Immunhistologische Untersuchungen zum Einfluss

Aus der
Medizinischen Klinik II mit Poliklinik
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. med. W. G. Daniel
Immunhistologische Untersuchungen zum Einfluss
demographischer Daten und kardialer Pathologien auf
die Verteilung adulter kardialer Stammzellen in
humanem Myokard
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von
Annette Schütz
aus Bamberg
Gedruckt mit Erlaubnis der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Dekan:
Prof. Dr. med. Dr. h.c. J. Schüttler
Referent:
Prof. Dr. med. C. Garlichs
Korreferent:
Prof. Dr. med. W. G. Daniel
Tag der mündlichen Prüfung: 21.04.2010
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1
Zusammenfassung................................................................................................ 1
2
Einleitung ............................................................................................................... 5
2.1
Herzinsuffizienz als relevante Erkrankung in der Gesellschaft............................. 5
2.1.1 Prävalenz und Inzidenz der Herzinsuffizienz ............................................... 5
2.1.2 Ursachen für die zunehmende Prävalenz der Herzinsuffizienz ................... 5
2.1.3 Problem der begrenzten Therapieoptionen bei Herzinsuffizienz ................. 5
2.2
Stammzellen als Möglichkeit in der Zellersatztherapie......................................... 6
2.2.1 Voraussetzungen für die Zellersatztherapie................................................. 6
2.2.2 Stammzellen - Überblick und Definitionen ................................................... 7
2.2.2.1 Embryonale Stammzellen ......................................................................... 8
2.2.2.2 Adulte Stammzellen .................................................................................. 8
2.2.3 Rolle der Myoblasten der Skelettmuskulatur in der Zelltherapie .................. 9
2.2.4 Einsatz von Knochenmarkstammzellen in der Zelltherapie ......................... 9
2.3
Nachweis und Potential herzeigener Stammzellen ............................................ 12
2.3.1 Hinweise auf Regenerationsprozesse in humanem Myokard .................... 12
2.3.2 Charakteristika der residenten kardialen Stammzellen .............................. 13
2.4
3
Ziele der vorliegenden Arbeit.............................................................................. 15
Studienkollektiv und Methoden ......................................................................... 16
3.1
Studienkollektiv................................................................................................... 16
3.2
Methoden............................................................................................................ 16
3.2.1 Untersuchte Antigene und verwendete Antikörper..................................... 16
3.2.1.1 Antigen Ki-67........................................................................................... 17
3.2.1.2 Antigen c-kit ............................................................................................ 18
3.2.1.3 Antigen CD45.......................................................................................... 19
3.2.1.4 Antigen CD34.......................................................................................... 20
3.2.2 Anfertigung der Präparate.......................................................................... 20
3.2.3 Grundlagen der immunhistochemischen Methode..................................... 21
3.2.4 Durchführung der immunhistochemischen Färbungen .............................. 22
3.2.4.1 Immunhistochemische Visualisierung von Ki-67..................................... 23
3.2.4.2 Immunhistochemische Mehrfachfärbungen zur Visualisierung von ...........
c-kit, CD34 und CD45.............................................................................. 24
3.2.5 Qualitätskontrolle ....................................................................................... 26
3.2.6 Lichtmikroskopische Auswertung der Färbungen ...................................... 26
3.2.6.1 Prinzip des Verfahrens............................................................................ 26
3.2.6.2 Auswertung der Einfachfärbungen mit Ki-67........................................... 27
Inhaltsverzeichnis
3.2.6.3 Auswertung der Mehrfachfärbungen mit c-kit, CD34 und CD45 ............. 28
3.3
Statistische Auswertung ..................................................................................... 28
3.4
Materialien .......................................................................................................... 29
4
Ergebnisse ........................................................................................................... 31
4.1
Demographische und klinische Daten des Patientenkollektivs........................... 31
4.2
Nachweis residenter kardialer c-kit+CD34-CD45- Zellen im pathologisch
veränderten humanen Myokard.......................................................................... 33
4.3
Nachweis Ki-67+ Kardiomyozyten im pathologisch veränderten humanen
Myokard .............................................................................................................. 34
4.4
Populationen der Ki-67+ und c-kit+CD34-CD45- Zellen im Vergleich ................ 35
4.5
Einfluss demographischer Daten auf die Zellpopulationen................................. 36
4.6
Einfluss von BMI und atherogenen Risikofaktoren ............................................. 37
4.7
Medikamentöse Therapie im Patientenkollektiv ................................................. 37
4.8
Einfluss der LV-EF im Patientenkollektiv ............................................................ 39
4.9
Vergleich von pathologisch verändertem und gesundem Myokard .................... 39
4.10 Verschiedene Herzerkrankungen im Patientenkollektiv ..................................... 41
4.10.1 Patienten mit Aortenklappenstenose ....................................................... 42
4.10.2 Postinfarktpatienten ................................................................................. 43
4.10.3 Veränderungen im ventrikulären Myokard herzinsuffizienter Patienten ... 43
4.10.4 Veränderungen im atrialen Myokard bei chronischem Vorhofflimmern ... 44
4.11 Die Zellpopulationen im Myokard von Kindern mit angeborenen Herzfehlern .... 46
4.12 Vergleich von geschädigtem Myokard Erwachsener mit fetalem Myokard ......... 46
5
5.1
Diskussion ........................................................................................................... 48
Nachweis von Zellen mit Stammzelleigenschaften und Zellproliferation im
Myokard herzkranker Patienten.......................................................................... 48
5.2
Regenerationspotential des Herzens im Hinblick auf die Klinik der Patienten mit
kardialen Erkrankungen...................................................................................... 53
5.3
Herkunft der c-kit+CD34-CD45- Zellen und Ki-67+ Kardiomyozyten im Myokard
herzinsuffizienter Patienten ................................................................................ 56
5.4
Veränderungen im atrialen Myokard bei chronischem Vorhofflimmern .............. 58
5.5
Ki-67+ Kardiomyozyten und c-kit+CD34-CD45- Zellen bei Patienten mit
Aortenklappenstenose........................................................................................ 59
5.6
Einfluss von Medikation und Nikotin auf die untersuchten Zellpopulationen ...... 61
5.7
Zusammenhang demographischer Daten mit den untersuchten
Zellpopulationen ................................................................................................. 63
5.8
C-kit+CD34-CD45- Zellen sowie Ki-67+ Kardiomyozyten im kindlichen
Myokard .............................................................................................................. 64
Inhaltsverzeichnis
5.9
Methodische Aspekte ......................................................................................... 64
5.10 Schlussfolgerungen und Ausblick....................................................................... 65
6
Literaturverzeichnis ............................................................................................ 67
7
Abkürzungsverzeichnis ...................................................................................... 77
8
Anhang ................................................................................................................. 79
8.1
Färbeprotokolle................................................................................................... 79
8.2
Daten der Patientengruppen .............................................................................. 80
9
Danksagung ......................................................................................................... 84
10 Lebenslauf............................................................................................................ 85
Zusammenfassung
1
1
Zusammenfassung
Hintergrund und Ziele: Das Herz wurde lange Zeit als terminal differenziertes Organ
betrachtet. Jedoch gab es in den letzten Jahren zahlreiche Hinweise auf ein
Regenerationspotential
des
Myokards.
Hierbei
wurde
insbesondere
kardialen
Stammzellen eine besondere Rolle zugeschrieben. Besonders die Arbeitsgruppe um
Anversa lieferte mit der Identifikation einer kardialen Zellpopulation, die sie als
„residente kardiale Stammzellen“ bezeichnete, schon früh Hinweise auf myokardiale
Regeneration. Diese Zellpopulation trug Oberflächenmarker adulter Stammzellen wie
c-kit aber keine Oberflächenmarker endothelialer oder hämatopoetischer Zellen wie
CD34 und CD45. Im Tierversuch gelang es, die Klonogenität und Differenzierung
dieser Zellen in Kardiomyozyten nachzuweisen. Angesichts der großen Relevanz
kardialer Erkrankungen in der Gesellschaft und der immer noch begrenzten
therapeutischen
Möglichkeiten,
insbesondere
bei
Patienten
mit
terminaler
Herzinsuffizienz, war es unsere Zielsetzung an einem menschlichen Kollektiv,
Hinweise auf kontinuierliche Regenerationsprozesse durch kardiale c-kit+CD34-CD45Vorläuferzellen zu sammeln. Zudem sollte evaluiert werden, in welcher Größenordnung
diese Zellen im humanen Myokard vorkommen, inwiefern Proliferationsaktivität
nachweisbar ist und ob es einen Einfluss demographischer Daten oder kardialer
Pathologien auf die Verteilung dieser Zellen im Myokard von Patienten mit kardialen
Erkrankungen gibt.
Methoden: Untersuchungsgrundlage dieser Studie waren Myokardproben von 112
herzkranken Patienten. Die Proben wurden immunhistochemisch gefärbt und
lichtmikroskopisch
ausgewertet.
Sie
wurden
auf
das
Vorhandensein
des
Stammzellmarkers c-kit und des Proliferationsmarkers Ki-67 sowie anhand der
Oberflächenantigene CD34 und CD45 auf endothelialen und hämatopoetischen
Ursprung untersucht. Dreifachfärbungen wurden für die simultane Detektion mehrerer
Antigene angewandt. Proliferierende Kardiomyozyten wurden durch die nukleäre
Markierung des Antigens Ki-67 sowie ihre typische Morphologie identifiziert. Ckit+CD34-CD45- Zellen wurden als residente kardiale Stammzellen gewertet. In die
Berechnungen gingen Zellzahlen pro Fläche ein.
Ergebnisse: Es konnten im Myokard herzkranker Patienten in allen untersuchten
Herzbereichen c-kit+CD34-CD45- Zellen sowie Ki-67+ Kardiomyozyten nachgewiesen
werden. Die Anzahl c-kit+CD34-CD45- Zellen war signifikant niedriger als die
durchschnittliche Anzahl Ki-67+ Kardiomyozyten. Im Vergleich zu Kontrollpersonen
Zusammenfassung
2
ohne kardiale Erkrankung haben Patienten mit kardialen Erkrankungen sowohl mehr ckit+CD34-CD45- Zellen als auch mehr Ki-67+ Kardiomyozyten. Es waren keine
eindeutigen Zusammenhänge zwischen Geschlecht, Alter, atherogenen Risikofaktoren,
Medikation und den untersuchten Zellpopulationen nachweisbar. Patienten mit
Vorhofflimmern (VHF) haben im Vergleich zu Patienten mit Sinusrhythmus (SR) eine
signifikant höhere Anzahl an Ki-67+ Kardiomyozyten im Vorhofmyokard. Die Verteilung
der untersuchten Zellpopulationen variiert in Abhängigkeit von den untersuchten
Herzhöhlen. Die meisten c-kit+CD34-CD45- Zellen befinden sich im Myokard des
rechten Ventrikels. Auch im Myokard von Kindern mit angeborenen Herzfehlern
konnten Zellen der untersuchten Populationen nachgewiesen werden.
Schlussfolgerungen: Der Nachweis residenter kardialer Stammzellen sowie der
Nachweis von Kardiomyozyten mit dem Proliferationsmarker Ki-67 im Myokard von 112
Patienten
mit
einer
kardialen
Erkrankung
liefert
weitere
Hinweise
auf
Regenerationsprozesse im menschlichen Herzen. Das vermehrte Vorliegen dieser
Zellen bei Patienten mit kardialen Erkrankungen weist auf eine Aktivierung von
Kardiomyozyten und deren Vorläuferzellen unter pathologischen Bedingungen hin. Die
geringe Anzahl der nachgewiesenen Zellen könnte eine Erklärung dafür sein, warum
klinisch
infolge
ausgeprägter
Regenerationsprozesse
zu
ischämischer
beobachten
sind.
Schädigungen
Da
keine
insgesamt
mehr
größeren
Ki-67+
Kardiomyozyten als c-kit+CD34-CD45- Zellen nachgewiesen wurden, ist anzunehmen,
dass es neben c-kit+ Progenitorzellen noch weitere proliferationsfähige Zellen im
Herzen gibt. Die in vorliegender Studie untersuchten Zellpopulationen müssten
zukünftig durch Isolation aus humanem Myokard und Untersuchungen in Zellkultur
genauer charakterisiert werden, um Aussagen über ihr therapeutisches Potential
treffen zu können.
Zusammenfassung
3
Englische Zusammenfassung – Summary
Background: The heart has been traditionally regarded as terminally differentiated
organ. However, in the past few years, new observations have provided strong
evidence of cardiac myocyte proliferation and regeneration. In this context cardiac stem
cells are of great interest. Especially Anversa et al. described early the existence of a
population of cardiac cells, which they called „resident cardiac stem cells“. These cells
were positive for stem cell markers like c-kit and did not express endothelial or
hematopoetic surface markers like CD34 and CD45. The clonogenic potential and the
differentiation of these cells in cardiomyocytes were documented in animal studies.
With regard to the role of cardiac diseases in our society and the limited therapeutic
options concerning especially people with terminal heart failure, it was the purpose of
this study to provide stronger evidence of continuous regeneration processes by ckit+CD34-CD45- progenitor cells in human myocardium. Furthermore the quantity of
these cells in human myocardium, the evidence of proliferation activity and the
influence of demographic factors and cardiac pathologies on the distribution of these
cells in human myocardium of patients with cardiac diseases were investigated.
Methods: Human myocardium of 112 patients with cardiac diseases was examined by
lightmicroscopy after immunohistochemical staining. The expression of the stem cell
marker c-kit, the proliferation marker Ki-67 and the endothelial or hematopoetic
markers CD34 and CD45 were detected. Proliferating cardiomyocytes were identified
by their morphology and presence of Ki-67. C-kit+CD34-CD45- cells were counted as
resident cardiac progenitor cells. Cell numbers per area were counted and compared.
Results: C-kit+CD34-CD45- cells and Ki-67+ cardiomyocytes could be identified in a
regular pattern in human myocyardium of patients with cardiac diseases in all areas of
the heart. The number of c-kit+CD34-CD45- cells was significantly lower than the
overall number of proliferating Ki-67+ cardiomyocytes. In patients with cardiac diseases
a
significantly
higher
number
of
both
c-kit+CD34-CD45-
cells
and
Ki-67+
cardiomyocytes was found as compared to control persons without cardiac diseases.
There was no clear influence of sex, age, atherogenous risk factors and drugs on the
examinated cell populations. In patients with atrial fibrillation a significantly higher
number of Ki-67+ cardiomyocytes was found in the atrial myocardium as compared to
patients without atrial fiblillation. The distribution of examinated cell populations varied
among the different parts of the heart. Most c-kit+CD34-CD45- cells were found in the
Zusammenfassung
4
myocardium of the right ventricle. Furthermore, the examinated cell populations were
also detected in myocardium of children with congenital heart defects.
Conclusions: Our findings about the existence of resident cardiac c-kit+CD34-CD45cells and cells expressing the proliferation marker Ki-67 in human myocardium of 112
patients with cardiac diseases provide evidence that the heart has a regenerative
potential. The higher number of these cells in patients with cardiac diseases suggests
the activation of cardiomyocytes and their progenitors under pathological conditions.
The small overall number of detected cells can explain the poor outcome of patients
suffering from important ischemic injuries despite the evidence of regeneration
processes in the heart. Because of the fact that more Ki-67+ cardiomyocytes than ckit+CD34-CD45- cells were detected, we suppose that there are further cells able to
proliferate in the human myocardium besides c-kit+ cells. The examined cell
populations certainly have to be characterized more closely by isolation and cell culture
experiments in order to evaluate their therapeutic potential.
Einleitung
5
2
Einleitung
2.1
Herzinsuffizienz als relevante Erkrankung in der Gesellschaft
2.1.1
Prävalenz und Inzidenz der Herzinsuffizienz
Kardiovaskuläre Erkrankungen sind laut statistischem Bundesamt sowohl für Männer
als auch für Frauen die häufigste Todesursache in Deutschland. Dabei spielt die
Zunahme an Patienten mit Herzinsuffizienz eine wesentliche Rolle. Die Zahl an
herzinsuffizienten Patienten in Deutschland beträgt laut statistischem Bundesamt 1,6
Millionen. Die Anzahl an Neuerkrankungen pro Jahr liegt bei zwei bis 12 pro 1000
Patienten (Lloyd-Jones 2002; Roger 2004). Studien zufolge haben Männer und Frauen
über 40 Jahren heute ein Lebenszeitrisiko von durchschnittlich 20% an Herzinsuffizienz
zu erkranken (Lloyd-Jones 2002). Den Angaben des statistischen Bundesamtes
zufolge war die Herzinsuffizienz im Jahr 2006 der häufigste Grund für einen stationären
Krankenhausaufenthalt. So ist die Herzschwäche ohne Zweifel eine klinisch wie auch
volkswirtschaftlich relevante Erkrankung in der Gesellschaft, die auch in Zukunft von
Bedeutung sein wird.
2.1.2
Ursachen für die zunehmende Prävalenz der Herzinsuffizienz
Ursache für die Zunahme der herzinsuffizienten Patienten ist sicher die hohe Prävalenz
der koronaren Herzerkrankung (KHK) in der Bevölkerung. Diese Erkrankung führt
langfristig oftmals zu klinisch relevanten Funktionseinschränkungen des Herzens.
Durch Fortschritte in der Frühintervention sowie durch optimale medikamentöse
Therapiemaßnahmen gelang es zwar, das Überleben des akuten Myokardinfarktes zu
verbessern und die Schädigung von Herzmuskelgewebe zumindest zu reduzieren.
Jedoch trägt vor allem die steigende Lebenserwartung dazu bei, dass immer mehr
Patienten,
Jahre
nach
dem
akuten
Ereignis,
das
Stadium
der
chronisch
fortschreitenden Herzinsuffizienz erreichen. Leider ist die Prognose dieser Patienten
aktuell schlecht. Studien zufolge hat die Anzahl an Todesfällen, die auf Herzinsuffizienz
zurückgeführt werden können, seit 1970 um das Drei- bis Vierfache zugenommen
(Levy 2002).
2.1.3
Problem der begrenzten Therapieoptionen bei Herzinsuffizienz
Die Tatsache, dass es mit Ausnahme der Herztransplantation noch keine etablierte
Therapieoption zum Ersatz des untergegangenen Myokardgewebes für eine solch
große Anzahl an Erkrankten gibt, ist unbefriedigend und fordert dringend zur Suche
nach neuen Therapieansätzen auf. Aktuell beträgt laut statistischem Bundesamt die 5-
Einleitung
6
Jahresmortalitätsrate symptomatischer herzinsuffizienter Patienten 50-70%. Von den
Patienten mit terminaler Herzinsuffizienz sterben auch unter optimaler medikamentöser
Therapie 20-50% pro Jahr (Lloyd-Jones 2002).
Die bislang einzige kurative Therapieoption ist die Herztransplantation, welche jedoch
mangels Spenderorganen nur wenigen Patienten offen steht. So standen im Jahr 2007
laut statistischem Bundesamt in Deutschland 394 Herztransplantationen einer Anzahl
von 707 neu zur Transplantation auf der Warteliste angemeldeten Patienten
gegenüber. Dies bedeutet, dass der Bedarf an Spenderorganen nicht mehr gedeckt
werden kann und pro Jahr eine beträchtliche Anzahl an Patienten, die auf der
Warteliste für ein Organ stehen, verstirbt. Dieser Trend besteht nun schon seit einigen
Jahren und setzt sich weiter fort (Abbildung 1). Aufgrund dieser unbefriedigenden
Situation sucht man nach neuen, alternativen Therapieformen, um die Prognose und
Lebensqualität der betroffenen Patienten zu verbessern. Eine vielversprechende
Möglichkeit könnte der Ersatz geschädigter Kardiomyozyten durch funktionsfähige
Zellen sein. So wurden in den letzten Jahren zahlreiche Studien zur Zellersatztherapie
mit Stammzellen durchgeführt.
Abbildung 1: Zahlen der Herztransplantationen und der Patientenauf der Warteliste
von 1999 bis 2003 (Dtsch Ärzteblatt 2004)
2.2
Stammzellen als Möglichkeit in der Zellersatztherapie
2.2.1
Voraussetzungen für die Zellersatztherapie
Ziel der Zelltherapie ist es, Zellen in ausreichender Menge in eine bestimmte
Myokardregion zu transplantieren und das Überleben sowie die Integration der Zellen
in den bestehenden Zellverband zu gewährleisten. Geeignet für die Zelltherapie wären
demnach leicht zu gewinnende, in ausreichender Menge vermehrbare, multipotente,
Einleitung
7
nicht immunogene Zellen ohne onkogenes Potential. Daher spielen bei der Suche nach
einer geeigneten Zellpopulation für die Zellersatztherapie, vermehrbare, noch nicht
vollständig ausdifferenzierte Vorläufer- oder Stammzellen eine Rolle. Die Frage nach
dem geeigneten Zelltyp ist eine Herausforderung, mit der sich Wissenschaftler schon
längere Zeit beschäftigen. So wird im Folgenden ein kurzer Überblick über die
verschiedenen Arten an Vorläuferzellen mit ihrem jeweiligen Potential für die
Zellersatztherapie gegeben. Anschließend sollen bestehende Lösungsansätze zur
Therapie am geschädigten Herzen mit ihren Vor- und Nachteilen erläutert werden.
2.2.2
Stammzellen - Überblick und Definitionen
Stammzellen sind nicht ausdifferenzierte Zellen. Sie besitzen einerseits die Eigenschaft
in ihrer undifferenzierten Form zu proliferieren oder sich andererseits in verschiedene
spezielle Zelltypen zu differenzieren (Morrison 1997). Die Differenzierung wird von
endogenen und exogenen Signalen, wie genetischen Faktoren, Wachstums- oder
Ernährungsfaktoren, beeinflusst (Renz-Polster 2004). Nach ihrer Herkunft, ihrem
Differenzierungspotential und ihrem ontogenetischen Alter kann man Stamm- oder
Progenitorzellen in frühe toti- oder pluripotente, embryonale Stammzellen einerseits
und in unipotente nicht-embryonale, somatische oder adulte Stammzellen andererseits
einteilen (Murken 2006) (Abbildung 2).
Abbildung 2: Differenzierungspotential von Stammzellen (modifiziert nach Jones,
2006)
Einleitung
8
2.2.2.1 Embryonale Stammzellen
Bis zum Acht-Zell-Stadium menschlicher embryonaler Stammzellen kann man von
Omni- oder Totipotenz ausgehen. In diesem Stadium können sich aus einzelnen Zellen
noch vollständige Lebewesen entwickeln. Die zu Forschungszwecken verwendeten
embryonalen Stammzellen gelten als pluripotent (Abbildung 2). Sie können sich zu
allen Zelltypen des Organismus, also zu Zellen der drei Keimblätter (Ekto-, Endo- und
Mesoderm)
sowie
zu
Keimbahnzellen,
differenzieren.
Unter
speziellen
Kulturbedingungen könnten sie sich beispielsweise zu frühen Kardiomyozyten
entwickeln, um sich dann, nach Transplantation, ins Myokard zu integrieren (Kehat
2004). Embryonale Stammzellen werden aus der inneren Zellmasse der Blastozyste
„überzähliger“ Embryonen, die bei In-vitro-Fertilisationen entstanden sind, oder durch
therapeutisches Klonen gewonnen. Vorteile dieser Zellen sind zweifelsohne ihre
Pluripotenz, ihre hohe Proliferationsrate, ihre Teilbarkeit über viele Passagen sowie
ihre lange Vermehrbarkeit im undifferenzierten Stadium in vitro. So ließe sich eine
unendlich große Anzahl an potentiellen Zellen für die Zellersatztherapie gewinnen
(Theiss 2006).
Nachteile bei der Anwendung embryonaler Stammzellen ergeben sich hauptsächlich jedoch nicht nur - aus ethischen und gesetzlichen Problemen. Die Gewinnung
embryonaler Stammzellen ist in Deutschland durch das Embryonenschutzgesetz
untersagt. Laut Stammzellengesetz dürfen lediglich bereits vorhandene (bis zum
1.1.2002), aus definierten Zelllinien stammende Zellen, zur Forschung verwendet
werden. Des Weiteren müsste die Gefahr einer Teratombildung durch gezielte
Selektion und Gewinnung einer kardialen Reinpopulation verhindert werden (David
2005). Ebenfalls problematisch wäre die Immunogenität dieser Zellen. So wäre eine
Immunsuppression erforderlich (Martin 2005). All diese Schwierigkeiten könnten
zumindest in Deutschland aufgrund derzeitiger Voraussetzungen kaum gelöst werden.
2.2.2.2 Adulte Stammzellen
Adulte Stammzellen gelten als unipotent oder auch determiniert, d.h. sie haben die
Fähigkeit Zelltypen eines speziellen Organs neu zu bilden oder bei Bedarf zu ersetzen
(Abbildung 2). Sie kommen gewebsspezifisch in regenerativen Organsystemen wie
z.B. der Haut, der Leber, der Skelettmuskulatur oder als hämatopoetische
Stammzellen im Knochenmark vor. Hier unterhalten sie einen kontinuierlichen
Zellumsatz zur Regeneration untergegangener Zellen. Das Herz wurde lange Zeit nicht
als regeneratives Organ betrachtet, da lange keine Regeneration von geschädigtem
Myokard durch ortsständige kardiale Stammzellen beobachtet werden konnte. Umso
wichtiger ist es daher, die Erkenntnisse neuer Studien, in denen ein regelhaftes
Einleitung
9
Vorkommen kardialer Stammzellen beschrieben wurde (Beltrami 2003), weiter zu
verfolgen und zu hinterfragen. Könnte man die Existenz solcher Zellen bestätigen,
wäre dies sicher eine Option im Rahmen der Zellersatztherapie. Umstritten ist, ob die
als determiniert geltenden, adulten Stammzellen je nach Umgebungsfaktoren noch ein
weitaus größeres Potential z.B. im Sinne einer Transdifferenzierung, besitzen. So hat
man beispielsweise bei hämatopoetischen Stammzellen aus dem Knochenmark nach
Transplantation in das Herzmuskelgewebe, eine Transdifferenzierung in Myozyten und
Blutgefäße beobachtet (Murry 2004; Orlic 2003; Wagers 2004). Ein Vorteil der adulten
Stammzellen für den therapeutischen Einsatz ist die Möglichkeit der Gewinnung der
Zellen vom Patienten selbst. Dies würde eine autologe Transplantation ohne Risiko
von Abstoßung oder Teratombildung ermöglichen. Weiterhin ist die Gewinnung
gewebsspezifischer Stammzellen ethisch weitaus weniger umstritten als der Einsatz
embryonaler Zellen. Zudem sind adulte Stammzellen in der Zelltherapie bereits
etabliert. So werden sie beispielsweise im Rahmen von Organersatz bei Leukämien
und Lymphomen therapeutisch in der täglichen Praxis eingesetzt. Bisher limitierend im
Unterschied zu embryonalen Stammzellen sind die begrenzte Vermehrbarkeit sowie
das eingeschränkte Differenzierungspotential der adulten Stammzellen.
2.2.3
Rolle der Myoblasten der Skelettmuskulatur in der Zelltherapie
Der Arbeitsgruppe um Menasché gelang es, sog. Satellitenzellen, eine Art
Vorläuferzellen oder Myoblasten der Skelettmuskulatur, aus Biopsien quergestreifter
Muskulatur zu isolieren und in vitro zu expandieren. Operativ oder durch
transepikardiale Injektion wurden diese Zellen, Patienten mit bereits bestehender
ischämischer Kardiomyopathie oder direkt nach einem akuten Myokardinfarkt in das
geschädigte Herzareal transplantiert (Herreros 2003; Menasché 2003; Pagani 2003).
Beim klinischen Einsatz der Skelettmyoblasten als Kardiomyozytenersatz ergab sich
zwar eine leichte Verbesserung der linksventrikulären Ejektionsfraktion (LV-EF) sowie
der Wandmotilität, jedoch erwies sich die fehlende funktionelle Integration dieser Zellen
in das Empfängermyokard aufgrund der fehlenden elektromechanischen Kopplung
zwischen den Zellen als problematisch. Als Folge traten Herzrhythmusstörungen in
Form von ventrikulären Tachykardien auf (Menasché 2005). Im schlimmsten Fall kam
es zum Tod von Patienten, weshalb die Studie abgebrochen werden musste.
2.2.4
Der Einsatz von Knochenmarkstammzellen in der Zelltherapie
Die Gruppe der Knochenmarkstammzellen umfasst mehrere verschiedene Stamm- und
Progenitorzellpopulationen, wie beispielsweise die hämatopoetischen Stammzellen, die
zur Neovaskularisierung beitragen, die endothelialen Progenitorzellen oder die
Einleitung
10
mesenchymalen Stammzellen aus dem Knochenmarkstroma. Zur praktischen
Anwendung
in
mononukleare
der
Zelltherapie
kamen
bisher
Knochenmarkstammzellen,
aber
am
häufigsten
auch
unselektierte
einzelne
selektierte
Zellpopulationen. Im Folgenden wird auf die verschiedenen, bereits angewandten
Zellpopulationen kurz eingegangen.
Endotheliale Progenitorzellen besitzen Studien zufolge die Fähigkeit, in ischämische
Areale des Myokards einzuwandern. Dort differenzieren sie sich in Endothelzellen aus
und tragen so zur Neovaskularisierung bei. Jedoch wurden paradoxerweise bei
Patienten mit KHK weniger und in ihrer Funktion eingeschränkte endotheliale
Progenitorzellen
gefunden.
Dies
stellt
die
therapeutische
Nutzbarkeit
dieser
Zellpopulation in Frage (Hill 2003; Vasa 2001).
Bei mesenchymalen Stammzellen aus dem Knochenmarkstroma wurde in Studien
unter speziellen Kulturbedingungen eine Differenzierung in myozytenähnliche Zellen
beobachtet. Nach Injektion dieser Zellen in Infarktgewebe zeigte sich eine
Funktionsverbesserung sowie eine Verhinderung von Remodelingprozessen (Pittenger
2004). Weitere Vorteile dieser Zellen sind ihre Expandierbarkeit in vitro und ihre
geringe Immunogenität (Pittenger 2004). Problematisch für die praktische Anwendung
der
mesenchymalen
Stammzellen
im
klinischen
Alltag
erscheint
jedoch
ihr
arrhythmogenes Potential. In einer Studie, in der menschliche mesenchymale
Stammzellen mit ventrikulären Myozyten neonataler Ratten kokultiviert wurden, zeigte
sich, dass die Mischung der beiden Zelltypen Arrhythmien hervorrufen kann (Chang
2006). Man nahm an, dass der Reentrymechanismus bei heterogenem Myokard
aufgrund der elektrischen Kopplung unerregbarer mesenchymaler Stammzellen mit
Myozyten erhöht ist (vgl. auch Effekte bei Skelettmyoblasten Kapitel 2.2.3).
In mehreren Studien wurden einer relevanten Anzahl an Patienten nach akutem
Myokardinfarkt zusätzlich zur Akut-PTCA und zur optimalen medikamentösen Therapie
autologe, mononukleare Knochenmarkstammzellen injiziert. In der TOPCARE-AMIStudie beispielsweise wurden insgesamt 59 Patienten mit Knochenmarkstammzellen
behandelt,
davon
wurden
bei
29
Patienten
unselektierte
mononukleare
Knochenmarkstammzellen und bei den restlichen 30 Patienten im Blut zirkulierende
Progenitorzellen appliziert. Im Vergleich zu den elf Kontrollpersonen ohne Zellinjiektion
wurden eine Verbesserung der LV-EF, eine bessere Perfusion des Infarktareals sowie
eine verringerte Infarktgröße beobachtet (Schachinger 2004). Ähnliches wurde in
weiteren Studien mit jeweils ca. zehn Patienten am Menschen (Britten 2003; Kang
2004; Stamm 2003; Strauer 2002) wie auch an Mäusen (Orlic 2003) beobachtet.
Assmus et al. untersuchten den Einfluss der Knochenmarkstammzelltherapie an
Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz und bereits bestehender ischämischer
Einleitung
11
Kardiomyopathie. Sie fanden bei dieser kontrollierten Studie mit über 70 Patienten
lediglich eine messtechnisch kaum relevante Funktionsverbesserung (LV-EF +3%)
nach drei Monaten. Die Methode selbst erscheint als sicher für die Patienten (Assmus
2006).
Da es sich bei Knochenmarkstammzellen um autologe Stammzellen handelt, muss
nicht mit immunologischen Abstoßungsreaktionen gerechnet werden. Die Gewinnung
von Knochenmarkstammzellen ist relativ einfach und bereits etabliert. Diese Zellen
werden entweder durch Knochenmarkpunktion oder durch Apherese aus dem
peripheren Blut gewonnen. Dank ihrer guten Kultivierbarkeit in vitro, konnten
Knochenmarkstammzellen bereits von mehreren Arbeitsgruppen vermehrt und
anschließend intrakoronar (Schachinger 2004; Strauer 2002), transendokardial (Fuchs
2003; Perin 2004) oder transepikardial (Hamano 2001) appliziert werden. Auch gilt das
Verfahren
nach
diesen
ersten
Studien
als
sicher.
Da
es
sich
bei
Knochenmarkstammzellen um eher heterogene Progenitorzellpopulationen handelt,
spricht man ihnen kontraktile und angiogenetische Potenz zu. Wenn man davon
ausgeht,
dass
physiologischerweise
bei
myokardialer
Ischämie
vermehrt
Vorläuferzellen aus dem Knochenmark freigesetzt werden und auch eine erhöhte
Zytokinkonzentration zur Stimulierung dieser Freisetzung vorliegt, scheint eine
künstliche Applikation dieser Knochenmarkstammzellen zur Regeneration des
Myokards nachvollziehbar (Beltrami 2003; Kajstura 2005; Orlic 2003). Betrachtet man
jedoch die bisher vorliegenden Studien, bei denen Knochenmarkstammzellen zum
Einsatz kamen, genauer, so sind die Funktionsverbesserungen gemessen an der LVEF durchgehend gering, mit einer messtechnisch kaum relevanten Größenordnung
zwischen 3-6% oder sogar unverändert bezogen auf die Kontrollgruppen (Assmus
2006; Kuethe 2004). Dies gilt sowohl für die Applikation von Knochenmarkstammzellen
direkt nach dem Infarkt als auch bei chronischer Herzinsuffizienz (Assmus 2006;
Schachinger 2004). Festzuhalten ist, dass sich die Studien bezüglich der Verringerung
der Infarktgröße unterscheiden. Auch konnte bisher in keiner Studie ein signifikanter
Effekt auf linksventrikuläre, enddiastolische Volumina gezeigt werden. Dies lässt
vermuten, dass die Zelltherapie durch Knochenmarkstammzellen einen wesentlich
geringeren Einfluss als erhofft, auf das linksventrikuläre Remodeling nach akutem
Infarkt hat (Muller 2005). Es gibt zudem Hinweise darauf, dass die aus den injizierten
Knochenmarkstammzellen gebildeten Kardiomyozyten nicht den Phänotyp adulter
Myozyten ausbilden, sondern frühen Zellstadien ähneln und mit der Zeit durch
Apoptose untergehen (Dawn 2005). Weiterhin unklar bleibt, ob der eventuelle
Funktionsgewinn wirklich auf die Injektionen der Zellen zurückzuführen ist oder
möglicherweise durch andere Faktoren beeinflusst wird.
Einleitung
2.3
12
Nachweis und Potential herzeigener Stammzellen
2.3.1
Hinweise auf Regenerationsprozesse in humanem Myokard
Nachdem nun schon mehrere verschiedene Zelltypen auf ihre Einsetzbarkeit in der
Zellersatztherapie am Herzen untersucht und diskutiert wurden, ist es bisher noch nicht
gelungen einen geeigneten Zelltyp zu identifizieren. Als weitere Möglichkeit in diesem
Zusammenhang soll nun die Population der herzeigenen Progenitorzellen vorgestellt
werden. Während der letzten Jahrzehnte nahm man an, dass der Verlust von
Kardiomyozyten
irreversibel
sei.
Man
ging
davon
aus,
dass
die
einzige
Kompensationsmöglichkeit des Herzens nach Zellverlust in der Hypertrophie der
verbleibenden Kardiomyozyten bestand. Diese Annahmen basierten seit den 50er
Jahren auf der allgemein akzeptierten Lehrmeinung, dass Kardiomyozyten nach der
Geburt terminaler Differenzierung unterlägen und nicht mehr am Zellzyklus teilnehmen
(Nakamura 2003). Vor kurzem haben jedoch Hinweise auf Myozytenregeneration im
menschlichen Herzen einen Paradigmenwechsel hervorgerufen. Es hat sich nunmehr
die
Lehrmeinung
etabliert,
dass
kontinuierliche
Regenerationsprozesse
im
menschlichen Herzen stattfinden. Demzufolge scheint das Herz kein enddifferenziertes
Organ zu sein und somit eine höhere Regenerationsfähigkeit zu besitzen, als bisher
angenommen wurde (Kajstura 2004) (Abbildung 3).
Abbildung 3: Kardiale Stammzellen in Nischen des Myokards. Nach Aktivierung
können aus diesen Zellen Kardiomyozyten und vaskuläre Strukturen hervorgehen.
(modifiziert nach Anversa, 2006)
In Tiermodellen wie auch am Menschen wurde gezeigt, dass Kardiomyozyten im
adulten Herzen regeneratives Potential besitzen (Beltrami 2001). Besonders die
Einleitung
13
Arbeitsgruppe um Anversa (Valhalla, New York) hat diese neue Lehrmeinung sehr früh
mit Nachdruck verfochten und untersucht. Erste Beweise für regenerative Prozesse im
menschlichen
Herzen
lieferten
Anversa
et
al.,
indem
sie
Y-chromosomale
Empfängermyozyten in einem weiblichen Spenderorgan nach Herztransplantation
nachwiesen (Anversa 2002). Die transplantierten Herzen enthielten offensichtlich aus
dem
männlichen
Organismus
eingewanderte
Zellen
mit
kardiomyozytären
Oberflächenmarkern. Als Ursprungsort dieser neu gebildeten Zellen kommen neben
zirkulierenden Vorläuferzellen in erster Linie herzeigene Progenitorzellen aus den
belassenen Vorhofresten des Empfängers in Betracht (Beltrami 2003). In weiteren
Versuchen zeigten Anversa et al. die Existenz kardialer Stammzellen im Myokard von
Ratten,
Hunden
und
dem
Menschen.
Insbesondere
identifizierten
sie
eine
Zellpopulation, die Markermoleküle von adulten Stammzellen, jedoch nicht von
hämatopoetischen Zellen exprimiert. Sie bezeichneten diese Zellen als „residente
kardiale Stammzellen“ (Anversa 2006).
2.3.2
Charakteristika der residenten kardialen Stammzellen
In Infarktmodellen von Nagern (Laugwitz 2005) und Hunden (Linke 2005) wurde belegt,
dass residente kardiale Stammzellen ein Potential zur Proliferation und zur
Myokardregeneration besitzen. Im Tierversuch wurde die Klonogenität und die
Differenzierung dieser Zellen in kardiale Zelltypen wie Kardiomyozyten, Endothelzellen
und glatte Muskelzellen nachgewiesen (Anversa 2006) (Abbildung 4). Obwohl diese
Ergebnisse Gegenstand kritischer Diskussionen sind, wurde die Grundhypothese
durch die Ergebnisse weiterer Arbeitsgruppen, durch die Beschreibung anderer
Zellpopulationen mit den Eigenschaften adulter kardialer Stammzellen und durch
Methoden zur Isolierung und Expansion kardialer Progenitorzellen gestärkt (Anversa
2002; Beltrami 2003; Hierlihy 2002; Matsuura 2004; Nadal-Ginard 2003; Oh 2003;
Quaini 2002; Urbanek 2003). So wären sicher wichtige Voraussetzungen für die
Anwendung dieser Zellpopulation in der Zelltherapie erfüllt. Die von Anversa et al.
entdeckten
kardialen
Progenitorzellen
trugen
Vorläuferzellmarker,
wie
den
Stammzellwachstumsfaktorrezeptor c-kit, MDR-1, ein Transporterprotein und Sca-1,
ein Stammzellantigen (Abbildung 4). Als zusätzlichen Nachweis der Teilungsfähigkeit
dieser
Zellen
wurde
die
Expression
kardialer
Transkriptionsfaktoren
und
Zytoplasmaproteine wie dem kardialen Myosin nachgewiesen (Abbildung 4).
Hämatopoetische oder Knochenmarkzellmarker wurden auf den betreffenden Zellen
nicht gefunden (Quaini 2002). Da ein Großteil der beschriebenen Befunde am
Tiermodell erhoben wurde, bleibt weiterhin zu klären, ob ähnliche Zellpopulationen
auch im menschlichen Gewebe regelhaft vorkommen und ob sie im Rahmen von
Einleitung
14
Pathologien eine Rolle spielen. Alleine aufgrund ihrer Ortsständigkeit bringen kardiale
Stammzellen optimale Voraussetzungen für den Einsatz in der Zellersatztherapie mit.
Unter allen bisher untersuchten Zellpopulationen wären sie den Kardiomyozyten am
ähnlichsten und könnten problemlos ins Myokard integriert werden. Da sie vom selben
Individuum stammen, müsste man keine Abstoßungsreaktionen befürchten. Wie o.g.
Studien zeigen, haben diese Zellen den Vorteil, sich kardiomyozytär und vaskulär
differenzieren zu können, was eine Voraussetzung für funktionsfähiges Myokard ist.
Weiterhin ist als Voraussetzung für eine klinische Applikation, ihre Isolierbarkeit und
Vermehrbarkeit in Zellkultur gegeben (Beltrami 2003). Dies prädisponiert die
Zellpopulation der residenten kardialen Stammzellen für den Einsatz in der
Zelltherapie. Limitierend könnte die möglicherweise sehr geringe Anzahl an kardialen
Stammzellen sein. Bisher ist noch nicht vollständig geklärt, wie viele dieser Zellen
tatsächlich im Myokard vorkommen und ob sie in ausreichender Zahl vermehrbar
wären. Vorliegende Arbeit soll mithelfen diese Fragen zu klären.
Abbildung
4: Wachstum
und
Differenzierung
kardialer
Stammzellen
(CSC):
Asymmetrische Teilung einer CSC in eine Tochter-CSC und eine kardiale
Tochterprogenitorzelle (CPg). Aus der CPg entstehen Myozytenprogenitorzellen
(MPg), endotheliale Progenitorzellen (EPg) und Progenitorzellen glatter Muskelzellen
Einleitung
15
(SMPg). Progenitorzellen teilen sich vorübergehend und differenzieren sich in reife
Kardiomyozyten, endotheliale Zellen und glatte Muskelzellen. CSCs sind CD34- und
CD45- Zellen, die die Stammzellmarker c-kit, MDR-1 oder Sca-1 exprimieren.
Vorläuferzellen exprimieren Stammzellmarker, Transkriptionsfaktoren, Membran- und
Zytoplasmaproteine, die für Kardiomyozyten, Endothelzellen und glatte Muskelzellen
typisch sind. (modifiziert nach Anversa, 2006)
2.4
Ziele der vorliegenden Arbeit
Zweifelsohne besteht eine Diskrepanz zwischen klinischem Alltag, wo man beobachten
kann, dass geschädigtes Myokard nur unzureichend ersetzt wird, und der neuen These
der kontinuierlichen myokardialen Regenerationsprozesse. Auch wurden bislang viele
Studien in diesem Zusammenhang im Rahmen von Tierversuchen oder lediglich an
sehr kleinen Fallzahlen menschlichen Myokards durchgeführt. Dieser Hintergrund gab
uns Anlass an einem größeren menschlichen Kollektiv Hinweise für kontinuierliche
myokardiale Regenerationsprozesse unter der Beteiligung kardialer Vorläuferzellen zu
finden. So müsste die von Anversa et al. beschriebene Population „residenter kardialer
Stammzellen“ sowohl im gesunden wie auch im geschädigten Herz nachweisbar sein.
Unterschiede in der Anzahl dieser Zellen könnte es unter pathologischen Bedingungen
wie auch in verschiedenen Wachstumsphasen des Organs geben. So wurde Myokard
von herzkranken Patienten und Kindern mit angeborenen Herzfehlern untersucht und
die Ergebnisse mit den Daten von herzgesunden Kontrollpersonen und fetalem
Myokard (Kufer 2009) verglichen.
Folgende Gesichtspunkte waren Ziel unserer Untersuchungen:
•
Bestätigung
des
regelhaften
Vorliegens
kardialer
Progenitorzellen
im
menschlichen Myokard von Patienten mit kardialen Erkrankungen
•
Quantifizierung dieser Zellpopulation zur Abschätzung des natürlichen,
endogenen Regenerationspotentials des menschlichen Herzens
•
Untersuchung verschiedener Einflussfaktoren, die für das Auftreten kardialer
Progenitorzellen von Bedeutung sein könnten, wie klinische Faktoren, kardiale
Pathologien oder demographische Daten
•
Verteilung
der
untersuchten
Zellen
im
Myokard
nach
anatomischen
Gesichtspunkten
•
Beurteilung der Proliferationsaktivität gemessen an der Anzahl Ki-67+
Kardiomyozyten im Myokard herzkranker Patienten
Studienkollektiv und Methoden
16
3
Studienkollektiv und Methoden
3.1
Studienkollektiv
Im Rahmen vorliegender Studie wurden Myokardproben von erwachsenen Patienten
(n=112) mit verschiedenen kardialen Erkrankungen untersucht. Die Proben wurden
nach ihrer Herkunft aus den vier Herzhöhlen rechtes Atrium (RA), linkes Atrium (LA),
rechter Ventrikel (RV) und linker Ventrikel (LV) unterschieden. Da pro Patient meist
Proben mehrerer Herzbereiche untersucht wurden, gingen in die Berechnungen
insgesamt 192 Proben von 112 verschiedenen Patienten ein. Es wurden Proben von
102 Patienten aus dem rechten Atrium, von 26 Patienten aus dem rechten Ventrikel,
von 27 Patienten aus dem linken Atrium und von 37 verschiedenen Patienten aus dem
linken Ventrikel untersucht. Zudem wurden Myokardproben von Kindern mit
angeborenen Herzfehlern (n=12) untersucht. Zum Vergleich wurden die Daten von
herzgesunden Kontrollpersonen (n=43), die an einer nicht kardialen Ursache
verstorben waren, sowie die Daten aus fetalem Myokard (n=35) herangezogen (Kufer
2009). Zur Erfassung klinischer und epidemiologischer Daten des Patientenkollektivs
wurden Befunde aus deren Krankenakten erhoben, um diese mit den histologischen
Ergebnissen zu korrelieren.
3.2
Methoden
Wir wählten immunhistochemische Verfahren für unsere Untersuchungen. In
Anlehnung an die Definition „residenter kardialer Stammzellen“ durch Anversa et al.
untersuchten wir das Myokard in einer Dreifachfärbung auf Zellen mit positivem
Nachweis für c-kit und fehlender Anfärbung für CD34 und CD45 zum Ausschluss
endothelialen bzw. hämatopoetischen Ursprungs. Diese c-kit+CD34-CD45- Zellen
werteten wir als potentielle kardiale Progenitorzellen. Zur groben Abschätzung der
proliferativen Aktivität des Myokards untersuchten wir die Proben zusätzlich auf
Kardiomyozyten mit Expression des Proliferationsmarkers Ki-67. In diese Ergebnisse
gingen nur gefärbte Zellen mit der Morphologie von Kardiomyozyten ein, um
proliferierende Zellen anderer Herkunft auszuschließen.
3.2.1
Untersuchte Antigene und verwendete Antikörper
In vorliegender Studie wurden poly- und monoklonale Antikörper der Maus und der
Ratte der Immunglobulinklasse IgG benutzt. Vor Beginn der Färbungen wurde für
jeden der verwendeten Antikörper dessen optimale Verdünnung, seine günstigste
Antigendemaskierungsmethode und das geeignete Detektionssystem bestimmt sowie
Studienkollektiv und Methoden
17
die Notwendigkeit einer Gegenfärbung geprüft. Antikörper werden von B-Lymphozyten
(Plasmazellen) als Antwort auf den Kontakt mit einem Antigen gebildet. Sie bilden mit
Antigenen sowohl im Körper als auch unter Laborbedingungen Immunkomplexe. Man
bezeichnet die molekularen Strukturen eines Antigens, die von Antikörpern erkannt
werden können, als antigene Determinanten oder Epitope. Während polyklonale
Antikörper von verschiedenen Plasmazelllinien produziert werden und aufgrund ihrer
Heterogenität mit verschiedenen Epitopen eines Antigens reagieren, werden
monoklonale Antikörper von nur einer bestimmten Plasmazelllinie (Klon) gebildet und
binden nur ein bestimmtes Epitop des Antigens. Im Folgenden werden Antigene und
die verwendeten Antikörper für die Immunreaktionen und deren Verwendungsziel
vorgestellt.
Tabelle 1: Antikörper und Inkubationsbedingungen
Antigen
Antikörper (Hersteller)
Verdün
-nung
Inkubationszeit
Detektionsmethode
Ki-67
Maus anti-Mensch IgG,
monoklonal (DAKO)
1:150
15 min
CSA-System
c-kit
Kaninchen anti-Mensch
IgG, polyklonal (DAKO)
1:500
30 min
EnVisionDoublestain
System
CD45
Maus anti-Mensch IgG,
monoklonal (DAKO)
1:100
10 min
EnVisionDoublestain
System
CD34
Maus anti-Mensch IgG,
monoklonal (DAKO)
1:50
10 min
EnVisionDoublestain
System
3.2.1.1 Antigen Ki-67
Das Antigen Ki-67 kann als Marker für proliferierende Zellen dienen (Gerdes 1984). Es
ist ein zellkernständiges Protein (Gerdes 1983) mit einem Molekulargewicht von
345kDa (Gerdes 1991). Seine Expression ist zellzyklusabhängig und streng an die
Zellreplikation gebunden. Experimente zeigten, dass Ki-67 nur in aktiven Phasen, d.h.
in der S-, G2-, M- und teilweise in der G1-Phase des Zellzyklus exprimiert wird. In
ruhenden Zellen, die sich nicht teilen oder in der G0-Phase befinden, kommt Ki-67
hingegen konstant nicht vor (Gerdes 1984). Zur Detektion des Antigens Ki-67 wurden
monoklonale Antikörper der IgG1 Subklasse (Ki-67/MIB1) verwendet. Diese Antikörper
sind gegen rekombinante Anteile des Ki-67 Antigens hergestellt und binden spezifisch
an das Ki-67 Antigen in Schnitten von formalinfixiertem und paraffineingebettetem
Gewebe (Cattoretti 1992). Proliferierende Zellen fallen folglich durch eine starke
Kernfärbung auf, während an ruhenden Zellen keine Reaktion zu beobachten ist
Studienkollektiv und Methoden
18
(Abbildung 5) (Cattoretti 1992). Dies ermöglicht eine Aussage über die Anzahl der sich
in der Zellteilung befindlichen Zellen eines Gewebes.
Abbildung 5: Kardiomyozyten mit positiver Kernfärbung des Antigens Ki-67 (braun)
A: Myokard im Längsschnitt mit einem Ki-67+ Kardiomyozyten (Pfeil; Balken 50µm)
B: Myokard im Querschnitt mit zwei Ki-67+ Kardiomyozyten (Pfeile; Balken 50µm)
3.2.1.2 Antigen c-kit
C-kit oder CD117 ist der Rezeptor des Stammzellenwachstumsfaktors (SCF). Als
Transmembranrezeptor der Rezeptortyrosinkinase-Familie III ist c-kit auf der
Oberfläche von Zellen lokalisiert (Catlett 1991). Er hat ein Molekulargewicht von
145kDa und ist durch das c-kit Proto-Onkogen auf Chromosom 4 des Menschen
kodiert (Catlett 1991). Strukturell ist c-kit mit dem Makrophagenwachstumsfaktor (CSF1) und dem plättchenabgeleiteten Wachstumsfaktorrezeptor verwandt (Yarden 1987).
Wie auch andere Arbeitsgruppen (Beltrami 2003; Fazel 2006) benutzen wir c-kit als
Marker für Stammzellen im menschlichen Myokard. C-kit wird von kardialen
Stammzellen, aber auch von anderen Zellarten, wie z.B. hämatopoetischen
Stammzellen, Melanozyten, Basalzellen der Haut, Mastzellen, Keimzellen, Cajal-Zellen
und Gangepithelien der Mamma, exprimiert (Tsuura 1994). Deshalb spielt der
Antikörper gegen c-kit auch bei der Identifizierung bestimmter Krebsformen, die c-kit
exprimieren, eine Rolle, wie z.B. bei gastrointestinalen Stromatumoren, kleinzelligen
Bronchialkarziomen, Mastzellenerkrankungen und Leukämien (van Oosterom 2001).
Normalerweise befindet sich c-kit in einem inaktiven Zustand. Seine Aktivierung erfolgt
durch den Liganden stem cell factor (SCF) und führt über verschiedene Signalwege zu
Zellproliferation, Zelldifferenzierung und Zellüberleben. Zur Detektion von c-kit wurden
polyklonale
Antikörper
verwendet.
Vom
Antikörper
markierte
Zellen
zeigen
Studienkollektiv und Methoden
hauptsächlich
eine
Anfärbung
19
der
Zellmembran,
jedoch
kann
eine
leichte
zytoplasmatische Färbung ebenfalls auftreten (Abbildung 6).
Abbildung 6: Zellen mit positiver Oberflächenfärbung für c-kit (braun) sowie zahlreiche
Zellen mit positiver Oberflächenfärbung für CD34 und/oder CD45 (rot); Balken 50µm
A: Myokard im Längsschnitt mit einer c-kit+ Zelle (Pfeil); rechts oben vergrößert:
Anfärbung der Zellmembran mit leichter Zytoplasmafärbung
B: Myokard im Längsschnitt mit vielen CD34+/CD45+ Zellen (rot) sowie einer c-kit+
Zelle (braun) direkt neben einer CD34/CD45+ Zelle (Pfeil; rechts oben vergrößert: hier
keine Zytoplasmafärbung der c-kit+ Zelle)
3.2.1.3 Antigen CD45
CD45 oder Leukocyte Common Antigen ist ein Transmembran-Glykoprotein. Es kommt
daher auf der Oberfläche von Zellen vor. Es wird von einem Gen auf Chromosom 1
kodiert und erscheint je nach Art der Leukozyten in verschiedenen Isoformen (180220kDa) (Kurtin 1985). Das intrazelluläre Segment mit Tyrosinphosphatase-Aktivität ist
bei allen Isoformen gleich (Rothstein 1992). CD45 wird auf den meisten kernhaltigen
Zellen hämatopoetischen Ursprungs, wie T-Zellen, B-Zellen, Monozyten, dendritischen
Zellen und Granulozyten exprimiert. Daher markiert der Antikörper gegen CD45
verschiedene Lymphozyten, lymphoide Zellen aus dem Knochenmark, Mastzellen und
Monozyten. Routinemäßig wird Anti-CD45 zur Identifikation neoplastischer Zellen
lymphoider Herkunft, wie Non-Hodgkin- oder B-Zell-Lymphomen verwendet (Kurtin
1985). Zur Detektion von CD45 wurden monoklonale Antikörper, die mit allen CD45Isotypen reagieren, verwendet. Das zelluläre Färbemuster von Anti-CD45 besteht
vornehmlich in einer Zellmembranmarkierung, jedoch kann auch eine leichte
zytoplasmatische Färbung auftreten (Abbildung 6). Da in der vorliegenden Studie nach
herzeigenen Progenitorzellen gesucht wurde, diente CD45 als Ausschlusskriterium.
Studienkollektiv und Methoden
20
Berücksichtigt wurden lediglich CD45- Zellen, um alle Zellen hämatopoetischen
Ursprungs darunter auch Mastzellen und lymphoide Zellen auszuschließen.
3.2.1.4 Antigen CD34
CD34 ist ein Transmembranprotein und kommt auf der Oberfläche von Zellen vor. Es
hat ein Molekulargewicht von 115kDa. CD34 wird auf kapillären Endothelzellen,
unreifen hämatopoetischen Vorläuferzellen, embryonalen Fibroblasten und auf
Gliazellen des Nervengewebes exprimiert (Krause 1996). Da CD34, anders als CD45,
nur in den frühesten Stadien der lymphohämatopoetischen Vorläuferzellen exprimiert
wird, gilt es auch als stadienspezifisches Antigen der Leukozytendifferenzierung (Civin
1990). Daher wird der Antikörper gegen CD34 routinemäßig zur Quantifizierung
lymphohämatopoetischer Stammzellen, zur Identifikation vaskulärer und lymphatischer
Tumoren sowie für die Klassifikation von Leukämien verwendet (Campos 1989). Man
unterscheidet bei den monoklonalen Antikörpern gegen CD34 die Klassen I-III, je nach
Empfindlichkeit der CD34-Epitope auf den Abbau durch unterschiedliche Enzyme. Zur
Detektion von CD34 wurde ein monoklonaler Antikörper der Klasse II verwendet,
welcher Endothelzellen von Kapillaren spezifisch markiert (Fina 1990). Die durch den
Antikörper markierten Zellen erscheinen auf ihrer Zelloberfläche gefärbt (Abbildung 6).
In vorliegender Studie diente CD34 als Ausschlusskriterium bei der Suche nach
kardialen Vorläuferzellen, da eine Verwechslung mit Endothelzellen sowie unreifen
hämatopoetischen Zellen ausgeschlossen werden sollte.
3.2.2
Das
Anfertigung der Präparate
Myokardgewebe
wurde
nach
seiner
Entnahme
in
4%ig
gepufferter
Formaldehydlösung (Merck, Darmstadt) fixiert, um Autolyse zu verhindern und die
Antigenizität
zu
erhalten.
Die
Gewebefixation
in
Formalin
erfolgte
durch
Proteinquervernetzungen. Zunächst wurde das Gewebe in einer aufsteigenden
Isopropanolreihe (Merck, Darmstadt) bei Raumtemperatur dehydriert. Anschließend
wurden die Proben bei 60°C zunächst von einem Isopropanol-Paraffingemisch und
anschließend von Paraffin (Merck, Darmstadt) verschiedener Reinheitsgrade infiltriert.
Dann wurde das Gewebe in Paraffinblöcke gegossen. Paraffin und Paraffingemische
hatten jeweils eine konstante Temperatur von knapp unter 60°C, um eine
Antigendenaturierung zu vermeiden. Am Mikrotom (Microm, Walldorf) wurden, nach
dem Anfräsen der Paraffinblöcke, Dünnschnitte von 4µm Dicke angefertigt. Die
Schnitte wurden im Paraffin-Streckbad (Microm, Walldorf) (40°C) auf silanbeschichtete
Objektträger (Menzel, Braunschweig) aufgezogen, um Schrumpfartefakte sowie ein
späteres Abschwimmen während der Mikrowellenvorbehandlung zu vermeiden. Da
Studienkollektiv und Methoden
21
jede Färbung an mindestens zwei Schnitten ausgeführt und weitere Schnitte als
Reserve- und Testschnitte benötigt wurden, fertigten wir pro Paraffinblock 4-10
Schnitte an. Auf jeden Objektträger wurden jeweils zwei Schnitte platziert. Die Schnitte
wurden bei ca. 60°C für 30 Minuten getrocknet. Durch das Schmelzen des
Einbettmediums kam es zu einer besseren Adhäsion zwischen Gewebe und
Objektträger. Um das Paraffin von Objektträger und Gewebe zu entfernen und somit
unspezifische Färbungen zu verhindern, wurden die Schnitte in Xylol bzw. Roti-Histol
(Roth, Karlsruhe) eingebracht und in einer absteigenden Alkoholreihe rehydriert.
Abschließend wurden die Schnitte in TBS-T-Puffer (pH 7,4) gespült. Da es durch die
Aldehydvernetzungen bei der Formalinfixation und durch Proteinstrukturveränderungen
bei der Paraffineinbettung zum Verlust der Bindungsfähigkeit antigener Epitope mit
bestimmten Antikörpern kommen kann, ist eine Antigendemaskierung notwendig. Es
wurde die Methode der Hitzedemaskierung mittels Mikrowellenvorbehandlung in
EDTA-Puffer (pH 9,0) gewählt.
EDTA-Puffer: 0,372g EDTA (Roth, Karlsruhe) wurden in 1l Aqua dest. gelöst und der
pH auf 9,0 mit NaOH (Roth, Kalsruhe) eingestellt.
10xTBS Puffer: 121g Tris-Base (Roth, Karlsruhe) und 180g NaCl (Roth, Karlsruhe)
wurden in 1800ml Aqua dest. gelöst, der pH auf 7,4 mit 37%iger (rauchender)
Salzsäure (Merck, Darmstadt) eingestellt und mit Aqua dest. auf 2l aufgeffüllt.
TBS-T Puffer: 2ml Tween-20 (Merck, Darmstadt) wurden in 2l 1xTBS (9xAqua
dest.+1x10xTBS) gelöst; Konzentration: 154mM NaCl, 50mM Tris
3.2.3
Grundlagen der immunhistochemischen Methode
Die Grundlage der Immunhistochemie ist die Antigen-Antikörper-Reaktion. Man nutzt
die Spezifität von Antikörpern, mit bestimmten Antigenen in vivo oder unter
Laborbedingungen Immunkomplexe zu bilden, um dann die Verteilung der Präzipitate
mittels verschiedener Verstärkungs- und Färbetechniken am histologischen Schnitt
sichtbar zu machen. Sowohl in der Forschung wie auch in der pathologischen
Routinediagnostik
bestimmter
wird
Zelltypen,
die
Immunhistochemie
Zellstrukturen
oder
zur
spezifischen
Zellprodukte
Identifizierung
angewandt.
Je
nach
Lokalisation des Antigens unterscheidet man verschiedene, immunhistochemische
Reaktionsmuster
eines
Antikörpers.
Beim
zytoplasmatischen
Reaktionsmuster
befinden sich Antigen und Farbreaktion nur im Zytoplasma der Zellen. Der Zellkern
bleibt negativ (z.B. Intermediärfilamente, Aktin, Zytokeratin, Troponin). Beim nukleären
Studienkollektiv und Methoden
22
Reaktionsmuster wie beispielsweise bei Ki-67 hingegen befinden sich Antigen und
Farbreaktion im Zellkern (Abbildung 5). Die weiteren untersuchten Antigene c-kit, CD45
und CD34 wiederum zeigen ein membranständiges Reaktionsmuster mit einer oftmals
netzartigen Anfärbung der äußeren Zellmembran (Abbildung 6). Jedoch kommt es
häufig auch zu Kombinationsformen der Reaktionsmuster. So reagiert beispielsweise
bei den Antikörpern c-kit, CD45 und CD34 häufig das Zytoplasma schwach mit.
Die erste praktische Anwendung von Antikörpern auf paraffineingebettetem Gewebe
wurde 1968 als Peroxidasegekoppelte-Antikörper-Methode (PAP) eingeführt (Nakane
1968). 1981 tauchte eine neue Generation immunhistochemischer Methoden, die
Avidin-Biotin-Komplex-Methode (ABC) auf, welche heute stark verbreitet ist. Sie stellt
eine Weiterentwicklung der PAP-Methode dar (Hsu 1981). Diese Methode wurde für
die Einfachfärbungen im CSA-System (catalyzed signal amplification) (DAKO,
Hamburg) benutzt. Da seit der routinemäßigen Nutzung der Immunhistochemie bald
die Notwendigkeit der Detektion mehrerer verschiedener Antigene, teilweise der
gleichen Spezies in einem Gewebeschnitt aufkam, steht als derzeit neueste Methode,
ein Färbesystem für Mehrfachfärbungen, das zusätzlich Signale mittels Thyramin
verstärkt, zur Verfügung (Toth 2007). In vorliegender Studie wurde das Polymersystem
EnVisionDoublestain System (DAKO, Hamburg) benutzt.
3.2.4
Durchführung der immunhistochemischen Färbungen
Die Antigen-Antikörper-Reaktion wird durch spezielle, an den Antikörper gekoppelte
Farbstoffe sichtbar gemacht. Man unterscheidet die direkte und die indirekte Methode.
Während der spezifische Antikörper bei der direkten Methode bereits enzym-, isotopoder farbstoffgekoppelt ist und ein zugefügtes Substrat den Immunkomplex aus
gekoppeltem Antikörper und gesuchtem Antigen sofort färbt, werden bei der indirekten
Methode unkonjugierte Primärantikörper verwendet. Hierbei ist die zusätzliche Zugabe
eines enzymkonjugierten Sekundärantikörpers, der den Primärantikörper erkennt, für
die Detektion des Immunkomplexes nach Substratzugabe nötig. Als konjugierende
Enzyme wurden Meerrettichperoxidase (HRP) und alkalische Phosphatase (AP)
verwendet. Bei beiden Methoden werden die entstehenden Antigen-AntikörperKomplexe lichtmikroskopisch durch Enzym-Chromogenreaktionen sichtbar gemacht.
Wir verwendeten ausschließlich die indirekte Methode, da sie zu stärkeren
Färbeergebnissen bei geringen Antigenmengen führt. Durch die Inkubation der
Schnitte in feuchten Kammern, wurde ein Verdunsten der Reaktionsflüssigkeit und
somit eine unspezifische Färbung verhindert. Gewaschen wurde mit TBS-T-Puffer. Zur
Fixierung wurden die Proben am Ende der Färbung mit Deckgläsern (Menzel,
Braunschweig) und wässrigem Fixiermedium (Merck, Darmstadt) eingedeckt. Um eine
Studienkollektiv und Methoden
23
falsch positive Färbereaktion durch die Aktivität endogener Peroxidase zu verhindern,
wurden endogene Enzyme im Gewebe vor dem eigentlichen, immunhistochemischen
Nachweis
blockiert.
Endogene
Peroxidase
kommt
z.B.
in
Hämoglobin
von
Erythrozyten, in Myoglobin, in eosinophilen Zellen und in Mastzellen vor (Escribano
1987). Ob die Chromogensubstratreaktion von der antigenunabhängigen, endogenen
Peroxidase oder der zugegebenen Peroxidase des Detektionssystems, die spezifisch
an antikörpermarkierten Stellen reagiert, katalysiert wird, kann später nicht mehr
unterschieden werden. So wurde die endogene Peroxidase der Präparate zunächst mit
Wasserstoffperoxid (Peroxidase-Block) blockiert. Ungefärbte Erythrozyten dienten als
Kontrolle für eine erfolgreiche Blockierung. Beim Doublestainsystem war es zusätzlich
notwendig, die endogene alkalische Phosphatase mit Hilfe des dualen endogenen
Enzymblocks zu blockieren, da hier für die Visualisierung des zweiten Antigens
alkalische Phosphatase zum Einsatz kam. Beim CSA-System wurden unspezifische
Bindungen der Reagenzien an Gewebeproteine mit Protein-Block (serumfreiem
Protein) unterdrückt. Hierbei wurden elektrostatische Ladungen der Proteine, die
unspezifische Bindungsstellen für Antikörper darstellen, im Gewebe abgesättigt.
3.2.4.1 Immunhistochemische Visualisierung von Ki-67
Für die Nachweise von Ki-67 verwendeten wir das CSA-System (DAKO, Hamburg).
Dieses Signalamplifikationssystem basiert auf der Streptavidin-Biotin-Komplex-(ABC)Methode, wodurch der Nachweis von sehr kleinen Mengen an Zielantigen gelingt
(Bobrow 1989). Die ABC-Methode beruht auf der starken Affinität von Avidin zu Biotin,
was letztendlich die spezifische, peroxidasevermittelte Farbreaktion an Stellen des
Antigens im Gewebe möglich macht. Anstelle des aus Hühnereiweiß gewonnenen
Avidin (68kDa), wurde das aus dem Bakterium Streptomyces avidinii isolierte
Streptavidin verwendet, da dieses weniger unspezifische Bindungen eingeht. Beide
Moleküle besitzen jeweils vier Bindestellen für das wasserlösliche Vitamin Biotin. Das
verwendete Enzym war HRP, also eine Peroxidase, die aus den Wurzeln von
Meerrettich stammt (40kDa) (Key 2006).
Folgende Arbeitsschritte wurden durchgeführt: Zunächst wurden die Proben mit dem
für das nachzuweisende Antigen spezifischen Primärantikörper (Maus-anti-Human Ki67)
inkubiert,
welcher
anschließend
mit
dem
passenden,
biotinylierten
Sekundärantikörper (Kaninchen-anti-Maus Immunglobulin) markiert wurde (Abbildung
7). Biotin lässt sich gut an den Brückenantikörper koppeln und stellt in den folgenden
Färbeschritten die Verbindung zum ABC-Komplex her. Bei diesem, vor Beginn der
Färbung hergestelltem Enzymkomplex, ist HRP über Biotin an Streptavidin gekoppelt.
Der Komplex besteht also aus Streptavidin, Biotin und HRP. Nach seiner Zugabe lagert
Studienkollektiv und Methoden
24
sich der Komplex über die vierte, noch freie Biotinbindestelle des Streptavidins, an ein
Biotinmolekül
des
Primärantikörper
Sekundärantikörpers
wird
also
über
an
den
(Abbildung
7).
Ein
einzelner
Sekundärantikorper
mit
mehreren
Peroxidasemolekülen verbunden. Dies steigert die Sensitivität verglichen mit direkten
Antigennachweismethoden um ein Vielfaches. Im nächsten Schritt erfolgte eine
Tyramin katalysierte Signalverstärkung durch Amplifikation der Biotinmoleküle, indem
Biotinyltyramid und Wasserstoffperoxid zugegeben wurden (Gross 1959). Diese
Biotinsignale
sind
wiederum
zusätzliche
Angriffspunkte
für
die
nachfolgend
zugegebene, streptavidingekoppelte Peroxidase (Adams 1992). Abschließend kommt
es zur Farbreaktion, indem die Peroxidase mit Wasserstoffperoxid als Katalysator und
dem Chromogensubstrat 3,3-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) ein braunes
Endprodukt an der Stelle des Antigens bildet. Weitere Angaben zu Färbeschritten und
den verwendeten Substanzen finden sich im Färbeprotokoll 1 (siehe Anhang).
Abbildung 7: Prinzip der ABC-Methode (modifiziert nach DAKO, 2004)
3.2.4.2 Immunhistochemische Mehrfachfärbungen zur Visualisierung von
c-kit, CD34 und CD45
Für den Nachweis c-kit+CD34-CD45- Zellen in einem Präparat benutzten wir ein
Detektionssystem (EnVision G/2 Doublestain System, DAKO), welches mehrere
Antigene in geringer Konzentration gleichzeitig und verschieden markieren kann.
Verfahrensprinzip des Systems ist eine sequentielle Doppelfärbung, bei der das erste
Antigen mittels Peroxidase (HRP) und dem zugehörigen Chromogen (DAB) braun,
sowie das zweite Antigen mit alkalischer Phosphatase und Permanent Red als
Chromogen
rot
gefärbt
Dextranpolymersystem
wird.
(EnVision),
Diese
neue
welches
Methode
bereits
basiert
vielfach
auf
antikörper-
einem
und
enzymkonjugiert ist (Abbildung 8). Es kommt bei diesem polymerbasierenden, also
Studienkollektiv und Methoden
25
biotinfreien System, nicht zu unspezifischen Färbungen aufgrund endogener AvidinBiotin-Aktivität.
Folgende Arbeitsschritte wurden durchgeführt: Nach der Blockierung endogener
Enzyme und der Inkubation des Primärantikörpers c-kit wurden die AntigenAntikörperkomplexe der Probe an ein HRP- und Sekundärantikörper- konjugiertes
Dextranpolymer gekoppelt. Die Bindung des Primärantikörpers am Polymer erfolgte
über den passenden (Kaninchen-anti-Kaninchen) Sekundärantikörper (Abbildung 8).
Diese Reaktion wurde mit Hilfe der Chromogenlösung DAB visualisiert. Das
Reaktionsprodukt war braun. Vor der Inkubation mit den zweiten Primärantikörpern,
CD34 und CD45, wurden die Proben mittels Doublestain Block Reagenz blockiert. Die
Immunkomplexe aus Gewebsantigen CD34 und CD45 mit den jeweils entsprechenden
Primärantikörpern wurden wiederum an ein Dextranpolymer gekoppelt. Die Bindung
erfolgte ebenfalls über einen passenden (Kaninchen-anti-Maus) Sekundärantikörper,
der an das Polymer konjugiert war. Anders als bei der ersten Reaktion war dieses
Polymer nicht enzymgekoppelt. So musste ein zweites mit alkalischer Phosphatase
und geeigneten Immunglobulinen konjugiertes Dextranpolymer zugegeben werden.
Visualisiert
wurden
die
Bindungsstellen
der
zweiten
Antikörper
durch
die
phosphatasekatalysierte Reaktion mit der Permanent-Red-Chromogenlösung. Das
Endprodukt dieser Reaktion erschien rot. Weitere Angaben zu Färbeschritten und den
verwendeten Substanzen finden sich im Färbeprotokoll 2 (siehe Anhang).
Abbildung 8: Prinzip der Polymermethode (modifiziert nach DAKO, 2004)
Studienkollektiv und Methoden
3.2.5
26
Qualitätskontrolle
Als Kontrollen wurde pro Objektträger ein zweiter Schnitt mitgeführt, der anstelle des
Primärantikörpers mit Antibody Diluent inkubiert wurde. Durch den direkten
mikroskopischen
Vergleich
von
Kontrolle
und
Probe
konnten
unspezifische
Immunreaktionen und Hintergrundartefakte erkannt werden. Ausgewertet wurden nur
Proben, deren Negativkontrolle völlig ungefärbt war (Abbildung 9) und somit keine
unspezifische Reaktion des Primärantikörpers oder des Detektionssystems mit dem
Gewebe aufwies. Um sicherzustellen, dass die Reagenzien richtig funktionieren,
verglichen wir unsere Färbeergebnisse mit Bildern von Testfärbungen aus der
Literatur.
Abbildung 9: Kontrollschnitt ohne Zugabe von Antikörpern zum Ausschluss
unspezifischer Färbungen (Balken 50µm)
3.2.6
Lichtmikroskopische Auswertung der Färbungen
3.2.6.1 Prinzip des Verfahrens
Die Auswertung der immunhistochemisch gefärbten Präparate erfolgte mit einem
Mikroskop (Olympus, Japan) bei 400-facher Vergrößerung (40x Objektiv-, 10x
Okularvergrößerung) im konventionellen Durchlichtverfahren ohne Kenntnis klinischer
oder epidemiologischer Begleitdaten. Stellen des gesuchten Antigens erschienen im
Gewebe je nach Art des Chromogens nach der immunhistochemischen Reaktion braun
bzw. rot gefärbt. Zellen und Zellbestandteile, die kein Antigen enthielten stellten sich
ungefärbt dar. Pro Schnitt wurde die mikroskopische Analyse in 10 beliebigen, zufällig
ausgewählten, verschiedenen und nicht überlappenden Arealen der angefärbten
Präparate durchgeführt. Die untersuchten Areale waren immer 316x249µm groß. Je
Areal wurde die Anzahl der gezählten, also antigentragenden und somit gefärbten
Zellen in Auswerttabellen dokumentiert und die Gesamtzellzahl der 10 Felder addiert.
Da von allen Proben je zwei Schnitte untersucht wurden, ging in die statistischen
Studienkollektiv und Methoden
27
Berechnungen die Summe der Zellzahlen bezogen auf eine Fläche von insgesamt 20
Gesichtsfelder (20x316x249µm) ein. Alle Areale mit antigenpositiven Zellen und andere
interessante Regionen wurden photodokumentiert (Kamera: Nikon, Düsseldorf;
Software: Lucia measurement, Prag) und gespeichert. Zur Verbesserung der
Reliabilität wurden die Präparate von jeweils zwei Untersuchern auf gefärbte Zellen an
zwei Schnitten je Probe in insgesamt 20 verschiedenen Gesichtsfeldern begutachtet.
3.2.6.2 Auswertung der Einfachfärbungen mit Ki-67
Im Fall von Ki-67 wurde die Wachstumsfraktion im Myokardgewebe durch Auszählen
der Kardiomyozyten mit positiver Kernfärbung ermittelt. In die Ergebnisse gingen nur
gefärbte Zellen mit der Morphologie von Kardiomyozyten ein (Abbildung 10). Dadurch
wurden andere Zelltypen wie etwa Blut- oder Mastzellen, die möglicherweise ebenfalls
Ki-67 exprimierten, ausgeschlossen. Zur Auswertung wurden willkürlich gewählte,
unterschiedliche Areale im Myokard herangezogen. Es wurde streng darauf geachtet,
weder Zellen in der Nähe von Blutgefäßen, noch Zellen im Bindegewebe oder an
sonstigen Stellen außerhalb des Myokards als positiv zu werten.
Abbildung 10: Darstellung von Kardiomyozyten mit positiver Kernfärbung des
Antigens
Ki-67
(braun)
in
Paraffinschnitten
in
humanem
Myokard
mittels
Einfachfärbung
A: Myokard im Längsschnitt mit einem Ki-67+ Kardiomyozyten (Pfeil; Balken 50µm)
sowie einer Ki-67+ Zelle im Interstitium (Pfeilspitze)
B: Myokard im Längsschnitt mit zwei Ki-67+ Kardiomyozyten; die nukleäre Färbung
liegt hier jeweils im Myokard (Pfeile; Balken 50µm)
Studienkollektiv und Methoden
28
3.2.6.3 Auswertungen der Mehrfachfärbungen mit c-kit, CD34 und CD45
Voraussetzung
für
ein
positives
Ergebnis
bei
der
Auswertung
des
immunhistochemischen Nachweises von c-kit+ und CD34/45- Zellen war eine braune
Anfärbung der Zellmembran durch das Chromogen DAB ohne zusätzliche rote
Farbkomponenten, welche durch die CD34/45-Färbung mit Permanent Red entstanden
sind (Abbildung 11). Auch hier wurden zur Auswertung willkürlich gewählte,
unterschiedliche Areale herangezogen.
Abbildung 11: Darstellung von Zellen mit den Oberflächenmarkern c-kit (braun), CD34
und
CD45
(rot)
in
Paraffinschnitten
in
humanem
Myokard
mittels
immunhistochemischer Mehrfachfärbung; Balken 50µm
A: Myokard im Längsschnitt mit zwei c-kit+CD34-CD45- Zellen (Pfeile), vielen
CD34+/CD45+ Zellen (rot) und einer c-kit+CD34/CD45+ Zelle (Pfeilspitze)
B: Myokard im Querschnitt mit einer c-kit+CD34-CD45- Zellen (Pfeil), vielen
CD34+/CD45+ Zellen (rot) und dem Anschnitt einer größeren Kapillare (links unten)
3.3
Statistische Auswertung
Zunächst wurden die Befunde aus den Krankenjournalen erhoben und zusammen mit
den Ergebnissen der immunhistochemischen Färbungen gespeichert. Anschließend
wurden alle Daten für die statistischen Berechnungen in eine Datenbank des
Statistikprogramms SPSS 13.0 übertragen und ausgewertet.
Metrische Variablen wurden zunächst durch die Angabe von Mittelwert und
Standardabweichung charakterisiert und deskriptiv dargestellt. Als Streuungsmaß
diente die Spannweite (Maximum-Minimum). Zur Ermittlung der Verteilung von Werten
innerhalb einer Gruppe wurde der Test auf Normalverteilung nach KolmogorovSmirnov verwendet. Da sich hierbei zeigt, dass die Messwerte der einzelnen Variablen
Studienkollektiv und Methoden
29
zum größten Teil keiner Normalverteilung folgten, wurden für alle Auswertungen nichtparametrische Verfahren gewählt. Statistische Unterschiede wurden mit Hilfe des UTests nach Mann und Whitney bei unverbundenen Stichproben und mittels WilcoxonVorzeichen-Rangsummentest
bei
verbundenen
Stichproben
berechnet.
Das
Signifikanzniveau wurde mit 0,05 definiert, so dass ein Test bei p<0,05 als statistisch
signifikant bezeichnet wurde. Da die Bestimmung der Zellzahlen pro Herzbereich eines
Patienten in je zwei unabhängigen Schnitten erfolgte und je Schnitt 10 Gesichtsfelder
mit einer Fläche von 316x249µm analysiert wurden, ging in die Auswertung die
Gesamtzellzahl der 20 analysierten Gesichtsfelder bezogen auf die untersuchte Fläche
ein. Für jeden Herzbereich eines Patienten wurde also eine bestimmte Zellzahl pro
Gewebefläche angegeben.
3.4
Materialien
Englische Bezeichnungen sind kursiv gedruckt.
Färbekits
EnVision TM G/2 Doublestain System, Rabbit/Mouse
Dako, Hamburg
(DAB+/Permanent Red)
Catalyzed Signal Amplification (CSA) System
Dako, Hamburg
Antikörper
Monoklonaler Maus anti-Ki-67 Antigen IgG 1; Klon MIB-1 Dako, Hamburg
anti-Mensch
Polyklonaler Kaninchen anti-c-kit (CD117); anti-Mensch
Dako, Hamburg
Monoklonaler Maus anti-CD45 IgG1 (Leukocyte Common Dako, Hamburg
Antigen); Klon 2B11 und PD7/26 anti-Mensch
Monoklonaler Maus anti-CD34 Class II IgG1; Klon QBEnd- Dako, Hamburg
10, M7165, anti-Mensch
Chemikalien
Antibody-Diluent
Dako, Hamburg
Microscopy Aquatex
Merck, Darmstadt
Formaldehydlösung 4% (pH 6,9)
Merck, Darmstadt
Roti-Histol
Roth, Karlsruhe
Ethanol absolute Emprove
Merck, Darmstadt
2-Propanol (Isopropylalkohol)
Merck, Darmstadt
Studienkollektiv und Methoden
30
Histosec Pastillen (Paraffin)
Merck, Darmstadt
EDTA Dinatriumsalz Dihydrat Titrierkomplex III,1mM 0,372g/l
Roth, Karlsruhe
Tween 20 (Polysorbat)
Merck, Darmstadt
Natriumchlorid
Roth, Karlsruhe
Natriumhydroxid
Roth, Karlsruhe
TRIS Ultra
Merck, Darmstadt
Salzsäure (rauchend 37%)
Merck, Darmstadt
Geräte und Programme
Einbettsystem Paraffin MPS/P1
MICROM, Walldorf
Mikrotom HM 335 E, Rotationsmikrotom
MICROM, Walldorf
Paraffin-Streckbad SB 80
MICROM, Walldorf
Cool-Cut
MICROM, Walldorf
Kamera Digital
Nikon, Düsseldorf
Software Lucia Measurement Version 4.71
Lucia, Prag
Mikroskop
Olympus, Japan
Pipetten Eppendorf Reference (1-1000µl)
Eppendorf, Hamburg
Statistik-Paket SPSS 13.0 (Statistical Package for The Social Chicago, USA
Sciences)
Verbrauchsmaterialien
Microscope Cover Glasses, 24x24mm bzw. 24x50mm
Menzel, Braunschweig
PAP PEN
G. Kisker, Steinfurt
Falcon Einwegpipette
Eppendorf, Hamburg
Objektträger SuperFrostPlus, 25x75x1.0 mm
Menzel, Braunschweig
Microtome Blade A35
Feather, Köln
Plastic Embedding Device
Bio-Optica, Mailand
Pipettenspitzen
Eppendorf, Hamburg
Ergebnisse
31
4
Ergebnisse
4.1
Demographische und klinische Daten des Patientenkollektivs
In vorliegender Studie wurden Myokardproben von insgesamt 112 Patienten mit
kardialen Erkrankungen untersucht. Das Patientenkollektiv bestand aus 80 männlichen
und 32 weiblichen Patienten. Im Durchschnitt waren die Patienten 64 (+/-12) Jahre alt.
Der durchschnittliche Patient war übergewichtig mit einem BMI von 28 (+/-4) kg/m². An
atherogenen Risikofaktoren wurden im Patientenkollektiv arterielle Hypertonie,
Diabetes mellitus, Nikotinkonsum und Hyperlipidämie untersucht. Nahezu alle
Patienten (93%) hatten in ihrer Anamnese zumindest einen der untersuchten
atherogenen Risikofaktoren. Häufigster Risikofaktor war die arterielle Hypertonie bei
71% der Patienten. Hyperlipidämie wurde bei 68% der Patienten festgestellt. Ungefähr
ein Drittel der Patienten war Diabetiker und/oder Raucher. Bei über 70% der Patienten
lag eine koronare Herzerkrankung vor und 32% hatten bereits einen Myokardinfarkt in
ihrer Anamnese. Bei 31 Patienten spielte chronisches Vorhofflimmern (VHF) eine
Rolle, während die restlichen 81 Patienten einen Sinusrhythmus (SR) im EKG zeigten
und anamnestisch kein Hinweis auf Vorhofflimmern bestand. Bezüglich der Medikation
wurde bei jedem Patienten die Einnahme von Thrombozytenaggregationshemmern,
Betablockern, ACE-Hemmern bzw. AT-II-Rezeptorblockern, Calciumantagonisten,
Nitraten, Diuretika, Aldosteronantagonisten und Statinen dokumentiert. In Abhängigkeit
von
ihrer
jeweiligen
Herzerkrankung
wurde
ein
großer
Teil
der
Patienten
leitlinienorientiert therapiert (vgl. 4.7). Am häufigsten wurden Betablocker und
Thrombozytenaggregationhemmer von 76 bzw. 70% der Patienten eingenommen.
Ebenfalls häufig, von über 50% der Patienten, wurden ACE-Hemmer, Diuretika und
Statine eingenommen. Die linksventrikuläre Ejektionsfraktion (LV-EF) war im
untersuchten Patientenkollektiv durchschnittlich mittelgradig eingeschränkt und lag bei
46 +/-21%. An Operationen wurden bei 22 Patienten eine Herztransplantation, bei 63
Patienten
eine
aortokoronare
Bypassoperation,
bei
28
Patienten
ein
Aortenklappenersatz und bei vier Patienten ein Mitralklappenersatz durchgeführt. Bei
einigen Patienten wurde die aortokoronare Bypassoperation kombiniert mit einem
Klappenersatz durchgeführt.
Der
Einfluss
der
dargestellten
demographischen
und
klinischen
Daten
des
Patientenkollektivs auf die untersuchten Zellpopulationen wird in 4.5 bis 4.10
dargestellt.
Ergebnisse
32
Tabelle 2: Demographische und klinische Daten des Patientenkollektivs
Patienten mit kardialen Erkrankungen
n = 112
%
80 / 32
71 / 29
KHK
82
73
Myokardinfarkt
36
32
VHF
31
28
Thrombozytenaggregationhemmer
76
70
Betablocker
85
76
ACE-Hemmer
68
61
Diuretika
61
55
Nitrate
22
20
Ca-Antagonisten
22
20
Aldosteronantagonisten
15
13
Statine
63
56
Arterielle Hypertonie
79
71
Hyperlipidämie
76
68
Nikotin
37
33
Diabetes mellitus
34
30
Herztransplatation
22
20
Aortokoronarer Bypass
63
56
Aortenklappenersatz
28
25
Mitralklappenersatz
4
3
männlich / weiblich
Medikation
Atherogene Risikofaktoren
Operative Eingriffe
Mittelwert +/- SD
Alter (Jahre)
64 +/-12
BMI (kg/m²)
28 +/-4
LV-EF (%)
46 +/-21%.
Ergebnisse
4.2
Nachweis
33
residenter
kardialer
c-kit+CD34-CD45-
Zellen
im
pathologisch veränderten humanen Myokard
Es gelang der regelhafte Nachweis von c-kit+CD34-CD45- Zellen im pathologisch
veränderten Myokard von Patienten mit einer kardialen Erkrankung (n=112) in allen
untersuchten Herzhöhlen. Durchschnittlich beträgt die Anzahl c-kit+CD34-CD45- Zellen
in pathologisch verändertem Myokard Erwachsener 1,3 (+/-1,3) c-kit+CD34-CD45Zellen pro mm² bzw. ca. 0,33 Zellen pro 10000 Kardiomyozyten.
Die c-kit+ Zellen wurden immunhistochemisch an der Oberfläche markiert und
erscheinen braun (Abbildung 12, 13). Rot wurden die Oberflächenantigene CD34 und
CD45 markiert, deshalb wurden braune Zellen mit zusätzlicher roter Markierung nicht
gezählt. Die untersuchten Zellen liegen meist im Interstitium zwischen voll
ausdifferenzierten Myozyten. Sie sind kleiner als ausdifferenzierte Kardiomyozyten,
haben eine rundliche oder ovale Form und eine eine Größe von ca. 12 x 6µm.
Abbildung 12:
C-kit+CD34-CD45- Zelle
(braun markiert; rechts oben
vergrößert; Balken 50µm)
Abbildung 13:
C-kit+ Zelle mit zusätzlicher
roter Markierung (links oben
vergrößert; Balken 50µm)
Ergebnisse
4.3
34
Nachweis Ki-67+ Kardiomyozyten im pathologisch veränderten
humanen Myokard
Im Myokard von Patienten (n=112) mit kardialen Erkrankungen konnte das regelhafte
Vorliegen von Zellen, die sich lichtmikroskopisch durch die für Kardiomyozyten
typische Struktur sowie den Proliferationsmarker Ki-67 auszeichneten, nachgewiesen
werden. Der Nachweis Ki-67+ Zellen mit Kardiomyozytenmorphologie gelang in allen
vier Herzhöhlen. Die Anzahl Ki-67+ Kardiomyozyten im pathologisch veränderten
Myokard beträgt durchschnittlich 3,5 (+/-3,0) Zellen pro mm² bzw. ca. 1,1 Zellen pro
10000 Kardiomyozyten.
Die Ki-67+ Kardiomyozyten sind immunhistochemisch durch eine positive Kernfärbung
markiert. Die Zellkerne der gesuchten Zellen erscheinen im immunhistologischen
Schnitt braun (Abbildung 14, 15). Gewertet wurden Zellen mit einer Kernmarkierung
sowie zusätzlicher kardiomyozytentypischer Morphologie im Sinne von Querstreifung
und Glanzstreifen (Disces intercalares; vgl. Abbildung 14 und 15).
Abbildung 14:
Kardiomyozyt mit nukleärer
Markierung (braun)
des Ki-67 Antigens
(Balken 50µm)
Abbildung 15:
Ki-67+ Kardiomyozyt und
Ki-67+ Zelle in einem Blutgefäß (Pfeil)
(Balken 50µm)
Ergebnisse
4.4
35
Populationen der Ki-67+ und c-kit+CD34-CD45- Zellen im Vergleich
Im Myokard von Patienten mit kardialen Erkrankungen wurden in allen Herzhöhlen
signifikant weniger c-kit+CD34-CD45- Zellen als Ki-67+ Kardiomyozyten nachgewiesen
(Abbildung 16, Tabelle 3). In die Berechnungen gingen insgesamt 192 Proben von 112
verschiedenen Patienten ein. Ausgewertet wurden jeweils 10 Gesichtsfelder (GF) einer
Größe von 316 x 249µm an zwei Schnitten je Probe und Zellpopulation. Es wurden
Proben von 102 Patienten aus dem rechten Atrium, von 26 Patienten aus dem rechten
Ventrikel, von 27 Patienten aus dem linken Atrium und von 37 verschiedenen Patienten
aus dem linken Ventrikel untersucht.
Signifikante Unterschiede zwischen zwei Herzbereichen ergaben sich bei den
Ki-67+ Kardiomyozyten zwischen dem rechten Atrium und dem linken Ventrikel und für
die c-kit+CD34-CD45- Zellen zwischen den beiden Ventrikeln. Im rechten Atrium lagen
signifikant mehr Ki-67+ Kardiomyozyten als im linken Ventrikel (p=0,01) vor, während
im rechten Ventrikel signifikant mehr c-kit+CD34-CD45- Zellen als im linken Ventrikel
vorlagen (p=0,01).
6,00
Mittelwert
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
Ki-67+ c-kit+ Ki-67+ c-kit+ Ki-67+ c-kit+ Ki-67+ c-kit+
Zellen/ Zellen/ Zellen/ Zellen/ Zellen/ Zellen/ Zellen/ Zellen/
mm²
mm²
mm²
mm²
mm²
mm²
mm²
mm²
LV
LV
LA
LA
RV
RV
RA
RA
Fehlerbalken: 95,00% CI
Abbildung 16: Ki-67+ Kardiomyozyten und c-kit+CD34-CD45- Zellen in den
verschieden Herzbereichen bei Patienten mit einer kardialen Erkrankung
Ergebnisse
36
Tabelle 3: Ki-67+ Kardiomyozyten und c-kit+CD34-CD45- Zellen im Myokard von
Patienten mit einer kardialen Erkrankung
Ki-67+ Myozyten/mm²
C-kit+CD34-CD45- Zellen/mm²
Signi-
Mittelwert +/- SD
Mittelwert +/- SD
fikanz
RA (GF=2040)
4,0 (+/-2,8)
1,3 (+/-1,3)
p=0,00
LA (GF=540)
3,0 (+/-2,4)
1,4 (+/-1,4)
p=0,00
RV (GF=520)
3,1 (+/-3,4)
1,9 (+/-1,2)
p=0,04
LV (GF=740)
2,8 (+/-3,9)
1,0 (+/-1,5)
p=0,00
4.5
Einfluss demographischer Daten auf die Zellpopulationen
Bei der Untersuchung der Patientengruppe bezüglich des Geschlechts ergaben sich
keine signifikanten Unterschiede in der Anzahl der c-kit+CD34-CD45- Zellen sowie der
Ki-67+ Kardiomyozyten (p>0,05). Es wurden hierfür Myokardproben von 80
männlichen Patienten mit Myokardproben von 32 weiblichen Patienten in den
verschiedenen Herzbereichen verglichen.
Das Durchschnittsalter im Patientenkollektiv (n=112) lag bei 64 (+/-12) Jahren. Gemäß
WHO kann man bezüglich des Alters „Adults“ (20-59 Jahre) und „Elderly“ (>=60Jahre)
unterscheiden. In der Gruppe der älteren Patienten waren im Patientenkollektiv 71%
der untersuchten Personen.
Für die Zellpopulation der c-kit+CD34-CD45- Zellen hat sich gezeigt, dass die
Altersgruppe keinen Einfluss auf die Anzahl der Zellen hat. Bei der Population der Ki67+ Kardiomyozyten wurden im rechten Atrium (p=0,02) und im linken Ventrikel
(p=0,04) in der Gruppe der über 60 Jährigen (n=76 bzw. n=21) mehr Zellen als in der
Gruppe der jüngeren Patienten (n=26 bzw. n=16) nachgewiesen.
Eine Kontrollgruppe von Personen ohne kardiale Erkrankung (n=43) wies keine
signifikanten Unterschiede hinsichtlich des Alters als auch der Geschlechterverteilung
(p=0,12 bzw. p=0,30) im Vergleich zum Studienkollektiv auf (Tabelle 4).
Tabelle 4: Vergleich demographischer Daten von Patienten- und Kontrollkollektiv
Patienten (n=112)
Kontrollgruppe (n=43)
Alter, Jahre (+/- SD)
64 (+/-12)
59 (+/-16)
21-59 Jahre
29% (32)
49% (21)
60-90 Jahre
71% (80)
51% (22)
männliches Geschlecht
71% (80)
63% (27)
Signifikanz
n.s. (p=0,12)
n.s. (p=0,30)
Ergebnisse
4.6
37
Einfluss von BMI und atherogenen Risikofaktoren
Unterteilt man die Patienten anhand ihres BMI in normalgewichtig (<=25kg/m²; n=34),
übergewichtig (26-30kg/m²; n=50) und adipös (>30kg/m²; n=27), so ergeben sich keine
Unterschiede bezüglich des Vorhandenseins an c-kit+CD34-CD45- Zellen und Ki-67+
Kardiomyozyten im Herzen. Der durchschnittliche Patient war übergewichtig mit einem
BMI von 28 (+/-4) kg/m².
Es zeigte sich, dass der BMI bei zunehmender Einschränkung der Pumpfunktion
tendentiell sinkt. So haben herzinsuffiziente Patienten (EF<30%; n=29) mit
durchschnittlich 26 (+/-3) kg/m² einen niedrigeren BMI als Patienten mit einer guten
Pumpfunktion (EF>50%; BMI=28,0 (+/-5) kg/m²; n=54).
Es wurde der Einfluss der atherogenen Risikofaktoren arterielle Hypertonie, Diabetes
mellitus, Nikotinkonsum und Hyperlipidämie auf die Anzahl der c-kit+CD34-CD45Zellen sowie der Ki-67+ Kardiomyozyten der Patienten untersucht. Nikotinkonsum
wurde über das derzeitige oder weniger als 20 Jahre zurückliegende Rauchen von
mehr als fünf Zigaretten pro Tag über mehrere Jahre definiert.
Im Hinblick auf die Proliferationsaktivität gemessen an der Zahl Ki-67+ Kardiomyozyten
hat unseren Berechnungen zufolge keiner der untersuchten Risikofaktoren einen
relevanten Einfluss.
In der Population der c-kit+CD34-CD45- Zellen scheint das Rauchen mit einer höheren
Anzahl an Zellen im Myokard einherzugehen (p=0,02). Hier wurden Proben des
rechten Vorhofs (n=102) von 35 Raucher und 67 Nichtrauchern verglichen.
Tabelle 5: Übersicht über BMI und atherogene Risikofaktoren im Patientenkollektiv
Patienten
Patienten
(n=112)
(n=112)
BMI, kg/m² (+/- SD)
28 (+/- 4)
Diabetes mellitus
30% (34)
Normalgewicht
31% (34)
Arterielle Hypertonie
71% (79)
Übergewicht
45% (50)
Nikotinabusus
33% (37)
Adipositas
24% (27)
Hyperlipidämie
68% (76)
4.7
Bei
Medikamentöse Therapie im Patientenkollektiv
jedem
der
112
untersuchten
Thrombozytenaggregationshemmern,
Patienten
Betablockern,
wurde
die
Einnahme
ACE-Hemmern
bzw.
von
AT-II-
Rezeptorblockern, Calciumantagonisten, Nitraten, Diuretika, Aldosteronantagonisten
und Statinen dokumentiert. Es war kein eindeutiger Zusammenhang von c-kit+CD34-
Ergebnisse
38
CD45- Zellen oder Ki-67+ Kardiomyozyten und der Medikation der Patienten
nachweisbar. Es zeigte sich, dass die meisten Patienten, aber nicht alle,
leitliniengerecht therapiert wurden (Tabelle 6).
Beispielsweise wird empfohlen, dass Postinfarktpatienten zur Sekundärprophylaxe
Betablocker, Thrombozytenaggregationshemmer, Statine und ACE-Hemmer erhalten.
Von den 36 Postinfarktpatienten in dem von uns untersuchten Kollektiv erhielten 81%
einen Betabocker, 75% einen Thrombozytenaggregationshemmer, 64% ein Statin und
lediglich 22% einen ACE-Hemmer bzw. AT-II-Rezeptorblocker. Von den 63 KHKPatienten,
die
mit
einem
ACB
versorgt
wurden,
wurden
89%
mit
einem
Thrombozytenaggregationshemmer, 75% mit einem Betablocker, 30% mit Nitraten und
21% mit einem Calciumantagonisten therapiert. Von den 29 Patienten mit chronischer
Herzinsuffizienz (LV-EF<30%), wurden 90% mit einem Betablocker, 62% mit einem
ACE-Hemmer bzw. AT-II-Rezeptorblocker, 83% mit einem Diuretikum und 38% mit
einem Aldosteronantagonisten behandelt.
Tabelle 6: Übersicht über die Medikation im Patientenkollektiv nach Herzerkrankungen
KHK-Pat.
Postinfarkt-
Patienten
Patienten
Patienten mit
ohne Infarkt
patienten
mit VHF
mit AKE
LV-EF<30%
(n=48)
(n=36)
(n=31)
(n=28)
(n=29)
ASS
83% (40)
75% (27)
45% (14)
54% (15)
55% (16)
Betablocker
71% (34)
81% (29)
87% (27)
61% (17)
90% (26)
ACE-Hemmer
63% (30)
61% (22)
55% (17)
50% (14)
62% (18)
Ca-Antagonist
21% (10)
14% (5)
10% (3)
25% (7)
7% (2)
Nitrat
27% (13)
25% (9)
23% (7)
7% (2)
14% (4)
Diuretikum
48% (23)
53% (19)
81% (25)
64% (18)
83% (24)
6% (3)
22% (8)
23% (7)
4% (1)
38% (11)
63% (30)
64% (23)
48% (15)
40% (11)
59% (17)
Aldosteronantagonist
Statine
Ergebnisse
4.8
39
Einfluss der LV-EF im Patientenkollektiv
Das untersuchte Patientenkollektiv (n=112) hat im Durchschnitt eine mittelgradig
eingeschränkte Pumpfunktion (LV-EF=46 +/-21%). Ein großer Teil der Patienten (48%;
n=54) hat eine normale Herzfunktion (EF>50%), während ein kleinerer Teil der
Patienten (26%; n=29) eine hochgradig eingeschränkte linksventrikuläre Funktion (LVEF<30%) aufwies.
LV-EF
25,89%
n=29
<30%
30% - 50%
>50%
<30%
48,21%
n=54
>50%
30% - 50%
25,89%
n=29
Abbildung 17: LV-EF im Patientenkollektiv
Betrachtet
man
die
Anzahl
der
c-kit+CD34-CD45-
Zellen
und
der
Ki-67+
Kardiomyozyten in Abhängigkeit von der LV-EF, ergeben sich keine relevanten
Unterschiede im Vorhofmyokard.
4.9
Vergleich von pathologisch verändertem und gesundem Myokard
Patienten mit kardialen Erkrankungen (n=112) haben in allen Herzbereichen signifikant
mehr Ki-67+ Kardiomyozyten als gesunde Kontrollpersonen (n=43; p=0,00; Tabelle 7;
Abbildung 18).
Die Anzahl residenter kardialer c-kit+CD34-CD45- Stammzellen ist im Myokard
herzkranker Patienten im Vergleich zu ihrer Kontrollgruppe ohne kardiale Erkrankung
ebenfalls erhöht. Mit Ausnahme des linken Ventrikels, in dem dies nur tendentiell
erkennbar ist, sind die Unterschiede in den übrigen Herzhöhlen signifikant (Tabelle 8;
Abbildung 19).
Je
Zellpopulation
wurden
hierfür
3840
Gesichtsfelder
im
Myokard
des
Patientenkollektivs ausgewertet und mit ebenso vielen GF der Kontrollgruppe (Kufer
2009) verglichen. Hinsichtlich des Alters und des Geschlechts unterscheiden sich
Patienten und Kontrollen nicht voneinander (p>0,05) (Tabelle 4).
Ergebnisse
40
Tabelle 7: Ki-67+ Kardiomyozyten bei Patienten und Kontrollpersonen
Ki-67+ Myozyten/mm²
Patienten
Kontrollpersonen
(n=112)
(n=43)
RA (GF=2040)
4,0 (+/-2,8)
1,9 (+/-3,3)
p=0,00
LA (GF=540)
3,0 (+/-2,4)
1,2 (+/-1,5)
p=0,00
RV (GF=520)
3,1 (+/-3,4)
1,2 (+/-1,6)
p=0,00
LV (GF=740)
2,8 (+/-3,9)
0,9 (+/-0,9)
p=0,00
(Mittelwert +/- SD)
Signifikanz
Tabelle 8: C-kit+CD34-CD45- Zellen bei Patienten und Kontrollpersonen
C-kit+CD34-CD45- Zellen/mm²
Patienten
Kontrollpersonen
(n=112)
(n=43)
RA (GF=2040)
1,3 (+/-1,3)
0,9 (+/-1,4)
p=0,01
LA (GF=540)
1,4 (+/-1,4)
0,9 (+/-1,2)
p=0,04
RV (GF=520)
1,9 (+/-1,2)
1,1 (+/-1,3)
p=0,00
LV (GF=740)
1,0 (+/-1,5)
0,6 (+/-0,9)
n.s. (p=0,11)
(Mittelwert +/- SD)
Signifikanz
Abbildung 18: Ki-67+ Kardiomyozyten bei Patienten und Kontrollpersonen
Ki-67+
Zellen/mm² RA
Ki-67+
Zellen/mm² LA
Ki-67+
Zellen/mm² RV
Ki-67+
Zellen/mm² LV
6,00
5,00
Mittelwert
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
Patientengruppe
Kontrollgruppe
Fehlerbalken: 95,00% CI
Ergebnisse
41
Abbildung 19: C-kit+CD34-CD45- Zellen bei Patienten und Kontrollpersonen
c-kit+CD34CD45Zellen/mm² RA
c-kit+CD34CD45Zellen/mm² LA
c-kit+CD34CD45Zellen/mm² RV
c-kit+CD34CD45Zellen/mm² LV
2,50
Mittelwert
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
Patientengruppe
Kontrollgruppe
Fehlerbalken: 95,00% CI
4.10
Im
Verschiedene Herzerkrankungen im Patientenkollektiv
Patientenkollektiv
(n=112)
Herztransplantation
(n=22),
Aortenklappenersatz
(n=28)
wurden
einen
sowie
Proben
von
aortokoronaren
einen
Patienten,
Bypass
Mitralklappenersatz
die
(n=63),
(n=4)
eine
einen
bekamen,
untersucht. In der Summe sind das mehr als 112 Operationen, da einige Patienten in
einer Operation einen aortokoronaren Bypass und gleichzeitig einen Klappenersatz
bekamen. Da bei den meisten Patienten Proben aus dem rechten Atrium (n=102)
vorlagen, wurden für eine grobe Übersicht über die Zellzahlen bei den verschiedenen
kardialen Erkrankungen zunächst exemplarisch Zahlen aus diesem Herzbereich
verglichen. Teilt man die Patienten nach ihrer Herzerkrankung anhand des
durchgeführten operativen Eingriffs ein, so unterscheiden sie sich untereinander weder
signifikant hinsichtlich ihrer Zahl an c-kit+CD34-CD45- Zellen noch hinsichtlich ihrer
Zahl an Ki-67+ Kardiomyozyten (Tabelle 9). So haben Patienten, die aufgrund einer
KHK mit einem ACB versorgt wurden etwa genauso viele c-kit+CD34-CD45- Zellen wie
beispielsweise
Patienten,
Aortenklappenersatz
die
bekamen.
aufgrund
Auch
einer
terminal
Aortenklappenstenose
herzinsuffiziente
einen
Patienten,
die
Ergebnisse
42
transplantiert wurden, unterscheiden sich nicht signifikant von den übrigen Patienten
hinsichtlich ihrer Zahl an c-kit+CD34-CD45- Zellen im rechten Vorhof (p>0,05). Für die
proliferierenden Ki-67+ Kardiomyozyten lassen sich ebenfalls keine signifikanten
Unterschiede in Abhängigkeit der verschiedenen Herzerkrankungen feststellen.
Interessant ist, dass Patienten mit einer Mitralklappeninsuffizienz, die einen
Mitralklappenersatz (n=4) bekamen, fast doppelt so viele c-kit+CD34-CD45- Zellen und
eine deutlich höhere Proliferationsaktivität als die restlichen Patienten im Myokard des
rechten Vorhofs haben. Jedoch ist diese Patientengruppe zu klein, um statistisch
sinnvolle Ergebnisse zu errechnen. Durchschnittlich haben Patienten mit kardialen
Erkrankungen 1,4 (+/-1,3) c-kit+CD34-CD45- Zellen und 4,0 (+/-2,8) Ki-67+
Kardiomyozyten im rechten Atrium.
Tabelle 9: C-kit+CD34-CD45- Zellen und Ki-67+ Kardiomyozyten im RA nach Art des
operativen Eingriffs der Patienten
Ki-67+ Zellen/mm²
C-kit+CD34-CD45-
Mittelwert +/- SD
Zellen/mm²; Mittelwert +/- SD
Patienten mit HTX (n=20)
4,1 (+/-3,2)
1,4 (+/-1,3)
KHK-Patienten mit ACB (n=61)
3,9 (+/-2,5)
1,3 (+/-1,4)
Patienten mit AKE (n=24)
4,1 (+/-2,3)
1,2 (+/-1,3)
Patienten mit MKE (n=4)
6,5 (+/-5,9)
2,4 (+/-1,1)
RA
4.10.1 Patienten mit Aortenklappenstenose
In
vorliegender
hämodynamisch
Studie
wurden
relevanter
28
Patienten
(11weiblich/17männlich)
Aortenklappenstenose
untersucht,
die
mit
einen
Aortenklappenersatz bekamen. Sie waren 67,7 (+/-13,5) Jahre alt und hatten
durchschnittlich eine gute Pumpfunktion (LV-EF 53,2 +/-13,2%). 13 Patienten hatten
eine KHK, jedoch hatte niemand einen Myokardinfarkt in der Anamnese. Acht
Patienten hatten VHF, 19 arterielle Hypertonie und acht waren Raucher. 50% wurden
mit einem ACE-Hemmer, 25% mit einem Calziumantagonisten, 64% mit Diuretika und
61% mit einem Betablocker behandelt. Bei neun Patienten wurde Myokard des linken
Ventrikels untersucht. Im Vergleich zu herzgesunden Kontrollpersonen (n=36) hatten
Patienten mit Aortenklappenstenose tendentiell sowohl mehr Ki-67+ Kardiomyozyten
als
auch
c-kit+CD34-CD45-
Zellen
im
linken
Ventrikel.
Für
ein
statistisch
aussagekräftiges Ergebnis müssten mehr Proben aus dem linken Ventrikel von
Patienten mit Aortenklappenstenose untersucht werden (Tabelle A1 im Anhang).
Ergebnisse
43
4.10.2 Postinfarktpatienten
In vorliegender Studie wurden 36 Patienten (11weiblich/25männlich) mit einem
Myokardinfarkt in der Anamnese untersucht. Sie waren 64 (+/-8,5) Jahre alt und hatten
durchschnittlich eine eingeschränkte Pumpfunktion (LV-EF 36,6 +/-21,1%). Nahezu
alle Patienten (94%) hatten eine KHK. 31% der Postinfarktpatienten hatten VHF. An
kardiovaskulären
Risikofaktoren
standen
die
arterielle
Hypertonie
und
die
Hyperlipidämie bei jeweils 72% der Patienten im Vordergrund. Ungefähr ein Drittel der
Postinfarktpatienten waren Raucher und/oder Diabetiker. 75% der Patienten wurden
mit einem Thrombozytenaggregationshemmer, 81% mit einem Betablocker und 61%
mit einem ACE-Hemmer therapiert.
Die Anzahl an c-kit+CD34-CD45- Zellen sowie die Anzahl an Ki-67+ Kardiomyozyten
ist bei Postinfarktpatienten im rechten Atrium (n=34) im Vergleich zum gesunden
Kontrollkollektiv (n=43) signifikant (p=0,01 bzw. p=0,00) erhöht. Im Vergleich zu KHKPatienten ohne Myokardinfarkt (n=44) ist die Anzahl an c-kit+CD34-CD45- Zellen wie
auch die Anzahl an Ki-67+ Kardiomyozyten bei Postinfarktpatienten im rechten Atrium
(n=34) lediglich tendentiell erhöht. Postinfarktpatienten haben im rechten Atrium
signifikant mehr Ki-67+ Kardiomyozyten als c-kit+CD34-CD45- Zellen (p=0,00). In
dieser Patientengruppe wurde exemplarisch nur das rechte Atrium untersucht, da aus
den übrigen Herzteilen zu wenige Proben zur Verfügung standen (Tabelle A2 im
Anhang).
4.10.3 Herzinsuffiziente Patienten
Von 22 Patienten mit terminaler Herzinsuffizienz, die eine Herztransplantation
bekamen, wurde Myokard aus allen vier Herzhöhlen untersucht. Bezüglich BMI (26
kg/m² vs. 28kg/m²) und Alter (55J. vs. 64J.) liegen die herzinsuffizienten Patienten
leicht unter dem Durchschnitt des Gesamtkollektivs. Hinsichtlich des Geschlechtes
überwiegen die Männer in dieser Gruppe (18:4). 70% dieser Patienten haben VHF. Bei
45% liegen eine KHK und/oder eine dilatative Kardiomyopathie vor. Als häufigste
Ursache einer Herzinsuffizienz in den westlichen Ländern gilt die koronare
Herzerkrankung (54-70%), die bei 35-52% der Patienten von einer arteriellen
Hypertonie begleitet ist (McMurray 2000). Die Medikation der in dieser Studie
untersuchten herzinsuffizienten Patienten ist leitlinienorientiert. 73% der terminal
herzinsuffizienten Patienten erhielten einen ACE-Hemmer bzw. AT-II-Rezeptorblocker,
91% einen Betablocker und 46% einen Aldosteronantagonisten.
Bei herzinsuffizienten Patienten wurden in allen Herzbereichen mehr Ki-67+
Kardiomyozyten als c-kit+CD34-CD45- Zellen nachgewiesen (p=0,00).
Ergebnisse
44
Hervorzuheben ist, dass terminal herzinsuffiziente Patienten in allen Herzbereichen
sowohl signifikant mehr Ki-67+ Kardiomyozyten als auch mehr c-kit+CD34-CD45Zellen als das herzgesunde Kontrollkollektiv (p<0,05) haben. Besonders im linken
Ventrikel
der
herzinsuffizienten
Patienten
(n=22)
zeigten
sich
deutliche
Veränderungen. So wurde im linken Ventrikel dieser Patienten eine um das ca.
Vierfache erhöhte Anzahl an Ki-67+ Kardiomyozyten im Vergleich zu gesunden
Kontrollpersonen (n=39) nachgewiesen. Dieser Unterschied an Proliferationsaktivität
im linksventrikulären Myokard terminal herzinsuffizienter Patienten und gesunder
Kontrollpersonen war mit p=0,00 signifikant. Ebenfalls signifikant (p=0,04) waren die
Unterschiede bei den c-kit+CD34-CD45- Zellen im Vergleich von Myokard des linken
Ventrikels bei herzinsuffizienten Patienten und Kontrollpersonen (Tabelle A3 im
Anhang).
Abbildung 20: Ki-67+ Kardiomyozyten im Myokard des linken Ventrikels bei terminal
herzinsuffizienten Patienten und Kontrollpersonen
Ki-67+ Zellen/mm² im linken Ventrikel
10,00
38
40
8,00
6,00
4,00
167
2,00
p=0,00
0,00
Herzinsuffiziente Patienten
(n=22)
4.10.4 Veränderungen
im
atrialen
Kontrollpersonen (n=39)
Myokard
bei
chronischem
Vorhofflimmern
In vorliegender Studie wurden 31 Patienten mit chronischem Vorhofflimmern (VHF)
untersucht. Sie hatten ein Durchschnittsalter von 62 (+/-12) Jahren und eine
Ergebnisse
45
Geschlechterverteilung von männlich zu weiblich 2:1. Als Kontrollgruppe dienten 81
Patienten mit Sinusrhythmus (SR) im EKG, die kein VHF in der Anamnese hatten. Die
LV-EF der Patienten mit VHF lag mit durchschnittlich 35 (+/-21)% signifikant unter der
LV-EF der Kontrollpatienten mit SR (p=0,00). Für die Berechnungen wurde
Vorhofmyokard von Patienten mit bekanntem chronischen VHF mit Vorhofmyokard von
Patienten der Kontrollgruppe mit SR verglichen.
Patienten mit chronischem VHF hatten im Myokard des rechten Atriums eine signifikant
höhere Anzahl an Ki-67+ Kardiomyozyten als Patienten ohne VHF (p=0,04) (Abbildung
20). Bei der Anzahl an c-kit+CD34-CD45- Zellen zeigten sich keine Unterschiede
zwischen der Gruppe der Patienten mit VHF und ihrer Vergleichsgruppe im
Vorhofmyokard. Wie im übrigen Studienkollektiv war die Anzahl an c-kit+CD34-CD45Zellen in beiden Gruppen gegenüber der Anzahl an Ki-67+ Kardiomyozyten geringer.
Die Therapie mit einem ACE-Hemmer bzw. AT-II-Rezeptorblocker hatte keinen
Einfluss auf die Anzahl der Ki-67+ Zellen im Vorhofmyokard der Patienten mit
chronischem VHF (p>0,05) (Tabelle A4 im Anhang).
Abbildung 21: Ki-67+ Kardiomyozyten im Vorhofmyokard von Patienten mit VHF und
von Patienten mit SR
Ki-67+ Zellen/mm² im rechten Atrium
15,00
10,00
5,00
p=0,04
0,00
Patienten mit SR (n=81)
Patienten mit VHF (n=31)
Ergebnisse
4.11
Die
46
Zellpopulationen
im
Myokard
von
Kindern
mit
angeborenen Herzfehlern
Es wurden Myokardproben von 14 Kindern mit angeborenen Herzfehlern, wie atrialem
Septumdefekt, ventikulärem Septumdefekt, Fallotscher Tetralogie oder Transposition
der großen Gefäße untersucht. Darunter waren 12 Jungen und zwei Mädchen mit
einem durchschnittlichen Alter von drei Jahren. Es konnten residente kardiale ckit+CD34-CD45- Zellen sowie Ki-67+ Kardiomyozyten nachgewiesen werden. Im
Myokard von Kindern waren mehr Ki-67+ Kardiomyozyten als c-kit+CD34-CD45Zellen nachweisbar (p=0,00). Kinder haben signifikant mehr Ki-67+ Kardiomyozyten als
gesunde erwachsene Personen (p=0,00) und als Patienten mit einer kardialen
Erkrankung (p=0,00). Hinsichtlich der Population c-kit+CD34-CD45- Zellen gibt es
keine Unterschiede zwischen kindlichem und pathologisch verändertem oder
gesundem Myokard erwachsener Personen. Im Vergleich mit den Ergebnissen aus
fetalem Myokard (Kufer 2009) wurden im kindlichen Myokard signifikant weniger Ki67+ Kardiomyozyten (p=0,00) gefunden. Ein Unterschied bei c-kit+CD34-CD45- Zellen
bestand nicht.
4.12
Vergleich von geschädigtem Myokard Erwachsener mit fetalem
Myokard
Im Myokard herzkranker Patienten ist die Proliferationsaktivität gemessen an der
Anzahl Ki-67+ Zellen im Vergleich zu fetalem Myokard geringer (p=0,00). Hier wurde
Myokard des linken Ventrikels von 37 Patienten mit eingeschränkter LV-EF mit den
Daten der Myokardproben von 34 Feten (Kufer 2009) verglichen. Prinzipiell konnte in
fetalem Myokard eine große Anzahl an proliferierenden Zellen nachgewiesen werden
(Kufer 2009). Hinsichtlich der Anzahl an c-kit+CD34-CD45- Zellen ergibt sich lediglich
die Tendenz, einer erhöhten Zellzahl in fetalem Myokard, jedoch kein signifikanter
Unterschied im Vergleich zum Patientenmyokard (p>0,05).
Interessant ist, dass die Proliferationsaktivität gemessen an der Anzahl Ki-67+
Kardiomyozyten im geschädigten Myokard erwachsener Patienten zwar geringer als in
fetalem Myokard (p=0,00), gleichzeitig jedoch höher als in gesundem Myokard
erwachsener Personen ist (p=0,00). Insbesondere bei Patienten mit einer stark
eingeschränkten LV-EF wurde eine im Vergleich zu gesunden Personen deutlich
erhöhte Proliferationsaktivität beobachtet. Die Unterschiede von hohen Zellzahlen in
fetalem Myokard und niedrigen Zellzahlen im Myokard erwachsener Personen sind
daher bei gesunden erwachsenen Kontrollpersonen deutlicher als bei herzkranken
Ergebnisse
47
erwachsenen Personen, da im gesunden Myokard Erwachsener weniger Ki-67+
Kardiomyozyten wie auch c-kit+CD34-CD45- Zellen als im geschädigten Myokard der
erwachsenen Patienten vorliegen (vgl. 4.9).
Diskussion
48
5
Diskussion
5.1
Nachweis
von
Zellen
mit
Stammzelleigenschaften
und
Zellproliferation im Myokard herzkranker Patienten
Die gezeigten Ergebnisse dokumentieren das Vorhandensein einer Population an ckit+CD34-CD45- Zellen im humanen Myokard bei herzkranken Personen (n=112).
Damit zeigt vorliegende Studie das Vorhandensein einer ähnlichen Population wie der
„residenter kardialer Stammzellen“, welche durch Anversa et al. beschrieben wurde,
ausgehend von zahlreichen Studien am Myokard verschiedener Tierspezies (Mäuse
(Matsuura 2004; Oh 2003), Ratten (Laugwitz 2005), Hunde (Linke 2005), Schweine
(Smith 2007). Wir wählten c-kit, den Rezeptor des Stammzellwachstumsfaktors, als
Marker
zur
Detektion
kardialer
Progenitiorzellen,
weil
c-kit+
Zellen
in
Regenerationsprozessen des menschlichen Herzens eine Rolle spielen und ihnen eine
Fähigkeit zur Regeneration myokardialer Zellen zugeschrieben wurde (Linke 2005;
Pouly 2008). In Studien von Anversa et al. wurde nachgewiesen, dass kardiale c-kit+
Zellen selbst-erneuernd, klonogen und multipotent sind und aus ihnen mindestens drei
verschiedene
kardiogene
Zelllinien,
wie
Myozyten,
glatte
Muskelzellen
und
endotheliale Zellen hervorgehen können (Dawn 2005). Im Tiermodell wurde gezeigt,
dass sie funktionsfähiges Myokard in vivo regenerieren können und diese Ergebnisse
nicht durch Zellfusion zustande kommen (Beltrami 2003). Zudem gelang die
Differenzierung dieser Zellen in vitro in schlagende Myozyten (Matsuura 2004; Oh
2003). Somit wurde das Potential zur Regeneration der verschiedenen Komponenten
des Myokards, was Stammzellen auszeichnet, für c-kit+ adulte kardiale Zellen
nachgewiesen (Beltrami 2003; Nadal-Ginard 2003; Quaini 2002). Anversa et al.
identifizierten die Population residenter kardialer Stammzellen jedoch zusätzlich zu ckit noch durch die beiden Oberflächenmarker MDR-1 und Sca-1 (Beltrami 2003).
Urbanek et al. untersuchten ebenfalls die drei Marker c-kit+, MDR-1 und Sca-1 auf
kardialen Stammzellen. Sie zeigten, dass ca. 60% der kardialen Stammzellen alle drei
Marker exprimierten und ca. 80% der kardialen Stammzellen c-kit+ waren (Urbanek
2005). So kann mit c-kit die Population kardialer Stammzellen weitgehend identifiziert
werden. Die absoluten Zahlen der gesamten kardialen Stammzellpopulation werden
durch die alleinige Identifizierung mit c-kit, der Studie von Urbanek et al. zufolge, etwas
unterschätzt. Es wurde durch die vorliegende Studie auch kein endgültiger Nachweis
erbracht, dass die c-kit+CD34-CD45- Zellen tatsächlich die von Anversa et al.
beschriebenen
Eigenschaften
von
Stammzellen
haben.
So
müsste
man
in
Diskussion
49
nachfolgenden Studien das Potential und die genauen Eigenschaften dieser Zellen in
vivo und in vitro weiter untersuchen.
Es ist bekannt, dass c-kit auch von hämatopoetischen und endothelialen Stammzellen
sowie Mastzellen, welche ebenfalls im Myokard vorkommen können, exprimiert wird
(Tsuura 1994; Wagers 2002). Da es unser Ziel war, residente kardiale Stammzellen
nachzuweisen, mussten wir diese c-kit+ Zellen duch die zusätzliche Markierung mit
CD34 und CD45 ausschließen. So handelt es sich bei der nachgewiesenen Population
c-kit+CD34-CD45-
Zellen
um
Vorläuferzellen,
die
weder
Oberflächenmarker
hämatopoetischer oder endothelialer Zellen noch von Mastzellen tragen. Anders als in
einer Studie von Pouly et al., in der vermutet wurde, dass alle c-kit+ Zellen im Herzen
Zellen hämatopoetischen Urprungs oder Mastzellen sind (Pouly 2008), wurden in
vorliegender Studie c-kit+ Zellen ohne Koexpression von CD45 im humanen Myokard
nachgewiesen. Dies gelang auch durch andere Arbeitsgruppen (Messina 2004; Quaini
2002; Urbanek 2003) und weist darauf hin, dass es im Herzen Zellen mit
Oberflächenmarkern von Stammzellen ohne Expression hämatopoetischer oder
endothelialer Marker gibt.
Die Anzahl an c-kit+CD34-CD45- Zellen liegt unseren Untersuchungen zufolge
bei durchschnittlich 1,3 (+/- 1,3) Zellen pro mm² bzw. bei ca. 0,33 Zellen pro 10000
Kardiomyozten im Herzen von Personen mit einer kardialen Erkrankung.
Wenn auch die exakte Anzahl kardialer Stammzellen nach wie vor Gegenstand heftiger
Diskussion ist (Anversa 2006), liegt die Anzahl an c-kit+CD34-CD45- Zellen unserer
Studie in einer Größenordnung, wie sie auch von anderen Arbeitsgruppen beschrieben
wurde:
So
wurden
c-kit+CD34-CD45-
Zellen
bei
Patienten
mit
dilatativer
Kardiomyopathie, Herzinsuffizienz und Aortenklappenstenose in einer Größenordnung
von 0,19 bis 0,21 Zellen pro mm² gefunden (Chimenti 2003; Urbanek 2003). In
Biopsien menschlichen Myokards einer weiteren Studie wurde eine durchschnittliche
Anzahl von 2,7 (+/-1,3) c-kit+CD45+MDR-1-Isl-1- Zellen beschrieben (Pouly 2008).
Beltrami et al. berichten von einer Stammzelle pro 10000 Kardiomyozyten bei Ratten
(Beltrami 2003). Im Myokard von Hunden wurden durchschnittlich 0,56 kardiale
Stammzellen pro 10000 Kardiomyozyten gefunden (Linke 2005). Weitere Studien an
Mäusen, Ratten, Hunden und Menschen gehen von einer Spanne zwischen einer
Stammzelle pro 8000 bis 80000 Kardiomyozyten aus (Anversa 2006). Als Gründe für
die unterschiedlichen Zahlen kommen die Untersuchung verschiedener Spezies, die
Verwendung unterschiedlicher Detektionsmethoden und die Diskrepanz an Markern
zur Identifikantion kardialer Stammzellen infrage. Zwar verwendeten alle zitierten
Studien c-kit als Stammzellmarker, jedoch benutzten einige Arbeitsgruppen zusätzlich
noch MDR-1 oder Sca-1 (Beltrami 2003; Linke 2005). Zudem wurden nicht immer alle
Diskussion
CD34+
50
und
CD45+
Zellen
ausgeschlossen
(Beltrami
2003;
Pouly
2008).
Übereinstimmend hat sich jedoch gezeigt, dass kardiale Stammzellen relativ selten
vorkommen. Im Allgemeinen wird angenommen, dass adulte Stammzellen unabhängig
vom Gewebe eher selten sind (Weissman 2000). So werden beispielsweise auch
hämatopoetische c-kit+CD34+ Stammzellen, die schon vor ca. 40 Jahren entdeckt
wurden und daher sehr gut untersucht sind, auf 1: 10000 bis 1:15000 geschätzt
(Weissman 2000).
C-kit+CD34-CD45- Zellen konnten in vorliegender Studie im Myokard aller
Herzhöhlen bei Patienten nachgewiesen werden. Beim Vergleich der verschiedenen
Herzhöhlen fällt auf, dass im rechten Ventrikel (n=26) mit 1,9 (+/-1,2) Zellen pro mm²
tendentiell
die
meisten
c-kit+CD45-CD45-
Zellen
vorliegen.
Ein
signifikanter
Unterschied (p=0,02) ergibt sich insbesondere im Vergleich zum linken Ventrikel
(n=37), in dem nur etwa halb so viele Stammzellen nachgewiesen werden konnten. Die
Zellzahlen der beiden Vorhöfe unterscheiden sich kaum und liegen dazwischen.
In ihrer Morphologie und Lage im Myokard ähneln die in vorliegender Studie
nachgewiesenen c-kit+CD34-CD45- Zellen den in der Literatur Beschriebenen. Die in
vorliegender Studie gezeigten c-kit+CD34-CD45- Zellen haben einen Durchmesser von
ca. 12 x 6µm. Damit sind sie durchschnittlich wenige Mikrometer größer als die von
Beltrami et al. beschriebenen Zellen bei Ratten (Beltrami 2003). Urbanek et al. und
Chimenti et al. wiesen im humanen Myokard von Patienten c-kit+CD34-CD45- Zellen
mit einem ebenfalls etwas geringeren Durchmesser von 6 +/-2µm (Urbanek 2003) bzw.
4-6µm (Chimenti 2003) nach. Wie die anderen Arbeitsgruppen fanden wir c-kit+CD34CD45- Zellen meist im Interstitium zwischen ausdifferenzierten Kardiomyozyten
(Beltrami 2003; Chimenti 2003). Auch in der rundlich bis ovalen Form gibt es keine
Unterschiede (Anversa 2006; Beltrami 2003; Chimenti 2003). Die Zellen lagen wie in
der Studie von Chimenti et al. in vorliegender Studie meist einzeln im Myokard verteilt
vor (Chimenti 2003) und nicht in Clustern von mehreren (6-12) Zellen (Urbanek 2003).
Am wahrscheinlichsten für diese Unterschiede erscheint uns die Detektionsmethode.
Im
Gegensatz
zu
den
anderen
Arbeitsgruppen
verwendeten
wir
ein
immunhistochemisches Amplifikationssystem, das auch kleine Mengen an Antigen
sichtbar macht, jedoch die einzelnen Zellen größer und nah beieinander liegende
Zellen möglicherweise als eine einzelne Zelle erscheinen lässt. Dies könnte der Grund
für einen größeren Durchmesser und eine etwas geringere Anzahl der von uns
gezeigten Zellen sein. Weiterhin wurden neu gebildete Myozyten mit einer Größe von
100 bis 2000µm³ beschrieben (Muller 2005). Diese Zahlen zeigen, dass die Zellen
einerseits in ihrer Größe variieren können und andererseits, dass sie auf jeden Fall
kleiner als ausdifferenzierte Kardiomyozyten sind. Letzter Aspekt wurde auch von
Diskussion
51
Nadal et al. an sich teilenden Kardiomyozyten bei Herzinsuffizienz beobachtet (NadalGinard 2003). Dieser Aspekt ist interessant, denn er zeigt, dass diese Zellen nicht aus
der Fusion mit ausdifferenzierten Kardiomyozyten entstanden sein können. Interessant
ist auch, dass insbesondere für kleine Myozyten ein im Vergleich zu größeren
Myozyten höheres Regenerationspotential und eine höhere Aktivität im Zellzyklus
nachgewiesen wurde (Urbanek 2003).
Neben der Population c-kit+CD34-CD45- Zellen konnte das regelhafte
Vorliegen von Kardiomyozyten mit dem Proliferationsmarker Ki-67 im humanen
Myokard bei herzkranken Personen (n=112) nachgewiesen werden. Die Anzahl Ki-67+
Kardiomyozyten liegt bei 3,5 (+/-3,0) Zellen pro mm² bzw. bei ca. 0,88 Zellen pro
10000 Myozyten bei diesen Personen. Ki-67+ Kardiomyozyten konnten im Myokard
aller Herzhöhlen nachgewiesen werden. Die Anzahl variiert jedoch in den
verschiedenen Herzhöhlen. Die meisten Ki-67+ Kardiomyozyten wurden im rechten
Vorhof (n=102) mit 4,0 (+/- 2,8) Zellen pro mm² und die wenigsten im linken Ventrikel
(n=37) mit 2,8 (+/-3,9) Zellen pro mm² gefunden. Dieser Unterschied ist signifikant
(p=0,01). Interessant ist, dass diese Verteilung mit der im gesunden Myokard der
Kontrollpersonen übereinstimmt (Kufer 2009). Kritisch zu bemerken ist, dass die
geringere Anzahl Ki-67+ Kardiomyozyten im linken Ventrikel möglicherweise aufgrund
der Auszählung von Zellen pro Fläche und dem Vorliegen größerer Zellen
insbesondere im hypertrophierten Ventrikelmyokard herzkranker Patienten, nur
vorgetäuscht sein kann.
Ki-67 kann als Marker für proliferierende Zellen dienen, da das zellkernständige Protein
nur in aktiven Phasen des Zellzyklus, also der G1-, S-, G2-Phase und der Mitose,
exprimiert wird und in ruhenden Zellen (G0-Phase) dagegen konstant nicht vorkommt
(Gerdes 1984). Geht man von Regenerationsprozessen und Zellneubildung durch
residente kardiale Stammzellen im menschlichen Myokard (Anversa 2006; NadalGinard 2003) aus, so ist es plausibel, dass auch Zellen mit dem Proliferationsmarker
Ki-67 im Myokard vorhanden sind. Die Koexpression von c-kit und Ki-67 wurde
nachgewiesen (Scholzen 2000). So können aktive c-kit+CD34-CD45- Zellen als eine
Teilpopulation von Ki-67+ Kardiomyozyten betrachtet werden. Ruhende c-kit+CD34CD45- Zellen gehen dagegen nicht in die von uns dokumentierte Population Ki-67+
Zellen ein. Auch frühe c-kit+CD34-CD45- Zellen, die anhand ihrer Struktur noch nicht
als Kardiomyozyten erkennbar sind, gehen nicht in die Population Ki-67+ Zellen dieser
Studie ein. Ki-67 ist eher ungeeignet, neu entstehende oder von außen durch
Zelltherapie
ins
Herz
eingebrachte
Kardiomyozyten
Ausdifferenzierung nachzuverfolgen (Beltrami 2003).
bis
zur
vollständigen
Diskussion
52
Festzuhalten ist, dass in vorliegender Studie im humanen Myokard sowohl Ki67+ Kardiomyozyten wie auch c-kit+CD34-CD45- Zellen nachgewiesen wurden. Beim
Vergleich dieser Zellpopulationen fällt auf, dass in allen Herzbereichen eine signifikant
höhere Zahl an Ki-67+ Kardiomyozyten als an c-kit+CD45-CD45- Progenitorzellen
vorlag (p<0,05). Mögliche Gründe für diesen Unterschied werden im Folgenden erörtet.
Kardiale Progenitorzellen können zwar ruhen und müssen deshalb nicht zwangsläufig
Ki-67 exprimieren, per Definition sind sie jedoch zur Proliferation fähig und exprimieren
als proliferierende Zellen Ki-67. Die Beschreibung weiterer möglicher kardialer
Stammzellpopulationen der letzten Zeit lässt vermuten, dass neben c-kit+CD34-CD45Zellen weitere kardiale Progenitorzellpopulationen existieren und zur Population
proliferierender Ki-67+ Zellen im Herzen beitragen. Als weitere Gruppen kardialer
Zellen mit Stammzelleigenschaften wurden sog. „side population cells“ (Martin 2004;
Pfister 2005), sca-1+CD31- Zellen (Matsuura 2004; Oh 2003; Rosenblatt-Velin 2005)
sowie isl-1+ Zellen (Laugwitz 2005) beschrieben.
Des Weiteren sind Zellen mit dem Proliferationsmarker Ki-67 im Unterschied zur
Population
c-kit+CD34-CD45-Zellen
nicht
zwangsläufig
Zellen
mit
Progenitoreigenschaften, sondern definitionsgemäß Zellen, die sich im Zellzyklus
befinden. So gibt es neben der Möglichkeit, dass Ki-67+ Kardiomyozyten einer
Progenitorzellpopulation angehören noch weitere Möglichkeiten der Identität Ki-67+
Zellen. So könnten Ki-67+ Zellen zwar aus c-kit+ Zellen hervorgegangen sein, sich
aber bereits weiter differenziert, geteilt und ihre primitiven Oberflächenmarker verloren
haben. Es wurde beschrieben, dass Stammzellantigene schon früh während der
Differenzierung von Zellen verloren gehen (Urbanek 2003). Dies würde mit der
Annahme, dass die Aktivierung einer begrenzten Anzahl von Stammzellen eine
größere Anzahl proliferierender Zellen hervorzubringt, in Einklang stehen (Wagers
2002). Bei Ki-67+ Kardiomyozyten könnte es sich auch um Zellen handeln, die auf dem
Weg in die Apoptose oder Dedifferenzierung wieder in den Zellzyklus eingetreten sind.
Es wurde beschrieben, dass apoptotische Zellen im normalen und pathologischen
Gewebe positiv für das Ki-67-Antigen sein können, es jedoch nicht sein müssen
(Coates 1996). Coates et al. schlossen daraus, dass Apoptose mit einem Eintritt in den
Zellzyklus verbunden sein kann, aber nicht sein muss (Coates 1996). Da
Apoptoseprozesse
im
menschlichen
Herzen
besonders
unter
pathologischen
Bedingungen eine Rolle spielen (Nadal-Ginard 2003), könnte Apoptose auch ein Grund
für die vergleichsweise hohe Anzahl Ki-67+ Zellen im geschädigten Myokard sein. Im
Myokard von Patienten mit chronischer ischämischer Kardiomyopathie wurde
beispielsweise eine Rate von 0,18 bis 1,2% an Myozyten, die Apoptoseprozesse
durchlaufen, beschrieben (Nadal-Ginard 2003). Interessant in diesem Zusammenhang
Diskussion
53
ist, dass in vorliegender Studie in der Gruppe der über 60 jährigen Patienten signifikant
mehr Ki-67+ Kardiomyozyten als bei jüngeren Patienten nachweisbar waren. Geht man
davon aus, dass Apoptoseprozesse mit zunehmendem Alter vermehrt im Herzen
vorkommen (Chimenti 2003) und Ki-67 auch Zellen, die auf dem Weg in die Apoptose
wieder in den Zellzyklus eintreten (Coates 1996), markiert, so könnte dieser Anstieg an
Ki-67+ Zellen lediglich ein Ausdruck vermehrten Zelluntergangs sein.
Ein weiterer Grund für das vermehrte Vorliegen des Zellkernantigens Ki-67 im
pathologisch
veränderten
Myokard
könnten
mehrkernige
Kardiomyozyten
im
hypertrophierten Herzen sein (Gerdes 1983). Hypertrophie ist ein bekannter
Regenerationsversuch
im
geschädigten
Myokard.
Nimmt
man
an,
dass
im
geschädigten Myokard vermehrt mehrkernige Kardiomyozyten entstehen, so wäre Ki67 unabhängig von der Entstehung neuer Kardiomyozyten erhöht, zumal die exakten
Zellgrenzen mit lichtmikroskopischen Methoden nur unzureichend beurteilt werden
können. Wir gehen jedoch wie andere Arbeitsgruppen davon aus, dass im pathologisch
veränderten Myokard neben der Hypertrophie auch die Bildung neuer Kardiomyozyten
eine Rolle spielt (Anversa 2002; Nadal-Ginard 2003). So könnte der Zellmarker Ki-67
die absolute Anzahl einzelner Kardiomyozyten im Zellzyklus bei den in dieser Studie
verwendeten Methoden etwas überschätzen. Die von uns untersuchte Population Ki67+ Zellen kann daher zwar eine grobe Abschätzung der Proliferationsaktivität geben,
sie müsste jedoch in weiteren Untersuchungen noch genauer charakterisiert werden.
Zusammenfassend kann man festhalten, dass der Nachweis von Zellen mit
Stammzelleigenschaften wie auch der Nachweis von Kardiomyozyten mit dem
Proliferationsmarker Ki-67 im Herzen darauf hindeuten, dass das Herz kein terminal
differenziertes Organ ist, sondern dass Regenerationsprozesse im Herzen stattfinden.
Einschränkend
muss
man
aufgrund
der
geringen
Anzahl
der
Zellen
mit
Stammzelleigenschaften und der proliferierenden Zellen davon ausgehen, dass das
Herz jedoch hauptsächlich aus terminal differenzierten Zellen besteht (Urbanek 2003).
Interessanterweise wurde Ähnliches in den letzten Jahren auch für das Gehirn, das ja
lange Zeit wie das Herz als terminal differenziertes Organ betrachtet wurde,
nachgewiesen (Gage 2002).
5.2
Regenerationspotential des Herzens im Hinblick auf die Klinik der
Patienten mit kardialen Erkrankungen
In vorliegender Studie wurde gezeigt, dass im pathologisch veränderten Myokard des
Patientenkollektivs (n=112) sowohl mehr c-kit+CD34-CD45- Zellen als auch mehr Ki-
Diskussion
54
67+ Kardiomyozyten vorkommen als im Myokard der Kontrollpersonen (n=43) ohne
kardiale Erkrankungen. Dieser Unterschied konnte in allen Herzhöhlen beobachtet
werden und war mit Ausnahme des linken Ventrikels bei c-kit+CD34-CD45- Zellen
statistisch signifikant.
Von anderen Arbeitsgruppen wurde ebenfalls beobachtet, dass Replikation von
Myozyten v.a. bei akuten pathologischen Zuständen, wie z.B. nach akutem
Myokardinfarkt, aber auch im chronisch geschädigten Herzen vermehrt vorkommt
(Urbanek 2003; Urbanek 2005). Es wurde beobachtet, dass herzinsuffiziente Patienten
und Patienten mit idiopathischer dilatativer Kardiomyopathie signifikant mehr ckit+CD34-CD45- Zellen als Kontrollpersonen ohne kardiale Erkrankung haben
(Chimenti 2003). Mehrere Arbeitsgruppen gehen von einer Aktivierung und
Proliferation residenter kardialer Stammzellen im Falle einer Schädigung aus (Beltrami
2003; Chimenti 2003; Urbanek 2003; Urbanek 2005). Dies führt ihrer Ansicht nach zu
einer erhöhten Anzahl residenter kardialer Stammzellen wie auch zu einer erhöhten
Proliferationsaktivität
im
Myokard
und
spricht
für
das
Stattfinden
von
Regenerationsprozessen im pathologisch veränderten Myokard (Anversa 2002; NadalGinard
2003).
Interessant
ist,
dass
auch
die
Anzahl
anderer
kardialer
Stammzellpopulationen wie z.B. die Anzahl Sca-1+ Vorläuferzellen im Myokard
ansteigt, wenn das erwachsene Herz einer Belastung ausgesetzt ist (Rosenblatt-Velin
2005). Rosenblatt et al. führten das auf einen vermehrten Bedarf an Sca-1+ Zellen
und/oder eine verstärkte Expression von Sca-1 auf Zellen im hypertroph geschädigten
Myokard zurück (Rosenblatt-Velin 2005).
Des Weiteren wurde in vorliegender Studie beobachtet, dass bei Patienten mit
Myokardinfarkt (n=36) die Anzahl an c-kit+CD34-CD45- Zellen sowie die Anzahl an Ki67+ Kardiomyozyten im Vergleich zum gesunden Kontrollkollektiv (n=43) signifikant
(p=0,01 bzw. p=0,00) erhöht ist. Dieses Ergebnis stimmt mit den Beobachtungen von
Urbanek et al. an Myokardproben von 20 Patienten mit akutem Myokardinfarkt, sowie
von 20 aufgrund einer ischämischen Schädigung terminal herzinsuffizienten Patienten
überein. Urbanek et al. identifizierten kardiale Stammzellen ebenfalls mit dem Marker
c-kit und verglichen die Patienten mit 12 herzgesunden Kontrollpersonen. Sie fanden
ebenfalls heraus, dass die Anzahl an kardialen Stammzellen v.a. nach akutem Infarkt
und in etwas geringerem Ausmaß nach chronischer Myokardschädigung durch
Ischämie
im
Gegensatz
zum
gesunden
Kontrollkollektiv
erhöht
ist.
Zudem
identifizierten sie in sieben Herzen von Patienten nach akutem Myokardinfarkt Orte
spontaner myokardialer Regeneration, die nicht durch Zellfusion zustande kamen. Sie
postulierten daher, dass es im menschlichen Herz zur Aktivierung kardialer
Stammzellen infolge ischämischer Schädigung kommt (Urbanek 2005). In einer
Diskussion
55
weiteren Studie wurde ebenfalls ein deutlicher Anstieg proliferierender Zellen im
menschlichen Herz nach Myokardinfarkt, insbesondere in der an das nekrotische
Myokard angrenzenden Region beschrieben (Leri 2002). Erste Hinweise auf
myokardiale Regeneration nach ischämischer Schädigung wurden im humanen
Myokard auch schon früher von Anversa et al. und Beltrami et al. beschrieben
(Beltrami 2001; Kajstura 1998). Interessant ist, dass Prozesse, die sich in einem
Anstieg kardialer Stammzellen oder Ki-67+ Kardiomyozyten äußern, in vorliegender
Studie bereits bei Patienten mit einer koronaren Herzerkrankung, die noch keinen
Myokardinfarkt in ihrer Anamnese hatten (n=44), beobachtet werden konnten.
Ausgehend von den Hinweisen auf kardiale Regenerationsprozesse im
pathologisch veränderten Myokard durch die vorliegende Studie und durch die
Ergebnisse zahlreicher Arbeitsgruppen (Beltrami 2001; Kajstura 1998; Leri 2002;
Urbanek 2005), stellt sich die Frage, warum sich diese Regenerationsprozesse klinisch
scheinbar nicht zeigen.
Abgesehen von der geringen Anzahl an c-kit+CD34-CD45- residenten kardialen
Stammzellen mit durchschnittlich 1,3 (+/-1,3) Zellen pro 40000 Kardiomyozyten, die
möglicherweise nicht ausreicht, funktionell wirksame Regenerationsprozesse zum
Ausgleich gravierender Schädigungen im Myokard in Gang zu setzen, sind noch
weitere Gesichtspunkte interessant.
Es ist bemerkenswert, dass Studien zufolge, der Anstieg kardialer Stammzellen bei
Patienten mit chronischer ischämischer Herzschädigung geringer ausfällt als nach
akutem Infarkt (Urbanek 2005). Die Bildung neuer Kardiomyozyten soll bei längerer
Dekompensation und terminaler Herzinsuffizienz abgeschwächt sein (Beltrami 2001;
Kajstura
1998).
In
vorliegender
Studie
konnte
jedoch
gerade
bei
terminal
herzinsuffizienten Patienten, die eine Herztransplantation bekamen, eine erhöhte
Anzahl an Ki-67+ Kardiomyozyten beobachtet werden. So könnten möglicherweise
neben myokardialer Regeneration auch Apoptoseprozesse von Bedeutung sein.
Urbanek et al. beobachteten einen Anstieg an Apoptoseprozessen der kardialen
Stammzellen von 0,3% im Gesunden auf 9,6% im chronisch geschädigten Myokard.
Sie wiesen in der Gruppe der herzinsuffizienten Patienten eine höhere Anzahl
p16INK4a und p53-positiver seneszenter kardialer Stammzellen mit kurzen Telomeren
nach.
p16INK4a,
Alterungsprozesse
p53
und
(McConnell
die
Telomerverkürzung
1998).
p16INK4a
ist
sind
ein
Marker
Cyclin
zellulärer
abhängiger
Kinaseinhibitor (Hara 1996). Er induziert Wachstumsstopp und zelluläre Seneszenz,
indem er Cdk4 und Cdk6 blockiert, die das Retinoblastomaprotein in seinem aktiven
hypophosphorylierten Zustand halten (Hara 1996). Dieser Verlust funktionell
kompetenter kardialer Stammzellen bei chronischer ischämischer Schädigung wurde
Diskussion
56
für den fortschreitenden Funktionsverlust bis hin zur terminalen Herzinsuffizienz
verantwortlich gemacht (Urbanek 2005). Interessant ist, dass sowohl im Myokard
herzinsuffizienter Patienten wie auch im Myokard herzgesunder Personen p16INK4a+
c-kit+CD34-CD45- Zellen nachgewiesen werden konnten (Chimenti 2003). In dieser
Studie wurde ebenso wie in vorliegender Studie ein Anstieg c-kit+CD34-CD45- Zellen
im geschädigten Herzen beobachtet. Jedoch stellte sich heraus, dass im geschädigten
Herzen 59% der c-kit+CD34-CD45- Zellen p16INK4a positv waren, während das nur
bei 14% der c-kit+CD34-CD45- Zellen im gesunden Myokard der Fall war (Chimenti
2003).
Apoptose
und
Nekrose
c-kit+
Zellen
wurde
nur
im
Myokard
der
herzinsuffizienten Patienten beobachtet (Chimenti 2003).
Ein interesanter Aspekt ist auch, dass unabhängig davon, ob ein Organ
Proliferationskapazität
besitzt
oder
nicht,
die
Konsequenz
einer
plötzlichen
Unterbrechung der Blutzufuhr, in allen Organen die Gleiche ist. Von der Niere ist
bekannt, dass sie Zellen besitzt, die wieder in den Zellzyklus eintreten können und
aktiv proliferieren (Kim 2008). Jedoch bedeutet ein Infarkt auch hier Zelltot,
Gewebsverlust und Narbenbildung in der ischämischen Region. Auch der Darm besitzt
Stammzellen, aber auch hier können Stammzellen nekrotische Segmente infolge eines
Mesenterialinfarktes
nicht
ersetzen.
Ebenso
besitzt
die
Haut
Zellen
mit
Selbsterneuerungspotential, aber auch hier wird bei schweren Schädigungen
Narbenbildung und nicht vollständige restitutio ad integrum beobachtet (Leri 2002). So
ist das Selbsterneuerungspotential des Herzens aufgrund von Zellneubildung aus
Stammzellen wie in allen anderen Organen begrenzt, gerade bei plötzlicher Ischämie.
Langsam progrediente Schädigungen scheinen durch diesen Pool an Zellen jedoch
lange kompensiert werden zu können, bevor sie klinisch in Erscheinung treten (Daniel
2006; Urbanek 2003).
5.3
Herkunft der c-kit+CD34-CD45- Zellen und Ki-67+ Kardiomyozyten
im Myokard herzinsuffizienter Patienten
Bei 22 Patienten mit terminaler Herzinsuffizienz konnten im Myokard aller Herzhöhlen
Ki-67+
Kardiomyozyten
und
c-kit+CD34-CD45-
Zellen
nachgewiesen
werden.
Herzinsuffiziente Patienten hatten in allen Herzbereichen signifikant mehr Ki-67+
Kardiomyozyten (p=0,00) als das herzgesunde Kontrollkollektiv (n=43) und tendentiell
ebenfalls mehr c-kit+CD34-CD45- Zellen.
In einer Studie, in der Myokard von 19 herzinsuffizienten Patienten mit Myokard von
sieben herzgesunden Kontrollpersonen verglichen wurde, zeigte sich eine ebenfalls
signifikant erhöhte Anzahl an c-kit+CD34-CD45- Zellen bei den Patienten (Chimenti
Diskussion
57
2003). Einen über zehnfachen Anstieg in der Zahl „sich teilender Kardiomyozyten“ bei
Herzinsuffizienz, der in einer weiteren Studie beobachtet wurde (Urbanek 2005),
konnten wir jedoch nicht bestätigen. Definiert man die „sich teilenden Kardiomyozyten“
über das Vorhandensein des Markers Ki-67, so fanden wir immerhin einen Anstieg um
das vierfache bei herzinsuffizienten Patienten.
Ausgehend
von
dem
vermehrten
Nachweis
an
c-kit+CD34-CD45-
kardialen
Stammzellen und Ki-67+ Kardiomyozyten bei terminaler Herzinsuffizienz stellt sich die
Frage nach der Herkunft dieser Zellen. Prinzipiell ist ein grundlegendes Problem bei
der Diskussion über adulte Stammzellen, ihre unzureichende Definition. Anders als bei
embryonalen Stammzellen, die durch ihren Ursprung aus der inneren Zellmasse der
Blastozyste definiert sind, gibt es keine exakte Definition für adulte Stammzellen. So
kennt keiner den tatsächlichen Ursprung adulter Stammzellen unabhängig vom
Gewebe, also auch nicht den der residenten kardialen Stammzellen (Beltrami 2003).
So kann die Herkunft der vermehrten Anzahl an c-kit+CD34-CD45- kardialen Zellen
und Ki-67+ Kardiomyozyten bei terminaler Herzinsuffizienz auf mehrere Arten gedeutet
werden:
1. Aktivierung kardialer Vorläuferzellen und dadurch Zunahme ihrer Gesamtzahl
und der proliferativen Aktivität des Myokards (Beltrami 2003; Leri 2002;
Urbanek 2003; Urbanek 2005)
2. Einwanderung von Progenitorzellen extrakardialen Ursprungs
3. Fehlende
Ausdifferenzierung
von
Progenitorzellen
unter
pathologischen
Bedingungen und dadurch Akkumulation juveniler Kardiomyozyten
4. Dedifferenzierung bzw. Expression fetaler, embryonaler Moleküle von adulten
Kardiomyozyten bei einer Schädigung
Im Zusammenhang mit Punkt zwei könnte der Nachweis von c-kit+CD34-CD45- Zellen
im Myokard herzinsuffizienter Patienten darauf hinweisen, dass falls es sich um
eingewanderte endotheliale oder hämatopoetische Progenitorzellen handeln sollte,
deren Einwanderung ins Myokard schon länger zurückliegen müsste, da sie ihre
endothelialen und hämatopoetischen Marker schon verloren haben (Nadin 2003).
Im Zusammenhang mit Punkt vier könnten Parallelen von geschädigtem Myokard zu
fetalem Myokard interessant sein. Wie durch vorliegende Studie für geschädigtes
Myokard konnte auch für fetales Myokard eine im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöhte
Anzahl an c-kit+CD34-CD45- Zellen nachgewiesen werden (Kufer 2009). Dies wird
durch die Beobachtungen unterstützt, dass es einerseits bei Ischämie zu einer
schnellen
Induktion
von
SCF,
dem
Liganden
des
c-kit
Rezeptors
kommt
(Frangogiannis 1998) und dass andererseits mRNA des SCF auch im fetalen Myokard
nachgewiesen werden konnte (Beltrami 2003). So könnte es sein, dass Mechanismen
Diskussion
58
der Embryonalzeit auch im geschädigten Myokard eine Rolle spielen. Ergebnisse einer
Forschergruppe des Max-Delbrück-Centrums für Molekulare Medizin liefern ebenfalls
Hinweise darauf, dass Regenerationsprozesse im erwachsenen Organismus von
ähnlichen Mechanismen reguliert werden, wie sie bei der Herzentwicklung des Feten
eine Rolle spielen (Zelarayan 2008). Sie fanden im Tierversuch heraus, dass die
Unterdrückung des Genschalters beta-catenin im Zellkern zur Proliferation kardialer
Vorläuferzellen führt. Interessant ist, dass über diesen Mechanismus der Studie
zufolge auch die Herzentwicklung im Embryo reguliert wird (Zelarayan 2008). Dies
könnte auch erklären, dass sowohl im von uns untersuchten Kollektiv der
herzinsuffizienten Patienten, als auch bei Feten (Kufer 2009) die Zahl an Ki-67+
Kardiomyozyten und c-kit+CD34-CD45- Zellen im Vergleich zur Gruppe der
herzgesunden Erwachsenen erhöht ist.
5.4
Veränderungen im atrialen Myokard bei Vorhofflimmern
In vorliegender Studie wurden sowohl Ki-67+ Kardiomyozyten als auch c-kit+CD34CD45- Zellen im Vorhofmyokard bei 31 Patienten mit chronischem VHF nachgewiesen.
Verglichen mit der ALFA-Studie, in der ein großes Kollektiv von Patienten mit VHF
(n=389) untersucht wurde, gibt es Parallelen zu unserem Kollektiv an Patienten mit
VHF. So liegt beispielsweise das durchschnittliche Alter der Patienten ebenfalls über
60 Jahre, die Relation von Männern zu Frauen beträgt ebenfalls 2:1 und die arterielle
Hypertonie spielt als Risikofaktor bei über 35% der Patienten eine Rolle (Levy 1999).
Im von uns untersuchten Kollektiv an Patienten mit chronischem VHF war die Anzahl
an Ki-67+ Kardiomyozyten im Vergleich zu den c-kit+CD34-CD45- Zellen signifikant
höher (p=0,00). Im Vergleich zu Patienten mit SR (n=81) war die Anzahl an Ki-67+
Kardiomyozyten bei Patienten mit VHF im atrialen Myokard signifikant erhöht (p=0,04).
Bezüglich der c-kit+CD34-CD45- Zellen zeigten sich keine Unterschiede.
Interessant ist also, dass VHF mit einer erhöhten Proliferationsaktivität im Myokard
assoziiert ist. Bekannt ist, dass strukturelle Veränderungen im Vorhofmyokard bei VHF
stattfinden. Als die häufigste pathologische Veränderung bei VHF galt bisher die
interstitielle Fibrose aufgrund einer gesteigerten Fibroblastenaktivität im atrialen
Myokard (Allessie 2002; Ausma 1997). Auch Apoptoseprozesse wurden in Biopsien
von atrialem Myokard bei Patienten mit VHF beobachtet (Aime-Sempe 1999). Man
geht heute davon aus, dass Zelltod und Regeneration durch Hypertrophie aber auch
durch die Bildung neuer Myozyten physiologischer Weise im Herzen stattfinden
(Anversa 2002). Die erhöhte Anzahl an Ki-67+ Kardiomyozyten könnte also einerseits
ein Zeichen proliferativer Aktivität im Sinne eines Regenerationsprozesses mit der
Diskussion
59
Aktivierung kardialer Vorläuferzellen sein, andererseits aber auch ein Zeichen für
vermehrte Apoptoseprozesse im geschädigten Myokard darstellen. Es wurden
strukturelle Parallelen zwischen Myokard bei VHF und Herzinsuffizienz beschrieben.
So spielt beispielsweise der Verlust von Kardiomyozyten durch Apoptose und Nekrose
auch bei Herzinsuffizienz eine Rolle (Nadal-Ginard 2003). Hier wurde gezeigt, dass die
Rate an neu gebildeten Myozyen insbesondere bei einer Zunahme der Wandspannung
ansteigt (Anversa 2002; Nadal-Ginard 2003). Ausma et al. haben im Tiermodell bei
VHF im Myokard einen Phänotyp wenig differenzierter Kardiomyozyten, die
embryonalen Kardiomyozyten ähnlich waren, beschrieben (Ausma 1997). Interessant
ist, dass eine fetalen Myozyten ähnliche Morphologie auch für sich teilende Ki-67+
Kardiomyozyten bei Herzinsuffizenz beschrieben wurde (Nadal-Ginard 2003). Bei
Herzinsuffizienz
wurden
diese Veränderungen
im
Ventrikelmyokard
auf eine
Aktivierung kardialer Progenitorzellen zurückgeführt (Nadal-Ginard 2003). So scheint
eine erhöhte Zahl an Zellen im Zellzyklus, möglicherweise eine generelle Reaktion des
Myokards auf pathologische Bedingungen zu sein.
Wie es strukturelle Parallelen im Myokard von herzinsuffizienten Patienten und
Patienten mit VHF gibt, scheint es auch klinisch einen Zusammenhang zwischen VHF
und einer schlechten Herzfunktion zu geben. Im von uns untersuchten Kollektiv der
Patienten mit VHF fiel eine im Vergleich zu den Kontrollpatienten mit SR stark
eingeschränkte LV-EF (p=0,00) auf. Das könnte darauf hindeuten, dass eine reduzierte
LV-EF ein Prädiktivfaktor für das Auftreten von VHF ist. Tatsächlich wird VHF in
großen Studien, die sich mit Herzinsuffizienz beschäftigen, als starker unabhängiger
Risikofaktor für Mortalität und hohe Morbidität gesehen (Fuster 2006). Wang et al.
untersuchten Teilnehmer der Framingham Heart Study und fanden einen starken
Zusammenhang
zwischen
VHF
und
Herzinsuffizienz.
Sie
postulierten,
dass
Herzinsuffizienz VHF unterstützt, VHF Herzinsuffizienz verschlimmert und Patienten
mit einer der beiden Pathologien, wenn sie die andere zusätzlich entwickeln, eine
schlechte Prognose haben (Wang 2003).
5.5
Ki-67+ Kardiomyozyten und c-kit+CD34-CD45- Zellen bei Patienten
mit Aortenklappenstenose
In
vorliegender
Studie
wurden
28
Patienten
(11weiblich/17männlich)
mit
hämodynamisch relevanter Aortenstenose untersucht, die einen Aortenklappenersatz
bekamen. Sie waren 67,7 +/-13,5 Jahre alt. 13 Patienten hatten eine KHK, jedoch hatte
niemand einen Myokardinfarkt in der Anamnese. Bei 24 Patienten wurde Myokard des
rechten Atriums und bei neun Patienten Myokard des linken Ventrikels untersucht.
Diskussion
60
Aufgrund der geringen Anzahl von neun Proben im linken Ventrikel können
Auswertungen dieses Herzbereiches sicher nur Tendenzen aufzeigen. Statistisch
verlässliche Ergebnisse müssten aus einer größeren Probenanzahl erhoben werden.
Es fällt dennoch auf, dass im linken Ventrikel dieser Patienten nur etwa halb so viele ckit+CD34-CD45- bzw. Ki-67+ Kardiomyozyten vorliegen als im rechten Vorhof, obwohl
das Myokard des linken Ventrikels in der Pathogenese dieser Erkrankung am frühesten
und am meisten von allen Herzbereichen verändert sein müsste. So wären hier folglich
am ehesten Regenerationsprozesse zu erwarten, zumal gezeigt wurde, dass die Rate
an neu gebildeten Myozyten insbesondere bei einer Zunahme der Wandspannung
ansteigt (Anversa 2002; Nadal-Ginard 2003). Grund für diese Diskrepanz könnte die
Auswertung
einer
Fläche
angesichts
der
Tatsache,
dass
insbesondere
bei
Aortenstenose der linke Ventrikel einer chronischen Druckbelastung ausgesetzt ist und
darauf mit der Entwicklung einer konzentrischen Hypertrophie reagiert, sein (Daniel
2006). Folglich sind wahrscheinlich größere und weniger Zellen in die Auswertungen
eingegangen. Trotzdem waren bei Patienten mit Aortenstenose im Vergleich zu
herzgesunden Kontrollpersonen (n=43) mehr Ki-67+ Kardiomyozyten nachweisbar. In
einer Studie von Urbanek et al. (Urbanek 2003) wurden Proben aus dem Ausflusstrakt
von 36 Patienten mit relevanter Aortenklappenstenose und Klappenersatz auf das
Vorhandensein c-kit+lin- sowie Ki-67+ Zellen untersucht und die Daten mit 12
Kontrollpersonen, die ebenfalls an einer nicht kardialen Ursache verstorben waren
verglichen. Hinsichtlich der Risikofaktoren und der Medikation unterscheiden sich
unsere Patientengruppe und die der Studie nicht. Urbanek et al. stellten in der
Patientengruppe eine signifikante Erhöhung an c-kit+lin- Zellen im Vergleich zur
Kontrollgruppe fest. Dies konnten wir nicht bestätigen. Weiterhin führte die
Aortenstenose in der Studie von Urbanek et al. zu einem Anstieg an Ki-67+ Myozyten.
Wir konnten ebenfalls einen Anstieg an Ki-67+ Kardiomyozyten, sowie ein vermehrtes
Vorliegen von Ki-67+ Kardiomyozyten im Vergleich zu c-kit+CD34-CD45- Zellen
nachweisen. Aufgrund ihrer Ergebnisse postulierten Urbanek et al., dass die
Aortenstenose im menschlichen Myokard die Bildung neuer Myozyten durch die
Differenzierung kardialer Stammzellen verursacht und eine Erhöhung kardialer Masse
aufgrund von Hypertrophie und Hyperplasie entsteht (Urbanek 2003). Sie brachten die
Tatsache, dass das Wachstum und die Differenzierung kardialer Stammzellen in reife
Myozyten
im
hypertrophierten
Myokard
von
Patienten
mit
chronischer
Aortenklappenstenose erhöht war mit der Tatsache in Verbindung, dass Patienten mit
Aortenklappenstenose eine gute ventrikuläre Funktion für viele Jahre bevor die
Dekompensation sichtbar wird haben (Carabello 1997). Es ist bekannt, dass Patienten
mit Aortenstenose typischerweise lange asymptomatisch bleiben (Daniel 2006).
Diskussion
61
Interessant ist auch, dass die von uns untersuchten Patienten durchschnittlich eine
gute Pumpfunktion (LV-EF 53,2 +/-13,2%) hatten. Dies könnte im Zusammenhang mit
den beschriebenen Hinweisen auf myokardiale Regeneration bedeuten, dass kleine,
schleichende Einschränkungen der ventrikulären Funktion im Unterschied zu einer
fulminanten
Ischämie
durchaus
Regenerationsprozesse
könnten
ausgeglichen
dazu
beitragen,
werden
können.
dass
Diese
hämodynamische
Veränderungen lange Zeit stabil bleiben.
5.6
Einfluss
von
Medikation
und
Nikotin
auf
die
untersuchten
Zellpopulationen
Allgemein kann man sagen, dass aus vorliegender Studie kein eindeutiger
Zusammenhang einer bestimmten Medikation mit den untersuchten Zellpopulationen
abgeleitet werden kann. Dies hängt möglicherweise damit zusammen, dass die von
uns untersuchten Patienten je nach Herzerkrankung ähnlich behandelt wurden. So ist
die Medikation eng verknüpft mit der Erkrankung und kein unabhängiger Einflussfaktor
auf die Zellpopulationen. Es war auch nicht Ziel dieser Studie das Verhalten der
untersuchten Zellpopulationen unter dem Einfluss einer bestimmten Medikation zu
testen. Den Einfluss von bestimmten Arzneimitteln auf proliferierende Zellen im
Myokard müsste man in Studien mit einem anderen Design überprüfen. Jedoch sind
einzelne Ergebnisse der Untersuchungen vorliegender Studie durchaus interessant
und könnten Anlass für weitere Untersuchungen geben.
So zeigten beispielsweise experimentelle und klinische Studien, dass ACE-Hemmer
und Angiotensinrezeptorantagonisten die Inzidenz von VHF senken können (Fuster
2006). Sie sollen Fibrose im atrialen Myokard reduzieren und so der Entstehung von
VHF vorbeugen können (Li 2001). Im atrialen Myokard von Patienten mit chronischem
VHF wurde eine stark erhöhte Expression von angiotensin converting enzyme
beobachtet (Goette 2000). Interessanterweise wurde auch bei Herzinsuffizienz
aufgrund ischämischer Herzerkrankungen ein Anstieg von Angiotensin II beobachtet,
der u.a. für Apoptoseprozesse und Ventrikeldilatiation verantwortlich gemacht wurde
(Nadal-Ginard
2003).
Angiotensin
II
spielt
offensichtlich
nicht
nur
in
der
Blutdruckregulation sondern auch in der Zellzyklusregulation eine Rolle. Im Tiermodell
wurde unter vermehrter Angiotensinexpression ein Anstieg Ki-67+ Zellen im Herzen
beobachtet (Mervaala 2000). Ein weiterer interessanter Aspekt ist, dass die Hemmung
von angiotensin converting enzyme mit der Funktion des Peptids Ac-SDKP, welches
Stammzellwachstum unterhält, interferiert (Azizi 1996). Ac-SDKP ist ein Peptid, das
Diskussion
62
frühe Progenitorzellen in die S-Phase versetzt. Die Gabe eines ACE-Hemmers kann
das Plasmalevel von Ac-SDKP beim Menschen erhöhen (Azizi 1996).
In vorliegender Studie konnte jedoch kein Effekt einer ACE-Hemmer bzw. AT-IIInhibitortherapie auf die Proliferationsaktivität von Kardiomyozyten gezeigt werden.
Möglicherweise waren für solche Untersuchungen die Zahlen der von uns untersuchten
Patienten zu gering. Es ist auch wahrscheinlich, dass für die Aktivierung von
Fibroblasten und Kardiomyozyten unterschiedliche Signalwege von Bedeutung sind.
Der Benefit einer ACE-Hemmer Therapie bei Patienten mit VHF, hängt sicher von
mehreren Faktoren ab und müsste noch genauer untersucht werden.
Des
Weiteren
führte
in
der
RALES-Studie
die
Gabe
eines
Aldosteronantagonisten bei schwer herzinsuffizienten Patienten (EF<35%) zu einer
Verbesserung der Symptomatik und der Sterblichkeit infolge Pumpversagens (Hogg
2004).
Auch
in
der
EPHESUS-Studie
wurde
bei
Postinfarktpatienten
mit
eingeschränkter Ejektionsfraktion und Herzinsuffizienzsymptomen durch die Gabe
eines Aldosteronantagonisten eine Verbesserung der Symptomatik und Senkung der
Mortalitätsrate
nachgewiesen
(Pitt
2004).
Interessanterweise
zeigte
sich
bei
herzinsuffizienten Patienten, die in vorliegender Studie untersucht wurden, die
Tendenz, dass diese Patienten unter der Therapie mit einem Aldosteronantagonisten
mehr c-kit+CD34-CD45-Zellen haben. Möglicherweise liegt der positiven Wirkung der
Aldosteronantagonisten eine Aktivierung kardialer Progenitorzellen zu Grunde.
In einer Studie von Vasa et al. wurde gezeigt, dass Statine bei Patienten mit
stabiler koronarer Herzerkrankung die Anzahl im Blut zirkulierender endothelialer
Progenitorzellen hämatopoetischen Ursprungs stimulieren können (Vasa 2001).
Bemerkenswerterweise zeigte sich auch im Patientenkollektiv vorliegender Studie der
Trend einer erhöhten Anzahl an c-kit+CD34-CD45- Zellen unter Statintherapie. So
wäre vorstellbar, dass Statine auch einen Einfluss auf Progenitorzellen nicht
hämatopoetischen Ursprungs haben. Ausgehend von diesen Hinweisen wäre es
interessant zu evaluieren, ob Statine die Proliferation kardialer Progenitorzellen im
geschädigten Myokard anregen und so zu einer Verbesserung der Herzfunktion
beitragen können.
Da es Hinweise darauf gibt, dass Nikotin am Wachstum von Tumoren mitwirkt
und laut C. Amos, einem Genetiker am M. D. Anderson Cancer Center der University
of Texas in Houston, die Zellproliferation, die Entwicklung neuer Blutgefäße und
Wachstumsfaktoren aktiviert, indem es verschiedene Signalwege hochreguliert, könnte
man auch einen Einfluss des Nikotins auf die Proliferation der kardialen Vorläuferzellen
annehmen. So zeigte sich im untersuchten Patientenkollektiv der Trend einer erhöhten
Anzahl c-kit+CD34-CD45- Zellen im Myokard von Rauchern im Vergleich zu
Diskussion
63
Nichtrauchern. Erstaunlicherweise führt das vermehrte Vorliegen c-kit+CD34-CD45Zellen bei Rauchern nicht zu einem messbaren Vorsprung an Proliferationsaktivität
insgesamt,
gemessen
an
der
Anzahl
an
Ki-67
positiven
Kardiomyozyten.
Interessanterweise wurde Ähnliches auch für Reparaturmechanismen in Gelenken und
im Knochen herausgefunden. Hier wird durch Benzapyren im Tabakrauch über den
Faktor SOX-9 die Umwandlung von Stammzellen in Knorpelzellen gehemmt (Zuscik
2007). So könnte durch das Rauchen auch die Ausdifferenzierung der Stammzellen im
Herzen gebremst werden, was zu einer insgesamt nicht erhöhten Proliferationsaktivität
führt.
5.7
Zusammenhang demographischer Daten mit den untersuchten
Zellpopulationen
In vorliegender Studie wurde Myokard von Kindern (n=14) mit angeborenen
Herzfehlern im Alter von 0-18 Jahren sowie Myokard von Erwachsenen (n=112) mit
kardialen Erkrankungen im Alter von 26-86 Jahren untersucht. Zudem wurde fetales
Myokard (n=34) und Myokard verstorbener Personen (n=43) untersucht und in einer
anderen Arbeit ausgewertet (Kufer 2009). So wurden Proben des gesamten
menschlichen Lebensalters untersucht. Es hat sich gezeigt, dass in allen Altersgruppen
sowohl c-kit+CD34-CD45- Zellen als auch Ki-67+ Kardiomyozyten nachgewiesen
werden können.
Diese Tatsache legt die Vermutung nahe, dass Progenitorzellen von der Fetalzeit an
undifferenziert im Myokard überleben können. Bekannt ist, dass in der frühen Fetalzeit
c-kit+ Zellen die Leber und den Dottersack kolonisieren (Teyssier-Le Discorde 1999).
Denkbar wäre, dass auch einige der c-kit+ Zellen ins Myokard einwandern und dort in
Nischen überleben.
Bei der Untersuchung der Patientengruppe bezüglich des Geschlechts ergaben
sich keine Unterschiede in der Anzahl der c-kit+CD34-CD45- Zellen sowie der Ki-67+
Kardiomyozyten. Die Geschlechterverteilung bei den herzkranken Patienten war mit 80
Männern
zu
32
Frauen
ungleich.
Jedoch gibt
es
auch
bei
der
Analyse
epidemiologischer Daten Hinweise darauf, dass Männer im Allgemeinen zumindest von
den häufigsten kardialen Erkrankungen häufiger betroffen sind als Frauen. Männer
weisen laut Bundesärztekammer eine höhere Rate an koronaren Ereignissen auf als
Frauen. Männer sind mit einer Geschlechterrelation von 1,5:1 häufiger von chronischer
Herzinsuffizienz betroffen als Frauen (McMurray 2000). Auch VHF tritt bei Männern in
einer Relation von 2:1 im Vergleich zu Frauen häufiger auf (Levy 1999). Für die
Diskussion
64
Berechnungen in vorliegender Studie wurde daher nicht bezüglich des Geschlechts
unterschieden.
5.8
C-kit+CD34-CD45-
Zellen
sowie
Ki-67+
Kardiomyozyten
im
kindlichen Myokard
Im Myokard von Kindern mit angeborenen Herzfehlern konnten sowohl c-kit+CD34CD45- Zellen als auch Ki-67+ Kardiomyozyten nachgewiesen werden. Wie im Myokard
der erwachsenen Patienten waren weniger c-kit+CD34-CD45- Zellen als Ki-67+
Kardiomyozyten nachweisbar (p=0,00).
Tallini et al. postulierten in einer kürzlich veröffentlichten Studie, dass die Expression
von c-kit im neonatalen Herzen, residente kardiale Progenitorzellen, die in vitro zur
Differenzierung in endotheliale Zellen, kardiale und glatte Muskelzellen fähig sind,
markiert (Tallini 2009). Die Studie wurde an Mäusen durchgeführt. Interessant ist, dass
ein Anstieg der Anzahl an c-kit+ Zellen im embryonalen Herzen bis zu einem Maximum
am zweiten postnatalen Tag, gefolgt von einem Abfall und seltenen Vorkommen im
erwachsenen Herzen beobachtet wurde (Tallini 2009). In vorliegender Studie wurden
ebenfalls im kindlichen und erwachsenen Myokard ähnlich niedrige Zahlen an ckit+CD34-CD45- Zellen gefunden.
Jedoch ist die Anzahl Ki-67+ Kardiomyozyten im kindlichen Myokard in vorliegender
Studie signifikant höher als im Myokard Erwachsener (p=0,00). Dies könnte man
möglicherweise auf eine Massenzunahme des kindlichen Herzens zurückführen.
5.9
Methodische Aspekte
Unser Ziel bestand darin, eine Aussage über das prinzipielle Vorhandensein und die
Verteilung kardialer Zellen mit Stammzelleigenschaften im menschlichen Myokard zu
machen.
Wir wählten immunhistochemische Verfahren für unsere Untersuchungen, da unsere
Proben in Formalin fixiert und teilweise bereits in Paraffin eingebettet vorlagen. Wir
verwendeten kommerziell erhältliche Färbekits, um einen Einfluss aufgrund einer
unterschiedlichen Zusammensetzung der Substanzen möglichst auszuschließen und
eine große Anzahl an Proben mit konstant gleichen Methoden untersuchen zu können.
Um das Antigen Ki-67 nachzuweisen, führten wir Einfachfärbungen mit einem
Amplifikationssystem (CSA-System, DAKO, Hamburg) durch. Für den Nachweis ckit+CD34-CD45- Zellen benutzten wir ein Mehrfachfärbesystem, das auf einer
Polymermethode beruht (EnVisionDoublestain System, DAKO, Hamburg). Beide
Diskussion
65
Systeme haben den Vorteil einer hohen Sensitivität, da auch sehr kleine Mengen an
Zielantigen nachweisbar sind (Bobrow 1989; Toth 2007). Andererseits kann die
Signalverstärkung, gefärbte Strukturen größer erscheinen lassen und möglicherweise
Zellgrenzen überdecken, so dass Signale eng beieinanderliegender Zellen als ein
Signal interpretiert werden könnten.
Die
Auswertung
unserer
immunenzymatischen
Färbungen
erfolgte
mittels
Lichtmikroskopie im konventionellen Durchlichtverfahren. Andere Arbeitsgruppen
verwendeten
Immunfluoreszenzfärbungen
und
werteten
die
Präparate
mittels
konfokaler Mikroskopie aus (Anversa 2002; Beltrami 2003; Nadal-Ginard 2003;
Urbanek 2003). Durch letzteres Verfahren gelingt eine dreidimensionale Darstellung
des Gewebes, was insbesondere bei der Färbung mehrerer Antigene in einem Schnitt
von Vorteil ist. Andererseits klingen Fluoreszenzsignale in relativ kurzer Zeit ab und
Autofluoreszenz durch Formaldehydfixierung kann die Ergebnisse verfälschen, was bei
immunenzymatischen Färbetechniken nicht vorkommt.
Wir identifizierten proliferierende Kardiomyozyten anhand ihrer positiven Kernfärbung
für Ki-67 jedoch zusätzlich an der Morphologie der Zelle, in der die positive Färbung
lag. Prinzipiell hat die Struktur der Herzmuskulatur typische Merkmale wie z.B. einen
regelmäßigen Aufbau spezieller quergestreifter Muskelfasern, Glanzstreifen und
mittelständige Zellkerne, anhand derer man sie lichtmikroskopisch als solche gut
identifizieren kann. Die genauen Zellgrenzen hingegen kann man lichtmikroskopisch
nur unzureichend beurteilen. Daher ist es möglich, dass mehrkernige Kardiomyozyten
als mehrere einzelne Zellen gewertet wurden.
Die Ermittlung quantitativer Daten aus immunhistochemischen Experimenten kann
ungenau und untersucherabhängig sein. Es wurden deshalb je Probe jeweils zwei
Schnitte und pro Schnitt 10 verschiedene, nicht überlappende und zufällig ausgewählte
Gesichtsfelder von 316x249µm Fläche von zwei Untersuchern ausgewertet. Insgesamt
wurden 13840 Gesichtsfelder analysiert.
5.10
Schlussfolgerungen und Ausblick
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass es residente c-kit+CD34-CD45Stammzellen im Myokard von Patienten mit kardialen Erkrankungen gibt. Die Anzahl
dieser Zellen ist jedoch sehr gering. Zudem konnte Proliferationsaktivität mit Hilfe des
nukleären Proteins Ki-67 im Myokard von Patienten nachgewiesen werden. Es wurde
gezeigt, dass im pathologisch veränderten Myokard mehr c-kit+CD34-CD45- Zellen als
im gesunden Myokard vorliegen und eine höhere Proliferationsaktivität gemessen an
Ki-67+ Kardiomyozyten beobachtet werden kann. So ist davon auszugehen, dass im
Diskussion
menschlichen
66
Myokard
insbesondere
unter
pathologischen
Bedingungen
Regenerationsprozesse stattfinden.
Um residente kardiale Stammzellen für eine Zelltherapie beim Menschen nutzen zu
können, müssten jedoch noch weitere Nachforschungen auf diesem Gebiet angestellt
werden. Zunächst müsste die Population residenter kardialer Stammzellen genauer
charakterisiert werden. Dazu wären die Isolierung dieser Zellen aus humanem
Myokard sowie Untersuchungen in Zellkultur notwendig. Auch müssten weitere
Erkenntnisse über das tatsächliche Regenerationspotential dieser Zellen gewonnen
werden. Es müsste evaluiert werden, ob man im Anbetracht des geringen
Vorkommens dieser Zellen im menschlichen Myokard eine ausreichende Anzahl dieser
Zellen für eine Zelltherapie gewinnen könnte. Es bleibt auch zu klären, inwieweit diese
Zellen tatsächlich vermehrbar sind und inwiefern eine Applikation dieser Zellen in
geschädigtes Myokard beim Menschen erfolgen könnte. Im Tierversuch wurden c-kit+
kardiale Progenitorzellen bereits in vitro vermehrt und ins Infarktgebiet intramyokardial
oder intrakoronar injiziert. Es wurde eine Einwanderung dieser Zellen ins Infarktareal
sowie eine Verbesserung der kardialen Funktion durch den Ersatz des geschädigten
Herzgewebes beobachtet (Beltrami 2003; Dawn 2005; Messina 2004).
Neben dem Zellersatz durch Vermehrung kardialer Stammzellen in vitro und die
Reimplantation dieser Zellen in geschädigtes Myokard, wäre als weitere Möglichkeit
eines therapeutischen Ansatzes die Stimulation vorhandener kardialer Stammzellen
zur Proliferation denkbar. Beispielsweise wurde am Mäusemodell gezeigt, dass die
Differenzierung von Kardiomyozyten aus Herzvorläuferzellen die Anwesenheit des
Fibroblasten-Wachstumsfaktors-2 (FGF-2) erfordert. So könnte FGF-2, das bereits als
Medikament zur Förderung von Revaskularisation geprüft wird, darüber hinaus durch
seine Wirkung auf kardiale Vorläuferzellen zu Regeneration von geschädigtem
Myokard beitragen (Rosenblatt-Velin 2005).
Zusammenfassend könnte man sagen, dass obwohl noch einige Bemühungen bis zu
einem erfolgreichen therapeutischen Einsatz kardialer Stammzellen nötig sind, die
Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zu weiteren Nachforschungen auf dem Gebiet
kardialer Regeneration durch herzeigene Stammzellen ermutigen.
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Abkürzungsverzeichnis
7
77
Abkürzungsverzeichnis
Englische Bezeichnungen sind kursiv gedruckt.
ABC
Avidin-Biotin-Komplex
ACB
Aortokoronarer Bypass
ACE
Angiotensin converting enzyme
AG
Antigen
AK
Antikörper
AKE
Aortenklappenersatz
AP
Alkalische Phosphatase
ASS
Acetylsalicylsäure
AT
Angiotensin
BMI
Body Mass Index
CD
Cluster of Differentiation
CSC
Cardiac stem cell
CSA
Catalyzed Signal Amplifikation
DAB
3,3-Diaminobenzidintetrahydrochlorid
DNS
Desoxyribonukleinsäure
EC
Endothelzelle
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
FGF-2
Fibroblastenwachstumsfaktor 2
GF
Gesichtsfeld
HRP
Horseradish Peroxidase
HTX
Herztransplantation
Ig
Immunglobulin (z.B. IgG)
Isl-1
Islet-1
kDa
Kilodalton
KHK
Koronare Herzerkrankung
Ki-67
Proliferationsmarker
KMSZ
Knochenmarkstammzellen
LA
Linkes Atrium
Lin-
lineage -, negativ für die Expression von Blutstammzellmarkern
LV
Linker Ventrikel
LV-EF
Linksventrikuläre Ejektionsfraktion
M-Phase
Mitosephase im Zellzyklus – Zellteilung
mRNA
messenger Ribonucleinsäure
Abkürzungsverzeichnis
78
NaCl
Natriumchlorid
PAP
Peroxidase-anti-Peroxidase
PBS
Phosphate Buffered Saline
PTCA
Perkutane transluminare koronare Angioplastie
RA
Rechtes Atrium
RV
Rechter Ventrikel
SCF
Stem cell factor
S-Phase
Synthese Phase des Zellzyklus – Reduplikation der DNA
SPSS
Statistical Package for the Social Sciences
SR
Sinusrhythmus
TBS
Tris Buffered Saline
TBST
Tris-Pufferlösung mit Tween
VHF
Vorhofflimmern
Anhang
79
8
Anhang
8.1
Färbeprotokolle
Protokoll 1: Einfachfärbung mit der ABC-Methode im CSA-System (DAKO)
A. Vorbereitungen: Feuchte Kammern herstellen, Antikörper verdünnen,
B. Blockieren endogener Substanzen:
B1: Peroxidase Block (Wasserstoffperoxid) für 5’ Æ Waschen mit TBS-T
B2: Protein Block (serumfreies Protein) für 5’ Æ Abklopfen
C. Immunhistochemische Färbung
C1: Primär-AK bzw. Negativkontrolle für 15’ Æ Waschen mit TBS-T
C2: Biotinmarkierter Brücken-AK (biotinylierte Kaninchen Anti-Maus Immunglobulin) für
15’ ÆWaschen mit TBS-T
C3:Streptavidin-Biotin-Peroxidase-Komplex für 15’ Æ Waschen mit TBS-T
C4: Verstärkungsreaktion (Biotinyltyramid) für 15’ Æ Waschen mit TBS-T,
C5: Streptavidin-Peroxidase für 15’Æ Waschen mit TBS-T
C6: Chromogen-Substrat-Reaktion für ca. 2-4’Æ Blocken mit Aqua dest.
D. Abdeckung mit wässrigem Eindeckmedium
Protokoll 2:
Mehrfachfärbung mit der Polymer-Methode im EnVision G/2
Doublestain System (DAKO)
A. Vorbereitungen: Feuchte Kammern herstellen; Antikörper verdünnen
B. Blockieren endogener Substanzen: Dual-Endogenous-Enzyme-Block
(Wasserstoffperoxid, Enzymhemmer) für 5’ Æ Waschen mit TBS-T
C. Immunhistochemische Färbung
C1: Primär-AK 1 bzw. Negativkontrolle für 30’ Æ Waschen mit TBS-T
C2: Polymer/HRP (mit Meerrettichperoxidase und affinitätsisolierten Immunglobulinen
konjugiertes Dextranpolymer) für 10’ Æ Waschen mit TBS-T
C3: DAB+ Arbeitslösung für 6’ Æ Abspülen mit Wasser
C4: Doublestainblock für 3’ Æ Waschen mit TBS-T
C5: Primär-AK 2 bzw. Negativkontrolle für 15’ Æ Waschen mit TBS-T
C6: Rabbit/Mouse-Link (mit sekundären Antikörpern gegen Kaninchen- und MausImmunglobuline gekoppeltes Dextranpolymer) für 10’ Æ Waschen mit TBS-T
C7: Polymer/AP (mit alkalischer Phosphatase und affinitätsisolierten Immunglobulinen
konjugiertes Dextranpolymer) für 10’ Æ Waschen mit TBS-T
C8: Permanent-Red für 5’ Æ Abspülen mit Wasser für 5’
D. Abdeckung mit wässrigem Eindeckmedium
Anhang
8.2
80
Daten der Patientengruppen
Tabelle A1: Daten zur Patientengruppe „Aortenklappenersatz bei Aortenstenose“
Patienten mit Aortenklappenersatz bei
Aortenklappenstenose
n = 28
%
17 / 11
60 / 40
KHK
13
46
Myokardinfarkt
0
0
VHF
8
29
Thrombozytenaggregationhemmer
15
54
Betablocker
17
61
ACE-Hemmer
14
50
Diuretika
18
64
Nitrate
2
7
Ca-Antagonisten
7
25
Aldosteronantagonisten
1
4
Statine
11
39
Arterielle Hypertonie
19
68
Hyperlipidämie
16
57
Nikotin
8
29
Diabetes mellitus
8
29
männlich / weiblich
Medikation
Atherogene Risikofaktoren
Mittelwert +/- SD
Alter (Jahre)
67 +/- 13
BMI (kg/m²)
28 +/-5
LV-EF (%)
53 +/- 13
Anhang
81
Tabelle A2: Daten zur Patientengruppe der Postinfarktpatienten
Postinfarktpatienten
n = 36
%
25 / 11
69 / 31
11
31
Thrombozytenaggregationhemmer
27
75
Betablocker
29
81
ACE-Hemmer
22
61
Diuretika
19
53
Nitrate
9
25
Ca-Antagonisten
5
14
Aldosteronantagonisten
8
22
Statine
23
64
Arterielle Hypertonie
26
72
Hyperlipidämie
26
72
Nikotin
11
31
Diabetes mellitus
13
36
männlich / weiblich
VHF
Medikation
Atherogene Risikofaktoren
Mittelwert +/- SD
Alter (Jahre)
64 +/-8
BMI (kg/m²)
28 +/-3
LV-EF (%)
36 +/-21%
Ki-67+Zellen/mm² im RA (n=34)
4,6 +/-3,5
c-kit+CD34-CD45-Zellen/mm² im RA (n=34)
1,5 +/-1,4
Anhang
82
Tabelle A3: Daten zur Patientengruppe der terminal herzinsuffizienten Patienten mit
Herztransplantation
Terminal herzinsuffizente Patienten mit
Herztransplatation
n = 22
%
18 / 4
82 / 18
KHK
10
46
Myokardinfarkt
12
55
VHF
15
68
Thrombozytenaggregationhemmer
11
50
Betablocker
20
91
ACE-Hemmer
16
73
Diuretika
19
86
Nitrate
3
14
Ca-Antagonisten
2
9
Aldosteronantagonisten
10
46
Statine
13
59
Arterielle Hypertonie
11
50
Hyperlipidämie
13
59
Nikotin
3
14
Diabetes mellitus
7
32
männlich / weiblich
Medikation
Atherogene Risikofaktoren
Mittelwert +/- SD
Alter (Jahre)
55 +/-10
BMI (kg/m²)
26 +/-3
LV-EF (%)
16 +/-6
Ki-67+Zellen/mm²
c-kit+CD34-CD45-Zellen/mm²
Mittelwert +/- SD
Mittelwert +/- SD
RA (n=20)
4,1 +/-3,2
1,4 +/-1,3
LA (n=21)
3,2 +/-2,1
1,7 +/-1,4
RV (n=22)
3,3 +/-3,5
2,0 +/-1,2
LV (n=22)
3,5 +/-4,7
1,0 +/-0,9
Anhang
83
Tabelle A4: Vergleich zwischen Patienten mit chronischem VHF und Patienten mit SR
Patienten mit VHF
Patienten mit SR
n = 31
%
n= 81
%
21 / 10
68 / 32
59 / 22
73 /27
KHK
19
61
63
78
Myokardinfarkt
11
36
25
31
Aortenklappenstenose
8
26
20
25
Thrombozytenaggregationhemmer
14
45
62
77
Betablocker
27
87
58
72
ACE-Hemmer
17
55
51
63
Diuretika
25
81
36
44
Nitrate
7
23
15
19
Ca-Antagonisten
3
10
19
24
Aldosteronantagonisten
7
23
8
10
Statine
15
48
48
59
Arterielle Hypertonie
17
55
62
77
Hyperlipidämie
19
61
57
70
Nikotin
5
16
32
40
Diabetes mellitus
10
32
24
30
männlich / weiblich
Medikation
Atherogene Risikofaktoren
Mittelwert
Mittelwert
+/- SD
+/- SD
Alter (Jahre)
62 +/-12
64 +/-12
n.s.
BMI (kg/m²)
27 +/-4
27 +/-4
n.s.
LV-EF (%)
35 +/-21%
51 +/-18
p=0,00
Ki-67+ Zellen/mm² im RA
5,1 +/-3,4
3,5 +/-2,4
p=0,04
1,1 +/-1,1
1,4 +/-1,4
n.s.
c-kit+CD34-CD45- Zellen/mm² im
RA
Signifikanz
Danksagung
9
84
Danksagung
Bedanken möchte mich bei allen, die mich bei der Durchführung dieser Arbeit
unterstützt haben.
Herrn Prof. Dr. med. W. G. Daniel, dem Klinikdirektor der Medizinischen Klinik II an der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg danke ich für die Möglichkeit, mein
Dissertationsvorhaben an seiner Klinik durchzuführen und sein Interesse an meiner
Doktorarbeit.
Herrn Prof. Dr. med. Christoph Garlichs danke ich für die Annahme als Doktorandin in
seinem Labor und die stets freundliche Unterstützung während der Durchführung
meiner Arbeit.
Ein ganz besonderer Dank gilt Herrn Dr. med. Martin Arnold für seine sehr gute
fachliche und
freundliche
Betreuung,
seine Art
zu Motivieren
sowie
seine
kontinuierliche Hilfsbereitschaft.
Bedanken möchte ich mich auch bei Herrn Prof. Dr. T. Fischlein und seinen
Mitarbeitern des Universitätsklinikums Erlangen sowie Herrn Prof. Dr. Dr. H.
Reichenspurner und seinen Mitarbeitern des Universitätaklinikums Hamburg für die
Bereitstellung der Proben.
Ich möchte auch Frau Katja Schubert und Herrn Heinrich Bär sowie allen weiteren
MitarbeiterInnen des Labors für molekulare Kardiologie der Universität ErlangenNürnberg für ihre Hilfsbereitschaft, die Unterstützung und das angenehme Arbeitsklima
im Labor danken.
Nichtzuletzt danke ich meinen Eltern und Martin sehr herzlich für ihre Unterstützung.
Lebenslauf
10
85
Lebenslauf
Persönliche Daten
Name:
Schütz
Vornamen:
Annette Luitgard
Geburtsdatum:
23.02.1983
Geburtsort:
Bamberg
Staatsangehörigkeit:
deutsch
Familienstand:
ledig
Schulbildung
1989 - 1993
Grundschule Litzendorf
1993 - 2002
Maria-Ward-Gymnasium Bamberg
2002
Allgemeine Hochschulreife
Studium
2002 - 2008
Studium der Humanmedizin an der Friedrich-AlexanderUniversität Erlangen-Nürnberg
08/2004
Ärztliche Vorprüfung
08/2007 – 07/2008
Praktisches Jahr:
08/2007 – 12/2007
Gynäkologie/Geburtshilfe, Lehrkrankenhaus der
Universität Bern in Langenthal
12/2007 – 03/2008
Innere Medizin, Medizinische Klinik IV (Pneumologie,
Allergologie,
Schlafmedizin),
Zentraler
Aufnahmebereich, Klinikum Bamberg
03/2008 – 07/2008
Chirurgie, Universitätsklinikum Erlangen
11/2008
Abschluss: Ärztliche Prüfung
Ärztliche Tätigkeit
ab 04/2009
Assistenzärztin am Klinikum Amberg
Internistischer