Versuch 02 Leitungsgeschwindigkeit an Axonen

Tierphysiologisches Praktikum (Teil Neurophysiologie) SS 2005
Johannes Gutenberg Universität Mainz
Protokoll zum 2.Kurstag am 09.05.2005
Versuch 2: „Fortgeleitete Aktionspotentiale einzelner
Nervenfasern“
Protokollant: Max Mustermann
Matrikelnummer: X
Studiengang: X
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An diesem Versuchstag wird die aktive Erregungsfortleitung an Axonen
untersucht. Als Versuchsobjekte werden der Nervus ischiadicus des
Krallenfrosches (Xenopus laevis) und die Riesenfasern im Bauchmark des
Regenwurms (Lumbricus terrestris) verwendet.
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Einleitung
Im ersten Versuchsteil dient der Nervus ischiadicus (wird freipräpariert: nach
Versuchsanleitung) des Krallenfrosches als Versuchsobjekt. Dieser Nerv entspringt
am Rückenmark des Frosches und verläuft bis zur Fußspitze. Er setzt sich sowohl
aus efferenten als auch aus afferenten Nervenfasern zusammen. Zu bestimmen ist
die Leitungsgeschwindigkeit von unterschiedlichen Axongruppen aus denen der Nerv
besteht, in Abhängigkeit vom Axondurchmesser. Es soll auch die Dauer der
absoluten- und der relativen Refraktärzeit bestimmt werden. Eine weitere Aufgabe ist
es die Abhängigkeit des Summenpotentials von der Reizamplitude zu untersuchen.
Ein Summenpotential (im Weiteren SP genannt) ist die Summe der elektrischen
Aktivitäten am Ableitort.
Im zweiten Teil des Versuches dient der Regenwurm als Versuchsobjekt. Untersucht
werden die Riesenfasern im Bauchmark des Wurms. Es gibt eine Mediane
(segmental gegliedert und über gap-junctions elektrisch gekoppelt) und zwei Laterale
(über Querverbindungen gekoppelt funktioniert als eine Einheit). Somit sind sie
abgeleiteten Potentiale keine SP wie beim Nervus ischidicus, sondern
Einzelpotentiale. Es werden, wieder die Leitungsgeschwindigkeit, die Dauer der
absoluten und der relativen Refraktärzeit bestimmt. Die Latenzzeit (Zeit zwischen
Reiz und AP) sollte eigentlich auch bestimmt werden, doch haben ich es versäumt
den Abstand zwischen Reizelektroden und reiznahen Elektroden zu notieren Material und Methode
Zur Messung der SP (Versuchsteil 1) bzw. der Einzelpotentiale (Versuchsteil 2) dient
eine Ableitkammer. Diese ist alle 5mm von dünnen Platindrähten durchzogen, denen
der freipräparierte Nerv (Versuchsteil 1) bzw. der Regenwurm (Der Regenwurm wird
als Ganzes auf die Elektroden gelegt ) (Versuchsteil2) aufliegt.Über versetzt
angebrachte Elektroden, die mit den Platindrähten in Verbindung stehen, können die
Spannungen extrazellulär (in Versuchsteil 2 sogar von der Oberfläche des Wurms)
abgegriffen werden.
Diese werden über einen Verstärker mittels eines Oszilloskops sichtbar gemacht. Die
Messelektroden werden auf dem Oszilloskop auf unterschiedlichen Kanälen (CH1
und CH2) dargestellt. Als Reizquelle dient ein Reizgerät. Das Oszilloskop wird mit
dem Reizgerät synchronisiert. Dazu verbindet man den Triggerausgnag (sync. out
Prepulse) des Reizgerätes mit dem external-trigger-Eingang des Oszilloskops.
Die Form des beobachteten Potentials hängt dabei von der Art der Ableitung ab: Es
ist diphasisch, wenn die absolute Differenz zwischen zwei am Nerv (Bauchmark)
benachbart liegenden Ableitelektroden gemessen wird (+ und – Eingang am
Differenzverstärker (siehe Abb.1), monophasisch wenn die zweite Elektrode auf
Erdpotential gelegt wird und dafür gesorgt ist, dass an ihr möglichst keine
Potentialänderungen stattfinden, d.h. sie sollte nicht am Nerv liegen. Das als
Differenz abgeleitete Potential ist störungsfreier! (Deswegen wird auch diese
Variante im Versuch gewählt)
Der Versuchsaufbau ist bei allen Versuchen der Gleiche abgesehen vom
Versuchsobjekt und dem Abstand zwischen den Messelektroden (Abb.1- und 2).
Variiert werden je nach Versuch, die Reizstärke und die Reizabstände.
Abb.1: Versuchsaufbau Teil 1 (Nervus ischiadicus)
Abb.2: Versuchsaufbau Teil 2 (Regenwurm)
Bestimmung der Nervenleitungsgeschwindigkeit
Reizdauer 0,1ms, Reizamplitude 0,5V, Wiederholungsfrequenz 10Hz. Der Abstand
zwischen den reiznahen und reizfernen Ableitelektroden beträgt im Versuchsteil:
1:
30mm = ∆sfrosch = ∆s1
2:
25mm = ∆swurm = ∆s2
Untersuchung der Abhängigkeit des Summenpotentials von der Reizamplitude
Man variiert die Reizstärke und beobachtet das Signal von einem der
Messelektrodenpaar. (Dieser Versuch wir nur am Nervus ischiadicus durchgeführt)
Untersuchung der Refraktärzeit von Nervenfasern
Reizung des Nervs bzw. des Bauchmarks mit einem Doppelreiz, Variation des
Zeitabstands zwischen den beiden Reizen. Bei der Messung der absoluten
Refraktärzeit verkürzt man die Zeit zwischen den beiden Reizen so lange, bis man
gerade keine Antwort mehr auf den zweiten Reiz bekommt. Um die Länge der
relativen Refraktärphase zu ermitteln, verlängert man wieder die Zeit zwischen den
beiden Reizen bis die Antwort auf den zweiten Reiz genauso groß ist wie die auf den
Ersten. Gemessen wird die Zeit zwischen den beiden Reizen bzw. Reizartefakten.
Verwendet wird nur ein Messelektrodenpaar.
Ermittlung der Latenzzeit:
1. Messung der Leitungsgeschwindigkeit
2. Messung der Zeit von Reizartefakt zu erster Auslenkung
3. Abziehen der Zeit, die für Fortleitung des Reizes von Reizelektroden zu reiznahen
Elektroden gebraucht wird, von der tatsächlich benötigten Zeit = Latenzzeit
Ergebnisse
Teil 1: Untersuchungen am Nervus ischiadicus des Krallenfroschs
(Xenopus laevis)
Versuch 1: Bestimmung der Nervenleitungsgeschwindigkeit
Abb.4 - Kurve1:
Nach dem Reizartefakt (R) fällt die Kurve steil ab, bis sie ein
Minimum
erreicht. Danach steigt sie wieder steil an fällt kurz ab
(2.Minimum),
steigt weiter über den Ausgangswert, fällt wieder ab
(3.Minimum) und
erreicht bald darauf wieder den Ausgangswert.
Abb.4 - Kurve2:
Nach dem Reizartefakt (R) fällt die Kurve steil ab, bis sie ein
Minimum
erreicht. Danach steigt sie wieder steil an, dann etwas
langsamer bis zu
ihrem Maximum. Danach fällt sie wieder langsam
ab und erreicht ihren
Ausgangswert.
Abb.3 und Abb.4 zeigen denselben Sachverhalt, jedoch sieht man bei Abb.4 Kurve1
besser die einzelnen Minima als in Abb.3 Kurve1. Dies liegt wahrscheinlich daran,
dass diese Kurve in Abb.4 eine Mittelwertsdarstellung mehrerer aufgenommener
Signale ist.
∆t1 = 0,6ms
∆t2 = 0,6ms
∆t3 = 2ms
VAxongruppe1 = ∆s1/∆t1 = 30mm/0,6ms = 50m/s
VAxongruppe2 = ∆s1/(∆t1+∆t2) = 30mm/1,2ms = 25m/s
VAxongruppe3 = ∆s1/(∆t1+ ∆t3) = 30mm/2,6ms = 11,5m/s
Abb.3: Messung der Nervenleitungsgeschwindigkeit (Einzelsignale)
Abb.4: Messung der Nervenleitungsgeschwindigkeit (Mittelwert auf CH1)
Versuch 2: Untersuchung der Abhängigkeit des Summenpotentials von der
Reizamplitude
Es ist zu erkennen, dass mit zunehmender Spannung die Amplitude des Signals der
reiznahen Elektroden zunimmt bis es ein Minimum erreicht (Abb.4 Kurve2); die
Auslenkung des Signals der reizfernen Elektroden nimmt auch zu. Hier wird auch ein
Minimum erreicht. Man sieht auch wie die Mehrgipfligkeit des SP’s am reizfernen
Ableitort zunimmt (Abb.4 Kurve1).
Versuch3: Untersuchung der Refraktärzeit von Nervenfasern
Wenn man die Zeit zwischen den zwei Reizen des Doppelreizes immer kleiner
werden lässt, beobachtet man wie die Antwort auf den zweiten Reiz immer kleiner
wird, bis sie letztendlich verschwindet (absolute Refraktärzeit). Erniedrigt man dann
wieder die Frequenz der Reizung, beobachtet man wie die Antwort auf den zweiten
Reiz wieder erscheint (kleinere Amplitude als die Antwort auf den ersten Reiz) und
größer wird, bis die beiden Amplituden (Antwort auf ersten und zweiten Reiz gleich
groß sind (relative Refraktärzeit).
Abb.5: Kurz vor dem Ende der absoluten Refraktärzeit (schnelle Fasern).
Absolute Refraktärzeit (schnelle Fasern): tabsolut = 1,3ms
Abb.6: Ende der relativen Refraktärzeit (langsame Fasern)
Relative Refraktärzeit (langsame Fasern): trelativ = 6,5ms
Teil 2: Untersuchung der Riesenfasern im Bauchmark des Regenwurms
(Lumbricus terrestris)
Versuch 1: Bestimmung der Nervenleitungsgeschwindigkeit
Auf das Reizartefakt (R) folgt ein Minimum (mediane Riesenfaser), kurz danach ein
Zweites (laterale Riesenfaser). Bei der reizfernen Ableitung geschieht genau das
Selbe.
Abb.7: Leitungsgeschwindigkeit (Regenwurm)
∆t4 = 2,36ms
∆t5 = 2,4ms
Vmedian = ∆s2/∆t4 = 25mm/2,36ms = 10,6m/s
Vlateral = ∆s2/∆t5 = 25mm/2,4ms = 10,4m/s
Versuch2: Untersuchung der Refraktärzeit der Nervenfasern
Abb.8: Signale während der relativen Refratärzeit
Abb.9: Kurz vor dem Ende der absoluten Refraktärzeit
Absolute Refraktärzeit (mediane- und laterale Fasern): tabsolut = 2,2ms
Abb.10: Kurz nach dem Ende der relativen Refraktärzeit
Relative Refraktärzeit (mediane- und laterale Fasern): trelativ = 7ms
Auswertung
Teil 1: Untersuchungen am Nervus ischiadicus des Krallenfroschs
(Xenopus laevis)
Versuch 1: Bestimmung der Nervenleitungsgeschwindigkeit
In Abb.3 und Abb.4 wurden die getrennt aufgenommenen Signale (reiznahe und
reizferne Ableitung) übereinander gelegt. Bei dem zuerst auftretenden Signal handelt
es sich um ein Reizartefakt (R). Dies ist das Signal, dass gleichzeitig mit dem Reiz
auf dem Oszilloskop erscheint. Man erkennt es daran, dass man bei Umpolung der
Reizelektroden ein spiegelverkehrtes Signal erhält. Das zeitversetzt auftretende SP
hingegen ändert seinen Verlauf dabei nicht. Man nimmt das Reizartefakt der
jeweiligen Signale als Nullpunkt und legt sie übereinander. Das SP stellt sich
aufgrund der Messung der absoluten Differenz zwischen den extrazellulär
angelegten Elektroden (E1-E2=E) als diphasisches Signal dar. Da es sich beim
Nervus ischiadicus um ein Nervenbündel mit Axongruppen unterschiedlichen
Durchmessers handelt, erhalten wir reizfern ein SP mit drei Minima. Reiznah ist die
Amplitude einheitlich, da die unterschiedlichen Leitungsgeschwindigkeiten der Axone
noch nicht zum Tragen kommen . Mit zunehmender Entfernung vom Reizort werden
die Abstände der einzelnen Ampilutden immer größer. Das liegt daran, dass die
Leitungsgeschwindigkeit vom Durchmesser des Axons abhängt.
Die Längskonstante λ = (Rm/Ri)1/2 der Membran entspricht der Strecke auf der Um
(Membranspannung) auf den e-ten Teil (37%) von U0 (Ausgangsspannung)
abgefallen ist. Kabelgleichung: Um = U0 · e -x / λ . Je größer λ, desto weiter entfernt
entstehen noch APs, was zu einer höheren Fortleitungsgeschwindigkeit entlang des
Axons führt. Bei dünneren Axonen ist λ klein, da der Innenwiderstand im Vergleich
zum Membranwiderstand sehr hoch ist. Bei größeren Axonen verhält es sich genau
umgelehrt. Hier ist Ri im Vergleich zu Rm sehr niedrig. Deshalb leiten größere Fasern
schneller als dünnere Fasern.
Aufgrund des Vergleichs der Ergebnisse mit den Daten aus dem Skript, handelt es
sich bei Axongruppe1 wahrscheinlich um Verbände vom Fasertyp A1 mit dem
Durchmesser 18,5µm (Skript), bei Axongruppe2 um Verbände vom Fasertyp A2 mit
dem Durchmesser 14µm (Skript). Axongruppe3 sind wahrscheinlich Verbände vom
Fasertyp A3 (ø = 11µm). Hierbei handelt es sich nur um Anhaltspunkte, da die
Vergleichswerte von Rana spec. stammen.
Axongruppe
Leitungsgeschwindigkeit
(m/s)
50
25
11,5
Axongruppe1
Axongruppe2
Axongruppe3
Tabelle1: Ermittelte Werte für Xenopus laevis
Fasertyp
Durchmesser (µm)
A1
A2
A3
18,5
14
11
Leitungsgeschwindigkeit
(ms)
42
25
17
Tabelle2: Vergleichswerte aus Skript
Versuch 2: Untersuchung der Abhängigkeit des Summenpotentials von der
Reizamplitude
Aufgrund des unterschiedlichen Eingangswiderstandes ist das Schwellenpotential
eines Axons bei dem ein AP ausgelöst wird abhängig vom Durchmesser. Der
Eingangswiderstand ist umso größer je höher der Innenwiederstand, was bei dünnen
Axonen der Fall ist. Deshalb feuern dickere Axone schon bei geringer Reizstärke.
Die beobachtete, graduierte Erhöhung der Amplitude des SP am reiznahen Ableitort
lässt sich dadurch erklären, dass das SP ja die Summe aller elektrischen Aktivitäten
am Ableitort darstellt (AP sind additiv).
Das heißt, es erhöht sich nicht die Amplitude der AP, sondern deren Anzahl, da mit
zunehmender Reizstärke auch die dünneren Nervenfasern depolarisiert werden.
Reiznah
ist
die
Amplitude
einheitlich,
da
die
unterschiedlichen
Leitungsgeschwindigkeiten der Axone noch nicht zum Tragen kommen. Mit
zunehmender Entfernung vom Reizort werden die Abstände der einzelnen
Amplituden immer größer. Es bilden sich Minima. Am reizfernen Ableitort sind drei
Minima zu sehen (siehe Abb.4 Kurve1). Beobachtet man gleichzeitig die Änderung
der beiden Signale (reiznah, reizfern) sieht man, dass beim ersten Signal (Kurve2)
sich nur die Amplitude ändert, beim Zweiten (Kurve1) aber auch eine Aufteilung des
Signals (synchron). Die maximale Amplitude des ersten Signals ist äquivalent zur
Summe der AP aller Fasern am Ableitort (ab einer gewissen Reizstärke sind alle
intakten Fasern aktiv).
Dies steht nicht im Widerspruch zum Alles-oder-Nichts-Prinzip, da es sich hierbei
nicht um ein einzelnes AP handelt sondern um Mehrere (SP). Bei gegebenem Reiz
werden nur solche Fasern gereizt, deren Schwelle erreicht wird. Deren Amplituden
werden dann zu einem SP addiert. Die Amplitude des SP erreicht ihr Maximum,
wenn durch ausreichende Reizstärke alle Fasern gereizt werden.
Versuch3: Untersuchung der Refraktärzeit von Nervenfasern
Die Refraktärphase eines Axons teilt sich in die absolute und die relative
Refraktärphase auf. Während der absoluten Refraktärphase (RP) ist der Nerv
überhaupt nicht erregbar, wobei bei der relativen Refraktärphase die Reizschwelle
erhöht ist und die Amplitude des Signals geringer ist. Die absolute Refraktärphase
ergibt sich aus der Inaktivierung der Na+-Kanäle (vom vorherigen AP). Deswegen
können keine Na+-Ionen in die Zelle einströmen und eine erneute Depolaristaion
hervorrufen. Während der relativen RP ist die Leitfähigkeit der K+-Kanäle von der
vorherigen Hyperpolarisation noch erhöht, weshalb ein Teil des Reizstroms direkt
wieder aus der Zelle heraus fließt und somit keinen Beitrag zur Depolarisation leistet.
Wie man auch an den Beobachtungen erkennt, dauert die relative RP immer länger
als die absolute RP. Die schnellen Axone weisen in der Regel eine kürzere absolute
relative RP als die langsamen Fasern auf. Dies ist notwendig, da die schnellen
Axone Informationen mit hoher Frequenz weiterleiten und eine zu lange RP dies
verhindern würde. Gar keine RP würde zur Folge haben, dass in gewissen
Situationen zu viele Erregungen auf einmal weitergeleitet werden und das ZNS
zusammenbricht. Die RP limitiert die Frequenz des Axons.
Die
langsamen
Fasern
haben
aufgrund
ihrer
langsamen
Weiterleitungsgeschwindigkeit eine lange absolute und relative Refraktärzeit, und die
schnellen Fasern jeweils eine Kurze. Also ist die absolute Refraktärzeit, die man in
dem Versuch bestimmt, die der schnellen Fasern, die Relative, die der langsamen
Fasern.
Teil 2: Untersuchung der Riesenfasern im Bauchmark des Regenwurms
(Lumbricus terrestris)
Versuch1: Bestimmung der Nervenleitungsgeschwindigkeit
Bei der Reizstärke, die verwendet wurde, wurden nur die beiden Riesenfasern erregt.
Da der Innenwiderstand so gering ist (wegen des großen Durchmessers), ist der
Schwellenwert der Axone gering gegenüber dem des N. ischiadicus. Man erkennt
aus dem Signalverlauf auch, dass die Latenzzeit der lateralen Riesenfasern länger ist
als die der Medianen.
Versuch2: Untersuchung der Refraktärzeit von Nervenfasern
Wenn man die Zeit zwischen den zwei Reizen des Doppelreizes immer kleiner
werden lässt, beobachtet man wie die Antworten (mediane und laterale Faser) auf
den zweiten Reiz immer kleiner wird, bis sie letztendlich verschwinden (absolute
Refraktärzeit). Beim Regenwurm beobachtet man in der relativen Refraktärphase
eine Überlagerung der Antwort der lateralen Faser auf den ersten Reiz mit der
Antwort der medianen Faser auf den zweiten Reiz.
In Abb.8 sind die ersten beiden Signale die Reizartefakte (R) des ersten und zweiten
Reizes. Das nächste Signal (1) ist die Antwort der medianen Faser auf den ersten
Reiz. Das darauf folgende Signal (2) ist die bereits erwähnte Überlagerung der
Antwort der lateralen Faser auf den ersten Reiz mit der Antwort der medianen Faser
auf den zweiten Reiz. Das letzte Signal (3) ist die Antwort der lateralen Faser auf den
zweiten Reiz.
In Abb.9 sind die ersten beiden Signale wieder die Reizartefakte (R) des ersten und
zweiten Reizes. Auf den ersten Reiz gibt es wieder eine Antwort der medianen- (M)
und eine der lateralen (L) Riesenfaser. Auf den zweiten Reiz allerdings folgt kein
Signal absolute Refraktärphase.
In Abb.10 folgt auf jeden Reiz eine Antwort (mediane (M)- und laterale (L)
Riesenfaser) die beides mal identisch ist Ende der relativen Refraktärphase.
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Literaturangaben
-Skript: Programm zum Neurobiologischen Teil des Tierphysiologischen Kurses
-Eckert; Tierphysiologie
-Wehner Gehring; Zoologie
-Penzlin; Lehrbuch der Tierphysiologie