Schlaglicht - BIOspektrum

Schlaglicht
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Fallstricke in der Durchführung von
Proteomanalysen
Katrin Marcus & Helmut E. Meyer, Medizinisches Proteom-Center, Ruhr-Universität Bochum
Die Autoren dieses Essays arbeiten seit
mehr als 25 Jahren im Feld der Proteinanalytik. Nachdem diese Disziplin lange Zeit
sowohl in Deutschland als auch weltweit ein
Schattendasein geführt hat, ist mit dem 1994
von Marc Wilkins geprägten Begriff des Proteoms für die Proteinchemie eine neue Ära
angebrochen. Zeitgleich mit der Einführung
dieses Begriffes wurde die Proteom-Analyse als Hochdurchsatzmethode definiert. Wie
schon bei der zuvor eingeführten Transkriptom-Analyse, die vor allem basierend auf
der DNA-Chip Technologie, gleichzeitig
zehn- bis hunderttausend oder mehr mRNA
Moleküle in einer einzigen Reaktion nachweisen kann, liefert die Proteom-Analyse
unter Einsatz von 2D-Gelelektrophorese
(2D-PAGE), multidimensionaler Chromatographie (MDLC), Isotopen-Kodierten Markierungstechniken (ICAT u.a.) und anderen
Techniken gefolgt von Massenspektrometrie tausende bis mehrere hunderttausend
Datensätze aus einer einzigen Probe. Dabei ergeben sich eine ganze Reihe von logistischen Problemen, die erkannt und gelöst
werden müssen, damit solche Hochdurchsatzstudien zuverlässige Resultate liefern,
die sich in einer nachfolgenden Validierung
als haltbar erweisen.
Wir werden im Folgenden eine Reihe von
Punkten thematisieren, die dabei der besonderen Beachtung bedürfen:
Planung einer Proteom-Studie
Unter einer Proteom-Studie verstehen wir
die Anwendung proteinanalytischer Technologien zum Auffinden neuer Proteine, die
in einem Bezug zu bestimmten Funktionen
oder im Zusammenhang mit bestimmten
Krankheiten stehen. Dabei werden meist
differentielle Ansätze gewählt, um durch die
Analyse der aufgefundenen Unterschiede relevante Hits = Proteintargets zu finden. Der
Erfolg eines solchen Ansatzes ist von einer
Vielzahl von Faktoren abhängig auf die wir
im Folgenden näher eingehen werden:
• Kooperation
Die gemeinsame Planung einer ProteomStudie mit dem Biochemiker, Pharmakologen oder Mediziner und dem involvierten
Proteinanalytiker von Anfang an ist essentiell. Dabei geht es darum, die Randbedingungen festzulegen, die einen erfolgreichen
Studienverlauf garantieren. Dazu gehört
festzustellen, welche Einflussparameter
(Substanzkonzentration, Temperatur, Stress,
Zeitverlauf und sonstige Bedingungen) auf
das zu untersuchende System variiert werden sollen und welche typischen messbaren
Veränderungen (Expressionsänderung, Posttranslationale Modifikationen etc.) damit
im Zusammenhang stehen (funktioneller
Readout).
• Probengewinnung und
Probenvorbereitung
Es ist offensichtlich, dass die Qualität und
genaue Kontrolle der Proben, die einer differentiellen Proteom-Analyse unterworfen
werden, darüber entscheiden, ob in der
nachfolgenden Analyse aussagekräftige Ergebnisse zu erzielen sind. Das heißt auch,
dass in der Planung genaue Protokolle erarbeitet werden müssen, um eine gleich bleibende Probenqualität zu gewährleisten. Mit
anderen Worten: die Probengewinnung und
-vorbereitung muss standardisiert werden.
Dies muss u.a. auch durch die Definition geeigneter Kontrollproben geschehen.
Um niedrig abundante Proteine in einer
Proteom-Studie quantitativ zu analysieren,
ist eine Vorfraktionierung von Zellen und
Geweben unumgänglich. Allein die Vergrößerung des dynamischen Bereichs einer
Nachweismethode führt nicht zum gewünschten Ziel, da die niedrigsten Signale
bei jeder angewandten Nachweistechnik
stets die höchsten Schwankungen aufweisen.
• Anzahl der unabhängig zu
analysierenden Proben
Die Anzahl der notwendigen Proben ist u.a.
abhängig von der Reproduzierbarkeit der
Probengewinnung und dem zu bearbeitenden System. Dabei steigt die Anzahl (n) mit
der Komplexität der Proben: Proteinkomplexe (n = 3) < Proteom einer Zellkultur (n
= 5) < Gewebe aus Modellorganismen (Inzuchtstämme) (n = 8–10) < Proben von humanen Gewebe (n = 20). Hierbei ist zu
berücksichtigen, dass bei humanen Proben
die biologische Variabilität auf Grund von
Polymorphismen sehr hoch ist. Unabhängig von diesen Überlegungen ist eine mehrmalige Wiederholung der gesamten Proteom-Analyse inklusive des jeweiligen bio-
logischen/biochemischen Experimentes unerlässlich.
Es ist sehr verlockend zu glauben, dass
sich mit zehntausenden von Datensätzen aus
der Analyse einer einzigen Probe die Wiederholung eines solchen Experimentes erübrigt. Dies ist ein gefährlicher Irrtum!
In einer differenziellen Proteom-Analyse,
bei der gleichzeitig tausende von Proteinen
parallel in ihrer relativen Quantität erfasst
werden, ist auf Grund der biologischen Probenvariabilität, der Variabilität in der Probenvorbereitung und der Variabilität in der
technischen Durchführung der Analyse mit
einer erheblichen Streuung der Ergebnisse
zu rechnen. Diese Streuung lässt sich in
ihrem Ausmaß nur durch eine ausreichende Anzahl von Wiederholungen bestimmen.
Gleichzeitig garantieren genügend Wiederholungen, die Proteine zu identifizieren, die
sich im Vergleich mit der Kontrollprobe reproduzierbar quantitativ verändern. Für eine handwerklich gut durchgeführte Proteom-Studie ist davon auszugehen, dass zwischen 100 bis ca. 200 unabhängig gewonnene Proben analysiert werden müssen. Der
damit verbundene hohe Arbeitsaufwand hat
schon bei der Transkriptom-Analyse zu der
Unsitte geführt, Proben zu poolen.
• Poolen von Proben
Wenn eine Proteom-Studie geplant wird, so
kommt man auf eine Anzahl von normalerweise 100 bis 200 Proben, die einzeln untersucht werden müssen. Dabei ist es ratsam,
jede Probe doppelt zu analysieren (Doppelbestimmung). Diese Anzahl von Proben z.B.
mittels 2D-PAGE aufzutrennen und die erhaltenen Proteinspotmuster nach Anfärbung
der Gele quantitativ auszuwerten, ist ein
sehr zeitaufwändiges Unternehmen, zumal
bis heute die computergestützte Bildauswertung alles andere als perfekt ist. Das bedeutet, dass für die Durchführung einer solchen Proteom-Studie leicht ein Arbeitsaufwand von 1 bis 2 Jahren einzukalkulieren ist
und zumindest zwei Personen Vollzeit damit
beschäftigt sind. Zusätzlich entstehen für eine solche Proteom-Studie sehr hohe Kosten
durch die große Menge an benötigtem Verbrauchsmaterial und Personal. Beispielsweise belaufen sich die Kosten für eine Proteom-Studie mittels der ICAT (Isotope Coded Affinity Tags)-Technologie auf 600 € pro
durchgeführte Analyse. Da ist es natürlich
verführerisch, die Anzahl der zu untersuchenden Proben durch Poolen drastisch zu
vermindern und somit Arbeitsaufwand und
Kosten zu sparen. Doch was geschieht durch
die Reduktion der Probenzahl durch das
Poolen?
Bei einem Vergleich von nur zwei Proben
(gesund – krank) beim Einsatz der 2D-PABIOspektrum · Sonderausgabe · 9. Jahrgang
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GE nach Klose (1), mit der bis zu 10 000 Proteinspezies aufgetrennt werden können, treten in der Regel 200 oder mehr zufällige Unterschiede auf. Es kann aus einem so gewonnenen Datensatz nicht zwischen zufälligen und krankheitsspezifischen Differenzen unterschieden werden.
Nach dem Poolen aller Proben zu einem
Untersuchungszeitpunkt (jeweils ein Pool
gesund und krank) ist es daher nicht mehr
möglich, die Proteinsignale herauszufinden,
die sich reproduzierbar quantitativ verändern. Selbst wenn diese gepoolte Probe
mehrfach analysiert wird, bleibt die Anzahl
der unabhängig voneinander durchgeführten Experimente (n) undefinierbar zwischen
n = 0 bis 1.
Erst der Vergleich von jeweils 5 bis 12
oder mehr unabhängig durchgeführten Experimenten (bei Modellorganismen) inklusive der dazugehörigen Kontrollen gewährleistet, die Proteinsignale herauszufinden,
die sich in der Mehrzahl der Experimente
reproduzierbar quantitativ verändern.
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Dieses Vorgehen führt auch
dazu, dass sich die Anzahl der
„Proteinhits“ drastisch vermindert, und es wird so gewährleistet, dass die weiterführenden
Untersuchungen mit validen Proteomdaten
gestartet werden.
Beispiel
Wir möchten dies am Beispiel einer publizierten Proteom-Studie erläutern: Claus Zabel et al. (2) haben im Rahmen einer Huntington-Studie mit Mäusen jeweils 12 transgene Tiere und 12 gesunde Kontroll-Tiere
vor dem Einsetzen der ersten Krankheitssymptome untersucht. Zum nächsten Zeitpunkt (Einsetzen der ersten Symptome)
wurden jeweils 8 transgene und 8 gesunde
Tiere untersucht und zum Ende der Studie
noch einmal jeweils weitere 8 Tiere im Spätstadium der Erkrankung. Das heißt, dass bei
dieser Proteom-Studie insgesamt 48 einzelne Gehirnproben untersucht wurden. Bei ei-
ner Doppelbestimmung pro Probe ergibt
sich daraus eine Anzahl von 96 Analysen.
Untersuchungen an weiteren Organen erforderten jeweils die gleiche Anzahl an Analysen. Das Ergebnis dieser Proteom-Studie
war, dass im Gehirn der transgenen Mäuse
drei Proteingruppen identifiziert wurden,
die mit dem Krankheitsverlauf korrelieren.
Hochdurchsatzanalyse = schnell und billig?
An den obigen Ausführungen ist abzulesen,
dass eine solche Proteom-Studie weder
schnell durchgeführt werden kann, noch billig ist. Das gilt auch für die neueren nicht
2D-PAGE basierten Techniken wie ICAT-,
MudPIT (Multidimensional Protein Identification Technology)-, MDLC (Multidimensionale Chromatographie)-MS/MS.
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Auch hier liegt die Anzahl der analytischen
Datensätze zum Teil in astronomischer
Höhe: Wie bei der Auswertung in der Bildanalyse benötigt hierbei die Validierung massenspektrometrischer Messungen mehrere
Wochen Arbeitszeit. Wir haben kalkuliert,
dass die Analyse einer einzigen Plasma-Probe aus dem HPPP mittels multidimensionaler LC gefolgt von MS/MS Fragmentanalysen zu einem Datensatz von ca. 400.000
auszuwertenden MS/MS Spektren führt, die
sicherlich einige Monate an manueller Nacharbeit erfordern werden. Dabei ist es klar,
dass mit der einmaligen Durchführung keine quantitativen Aussagen getroffen werden
können; dies ist erst dann möglich, wenn
dieselbe Probe mehrfach analysiert wurde.
Momentan werden ca. 90% der Zeit, die für
eine solche Proteom-Studie aufgewandt werden, für die Validierung massenspektrometrischer Daten benötigt. An dieser Stelle sind
die Fachleute der Bioinformatik gefordert,
um die zurzeit notwendige manuelle Interpretationsarbeit weitgehend zu automatisieren und damit Hochdurchsatz-Analysen in
der Proteomforschung mit den notwendigen
Wiederholungen zu ermöglichen.
Als erfolgreich und damit preiswert ist sicherlich eine Proteom-Studie zu bezeichnen,
die aus sich heraus valide Ergebnisse liefert,
die sich in den nachfolgenden Untersuchungen mit anderen biochemischen Methoden validieren lassen.
Literatur
[1] Klose, J. (1999): Large-gel 2-D electrophoresis.
Methods Mol Biol. 112: 147–172
[2] Zabel, C., Chamrad, D.C., Priller, J., Woodman, B., Meyer, H.E., Bates, G.P., Klose, J. (2002):
Alterations in the mouse and human proteome caused by
Huntington’s disease. Mol Cell Proteomics 1(5): 366–375.
Danksagung
Die im vorliegenden Artikel beschriebenen
Arbeiten wurden vom BMBF finanziert.
Korrespondenzadresse:
Prof. Dr. Helmut E. Meyer
Ruhr-Universität Bochum
Protein Struktur/Gebäude MA 2/143
D-44780 Bochum
Tel.: 0234-32-22427
Fax: 0234-32-14554
[email protected]
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