DE 181.qxd - Sigma
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REAGENZIEN LYMPHOZYTEN-ENZYME (Verfahren Nr. 181) VERWENDUNGSZWECK Die Lymphozyten-Enzym-Kits von Sigma-Aldrich dienen zum Nachweis von Saurer Phosphatase (Kit Nr. 181-A), α-Naphthyl-Butyrat-Esterase (Kit Nr. 181-B) oder ß-Glucuronidase (Kit Nr. 181-C) in Blut, Knochenmarkfilmen oder Abklatschpräparaten. Die Lymphozyten-Enzym-Kits sind für die “In-vitro-Diagnostik” bestimmt. Die Aufteilung des Reifungsprozesses normaler T-Zellen in verschiedene Stadien durch Enzym-Zytochemie und monoklonale Antikörpern hat gezeigt, dass T-Zell-Malignitäten dieselbe ontogenetische Vielfalt aufweisen.1–14 Diese Berichte unterstützen größtenteils die Schlussfolgerung, dass T-ZellNeoplasien den Reifungsprozess während einer normalen Entwicklung hemmen. Die OKT ®-Serie monoklonaler Antikörper, die T-ZellenOberflächenantigene erkennen, unterscheiden Prothymozyten/ Thymozyten von reifen T-Zellen. Ganz ähnlich weisen die meisten T-Zellen des peripheren Bluts und des Lymphgewebes nach einer Enzymfärbung auf Saure Phosphatase (AcP), ßGlucuronidase (BG) und α-Naphthyl-Butyrat-Esterase (α-NB) ein typisches, altersbedingtes zytochemisches Profil auf. AcP wird durch frühe fetale Thymozyten erworben und durch T-ZellDifferenzierung erhalten.15-16 BG, das später in der Entwicklung auftritt, kommt in Thymozyten nach der Schwangerschaft und reifen, zirkulierenden T-Zellen vor17 und könnte ein echtes Pan T-Enzym sein.18-20 Ein Epitop aus α-NB, das bei einem engen pHBereich von (5,7–6,0) reaktiv ist, wird durch reife T-Zellen und medulläre Thymozyten exprimiert.18-20 Aus diesen Ergebnissen haben Basso et al.16 ein Reifungsschema vorgeschlagen, bei dem sich differenzierende T-Zellen aus AcP+, BG-, α-NB- in AcP+, BG+, α-NB- und dann in AcP+, BG+, α-NB+ umwandeln. Die meisten reifen T-Zellen, wie sie durch die RosettingTechnik mit Schaf-Erythrozyten beschrieben werden, weisen ein typisches herdförmiges (Punkt-)Muster auf, wenn sie auf AcP, BG und α-NB21,22 gefärbt werden und exprimieren Oberflächenrezeptoren für IgM (TM, Tµ, Fcr).23 Diejenigen mit einer diffusen/granulären Färbung exprimieren Fc-Rezeptoren für IgG (Tg, gFcr).9,23 Es gibt einige Beweise, dass sich die TM/TG Subsets mit den OKT-4/OKT-8 (Helfer-Suppressor) Subsets überlappen.17–20 Zu dieser Beziehung wurden uneinheitliche Daten geliefert.9,23,24 Gegenwärtig scheint es, dass Enzym-Phenotypen primär zur Bestimmung des Stadiums der Hemmung des Heranreifens in T-Zell-Malignitäten dienen und die Differenzierung zwischen T-, B-, und Non-T/Non-B lymphoproliferativen Störungen zulassen. Das beschriebene Verfahren ermöglicht die Zerlegung des T-Zell-Kompartments in drei separate Entwicklungsphasen. Diese Techniken schließen die Verwendung monoklonaler Antikörper für die phenotypische Analyse nicht aus, können jedoch in Zusammenarbeit zusätzliche Informationen über die Art der T-Zell lymphoproliferativen Störungen liefern. Die nachstehend beschriebene Reaktion für die αNaphthyl-Butyrat-Esterase weist ebenfalls unspezifische Esteraseaktivitäten in Monozyten und Makrophagen auf. Für dieses Verfahren stehen mehrere Methoden zur Verfügung. Die unten aufgeführte Methode ist nicht spezifisch für Monozyten und Makrophagen, da der pH des Inkubationsmediums angepasst wurde, um in einigen Lymphozyten ein herdförmiges (Punkt-)Färbungsmuster aufzuzeigen. Die α-Naphthyl-ButyratEsterase ist weniger empfindlich als das α-Naphthyl-AzetatEsterase-Verfahren. Für Verfahren, die empfindlicher auf Monozyten reagieren, bietet Sigma zwei Esterase-Kits an, Bestell-Nr. 90-A1 und 91-A. Diese Kits enthalten ebenfalls Anweisungen für den Nachweis von α-Naphthyl-AzetatEsterase mit Fluoridinhibition. Entsprechend der Techniken von Sigma-Aldrich werden Zytozentrifugenpräparate oder Filme in einer Zitrat-AzetonFormaldehyd-Lösung fixiert. Saure Phosphatase, α-NaphthylButyrat-Esterase und ß-Glucuronidase werden dann durch die folgenden gleichzeitigen Bindungsreaktionen visualisiert. Saure Phosphatase: Naphthol AS-BI Phosphat Unlöslich-Chromogener Naphthol AS-BI-GBC Komplex (Rot-Violett) α-Naphthyl-Butyrat-Esterase: α-NB α-NaphthylUnlöslich-Chromogener Butyrat Hexazotiert α-Naphthyl-HPRPararosanilin Komplex (Rot-Braun) ß-Glucuronidase: BG α-Naphthol AS-BI Unlöslich-Chromogener Hexazotiert Naphthol AS-BI-HPRß-D-Glucuronid Pararosanilin Komplex (Rot) AcP GBC α-NAPHTHYL-BUTYRAT-LÖSUNG Bestell-Nr. 180-1 α-Naphthyl-Butyrat, 2,4 g/l, in Methanollösung mit Lösungsmitteln. NAPHTHOL AS-BI PHOSPHORSÄURE-LÖSUNG Bestell-Nr. 180-2 Naphthol AS-BI Phosphorsäure, 4 g/l, in Methanollösung mit Lösungsmitteln. NAPHTHOL AS-BI ß-D-GLUCURONSÄURE-LÖSUNG Bestell-Nr. 180-3 Naphthol AS-BI ß-D-Glucuronsäure, 2,5 g/l, in Methanollösung mit Lösungsmitteln. PARAROSANILIN-LÖSUNG, Bestell-Nr. 180-4 Pararosanilin, 40 g/l, in 2 mol/l Salzsäure. FAST GARNET GBC STANDARDLÖSUNG, Bestell-Nr. 387-2 Fast Garnet GBC Standardlösung, 7,0 mg/ml, in 0,4 mol/l Salzsäure und Stabilisatoren. NATRIUMNITRIT-LÖSUNG, Bestell-Nr. 91-4 Natriumnitrit, 0,1 mol/l. NATRIUMNITRIT-TABLETTEN, Bestell-Nr. 180-9 Natriumnitrit, 250 mg pro Tablette. ZITRATLÖSUNG, Bestell-Nr. 91-5 Zitronensäure, 18 mmol/l, Natriumzitrat, 9 mmol/l, Natriumchlorid, 12 mmol/l, und Surfactant. Der pH sollte bei 3,6 + 0,1 liegen. AZETATLÖSUNG, Bestell-Nr. 386-3 Azetatpuffer, 2,5 mol/l, pH 5,2. PHOSPHATPUFFER, Bestell-Nr. 180-5 Natrium- und Kaliumphosphate. METHYLENBLAU-LÖSUNG, Bestell-Nr. 180-8 Methylenblau, 1,4 % (Gew.%) in 95 % Ethanol. AUFBEWAHRUNG UND STABILITÄT: Die α-Naphthyl-Butyrat-Lösung, Naphthol AS-BI Phosphorsäure-Lösung und Naphthol AS-BI ß-D-Glucuronsäure -Lösung im Gefrierschrank unter 0 °C aufbewahren. Die Lösungen vor Gebrauch auf 37 °C erwärmen und gründlich mischen. Entsorgen, falls die Reagenzien gelb werden oder sich ein Präzipitat bildet. Pararosanilin-Lösung, Phosphatpuffer, Natriumnitrit-Tabletten und Methylenblau-Lösung bei Raumtemperatur (18–26 °C) und vor Licht geschützt aufbewahren. Fast Garnet GBC Standardlösung, Natriumnitrit-Lösung, Natriumnitrit-Tabletten-Lösung, Azetatlösung und PhosphatpufferLösung gekühlt (2–8 °C) aufbewahren. Die Verfallsdaten sind auf den Reagenzetiketten angegeben. Die Natriumnitrit- und Zitratlösung sind verwendbar, wenn keine mikrobielle Besiedlung vorhanden ist. PRODUKTVERFALL: Die α-Naphthyl-Butyrat-Lösung, Naphthol AS-BI Phosphorsäure-Lösung und Naphthol AS-BI ß-D-GlucuronsäureLösung entsorgen, falls die Reagenzien gelb werden oder sich ein Präzipitat bildet. Die Pararosanilin-Lösung entsorgen, falls sie nach Zugabe von Natriumnitrit-Lösung nicht bernsteinfarben wird. Die Natriumnitrit-Lösung und Phosphatpuffer-Lösung sollten entsorgt werden, falls sie sich trüben. VORBEREITUNG: Die α-Naphthyl-Butyrat-Lösung, Naphthol AS-BI Phosphorsäure-Lösung und Naphthol AS-BI ß-D-GlucuronsäureLösung auf 37 °C erwärmen. Die Natriumnitrit-Tabletten-Lösung 4 g/dl wird durch Auflösen von 1 Tablette in 6,25 ml entionisiertem Wasser zubereitet. Diese Lösung fest verschlossen bei 2–8 °C aufbewahren. Vor Verwendung auf Raumtemperatur erwärmen. Die Lösung entsorgen, falls sie sich trübt. Die Phosphatpuffer-Lösung wird durch Auflösen des Inhalts von Phosphatpuffer, Bestell-Nr. 180-5, in 500 ml entionisiertem Wasser zubereitet. Der Puffer hat eine Konzentration von 0,067 mol/l, pH 7,7 bei 25 °C. Im Kühlschrank (2–8 °C) aufbewahren. Bei mikrobieller Besiedlung entsorgen. HINWEIS: Die mikrobielle Besiedlung kann durch Filtrieren durch eine 0,22 Mikron Filtereinheit verzögert werden. Der Methylenblau-Gegenfarbstoff wird durch Hinzugabe von 5 ml Methylenblau-Lösung, Bestell-Nr. 180-8, zu 45 ml entionisiertem Wasser zubereitet. Gründlich mischen. Jeden Tag frisch zubereiten. Zitrat-Azeton-Formaldehyd-Fixiermittel: Zu 25 ml Zitratlösung, Bestell-Nr. 91-5, 65 ml Azeton und 8 ml 37 % Formaldehyd zugeben. In eine Glasflasche füllen und fest verschließen. Im Kühlschrank bei (2–8 °C) aufbewahren. Vor Gebrauch auf 23–26 °C vorwärmen. Die Lösung ist stabil, wenn sie fest verschlossen im Kühlschrank aufbewahrt wird. VORSICHTSMASSNAHMEN: Bei der Handhabung von Laborreagenzien sollten normale Vorsichtsmaßnahmen eingehalten werden. Bei der Entsorgung von Abfällen alle örtlichen, staatlichen und nationalen Vorschriften befolgen. Aktuelle Hinweise zu Risiken, Gefahren und Sicherheitsmaßnahmen sind dem Sicherheitsdatenblatt zu entnehmen. 1-DE US-Gefahren- und Sicherheitsangaben Die α-Naphthyl-Butyrat-Lösung ist ENTZÜNDLICH und TOXISCH. Toxisch bei Einatmen, Hautkontakt und Verschlucken. Toxisch: Gefahr schwerer, irreversibler Schäden bei Einatmen, Hautkontakt und Verschlucken. Reizt Augen und Haut. Behälter dicht geschlossen halten. Von Zündquellen fernhalten – nicht Rauchen. Vorsichtsmaßnahmen gegen elektrostatische Entladungen treffen. Kontakt mit Haut vermeiden. Bei der Arbeit geeignete Schutzhandschuhe und Schutzkleidung tragen. Bei Unfall oder Unwohlsein sofort einen Arzt zuziehen (wenn möglich dieses Etikett vorzeigen). Naphthol AS-BI Phosphorsäure-Lösung ist ENTZÜNDLICH und TOXISCH. Toxisch bei Einatmen, Hautkontakt und Verschlucken. Toxisch: Gefahr schwerer, irreversibler Schäden bei Einatmen, Hautkontakt und Verschlucken. Reizt Augen und Haut. Von Zündquellen fernhalten – nicht Rauchen. Bei Kontakt mit den Augen sofort mit reichlich Wasser spülen und ärztlichen Rat einholen. Bei der Arbeit geeignete Schutzhandschuhe und Schutzkleidung tragen. Bei Unfall oder Unwohlsein sofort einen Arzt zuziehen (wenn möglich dieses Etikett vorzeigen). ist Naphthol AS-BI ß-D-Glucuronsäure-Lösung ENTZÜNDLICH und TOXISCH. Schädlich bei Einatmen und Verschlucken. Reizt Augen und Haut. Von Zündquellen fernhalten – nicht Rauchen. Bei Kontakt mit den Augen sofort mit reichlich Wasser spülen und ärztlichen Rat einholen. Bei der Arbeit geeignete Schutzhandschuhe und Schutzkleidung tragen. Bei Unfall oder Unwohlsein sofort einen Arzt zuziehen (wenn möglich dieses Etikett vorzeigen). Pararosanilinlösung ist TOXISCH. Bei Einatmen toxisch. Verursacht Verätzungen. Kann Krebs verursachen. Bei Kontakt mit den Augen sofort mit reichlich Wasser spülen und ärztlichen Rat einholen. Geeignete Schutzkleidung, Handschuhe und Augen-/Gesichtsschutz tragen. Bei Unfall oder Unwohlsein sofort einen Arzt zuziehen (wenn möglich dieses Etikett vorzeigen). Zielorgane: Leber und Schilddrüse. California Prop 65 karzinogen. Phosphatpuffer nicht einatmen und Kontakt vermeiden. Methylenblau-Lösung ist ENTZÜNDLICH und ein REIZMITTEL. Reizt Augen, Atmungssystem und Haut. Behälter dicht geschlossen halten. Von Zündquellen fernhalten – nicht Rauchen. Bei Kontakt mit den Augen sofort mit reichlich Wasser spülen und ärztlichen Rat einholen. Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung tragen. Natriumnitrit-Tabletten sind TOXISCH, OXIDIEREND und umweltschädlich. Der Kontakt mit brennbarem Material kann Brände verursachen. Bei Verschlucken toxisch. Für Wasserorganismen sehr giftig. Von brennbarem Material fernhalten. Geeignete Schutzkleidung, Handschuhe und Augen/Gesichtsschutz tragen. Bei Unfall oder Unwohlsein sofort einen Arzt zuziehen (wenn möglich dieses Etikett vorzeigen). Freisetzung in die Umwelt vermeiden. Siehe spezielle Anweisungen/Sicherheitsdatenblätter. Fast Garnet GBC Standard-lösung ist TOXISCH. Bei Verschlucken schädlich. Bei Einatmen toxisch. Verursacht Verätzungen. Kann Krebs verursachen. Bei Kontakt mit den Augen sofort mit reichlich Wasser spülen und ärztlichen Rat einholen. Geeignete Schutzkleidung, Handschuhe und Augen/Gesichtsschutz tragen. Bei Unfall oder Unwohlsein sofort einen Arzt zuziehen (wenn möglich dieses Etikett vorzeigen). Zielorgane: Leber und Nieren. Azetatlösung – Vorsicht: Die Substanz ist noch nicht vollständig geprüft. Azeton ist ENTZÜNDLICH und ein REIZMITTEL. Reizt die Augen. Wiederholte Exposition kann zu trockener oder rissiger Haut führen. Dämpfe können Schläfrigkeit und Schwindel verursachen. Den Behälter an einem gut durchlüfteten Ort aufbewahren. Von Zündquellen fernhalten – nicht Rauchen. Bei Kontakt mit den Augen sofort mit reichlich Wasser spülen und ärztlichen Rat einholen. Zielorgane: Leber und Nieren. Formaldehyd-Lösung ist TOXISCH. Toxisch bei Einatmen, Hautkontakt und Verschlucken. Verursacht Verätzungen. Verdacht auf krebserzeugende Wirkung. Kontakt mit der Haut kann zu einer Sensibilisierung führen. Kann vererbbare genetische Schäden verursachen. Bei Kontakt mit den Augen sofort mit reichlich Wasser spülen und ärztlichen Rat einholen. Geeignete Schutzkleidung, Handschuhe und Augen/Gesichtsschutz tragen. Bei Unfall oder Unwohlsein sofort einen Arzt zuziehen (wenn möglich dieses Etikett vorzeigen). Nur an gut durchlüfteten Orten verwenden. EU-Gefahren- und Sicherheitsangaben (Vorsicht: Substanzen sind noch nicht vollständig geprüft) Die α-Naphthyl-Butyrat-Lösung ist TOXISCH. Toxisch bei Einatmen, Hautkontakt und Verschlucken. Toxisch: Gefahr schwerer, irreversibler Schäden bei Einatmen, Hautkontakt und Verschlucken. Bei der Arbeit geeignete Schutzhandschuhe und Schutzkleidung tragen. Bei Unfall oder Unwohlsein sofort einen Arzt zuziehen (wenn möglich dieses Etikett vorzeigen). Naphthol AS-BI Phosphorsäure-Lösung ist TOXISCH. Entzündlich. Toxisch bei Einatmen, Hautkontakt und Verschlucken. Toxisch: Gefahr schwerer, irreversibler Schäden bei Einatmen, Hautkontakt und Verschlucken. Reizt Augen und Haut. Von Zündquellen fernhalten – nicht Rauchen. Bei Kontakt mit den Augen sofort mit reichlich Wasser spülen und ärztlichen Rat einholen. Bei der Arbeit geeignete Schutzhandschuhe und Schutzkleidung tragen. Bei Unfall oder Unwohlsein sofort einen Arzt zuziehen (wenn möglich dieses Etikett vorzeigen). Naphthol AS-BI ß-D-Glucuronsäure-Lösung ist TOXISCH. Entzündlich. Schädlich bei Einatmen, Hautkontakt und Verschlucken. Reizt Augen und Haut. Bei Kontakt mit den Augen sofort mit reichlich Wasser spülen und ärztlichen Rat einholen. Geeignete Schutzkleidung, Handschuhe und Augen/Gesichtsschutz tragen. Bei Unfall oder Unwohlsein sofort einen Arzt zuziehen (wenn möglich dieses Etikett vorzeigen). Pararosanilin-Lösung ist ein REIZMITTEL. Reizt Augen, Atmungssystem und Haut. Bei Kontakt mit den Augen sofort mit reichlich Wasser spülen und ärztlichen Rat einholen. Bei der Arbeit geeignete Schutzhandschuhe und Schutzkleidung tragen. Phosphatpuffer: Vorsicht: Die Substanz ist noch nicht vollständig geprüft. Methylenblau-Lösung ist HOCHENTZÜNDLICH. Hochentzündlich. Behälter dicht geschlossen halten. Von Zündquellen fernhalten – nicht Rauchen. Natriumnitrit-Tabletten sind OXIDIEREND, TOXISCH und umweltschädlich. Der Kontakt mit brennbarem Material kann Brände verursachen. Bei Verschlucken toxisch. Für Wasserorganismen sehr giftig. Bei Unfall oder Unwohlsein sofort einen Arzt zuziehen (wenn möglich dieses Etikett vorzeigen). Freisetzung in die Umwelt vermeiden. Siehe spezielle Anweisungen/Sicherheitsdatenblätter. Fast Garnet GBC Standardlösung ist TOXISCH. Bei Verschlucken schädlich. Kann Krebs verursachen. Bei Unfall oder Unwohlsein sofort einen Arzt zuziehen (wenn möglich dieses Etikett vorzeigen). Azetatlösung – Vorsicht: Die Substanz ist noch nicht vollständig geprüft. Azeton ist HOCHENTZÜNDLICH und ein REIZMITTEL. Hochentzündlich. Reizt die Augen. Wiederholte Exposition kann zu trockener oder rissiger Haut führen. Dämpfe können Schläfrigkeit und Schwindel verursachen. Den Behälter an einem gut durchlüfteten Ort aufbewahren. Von Zündquellen fernhalten – nicht Rauchen. Bei Kontakt mit den Augen sofort mit reichlich Wasser spülen und ärztlichen Rat einholen. Formaldehyd-Lösung ist TOXISCH. Toxisch bei Einatmen, Hautkontakt und Verschlucken. Verursacht Verätzungen. Verdacht auf krebserzeugende Wirkung. Kontakt mit der Haut kann zu einer Sensibilisierung führen. Bei Kontakt mit den Augen sofort mit reichlich Wasser spülen und ärztlichen Rat einholen. Geeignete Schutzkleidung, Handschuhe und Augen/Gesichtsschutz tragen. Bei Unfall oder Unwohlsein sofort einen Arzt zuziehen (wenn möglich dieses Etikett vorzeigen). Nur an gut durchlüfteten Orten verwenden. VERFAHREN PROBENNAHME: Es wird empfohlen, die Probennahme gemäß NCCLSDokument M29-A2 durchzuführen. Keine Testmethode kann eine absolute Gewähr dafür liefern, dass Blut- und Gewebeproben keine Infektionen übertragen. Deshalb müssen alle Blutderivate und Gewebeproben als potenziell infektiös behandelt werden. Proben können in Heparin oder EDTA entnommen werden. Nach der Fixierung können die Objektträger bei Raumtemperatur mindestens 2 Wochen aufbewahrt werden. Falls mononukleäre Zellen mit HISTOPAQUE®-1077 isoliert werden, sollte die Trennung innerhalb von 4 Stunden stattfinden, obwohl es nach 24 Stunden zu einer Wiederherstellung kommt.25 Für diese Verfahren eignen sich keine Blutfilme, insbesondere von leukopenischen Patienten, da die Untersuchung dieses Materials sehr zeitaufwändig ist. Es sollten Zytozentrifugen- oder Leukozytenmanschettenpräparate verwendet werden. Knochenmarkfilme und Abklatschpräparate stellen im Hinblick auf die Untersuchung unter dem Mikroskop keine Probleme dar. SPEZIELL ERFORDERLICHE, ABER NICHT MITGELIEFERTE MATERIALIEN: Azeton, ACS-Reagenz Formaldehyd Formaldehyd, 37 % Wasserbad, das 37 °C aufrechterhalten kann, vor Licht geschützt HINWEISE: In jeden Test sollten Zellen von gesunden Spendern miteingeschlossen werden. Zellen, die auf Polysaccharose-Natrium-Diatrizoat Gradienten isoliert werden, können zu Kontrollzwecken in flüssigem Stickstoff (LN2) aufbewahrt werden. Um das zu erreichen, werden pro Minute 1 x 107 - 108 Zellen bei 1 ± 0,3 °C in einem Medium mit 50 % fetalem Kälberserum, 40 % RPMI1640 (oder einer anderen geeigneten Gewebekulturflüssigkeit) und 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) gefroren. Sie können sowohl in flüssigem oder gasförmigem LN2 aufbewahrt werden. Die Objektträger sollten mit einer 1000X Vergrößerung untersucht werden. Dydimiumfilter können speziell die Farbe des diffusen Farbstoffs α-NB verstärken. Die aus diesem Verfahren gewonnenen Daten dienen nur als Hilfe zur Diagnose und sollten im Zusammenhang mit anderen klinischen Diagnostiktests und Informationen überprüft werden. VERFAHREN: SAURE PHOSPHATASE-VERFAHREN: Reagenzien Naphthol AS-BI Phosphorsäure-Lösung, Bestell-Nr. 180-2 FAST GARNET GBC Standardlösung, Bestell-Nr. 387-2 Natriumnitrit-Lösung, Bestell-Nr. 91-4 Zitratlösung, Bestell-Nr. 91-5 Azetatlösung, Bestell-Nr. 386-3 Methylenblau-Lösung, Bestell-Nr. 180-8 1. Die für einen Tag benötigte Menge entionisiertes Wasser auf 37 °C vorwärmen. 2. Unmittelbar vor der Fixierung 1 ml Natriumnitrit-Lösung, Bestell-Nr. 91-4, zu 1 ml Fast Garnet GBC Standardlösung, Bestell-Nr. 387-2, zugeben. Durch Umdrehen sorgfältig mischen und 2-5 Minuten stehen lassen. 3. Die Lösung aus Schritt 2 zu 38 ml vorgewärmtem entionisiertem Wasser zugeben. 4. 5 ml Azetatlösung, Bestell-Nr. 386-3, zugeben. 5. 5 ml Naphthol AS-BI Phosphorsäure-Lösung, BestellNr. 180-2, hinzufügen. Gut vermischen und in eine CoplinKüvette gießen. Die Lösung ist bernsteinfarben. Eine Präzipitatbildung deutet auf einen Reagenzzerfall hin. 6. Die Objektträger 30 Minuten in Zitrat-Azeton-FormaldehydFixiermittel bei Raumtemperatur (23–26 °C) fixieren. In entionisiertem Wasser 45–60 Sekunden spülen. Die Objektträger dürfen nicht trocknen. 7. Die Objektträger unmittelbar nach dem Spülen in die Lösung aus Schritt 5 stellen und 1 Stunde bei 37 °C inkubieren. HINWEIS: Wenn die Objektträger nach der Fixierung nicht in die Inkubationslösung gestellt werden, müssen sie mindestens 45 Minuten an der Luft trocknen. 8. Die Objektträger nach 1 Stunde aus der Coplin-Küvette nehmen und mindestens 2 Minuten unter fließendem Leitungswasser spülen. Die Färbelösung entsorgen. 9. Die Objektträger vor der Gegenfärbung mindestens 15 Minuten an der Luft trocknen lassen. 10. 2 Minuten in Methylenblau-Gegenfarbe gegenfärben. 11. In entionisiertem Wasser spülen. α-NAPHTHYL-BUTYRAT-ESTERASE-VERFAHREN: Reagenzien α-Naphthyl-Butyrat-Lösung, Bestell-Nr. 180-1 Pararosanilinlösung, Bestell-Nr. 180-4 Natriumnitrit-Tabletten, Bestell-Nr. 180-9 Phosphatpuffer, Bestell-Nr. 180-5 Methylenblau-Lösung, Bestell-Nr. 180-8 Zitratlösung, Bestell-Nr. 91-5 1. Die Phosphatpuffer-Lösung auf 37 °C vorwärmen. 2. Unmittelbar vor dem Fixieren 1,5 ml Natriumnitrit-TablettenLösung zu 1,5 ml Pararosanilinlösung, Bestell-Nr. 180-4, zugeben. Durch Umdrehen sorgfältig mischen und mindestens 5 Minuten stehen lassen, dann zu 40 ml vorgewärmter Phosphatpuffer-Lösung zugeben. 3. 5 ml α-Naphthyl-Butyrat-Lösung, Bestell-Nr. 180-1, zugeben. 4. Gut mischen und ein eine Coplin-Küvette gießen. Die Lösung ist bernsteinfarben. Eine Präzipitatbildung deutet auf einen Reagenzzerfall hin. 5. Die Objektträger 10 Sekunden in Zitrat-AzetonFormaldehyd-Fixiermittel bei Raumtemperatur (23–26 °C) fixieren. In entionisiertem Wasser 45 Sekunden spülen. Die Objektträger dürfen nicht trocknen. 6. Die Objektträger unmittelbar nach dem Spülen in die Lösung aus Schritt 4 stellen und 1 Stunde bei 37 °C inkubieren. HINWEIS: Wenn die Objektträger nach der Fixierung nicht in die Inkubationslösung gestellt werden, müssen sie mindestens 45 Minuten an der Luft trocknen. 7. Die Objektträger nach 1 Stunde aus der Coplin-Küvette nehmen und 2-3 Minuten unter fließendem Leitungswasser spülen. Die Färbelösung entsorgen. 8. Die Objektträger vor der Gegenfärbung mindestens 15 Minuten an der Luft trocknen lassen. 9. 5 Minuten in Methylenblau-Gegenfarbe gegenfärben. 10. In entionisiertem Wasser spülen. ß-GLUCURONIDASE-VERFAHREN: Reagenzien Naphthol AS-Bl ß-D-Glucuronsäure, Bestell-Nr. 180-3 Pararosanilinlösung, Bestell-Nr. 180-4 Natriumnitrit-Tabletten, Bestell-Nr. 180-9 Azetatlösung, Bestell-Nr. 386-3 Methylenblau-Lösung, Bestell-Nr. 180-8 Zitratlösung, Bestell-Nr. 91-5 1. Die für einen Tag benötigte Menge entionisiertes Wasser auf 37 °C vorwärmen. 2. Unmittelbar vor dem Fixieren 0,5 ml Natriumnitrit-TablettenLösung zu 0,5 ml Pararosanilinlösung, Bestell-Nr. 180-4, zugeben. Durch Umdrehen sorgfältig mischen und 5 Minuten stehen lassen, dann zu 38 ml vorgewärmtem entionisiertem Wasser zugeben. 3. 5 ml Azetatlösung, Bestell-Nr. 386-3, zugeben. 4. 5 ml Naphthol AS-BI ß-D-Glucuronsäure-Lösung, BestellNr. 180-3, zugeben. 2-DE 5. Gut mischen und ein eine Coplin-Küvette gießen. Die Lösung ist bernsteinfarben. Eine Präzipitatbildung deutet auf einen Reagenzzerfall hin. 6. Die Objektträger 30 Sekunden in Zitrat-AzetonFormaldehyd-Fixiermittel bei Raumtemperatur (23–26 °C) fixieren. In entionisiertem Wasser 45 Sekunden spülen. Die Objektträger dürfen nicht trocknen. 7. Die Objektträger unmittelbar nach dem Spülen in die Lösung aus Schritt 5 stellen und 90 Minuten bei 37 °C vor Licht geschützt inkubieren. HINWEIS: Wenn die Objektträger nach der Fixierung nicht in die Inkubationslösung gestellt werden, müssen sie mindestens 45 Minuten an der Luft trocknen. 8. Die Objektträger nach 90 Minuten aus der Coplin-Küvette nehmen und 2-3 Minuten unter fließendem Leitungswasser spülen. Die Färbelösung entsorgen. 9. Die Objektträger vor der Gegenfärbung mindestens 15 Minuten an der Luft trocknen lassen. 10. 3 Minuten in Methylenblau-Gegenfarbe gegenfärben. 11. In entionisiertem Wasser spülen. LEISTUNGSMERKMALE SAURE PHOSPHATASE: Die herdförmige (Punkt-)Färbung der Lymphozyten deutet auf eine Linie des Thymus (T-Zellen) hin. α-NAPHTHYL-BUTYRAT- ESTERASE: Das in einigen Lymphozyten beobachtete Punktfärbemuster steht in Verbindung mit reifen T-Zellen, die Fc-Rezeptoren für IgM aufweisen. Diese Untergruppe überschneidet sich teilweise mit der T-Helfer-ZellenPopulation, ist jedoch kein zuverlässiger Maßstab für die Helferfunktion. Die diffus oder granulär gefärbten Lymphozyten haben Rezeptoren für den Fc-Teil des IgG und überlappen teilweise die T-Suppressor-Zell-Population. ß-GLUCURONIDASE: Eine positive Färbung erscheint im Zusammenhang mit reifen Thymozyten, zirkulierenden T-Zellen und einer Subpopulation unreifer B-Zellen. Das herdförmige (Punkt-)Färbungsmuster und diffus-granuläre Muster färben analog zur α-Naphthyl-Butyrat-Esterase. Monozyten und Granulozyten sind normalerweise negativ. Falls sich die beobachteten Ergebnisse von den erwarteten Ergebnissen unterscheiden, bitte den technischen Kundendienst von Sigma-Aldrich verständigen. LITERATURANGABEN 1. Nadler LM, Ritz J, Reinherz EL, Scholssman SF: Cellular Origins of Human Leukemias and Lymphomas. IN Leukemia Markers, W Knapp, Editor, Academic Press, London, 1981, p 3 2. Greaves MF: Monoclonal Antibodies as Probes for Leukaemic Heterogeneity and Haemopoietic Differentiation. Ibid., p 19 3. 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