„Molekulare Biophysik“ NMR-Spektroskopie (Teil 1)
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„Molekulare Biophysik“ NMR-Spektroskopie (Teil 1) 2/93 Das Vorlesungs-Programm Vorlesung “Molekulare Biophysik”: NMR-Spektroskopie Tag 1 Tag 2 Theoretische Grundlagen der Theoretische Grundlagen der NMR-Spektroskopie (1) NMR-Spektroskopie (2) Tag 3 Mehrdimensionale NMRSpektroskopie Tag 4 NMR-Spektroskopie an Peptiden Tag 5 Tag 6 NMR-Spektroskopie an Proteinen NMR-Spektroskopie an Proteinen (1) (2) Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP Allgemeine Aspekte der NMR-Spektroskopie Allgemeine Aspekte der NMR-Spektroskopie 4/93 Nuclear Magnetic Resonance NMR-Spektroskopie beobachtet die Resonanz von Atomkernspins mit elektromagnetischer Strahlung. Der Effekt ist nur in einem starken Magnetfeld beobachtbar. Jeder Atomkern wird getrennt beobachtet und eine Wechselwirkung zwischen Atomkernen kann detektiert werden. NMR entspricht daher sehr gut der Sicht eines Chemikers, der Moleküle als Atome und Bindungen betrachtet. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP Allgemeine Aspekte der NMR-Spektroskopie NMR ist extrem wichtig bei der Synthese-Analytik. 12 11 10 9 8 7 6 5 4 Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie 3 2 ppm Peter Schmieder FMP 5/93 Allgemeine Aspekte der NMR-Spektroskopie 6/93 Strukturbestimmung von Naturstoffen NMR ist sehr hilfreich bei der Bestimmung der Konstitution von Naturstoffen. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP Allgemeine Aspekte der NMR-Spektroskopie Bestimmung der 3D Struktur von Proteinen Mit NMR kann die Raumstruktur von Proteinen bestimmt werden, in Lösung und im Festkörper. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 7/93 Allgemeine Aspekte der NMR-Spektroskopie Detektion von Molekül-Molekül-Wechselwirkungen NMR kann für die Detektion von Protein-Ligand Wechselwirkungen genutzt werden. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 8/93 Allgemeine Aspekte der NMR-Spektroskopie Detektion von Dynamik in Biomolekülen Mit der NMRSpektroskopie kann die interne Beweglichkeit von Proteinen bestimmt werden. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 9/93 Allgemeine Aspekte der NMR-Spektroskopie Detektion von Vorgängen in lebenden Zellen Mit der in-cell-NMRSpektroskopie kann man Veränderungen von Proteinen in Zellen beobachten. 15 N N 15 Ser H 1 Serine H 1 15 N N 15 1 H pSer H 1 phospho-Serine Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 10/93 Allgemeine Aspekte der NMR-Spektroskopie Bücher James Keeler gibt es auf: z.B. http://www.youtube.com/watch?v=nM7jQFhrvR0 Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 11/93 Grundlagen der NMR-Spektroskopie Grundlagen der NMR-Spektroskopie 13/93 Das Konzept des „Spins“ wurde von Wissenschaftlern eingeführt um bestimmte experimentelle Beobachtungen zu erklären. Als quantenmechanisches Konzept ist es außer im Rahmen von mathematischen Gleichungen nicht vollständig zu verstehen. Man kann aber im Rahmen von physikalischen und geometrischen Modellen gut damit umgehen, solange man sich der Limitierungen dieser Modelle bewusst ist. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP Grundlagen der NMR-Spektroskopie 14/93 Grundlage für die NMR-Spektroskopie ist der Kernspin, den man sich als Mischung von Kreisel und Stabmagnet vorstellen kann. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP Grundlagen der NMR-Spektroskopie Ein Kreisel hat ein Drehmoment dessen Achse im Raum stabil ist. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 15/93 Grundlagen der NMR-Spektroskopie 16/93 Ein Magnet richtet sich in einem statischen Magnetfeld aus, diese Ausrichtung wird durch die Kreiseleigenschaft verhindert, die Kerne beginnen mit einer Präzesionsbewegung. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP Grundlagen der NMR-Spektroskopie Der Kernspin hat aber, als quantenmechanische Größe, einige Eigenschaften, die vom klassischen Bild abweichen. Er wird charakterisiert durch ein Kernspindrehmoment I, dessen Betrag I= (ћ2 [I(I+1)]) ist, wobei I die Kernspinquantenzahl ist. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 17/93 Grundlagen der NMR-Spektroskopie 18/93 Es kann nur der Betrag I und die z-Komponente Iz des Kernspins gleichzeitig angegeben werden. Die z-Komponente ist parallel zum äußeren Magnetfeld B0 und gegeben durch Iz = ћ m wobei m die magnetische Quantenzahl ist m = (-I, -I+1, .... ,I-1, I) Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP Grundlagen der NMR-Spektroskopie Für die hochauflösende NMR sind fast ausschließlich Kerne mit einem Kernspin von I = 1/2 interessant. I= √3 ћ/2 Iz = ћ/2 Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 19/93 Grundlagen der NMR-Spektroskopie Der Zustand mit m = +1/2 wird als -Zustand, der Zustand mit m = -1/2 als den -Zustand bezeichnet. Die Bilder oben sind graphische Repräsentationen, keine physikalischen Darstellungen. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 20/93 Grundlagen der NMR-Spektroskopie Verbunden mit dem Kernspindrehmoment ist ein magnetisches Moment, das sich aus dem Drehmoment über das gyromagnetische Verhältnis ergibt: =I z = Iz = ћ m Je größer das gyromagnetische Verhältnis, desto größer das magnetische Moment. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 21/93 Grundlagen der NMR-Spektroskopie In einem externen Magnetfeld ergibt sich die Energie der Spinzustände als das Skalarprodukt von magnetischem Moment und externem Magnetfeld B. E=-B Em =-z B0= - Iz B0= - ћ mB0 Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 22/93 Grundlagen der NMR-Spektroskopie Es ergeben sich 2I+1 (2 für I = 1/2) unterschiedliche Energieniveaus, die hier geltende Auswahlregel ist: m = 1 E1/2 =-z B0= - Iz B0= - ћ 1/2B0 E-1/2 =-z B0= - Iz B0= ћ 1/2B0 } E = ћ B0 Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 23/93 Grundlagen der NMR-Spektroskopie 24/93 Der Energieunterschied entspricht einer Frequenz E = ћ B0 elektromagnetischer Strahlung. B=0 B = B0 E = h 0 = B0 / 2 0 = 2 0 = B0 Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 25/93 Grundlagen der NMR-Spektroskopie Das ist auch genau die B0 [Tesla] 0 [MHz] Rotationsfrequenz der 1.4 60 5.9 250 9.4 400 14.1 600 21.2 900 Spins. Sie ist somit dem äußeren Magnetfeld direkt proportional. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 26/93 Grundlagen der NMR-Spektroskopie Eigenschaften der wichtigsten NMR-Kerne Kern I natürliche Häufigkeit gyromagnetisches Verhältnis 1H 1/2 99.98 % 26.75 12C 0 98.89 % 0 13C 1/2 1.11 % 6.73 14N 1 99.63 % 1.93 15N 1/2 0.37 % -2.71 19F 1/2 100 % 25.18 31P 1/2 100 % 10.84 113Cd 1/2 12.26 % -5.96 Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP Grundlagen der NMR-Spektroskopie Wir kennen jetzt die Eigenschaften einzelner Kerne, messen werden wir aber immer Proben mit sehr vielen Kernen. Was im Magneten passiert wollen wir uns jetzt bis hin zur Aufnahme eines 1DSpektrums anschauen. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 27/93 Grundlagen der NMR-Spektroskopie Ohne externes Magnetfeld sind die Spins in alle Raumrichtungen gleichmäßig verteilt. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 28/93 Grundlagen der NMR-Spektroskopie Wenn ein Magnetfeld eingeschaltet wird, ändert sich das nicht sofort, aber die thermische Bewegung erzeugt eine Orientierung mit Vorzugsrichtung. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 29/93 Grundlagen der NMR-Spektroskopie Es baut sich eine Magnetisierung... Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 30/93 Grundlagen der NMR-Spektroskopie 31/93 …entlang des Magnetfeldes auf, man erhält eine Bolzmannverteilung. In x,y-Richtung ist dagegen alles gleich verteilt und kein magnetisches Moment vorhanden. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP Grundlagen der NMR-Spektroskopie Aus dem Energieunterschied ergibt sich auch die Differenz in der Besetzung der Energieniveaus, es liegt eine Boltzmannverteilung vor, die man mit einem Energieniveauschema darstellen kann. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 32/93 Grundlagen der NMR-Spektroskopie N/N = exp(-E/kT) = exp(- h B0 / 2kT) Bei 600 MHz Messfrequenz ergibt sich N/N = 0.999904 Dieser kleine Unterschied ist der Grund für die Unempfindlichkeit der NMR-Spektroskopie. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 33/93 CW vs. FT 35/93 CW vs. FT Nun haben wir die Probe im Magneten und wollen die Messung durchführen. Dazu gibt es zwei grundsätzliche Methoden, die Messung durchzuführen: CW-Technik (continous wave) FT-Technik (fourier transform) Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 36/93 CW vs. FT Die CW-Technik ist die Methode, die man von anderen Spektroskopie-Arten kennt (z.B. UV), sie wird aber heute kaum mehr verwendet, da das Signal-zu-Rausch-Verhältnis ein Problem ist. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 37/93 CW vs. FT Moderne NMR-Experimente verwenden alle die FT- NMR-Technik, die auch als „gepulste NMR“ bezeichnet wird und bei der sich das Signal-zu-Rausch-Verhältnis leichter verbessern lässt..... FT Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 38/93 CW vs. FT .... durch Wiederholung der Messung und Addition der aufgenommenen Signale. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 39/93 CW vs. FT Wir führen also in Wirklichkeit unsere Messung mehrmals durch, man spricht von dabei immer noch von eine Anzahl von „scans“. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP Das rotierende Koordinatensystem ( Wie funktioniert ein Puls ? ) Das rotierende Koordinatensystem 41/93 Die Experimente werden heute fast ausschließlich mit der FT-Methode durchgeführt. Während des NMR-Experiments werden Radiowellen (RF) auf die Probe eingestrahlt, die von der Probe im Falle der richtigen Frequenz aufgenommen werden. Um dieses „Resonanzphänomen“ gut verstehen zu können, bedient man sich des „rotierenden Koordinatensystems“. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP Das rotierende Koordinatensystem Ausgangspunkt ist unsere Bolzmannverteilung von Spins im Magnetfeld. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 42/93 Das rotierende Koordinatensystem Alle Kerne vollführen immer noch ihre Rotationsbewegung, Wir wechseln jetzt in ein rotierendes Koordinatensystem. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 43/93 Das rotierende Koordinatensystem 44/93 Die Idee des rotierenden Koordinatensystems ist einleuchtend, bedenkt man dass wir uns auf der Erde auch auf einem rotierenden Objekt Befinden. Der Beobachter rotiert mit einer Frequenz , der Spin mit einer Frequenz 0. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP Das rotierende Koordinatensystem Die Bewegung des Spins wird durch das Magnetfeld Hervorgerufen: 0 = 2 0 = B0 Ist die Bewegung langsamer, erscheint dem Beobachter das Magnetfeld schwächer: 0 - = = (B0 - /) Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 45/93 Das rotierende Koordinatensystem Innerhalb dieses Bildes sind dann auch negative Frequenzen möglich, d.h. Rotationen in die entgegengesetzte Richtung. Keine Bewegung bedeutet kein Magnetfeld !! Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 46/93 47/93 Das rotierende Koordinatensystem z x y Die Anregung erfolgt durch das Einstrahlen von Radiowellen. Die sind linear polarisiert und enthalten eine elektrische und eine magnetische Komponente, letztere interessiert uns hier. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 48/93 Das rotierende Koordinatensystem normale Darstellung p Das Einstrahlen funktioniert über die Messspule, die Radiofrequenz wird (in der modernen Form der NMRSpektroskopie) in Form eines kurzen „Pulses“ in der x,y-Ebene ins System eingebracht. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP Das rotierende Koordinatensystem Die linear polarisierte Oszillation wird als eine Überlagerung von zwei in umgekehrter Richtung wandernde Komponenten betrachtet. Eine Komponente ist sehr schnell und kann ignoriert werden.... Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 49/93 Das rotierende Koordinatensystem ....während die andere im rotierenden Koordinatensystem fast statisch erscheint, sie ist „on resonance“ oder zumindest nahe an der Resonanzfrequenz, man spricht vom B1-Feld. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 50/93 Das rotierende Koordinatensystem Im rotierenden Koordinatensystem sind somit das Hauptfeld und das RF-Feld von θ ähnlicher Größe, es resultiert ein „effektives Feld“, Beff. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 51/93 Das rotierende Koordinatensystem Beff = (B1)2 + (B0 – /)2 2 2 BeffBeff =(B1 )(B (1)B20 + / ) 2 θ (B0 – /) B1 tan tan = = ( B1 0 / ) B1 B BB11 BB eff eff Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 52/93 Das rotierende Koordinatensystem Die Präzession der Magnetisierung erfolgt nun natürlich um das neue „effektive Feld“, Beff. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 53/93 Das rotierende Koordinatensystem 54/93 Ist der RF-Puls „on resonance“ verschwindet das Hauptfeld und die Magnetisierung beginnt eine Präzession um das B1-Feld. Der Winkel wird von der Länge und Stärke des Pulses bestimmt Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP Pulse und Vektor-Model 56/93 Pulse und Vektormodel Die Pulse werden durch ein starkes B1-Feld erzeugt und decken so eine große Frequenzregion ab Frequenz 600 MHz 90° Puls = 10 sec θ B1 = 25 kHz 3000 Hz 10 ppm 0 Hz 5 ppm = 3000 tan = 0.12 = 6.8° on-resonance =0 tan = 0 =0 Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie -3000 Hz 0 ppm = -3000 tan = -0.12 = -6.8° Peter Schmieder FMP 57/93 Pulse und Vektormodel Jeder einzelne Spin wird um den gleichen Winkel gedreht und somit auch das in der Summe resultierende magnetische Moment Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 58/93 Pulse und Vektormodel Nach einem 90°-Puls resultiert ein magnetisches Moment in der x,y-Ebene, es liegt keine Z-Magnetisierung mehr vor. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 59/93 Pulse und Vektormodel Strahlt man die Radiowellen noch länger ein, dann kommt man über den 90° Winkel hinaus und erreicht irgendwann die 180° Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 60/93 Pulse und Vektormodel Diese beiden Winkel sind von besonderer Bedeutung: der 90° Puls und der 180° Puls. Weil die Länge so wichtig ist, gibt man Pulswinkel in sec an 90° Puls (/2) aus x: Der Vektor dreht sich um die x-Achse nach (-y) Ein typischer Wert für einen 90° Puls sind 10 sec 180° Puls () aus x: Der Vektor dreht sich um die x-Achse nach (-z) Der Wert für den 180° Puls ist dann 20 sec Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 61/93 Pulse und Vektormodel Die Richtung des B1-Feldes (die Phase des Pulses) kann im Experiment festgelegt werden und verändert dann die Wirkung des Pulses auf die Magnetisierung. z y z y B1 aus x x y B1 aus x x B1 aus y x y Kommen Puls und Magnetisierung aus der gleichen Richtung passiert nichts !! Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie B1 aus x x Peter Schmieder FMP 62/93 Pulse und Vektormodel Diese „klassische“ Betrachtung eines magnetischen Moments unter dem Einfluss von Magnetfeldern (Hauptfeld oder Pulse) wird als „Vektormodel“ bezeichnet, es wird mathematisch durch die Bloch-Gleichungen beschrieben. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP Detektion des Signals 64/93 Detektion des Signals Das FT Experiment besteht also zunächst aus einem Radiofrequenzpuls, der die Magnetisierung dreht. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 65/93 Detektion des Signals Die Drehung führt die Magnetisierung von der zRichtung in die x,y Richtung. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 66/93 Detektion des Signals Wird der Puls nach 90 ° abgeschaltet, ist wieder das statische Magnetfeld das entscheidende, die Spins führen wieder ein Präzession um dieses Feld durch, aber mit ihrer neuen Orientierung. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 67/93 Detektion des Signals Die Präzession induziert einen Strom in der Detektionsspule, das resultierende Signal wird aufgezeichnet. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 68/93 Detektion des Signals Entlang der x und y Achse ergeben sich Sinus- und Cosinus-Funktionen. Mx cos t y t sin t x t Mx = cos t exp (-t/T2) My t My = sin t exp (-t/T2) Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 69/93 Detektion des Signals Zusätzlich kehrt das System wieder in den Ausgangszustand zurück, es “relaxiert”, was durch eine Exponentialfunktion beschrieben wird: Mx,y ~ exp (-t/T2) Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 70/93 Detektion des Signals Beide Signale werden aufgezeichnet, es ergibt sich ein komplexes Signal: M = Mx + i My M = exp (it) exp (-t/T2) Dabei werden die berühmten “Euler-Gleichungen” verwendet: exp(i) = cos + i sin exp(-i) = cos - i sin Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 71/93 Detektion des Signals Mx M y Berechnung von Pulssequenzen t Mx = cos 0t exp (-t/T2) t My = sin 0t exp (-t/T2) M = Mx + i My = [cos 0t + i sin 0t ] exp (-t/T2) M = exp (i0t) exp (-t/T2) Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 72/93 Detektion des Signals Die Aufnahme beider Signale nennt man „Quadraturdetektion“, man erhält einen komplexen Datenpunkt und kann in der Mitte des Spektrums „sitzen“ Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 73/93 Detektion des Signals Zur Verarbeitung des Signals muss es in eine computergerechte Form gebracht werden, dazu wird ein Analog-Digital-Konverter (ADC) verwendet. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 74/93 Detektion des Signals Das hat aber Konsequenzen: die Punkte müssen equidistant sein (wegen der DFT) und man braucht drei Punkte pro Periode 2t Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 75/93 Detektion des Signals Also gibt es Grenzen bei den Frequenzen die digitalisiert werden können. Es gilt das die Nyquist-Frequenz fn = 1/(2t) die größte Frequenz ist, die bei einem Abstand t der Datenpunkten noch erfasst werden kann. Da wir in der Mitte sitzen und +/- fn detektieren können gilt für die spektrale Breite („spectral width“) SW = 2 * fn = 1/t Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 76/93 Detektion des Signals Das schauen wir uns noch näher an z z y 90°-x x y x 2000 Hz -500 Hz -1500 Hz y Das Spektrum nehmen wir mit SW = 6000 Hz auf (+/- 3000), t = 0 sec x also einem t = 166 sec Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 77/93 Detektion des Signals y y y x y x t = 0 sec t = 166 sec x t = 332 sec x t = 498 sec 1 Iy 0 0.2 0.5 0.3 0.1 0.4 t [msec] -1 1 Ix 0 0.2 0.1 0.4 0.3 0.5 -1 Man erkennt das die Ränder (+/- 3000 Hz) in 166 usec 180° laufen würden ! Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 78/93 Detektion des Signals 1 Iy 0.2 0 0.3 0.1 0.4 -1 0.5 t [msec] 1 Ix 0.2 0 0.3 0.1 0.4 0.5 -1 FT 3000 2000 1000 0 -1000 -2000 -3000 [Hz] 10 8.33 6.66 5 3.33 1.66 0 [ppm] Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP Die Fourier-Transformation 80/93 Fourier-Transformation Die FT ermittelt aus dem Signal von überlagerten Schwingungen welche Frequenzen enthalten sind. FT Wie funktioniert das ? Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 81/93 Fourier-Transformation Von der folgenden Schwingung soll die Frequenz ermittelt werden. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 82/93 Fourier-Transformation Dazu „raten“ wir eine Frequenz und erzeugen das dazugehörige Zeitsignal. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 83/93 Fourier-Transformation Dann werden die beiden miteinander multipliziert. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 84/93 Fourier-Transformation Schließlich wird über alle Zeitpunkte aufsummiert. Hier „passt“ die Frequenz nicht, es gibt ähnlich viele positive wie negative Punkte, das Resultat ist nahe 0 ! Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 85/93 Fourier-Transformation Hier „passt“ die Frequenz sehr gut, fast alle Punkte sind größer als null, das Resultat der Summe ist daher auch sehr groß. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 86/93 Fourier-Transformation Das machen wir nun ganz systematisch für alle möglichen Frequenzen und erhalten eine Kurve aufgetragen gegen die Frequenz, ein „Spektrum“. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 87/93 Fourier-Transformation Die Fouriertransformation ist in Gleichungen am einfachsten mit einem komplexen Signal zu erläutern Ein komplexes NMR-Signal hat - wie gesehen - die Form s(t) = exp (i0t) exp (-t/T2) Signaloszillation Signalabfall (die Frequenz) (Relaxation) Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 88/93 Fourier-Transformation Wir führen eine Fouriertransformation durch, die Summation ist eine Integration. S() =∫s(t) exp (-it) dt 0 S() =∫exp (i0t) exp (-t/T2) exp (-it) dt 0 S() = 1 (1/T2) + i( – 0) Lorentzlinie Eine komplexe Funktion besteht aus Realteil und Imaginärteil: S () = R() + i I() Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 89/93 Fourier-Transformation Im einfachsten (besten) Fall ist der Realteil “absorbtiv” und der Imaginärteil “dispersiv”: S () = A() + i D() A() = D() = (1/T2) (1/T2)2 + ( – 0)2 - ( – 0) (1/T2)2 + ( – 0)2 Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 90/93 Fourier-Transformation s(t) = exp (i0t) exp (-t/T2) Signaloszillation Signalabfall (die Frequenz) (Relaxation) Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 91/93 Fourier-Transformation FT FT Die Einhüllende ergibt die Linienform, die Oszillation die Position im Spektrum. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP 92/93 Fourier-Transformation Was ist mit konstanten Faktoren ? s(t) = A exp (i0t) exp (-t/T2) S() =∫s(t) exp (-it) dt 0 S() = ∫A exp (i0t) exp (-t/T2) exp (-it) dt 0 S() = A (1/T2) + i( – 0) Die Fouriertransformation ist eine lineare Operation, deshalb kann man Spektren integrieren. Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie Peter Schmieder FMP That‘s it Fragen: [email protected] Scripte: schmieder.fmp-berlin.info/teaching/vorlesung_mbph.htm
