsäureantagonist, welcher in die S-Phase eingreift und die Pyrimi-
dinsynthese blockiert. MTX findet Verwendung bei den akuten lymphoblastischen Leukämien im Kindesalter, bei Osteosarkomen, Chorionkarzinomen, Lymphomen, Kopf -
71
Hals - Tumoren und anderen soliden Tumorerkrankungen. MTX wird ebenfalls bei
chronisch entzündlichen Erkrankungen, wie z. B. der rheumatoiden Arthritis oder bei
Psoriasis, klinisch angewendet.
Die Dosierungen reichen von 30 mg/m2 wöchentlich oder 50 - 100 mg/m2 drei- bis
vierwöchentlich bis zu Dosierungen von 100 - 1500 oder 8000 - 12000 mg/m2 (Hochdosistherapie). Hier ist ein Einsatz von Folsäureersatz unabdingbar (14). Nach intravenöser Gabe lagert sich MTX zu 35 - 50 % unspezifisch an Plasmaeiweiße. Seine Halb-
wertszeit, welche vor allem durch die glomeruläre Filtration bedingt ist, wird mit 0,5 - 3
Stunden angegeben (15). Eine intakte Blut - Hirn - Schranke passiert MTX nicht. MTX
induzierte Nerbenwirkungen bestehen vor allen von Seiten des Blutbildes (Thrombo-
zytopenie, Leukozytopenie), der Schleimhäute (Mucositis, Stomatitis), des Urogenital-
traktes (Nierenfunktionsstörungen, Zystitis), der Leber (Hepatopathien, Lebernekrosen)
und der Haut (Exantheme, Erytheme, Alopezie).
Die Verwendung von Methotrexat in der Behandlung von zerebralen Malignomen kon-
zentriert sich vor allem auf die intrathekale Applikation bei zerebralen Lymphomen (16)
und der leptomeningialen Aussaat von systemischen Tumorerkrankungen (17). Jedoch
wurde Methotrexat in den 70er Jahren auch bei Glioblastomen getestet, wobei teilweise
sehr hohe Dosierungen in Kombination mit Folsäureersatz verwendet wurden (18).
Intraarterielle (19) oder intratumorale Injektionen (20, 21, 22) von Methotrexat oder
lokale Applikationen von MTX, welche teilweise an synthetische Träger, wie z. B. Po-
lylactit (23) oder Polymethylmethacrylat (24), dienten der Verbesserung der Pharmako-
kinetik mit höheren lokalen Wirkstoffkonzentationen. Weiterführende klinische Studien
hierüber existieren jedoch nicht. Insgesamt muß man davon ausgehen, daß Methotrexat
bei Glioblastomen eher schwach wirksam ist. Neben den bekannten systemischen Nebenwirkungen kann bei intrathekaler Applikation eine schwere Neurotoxizität beob-
achtet werden, vor allem dann, wenn MTX intrathekal in Kombination mit einer Ganzhirnbestrahlung appliziert wird (25, 26).
In Kenntnis der doch deutlichen systemischen Nebenwirkungsrate bei Dosierungen von
50 mg MTX/m2 wöchentlich erscheinen die in den Phase-I und II-Studien erreichten
72
Toxizitäten von 50 mg MTX-HSA/m2 trotz der deutlich längeren Zirkulationszeiten des
Konjugates im Vergleich zu freiem MTX als gering (2 x Transaminasenerhöhung Grad
3 und 1 x Trombozytopenie Grad 3 bei 50 mg MTX-HSA /m2 wöchentlich; 1 x Throm-
bozytopenie Grad 4 bei 70 mg MTX-HSA /m2 zweiwöchentlich). In allen Fällen konnte
die Toxizität durch eine Spreizung der Studienmedikation beherrscht werden. Eine Zunahme an Toxizität nach Einführung der „loading dose“ von 110 mg MTX-HSA/m2
wurde nicht beobachtet. Insgesamt bestätigte sich, daß mit MTX-HSA ein sog. „pro-
drug“ vorliegt, welches trotz der langen Zirkulationszeit physiologisch proliferierendes
Gewebe kaum belastet.
Bezüglich der Effektivität konnte in der Phase-I-Studie unter Behandlung mit MTX-
HSA bei zwei Patienten mit sekundären Glioblastomen, welche unter BCNU eine Tu-
morprogression aufwiesen, ein Stillstand des Tumorwachstums über 2,5 bzw. drei Mo-
nate erreicht werden. In der Phase-II-Studie wurden nach Randomisierung alle sekundären Glioblastome primär mit BCNU behandelt. Hierbei zeigte sich eine Ansprechrate
mit einem „no change“ über drei, fünf, sechs und zehn Behandlungszyklen (p = 0,0082;
sekundäre versus primäre Glioblastome). Deutlich niedriger war die Ansprechrate bei
den primären Glioblastomen. Hier hatte die primäre Nitrosoharnstoffbehandlung bei
keinem Patienten zu einem Stillstand des Tumorwachstums geführt. Allerdings zeigten
zwei Patienten mit primärem Glioblastomrezidiven, welche initial mit MTX-HSA behandelt wurden, einen Stillstand der zuvor beobachteten Tumorprogression auf. Am
häufigsten aber, nämlich bei fünf von sechs Patienten, finden sich Effekte der Chemo-
therapie bei einem Wechsel der Studienmedikation, sog. „cross over“, so daß ein syner-
gistischer Effekt des Folsäureantagonisten und des Anti-Alkylans vermutet werden kann
(p = 0,0014; cross over versus kein cross over).
Insgesamt aber sind die Effekte vor allem bei den primären Glioblastomen oder Glio-
sarkomen von nur kurzer Dauer und erreichen einen Stillstand in der Tumorprogression
von ungefähr vier bis fünf Monaten. Auch wenn dies insgesamt gesehen ein nur kurzer
Zeitraum ist, so erscheint dies bei der sehr guten Verträglichkeit beider Substanzgrup-
pen für den Einzelfall durchaus als Teilerfolg. Auch wenn eine abschließende Beurtei-
lung der Studie noch nicht vorliegt, so stellt sich die Frage, ob nicht gerade das Ausnut-
73
zen eines vermuteten synergistischen Effektes zwischen Antifolat und Anti-Alkylans
(27) eine Fortführung der Studie im Sinne einer Kombinationstherapie rechtfertigt.
74
Kapitel 5
Albuminvermittelte Lymphdiagnostik mit TCPC- oder TCPP-HSA
und Gadolinium-HSA
5.1.
Einleitung
Eine Hauptaufgabe des Lymphgefäßsystems besteht in der Bewältigung der extravaskulären Zirkulation von Plasmaproteinen. Bis auf eine geringe Menge, welche über
Blutkapillaren wieder in den Kreislauf zurückgelangen, muß der überwiegende Teil der
das Kapillarbett verlassenden Plasmaproteine über das Lymphbahnsystem in das venöse
System über den Ductus thoracicus zurückgeführt werden. Für diese Eigenschaft sind
Lymphgefäße mit Klappen ausgestattet, können aber auch eine gewisse Eigenkontraktabilität entwickeln. Äußere Einflüsse, wie die Muskelpumpe, Atemexkursion und aterielle Pulsation unterstützen den Lymphfluß (1).
Neben dem Transport von Plasmaproteinen stellen Lymphwege aber auch ein wichtiges
Ausbreitungsnetz bei Karzinomerkrankungen dar. Eine Vielzahl maligner Tumoren,
wie z. B. das Mammakarzinom, maligne Melanom und Prostatakarzinom, metastasieren
über Lymphbahnen, weswegen der Diagnostik von tumordrainierenden Lymphwegen
und deren Lymphknoten in der letzten Zeit vermehrt Beobachtung geschenkt wird. So
wurde das Konzept des Wächterlymphknotens, d. h. des ersten im Lymphabstromgebiet
des malignen Tumors befallenen Lymphknoten, entwickelt. Dieses Konzept des „sentinel lymph node“ (SLN) wurde 1977 von Canabas (2) anhand lymphangiographischer
Untersuchungen bei Peniskarzinomen entwickelt und 1992 von Morton (3) auf das maligne Melanom übertragen. Während beide Autoren für die intraoperative Darstellung
von Lymphwegen noch Patentblau verwendeten, wurde wenige Zeit später radioaktiv
mit 99mTechnetium markiertes kolloidales humanes Serumalbumin (99mTc-HSA) zur
Identifizierung des SLN eingesetzt ( 4, 5, 6, 7, 8).
Durch Einführung des Sentinel-Lymph-Node-Konzeptes (SLN) hat die Diagnostik und
Therapie von tumordrainierenden Lymphbahnen und deren Lymphknoten eine Renais-
75
sance erfahren (9). Mit 99mTc-HSA ist präoperativ eine Lymphabstromszintigraphie
möglich, intraoperativ kann dann der SLN mit speziellen Gammasonden und auch unter
Zuhilfenahme von intraoperativ appliziertem Patentblau aufgesucht werden. Mit Hilfe
dieser Technik gelingt es, zu mehr als 90 % den SLN aufzusuchen, welcher bereits bei
Tumordurchmessern von nur wenigen Millimetern schon Mikrometastasen aufweisen
kann (10). Somit trägt die SLN-Diagnostik wesentlich zu einer verbesserten Diagnostik
und Therapie der frühen lymphogenen Metastasierung solider Tumoren bei. Da bislang
hauptsächlich kolloidales 99mTc-HSA mittels der Lymphabstromszintigraphie und in-
traoperativ Gammasonden zum Einsatz kommen, sollte versucht werden, ob nicht auch
durch eine Fluoreszenzbeladung von HSA ein direkte Darstellung von Lymphwegen
und veränderten im Abstromgebiet liegenden Lymphknoten (SLN) möglich sei. Dies
sollte durch eine 1:1 molare Beladung von Tetra(4-Carboxy-Phenyl-Chlorin (TCPC)
oder Tetra(4-Carboxy-Phenyl-Porphyrin (TCPP) an HSA tierexperimentell untersucht
werden.
1,2
Absorption
1
Emmission
0,8
0,6
0,4
0,2
0
300
400
500
600
700
nm
800
900
Abb. 1: Die Emissions- und Absorptionsspektren von TCPP- und TCPC-HSA
76
995
5.2
Die Diagnostik von Lymphwegen mit TCPC - HSA
Zunächst wurden die retroperitonealen Lymphbahnen bei der Ratte mit TCPC-HSA
untersucht. In Äthernarkose wurden bei drei SD-Ratten jeweils 0,1 ml TCPC-HSA
beidseits intrakutan in den Fußrücken injiziiert. Eine Stunde danach wurden die großen
retroperitonealen Lymphgefäße durch Beiseiteschieben der Darmschlingen freigelegt
und das Farbstoffkonjugat TCPC-HSA mit einem D-Light (Fa. Storz, Tuttlingen) bei
einer Anregung von ca. 400 nm aktiviert. Die Betrachtung der Fluoreszenz erfolgte mit
einem Langwellenfilter. Eindrucksvoll präsentierten sich die großen retroperitonealen
Lymphbahnen, nachdem eine Stunde zuvor TCPC-HSA intrakutan appliziert worden
war. Ein direktes Erkennen der Lymphbahnen war ohne Zuhilfenahme des Farbstoffes
nicht möglich.
A
77
B
C
Abb. 2: Darstellung der retroperitonealen Lymphbahnen (C) der Ratte nach intrakutaner Injektion (A) und Beiseiteschieben der Darmschlingen (B).
78
5.3
Diagnostik von Lymphwegen und reaktiv veränderten Lymphknoten des
Kaninchens mit TCPC – HSA
Um dem Konzept des „sentinel lymph node“ näher zu kommen, wurden weitere Versuche mit TCPC-HSA bei Chinchilla-Kaninchen durchgeführt. Hier wurde drei Tage vor
Versuchsbeginn eine Stimulation drainierender Lymphknoten durch intrakutane Injektionen von 0,2 ml Freund’schem Adjuvans 5 % beidseits am Fußrücken der Versuchs-
tiere vorgenommen. Am Versuchstag selbst wurde die intrakutane Injektion durch Applikation von 0,1 ml TCPC-HSA in den Fußrücken beidseits wiederholt. Wiederum
wurde das Farbstoffkonjugat durch das D-Light aktiviert. Bereits eine Stunde nach der
intrakutanen Applikation zeigte sich ein Aufsteigen des Farbstoffkonjugates vom Fußrücken bis in den Bereich des Fossa poplitea. Nach kurzer Präparation fand sich unter
fluoreszenzoptischer Betrachtung ein deutlicher, TCPC-HSA aufnehmender und durch
Freund’sches Adjuvans reaktiv vergrößerter Lymphknoten in der Fossa poplitea der
Versuchstiere. Nach einer weiteren Stunde wurde das Abdomen eröffnet und die Darmschlingen beiseite geschoben, um die illiakalen und paraaortalen sowie parakavalen
Lymphwege und Lymphknoten darzustellen. Auch hier konnte eine sehr gute Darstellung der Lymphbahnen und der reaktiv veränderten Lymphknoten unter Aktivierung
von TCPC-HSA mit dem D-Light erzielt werden.
A
79
B
C
Abb. 4: Darstellung eines durch Freund’sches Adjuvans reaktiv veränderten Lymphknotens an der Fossa poplitea des Kaninchens.
80
5.4
Die Darstellung von Lymphbahnen und Lymphknoten mit Gd-HSA
Nachdem Sinn auch eine kovalente Konjugierung des MR-Kontrasmittels Gadolinium
an humanem Serumalbumin in einem 1:1 molaren Verhältnis gelang, sollte die Frage
der kernspintomographischen Darstellung von Lymphbahnen und des SLN untersucht
werden.
Drei Kaninchen wurden mit intrakutanen Injektionen von 0,2 ml Freund’schem Adju-
vans in beide Hinterpfoten vorbehandelt, um so eine Vergrößerung der sonst sehr klei-
nen Lymphknoten zu erreichen. Am eigentlichen Versuchstag selbst erfolgte dann eine
intrakutane Injektion von 0,2 ml Gd-HSA in die rechte Hinterpfote, die linke Hinter-
pfote diente als Kontrollgruppe und wurde ohne Kontrastmittel kernspintomographisch
untersucht.
In einer fettgesättigten Gradietenechosequenz (20 msec Echo-time [TE], 530 msec Re-
peat-time [TR], 2mm Schichtdicke) wurden die Tiere kernspintomographisch (MR-
Edge; 1,5 T Picker Unit, USA) untersucht. Bereits eine Stunde nach Kontrastmittelgabe
zeigte sich im Vergleich zur Kontrollseite eine sehr gute Kontrastierung des poplitealen
Lymphknotens mit ebenfalls vorhandener Kontrastierung der dazugehörigen
Lymphbahn. Zwei Stunden später waren dann auch die illeakalen sowie paraaortalen
und parakavalen Lymphknoten erkennbar.
Fiducial
A
B
81
LK der Fossa poplitea
LK der Fossa poplitea
C
Abb. 5: Darstellung eines reaktiv veränderten Lymphknotens (A) sowie drainierender
Lymphwege (C) beim Kaninchen mit Gd-HSA; (B) entspricht der Kontrollseite ohne
Gd-HSA
82
5.5
Diskussion
Noch Mitte der 50er Jahre erforderte eine Lymphangiographie eine operative Freilegung
eines oberflächlichen Lymphgefäßes, welches zuvor nach subkutaner Injektion von Patentblau, z. B. in der ersten Interdigitalfalte, dargestellt wurde (1). In dieses operativ
freigelegte Lymphgefäß wurde dann ein öliges, jodhaltiges Kontrastmittel langsam ein-
gespritzt. Dargestellt werden konnten so die im Abstromgebiet liegenden Lymphbahnen
und Lymphknoten, wie z. B. die inguinalen Stationen, die Gruppen der Illiaca commu-
nis und Illiaca externa, die paraaortalen und paracavalen Lymphstationen und der Ductus thoracicus.
Durch die Entwicklung des Sentinel-Lymph-Node-Konzeptes (SLN) hat das Untersu-
chungsverfahren der Lymphwegediagnostik eine Renaissance erhalten (9). Hierbei wird
vor allem mit 99Tc markiertes kolloidales Serumalbumin intradermal oder peritumoral
injiziert, so daß wenige Minuten bis zu einigen Stunden danach Lymphabflußwege und
vor allem Wächterlymphknoten (SLN) dargestellt werden können. Die intraoperative
Detektion eines Lymphknotens wird dann unter Zuhilfenahme einer speziellen Gammasonde teilweise aber auch durch den intraoperativen Einsatz von Patentblau ermöglicht.
Mit Hilfe dieser Methode lassen sich über 95 % der SNL (10) erkennen. Da sich auch
schon bei kleinen Tumorvolumina immer wieder Mikrometastasen in den drainierenden
Lymphknoten finden, erscheint dieses Verfahren nicht nur von diagnostischer Bedeutung sondern auch von chirurgischem Interesse.
In dem von uns vorgestellten Konzept der Darstellung lymphatischen Gewebes wurde
zunächst eine fluoreszenzoptische Darstellung der Lymphbahnen und Lymphknoten mit
TCPC/TCPP-HSA durchgeführt. TCPC und TCPP sind stark leuchtende hellrote Fluoreszenzfarbstoffe, welche im Rotlichtbereich erkannt werden. In den Tierversuchen
konnten die drainierenden Lymphbahnen und die veränderten Lymphknoten im Sinne
des SLN mit TCPC/TCPP-HSA sehr gut dargestellt werden. Albumin, welches intra-
kutan appliziert wurde, blieb eindeutig auf das lymphatische System beschränkt. Auch
wenn Angaben über die Abflußgeschwindigkeiten von TCPC-HSA aus den bisherigen
Daten noch nicht erhoben werden können, so imponiert der eigentliche Vorteil der fluo-
83
reszenzoptischen Darstellung der Lymphabstrombahnen darin, daß seine Wege erst
durch Aktivierung des Farbstoffes sichtbar werden, ohne daß eine Kontamination des
OP-Gebietes durch einen immer sichtbaren Farbstoff, wie z. B. dem Patentblau, vorliegt. Wie selektiv, wie spezifisch und wie gut das „lymphatic mapping“ mit TCPC/
TCPP-HSA wirklich ist, kann erst in klinischen Studien überprüft werden. Allerdings
erfordert dies eine dem Arzneimittelgesetz entsprechende Phase-I/II-Zulassungsstudie.
Im Gegensatz zu der direkten Darstellung des lymphatischen Gewebes mit TCPC- oder
TCPP-HSA erlaubt die Lymphdiagnostik mit Gd-HSA eine präoperative Lokalisation
von Lymphbahnen und Lymphknoten im Kernspintomogramm. Erstaunlich gut konnten
diese Strukturen in den Tierversuchen in hochauflösenden und Fettgewebe supprimierenden MR-Sequenzen dargestellt werden. Da uns ein Tumormodell mit lymphogener
Metastasierung bislang nicht bekannt ist, wurde eine Aktivierung von im Abstromgebiet
liegenden Lymphknoten mit Freund’schem Adjuvans vorgenommen und dadurch das
Konzept des SLN imitiert. Somit stünde für die Lymphdiagnostik ein MR-Kontrast-
mittel zur Verfügung, welches in den bisherigen tierexperimentellen Untersuchungen
eine hohe Auflösung der entsprechenden anatomischen Strukturen aufzeigte. Die Ver-
wendung von 3D-Datensätzen und der Einsatz von Navigationsverfahren erscheinen als
geeignete Methoden mit Hilfe des MR-Kontrastmittels Gd-HSA Lymphbahnen und
SLN intraoperativ gezielt aufzusuchen. Allerdings bedarf es auch für Gd-HSA einer Zulassungsstudie entsprechend dem Arzneimittelgesetz. Insgesamt aber kann vermutet
werden, daß besonders tumorbefallene drainierende Lymphknoten durch die endozytotische Aufnahme der Albuminkonjugate TCPC/TCPP-HSA und/oder GD-HSA und deren
langen Verweildauer zur Darstellung gebracht werden (11).
84
Kapitel 6
Perspektiven
6.1
Tumordiagnostik mit Gadolinium-HSA
Kooperation mit: Dr. Th. Egelhof, Neuroradiologische Abteilung, Universitätsklinikum Essen, Dr.
F. Kiessling, Abteilung für Tumordiagnostik und Therapie, Deutsches Krebsforschungszentrum
Heidelberg und Frau PD Dr. S. Heiland, Neuroradiologische Abteilung, Universitätsklinikum
Heidelberg
Berichte über die Konjugierung des MR-Kontrastmittels Gadolinium an humanes
Serumalbumin (Gd-HSA) liegen bereits sei Ende der 80er Jahre vor (1,2). Ähnlich wie
bei den Albuminbeladungen mit Methotrexat wurde, wohl um eine Erhöhung der Kon-
trastdarstellung zu erreichen 18, 19, 24 oder 30 Moleküle Gadolinium pro Albuminmo-
lekül geladen ( 1, 2, 3, 4, 5). Dies aber führt unweigerlich zu einer uns schon bekannten
Alteration von Albumin, so daß allergische Reaktionen und deutlich verkürzte Zirkulationszeiten eine Anwendung am Menschen nicht als möglich erscheinen lassen (6).
Bislang wird Gadolinium-HSA vor allem zur Darstellung der Mikrozirkulation oder zur
Perfusionsmessung verwendet (7, 8, 9).
Durch die von Sinn, DKFZ, entwickelte niedrige Beladungsrate von ca. 1 : 1 oder 3 : 1
molarem Gd-HSA war nun aber eine Anwendung auch zur Tumordiagnostik möglich.
Sowohl Egelhoff wie auch Kiesling gelangen lang anhaltende Tumordarstellungen mit
dem niedermolar beladenen Gd-HSA bei malignen Rattengliomen wie auch bei Xe-
notransplantaten an Nacktmäusen (10, 11). Allergische Reaktionen oder ein Abfangen
von Gd-HSA im retikuloendothelialen System oder der Leber wurden nicht beobachtet.
Nicht immer ist eine diagnostische Differenzierung zwischen benignen und malignen
Tumoren trotz Verwendung moderner bildgebender Verfahren möglich. Aber gerade
der Hinweis, daß durch makromolekulare Kontrastmittel, welche von Tumorzellen via
Endozytose aufgenommen werden, eine Unterscheidung von benignen und malignen
Tumoren, wie z. B. dem Fibroadenom der Brust versus maligner Mammatumoren, läßt
an eine unmittelbare klinische Anwendung denken (6, 12). Monokristalline Eisenpartikel (MIONS) werden ebenfalls von Tumorzellen phagozytiert (13, 14) und können da-
85
her auch zur Tumordiagnostik herangezogen werden. Im Gegensatz zu nieder belade-
nem Gd-HSA werden MIONS jedoch sehr schnell in der Leber abgefangen, so daß, auf
Grund der dadurch bedingten deutlich verkürzten Zirkulationszeit, für periphere Malignome eine nur schwache Kontrastierung möglich ist.
A
B
A
B
Abb. 1: Malignes Rattengliom ohne Gd-HSA (A) und 24 h nach intravenöser Injektion von GdHSA (B).
6.2
Die Behandlung der rheumatoiden Arthritis mit Methotrexat-HSA
Auch bei der rheumatoiden Arthritis wird Methotrexat therapeutisch eingesetzt. Im Gegensatz zu seiner onkologischen Anwendung als Folsäureantagonist wirkt Methotrexat
hier eher immunmodulatorisch durch eine Verschiebung von entzündungsfördernden zu
entzündungshemmenden Zytokinen. Ein genauer Wirkmechanismus ist jedoch nicht
bekannt (15, 16, 17).
Bei einem Drittel der Patienten mit rheumatoider Arthritis können unter wöchentlichen
Anwendungen von 7,5 bis 20 mg Methotrexat Remissionen beobachtet werden. Jedoch
treten, wohl wegen der Langzeitbehandlung, typische Methotrexatnebenwirkungen, wie
z.B. Stomatitiden, gastrointestinale Symptome, Transaminasenerhöhungen oder Leukound Thrombozytopenien auf (18).
Erstmals wurde das von Sinn entwickelte 1 : 1 molar beladene MTX-HSA durch Wunder und Fiehn im Arthritis-Tiermodell untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, daß
auch Synoviozyten in der Lage sind, Methotrexat-Albumin aufzunehmen. Im Vergleich
86
zu freiem Methrotrexat war bei dem Konjugat nur ein Fünftel der Dosis notwendig, den
Entzündungsprozess im Tiermodell günstig zu beeinflussen (19).
In Kenntnis der deutlich reduzierten systemischen Toxizität von MTX-HSA erscheint
eine klinische Prüfung bei Patienten mit rheumatoider Arthritis vor allem in Hinblick
auf die durch die Konjugierung deutlich verminderte systemische Toxizität als sehr
vielversprechend.
87
Kapitel 7
7.1
Zusammenfassung
In der vorliegenden Arbeit wurde die Eigenschaft von Albumin als Carrier für verschiedene diagnostische und therapeutische Vorhaben aufgezeigt.
7.1.1 Laserfluoreszenzdiagnostik mit 5-Aminofluorescein - Albumin (AFLc-HSA)
In tierexperimentellen und präklinischen Untersuchungen wurde der Fluoreszenzfarb-
stoff AFLc-HSA vorgestellt, welcher in der intraoperativen Tumordiagnostik bei malig-
nen Gehirntumoren im Rahmen einer Phase I/II-Studie untersucht werden soll. Die hohe
Lichtstärke von Aminofluorescein, sein geringes Ausbleichen und seine durch die
Konjugierung an Albumin bedingte lange intrazelluläre Verweildauer im Tumor bieten
neue Ansätze in der intraoperativen Tumordiagnostik durch Laserfluoreszenz. Eine für
maligne Gehirntumoren vorgesehene Phase-I/II-Studie wurde im April d. J. von der
hiesigen Ethikkommission genehmigt und kann nun nach Erteilung der Prüfnummer
durch das Bundesministerium für Arzneimittel begonnen werden. Alle technischen
Voraussetzungen hierfür sind erfolgt. Der Vergleich der laserinduzierten Fluoreszenz
durch AFLc-HSA mit Systemen der Neuronavigation, dem intraoperativen MR-Open
und dem intraoperativen Ultraschall stellt für die Neurochirurgische Universitätsklinik
Heidelberg einen weiteren Schwerpunkt in der Bedeutung der intraoperativen Bildgebung und Radikalitätskontrolle dar.
7.1.2 Albuminvermittelte Chemotherapie
Aminopterin-Albumin (AMPT-HSA)
Tierexperimentell wurde das Antifolat Aminopterin gegenüber dem Albuminkonjugat
AMPT-HSA in seiner Pharmakokinetik wie auch Verträglichkeit und Wirksamkeit am
Walker-256-Karzinom der Ratte untersucht. Unzweifelhaft bewirkt die Konjugierung
von Aminopterin an Albumin eine deutliche Reduzierung der systemischen Toxizität
des Antifolates trotz der Tatsache, daß AMPT-HSA vielfach länger in Zirkulation
88
bleibt. Dies ist dadurch zu verstehen, daß Albumin oder Albuminkonjugate physiolo-
gisch proliferierendes Gewebe nicht in der gleichen Quantität wie freies und niedermolekulares AMPT erreichen und die eigentliche Wirksubstanz erst nach der lysosomalen
Abspaltung in der Tumorzelle freigesetzt wird. Neben Methotrexat-Albumin (MTX-
HSA) steht nun mit AMPT-HSA ein weiteres hoch wirksames Antifolatkonjugat zur
Verfügung, welches in Xenographtmodellen aber auch in klinischen Studien weiter untersucht werden kann.
Methotrexat-Albumin (MTX-HSA)
Seit Februar 2000 befindet sich MTX-HSA in einer vergleichenden Phase-II-Studie bei
Patienten mit primären und sekundären Glioblastomrezidiven. MTX-HSA wird ambulant wöchentlich bis zweiwöchentlich in einer Dosierung von 50 mg/m2 intravenös als
Kurzinfusion appliziert und zeigt eine durch die Albuminkonjugierung bedingte deut-
lich reduzierte systemische Toxizität im Vergleich zu freiem MTX. Bislang ist jedoch
keine Überlegenheit in der Wirksamkeit gegenüber den Nitrosoharnstoffen BCNU und
CCNU zu erkennen, auch wenn positive Effekte unter der Behandlung von MTX-HSA
gesehen wurden. Überraschend ist jedoch die hohe Ansprechrate der Glioblastomrezidive bei einem Wechsel der Studienmedikation bei insgesamt 5/6 Patienten, so daß über-
legt werden muß, ob die klinische Prüfung mit MTX-HSA als Kombinationsbehandlung
mit z. B. Nitrosoharnstoffen oder Temozolomid fortgeführt werden soll.
7.1.3 Albuminvermittelte Sentinel-Lymph-Node-Diagnostik
Entsprechend der Sentinel-Lymph-Node-(SNL)-Diagnostik, bei der vor allem kolloidales 99mTechnetium-Albumin verwendet wird, zeigen die Albuminkonjugate Tetra(4-
Carboxy-Phenyl-Chlorin- (TCPC) oder Tetra(4-Carboxy-Phenyl-Porphyrin TCPP-HSA
eindrucksvoll die drainierenden Lymphwege und deren Lymphknoten unter Fluoreszenzaktivierung. Eine unter Fluoreszenzbedingungen durchgeführte Lymphwegedissektion
mit TCPP- und TCPC-HSA erlaubt eine exakte Zuordnung und anatomische Differenzierung der Lymphstrukturen, ohne daß das Operationsgebiet, wie z. B. durch Patentblau, permanent kontaminiert wird. Eine SLN-Diagnostik unter Zuhilfenahme dieser
Fluoreszenzkonjugate bei Mammakarzinomen, malignen Melanomen oder Kopf - Hals -
89
Tumoren, erscheint vielversprechend. Auch insofern, als daß durch eine ebenfalls nie-
dermolare Konjugierung von Gadolinium an Albumin eine präoperative Lymphdiagnostik kernspintomographisch als möglich erscheint.
7.2
Schlußfolgerung
Mit Albumin existiert ein vielfach verwendbarer und biologisch verfügbarer Carrier, der
unterschiedliche Wirksubstanzen gezielt via Endozytose in malignes oder chronisch
entzündlich verändertes Gewebe einschleust. Eine grundsätzliche Voraussetzung für die
kovalente Albuminkonjugierung ist jedoch eine schonende, d.h. 1 : 1 molare Beladung,
so daß das Protein weder in seiner Tertiärstruktur noch in seiner biologischen Funktion
oder Integrität verändert wird. Dies hätte nämlich deutlich verringerte Zirkulationszei-
ten, ein Abfangen im retikuloendothelialen System oder der Leber und, bei wiederholten Applikationen, allergische Reaktionen zur Folge. Zwischenzeitlich befinden sich
bereits zwei Albuminkonjugate, nämlich MTX-HSA und AFLc-HSA, in klinischer Prüfung. Und trotz vielfacher und oft wiederholter Anwendung ist für MTX-HSA in den
multizentrischen Phase - I/II - Studien bei über 100 Patienten bislang keine einzige allergische Reaktion beobachtet worden.
Gerade die niedermolar beladenen Albuminkonjugate erreichen in malignen oder chro-
nisch entzündlich veränderten Geweben hohe und lang anhaltende Wirkstoffkonzentrationen. Zudem wird durch die kovalente Konjugierung an Albumin die sonst vor allem
bei niedermolekularen Zytostatika häufig beobachtete systemische Toxizität deutlich
reduziert. Insgesamt erscheint das Konzept der niedermolaren kovalenten Albumin-
konjugierung als vielversprechend für ganz unterschiedliche diagnostoische und therapeutische Fragestellungen.
90
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Kapitel 1
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12. Su MY, Wang Z, Carpenter PM, Lao X, Muhler A, Nalciouglu O. Characterization
of N-ethyl-N-nitrosourea-induced malignant and benign breast tumors in rats by
using three MR contrast agents. J Magn Reson Imaging 1999; 9: 177-186.
13. Zimmer C, Weissleder R, Poss K, Bogdanova A, Wright SCJ, Enochs WS: MR
imaging of phagocytosis in experimental gliomas. Radiology 1995;197: 533-538.
14. Egelhof T, Delbeck N, Hartmann M, Roth SU, Elste V, Heiland S, Sartor K. Can
superparamagnetic contrast media improve MRI-tomographic images of experimental gliomas? Radiologe 1998; 38: 943-947.
15. Bannwarth B, Labat L, Moride Y, Schaeverbeke T. Methotrexate in rheumatoid
arthirtis. An update. Drugs 1994; 47: 25-50.
16. Kremer JM. The mechanism of action of methotrexate in rheumatoid arthirtis: the
search continues. J Rheumatol 1994; 21: 1-5.
17. Cronstein BN. The mechanism of action of methotrexate. Rheum Dis Clin North
Am 1997; 23: 739-755.
18. Schnabel A, Gross WL. Low-dose methotrexate in rheumatic dieseases-efficacy,
side effects, and risk factors for side effects. Semin Arthritis Rheum 1994; 23: 310327.
19. Wunder A. Habilitationsschrift der Ruprechts-Karls-Universität Heidelberg, Medizinische Fakultät Klinikum Mannheim, 2000.
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Danksagung
Zum Schluß dieser Arbeit möchte ich all denen danken, die mir mit ihren Ideen oder mit
Rat und Tat zur Seite standen.
Allen voran danke ich Herrn Professor Dr. Kunze, meinem akademischen Lehrer, der es
mir ermöglicht hat, diese Arbeit zu verwirklichen.
Die Idee, Resttumorgewebe intraoperativ anzufärben, stammte von Herrn Professor Dr.
Albert, jetzt Paracelsus-Klinik Osnabrück. Durch ihn kam der Kontakt zu Herrn Dr.
Sinn, DKFZ, zu Stande, der das Konzept der niedermolaren Albuminkonjugierung entwickelte. In zahlreichen Stunden wurden verschiedene Projekte besprochen und durchgeführt. Nun darf Herr Dr. Sinn sich stolz Vater zweier vom DKFZ initiierter PhaseI/II-Studien nennen. Ebenfalls danke ich seinen Mitarbeitern, Herrn Schrenk, Frau Bauder-Wüst wie auch den Herren Dr. Haase und Dr. Wunder, für ihre wertvolle Zusammenarbeit.
Ohne die großzügige Unterstützung von Herrn Dr. Zillmann, Leiter des Zentralen Tierlabores des DKFZ, und seinen Mitarbeitern, den Herren Dähmel, Eskersky und Lehr,
wären die zahlreichen und zeitaufwendigen tierexperimentellen Untersuchungen nicht
möglich gewesen.
Auch danke ich Herrn PD Dr. Hartung, Onkologische Abteilung der Universitätsklinik
Rostock, sowie Frau Dr. Frei, DKFZ, für ihre wertvollen Anregungen im Hinblick auf
die albuminvermittelte Chemotherapie.
Danken möchte ich auch allen meinen Kollegen aus der Neurochirurgischen Universitätsklinik, die mir vor allem bei der Durchführung der klinischen Studien zur Seite standen.
Der Dank gilt besonders meiner Familie, meiner Frau für das Schreiben und meinem
Schwiegervater, Herrn Dr. Inhoffen, für die aufmerksame Durchsicht des Manuskriptes.
Ganz im Sinne von „euntes eunt et plorant...“ gilt mein aufrichtiger Dank den Patienten
und ihren Angehörigen. Denn auch sie tragen in Geduld und Hoffnung zu dem medizinischen Fortschritt, sei es bei individuellen Heilversuchen oder klinischen Phase-I/IIStudien, einen großen Anteil bei.
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