Functional analysis of FAT10, a cytokine - ETH E

Diss. ETH No. 14312
Functional analysis of FAT10,
a cytokine-inducible ubiquitin-like protein
A dissertation submitted to the
SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY, ZURICH
For the degree of
DOCTOR OF NATURAL SCIENCES
Presented by
SHAHRI RAASI
Dipl. Biochemist, FU Berlin
born 20.02.1961 in Tabriz
from the Islamic Republic of IRAN
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Hans Hengartner, examiner
Prof. Dr. JosefBrunner, examiner
PD Dr. Marcus Groettrup, co-examiner
2001
Zusammenfassung
Ubiquitin ist ein relativ kleines globuläres Protein. Es verbindet sich mit zellulären Proteinen
durch eine kovalente Bindung und auf diese Weise werden die Proteine zu den
unterschiedlichen Prozessen in der Zelle orientiert oder ihre Funktion reguliert. Ubiquitin
wurde etwa vor 20 Jahren entdeckt. Heute gibt es ein solides aber noch nicht vollständiges
Wissen darüber, wie und mit welchem Mechanismus es funktioniert. Es sind mehrere
Faktoren identifiziert worden, die im Ubiquitin System eine Rolle spielen. In den letzten
Jahren sind eine stetig steigende Zahl von Ubiquitin ähnlichen Proteinen gefunden worden,
die in ihrer primären Struktur eine signifikante Homologie zu Ubiquitin aufweisen und
ähnlich wie Ubiquitin entweder eine kovalente Verbindung mit anderen Proteinen eingehen
oder ihre Effekte durch eine nicht kovalente Interaktion erreichen.
Diese Arbeit befasst sich mit der Analyse eines neuen Ubiquitin-ähnlichen Proteins. Es wurde
ursprünglich Diubiquitin genannt, weil es zwei Ubiquitin-ähnlichen Domänen in seiner
Primärstuktur aufweist. Später wurde es, um seine Lokalisierung im HLA-F Lokus des MHC
Klasse I Komplexes zu verdeutlichen, zu FATIO umbenannt. FATIO wurde in einer früheren
Arbeit als ein B-Zellen und dendritische Zellen spezifisch expremiertes Gen beschrieben,
welches für FATIO eine Rolle in professionellen Antigen-presäntierenden Zellen vermuten
lässt.
In memer Arbeit habe ich zuerst mit Hilfe von RT-PCR die FATIO Expression in
verschiedenen Zelllinien in Anwesenheit von drei Zytokinen, IFN-y, TNF-a, und IFN-a
analysiert. In diesen Experimenten habe ich Hinweise auf eine Induzierbarkeit von FATI 0
durch IFN-y und TNF-a bekommen und konnte zeigen, dass die Expression von FATIO nicht
spezifisch für B-Zellen und dendritische Zellen ist, sondern auf synergistischer Weise in
vielen Zelltypen durch die beiden genannten Zytokine induzierbar ist. Ich habe ferner zeigen
können, dass auch das Murine FATIO mit diesen Zytokinen induzierbar ist, was vermuten
lässt, dass die Rolle von FATIO in Vertebraten mindestens zwischen Maus und Mensch
1
konserviert ist. Ich habe versucht, humanes FAT10 in Säugertierzellen stabil zu expremieren
und dabei Hinweise auf eine Toxizität der FATI 0 Expression in Fibroblasten-linien erhalten.
Um die oben genannten Effekte zu bestätigen, habe ich Mausfibroblasten mit einem FATIO
Expressionskonstrukt
transfiziert,
welches
unter
der
Kontrolle
emes
Tetrazyklin-
reprimierbaren Promotor steht. In diesen Transfektanten konnte ich zeigen, dass FATl 0 an
bisher nicht identifizierte Zielproteine kovalent konjugiert wird, und dass die Konjugation von
zwei C-terminalen Glycinresten im FAT10 Molekül abhängt. Interessanterweise führt die
Expression von FATIO in Fibroblasten zum programmierten Zelltod in einem Caspaseabhängigen Prozess.
Die zwei oben erwähnten Befunde sind ausführlich in Kapitel II und
m beschrieben
und
bereits in Fachzeitschriften publiziert worden. Der letzte Teil der Arbeit gehört zu meinem
noch nicht publizierten Daten über die Produktion von polyklonalen Antikörpern gegen
Summary
Ubiquitin is a small globular protein which binds covalently to cellular proteins and targets
them to different cellular pathways. It was discovered about 20 years ago and today, there
exists asolid but not yet complete knowledge about the mechanism of its function. Over the
last few years an increasing number of ubiquitin-like proteins have been identified with some
extent of homology to ubiquitin in their primary structure. They act in a similar manner as
ubiquitin in that they become covalently bound to or just physically interact with cellular
proteins.
This thp.~i~ 1~ focnsed on the functional analvsis of a ubiquitin-Iike protein, initially called
anti-FATIO antibodies. With the help of these antibodies I analysed some aspects of the
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