Seroprävalenz von Masernvirus-IgG Antikörpern
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Seroprävalenz von Masernvirus-IgG Antikörpern: Untersuchung zum Zusammenhang zwischen Avidität und In-Vitro-Neutralisationsfähigkeit Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med. an der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig eingereicht von: Norman Wernecke geb. 04.07.1990 in Leinefelde angefertigt an: Institut für Virologie Universität Leipzig Betreuer: Professor Dr. med. Uwe Gerd Liebert Beschluss über die Verleihung des Doktorgrades vom: 20.09.2016 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis ........................................................................................................................................ III Bibliographische Beschreibung ..................................................................................................................... V Abkürzungsverzeichnis................................................................................................................................. VI 1. Einleitung .................................................................................................................................................. 1 1.1 Das Masernvirus ...................................................................................................................... 1 1.1.1 Aufbau ........................................................................................................................................... 1 1.1.2 Pathologie und Klinik .................................................................................................................... 2 1.1.3 Diagnostik ..................................................................................................................................... 4 1.1.4 Therapiemöglichkeiten ................................................................................................................. 5 1.1.5 Entwicklung der Impfprävention .................................................................................................. 5 1.1.6 Epidemiologie der Masern ............................................................................................................ 9 1.2 Ziele der Arbeit ....................................................................................................................... 11 2. Materialien und Methoden..................................................................................................................... 12 2.1 Patientenproben .......................................................................................................................... 12 2.2 Medien, Puffer, Lösungen, Zelllinie, Virus .................................................................................... 12 2.3 Verbrauchsmaterialien................................................................................................................. 13 2.4 Technische Ausstattung ............................................................................................................... 14 2.5 Zellkulturverfahren....................................................................................................................... 15 2.5.1 Zellkultivierung................................................................................................................................... 15 2.5.2 Zellzählung ......................................................................................................................................... 15 2.5.3 Mykoplasmentest .............................................................................................................................. 16 2.6 Auswahl der Proben ..................................................................................................................... 18 2.6.1 Auswahl der Proben für die Testung ................................................................................................. 18 2.6.2 Auswahl von Antikörperbestimmungen für das Masernvirus in den Jahren 1997 bis 2013 ............. 19 2.7 Testverfahren ............................................................................................................................... 19 2.7.1 Aviditätstestung und Bestimmung der IgG-Konzentration................................................................ 19 2.7.2 Endpunktneutralisationstest.............................................................................................................. 21 2.7.3 Plaquereduktionsneutralisationstest (PRNT)..................................................................................... 22 2.8 Statistische Methoden ................................................................................................................. 24 3. Ergebnisse ............................................................................................................................................... 25 3.1 Ergebnisdarstellung der untersuchten Parameter ....................................................................... 25 3.1.1 Antikörperprävalenz zwischen 1997 und 2013 (ELISA) ..................................................................... 25 III Inhaltsverzeichnis 3.1.2 Aviditätswerte der Stichprobe des Jahres 2012 ................................................................................ 31 3.1.3 Ergebnisse der Endpunktneutralisationstests ................................................................................... 33 3.1.4 Ergebnisse der Anti-MV-IgG-Konzentration für die Stichprobe 2012 ............................................... 34 3.2 Impfstatus der 2- bis 18-Jährigen................................................................................................. 35 3.3 Vergleichbarkeit von Plaquereduktionsneutralisationstest und Endpunktneutralisationstest.... 37 3.4 Korrelation zwischen Neutralisationstiter und IgG-Konzentration .............................................. 40 3.5 Korrelation zwischen Avidität und Neutralisationstiter ............................................................... 41 4. Diskussion ............................................................................................................................................... 45 4.1 Epidemiologie der Masernimmunität im Raum Leipzig 1997 bis 2013 ........................................ 45 4.2 Impfprävalenz bei Kindern und Jugendlichen .............................................................................. 48 4.3 Korrelation zwischen Plaquereduktionsneutralisationstest und Neutralisationstest .................. 51 4.4 Korrelation zwischen Avidität und Neutralisationstiter ............................................................... 53 5. Zusammenfassung .................................................................................................................................. 57 6. Literaturverzeichnis ................................................................................................................................ 60 7. Selbstständigkeitserklärung .................................................................................................................... 70 8. Danksagung ............................................................................................................................................. 71 IV Bibliographische Beschreibung Bibliographische Beschreibung Wernecke, Norman Seroprävalenz von Masernvirus-IgG Antikörpern: Untersuchung zum Zusammenhang zwischen Avidität und In-Vitro-Neutralisationsfähigkeit Universität Leipzig, Dissertation 80 S., 90 Lit., 22 Abb., 9 Tab. Referat: Die vorliegende Arbeit hatte das Ziel, die Korrelation zwischen der Avidität der Anti-Masern-IgGAntikörper und deren In-Vitro-Neutralisationsfähigkeit zu untersuchen, sowie mittels Datenbankanalyse die Seroprävalenz von schützenden Antikörpern gegen Masern und den Impfstatus der Kinder- und Jugendlichen festzustellen. Die lineare Korrelation zwischen Neutralisationsfähigkeit und Avidität war in dieser Stichprobe schwach (ρ=0,240, p=0,006). Für hohe IgG Konzentrationen über 1000 mIU/ml fand sich eine mittlere Korrelation zwischen Avidität und Neutralisationstiter (ρ=0,612; p<0,001). Bei den untersuchten Jahren von 1997 bis 2013 zur Seroprävalenz (n=8611) wiesen im Durchschnitt 93,4 % der Patienten IgG-Konzentrationen im positiven Bereich (>200 mIU/ml) auf. In allen Jahrgängen lag der Anteil über 90 %. Zur Ermittlung des Impfstatus wurde eine Stichprobe 2- bis 18-Jähriger aus dem Jahr 2012 untersucht. Insgesamt hatten 81,1 % die erste Masernimpfung erhalten. Die zweite Masernimpfung erhielten noch 59,7 % der Kinder und Jugendlichen. V Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung AI Aviditätsindex AK Antikörper AM Arithmetisches Mittel bzw. beziehungsweise CD Cluster of differentiation cm2 Quadratzentimeter CO2 Kohlenstoffdioxid °C Grad Celsius CPE Zytopathischer Effekt DDR Deutsche Demokratische Republik DMEM Dulbecco‘s Modified Eagle Medium DNA Deoxyribonucleic acid ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay FBS Fetal bovine serum Ggfs. Gegebenenfalls h Hour i.d.R in der Regel IgG Immunglobulin G IgM Immunglobulin M KI Konfidenzintervall KiGGS Kinder- und Jugendgesundheitssurvey VI Abkürzungsverzeichnis Mio. Millionen ml Milliliter µl Mikroliter mm Millimeter mM Millimolar MMR Mumps Masern Röteln MV Masernvirus nm Nanometer n.s. nicht signifikant OD Optische Dichte pfu Plaque Forming Units PRNT Plaque-Reduktions-Neutralisationstest RKI Robert-Koch-Institut RNA Ribonucleic acid RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction SD Standard Deviation SLAM Signaling lymphocytic activation molecule sog. sogenannte Tab. Tabelle u.a. unter anderem UAW unerwünschte Arzneimittelwirkung usw. und so weiter WHO World Health Organization VII Abkürzungsverzeichnis ZNS Zentrales Nervensystem VIII 1. Einleitung 1. Einleitung 1.1 Das Masernvirus Die Masern sind eine hochansteckende Krankheit, welche durch Morbilliviren, die zur Familie der Paramyxoviridae gehören, hervorgerufen werden (Rima & Duprex 2006). Die Masern werden von der Allgemeinbevölkerung häufig als Kinderkrankheit angesehen. Sie können jedoch Menschen jeden Alters betreffen und sind eine ernst zu nehmende Infektionskrankheit. Vor allem in Entwicklungsländern kommen mehr als 95 % der durch Masern verursachten Todesfälle weltweit vor (World Health Organization 2015). Auch in Deutschland kommen immer wieder Ausbrüche vor, die das Ziel der Elimination erschweren. Der letzte größere Ausbruch fand im Großraum Berlin statt und dauerte von Oktober 2014 bis August 2015 mit 1.359 Erkrankungsfällen (Landesamt für Gesundheit und Soziales Berlin 2015). 1.1.1 Aufbau Das Masernvirus ist ein Lipidmembran-behülltes, negativ orientiertes Einzelstrang-RNA-Virus. Es ist pleomorph und zwischen 100 und 300 nm groß (Rima & Duprex 2006). Das Genom umfasst sechs Gene, welche für das Nukleokapsid-, Phospho-, Matrix-, Fusions-, und Hämagglutininprotein sowie das L (large) Protein kodieren (Watanabe et al. 2013). Masernviren sind sehr empfindlich. Im Zuge einer thermalen Inaktivierung bei 37 °C beträgt die Halbwertszeit nur 2 Stunden (Black 1959). Entgegen der früher herrschenden Meinung, dass lediglich ein Antigentyp vorkommt (Beale 1974), weisen neuere Forschungen darauf hin, dass bei Masernviren aufgrund der hohen Punktmutationsrate die Entstehung von veränderten Antigenstrukturen möglich ist. Daher empfehlen einige Autoren eine strengere Überwachung der Antigenentwicklung, um möglichen Impflücken vorzubeugen (Tahara et al. 2012; Finsterbusch et al. 2009; Kühne et al. 2006). 1 1. Einleitung 1.1.2 Pathologie und Klinik Masern werden durch das Einatmen infektiöser Exspirationströpfchen (Sprechen) bzw. Tröpfchenkerne (Husten, Niesen) sowie durch Kontakt mit infektiösen Sekreten aus Nase oder Rachen übertragen (Robert-Koch-Institut 2014). Nach der Inhalation des Virus findet die Virusreplikation zunächst im oberen Respirationstrakt und im Epithelgewebe der Trachea und Lunge statt (Rima & Duprex 2006). Die Infektion der Wirtszellen erfolgt durch eine pH-Wert-unabhängige Membranfusion an der Zelloberfläche. Hierbei bindet das Hämagglutininprotein an einen zellulären Rezeptor und bewirkt vermutlich eine Konformationsänderung des Fusionsproteins (Watanabe et al. 2013). Das WildtypMasernvirus kann Lymphozyten über CD150 (SLAM-Rezeptor) (Tatsuo et al. 2000), sowie diese und andere kernhaltige Zellen über das Komplement-Regulator-Protein (auch Membran-CofaktorProtein) CD46 infizieren (Manchester et al. 2000; Dörig et al. 1993). Weiterhin spielt auch der Nektin4-Rezeptor eine Rolle bei der Infektion der Zellen, der in den Atemwegen stark exprimiert wird (Watanabe et al. 2013; Mühlebach et al. 2011). Für Laborviren, wie beispielsweise den Stamm Edmonston, ist vor allem CD46 von Bedeutung (Dörig et al. 1993). B-Zellen sind ein Hauptziel der MV-Infektion (Bouche et al. 2002). Dies erklärt teilweise die zahlreichen Symptome während der Infektion. Nach einer Inkubationszeit von 10-12 Tagen tritt ein Prodomalstadium (Dauer: 2-4 Tage) auf. Mögliche Symptome sind Fieber, Unwohlsein, Appetitlosigkeit, Konjunktivitis, Schnupfen, sowie Husten. Diese erste Phase endet mit hohem Fieber (ca. 40°C) und dem Vorkommen der pathognomonischen Koplik-Flecken. Hierbei handelt es sich um Mundschleimhautnekrosen, welche häufig 1-2 Tage vor bis 1-2 Tage nach dem Exanthem gegenüber dem ersten oder zweiten Molaren auftreten. Das sich anschließende Exanthemstadium ist charakterisiert durch ein erythematöses maculo-papulöses konfluierendes Exanthem, welches am Kopf beginnt und sich über den ganzen Körper ausbreitet. Es persistiert meist für 4-5 Tage. Man geht davon aus, dass es sich bei dem Exanthem um eine hypersensitive Reaktion handelt (Lachmann 1974). Die gesamte symptomatische Phase hält bei immunkompetenten Personen für ca. 7-10 Tage an. Ein Husten als Zeichen der Tracheobronchitis ist häufig das zuletzt auftretende Symptom. Infizierte sind 2-4 Tage 2 1. Einleitung vor Beginn des Exanthems bis ca. 4 Tage danach ansteckend (Sabella 2010). Die Transmission erfolgt vor allem durch Viruspartikel, welche aus Immunzellen der Lunge freigesetzt wurden (Rima & Duprex 2006). Die Komplikationen der Masern sind vielfältig. Am häufigsten kommen eine Otitis media und Pneumonie vor. Allgemein sind Patienten im Alter unter 5 und über 20 Jahren häufiger betroffen. Weiterhin gilt Mangelernährung als Risikofaktor für signifikant höhere Komplikationsraten. Die Pneumonie ist für 60 % der Todesfälle bei Masern verantwortlich. Insgesamt wird die Letalität mit 1-3 pro 1000 Erkrankten angegeben (Rima & Duprex 2006). Es gibt verschiedene Formen von neurologischen Komplikationen. Die akute demyelisierende Enzephalomyelitis (ADEM) tritt ca. 5-6 Tage nach Beginn des Exanthems auf. Ein Patient von 1000 Infizierten erkrankt daran. Eine Hypothese der Ätiologie ist, dass es sich hierbei um eine Autoimmunreaktion handelt (Rima & Duprex 2006). Die Masern-Einschlusskörper-Enzephalitis kommt bei immungeschwächten Patienten zwischen 2 bis 6 Monaten nach der akuten Infektion vor und kann auch nach einer Impfung auftreten (Rima & Duprex 2006). Sie ist charakterisiert durch epileptische Anfälle und Bewusstseinsveränderungen und führt in ca. 75 % der Fälle zum Tod (Bitnun et al. 1999). Die subakute sklerosierende Panenzephalitis (SSPE), als eine weitere neurologische Komplikation, ist sehr selten. Man geht davon aus, dass sie mit einer Häufigkeit von 1:10 000 - 25 000 Infizierten vorkommt. Männliche Patienten haben ein 2,5-fach höheres Risiko als weibliche, an SSPE zu erkranken (Rima & Duprex 2006). Eine Maserninfektion vor dem zweiten Lebensjahr gilt ebenfalls als Risikofaktor. Bei einer SSPE kommt es zu einer persistierenden Infektion im ZNS, die zu einer erhöhten Antikörperreaktion führt. Durchschnittlich treten 8 Jahre nach der akuten Maserninfektion die ersten Symptome auf. Es kommt zu Persönlichkeitsveränderungen, myoklonischen Krämpfen, motorischen Störungen und final immer zu Koma und Tod (Sabella 2010; Rima & Duprex 2006). 3 1. Einleitung Durchfall und Stomatitis können weitere Komplikationen der Maserninfektion darstellen, die häufige Todesursachen in Entwicklungsländern sind. Eine subklinische Hepatitis wird bei mindestens 30 % der Erwachsenen beobachtet (Sabella 2010). 1.1.3 Diagnostik Zur Diagnostik der akuten Infektion werden verschiedene Verfahren, meist in Kombination, herangezogen. Innerhalb der ersten 7 Tage nach Exanthembeginn kann eine RT-PCR zum Virusgenomnachweis aus einem Rachenabstrich oder einer Urinprobe durchgeführt werden. IgM-Antikörper im Serum zum Nachweis einer akuten Infektion ergeben bei 30 % der Patienten erst drei Tage nach Exanthembeginn positive Ergebnisse (Robert-Koch-Institut 2015). Zur Bestätigung der Diagnose kann die Konzentration der IgG-Antikörper mittels ELISA und die Avidität dieser gemessen werden. Letztere kann eine Infektion jedoch nur bestätigen (Mercader et al. 2012). Die Avidität ist ein Maß für die Bindungsspezifität der IgG-Antikörper zu einem Antigen. Bereits 1964 führten Forschungen zu der Annahme, dass während der Immunreaktion eine Zunahme der Bindungsfähigkeit der Antikörper für ein Antigen stattfindet (Eisen & Siskind 1964). Wenn die Avidität hoch ist, kann man davon ausgehen, dass sich die Infektion in einem späteren Stadium befindet. Weiterhin wird sie gemessen, um sekundäre Impfversager zu identifizieren, welche durch eine hohe Avidität und ein charakteristisch hohes Niveau an neutralisierenden Antikörpern gekennzeichnet sind (Hickman et al. 2011). Weitere Verfahren sind der Plaquereduktions- sowie Endpunktneutralisationstest. Diese Methoden sind mit hohem Arbeitsaufwand und einer längeren Testdauer von 5 bis 7 Tagen verbunden. Dennoch gelten sie als sensitiveres Verfahren als der ELISA-Test (Poethko-Müller & Mankertz 2011) und werden in unklaren Fällen zur Diagnostik eingesetzt. Zur Evaluation der Masern-Immunität sind diese beiden Verfahren zu favorisieren (Chen et al. 1990). 4 1. Einleitung 1.1.4 Therapiemöglichkeiten Für Masern existieren keine spezifisch wirksamen antiviralen Substanzen. Die Therapie beschränkt sich daher auf supportive Maßnahmen wie ausreichende Ernährung, Behandlung einer Dehydratation und Ausgleich des Elektrolythaushaltes. Antibiotika sollten bei Komplikationen wie Infektionen der Augen und Ohren sowie einer Pneumonie zum Einsatz kommen (Sabella 2010). In Entwicklungsländern wird eine Vitamin-A-Gabe empfohlen, um Augenschäden bzw. einer Erblindung vorzubeugen (World Health Organization 2015). Weiterhin wird an einer spezifischen medikamentösen Therapie für Masern geforscht. So liegen beispielsweise Ergebnisse vor, die eine größere Effizienz für die Gabe von hoch dosiertem Ribavirin und Interferon Alpha im Vergleich zu den isoliert getesteten Substanzen belegen. Trotz schlechterer Resultate einiger Studien zu antiviralen Substanzen deuten sie dennoch darauf hin, dass eine Verminderung von Komplikationen erreicht werden kann (Plemper & Snyder 2009). Ribavirin kann weiterhin zur Therapie der schweren Pneumonitis bei einer MV-Infektion in Erwägung gezogen werden. (Forni et al. 1994). Als Postexpositionsprophylaxe steht ein hoch konzentriertes MV-spezifisches Immunglobulin zu Verfügung, welches innerhalb von 6-10 Tagen nach Kontakt appliziert werden sollte. Es wird für Immunsupprimierte und Neugeborene bis 12 Monate empfohlen. (Takla et al. 2012; Plemper & Snyder 2009). 1.1.5 Entwicklung der Impfprävention Das Masernvirus hat lediglich ein humanes Reservoir (Rima & Duprex 2006). Zwar weisen neuere Forschungen darauf hin, dass Morbilli-verwandte Viren auch in Fledermäusen in Europa und Afrika vorkommen, aber ihre humanpathogene Bedeutung ist noch unklar (Drexler et al. 2012). Der R0-Wert des MV liegt zwischen 15 und 17. Folglich können sich 15 bis 17 Personen bei einem Indexfall anstecken, womit MV zu den sehr kontagiösen Viren gehört. (Monto 1999). Deshalb ist eine dauerhafte Impfquote von mindestens 95 % notwendig, um die Masern zu eliminieren (Robert-KochInstitut 2013; World Health Organization 2009b). Die Impfquote ist definiert als der Anteil der Personen in Prozent, die eine Impfung bzw. eine Impfserie erhalten haben, in Relation zur Personenanzahl 5 1. Einleitung der Grundgesamtheit (Poethko-Müller & Schmitz 2013). Eine wirksame Vakzination zeichnet sich durch zwei Effekte aus: Der direkte Impfeffekt als der Schutz des erfolgreich geimpften Individuums. Der indirekte Impfeffekt ist die geringere Ansteckungswahrscheinlichkeit der Ungeimpften (Anderson & May 1990). Neugeborene, deren Mütter immun sind, besitzen für ca. 6 Monate eine Leihimmunität (Anderson & May 1990; Beale 1974). Geimpfte Mütter besitzen niedrigere Antikörperspiegel und übertragen demzufolge weniger Antikörper als Nestschutz auf ihre Kinder. Die Leihimmunität hält deshalb bei Kindern geimpfter Mütter durchschnittlich weniger lange an (Matysiak-Klose 2013). Die Einführung der Masernimpfung erfolgte 1970 in der DDR und 1973 in der BRD und führte zu einem Rückgang der Masernerkrankungen in Deutschland (Robert-Koch-Institut 2014). 1986 wurde in der DDR eine Zweifachimpfung Pflicht. In der BRD wurde ab 1980 mit einem MMRKombinationsimpfstoff geimpft. Eine deutschlandweite Zweifachimpfung mit MMR wurde 1991 eingeführt (Wichmann et al. 2009). Seit Juli 2001 wird die erste Impfung bereits im Alter von 15–23 Monaten empfohlen. Die zweite Masernimpfung kann 4 bis 6 Wochen nach der ersten Masernimpfung erfolgen (Robert-Koch-Institut 2014). 2011 erfolgte die Empfehlung, auch vor 1970 Geborene und über 17-Jährige mit unklarem Impfstatus oder nur einer Impfung, einmalig mit MMR nachzuimpfen (Poethko-Müller & Mankertz 2013). In Sachsen wird die erste MMR-Impfung ab dem 13. Lebensmonat und die zweite ab dem fünften Lebensjahr empfohlen (Landesuntersuchungsanstalt für das Gesundheits- und Veterinärwesen 2016). Die im Handel befindlichen Impfstoffpräparate sind Lebendvirusimpfstoffe, welche durch die Vermehrung von attenuierten Masernviren in Hühnerfibroblasten gewonnen werden (Robert-Koch-Institut 2014). Zur Eliminierung der Masern ist ein gutes Surveillancesystem erforderlich (Wichmann & Ultsch 2013). In Deutschland wurde 2001 das Infektionsschutzgesetz (IfSG) eingeführt, welches die Meldung von Erkrankungen regelt (Robert-Koch-Institut). Nach § 6 IfSG ist der Krankheitsverdacht, die Erkrankung sowie der Tod an Masern namentlich an das zuständige Gesundheitsamt zu melden. Gemäß § 7 IfSG 6 1. Einleitung besteht für Leiter von Untersuchungsstellen eine Meldepflicht für den direkten oder indirekten Nachweis einer akuten Masernvirus-Infektion (Robert-Koch-Institut 2014). Während in den Jahrgängen vor 1990 die Durchimpfung mit 2 Masernimpfungen in Ostdeutschland bei über 90 % lag, betrug sie in Westdeutschland nur wenig über 70 % (Poethko-Müller & Mankertz 2013). Bei einer großangelegten Studie des RKI, welche die Geburtsjahrgänge 1988 bis 2000 betrachtete, wurde festgestellt, dass 93,6 % der Über-2-Jährigen in Deutschland eine Impfung erhalten hatten, 74,2 % erhielten auch die Zweite (n=16.460). Allerdings erfolgte die Impfung nicht zeitgerecht. Bei den Geburtsjahrgängen bis 1999 hatten mit Ende des 2. Lebensjahres weniger als 20 % die zweite Masernimpfung erhalten. Im Jahrgang 2000 waren es schon 24,9 % und 2002 50,1 % der Kinder. Die Kinder erhielten also zu einem hohen Anteil die 2. Impfung erst nach dem zweiten Lebensjahr. Es fanden sich keine Unterschiede zwischen Mädchen und Jungen (Poethko-Müller et al. 2007). Daten der Krankenversicherungen für die Geburtsjahrgänge 2006 bis 2008 zeigten, dass 94 % eine und 66 % zwei Masernimpfungen zum Ende des zweiten Lebensjahres erhalten hatten. Somit sind die Quoten für eine zeitgerechte Impfung gegenüber dem Jahr 2002 vermutlich weiter angestiegen. Zwischen den Jahrgängen 2006 bis 2008 bestehen keine Unterschiede, sodass angenommen wird, dass sich der Trendanstieg seit 2006 nicht mehr fortgesetzt hat (Poethko-Müller & Mankertz 2013). Die WHO geht davon aus, dass bei 15 % der einmal Geimpften noch kein Schutz vorhanden ist. (World Health Organization 2015). Deshalb ist eine zweite Impfung notwendig, um eine zuverlässige und ausreichende Herdenimmunität zu erreichen. Doch auch nach einer zweiten Impfung ist das Vorkommen sogenannter sekundärer Impfversager möglich. Diese sind definiert als das Auftreten von Masern bei Personen, die zuvor eine Impfung mit erfolgreicher Serokonversion erhalten haben (Paunio et al. 2000; Markowitz et al. 1990; Mathias et al. 1989). Es gibt viele Studien zu sekundären Impfversagern, die verschiedenste Ergebnisse zur Prävalenz haben. In einer Metaanalyse einiger dieser Studien kamen Anders et al. (1996) zu dem Schluss, dass die Häufigkeit mit unter 0,02 % sehr gering ist. Sekundäre Impfversager sind charakterisiert durch hohe Avidität der Antikörper und unverwechselbar ausgeprägt hohen Levels an neutralisierenden Antikörpern (Hickman et al. 2011). 7 1. Einleitung In den letzten Jahren kam eine vermehrte Skepsis gegenüber Impfungen im Allgemeinen auf. Bei kleineren Fallzahlen sinkt die subjektiv empfundene Bedrohung durch eine Krankheit, während gleichzeitig mögliche unerwünschte Nebenwirkungen einer Impfung an Bedeutung gewinnen. So kommt es zu einem Interessenkonflikt zwischen dem Wohl des Individuums und dem der Gesellschaft (Poethko-Müller & Schmitz 2013; Anderson & May 1990). Bei kaum einer anderen Impfung wie Masern wird diese Problematik so kontrovers diskutiert. Im Folgenden sollen Nebenwirkungen der Impfstoffe am Beispiel von trivalenten MMR-Vakzinen dargestellt werden. Häufig kommt es zu lokalen Reaktionen der Impfstelle, wie Rötung, Schwellung und Schmerzhaftigkeit, welche selten länger anhalten. Gelegentlich tritt zusätzlich eine Schwellung der dazugehörigen Lymphknoten auf. Weiterhin können i.d.R. temporäre Allgemeinsymptome wie leichte bis mäßige Temperaturerhöhung (5-15 % der Impflinge), Kopfschmerzen, Mattigkeit, Unwohlsein oder Magen-Darm-Beschwerden auftreten. Im Abstand von 1 bis 4 Wochen entwickeln ca. 2 % der Impflinge eine sog. "Impfkrankheit". Diese ist charakterisiert durch Fieber in Kombination mit einem schwachen, masernähnlichen Exanthem. Gelegentlich tritt eine Schwellung der Ohrspeicheldrüse auf. Bei Jugendlichen und Erwachsenen kann es zu vorübergehenden Arthralgien kommen. Diese können sehr selten länger anhalten. Selten kann es zu einer leichten Hodenschwellung, sowie einer leichten Reaktion der Bauchspeicheldrüse (Enzymanstieg) kommen (Robert-Koch-Institut 2007). Als mögliche Komplikationen ist bei Säuglingen und jungen Kleinkindern im Rahmen einer fieberhaften Reaktion selten das Auftreten eines Fieberkrampfes (i.d.R. ohne Folge) beschrieben. Sehr selten sind allergische Reaktionen auf die im Impfstoff enthaltenen Begleitstoffe. Von einem anaphylaktischen Schock existieren nur Einzelfallberichte. Bei weltweit wenigen Fällen wurde eine MasernEinschlusskörperchen-Enzephalitis nach Masern-Impfung beschrieben (Robert-Koch-Institut 2007). Ein Fall ereignete sich 1998 in Kanada, bei dem bei einem Kind mit CD-8-Immundefekt per Hirnbiopsie die RNA des Impfvirus nachgewiesen werden konnte (Bitnun et al. 1999). 8 1. Einleitung 1.1.6 Epidemiologie der Masern Im Jahr 1980, vor Einführung ausgedehnter Impfprogramme, starben weltweit schätzungsweise 2,6 Millionen Menschen pro Jahr an einer Maserninfektion (World Health Organization 2015). Seitdem konnte die Sterblichkeit stark reduziert werden. So lag die Sterblichkeitsrate 2013 weltweit noch bei 145 700 Menschen (World Health Organization 2015). Es ist das erklärte Ziel der WHO, die Masern bis 2020 in mindestens fünf von sechs der durch sie definierten Regionen zu eliminieren (World Health Organization 2015). Auch in Europa ist ein drastischer Rückgang der Inzidenz zu verzeichnen: 1991 bis 1993 wurden noch nahezu 400 Fälle pro 1 Mio. Einwohner dokumentiert. Demgegenüber wurden im Zeitraum von 2007 bis 2009 noch 8 bis 10 Fälle auf 1 Mio. Einwohner verzeichnet (Martin et al. 2011). Trotz der allgemein sinkenden Inzidenz kam es in den letzten Jahren wiederholt zu größeren Ausbrüchen in Europa. So kam es beispielweise im Jahr 2002 in Italien zu einer Epidemie mit ca. 16 500 Infizierten. 2006 wurde hierzulande ebenfalls eine erhöhte Erkrankungsrate mit 2300 gemeldeten Fällen festgestellt. Im Jahr 2008 häuften sich die Fallmeldungen in Italien, Großbritannien, Frankreich und in geringerem Maß auch Deutschland. 2011 wurden in Frankreich 16 000 Menschen mit Masern infiziert (ECDC 2015). Die Eradikation der Masern, welche von der WHO ursprünglich für 2010 beabsichtigt war, wurde nicht erreicht und die Frist bis 2015 verlängert. Auch dieses Ziel wurde verfehlt. Als eliminiert gelten Infektionskrankheiten, wenn keine endemischen Fälle in einer Region über einen Zeitraum von mindestens 12 Monaten bei Vorhandensein eines guten Surveillance-Systems vorkommen. Die jährliche Inzidenz sollte geringer als 1/1 Mio. Einwohner sein und die Impfquote mindestens 95 % betragen (World Health Organization Regional Office For Europe 2014). Weiterhin sollen mehr als 80 % der Masernfälle durch eine serologische Untersuchung und/oder eine PCR bestätigt werden (Roggendorf et al. 2012). In Deutschland lag die Inzidenz bisher nicht unter 1/1 Mio. Einwohner und eine Häufung der Erkrankungen in den Jahren 2001, 2002, 2006, 2008, 2011, 2013 und 2015 erschwert eine Eradikation der Masern (siehe auch Tab. 1; nach Robert-Koch-Institut 2016). Finnland erreichte als erstes 9 1. Einleitung Land die Elimination von Masern. Durch das im Jahr 1982 eingeführte Impfprogramm mit einer Zweifachimpfung von trivalenten MMR-Vakzinen ähnlich den sächsischen Impfempfehlungen konnten Masern 1996, sowie Mumps und Röteln 1997 eliminiert werden (Peltola et al. 2008). Jahr Anzahl der Masernfälle Inzidenz pro 1 Mio. Einwohner 2001 6.039 73,3 2002 4.556 56,4 2003 777 9,4 2004 123 1,5 2005 781 9,5 2006 2.308 28,2 2007 566 6,9 2008 915 11,2 2009 572 7 2010 780 9,5 2011 1.608 19,6 2012 165 2 2013 1.769 21,9 2014 442 5,5 2015 2.464 30,5 Tabelle 1: Übermittelte Masern-Fälle und Fallzahl pro 1 Million Einwohner in den Jahren von 2001 bis 2015 in Deutschland (Robert-Koch-Institut 2016). 10 1. Einleitung 1.2 Ziele der Arbeit Das Ziel dieser Arbeit ist die Beantwortung von drei Fragestellungen. Da in Deutschland kein flächendeckendes System zur Überwachung der Antikörperprävalenz existiert, sollen die Seroprävalenzdaten im Untersuchungsgut des Institutes für Virologie der Jahre 1997 bis 2013 ausgewertet werden. Weiterhin findet in Deutschland keine regelmäßige Überwachung der Impfrate von Kindern und Jugendlichen statt, so dass auf Ergebnisse von Einzeluntersuchungen zurückgegriffen wird. Daher soll bei einer Stichprobe der Impfstatus durch eine elektronische Aktenauswertung sowie durch eine Befragung von Hausärzten ermittelt werden. Das dritte Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung des Zusammenhanges zwischen der Avidität der Anti-MV-IgG-Antikörper und dem In-vitro-Neutralisationstiter. Kann man anhand der Höhe der Avidität auch eine Aussage zur Neutralisationsfähigkeit der IgG-Antikörper treffen, oder ist in unklaren Situationen zusätzlich ein Neutralisationstest sinnvoll, um genauere Informationen über die Immunitätslage eines Patienten zu erhalten? 11 2. Materialien und Methoden 2. Materialien und Methoden 2.1 Patientenproben Es wurden Patientenseren aus dem Jahr 2012 verwendet, welche dem Institut für Virologie vorlagen und bei -20 °Celsius gelagert wurden. Die Angaben über Alter, Geschlecht und Höhe der IgGKonzentration für die Proben der Jahre 1997 bis 2013 wurden der hauseigenen Datenbank entnommen. 2.2 Medien, Puffer, Lösungen, Zelllinie, Virus Zellkultur DMEM (1x) + GlutaMAX™-I Gibco DPBS (10x), Dulbecco`s Phosphate Buffered Saline Gibco FBS (Fetal Bovine Serum) Biochrom Penicillin/Streptomycin Invitrogen 0,05 % Trypsin-EDTA (1x) Gibco Vero-Zellen Vero-Zellen sind Nierenepithelzellen der grünen Meerkatze. Sie sind empfänglich für sehr viele Virusarten und haben sich auch für die Testung von Morbilliviren als gut geeignet erwiesen (Albrecht et al. 1981; Rhim et al. 1969;). I.A.Z. ATCC Nummer: CCL 81 Virus Masernvirus Stamm Edmonston 12 2. Materialien und Methoden Spezielle Materialien für den Mykoplasmentest Färbelösung Hoechst 33258 Sigma-Aldrich Hoechst-Gebrauchslösung 1ml Methanol + 4µl Hoechst-Stocklösung 0,5 mg/ml Eindeckmedium Mounting Fluid 10 ml Light Diagnostics 2.3 Verbrauchsmaterialien Cryoröhrchen Carl Roth GmbH +Co. KG Filter Tip Universal 20µl, 200µl, 1000µl Greiner bio-one Handschuhe Peha-soft® nitrile, FINO Hartmann Röhre 15ml, 120 x 17mm, PP Sarstedt Röhre 50ml, 114 x 28mm, PP Sarstedt Zellkultur CELLSTAR® CELL CULTURE FLASKS 75cm2 Greiner Bio-One GmbH Neubauer-Zählkammer Brand Endpunktneutralisationstest Eppendorf-Reaktionsgefäße 2ml Sarstedt Tissue Culture Plate 96-Well Flat Bottom Sarstedt Kristallviolett, Indikator, ACS Merck Plaquereduktionsneutralisationstest FBS (Fetal Bovine Serum) Biochrom Eppendorf-Reaktionsgefäße 1,5 ml Sarstedt GIBCO DMEM 52100 SL Invitrogen L-Glutamin 200 mM Gibco 13 2. Materialien und Methoden Neutralrot Merck Tissue Culture Plate 6-Well Flat Bottom Sarstedt UltraPure™ LMP Agarose Invitrogen 2.4 Technische Ausstattung Euroimmun Analyzer I Euroimmun Medizinische Geräte Labordiagnostika AG CO2 Incubator MCO-20AIC Panasonic Healthcare Co., Ltd. Fluoreszenz-Mikroskop DMRA Leica Gefrierschrank Modellnummer: ULT 2586-3-V14 Revco Scientific, Inc. Kühlschrank Liebherr Kamera DFC 360 FX Leica Laminarflowsystem Telstar Mikroskop DMIL Leica Mikrowelle Typ NE-1440 Panasonic Pipetus®-Akku Hirschmann Laborgeräte Wasserbad Memmert Vortexer REAX 2000 Heidolph 14 2. Materialien und Methoden 2.5 Zellkulturverfahren 2.5.1 Zellkultivierung Die verwendete Vero-Zelllinie wurde in sterilen Kulturflaschen (75 cm2) bei 37 °C und 90 % relativer Luftfeuchtigkeit, sowie einem CO2-Gehalt von 5 % im Brutschrank kultiviert. Als Medium wurde DMEM(1x)+ GlutaMAX™-I mit 4,5g/l D-Glucose mit 5 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin-Lösung (enthält 10.000 Units/ml Penicillin, 10.000 µg/ml Streptomycin) verwendet. Dieses wurde in Portionen von 200 ml unter der Laminar-Flow-Box gemischt und im Kühlschrank aufbewahrt. Die Zellen wurden alle drei Tage passagiert. Hierzu wurden sie nach Abnahme des Mediums mit PBS gespült. Dieser Schritt ist notwendig, damit die Trypsin-Aktivität nicht durch FBS-Rückstände gehemmt wird. Im Anschluss wurde Trypsin auf den Zellrasen pipettiert und die Kulturflasche mit einer kurzen Einwirkzeit im Brutschrank inkubiert. Das Trypsin bewirkt innerhalb dieser Zeit eine Ablösung der Zellen. Weiterhin wurden die Zellen danach mechanisch durch mehrmaliges Spülen mit Medium gelöst. Durch das im Medium enthaltene FBS wird die Reaktion des Trypsins abgestoppt. Das Gemisch aus Medium und Zellen wurde im Anschluss im Verhältnis 1:5 bis 1:10 mit neuem Medium verdünnt und im Brutschrank inkubiert. 2.5.2 Zellzählung Die für die Neutralisationstests notwendige Zellzählung wurde mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer durchgeführt. Dabei handelt es sich um einen Objektträger mit eingelaserten Quadraten (3x3) von 1 mm Kantenlänge, die wiederum in kleinere Quadrate von 0,1 mm Kantenlänge untergliedert sind. Durch einen festgelegten Abstand des Deckgläschens zum Objektträger entsteht ein definiertes Volumen und die Zellzahl pro ml kann ermittelt werden. Die Zellsuspension wurde resuspendiert. Danach wurde diese zu gleichen Teilen mit Trypanblau gemischt und auf die Zählkammer pipettiert. In den sich diagonal gegenüber liegenden Großquadraten wurden die Zellen unter dem Mikroskop gezählt und die Zellzahl/ml nach folgender Gleichung ermittelt: 15 2. Materialien und Methoden 2.5.3 Mykoplasmentest Mykoplasmen sind die kleinsten bekannten Organismen, die sich autonom vermehren und wachsen können (Razin 1969). Sie wurden erstmalig im Jahr 1956 aus einer kontaminierten Zellkultur isoliert (Drexler & Uphoff 2002). Ihre geringe Größe von nur 0,3 – 0,8 µm und ihre Flexibilität aufgrund der fehlenden Zellwand erlauben es ihnen, Standardbakterienfilter mit einem Durchmesser von 0,2 µm zu überwinden. Dies erhöht die Kontaminationsgefahr und macht eine regelmäßige Testung notwendig. Untersuchungen der letzten Jahre haben gezeigt, dass sie auch intrazellulär wachsen können (Drexler & Uphoff 2002). Eine Infektion mit Mykoplasmen kann vielfältige Veränderungen in der Zellkultur bewirken. Beschrieben wurden u.a. Veränderungen der Zelleigenschaften, des Enzymmusters, der Zusammensetzung der Zellmembran, chromosomale Veränderungen sowie CPE. Diese Effekte können einen großen Einfluss auf die experimentellen Ergebnisse haben (Razin et al. 1998; Kuppefeld et al. 1994). Im Falle einer Infektion haben sich verschiedene Antibiotika als wirksam erwiesen. So zeigen Makrolide und Tetrazykline (kombiniert in BM-Cyclin©), sowie Fluorchinolone eine gute Wirksamkeit. (Drexler & Uphoff 2002). Penicillin ist indes aufgrund des Wirkmechanismus ungeeignet (Razin 1969). Am hiesigen Institut wird Ciprofloxacin (2 mg/ml, Gebrauchslösung 2 µg/ml) zur Behandlung einer Kontamination verwendet. 16 2. Materialien und Methoden Zur Vorbereitung wurden die Zellen in geringer Zahl in Erhaltungsmedium ohne Penicillin/Streptomycin-Lösung auf Deckgläschen in einer Petrischale für einen Tag im Brutschrank inkubiert. Danach wurden sie gewaschen und anschließend mit Hoechst 33258 mit Fluorochrom Bisbezimid bei einer Endkonzentration von 1 µg/ml in Methanol für 5 Minuten inkubiert. Im nächsten Abbildung 1: Beispielhafte Darstellung eines negativen Testergebnisses beim Mykoplasmentest. Die Zellkerne werden abgebildet; es ist eine Mitose erkennbar (mit Stern gekennzeichnet). Schritt wurde die Färbelösung verworfen und die Deckgläschen mit destilliertem Wasser gespült. Nach dem Trocknen an der Luft wurden die Deckgläser mit dem Eindeckmedium Mounting Fluid auf einen Objektträger gebracht. Die Beurteilung erfolgte unter dem Fluoreszenzmikroskop mittels Blauanregung (λ=350 nm). Durch die unspezifische Anfärbung der DNA mit Bisbenzimid werden im negativen Fall lediglich die Zellkerne sichtbar (Abb. 1). Wenn sich neben dem Zellkern zytoplasmatische Granula anfärben, gilt der Test als positiv. Der Mykoplasmentest wurde während der Versuchsphase in zweimonatigem Abstand durchgeführt und war stets negativ. 17 2. Materialien und Methoden 2.6 Auswahl der Proben 2.6.1 Auswahl der Proben für die Testung Die Serumproben sind zwischen dem 16.01.2012 und 28.12.2012 im Institut für Virologie eingegangen und wurden nach der initialen Testung im Haus bei -20 °C kryokonserviert. Die Auswahl der Proben erfolgte innerhalb der Gruppen mit grenzwertiger und positiver IgG-Konzentration zufällig. Es wurde auf eine gleichmäßige Verteilung von Alter, Geschlecht und IgG-Konzentration geachtet. Des Weiteren wurden Proben von identischen Patienten ausgeschlossen. Mehrfachtestungen mit einem mehr als vierfachen IgG-Konzentrationsunterschied wurden ebenfalls nicht einbezogen. Eine Konzentrationsänderung um diesen Faktor wird als Nachweis für eine gerade ablaufende Maserninfektion angesehen (Sabella 2010). Die Proben wurden in Altersgruppen eingeteilt. In den Altersgruppen 1 und 2 gab es ursprünglich lediglich 11 Fälle mit bereits gemessener Antikörperkonzentration gegen Masern. Daher wurden weitere Proben aus dem Jahr 2012 getestet (n=132). Von diesen und den Proben der anderen Altersgruppen (drei bis fünf) wurden zufällig Proben ausgewählt, bei denen ein Endpunktneutralisationstest durchgeführt wurde (n=129, Tab. 2). Altersgruppe Anzahl der Proben für die Endpunktneutralisation Alter 1 2 bis 6 Jahre 23 2 7 bis 18 Jahre 30 3 19 bis 39 Jahre 28 4 40 bis 59 Jahre 24 5 Über 60 Jahre 24 Tabelle 2: Einteilung und Fallzahl der Altersgruppen. Bei insgesamt 143 Fällen der Altersgruppen 1 und 2 wurde der Impfstatus ermittelt und ausgewertet. Die Daten wurden primär im SAP erhoben. Bei 60 Fällen war dies nicht möglich und es wurden die betreuenden Ärzte schriftlich kontaktiert. Die Rücklaufquote betrug 91,7 %. Lediglich von 5 Ärzten wurde keine Antwort erhalten. 18 2. Materialien und Methoden 2.6.2 Auswahl von Antikörperbestimmungen für das Masernvirus in den Jahren 1997 bis 2013 Für die Auswertung der Masernimmunität in der Bevölkerung in den Jahren 1997 bis 2013 wurden aus der Datenbank des Institutes für Virologie Patientendaten mit gemessener IgG-Konzentration zusammengestellt. Von Patienten, bei denen mehrere Proben vorhanden waren, wurde pro Jahr jeweils nur die Letzte verwendet. Wenn Proben für mehrere Jahre vorlagen, wurde jeweils nur die des ersten Jahrganges einbezogen. Bis Ende 2011 wurde ein Test der Firma Siemens (Enzygnost® Anti-Measles Virus/IgG) verwendet. Danach wurde auf ein Testsystem der Firma Euroimmun umgestellt. Aufgrund des Testaufbaus gibt es bei der Testung mit Euroimmun einen Maximalwert von 5000 mIU/ml. Daher wurden die Werte der mit Siemens gemessenen Proben über 5000 mIU/ml analog zu Euroimmun als > 5000 mIU/ml angegeben. In die Auswertung sind 8611 Proben eingegangen. 2.7 Testverfahren 2.7.1 Aviditätstestung und Bestimmung der IgG-Konzentration Die Aviditätstestung der Serumproben erfolgte mit einem Euroimmun Analyzer I und dem von Euroimmun erhältlichen Testkit. Da die Aviditätstestung auf einem Testkit zur IgG-Bestimmung beruht, wurde zusätzlich eine Eichkurve für die IgG-Konzentration mitgeführt und die Werte anhand dieser berechnet. Bei jeder Aviditätstestung werden eine hoch- (>60 %) und eine niedrigavide (<40 %) Kontrolle mitgeführt. Die Patientenproben werden im Verhältnis 1:101 mit Phosphatpuffer verdünnt. Jede Kontrolle und Patientenprobe wird in zwei benachbarte Wells innerhalb einer Zeile einer 96-Well-Mikrotiterplatte pipettiert. Die Wells sind mit Masern-Antigen beschichtet. Zunächst wurden die Proben 30 Minuten bei Raumtemperatur (18 bis 25 °C) inkubiert und anschließend automatisch gewaschen. Die Proben der Streifen mit ungeraden Zahlen wurden 10 Minuten mit einer Harnstofflösung inkubiert. Die Proben der Streifen mit geraden Zahlen wurden lediglich mit PBS inkubiert. Durch die Harnstofflösungen wurden Bindungen zwischen niedrigaviden Antikörpern und den Antigenen gelöst. Im Anschluss wurden die Wells dreimal gewaschen und die verbliebenen Antikörper mit Enzymkonjugaten (Peroxidase19 2. Materialien und Methoden markiertes Anti-Human-IgG) gebunden und für 30 Minuten inkubiert. Nach dreimaligem Waschen erfolgte die Zugabe der Chromogen-Substrat-Lösung (15 Minuten Inkubationszeit). Die Reaktion wurde mittels einer Stopplösung beendet und die chromogenen Substrate erzeugten eine spezifische Extinktion, welche bei 450 nm gemessen wurde (laut Herstellerangaben Euroimmun AG). Die Avidität berechnete sich als Prozentzahl nach entsprechender Formel: Laut Euroimmun können Extinktionswerte >1,200 der Wells ohne Harnstoffbehandlung zu falsch hohen Werten für die Avidität führen. Der Grund dafür ist das möglicherweise gleichzeitige Vorliegen von hoch- und niedrigaviden Antikörpern bei hohen Gesamt-IgG-Konzentrationen. Dies führt dazu, dass eher die hochaviden Antikörper an die Antigenepitope binden und sich bezüglich der GesamtIgG-Population eines Patienten ein falsch hoher Wert für den relativen Aviditätsindex ergibt. Daher wird empfohlen, die Testungen mit einer 1:404 Verdünnung oder ggfs. höher zu wiederholen. Dementsprechend wurde bei Extinktionswerten größer als 1,200 vorgegangen. Die Extinktionswerte der mit PBS inkubierten Wells sind ein Maß für die gesamte Anti-MV-IgGKonzentration. Daher war es möglich, aus diesen Werten und der parallel mitgeführten Eichkurve die IgG-Konzentrationen der Proben zu ermitteln. Die Eichkurven wurden ebenfalls in einer 1:101Verdünnung angefertigt. Extinktionswerte, die aufgrund des oben beschriebenen Vorgehens in einer anderen Verdünnungsstufe gemessen wurden, wurden rechnerisch an die Verdünnung der Eichkurve angepasst. 20 2. Materialien und Methoden Abbildung 2: Beispiel einer Eichkurve; Extinktionswerte in Abhängigkeit der eingesetzten definierten Menge von Anti-MV-IgG (mIU/ml). Aus der Eichkurve sowie der gemessenen Extinktion der Probe ließ sich die IgG-Konzentration anhand der Gerade im entsprechenden Abschnitt ermitteln. 2.7.2 Endpunktneutralisationstest Es wurde die Serumverdünnungsmethode angewandt. Die Proben wurden in FBS-freiem Medium in Potenzen von 2 beginnend mit 1:10 bzw. 1:20 bis 1:1280 respektive 1:2560 verdünnt. Zu den Serumverdünnungen wurde Masernvirus vom Stamm Edmonston mit einer Konzentration von 200 pfu/50µl hinzugegeben und anschließend 1 Stunde bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Danach wurden 1,6*105 Vero-Zellen hinzu pipettiert (ca. 20 000 Zellen/Well) und eine weitere Stunde bei 37°C inkubiert. Nach Zugabe von FBS (5 % FBS pro Well) wurden die Verdünnungen sechsfach auf eine 96-wellMikrotiterplatte auspipettiert und für 5 Tage im Brutschrank bei 37 °C, 5 % CO2 und 90 % relativer Luftfeuchtigkeit belassen. Ab dem fünften Tag erfolgte die Färbung und Auswertung, wenn keine mikroskopischen Veränderungen des zytopathischen Effektes erkennbar waren. Die Anfärbung und Fixierung erfolgte mit 0,1 % Kristallviolett in 20 %iger Ethanollösung. Der CPE wurde makroskopisch und unter dem Lichtmikroskop beurteilt. Die Berechnung des Neutralisationstiters erfolgte nach der Methode von Behrens & Kaerber (Bachmann et al. 1977): 21 2. Materialien und Methoden V = -log der ersten Serumverdünnung, bei der 100 % der Reagenten positiv waren. d = -log des Verdünnungsfaktors (1:2) S= Summierungsverhältnis Ein Titer über 1:8 wurde als positiv angesehen (Poethko-Müller & Mankertz 2011). 2.7.3 Plaquereduktionsneutralisationstest (PRNT) Während die Endpunktneutralisation nach dem Alles-oder-Nichts-Gesetz funktioniert, also nur die totale Hemmung der Virusvermehrung nachweist, lassen sich mit dem PRNT auch partielle Neutralisationsreaktionen erfassen. Deshalb gilt der PRNT als präziseres Verfahren als die Endpunktneutralisation (Albrecht et al. 1981; Kenny & Schell 1975). Um zu überprüfen, ob die Endpunktneutralisation als Sechsfachbestimmung dieselbe Genauigkeit besitzt wie der PRNT, wurden 25 Proben mit beiden Verfahren getestet und die Ergebnisse miteinander verglichen. Am Vortag der Testung wurden in eine 6-Well-Platte 3x106 Zellen (entspricht 500.000 Zellen pro Well) ausplattiert, sodass diese am nächsten Tag nahezu 100 % optische Konfluenz aufwiesen. Eine Serumverdünnung wurde analog zum Endpunktneutralisationstest hergestellt und mit 200pfu/250 µl (entspricht 200 pfu pro Well) gemischt. Zusätzlich wurde pro Ansatz auch eine Viruspositivkontrolle mitgeführt. Nach einstündiger Inkubation im Wasserbad bei 37 °C wurde das SerumVirus-Gemische auf den Zellrasen, welcher vorher mit PBS gewaschen wurde, ausgebracht und für eine Stunde im Brutschrank inkubiert. Im Anschluss wurde das Gemisch abgenommen und die Zellen mit 3 ml agarosehaltigem Medium überschichtet. Im Brutschrank wurden die Platten bei 37 °C, 90 % relativer Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2-Anteil für mindestens 5 bis 6 Tage inkubiert. Die Färbung erfolgte mit Neutralrotlösung (Nautralrot-Stock 1g ad 60ml Aquadest, Gebrauchslsg. 1:100 in PBS) für 1 h bei 37 °C. Der Farbstoff wird nur von den lebenden Zellen aktiv aufgenommen. 22 2. Materialien und Methoden Makroskopisch wurde die Anzahl der Plaques pro Well ermittelt und diejenige Verdünnungsstufe als Ergebnis angegeben, bei der die Anzahl der Plaques 50 % der maximal erreichten Plaqueanzahl der Probe entsprachen. 23 2. Materialien und Methoden 2.8 Statistische Methoden Die Daten wurden mit SPSS Version 22 bearbeitet. Die Berechnung des linearen Zusammenhangs erfolgte mithilfe der Spearman-Rangkorrelation. Der Wertebereich des Korrelationskoeffizienten kann Werte zwischen -1 und 1 annehmen. Zur Interpretation der Werte findet man in der Literatur unterschiedliche Angaben. Beispielhaft soll eine grobe Einteilung genannt werden (Tab. 3; Fahrmeir et al. 2007; Dawson et al. 1994). Wertebereich von r Korrelationsstärke 0 - <0,5 schwache Korrelation 0,5 - <0,8 mittlere Korrelation 0,8- 1 starke Korrelation Tabelle 3: Bewertung von Korrelationskoeffizienten (Fahrmeir et al. 2007). Zur Überprüfung, ob zwei Gruppen zur selben Grundgesamtheit gehören, wurde der Mann-WhitneyU-Test angewendet. Bei den dargestellten Boxplots sind die Ausreißer als Werte die 1,5 bis 3 Boxlängen vom Ende einer Box entfernt liegen definiert. Extremwerte liegen mehr als drei Boxlängen vom Ende einer Box entfernt. 24 3. Ergebnisse 3. Ergebnisse 3.1 Ergebnisdarstellung der untersuchten Parameter 3.1.1 Antikörperprävalenz zwischen 1997 und 2013 (ELISA) Für die Auswertung der Daten der Jahrgänge 1997 bis 2013 standen Ergebnisse von n=8611 Seren zur Verfügung. Die Verteilung der Fälle über die Jahre ist in Tab. 4 dargestellt. Anzahl Fälle Prozent 1997 463 5,4 1998 354 4,1 1999 453 5,3 2000 502 5,8 2001 408 4,7 2002 307 3,6 2003 314 3,6 2004 394 4,6 2005 461 5,4 2006 514 6,0 2007 640 7,4 2008 593 6,9 2009 667 7,7 2010 652 7,6 2011 627 7,3 2012 538 6,2 2013 724 8,4 Gesamtsumme 8611 100,0 Jahr Tabelle 4: Verteilung der Fallzahl über die Jahre Bei der Verteilung des Geschlechtes zeigt sich über die Jahre ein durchschnittlicher Anteil von 47,8 % Männern (Horizontale Linie in Abb. 3) und 52,1 % Frauen. Damit präsentiert sich eine gute Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Zensus-Untersuchungen von 2011, bei der der Anteil der Männer in Sachsen bei 48,8 % lag (Statistisches Landesamt des Freistaates Sachsen 2011). Über die Jahre zeigen sich Schwankungen um wenige Prozentpunkte, im Jahr 2001 ist die Abweichung mit einem Unterschied von 9,8 % am größten. Im Jahr 2012 betrug die Abweichung 2,6 % zum Mittelwert der 25 3. Ergebnisse Stichprobe. Insgesamt kann man von einer homogenen Geschlechtsverteilung über die Jahre sprechen. Das Durchschnittsalter (Abb. 4) beträgt in der gesamten Stichprobe 43,5 Jahre. Die Unterschiede zwischen den Jahren sind allerdings groß. Das Durchschnittsalter lag für Sachsen im Jahr 2011 bei 46,3 Jahren (Statistisches Landesamt des Freistaates Sachsen 2014). Wenn man sich die einzelnen Jahrgänge betrachtet, dann liegen nur die Jahrgänge 2004, 2008 und 2012 mit ihrem Konfidenzintervall in diesem Bereich. Bei den restlichen Jahren waren die Mittelwerte überwiegend darunter, für die Jahre 2009 und 2010 darüber. Abbildung 3: Geschlechtsverteilung über die Jahre; Die Linie stellt den Mittelwert aller Jahrgänge dar. 26 3. Ergebnisse Fehlerbalken: 95% Konfidenzintervall Abbildung 4: Durchschnittsalter über die Jahre mit 95 %-Konfidenzintervall; die durchgezogene Linie bei 43,5 Jahren markiert den Durchschnittswert der gesamten Stichprobe. Die IgG-Konzentrationen wurden qualitativ ausgewertet (Abb. 5). Hierfür wurden die Grenzen der WHO herangezogen (>200 mIU/ml = positiv; World Health Organization 2009a). Im Durchschnitt lagen 93,4 % der Patienten im positiven Bereich der IgG-Konzentration. Für die qualitative Verteilung ergab sich kein Geschlechtsunterschied (Mann-Whitney-U-Test n.s., p=0,772). Der Anteil der Seropositiven fluktuiert um 5 %. Das Jahr 2012 gehört mit 92,9 % seropositiven Probanden zu den fünf Jahren mit dem niedrigsten Anteil. Der Anteil der Seropositiven liegt in allen Jahrgängen über 90 %. 27 3. Ergebnisse Abbildung 5: Verteilung der qualitativen IgG-Konzentration über die Jahre; Werte nach WHO (>200 mIU/ml = positiv). Die Jahrgänge mit den niedrigeren Altersdurchschnittswerten zeigen einen geringeren Anteil an seropositiven Patienten. Aufgrund dieser Daten wurden die Mediane der IgG-Konzentrationen dem Alter der Personen zusammengefasst in je 5-Jahresgruppen in einem Boxplot gegenübergestellt. In Abb. 6 kann man im jungen Alter einen exponentiellen Anstieg der IgG-Konzentration erkennen, bevor sich ab ca. 50 Jahren ein Plateau einstellt. Bei den Altersgruppen sind die jeweiligen Fallzahlen im dreistelligen Bereich. Im Alter über 85 Jahre gab es nur wenige Patienten. Deshalb wurden diese Werte nicht abgebildet. 28 3. Ergebnisse Abbildung 6: Boxplot für die Konzentration der IgG- Antikörper für die in 5-Jahresabständen zusammengefassten Altersgruppen; Kreise bei den 6 bis 20-Jährigen stellen Ausreißer dar; n=8554. Korrespondierend hierzu lässt sich auch der Anteil der Seropositiven über die Altersgruppen darstellen (Abb. 7), welcher von 62,7 % in den ersten 5 Lebensjahren auf 87,3 % bei den 6 bis 10-Jährigen und 81,3 % bei den 11 bis 15-Jährigen ansteigt. In den folgenden Altersgruppen liegt der Anteil im Bereich zwischen 90 % und 91 % und erreicht bei den Über-45-Jährigen Werte über 95 %. 29 3. Ergebnisse Abbildung 7: Anteil der Seropositiven in den Altersgruppen in 5 Jahresabständen nach WHO. 30 3. Ergebnisse 3.1.2 Aviditätswerte der Stichprobe des Jahres 2012 Für die Avidität wurden n=129 Fälle mit einer IgG-Konzentration von über 200 mIU/ml ausgewertet. Zur Übersicht sind die Ergebnisse in Abb. 8 dargestellt. Alle Probanden hatten einen Aviditätswert im hochaviden Bereich (>60 %). Der Mittelwert lag bei 78 %. Es zeigte sich kein signifikanter Unterschied zwischen den Geschlechtern (Mann-Whitney-U-Test n.s, p=0,065). Weiterhin ließ sich kein Zusammenhang zwischen Alter und Avidität herstellen. Die Avidiätsergebnisse zeigten über alle Altersgruppen eine ähnliche Streubreite (Abb. 9). Abbildung 8: Boxplot mit Darstellung der Avidität in Abhängigkeit von Altersgruppe und Geschlecht. 31 3. Ergebnisse Abbildung 9: Mittelwert der Avidität der einzelnen Altersgruppen mit Angabe des 95 %Konfidenzintervalls. 32 3. Ergebnisse 3.1.3 Ergebnisse der Endpunktneutralisationstests Bei der hier durchgeführten Stichprobe von Endpunktneutralisationstests zeigten sich keine Geschlechtsunterschiede (Mann-Whitney-UTest n.s., p=0,101). Die Verteilung der Werte fasst Tab. 5 zusammen. Es zeigte sich eine Streuung der Werte mit insgesamt 6 Extremwerten Anzahl Mittelwert Minimum Maximum Perzentile und 4 Ausreißern. Über die Altersgruppen lagen die Werte in ähnlichen Bereichen, wobei bei den 2 bis 6-jährigen Mädchen und den 25 50 75 129 1:144 1:10 1:1613 1:40 1:71 1:113 Tabelle 5: Verteilungsmaße der Stichprobe der Neutralisationstests. Altersgruppen ab 40 Jahren eine Häufung höherer Neutralisationstiter zu verzeichnen war (Abb. 10). Abbildung 10: Boxplot zur Darstellung des Reziprokes des Neutralisationstiters in Relation zu den Altersgruppen und dem Geschlecht. Bei einer durchgeführten Negativkontrolle von Patientenproben mit einer IgG-Konzentration unter 200 mIU/ml wurden von 8 Proben 4 mit positiven Titern gemessen (1:14 bis 1:20). 33 3. Ergebnisse 3.1.4 Ergebnisse der Anti-MV-IgG-Konzentration für die Stichprobe 2012 Die 129 Proben, für die auch ein Endpunktneutralisationstest durchgeführt wurde, zeigten ebenfalls keine signifikanten Geschlechtsunterschiede (Mann-Whitney-U-Test n.s., p=0,79). Die Verteilung über die Altersgruppen ist in Tabelle 6 dargestellt. IgG-Konzentration (mIU/ml) Altersgruppen Minimum 25. Perzentil Median 75. Perzentil Maximum 2 bis 6 Jahre 217 601 734 3073 5001 7 bis 18 Jahre 215 259 542 651 4340 19 bis 39 Jahre 210 258 538 824 5001 40 bis 59 Jahre 216 490 850 5001 5001 Über 60 Jahre 211 535 4850 5001 5001 Tabelle 6: Lagemaße der IgG-Konzentration in Abhängigkeit von den Altersgruppen. Für die Altersgruppen der 2 bis 6-Jährigen sowie der 40 bis 59-Jährigen und über 60-Jährigen erreichen die IgG-Konzentrationen sowohl minimale als auch maximale Werte, wohingegen bei den 7 bis 18-Jährigen und den 19 bis 39-Jährigen 50 % der Werte im Bereich zwischen 200 und 900 mIU/ml liegen und nur wenige Werte darüber. 34 3. Ergebnisse 3.2 Impfstatus der 2- bis 18-Jährigen Bei den 143 betrachteten Fällen waren insgesamt für 13 (9,1 %) keine Impfangaben ermittelbar. In 31 Fällen waren die Angaben im SAP anamnestisch ohne Vorlage des Impfausweises erhoben worden. Da diese Angaben mit einer größeren Unsicherheit behaftet sind, wurden sie in der Auswertung kenntlich gemacht. Die Verteilung der Fälle auf die Altersgruppen und das Geschlecht ist in Tab. 7 dargestellt. Insgesamt haben 81,1 % (n=116) die erste Masernimpfung erhalten. Die zweite Masernimpfung erhielten noch 59,7 % (n=77) der Kinder und Jugendlichen. Alter und Geschlecht Anzahl Prozentanteil 2 bis 6 Jahre, weiblich 33 23,1 2 bis 6 Jahre, männlich 31 21,7 7 bis 18 Jahre, weiblich 35 24,5 7 bis 18 Jahre, männlich 44 30,8 Gesamtsumme 143 100,0 Tabelle 7: Verteilung über Altersgruppen und Geschlecht. Bei der Betrachtung der einzelnen Altersgruppen zeigt sich ein differenzierteres Bild (Abb. 11). Dabei gibt es zwischen den Mädchen und Jungen innerhalb der einzelnen Gruppen keine Unterschiede (Mann-Whitney-U-Test n. s., p=0,637). Es zeigt sich jedoch, dass bei den 2- bis 6-jährigen lediglich ein Drittel bereits die zweite Impfung erhalten hat. Bei den 7- bis 18-Jährigen liegt dieser Anteil bereits bei rund 71 %. Allerdings sind die Werte in dieser Gruppe mit einer größeren Unsicherheit behaftet, da bei 13,9 % (11/79) der Fälle keine Angaben ermittelbar waren. Aufgrund der fehlenden Daten ist es möglich, dass die geforderte Impfrate bei der älteren Altersgruppe erreicht wurde. Bei der Jüngeren ist der Anteil der Ungeimpften mit 17,2 % jedoch deutlich zu hoch. Für eine erfolgreiche Elimination wird eine Impfrate von 95 % in allen Altersgruppen gefordert (Robert-Koch-Institut, 2013). 35 3. Ergebnisse Abbildung 11: Verteilung der Impfungen innerhalb der Altersgruppen. 36 3. Ergebnisse 3.3 Vergleichbarkeit von Plaquereduktionsneutralisationstest und Endpunktneutralisationstest Die 25 verwendeten Proben hatten in der Nachtestung eine grenzwertige IgG-Konzentration (200 bis 275 mIU/ml). Alle Altersgruppen waren vertreten, wobei der Mittelwert bei 27,6 Jahren lag. Es wurden 14 Proben von männlichen und 11 von weiblichen Patienten verwendet. Die durchschnittliche IgG-Konzentration lag bei 238 mIU/ml, die Avidität bei 74 %. Der Mittelwert des PRNT-Titers war mit 1:40 etwas höher als der der Endpunktneutralisation (Mittelwert 1:32). Man geht davon aus, dass bis zu einer vierfachen Abweichung der Titer voneinander der Unterschied auf die biologische Variabilität der Testverfahren zurückgeführt werden kann. Dieser Rahmen ist in Abb. 12 dargestellt. Bei dieser Stichprobe lagen alle Wertepaare innerhalb dieses Bereiches. Abbildung 12: Gegenüberstellung der Titer in Abhängigkeit vom angewendeten Verfahren; im Bereich zwischen den eingezeichneten Geraden ist die Abweichung kleiner als der Faktor 4. Für eine genauere Analyse wurden die Daten zu Werten des natürlichen Logarithmus transformiert, um eine Normalverteilung zu erhalten (Abb. 13 und Abb. 14). 37 3. Ergebnisse Abbildung 13: Verteilung der Werte des Endpunktneutralisationstests (NT), zur Transformation wurde vom Reziprok des Titers der natürliche Logarithmus gebildet; die blaue Linie stellt die Normalverteilung dar. Abbildung 14: Verteilung der Werte des Plaquereduktionsneutralisationstests (PRNT); zur Transformation wurde vom Reziprok des Titers der natürliche Logarithmus gebildet; die blaue Linie stellt die Normalverteilung dar. 38 3. Ergebnisse Mithilfe dieser Transformation lassen sich die Standardabweichungen vergleichen und eine Aussage zur Lage der Wertepaare treffen. In Abb. 15 sind die transformierten Ergebnisse der Endpunktneutralisation in Abhängigkeit von denen des PRNT dargestellt. Abbildung 15: Transformierte Werte der Endpunktneutralisation in Abhängigkeit von den Ergebnissen des PRNT; zur Transformation wurde vom Reziprok des Titers der natürliche Logarithmus gebildet; die Linien stellen die Arithmetischen Mittel (AM) addiert bzw. subtrahiert mit der einfachen und doppelten Standardabweichung (SD) dar. Weiterhin sind Linien für den Mittelwert (AM) und die ein- und zweifache Standardabweichung (SD) dieser dargestellt. Es zeigt sich, dass 22 der 25 Wertepaare (88 %) im Bereich der zweifachen Standardabweichung vom Mittelwert liegen, also in dem Bereich, in dem 95,4 % der Werte erwartet werden können. Die 3 Wertepaare außerhalb dieses Bereichs sind ebenfalls gut miteinander vergleichbar, bilden jedoch aufgrund ihrer Höhe den Randbereich dieser Stichprobe. 39 3. Ergebnisse 3.4 Korrelation zwischen Neutralisationstiter und IgG-Konzentration In anderen Arbeiten (Marianov 2005; van den Hof et al. 2003) wurde bereits ermittelt, dass eine quantitative und qualitative Übereinstimmung zwischen Neutralisationstiter und IgG-Konzentration besteht. Van den Hof`s Untersuchung ergab einen Spearman-Korrelationskoeffizienten von ρ=0,78 (n=791). Die Überprüfung dieses Sachverhaltes wurde als Qualitätskontrolle für diese Arbeit verwendet. Die Höhe der Neutralisationstiter im Verhältnis zur Höhe der IgG-Konzentration stellt Abb. 16 dar. Es wurden n=129 Werte in die Auswertung einbezogen. Es ergab sich eine Spearman-Korrelation von ρ=0,734 (p<0,001). Man kann also von einer mittleren bis starken Korrelation sprechen. Somit lassen sich die Ergebnisse bestätigen. Abbildung 16: Transformation der Neutralisationstiter (NT; Natürlicher Logarithmus des Reziprokes) in Relation zur transformierten IgG-Konzentration (Dekadischer Logarithmus). 40 3. Ergebnisse 3.5 Korrelation zwischen Avidität und Neutralisationstiter Die Werte des Neutralisationstiters wurden in Werte des natürlichen Logarithmus transformiert. Dadurch wurde die Voraussetzung der Normalverteilung für die Ermittlung des Korrelationskoeffizienten erfüllt (Abb. 17 und 18). Es zeigte sich ein Korrelationskoeffizient von ρ=0,240 (p=0,006) zwischen der Avidität und dem Neutralisationstiter. Dies ist ein schwacher linearer Zusammenhang. Auch unter Berücksichtigung des möglichen Einflusses der Höhe der IgG-Konzentration und der Ermittlung einer partiellen Korrelation bleibt der Koeffizient niedrig (r=0,266, p=0,002). Abbildung 17: Histogramm der Werteverteilung der Avidität; die blaue Linie stellt die Normalverteilung dar. Abbildung 18: Histogramm der Werteverteilung des natürlichen Logarithmus des Reziprokes des Neutralisationstiters; die blaue Linie stellt die Normalverteilung dar. In der graphischen Auswertung (Abbildung 19) zeigt sich eine Punktwolke, die keine lineare Korrelation erkennen lässt. 41 3. Ergebnisse Abbildung 19: Abhängigkeit des natürlichen Logarithmus des Neutralisationstiters (NT) von der Avidität. Da sich bei der graphischen Darstellung eine scheinbare Aufteilung in zwei Cluster zeigt (Abb. 20), wurde versucht, ein assoziiertes Merkmal zu identifizieren. Es zeigte sich, dass für hohe IgG Konzentrationen über 1000 mIU/ml nahezu alle Punkte im oberen Cluster liegen. Dementsprechend findet sich für diese Gruppe auch eine signifikante Korrelation zwischen Avidität und Neutralisationstiter (n=41; ρ=0,612; p<0,001). Man kann also von einer mittleren Korrelation zwischen Neutralisationstiter und Avidität sprechen, wenn die IgG-Konzentration hoch ist. Für die Gruppe mit Konzentrationen zwischen 200 und 1000 mIU/ml ist die Korrelation schwach (n=88; ρ=0,341), jedoch signifikant (p=0,001). 42 3. Ergebnisse Abbildung 20: Abhängigkeit des natürlichen Logarithmus des Neutralisationstiters (NT) von der Avidität; Einteilung nach Höhe der IgG-Konzentration (mIU/ml). Wenn man die einzelnen Altersgruppen auswertet, dann ergibt sich für die 7- bis 18-Jährigen (n=30; ρ=0,514; p=0,04; Abb. 21) und die über 60 Jährigen (n=24; ρ=0,422; p=0,04; Abb. 22) eine signifikante Korrelation zwischen der Avidität und dem Neutralisationstiter. Bei den 7- bis 18-Jährigen hatten 20 zwei MMR-Impfungen bekommen, sowie weitere drei erhielten eine und für sieben war der Impfstatus nicht eruierbar. Für die übrigen Altersgruppen fielen die Ergebnisse nicht signifikant aus (Tab. 8). Altersgruppe Anzahl der Fälle Spearman Rangkorrelation P-Wert 2 bis 6 Jahre 23 ρ= -0,143 p=0,516 19 bis 39 Jahre 28 ρ= 0,163 p=0,409 40 bis 59 Jahre 24 ρ= 0,168 p=0,432 Tabelle 8: Spearman-Rangkorrelation für die Altersgruppen 1, 3 und 4. 43 3. Ergebnisse Weiterhin ist ein Geschlechtsunterschied erkennbar. Bei den weiblichen Patienten ist der Zusammenhang schwach, allerdings signifikant (n=65; ρ=0,251; p=0,044). Bei den männlichen Patienten kann man nicht von einem Zusammenhang sprechen (n=64; ρ=0,209; p=0,097). Abbildung 21: Abhängigkeit des natürlichen Logarithmus des Neutralisationstiters von der Avidität bei der Altersgruppe der 7- bis 18-Jährigen. Abbildung 22: Abhängigkeit des natürlichen Logarithmus des Neutralisationstiters von der Avidität bei der Altersgruppe über 60-Jährigen. 44 4. Diskussion 4. Diskussion 4.1 Epidemiologie der Masernimmunität im Raum Leipzig 1997 bis 2013 Die archivierten Ergebnisse des Institutes für Virologie stellen eine geeignete repräsentative Grundlage für Untersuchungen der Seroprävalenz dar. Bei einer geforderten Impfquote von mindestens 93 bis 95 % der WHO (World Health Organization 2009b) kann angenommen werden, dass auch der entsprechende Anteil der Bevölkerung seropositiv ist. Vor 1990 wurden über 90 % der DDR-Bevölkerung geimpft (Reiter & Poethko-Müller 2009). Das Impfprogramm der DDR war sehr erfolgreich und konnte die Inzidenz zunächst sehr stark senken (Pöhn & Rasch 1994). In den Folgejahren der deutschen Wiedervereinigung lag die Impfquote für die erste Masernimpfung vermutlich weiterhin bei über 90 %. In den Jahren 1987 bis 1998 lag sie für die 2. Masernimpfung noch bei über 70 %, in den Jahren 1999 bis 2002 jedoch unter 70 % (PoethkoMüller & Mankertz 2013). Diese Ergebnisse gelten allerdings für ganz Deutschland und es ist unklar, wie sehr die Impfquoten im Raum Leipzig von diesen Zahlen abweichen. Weiterhin muss berücksichtig werden, dass sich die sächsischen Impfempfehlungen von denen des RKI unterscheiden. Der Anteil der Seropositiven muss in der vorliegenden Arbeit unter dem Aspekt betrachtet werden, dass die Altersstruktur der Jahreskohorten sehr heterogen ist. Ältere Probanden haben eine höhere Wahrscheinlichkeit, seropositiv zu sein. Die Jahrgänge mit einem hohen Durchschnittsalter weisen auch einen höheren Anteil an Seropositiven auf. So zeigen die Stichproben der Jahre 2009 und 2010 mit einem Anteil Seropositiver von 95,5 % (2009) und 95,3 % (2010) von allen Jahren die höchsten Werte. Dies waren die Jahre mit den höchsten Mittelwerten des Alters und damit der größten Abweichung vom Durchschnittswert der gesamten Stichprobe. Vor allem im Jahr 2013 ist der Anteil mit 91,0 % niedrig, obwohl die Patientenzahl für dieses Jahr mit n=724 groß ist. Das Durchschnittsalter ist in diesem Jahrgang mit 38,6 Jahren in der gesamten Stichprobe am geringsten. Dies könnte einen Einfluss auf den niedrigen Anteil der Seropositiven haben. Im Jahr 2013 und wesentlich stärker auch 2015 hat wieder eine Inzidenzzunahme im Raum Leipzig wie auch in Sachsen insgesamt stattgefunden (Tab. 9). Dies spricht für eine Zunahme empfänglicher 45 4. Diskussion Personen und könnte ein Hinweis für eine abnehmende Impfrate bei Kindern sein. Im Jahr 2005 war der Anteil der Seropositiven mit 90,5 % in der gesamten Stichprobe am geringsten. In diesem Jahr Inzidenz Inzidenz Sachsen Region Leipzig 2001 7,3 3,0 2002 3,2 2,0 2003 0,5 0 2004 0,5 1 2005 3,7 9,0 2006 0,2 1,0 2007 0,2 0 2008 0,7 0 2009 0,5 2,0 2010 1,0 0 2011 5,6 2,0 2012 0 0 2013 13,8 6,1 2014 1,5 2,0 2015 66,5 79,1 Jahr Tabelle 9: Vergleich der Inzidenzraten (pro 1Mio. Einwohner) zwischen Sachsen und der Region Leipzig über die Jahre (Robert-Koch-Institut 2016). wurde in Sachsen und insbesondere in der Region Leipzig auch ein Anstieg der Inzidenz verzeichnet. Im Jahr 2013 war der Anteil der Seropositiven mit 91,0 % am zweitniedrigsten und auch in diesem Jahr stieg die Inzidenz sowohl in Sachsen wie auch in der Region Leipzig an. Die geringere Seroprävalenz von schützenden Antikörpern gegen Masern in diesen Jahren kann ursächlich für die steigenden Fallzahlen gewesen sein. In anderen Jahren wurde das Ziel der Elimination in Bezug auf die Inzidenz erfüllt. So waren die Inzidenzraten 2006 bis 2009 in Sachsen konstant unter 1/1.000.000 Einwohner, stiegen in den 2 Folgejahren wieder darüber, und unterliegen seitdem stärkeren Schwankungen. Diese Inzidenzschwankungen der letzten Jahre können bei einer unzureichenden Impfquote auftreten (Anderson & May 1990). 46 4. Diskussion Poethko-Müller & Schmitz (2013) führten eine groß angelegte Studie (n=8152) zum Impfstatus Erwachsener in Deutschland durch, in der u.a. auch der Impfstatus von Masern bei Probanden im Alter zwischen 18 und 79 Jahren untersucht wurde. Die Impfung war ab 1970 bzw. 1973 verfügbar und wurde für Geburtsjahrgänge ab diesem Zeitpunkt durchgeführt. Die Masernimpfquote war im Osten bei den 18- bis 29-Jährigen am höchsten (90,4 % bei Frauen, 92,1 % bei Männern) und sinkt mit zunehmendem Alter. Bei den 30- bis 39-Jährigen betrug sie noch 73,9 % bei den Frauen und 67,8 % bei Männern (Poethko-Müller & Schmitz 2013). Ein Anteil von Seropositiven über 90 % fand sich in diesen Altersgruppen der 20 bis 30-Jährigen auch in der vorliegenden Arbeit und ist ein gutes Maß für die Repräsentanz der Stichprobe. Der rapide Anstieg des Anteils der Seropositiven von 62,7 % bei den 1- bis 5-Jährigen auf 87,3 % bei den 6- bis 10-Jährigen ist ein Anzeichen dafür, dass mehrheitlich nach den Empfehlungen der Sächsischen Impfkommission geimpft wurde. Die Auswertung zeigte eine starken Anstieg der IgG-Konzentration mit zunehmendem Alter und entsprechend auch eine Zunahme des Anteils der Seropositiven. Dieses Ergebnis stellt gut dar, wie sich eine Masernexposition positiv auf die Seroprävalenz auswirkt. Die Wahrscheinlichkeit, mit dem Virus in Berührung zu kommen, wird mit zunehmendem Alter größer und kann zu einer stärkeren Immunantwort führen. Dies kann durch eine größere IgG-Antikörperkonzentration messbar werden (Beale 1974). Eine mögliche Limitation dieser Daten könnte eine verzerrte Darstellung der Alters- und Geschlechtsstruktur der Allgemeinbevölkerung sein. Die einzelnen Jahre unterschieden sich stark voneinander. Dennoch ließ sich ein Zusammenhang zwischen der Seroprävalenz und den Fallzahlen in Sachsen erkennen. Da in Deutschland kein umfassendes System zur regelmäßigen Ermittlung des Immunstatus der Bevölkerung vorhanden ist (Poethko-Müller & Mankertz 2013), können Datenbankauswertungen, wie die der vorliegenden Arbeit zur Ermittlung der Seroprävalenz von Anti-MV-IgG-Antikörpern hilfreich und sinnvoll sein. In Leipzig wäre es denkbar, eine Datenbankanalyse in dieser oder einer ähnlichen 47 4. Diskussion Form regelmäßig vorzunehmen. Hiermit könnte man die Entwicklung der Immunität im Raum Leipzig längerfristig monitoren. 4.2 Impfprävalenz bei Kindern und Jugendlichen In Deutschland existiert kein umfassendes System zur regelmäßigen Ermittlung des Impfstatus der Bevölkerung. Daher müssen hierfür verschiedene Datenquellen zu Teilstichproben oder aus Querschnittuntersuchungen betrachtet werden (Poethko-Müller & Mankertz 2013). Die Untersuchung des Impfstatus der 2- bis 18-Jährigen aus dem Jahr 2012 im Raum Leipzig der vorliegenden Arbeit kann hierzu einen Beitrag leisten. Zur Methodik kann man festhalten, dass die Rücklaufquote mit 91,7 % sehr gut war und die betreuenden Ärzte sehr kollegial benötigte Informationen zur Verfügung gestellt haben. Im Zeitraum zwischen Mai 2003 und Mai 2006 wurde eine große Studie zur Impfprävalenz bei Kindern und Jugendlichen, das Kinder- und Jugendgesundheitssurvey (KiGGS) durch das RKI durchgeführt. Ziel dieses bundesweiten Befragungs- und Untersuchungssurveys war es, erstmals umfassende und bundesweit repräsentative Daten zum Gesundheitszustand von Kindern und Jugendlichen im Alter von 0–17 Jahren zu erheben. An der Studie haben insgesamt 17.641 Kinder und Jugendliche aus 167 für die Bundesrepublik repräsentativen Städten und Gemeinden teilgenommen. Die Teilnahmequote betrug 66,6 %. Um repräsentative Aussagen treffen zu können, wurden die Analysen mit einem Gewichtungsfaktor durchgeführt, der Abweichungen der Netto-Stichprobe von der Bevölkerungsstruktur (Stand: 31.12.2004) hinsichtlich Alter (in Jahren), Geschlecht, Region (Ost/West/Berlin) und Staatsangehörigkeit korrigiert (Poethko-Müller et al. 2007). Während bei dieser Studie festgestellt wurde, dass 93,6 % der 1- bis 17-Jährigen die erste Impfung erhielten und 75 % auch die zweite (Poethko-Müller & Mankertz 2013), waren die Ergebnisse bei der Stichprobe der vorliegenden Arbeit schlechter. 81,1 % der 2- bis 18-Jährigen haben eine Impfung erhalten und lediglich 57,7 % auch die zweite. Selbst wenn man den Anteil der fehlenden Daten von 9,1 % berücksichtigt, muss man davon ausgehen, dass die Impfquote etwas geringer ausfällt. 48 4. Diskussion Poethko-Müller & Mankertz (2013) kamen weiterhin zu dem Ergebnis, dass bei den Geburtsjahrgängen 1999 bis 2002 weniger als 70 % die zweite Impfung erhalten hatten. Bei der vorliegenden Arbeit war für die 7- bis 18-Jährigen, also die Jahrgänge 1994 bis 2005 der Anteil mit 70,9 % ähnlich. Die Gründe für die Ablehnung einer Impfung sind hier nicht beleuchtet worden. Häufige Gründe in Deutschland wurden bisher vielfach untersucht. In einer umfassenden Befragung (n=3002) hatten 64 % der Befragten keine Impfvorbehalte, 1 % lehnte Impfungen grundsätzlich ab, impfskeptische Eltern erreichten einen Anteil von 35 %. Masern wurden bei dieser Untersuchung von einem Drittel für harmlos gehalten (Gaczkowska et al. 2013). Die Zielgruppe (n=303) der Personen für eine Nachholimpfung, die nach 1970 geboren sind und/oder einen unklaren Impf- bzw. Immunitätsstatus haben, kannten diese Empfehlung lediglich zu einem Anteil von 19 %. Sie gaben als Gründe für eine Nichtimpfung am häufigsten folgendes an: Sie wurden nicht auf die Notwendigkeit hingewiesen, Masern seien keine besonders schwere Krankheit und die Angst vor Nebenwirkungen der Impfung (Gaczkowska et al. 2013). Frühere Untersuchungen kamen schon zu ähnlichen Ergebnissen (Morgan et al. 1987). Eine weitere Ursache sind Eltern mit einem anthroposophischen Lebensstil, welcher häufig mit dem Besuch entsprechender Schulen assoziiert ist und die Ansicht, dass eine natürliche Infektion das Immunsystem stärken würde (Roggendorf et al. 2012). Weiterhin wird die Impfung teilweise nicht von Ärzten empfohlen (Wadl et al. 2011; Wichmann et al. 2009). Wakefield et al. publizierten 1998 eine Arbeit, in der ein vermeintlicher Zusammenhang zwischen dem MMR-Impfstoff und Autismus hergestellt wurde (Wakefield et al. 1998). Dies entfachte eine anhaltende Kontroverse. Bereits im folgenden Jahr wurde diese Hypothese widerlegt (Taylor et al. 1999). Eine weitere Arbeit stärkte die Evidenz der Arbeit von Taylor et al. (Farrington et al. 2001). Die Mehrheit der Autoren wiederriefen die Interpretation der Ergebnisse im Jahr 2004 (Murch et al. 2004). Im Jahr 2010 folgte ein Urteil des britischen General Medical Council, welches zu dem Schluss kam, dass mehrere Aspekte der 1998 veröffentlichten Arbeit inkorrekt waren. Daraufhin wurde der Artikel zurückgezogen (The Editors of The Lancet 2010). 49 4. Diskussion Dennoch halten sich diese Bedenken in der Allgemeinbevölkerung beharrlich. Man kann davon ausgehen, dass auch bei der hier vorliegenden Stichprobe die genannten Gründe eine Rolle gespielt haben und zu einem unzureichenden Impfschutz bei einigen Kindern- und-Jugendlichen geführt haben. Die Stichprobenzahl der vorliegenden Arbeit ist mit 143 Fällen nicht groß. Der Anteil fehlender Daten führt zu einer Unsicherheit besonders bei den 7- bis 18-Jährigen und limitiert die Aussagekraft. Im SAP waren bei 42 % (60 von 143) der Kinder und Jugendlichen keine Angaben zum Impfstatus auffindbar. Wenn eine standardisierte Impfanamnese bei allen Kindern stattfinden und dokumentiert werden würde, könnte man anhand dieser Daten einfach und kosteneffizient die Impfquote ermitteln. Weiterhin könnten bei dieser Erhebung notwendige Catch-up Impfungen angeboten bzw. geplant werden. Diese gehören maßgeblich zur Strategie der Masernelimination in Deutschland (Wichmann & Ultsch 2013). 50 4. Diskussion 4.3 Korrelation zwischen Plaquereduktionsneutralisationstest und Neutralisationstest Verschiedene Untersuchungen sind bereits auf die Bedeutung der Plaquereduktions- neutralisationstests und Endpunktneutralisationstests eingegangen (Cohen et al. 2006; Chen et al. 1990; Albrecht et al. 1981; Kenny & Schell 1975). Albrecht et al. (1981) kamen zu dem Schluss, dass der PRNT als wesentlich sensitiver als der Endpunktneutralisationstest anzusehen ist. Allerdings ist dieser Test zeitintensiver als der Endpunktneutralisationstest. Bei der vorliegenden Arbeit ließ sich feststellen, dass zwischen dem durchgeführten Protokoll des Endpunktneutralisationstestes als Sechsfachbestimmung und dem des PRNT eine sehr gute Vergleichbarkeit besteht und davon ausgegangen werden kann, dass die Unterschiede zwischen den Ergebnissen aufgrund der biologischen Variabilität der Testverfahren zustande kommen und vernachlässigt werden können. Die Untersuchung von Albrecht et al. (1981) wird häufig zitiert. Einige Autoren haben ihre Methoden an die in dieser Arbeit verwendeten angelehnt (Tahara et al. 2012; Hickman et al. 2011; Cohen et al. 2008; Moss et al. 2007; Miller et al. 1995; Chen et al. 1990; Neumann et al. 1985). Dort wurde der Virus-Plaque-Neutralisationstest erstmals genauer beschrieben und mit anderen und auch den bis dahin etablierten Hämagglutination-Inhibitionstests und Komplement-Fixationstests verglichen. Der Plaquereduktionsneutralisationstest wie auch der CPE-Neutralisationstest wurden bei der vorliegenden Arbeit mit der Serumverdünnungsmethode durchgeführt. Allerdings gibt es Unterschiede in der eingesetzten Viruskonzentration. Albrecht et al. (1981) verwendeten 25 pfu pro Well. Bei der vorliegenden Untersuchung wurde eine höhere Viruskonzentration von 200 pfu pro Well verwendet. Man kann davon ausgehen, dass dadurch die Höhe des Neutralisationstiters tendenziell geringer wird, da eine höhere Antigenkonzentration vorliegt und somit mehr Antikörper für eine Neutralisation benötigt werden. Davon gingen schon Albrecht et al. (1981) aus. Weiterhin wurde der Plaquereduktionsneutralisationstest mit einer kürzeren Inkubationszeit von lediglich 4 Tagen für nicht abgeschwächte Viren durchgeführt und auch beim CPE-Neutralisationstest wurden die Vero-Zellen bereits am Vortag in 96-Well-Platten ausplattiert. Ferner wurde zur Färbung bei beiden Testsystemen Neutralrot verwendet. 51 4. Diskussion Der gravierendste Unterschied zwischen diesen Methoden ist die verwendete Viruskonzentration. Albrecht et al. (1981) gingen davon aus, dass mit Steigerung der verwendeten Virusmenge die Sensibilität sinken würde. Bei der vorliegenden Arbeit war ein Streubereich des Neutralisationstiters im Verhältnis zur IgG-Konzentration sichtbar, welcher sich an der Grenze zwischen negativen und positiven Titern womöglich negativ auf die Sensitivität auswirken könnte. Wichtig ist hierbei, dass durchaus Unterschiede im detektierten Spektrum der IgG-Antikörper vorhanden sind. So können Antikörper, die keine neutralisierende Wirkung haben, trotzdem durch einen ELISA-Test detektiert werden, wodurch es dort zur Messung höherer IgG-Konzentrationen kommen könnte (Hesketh et al. 1997). Da in der vorliegenden Arbeit jedoch eine IgG-Konzentration im positiven Bereich (höher als 200 mIU/ml) als Kriterium angewendet wurde, hatte diese Problematik für die Auswertung eine untergeordnete Bedeutung. Der Endpunktneutralisationstest als Sechsfachbestimmung scheint eine gute Vergleichbarkeit mit dem PRNT zu besitzen und aufgrund seiner leichteren Durchführbarkeit in bestimmten Fragestellungen zur Serokonversion bei Patienten durchaus geeignet. Möglicherweise ist schon eine Vier- oder Fünffachbestimmung für ähnliche Ergebnisse ausreichend. Da es sich um biologische Testverfahren handelt, ist die Standardisierung dieser schwierig. Von der WHO wurden Maßgaben mit Anwendung von Referenzseren (World Health Organization 2009a) eingeführt, um diese Verfahren besser vergleichbar zu machen. Bei der vorliegenden Arbeit wurde jedoch das im Institut etablierte Protokoll angewendet. In absoluten Zahlen ist eine Gegenüberstellung mit anderen Untersuchungen schwierig, allerdings sind die Aussagen zur Korrelation vergleichbar, da die Ränge gebildet wurden. 52 4. Diskussion 4.4 Korrelation zwischen Avidität und Neutralisationstiter Die Korrelation zwischen der Avidität und dem Neutralisationstiter wurde bereits in anderen Untersuchungen betrachtet. Für das Cytomegalievirus liegen Ergebnisse von Nozawa et al. (2009) vor, die unter anderem einen Zusammenhang für die Avidität und den Neutralisationstiter zeigten. Bower et al. (2006) fanden für das HIV-1 Virus im Rahmen eines murinen Experimentes zur Wirksamkeit von Impfstoffen eine ähnliche Beziehung. Beim Dengue-Virus existiert ebenfalls eine signifikante Korrelation (Puschnik et al. 2013). Für das Masernvirus wurde der Zusammenhang von Avidität und Neutralisationstiter bei einer Population mit teilweise HIV-infizierten Kindern untersucht (Nair et al. 2009). In Abhängigkeit von den verwendeten Impfstämmen zeigte sich hier für den Masernvirus Wildtyp Zambia eine signifikante Korrelation (ρ=0,78, p=0,002). Bei der Verwendung von Laborviren (Chicago1) konnte kein Zusammenhang nachgewiesen werden (Vero-Zellen: ρ=0,618, p=0,139; Vero/SLAM: ρ=0,158, p=0,783). Im Unterschied zu den Ergebnissen der jetzigen Arbeit wurden bei dieser Betrachtung sowohl hoch- als auch niedrigavide AK von Kindern mit einer durchgemachten Maserinfektion einbezogen. Weiterhin wurden die Neutralisationstiter mit einem Plaquereduktionsneutralisationstest ermittelt, dessen Ergebnisse mittels eines parallel mitgeführten WHO-Standard-Serums (66/202, entspricht 5000 mIU/ml) in mIU/ml umgerechnet wurden. Demnach sind am ehesten die Ergebnisse der Vero-Zellen mit Chicago-1 mit einer Spearman-Korrelation von ρ=0,618, welche nicht signifikant ausfielen, mit den Resultaten der vorliegenden Arbeit vergleichbar. Das könnte an der kleineren Fallzahl liegen (n=48, davon n=29 ohne HIV-Infektion, n=19 mit HIV-Infektion; Nair et al. 2009). Der größere Wert für die Korrelation könnte durch die Verwendung von hoch- und niedrigaviden Aviditätsindizes begründet sein. Bei dieser Untersuchung wurde der Masernstamm Edmonston verwendet. Dies könnte einen Einfluss auf die insgesamt niedrige Korrelation gehabt haben. Der stärkere Zusammenhang bei hohen IgGKonzentrationen könnte durch den Testaufbau begründet sein. Bei der IgG-Konzentrationsbestimmung und auch Aviditätstestung wurden die Antigene aus einem Vero-Zelllysat, welches mit dem MV Stamm Edmonston infiziert wurde, gewonnen (laut Herstellerangaben Euroimmun AG). Das 53 4. Diskussion heißt, die Ergebnisse der Testung bilden alle MV Antigene ab, besonders das Nukleokapsidprotein, welches das am häufigsten vorkommende Protein in maserninfizierten Zellen darstellt (Cohen et al. 2006). Beim Neutralisationstest hingegen spielen vor allem die funktionellen AK, die sich gegen das H-Protein (Bellini et al. 1981) und, weniger ausgeprägt, auch gegen das F-Protein richten (Orenstein et al. 1987) eine Rolle. Bei höheren IgG-Konzentrationen ist es wahrscheinlicher, dass mehr Antikörper auch gegen das H- und F-Protein gerichtet sind und zu höheren Neutralisationstitern führen. Demzufolge könnte sich eine stärkere Korrelation für hohe IgG-Konzentrationen ergeben haben. Der Unterschied zwischen den Geschlechtern ist minimal. Bei den Frauen ist die Korrelation zwar signifikant, jedoch schwach ausgeprägt. Bei den Männern bewegt sich die Korrelationsstärke in einem ähnlichen Bereich, könnte jedoch auch zufällig bedingt sein. Es ist bekannt, dass Frauen anders auf eine Masernimpfung reagieren. So haben Frauen beispielsweise einen höheren Titer nach der Impfung und ein höheres Risiko für Nebenwirkungen (Shohat et al. 2000; Green et al. 1994). Ob auch bei dieser Fragestellung ein Geschlechtsunterschied besteht, bleibt unklar. Möglicherweise war der hier verwendete Stichprobenumfang noch zu klein, um einen eventuell tatsächlich bestehenden Unterschied aufzudecken. Bei der Betrachtung der Altersgruppen zeigte sich für die 7- bis 18-Jährigen eine mittlere Korrelation. Zwei Drittel der Stichprobe haben zwei MMR Impfungen erhalten. Auffällig im Vergleich zu den anderen Altersgruppen war, dass sich vor allem bei der IgG-Konzentration und den Ergebnissen der Endpunktneutralisationstests eine kleinere Spannweite zeigte. Bei der IgG-Konzentration waren lediglich zwei Werte größer als 1000 mIU/ml. Die Titer der Endpunktneutralisationstest sind im Vergleich zur gesamten Stichprobe geringer. 50 % der Werte liegen in einem Bereich zwischen 1:40 und 1:71 und lediglich zwei Werte erreichen einen höheren Wert, als 1:110. Die Avidität ist tendenziell etwas höher als bei den älteren Altersgruppen. Es besteht jedoch kein signifikanter Unterschied. Die Höhe der IgG-Konzentration scheint in dieser Altersgruppe eine geringere Rolle zu spielen. Trotz der niedrigen IgG-Konzentrationen und der vergleichsweise geringen Titer zeichnet sich hier eine signifikante mittlere Korrelation ab. Möglicherweise steht dies im zeitlichen Zusammenhang mit der erfolgten Imp54 4. Diskussion fung. 20 der 30 Patienten haben eine zweifache Impfung erhalten. Bei den 7 nicht ermittelbaren Fällen ist es ebenfalls möglich, dass es sich um zweifach geimpfte Kinder- und Jugendliche handelt. In Deutschland werden Impfstoffe mit Edmonston-Stämmen oder davon abgeleiteten SchwarzStämmen (Beale 1974) geimpft. Wenn die Patienten mit solchen Impfstoffen geimpft wurden und noch nicht mit einem Wildtypvirus in Kontakt gekommen sind, könnten die produzierten Antikörper noch eine Bindungsspezifität ausbilden, welche besser mit der Neutralisationsfähigkeit korreliert. Bei den über 60-Jährigen fand sich eine schwache bis mittlere Korrelation. Alle Probanden sind vor 1952 geboren und haben mit hoher Wahrscheinlichkeit die Infektion als Kind durchgemacht. Im Verhältnis zur gesamten Stichprobe wiesen sie keine höhere Avidität auf. Der Neutralisationstiter und die IgG-Konzentration fielen bei Ihnen jedoch deutlich größer aus, somit fallen sie allgemein in die Gruppe der hohen IgG-Konzentrationen, für die die Korrelation stärker war. Dies hat vermutlich einen Einfluss auf den signifikanten Zusammenhang. Die Avidität zeigte mit steigendem Alter der Probanden eine leichte Abnahme. Nur bei den über 60Jährigen war der Mittelwert etwas höher. Bei den Geburtsjahrgängen ab 1970 hat vermutlich der größere Anteil die Impfung im Kindesalter erhalten. Die wenn auch nur geringe Abnahme der Avidität könnte ein Indiz für die schnellere Verminderung der Antikörper bei Geimpften sein (Markowitz et al. 1990). Dies könnte sich auch in niedrigeren AI-Werten als qualitatives Merkmal der IgG-Antikörper ausdrücken. Ein wichtiger Aspekt beim Vergleich dieser beiden Werte ist das Auftreten von sekundären Impfversagern. Da diese durch hohe Aviditätswerte in Kombination mit hohen Neutralisationstitern charakterisiert sind, könnten sie die Korrelation dieser beeinflussen. Bei der vorliegenden Arbeit kann man nicht absolut ausschließen, dass Werte von sekundären Impfversagern mit einbezogen wurden. Insgesamt konnte bei dieser Untersuchung lediglich ein schwacher Zusammenhang zwischen Avidität und Neutralisationstiter gefunden werden. Mit einer größeren Stichprobenzahl und der Verwendung anderer Virusstämme, wie in der Arbeit von Nair et al. (2009) könnte sich eine stärkere Korrelation zwischen diesen Parametern zeigen. Wenn sich der Zusammenhang mit geeigneten Testprotokollen 55 4. Diskussion bestätigen ließe und man über die Avidität Rückschlüsse auf den Neutralisationstiter ziehen könnte, wäre dies eine Erleichterung der Diagnostik. 56 5. Zusammenfassung 5. Zusammenfassung Dissertation zu Erlangung des akademischen Grades Dr. med. Titel: Seroprävalenz von Masernvirus-IgG Antikörpern: Untersuchung zum Zusammenhang zwischen Avidität und In-Vitro-Neutralisationsfähigkeit eingereicht von: Norman Wernecke angefertigt am Institut für Virologie der Universität Leipzig Betreuer: Professor Dr. med. Uwe Gerd Liebert eingereicht im April 2016 Die Masern sind eine hochkontagiöse durch Morbilliviren verursachte Infektionskrankheit. Trotz Einführung von wirksamen Impfungen sind die Masern weltweit noch immer eine Haupttodesursache vor allem bei Kindern unter 5 Jahren. Die WHO hat als Ziel definiert, eine Elimination der Masern bis 2020 in 5 von 6 Weltregionen zu erreichen. In Europa und auch in Deutschland konnte dies bisher noch nicht erzielt werden. Neben der klinischen Symptomatik sind verschiedene labordiagnostische Verfahren zur Diagnostik etabliert. Die Avidität definiert sich als Maß für die Bindungsspezifität von IgG-Antikörpern zu einem Antigen und wird in der Diagnostik u.a. dazu eingesetzt, um das Stadium einer Infektion festzustellen und kann im Zusammenhang mit dem Neutralisationstiter sekundäre Impfversager identifizieren. Die Bestimmung des Neutralisationstiters gilt als Goldstandard zur Bestimmung der Immunität. 57 5. Zusammenfassung Die vorliegende Arbeit hatte das Ziel, die Korrelation zwischen der Avidität der Anti-Masern-IgGAntikörper und deren In-Vitro-Neutralisationsfähigkeit zu untersuchen, sowie mittels Datenbankanalyse die Seroprävalenz von schützenden Antikörpern gegen Masern und den Impfstatus der Kinderund Jugendlichen festzustellen. Der In-Vitro-Neutralisationstest erfolgte nach der Serumverdünnungsmethode. Masernvirus vom Stamm Edmonston (Konzentration 200pfu/50µl) wurde zusammen mit der Serumverdünnungsreihe auf Vero-Zellen aufgebracht. Die Aviditätstestung wurde mit dem Euroimmun Analyzer I und dem von Euroimmun erhältlichen Testkit durchgeführt. Die lineare Korrelation zwischen Neutralisationsfähigkeit und Avidität war in dieser Stichprobe schwach (ρ=0,240, p=0,006). Für hohe IgG Konzentrationen über 1000 mIU/ml fand sich eine mittlere Korrelation zwischen Avidität und Neutralisationstiter (ρ=0,612; p<0,001). Dies lässt sich aufgrund des Testaufbaus erklären, da sich bei hohen IgG-Konzentrationen mehr Antikörper auch gegen das H- und F-Protein richten und zu höheren Neutralisationstitern führen. Mit dem verwendeten Testprotokoll ließen sich keine Rückschlüsse auf die Neutralisationstiter ziehen, sodass bei bestimmten Fragestellungen die Durchführung eines Endpunktneutralisationstestes sinnvoll erscheint. In Deutschland existiert kein flächendeckendes System zur Evaluierung der Seroprävalenz und der Impfrate. Einzelne Untersuchungen wie die vorliegende Arbeit können zu diesen Fragestellungen einen Beitrag leisten. Bei den untersuchten Jahren 1997 bis 2013 zur Seroprävalenz (n=8611) wiesen im Durchschnitt 93,4 % der Patienten IgG-Konzentrationen im positiven Bereich (>200 mIU/ml) auf. In allen Jahrgängen lag der Anteil über 90 %. Es kommt weiterhin zu Masernausbrüchen, sodass eine weitere Erhöhung der Seroprävalenz von schützenden Antikörpern notwendig scheint. Zur Ermittlung des Impfstatus wurde eine Stichprobe 2- bis 18-Jähriger aus dem Jahr 2012 untersucht. Insgesamt hatten 81,1 % (n=116) die erste Masernimpfung erhalten. Die zweite Masernimpfung erhielten noch 59,7 % (n=77) der Kinder und Jugendlichen. Die WHO gibt eine Impfrate von mindestens 95 % vor, um die Elimination der Masern zu erreichen. Dieses Ziel wurde bisher verfehlt. Die Impfungen erfolgen nach dem Impfkalender der STIKO nicht zeitgerecht. Bei den 2- bis 6-Jährigen 58 5. Zusammenfassung war lediglich ein Drittel zweifach gegen Masern geimpft. Um das Ziel der Elimination bis zum Jahr 2020 zu erreichen, ist eine Erhöhung der Impfrate weiterhin anzustreben. 59 6. Literaturverzeichnis 6. Literaturverzeichnis Albrecht, P., Herrmann, K., Burns, G.R.: Role of virus strain in conventional and enhanced measles plaque neutralization test. Journal of Virological Methods, 1981, 3: 251–260. Anders, J.F., Jacobson, R.M., Poland, G.A., Jacobsen, S.J., Wollan, P.C.: Secondary failure rates of measles vaccines: a metaanalysis of published studies. The Pediatric infectious disease journal, 1996, 15: 62–66. Anderson, R.M., May, R.M.: Immunisation and herd immunity. Lancet, 1990, 335: 641–645. Bachmann, A., Bibrack, P.A., Wittmann, B., Mayr, G.: Virologische Arbeitsmethoden. Band 2: Serologie. Kapitel 6.3.1.1. Serumverdünnungsmethode (Serumneutralisation). 1. 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Selbstständigkeitserklärung Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und ohne unzulässige Hilfe oder Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Ich versichere, dass Dritte von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten haben, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen, und dass die vorgelegte Arbeit weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde zum Zweck einer Promotion oder eines anderen Prüfungsverfahrens vorgelegt wurde. Alles aus anderen Quellen und von anderen Personen übernommene Material, das in der Arbeit verwendet wurde oder auf das direkt Bezug genommen wird, wurde als solches kenntlich gemacht. Insbesondere wurden alle Personen genannt, die direkt an der Entstehung der vorliegenden Arbeit beteiligt waren. ……………………………. ………….……………………. Datum Unterschrift 70 8. Danksagung 8. Danksagung Mein Dank gilt: Prof. U.G. Liebert und Frau Maier für die vielen Anregungen und die Möglichkeit, diese Arbeit zu verwirklichen. G. Szczepankiewicz für ihren Rat bei allen praktischen Arbeiten im Labor. Frau S. Weber, Frau U. Kaminorz sowie Frau Warnath für ihre stets freundliche Unterstützung. Dr. D. Hasenclever für die statistische Beratung. Jennifer Krieg für die anregenden Gespräche. Kathrin Foth für ihren fortwährenden Beistand. Meinen Eltern für ihre Unterstützung während dieser Arbeit und des gesamten Studiums. Allen Mitarbeitern des Instituts für Virologie für das angenehme Arbeitsklima und die Bereitschaft zur Zusammenarbeit und gegenseitigen Unterstützung. 71
