Identifizierung, funktionelle Charakterisierung und Tumor
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Identifizierung, funktionelle Charakterisierung und Tumor-Relevanz häufiger Kopiezahl-Veränderungen beim humanen Prostatakarzinom Dissertation zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades an der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften Fachbereich Biologie der Universität Hamburg vorgelegt von Antje Krohn aus Hamburg Hamburg 2014 Meinen Eltern „Alles wird gut“ S. Soltau, beste Freundin Inhaltsverzeichnis 1. EINLEITUNG ................................................................................................................. 1 1.1. Krebs.......................................................................................................................................... 1 1.2. Die Prostata ............................................................................................................................... 1 1.2.1. Pathologische Veränderungen der Prostata .......................................................................... 2 1.2.2. Das Prostatakarzinom ............................................................................................................ 3 1.2.3. Chromosomale Veränderungen beim Prostatakarzinom ....................................................... 5 1.3. 2. 1.2.3.1. Die TMPRSS2:ERG Fusion beim Prostatakarzinom .................................................... 7 1.2.3.2. Die Rolle des Tumorsupressorgens PTEN ................................................................... 8 Zielsetzungen der Arbeit........................................................................................................ 10 MATERIAL & METHODEN ..........................................................................................12 2.1. Nukleinsäure-Isolationen ....................................................................................................... 12 2.1.1. 2.1.1.1. DNA-Isolation aus Geweben und Zellkulturen ............................................................ 15 2.1.1.2. RNA-Isolation aus Zellkulturen .................................................................................... 16 2.1.1.3. Isolation von BAC-Konstrukten aus Escherichia coli (E. coli) ..................................... 17 2.1.1.4. Isolation von shRNA-, Expressions- und Luziferase-Konstrukten aus E. coli ............. 17 2.1.2. Nukleinsäure-Isolationen aus Formalin-fixierten und Paraffin-eingebetteten Geweben...... 17 2.1.2.1. Entparaffinierung von Gewebe-Stanzen und -Schnitten ............................................. 17 2.1.2.2. DNA-Isolation aus FFPE-Geweben ............................................................................. 18 2.1.2.3. RNA-Isolation aus FFPE Geweben ............................................................................. 18 2.1.2.4. RNA-Isolation aus Laser-mikrodissektierten FFPE-Geweben .................................... 18 2.1.3. 2.2. Nukleinsäure-Isolationen aus Cryo-Geweben und Lebendkulturen .................................... 15 Quantifizierung und Qualitätskontrolle von Nukleinsäuren .................................................. 19 Analyse von Nukleinsäuren................................................................................................... 19 2.2.1. DNA-Sequenzierung nach Sanger ....................................................................................... 19 2.2.2. Promotor-Methylierungs-Analyse mittels MassARRAY® Technologie ................................ 24 2.2.3. mRNA Expressions-Analyse mittels Real Time quantitativer PCR ...................................... 26 2.3. 2.2.3.1. Reverse Transkription ................................................................................................. 27 2.2.3.2. Real Time quantitative PCR mit Taqman®-Sonden.................................................... 27 Identifizierung von Kopiezahl-Veränderungen mittels SNP-Array Technologie .............. 28 2.3.1. Verwendete Gewebe und Prostata-Zelllinien ....................................................................... 28 2.3.2. Detektion von CNV mittels SNP-Chip Technologie ............................................................. 29 2.3.2.1. Prozessierung der SNP-Arrays ................................................................................... 34 2.3.2.2. Erfassung der Hybridisierungs-Intensitäten von SNP-Arrays ..................................... 34 2.3.2.3. Rohdaten-Prozessierung und Berechnung der SNP-Arrays ....................................... 34 2.3.3. FISH Oracle 2 – Web-basierte Software zur Visualisierung von CNV................................. 35 2.3.4. GISTIC-Analyse ................................................................................................................... 36 2.4. Validierung von Krebs-relevanten Kopiezahl-Veränderungen an humanen Gewebeproben des Prostatakarzinoms ............................................................................................ 38 2.4.1. Tissue Microarrays (TMAs) .................................................................................................. 38 2.4.1.1. Sondentest-TMAs ........................................................................................................ 38 2.4.1.2. Prognose-TMA ............................................................................................................ 38 2.4.1.3. TMA mit Hormon-refraktären Prostatakarzinomen (HR-TMA) .................................... 40 2.4.1.4. Heterogenitäts-TMA .................................................................................................... 41 2.4.1.5. Großflächenschnitt-Validierung in der Heterogenitäts-Analyse .................................. 43 2.4.2. Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) ........................................................................... 43 2.4.2.1. Architektur von FISH DNA-Sonden ............................................................................. 44 2.4.2.2. Auswahl der BAC-Klone für die Herstellung von FISH DNA-Sonden ......................... 45 2.4.2.3. Herstellung von FISH DNA-Sonden ............................................................................ 46 2.4.2.3.1. Nicktranslation nach Abbott .................................................................................... 47 2.4.2.3.2. Aufreinigung und Konzentration der DNA-Sonden ................................................. 48 2.4.2.4. Verwendete FISH DNA-Sonden .................................................................................. 48 2.4.2.4.1. ERG FISH Sonde ................................................................................................... 48 2.4.2.4.2. PTEN FISH Sonden ................................................................................................ 49 2.4.2.4.3. FOXP1 FISH Sonden ............................................................................................. 50 2.4.2.4.4. TP53 FISH .............................................................................................................. 50 2.4.2.4.5. Test der DNA-Sonden ............................................................................................ 51 2.4.2.5. Durchführung der Fluoreszenz in situ Hybridisierung ................................................. 51 2.4.2.5.1. Vorbehandlung der TMAs und Großflächenschnitte .............................................. 53 2.4.2.5.2. Ansatz des Sonden-Hybridisierungsmix ................................................................. 53 2.4.2.5.3. In situ Hybridisierung der DNA FISH Sonden ......................................................... 53 2.4.2.5.4. Posthybridisierung .................................................................................................. 54 2.4.2.6. Fluoreszenz-Mikroskopie und Bilddokumentation ....................................................... 54 2.4.2.7. Technische Aspekte der FISH Auswertung................................................................. 54 2.4.2.7.1. Auswertung von FISH Deletions-Sonden ............................................................... 55 2.4.2.7.2. Auswertung von FISH Breakapart-Sonden ............................................................ 55 2.4.2.7.3. Ermittlung des Inaktivierungs-Status von PTEN..................................................... 56 2.4.3. Immunhistochemische Färbungen (IHC) ............................................................................. 56 2.4.3.1. 34βE12 und p504s IHC ............................................................................................... 56 2.4.3.2. ERG IHC ...................................................................................................................... 56 2.5. 2.4.3.3. FOXP1 IHC .................................................................................................................. 56 2.4.3.4. p53 IHC ....................................................................................................................... 57 Funktionelle Analysen an Prostata-Zelllinien ...................................................................... 57 2.5.1. Kultivierung von Konstrukt-haltigen E. coli Bakterien .......................................................... 57 2.5.1.1. Kultivierung von E. coli Bakterien mit BAC-Konstrukten ............................................. 59 2.5.1.2. Kultivierung von E. coli Bakterien mit shRNA-, Expressions- und Luziferase- Konstrukten ................................................................................................................................... 59 2.5.2. Anzucht, Pflege und Manipulation von Zellkulturen ............................................................. 59 2.5.2.1. Anzucht und Pflege ..................................................................................................... 61 2.5.2.2. Assay zur Koloniebildung ............................................................................................ 62 2.5.2.2.1. Transfektion mit Lipofectamine® 2000 ................................................................... 62 2.5.2.2.1.1. Überexpression ................................................................................................ 63 2.5.2.2.1.2. Depletion .......................................................................................................... 64 2.5.2.2.2. Detektion der Zellkolonien ...................................................................................... 64 2.5.2.3. Dualer Luziferase Reportergen-Assay ........................................................................ 65 2.5.2.3.1. Transfektion mit Polyethylenimin (PEI) ................................................................... 65 2.5.2.3.1.1. Dualer Luziferase Genreporter-Assay ............................................................. 66 2.6. 3. Statistik .................................................................................................................................... 66 ERGEBNISSE ..............................................................................................................67 3.1. Identifizierung der Kopiezahl-Veränderungen beim Prostatakarzinom ............................ 67 3.1.1. Kopiezahl-Verluste beim Prostatakarzinom ......................................................................... 67 3.1.1.1. 3.1.2. GISTIC Analyse – Kopiezahl-Verluste ........................................................................ 73 Kopiezahl-Zugewinne beim Prostatakarzinom ..................................................................... 75 3.1.2.1. GISTIC Analyse - Kopiezahl-Zugewinne ..................................................................... 78 3.1.3. Zytobanden mit variablen Kopiezahl-Veränderungen .......................................................... 80 3.1.4. Vergleich der Ergebnisse der aktuellen CNV-Analyse mit denen anderer Studien ............. 80 3.1.5. Detaillierte Analyse ausgewählter Zytobanden .................................................................... 82 3.1.5.1. Zytobande 3p13 ........................................................................................................... 82 3.1.5.1.1. GISTIC Analyse der 3p13 deletierten Tumoren ..................................................... 84 3.1.5.2. Zytobanden 21q22.2-q22.3 (ERG) .............................................................................. 85 3.1.5.3. Zytobande 10q23.31 (PTEN) ...................................................................................... 87 3.1.5.3.1. GISTIC Analyse der 10q23 deletierten Tumoren ................................................... 88 3.1.5.3.2. Intragenische Brüche von PTEN ............................................................................ 89 3.2. Validierung der genomischen Aberrationen an den Zytobanden 21q22.2-q22.3 (ERG) . 91 3.2.1. Technische Aspekte der ERG FISH Analyse und ERG IHC ............................................... 91 3.2.2. Assoziationen von ERG zu klinisch-pathologischen Parametern ........................................ 91 3.2.3. Klinische Bedeutung von ERG ............................................................................................. 93 3.2.4. Korrelation von ERG FISH und ERG IHC ............................................................................ 94 3.3. Validierung der genomischen Aberrationen an der Zytobande 10q23.31 (PTEN) ........... 94 3.3.1. Technische Aspekte der PTEN FISH-Auswertung am Prognose- und am Hormon- refraktären (HR) TMA ........................................................................................................................ 94 3.3.2. PTEN Deletionen und deren Assoziationen zu klinisch-pathologischen Parametern ......... 95 3.3.3. Art und Häufigkeit weiterer genomischer PTEN Aberrationen und deren Assoziationen zu klinisch-pathologischen Parametern ................................................................................................. 96 3.3.4. PTEN Inaktivierung .............................................................................................................. 98 3.3.4.1. Assoziationen von PTEN Inaktivierungen zu klinisch-pathologischen Parametern .. 101 3.3.4.2. Klinische Bedeutung der PTEN Inaktivierungen ....................................................... 102 3.3.5. PTEN Mutations-Analyse mittels Sanger Sequenzierung ................................................. 105 3.3.6. Epigenetische Veränderungen am PTEN Promotor .......................................................... 107 3.3.7. PTEN FISH-Analysen am Heterogenitäts-TMA ................................................................. 108 3.3.7.1. Technische Aspekte der PTEN FISH-Auswertung am Heterogenitäts-TMA ............ 108 3.3.7.2. PTEN Heterogenität .................................................................................................. 109 3.3.7.3. Abfolge und Zusammenhang von PTEN Deletionen und Translokationen............... 111 3.3.8. PTEN und andere genetische Veränderungen .................................................................. 113 3.3.8.1. PTEN Inaktivierungen und ERG Überexpression ..................................................... 113 3.3.8.1.1. Klinische Bedeutung der PTEN Inaktivierung nach ERG Status .......................... 114 3.3.8.1.2. Abschätzung des zeitlichen Auftretens von ERG Überexpression und PTEN Inaktivierung ........................................................................................................................... 115 3.3.8.2. 3.4. PTEN Inaktivierung und p53 ..................................................................................... 116 Validierung der genomischen Aberrationen an Zytobande 3p13 und funktionelle Charakterisierung betroffener Gene ................................................................................................ 118 3.4.1. Technische Aspekte der FOXP1 FISH Analysen............................................................... 118 3.4.2. FOXP1 FISH Analysen ...................................................................................................... 119 3.4.2.1. Assoziationen von FOXP1 Deletionen zu klinisch-pathologischen Parametern ....... 120 3.4.2.2. Klinische Bedeutung der FOXP1 Deletionen ............................................................ 121 3.4.3. 4. FOXP1 und andere genetische Veränderungen ................................................................ 121 3.4.3.1. FOXP1 Deletionen und ERG Überexpression .......................................................... 121 3.4.3.2. Assoziationen von FOPX1 Aberrationen und PTEN Inaktivierung ........................... 123 3.4.4. Assoziation zwischen den 3p13 deletierten Genen und ihrer Expression ......................... 125 3.4.5. Rolle von FOXP1, SHQ1 und RYBP als Tumorsuppressorgene ....................................... 128 3.4.6. Einfluss von AR und ERG auf die Expression von FOXP1, RYBP und SHQ1 .................. 130 DISKUSSION .............................................................................................................133 5. ZUSAMMENFASSUNG..............................................................................................154 6. ABSTRACT ................................................................................................................156 7. LITERATUR ...............................................................................................................158 8. ANHANG ........................................................................................................................ I Ergänzung zu den Zytobanden 21q22.2-q22.3 .................................................................................... I Ergänzung zur Zytobande 3p13 ........................................................................................................... II Abbildungsverzeichnis ........................................................................................................................ III Tabellenverzeichnis ............................................................................................................................. VI Herstellernachweise ........................................................................................................................... VIII Verbrauchsmaterialien, Kits und Reagenzien ................................................................................... IX Erstautorenschaften ............................................................................................................................ XII Danksagung ........................................................................................................................................ XIII Eidesstattliche Versicherung ............................................................................................................XIV Abkürzungen Abb. Abbildung aCGH arrayCGH AJCC American Joint Commitee on Cancer Amp Ampicillin ATCC American Type Culture Collection BAC Bacterial Artificial Chromosome BCR Biochemical recurrence (biochemisches Rezidiv) bp Basenpaar/e BPH Benigne Prostatahyperplasie BSA Bovine serum albumin (Rinderserumalbumin) C Zytosin cDNA Komplementäre DNA CEP Centromere enumeration probe (Referenz FISH DNA-Sonde am Zentromer) CGH Comparative Genomic Hybridisation Cm Chloramphenicol CNV Copy number variation (Kopiezahl-Veränderung) COPA Cancer Outlier Profile Analysis Ct-Wert Cycle threshold-Wert DAPI 4′,6-Diamidin-2-phenylindol dATP Desoxyadenosintriphosphat dCTP Desoxycytidintriphosphat ddNTP Di-Desoxy-Ribonukleosidtriphosphat dGTP Desoxyguanosintriphosphat dH2O destilliertes Wasser DHT Dihydrotestosteron DKFZ Deutsches Krebsforschungs-Zentrum Heidelberg DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) dNTP Desoxy-Ribonukleosidtriphosphat DRU Digito-rektale Untersuchung dTTP Desoxythymidintriphosphat dUTP Desoxyuridintriphosphat E. coli Escherichia coli EBI European Bioinformatics Institute EDTA Ethylen-Diamintetraessigsäure ERG „v-ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog“ EtBr Ethidiumbromid EtOH Ethanol ETS „E twenty-six“ Genfamilie FCS Fetales Kälberserum FFPE Formalin-fixiert, Paraffin-eingebettet FISH Fluoreszenz in situ Hybridisierung FOXP1 „forkhead box P1“ FRET fluorescence resonance energy transfer G Guanin GF Großflächen-Schnitt GISTIC Genomic Identification of Significant Targets in Cancer H&E Hämatoxylin-Eosin Färbung HCl Chlorwasserstoff HR-TMA Hormon-refraktärer Gewebe-Mirkoarray HUGO Humanes Genom-Projekt IHC Immunhistochemie kb Kilobase/n KLLN „killin“ LB Lysogeny broth LRR log R ratio MALDI-TOF Matrix-assisted laser desorption-time of flight mass spectrometry (Matrix-unterstützte LasersdesorptionMassenspektrometrie mit Flugzeitanalysator) max. maximal MB Megabase/n MEM Minimum Essential Medium MES 2-Morpholinoethansulfonsäure mRNA Messenger RNA NaAc Natriumacetat NAHR Nicht-allelische homologe Rekombination NaOH Natriumhydroxid NEAA Nicht-essentielle Aminosäuren NHEJ Nicht-homologes End-Joining NP-40 Octylphenoxypolyethoxyethanol Nsp I Nostoc species OCR Oligo Control Reagenz OT Objektträger P/S Penicillin/ Streptomycin PCR Polymerase-Kettenreaktion pH Negativ dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionen-Konzentration (potentia Hydrogenii) PIN Prostatisch intraepitheliale Neoplasie PIP2 Phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate PIP3 Phosphatidylinositol-(3,4,5)-trisphosphate pN Lymphknoten-Status nach Tumour-Node-Metastasis (TNM)-Klassifikation PSA Prostata spezifisches Antigen pT Größe des Primärtumors nach Tumour-Node-Metastasis (TNM)-Klassifikation PTEN „phosphatase and tensin homolog“ RB1 „retinoblastoma 1“ RNA Ribonucleic acid (Ribonukleinsäure) rpm Rounds per minute (Umdrehungen pro Minute) RPMI Roswell Park Memorial Institute RT Raumtemperatur RYBP „RING1 and YY1 binding protein“ SHQ1 „SHQ1 homolog“ shRNA short hairpin RNA SNP Single nucleotide polymorphism (Einzelnukleotid-Polymorphismus) SSC Salines Natrium-Citrat (saline sodium citrate) SSPE Salines Natrium Phosphat EDTA (saline sodium phosphate EDTA) Sty I Salmonella typhi Tab. Tabelle TAE Tris-Acetat-EDTA TMA Tissue-Microarray (Gewebe-Mirkoarray) TMACL Tetramethyl Ammonium Chlorid TMPRSS2 „transmembrane protease, serine 2“ TP53 „tumorprotein 53“ TSG Tumorsuppressorgen U Units (Einheit von Enzymen) ü.N. über Nacht UKE Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf UV Ultraviolett WHO World Health Organisation (Weltgesundheitsorganisation) WTSI Wellcome Trust Sanger Institute Maßeinheiten werden nach dem Internationalen Einheitensystem (SI = Système Internationale d’Unité) verwendet. Einleitung 1. Einleitung 1.1. Krebs Die Weltgesundheitsorganisation WHO erklärt in ihrem aktuellen „World Cancer Report 2014“, dass 2012 weltweit 14 Mio. Menschen neu an Krebs erkrankt sind und 8 Mio. an einer krebsbedingten Todesursache starben. Es wird erwartet, dass die Inzidenz zukünftig weiter ansteigt und in zehn Jahren bei ca. 20 Mio. liegt1. In Deutschland wurden 2010 mehr als 475.000 Neuerkrankungen und über 218.000 krebsbedingte Todesfälle gemeldet2. Somit stellt Krebs in der Bundesrepublik, nach kardiovaskulären Erkrankungen (wie z. B. Herzinfarkt oder Herzinsuffizienz), die häufigste Todesursache dar3. Grundlage der Krebsentstehung sind initiale Beeinflussungen des Genoms durch Noxen, wie Tabakrauch, Alkohol, Chemikalien und UV-Strahlung oder seltener durch genetische Prädisposition. Kommt es durch diese zu Veränderungen an Genen, die maßgeblich am Zellwachstum oder dessen Kontrolle beteiligt sind, kann es zu permanentem Wachstum und schließlich zur Entstehung von Tumoren kommen. Diese dringen in das normale Gewebe eines Organs ein und be- bzw. verhindern dadurch seine eigentliche Integrität. Zusätzlich dazu haben Krebszellen die Fähigkeit in angrenzende Gewebe zu infiltrieren und im fortgeschrittenen Stadium auch in entfernten Teilen eines Organismus Tochtergeschwülste (Metastasen) zu bilden. 1.2. Die Prostata Die Prostata ist die größte akzessorische Drüse der inneren Geschlechtsorgane des Mannes. Sie liegt unterhalb der Harnblase und umschließt den Anfang der Urethra ringförmig (Abb. 1). Eine Bindegewebskapsel umgibt das prostatische Drüsengewebe und separiert es, durch Einwachsungen, in Läppchen. Histologisch und funktionell betrachtet, lässt sich die Prostata jedoch in eine zentrale, eine periphere und eine periurethrale Zone aufteilen4. Die Drüsen werden umgeben von glatter Muskulatur und elastischen Bindegewebsfasern, dem Stroma5. Die Prostata ist an der Regulierung des Harnabsatzes beteiligt und ermöglicht die Ejakulation durch den Auslass des Spermasekrets. 1 Einleitung Als exokrine Drüse produziert sie Moleküle und Enzyme, die das Ejakulat verdünnen, die Lebensfähigkeit und Beweglichkeit der Spermien erhöhen und sie nähren. In ihrer endokrinen Funktion hilft die Prostata außerdem beim Metabolismus vom Androgen Testosteron in dessen aktive Form, das Dihydrotestosteron (DHT). Sie beeinflusst durch eine negative Rückkopplung indirekt auch die Funktionen von Hypothalamus und der Hypophyse, indem sie deren Hormonausschüttung bremst, die eigentlich für die Androgenproduktion in den Hoden sorgt4. Abbildung 1. Unterer Urogenitaltrakt des Mannes Quelle: Jörg Neisel, © Wort & Bild Verlag Konradshöhe GmbH & Co. KG, modifiziert Antje Krohn 2013. 1.2.1. Pathologische Veränderungen der Prostata Im Gegensatz zu anderen Organen, die mit zunehmendem Alter beginnen zu atrophieren, nimmt das Volumen der Prostata zu6. Ursächlich ist in den meisten Fällen die Proliferation von Drüsengewebe und Stroma, die zu einer benignen Prostatahyperplasie (BPH) führt. Folgen dieser Gewebsvermehrung sind Einengung der Urethra, die zu Problemen beim Wasserlassen und nicht selten zu einer Entzündung der Prostata (Prostatitis) führt5. Entzündungen sind nicht selten initial an tumorösen Entartungen beteiligt7, dennoch konnte beim Prostatakarzinom noch nicht geklärt werden, ob Prostatitis oder BPH eine Tumorentstehung begünstigen können8. Als eine echte Präkanzerose wird jedoch die prostatisch intraepitheliale Neoplasie (PIN) angesehen. Sie zeigt histologische und 2 Einleitung genotypische Charakteristika, die zwischen denen von normalem Epithel und invasiven Prostatakarzinomen liegen9, 10 . Patienten bei denen erstmals eine PIN diagnostiziert wird, müssen in kürzeren Zeitabständen überwacht werden, da in diesem Fall das Risiko an einem invasiven Karzinom zu erkranken um ca. 30% ansteigt11. 1.2.2. Das Prostatakarzinom Mit jährlich mehr als 65.000 Neuerkrankungen (2010) ist das Prostatakarzinom in Deutschland die häufigste Krebserkrankung des Mannes. Für das Jahr 2014 prognostiziert das Robert Koch Institut eine steigende Inzidenz und erwartet ca. 70.000 Patienten mit der Erstdiagnose „Prostatakrebs“2. Das Prostatakarzinom steht mit ca. 12.000 Todesfällen und einer Mortalitätsrate von 10% an dritter Stelle der krebsbedingten Todesarten, auch wenn die Sterberate aktuell rückläufig ist2, 12. Bis heute sind regelmäßige urologische Untersuchungen (DRU: Digito-rektale Untersuchung), histologische Befundung an Stanzbiopsien (Tumorstadium pT, Gleason Grad) und das PSA-Screening (Serum-Konzentration des Prostata-spezifischen Antigens) die einzigen Methoden zur frühzeitigen Erkennung von Prostatakarzinomen. Besonders die Entdeckung des Prostata-spezifischen Antigens als Serum-Marker13 hat in den letzten 25 Jahren dazu beigetragen, Prostatakarzinome frühzeitiger diagnostizieren zu können14. Beim PSA handelt sich um ein Protein, welches vom Epithelgewebe der Prostata gebildet und in das Lumen sezerniert wird. Im Blut lässt es sich als freies oder in Komplexen gebundenes Molekül nachweisen und kann ab einem bestimmten Schwellenwert den Hinweis auf eine tumoröse Veränderung der Prostata geben. Die durchschnittliche PSA-Konzentration unterliegt jedoch natürlichen Schwankungen und steigt mit zunehmendem Alter grundsätzlich von sich aus an. Außerdem hat sich gezeigt, dass ein erhöhter PSA-Wert nicht immer mit dem Vorhandensein eines Karzinoms einhergeht und dass ein niedriger Wert einen Tumor nicht zwangsläufig ausschließt15. Auf Grund dieser Tatsache wird heute die Zuverlässigkeit des PSA-Screenings angezweifelt16. Es wird zudem geschätzt, dass die Prostatakarzinome bei mehr als einem Drittel der Patienten im Verlaufe ihres Lebens nicht klinisch relevant geworden wären und man von einer Behandlung hätte absehen können17-19. Laut der Studie einer Krankenkasse unterzogen sich in Deutschland 2011 ca. 31.000 Männer einer radikalen Prostatektomie (Entfernung der gesamten Prostata), bei rund 10.000 wurden minimal-invasive Teilresektionen durchgeführt und weitere 6.600 sind auf Grund eines Prostatakarzinoms anderweitig therapiert worden (Brachy- und Chemotherapie, perkutane Bestrahlung). Die 3 Einleitung Kosten für die stationären Behandlungen lagen bei ungefähr 340 Millionen Euro. Ein aktives Überwachen (active surveillance) sei jedoch für einen Großteil dieser Patienten die bessere Alternative gewesen, da viele von ihnen, trotz verbesserter, nervenschonender Operationsmethoden20 über postoperative Harninkontinenz und erektile Dysfunktionen klagten21. Häufig weisen Prostatakarzinome eine langsame und insignifikante (nicht zu Symptomen führende) Entwicklung auf, können aber auch invasiv-metastatisch wachsen5. Bei Patienten mit metastasierten Karzinomen und bei solchen, die nach eingangs erfolgreicher Behandlung (z. B. Prostatektomie, Radiotherapie) ein Rezidiv erleiden, ist die Prognose außerordentlich schlecht. Als letzte Maßnahme bleibt diesen Patienten häufig nur noch die Hormontherapie in Form einer Androgenablation. Androgene stellen sowohl für normale Prostatazellen, als auch Prostatakarzinomzellen einen wichtigen Faktor für Wachstum und Funktion dar22, 23. Die Absenkung des Androgen-Spiegels (durch agonistische und antagonistische Medikamente, Antiandrogene, Östrogene oder seltener auch durch chirurgische Kastration) lindert die Beschwerden, verzögert ein Fortschreiten des Tumors und kann sogar dessen Rückbildung begünstigen24. Obwohl das Gros dieser Patienten anfangs gut auf die Hormontherapie anspricht, kommt es bei vielen nach wenigen Jahren zu einem biochemischen Rezidiv (wiederkehrende Erhöhung des PSA-Wertes nach bzw. unter einer Therapie) und einem erneuten, nun auch Hormon-unabhängigen Tumorwachstum25, 26 . Hormon-refraktäre Karzinome der Prostata sind kurativ nicht mehr behandelbar. Genspezifische Therapien, die zielgerichtet ein Gen oder Genprodukt mit zentraler Bedeutung für den Tumor inhibieren oder beeinflussen, (wie z. B. Trastuzumab/Herceptin® zur Behandlung von Mammakarzinomen27) HER2-positiven existieren beim Prostatakarzinom nicht. Ursächlich hierfür ist die Tatsache, dass bis vor wenigen Jahren noch vergleichsweise wenig über die molekularen Veränderungen, die an der Entstehung von Prostatakarzinomen beteiligt sind, bekannt war28. Doch genau dieses Wissen ist essentiell für die Identifizierung verlässlicher Prognosemarker und das Auffinden von geeigneten Therapiezielen. Erschwerend bei der Suche nach universellen Markern ist die Tatsache, dass Prostatakarzinome eine hohe zytologische und genomische Heterogenität aufweisen. Bei Diagnose eines Prostatakarzinoms werden in 60 bis 90% der Fälle multiple Tumorherde (Tumorfoci) identifiziert, welche nicht selten unabhängige 29-31 unterschiedliche genetische Charakteristika ausweisen 4 . Entwicklungen und Einleitung 1.2.3. Chromosomale Veränderungen beim Prostatakarzinom Chromosomale Veränderungen werden durch Replikationsfehler der DNA-Polymerase (replication slippage), fehlerhafte homologe Rekombination, nicht-allelische homologe Rekombination (non-allelic homologous recombination, NAHR), nicht-homologes EndJoining (non-homologous end-joining, NHEJ) und Retrotransposons verursacht32-34. Nicht selten wirken sich die verschiedenen Rekombinations-Mechanismen auf die Summe bzw. die Menge von chromosomalen Abschnitten aus. Auffällig bzw. pathologisch werden solche Kopiezahl-Veränderungen (CNV, copy number variations) erst dann, wenn sie die Anzahl von Genkopien (folglich die Menge des kodierten Genproduktes) ändern, Gene ruptieren oder Fusionen zwischen zwei Genen (mit funktionell aktivem Genprodukt) verursachen. Molekularpathologisch besonders interessant sind solche Kopiezahl-Veränderungen, die Einfluss auf die Expression von Onkogenen und Tumorsupressorgenen (TSG) nehmen, da diese die Tumorentwicklung und/oder dessen Fortschreiten begünstigen können. Derartige chromosomale Aberrationen lassen sich durch die komparative genomische Hybridisierung (CGH)35, 36 bzw. Array-CGH (aCGH)37, aber auch durch DNA-Chips, wie z. B. SNP-Arrays38 nachweisen. In den letzten zwei Dekaden konnten vor allem durch die aCGH wiederholt auftretende Kopiezahl-Veränderungen in diversen Tumorentitäten39 und auch beim Prostatakarzinom identifiziert werden40. Die aCGH ist eine Weiterentwicklung der CGH und verwendet im Gegensatz zu ihrer konventionellen Schwester (bei der ein MetaphaseChromosom das Hybridisierungsobjekt darstellt) eine Matrix genau definierter, genomisch kartierter DNA-Fragmente (cDNA (complementary DNA), BAC-Klone (Bacterial Artificial Chromosome) oder Oligonukleotide), die auf einem Objekträger immobilisiert sind. Beiden Methoden ist die konkurrierende Hybridisierung von farblich unterschiedlich markierter Tumor- und Referenz-DNA gemein. Die aus beiden Färbeintensitäten bioinformatisch ermittelte Ratio zeigt an, wo die Tumor-DNA im Vergleich zur Referenz (DNA eines gesunden Patienten) vermehrt (Zugewinne) bzw. vermindert (Verluste) vorliegt. In ihrer Zusammenfassung von mehr als 40 aCGH-Studien, zeigten Sun et al.40, dass bei Prostatakarzinomen häufig Zugewinne an den Zytobanden 8q22-q24 (bis zu 25%), 7q11-q33 (13%), 17q24-q25 (12%), Xq11-q23 (11%) und 3q23-q26 (10%) beschrieben wurden und dass genomische Verluste vor allem die Zytobanden 8p23-p21 (34%), 13q14-q22 (28%), 6q14-q21 (22%), 16q13-q24 (18%), 5q13-q21 (13%), 2q21-q22 (12%), 18q12-q23 (13%) und 10q23-q25 (12%) betrafen. Nachfolgende aCGH Studien detektierten (vor allem durch das höhere Auflösungsvermögen verbesserter aCGH-Plattformen) zusätzlich vermehrt chromosomale Verluste an den Zytobanden 1q24, 17p13, 17q21, 18q22-q23, 20q13, 21q22 5 Einleitung und 22q11-q1341, 42 . Kürzlich wurde außerdem erstmals von rekurrenten Verlusten an der Zytobande 3p14 berichtet43. Viele dieser genomischen Verluste und Zugewinne betreffen große Bereiche der Chromosomen und sind nicht selten mehrere Megabasen lang. Sie können sich daher auf eine ganze Reihe von Genen auswirken, was die Suche nach einem potentiell Tumorrelevanten Gen erschweren kann. Dennoch konnten für einige dieser betroffenen Bereiche bereits Tumor-relevante Zielgene identifiziert oder zumindest krebsfördernde Gene verdächtigt werden. Ermöglicht werden solche hochspezifischen und gengenauen Validierungen vor allem durch die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)44. Bei dieser Methode werden numerische und strukturelle Veränderungen an Genen oder chromosomalen Abschnitten mit DNA-Sonden nachgewiesen. Insbesondere in Verbindung mit Gewebe-Mikroarrays (tissue microarrays, TMA), die es ermöglichen mehrere 100 Gewebeproben innerhalb eines Experiments zu bearbeiten und auszuwerten, ist die FISH ein leistungsstarkes molekulares Werkzeug, um Aussagen über die Häufigkeit und klinische Relevanz einer genetischen Veränderung treffen zu können. Beim Prostatakarzinom sind z. B. Kopiezahl-Zugewinne für die Onkogene cMYC („v-myc myelozytomatosis viral oncogene homolog“)45 an Zytobande 8q2446-48 und die Kinase PIK3CA49 („phosphoinositide-3-kinase“ 3q26.3)50 an bekannt. Zugewinne des Androgenrezeptors AR (Xq12) sind in primären Tumoren zwar äußerst selten zu finden (<2%)51, treten aber unter der Hormontherapie sehr häufig auf (20-30%). Die Androgenrezeptor-Amplifikation ist einer der Ursachen für die Antiandrogenresistenz und ermöglicht es Tumoren erneut zu Proliferieren oder zu Metastasieren47, 51. Als Tumorsuppressorgene gelten z. B. NKX3.152, 53 („NK3 homeobox 1“) an Zytobande 8p12, TP53 54, 55 („tumorprotein 53“) an 17p13, RB156, 57 („retinoblastoma 1“) an 13q14, PTEN 58-63 , CHD164, 65 („chromodomain helicase DNA („phosphatase and tensin homolog“) an 10q23 binding protein 1“) an 5q21 und MAP3K766, 67 („mitogen-activated protein kinase kinase kinase 7“) an 6q15. Die integrative Analyse der 3p14 Deletionen von Taylor et al.43 ergab, dass dort mehrere Gene, namentlich FOXP1 („forkhead box P1“), RYBP („RING1 and YY1 binding protein“) und SHQ1 („SHQ1 homolog“), eine potentielle Tumorsuppressor-Funktion innehaben könnten. Trotzdem diese und weitere Gene beim Prostatakarzinom vermehrt von KopiezahlVeränderungen betroffen sind und dies auch nicht selten eine progressive Tumorentwicklung begünstigt, hat sich bisher keines von ihnen als zuverlässiger Prognosemarker für das Prostatakarzinom erwiesen. 6 Einleitung 1.2.3.1. Die TMPRSS2:ERG Fusion beim Prostatakarzinom In ihrer Metaanalyse von mehr als 10.000 Genexpressions-Datensätzen haben Tomlins et al.68 gezeigt, dass mehr als die Hälfte der untersuchten Prostatakarzinome eine Überexpression des Genes ERG („v-ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog“)69, ein Mitglied der ETS („E twenty-six“) Familie70, aufweisen. Zu dieser Familie gehören derzeit 27 Gene71, welche DNA-bindende Transkriptionsfaktoren kodieren72. Diese regulieren aktivierend oder inhibierend die Expression von Genen und nehmen so Einfluss auf biologische Prozesse, wie Zellproliferation, Angiogenese, Differenzierung, Apoptose oder auch Transformation73. Nachfolgende Untersuchungen von Tomlins´ s. g. Cancer Outlier Profile Analysis (COPA) zeigten, dass eine Genfusion zwischen der Androgen-regulierten Serinprotease TMPRSS2 („transmembrane protease, serine 2“)74 und ERG ursächlich für dessen Überexpression ist. FISH-Analysen zur Validierung der Fusion zwischen diesen beiden Genen ergaben, dass sie entweder durch eine interstitielle Deletion oder eine Translokation an den Zytobanden 21q22.2-q22.3 entstehen können75-77. Translokationen sind vor allem bei hämatologischen Tumorerkrankungen bekannt78, 79 und spielten bis vor kurzem bei soliden Tumoren eine eher untergeordnete Rolle. Neben TMPRSS2:ERG sind bis heute weitere Genfusionen mit mehrheitlicher Beteiligung von ETS Genen (wie z. B. ETV1, ETV4, ETV5, ELK4) identifiziert worden80, die allerdings vergleichsweise selten auftreten (ETV1 unter 10%, andere unter 1%)68, 81-83 . Bei fast allen diesen Genfusionen liegt die Gemeinsamkeit in einer Fusion mit einem Androgen-regulierten Partnergen, die zu einer Überexpression des Transkriptionsfaktors führt. In vitro Studien haben gezeigt, dass die Überexpression dieser ETS Gene, ähnlich wie bei der ERG Translokation, für die Aktivierung von Zielgenen sorgt, die an Migration und Invasion beteiligt sind84, 85. Mit der Translokation zwischen FOXP1 und ETV1 („ets variant 1“) haben Hermans et al.86 eine weitere ETS-Genfusion im Prostatakarzinom nachgewiesen. Bislang ist jedoch unsicher, ob diese ebenfalls androgen-reguliert ist87 oder nicht88. Obwohl nahezu die Hälfte der Prostatakarzinome eine TMPRSS2:ERG Fusion aufweisen, konnte ihre klinische Bedeutung noch nicht eindeutig geklärt werden. Es wird jedoch beschrieben, dass die ERG-Überexpression die Differenzierung von Prostataepithelzellen verhindert89, 90 und sowohl die Zellinvasion-, -migration, als auch die Metastasierung begünstigt90-92. Tiermodelle und funktionelle Studien deuten allerdings darauf hin, dass die Überexpression allein nicht ausreichend ist, um eine maligne Veränderung von Prostataepithelzellen auszulösen. Vielmehr sollen weitere genetische Aberrationen mit der ERG Überexpression kooperieren93-95. 7 Einleitung Als eine kooperative Veränderung wird die Deletion von PTEN („phosphatase and tensin homolog“) angesehen58, 96-100 . Aktuell ist über die Mechanismen, die für eine Co-Existenz beider Veränderungen verantwortlich sind, wenig bekannt. Denkbar wäre, dass die Entstehung von PTEN Aberrationen durch die ERG Überexpression begünstigt wird oder umgekehrt, dass PTEN Aberrationen die Fusion zwischen ERG und TMPRSS2 fördern. Des Weiteren besteht die Möglichkeit, dass ein weiteres genetisches Ereignis die Entstehung beider Veränderungen initiiert. 1.2.3.2. Die Rolle des Tumorsupressorgens PTEN Die biologischen Auswirkungen von Verlusten des Tumorsuppressorgens PTEN sind beim Prostatakarzinom auf funktioneller Ebene bereits gut beschrieben worden. Im Maus-Modell ist schon die Inaktivierung eines PTEN-Allels (heterozygote Deletion) ausreichend, um PIN zu verursachen101. Die Komplett-Inaktivierung aller PTEN-Allele (homozygote Deletion) hingegen führt zu invasiv wachsenden und metastasierenden Tumoren102-104. Auch Studien an Zelllinien von Prostatakarzinomen bestätigen die wichtige Rolle des PTEN-Verlustes, insbesondere für die Zellproliferation102, 105, 106. PTEN steht mit zentraler Funktion an initialer Stelle im AKT-(„v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1“)-Signalweg und hilft bei der Übertragung von Wachstumsreizen membranständiger Rezeptoren an den Zellkern107. In gesunden Zellen phosphoryliert die PI3 Kinase den sekundären Botenstoff PIP2 („Phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate“) („Phosphatidylinositol-(3,4,5)-trisphosphate“) in 108 seine aktive , und ermöglicht Form, das PIP3 auf diese Weise die Weiterleitung der Wachstumsreize (Abb. 2 A). Auf Grund seiner Phosphatase-Aktivität sorgt PTEN als Antagonist der PI3 Kinase für eine De-Phosphorylierung von PIP3 zu PIP2109 und kontrolliert somit die nachfolgenden AKT-abhängigen Signalkaskaden, die an Apoptose, Überleben, Proliferation, Differenzierung und Migration beteiligt sind110. In Tumoren kommt es häufig zu einer Störung dieses Regelkreises. Dies kann zum einen durch Amplifikation oder gain-of-function Mutationen (führt zur dauerhaften Aktivierung) der PI3 Kinase111 geschehen (Abb. 2 B (2)) und zum anderen durch inaktivierende Mutationen oder Verluste von PTEN 107, 112, 113 (Abb. 2 B (1)). Zu den am häufigsten beschriebenen Aberrationen von PTEN gehören Deletionen an der Zytobande 10q23.31. Allerdings weisen die vergangenen Studien zur Prävalenz und klinischen Bedeutung von PTEN Deletionen abweichende Ergebnisse auf. Mittels FISH, die als Gold-Standard Methode für die Analyse von Genkopiezahl-Veränderungen gilt, sind in 8 Einleitung lokalisierten Prostatakarzinomen stark variierende Deletionsraten von 17 bis 68% ermittelt worden58, 60-63. Abbildung 2. AKT-Signalweg (reduziert) A) Intakter Regelkreis im AKT-Signalweg, B) Defekter Regelkreis, entweder durch inaktiviertes PTEN (1) oder eine dauerhaft aktive PI3Kinase (2). Neben PTEN Deletionen haben Berger et al.114 in ihrer Whole-Genome Sequencing-Studie an sieben Prostatakarzinomen auch intragenische Deletionen (Bruchpunkt der Deletion innerhalb von PTEN) und erstmals inaktivierende Inversionen am PTEN-Lokus beschrieben. Überdies haben Weischenfeldt et al.115 gezeigt, dass es dort außerdem zu Translokationen kommen kann. Die Häufigkeit, mit der PTEN von diesen zusätzlichen chromosomalen Aberrationen betroffen ist und mögliche Fusionspartner, sind nicht bekannt. 9 Einleitung Fraglich blieb bis heute auch, an welchem Zeitpunkt PTEN Aberrationen in der Tumorentwicklung auftreten, was sie verursacht und welche Inaktivierungsmechanismen für dieses Gen vorherrschend sind. 1.3. Zielsetzungen der Arbeit Die Zytogenetik des Prostatakarzinoms ist im Vergleich zu anderen soliden Tumorarten bislang unzureichend erforscht. Die Erfolge von genspezifischen Medikamenten, wie sie bereits für Brust- und Lungenkrebs bestehen, haben eindrücklich gezeigt, wie das theoretische Wissen um genetische Veränderungen in eine praktische Verbesserung der klinischen Krankenversorgung umgesetzt werden kann. Ausgerechnet beim Prostatakarzinom, der häufigsten Tumorerkrankung des Mannes, ist es bislang noch nicht gelungen, ein solches molekulares Therapieziel zu finden. Durch zytogenetische Studien konnten in den vergangenen 15 Jahren zwar eine Vielzahl von genetischen Veränderungen beschrieben und (zumindest für einige davon) auch Vermutungen über deren klinische Bedeutung angestellt werden. Ein echter „Durchbruch“ im Sinne der Identifizierung eines klinisch verwendbaren Prognosemarkers oder sogar einer Therapie-Strategie ist bislang ausgeblieben. Dies liegt zum einen daran, dass beim Prostatakarzinom bis zum Beginn der vorliegenden Arbeit keine detaillierte Profilierung der zytogenetischen und molekulargenetischen Veränderungen mit modernen hochauflösenden Methoden durchgeführt worden ist und zum anderen wurden selbst vielversprechende GenVeränderungen nur ungenügend validiert, da ausreichend große und klinisch gut charakterisierte Gewebekollektive mit langfristiger Verlaufskontrolle dafür schlichtweg fehlen. Die vorliegende Arbeit hat daher zwei primäre Ziele. Zunächst soll ein eingehendes Profil der zytogenetischen Veränderungen des Prostatakarzinoms erstellt werden, indem die aktuell beste verfügbare DNA-Chip Technologie (Affymetrix‘ Genome-Wide Human SNP Array 6.0) zur Detektion von DNA-Kopiezahl-Veränderungen an einem Kollektiv von 77 Prostatakarzinomen eingesetzt wird. Anschließend sollen besonders auffällige Befunde an einem sehr großen und klinisch umfassend charakterisierten Gewebekollektiv (>3.000 Gewebeproben von ebenso vielen Tumoren) im TMA-Format validiert werden. Hierbei werden auch zwei bekannte Veränderungen eingeschlossen werden, nämlich PTEN und ERG Aberrationen. Die klinische Relevanz dieser beiden Veränderungen ist bis heute nicht umfassend geklärt. So wurden für PTEN zwar Inaktivierungen durch Deletionen, Mutationen und Translokationen beschrieben, die Aussagen zur Häufigkeit und zur klinischen Relevanz im humanen Prostatakarzinom sind jedoch äußerst diskrepant. 10 Einleitung PTEN Inaktivierungen stehen außerdem im Verdacht zusammen mit der ERG Überexpression kooperativ an der Tumorentstehung und -weiterentwicklung beteiligt zu sein. Bislang ist jedoch völlig ungeklärt, ob diese Veränderungen in einer bestimmten Reihenfolge auftreten oder ob eine dieser Veränderungen die andere bedingt. Zur Klärung dieser Frage soll eine neuartige Gewebearray-Plattform, ein Heterogenitäts-TMA, hinsichtlich der ERG Überexpression und der PTEN Aberrationen validiert werden. 11 Material & Methoden 2. Material & Methoden Alle Herstellernachweise und die Bestellnummern der, in dieser Arbeit verwendeten Verbrauchsmaterialien, Kits und Reagenzien befinden sich im Anhang auf den Seiten IX bis XII. 2.1. Nukleinsäure-Isolationen Die Nukleinsäure-Isolationen dienen der Gewinnung von DNA (desoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure) oder RNA (ribonucleic acid, Ribonukleinsäure) aus Geweben, Zellkulturen und anderen zellkernhaltigen Sekreten. Zellen und Gewebe lysieren in Puffern mit chaotropen Salzen (z. B. Guanidin-Hydrochlorid oder Guanidinium-Thiocyanat) und Protease bzw. Proteinase K. Das Lysat wird auf Filtersäulen überbracht und zentrifugiert, im Vakuum durchgezogen oder per Schwerkraft durchlaufen gelassen. Auf Grund der Salz- und pH-Bedingungen binden die Nukleinsäuren an die Silikat-Fasern (bei Silikat-Gel Membranen) bzw. an die Anionenaustauscher-Matrix (bei Anionenaustauscher-Säulen). Nach einigen Waschschritten mit Ethanol-basierten Puffern, deren chaotropische Salzkonzentration stetig abnimmt, können die Nukleinsäuren mittels eines basischen Hochsalz-Puffers (meist 10 mM Tris) oder Wasser rehydriert und von den Fasern bzw. der Matrix gelöst werden. Eine Besonderheit der Nukleinsäure-Isolation stellt die alkalische Lyse bei der PlasmidPräparation aus Bakterien dar116. Nach der Zell-Lysis wird dem Lysat hoch-alkalisches Natriumhydroxid (NaOH) beigemischt, was zur Denaturierung von bakterieller und PlasmidDNA führt. Auf Grund ihrer Konformation ist die Plasmid-DNA nach einer Neutralisierung des NaOH mit Kaliumacetat in der Lage zu renaturieren. Die bakterielle DNA zeigt jedoch nur vereinzelt Anlagerung homologer Bereiche und bleibt größtenteils als Gewirr mit Zelltrümmern und Proteinen verklumpt. Nach einer Zentrifugation verbleibt die Plasmid-DNA im Überstand und muss in nachfolgenden Schritten nur noch gewaschen, entsalzt und konzentriert werden. Verbrauchsmaterial: Pipettenspitzen (Sarstedt) 1,5 ml Reaktions-Gefäße (Eppendorf) 2 ml Sammel-Gefäße (Eppendorf) 50 ml Reaktion-Gefäße (Greiner) 12 Material & Methoden Rotor-Adaptoren für QIAcube (Qiagen) Labormaterial: 250 ml Zentrifugen-Becher (Beckman-Coulter) 50 ml Zentrifugen-Röhrchen (VWR) Pipetten (Eppendorf) Mikropistell (Schult Biotec) QIArack (Qiagen) Trichter (VWR) QIAvac 24 Plus Absaugvorrichtung für Filtersäulen (Qiagen) Verwendete Geräte: Thermomixer comfort (Eppendorf) Zentrifuge Biofuge Fresco (Heraeus) Zentrifuge 2k15 (Sigma-Aldrich) Ultrazentrifuge J2-21M/E (Beckmann-Coulter) Vakuum Pumpe AC500 (HLC) Vortex MS1 Minishaker (IKA) Spektralphotometer NanoDrop ND-1000 (Peqlab) QIAcube (Qiagen) Verwendete Kits: Alle konzentrierten Puffer wurden vor Gebrauch mit dem, auf dem Puffergefäß deklarierten Volumen an Ethanol (absolut) verdünnt. QIAamp® DNA Mini Kit (Qiagen) o o o o o o o Proteinase K (600 mAU/ml) QIAamp Filtersäulen AL Puffer ATL Puffer AW1 Puffer (konzentriert) AW2 Puffer (konzentriert) AE Puffer QIAamp® DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen) o QIAamp MinElute® Filtersäulen o 2 ml Sammel-Gefäße o ATL Puffer o AL Puffer o AW1 Puffer (konzentriert) o AW2 Puffer (konzentriert) o ATE Puffer o Proteinase K NucleoSpin® RNA II (Macherey & Nagel) o o o o Lysis-Puffer RA1 Waschpuffer RAW2 Waschpuffer RA3 (konzentriert) Membran Entsalzungs-Puffer (MDB) 13 Material & Methoden o o o o o o o RNeasy® FFPE Kit (Qiagen) o RNeasy MinElute® Spin Columns o 2 ml Sammel-Gefäße (RNase-frei) o 1,5 ml Reaktions-Gefäße (RNase-frei) o RBC Puffer o PKD Puffer o Proteinase K o RNase-freie DNase I (lyophilisiert) o RNase-freies Wasser o DNase Booster Puffer o RPE Puffer (konzentriert) Qiagen Plasmid Plus Maxi Kit (Qiagen) o o o o o o o o o o o o o rDNase Puffer rDNase, RNase-frei (lyophilisiert) RNase-freies dH2O NucleoSpin®Filter NucleoSpin®RNA Filtersäulen 2 ml Sammel-Gefäße (RNase-frei) 1,5 ml Reaktions-Gefäße (RNase-frei) RNase A 25 mg QIAGEN Plasmid Plus Spin Säulen QIAfilter Maxi Kartuschen Deckel für QIAfilter Tube Erweiterungen (20 ml) 2 ml Sammel-Gefäße P1 Puffer P2 Puffer S3 Puffer ETR Puffer BB Puffer PE Puffer (konzentriert) EB Puffer NucleoBond® BAC 100 (Macherey & Nagel) o o o o o o o o Resuspensions-Puffer S1 RNase A (lyophilisiert) Lysis-Puffer S2 Neutralisations-Puffer S3 NucleoBond®AX 100 Säulen Equilibrierungs-Puffer N2 Wasch-Puffer N3 Elutions-Puffer N5 Benötigte Reagenzien: Gewebe und Lebendkulturen (Cryo-Gewebe, Formalin-fixiertes, Paraffin-eingebettete (FFPE) Gewebestanzen, Gewebe-Schnitte auf PALM-Objektträgern, Bakteriensuspensionen, Zellkulturen) Xylol (J.T. Baker) Ethanol (EtOH), 75%, 80%, 96%, absolut (Th. Geyer, Merck (absolut)) 14 Material & Methoden TRIzol® Reagenz (Invitrogen) Chloroform (Merck) Flüssig-Stickstoff (TMG) RNase ZAP (Sigma-Aldrich) Isopropanol (Merck) Nuklease-freies dH2O (Sigma-Aldrich) Anzusetzende Lösungen: •rDNase-Lösung (RNase-frei) 1 Tube lyophilisierte rDNase 550 µl RNase-freies dH2O (Macherey & Nagel) (Macherey & Nagel) die rDNase in 550 µl RNase-freiem H2O lösen gelöste rDNase aliquotieren (stabil für 6 Monate) bei -20°C lagern •DNase I-Lösung (RNase-frei) 1 Tube lyophilisierte DNase 550 µl RNase-freies H2O (Qiagen) (Qiagen) die DNase I in 550 µl RNase-freiem H2O lösen gelöste DNase I aliquotieren bei -20°C lagern (stabil für 9 Monate) aufgetaute DNase I Aliquots bei -4-8°C lagern (stabil für 6 Wochen) Verwendete Software: ND-1000 V3.7.1 (Thermo Fisher Scientific) 2.1.1. 2.1.1.1. Nukleinsäure-Isolationen aus Cryo-Geweben und Lebendkulturen DNA-Isolation aus Geweben und Zellkulturen Vorarbeiten: Der Tumorbereich der gefrorenen Gewebeblöcke wurde von einem Pathologen auf einem H&E-gefärbten Schnitt markiert (Hämatoxylin-Eosin Färbung: Histologische Färbung zur Darstellung von Gewebestrukturen). Der Tumoranteil lag in allen Fällen bei mindestens 60%. Umliegende, nicht tumoröse Bereiche, sind aus den Gewebeblöcken entfernt worden. Vom Tumor wurden durchschnittlich fünf 16 µm dicke Schnitte abgenommen und für die DNAIsolation verwendet. Bei besonders kleinen Tumoren ist die Schnittanzahl entsprechend erhöht worden. Zur Kontrolle der tieferliegenden Tumorareale wurde nach zehn Schnitten 15 Material & Methoden erneut ein H&E angefertigt und kontrolliert. Der Gewebeblock ist gegebenenfalls angepasst worden, um den Gehalt an nicht-tumorösem Gewebe möglichst gering zu halten. Durchführung: Die DNA-Isolation aus Gewebeschnitten ist mit dem „QIAamp® DNA Mini Kit“ nach den Angaben des Herstellers (Qiagen) im Handbuch „QIAamp® DNA Mini and Blood Mini Handbook“ (Stand: Juni 2006) erfolgt. Die DNA-Isolation aus Zellkulturen wurde ebenfalls nach den Herstellerangaben des „QIAamp® DNA Mini and Blood Mini Handbook“ unter Verwendung der Modifikation „Appendix B: Protocol for cultured cells“ durchgeführt. Die Zellkonzentration betrug in allen Fällen 5x106 Zellen. Die Kulturbedingungen der Zelllinien sind in Abschnitt 2.5.2.1. beschrieben. Bei beiden Isolations-Methoden ist ein optionaler Schritt zur zusätzlichen Trocknung der Filtermembran vor der Elution eingefügt worden (Schritt 10 im „QIAamp® DNA Mini and Blood Mini Handbook“). Die Quantifizierung der DNA erfolgte nach den Angaben in Abschnitt 2.1.3. Die DNA konnte anschließend direkt verwendet oder bei -20°C gelagert werden. 2.1.1.2. RNA-Isolation aus Zellkulturen Durchführung: Zur RNA-Isolation aus Zellkulturen wurde zunächst eine TRIzol-Lysis durchgeführt. Für den DNase-Verdau und die Aufreinigung der RNA ist das „NucleoSpin®RNA II Kit“ von Macherey & Nagel nach Modifikationen des Herstellerhandbuchs verwendet worden. Für die RNA-Isolation aus Zellkulturen (max. 4x 107 Zellen) wurden 800µl TRIzol® Reagenz je Well einer 6-Well-Platte benötigt (400µl TRIzol/Well in 12-Well-Platten). Die Zellen wurden kräftig mit einer Pipette vom Boden des Wells abgespült und suspendiert. Das Zell-Lysat ist mit Chloroform in einem Verhältnis von 4:1 (Lysat:Chloroform) versetzt und auf dem Vortex durchmischt worden. Das Gemisch wurde 15 Min. bei 15.300 rpm zentrifugiert, damit anschließend die obere der drei Phasen abgenommen und in ein neues Sammel-Gefäß überführt werden konnte. Nach der Fällung der RNA mit 80%igem EtOH (Verhältnis 1:1) ist der Ansatz auf eine NucleoSpin®RNA Filtersäule pipettiert und mittels der QIAvac 24 Plus Absaugvorrichtung im Vakuum durch die RNA-Säule gezogen worden. Die Filtermembran, mit der gebundenen RNA ist mit 400µl MDB-Puffer überschichtet und dieser im Vakuum abgezogen worden. Zum DNase-Verdau wurde die RNA-Säule zunächst in ein neues Sammel-Gefäß überführt, 1 Min. bei 15.300 rpm in der Zentrifuge getrocknet und mit 95 µl DNA-Lösung überschichtet. Die Säule musste 15 Min. bei RT (Raumtemperatur) inkubiert werden und ist nachfolgend wieder mit der Absaugvorrichtung verbunden worden. Es folgten drei Waschschritte mit je 300µl RA2 Puffer, 600µl RA3 Puffer 16 Material & Methoden und 300µl RA3 Puffer. Zur Elution der RNA wurde die Säule zunächst 1 Min. trockenzentrifugiert, in ein neues Reaktions-Gefäß überbracht und die Filtermembran mit 40 µl RNase-freiem dH2O überschichtet. Nach einer 5-minütigen Inkubationszeit bei RT wurde die RNA-Säule zentrifugiert und die gelöste RNA im Reaktions-Gefäß aufgefangen. Die Quantifizierung der RNA erfolgte nach den Angaben in Abschnitt 2.1.3. Die RNA konnte anschließend direkt verwendet oder bei -80°C gelagert werden. 2.1.1.3. Isolation von BAC-Konstrukten aus Escherichia coli (E. coli) Für die Isolation von BAC-Plasmid-DNA ist das „NucleoBond® BAC 100 Kit“ von Macherey & Nagel verwendet worden. Die Isolation folgte den Herstellerangaben im Handbuch „Plasmid DNA purification – AX 500/BAC 100“ für low copy Plasmide (Stand: November 2011). Das Kulturvolumen lag bei 250 ml. Die Kulturbedingungen sind in Abschnitt 2.5.1.1. beschrieben. Die Quantifizierung der Plasmid-DNA erfolgte nach den Angaben in Abschnitt 2.1.3. Die Plasmid-DNA konnte anschließend direkt verwendet oder bei 4-8°C gelagert werden. 2.1.1.4. Isolation von shRNA-, Expressions- und Luziferase-Konstrukten aus E. coli Zur Plasmid-DNA-Isolation von shRNA-, Expressions- und Luziferase- Konstrukten ist das „Plasmid Plus Maxi Kit“ von Qiagen verwendet worden. Die Isolation erfolgte nach den Herstellerangaben des Standard Protokolls „Plasmid DNA Purification using QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kits“ (Stand: April 2012) aus Kulturvolumina bis zu 200 ml. Das Kulturvolumen lag in allen Fällen bei 200 ml. Die Kulturbedingungen sind in Abschnitt 2.5.1.2. erläutert. Die Quantifizierung der Plasmid-DNA erfolgte nach den Angaben in Abschnitt 2.1.3. Die Plasmid-DNA konnte anschließend direkt verwendet oder bei 4-8°C gelagert werden. 2.1.2. Nukleinsäure-Isolationen aus Formalin-fixierten und Paraffin-eingebetteten Geweben 2.1.2.1. Entparaffinierung von Gewebe-Stanzen und -Schnitten Für die Nukleinsäure-Isolationen aus Gewebe-Stanzen und -Schnitten ist pro Gewebe-Block entweder ein 0,6 mm großer Stanzzylinder entnommen oder mehrere 16µm dünne Schnitte (je nach Größe des Tumorareals) abgenommen und in Xylol entparaffiniert worden. Die Gewebe wurden zweimal für 10 Min. in Xylol inkubiert und der Überstand verworfen. Anschließend sind diese zweimal für 10 Min. in 96%igem Ethanol inkubiert worden, um das 17 Material & Methoden Xylol zu verdrängen. Auch hier wurde der Überstand verworfen. Anhaftendes Ethanol wurde für 60 Min. bei 60°C verdampft. Nach Trocknung der Gewebe wurde sofort die NukleinsäureIsolation durchgeführt. 2.1.2.2. DNA-Isolation aus FFPE-Geweben Zur Isolation von DNA aus FFPE-Geweben ist das „QIAamp® DNA FFPE Tissue Kit“ von Qiagen nach Modifikation des Herstellerhandbuchs, unter Anwendung des Isolationsroboters „QIAcube“ (Qiagen) verwendet worden. Die entparaffinierte Gewebe-Stanze ist in 180µl ATL Puffer und 20 µl Proteinase K aufgenommen und bei 56°C über Nacht (ü. N.) inkubiert worden. Danach wurde der Ansatz erneut mit 5 µl Proteinase K versetzt und eine weitere Stunde inkubiert. Undverdautes Gewebe ist in der Zentrifuge pelletiert und der Überstand in ein neues 1,5 ml ReaktionsGefäß überführt worden. Die Aufreinigung und Elution der DNA wurden vollautomatisch im QIAcube (Qiagen) dem Programm „QIAamp DNA FFPE tissue“ folgend durchgeführt. Die Quantifizierung der DNA erfolgte am NanoDrop nach den Angaben in Abschnitt 2.1.3. Die DNA konnte anschließend direkt verwendet oder bei 4-8°C gelagert werden. 2.1.2.3. RNA-Isolation aus FFPE Geweben Durchführung: Zur Isolation von RNA aus FFPE-Geweben ist das „RNeasy FFPE Kit“ von Qiagen nach Modifikation des Herstellerhandbuchs, unter Verwendung des Isolationsroboters „QIAcube“ angewendet worden. Die entparaffinierten Gewebe-Stanzen sind in ein frisches 1,5 ml Reaktions-Gefäß überführt und in flüssigem Stickstoff eingefroren worden. Das gefrorene Gewebe wurde mit einem sterilen Mikropistell pulverisiert und in 180 µl PKD Puffer resuspendiert. Nach zweimaliger Zugabe von 20 µl Proteinase K im Abstand von ca. 4 Stunden ist das Gewebe über Nacht verdaut worden. Nichtverdautes Gewebe ist in der Zentrifuge pelletiert und der Überstand in ein frisches 2 ml Reaktions-Gefäß überführt worden. Alle nachfolgenden Schritte wurden vollautomatisch im QIAcube (Qiagen) nach dem Programm „RNeasy FFPE: 3-8 FFPE tissue sections“ durchgeführt. Die Quantifizierung der RNA erfolgte nach den Angaben in Abschnitt 2.1.3. Die RNA konnte anschließend direkt verwendet oder bei -80°C gelagert werden. 2.1.2.4. RNA-Isolation aus Laser-mikrodissektierten FFPE-Geweben Vorarbeiten: Zur Isolation von RNA aus Laser-mikrodissektiertem FFPE Gewebe wurden 16 µm dünne Gewebe-Schnitte auf Poly-L-Lysin beschichtete PALM-Objektträger aufgezogen, entparaffiniert und H&E gefärbt. Ein Pathologe hat die tumorösen Anteile an einem Laser- 18 Material & Methoden Mikroskop mikrodissektiert und die Gewebepartikel in einem 0,5 ml Reaktions-Gefäß mit adhäsivem Deckel gesammelt. Alle genannten Vorarbeiten sind im TMA-Labor des Instituts für Pathologie durchgeführt worden. Durchführung: Für die Isolation von RNA aus Laser-mikrodissektiertem FFPE-Gewebe ist das „RNeasy FFPE Kit“ von Qiagen verwendet worden. Die Isolation ist nach den Angaben im Herstellerhandbuch „RNeasy® FFPE Handbook“ (Stand: Januar 2006) bzw. dem Abschnitt „Protocol: Purification of Total RNA from Microdissected FFPE Tissue Sections“ folgend (mit Modifikation des Proteinase K Verdaus) unter Verwendung des Isolationsroboters „QIAcube“ (Qiagen) durchgeführt worden. Die Inkubation des Gewebes erfolgte bei 56°C ü. N. und nicht, wie im Protokoll vorgesehen, für 15 Min. Alle nachfolgenden Schritte wurden vollautomatisch im QIAcube (Qiagen) nach dem Programm „RNeasy FFPE: 3-8 FFPE tissue sections“ prozessiert. Die Quantifizierung der RNA erfolgte nach den Angaben in Abschnitt 2.1.3. Die RNA konnte anschließend direkt benutzt oder bei -80°C gelagert werden. 2.1.3. Quantifizierung und Qualitätskontrolle von Nukleinsäuren Die Konzentration und Qualität (260/280 bzw. 260/230 Ratio) der Nukleinsäuren (DNA, RNA, Plasmid-DNA) wurde am Spektralphotometer NanoDrop ND-1000 ermittelt bzw. überprüft. Die Messungen sind ohne Änderungen, gemäß den Herstellerangaben im Handbuch „ND1000 Spectrophotometer V3.3 User’s Manual“ (Stand: September 2008) durchgeführt worden. 2.2. Analyse von Nukleinsäuren 2.2.1. DNA-Sequenzierung nach Sanger Grundlage der Sequenzierung nach Sanger ist eine PCR-basierte (Polymerase- Kettenreaktion) DNA-Synthese, bei den neben den üblichen Bausteinen der DNA (Desoxyribonukleosid-Triphosphate, dNTPs: dATP, dCTP, dGTP und dTTP) auch Nukleotide (Di-desoxyribonukleosid-Triphosphate, Reaktionsabbruch führen 117 ddNTPs) eingebaut werden, die zu einem . Anders als bei der klassischen PCR wird bei der Sequenzierung jedoch nur ein Primer (forward oder reverse) verwendet. 19 Material & Methoden Den speziellen Nukleotiden der Sequenzier-Reaktion fehlt ein Sauerstoff-Rest, der eigentlich für die Verknüpfung mit dem nächsten Baustein nötig wäre. Außerdem ist jedes der vier ddNTPs mit unterschiedlichen Fluoreszenz-Farbstoffen (oder seltener radioaktiv) markiert. Das Ergebnis der Kettenabbruch-PCR sind viele Fragmente unterschiedlicher Länge, die je nach dem terminalen ddNTP unterschiedlich markiert sind. In einer Kapillar-Elektrophorese lassen sich diese Fragmente nach Größe auftrennen. Die endständigen ddNTPs werden mittels eines Lasers angeregt und über einen Detektor ausgelesen. Die Reihenfolge der unterschiedlichen Fluoreszenzen entspricht dabei der Abfolge der Nukleotide in der sequenzierten DNA und wird als Elektropherogramm graphisch festgehalten. Verbrauchsmaterial: Pipettenspitzen (Sarstedt) 0,2 ml 8er PCR Reaktions-Gefäße (Brand) Deckel-Streifen für 8er PCR Reaktions-Gefäße (Brand) 1,5 ml Reaktions-Gefäße (Eppendorf) Labormaterial: Pipetten (Eppendorf) Verwendete Geräte: Thermocycler C1000 (Biorad) Thermomixer comfort (Eppendorf) QIAxcel Kapillar-Elektrophorese System (Qiagen) PCR-Streifen Zentrifuge MC 6 (Sarstedt) Kühl-Zentrifuge 5804 R (Eppendorf) Vortex MS1 Minishaker (IKA) ABI PRISM® 3130 xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems) Verwendete Kits: QIAxcel DNA Screening-Kit (Qiagen) o QIAxcel DNA Screening-Kartusche o QX Separations-Puffer o QX Wasch-Puffer o QX Mineralöl o QX DNA Verdünnungs-Puffer o QX Intensitäts-Kalibrierungsmarker o QX 0,2 ml 12er PCR-Streifen o QX farbige 0,2 ml 12er PCR-Streifen BigDye® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems): o BigDye Terminator v1.1 o 5X 3.1 Sequencing Puffer o –21 M13 Kontroll-Primer (forward) o pGEM®-3Zf(+) Doppel-Strang DNA Kontroll-Template Benötigte Reagenzien: Isolierte DNA nach Abschnitt 2.1.2.2. 20 Material & Methoden Primer (Eurofins MWG, siehe Tab. 1) Ampli Taq Gold PCR Master Mix (Puffer, Polymerase) (Applied Biosystems) dNTP Set (100mM) (Promega) Nuklease-freies dH2O (Sigma-Aldrich) QX Alignment Marker 15bp/1kb (Qiagen) QX DNA Größen-Marker 50-800bp (Qiagen) ExoSAP-IT® (Affymetrix USB) 3 M Natriumacetat (NaAc), (AppliChem) Ethanol (EtOH), absolut (Merck) Verwendete Software Primer 3118, 119 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/, Abfragedatum: 14.08.2013) BioCalculator™ 3.0.05 (Qiagen) Sequencing Analysis Software Seg A6 6.0 (Applied Biosystems) In die Mutationsanalyse sind insgesamt 69 Hormon-naïve und 39 Hormon-refraktäre Prostatakarzinome eingegangen. Der PTEN Inaktivierungsstatus lag vor Auswahl der Tumoren nicht vor und wurde erst während der Sequenzierung ermittelt. Durchführung: Zunächst wurde für jedes PTEN Exon (Ausnahme Exon acht: Exon in zwei Fragmente geteilt) eine klassische PCR durchgeführt. Die passenden Primer-Paare wurden über Primer 3 ermittelt und bei Eurofins MWG bestellt. Alle Primer-Paare sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Der PCR-Mastermix wurde nach folgenden Angaben zusammengestellt: • PCR Mastermix (1-facher Ansatz) 17,2 2,5 2 1 0,3 23 µl µl µl µl µl µl Nuklease-freies dH2O AmpliTaq Gold PCR Puffer (10x) dNTPs (25μmol ) PCR Primer (10 pM) Tab. 1 AmpliTaq Gold® DNA Polymerase Für einen PCR-Ansatz wurden 2 µl DNA mit 23 µl PCR- Mastermix versetzt und nach folgendem Programm im Thermocycler inkubiert: 21 Material & Methoden • Cyclerprogramm PTEN PCR 95 °C 95 °C 53,51) / 552) 72 72 8 1) °C °C °C °C 10 min 20 sec 20 sec 40 sec 7 min ∞ 35 Zyklen 1x Exon: 2,5,7,8,9; 2) Exon: 1,3,4,6 Tabelle 1. PTEN PCR Primer-Paare Exon Forward primer Reverse Primer 1 5’-TTTCCATCCTGCAGAAGAAGC-3’ 5’-CCCACGTTCTAAGAGAGTGACA-3’ 2 5’-CTCCAGCTATAGTGGGGAAAA-3’ 5’-CTTTTTCTGTGGCTTAGAAATC-3’ 3 5’-CCCATAGAAGGGGTATTTGTTG-3’ 5’-CTCTACCTCACTCTAACAAGCAGA-3’ 4 5’-CACATTATAAAGATTCAGGCAATGTT-3’ 5’-AAGATACAGTCTATCGGGTTTAAGTT-3’ 5 5’-CTTATTCTGAGGTTATCTTTTTACCAC-3’ 5’-TCCAGGAAGAGGAAAGGAAAA-3’ 6 5’-GGCTACGACCCAGTTACCAT-3’ 5’-GGAAGGATGAGAATTTCAAGCA-3’ 7 5’-CAGTTAAAGGCATTTCCTGTG-3’ 5’-TGGATATTTCTCCCAATGAAAG-3’ 8 Frag. 1 5’-TGTTTAACATAGGTGACAGATTTTC-3’ 5’-TTGCAGTATAGAGCGTGCAGA-3’ 8 Frag. 2 5’-ACCAGGACCAGAGGAAACCT-3’ 5’-AAGTCAACAACCCCCACAAA-3’ 5’-GATGAGTCATATTTGTGGGTTTTC-3’ 5’-GGTCCATTTTCAGTTTATTCAAGT-3’ 9 Nach der PCR ist die Qualität der amplifizierten DNA-Fragmente am QIAxcel KapillarElektrophorese System nach den Angaben des Herstellerhandbuchs „QIAxcel® DNA Handbook“ (Stand: Januar 2011) unter Verwendung des QIAxcel DNA Screening-Kits überprüft worden. Nach erfolgreicher Überprüfung und geeigneter Qualität wurden 5µl der PCR-Produkte mit 2 µl ExoSAP versetzt und nach folgendem Programm im Thermocycler inkubiert, um nichtinkorporierte Nukleotide und überschüssige Primer zu entfernen: • Cyclerprogramm ExoSAP 37 °C 80 °C 8 °C 15 min 15 min ∞ 22 Material & Methoden Für die Sequenzier-Reaktion ist ein Mastermix nach folgenden Angaben hergestellt worden: • Sequenzier-Reaktion Mastermix (1-facher Ansatz) 4 µl 6 2 1 13 µl µl µl µl dH2O 3.1 Sequencing Puffer (5X) BigDye Terminator v1.1 Sequenzier-Primer (10 pM) Tab. 2 Die Zusammenfassung der verwendeten Sequenzier-Primer ist in Tabelle 2 einzusehen. 7 µl der gereinigten PCR-Produkte wurden mit 13 µl Sequenzier-Mastermix versetzt und nach folgendem Programm im Thermocycler inkubiert: • Cyclerprogramm Sequenzier-Reaktion 95 °C 10 min 95 °C 10 sec 55 °C 10 sec 60 °C 2 min 8 °C ∞ 35 Zyklen Tabelle 2. PTEN Sequenzier-Primer Exon Primer 1 (forward) 5’-TTCCATCCTGCAGAAGAAGC-3’ 2 (forward) 5’-CTCCAGCTATAGTGGGGAAAA-3’ 3 (forward) 5’-CCCATAGAAGGGGTATTTGTTG-3’ 4 (forward) 5’-CACATTATAAAGATTCAGGCAATGTT-3’ 5 (reverse) 5’-TCCAGGAAGAGGAAAGGAAAA-3’ 6 (forward) 5’-GGCTACGACCCAGTTACCAT-3’ 7 (forward) 5’-CAGTTAAAGGCATTTCCTGTG-3’ 8 (1) (reverse) 5’-TTGCAGTATAGAGCGTGCAGA-3’ 8 (2) (reverse) 5’-AAGTCAACAACCCCCACAAA-3’ 9 (reverse) 5’-GGTCCATTTTCAGTTTATTCAAGT-3’ Nach erfolgter Sequenzier-Reaktion wurde jeder Ansatz in einer NaAc-Fällung gereinigt und konzentriert. Dazu ist jede Sequenzier-Reaktion (20µl) mit 170 µl dH2O, 17 µl 3M NaAcLösung und 500 µl EtOH absolut versetzt worden. Das Gemisch wurde anschließend für 20 Min. bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand ist verworfen und das DNA-Pellet bei 60°C im Thermomixer getrocknet worden. 23 Material & Methoden Die Sequenzierung erfolgte am ABI Prism 3100 Genetic Analyser. Die Arbeitsschritte am Sequinator wurden von den technischen Angestellten des PCR-Diagnostik Labors am Institut für Pathologie durchgeführt. Jede identifizierte Mutation ist in einer zweiten, unabhängigen Sequenzierung validiert und bestätigt worden. 2.2.2. Promotor-Methylierungs-Analyse mittels MassARRAY® Technologie Genetische Vorgänge, wie die genomische Prägung (Imprinting) oder auch die Xchromosomale Inaktivierung, werden durch einen epigenetischen Mechanismus, die Methylierung bedingt. Dabei kommt es zur Bindung einer Methylgruppe (katalysiert durch die DNA-Methyltransferase) an Zytosin-Basen, bevorzugt an CpG-Inseln. Dies sind Bereiche im Genom an denen wiederholt CG-Dinukleotide (Zytosin und Guanin liegen benachbart auf dem gleichen DNA-Strang) auftreten. Zu finden sind diese CpG-Inseln besonders häufig in Promotorbereichen von Genen. Kommt es zu einer Methylierung dieser CpG-Inseln, ändert sich die die Struktur des Chromatins und die Transkription des Genes wird inhibiert120. Die Methylierung spielt nicht nur in den normalen genetischen Vorgängen eine Rolle, sondern auch in der Krebsentstehung121, denn ähnlich wie Kopiezahl-Veränderungen, können sich Hyper- oder Hypomethylierungen im Promotorenbereich von Onkogenen und Tumorsupressorgenen auf deren Expression auswirken. Methylierungs-Analysen basieren auf einer Behandlung von genomischer DNA mit Natriumhydrogen (veraltet: Bisulfit). Bei der es durch Deaminierungen zur Umwandlung von Zytosin in Thymin kommt, wenn das Zytosin nicht methyliert vorlag. Methyliertes Zytosin bleibt hingegen unverändert. In einer anschließenden PCR-Amplifikation werden die Produkte mit einer, an den PCR-Primern gebundenen, T7 Promotor-Sequenz versehen und von der T7 Reversen Transkriptase in einen Einzelstrang transkribiert. Die Transkripte werden nachfolgend mit einer Basen-spezifischen Endonuklease geschnitten und bilden in Abhängigkeit der methylierten CpG-Inseln Fragmente unterschiedlicher Größe bzw. Masse. Diese Massen werden anschließend in einer Massenspektrometrie (MALDI-TOF) detektiert und analysiert120. Die Vorarbeiten für die quantitative DNA-Methylierungs-Analyse fanden am Institut für Pathologie statt. Die quantitative DNA-Methylierungs-Analyse der PTEN CpG-Inseln wurde am Deutschen Krebsforschungszentrum (DFKZ Heidelberg) in der Abteilung für Epigenetik und Krebsfaktorforschung (Direktor: Prof. Dr. C. Plass) durchgeführt. Die Ergebnisse dieser 24 Material & Methoden Analyse wurden mit freundlicher Genehmigung für die vorliegende Arbeit zur Verfügung gestellt. Insgesamt sind 34 Prostatakarzinome und fünf prostatische Normalgewebe in die PTEN Methylierungs-Analyse eingegangen. Die Lage der MassARRAY PCR-Primer ist in Abb. 3 dargestellt und die Sequenzen in Tabelle 3 zusammengefasst. Die regulativen Sequenzen von GSTP1 („glutathione S-transferase pi 1”) sind bei Prostatakarzinomen sehr häufig methyliert122, 123 , in normalen Prostataepithel-Gewebe hingegen sehr selten124. Die GSTP1 Methylierung wurde als Positiv-Kontrolle und eine methylierte genomische DNA (zu 0%, 20%, 40%, 60%, 80% und 100% methyliert) als Standard verwendet. Abbildung 3. Lage der verwendeten Primer zu Methylierungs-Analyse mittels MassARRAY Technologie Die Primer der detaillierten Methylierungs-Analyse sind mit roten Rahmen markiert. Tabelle 3. MassARRAY Primer Sequenzen für die PTEN Methylierungs-Analyse Alle angegebenen Primerpaare sind für eine Voranalyse verwendet worden. Die grau hinterlegten Primerpaare wurden für die Methylierungs-Analyse der 34 Prostatakarzinome benutzt. Y und R stehen für variable Nukleotide (wobble sites): Y = variables Nukleotid: Pyrimidin (C oder T), R = variables Nukleotid: Purin (A oder G). PTEN 1 2 3 4 4,5 5 6 7 8 9p 10p 11p 12p 13p 14p GSTP1 GSTP1_6ss Forward Primer Reverse Primer 5'-TGGTATTAGTTTGGGGATTTTTT-3' 5'-TGGGTGTTTGTGTAATTAGTTTTTTA-3' 5'-GGAAAGTAGTTTYGATTGTGGTT-3' 5'-GGGGTTAGGTGGTTTTTGAGAAT-3' 5'-GATTTTTTTGGGGGTATYGGAG-3' 5'-TAGATAGGTGTTTTTTGGGTTTTTG-3' 5'-ATTATGAGGATATAGATTTGGGGGAA-3' 5'-GGAGGGTATTTTTTTTGTAGGG-3' 5'-TTGGGTTTTTGGGTAGAGGT-3' 5'-GGAAGATYGAGGGGAGG-3' 5'-GTTGTTTATAGGYGTTGAGAGG-3' 5'-GAGAAGTYGAGGAAGAGGT-3' 5'-TTTTTTGAAAGGGAAGGTGGAA-3' 5'-TTTGTTATTATTTTTAGGGTTGGGA-3' 5'-GGAGGATTATTYGTTTTTTTTTTATTT-3' 5'-AAACTAATTACACAAACACCCA-3' 5'-AAACTACTTTCCAAAAAAAATCAC-3' 5'-ATTCTCAAAAACCACCTAACCCC-3' 5'-CAAAAACCCAAAAAACACCTATCTA-3'' 5'-CTCATCCRACTCCCTTACAAC-3' 5'-TTCCCCCAAATCTATATCCTCATAAT-3' 5'-CCCTACAAAAAAAATACCCTCC-3' 5'-ACCTCTACCCAAAAACCCAA-3' 5'-CATACCCAATATAACTACCTAAAACTTACT-3' 5'-CAAACCCCAAACAACTACAC-3' 5'-CCTCCCCTCRATCTTCC-3' 5'-CCTCTCAACRCCTATAAACAAC-3' 5'-TCCCAACCCTAAAAATAATAACAAA-3' 5'-AAATAAAAAAAAAACRAATAATCCTCC-3' 5'-CTACTAATAACRAAACTTCTTCTAC-3' 5'-GTGTGGTTTTTATTTYGGGTTTTTTTTT-3' TAACCCTAATCTACCAACAACATAC-3' 25 Material & Methoden 2.2.3. mRNA Expressions-Analyse mittels Real Time quantitativer PCR Die Real Time quantitative PCR ermöglicht die Quantifizierung von mRNA über den s. g. „fluorescence resonance energy transfer“ (FRET)125. Es handelt sich dabei um eine PCR, die neben den üblichen Primerpaaren zur Amplifikation auch eine Sonde mit zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen (Fluorochrome) enthält. Das Fluorochrom 1 wird energetisch (Licht) angeregt und strahlt diese Energie (in einer anderen Wellenlänge) im Normalfall wieder ab. Auf Grund der physischen Nähe zum Fluorochrom 2 wird die Energie jedoch nicht abgestrahlt, sondern von ihm aufgenommen und in einer Fluorochrom 2spezifischen Wellenlänge abgegeben. Die Lichtenergie kann gemessen werden, um so Rückschlüssen auf die Produktmenge in der PCR zu ziehen. Im Falle der Taqman®-Sonden sind die Fluorochrome an den entgegengesetzten Enden eines Oligonukleotids lokalisiert, wobei Fluorochrom 2 (Quencher) die Lichtemission von Fluorochrom 1 (Reporter) unterdrückt. Man nennt diese Sonden auch Hydrolyse-Proben, da sie sich in der AnnealingPhase der PCR an den Template-Strang setzen und in der Elongations-Phase von der Polymerase hydrolisiert werden126. Sobald die beiden Fluorochrome separiert sind gibt Fluorochrom 1 die Energie ab, die zur Quantifizierung benötigt wird. Je mehr PCR-Produkt entsteht, desto mehr Reporter-Lichtemission wird freigesetzt und umso höher ist die gemessene Signalstärke im Reaktions-Gefäß. Anhand der Emissionen lässt sich ein Wert bestimmen, der cT-Wert, an dem die Real Time PCR exponentiell abläuft, bevor sie durch das zur Neige gehen von Primern und dNTPs oder durch Nebenprodukte der PCR gestört wird. Zur Quantifizierung wird dieser Wert gegen den eines zweiten Gens, eines Housekeepers, dessen Expression in allen Zellen des Körpers annähernd gleich und gegenüber äußerer Einflüsse stabil ist, berechnet. Das Housekeeper-Gen GAPDH127 diente als interne Referenz. Die mRNA Expression wurde nach der relativen Standard-Kurvenmethode berechnet128. Verbrauchsmaterial: Pipettenspitzen (Sarstedt) 1,5 ml Reaktions-Gefäße (Eppendorf) 0,2 ml 8er PCR Reaktions-Gefäße (Brand) Deckel-Streifen für 8er PCR Reaktions-Gefäße (Brand) MicroAmp® Fast Optical 96-Well Platte (Applied Biosystems) MicroAmp® Optical Abdeckfolie (Applied Biosystems) Labormaterial: Pipetten (Eppendorf) UV-Bank UVT-S-AR (Grant Instruments) 26 Material & Methoden Verwendete Geräte: PCR-Streifen Zentrifuge MC 6 (Sarstedt) Thermocycler PTC-100 (MJ Research) 7900 HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) Verwendete Kits: High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems): o RT Puffer o dNTP Mix (100 mM) o RT Random Primer o MultiScribe™Reverse Transkriptase (50 U/μL) o RNase Inhibitor o Nuklease-freies H2O Benötigte Reagenzien: Isolierte Total RNA nach Abschnitt 2.1.1.2. (frisch) bzw. 2.1.2.3. (FFPE) Nuklease-freies dH2O (Sigma-Aldrich) TaqMan® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) Taqman Primer- und Sonden-Set (Assay-on-Demand), siehe Tab. 4 Verwendete Software: SD8 2.3 (Applied Biosystems) 2.2.3.1. Reverse Transkription Durchführung: Für die reverse Transkription der Total-RNA in cDNA ist das „High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit“ von Applied Biosystems verwendet worden. Die Umschreibung und die Inkubation der enzymatischen Reaktion erfolgte nach Herstellerangaben des Handbuchs „High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Protocol“ (Stand: 2010). 2.2.3.2. Real Time quantitative PCR mit Taqman®-Sonden Durchführung: Der Mastermix für die quantitative PCR mit Taqman®-Sonden ist nach folgenden, Angaben hergestellt worden. • Quantitative PCR Mastermix (einfacher Ansatz) TaqMan® Universal PCR Master Mix 15 µl 1,5 µl Assay-on-Demand Primer/Sonde (Tab. 4) Nuklease-freies dH2O 8,5 µl 25 µl 27 Material & Methoden Tabelle 4. Quantitative Real Time PCR Assays (Assay-on-demand von Applied Biosystems) Gen GAPDH PTEN AR FOXP1 TMPRSS2 ERG RB1 RYBP SHQ1 FKBP5 Assay ID Hs99999905_m1 Hs02621230_s1 Hs00907244_m1 Hs00908902_m1 Hs01122331_m1 Hs01554630_m1 Hs01078066_m1 Hs00393028_m1 Hs00250772_m1 Hs01561001_m1 Es wurde 1 µg cDNA (in einem Volumen von 25 µl Nuklease-freiem H2O) und 25 µl Mastermix pro PCR verwendet. Jeder Ansatz wurde im Duplikat angesetzt und nach folgendem Programm im ABI 7900 HT Fast Real-Time PCR System inkubiert. • Cyclerprogramm quantitative PCR 95 °C 10 min 95 °C 15 sec 60 °C 1 min 8 °C ∞ 2.3. Identifizierung von 35 Zyklen Kopiezahl-Veränderungen mittels SNP-Array Technologie 2.3.1. Verwendete Gewebe und Prostata-Zelllinien Für die DNA-Profilierung wurden fünf kommerzielle Prostata-Zelllinien (Tabelle 5) und 77 prostatische Tumorgewebe verwendet. Die 77 cryo-aservierten Gewebeproben stammten von Patienten, die zwischen 2005 und 2009 im Martiniclinic Prostate Cancer Center und im Institut für Pathologie am Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf operiert bzw. befundet worden sind. Das Alter der Patienten lag zwischen 48 und 73 Jahren (medianes Alter 65). Die klinischpathologischen Daten sind in Tabelle 6 zusammengefasst. Die Kultivierung der Prostata-Zelllinien wird in Abschnitt 2.5.2.1. beschrieben. 28 Material & Methoden Tabelle 5. Bestellnummern der, für die DNA-Chip Analyse verwendeten Prostata-Zelllinien Zelllinie RWPE-1 DU-145 LNCaP PC-3 VCaP Lieferant ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC Bestellnummer #CRL-11609 #HTB-81 #CRL-1740 #CRL-1435 #CRL-2876 Ursprung Normale Prostataepithelzellen Hirn-Metastase Lymphknoten-Metastase Knochen-Metastase Wirbelsäulen-Metastase Tabelle 6. Klinisch-pathologische Daten der, für die DNA-Chip Analyse verwendeten Prostatakarzinome AJCC: American Joint Committee on Cancer, pT: Tumorstadium, pN: Nodalstatus (pN0 = Lymphknoten negativ, pN+ = Lymphknoten positiv). Studienkohorte nach Kategorien (n=77) Alter (Jahre) <50 50-60 60-70 >70 Tumorstadium pT (AJCC 2002) pT2 pT3a pT3b pT4 Gleason Grad ≤3+3 3+4 4+3 ≥4+4 LymphkotenMetastasen pN pN0 pN+ 2.3.2. 1 13 53 9 27 29 13 2 10 29 23 15 50 14 Detektion von CNV mittels SNP-Chip Technologie Im Rahmen des Humangenomprojekts ist (besonders von Pharmafirmen) ein Fokus auf die Identifizierung von individuellen Unterschieden in Einzel-Basen, s.g. EinzelnukleotidPolymorphismen (single nucleotid polymorphisms, SNPs) gelegt worden. Diese treten im gesamten Genom auf und könnten mit bestimmten Krankheitsbildern und Pharmaka- 29 Material & Methoden Resistenzen assoziiert sein. Anfang 2000 sind daher die ersten DNA-Chips zur SNP-Analyse eingeführt worden. Für die Analyse der Genkopiezahl-Veränderungen wurde der hochauflösende SNP-Array „Genome-Wide Human SNP Array 6.0“ der Firma Affymetrix verwendet. Neuartige mathematische Algorithmen haben es ermöglicht neben einer SNP-Analyse auch eine Auswertung von Kopiezahl-Veränderungen durchzuführen. Dabei wird der Grad der ermittelten Fluoreszenz eines einzelnen SNPs verwendet, um in einer vergleichenden Analyse benachbarter SNPs chromosomale Abschnitte mit gleicher Intensität zu identifizieren. Abschnitte gleicher Intensität, Segmente genannt, können ab einem bestimmten Wert Zugewinne oder Verluste (copy number variations, CNV) von chromosomalem Material anzeigen129, 130. Abbildung 4 zeigt die einzelnen Arbeitsabläufe mit denen genomische DNA zur Hybridisierung auf die SNP-Arrays vorbereitet wird. Abbildung 4. Affymetrix® Genome-Wide Human SNP 6.0 - Schema der Arbeitsabläufe (Quelle: http://www.asuragenservices.com/Services/services/genotyping/affymetrix_SNP.aspx, Abfragedatum: 21.05.2013, modifiziert Antje Krohn 2013). Im Einzelnen wird die DNA bei dieser Methode durch einen enzymatischen RestriktionsVerdau fragmentiert, die Fragmente anschließend mit einem Oligonukleotid-Adapter versehen und in einer PCR vervielfältigt. Eine Fragmentierung der PCR-Produkte, sowie 30 Material & Methoden deren Biotin-Markierung, ermöglicht danach die Hybridisierung auf die DNA-Chip und eine anschließende Detektion der Hybridisierungs-Intensitäten über eine Fluoreszenz-gekoppelte Antikörper-Kaskade. Verbrauchsmaterial: 0,2 ml 8er PCR Reaktions-Gefäße (Brand) Deckel-Streifen für 8er PCR Reaktions-Gefäße (Brand) 0,2 ml PCR-Gefäße (Brand) 0,5 ml Reaktions-Gefäße (Sarstedt) 1,5 ml Reaktions-Gefäße (Sarstedt) Lichtdichte 1,5 ml Reaktions-Gefäße (Eppendorf) 2 ml Reaktions-Gefäße (Sarstedt) 15 ml Falcon-Reaktionsgefäße (Greiner) Deep Well Storage Plate (VWR) DNA-Chip: Genome Wide SNP Array 6.0 (Affymetrix) Tough-Spots (VWR) 0,2 µm Steril-Filtereinheit (VWR) Labormaterial: MagnaRack, magnetisches Gestell für Reaktionsgefäße (Invitrogen) Gelkammer Wide Mini Sub™ Cell (Biorad) 30-Well Gelkamm (Peqlab) Verwendete Geräte: Kühl-Gestell (Eppendorf) PCR-Streifen Zentrifuge MC 6 (Sarstedt) Thermocycler PTC 100 (MJ Research) Thermocycler PTC 225 (MJ Research) UV-Bank UVT-S-AR (Grant Instruments) Vortex mit einem Einsatz für 2 ml Reaktionsgefäße (IKA) Spannungsquelle Power Pac 300 (Biorad) Vakkumpumpe MZ 2C (Vaccubrand) Analysewaage AE100 (Mettler-Toledo) Magnetrührer Ikamag RH (IKA) GeneChip® Hybridisierungs-Ofen 640 (Affymetrix) Gene Chip® Fluidics Station 450 (Affymetrix) Gene Chip® Scanner 3000 (Affymetrix) Verwendete Kits: Genome-Wide Human SNP 5.0/6.0 Assay Kit (Affymetrix): o Adapter Nsp I und Sty I, je 50 μM o 100 μM Primer 002 o 10x Fragmentierungs-Puffer o Fragmentierungs-Reagenz DNase I (2-3 U/µl) o 5x Terminal Deoxynucleotidyl Transferase Puffer o 30 mM Labeling Reagenz o Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (30 U/μL) o Oligo Control Reagenz (OCR) 31 Material & Methoden TITANIUM™ DNA Amplification Kit (Clontech): o 10x Taq PCR Puffer o 5M GC-Melt o dNTPs, je 2,5 mM o Taq DNA Polymerase Benötigte Reagenzien: Genomische DNA aus Cryogeweben oder Zellkulturen, Isolation gemäß Abschnitt 2.1.1.1. Nuklease-freies dH2O (Sigma-Aldrich) Restriktionsenzyme: Nsp I und Sty I (je 10 U/µl mit Puffern und BSA) (New England Biolabs) T4 DNA Ligase (400 U/μl mit Puffer) (New England Biolabs) Agarose (Sigma-Aldrich) Ethidiumbromid, EtBr (Sigma-Aldrich) TAE-Puffer (Sigma-Aldrich) 100 bp DNA Marker mit Ladepuffer (Thermo Fisher Scientific) 50 bp DNA Marker mit Ladepuffer (Thermo Fisher Scientific) Ethanol, 75% (Th. Geyer) EB Puffer (Qiagen) Agencourt AMPure XP (Beckman-Coulter) MES Hydrat (Sigma-Aldrich) MES Natriumsalz (Sigma-Aldrich) 50x Denhardt´s Lösung (Sigma-Aldrich) 0,5 M Tris-EDTA (Sigma-Aldrich) Heringssperma-DNA (10 mg/ml) (Promega) Human COT-1 DNA (Roche) 10% Tween-20 (Biorad) Dimethylsulfoxid - DMSO (Sigma-Aldrich) 5M Tetramethyl Ammonium Chlorid (TMACL) (Sigma-Aldrich) 20x Salines Natrium Phosphat EDTA (SSPE) (Sigma-Aldrich) 5M Natriumchlorid (Sigma-Aldrich) R-Phycoerythrin Streptavidin (Invitrogen) Biotinylierter anti-Streptavidin Antikörper (Vector Laboratories) Anzusetzende Lösungen: • 12x MES 70,4 g 193,3 g 800,0 ml MES Hydrat MES Natriumsalz dH2O MES Hydrat und MES Natriumsalz im dH2O lösen einen pH Wert zwischen 6,5 und 6,7 einstellen mit dH2O auf 1000 ml auffüllen durch einen 0,2 μm Filter filtrieren dunkel (Flasche in Alufolie) bei 4°C lagern 32 Material & Methoden • Nicht-stringenter Waschpuffer A (6x SSPE, 0,01% Tween 20) 300,0 ml 20x SSPE 1,0 ml Tween 20 (10%) 699,0 ml dH2O Reagenzien vermischen durch einen 0,2 μm Filter filtrieren bei RT lagern • Stringenter Waschpuffer B (0,6x SSPE, 0,01% Tween 20) 30,0 ml 20x SSPE 1,0 ml Tween 20 (10%) 969,0 ml dH2O Reagenzien vermischen durch einen 0,2 μm Filter filtrieren bei RT lagern • Anti-Streptavidin Antikörper 0,5 mg Anti-Streptavidin Antikörper 1,0 ml dH2O Lyophilisierten Antikörper in H2O lösen bei 4°C lagern • 1x Array Holding Puffer (0,6x SSPE, 0,01% Tween 20) 8,3 ml 12x MES (s.o.) 18,5 ml Natriumchlorid (5M) 0,1 ml Tween 20 (10%) dH2O 73,1 ml Reagenzien vermischen dunkel bei 2 bis 8°C lagern Verwendete Software: Gene Chip® Command Console (Affymetrix) Genotyping Console (Affymetrix) Power Tools (Affymetrix) FISH Oracle 2 (Universität Hamburg, Mader et al., Manuskript „FISH Oracle 2: A web server for integrative visualization of genomic data in cancer research” 09/2013 eingereicht bei GenomeMedicine) GISTIC 2.0 (Beroukhim et al.131) 33 Material & Methoden 2.3.2.1. Prozessierung der SNP-Arrays Durchführung: Die SNP-Arrays sind nach den Herstellerangaben des Handbuchs „Affymetrix® GenomeWide Human SNP Nsp/Sty 6.0 User Guide“ (Stand: 2007) prozessiert worden. Von diesem Handbuch abweichend wurden die Protokoll-Unterpunkte „PCR-Aufreinigung“ und „Fragmentierung“ durchgeführt. Die genannten Schritte sind stattdessen nach den Herstellerangaben des Handbuchs „Affymetrix® Zytogenetics Copy Number Assay User Guide“ (Stand: 2008) bearbeitet worden. 2.3.2.2. Erfassung der Hybridisierungs-Intensitäten von SNP-Arrays Durchführung: Die prozessierten SNP-Arrays sind zur Datenerhebung im Gene Chip® Scanner 3000 ausgelesen worden. Die Durchführung des Scans wurde nach den Angaben des Herstellers (Affymetrix: „GeneChip® Operating Software User’s Guide“) (Stand: 2005) ausgeführt. Der Scanner und die GeneChip® Operating Software erfassten die Hybridisierungsintensitäten aller, auf dem SNP-Array repräsentierten, Datenpunkte und generierten automatisch .CELDateien, welche für die nachfolgende Rohdaten-Prozessierung verwendet werden konnten. Es sind nur Daten verwendet worden, die oberhalb einer Callrate (Hybridisierungsqualität) von 86% lagen. Die durchschnittliche Callrate der 77 SNP-Arrays lag bei 96,7% (zwischen 89,4 und 99,0%). 2.3.2.3. Rohdaten-Prozessierung und Berechnung der SNP-Arrays Durchführung: Die .CEL-Dateien der SNP-Arrays wurden unter Verwendung der kostenfreien Software „Affymetrix Power Tools“ (Affymetrix: Affymetrix Power Tools http://www.affymetrix.com/partners_programs/programs/developer/tools/powertools.affx#1_1 , Abfragedatum: 14.08.2013) normalisiert und als .TXT-Datei zusammengefasst. Dieses Programm ermittelte die log R Ratios (LRR, Signalintensität der SNP-Allele) und B-Allel Frequenzen (BAF, normalisierte Ratio aus den Intensitäten der einzelnen SNP-Allele) der SNP Arrays und ordnete den einzelnen SNPs chromosomale Positionen zu. Die Berechnung der Segmente (SNPs mit gleicher log R Ratio) und deren Visualisierung erfolgte über ein DNAcopy-basiertes Programm-Paket. Dieses Programm-Paket ist aktuell noch nicht beschrieben bzw. veröffentlicht; die Informationen der einzelnen Komponenten sind jedoch auf Anfrage erhältlich. In der Visualisierung war jeder SNP als schwarzer Punkt (Abb. 5 A und B) in Abhängigkeit seiner chromosomalen Position und seiner Hybridisierungs-Intensität dargestellt. Die roten Segmente entsprachen SNPs mit gleicher Hybridisierungs-Intensität und ermöglichten die Identifizierung von Kopiezahl-veränderten Bereichen. Abbildung 5 A 34 Material & Methoden zeigt ein Beispiel des Chromosoms 12 mit einem Kopiezahl-Zugewinn, Abb. 5 B hingegen Chromosom 10 mit einem Kopiezahl-Verlust. Die Chromosomen wurden horizontal dargestellt, wobei der kurze p-Arm linksseitig und der lange q-Arm rechtsseitig gelegen war. Abbildung 5. Graphische Darstellung von Kopiezahl-Veränderungen, berechnet mit DNAcopy Die schwarzen Punkte entsprechen den Hybridisierungs-Punkten auf den SNP-Arrays, annotiert an ihre chromosomale Position (X-Achse) und logarithmierter Hybridisierungsintensität LRR (Y-Achse). Diese streuen um einen Nullpunkt und zeigen Kopiezahl-Veränderungen durch positive (LRR >0 = Zugewinne) oder negative (LRR <0 = Verluste) Intensitätswerte an. Dargestellt sind zwei Chromosomen. In dieser Orientierung befindet sich der kurze Chromosom-Arm (p-Arm) links und der lange Chromosom-Arm (q-Arm) rechts. Beide Chromosomen-Arme sich durch einen Punkt-freien Abschnitt, das Zentromer, separiert. A) Beispiel für einen Kopiezahl-Zugewinn auf dem q-Arm von Chromosom 12, B) Beispiel für einen chromosomalen Verlust auf dem q-Arm von Chromosom 10. 2.3.3. FISH Oracle 2 – Web-basierte Software zur Visualisierung von CNV Das FISH Oracle 2 ist ein webbasiertes Software-Tool für die integrative Analyse von genomischen Daten und wurde in enger Kooperation mit dem Institut für Bioinformatik der Universität Hamburg entwickelt. Es handelt sich dabei um eine Weiterentwicklung der FISH Oracle 1 Datenbank132, die u.a. die Segment-Daten aller SNP-Arrays vergleichend visualisiert und interaktiv mit der Ensembl Genomannotation verlinkt. Über eine Suchoberfläche (Abb. 6 A) lassen sich Genomabschnitte mit Kopiezahl-Zugewinnen und Verlusten anzeigen bzw. rekurrente CNV identifizieren (Abb. 6 B) und interessante Bereiche im Detail und Basen-genau darstellen (Abb. 6 C). 35 Material & Methoden Abbildung 6. FISH Oracle 2 Benutzeroberfläche A) Suchmaske, B) Vergleichende Visualisierung der Kopiezahl-Veränderungen (hier Verluste) über mehrere Zytobanden bei Geweben und Zelllinien, C) Detailierte Ansicht an der Zytobande 1p36.12 mit Angaben der betroffenen Gene. 2.3.4. GISTIC-Analyse GISTIC 2 (Genomic Identification of Significant Targets in Cancer) ist ein statistisches Tool zur Identifizierung von signifikanten CNV in Tumoren. Ein Beispiel einer GISTIC Auswertung ist in Abb. 7 gezeigt. Bei dieser Methode werden die statistischen Signifikanzen von CNV über zwei Schritte ermittelt: Zunächst wird der G-Score berechnet, der sich aus der Häufigkeit und der Amplitude der CNV ergibt. In einem zweiten Schritt berechnet GISTIC die statistische Signifikanz der einzelnen CNV (über einen Permutationstest), den s. g. q-Wert. Dieser stellt einen Vergleich der beobachteten und einer virtuellen, zufällig bedingten Verteilung der Veränderungen dar. Diese zufällige Verteilung basiert dabei auf dem allgemeinen Muster der Aberrationen die im Genom vorkommen. Signifikante Veränderungen werden in der graphischen Darstellung als „Peaks“ abgebildet131. 36 Material & Methoden Abbildung 7. Graphisches Beispiel einer GISTIC Auswertung von SNP-Daten Die Analyse umfasst alle Autosomen und Chromosom X. Diese sind rechtseitig der Abbildung annotiert und durchgängig mit einem Farbcode (weiß, grau) hinterlegt. In der graphischen Datenausgabe sind die signifikant veränderten Zytobanden, die Peaks, die oberhalb des Signifikanz-Schwellenwertes (senkrechte, grüne Line) liegen, am rechten Rand der Abbildung aufgelistet. Die GISTIC Software ist über die Internetpräsenz des BROAD Institute erhältlich (Mermel C, Schumacher S, Hill B, Meierson M, Beroukhim R, Getz G: GISTIC 2.0 facilitates sensitive and confident localization of the targets of focal somatic copynumber alteration in human cancers http://www.broadinstitute.org/cgibin/cancer/publications/pub_paper.cgi?mode=view&paper_id =216&p=t, Abfragedatum: 14.08.2013). 37 Material & Methoden 2.4. Validierung von Krebs-relevanten Kopiezahl-Veränderungen an humanen Gewebeproben des Prostatakarzinoms 2.4.1. Tissue Microarrays (TMAs) Bei Tissue Microarrays handelt es sich um eine moderne Form der Gewebearchivierung. Hierbei werden Bohrkerne (0,6 mm Durchmesser) aus einem von Pathologen definierten, repräsentativen Bereich eines Formalin-fixiertem, Paraffin-eingebetteten Gewebes entnommen und diese, zusammen mit vielen anderen Proben, in einen neuen Paraffinblock überbracht. Auf diese Weise lassen sich bis zu 600 Patientenproben in einem Paraffinblock anordnen. Histologische, molekular-zytogenetische und Protein-Färbungen können dadurch zeit- und kostensparend an einer Vielzahl von Proben innerhalb eines Experiments unter gleichen Bedingungen durchgeführt werden. Die Archivierung von Patientenproben und ihre Verwendung unterliegen dem Hamburger Krankenhaus- und Datenschutzgesetz, daher sind alle verwendeten TMAs pseudonymisiert. Den Patientenproben auf den TMAs lassen sich nur klinisch-pathologische Daten, jedoch keine persönlichen Identifikationsmerkmale, wie Patientenname, Geburtsdatum oder interne Eingangsnummern zuweisen. 2.4.1.1. Sondentest-TMAs Ein Sondentest-TMA umfasst eine geringe Anzahl (20-30 Proben) von Geweben ohne klinische Daten und Patienten-Identifikationsnummern. Sie dienen lediglich zur Überprüfung der Leuchtkraft und Spezifität von neu hergestellten FISH DNA-Sonden. 2.4.1.2. Prognose-TMA Prognose-TMAs umfassen eine große Anzahl von Gewebe-Stanzen für die ebenfalls pathologische Parameter und klinische Verlaufsdaten zur Verfügung stehen. Dies erlaubt nicht nur die Häufigkeit einer genetischen Veränderung zu ermitteln, sondern ermöglicht auch eine Korrelation zu pathologischen Parametern und die Überprüfung der klinischen Relevanz133. Zur Validierung der identifizierten CNV bzw. der potentiell krebsrelevanten Gene stand ein Prognose-TMA mit 7.478 Patientenproben zur Verfügung (Abb.8). Die Patienten wurden zwischen 1992 und 2009 im Institut für Urologie bzw. dem Martiniclinic Prostate Cancer Center am Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf operiert und im Institut für Pathologie befundet. Keiner der Patienten hat eine neoadjuvante oder adjuvante Therapie erhalten. 38 Material & Methoden Abbildung 8. Prognose TMA Die 7.478 Gewebeproben sind über 16 Paraffin-Blöcke verteilt. Der Ausschnitt zeigt eine histologische Färbung eines Blocks (Hämatoxylin & Eosin) Das durchschnittliche Alter lag bei 63 Jahren (Median: 64 Jahre). Für 6.022 der 7.478 Patienten lagen klinische Verlaufsdaten vor. Bei allen Patienten wurde der Wert des Prostata-spezifischen Antigens (PSA) im ersten Jahr nach der Operation vierteljährlich, im nächsten Jahr halbjährlich und nach dem dritten Jahr jährlichen gemessenen. Der erste postoperative Wiederanstieg des PSA-Wertes auf ≥ 0,2 ng/ml wurde als Zeitpunkt eines biochemischen Rezidivs (BCR) definiert. Patienten ohne den Nachweis eines Rezidivs wurden zum Zeitpunkt der letzten Erhebung klinischer Verlaufsdaten zensiert. Im Falle eines BCR ist eine zusätzliche (Salvage-)Therapie eingeleitet worden. 39 Material & Methoden Tabelle 7. Klinisch-pathologische Parameter des Prognose-TMAs Die Summe der Patienten in den einzelnen Kategorien entspricht nicht immer 7.478. Für die fehlenden Patienten standen keine klinischen Verlaufsdaten zur Verfügung. Bis auf die Angaben der klinischen Verlaufsdaten entsprechen die Angaben in den einzelnen Kategorien absoluten Werten. AJCC: American Joint Committee on Cancer, pT: Tumorstadium, pN: Nodalstatus (pN0 = Lymphknoten negativ, pN+ = Lymphknoten positiv). Studienkohorte nach Kategorien Patienten mit biochemischen Rezidiv nach Kategorien (n=7.478) (n=1.456) 53,4 36,8 - 234 1912 4.438 820 43 368 872 171 4.926 1.649 803 58 460 476 472 48 2.316 3.803 1.017 287 171 693 447 144 3.962 327 919 206 976 4.442 1.460 488 125 649 411 248 5.919 1.428 913 516 Klinische Verlausdaten (Monate) Mittelwert Median Alter (Jahre) <50 50-60 60-70 >70 Tumorstadium pT (AJCC 2002) pT2 pT3a pT3b pT4 Gleason Grad ≤3+3 3+4 4+3 ≥4+4 Lymphkoten-Metastasen pN pN0 pN+ PSA vor Behandlung [ng/ml] <4 4-10 10-20 >20 Sektionsrand negativ positiv 2.4.1.3. TMA mit Hormon-refraktären Prostatakarzinomen (HR-TMA) Der HR-TMA umfasste Gewebeproben aus palliativ-transurethralen Resektionen von 71 Patienten. 40 Karzinome stammten vom Institut für Pathologie am UKE und die verbleibenden 31 wurden freundlicherweise vom Department of Surgery der Universität 40 Material & Methoden Montreal in Kanada zur Verfügung gestellt. Es lagen keine Verlaufsdaten für diese Tumorproben vor. Hormon-refraktäre Prostatakarzinome definierten sich durch: Kastration-Niveau von Testosteron im Serum; drei aufeinanderfolgenden Erhöhungen der PSA-Wertes, was zu zwei 50%igen Erhöhungen über dem Nadir (Tiefstpunkt des PSA-Wertes) führt; Anti-Androgen Entzug für mindestens 4 Wochen; PSA-Erhöhung trotz sekundärer Hormon-Behandlung oder das Auftreten von knöchernen oder Weichgewebs-Läsionen. 2.4.1.4. Heterogenitäts-TMA Beim Heterogenitäts-TMA handelt es sich um eine neuartige Form eines GewebeMicroarrays. Im Gegensatz zu Prognose-TMAs, auf denen jeder Tumor mit einem Gewebespot repräsentiert ist, stehen auf dem Heterogenitäts-TMA zehn Gewebespots zur Verfügung. Auf diese Weise lässt sich die Verteilung eines genetischen Markers in einem Tumorfokus (intrafokal) oder zwischen mehreren Tumorfoci (interfokal) analysieren. Dies ermöglicht es eine Aussage über die Heterogenität des Markers treffen zu können. Für die Herstellung dieses TMAs wurden Prostata-Explantate (nach radikaler Prostatektomie) von 190 Patienten verwendet, die zwischen Januar und März 2010 am Martiniclinic Prostate Cancer Center operiert und im Institut für Pathologie am UKE befundet worden sind. Die Sektionierung der Prostaten wurde den Institutsvorgaben134 folgend durchgeführt und nach der Präparation makroskopisch bildarchiviert. Nach den Vorgaben von Wise et al.135 hat ein Pathologe die Lage des Tumors bzw. einzelner Tumorfoci innerhalb der gesamten Prostata bestimmt. 67 Prostaten enthielten Tumorareale, die nur auf einen Fokus begrenzt waren. In 48 Prostaten wurden zwei unabhängige Tumorfoci identifiziert und weitere 28 Prostaten wiesen drei Tumorfoci auf. Die verbleibenden 38 Prostaten enthielten vier und mehr Tumorfoci. Aus jeder Prostatektomie wurden zehn tumorhaltige Gewebeblöcke ausgewählt und jedem ein Gewebekern entnommen. Jeder Bohrkern ist in einen neuen Paraffinblock überbracht worden, so dass der Heterogenitäts-TMA aus zehn Paraffinblöcken bestand. Die Lokalisation der Bohrkerne, die Zugehörigkeit zum jeweiligen Tumorfokus und die klinischen Parameter der Tumoren sind in einer Datenbank archiviert worden. Eine vereinfachte Darstellung des Heterogenitäts-TMAs ist in Abbildung 9 gezeigt. 41 Material & Methoden Abbildung 9. Heterogenitäts-TMA Nach der Prostatektomie und der Befundung durch einen Pathologen sind zehn tumorhaltige Blöcke für die Herstellung des Heterogenitäts-TMAs verwendet worden. In der Abbildung ist die Makroaufnahme einer sektionierten Prostatektomie mit zwei verschiedenen Tumorfoci gezeigt. Real verteilen sich die zehn Proben über zehn verschiedene TMA-Blöcke. Zum besseren Verständnis des Heterogenitäts-TMAs ist in dieser Abbildung nur ein TMA-Block dargestellt. Die klinisch-pathologischen Daten der Tumoren auf dem Heterogenitäts-TMA sind in Tab. 8 zusammengefasst. Nach Fertigstellung des TMAs ist eine Patientenprobe auf Grund fehlender klinischer Daten aus der Analyse ausgeschlossen worden. Neben der Analyse der Heterogenität eines 42 Material & Methoden genetischen Markers, lässt sich der Heterogenitäts-TMA für eine vergleichende Analyse (zeitliches Auftreten) zwischen zwei genetischen Ereignissen verwenden. Tabelle 8. Klinisch-pathologische Parameter des Heterogenitäts-TMAs Die Summe der Werte in den Kategorien „pN“ und „Sektionsrand“ ergeben nicht immer 189, weil für diese keine Informationen vorlagen. AJCC: American Joint Committee on Cancer, pT: Tumorstadium, pN: Nodalstatus (pN0 = Lymphknoten negativ, pN+ = Lymphknoten positiv) Studienkohorte nach Kategorien (n=189) Alter (Jahre) <50 50-60 60-70 >70 pT Kategorie (AJCC 2002) pT2 pT3a pT3b pT4 Gleason Grad ≤3+3 3+4 4+3 ≥4+4 pN Kategorie pN0 pN+ Sektionsrand negativ positiv 2.4.1.5. 3 43 120 23 127 32 29 1 4 144 33 8 130 10 160 26 Großflächenschnitt-Validierung in der Heterogenitäts-Analyse Für die Validierung von fraglichen Ergebnissen einer Gewebe-Stanze des HeterogenitätsTMAs sind vereinzelt Großflächen-Schnitte von dem Gewebeblock, aus dem die Stanze entnommen worden ist, angefertigt. 2.4.2. Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung ermöglicht den Nachweis von numerischen Veränderungen von Chromosomen und Genen, sowie strukturellen Aberrationen, wie Translokationen, Genfusionen oder auch intragenische Deletionen an histologischen Gewebeschnittpräparaten. Für die Visualisierung von genomischen Aberrationen werden 300 bis 500 kb lange DNA-Sonden benötigt, deren Sequenz komplementär zu dem zu 43 Material & Methoden untersuchenden DNA-Abschnitt des Untersuchungsmaterials ist. Die benötigten SondenDNAs lassen sich z. B. über BAC-Bibliotheken (Bacterial Artificial Chromosome; Vektoren, in die bis zu 1 MB Fremd-DNA kloniert werden kann) identifizieren und sind käuflich zu erwerben. Der Vorteil der BACs ist ihre leichte Vermehrung über Bakterien und ihre unkomplizierte Isolation mittels alkalischer Lyse. Die erhaltene DNA wird durch die s. g. Nicktranslation mit Fluoreszenzfarbstoffen versehen und mit dem Untersuchungsmaterial hybridisiert. Ein Schema der Arbeitsabläufe bei der FISH ist in Abb. 10 gezeigt. Abbildung 10. Arbeitssabläufe bei der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (Quelle: Wikipedia http://de.wikipedia.org/wiki/In-situ-Hybridisierung, Abfragedatum: 21.05.2013, modifiziert Antje Krohn 2013) Dargestellt ist die Direktmarkierung der Sonden-DNA mit einem Fluoreszenz-Farbstoff, die mit dem Untersuchungsmaterial hybridisiert werden. Die Auswertung der FISH kann direkt nach der Hybridisierung erfolgen. 2.4.2.1. Architektur von FISH DNA-Sonden Die FISH-Auswertungen erfolgten mit Deletions- und/oder Breakapart-Sonden. Die Größe und Lage der DNA-Sonden deckten die zu untersuchende Gene repräsentativ ab. Als Grundlage dienten hier die Ergebnisse der DNA-Chipanalyse. Die Lokalisation der jeweiligen Deletions- bzw. Breakapart-Sonden ist zum Vergleich in die Abbildungen 19, 22 bzw. 24 der identifizierten Deletionen integriert worden. Für jede Deletions-Sonde wurden zwei BACs und eine kommerziell erhältliche Referenz-Sonde verwendet. Es handelte sich dabei um Zentromer DNA-Sonden des Chromosoms, auf dem das untersuchte Gen 44 Material & Methoden lokalisiert war. Die Breakapart-Sonden bestanden aus zwei, farblich unterschiedlich Fluoreszenz-markierten DNA-Sonden (grün und orange) bzw. vier BACs, die repräsentativ sowohl das 5’ Ende, als auch das 3’ Ende des zu untersuchenden Gens abdeckten und einer Referenzsonde (in einer dritten Farbe), wenn eine solche kommerziell erhältlich war. 2.4.2.2. Auswahl der BAC-Klone für die Herstellung von FISH DNA-Sonden Die Auswahl der BAC-Klone zur Herstellung der FISH DNA-Sonden wurde über die Ensembl (http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/Index, Abfragedatum 14.08.2013) getroffen. Ensembl ist gemeinsames Projekt des European Bioinformatics Institutes (EBI) und des Wellcome Trust Sanger Institutes (WTSI). Es handelt sich dabei um eine öffentlich zugängliche Datenbank, in der seit Juli 2000 u.a. alle Informationen zur genomischen Sequenz des Menschen gesammelt und dargestellt werden. Ebenfalls abgelegt sind die BAC-Bibliotheken aus dem Humanen Genom-Projekt (HUGO). Der Bezug der BAC-Klone erfolgte über Source Bioscience (Nottingham, Großbritannien). Alle verwendeten BAC-Klone sind in Tabelle 9 zusammengefasst. Tabelle 9. BAC-Klone zur FISH DNA-Sonden Herstellung Gen Internationale Klone-ID Bestellnummer Source Bioscience Vector InsertLänge [kb] AntibiotikaResistenz ERG RP11-720N21 RPCIB753N21720Q pBACe3.6 208 Chloramphenicol ERG RP11-94J12 RPCIB753J1294 pBACe3.6 170 " ERG RP11-95I21 RPCIB753I2195 pBACe3.6 187 " ERG RP11-360N24 RPCIB753N24360 pBACe3.6 201 " PTEN RP11-380G05 RZPDB737D042109D pBACe3.6 201 " PTEN RP11-813O03 RPCIB753O03813Q pBACe3.6 161 " PTEN RP11-765C10 RPCIB753C10765Q pBACe3.6 181 " PTEN RP11-659F22 RPCIB753F22659Q pBACe3.6 179 " PTEN RP11-79A15 RPCIB753A1579Q pBACe3.6 170 " FOXP1 RP11-154H23 RPCIB753H23154Q pBACe3.6 157 " FOXP1 RP11-49E03 RPCIB753E0349Q pBACe3.6 177 " FOXP1 RP11-79P21 RPCIB753P2179Q pBACe3.6 168 " FOXP1 RP11-430J03 RPCIB753J03430Q pBACe3.6 160 " RYBP RP11-483B19 RPCIB753B19483Q pBACe3.6 193 " RYBP RP11-699H1 RPCIB753H01699Q pBACe3.6 198 " SHQ1 RP11-624D20 RPCIB753D20624Q pBACe3.6 191 " SHQ1 RP11-728B21 RPCIB753B21728Q pBACe3.6 162 " 45 Material & Methoden 2.4.2.3. Herstellung von FISH DNA-Sonden Verbrauchsmaterial: Pipettenspitzen (Sarstedt) Lichtdichte 0,5 ml Reaktions-Gefäße (Eppendorf) Lichtdichte 1,5 ml Reaktions-Gefäße (Eppendorf) Labormaterial: Kühl-Gestell (Eppendorf) Pipetten (Eppendorf) Verwendete Geräte: Thermocycler Primus 25 (MWG) Zentrifuge Biofuge Fresco (Heraeus) Vortex MS1 Minishaker (IKA) Vakuum Zentrifuge Concentrator plus (Eppendorf) Verwendete Kits: Nick Translations Reagent Kit (Abbott) o Nicktranslations-Enzyme Mix (DNase I, DNA Polymerase I) o 10x Nicktranslations-Puffer o dNTPs: dATP, dCTP, dGTP (je 0,3 mM) und dTTP (1 mM) o Nuklease-freies dH2O Nucleotide Removal Kit (Qiagen) o QIAquick Spin Säulen o PNI Puffer (konzentriert) o PE Puffer (konzentriert) o EB Puffer o 2 ml Sammel-Gefäße o Ladepuffer Benötigte Reagenzien: BAC Plasmid-DNA (Tab. 9, Isolation nach Abschnitt 2.1.1.3.) SpectrumGreen: 50 mM Green dUTP (lyophilisiert) (Abbott) SpectrumOrange: 50 mM Orange dUTP (lyophilisiert) (Abbott) Ethanol, absolut (Merck) Isopropanol (Merck) Immersol (Zeiss) Anzusetzende Lösungen: Die konzentrierten Puffer PNI und PE wurden vor Gebrauch mit dem, auf dem Puffergefäß deklarierten Volumen an Isopropanol bzw. Ethanol (absolut) verdünnt. 46 Material & Methoden • 0,2mM dUTPs (SpectrumGreen, SpectrumOrange) 1 Tube 50 mM Green oder Orange dUTP (lyophilisiert) 50 µl dH20 lyophilisierte dUTPs in 50 µl dH20 lösen bei -20°C lagern • 0,1mM dTTPs 10 µl 40 µl dTTP (1 mM) dH20 1 mM dTTP verdünnen bei -20°C lagern 2.4.2.3.1. Nicktranslation nach Abbott Die Nicktranslation ist eine enzymatische Reaktion zur Herstellung von FISH DNA-Sonden, bei der die Sonden-DNA mit Fluoreszenz-Farbstoffen versehen und fragmentiert wird. Als Enzyme werden DNase I und DNA Polymerase I verwendet. Die DNase I verursacht willkürlich Strangbrüche („nicks“) in der Sonden-DNA. Neben ihrer Fähigkeit DNA-Stränge neu zu synthetisieren (Polymerase-Aktivität), kann die DNA Polymerase I auf Grund ihrer 5‘-3‘-Exonuklease-Aktivität (Reparatur-Funktion) diese Strangbrüche erkennen und „reparieren“. Dabei wird der „defekte“ DNA-Strang abgebaut und neu synthetisiert. Bei der Neusynthese werden neben den normalen DesoxyribonukleosidTriphosphaten (dNTPs) auch solche dNTPs eingebaut, an denen ein Fluorochrom angeheftet ist. Eine Verknüpfung der Strangenden bleibt dabei aus und sorgt so, bei Häufung dieser offenen DNA-Enden, für eine kontinuierliche Fragmentierung der DNA. Durchführung: Die Nicktranslation ist nach den Herstellerangaben des Begleitscheins „Nick Translation: Assay Procedure„ (Stand: Juni 2011) durchgeführt worden. Die Inkubation enzymatischen Reaktion erfolgte nach folgendem Programm im Thermocycler Primus 25: • Cyclerprogramm Nicktranslation 15 °C 8h 70 °C 10 min 4 °C ∞ 47 der Material & Methoden 2.4.2.3.2. Aufreinigung und Konzentration der DNA-Sonden Zur Entfernung der nicht-inkorporierten Nukleotide wurde nach der Nicktranslation das „QIAquick Nucleotide removal Kit“ von Qiagen verwendet. Das Verfahren ist nach Herstellerangaben des „QIAquick® Spin Handbook“ für nicht-radioaktive Proben“ (Stand: Mai 2012) durchgeführt worden. Die DNA-Sonden wurden in 60µl dH20 eluiert. Die DNA-Sonden sind anschließend für 20 Min. bei 45°C in der Vakuum-Zentrifuge konzentriert worden. Das Endvolumen lag bei ungefähr 20µl. 2.4.2.4. Verwendete FISH DNA-Sonden 2.4.2.4.1. ERG FISH Sonde Zur Analyse der ERG-Aberrationen ist eine ERG Breakapart-Sonde verwendet worden (Abb. 11). Für die 5’-Seite der Sonde wurden die BAC-Klone RP11-95I21 und RP11-360N24 mit SpectrumGreen und für die 3’-Seite die BAC-Klone RP11-720N21 und RP11-94J12 mit SpectrumOrange markiert. Eine Referenz-Sonde wurde für die ERG FISH Analysen nicht benötigt. Abbildung 11. ERG FISH Breakapart-Sonde Die Abbildung zeigt die Lage der verwendeten BAC-Klone, die Größe der FISH-Sonden (3‘ERG: 320 kb, 5‘ERG: 315 kb) und die Farbe der Fluoreszenz-Markierung (3‘ERG: orange, 5‘ERG: grün). Die Lücke zwischen 3‘ und 5‘-Sonde beträgt 140 kb. 48 Material & Methoden 2.4.2.4.2. PTEN FISH Sonden Die PTEN FISH Analysen sind mit zwei DNA-Sondensets durchgeführt worden (Abb. 12). Zunächst mit einer SpectrumOrange markierten PTEN Deletions-Sonde, hergestellt aus den BAC-Klonen RP11-380G05 und RP11-813O03. Als Referenz wurde die SpectrumGreen markierte Zentromer 10 Sonde der Firma Abbott verwendet. Des Weiteren ist eine PTEN Breakapart-Sonde benutzt worden. Die 5’-Seite der Sonde bestand aus den SpectrumOrange markierten BAC-Klonen RP11-659F22 und RP11-79A15, die 3’-Seite aus den SpectrumGreen markierten BAC-Klonen RP11-765C10 und RP11813O03). Als Referenz wurde die SpectrumAqua markierte Zentromer 10 Sonde von Abbott verwendet. Abbildung 12. PTEN FISH Deletions- und Breakapart-Sonde Die Abbildung zeigt die Lage der verwendeten BAC-Klone, die Größe der FISH-Sonden (PTEN Deletion: ~400 kb; PTEN Breakapart: 5‘PTEN: ~295 kb, 3‘PTEN: ~320 kb) und die Farbe der Fluoreszenz-Markierung (PTEN Deletion: orange; PTEN Breakapart: 5‘PTEN: orange, 3‘PTEN: grün). Die Lücke zwischen 5‘ und 3‘-Sonde beträgt ungefähr 105 kb. 49 Material & Methoden 2.4.2.4.3. FOXP1 FISH Sonden Für die FOXP1 FISH Analysen sind zwei DNA-Sondensets verwendet worden (Abb. 13). Zum einen eine FOXP1 Deletions-Sonde, die aus den SpectrumGreen markierten BACKlonen RP11-49E03 und BAC RP11-154H23 bestand, zum anderen eine FOXP1 Breakapart-Sonde. Die 5’-Seite der Breakapart-Sonde bestand aus den SpectrumGreen markierten BAC-Klonen RP11-49E03 und RP11-154H23, die 3’-Seite aus den SpectrumOrange markierten BAC-Klonen RP11-430J03 und RP11-79P21. Als Referenz der Deletions-Sonde diente die SpectrumOrange markierte Zentromer 3 Sonde von Abbott. Abbildung 13. FOXP1 FISH Deletions- und Breakapart-Sonde Die Abbildung zeigt die Lage der verwendeten BAC-Klone, die Größe der FISH-Sonden (FOXP1 Deletion: ~280 kb; FOXP1 Breakapart: 3‘FOXP1: ~328 kb, 5‘FOXP1: ~280 kb) und die Farbe der Fluoreszenz-Markierung (FOXP1 Deletion: grün; FOXP1 Breakapart: 3‘FOXP1: orange, 5‘FOXP1: grün). Die Lücke zwischen 5‘ und 3‘-Sonde beträgt ungefähr 350 kb. 2.4.2.4.4. TP53 FISH Das Datenset der TP53 FISH stellte eine Teilmengen einer früheren Studie (Kluth et al.: Manuskript „Clinical significance of different types of p53 gene alterations in radically operated prostate cancer“ akzeptiert seit 01/2014 im beim International Journal of Cancer)55 50 Material & Methoden des Instituts für Pathologie dar und wurde für die vorliegende Arbeit zu Zwecken der Korrelationen zur Verfügung gestellt. 2.4.2.4.5. Test der DNA-Sonden Die hergestellten DNA-Sonden wurden vor ihrem Einsatz einem Sondentest unterzogen. Jede DNA-Sonde bestand aus mindestens zwei (bei Deletions-Sonden) bzw. vier BACKlonen (bei Breakapart-Sonden). Zur Überprüfung der Leuchtintensität, wurde zunächst jede Sonde (bestehend aus einem BAC) einzeln in einer Testhybridisierung auf einem Sondentest-TMA kontrolliert. In einem zweiten Test sind alle, zu einer DNA-Sonde zugehörigen BACs kohybrisiert worden, um die Spezifität zu kontrollieren. 2.4.2.5. Durchführung der Fluoreszenz in situ Hybridisierung Verbrauchsmaterial: Deckgläser (Marienfeld) 0,5 ml lichtdichte Reaktions-Gefäße (Eppendorf) Labormaterial: 100 ml Glasküvetten (Roth) Diamantschreiber, nur bei Gewebegroßflächen (VWR) Verwendete Geräte Strecktisch (Medax) Wasserbad 1002, 1003 (GFL) Vortex Vibrofix VF1 (IKA) Analysewaage PJ3000 (Mettler-Toledo) Magnetrührer Ikamag RH (IKA) Thermobrite StatSpin (Abbott) Fluoreszenz-Mikroskop AxioVision Imager.A1 (Zeiss) Kamera AxioCam MRc (Zeiss) pH-Meter 766 Calimatic (Knick) Benötigte Reagenzien: TMAs oder Großflächenschnitte, nachfolgend als Objekträger (OT) bezeichnet (Institut für Pathologie, UKE) dH2O aus Reinstwasser-Anlage Astacus (MembraPure) dH2O (Sigma-Aldrich) Xylol (J.T. Baker) Ethanol (70%, 80%, 96%) (Th. Geyer) Pretreatment Lösung (Abbott) Protease Puffer, 0,01 N HCl (Abbott) Protease I (Pepsin) (Abbott) Human COT-1 DNA (Roche) Fixogum (Marabu) NP-40 (Octylphenoxypolyethoxyethanol) (Abbott) 20x Salines Natrium-Citrat Pulver (SSC) (Abbott) 51 Material & Methoden Dextransulfat (Roth) Formamid, deionisiert (Merck) DNA-Sonden (Herstellung nach Abschnitt 2.4.2.3.) Zentromer-Sonden o FOXP1: CEP 3, SpectrumOrange markiert (Abbott) o PTEN: CEP 10, SpectrumGreen markiert (Abbott) CEP 10, SpectrumAqua markiert (Abbott) DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindol)/Antifade-Lösung (Vector Laboratories) Anzusetzende Lösungen: •Protease-Lösung (0,5mg/ml) 500 ml Protease Puffer (0,01 N HCl, pH 2,0) 250 mg Protease I (Pepsin) 250 mg Protease I in 500 ml Protease Puffer lösen bei 4°C lagern • 20x SSC-Lösung 123 g SSC 500 ml dH2O SSC in dH2O lösen pH 5,3 einstellen bei RT lagern • Basis-Hybridisierungsmix 15,0 ml deionisiertes Formamid 4,5 ml 20x SSC 3,0 ml Dextransulfat bei 60°C auf dem Magnetrührer rühren bis sich das Dextransulfat gelöst hat pH 7 einstellen mit dH2O auf 21 ml auffüllen bei 4°C lagern • Posthybrisidierungs-Waschpuffer 100 ml 20x SSC 3 ml NP40 ad 1000 ml dH2O SSC und NP-40 in aqua dest. Lösen pH 7,25 einstellen mit dH2O auf 1000 ml auffüllen bei RT lagern 52 Material & Methoden Verwendete Software: Bilddokumentations-Software „AxioVision Release 4.8“ (Zeiss) 2.4.2.5.1. Vorbehandlung der TMAs und Großflächenschnitte Durchführung: Von allen verwendeten TMAs und von den Gewebeblöcken (Großflächen) sind 4 µm dünne Schnitte für die FISH-Analysen angefertigt worden. Die frisch geschnittenen TMAs bzw. Großflächen sind zunächst dreimal 10 Min. lang in Xylol entparaffiniert, nachfolgend zweimal in 96%igem Ethanol vom Xylol befreit und abschließend für 3 Min. auf einer Heizplatte (48°C) luftgetrocknet worden. Zur Vorbehandlung der Formalin-fixierten Gewebe sind die OTs für 15 Min. in 80°C heißem Pretreatment (Küvette im Wasserbad) inkubiert und in dH2O gespült worden. Der anschließende Andau der vorbehandelten Gewebeschnitte in einer Protease-Lösung (bei 37°C in einer Küvette im Wasserbad) verbesserte während der Hybridisierung die Zugänglichkeit der DNA-Sonden zum Nukleus und erfolgte bei TMAs für 150 Min., bei Großflächen für 250 Min. Anhaftende Protease-Lösung wurde nach dem Gewebe-Andau in dH2O entfernt. Das Gewebe ist nachfolgend in einer aufsteigenden Alkoholreihe (70%, 80%, 96%) je drei Minuten entwässert und abschließend bei 48°C auf einer Heizplatte luftgetrocknet worden. 2.4.2.5.2. Ansatz des Sonden-Hybridisierungsmix Durchführung: Der Sonden-Hybridisierungsmix wurde nach folgenden Angaben zusammengestellt: • Sonden-Hybridisierungsmix 14,0 µl Basis-Hybridierungsmix 2,0 µl COT-DNA 3,5 µl DNA-Sonde 0,5 µl CEP-Sonde (nur bei Deletionssonden) 20,0 µl Sonden-Hybridisierungsmix Bei Verwendung von FISH Breakapart-Sonden ist die CEP-Sonde durch einen entsprechenden Volumenanteil dH2O ersetzt worden. 2.4.2.5.3. In situ Hybridisierung der DNA FISH Sonden Durchführung: Der Sonden-Hybridisierungsmix wurde auf die vorbehandelte Gewebefläche des TMA- oder Großflächenschnittes pipettiert, luftblasenfrei mit einem Deckglas eingedeckelt und die Randflächen mit Fixogum versiegelt, um ein Austrocknen zu vermeiden. Die Schnitte mussten in allen nachfolgenden Schritten vor übermäßiger Lichteinstrahlung geschützt 53 Material & Methoden werden. Die vorbereiteten OTs wurden in den Thermobrite eingelegt und die Hybridisierung initiiert. Nach einer 10-minütigen Denaturierungsphase bei 72°C folgte die Inkubation bei 37°C über Nacht. 2.4.2.5.4. Posthybridisierung Durchführung: Nach der Hybridisierung wurden die OTs aus dem Thermobrite entnommen, das Fixogum entfernt und die Schnitte entdeckelt. Um das Entfernen der Deckgläschen zu erleichtern, konnten die OTs für eine halbe Stunde in eine Küvette mit Posthybridisierungs-Waschpuffer eingestellt werden. Nachfolgend sind die OTs in 72°C warmen PosthybridisierungsWaschpuffer (Küvette im Wasserbad) gewaschen worden, um überschüssige DNA-Sonde und unspezifische Bindungen zu entfernen. Nach einem kurzen Waschschritt in dH2O wurden die Schnitte im Dunklen luftgetrocknet, anschließend mit 20 µl DAPI überschichtet und mit einem Deckgläschen abgedeckt. 2.4.2.6. Fluoreszenz-Mikroskopie und Bilddokumentation Die nach Abschnitt 2.4.2.5. prozessierten OTs wurden am AxioVision Imager.A1 Fluoreszenz-Mikroskop ausgewertet. Zur Bilddokumentation von Mehrfarb-Aufnahmen standen die AxioCam MRc (Zeiss) und die Anwendung AxioVision Release 4.8 zur Verfügung. 2.4.2.7. Technische Aspekte der FISH Auswertung Zum vorzeitigen Ausschluss von Gewebespots, die keinen bzw. nur einen unzureichenden Tumorgehalt aufwiesen, sind immunhistochemische und histologische Färbungen (H&E) an TMA-Schnitten durchgeführt und von einem Pathologen ausgewertet worden. Als Antikörper für die IHC wurden der Basalzell-Marker 34βE12 und p504s zur Detektion von AMACR (wird spezifisch in PIN und Prostatakarzinomen exprimiert136) verwendet und nach InstitutsVorgaben prozessiert (Abschnitt 2.4.3.1.). Eine Vielzahl auszuschließen. weiterer Dazu Ereignisse gehörten, bedingte es Gewebe von der FISH-Analyse auf Grund von Präparations-Artefakten, fehlende Gewebespots oder auch deren Teilverlust. Häufig mussten Spots wegen unspezifischer Bindungen der DNA-Sonde (Hintergrund) oder wegen einer suboptimalen Hybridisierung (die zu schwachen DNA Sonden-Signalen führte) exkludiert werden. 54 Material & Methoden Um eine möglichst hohe Vergleichbarkeit der Einzelanalysen zu gewährleisten, sind alle Auswertungen (von H&E-, IHC- und Fluoreszenz-Färbungen) an konsekutiven Schnitten der jeweiligen TMAs durchgeführt worden. Ob ein Gewebe-Spot positiv für eine genomische Veränderung war, ist vom Anteil der betroffenen Tumorzellkerne abhängig gewesen. Durch Vorarbeiten am Institut für Pathologie ist ein Schwellenwert festgelegt worden, der einen Mindestanteil betroffener Zellkerne von 60% voraussetzte. 2.4.2.7.1. Als „unverändert“ bzw. Auswertung von FISH Deletions-Sonden „normal“ wurden solche Tumorzellkerne bezeichnet, die durchschnittlich die gleiche Anzahl von Gen- und Referenzsignal aufwiesen. Bei einem normalen Chromosomensatz wären dies zwei Gen- zu zwei Referenzsignalen, bei einer Aneuploidie entsprechend 3/3 bzw. mehr Signale. Eine heterozygote Deletion lag vor, wenn in den Tumorzellkernen weniger Gen- als Referenzsignale zu finden waren, z. B. ein Gensignal zu zwei Referenzsignalen. Von homozygoten Deletionen wurde ausgegangen, wenn in den Tumorzellkernen keine Gensignale, aber Referenzsignale zu finden waren. Als zusätzliche Kontrolle wurde hierbei das Stroma herangezogen, in dem die Gensignale nachweislich vorhanden sein mussten. 2.4.2.7.2. Auswertung von FISH Breakapart-Sonden Als „normal“ wurden solche Tumorzellkerne bezeichnet, die überlappende orangefarbene und grüne Signale aufwiesen. Auf Grund ihrer Emissionen erschienen die überlappenden Fluoreszenzsignale gelb. Eine balancierte Translokation lag vor, wenn mindestens ein Allel einen Zerfall aufwies und zwei deutlich voneinander separierte Signale (orange und grün) erkennbar waren. Sind nicht alle Allele betroffen gewesen, wurde die Translokation als heterozygot bezeichnet, betraf sie jedoch alle Allele, lag eine homozygote Translokation vor. Intragenische Brüche definierten sich über den Verlust des grünen oder orangefarbenen Sonden-Anteils. Im Falle der PTEN Breakapart Sonde sind die intragenischen Brüche zur Reduzierung der Anzahl von Aberrationsklassen in die entsprechende Kategorie der heteround homozygoten Deletion eingeordnet worden. Um die einzelnen chromosomalen Aberrationen der Breakapart-Sonde unterscheiden zu können ist für jede ein BreakapartCode definiert worden. Dieser setzte sich aus der Anzahl intakter (gelber) Signale X, der Anzahl einzelner orangefarbener Signale Y und der Anzahl einzelner grüner Signale Z zusammen (X/Y/Z). Ein Breakapart-Code von 2/0/0 entsprach nach diesen Vorgaben einem Gewebe mit zwei intakten, aber keinem separaten orangefarbenen bzw. grünen Signal und stellte somit den Normalzustand dar. 55 Material & Methoden Lag durchschnittlich nur ein gelbes Signal in mehr als 60% der Tumorzellkerne vor, wurde von einer heterozygoten Deletion ausgegangen. Ließen sich keine Signale mehr in den Tumorzellkernen, wohl aber im umliegenden Stroma finden, lag eine homozygote Deletion vor. 2.4.2.7.3. Ermittlung des Inaktivierungs-Status von PTEN Es wurde angenommen, dass die biologische Konsequenz von heterozygoten Deletionen, heterozygoten Translokationen und heterozygoten intragenischen Brüchen eine nahezu identisch waren und die Inaktivierung eines PTEN Allels bedeuteten. Da gleichzeitig die Funktion des intakten PTEN Allels erhalten blieb wurden diese Aberrationen als heterozygote Inaktivierung zusammengefasst. Homozygote Inaktivierungen hingegen wiesen sich durch den funktionellen Verlust aller PTEN Allele aus. Dies konnte durch Deletionen aller Allele, durch intragenische Deletionen in allen Allelen, durch Translokationen aller Allele oder durch die Deletion eines Allels und der Translokation des Verbleibenden passieren. 2.4.3. Immunhistochemische Färbungen (IHC) 34βE12 und p504s IHC 2.4.3.1. Zum Ausschluss von ungeeigneten Gewebespots mit unzureichendem Tumorgehalt sind alle verwendeten TMA-Schnitte mit Antikörpern des Basalzell-Markers 34βE12 (Klon MA903, Dako; 1:12,5; pH 7,8) und p504s zu Detektion von AMACR (Klon 13H4, Dako, 1:200; pH 9,0) immunhistologisch gefärbt und von einem Pathologen ausgewertet worden. 2.4.3.2. ERG IHC Die Ergebnisse der ERG Überexpression entstammten früherer Studien137, 138 am Institut für Pathologie und wurden für die vorliegende Arbeit zu Korrelationszwecken zur Verfügung gestellt. Das Datenset der ERG IHC Ergebnisse am Prognose-TMA137 ist für die vorliegende Arbeit erweitert worden. 2.4.3.3. FOXP1 IHC Für den immunhistochemischen Nachweis von FOXP1 ist der polyklonale Antikörper #ab16645 von Abcam verwendet worden. Alle Arbeitsschritte sind im immunhistologischen Labor des Instituts für Pathologie durchgeführt worden. Die immunhistochemisch gefärbten TMAs erfolgte durch einen Pathologen. 56 Auswertung der Material & Methoden Kurzbeschreibung: Die frisch präparierten TMA-Schnitte wurden zunächst entparaffiniert und 20 Min. zur Antigen-Demaskierung (teilweise Wiederherstellung der Immunreaktivität) in der Retrieval-Lösung (pH 9) einer Dampfhitze (89°C) ausgesetzt. Der gebundene Antikörper ist mit EnVision™ Kit von DAKO detektiert worden. Auswertung: Die FOXP1 Expression wurde vorrangig im Nukleus beobachtet und in vier Kategorien eingeteilt: Die Färbeintensität des Antikörpers ist in vier Stufen gegliedert (keine Färbung, 1+, 2+, 3+) und der Anteil gefärbter Tumorzellkerne (%) ermittelt worden. Die vier Kategorien wurden durch einen Verbund beider Parameter in negativ (keine nukleäre Färbung), schwach (1+ Färbung in ≤ 70% der Tumorzellkerne oder 2+ Färbung in ≤ 30% der Tumorzellkerne), moderat (1+ Färbung in > 70% der Tumorzellkerne oder 2+ Färbung in >30% aber ≤ 70% der Tumorzellkerne) und stark (2+ Färbung in > 70% der Tumorzellkerne oder 3+ Färbung in > 30% der Tumorzellkerne) eingeteilt. 2.4.3.4. p53 IHC Das Datenset der p53 IHC stellte eine Teilmenge einer früheren Studie (Kluth et al.: Manuskript „Clinical significance of different types of p53 gene alteration in radically operated prostate cancer“ akzeptiert seit 01/2012 beim International Journal of Cancer)55 des Instituts für Pathologie dar und wurde für die vorliegende Arbeit zu Zwecken der Korrelationen zur Verfügung gestellt. 2.5. 2.5.1. Funktionelle Analysen an Prostata-Zelllinien Kultivierung von Konstrukt-haltigen E. coli Bakterien Verbrauchsmaterial: Pipettenspitzen (Sarstedt) Serologische Pipetten (Falcon) 1,5 ml Reaktions-Gefäße (Eppendorf) 1,8 ml Cryo-Gefäße (VWR) Zahnstocher, steril Labormaterial: Pipetten (Eppendorf) Pipettierhife „Pipetus“, elektrisch (Hirschmann Laborgeräte) Pinzette (VWR) 100 ml Erlenmeyerkolben (Schott Duran) 500 ml Erlenmeyerkolben (Schott Duran) Verwendete Geräte: Kulturen-Schüttler 3031 (GFL) Bunsenbrenner „Fireboy“ (Tecnomara AG) 57 Material & Methoden Analysewaagen PJ3000 und AE100 (Mettler-Toledo) Magnetrührer Ikamag RH (IKA) Benötigte Reagenzien: Glycerol-Stocks mit E. coli Bakterien (Tab. 5) Lysogeny broth-(LB)-Medium (Sigma-Aldrich) dH2O aus Reinstwasser-Anlage Astacus (MembraPure) Chloramphenicol, Cm (Sigma-Aldrich) Ampicillin Natriumsalz, Amp (Roth) Glycerol (Sigma-Aldrich) Ethanol, absolut (Merck) Anzusetzende Lösungen: • 1x LB-Medium 25 g 1l LB Medium dH20 LB Medium in dH2O lösen und autoklavieren Bei 4-8°C lagern • Chloramphenicol-Lösung (34 mg/µl) 34 mg Chloramphenicol 1 ml Ethanol, absolut Chloramphenicol in Ethanol lösen In Aliquots bei -20°C lagern • 60% Glycerol, steril 6 ml 4 ml Glycerol dH20 Glycerol mit dH2O verdünnen 320µl Aliquots in Cryo-Röhrchen abfüllen und autoklavieren Sterile Aliquots bei RT lagern • Ampicillin-Lösung (100 mg/µl) 1g Ampicillin Natriumsalz 100 ml dH2O Ampicillin Natriumsalz in dH2O lösen In 1ml Aliquots bei -20°C lagern 58 Material & Methoden 2.5.1.1. Kultivierung von E. coli Bakterien mit BAC-Konstrukten Durchführung: Vorkultur: Für die Vorkultur der BAC E. coli Bakterien sind 10 ml LB-Medium mit 30 µl Chloramphenicol-Lösung (Cm-LB Endkonzentration: 0,1 mg Cm/ml) versetzt worden. Unter sterilen Bedingungen wurde ein Abstrich aus dem gelieferten Glycerol-Stock abgenommen und dieser in Cm-LB-Medium überbracht. Die Inkubation erfolgte 8 h im Schüttler bei 37°C und 200 rpm. Hauptkultur: Zur Hauptkultivierung sind 2 ml der Bakterien-Vorkultur in 250 ml Cm-LB-Medium überimpft und ü. N. (16-18 Stunden) bei 37°C und 160 rpm inkubiert worden. Nach der Inkubation wurde die BAC-Plasmid-DNA nach Abschnitt 2.1.1.3. isoliert. Zur Archivierung ist 1 ml Bakterien-Kultur in einem sterilen Glycerol-Aliquot (320 µl) suspendiert und bei -80°C gelagert worden. 2.5.1.2. Kultivierung von E. coli Bakterien mit shRNA-, Expressions- und Luziferase-Konstrukten Durchführung: Zur Kultivierung von E. coli Bakterien mit shRNA-, Expressions und Luziferase-Konstrukten wurden 200 ml 1x LB-Medium mit 200 µl Ampicillin-Lösung versetzt (Amp-LB Endkonzentration: 0,1 mg Amp/ml) und die Bakterien steril (Pipettenspitze) aus dem Glycerol-Stock in das Amp-LB-Medium überbracht. Die Inkubation verlief über Nacht bei 37°C und 160 rpm. Nach der Inkubation ist die Plasmid-DNA nach Abschnitt 2.1.1.4. isoliert worden. 2.5.2. Anzucht, Pflege und Manipulation von Zellkulturen Zellkulturen sind aus dem Gewebeverband herausgelöste Zellen, die in einem geeigneten Medium über viele Generationen am Leben erhalten werden können und u. a. in vitroStudien dienen. So lassen sich z. B. durch Einbringung zellfremder Nukleinsäuren (Transfektion) Gene manipulieren (Überexprimieren, Herunterregulieren (Knockdown)) und deren Einfluss auf Wachstum, Differenzierung und Proliferation der Zellen untersuchen. Bei denen, für die funktionellen Studien verwendeten Zellkulturen handelte es sich um immortalisierte Prostata-Zelllinien (Tab. 10). Verbrauchsmaterial: Pipettenspitzen (Sarstedt) Serologische Pipetten (Falcon) 1,5 ml Reaktions-Gefäße (Eppendorf) 1,8 ml Cryo-Gefäße (VWR) 59 Material & Methoden 9 cm Petrischalen (VWR) Kulturflaschen, T75ml, T25ml (Sarstedt) Pasteurpipetten (Heinz Herenz GmbH) 6-Well-Platten (Sarstedt) Cellometer Einmal-Zählkammern (Peqlab) 33 mm Millex Filter Einheiten (Millipore) Labormaterial: Pipetten (Eppendorf) Pipettierhife „Pipetus“, elektrisch (Hirschmann Laborgeräte) Verwendete Geräte: Clean-Bench Hera Safe HS12 (Heraeus) Inkubator Heracell® 240 (Heraeus) 2k15 (Sigma-Aldrich) Analysewaage AE100 (Mettler-Toledo) Vakuum-Pumpe mit Saugflasche (ABM Greiffenberger Antriebstechnik) Invers-Mikroskop Wilovert S (Hund GmbH) Cellometer™ Auto T4 (Peqlab) Luminometer Centro LB 960 (Berthold Technologies) Verwendete Kits: Dual-Luciferase® Reporter Assay Kit (Promega) o Luziferase Assay Puffer II o Luziferase Assay Substrat o Stop & Glo® Puffer o Stop & Glo® Substrat o Lysispuffer Benötigte Reagenzien: Prostata-Zelllinien (siehe Tab. 10) Nach Abschnitt 2.1.1.4. isolierte shRNA-, Expressions- und Luziferase-Konstrukte (siehe Tab. 11 ,Tab. 12 und Tab. 13) Nuklease-freies dH2O (Sigma-Aldrich) Trypsin (Invitrogen) DMSO (Sigma-Aldrich) Fetales Kälber-Serum Gold , FCS (PAA) Penicillin/ Streptomycin, P/S (Invitrogen) Nicht-essentielle Aminosäuren, 100x MEM NEAA (Gibco) Natrium-Pyruvat (Gibco) RPMI 1640 Medium GlutaMAX™-I (Gibco) DMEM (High Glucose) Medium (Invitrogen) DPBS (Gibco) Opti-MEM® I (Invitrogen) Puromycin Di-Hydrochlorid (Sigma-Aldrich) Lipofectamine® 2000 (1mg/ml) (Invitrogen) Lineares Polyethylenimin, PEI (1mg/ml) (Polysciences) 5α-Androstan-17β-ol-3-one/ Dihydrotestosteron (DHT) (Sigma-Aldrich) Methanol (Merck) Giemsa (Merck) 60 Material & Methoden Anzusetzende Lösungen: • Puromycin-Lösung (10μg/μl) 100 mg Puromycin Di-Hydrochlorid dH20 10 ml Puromycin Di-Hydrochlorid in dH2O lösen Bei -20°C lagern • Vollmedium für Prostata-Zelllinien 500 ml RPMI Medium 1640+ GlutaMAX™- I 50 ml FCS 5,5 ml Natrium-Pyruvat 5,5 ml MEM NEAA (10x) 5,5 ml P/S Reagenzien zusammenführen und mischen Bei 4-8°C lagern, vor Verwendung anwärmen • Selektionsmedium (1,5μg Puromycin/μl) 566,5 ml Vollmedium 84,9 µl Puromycin-Lösung Puromycin-Lösung und Vollmedium mischen Verwendete Software: Cellometer Auto T4 3.3.0 (Nexcelom Bioscience) Tabelle 10. Für die Zellkulturversuche verwendete Prostata-Zelllinien AR = Androgenrezeptor Zelllinie Lieferant Bestellnummer Ursprung RWPE-1 BPH-1 DU-145 LNCaP PC-3 VCaP ATCC DSMZ ATCC ATCC ATCC ATCC #CRL-11609 #ACC 143 #HTB-81 #CRL-1740 #CRL-1435 #CRL-2876 Normale Prostataepithelzellen Prostataepithelzellen einer BPH Hirn-Metastase Lymphknoten-Metastase Knochen-Metastase Wirbelsäulen-Metastase 2.5.2.1. Hormonsensitiv? ja ja ~ ja ~ ja AndrogenrezeptorStatus (expremiert) ~ ~ expremiert ~ AR amplifiziert Anzucht und Pflege Durchführung: Zur Erstanzucht sind die angetauten Zellkultur-Stabstocks nach Ankunft in 5 ml Vollmedium bei 37°C und einer CO2-Konzentration von 5% im Inkubator kultiviert worden. Das Standard61 Material & Methoden Kulturvolumen lag anschließend bei 10 ml in T75-Kulturflaschen. Ein Mediums-Wechsel fand, nach Abhängigkeit der Zelldichte, alle zwei bis drei Tage statt. Die Zelldichte ist vor jedem Mediums-Wechseln am Invers-Mikroskop überprüft worden. Bei Konfluenz sind die Zellen mit 1 bis 2 ml Trypsin vom Boden des Kultur-Gefäßes gelöst und in frischem Vollmedium suspendiert worden. Zum Passagieren der Zellen ist 1/5 (2 ml) der Zellsuspension auf neue Kulturgefäße aufgeteilt und das Gesamtvolumen (10 ml) mit Vollmedium aufgefüllt worden. Zur Cryo-Archivierung der Zellen sind diese pelletiert und in 900 µL FCS und 100 µL DMSO aufgenommen worden. Die Bakterien -Suspension wurde 30 Min. bei -20°C gekühlt, über Nacht bei -80°C und anschließend im flüssigen Stickstoff gelagert. Für Experimente, die eine bestimmte Anzahl von Zellen erforderten, wurde das Cellometer der Firma Peqlab zur Bestimmung der Zellkonzentration verwendet und die Zellzahl nach Herstellerangaben im Handbuch „Cellometer Auto M10, Cellometer Auto T4 & Cellometer Auto T4 Plus User Manual“ (Stand: 2010) in Cellometer Einmal-Zählkammern ermittelt. 2.5.2.2. Assay zur Koloniebildung Der Kolonieformations-Assay oder auch klonogene Test ist ein in vitro Test, der das Überleben von Zellen, basierend auf ihrer Fähigkeit zu wachsen und Zellkolonien zu bilden, untersucht. Der Test prüft im Wesentlichen, ob sich Zellen unter einem gewissen Einfluss weiterhin ungehindert teilen können. Normalerweise werden klonogene Tests für die Untersuchung der Einflüsse von Zytostatika verwendet139, können aber auch für die Analyse unterschiedlicher Expressionsniveaus von Genen verwendet werden. Dazu wird die Expression der zu untersuchenden Gene, durch Einbringung geeigneter Konstrukte, in den Zellen vermittelt (z. B. über ein Expressions-Konstrukt) oder inhibiert (z. B. über ein shRNAKonstrukt). Der shRNA-vermittelte knock-down nutzt den natürlichen Prozess der RNA-Interferenz (RNAi). Es kommt zwischen den künstlich in die Zelle eingebrachten (meist durch Transfektion) shRNA-Vektoren und den vorhandenen mRNAs zu Wechselwirkungen, welche zu einer Degradation dieser führen und so die Proteinsynthese verhindern140. 2.5.2.2.1. Transfektion mit Lipofectamine® 2000 Vorarbeiten: Für die Auswahl geeigneter shRNA-Konstrukte zur Depletion von FOXP1, RYBP und SHQ1 sind je fünf verschiedene shRNAs über eine lentivirale Transfektion ausgetestet worden. Diese Vorarbeiten wurden am Institut für Pathologie von Herrn PD Dr. med. Hüseyin Sirma (S2-berechtigt) durchgeführt. 62 Material & Methoden Durchführung: Für die Transfektion von shRNA- oder Expressions-Konstrukten sind 2x105 Zellen pro Well (gut suspendiert in Vollmedium) in 6-Well Platten (Kulturvolumen: 2 ml) ausgesät und ü. N. kultiviert worden. Vor der Transfektion ist das Vollmedium gegen ein entsprechendes Volumen Opti-MEM® I ausgetauscht und der Transfektions-Mix „Lipofectamine® 2000 Expression“ bzw. „Lipofectamine® 2000 Depletion“ nach folgenden Angaben hergestellt worden: • Transfektions-Mix "Lipofectamine® 2000" Expression (für 1 Well) 4 µg Expressions-Konstrukt (Tab. 11) 1 µg pLKO-shGFP 100 µl Opti-MEM® I 8 µl Lipofectamine® 2000 • Transfektions-Mix "Lipofectamine® 2000" Depletion (für 1 Well) 4 µg shRNA-Konstrukt (Tab. 12) 100 µl Opti-MEM® I 8 µl Lipofectamine® 2000 Nach einer 20-minütigen Inkubation des Transfektions-Mixes bei RT sind 100 µl des Ansatzes „Lipofectamine® 2000“ in jedes Well pipettiert und in Kreuzbewegungen verteilt worden. Die Inkubation erfolgte 8-10 Stunden bei 37°C im Inkubator. Nach der Inkubation wurde der Transfektions-Mix gegen Vollmedium ausgetauscht und für ca. 36 Stunden kultiviert. Zur antibiotischen Selektion sind die Zellen anschließend in 2 ml SelektionsMedium kultiviert worden. Als Leerkontrollen dienten Wells, die ohne Konstrukte prozessiert wurden. 2.5.2.2.1.1. Überexpression Da sich die verwendeten Expressions-Konstrukte in ihrer Antibiotikaresistenz unterschieden haben, wurden die Zellkulturen mit pLKO-shGFP Konstrukt kotransfiziert, um eine einheitliche Selektion über Puromycin zu ermöglichen. Die Prostata-Zelllinien PC-3 und BPH-1 sind nach den Angaben in Abschnitt 2.5.2.1. kultiviert und nach Abschnitt 2.5.2.2.1. je mit einem Expressions-Konstrukt für FOXP1141, SHQ1142, RYBP, PTEN143 bzw. RB1144 und shGFP kotransfiziert worden. Die Expressions-Konstrukte für FOXP1, RYBP und ERG sind freundlicherweise von anderen Arbeitsgruppen (AG) zur Verfügung gestellt, die Konstrukte für SHQ1, RB1 und PTEN hingegen kommerziell erworben worden. Die verwendeten Expression-Konstrukte sind in Tab. 11 aufgelistet. Als Kontrolle diente shGFP. 63 Material & Methoden Tabelle 11. Expressions-Konstrukte Vektoren cDNA Quelle pCDNA3 pAAV-CMV pCMV pSG5L-HA pSG5L-HA pMSCV FOXP1 RYBP SHQ1 RB1 PTEN ERG AG Banham, Universität Oxford, England AG Trepel, Universität Hamburg, Deutschland Origene (#SC113691) addgene (# 10720) addgene (#10750) Dr. Pandolfi, Harvard Medical School, Maryland, USA 2.5.2.2.1.2. Depletion Die Depletions-Effizienz der verwendeten shRNA-Konstrukte ist über eine Real Time quantitative PCR (Daten nicht gezeigt) ermittelt worden. Die Prostata-Zelllinie BPH-1 wurde nach den Vorgaben in Abschnitt 2.5.2.1. kultiviert und nach Abschnitt 2.5.2.2.1. mit den Konstrukten shFOXP1, shSHQ1, shRYBP, shPTEN, shRB1 und shGFP (als Kontrolle) transfiziert. Die verwendeten shRNA-Konstrukte sind in Tab. 12 zusammengefasst und bis auf pLKO-shGFP bei Sigma-Aldrich erworben worden. Das pLKO-shGFP Konstrukt wurde freundlicherweise von Prof. Roger Everett (MRC, University of Glascow, Centre of Virus Research, UK) zur Verfügung gestellt. Tabelle 12. shRNA-Konstrukte TRC = The RNAi Consortium des BROAD Institute Vektor pLKO.1 pLKO.1 pLKO.1 pLKO.1 pLKO.1 pLKO.1 shRNA gerichtet gegen FOXP1 RYBP SHQ1 PTEN RB1 GFP TRC Nummer Region siRNA Zielsequenz TRCN0000015664 TRCN0000007943 TRCN0000122853 TRCN0000002746 TRCN0000295892 nontargeting sequence CDS (Exon 7) 3' UTR CDS (Exon 5) CDS (Exon 5) CDS (Exon 16) GCAGCAAGTTAGTGGATTAAA GCCAAGTATTCGTGTAAATTA GCCAAGTTTGATCCTGATCAT CCACAGCTAGAACTTATCAAA GTGCGCTCTTGAGGTTGTAAT CAACAAGATGAAGAGCACCAA Bei allen Ansätzen dienten außerdem Leerwells ohne Konstrukte als Überwachung der Selektion. 2.5.2.2.2. Bei beiden Detektion der Zellkolonien Koloniebildungs-Assays wurden alle zwei Tage ein Wechsel des Selektionsmediums durchgeführt. Nach einer Wachstumssphase von ca. zehn Tagen ist das Selektionsmedium entfernt und die Zellen mit PBS gewaschen worden. Anschließend wurden sie mit Methanol (1,5 ml) überschichtet und 2 Min. inkubiert. Nach Entfernung des Methanols sind die Zellen mit Giemsa überschichtet (1 ml) und erneut 2 Min. inkubiert worden. Überschüssiges Giemsa wurde entfernt 64 und die Zellen ausgiebig mit Material & Methoden Leitungswasser gespült. Nach vollständiger Trocknung sind die Kolonien ausgezählt worden. Jeder Ansatz wurde im Duplikat durchgeführt. 2.5.2.3. Dualer Luziferase Reportergen-Assay Mit dem Luziferase-Assay lässt sich der Einfluss bestimmter Stimulanzien auf regulative Sequenzen von Genen (z. B. Promotoren) untersuchen. Dieser Assay nutzt Konstrukte mit einklonierten Luziferasen und einem gewünschten Promotor, die in eine Zelle eingebracht werden und dort Luziferase transkribieren. Nach Zugabe von Luziferin wird durch die enzymatische Reaktion der Luziferase u. a. Licht emittiert, welches mit einem Luminometer in relativen Lichteinheiten (relative light units, RLU) gemessen werden kann. Die Lichtemission ist dabei proportional zur Luciferasemenge im Ansatz, was einen Rückschluss auf die Aktivität des Promotors erlaubt. Beim dualen Reportergen-Assay werden zwei Luziferase-Konstrukte kotransfiziert. Die eingesetzten Reporter-Konstrukte beinhalteten die Luziferasen aus Photinus pyralis (Leuchtkäfer bzw. „Firefly“) und aus Renilla renifomis (Seefeder). Die Aktivitäten der Photinus- und Renilla-Luziferase werden über eine induzierte enzymatische Reaktion kurz hintereinander in einem Versuchsansatz gemessen und gegeneinander normalisiert. Auf diese Weise können Pipettier-Ungenauigkeiten, Unterschiede in der Zelllyse und –viabilität und des Transfektionseffizienz ausgeglichen werden. Zur Einbringung der Luziferase-Konstrukte wurde das kationische Polymer Polyethyleninim (PEI) verwendet. Der Luziferase Reportergen-Assay ist mit dem „DualLuciferase® Reporter Assay Kit“ von Promega durchgeführt worden. Die Ergebnisse wurden als Ratio der RLUs der Photinus- und der Renilla-Luziferase berechnet und angegeben. 2.5.2.3.1. Transfektion mit Polyethylenimin (PEI) Durchführung: Für die Kotransfektion vom Photinus-Reporter Konstrukt und der Renilla-Kontrolle sind 5x104 Zellen pro Well (in Vollmedium) in 24-Well (Kulturvolumen: 0,5 ml) Platten ausgesät und ü. N. kultiviert worden. Vor der Transfektion wurde ein Mastermix-Mix nach folgenden Angaben hergestellt: • Transfektions-Mix "PEI" (für 1 Well) 4 µg Photinus Reporter-Konstrukt (Tab. 13 ) 1 µg pCMV-Renilla 1 ml RPMI 1640 8 µl Polyethylenimin 65 Material & Methoden Tabelle 13. Luziferase-Konstrukte MMTV = mouse mammary tumor virus Promotor Kontrukt PSA Probasin MMTV FOXP1 GAPDH Luziferase Quelle Leuchtkäfer (Photinus pyralis ) pGL3_PSA540 ARR3-tk-luc/tk81-PB3 " MMTV-luc " pGL4_luc2_FOXP1 " pGL4_luc2_GAPDH " pCMV–Renilla Seefeder (Renilla reniformes ) Dr. Schüle, Universität Freiburg, Deutschland " " Switchgear Genomics, CA, USA (#S108333) Switchgear Genomics, CA, USA (#S121624) Heinrich Pette Institut, Hamburg, Deutschland Nach einer 20-minütigen Inkubation des Ansatzes bei RT sind 400 µl TransfektionsMastermix „PEI“ in jedes Well pipettiert und in Kreuzbewegungen verteilt worden. Die Inkubation erfolgte ü. N. bei 37°C im Inkubator. 24 h nach der Transfektion ist den Zellen für 24 h ein Vollmedium mit 100nM Dihydrotestosteron (DHT) zugeführt worden. 2.5.2.3.1.1. Dualer Luziferase Genreporter-Assay Durchführung: Nach der Inkubation mit DHT wurden die Zellen im Luziferase Assay Puffer II durch Pipettieren suspendiert, lysiert und die Luziferase-Aktivitäten über das „Dual- Luciferase®Reporter Assay System“ von Promega nach den Herstellerangaben im Handbuch „Dual-Luciferase®Reporter Assay System“ (Stand: Juni 2011) induziert. Die Messung der relativen Lichteinheiten wurde an einem Luminometer gemessen. Alle Ansätze sind im Duplikat durchgeführt worden. 2.6. Statistik Für alle statistischen Analysen wurde die JMP 9.0 Software der Firma SAS (SAS Institute Inc., NC, USA) verwendet. Für den Vergleich von zwei oder mehreren Markern wurden Kontigenztafeln berechnet. Die Signifikanz-Berechnung erfolgte über einen chi² (Likelihood) Test. Das PSA Rezidiv-freie Überleben wurde in Kaplan Meier Kurven dargestellt; der Vergleich der Überlebenskurven erfolgte über einen Logrank-Test. Die COX Hazard Regressions-Analyse wurde durchgeführt, um die statistische Signifikanz und Unabhängigkeit zwischen klinischen, pathologischen und molekularen Parametern zu berechnen. 66 Ergebnisse 3. Ergebnisse 3.1. Identifizierung der Kopiezahl-Veränderungen beim Prostatakarzinom Die DNA-Profilierung der 77 Prostatakarzinome zeigte ein variables Ausmaß der KopiezahlVeränderungen. In sieben Proben konnten keine CNV detektiert werden. Diese gehörten zu Tumoren mit einem Gleason Grad von ≤3+4. Bei 36 bzw. 19 Tumorproben waren wenige (1 bis <4) bzw. vermehrt (4-6) Chromosomen von CNV betroffen. 15 Proben zeigten hingegen CNV bei mehr als sechs Chromosomen. Diese gehörten zu Tumoren mit einem Gleason Grad von ≥4+3. Es konnten eine ganze Reihe von Zytobanden identifiziert werden, an denen bevorzugt Deletionen auftraten (Abschnitt 3.1.1) und solche, an denen vermehrt Zugewinne (Abschnitt 3.1.2) vorlagen. Des Weiteren wiesen einige Zytobanden variable Kopiezahl-Veränderungen auf, die sowohl Zugewinne als auch Verluste zeigten (Abschnitt 3.1.3). Generell lagen bei den untersuchten Prostatakarzinomen um den Faktor fünf häufiger chromosomale Verluste als Zugewinne vor. Amplifikationen waren nicht zu finden. 3.1.1. Kopiezahl-Verluste beim Prostatakarzinom Bis auf wenige Ausnahmen war nahezu jedes Chromosom von Kopiezahl-Verluste betroffen (Abb. 14). Selten lagen Verluste auf den Chromosomen 9, 14, 18 und 19 vor. Die KopiezahlVerluste erstreckten sich durchschnittlich über 50 MB große Intervalle (4 bis 152 MB). Die darin enthaltenen Peaks lagen in einer Größenordnung von 1,4 MB (0,13 bis 6,7 MB) und umfassten im Durchschnitt 31 Gene. Zwei Deletionen fielen jedoch durch ihr kleines Ausmaß (< 600 kb) und ihr häufiges Auftreten (in mehr als 18% der analysierten Proben) auf. Dies waren Deletionen an den Zytobanden 3p13 und 10q23. Die detaillierte Analyse der Kopiezahl-Verluste (schloss nur solche Zytobanden ein, die mindestens in sechs Tumorproben betroffen waren) zeigte, dass die häufigsten KopiezahlVerluste an den Zytobanden 10q23.31 (19,5%) und 15q11.2-q11.1 auftraten. An Zytobande 10q23 waren das Tumorsuppressorgen PTEN59 und das putative Tumorsuppressorgen KLLN („killin“)145 lokalisiert. Die Verluste an Zytobande 15q11 wiesen auf die natürlichen CNV der dort lokalisierten olfaktorischen Rezeptoren hin146. Des Weiteren sind Bruchpunkte 67 Ergebnisse mit Kopiezahl-Verlusten am KANSL1 Lokus an der Zytobande 17q21.31 (18,2%) und Deletionen mit komplexen Mustern an Zytobande 3p13 (18,2%) detektiert worden. KANSL1 („KAT8 regulatory NSL complex subunit 1“) stellt einen häufigen (nicht nur beim Prostatakarzinom auftretenden) Bruchpunkt dar und ist im Allgemeinen mit dem 17q21.31 Mikrodeletions/Mikroduplikations-Syndrom147 assoziiert. Weitere Kopiezahl-Verluste lagen an 5q21.1 (16,9%, Tumorsuppressorgen CHD165) und 6q15 (16,9%, Tumorsuppressorgen MAP3K767) vor. Ebenfalls in 16,9% der Tumoren traten Verluste an 14q11.2 (olfaktorische Rezeptoren) und 16q24.1 auf. Mit 15,6% war die Zytobande 5q13.2 (putatives Tumorsuppressorgen CDK7 („cyclin-dependent kinase 7“)148) betroffen. Abbildung 14. Ideogramm mit genomischen Verlusten beim Prostatakarzinom Die Verluste sind linksseitig der Chromosomen als blaue Balken dargestellt. Die Darstellung umfasst nur klinische Proben. Die roten Sektoren stellen Vergrößerungen der Kopiezahl-Veränderungen an den Zytobanden 2q37 (I), 3p13 (II), 10q23 (III) und 14q11 (IV) dar. 68 Ergebnisse Des Weiteren sind in je 14,3% der Prostatakarzinome Kopiezahl-Verluste an 12p13.2-p13.1 (putativer/s Tumorsuppressorgen/Translokationsgen ETV6 („ets variant 6“)149, Tumorsuppressorgen CDKN1B („cyclin-dependent kinase inhibitor 1B (p27, Kip1)“ 150 , 151 ) und 21q22.3 (Translokationsgen: TMPRSS268) nachgewiesen worden. In je zehn (13%) Tumoren konnten Verluste an den Zytobanden 2q21.2 (putatives Tumorsuppressorgen LYPD1 („LY6/PLAUR domain containing 1“)152, putatives Translokationsgen NCKAP5 („NCKassociated protein 5“)153), 2q37.3 (putative Tumorsuppressorgene: ING5 („inhibitor of growth family, 5”)154 member und NEU4 („sialidase (Tumorsuppressorgene: KLF5 („Krüppel-like factor 5“) 1 (Drosophila)“ 157 homeobox 3“)158, 159 156 4“)155), 12p13.32, 13q22.1 und DACH1 („dachshund homolog ) und 16q22.2-q22.3 (Tumorsuppressorgen: ZFHX3 („zinc finger ) festgestellt werden. Die Zytobanden 8p21.3 (Tumorsuppressorgene: LPL („lipoprotein lipase“)160 und NKX3.152, 53), 13q14.1 (Tumorsuppressorgen RB156, 57) und 17q21.31 (BRCA1, ETV4 und UBTF) waren in 11,7% der Prostatakarzinome von KopiezahlVerlusten betroffen. Dieser zweite Peak an 17q21.31 lag 2 MB zentromerisch vom bereits beschriebenen KANSL1 Lokus. Für ETV4 ("ets variant 4“) und UBTF („upstream binding transcription factor, RNA polymerase I“) sind bereits Fusionen beim Prostatakarzinom beschrieben worden161. Tumorsuppressorgen BRCA1 („breast cancer 1, early onset“) ist ein 162 , dem vor kurzem auch eine wichtige Rolle (Deletionen, Mutationen) beim Prostatakarzinom zugeschrieben wurde163, 164 . 8p22 war in 10,4% der Fälle deletiert und schloss das putative Tumorsuppressorgen MSR1 („macrophage scavenger receptor 1“)165 ein. In je sieben Tumorproben (9,1%) lagen Verluste an den Zytobanden 2p21 (putatives Translokationsgen THADA („thyroid adenoma associated“)166), 8p11.21, 8q24.3, Xq23 (putatives Tumorsuppressorgen STAG2 („stromal antigen 2“) 167 ) und Xq25 vor. Mit 7,8% waren 1q42.2-42.3 (putatives Tumorsuppressorgen: ARID4B („AT rich interactive domain 4B (RBP1-like)” 168 combs like 2 (Drosophila)” ), 2p32.2 (putatives Translokationsgen: ASXL2 (“additional sex 169, 170 ) und 17p13.1 (Tumorsuppressorgen: TP53 (“tumor protein p53”)171) betroffen. Die Ergebnisse der Kopiezahl-Verluste sind in Tabelle 14 zusammengefasst. 69 Ergebnisse Tabelle 14. Kopiezahl-Verluste der 77 Prostatakarzinome (Auswertung erst ab sechs betroffenen Tumorproben) Unterstrichene Gene sind nicht im Peak lokalisiert, sondern liegen direkt angrenzend (Tabelle wird auf den nächsten drei Seiten weitergeführt), cb = Zytobande, MB = Megabase, bp = Basenpaar. * Detaillierte Auflistung der Peaks an Zytobande 3p13, insgesamt sind 14/77 (18,2%) Tumoren an 3p13 Deletionen beteiligt. Start [cb] Ende [cb] IntervalLänge [MB] 1q32.3 1q44 2p24.1 Proben Peak Peak Länge mit Peak Häufigkeit [bp] [n] [% ] Peak Anzahl in Gene / GISTIC davon kodierend Analys e Betroffene Zelllinen (Putative) TumorsuppressorGene PC-3 (ARID4B) Peak Start Peak [bp] Ende Peak [bp] 38 1q42.2-q42.3 234.468.324 235.754.088 1.285.764 6 7,8 26 / 10 2p23.3 9 2p23.3 25.969.729 26.253.320 283.591 6 7,8 7/2 2p23.1 2p16.1 28 2p21 42.850.585 43.521.167 670.582 7 9,1 8/5 ja 2q12.1 2q32.3 89 2q21.2 133.056.803 133.969.758 912.955 10 13,0 7/3 (ja) 2q21.3 (LYPD1) 2q36.3 2q37.3 16 2q37.3 242.725.752 243.048.760 323.008 10 13,0 6/5 ja (ING5 ), (NEU4 ) 3p14 3p12.3 13 3p13* 71.432.139 71.745.688 313.549 10 13,0 2/2 (FOXP1) " " " 3p13* 72.432.968 72.558.999 126.031 10 13,0 1/1 (RYBP) " " " 3p13* 72.818.646 72.949.375 130.729 10 13,0 4/2 3p13 3p12.3 6 3p12.3 75.439.781 75.516.091 76.310 15 19,5 5/0 70 ja CNV assoziiert mit ASXL2 (putatives Translokationsgen) ja LNCaP THADA (putatives Translokationsgen) NCKAP5 (putatives Translokationsgen) (SHQ1) Artefakt Ergebnisse Fortsetzung Tabelle 14. Ende [cb] IntervalLänge [MB] Peak 5q11.2 5q31.2 87 5q13.2 70.753.934 72.843.780 2.089.846 12 15,6 27 / 15 " " " 5q21.1 98.135.462 100.128.605 1.993.143 13 16,9 6q11.1 6q22.33 67 6q15 90.973.159 94.574.869 3.601.710 13 8p23.3 8q11.21 50 8p22 14.089.730 16.628.724 2.538.994 " " " 8p21.3 16.634.563 23.344.403 " " " 8p11.21 41.938.238 8q11.1 8q24.3 99 8q24.23 " " " 59 10q22.2 10q26.3 Betroffene Zelllinen (Putative) TumorsuppressorGene ja PC-3, VCaP (CDK7) 12 / 2 ja VCaP CHD1 16,9 9/2 (ja) 6q16.1 LNCaP MAP3K7 8 10,4 11 / 3 VCaP (MSR1 ) 6.709.840 9 11,7 85 / 30 (ja) 8p22 VCaP LPL, NKX3.1 42.224.155 285.917 7 9,1 7/4 ja 137.681.619 137.862.435 180.816 12 15,6 0 8q24.3 140.544.962 142.978.944 2.433.982 7 9,1 14 / 12 10q23.31 89.579.599 90.150.837 571.238 15 19,5 4/3 Start Peak [bp] Ende Peak [bp] Proben Peak Peak Länge mit Peak Häufigkeit [bp] [n] [% ] Peak Anzahl in Gene / GISTIC davon kodierend Analys e Start [cb] 71 CNV assoziiert mit Artefakt ja LNCaP, PC-3 PTEN, (KLLN) Ergebnisse Fortsetzung Tabelle 14. Start [cb] Ende [cb] 12p13.33 12p11.22 IntervalLänge [MB] Peak 30 12p13.32 Start Peak [bp] 3.426.826 12p13.2-p13.1 11.776.232 Ende Peak [bp] Proben Peak Peak Länge mit Peak Häufigkeit [bp] [n] [% ] Peak Anzahl in Gene / GISTIC davon kodierend Analys e (ja) Betroffene Zelllinen 3.959.963 533.137 10 13,0 6/3 12p13.3 3 PC-3 14.633.223 2.856.991 11 14,3 38 / 22 ja PC-3 (ja) 13q14.2 " " " 13q11 13q34 66 13q14.11 43.487.452 44.708.720 1.221.268 9 11,7 8/5 13q12.3 13q34 82 13q22.1 71.853.723 76.117.653 4.263.930 10 13,0 23 / 9 14q11.2 20.211.644 20.383.582 171.938 13 16,9 10 / 4 ja RWPE1 15q11.1-q11.2 20.564.575 22.588.019 2.023.444 15 19,5 47 / 5 ja VCaP 16q22.2-q22.3 72.855.844 73.612.269 756.425 10 13,0 2/2 13 16,9 9/7 6 7,8 93 / 69 16p11.2 16q24.3 " " 17p13.3 17p11.2 55 " 16q24.1 84.774.120 85.679.484 905.364 17 17p13.1 6.362.733 7.825.574 1.462.841 72 CNV assoziiert mit (ETV6) , CDKN1B RB1 LNCaP, VCaP VCaP, LNCAP ja (Putative) TumorsuppressorGene DACH1, KLF5 Olfaktorische Rezeptoren Olfaktorische Rezeptoren; MMS: NIPA1 (Prader-Willi/Angelmann Syndrom) ZFHX3 VCaP, LNCAP VCaP, LNCAP, PC-3 TP53 Ergebnisse Fortsetzung Tabelle 14. Start [cb] Ende [cb] 17q11.2 17q21.31 " Peak 17 17q21.31 42.223.068 42.860.326 637.258 9 11,7 20 / 18 17q21.31 44.165.803 44.353.885 188.082 14 18,2 5/2 ja 4 21q22.3 42.215.832 42.871.220 655.388 11 14,3 8/6 ja ja " 21q22.2 21q22.3 Start Peak [bp] Ende Peak [bp] Proben Peak Peak Länge mit Peak Häufigkeit [bp] [n] [% ] Peak Anzahl in Gene / GISTIC davon kodierend Analys e IntervalLänge [MB] Xp22.33 Xq28 152 Xq23 114.864.364 115.020.940 156.576 7 9,1 2/2 " " " Xq25 120.652.880 125.529.977 4.877.097 7 9,1 27 / 8 3.1.1.1. Betroffene Zelllinen (Putative) TumorsuppressorGene CNV assoziiert mit LNCaP BRCA1 ETV4 , UBTF ( Fusionspartner von ETV4) MAPT , KANSL1 ruptiert (Bruchpunkt 17q21.31 Microdeletion Syndrom) DU-145 TMPRSS2 (Translokationsgen) VCaP VCaP (STAG2) GISTIC Analyse – Kopiezahl-Verluste Die unabhängige GISTIC-Analyse der SNP-Array Daten bestätigte einen Großteil der rekurrenten Kopiezahl-Verluste. Für die Zytobanden 2p23.3, 8p21.3, 8q24.3, 13q21.1, 16q22.-22.3, 17p13.1, 17q21.31 (zweiter Peak an dieser Zytobande) und Xq25 konnten keine signifikanten Peaks ermittelt werden. Die Intensität der Segmente (Segment Mean) an diesen Zytobanden lag durchschnittlich unter 0,3 und fiel daher möglicherweise unter die Signifikanz-Schwelle der GISTIC Analyse (Abb. 15). 73 Ergebnisse Abbildung 15. Ergebnisse der GISTIC Analyse – Verluste Die roten Linien markieren die, als „rekurrent deletiert“ identifizierten Zytobanden der DNA-Chip Analyse, * Artefakte, + rekurrente Kopiezahl Verluste, die unter dem Auswertungs-Schwellenwert der DNA-Chip Analyse liegt (n < 6), (+) Kopiezahl-Verluste in weniger als drei Tumorproben, die durch ein zusätzliches Artefakt signifikant hervortreten. 74 Ergebnisse 3.1.2. Kopiezahl-Zugewinne beim Prostatakarzinom Die genomische Profilierung der 77 Prostatakarzinome zeigte, dass im Allgemeinen nur wenige Chromosomen von Kopiezahl-Zugewinnen betroffen waren (Abb. 16). In die detaillierte Auswertung wurden nur solche Kopiezahl-Zugewinne einbezogen, die in mindestens sechs Tumorproben auftraten. Rekurrent betroffen waren die Chromosomen 8, 9, 14, 15, 16, 17, 16, 18 und Y, wobei sich die Veränderung zumeist über weite Intervalle zwischen 0,4 und 104 MB (MB = Megabasen, Mittelwert: 52 MB) erstreckten. Innerhalb dieser Intervalle sind 0,4 bis 4,0 MB (Mittelwert: 1,4 MB) breite Peaks identifiziert worden, in denen durchschnittlich 17 Gene lokalisiert waren. Häufige Zugewinne (22,1 % der Prostatakarzinome) wurden an der Zytobande 17q21.31 verzeichnet. Weitere Zugewinne sind an den Zytobanden 14q11.2 (19,5%) und 15q11.2 (18,2%) identifiziert worden. Diese umfassten eine Vielzahl von olfaktorischen Rezeptoren und Pseudogenen, die natürlichen Kopiezahl-Veränderungen unterliegen146. Veränderungen an Zytobande 15q11.2 sind außerdem mit dem Angelman/Prader-Willi-Syndrom assoziiert. Zusätzlich konnten noch Kopiezahl-Zugewinne an den Zytobanden 8p23.3-p23.2 (18,2%), 8p11.22 (14,3%), 8p11.21, (13%), 16p11.1 (13,0%, assoziiert mir Mikrodeletionen und duplikationen172, 173), 8p12 (11,7%), 8q24.22-q24.23 (11,7%), 9p21.3 (11,7%), 8p22 (10,4%) und 18q22.1 (7,8%) nachgewiesen werden. Der Peak an Zytobande 8p11.21 fasste das bekannte Onkogen FGFR1 („fibroblast growth factor receptor 1“) ein50, 174, 175. An 8p12 war DUSP26 („dual specificity 176 Schilddrüsenkrebs phosphatase und in Neuroblastomen 177 26 (putative)“) lokalisiert, dass bei bereits als putatives Onkogen beschrieben wurde und als Phosphatase sowohl p38, als auch p53 phosphoryliert, um deren Tumorsuppressor-Funktion zu inhibieren. Ein weiterer Peak an den Zytobanden 8q24.22q24.23 lag neben dem Onkogen MYC („v-myc myelozytomatosis viral oncogene homolog (avian)“) 46, 178 und schloss WISP1 („WNT1 inducible signaling pathway protein 1“) 179 ein, welches die p53-vermittelte Apoptose blockiert und ebenfalls als Onkogen gilt. Alle Ergebnisse der Kopiezahl-Verluste sind in Tabelle 15 zusammengefasst. 75 Ergebnisse Abbildung 16. Ideogramm mit genomischen Zugewinnen beim Prostatakarzinom (identifiziert über DNAChip Analyse) Die Genkopiezahl-Zugewinne sind rechtsseitig der Chromosomen als rote Balken dargestellt. Die Darstellung umfasst nur klinische Proben. Die blauen Sektoren stellen Vergrößerungen der KopiezahlVeränderungen an den Zytobanden 14q11 (I), 16p11 (II) und 17q21 (III) dar. Auf Chromosom Y wurden massive Zugewinne in nahezu 70% der untersuchten Tumorproben detektiert. Sie betrafen 26 MB des 59 MB großen Chromosoms und reichten vom p-Arm bis in den q-Arm. Die Abdeckung der abgefragten Chip-Datenpunkte war auf diesem Chromosom recht spärlich und betrug in dem 26 MB langen Abschnitt nur ca. 230 Marker. Dies entsprach einer ungefähren Auflösung von 100 kb und lag damit weit über der durchschnittlichen Auflösung der DNA-Chips von 1 kb, so dass die Zugewinne auf Chromosom Y mit Vorsicht zu betrachten waren. Eine zusammenfassende Darstellung der Ergebnisse der Kopiezahl-Zugewinne ist in Tabelle 15 gezeigt. 76 Ergebnisse Tabelle 15. Kopiezahl-Zugewinne der 77 Prostatakarzinome (Auswertung erst ab sechs betroffenen Tumorproben) Unterstrichene Gene sind nicht im Peak lokalisiert, sondern liegen direkt angrenzend. Die rot markierten Zytobanden sind aus der allgemeinen Analyse der Kopiezahl-Zugewinne ausgeschlossen worden, cb = Zytobande, MB = Megabase, bp = Basenpaar. (Tabelle wird auf der nächsten Seite weitergeführt) Ende [cb] IntervalLänge [MB] 8p23.3 8p11.1 46 8p23.3-p23.2 161.222 2.380.081 2.218.859 14 18,2 16 / 10 ja 8p23.2 8q13.2 68 8p22 13.866.640 17.964.559 4.097.919 8 10,4 27 / 15 ja " " " 8p12 32.217.554 35.276.729 3.059.175 9 11,7 20 / 7 ja " " " 8p11.22 38.165.072 39.021.035 855.963 11 14,3 " " " 8p11.21 41.870.250 43.150.374 1.280.124 10 8q11.21 8q24.3 104 8q24.22-q24.23 133.423.607 135.372.740 1.949.133 9p24.3 9q22.31 96 9p21.3 21.773.167 23.860.330 2.087.163 14q11.2 20.211.644 20.389.721 15q11.2 22.351.239 22.588.019 15q11.2 15q11.1 2,7 Peak Start Peak [bp] Ende Peak [bp] Proben Peak Peak Länge mit Peak Häufigkeit [bp] [n] [% ] Peak Anzahl in Gene / GISTIC davon kodierend Analys e Start [cb] Betroffene Zelllinen (Putative) Onkogene DU-145 LNCaP (DUSP26 ) 13 / 10 LNCaP, VCaP FGFR1 13,0 33/18 LNCaP 9 11,7 20 / 11 ja VCaP, PC-3 9 11,7 13 / 6 ja VCaP 178.077 15 19,5 3/3 ja 236.780 14 18,2 10 / 2 ja 77 CNV assoziiert mit WISP1, c-MYC Olfaktorische Rezeptoren DU-145, PC-3 Olfaktorische Rezeptoren; MMS: NIPA1 (Prader-Willi/Angelmann Syndrom) Ergebnisse Fortsetzung Tabelle 15. Start [cb] Ende [cb] IntervalLänge [MB] Peak Start Peak [bp] Proben Peak Peak Länge mit Peak Häufigkeit [bp] [n] [% ] Peak Anzahl in Gene / GISTIC davon kodierend Analys e Betroffene Zelllinen (Putative) Onkogene CNV assoziiert mit 16p11.2-p11.1 34.592.035 34.652.122 60.087 10 13,0 4/0 ja DU-145 MMS: (z.B. Autismus) 44.208.674 44.280.697 72.023 17 22,1 1/1 ja LNCaP MMS: MAPT , KANSL1 ruptiert (Bruchpunkt 17q21.31 Microdeletion Syndrom) 19.563.894 11.004.107 53 68,8 17q21.31 17q21.31 0,4 17q21.31 Yp11.31 Yq11.23 26 Yp11.2-q11.221 8.559.787 3.1.2.1. Ende Peak [bp] Y nicht in GISTIC berechnet DU-145, LNCaP, VCaP GISTIC Analyse - Kopiezahl-Zugewinne Die unabhängige GISTIC-Analyse der SNP-Array Daten zeigte eine Vielzahl von Artefakten, die auf wenige, aber übermäßig stark hybridisierte, SNP-Datenpunkte auf den Arrays zurückzuführen waren. Diese Artefakte lagen zumeist in genleeren Abschnitten von durchschnittlich 18 kb Länge. Die über die FISH Oracle Datenbank identifizierten, rekurrenten Kopiezahl-Zugewinne sind von der GISTIC Analyse mit einer Ausnahme (8p11.21) als signifikant bestätigt worden. Die graphische Darstellung der GISTIC Analyse ist in Abbildung 17 gezeigt. 78 Ergebnisse Abbildung 17. Ergebnisse der GISTIC Analyse - Zugewinne Die roten Linien markieren die Zytobanden, die nach der DNA-Chip Analyse rekurrent auftraten, * Artefakte, + rekurrente Kopiezahl-Zugewinne, die unter dem Auswertungs-Schwellenwert der DNA-Chip Analyse liegen (n < 6), (+) Kopiezahl-Zugewinne in weniger als drei Tumorproben, die durch ein zusätzliches Artefakt signifikant hervortreten. 79 Ergebnisse 3.1.3. Zytobanden mit variablen Kopiezahl-Veränderungen Es wurden bei der Auswertung der DNA-Chips vier Zytobanden identifiziert, an denen vermehrt Kopiezahl-Verluste oder auch -Zugewinne vorlagen. Dies waren die Zytobanden 8p22, 14q11.2, 15q11.2 und 17q21.31. Für die Zytobanden 14q11.2 und 15q11.2 sind natürliche CNV der dort lokalisierten olfaktorischen Rezeptor-Gene bekannt. Es ist anzunehmen, dass diese Zytobanden wenig Tumor-relevant sind, da sie sehr wahrscheinlich auch in gesunden Geweben Kopiezahl-Varianzen aufweisen. Für 15q11.2 ist außerdem eine Assoziation zum Angelman/Prader-Willi-Syndrom bekannt und für 17q21.31 das Auftreten von Mikrodeletions/Mikrodublikations-Syndromen. In den Kopiezahl-veränderten Bereichen der Zytobande 8p22 konnte noch kein relevantes Gen bzw. keine relevanten Gene identifiziert werden, allerdings scheinen sie ebenfalls mit fehlbildenden Syndromen in Verbindung zu stehen180-182. 3.1.4. Vergleich der Ergebnisse der aktuellen CNV-Analyse mit denen anderer Studien Ein Vergleich der am häufigsten deletierten Bereiche vorangegangener aCGH Studien40-43 mit den Ergebnissen der aktuellen Analyse hat gezeigt, dass eine ganze Reihe von gleichen Zytobanden wiederholt Kopiezahl-Verluste aufwiesen (Tab. 16). Allerdings unterschieden sich die ermittelten Frequenzen der einzelnen Studien deutlich. Differenzen in der Häufigkeit betroffener Zytobanden könnten über zu geringe Fallzahlen41, 42 oder besonders stringente 43 Auswertestrategien , aber auch durch eine unterschiedliche Zusammensetzung der Gewebekollektive erklärt werden. Besonders auffällig war, dass die Zytobande 8p21 in den anderen Studien außerordentlich häufig von Deletionen betroffen waren, was im Gewebekollektiv der aktuellen Arbeit nicht bestätigt werden konnte. Aktuell traten außerdem in 13 % der Fälle subtelomerische, maximal 300 kb lange Deletionen an der Zytobande 2q37.3 auf, die in den anderen Studien nicht vermerkt worden sind. Sehr wahrscheinlich lag dies an der geringeren Auflösung der verwendeten Plattformen. Als eine bis vor kurzem noch nicht beschriebene und sehr wahrscheinlich Tumor-relevante CNV war die Deletion an Zytobande 3p13 anzusehen. Taylor et al.43 haben in ihrer unabhängigen Studie ebenfalls ca. 2 MB große, wiederholt auftretende Deletionen an diesem Lokus detektiert. 80 Ergebnisse Tabelle 16. Vergleich der häufigsten Deletionen aus aCGH/DNA-Chip Studien zur Identifizierung von CNV beim Prostatakarzinom * Lapointe et al. haben nur die fünf häufigsten Deletionen angegeben. ⱡ Zweiter Peak an 17q21.31 umfasst BRCA1, UBTF und ETV4, nicht KANSL1 Lokus. Sun et al .40 (n=872) 2007 Plattform: Metaanalyse von 41 aCGH Studien DeletionsHäufigkeit [%] 8p21.3 34,1 13q21.33 28,0 6q15 22,2 16q22.1 17,9 5q15 13,1 18q21.33-q22.1 12,8 2q22.2 12,4 10q23.2 11,8 4q27-28.1 7,6 15q23 6,7 12p13.1 6,0 Cytobanden Lapointe et al .42 (n=55+9)* 2007 Plattform: cDNA-Array (39.632 probes) Cytobanden 13q14 8p11-23 6q15 10q23 12p13 DeletionsHäufigkeit [%] 52 47 38 28 27 Ishkanian et al .41 (n=24) 2009 Plattform: BAC-Array (26.819 probes) Cytobanden 8p21.2 16q24.1 1q42.12-q42.3 16q23.1 13q14.3 13q21.1-q22.2 22q12.1 22q13.31 6q15 8q21.13-q23.3 8q24.12-24.23 13q34 17p13.2-p13.1 21q22.2 22q11.21 10q23.31 17q21.31 18q22.3-q23 DeletionsHäufigkeit [%] 66,6 41,6 37,5 37,5 33,3 33,3 33,3 33,3 29,2 29,2 29,2 29,2 29,2 29,2 29,2 25,0 25,0 25,0 81 Taylor et al .43 (n=194) 2010 Plattform: Agilent 244K Array DeletionsHäufigkeit [%] 8p21.3-p11.21 78,3 6q12-q22.33 62,4 12p13.31-p12.3 61,3 13q14.12-q14.2 47,4 16q23.1-q24.2 37,6 10q23.31 34,0 21q22.2 32,0 2q14.3-q22.3 29,9 17p13.1 26,3 5q21.1 26,3 3p14 21,2 1q21.1 20,1 5q11.2 19,6 5q12.1 17,0 2q31.1 16,5 2q22.3-q23.1 15,4 17q21.31 14,9 2q23.1-q23.3 14,9 Cytobanden Aktuelle Studie (n=77) 2013 Plattform: Affymetrix Genome-wide human SNP array 6.0 DeletionsCytobanden Häufigkeit [%] 10q23.31 19,5 3p13 18,2 5q21.1 16,9 6q15 16,9 16q24.1 16,9 5q13.2 15,6 12p13.2-p13.1 14,3 21q22.3 14,3 2q21.2 13,0 2q37.3 13,0 12p13.32 13,0 13q22.1 13,0 16q22.2-q22.3 13,0 8p21.3 11,7 13q14.11 11,7 17q21.31ⱡ 11,7 8p22 10,4 2p21 9,1 Ergebnisse 3.1.5. 3.1.5.1. Detaillierte Analyse ausgewählter Zytobanden Zytobande 3p13 Insgesamt zeigten 14 der 77 (18,2%) Prostatakarzinome chromosomale Verluste am 3p13 Lokus. Beispiele der DNA-Chip Analyse sind in Abbildung 18 gezeigt. Abbildung 18. Beispiele von 3p13 Deletionen, ermittelt durch die DNA-Chip Analyse Die Abbildung zeigt Chromosom 3 von vier verschiedenen Tumorproben mit 3p13 Deletionen. Die Deletionen sind mit blauen Pfeilen markiert. Probe C weist neben der heterozygoten Deletion an der Zytobande 3p13 auch einen homozygoten Verlust am RYBP Lokus auf. Zwei der 14 Tumoren wiesen relativ große Deletionen (bis 7,5 MB) auf, die verbleibenden 12 Karzinome dagegen Deletionen, die durchschnittlich 2,5 MB lang waren (Abb. 19 A). Die Deletionen umfassten einen Kernbereich, der die Gene FOXP1, EIF4E3 („eukaryotic translation initiation factor 4E family member 3“), GPR27 („G protein-coupled receptor 27“), PROK2 („prokineticin 2“), RYBP („RING1 and YY1 binding protein“), SHQ1 („SHQ1 homolog (S. cerevisiae)“) und GXYLT2 („glucoside xylosyltransferase 2“) einschloss, zeigten im Einzelnen aber komplexe Deletionsmuster. Es konnten drei rekurrent betroffene Bereiche (minimally deleted regions, MDR) definiert werden, in deren minimal überlappenden Kopiezahl-Verlusten die Gene FOXP1 (10/14), RYBP (10/14) und SHQ1 (10/14) lokalisiert waren (Abb. 19 B). 82 Ergebnisse Vier der 14 Tumoren wiesen Deletionen auf, die die Gene FOXP1, RYBP und SHQ1 gleichermaßen einschlossen. Drei Weitere betrafen RYBP und SHQ1, sowie FOXP1 anteilig; hier lagen die Bruchpunkte der Deletionen vereinzelt innerhalb des Genes (intragenische Brüche bzw. Deletionen). Zwei der Deletionen umfassten nur den FOXP1 Lokus, zwei Weitere nur RYBP und SHQ1. Die verbleibenden Deletionen zeigten verschiedene Muster, bei denen nur FOXP1 und RYBP, FOXP1 und SHQ1 (durch eine unterbrochene Deletion) oder nur SHQ1 beeinflusst wurden. In allen 3p13-deletierten Tumoren lagen nur heterozygote Verluste vor. Nur ein Tumor zeigte, innerhalb einer heterozygoten Deletion, einen homozygot deletierten Bereich am RYBP Lokus (Abb. 18 C). Abbildung 19. FISH Oracle Darstellung der 3p13 deletierten Tumoren und detaillierte Ansicht der Zytobande 3p13 Die Abbildung zeigt die Ausdehnung der identifizierten Deletionen (als blaue Balken) an den Zytobanden 3p14-p12 in einer FISH Oracle Darstellung (A) und einer vergrößerten Ansicht des Kernbereichs mit Angabe der beeinflussten Gene (B). Die stumpfen Balken-Enden mit grauen Pfeilen markieren Deletionen, die über den gezeigten Bereich hinausragen. MDR = minimally deleted region (kleinster, gemeinsam deletierter Bereich), * Lage der FOXP1 FISH DNA-Sonden: F DEL = FOXP1 Deletions-Sonde; F 3‘ und 5‘ BA = Lage der FOXP1 Breakapart-Sonde, # 76 kb langes Artefakt der DNA-Chip Analyse. Dieses liegt in einem Gen-leeren Bereich. 83 Ergebnisse Die GISTIC Analyse hat unabhängig von der FISH Oracle Auswertung eine signifikant häufig auftretende Kopiezahl-Veränderung an der Zytobande 3p13 bestätigt, zentriert auf die Gene RYBP und SHQ1 (Abb. 15). Keine der, für die DNA-Chip Analyse verwendeten ProstataZelllinien wies eine 3p13 Deletion auf. 3.1.5.1.1. GISTIC Analyse der 3p13 deletierten Tumoren Eine zweite GISTIC Analyse sollte CNV identifizieren die häufiger zusammen mit 3p13 Deletion auftreten. Auch wenn die Assoziationen zu anderen deletierten Zytobanden nicht hochgradig signifikant waren, konnte zumindest gezeigt werden, dass vermehrt Deletionen an 1q42.3 (ARID4B), 8p21.3 (LPL), 17q21.31 (KANSL1) und 21q22.2 (ERG) vorlagen, wenn 3p13 ebenfalls deletiert war (Abb. 20). Abbildung 20. GISTIC Analyse der 14 Tumoren mit einer 3p13 Deletion Die Abbildung zeigt einen hoch signifikanten Peak an der Zytobande 3p13 und eine ganze Reihe weiterer Zytobanden, deren Kopiezahl-Verluste mit der 3p13 Deletion assoziiert sind. Putative Tumorsuppressorgene stehen in Klammern, Gene, die nicht im minimal deletierten Bereich liegen, aber benachbart lokalisiert sind, sind unterstrichen. 84 Ergebnisse 3.1.5.2. Zytobanden 21q22.2-q22.3 (ERG) 12 der 77 (15,6%) untersuchten Prostatakarzinome zeigten in der DNA-Chip Analyse Deletionen der Zytobanden 21q22.2-22.3. Beispiele von vier Tumorproben sind in Abbildung 21 dargestellt. Abbildung 21. Beispiele von 21q22.2-q22.3 Deletionen, ermittelt durch die DNA-Chip Analyse Die Abbildung zeigt Chromosom 21 von vier verschiedenen Tumorproben mit 21q22.2-q22.3 Deletionen. Die Deletionen sind mit blauen Pfeilen markiert. A), B) und C) zeigen breite, etwa 3 MB große Deletionen, D) hingegen 0,7 MB breite Deletion an Zytobande 21q22.2 um den ERG Lokus. Sechs von 12 21q22-deletierten Proben wiesen etwa 3 MB große Deletionen zwischen den Genen ERG und TMPRSS2 auf. Eine weitere Probe zeigte einen ca. 0,7 MB großen deletierten Bereich am ERG Lokus und die verbleibenden 4, Deletionen im Bereich um TMPRSS2 (0,6 bis 1,2 MB) (Abb. 22). 85 Ergebnisse Abbildung 22. Detaillierte FISH Oracle Darstellung der 21q22.2-q22.3 deletierten Tumoren Die Abbildung zeigt die Ausdehnung der identifizierten Deletionen (als blaue Balken) an den Zytobanden 21q22.2-q22.3 in einer FISH Oracle Darstellung (A) und einer vergrößerten Ansicht des Kernbereichs mit Angabe der beeinflussten Gene (B). Die stumpfen Balken-Enden mit grauen Pfeilen markieren Deletionen, die über den gezeigten Bereich hinausragen. * Lage der ERG FISH DNA-Sonden: E 3‘ und 5‘ BA = Lage der ERG Breakapart-Sonde. In der DNA-Chip Analyse konnte in keiner der Prostata-Zelllinien eine genomische Veränderung an den Zytobanden 21q22.2-q22.3 nachgewiesen werden. 86 Ergebnisse 3.1.5.3. Zytobande 10q23.31 (PTEN) Die Zytobande 10q23.31 war in 15 von 77 (18,9%) Gewebeproben von Deletionen betroffen. Vier Beispiele von betroffenen Proben sind in Abb. 23 gezeigt. Abbildung 23. Beispiele von 10q23.31 Deletionen, ermittelt durch die DNA-Chip Analyse Die Deletionen sind mit blauen Pfeilen markiert. A) und B) zeigen breite, etwa 10 bzw. 8 MB große, Deletionen mit einem homozygoten Verlust am PTEN Lokus in B) und etwa 1,2 MB breite Deletion um den PTEN Lokus in C) und D). Vier dieser Deletionen zeigten breite chromosomale Verluste zwischen 10 und 36 MB. Acht weitere wiesen eine durchschnittliche Ausdehnung von 1,8 MB auf und die verbleibenden drei Deletionen lagen zwischen 570 und 840 Kilobasen (Abb. 24 A). Der kleinste gemeinsam deletierte Bereich (MDR) aller Proben umfasste 450 kb und betraf die Gene PTEN und RNLS („renalase, FAD-dependent amine oxidase“) (Abb. 24 B). Die Zelllinien LNCaP und PC-3 wiesen ebenfalls Deletionen am PTEN Lokus auf. 87 Ergebnisse Abbildung 24. FISH Oracle Darstellung der 10q deletierten Tumoren und detaillierte Ansicht an der Zytobande 10q23.31 Die Abbildung zeigt die Ausdehnung der identifizierten Deletionen (als blaue Balken) an den Zytobanden 10q22.2-q25.1 in einer FISH Oracle Darstellung (A) und einer vergrößerten Ansicht des Kernbereichs an 10q23.31 mit Angabe der beeinflussten Gene (B). Die blauen Balken zeigen die Ausdehnungen der Deletionen. Spitze Balkenenden kennzeichnen den Anfang oder das Ende einer Deletion, stumpfe Enden und graue Pfeilspitzen markieren Deletionen, die über den gezeigten Bereich hinausragen. MDR = minimally deleted region (kleinster gemeinsam deletierter Bereich), * Lage der PTEN FISH DNA-Sonden: PTEN DEL = PTEN Deletions-Sonde; PTEN 5‘ und 3‘ BA = Lage der PTEN Breakapart-Sonde. 3.1.5.3.1. GISTIC Analyse der 10q23 deletierten Tumoren Eine erneute GISTIC Analyse mit Tumoren, die eine 10q23 Deletion aufwiesen zeigte, dass in solchen Fällen auch wiederholt Deletionen an den Zytobanden 5q13.1 (CDK7), 16q22.3 (ZFHX3), 17q13.1 (TP53), 17q21.31 (KANSL1) und 21q22.3 (TMPRSS2) auftraten. Allerdings wiesen diese, ähnlich wie bei der 3p GISTIC Re-Analyse, nur eine leichte Signifikanz auf (Abb. 25). 88 Ergebnisse Abbildung 25. GISTIC Analyse der 15 Tumoren mit einer 10q23 Deletion Die Abbildung zeigt einen hoch signifikanten Peak an der Zytobande 10q23 und weitere Zytobanden, deren Kopiezahl-Verluste mir der 10q23 Deletion assoziiert sind. 3.1.5.3.2. Intragenische Brüche von PTEN Die DNA-Chipanalyse identifizierte zwei klinische Tumorproben und eine Prostata-Zelllinie mit intragenischen Brüchen von PTEN (Abb. 26). Eine Tumorprobe zeigte Verluste von 5‘ und 3‘ Ende mit einem undeletierten, 17 kb langem Bereich, zentral im PTEN Gen. Eine weitere Probe wies einen Bruchpunkt an der Basenpaarposition 89.700.671 (in Intron 6) auf und zeigte demnach einen Verlust des 3‘. In der Zelllinie PC-3 lag ebenfalls ein Bruch im Intron 6 vor (bp-Position 89.764.157) und wies folglich ebenfalls einen Verlust des 3‘ Endes von PTEN auf. 89 Ergebnisse Abbildung 26. FISH Oracle Darstellung der intragenischen Brüche von PTEN Zwei der klinischen Proben weisen intragenische Brüche innerhalb von PTEN auf (1* und 2*). 3* markiert einen intragenischen Bruch in der Zelllinie PC-3. 90 Ergebnisse 3.2. Validierung der genomischen Aberrationen an den Zytobanden 21q22.2q22.3 (ERG) 3.2.1. Technische Aspekte der ERG FISH Analyse und ERG IHC Unter Verwendung einer FISH Breakapart-Sonde konnte der genetische Status von ERG erfolgreich an 3.950 von 7.478 (52,8%) Tumorproben bestimmt werden. In 3.528 Geweben schlug die Analyse auf Grund suboptimaler Hybridisierung, unzureichendem Tumorgehalt und fehlender Gewebespots fehl. ERG IHC Ergebnisse standen für 6.710 (89,7%) Tumorproben zur Verfügung. Eine Teilmenge davon stammte aus einer vorangegangenen Studie137 und wurde für die vorliegende Arbeit erweitert. 3.2.2. Assoziationen von ERG zu klinisch-pathologischen Parametern In 1.901 von 3.950 (48,1%) Tumorproben konnten genomische Veränderungen von ERG nachgewiesen werden, welche sich in 853 (44,9%) Translokationen und 1.048 (55,1%) Deletionen aufteilten. Mehrfarb-Aufnahmen der ERG Aberrationen und des Normalzustandes sind in Abbildung 27 gezeigt. Beide Aberrationsarten zeigten weder Unterschiede in der Assoziationen zu klinisch-pathologischen Parametern, noch hatten sie einen divergierenden Einfluss auf das Überleben von Patienten (Tab. A 1 und Abb. A 1 im Anhang). Nachfolgend wurde auf eine getrennte Darstellung verzichtet und beide Aberrationen als „ERG Fusion“ zusammengefasst. Abbildung 27. Mehrfarb-Aufnahmen der ERG Breakapart FISH Sonde im Zellverband A) Beide ERG Allele sind intakt. 5‘-Sonde (grün) und 3‘-Sonde (orangefarben) zeigen eine Überlagerung. Die Signale wirken gelb, B) eines der beiden ERG Allele zeigt einen Bruch. 5‘- und 3‘-Sonde liegen deutlich voneinander separiert (ERG 91 Ergebnisse Translokation), C) an einem der ERG Allele liegt ein intragenischer Bruch vor, der den Verlust der grünen 5‘Sonde verursacht (ERG Deletion). Die Korrelation der FISH Ergebnisse mit klinisch-pathologischen Parametern zeigte signifikante Assoziationen von ERG Fusionen mit Tumorstadium, Gleason Grad und präoperativem PSA-Level (je p<0,0001). Auch die 3.068 (45,7%) ERG positiven (IHC) Tumorproben zeigten, ähnlich wie die ERG FISH Ergebnisse, eine signifikante Assoziation zu Tumorstadium, Gleason Grad, präoperativem PSA-Level (p<0,0001), aber auch eine Korrelation zum Status des Sektionsrandes (p=0,038). Ein tatsächlicher Zusammenhang von ERG Fusionen bzw. der ERG Überexpression mit fortgeschrittenen Tumoreigenschaften konnte jedoch nich angenommen werden, da die Einzelwerte in den Parametergruppen keinen klaren Trend erkennen ließen. Die Verteilung der Ergebnisse von ERG FISH und ERG IHC und ihrer Assoziationen zu den klinisch-pathologischen Parametern sind in Tabelle 17 zusammengefasst. Tabelle 17. Assoziationen von ERG FISH und ERG IHC zu klinisch-pathologischen Parametern pT: Tumorstadium, pN: Nodalstatus (pN0 = Lymphknoten negativ, pN+ = Lymphknoten positiv). Parameter n n gesamt auswertbar ERG FISH p Werte n auswertbar normal (%) Fusion (%) Alle Tumoren 7.478 3.950 51,9 48,1 Tumorstadium pT2 pT3a pT3b pT4 4.926 1.649 803 58 2.497 928 473 34 54,95 45,04 49,47 44,12 45,05 54,96 50,53 55,88 Gleason Grad ≤3+3 3+4 4+3 ≥4+4 2.316 3.803 1.017 287 1.093 2.075 589 168 55,81 48,14 54,84 61,90 LymphknotenMetastasen pN0 pN+ 3.962 327 2.189 184 Präoperativer PSA Wert [ng/ml] <4 4-10 10-20 >20 976 4.442 1.460 488 Sektionsrand frei negativ positiv 5.919 1.428 ERG IHC p Werte negativ (%) positiv (%) 6.710 54,3 45,7 <0,0001 4.341 1.530 735 50 57,18 47,52 51,97 52,0 42,82 52,48 48,03 48,0 <0,0001 44,19 51,86 45,16 38,10 <0,0001 1.993 3.454 937 259 57,25 50,98 56,99 67,18 42,75 49,02 43,01 32,82 <0,0001 52,03 45,65 47,97 54,35 0,0963 3.600 300 54,25 52,0 45,75 48,0 0,4529 494 2.299 814 284 47,17 50,76 58,97 50,0 52,83 49,24 41,03 50,0 <0,0001 841 3.979 1.331 441 48,87 53,41 59,73 58,28 51,13 46,59 40,27 41,72 <0,0001 3.103 778 52,27 49,87 47,73 50,13 0,231 5.262 1.314 54,87 51,67 45,13 48,33 0,038 92 Ergebnisse 3.2.3. Klinische Bedeutung von ERG Klinische Verlaufsdaten standen für 3.639 (FISH) bzw. 6.180 (IHC) Tumorproben zur Verfügung. Weder Tumoren mit einer nachgewiesenen ERG Fusion (Abb. 28 A), noch solche mit positiver ERG Expression (Abb. 28 B), zeigten im Vergleich zu Tumoren ohne Aberrationen bzw. Expression ein signifikant schlechteres Überleben (p=0,7715 bzw. p=0,5918). Wurde jedoch der Ploidiestatus (ermittelbar in der FISH) mit in die Analyse einbezogen, zeigte sich, dass Tumoren mit einer erhöhten Anzahl an Chromosomen 21 (Aneuploidie) bzw. einem erhöhten Chromosomensatz ein verstärktes Risiko für ein biochemisches Rezidiv zeigen (p=0,0023, Abb. 28 C), ungeachtet der Tatsache, ob sie eine genomische ERG Aberration aufwiesen oder nicht. Abbildung 28. Assoziationen von ERG Aberrationen bzw. ERG Überexpression und der Wahrscheinlichkeit ein biochemisches Rezidiv zu erleiden (Kaplan Meier Überlebenskurve) A) ERG FISH (Fus = Fusion), B) ERG Expression (IHC: pos = positiv, neg = negativ), C) ERG FISH unter besonderer Berücksichtigung des Ploidiestatus. Tumoren mit einer erhöhten Zahl an Chromosomen 21 (Aneu = Aneuploidie) zeigen ein erhöhtes Risiko für ein biochemisches Rezidiv, als Tumoren mit einem diploiden Anzahl von Chromosom 21 (2n). 93 Ergebnisse 3.2.4. Korrelation von ERG FISH und ERG IHC Die Konkordanz der beiden Analysemethoden zeigte sich in einem durchschnittlichen Korrelations-Faktor von 0,95. In 1.842 ERG Tumoren mit Fusionen sind 1.753 (95,2%) ERG positive Tumoren identifiziert worden, aber nur 95 (4,9%) ohne eine ERG Färbung (Tabelle 18). Die IHC konnte demnach als adäquates Surrogat für die genomischen Aberrationen von ERG angesehen werden. Für alle nachfolgenden Analysen und Korrelationen wurden die Resultate der ERG IHC verwendet. Tabelle 18. Korrelation von ERG IHC und ERG FISH Vergleich der Ergebnisse der ERG IHC und ERG FISH in Gewebespots, die für beide Analysen auswertbar waren. ERG IHC neg (n=1.931) ERG IHC pos (n=1.848) 3.3. ERG FISH normal n = 1.937 1.842 (95,4%) 95 (5,1%) ERG FISH Fusion n = 1.842 89 (4,6%) 1.753(94,9%) p Wert < 0,0001 Validierung der genomischen Aberrationen an der Zytobande 10q23.31 (PTEN) 3.3.1. Technische Aspekte der PTEN FISH-Auswertung am Prognose- und am Hormon-refraktären (HR) TMA Die PTEN FISH-Analysen wurden mit einer Deletions- und einer Breakapart-Sonde auf dem Prognose-, dem HR- und dem Heterogenitäts-TMA durchgeführt. Insgesamt wurden 7.478 Hormon-naïve (Prognose-TMA) und 71 Hormon-refraktäre (HRTMA) Prostatakarzinome in die PTEN FISH-Analyse einbezogen. Diese schlug bei der PTEN Deletionsanalyse aufgrund fehlender Gewebespots, suboptimaler Hybridisierung oder ungenügendem bzw. fehlendem Tumorgehalt in 3.697/7.478 der Hormon-naïven und in 24/71 der Hormon-refraktären Tumoren fehl. Zusammenfassend konnten 3.781 Hormonnaïve (Auswertbarkeit: 50,6%) und 47 Hormon-refraktäre (66,2%) Tumoren in die PTEN Deletionsanalyse eingeschlossen werden. Für die PTEN Breakapartanalyse ist das gleiche Patientenkollektiv herangezogen worden, welches auch für die Validierung der PTEN Deletionen verwendet worden ist. Insgesamt 94 Ergebnisse konnten in der FISH-Analyse der PTEN Aberrationen 3.628 Hormon-naïve (48,5%) und 54 Hormon-refraktäre Tumoren (78,1%) erfolgreich analysiert werden. 3.3.2. PTEN Deletionen und deren Assoziationen zu klinisch-pathologischen Parametern PTEN Deletionen traten in 21,5% (810/3.781) der Prostatakarzinome auf, wobei homozygote Deletionen (12,1%) häufiger identifiziert wurden, als heterozygote (9,4%). Repräsentative Mehrfarb-Aufnahmen der einzelnen FISH Ergebnisse sind in Abb. 29 zusammengestellt. Hetero- und homozygote Deletionen waren häufiger in Hormon-refraktären Karzinomen (12,8% bzw. 29,8%) zu finden als in Hormon-naïven. Dieser Unterschied war besonders auffällig bei homozygoten Deletionen, die in 14 von 47 (29,8%) der Hormon-refraktären, aber in nur 456 von 3.781 (12,1%) der Hormon-naïven Karzinome gefunden wurden (p<0,0001). Abbildung 29. Mehrfarb-Aufnahmen der PTEN FISH Deletions-Sonde in einzelnen Zellkernen A) PTEN normal: Im Zellkern liegen je zwei PTEN- (orangefarben) und zwei Zentromer-Signale (Zen 10, grün) vor; B) heterozygote PTEN Deletion mit Verlust eines orangefarbenen Gensignals, während beide Zentromer-Signale vorhanden sind, C) homozygote PTEN Deletion mit kompletten Verlust beider Gensignale, nur die ZentromerSignale sind erkennbar. PTEN Deletionen waren signifikant mit fortgeschrittenem Tumorstadium (p<0,0001), hohem Gleason-Grad (p<0,0001), Vorhandensein von Lymphknotenmetastasen (p<0,0001) und positivem Sektionsrand (p<0,0001) assoziiert. Obwohl auch ein signifikanter p-Wert für die Assoziation zwischen PTEN-Deletionen und dem präoperativem PSA-Wert (p=0,0028) gefunden wurde, ist ein realer Zusammenhang nicht anzunehmen, da die Einzelwerte in den PSA-Wertklassen keine eindeutige Tendenz zeigten. Die Assoziationen der PTEN Deletionen zu den klinisch-pathologischen Parametern sind in Tabelle 19 zusammengefasst. 95 Ergebnisse 1 Tabelle 19. Assoziationen von PTEN Deletionen zu klinisch-pathologischen Parametern Hormon-refraktäre (HR) versus Hormone-naïve Prostatakarzinome, 2 Hormon-refraktäre Tumoren ausgeschlossen. pT: Tumorstadium, pN: Nodalstatus (pN0 = Lymphknoten negativ, pN+ = Lymphknoten positiv). Parameter Alle Tumoren n n gesamt auswertbar PTEN Deletion p Werte heterozygot (%) homozygot (%) 7.478 3.781 9,4 12,1 pT2 pT3a pT3b pT4 4.926 1.649 803 58 2.363 919 450 29 6,56 12,62 17,33 13,79 8,08 16,0 23,78 31,03 <0,0001 HR 71 47 12,8 29,8 <0,00011 Gleason Grad2 ≤3+3 3+4 4+3 ≥4+4 2.316 3.803 1.017 287 1.005 2.003 566 178 4,68 9,89 13,96 15,73 5,47 11,58 22,97 19,1 <0,0001 3.962 327 2.027 193 11,1 16,1 13,32 28,5 <0,0001 <4 4-10 10-20 >20 976 4.442 1.460 488 472 2.204 786 263 9,96 8,48 10,69 11,41 15,47 11,34 10,69 15,59 0,0128 Sektionsrand frei2 negativ positiv 5.919 1.428 2.914 795 8,68 11,07 11,29 14,84 <0,0001 Tumorstadium LymphknotenMetastasen2 pN0 pN+ Präoperativer PSA Wert [ng/ml]2 3.3.3. Art und Häufigkeit weiterer genomischer PTEN Aberrationen und deren Assoziationen zu klinisch-pathologischen Parametern Wie im Material- und Methodenteil beschrieben wurden die Tumoren mit intragenischen Brüchen von PTEN bei der Auswertung der Breakapart Sonde, zur Reduzierung der 96 Ergebnisse Aberrationsklassen, je nach Anzahl der betroffenen Allele in die entsprechende Kategorie der hetero- und homozygoten Deletion eingeordnet. PTEN Aberrationen waren in 21,2% (769/3.628) der auswertbaren Prostatakarzinome zu finden. Der Anteil an heterozygoten Deletionen (het del) lag bei 6,5%, die der homozygoten Deletionen (homo del) bei 11,2%. Weitere 2,6% der Patienten hatten neben einer heterozygoten Deletionen auch eine zusätzliche Translokation auf dem verbleibenden PTEN Allel (het del + trans). Translokationen ohne eine zusätzliche Deletion konnten in 0,9% der Fälle nachgewiesen werden. Dabei entfielen 0,4% auf heterozygote (het trans) und 0,5% auf homozygote Translokationen (homo trans). Abbildung 30 zeigt Mehrfarb-Aufnahmen verschiedener PTEN Aberrationen. Wie schon bei der PTEN Deletions-Auswertung, lag der Anteil von hetero- und homozygoten Deletionen in den Hormon-refraktären Karzinomen (11,11% bzw. 25,9%) höher, als in den Hormon-naïven (6,5% bzw. 11,2%, p<0,0001). In den Hormon-refraktären Karzinomen akkumulierten außerdem PTEN Aberrationen mit einer Inaktivierung beider Allele (het del + trans, homo trans). Translokationen, die nur ein PTEN Allel betrafen (het trans), konnten in den Hormon-refraktären Karzinomen nicht nachgewiesen werden. Abbildung 30. Mehrfarb-Aufnahmen der PTEN FISH Breakapart-Sonde in einzelnen Zellkernen A) Beide PTEN Allele sind intakt, 5‘-Sonde (orangefarben) und 3‘-Sonde (grün) zeigen eine Überlagerung. Die Signale wirken gelb, B) Verlust eines Allels durch eine heterozygote Deletion, das verbleibende Allel ist intakt, C) eines der Allele zeigt einen Bruch, 5‘- und 3‘-Sonde liegen deutlich voneinander separiert (heterozygote Translokation), D) zusätzlich zur heterozygoten Deletion eines Allels liegt ein Bruch des verbleibenden Allels vor (heterozygote Deletion und Translokation). Alle PTEN Aberrationen waren signifikant mit fortgeschrittenem Tumorstadium (p<0,0001), hohem Gleason-Grad (p<0,0001), Vorhandensein von Lymphknotenmetastasen (p<0,0001) und positivem Sektionsrand (p<0,0001) verbunden. Die Assoziationen der PTEN Aberrationen zu den klinisch-pathologischen Parametern ist in Tabelle 20 einzusehen. 97 Ergebnisse Tabelle 20. Assoziationen von PTEN Aberrationen zu klinisch-pathologischen Parametern 1 Hormon- 2 refraktäre (HR) gegen Hormone-naïve Prostatakarzinome, Hormon-refraktäre Tumoren ausgeschlossen; het del = heterozygote Deletion, het trans = heterozygote Translokation, het del + trans = heterozygote Deletion und Translokation auf dem zweiten Allel, homo del = homozygote Deletion, homo trans = homozygote Translokation, pT: Tumorstadium, pN: Nodalstatus (pN0 = Lymphknoten negativ, pN+ = Lymphknoten positiv). Parameter n n gesamt auswertbar PTEN Aberrationen p Werte het del het trans het del + homo del homo trans (%) (%) trans (%) (%) (%) Alle Tumoren 7.478 3.628 6,5 0,4 2,6 11,2 0,5 Tumorstadium pT2 pT3a pT3b pT4 4.926 1.649 803 58 2.285 881 419 27 4,6 10,22 8,35 7,41 0,35 0,57 0,72 0 1,49 3,06 7,16 11,11 7,53 14,53 23,39 25,93 0,26 0,68 1,67 0 <0,0001 HR 71 54 11,11 0 3,7 25,9 11,11 <0,00011 Gleason Grad2 ≤3+3 3+4 4+3 ≥4+4 2.316 3.803 1.017 287 1.003 1.894 541 167 3,19 7,39 7,76 10,18 0,2 0,42 1,11 0 0,9 2,59 5,73 2,99 5,68 10,72 21,07 17,37 0,2 0,48 0,74 2,4 <0,0001 LymphknotenMetastasen2 pN0 pN+ 3.962 327 1.936 163 7,39 11,18 0,57 0,62 3,2 6,21 12,81 26,71 0,57 1,86 <0,0001 Präoperativer PSA Wert [ng/ml]2 <4 4-10 10-20 >20 976 4.442 1.460 488 470 2.109 736 258 7,45 6,02 7,07 6,59 0,64 0,33 0,54 0,39 2,77 2,37 2,31 4,26 13,4 10,53 10,05 15,5 0,21 0,43 1,09 0,39 0,1435 Sektionsrand frei2 negativ positiv 5.919 1.428 2.811 754 6,05 7,16 0,43 0,53 2,21 3,98 10,53 13,66 0,43 0,8 <0,0001 3.3.4. PTEN Inaktivierung Die Breakapart-Sonde beinhaltete zwar neben der Sonde für PTEN auch eine kommerzielle Zentromer 10 Sonde (Referenzsonde in blau), was normalerweise ausreichend ist, um den 98 Ergebnisse Gen- und Ploidie-Status eines Gewebes zu ermitteln. Allerdings konnte diese, auf Grund schlechter Hybrisierungsqualität, in einem Großteil der Gewebe nicht in die Analyse eingeschlossen werden. Zur Ermittlung der Ploidie der Gewebe wurde daher die Referenzsonde der Deletions-Analyse (kommerzielle Zentromer 10 Sonde in grün) herangezogen. Für die vergleichende Analyse beider PTEN FISH-Sonden wurden nur Gewebe berücksichtigt, die in beiden Analysen ein Ergebnis erbracht haben. Auf insgesamt 3.232 Gewebe traf dieses Kriterium zu. Innerhalb dieser Gewebe zeigten 685 (21,2%) Patienten einen Verlust am PTEN Lokus, dabei entfielen 304 (9,4%) auf heterozygote und 381 (11,8%) auf homozygote Deletionen, wenn nur die Ergebnisse der PTEN Deletions-Sonde beachtet wurden (Abb. 31 A). Abbildung 31. Verteilung der PTEN Aberrationen, ermittelt über die PTEN Deletions- und Breakapart Sonden A) Verteilung der PTEN Aberrationen nach Auswertung der Deletions-Sonde (het del = heterozygote Deletion, homo del = homozygote Deletion), B) Verteilung der PTEN Aberrationen nach der Breakapart-Analyse (het del + trans = heterozygote Deletion und Translokation auf dem verbleibenden Allel, het trans = heterozygote 99 Ergebnisse Translokation, homo trans = homozygote Translokation. Dargestellt sind die Ergebnisse der Tumoren, die für beide PTEN FISH-Sonden auswertbar waren. Bei Betrachtung der gleichen Fälle nach Analyse der Breakapart-Sonde fällt auf, dass PTEN Aberrationen bei zusätzlichen 38 Patienten detektiert werden konnten und die Summe der PTEN aberranten Fälle demnach auf 723 (22,4%) anstieg. Der Anteil homozygoter Deletionen erhöht sich auf 12,0%, der Anteil der heterozygoten Deletionen reduziert sich hingegen auf 6,7%. Ursächlich waren zusätzlich zu einer heterozygoten Deletion auftretende Translokationen („het del + trans“) in 2,7% der Tumoren. Außerdem konnten bei 31 Tumoren (0,9%) eine Translokation detektiert werden, die entweder nur ein Allel (0,4% heterozygote Translokationen, „het trans“) oder alle Allele (0,5% homozygote Translokation, „homo trans“) betraf (Abb. 31 B). Der Vergleich beider FISH-Auswertungen zeigte deutlich, dass der Anteil biallelischer Funktionsverluste (in Abb. 30 in Rottönen dargestellt) von PTEN de facto höher war, als zunächst mit der konventionellen Deletions-Sonde detektierbar gewesen ist (Deletions-Sonde: 11,8% versus Breakapart-Sonde: 15,2%). Tab. 21 stellt die beobachteten Ergebnisse von Deletions- und Breakapart-Sonde gegenüber und definiert in welche Inaktivierungs-Kategorie die einzelnen Aberrations-Klassen fallen. Tumoren, die z. B. in der Deletions-Analyse „normale“ FISH Signale (z. B. 2 Gensignale zu 2 Referenzsignalen) zeigen, können faktisch von einer intragenischen Deletion (Breakapart Code: 1/0/1), einer einfachen (1/1/1) oder biallelischen Translokation (0/2/2) betroffen sein. 100 Ergebnisse Tabelle 21. Beobachtete PTEN Breakapart-Codes und Bildung des PTEN Inaktivierungsstatus PTEN Breakapart-Zahlencode: X/Y/Z = Anzahl intakter Signale / Anzahl einzelner (orangefarbener) 5' Signale / Anzahl einzelner (grüner) 3' Signale. Der Übersichtlichkeit halber, sind heterozygote Deletionen in aneuploiden Tumoren in dieser Darstellung nicht berücksichtigt, fallen aber grundsätzlich in die Kategorie „heterozygot inaktiviert“. PTEN Inaktivierungsstatus PTEN Deletionssonde normal heterozygote Deletion homozygote Deletion 2/0/0 normal 1/1/1 1/0/0 1/0/1 1/1/0 0/2/2 0/1/1 0/2/0 0/0/1 0/1/0 heterozygot inaktiviert PTEN BreakapartSonde homozygot inaktiviert 0/0/0 Für alle nachfolgenden Berechnungen wurde aus den Ergebnissen der Deletions- und Breakapart-Sonde ein Inaktivierungs-Status für PTEN ermittelt. Zu heterozygoten Inaktivierungen gehörten heterozygote Deletionen und Translokationen. Zu homozygoten Inaktivierungen homozygote Deletionen und Translokationen, sowie heterozygote Deletionen mit Translokation des verbleibenden Allels. 3.3.4.1. Assoziationen von PTEN Inaktivierungen zu klinisch-pathologischen Parametern 372 der 3.232 (23%) für beide DNA-Sonden auswertbaren Gewebespots wiesen eine Inaktivierung von PTEN auf. Dabei entfielen 245 (7,6%) der Tumoren auf heterozygote und 499 (15,4%) auf homozygote Inaktivierungen. PTEN Inaktivierungen waren signifikant mit fortgeschrittenem Tumorstadium (p<0,0001), hohem Gleason-Grad (p<0,0001), Vorhandensein von Lymphknotenmetastasen (p<0,0001), positivem Sektionsrand (p<0,0001) und dem präoperativem PSA-Wert (p=0,0373) assoziiert. Eine tatsächlich bestehende Assoziationen zwischen PTEN Inaktivierungen und dem PSA Wert ist jedoch wenig wahrscheinlich, da die Einzelwerte der PSA-Klassen keinen eindeutigen Trend zeigten. 101 Ergebnisse Die Assoziationen vom PTEN Inaktivierungs-Status zu den klinisch-pathologischen Parametern sind in Tabelle 22 zusammengefasst. 3.3.4.2. Klinische Bedeutung der PTEN Inaktivierungen Für 2.976 Tumoren bei denen erfolgreich der PTEN Inaktivierungsstatus beurteilt werden konnte, standen ebenfalls klinische Verlaufsdaten zur Verfügung. Die Analyse zeigte, dass PTEN Inaktivierungen signifikant mit einem biochemischen Rezidiv assoziiert sind (p<0,0001, Abb. 32). Es wurde jedoch kein Unterschied zwischen Tumoren mit heterozygoter oder homozygoter Inaktivierung (p=0,217) festgestellt. 102 Ergebnisse Tabelle 22. Assoziationen des PTEN Inaktivierungs-Status zu klinisch-pathologischen Parametern pT: Tumorstadium, pN: Nodalstatus (pN0 = Lymphknoten negativ, pN+ = Lymphknoten positiv). Parameter n gesamt n auswertbar PTEN Inaktivierungsstatus heterozygot (% ) homozygot (% ) p Werte Alle Tumoren 7.478 3.232 7,6 15,4 Tumorstadium pT2 pT3a pT3b pT4 4.926 1.649 803 58 2.023 793 378 23 5,64 10,97 10,58 8,7 10,18 19,17 34,39 43,48 <0,0001 Gleason Grad ≤3+3 3+4 4+3 ≥4+4 2.316 3.803 1.017 287 853 1.717 483 157 3,63 8,39 10,14 11,46 7,27 14,91 28,78 24,84 <0,0001 LymphknotenMetastasen pN0 pN+ 3.962 327 1.718 158 8,61 11,39 17,75 36,08 <0,0001 <4 4-10 10-20 >20 976 4.442 1.460 488 418 1.868 666 233 8,85 6,8 9,01 7,73 17,94 14,51 14,26 20,6 0,0373 Sektionsrand frei negativ positiv 5.919 1.428 2.487 684 7,0 8,77 14,6 18,57 <0,0067 Präoperativer PSA Wert [ng/ml] 103 Ergebnisse Abbildung 32. Assoziation zwischen PTEN Inaktivierungen und der Wahrscheinlichkeit ein biochemisches Rezidiv zu erleiden (Kaplan Meier Überlebenskurve) In einer multivariaten Regressions-Analyse nach Cox, die Tumorstadium, Gleason Grad, präoperativem PSA Wert und den PTEN Inaktivierungs-Status einschloss, wurden PTEN Inaktivierungen als unabhängiger Prädiktor für das PSA Rezidiv-freie Überleben (p=0,0022, Tabelle 23) identifiziert. Tabelle 23. Cox Regressions-Analyse von Tumorstadium, Gleason Grad, präoperativem PSA Wert und PTEN Inaktivierung HR: Hazard Ratio, KI: Konfidenzintervall, PTEN Inaktivierung (fasst hetero- und homozygote Inaktivierungen zusammen). Parameter Faktor HR 95% KI p Wert Tumorstadium pT3a vs. pT2 pT3b vs. pT2 pT4 vs. pT2 2,0 3,6 6,1 1,7-2,4 3,0-4,4 3,9-9,1 <0,0001 Gleason Grad 3+4 vs. ≤3+3 4+3 vs. ≤3+3 ≥4+4 vs. ≤3+3 2,2 5,0 6,0 1,7-2,8 3,8-6,5 4,3-8,3 <0,0001 Präoperativer PSA Wert (ng/ml) 4-9 vs. <4 10-20 vs. <4 >20 vs. <4 1,0 1,6 2,2 0,8-1,3 1,2-2,2 1,6-2,9 <0,0001 PTEN Inaktivierung inakt vs. nicht 1,3 0,9-1,1 0,0022 104 Ergebnisse 3.3.5. PTEN Mutations-Analyse mittels Sanger Sequenzierung Die Sequenzierung der 108 Proben (69 Hormon-naïve und 39 Hormon-refraktäre Prostatakarzinome) ergab sieben Fälle mit Mutationen, davon entfielen 3 (4,3%) auf Hormon-naïve und 4 (10,3%) auf Hormon-refraktäre Tumoren (p=0,943). Die FISH Analyse der sequenzierten Tumoren ergab 65 „normale“ Tumoren, 12 heterozygot und 16 homozygot deletierte Tumoren, zwei Tumoren mit homozygoten Translokationen und 3 Tumoren mit heterozygoten Deletionen. In Tumoren mit heterozygoter PTEN Deletion wurden 33,3% Mutationen (4/12, ein Hormonnaïver Tumor, drei Hormon-refraktäre Tumoren) und 4,8% Mutationen in Tumoren mit normalen PTEN (3/65, zwei Hormon-naïve Tumoren, ein Hormon- refraktärer Tumor) gefunden (p=0,0068). Die FISH Ergebnisse und die Mutations-Häufigkeiten sind in Tabelle 24 einzusehen. Tabelle 24. Ergebnisse der PTEN Sequenzierung und Zuordnung zum PTEN FISH Status * p Wert gilt für mutiert in „PTEN FISH normal“ gegen „PTEN FISH het del“. Der Farb-Code gibt den PTEN Inaktivierungs-Status an, grün = heterozygot inaktiviert, rot = homozygot inaktiviert. PTEN FISH Status PTEN norm PTEN het del PTEN het del + trans PTEN homo del PTEN homo trans PTEN FISH unbekannt gesamt n 65 12 3 16 2 10 108 PTEN wt 62 (95,4%) 8 (66,7%) 3 16 2 10 101 (93,5%) PTEN mutiert 3 (4,6%) 4 (33,3 %) 0 0 0 0 7 (6,5%) p Wert 0,0068* Zu den identifizierten Mutationen gehörten vier Tumoren mit Missense-Mutationen, bei denen es zu einem Austausch einer Base und einer Änderung der Aminosäuresequenz kam. Diese betrafen die Exons 5 (p.H118Y) und 8 (p.D326N, in drei unabhängigen Tumoren). Die Mutation in Exon 5 könnte inaktivierend auf das PTEN Protein wirken, da dort die Phosphatase-Domäne lokalisiert ist183. Exon 6 wies eine Nonsense-Mutation auf, die in einem Stop-Codon resultierte (p.E201*). In den Exons 1 und 8 konnten jeweils 4-bp lange Deletionen nachgewiesen werden, die zu Leseraster-Verschiebungen (frameshift) führten und einen Peptidsynthese-Abbruch nach 10 (Exon 1: p.N12fs*10) bzw. nach 2 Codons (Exon 8: p.L318fs*2) verursachten. Alle Mutationen sind in Tab. 25 zusammengefasst und in Abb. 33 graphisch dargestellt. 105 Ergebnisse Tabelle 25. Identifizierte PTEN Mutationen PTEN Sequenzvariationen auf DNA- und Protein-Ebene Exon 1 5 6 8 8 8 8 Sequenzvariation PTEN FISH Status DNA Level Protein Level het del het del norm norm het del norm het del c.36_39delCAA p.N12fs*10 c.352C>T p.H118Y c.601G>T p.E201* c.950_953delTACp.L318fs*2 c.976G>A p.D326N c.976G>A p.D326N c.976G>A p.D326N Art der Mutation Frameshift Missense Nonsense Frameshift Missense Missense Missense Abbildung 33. Elektropherogramme der identifizierten PTEN Mutationen und der Wildtypsequenz A) Exon 1: p.N12fs*10, B) Exon 5: p.H118Y, C) Exon 6: p.E201*, D) Exon 8: p.D326N; E) Exon 8: p.Ll318fs*2, * Wildtypund Mutationen sind in reverse-Sequenzen angegeben. 106 Ergebnisse 3.3.6. Epigenetische Veränderungen am PTEN Promotor Für die Methylierungs-Analyse (durchgeführt im DKFZ, siehe Material- und Methodenteil) von PTEN wurden 15 Primerpaare verwendet, welche die CpG-Inseln des Promotors abdeckten. Eine Voranalyse mit allen Primerpaaren zeigte keine auffälligen Unterschiede zwischen Tumor- und Normalgeweben (Daten nicht gezeigt). Für die Analyse der 34 Prostatakarzinome und fünf Normalgewebe sind daher nur zwei Primerpaare (PTEN4.5 und PTEN10p) ausgewählt worden. PTEN4.5 deckte sechs und PTEN10p sieben CpG-Einheiten ab. Der Grad der Methylierung der Normal- und Tumorgewebe, sowie der Standard-DNA für PTEN4.5, PTEN10p und des Kontroll-Gens GSTP1 sind in Abbildung 34 A dargestellt. Die durchschnittliche Methylierung der CpC-Einheiten von PTEN4.5 bzw. PTEN10p lag bei unter 10% (Abb. 34 B) und wies keinen Unterschied zwischen Tumor- und Normalgewebe auf. Die Positiv-Kontrolle GSTP1 dagegen zeigte in den Tumorproben eine durchschnittliche Methylierung der CpG-Einheiten von 79% und nur eine 5%ige Methylierung der gleichen Einheiten bei Normalgeweben. Abbildung 34. Methylierung des PTEN Promotors A) Heatmap der CpG Methylierungs-Analyse mittels MassARRAY Technologie. Jede Reihe repräsentiert eine Probe, die entweder für prostatisches Normalgewebe (N), Tumorgewebe (P) oder die Standard-DNA steht. Jede Spalte entspricht einer bzw. zweier CpG-Dinukleotide in den Amplikons für PTEN4.5, PTEN10p und GSTP1. Der Grad der Methylierung lag zwischen 0 und 100%, 107 Ergebnisse wobei hellblau 0% und dunkelblau 100% entspricht. Ein Farbcode ist unterhalb der Heatmap angegeben. B) Dot Blot Diagramm der durchschnittlichen Methylierung der drei Amplikons in Normal- und Tumorgeweben. Die horizontalen Linien geben den Median der jeweiligen Dots an. 3.3.7. 3.3.7.1. PTEN FISH-Analysen am Heterogenitäts-TMA Technische Aspekte der PTEN FISH-Auswertung am HeterogenitätsTMA Bei der Analyse des Heterogenitäts-TMAs sind zur Vermeidung von technischen Fehlern und Fehlinterpretationen strikte Auswerte- und Ausschlusskriterien der Gewebespots angewendet worden. Dazu gehörte, neben dem üblichen Ausschluss von Gewebespots mit insuffizientem Tumorgehalt über immunhistologische Färbungen an konsekutiven TMASchnitten, auch der Ausschluss von ungeeigneten Gewebespots direkt auf den TMASchnitten, die für die FISH verwendet worden sind. Dieser wurde von einem Pathologen ausgeführt. Des Weiteren wurden die FISH-Analysen von zwei unabhängigen Beobachtern durchgeführt und fragliche Fälle zusätzlich von einer dritten Person begutachtet. Dies galt insbesondere für Gewebespots von Tumorfoci mit nur einer PTEN Veränderung bzw. von Tumorfoci, denen nur ein positiver Spot zur Homogenität fehlte. Außerdem wurden heterogene Tumoren bzw. Gewebeblöcke in einer Großflächen-Analyse validiert. Für die Heterogenitäts-Analyse von PTEN Aberrationen standen insgesamt 1.890 Gewebespots zur Verfügung. 111 der Spots fehlten auf den TMA-Schnitten (PräparationsArtefakte), 501 weitere wurden auf Grund eines unzureichenden Tumorgehaltes aus der Analyse ausgeschlossen und 270 Spots entfielen durch ein schlechtes Hybridisierungsergebnis. 887 (Auswertbarkeit: 46,9%) bzw. 907 (48,0%) Gewebespots konnten mit der PTEN Deletions- bzw. der Breakapart-Sonde ausgewertet werden. Bei weiteren 125 konnte nur ein Ergebnis mit der Breakapart-Sonde erzielt werden. Da diese Spots solchen Tumorfoci zugehörig waren, die nachweislich keine Aneuploidie aufwiesen (ermittelt durch weitere Gewebespots in den jeweiligen Foci, die mit der Deletions-Sonde ausgewertet werden konnten), sind diese ebenfalls für die Heterogenitäts-Analyse verwendet worden. Für weitere 103 Gewebespots lagen nur Ergebnisse der Deletions-Sonde vor. Auf Grund der allgemein geringen Rate an PTEN Translokationen (<4%, siehe Abschnitt 3.3.3.) und weil die betroffenen Tumorfoci keinen Hinweis auf derartige PTEN Aberrationen geben (ermittelt durch weitere Gewebespots in den jeweiligen Foci, die mit der Breakapart-Sonde 108 Ergebnisse ausgewertet werden konnten). Auch diese 103 Spots wurden in die Auswertung einbezogen, so dass insgesamt 1.008 Gewebespots für die Heterogenitäts-Analyse zur Verfügung standen. Diese verteilten sich auf 173 verschiedene Tumorfoci, die 136 Prostatektomien entstammten. Um die Heterogenität nicht künstlich zu beeinflussen, sind für dessen Analyse nur solche Tumorfoci verwendet worden, die mindestens drei auswertbare Gewebespots aufwiesen. Zusammenfassend traf dieses Kriterium auf 123 Tumorfoci aus 118 Prostatektomien zu, sodass das Gewebekollektiv 821 Proben umfasste. Auf Grund der strengen Kriterien entfiel eine Großzahl von Tumorfoci, was die Analyse der interfokalen Heterogenität von PTEN unmöglich machte. Die nachfolgenden Ergebnisse beziehen sich daher nur auf die intrafokale Heterogenität. 3.3.7.2. PTEN Heterogenität Von den 123 Tumorfoci, die in die Heterogenitäts-Analyse eingeschlossen wurden, konnten 48 Foci identifiziert werden, die mindestens in einem Gewebespot eine PTEN Aberration (Deletion und/oder Translokation) aufwiesen. Nur vier (8%) dieser Tumorfoci zeigten eine homogene PTEN Inaktivierung in allen auswertbaren Gewebespots. In den verbleibenden 44 Foci (92%) wurden heterogene Muster aus Arealen mit und ohne PTEN Aberrationen nachgewiesen. Die Verteilung der PTEN Inaktivierungen in den homogen bzw. heterogen veränderten Tumorfoci war vergleichbar, wobei in beiden Fällen der Anteil homozygoter Inaktivierungen überwog. Interessanterweise lag bei sechs Tumorfoci (6/44, 13,6%) ein Gemisch aus heteround homozygot inaktivierten Gewebespots vor. Die Ergebnisse der einzelnen Gewebespots von PTEN-aberranten Tumorfoci sind, aufgeteilt nach ihrem Inaktivierungs-Status und der Zugehörigkeit zu homogenen bzw. heterogenen Foci, in Abb. 35 gezeigt. Zur Überprüfung und zur Validierung einzelner Ergebnisse der Heterogenitäts-Analyse von PTEN Aberrationen sind Großflächen-Schnitte (GF) von 15 Tumorfoci analysiert worden. Zu den validierten Fällen gehörten zehn Tumoren, die nur in einem Gewebespot eine heterozygote (fünf) bzw. homozygote (fünf) PTEN Inaktivierung vorliegen hatten, sowie fünf Tumoren, denen nur ein positiver Gewebespot zur Homogenität fehlte. Die GF der Tumoren mit nur einem veränderten Gewebespots zeigten nahe des Stanzdefekts (Entnahmestelle des Bohrkerns für die TMA-Herstellung) die gleichen Veränderungen, die in der TMA-Stanze 109 Ergebnisse ermittelt worden sind. In sechs dieser GF lagen neben den PTEN-veränderten Anteilen auch Tumorareale vor, die einen normalen PTEN Status zeigten. Abbildung 35. Heterogenität der PTEN Inaktivierungen Zusammenfassung aller 48 Tumorfoci, die mindestens eine PTEN Aberration aufwiesen. Alle in einer Reihe gezeigten Gewebespots gehören zu einem Tumorfokus. Die unterschiedlich gefüllten Kreise stellen die Ergebnisse der auswertbaren Gewebespots dar. Die Bedeutung der unterschiedlichen Füllungen ist in einer Legende am unteren, linken Ende der Abbildung zusammengefasst. Die 110 Ergebnisse Zahl der auswertbaren Gewebespots lag zwischen 3 und 10. „Homogen verändert“ umfasst alle Foci, die in allen auswertbaren Gewebespots von einer PTEN Aberration betroffen waren. „Heterogen verändert“ sind alle verbleidenden Foci, die mindestens einen PTEN aberranten Gewebespot aufwiesen, aber nicht in allen betroffen waren. Die fünf anderen GF (mit einem fehlenden, positiven Gewebespot zur Homogenität) wiesen keine Indikation für eine PTEN Veränderung am Stanzdefekt oder in dessen nächster Nähe auf. In allen diesen GF konnten jedoch entfernter liegende Tumorareale gefunden werden, in denen eine PTEN Veränderung vorlag. Die Ergebnisse der GF-Analyse bestätigten den Grad der Heterogenität von PTEN Inaktivierungen und zeigten, dass diese nicht nur ganze Tumorfoci betreffen kann, sondern bereits im Areal eines einzelnen Gewebeblocks vorliegen kann. Zwei Beispiele der Großflächen-Validierung sind in Abb. 36 A (homo del in nur einem Gewebespot des Tumorfokus) und 36 B (het del in nur einem Gewebespot des Tumorfokus) dargestellt. 3.3.7.3. Abfolge und Zusammenhang von PTEN Deletionen und Translokationen Bei 40 der 48 von PTEN aberranten Tumorfoci lagen Deletionen am PTEN Lokus vor. Sieben Foci wiesen neben deletierten Tumoranteilen auch Areale auf, bei denen es zusätzlich zu PTEN Translokationen gekommen ist. In einem weiteren Tumorfokus lag als einzige Veränderung eine heterozygote Translokation ohne gleichzeitige Deletion des verbleibenden Allels vor. Die strukturellen Veränderungen von PTEN waren signifikant mit PTEN Deletionen assoziiert (p=0,003). Das gleichzeitige Vorhandensein von strukturellen Veränderungen und Deletionen ermöglichte es das serielle Auftreten der PTEN Aberrationen zu untersuchen. Hierfür wurden nur solche Tumorfoci herangezogen, die mindestens zwei, von PTEN Aberrationen betroffene Gewebespots aufwiesen. Abbildung 37 zeigt eine schematische Darstellung der, in den sechs Tumorfoci vorherrschenden, PTEN Aberrationen. Bei allen Foci lagen translozierte PTEN Allele vor, wobei drei Foci bereits eine Deletion eines Allels aufwiesen. Die Gewebespots nahegelegener Tumorareal zeigten einen fortschreitenden Zerfall des PTEN Lokus, meist beginnend mit dem (grün-markierten) 3‘ Ende. Nachfolgend konnte ein Verlust des (orange-markierten) 5‘ Endes beobachtet werden, der höchstwahrscheinlich auch zentromerisch gelegene Nachbargene, wie MINPP1 („multiple inositol-polyphosphate phosphatase 1), PAPSS2 („3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2“), ATAD1 („ATPase family, AAA domain containing 1“) und KLLN beeinflusste. 111 Ergebnisse Abbildung 36. Beispiele der Großflächen-Validierung von zwei PTEN heterogenen Tumoren Die beiden oberen Aufnahmen zeigen das Gewebe der Großflächen im DAPI-Filter bei schwacher Vergrößerung. Die Stanzdefekte der Gewebe sind mit einer gestrichelten Linie markiert. Hier wurde der Bohrkern für die TMAHerstellung entnommen. A) Heterogener Tumorfokus analysiert mit der PTEN Breakapart-Sonde. Die Auswertung des Gewebespots auf dem Heterogenitäts-TMA ergab intragenischen Brüche (Verlust des grünen 3‘ Anteils der Breakapart-Sonde), die zu einer homozygoten Inaktivierung führten. Die Sektoren I und II sind nahe am Stanzdefekt gelegene Tumordrüsen. Im unteren Bildteil sind diese Sektoren vergrößert dargestellt. Die integrierten Vergrößerungen in den Sektoren zeigen den Zustand der Breakapart-Sonde. In Sektor I liegen demnach Tumorzellkerne mit intakten PTEN Signalen, in Sektor II Tumorzellkerne mit intragenischen Brüchen. B) 112 Ergebnisse Heterogener Tumorfokus analysiert mit der PTEN Deletions-Sonde. In der Gewebestanze des HeterogenitätsTMAs liegt eine heterozygote Deletion vor. Die Tumorzellkerne in Sektor III weisen keine Deletion, sondern einen normalen Zustand von PTEN auf (2/2). Die Tumorzellkerne in Sektor IV hingegen zeigten ebenfalls heterozygote Deletionen. Abbildung 37. Schematische Darstellung der sechs Tumorfoci mit PTEN Deletionen und Translokationen, die mindestens zwei PTEN aberrante Gewebespots aufgewiesen haben Die schwarzen Kreise symbolisieren die Zentromer-Sonde und die farbigen Kreise die Enden der PTEN FISH Breakapart Sonde (5‘ Ende: orange und 3‘ Ende: grün). Der Zustand eines diploiden Zellkerns mit intaktem PTEN ist in der Abbildung unten links schematisiert. Nach einer zunächst vorliegenden Translokation zerfiel PTEN sequenzweise (meist beginnend mit dem grünen 3‘ Ende) bis zu einem kompletten Verlust des Gens. 3.3.8. 3.3.8.1. PTEN und andere genetische Veränderungen PTEN Inaktivierungen und ERG Überexpression Für 3.067 Tumoren lagen sowohl Ergebnisse für PTEN Inaktivierungen, als auch die ERG Überexpression vor. PTEN Inaktivierungen waren signifikant mit einem positiven ERG Status assoziiert (Abb. 38, p <0,0001). 113 Ergebnisse In ERG negativen Fällen wurden 222 (13,9%) Tumoren mit PTEN Inaktivierungen identifiziert, wobei die Verteilung von hetero- (7,4%) und homozygoten (6,6%) ausgeglichen war. In den ERG positive Tumoren sind mehr als doppelt so viele (497, 33,6%) PTEN Inaktivierungen verzeichnet worden. Der Anteil an homozygoten Inaktivierungen war außerordentlich hoch (PTEN homo inakt : ERG neg versus PTEN homo inakt : ERG pos: p<0,0001). Abbildung 38. Verteilung der PTEN Inaktivierungen in ERG negativen und ERG positiven Tumoren PTEN Inaktivierungen waren auch bei der Auswertung des Heterogenitäts-TMAs signifikant mit der ERG Positivität assoziiert. Für 821 auswertbare Gewebespots (PTEN FISH) lagen für 786 (96%) Tumoren auch ERG IHC Ergebnisse vor. Bei 120 von 332 (36%) ERG positiven Gewebespots konnte ebenfalls PTEN Inaktivierungen nachgewiesen werden, wohingegen nur 26 PTEN Inaktivierungen in 454 (6%) ERG negativen Geweben identifiziert worden sind (p<0,0001, ohne Abbildung). 3.3.8.1.1. Klinische Bedeutung der PTEN Inaktivierung nach ERG Status Die kombinierte Analyse von PTEN und ERG in 2.828 Gewebeproben (Abb. 39) zeigte, dass bei Tumoren mit einer PTEN Inaktivierung unabhängig vom ERG Status eine erhöhte Chance besteht ein biochemisches Rezidiv zu erleiden (p<0,0001). Es wurde kein wesentlicher Einfluss von ERG auf das Überleben von Patienten mit PTEN Inaktivierungen (p=0,1874) festgestellt. Eine signifikant schlechtere Prognose bestand jedoch für ERG negative Karzinome mit normalem PTEN Status (p=0,0163). 114 Ergebnisse Abbildung 39. Kombinierte Kaplan Meier Überlebenskurve von PTEN Inaktivierungen und ERG IHC für die Wahrscheinlichkeit ein biochemisches Rezidiv zu erleiden (Kaplan Meier Überlebenskurve) Bei Tumoren mit einer PTEN Inaktivierung besteht unabhängig vom ERG Status eine erhöhte Chance ein biochemisches Rezidiv zu erleiden. Es besteht ein signifikanter Unterschied (p=0,0163) zwischen ERG negativen und ERG positiven Tumoren, wenn keine PTEN Inaktivierung vorliegt. Heterozygote und homozygote Inaktivierungen sind unter „PTEN inakt“ zusammengefasst worden. 3.3.8.1.2. Abschätzung des zeitlichen Auftretens von ERG Überexpression und PTEN Inaktivierung Der Heterogenitäts-TMA ist für eine vergleichende Analyse zwischen ERG und PTEN herangezogen worden. Dies ermöglichte es Hinweise auf das entwicklungszeitliche Auftreten beider Veränderungen zu erlangen. Für diesen Vergleich sind solche Tumorfoci analysiert worden, die für beide Veränderungen auswertbar waren und mindestens drei auswertbare Gewebespots aufwiesen. Zusammenfassend traf dieses Kriterium auf 34 Tumorfoci zu. Abbildung 40 zeigt die Verteilung der PTEN Inaktivierungen innerhalb ERG positiver Tumorfoci. 19 der 34 Tumorfoci waren homogen ERG positiv. Von den 19 homogenen Tumorfoci zeigten 3 ebenfalls PTEN Inaktivierungen in allen auswertbaren Gewebespots. Bei den verbleibenden 16 Foci hingegen lag nur fokal eine Inaktivierung von PTEN vor. In zehn Tumorfoci, in denen größer Areale von PTEN Veränderungen vorlagen (Daten nicht gezeigt), konnten keine fokalen ERG positiven Anteile nachgewiesen werden (16/19 ERG positiv - fokal PTEN-aberrant versus 0/10 PTEN-aberrant - fokal ERG positiv, p<0,0001). In den drei verbleibenden Tumorfoci lagen PTEN-aberrante und ERG positive Areale (in zwei 115 Ergebnisse Foci) bzw. Areale einer Co-Veränderung von PTEN und ERG in Nachbarschaft zu PTENaberrant Arealen (ein Fokus) vor. Abbildung 40. Verteilung der PTEN Inaktivierungen in ERG positiven Tumorfoci in Abhängigkeit von der Anzahl ihrer auswertbaren Gewebespots Rote Balken entsprechen Gewebespots, die sowohl ERG positiv, als auch PTEN inaktiviert sind. Blaue Balken zeigen Gewebespots an, bei denen nur eine ERG Positivität vorliegt, aber keine PTEN Inaktivierung nachgewiesen werden konnte. Grüne Balken markieren Gewebespots mit PTEN Inaktivierungen als alleinige Veränderung. 3.3.8.2. PTEN Inaktivierung und p53 Ergebnisse zur PTEN Inaktivierung und zur p53 IHC bzw. TP53 FISH lagen für 2.987 bzw. 2.561 Prostatakarzinome vor (Abb. 41). Hetero- und homozygote PTEN Inaktivierungen wurden sehr viel häufiger in p53 positiven Tumoren (14,8% bzw. 32,7%) detektiert, als in p53 negativen (6,8% bzw. 13,1%, p<0,0001). Auch bei Karzinomen mit einer heterozygoten TP53 Deletion traten PTEN Inaktivierungen (het inakt: 8,9%, homo inakt: 18,7%) häufiger auf, als in TP53 normalen Tumoren (het inakt: 7,4%, homo inakt: 14,1%, Abb. 40, p=0,0294). Eine kombinierte Analyse von PTEN Inaktivierungen und p53 in 2.754 Tumoren zeigte, dass Tumoren, die sowohl p53 positiv als auch PTEN inaktiviert waren, eine besonders schlechte Prognose aufwiesen. Allerdings konnte keine signifikant schlechtere Prognose zu solchen Tumoren festgestellt werden, die zwar p53 positiv, aber PTEN normal waren (p=0,1249). P53 positive Tumoren wiesen demnach, unabhängig vom PTEN Status, eine signifikant schlechtere Prognose auf (Abb. 42). 116 Ergebnisse Abbildung 41. Verteilung der PTEN Inaktivierungen in (A) p53 IHC negativen und positiven Tumoren und (B) in TP53 FISH normalen und deletierten Tumoren Abbildung 42. Kombinierte Kaplan Meier Überlebenskurve von PTEN Inaktivierungen und p53 IHC für die Wahrscheinlichkeit ein biochemisches Rezidiv zu erleiden P53 positive Tumoren zeigen im Allgemeinen eine signifikant schlechtere Prognose. Die PTEN Inaktivierung wird prognostisch nur relevant, wenn p53 intakt ist (p<0,0001). Heterozygote und homozygote Inaktivierungen sind unter „PTEN inakt“ zusammengefasst worden. 117 Ergebnisse 3.4. Validierung der genomischen Aberrationen an Zytobande 3p13 und funktionelle Charakterisierung betroffener Gene 3.4.1. Technische Aspekte der FOXP1 FISH Analysen 3p13 Deletionen wurden mittels einer FISH Deletions- bzw. einer Breakapart-Sonde FOXP1 ausgewertet. Für die Analysen wurde eine Teilmenge des Prognose-TMAs verwendet, die 3.261 Tumorproben umfasste (die klinisch-pathologischen Patientendaten dieser Teilmenge sind in Tab. A 2 im Anhang dargestellt). Bei der Deletions-Analyse konnte für insgesamt 1.300 Tumoren ein Ergebnis ermittelt werden. Die verbleibenden 1.961 Tumorproben wurden wegen fehlender Gewebespots, unzureichendem Tumorgehalt oder suboptimaler Hybridisierung ausgeschlossen. Die Breakapart-Analyse war in 1.738 Tumorproben erfolgreich. Die restlichen Gewebe mussten ebenfalls wegen der o. g. Probleme exkludiert werden. Der Vergleich der Ergebnisse beider Sonden-Arten zeigte ein hohes Maß an Konkordanz (Korrelations-Faktor 0,98, Tab. 26, p<0,0001). Tabelle 26. Korrelation von FOXP1 FISH Deletions- und FISH Breakapart-Sonde Vergleich der Ergebnisse in Gewebespots, die für beide Sonden auswertbar waren. FOXP1 Breakapart: FOXP1 Breakapart: norm (n = 1.005) het del (n = 152) FOXP1 Deletion: norm (n = 1.010) 1.001 (99,1%) 9 (0,9%) FOXP1 Deletion: het del (n = 147) 4 (2,7%) 143 (97,3%) p Wert <0,0001 Mehr als 90% der ausgewerteten Tumoren zeigten in der Deletions-Analyse einen diploiden Status. Es konnte daher angenommen werden, dass der FOXP1 Status in Tumoren ohne das Ergebnis der Zentromer 3 Sonde allein durch die Breakapart-Sonde ermittelt werden konnte. In 90 Tumoren wurde der FOXP1 Status nur durch die Deletions-Sonde beurteilt und eine intragenische Deletion (Deletionen deren Start- bzw. Endpunkt innerhalb von FOXP1 liegen) oder Translokation nicht angenommen. Für die Korrelation mit klinisch- pathologischen Parametern und anderen chromosomalen Veränderungen sind daher die Ergebnisse der FOXP1 Deletions- und Breakapart-Sonde kombiniert worden. 118 Ergebnisse 3.4.2. FOXP1 FISH Analysen Die Einzel-Analysen der verwendeten FISH Sonden ergaben einen heterozygoten Verlust von FOXP1 in 188/1.300 auswertbaren Tumoren in der Deletions-Analyse (14,5%) und von 233/1.738 Tumoren in der Breakapart-Analyse (13,4%). Bei Auswertung der BreakapartSonde sind neben Deletionen, die den gesamten Genlokus umfassten, weitere 50 Tumoren mit intragenischen Brüchen detektiert worden, die den Verlust des zentromerisch gelegenen 5‘ Endes (n=32, 1.9%) bzw. den des telomerischen 3‘ Endes von FOXP1 (n=18, 1%) bedeuteten (Daten nicht gezeigt). Überdies konnten durch die Breakapart-Analyse 21 (1,2%) Tumoren identifiziert werden, bei denen eine FOXP1 Translokation vorlag. Die Ergebnisse der FOXP1 Deletions- und Breakapart Analyse sind zu einer Gesamtzahl von 1.828 auswertbaren Tumorproben zusammengezogen worden. Die Deletionsrate im kombinierten Datenset lag bei 13,8% (komplette Deletion von FOXP1, die den gesamten Genlokus umfassten, in 252/1.828 Tumoren), weitere 2,7% entfielen auf intragenische Deletionen. Komplette und intragenische Deletionen sind für die nachfolgenden Analysen als „Deletionen“ zusammengefasst worden und ergaben somit eine Verlustrate von 16,5%. Homozygote FOXP1 Deletionen konnten nicht verzeichnet werden. Repräsentative Mehrfarb-Aufnahmen der FOXP1 FISH Deletions- und Breakapart-Analyse sind in Abbildung 43 gezeigt. Abbildung 43. Mehrfarb-Aufnahmen der FOXP1 FISH DNA-Sonden in einzelnen Zellkernen DeletionsSonde: A) Normaler Zellkern mit zwei grünen FOXP1 und zwei orangefarbenen Zentromer 3 Signalen (Zen 3, B) heterozygote Deletion von FOXP1 - Verlust eines grünen Signals, bei Vorhandensein zweier Zentromer-Signale; Breakapart-Sonde: C) zeigt denselben Fall wie in B), ausgewertet mit der Breakapart-Sonde. Hier liegt nur noch ein intaktes gelbes Signal vor, D) und E) zeigen intragenische Brüche mit Verlust des grünen 5’ Signals (D) bzw. des orangefarbenen 3’ Signals (E), F) heterozygote Translokation von FOXP1 mit zwei deutlich separierten grünen und orangefarbenen Signalen neben einem intakten gelben Signal. 119 Ergebnisse 3.4.2.1. Assoziationen von FOXP1 Deletionen zu klinisch-pathologischen Parametern Die FOXP1 Deletion (komplett und intragenisch) waren signifikant mit fortgeschrittenem Tumorstadium (p<0,0001), hohem Gleason Grad (p=0,0125) und einem erhöhten präoperativen PSA Wert (p=0,0125) assoziiert. FOXP1 Translokationen waren häufiger in fortgeschrittenen Tumorstadien (pT2: 0,95%, pT≥3b+4: 1,87%) und hohem Gleason Grad (Gl. ≤3+3: 1,05%; Gl. ≥4+3: 1,33%) zu finden. Diese Assoziationen konnten auf Grund geringer Fallzahlen allerdings nicht statistisch gesichert werden. Alle Ergebnisse sind in Tab. 27 zusammengefasst. Tabelle 27. Assoziationen von FOXP1 Deletionen und Translokationen zu klinisch-pathologischen Parametern * Die p Werte gelten nur für Deletionen. Diese umfassen den FOXP1 Lokus komplett oder nur anteilig (intragenische Brüche). Parameter n Alle Tumoren p Werte 3.261 FOXP1 FISH-Status Deletion komplett / Translokationen (%) intragenisch (%) 13,8 / 2,7 1,2 1.828 Tumorstadium pT2 pT3a pT3b+4 2.153 643 384 1.153 388 268 12,23 / 2,25 13,14 / 3,09 22,01 / 4,48 0,95 1,29 1,87 <0,0001* Gleason Grad ≤3+3 3+4 ≥4+3 1.476 1.364 325 762 822 225 11,81 / 1,84 15,33 / 3,53 15,56 / 3,11 1,05 1,22 1,33 0,0125* LymphknotenpN0 pN+ 1.587 99 916 57 15,07 / 3,38 21,05 / 3,51 0,98 1,75 0,2543* Präoperativer PSA 529 <4 1.745 4-10 669 10-20 233 >20 276 955 400 152 10,87 / 1,45 13,72 / 2,51 14,5 / 2,0 17,76 / 7,24 1,81 0,73 1,75 1,32 0,0125* 1.397 411 14,03 / 2,29 13,38 / 4,14 1,07 1,46 0,5466* Sektionsrand frei negativ positiv 2.555 665 n 120 Ergebnisse 3.4.2.2. Klinische Bedeutung der FOXP1 Deletionen Für insgesamt 1.724 Tumorproben lagen ebenfalls klinische Verlaufsdaten vor. Das Auftreten von FOXP1 Deletionen war signifikant mit einem erhöhten Risiko verbunden, frühzeitig ein biochemisches Rezidiv zu erleiden (Abb. 44, p=0,0015). Abbildung 44. Assoziation von FOXP1 Deletionen und der Wahrscheinlichkeit ein biochemisches Rezidiv zu erleiden (Kaplan Meier Überlebenskurve) In die Analyse wurden nur Tumoren mit kompletten oder intragenischen Deletionen eingeschlossen (20 Tumoren mit FOXP1 Translokationen sind exkludiert). 3.4.3. 3.4.3.1. FOXP1 und andere genetische Veränderungen FOXP1 Deletionen und ERG Überexpression Insgesamt lagen für 1.793 Tumoren Ergebnisse der FOXP1 FISH und ERG IHC vor. FOXP1 Deletionen traten in 970 der ERG positiven (23,2%) bzw. in 823 ERG negativen (8,9%) Tumoren auf und waren signifikant mit ERG positiven Tumoren assoziiert (p<0,0001). Die Anzahl der FOXP1 Translokationen (n=20) war für eine Signifikanz-Berechnung zu gering, lag aber, sowohl in ERG negativen, als auch ERG positiven Karzinomen bei ca. 1% (Abb. 45). 121 Ergebnisse Abbildung 45. Verteilung von FOXP1 Deletionen und Translokationen in ERG negativen und positiven Tumoren * Der p Wert gilt nur für FOXP1 Deletionen. Eine prognostische Relevanz von FOPX1 Deletionen konnte nur in ERG positiven (p=0,0004, Abb. 46 B), nicht aber in ERG negativen Tumoren festgestellt werden (p=0,1513, Abb. 46 A). Abbildung 46. Assoziation von FOXP1 Deletionen und der Wahrscheinlichkeit ein biochemisches Rezidiv zu erleiden unter Berücksichtigung des ERG Status (Kaplan Meier Überlebenskurve) A Prognostische Relevanz von FOXP1 Deletionen in ERG negativen Tumoren, B Prognostische Relevanz von FOXP1 Deletionen in ERG positiven Tumoren. 122 Ergebnisse 3.4.3.2. Assoziationen von FOPX1 Aberrationen und PTEN Inaktivierung Für 1.326 Tumoren lagen Ergebnisse der FOXP1 FISH, PTEN FISH und der ERG IHC vor. Die FOXP1 Deletionen korrelierten signifikant mit der PTEN Inaktivierung (p<0,0001), wenn alle Tumoren parallel analysiert wurden, sowie in der Teilmenge der ERG negativen Karzinome (p=0,002). In ERG positiven Tumoren lag keine signifikante Assoziation vor (p=0,1558; Tab. 28) Tabelle 28. Korrelation von FOXP1 Aberrationen, PTEN Inaktivierung und deren Verteilung in den Teilmengen der ERG negativen und ERG positiven Tumoren PTEN FISH Status alle Tumoren normal 1.082 (n=1.326) inakt 244 FOXP1 FISH Deletionen Translokationen (%) (%) 14,51 1,29 27,05 2,05 <0,0001 ERG neg (n=621) normal inakt 570 51 7,37 23,53 1,23 0 0,002 ERG pos (n=685) normal inakt 494 190 22,87 27,89 1,21 2,63 0,1558 In 685 der ERG positiven Karzinomen traten nur 7,7% der PTEN Inaktivierung und FOXP1 Deletion gemeinsam auf (Abb. 47). In 20% bzw. 16,5% der ERG positiven Tumoren stellten PTEN bzw. FOXP1 unabhängige genomische Veränderungen dar. Zum Vergleich wurden FOXP1 und PTEN nur in 1.9% der Tumoren als codeletiert identifiziert. Ansonsten lagen PTEN (6,3%) und FOXP1 (6,8%) Veränderungen unabhängig voneinander vor. Tumoren mit einer Codeletion von FOXP1 und PTEN wiesen zwar eine signifikant schlechtere Prognose auf als solche, bei denen nur eine FOXP1 Deletion vorlag (p<0,0001), allerdings konnte keine zusätzliche prognostische Relevanz von FOXP1/PTEN Codeletionen gegenüber PTEN Inaktivierungen festgestellt werden, wenn diese die einzige Veränderung war (p=0,8460, Abb. 48). 123 Ergebnisse Abbildung 47. Verteilung der PTEN Inaktivierungen und FOXP1 Deletionen in ERG negativen und ERG positiven Tumoren Abbildung 48. Kombinierte Kaplan Meier Überlebenskurve von FOXP1 Deletionen (Translokationen exkludiert), PTEN Inaktivierungen und der Wahrscheinlichkeit ein biochemisches Rezidiv zu erleiden 124 Ergebnisse 3.4.4. Assoziation zwischen den 3p13 deletierten Genen und ihrer Expression Für die mRNA Expressions-Analyse der Gene im Kernbereich der 3p13 Deletion sind 14 Tumoren mit und 18 ohne eine FOXP1 Deletion ausgewählt worden. Tumoren mit Deletion zeigten nur eine leichte Reduzierung der mRNA Expression bei FOXP1 und GXYLT2 (p=0,106 bzw. p=0,12). Eine signifikante Reduktion der mRNA Expression konnte jedoch bei RYBP (p=0,0005), SHQ1 (p=0,0026) und EIF3E4 (p=0,018) festgestellt werden. Eine mRNA Expression von GPR27 und PROK2 war nicht nachweisbar (Abb. 48). Eine zweite Expression-Analyse von 60 Laser-mikrodissektierten Tumorproben (41 FOXP1 deletierte und 19 nicht deletierte Proben) zeigte zwar eine 1,3-fachen Expressions-Verlust von FOXP1 in deletierten Tumoren (relative Genexpression in deletierten Tumoren = 8,440 ± 710, in nicht-deletierten Tumoren: 10,834 ± 1043) aber auch hier war der Zusammenhang nicht statistisch signifikant (Abb. 49, p=0,0628). Abbildung 49. Einfluss der 3p13 Deletion auf die mRNA Expression der Gene im deletierten Kernbereich Die Balken zeigen die relative mRNA Expression der Gene FOXP1, EIF4E3, GRP27, PROK2, RYBP, SHQ1 und GXYLT2 in nicht deletierten (hellgrau) und deletierten (dunkelgrau) Tumoren. Die mRNA Expression wurde über Taqman-PCR ermittelt und gegen die mRNA Expression des Housekeeper-Gens GAPDH normalisiert. Soweit nicht anders angegeben, liegen die p Werte über 0,05. 125 Ergebnisse Abbildung 50. mRNA Expression von FOXP1 in Laser-mikrodissektiertem Gewebe von deletierten und nicht deletierten Tumoren Für 1.300 Tumoren lagen Ergebnisse der FOXP1 FISH und der immunhistochemischen Expressions-Analyse vor. Es wurde kein Zusammenhang zwischen FOXP1 Deletionen und der Expression von FOXP1 festgestellt (p=0,4626, Abb. 50). Abbildung 51. Korrelation von FOXP1 FISH und FOXP1 Expression (IHC) * p Wert gilt nur für FOXP1 FISH norm versus Deletion. Die FOXP1 Expression war ausschließlich innerhalb der Zellkerne detektierbar. Neben sekretorischen Zellen, konnte die FOXP1 Expression auch in Basalzellen und vereinzelt im Stroma und in inflammatorischen Zellen beobachtet werden (Abb. 52). 126 Ergebnisse Abbildung 52. Beispiele der immunhistologischen FOXP1 Färbung Moderate FOXP1 Färbung in normalem prostatischen Gewebe (A) und einem Prostatakarzinom (B). C) Starke FOXP1 Färbung bei einem Prostatakarzinomen. Die jeweiligen Vergrößerung zeigen auch FOXP1 Expression in den Basalzellen (+) des prostatischen Normalgewebes, in Stroma-Zellen (*) und Entzündungs-Zellen (). 127 Ergebnisse 3.4.5. Rolle von FOXP1, SHQ1 und RYBP als Tumorsuppressorgene Für die weiterführenden Untersuchungen der potentiell Tumor-relevanten Gene FOXP1, RYBP und SHQ1 wurde zunächst deren Expression in den sechs verfügbaren ProstataZelllinien, BPH1, DU-145, LNCaP, PC-3, RWPE-1 und VCaP, ermittelt. Alle drei Gene wurden, wenn auch im unterschiedlichen Ausmaß, in den getesteten Zellline exprimiert (Abb. 53 A). Vor allem FOXP1 zeigte eine variable Expression, von einer geringen Expression in DU-145 bis zu einer hohen Expression in VCaP. Abbildung 53. Relative mRNA Expression von FOXP1, RYBP, SHQ1, dem Androgenrezeptor AR und ERG in den Prostata-Zelllinien BPH1, DU-145, LNCaP, PC-3, RWPE-1 und VCaP A) FOXP1, RYBP und SHQ1, B) Androgenrezeptor AR und ERG, (normalisiert gegen GAPDH). Des Weiteren wurden die Expression von ERG und dem Androgenrezeptor in den besagten Zelllinien ermittelt (Abb. 53 B). Die Expression von AR und ERG war in VCaP besonders 128 Ergebnisse hoch. Diese Ergebnisse waren zu erwarten, da diese Zelllinie sowohl eine AR Amplifikation aufweist, als auch eine Translokation, die zur TMPRSS2:ERG Fusion führt 68, 184. Für LNCaP ist ebenfalls bekannt, dass sie den Androgenrezeptor exprimiert185. Um den Einfluss einer Überexpression von FOXP1, RYBP und SHQ1 auf das Zellwachstum zu untersuchen, wurde mittels Überexpressions-Konstrukten ein Kolonieformations-Assay (klonogener Test) an den Zelllinien BPH-1 und PC-3 durchgeführt. Als Kontrolle und CoTransfektions-Konstrukt (zur Antibiotika-Selektion) diente pLKO.1-shGFP. Zu vergleichenden Zwecken sind die bekannten Tumorsuppressorgene PTEN und RB1 in die Analyse eingeschlossen worden. Die Überexpression von allen drei Genen verursachte, sowohl in BPH-1 als auch in PC-3 eine massive Wachstums-Inhibierung der Zellen (Abb. 54 A und B). Eine ähnliche Wachstums-Inhibierung haben auch PTEN und RB1 gezeigt. Abbildung 54. Kolonieformations-Assay an BPH-1 und PC-3 Zellen Fähigkeit von (A) BPH-1 und (B) PC-3 Zellen nach Überexpression von FOXP1, RYBP, SHQ1, RB1 und PTEN zu wachsen bzw. Kolonien zu bilden. Als Kontrolle ist das pLKO.1-shGFP Konstrukt verwendet worden (in den Abbildungen jeweils links gezeigt). Soweit nicht anders angegeben liegen die p Werte unter 0,03. In einem zweiten Kolonieformations-Assay sollte der Einfluss des Expressions-Verlustes von FOXP1, RYBP und SHQ1 auf das Zellwachstum untersucht werden. 129 Ergebnisse Der shRNA-vermittelte Knockdown von FOXP1 und SHQ1 in der BPH-1 Zelllinie zeigte eine, mit dem Knockdown von PTEN vergleichbare Hemmung des Zellwachstums. Dies lässt eine ähnlich essentielle Rolle für FOXP1 und SHQ1 für das Überleben und das Wachstum von Prostatazellen vermuten. Eine statistisch signifikante Inhibierung durch den Knockdown von RYBP konnte nicht festgestellt werden (Abb. 55). Abbildung 55. Effekt des shRNA-vermittelten Knockdowns von FOXP1, RYBP und SHQ1 auf das Zellwachstum von BPH-1 Zellen bzw. die Fähigkeit von BPH-1 Zellen Kolonien zu bilden Das Zellwachstum der BPH-1 Zellen ist nach Depletion von FOXP1, SHQ1 und PTEN, nicht aber nach Depletion von RYBP und RB1 reduziert. Als Kontrolle diente das pLKO.1-shGFP Konstrukt, welches in der Abbildung links dargestellt ist. 3.4.6. Einfluss von AR und ERG auf die Expression von FOXP1, RYBP und SHQ1 In parentalen LNCaP Zellen konnte keine ERG Expression und eine moderate Expression von AR nachgewiesen werden (Abb. 56 A). Zur Untersuchung des Einflusses von ERG und einer möglichen Androgenrezeptor-abhängigen Aktivierung der Transkription von FOXP1, RYBP und SHQ1 sind zunächst ERG überexprimierende LNCaP Zellen hergestellt worden. Abbildung 56 A zeigt die erfolgreiche Transfektion von LNCaP Zellen mit dem ERG überexprimierenden Konstrukt MSCV-ERG über den Nachweis der ERG mRNA-Expression. Der Einfluss von Androgen in Form von Dihydrotestosteron und von ERG auf die Expression von FOXP1, RYBP und SHQ1 wurde in parentalen LNCaP (mit pLKO.1-shGFP) und ERG überexprimierenden LNCaP (MSCV-ERG) Zellen vor und nach der Behandlung mit Dihydrotestosteron (+DHT) analysiert. Als Kontrollen wurden zwei AR-abhängige Gene 130 Ergebnisse (TMPRSS2 und FKBP5 („FK506 binding protein 5“)186) mit in die Analyse eingeschlossen. Nach der Behandlung mit 100nM DHT konnte ein massiver Anstieg der Expression von TMPRSS2 und FKBP5 verzeichnet werden (Abb. 56 B und C). Ein derartiger Einfluss auf die Expression von FOXP1 und RYBP konnte weder bei Überexpression von ERG, noch nach DHT Stimulation oder in Kombination beider Faktoren festgestellt werden (Abb. 55 D und E). Im Falle von SHQ1 ergab die Analyse sogar eine Unterdrückung der Expression nach der DHT Behandlung (Abb. 56 F). Abbildung 56. Einfluss von ERG und der AR-abhängigen Aktivierung auf die Expression von FOXP1, RYBP und SHQ1 und die, der AR-responsiven Gene TMPRSS2 und FKBP5 A) Relative mRNA Expression von ERG und AR in ERG überexprimierenden (LNCaP MSCV-ERG) und parentalen LNCaP Zellen (KontrollTransfektion mit pLKO.1-shGFP), B) und C) Relative mRNA Expression von TMPRSS2 (B) und FKBP5 (C) in MSCV-ERG LNCaP und parentalen LNCaP Zellen mit (+DHT) und ohne Dihydrotestosteron-Behandlung. D), E) und F) Relative mRNA Expression von FOXP1, RYBP und SHQ1 in MSCV-ERG LNCaP und parentalen LNCap Zellen mit (+DHT) und ohne Dihydrotestosteron-Behandlung. Eine fehlende Antwort auf die AR-Stimulation ist für FOXP1 in einem weiteren, unabhängigen Versuch bestätigt worden. In einem Luziferase-Assay wurde die Aktivität von Luziferase (Luc) über Konstrukte, die neben diesem Gen auch Promotoren der ARresponsiven Gene Probasin187, 188, MMTV189 oder PSA190, bzw. mit Promotoren von FOXP1 oder GAPDH (als Kontrolle) enthielten, getestet. Die Luziferase-Aktivität der AR-responsiven Konstrukte war nach der Behandlung mit DHT bei Probasin und PSA massiv und bei MMTV im Vergleich zur GAPDH-Kontrolle sehr erhöht. Weder das Luziferase-Konstrukt mit dem Promotor von GAPDH, noch das des FOXP1 131 Ergebnisse Promotors zeigten eine DHT-abhängige Änderung der Luziferase-Aktivität (Abb. 57). Zusammenfassend zeigten FOXP1, RYBP und SHQ1 keine Transaktivierung durch die ERG Überexpression und den Androgenrezeptor. Abbildung 57. Einfluss von Dihydrotestosteron (DHT) auf die Aktivität des FOXP1 Promotors in LNCaP Zellen, im Vergleich zu den bekannten AR-responsiven Promotoren von PSA, Probasin und MMTV Der GAPDH Promotor diente als Kontrolle. Die Abbildung zeigt die Luziferase-Aktivität der fünf verschiedenen Konstrukte ohne (w/o) und mit (w) DHT Behandlung im Doppelansatz. Die Luziferase-Aktivität ist relativ zu Renilla dargestellt (Ratio Photinus:Renilla). 132 Diskussion 4. Diskussion Die molekularbiologische Forschung der letzten Dekade belegt unbestritten, dass die Mechanismen, die zur Entstehung von Krebs führen können, nicht nur auf Mutationen in Genen und regulativen Sequenzen beruhen, sondern vielmehr auch auf genomischen Aberrationen, die lange chromosomale Abschnitte betreffen können. Zu diesen gehören Inversionen, Translokationen, Deletionen und Duplikationen. Die zwei Letztgenannten, häufig unter dem Begriff CNV (copy number variation, Kopiezahl-Veränderung) zusammengefasst, können in einer Größenordnung von 1 kb bis zu mehreren 100 kb auftreten und beeinflussen in ihrer Gesamtheit mehr Anteile des humanen Genoms, als die ebenfalls häufig auftretenden Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNP)191, 192 . CNV können Gene ruptierten, die Kopiezahl Dosis-sensitiver Gene verändern oder zu Genfusionen führen und so einen malignen Phänotyp verursachen32. Ziel der Prostatakrebs-Forschung und der Krebsforschung im Allgemeinen ist es, die molekularen Grundlagen und Mechanismen von Tumorerkrankungen zu untersuchen, um genomische Veränderungen zu identifizieren, die diagnostisch, prädiktiv oder sogar therapeutisch genutzt werden können. Eine der Zielsetzungen der vorliegenden Arbeit war die DNA-Profilierung von Prostatakarzinomen, unter Verwendung der höchauflösenden SNP-Array Technologie. Die 77 untersuchten Prostatakarzinome wiesen Kopiezahl-Veränderungen im unterschiedlichen Ausmaß auf. Einige Tumoren zeigten vereinzelte bis keine KopiezahlVeränderungen und gehörten klinisch-pathologisch eher zu den weniger aggressiven (Gleason Grad ≤3+4) Karzinomen. Andere hingegen wiesen viele CNV auf und ließen sich in die Gruppe der fortgeschrittenen, de-differenzierten Tumoren (Gleason Grad ≥ 4+3) einordnen. Die Resultate der vorliegenden Arbeit deuten darauf hin, dass sich Prostatakarzinome auf zytogenetischer Ebene grundlegend von anderen soliden Tumorentitäten unterscheiden, da Kopiezahl-Verluste um den Faktor fünf häufiger auftreten, als Zugewinne. Eine detaillierte Analyse zeigte, dass Kopiezahl-Verluste bevorzugt an den Zytobanden 10q23.31 (19,5%), 15q11.1-11.2 (19,5%), 17q21.31 (18,2%), 3p13 (18,2%), 5q21.1 (16,9%), 6q15 (16,9%), 14q11.2 (16,9%), 16q24.1 (16,9%), 5q13.2 (15,6%), 12p13.2-13.1 (14,3%), 21q22.3 (14,3%), 2q21.2 (13%), 2q37.3 (13,0%), 12p13.31 (13%), 13q22.1 (13%), 16q22.222.3 (13%), 8p21.3, 13q14.1 (11,7%), 17q21.31 (11,7%, 2 MB zentromerisch neben einem 133 Diskussion weiteren Peak an dieser Zytobande), 8p22 (10,4%), 2p21 (9,1%), 8p11.21 (9,1%), 8q24.3 (9,1%), Xq25 (9,1%), 1q42.2-42.3 (7,8%), 2p32.2 (7,8%) und 17q13.1 (7,8%) auftraten. Eine ganze Reihe dieser deletierten Zytobanden umfasste die Genloci bekannter Tumorsuppressorgene aus. Zu diesen zählten CHD1 (5q21.1)65, MAP3K7 (6q15)67, LPL (8p21.3, nahe NKX3.1)52, (13q22.1) 156, 53, 160 157 , PTEN (10q23)59, RB1 (13q14.1)56, , ZFHX3 (16q22.2-22.3) 158, 57 , KLF5 und DACH1 159 , BRCA1 (17q21.31)162-164 und TP53 (17q13.1)171. Des Weiteren konnten CNV an Genen identifiziert werden, denen bereits eine putative Rolle als Tumorsuppressorgen beim Prostatakarzinom oder zumindest bei einer anderen Tumorentität zugeschrieben werden konnte. Diese Gene waren ARID4B (1q42.242.3)168, LYPD1 (2q21.2) 152 , ING5 und NEU4 (2q37.3)154, 155 , FOXP1, RYBP und SHQ1 (3p13)43, CDK7 (5q13.2)148 MSR1 (8p22)165, KLLN (10q23)145, ETV6 und CDKN1B (12p13.213.1)149-151, STAG2 (Xq23)167. Zusätzlich dazu sind CNV nachgewiesen worden, an deren Bruchpunkten Translokations-Partner von Fusionsgenen liegen. THADA (2p21)166, ASXL2 (2p32.2)169, 170, NCKAP5 (2q21.2)153, ETV4 und UBTF (17q21.31)161, TMPRSS2 (21q22.3)68 waren solche Gene. Auch die Ergebnisse der relevanten aCGH-Studien der letzten Jahre40-43 belegten, dass Prostatakarzinome sehr viel öfter von Kopiezahl-Verlusten betroffen sind und Tumorsuppressorgenen folglich eine weitaus bedeutendere Funktion zukommt als Onkogenen. Der Vergleich, der am häufigsten deletierten Bereiche mit den Ergebnissen anderer Studien zeigte im Großen und Ganzen ähnliche Zytobanden, die allerdings ungleich oft betroffen waren. Vor allem an Zytobande 8p21 wurden außerordentlich häufig Deletionen beschrieben, was im Gewebekollektiv der aktuellen Arbeit nicht festgestellt werden konnte. Differenzen lassen sich über unterschiedliche Auswertestrategien und Schwellenwerte (ab welcher Intensität eine Veränderung als real angesehen wird), Untersuchungs-Plattformen (Auflösungsvermögen), aber auch über die Zusammensetzung der Gewebeproben und die Qualität der untersuchten Tumor-DNA erklären. Prostatakarzinome sind in ihrer physischen Ausdehnung per se relativ klein und weisen eine hohe zytologische Heterogenität auf. Ein Faktor, der die Ergebnisse einer DNA-Profilierung stören und „verwässern“ könnte43. Um die Verunreinigung der Tumor-DNA mit Stroma-DNA möglichst gering zu halten, wurden die Kriterien für die Auswahl der Gewebe für die DNA-Profilierung der vorliegenden Arbeit strikt gefasst und nur solche Tumoren verwendet, deren Tumorgehalt bei mindestens 70% lag. Auch die Anzahl der untersuchten Proben kann eine mögliche Erklärung für die unterschiedlich ausfallenden Häufigkeiten sein. So fällt besonders bei Taylor et al.43 der enorme Anteil an 8p21-deletierten Proben auf. Allerdings umfasst deren Gewebekollektiv neben 181 primären Karzinomen auch 12 Xenografts bzw. Zelllinien und 37 Metastasen, für die bekannt ist, genetisch außerordentlich instabil und häufig von Kopiezahl-Veränderungen 134 Diskussion betroffen zu sein. Die Unterschiede in den Resultaten machen deutlich, dass eine DNAProfilierung allein nicht ausreichend ist, um eine Aussage über die Häufigkeit und die TumorRelevanz einer genomischen Veränderung treffen zu können. Es bedarf immer einer zweiten Methode, mit der die Ergebnisse an einem großen, gut charakterisierten Gewebekollektiv validiert werden sollten. Rekurrente Kopiezahl-Zugewinne waren u. a. an den Genloci der Onkogene FGFR1 (8p11)50, 174, 175 und WISP1179 (8q24.22-24.23, nahe dem Onkogen c-MYC46, 178) zu finden. Zugewinne auf 8q sind eine der häufigsten chromosomalen Veränderungen beim fortgeschrittenen Prostatakarzinom. Sie sind mit einem aggressiven Phänotyp assoziiert, entwickeln sich aber häufig erst während der Tumorprogression193-195. Die einzig hochgradige und als Therapieziel genutzte Amplifikation eines Genes196, 197 , die des Androgenrezeptors, konnte in den untersuchten Proben nicht nachgewiesen werden, da diese Genveränderung mit metastasierten bzw. Hormon-refraktären Tumoren assoziiert ist51, 198 und solche nicht in die DNA-Profilierung eingeschlossen worden sind. In annähernd 70% der untersuchten Tumorproben wurden massive Zugewinne auf Chromosom Y detektiert. Sie betrafen 26 MB und machen daher mehr als 50% des Chromosoms (Gesamtgröße: ~59 MB) aus. Solche Zugewinne stehen im drastischen Gegensatz zu den Ergebnissen bestehender Analysen, die nur Kopiezahl-Verluste199, 200 bzw. keine rekurrenten CNV201 an Chromosom Y feststellen konnten. Die auf Chromosom Y abgefragten Datenpunkte (SPN) sind verhältnismäßig sporadisch verteilt und lagen mit einer ungefähren Auflösung von 100 kb weit unter dem Durchschnitt der SNP Arrays (normalerweise ~1 kb). Bei dieser CNV sollte eher davon ausgegangen werden, dass es sich mehr um ein Artefakt der Arrays, als um ein tatsächliches genetisches Ereignis handelt. An mehreren Zytobanden lagen variablen Kopiezahl-Veränderungen vor, an denen sowohl Verluste, als auch Zugewinne verzeichnet werden konnten. Besonders 17q21.31, dem Genlokus von KANSL1 („KAT8 regulatory NSL complex subunit 1“), zeigte vermehrt Deletionen (18,2%) oder Zugewinne (22,1%). KANSL1 kodiert ein Protein, dass Teil eines Komplexes zur Histon-Acetylierung und somit an der Chromatin-Modellierung beteiligt ist202. Eine regulative Rolle bei der Transkription von Genen wäre daher nachvollziehbar; die Relevanz für eine kanzerogene Entartung hingegen noch unbekannt. Allerdings lässt sich KANSL1 durch seine variablen Kopiezahl-Veränderungen (entweder zugewonnen oder verloren) schwer in die Kategorie eines Tumorsuppressor- bzw. Onkogens einordnen. Für die CNV an 17q21.31 ist jedoch bekannt, dass sie mit einem genetischen Syndrom assoziiert ist147 und sich phänotypisch in Sprachstörungen, niedrigem Blutdruck und bestimmten 135 Diskussion markanten Gesichtszügen äußern kann202, 203 . Da es sich bei dieser CNV aller Wahrscheinlichkeit nach nicht um eine konstitutionelle, sondern vielmehr um eine somatische Veränderung handelt, ist nicht anzunehmen, dass ein solcher Phänotyp bei Prostatakarzinom-Patienten ausgeprägt ist. Diese Kopiezahl-Veränderung stellt vermutlich eher eine Begleiterscheinung dar, die durch die genetische Instabilität der Tumoren verursacht worden sein könnte. Durch die hochauflösenden, zytogenetischen Studien der vergangenen Jahre, konnten zunehmend subchromosomalen Regionen identifiziert werden, an denen variable CNV (Deletionen oder Duplikationen) auftreten. Derartige Mikrodeletions- oder Mikroduplikationssyndrome (MMS) wurden vorrangig mit mentaler Retardierung (z. B. Autismus, Schizophrenie oder Sprachstörungen) in Verbindung gebracht, wie z. B. das MMS an den Zytobanden 16p11.1-11.2204. Aber nicht alle MMS stellen maligne Variationen dar205. Zwei wiederholt von Deletionen und Zugewinnen beeinflusste Zytobanden, die natürlicherweise von CNV betroffen sind, liegen an 14q11.2 und 15q11.2. An diesen sind Cluster von Genen und Pseudogenen lokalisiert, die zur größten Genfamilie der Säugetiere gehören, den olfaktorischen Rezeptoren206. Diese waren in der humanen Evolution, durch ihre Nähe zu bruchanfälligen, repetitiven Sequenzen207 einer ganzen Reihe von deletierenden, duplizierenden und rekombinatorischen Prozessen ausgesetzt208. An Zytobande 14q11.2 befindet sich eine der größten Ansammlungen von olfaktorischen Genen beim Menschen209 und sie stellt, zusammen mit 15q11.2, einen der häufigsten Rekombinations-Hotspots der olfaktorischen Gencluster dar210. Einige CNV können demnach mit bestimmten genetischen Störungen assoziiert sein, spielen aber auch eine gewichtige Rolle in der humanen Evolution und sorgen als natürliche Variationen für die genetische Vielfalt zwischen Individuen192. Der Großteil der DNA Profilierungs-Studien beim Prostatakarzinom basierte auf Loss of Heterocygosity-Analysen (LOH) und der klassischen CGH, deren Limitation hauptsächlich in ihrer geringeren Auflösung bestand. Mitte der 1990er Jahre war man grundsätzlich in der Lage, chromosomale Zugewinne im Bereich von 2 Megabasen (MB) und Verluste in einer Größenordnung von ca. 10 MB zu detektieren211. Erst mit Einführung der höher auflösenden, das gesamte Genom abdeckenden arrayCGH (aCGH) und der DNA-Chips konnten Veränderungen detektiert werden, die unterhalb dieser Grenzen lagen42. Dies ermöglichte die CNV genauer zu definieren und damit auch die Zahl potentiell Tumor-relevanter Gene einzugrenzen. Es scheint jedoch, dass die höhere Auflösung der Arrays nicht nur Vorteile bringt, da sich parallel dazu die Wahrscheinlichkeit erhöht, vermehrt auch kleinere CNV zu detektieren, die keinen Einfluss auf eine Tumorentstehung haben. 136 Diskussion Bei der DNA-Profilierung fielen u. a. langstreckige CNV auf, in deren Intervallen sich zusätzlich zwei bzw. drei kleinste gemeinsam deletierte Bereiche, Peaks genannt, definieren ließen. Hierzu zählten Deletionen an 5q11.2-q31.2 (mit zwei Peaks), 8p23.3-q11.21 (mit drei Peaks), 8q11.1-q24.3 (mit zwei Peaks), 12p13.33-p11.22 (mit zwei Peaks) und 16p11.2q24.3 (mit zwei Peaks). Sehr wahrscheinlich stellen diese Peaks keine eigenständige CNV dar, sondern sollten eher als Vorläuferläsionen der langstreckigen CNV betrachtet werden, die durch die chromosomale Instabilität der Tumoren in der Tumorprogression erweitert werden und schlussendlich fusionieren. Für den kurzen Arm von Chromosom 8 ist z. B. bekannt, dass es bei Tumoren auf der gesamten Länge häufig zu chromosomalen Umgestaltungen und Kopiezahl-Veränderungen kommen kann212. Beim Prostatakarzinom wurden dort vor allem Deletionen beschrieben und mehrere Studien bestätigen, dass verschiedenen Zytobanden (8p23, 8p22 und 8p21) wiederholt von Kopiezahl-Verlusten betroffen sein können193, 213-215 . Möglicherweise weisen andere Chromosomen-Arme eine ebenso geartete genomische Instabilität auf und zeigen daher neben großen Deletionen (in fortgeschrittenen Tumoren) auch initiale, kleine Kopiezahl-Veränderungen an verschiedenen Zytobanden. Die Kopiezahl-Verluste der profilierten Prostatakarzinome erstreckten sich meist über relativ große Intervalle (4 bis 152 MB; durchschnittlich 50 MB). Die darin enthaltenen kleinsten gemeinsam deletierten Bereiche lagen in einer Größenordnung von 0,13 bis 6,7 MB (durchschnittlich 1,4 MB). In diesen Arealen ist die Wahrscheinlichkeit hoch, ein Tumorrelevantes Gen zu finden, da sie in allen betroffenen Tumoren deletiert vorliegen. In der Vergangenheit bestand im Allgemeinen die Annahme, dass der Verlust eines Genes innerhalb einer Deletion entscheidend ist für deren kanzerogenen Charakter. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die Deletionen, trotz der Fokussierung auf die kleinsten gemeinsam deletierten Bereiche, immer noch groß genug sind, eine ganze Reihe von Genen (durchschnittlich 31) zu umfassen. Durch ihr häufiges Auftreten (18,2%) und ihre vergleichsweise geringe Ausdehnung (max. 2 MB), stellen Deletionen an der Zytobande 3p13 daher eine besondere chromosomale Veränderung dar. Vor allem für diese Deletion sollte angenommen werden, dass sich leicht Gene mit tumorbiologischer Relevanz identifizieren lassen, da sie gerade einmal sieben Gene umfasst. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit und die der Studie von Taylor et al.43 zeigen jedoch, dass mindestens dreien dieser Gene eine entsprechende Funktion zugewiesen werden kann und die Eingrenzung auf ein bestimmtes ausschlagegebendes Gen schwerfällt. Fraglich ist daher, warum ein Tumor, gerade in großen Deletionen, übermäßig viel chromosomales Material verliert, wenn es doch bereits ausreichend sein sollte ein bestimmtes Gen zu inaktivieren. 137 Diskussion Viel nachvollziehbarer ist daher die Annahme, dass mehrere Gene einer Deletion bzw. mehrere Gene in unterschiedlichen Deletionen entscheidend und kooperativ an der Tumorentstehung- bzw. -progression beteiligt sind. Selbst bei einer der kleinsten Tumorrelevanten CNV, die beim Prostatakarzinom auftreten können, der Deletion an Zytobande 10q23 (dem Genlokus vom Tumorsuppressorgen PTEN), muss die „eine Deletion – ein ausschlaggebendes Gen“-Hypothese überdacht werden, da Cho et al.216 2008 von dem Apoptose-relevanten Gen und putativen Tumorsuppressor KLLN („killin“)145 berichteten, welches in nächster Nähe zu PTEN liegt und daher genauso von der 10q23 Deletion beeinflusst werden kann, wie der altbekannte Tumorsuppressor. Neben PTEN und KLLN wurde durch die CNV an Zytobande 10q23 nur noch das Gen RNLS beeinflußt. RNLS kodiert das Enzym Renalase, welches von den Nieren ins Blut sezerniert wird und regulativ an Herzfunktion und Blutdruck beteiligt ist217. Die Ergebnisse der DNAChip Analyse zeigten in 15/77 (19,5%) der klinischen Proben einen chromosomalen Verlust an der Zytobande 10q23 und liegen damit leicht unterhalb der Deletionsraten, der hochauflösenden aCGH Studien der letzten Jahre (21-34%)41-43. Die Auswertung der PTEN FISH Deletions-Sonde am Prognose-TMA (Hormon-naïve Karzinome) ergab eine vergleichbare Verlustrate von 21,5%. Ein massiv ansteigender Anteil (42,6%) von PTEN-aberranten Karzinomen konnte hingegen bei den Hormon-refraktären Karzinomen verzeichnet werden und bestätigte die Verhältnismäßigkeiten, die bereits in der Literatur beschrieben worden sind. Die PTEN Deletionsrate variierten dort bei lokalisierten Karzinomen bzw. Hormon-naïven Prostatakarzinomen zwischen 17 und 68% und bei Hormon-refraktären Tumoren zwischen 41 und 77%58, 60-63, 96, 100, 218. Die PTEN Deletionen in den Hormon-naïven Karzinomen verteilten sich auf 9,4% heteround 12,1% homozygote Deletionen. Diese Deletionsraten unterschieden sich von denen der anderen FISH-Studien, die einen wesentlich höheren Anteil an heterozygoten Deletionen (het del: 39-62% zu homo del: 5-6%)62, 63 bzw. vergleichbare Raten von hetero- und homozygoten Deletionen (het del: 12-34% zu homo del: 8-25%) ermittelt haben58, 61, 98, 218 . Mögliche Gründe für diese Unterschiede könnten die vergleichsweise geringe Anzahl von untersuchten Proben (35 bis 281 Gewebe) oder deren klinische Zusammensetzung sein. Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung gilt im Allgemeinen als „Gold-Standard Methode“ für die Analyse von Genkopiezahl-Veränderungen, dennoch lässt sich die starke Varianz zwischen den Ergebnissen der einzelnen Studien möglicherweise auch an der Wahl der verwendeten FISH DNA-Sonden oder an unterschiedlich definierten Auswertungskriterien festmachen. So sind bei einigen Studien die durchschnittlichen, artifiziellen Verluste der FISH Signale durch Schnittartefakte (entstehen unweigerlich durch die nur 4µm dicken 138 Diskussion Schnitte der Gewebe- bzw. TMA-Blöcke) an normalen prostatischen Epithelzellen festgelegt worden. Dieser „Verlustfaktor“ diente als Schwellenwert für die PTEN-Deletionen in den Karzinomzellkernen58, 62, 100, 218. In solchen Fällen erhöht sich jedoch die Wahrscheinlichkeit einer falsch identifizierten Deletion, da die größeren Nuklei der Karzinome (~10µm) eher das FISH Signal durch Schnittartefakte verlieren, als die kleineren Nuklei (~6µm) von normalen Epithelzellen. Auch das Kriterium ein Gewebe als PTEN deletiert einzuordnen, wenn bereits 20-30% der Zellkerne innerhalb eines TMA-Gewebespots betroffenen sind, kann die Deletionsrate künstlich erhöhen62, 218. Vorarbeiten am Institut für Pathologie, bei denen zehn Tumoren mit bekanntem Deletionsstatus (ermittelt durch die DNA-Chip Analyse) mittels FISH re-analysiert wurden, ergaben eine klar definierte Auswertungsstrategie, bei der nur solche Tumoren als deletiert bzw. aberrant eingeordnet wurden, wenn mindestens 60% der Tumorzellkerne (innerhalb eines Gewebespots) von einer PTEN Aberration betroffen gewesen sind. Des Weiteren wurden im Allgemeinen die verwendeten FISH-Sonden so konzipiert, dass sie die deletierten bzw. aberranten Bereiche an den Genloci (ebenfalls ermittelt durch die DNA-Chip Analyse) repräsentativ abdeckten. PTEN Deletionen bzw. Inaktivierungen waren nach GISTIC und FISH Analyse mit der CNV an Zytobande 17p13.1 (deletiert in 7,8% der untersuchten Prostatakarzinome) bzw. dem dort lokalisierten Tumorsuppressorgen TP53 assoziiert, was einen kooperativen Effekt zwischen beiden genetischen Ereignissen vermuten lässt. Vor allem homozygote PTEN Inaktivierungen korrelierten signifikant mit der mutationsbedingten Expression von p53. Diese traten in 13% der p53 IHC negativen und in 33% der p53 IHC positiven Tumoren auf. TP53 (auch p53) ist ein Transkriptionsfaktor, der als „Wächter des Genoms“219 nach genotoxischem Stress oder anderen DNA-Schädigungen für die Aktivierung oder Inhibierung von Genen sorgt, die an Zellzyklus, Wachstum, Überleben, Apoptose und Seneszenz beteiligt sind220. Zunächst wird der Zellzyklus nach Feststellung von DNA-Schäden arretiert, um der betroffenen Zelle Zeit zu verschaffen die fehlerhaften DNA-Sequenzen auszubessern. Funktioniert die Reparatur nicht mehr, sorgt p53 für die Einleitung der Apoptose220. PTEN ist ebenfalls eines der Gene, das auf die Aktivierung von p53 reagiert und durch Regulation des AKT-Signalwegs beim Zellzyklusarrest beiträgt221. Mausmodelle und funktionelle Studien haben gezeigt, dass diese Regulation beim kompletten Verlust der PTEN Expression ausbleibt und stattdessen ein p53-abhängiger Mechanismus aktiviert wird, der die betroffene Zelle in den Ruhezustand der Seneszenz versetzt222-224. Ein Zustand der zwar die Zellteilung, nicht aber den Zellmetabolismus blockiert225, was den seneszenten Zellen weiterhin ermöglicht Zytokine und Wachstumsfaktoren zu sezernieren und mit ihren Nachbarzellen zu „kommunizieren“226, 227. Die p53-abhängige Aktivierung der Seneszenz bei 139 Diskussion Verlust der PTEN Expression ist abhängig von dessen Gendosis und wird erst unterhalb einer heterozygoten Expressionshöhe angeregt223. In Tumoren ist TP53 häufig von Mutationen betroffen, welche die Wirkungsweise des Proteins verändern und ihm sogar einen onkogenen Charakter verleihen können228. Sie treten besonders häufig in der DNA-Bindungsdomäne auf229, verursachen nicht selten gainof-function Mutationen230 und sorgen für eine Akkumulation von p53 im Zellkern231. Diese Mutationen führen zu einem defekten Reparaturmechanismus, genetischer Instabilität232 und unterdrücken außerdem (dominant negativer Effekt) die Funktion von bestehendem Wildtyp p53233. Folglich kann der fail-safe Mechanismus der p53-aktivierten Seneszenz nicht mehr ausgelöst werden und der Tumor ist in der Lage ungehindert zu proliferieren. Im Vergleich dazu, wirkt sich der Verlust einer TP53 Kopie durch Deletion weitaus weniger stark auf diesen Regelkreis aus, da in solchen Fällen ein intaktes Allel für dessen Erhaltung sorgen kann. Die kombinierte Analyse von PTEN Inaktivierungen und p53 Expression in einer Überlebenskurve zeigte, dass die Prognose bei Tumoren mit der mutationsbedingten Expression von p53 außerordentlich schlecht ist und dass der Status der PTEN Inaktivierung keinen zusätzlichen Einfluss auf das Überleben nimmt. In p53 negativen Tumoren hingegen weisen PTEN Inaktivierungen eine prognostische Relevanz auf. PTEN zeigte in zwei von 77 Tumor-Proben und in einer Prostata-Zelllinie einen Bruchpunkt innerhalb des Genes (ermittelt in der DNA-Chip Analyse), was auf das Vorhandensein von intragenischen Deletionen (Deletionen, die innerhalb des Genes starten oder enden) hindeutet. Solche rekurrenten Bruchpunkte im PTEN Gen sind ebenfalls von Mao et al.234 und Berger et al.114 beschrieben worden und stellen, neben den langstreckigen Deletionen, die den gesamten Lokus betreffen, einen möglicherweise zusätzlichen Mechanismus zur Inaktivierung dieses Tumorsuppressorgens dar. In einer weiteren Studie wurden außerdem Translokationen von PTEN beschrieben, die das Gen ruptieren115. Um die Häufigkeit und prognostische Relevanz dieser zusätzlichen Inaktivierungen zu überprüfen, ist neben der PTEN Deletions-Sonde auch eine Breakapart-Sonde entworfen und am gleichen Gewebekollektiv ausgewertet worden. Die Ergebnisse der Breakapart-Analyse zeigten eine Vielzahl von verschiedenen PTEN-Aberrationsmustern. Zur Vereinfachung der Auswertung, sind intragenische Brüche von PTEN in die entsprechende Kategorie der heterozygoten Deletionen eingeordnet worden, wenn nur ein Allel betroffen war bzw. zu den homozygoten Deletionen, wenn beide oder alle (im Falle einer Aneuploidie) verändert vorlagen. Der Vergleich beider FISH Auswertungen hat ergeben, dass PTEN neben den großen Deletionen, öfter auch von strukturellen Aberrationen betroffen ist, die ein, häufiger aber alle Allele inaktivieren. Besonders zahlreich (in ca. 3% der analysierten Tumoren) wurden 140 Diskussion zusätzliche Translokationen von PTEN detektiert, wenn bereits ein Allel durch eine heterozygote Deletion inaktiviert war. Des Weiteren konnten Translokationen eines (0,4%) oder beider (0,5%) Allele identifiziert werden. Ein FISH DNA-Sondenkonzept, ähnlich der in dieser Arbeit verwendeten Sonden, ist kürzlich auch von Reid et al.235 für die Analyse von 187 Tumorproben verwendet worden. Die Arbeitsgruppe detektierte Brüche von PTEN in 6,9% ihrer Studienkohorte, allerdings nur in solchen Tumoren, in denen bereits eine Deletion des anderen Allels vorlag. Einfache Translokationen wurden nicht nachgewiesen. Die verwendete Sonde bestand aus drei unterschiedlich farblich markierten Sonden-Anteilen. Einer lag direkt im PTEN Gen (gelb), ein weiterer flankierte das 5‘ Ende (rot) und der dritte Anteil überlagerte das 3‘ Ende (grün). Der direkt in PTEN liegende Anteile zeigte in keinem Tumor einen alleinigen Verlust, sondern fehlte immer nur in Verbindung mit dem 5‘ oder 3‘ Sonden-Anteil. Es ist bei diesem Sondenkonzept jedoch mehr als fraglich, ob der Verlust der mittleren, gelben PTEN Sonde überhaupt detektierbar gewesen wäre, da die flankierenden Sonden-Anteile auf Grund der Überlagerung ihrer Emissionen per se ein gelbes Signal verursachen. PTEN wies eine ganze Reihe strukturell unterschiedlicher Zustände auf, von denen allerdings nicht anzunehmen ist, dass es sich um dauerhafte Ereignisse handelt. Die Ergebnisse der FISH Analysen am Heterogenitäts-TMA deuten eher darauf hin, dass die strukturellen Veränderungen hauptsächlich zeitlich begrenzte Zwischenschritte auf dem Wege zur Komplettinaktivierung darstellen. Diese Annahme stützt sich darauf, dass in einigen der untersuchten Tumorfoci, neben Arealen mit PTEN Translokationen, auch solche mit einem fortschreitendem Zerfall des Genes (Breakapart-Sonde: anfänglich ein Verlust der grünen 3‘-Seite) nachgewiesen werden konnten. Durch den sukzessiven Verlust von chromosomalem Material (angezeigt durch nachfolgenden Verlust der orangefarbenen 5‘Seite der Breakapart-Sonde) zeigten diese Tumorfoci auch Areale mit einem finalen Komplett-Verlust von PTEN. Ein anfänglicher Verlust der 5‘-Seite ist in der Analyse des Heterogentitäts-TMAs gar nicht und im großen Kollektiv des Prognose-TMAs äußerst selten (<1%) beobachtet worden. Reid et al. haben in ihrer Studie ebenfalls Brüche beschrieben, die häufiger den Verlust des 3‘ Endes (27,5%), in 10% der betroffenen Tumoren aber auch den des 5‘ Endes von PTEN bedeuteten 235. Bemerkenswert ist, dass der Zerfall von PTEN auch dann noch fortschreitet, wenn alle Allele bereits homozygot inaktiviert (z. B. heterozygote Deletion und Translokation des verbleibenden Allels) vorliegen. Der beobachtete zusätzliche Verlust von chromosomalem Material am PTEN Lokus scheint Tumoren also noch andere Wachstumsvorteile zu verschaffen. Ein weiteres Ziel, welches durch die chromosomalen Verluste am 5‘ Ende von 141 Diskussion PTEN beeinflusst werden könnte, ist das bereits beschriebene und ebenfalls p53-regulierte Gen Killin (KLLN), welches sich mit PTEN eine Promotorsequenz teilt236. Nach Aktivierung bindet KLLN an doppel- oder einzelsträngige DNA (z. B. an die Replikationsgabel), führt zu einem S-Phasearrest und sorgt für die Einleitung der Apoptose216. KLLN ist ein Transkriptionsfaktor, der seinerseits die Transkription von p53 und auch von p73, einem Gen, das unabhängig von p53 in der Lage ist die Apoptose einzuleiten237, 238 , regulieren kann145, 239. Es ist anzunehmen, dass Prostatakarzinome mit einer Codeletion von PTEN und KLLN die p53-abhängigen und -unabhängigen Sicherungsmechanismen umgehen können, welche normalerweise zur Seneszenz bzw. zur Apoptose führen und ungehindert proliferieren. Es bleibt die Frage, warum Zellen mit einer homozygoten PTEN Inaktivierung vor einem p53inakten Hintergrund weiteres chromosomales Material verlieren können, wenn diese doch bereits durch den kompletten Verlust der PTEN Expression seneszent sein sollten. Tumorzellen sind in der Lage sich aus dem Ruhezustand zu lösen, um erneut den Zellzyklus aufzunehmen. Ein Phänomen, dass kürzlich auch beim Hepatozellulären Karzinom (HCC) beobachtet wurde227. Als Auslöser bzw. Mediatoren für das Entkommen aus der Seneszenz wurden Deregulierungen von p53 selbst und der Expression des Tumorsuppressorgens RB1 beschrieben226, 240 . Über einen shRNA-vermittelten Expressionsverlust in murinen Fibroblasten (MEF) konnte aufgezeigt werden, dass die Unterdrückung der p53-Expression in seneszenten MEF zu einer raschen Wiederaufnahme des Zellzyklus, dem Verlust der Expression Seneszenz-assoziierter Gene und zur Immortalisierung der Zellen führte. Diese Ergebnisse belegen, dass der Ruhezustand, zumindest in MEF, reversibel ist und dass nicht nur die Einleitung der Seneszenz p53-abhängig ist, sondern auch deren Aufrechterhaltung226. In primären humanen Fibroblasten ergab die Ablation der p53 Expression durch Mikroinjektion eines p53 Antikörpers allerdings nur eine vorübergehende Aufhebung der Seneszenz und somit einen zeitlich begrenzten Wiedereintritt in den Zellzyklus240. Der Expressionsverlust von p53 verzögerte die Seneszenz, hob sie aber nicht auf. Was darauf hindeutet, dass die p53 Inaktivierung in humanen Geweben wahrscheinlich allein nicht ausreicht, um eine stabile Umkehr der Seneszenz zu vermitteln. Eine weitere Möglichkeit die Seneszenz zu umgehen ist die Deregulierung von RB1. Dies kann entweder direkt durch den Verlust von RB1 selbst oder indirekt durch regulative Proteine im RB1 Signalweg passieren. RB1 sorgt im Normalfall für einen G1-Phasearrest, der durch die Cyclin-abhängigen Kinasen CKD4, CDK6 und CDK2 unterbunden werden kann, um so für den Eintritt in die S-Phase des Zellzyklus zu sorgen241. Fehlt diese regulative Einheit, kommt es zu einem ungehinderten Zellwachstum. 142 Diskussion PTEN Mutationen liegen, im Vergleich zu den Deletionen, weitaus weniger häufig vor (6,5%). Ähnliche Mutationsraten zwischen 5% und 11,5%61, 115, 242-244 wurden auch von anderen Arbeitsgruppen bei lokalisierten Prostatakarzinomen beschrieben. Höhere Mutationsraten konnten lediglich bei metastasierenden Tumoren (21-34%)243, 245, 246 festgestellt werden oder wenn gleichzeitig ein Verlust der Heterozygotie (LOH) an Zytobande 10q23 (43%)247, 248 bestand. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigten, dass PTEN Mutationen bevorzugt in Tumoren auftraten, in denen bereits eine heterozygote Deletion vorlag (4/12, 33,3%). Dennoch befand sich unter den Tumoren mit normaler PTEN Kopiezahl auch ein nicht ganz unerheblicher Anteil von Karzinomen, die eine Mutation aufwiesen (3/65, 4,6%). Sowohl die PTEN FISH- als auch die Mutations-Analysen belegen, dass bereits heterozygot inaktivierte Tumoren vermehrt durch eine Inaktivierung des zweiten Allels betroffen sind, was auf einen starken Selektionsvorteil für Tumorzellen mit einem kompletten Funktionsverlust von PTEN schließen lässt. Diese Ergebnisse sind von besonderem Interesse, da PTEN als haploinsuffizentes Gen gilt, bei dem bereits ein heterozygoter Verlust einen signifikanten Einfluss auf die Tumorentstehung und -proliferation hat249-251. Die Häufigkeit mit der PTEN von strukturellen Aberrationen (23%) und Mutationen betroffen ist, legt nahe, dass die Inaktivierung des Genes hauptsächlich auf genomischer Ebene zu finden ist. Die Ergebnisse der PTEN Promotor-Methylierungs-Analyse bestätigten die Annahme, dass epigenetische Mechanismen eine unwesentlich Rollen für PTEN Inaktivierungen spielen, da in keinem der 34 analysierten Tumoren eine PromotorMethylierung nachgewiesen werden konnte. Dieses Ergebnis korreliert mit Arbeiten anderer Arbeitsgruppen, die ebenfalls keine PTEN Promotor-Methylierung beim Prostatakarzinom feststellen konnten247, 252-254. Da anzunehmen ist, dass die verschiedenen (besonders die heterozygoten) PTEN Aberrationen eher transiente als statische Zustände darstellen, sind sie nach ihrer biologischen Eigenschaft in drei Gruppen eingeordnet worden: PTEN normal (ohne Aberrationen), PTEN heterozygot inaktiviert (heterozygote Deletion, heterozygote Translokation, heterozygoter intragenischer Bruch) und PTEN homozygot inaktiviert (heterozygote Deletion und Translokation auf dem verbleibenden Allel, homozygote Deletion, homozygote Translokation und homozygote intragenische Brüche). Die signifikante Korrelation zwischen PTEN Inaktivierungen und maligner Tumoreigenschaften (Tumorstadium, Gleason Grad und Lymphknoten-Metastasen) belegt eindeutig, dass es beim Verlust von PTEN zur Begünstigung der Tumorprogression kommt. Diese Ergebnisse stehen, trotz zusätzlicher Inaktivierungsmechanismen, die den Anteil an PTEN aberranten Tumoren erhöht, im Einklang mit vorherigen FISH-basierten Studien58, 60, 62, 100, 218. 143 Diskussion Bei der Analyse der Heterogenität eines genetischen Markers ist es unabdinglich technische Fehler einzelner Tumorspots, die zu einer künstlich erzeugten Heterogenität führen könnten, auszuschließen. Durch die strikten Auswertekriterien der einzelnen Gewebespots, die konsequente Überprüfung des Tumorgehaltes der TMA-Schnitte (auch der Schnitte, die für die FISH verwendet worden sind) durch mehrere Pathologen, die Validierung von Großflächenschnitten und fraglicher Fälle durch zusätzliche Beobachter, konnten Fehlinterpretationen nahezu ausgeschlossen werden. Im Vergleich zu den Ergebnissen des Prognose-TMAs, bei der nur jeweils ein Gewebespot pro Tumor untersucht worden ist, stieg bei der Analyse des Heterogenitäts-TMA die Rate der PTEN Aberrationen von 23% (372/3.232 Tumoren) auf 39% (48/123 Tumorfoci) an. Dies lässt sich leicht durch die höhere Wahrscheinlichkeit einer Identifizierung von PTEN Aberrationen erklären, wenn mehrere Proben eines Tumors analysiert werden können (3-10 Gewebespots pro Tumorfokus in der Heterogenitäts-Analyse). In mehr als der Hälfte der Karzinome konnte nachgewiesen werden, dass sich die PTEN Aberrationen nur auf einen geringen Anteil des Fokus beschränken, was die Annahmen stützt, dass PTEN eher später in der Entwicklung von Prostatakarzinomen defizient wird. Die Häufigkeit und Prognoserelevanz von PTEN Inaktivierungen zeigen unbestritten, dass Aberrationen von PTEN massiv mit aggressiven, schnell voranschreitenden Prostatakarzinomen und der Wahrscheinlichkeit frühzeitig ein Rezidiv zu erleiden assoziiert sind. Dennoch reduziert sich das Potenzial von PTEN als prognostischer Marker durch den hohen Grad an Heterogenität der innerhalb der Tumorfoci vorherrscht, da sich dadurch ebenfalls die Wahrscheinlichkeit reduziert, bei einer routinemäßig entnommenen Stanzbiopsie den aberranten Tumoranteil zu treffen. Rein rechnerisch kann auf Grund der Heterogenität von PTEN erst ab einer Anzahl von fünf Biopsien mit einem positiven PTEN Befund gerechnet werden, wenn davon ausgegangen wird, dass mit jeder Stanze auch immer Tumorgewebe entnommen wird. Auch andere Studien konnten bereits eine hohe Heterogenität von PTEN Deletionen, aber auch von Mutationen innerhalb eines Tumorfocus235, 255 und zwischen verschiedenen Metastasen eines Tumors zeigen245. Der Kernbereich, der 3p13 Deletionen schloss die sieben Gene FOXP1, EIF4E3, GPR27, PROK2, RYBP, SHQ1 und GXYLT2 ein. Ein Großteil der betroffenen Tumoren zeigte allerdings komplexe Deletionsmuster. Über die FISH Oracle Datenbank ließen sich drei kleinste gemeinsam deletierte Bereiche definieren, welche die Genloci von FOXP1, RYBP und SHQ1 umfassten. In zwei Tumoren betrafen die Deletionen nur den FOXP1 Lokus, in 144 Diskussion zwei Weiteren nur RYBP und SHQ1 und bei anderen Tumoren lagen Deletionsmuster vor, bei denen entweder nur FOXP1 und RYBP, FOXP1 und SHQ1 oder nur SHQ1 beeinflusst wurden. Die Häufigkeiten, mit denen FOXP1 (10/14), RYBP (10/14) bzw. SHQ1 (10/14) an den deletierten Bereichen 3p13 Deletionen beteiligt sind, belegen allen drei Genen, ein geeignetes Surrogat für FISH-Analysen dieser CNV zu sein. In der DNA-Chip Analyse konnte festgestellt werden, dass FOXP1 in vier von 10 Tumoren nicht komplett deletiert, sondern von intragenischen Brüchen, also Deletionen, deren Bruchpunkt innerhalb des Genes liegt, betroffen ist. Zusätzlich ist für das Prostatakarzinom bekannt, dass FOXP1, wenn auch sehr selten, an Translokationen beteiligt sein kann86, 115 . Für die FISH-Analyse standen generell DNA-Sonden für FOXP1, RYBP und SHQ1 zur Verfügung, um allerdings, sowohl die Deletions-Häufigkeit der 3p13 Deletionen, als auch die der FOXP1 Aberrationen (intragenische Deletionen, Translokationen) zu analysieren, sind für die FISH Analysen FOXP1 Deletions- und Breakapart-Sonden gewählt worden. Da, biologisch gesehen, der Verlust einer FOXP1 Genkopie durch eine Deletion oder die Inaktivierung durch einen intragenischen Bruch die gleiche funktionelle Konsequenz, nämlich den Verlust eines Allels, zur Folge hat, sind beide Aberrationsarten zusammenfassend als „Deletion“ benannt worden. In der FOXP1 FISH Analyse wurden 323/1.828 (16,5%) Tumoren mit einer Deletion identifiziert. Diese Rate entsprach annähernd der Deletionshäufigkeit, die in der DNA-Chip Analyse (18,2%) ermittelt worden ist. Eine leicht reduzierte Deletionsrate ist nachvollziehbar, da FOXP1 nach den Ergebnissen der DNA-Profilierung nicht an allen Deletionen beteiligt war. Die 323 Tumoren umfassten auch die 50 (2,7%) Fälle, bei denen nur ein partieller Verlust (intragenische Deletion) von FOXP1 vorlag. Das Gros dieser Tumoren wies, wie bereits auf Grund der DNA-Chip Ergebnisse zu vermuten war, einen Verlust des 5‘ Endes (der Promoterregion) auf. Bei 21 Tumoren (1,2%) konnten außerdem Translokationen von FOXP1 nachgewiesen werden. Bis heute sind beim Prostatakarzinom zwei individuelle Fälle beschrieben worden, die zu den exprimierten Fusionsgenen FOXP1:MIPEP115 und FOXP1:ETV186 führen. FOXP1:ETV1 wird als Fusion zwischen Exon 11 von FOXP1 und Exon 5 von ETV1 an Chromosom 7p21 beschrieben. Im Falle dieser Fusion wurde zunächst angenommen, dass sie, ähnlich der TMPRSS2:ERG Fusion, ein weiteres Beispiel für eine androgen-regulierte Überexpression eines ETS-Transkriptionsfaktors ist, da FOXP1 anfangs als androgenresponsiv galt87. Allerdings zeigen die Daten der vorliegenden Arbeit und auch die der Arbeitsgruppe um Banham88, dass Androgen keinen direkten Effekt auf die Expression von FOXP1 hat. Es ist also anzunehmen, dass FOXP1 Translokationen eher einen additiven Inaktivierungsmechanismus für das Gen darstellen oder dass Fusionsgenprodukte kodiert 145 Diskussion werden, die nicht androgen-reguliert sind. Interessanterweise konnte bei den identifizierten Translokationen vermehrt eine hohe FOXP1 Expression (9/14, 53%) nachgewiesen werden, was vermuten lässt, dass FOXP1 in diesen Tumoren translokationsbedingt unter den Einfluss eines heterologen Promotors gerät und nicht den regulierenden Fusionspartner darstellt. Die signifikante Assoziation der FOXP1 Deletionen mit malignen Parametern, wie fortgeschrittenem Tumorstadium, hohem Gleason Grad und des negativen Einflusses auf das Überleben von Patienten mit einer Deletion, belegen eindeutig die gewichtige Rolle von 3p13 Aberrationen bei der Progression von Prostatakarzinomen. Deletionen und Translokationen an dieser Zytobande sind zuvor schon bei anderen Tumorentitäten, wie z. B. beim uvealen Melanom256 und vor allem bei Non-Hodgkin-Lymphomen64 beschrieben worden. Aber auch beim Cervixkarzinom wurde ihnen bereits eine kooperative Rolle bei der Karzinogenese zugeschrieben257. Berücksichtigt man bei der 3p13 FISH Analyse den ERG Status, so fällt auf, dass die Deletionen häufiger in ERG positiven (23%) als in ERG negativen Tumoren (9%) zu finden sind. Dies lässt vermuten, dass es unter den Genen der 3p13 Deletion eines geben muss, welches einen kooperativen Zusammenhang mit den funktionellen Konsequenzen der ERG Überexpression aufweist. Einen solchen Kooperationspartner könnte vermutlich RYBP darstellen. RYBP gehört als Polycomb-assoziiertes Protein zur Gruppe der PRC Proteine258. Polycomb Proteine sind transkriptionelle Repressoren, die durch Modifikationen der Histone die Expression von Genen regulieren können259. Es sind bereits funktionelle Zusammenhänge zwischen ERG und dem PRC Protein EZH2 („enhancer of zeste homolog 2“) beschrieben worden260-263, bei denen die ERG-abhängige Aktivierung von EZH2 nachfolgend für eine Expressions-Hemmung seiner Zielgene sorgt und so eine DeDifferenzierung von Zellen begünstigt260. Auf eine ähnliche Weise könnte RYBP deregulierend auf eine Reihe von Zielgenen wirken264, eine Klärung dieser Hypothese ist jedoch ausstehend. Es könnte vice versa vermutet werden, dass Gene der 3p13 Deletion eine chromosomale Veränderung am ERG Lokus auslösen könnten. Chromatin und dessen Modellierung spielt eine entscheidende Rolle für die Integrität der DNA. Eine fehlerhafte Chromatin-Modellierung kann entscheidend an der Entstehung von chromosomalen Veränderungen beteiligt sein262, 265, 266 . Allerdings konnte keinem der Gene innerhalb der 3p13 Deletion eine solche Eigenschaft zugeordnet werden, so dass ein initiierender Effekt der 3p13 Deletion für ERG Aberrationen nahezu ausgeschlossen werden kann. Wie bereits beschrieben sind auch PTEN Inaktivierungen signifikant mit der ERG Überexpression assoziiert. Dies wirft die Frage auf, ob die Häufung der 3p13 Deletionen in ERG positiven Tumoren nur durch eine Kopplung an PTEN verursacht wird oder ob es sich 146 Diskussion um eine unabhängige genetische Veränderung handelt. Die Ergebnisse einer vergleichenden Analyse zeigten eindeutig, dass 86% der Tumoren mit einer PTEN oder 3p13 Deletion nur eine der beiden Veränderungen aufweisen, wohingegen nur 14% eine Codeletion zeigten. Die Verteilung der Codeletionen ändert sich in ERG positiven (14,9%) und in ERG negativen (11,4%) Tumoren nur unwesentlich, so dass davon ausgegangen werden kann, dass es sich bei PTEN Inaktivierungen und 3p13 Deletionen um zwei genetisch distinkte Veränderungen handelt, die beide vermehrt in ERG positiven Tumoren auftreten. Eine weitere Ursache für die Entstehung von 3p13 Deletionen könnte die Nachbarschaft zu einer fragile site sein. Dies sind bruchanfällige Abschnitte (z. Z. sind mehr als 200 bekannt), die regelmäßig im gesamten humanen Genom vorkommenen267 und an denen es häufig zu einer Verzögerung der DNA-Vervielfältigung durch eine verlangsamte bzw. gestörte Initiation der Replikation kommt268. Durch diesen Replikationsstress treten an den fragile sites besonders häufig chromosomale Aberrationen auf, die nachhaltig die Expression der dort lokalisierten Gene beeinflussen. Es ist bekannt, dass sich auf Chromosom 3 eine der aktivsten fragile sites des humanen Genoms befindet269, FRA3B an Zytobande 3p14.2. Diese fragile site wird überspannt von dem Gen FHIT („fragile histidine triad“), über dessen genomische Aberrationen bekannt ist, an der Entwicklung und Progression einer Vielzahl von Tumoren beteiligt zu sein270, 271 . Die physische Entfernung von FRA3B zu den strukturellen Veränderungen am 3p13 Lokus beträgt jedoch in etwa 10 Megabasen, so dass keine der Deletionen an FRA3B heranreicht. Es ist daher weitestgehend auszuschließen, dass 3p13 Deletionen unter dem Einfluss der FRA3B fragile site entstehen, sondern andere, bisher unbekannte, Mechanismen für die Entstehung dieser CNV ausschlaggebend sein müssen. Im Regelfall bedeutet ein Verlust einer Genkopie den Ausfall seiner Expression. In mehreren Tumorentitäten konnten schon Expressions-Verluste von FOXP1 festgestellt272 und beim Östrogen-Rezeptor negativen Mammakarzinom mit einer schlechten Patientenprognose assoziiert werden273-275. Die Ergebnisse einer ersten quantitativen Analyse an GewebeStanzen zeigte zwar, dass die exprimierten Gene (FOXP1, EIF3E4, RYBP, SHQ1 und GXYLT2) der 3p13 Deletion in deletierten Geweben reduziert, die Herab-Regulierung aber nur bei EIF4E3, RYBP und SHQ1 signifikant war. Die Deletions-bedingte Reduzierung der Expression von FOXP1 und GXYLT2 hingegen, ist unwesentlich und nicht signifikant. Ähnliche Ergebnisse haben Taylor et al.43 beschrieben, die in ihren 3p14-deletierten (die Unterschiede in den Zytobanden ergeben sich aus der aktualisierten humanen Genomannotation im August 2010) Tumoren zwar einen starken Expressionsverlust für 147 Diskussion RYBP und SHQ1, nicht aber für FOXP1 nachweisen konnten43. Ein möglicher Grund dafür könnte sein, dass FOXP1 nicht nur in Tumorzellen, sondern auch in normalen Prostatazellen, Stroma und inflammatorischen Zellen exprimiert wird, wie die immunhistologische Auswertung zeigte. Um dieser „Verunreinigung“ in der Expressionsanalyse zu entgehen, sind in einer zweiten quantitativen Untersuchung Laser-mikrodissektierte Gewebe verwendet worden. Doch auch Diese lies nur einen unwesentlichen, nicht signifikanten Expressionsverlust von FOXP1 erkennen. Die Ergebnisse der FOXP1 IHC zeigten ebenfalls keinen Zusammenhang zur Genkopiezahl von FOXP1 (FISH); eine Diskrepanz, die auch von Goatly et al. bei der Analyse von Lymphomen festgestellt worden ist276. Eine IHC-Auswertung mit dem verwendeten Antikörper scheint demnach für eine Proteinanalyse von FOXP1 ungeeignet zu sein. Da sowohl die Ergebnisse der DNA-Chip Analyse, als auch die Daten der FISH Auswertung aufzeigen, dass FOXP1 immer nur heterozygot, niemals aber homozygot inaktiviert ist, kann angenommen werden, dass der Verlust eines FOXP1 Allels durch bestimmte Mechanismen ausgeglichen bzw. die Expression des intakten Alles reguliert und angepasst werden kann. Die funktionellen Untersuchungen von FOXP1, RYBP und SHQ1 zeigten, dass die ektopische Überexpression in allen Fällen in einer Reduzierung der Fähigkeit Zellkolonien zu bilden resultierte und war folglich mit einer Wachstumshemmung assoziiert. Im shRNAvermittelten Knockdown der FOXP1, RYBP und SHQ1 Expression konnte im Vergleich zur Kontrolle zwar keine massiv erhöhte Proliferation festgestellt werden, allerdings lag, zumindest bei FOXP1 und SHQ1, eine erneute Wachstumshemmung vor. Ein vergleichbarer Effekt konnte bei einem Knockdown von PTEN beobachtet werden, was vermuten lässt, dass es sich bei FOXP1 und SHQ1 um ebenso essentielle Gene handelt, die für das Wachstum von Prostatazellen notwendig sind. Wie zuvor beschrieben muss also, entgegen der Annahme, dass bei kleinen Deletionen eine erhöhte Chance besteht ein Tumorrelevantes Gen zu identifizieren, davon ausgegangen werden, dass sich unter den sieben betroffenen Genen der 3p13 Deletion mehr als ein Tumor-relevantes Gen befindet, da sowohl FOXP1, als auch RYBP und SHQ1 ein Tumorsuppressor-Potential nachgewiesen werden konnte. Auch Taylor et al. haben alle drei Gene als potentielle Tumorsuppressorgene benannt43. Die Funktionen von FOXP1 (Transkriptions-Faktor)272, RYBP (transkriptionelle Repression und Stabilisierung von p53)258, 277 und SHQ1 (Telomer-Erhaltung)142, 278 lassen sich ebenfalls gut mit einer Tumor-inhibierenden Funktion vereinbaren. Des Weiteren konnten bereits in 148 Diskussion mehreren Studien Mutationen bei RYBP, SHQ1 und FOXP1 beschrieben werden, die ebenfalls die Zuordnung dieser Gene zu den Tumorsuppressoren stützen43, 114, 244, 246. Für die beiden anderen exprimierten Gene der 3p13 Deletion, EIF4E3 und GXYLT2, ist festzustellen, dass sich GXYLT2 auf Grund seiner Funktion nicht mit den Eigenschaften eines Tumorsuppressorgens vereinbaren lässt, da es eine Xylosyltransferase kodiert, die an der Glykosylierung beteiligt ist279. Für EIF4E3 ist jedoch bekannt, dass es die Rekrutierung der mRNA an die Ribosomen vermittelt und zur Regulation der Transkription an die 5‘ CapStrukturen der mRNAs bindet280, 281 . EIF4E3 wurde nicht in die Zellkulturversuche eingeschlossen, da es außerhalb der minimal deletierten Bereiche lag. Für dieses Gen wäre es jedoch ebenfalls interessant zu wissen, wie sich ein Knockdown bzw. eine Überexpression auf das Wachstum von Prostatazellen auswirkt. Grundsätzlich belegen die vorliegenden Eigenschaften der 3p13 Deletion und der von Ihr beeinflussten Gene, dass an diesem Lokus mehrere Tumorsuppressorgene lokalisiert sind. Es scheint, dass bereits durch den Verlust eines der Gene eine Tumorentstehung begünstigt werden kann. Ein kooperativer Effekt mehrerer Gene ist dennoch wahrscheinlicher, weil sie zumeist gemeinsam an einem Großteil der Deletionen beteiligt waren. Eine solche gemeinschaftliche Funktion von FOXP1, RYBP und SHQ1 konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht abschließend geklärt werden, da sich bereits die Überexpression bzw. Depletion eines der Gene allein (bis auf RYBP) negativ auf das Zellwachstum ausgewirkt haben. Weitergehende Untersuchungen, besonders die Effekte unterschiedlicher Gen-Dosen könnten das Verständnis der Interaktionen dieser Gene verbessern. In der vorliegenden Studie treten PTEN Inaktivierungen mehr als doppelt so häufig in ERG positiven (33,6%) Tumoren auf, als in ERG negativen (13,9%). Es ist bekannt, dass die Erg Überexpression im Mausmodell die Entstehung von prostatischen Entartungen, wie Hyperplasien und PIN zur Folge hat, aber kein invasives Karzinom bedingt90, 92. Tritt zur Erg Überexpression jedoch noch eine Pten Deletion oder ein hochaktives Akt auf, kommt es zur Degeneration und schlussendlich zur Tumorbildung93-95. Diese Resultate waren die Grundlage für die Annahme eines kooperativen Effekts von ERG und PTEN. Eine Vielzahl von Studien lieferte die Belege für eine positive Assoziation auch in humanen Prostatakarzinomen58, 96-98, 100 . Yoshimoto et al.96 stellten fest, dass Patienten mit PTEN Deletion und ERG Fusion eine besonders schlechte Überlebensrate hatten. Reid et al.100 ermittelten hingegen, dass das Auftreten von PTEN Deletion auch ohne den Einfluss der ERG Fusion zu einer schlechteren Prognose führte. Auch die Daten der vorliegenden Arbeit 149 Diskussion zeigen, dass PTEN, unabhängig vom ERG Status, der ausschlaggebende Faktor für eine schlechte Prognose ist. Dennoch bleibt die Frage, warum PTEN Aberrationen vermehrt in ERG positiven Prostatakarzinomen akkumulieren. Um das sequenzielle Auftreten von ERG und PTEN Aberrationen untersuchen zu können, ist eine neuartige TMA-Plattform (Heterogenitäts-TMA) verwendet worden, die es ermöglicht, die Ausdehnung zweier Marker innerhalb eines Tumorfokus zu vergleichen. Abhängig vom zeitlichen Auftreten würde man erwarten können, dass sich ein Tumorareal mit beiden molekularen Veränderungen in einem größeren Tumorareal finden lässt, welches nur eine, nämlich die zuerst auftretende Veränderung zeigt. Durch die Analyse des Heterogenitäts-TMAs konnten homogen ERG positive Tumorfoci identifiziert werden, die fokale PTEN Aberrationen aufwiesen, aber keine Foci, die innerhalb eines größeren Areals mit PTEN Aberrationen fokal ERG positiv waren. TMPRSS2:ERG Fusionen gehen einer PTEN Veränderung folglich voraus und scheinen, im Gegensatz zur bisherigen Annahme eines einfachen kooperativen Effektes, ein Fortschreiten von PTEN Aberrationen zu fördern. Rickman et al.282 haben kürzlich gezeigt, dass ERG weitläufig auf die Chromatinstruktur einwirkt und häufiger Brüche an Genorten entstehen, in deren nächster Nähe eine hohe Dichte an ERG Bindungsstellen zu finden ist. Es ist anzunehmen, dass auch der PTEN Lokus oder umliegende Areale reich an solchen ERG Bindungsstellen ist, eine Identifizierung ist jedoch ausstehend. Auch wenn die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit und weitere Studien einen eindeutigen Zusammenhang von PTEN Aberrationen und ERG Überexpression stützen, zeigen sie darüber hinaus, dass ERG Fusionen nicht unbedingt eine Voraussetzung für einen PTEN Verlust darstellen müssen, da auch ein nicht ganz unerheblicher Anteil an Tumoren PTEN Aberrationen (~14%) ohne einen positiven ERG Hintergrund aufweist. Ein möglicher Grund hierfür könnte sein, dass am PTEN Lokus bereits eine erhöhte Wahrscheinlichkeit einer Entstehung von chromosomalen Veränderungen besteht. Yoshimoto et al.283 haben jüngst herausgefunden, dass zwei Sequenzen mit segmentaler Duplikationen (SD) in nächster Nähe zum PTEN Lokus liegen. Solche SD oder auch low copy repeats (LCR)192 sind 1-400 kb lange Bereiche, die über 90%ige Homologie zu anderen LCR aufweisen können und als „Hotspots“ der nicht-homologen Rekombination (NAHR) gelten32, 191. Solche bruchanfälligen Sequenzen sind bereits bei der Chronischen Myeloischen Leukämie (CML) beschrieben worden und stehen in Verdacht maßgeblich an der Entstehung der BCR:ABL Fusion beteiligt zu sein, die über 90% der betroffenen Patienten aufweisen284. Es ist unbestritten, dass die ERG Überexpression an der Deregulierung einer Vielzahl von Genen bzw. Signalwegen beteiligt ist.285-288. Die Frage nach einem direkten Einfluss auf das 150 Diskussion Entstehen von Tumoren und die prognostische Relevanz war lange Mittelpunkt vieler Untersuchungen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit lagen mit 46% ERG positiven Karzinomen in einer ähnlichen Größenordnung, wie andere Studien (47-55%)76, 137, 289-296. Die aktuellen Resultate zeigen jedoch eindeutig, dass die ERG Überexpression weder mit bestimmten klinisch-pathologischen Parametern assoziiert ist, noch eine prognostische Relevanz aufweist. Dies konnte sowohl auf genomischer Ebene (mittels FISH Breakapart Assay) als auch auf Proteinebene (IHC) nachgewiesen werden. Auch die beiden ERG Aberrationsarten, Translokation und Deletion, verhielten sich in der Korrelation mit den klinischen Parametern gleich und bestätigten die Aussagen dreier Studien, bei denen ebenfalls kein Zusammenhang zwischen dem Vorhandensein der Fusion und klinischen Parametern festgestellt werden konnte137, 290, 296 . Andere Studien belegten der ERG Überexpression hingegen eine gute Prognose293, 295 oder wiesen ihr einen negativen Einfluss auf das Überleben und Assoziationen zu progressivem Tumorverhalten nach76, 289, 291, 294 . Interessanterweise wurden Karzinomen, bei denen eine ERG Fusion durch eine interstitielle Deletion verursacht wurde, eine besonders schlechte Prognose zugesprochen, wenn gleichzeitig eine Duplikation der ERG Sequenz vorlag96, akrozentrischen Chromosoms 21 steht im 297 Allgemeinen . Bei der Analyse des keine Referenz- bzw. Zentromersonde zur Verfügung, was die Abschätzung des Ploidie-Status eines Gewebes erschwert. Der Vergleich von Tumoren, unter besonderer Berücksichtigung der Anzahl von ERG-Kopien (egal ob das ERG FISH Signal intakt war oder nicht) zeigte, dass die Prognose bei Tumoren mit einer abnormalen Anzahl an Chromsosom 21 (>2, aneuploid) schlechter war, als bei Tumoren mit einer diploiden Anzahl, ohne dass es dabei relevant war, ob eine ERG Aberration vorlag oder nicht. Der von Attard et al.297 erstmals beschriebene, s. g. „Edel 2+“ Typ resultiert also vielmehr aus Deletionen in aneuploiden Karzinomen, in denen mehrere Allele von einem chromosomalen Verlust betroffen sind, als aus Deletionen mit zusätzlicher Duplikation am ERG Lokus. Die Entdeckung der ERG Überexpression hat seit 200568 zur molekularen Einteilung in Fusions-negative und -positive Prostatakarzinome geführt und die Klärung ihrer funktionellen Konsequenzen steht nach wie vor im Fokus der Prostatakrebsforschung. Ein direkter Einfluss der ERG Überexpression konnte weitestgehend ausgeschlossen werden. Die bisherigen Studienergebnisse weisen allerdings darauf hin, dass Karzinome mit und ohne ERG Fusion durch weitere genetische Unterschiede charakterisiert sind. Dies wird sowohl in veränderten Gen-Expressionsmustern deutlich, genetischen Ereignissen42, 43, 298 als auch durch Assoziationen mit bestimmten . So konnten Taylor et al.43 zeigen, dass eine positive Assoziation zwischen der TMPRSS2:ERG Fusion und Deletionen an der Zytobande 3p14 151 Diskussion und der Genloci von TP53 und PTEN besteht, was die Existenz molekular distinkter und klinisch relevanter Subgruppen innerhalb von Prostatakarzinomen untermauert. Auch Lapointe et al. ERG-negativen 42 und -positiven haben in ihrer aCGH Studie an 55 primären Prostatakarzinomen und neun Lymphknoten-Metastasen verschiedene KarzinomSubtypen beschreiben können, die sich anhand bestimmter genetischer Veränderungen kategorisieren ließen. Ein Subtyp wurde durch das Auftreten von TMPRSS2:ERG Fusionen (21q22-q23) und 8p Verluste definiert. Karzinome, die diese Veränderungen aufwiesen, zeigten eine höhere Rate an Rezidiven. Als einen weiteren Subtyp sahen sie Karzinome an, bei denen wiederholt Deletionen an den Zytobanden 5q21 und 6q15 auftraten. Diese Karzinome waren klinisch indolent und mit einer guten Prognose assoziiert. Zusammenfassend unterstützen diese Ergebnisse ebenfalls die Annahme kooperativer Effekte zwischen verschiedenen Genen und Genveränderungen. Ein wesentlicher Nachteil der DNA-Profilierung durch aCGH, aber auch durch SNP-Arrays besteht darin, dass sich nur Veränderungen nachweisen lassen, die unbalanciert sind, also mit einer Genkopiezahl-Veränderung einhergehen. Mutationen, Inversionen oder auch komplexere Strukturen, wie Translokationen lassen sich nicht detektieren. Dies wird besonders deutlich, wenn man die Ergebnisse der DNA-Chip Analyse an der Zytobande 21q22.2-q22.3 betrachtet, der Lokus, der im Allgemeinen in 50% der Prostatakarzinome verändert vorliegt; der Genort der TMPRSS2:ERG Fusion und der daraus resultierenden ERG Überexpression. Die Fusion wird bekanntlich entweder über eine Deletion oder durch eine Translokation des chromosomalen Abschnittes zwischen den beiden Gene verursacht. In den 77 Prostatakarzinomen, die für DNA-Profilierung verwendeten worden sind, konnten nur 12 (15,6%) Proben identifiziert werden, die CNV an besagten Zytobanden aufwiesen. In nur sechs (7,8%) davon lag eine interstitielle Deletion zwischen ERG und TMPRSS2 vor, die nachweislich zur Fusion beider Gene führt. Wie viele der untersuchten Tumoren eine Translokation aufwiesen, konnte in der DNA-Chip Analyse nicht ermittelt werden. Die gegenwärtigen methodischen Neuerungen in der Molekularbiologie haben diese Einschränkungen bei der Detektion von genomischen Veränderungen bereits überwunden und werden bald den Einsatz von aCGH und DNA-Chip obsolet werden lassen. Die DNA-Profilierung mittels SNP-Arrays hat bereits gezeigt, dass mit steigender Auflösung auch der Arbeitsaufwand der Datenanalyse und die Anzahl der detektierten CNV zunehmen. Vermehrt lassen sich auch kleine CNV detektieren, die mit natürlichen Variationen bzw. mit genomischen Erkrankungen (Syndromen) assoziiert sind oder lediglich Begleiterscheinungen der genetischen Instabilität der Tumoren darstellen. Die Technologien zur Gesamtanalyse 152 Diskussion des humanen Genoms, die Whole-Genome Sequenzierung, die Exom-Sequenzierung und die Transkriptom-Sequenzierung, werden neben weiteren kleinen CNV auch Informationen über Translokationen, Mutationen, Variationen in regulativen Sequenzen intergenischer Abschnitte und vor allem zu microRNAs (nicht kodierende RNAs, welche die Expression anderer Gene posttranskriptionell regulieren299), denen in den letzten Jahren immer mehr Aufmerksamkeit zugesprochen wird300-303, generieren. Zurzeit belaufen sich die meisten dieser Studien der Whole-Genome Sequenzierung, angesichts der vergleichsweise hohen Kosten und dem Aufwand, der mit deren Datenanalyse verbunden ist, auf nur wenige komplett sequenzierte Prostatakarzinome. Man wird jedoch mit steigender Anzahl an Studienobjekten zusehends in der Lage sein, Subtypen zu definieren, aus deren DNA- und RNA-Profilen sich „Verhaltensweisen“ von Prostatakarzinomen und vielleicht sogar die Entwicklungstendenzen des normalen prostatischen Epithels ablesen lassen, um maßgeschneiderte Therapieansätze entwickeln zu können. Erste Hinweise deuten bereits darauf hin, dass es beim Prostatakarzinom bestimmte genetische Veränderungen gibt, die mit guter und schlechter Prognose assoziiert sind bzw. bei Vorliegen das Voranschreiten weiterer genomischer Aberrationen begünstigen. Bis zu einem diagnostischen Tool, wie dem MammaPrint™304, der über einen 70 Gene umfassenden Klassifikator verfügt und bereits seit Jahren zur Abschätzung der Aggressivität von Mammakarzinomen eingesetzt wird305, wird es noch ein langer Prozess sein. Von der Annahme einzelner, tumorbegünstigender Gendefekte sollte beim Prostatakarzinom abgewichen und das Augenmerk zukünftig auf die Kooperativitäten zwischen den einzelnen Ereignissen gelegt werden. 153 Zusammenfassung 5. Zusammenfassung Die Zielsetzungen der vorliegenden Arbeit waren die Identifizierung der KopiezahlVeränderungen beim Prostatakarzinom mit der hochauflösenden SNP-Array Technologie, die Validierung der Prävalenz und klinischen Bedeutung von Aberrationen an potentiell Tumor-relevanten Genen mittels Fluoreszenz in situ Hybridisierung und die Charakterisierung ihrer funktionellen Konsequenz. Die profilierten Prostatakarzinome waren häufiger von Kopiezahl-Verlusten als von -Zugewinnen betroffen. Es ist davon auszugehen, dass sich die Genetik dieser Tumorentität grundsätzlich von anderen unterscheidet und hauptsächlich der Verlust von Tumorsuppressorgenen für die Tumorentstehung von Bedeutung ist. Nicht jeder Deletion lässt sich ein bestimmtes Tumor-relevantes Gen zuordnen. Bereits in kleinen deletierten Bereichen können mehrere Gene mit Tumorinhibierender Funktion zu finden sein. Die Entstehung und Progression von Prostatakarzinomen scheint daher eher in der Kooperativität zwischen mehreren genetischen Ereignissen begründet zu sein. Die DNA-Profilierung (14/77, 18,2%) und funktionellen Analysen ergaben, dass in der 3p13 Deletion mindestens drei Tumor-relevante Gene, nämlich FOXP1, RYBP und SHQ1, liegen. FISH-Analysen mit FOXP1-spezifischen DNA-Sonden in mehr als 3.000 Prostatakarzinomen zeigten Deletionen und Translokationen in 16,5% bzw. 1,2% der analysierbaren Tumorproben. 3p13 Deletionen waren mit malignen Tumoreigenschaften (fortgeschrittenem pT Stadium (p<0,0001), hohem Gleason Grad (p=0,0125), frühen PSA Rezidiven (p=0,0015)), ERG Positivität (p<0,0001) und PTEN Inaktivierungen (p<0,0001) assoziiert. Eine Subanalyse von ERG positiven Tumoren identifizierte 3p13 deletierte Karzinome als eine eigenständige, molekulare Einheit, die unabhängig von PTEN Inaktivierungen auftritt (p=0,1558). Die Ergebnisse der PTEN FISHAnalysen von über 7.000 ausgewerteten Prostatakarzinomen ergaben 6,7% heterozygote Deletionen, 0,4% heterozygote Translokationen, 2,7% heterozygote Deletionen und Translokationen auf dem verbleibenden Allel, 0,5% homozygote Translokationen und 12,0% homozygote Deletionen. Unter Verwendung einer neuartigen TMA-Technologie konnte jedoch festgestellt werden, dass die verschiedenen PTEN Aberrationen nicht statisch waren, sondern Zwischenstufen auf dem Weg zur Komplett-Inaktivierung darstellten. Biallelische Inaktivierungen von PTEN, durch genomische Aberrationen und Mutationen, sind der bevorzugte Mechanismus für dessen funktionellen Verlust (7,1% heterozygot inaktiviert versus 15,2% homozygot inaktiviert). PTEN Inaktivierungen waren massiv mit malignen Tumoreigenschaften, wie z. B. fortgeschrittenem pT Stadium (p<0,0001), hohem GleasonGrad (p<0,0001), Vorhandensein von Lymphknoten-Metastasen (p<0,0001) und Hormon- 154 Zusammenfassung Refraktion assoziiert. Sie standen außerdem in Korrelation zur ERG IHC Positivität (p<0,0001), der Akkumulation von nukleärem p53 (p<0,0001) und Deletionen von TP53 (p=0,0294). PTEN Inaktivierungen waren auch mit einem frühen PSA-Rezidiv in einer univariaten (p<0,0001) und der multivariaten Analyse (p=0,0022) assoziiert. Die prognostische Bedeutung hatte unabhängig vom ERG Status Bestand. Neben der klinischen und prognostischen Relevanz zeigten PTEN Inaktivierungen allerdings eine erhebliche Heterogenität. 155 Abstract 6. Abstract The objective of this study was to identify copy number changes in prostate cancer using high-resolution SNP array technology, to validate prevalence and clinical significance of potentially cancer-related gene copy number changes by fluorescence in situ hybridization and to characterize their functional consequences by cell culture experiments. The 77 profiled prostate cancers were more frequently affected by copy number losses than by gains. It can be assumed that the genetics of this tumor entity is fundamentally different from others and loss of tumor suppressor genes is of mainly importance for tumorigenesis. Furthermore, it must be assumed that the development and progression of prostate cancers can rather be explained by the cooperativity of different genetic events than by a specific gene aberration. It is difficult to determine an individual tumor-related gene within a deletion, as several genes with tumor-inhibitory function can already be found in small deleted regions. DNA profiling (14/77, 18.2%) and functional analyses revealed that 3p13 deletion probably encompasses at least three tumor-relevant genes, namely FOXP1, RYBP and SHQ1. FISH analysis using locus specific DNA probes for FOXP1 in more than 3,000 prostate cancer specimen showed deletions and translocations in 16.5% and 1.2% respectively. 3p13 deletions were related to malignant tumor features like advanced pT stage (p<0.0001), high Gleason grade (p=0.0125), early PSA recurrence (p=0.0015), ERG IHC positivity (p<0.0001) and PTEN inactivation (p<0.0001). A sub-analysis of ERG positive tumors identified 3p13 deleted carcinoma as a distinct molecular entity, which occurs independently of PTEN inactivation (p=0.1558). PTEN FISH analysis in more than 7,000 evaluated prostate cancers revealed 6.7% heterozygous deletions, 0.4% heterozygous translocations, 2.7% heterozygous deletions and translocations of the remaining allele, 0.5% homozygous translocations and 12.0% homozygous deletions. However, using a novel TMA technology it could be observed that the various PTEN aberrations were not static, but constitute intermediate steps on the way to complete inactivation. Biallelic inactivation of PTEN by genomic aberrations and mutations seemed to be the preferred mechanism for its functional loss (7.1% heterozygous inactivated versus 15.2% homozygous inactivated). PTEN inactivations were massively linked to malignant tumor characteristics e. g. advanced pT stage (p<0.0001), high Gleason grade (p<0.0001), presence of lymph node metastases (p<0.0001) and were associated with hormone-refractory disease. They also correlated with ERG positivity (p<0.0001), the accumulation of nuclear p53 (p<0.0001) and deletions of TP53 (p=0.0294). PTEN inactivation were also associated with early PSA recurrence in univariate (p<0.0001) and multivariate analysis (p=0.0022). The prognostic significance was 156 Abstract independent of ERG. Despite its clinical and prognostic relevance PTEN inactivations showed extensive heterogeneity. 157 Literatur 7. Literatur 1. Stewart B, Wild C: World Cancer Report 2014. Edited by WHO. Lyon, 2014, p. 916 2. Kaatsch P., Spix C., Katalinic A., Hentschel S., Luttmann S., C. S: Krebs in Deutschland 2009/2010. Edited by Robert Koch-Institut - Gesellschaft der epidemiologischen Krebsregister in Deutschland e.V. Berlin, 2013, p. 146 3. StatistischesBundesamt: Gesundheit Todesursachen in Deutschland. Edited by Statistisches Bundesamt Wiesbaden, 2012, p. 51 4. Kumar VL, Majumder PK: Prostate gland: structure, functions and regulation, Int Urol Nephrol 1995, 27:231-243 5. 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Assoziationen klinisch-pathologischer Parameter zur ERG FISH, aufgeteilt nach Art der genomischen Aberration Parameter n gesamt Alle Tumoren n ERG FISH auswertbar normal ERG FISH ERG FISH Deletion Translokation (% ) (% ) (% ) p Werte FISH / IHC 7.478 3.950 51,9 26,5 21,6 Tumorstadium pT2 4.926 pT3a 1.649 pT3b 803 pT4 58 2.497 928 473 34 54,95 45,04 49,47 44,12 24,71 29,96 29,18 26,47 20,34 25,0 21,35 29,41 0,0003 / 0,0001 Gleason Grad ≤3+3 2.316 3+4 3.803 4+3 1.017 ≥4+4 287 1.093 2.075 589 168 55,81 48,14 54,84 61,9 24,79 28,53 24,11 20,83 19,4 23,33 21,05 17,26 0,0007 / 0,0003 Lymphknoten-Metastasen N0 3.962 N+ 327 2.189 184 52,03 45,65 26,72 28,8 21,24 25,54 0,1023 / 0,2633 Präoperativer PSA Wert (ng/ml) <4 976 494 4-10 4.442 2.299 10-20 1.460 814 >20 488 284 47,17 50,76 58,97 50,0 28,34 27,23 21,87 29,93 24,49 22,01 19,16 20,07 0,0076 / 0,0003 Sektionsrand frei negativ 5.919 positiv 1.428 52,27 49,87 25,85 28,66 21,88 21,47 0,788 / 0,1127 3.103 778 I Anhang Abbildung A 1. Assoziation von ERG Aberrationen und der Wahrscheinlichkeit ein biochemisches Rezidiv zu erleiden (Kaplan Meier Überlebenskurve) ERG FISH normale, deletierte und translozierte Tumoren. Ergänzung zur Zytobande 3p13 Tabelle A 2. Teilmenge des Prognose-TMAs Die Teilmenge des Prognose-TMAs umfasst 3.261 Prostatakarzinome. Für 2.652 dieser Tumorproben lagen klinische Verlaufsdaten vor (ein bis 204 Monate, Median 36,3 Monate). Studienkohorte nach Kategorien Patienten mit biochemischen Rezidiv nach Kategorien (n=3.261) (n=832) 47,4 36,3 - 94 926 1.960 209 30 232 507 61 2.153 643 384 42 255 257 281 39 1.476 1.364 325 57 136 432 220 44 1.587 99 524 88 529 1.745 669 233 79 343 252 138 2.555 665 528 303 Klinische Verlaufsdaten (Monate) Mittelwert Median Alter (Jahre) <50 50-60 60-70 >70 Tumorstadium pT (AJCC 2002) pT2 pT3a pT3b pT4 Gleason Grad ≤3+3 3+4 4+3 ≥4+4 Lymphkoten-Metastasen pN pN0 pN+ PSA vor Behandlung [ng/ml] <4 4-10 10-20 >20 Sektionsrand negativ positiv II Anhang Abbildungsverzeichnis Seite Abbildung 1 Unterer Urogenitaltrakt des Mannes …………………. 2 Abbildung 2 AKT-Signalweg (reduziert) …………………. 9 Abbildung 3 Lage der verwendeten Primer zur Methylierungs-Analyse mittels MassARRAY Technologie …………………. 25 Abbildung 4 Affymetrix® Genome-Wide Human SNP 6.0 - Schema der Arbeitsabläufe …………………. 30 Abbildung 5 Graphische Darstellung von Kopiezahl-Veränderungen, berechnet mit DNAcopy …………………. 35 Abbildung 6 FISH Oracle 2 Benutzeroberfläche …………………. 36 Abbildung 7 Graphisches Beispiel einer GISTIC Auswertung von SNPDaten …………………. 37 Abbildung 8 Prognose TMA …………………. 39 Abbildung 9 Heterogenitäts-TMA …………………. 42 Abbildung 10 Arbeitssabläufe bei der Fluoreszenz in situ Hybridisierung …………………. 44 Abbildung 11 ERG FISH Breakapart-Sonde …………………. 48 Abbildung 12 PTEN FISH Deletions- und Breakapart-Sonde …………………. 49 Abbildung 13 FOXP1 FISH Deletions- und Breakapart-Sonde …………………. 50 Abbildung 14 Ideogramm mit genomischen Verlusten beim Prostatakarzinom …………………. 68 Abbildung 15 Ergebnisse der GISTIC Analyse – Verluste …………………. 74 Abbildung 16 Ideogramm mit genomischen Zugewinnen beim Prostatakarzinom …………………. 76 Abbildung 17 Ergebnisse der GISTIC Analyse – Zugewinne …………………. 79 Abbildung 18 Beispiele von 3p13 Deletionen, ermittelt durch die DNAChip Analyse …………………. 82 Abbildung 19 FISH Oracle Darstellung der 3p13 deletierten Tumoren und …………………. detaillierte Ansicht der Cytobande 3p13 83 III Anhang Abbildung 20 GISTIC Analyse der 14 Tumoren mit einer 3p13 Deletion …………………. 84 Abbildung 21 Beispiele von 21q22.2-q22.3 Deletionen, ermittelt durch die …………………. DNA-Chip Analyse 85 Abbildung 22 Detaillierte FISH Oracle Darstellung der 21q22.2-q22.3 deletierten Tumoren …………………. 86 Abbildung 23 Beispiele von 10q23.31 Deletionen, ermittelt durch die DNA-Chip Analyse …………………. 87 Abbildung 24 FISH Oracle Darstellung der 10q deletierten Tumoren und detaillierte Ansicht an der Cytobande 10q23.31 …………………. 88 Abbildung 25 GISTIC Analyse der 15 Tumoren mit einer 10q23 Deletion …………………. 89 Abbildung 26 FISH Oracle Darstellung der intragenischen Brüche von PTEN …………………. 90 Abbildung 27 Mehrfarb-Aufnahme der ERG Breakapart FISH Sonde im Zellverband …………………. 91 Abbildung 28 Assoziationen von ERG Aberrationen bzw. ERG Überexpression und der Wahrscheinlichkeit ein biochemisches Rezidiv zu erleiden (Kaplan Meier Überlebenskurve) …………………. 93 Abbildung 29 Mehrfarb-Aufnahmen der PTEN FISH Deletions-Sonde in einzelnen Zellkernen …………………. 95 Abbildung 30 Mehrfarb-Aufnahmen der PTEN FISH Breakapart-Sonde in …………………. einzelnen Zellkernen 97 Abbildung 31 Verteilung der PTEN Aberrationen, ermittelt über die PTEN …………………. Deletions- und Breakapart Sonden 99 Abbildung 32 Assoziation zwischen PTEN Inaktivierungen und der Wahrscheinlichkeit ein biochemisches Rezidiv zu erleiden (Kaplan Meier Überlebenskurve) …………………. 103 Abbildung 33 Elektropherogramme der identifizierten PTEN Mutationen und der Wildtypsequenz …………………. 105 Abbildung 34 Methylierung des PTEN Promotors …………………. 106 Abbildung 35 Heterogenität der PTEN Inaktivierungen …………………. 109 Abbildung 36 Beispiele der Großflächen-Validierung von zwei PTEN heterogenen Tumoren …………………. 111 Abbildung 37 Schematische Darstellung der sechs Tumorfoci mit PTEN Deletionen und Translokationen, die mindestens zwei PTEN aberrante Gewebespots aufgewiesen haben …………………. 112 Abbildung 38 Verteilung der PTEN Inaktivierungen in ERG negativen und …………………. ERG positiven Tumoren 113 IV Anhang Abbildung 39 Kombinierte Kaplan Meier Überlebenskurve von PTEN Inaktivierungen und ERG IHC für die Wahrscheinlichkeit ein biochemisches Rezidiv zu erleiden (Kaplan Meier Überlebenskurve) …………………. 114 Abbildung 40 Verteilung der PTEN Inaktivierung in ERG positiven Tumorfoci in Abhängigkeit von der Anzahl ihrer auswertbaren Gewebespots …………………. 115 Abbildung 41 Verteilung der PTEN Inaktivierungen in (A) p53 IHC negativen und positiven Tumoren und (B) in TP53 FISH normalen und deletierten Tumoren …………………. 116 Abbildung 42 Kombinierte Kaplan Meier Überlebenskurve von PTEN Inaktivierungen und p53 IHC für die Wahrscheinlichkeit ein biochemisches Rezidiv zu erleiden …………………. 116 Abbildung 43 Mehrfarb-Aufnahmen der FOXP1 FISH DNA-Sonden in einzelnen Zellkernen Deletions-Sonde …………………. 118 Abbildung 44 Assoziation von FOXP1 Deletionen und der Wahrscheinlichkeit ein biochemisches Rezidiv zu erleiden (Kaplan Meier Überlebenskurve) …………………. 120 Abbildung 45 Verteilung von FOXP1 Deletionen und Translokationen in ERG negativen und positiven Tumoren …………………. 121 Abbildung 46 Assoziation von FOXP1 Deletionen und der Wahrscheinlichkeit ein biochemisches Rezidiv zu erleiden unter Berücksichtigung des ERG Status (Kaplan Meier Überlebenskurve) …………………. 121 Abbildung 47 Verteilung der PTEN Inaktivierungen und FOXP1 Deletionen in ERG negativen und ERG positiven Tumoren …………………. 123 Abbildung 48 Kombinierte Kaplan Meier Überlebenskurve von FOXP1 Deletionen (Translokationen exkludiert), PTEN Inaktivierungen und der Wahrscheinlichkeit ein biochemisches Rezidiv zu erleiden …………………. 123 Abbildung 49 Einfluss der 3p13 Deletion auf die mRNA Expression der Gene im deletierten Kernbereich …………………. 124 Abbildung 50 mRNA Expression von FOXP1 in Laser-mikrodissektiertem …………………. Gewebe von deletierten und nicht deletierten Tumoren 125 Abbildung 51 Korrelation von FOXP1 FISH und FOXP1 Expression (IHC) …………………. 125 Abbildung 52 Beispiele der immunhistologischen FOXP1 Färbung …………………. 126 Abbildung 53 Relative mRNA Expression von FOXP1, RYBP, SHQ1, dem Androgen-Rezeptor AR und ERG in in den ProstataZelllinien BPH1, DU-145, LNCaP, PC-3, RWPE-1 und VCaP Kolonieformations-Assay an BPH-1 und PC-3 Zellen …………………. 127 …………………. 128 Abbildung 54 V Anhang Abbildung 55 Effekt des shRNA-vermittelten Knockdowns von FOXP1, RYBP und SHQ1 auf das Zellwachstum von BPH-1 Zellen bzw. die Fähigkeit von BPH-1 Zellen Kolonien zu bilden …………………. 129 Abbildung 56 Einfluss von ERG und der AR-abhängigen Aktivierung auf die Expression von FOXP1, RYBP und SHQ1 und die, der AR-responsiven Gene TMPRSS2 und FKBP5 …………………. 130 Abbildung 57 Einfluss von Dihydrotestosteron (DHT) auf die Aktivität des …………………. FOXP1 Promotors in LNCaP Zellen, im Vergleich zu den bekannten AR-responsiven Promotoren von PSA, Probasin und MMTV 131 Abbildung A 1 Assoziation von ERG Aberrationen und der Wahrscheinlichkeit ein biochemisches Rezidiv zu erleiden (Kaplan Meier Überlebenskurve) …………………. Anhang II Tabellenverzeichnis Seite Tabelle 1 PTEN PCR Primer-Paare …………………. 22 Tabelle 2 PTEN Sequenzier-Primer …………………. 23 Tabelle 3 MassARRAY Primer Sequenzen für die PTEN Methylierungs-Analyse …………………. 25 Tabelle 4 Quantitative Real Time PCR Assays …………………. 28 Tabelle 5 Bestellnummern der, für die DNA-Chip Analyse verwendeten …………………. Prostata-Zelllinien 29 Tabelle 6 Klinisch-pathologische Daten der, für die DNA-Chip Analyse verwendeten Prostatakarzinome …………………. 29 Tabelle 7 Klinisch-pathologische Parameter des Prognose-TMAs …………………. 40 Tabelle 8 Klinisch-pathologische Parameter des Heterogenitäts-TMAs …………………. 43 Tabelle 9 BAC-Klone zur FISH DNA-Sonden Herstellung …………………. 45 Tabelle 10 Für die Zellkulturversuche verwendete Prostata-Zelllinien …………………. 61 Tabelle 11 Expressions-Konstrukte …………………. 64 Tabelle 12 shRNA-Konstrukte …………………. 64 VI Anhang Tabelle 13 Luziferase-Konstrukte …………………. 66 Tabelle 14 Kopiezahl-Verluste der 77 Prostatakarzinome (Auswertung erst ab sechs betroffenen Tumorproben) …………………. 70 Tabelle 15 Kopiezahl-Zugewinne der 77 Prostatakarzinome (Auswertung erst ab sechs betroffenen Tumorproben) …………………. 77 Tabelle 16 Vergleich der häufigsten Deletionen aus aCGH/DNA-Chip …………………. Studien zur Identifizierung von CNVs beim Prostatakarzinom 81 Tabelle 17 Assoziationen von ERG FISH und ERG IHC zu klinischpathologischen Parametern …………………. 92 Tabelle 18 Korrelation von ERG IHC und ERG FISH …………………. 94 Tabelle 19 Assoziationen von PTEN Deletionen zu klinischpathologischen Parametern …………………. 96 Tabelle 20 Assoziationen von PTEN Aberrationen zu klinischpathologischen Parametern …………………. 98 Tabelle 21 Beobachtete PTEN Breakapart-Codes und Bildung des PTEN Inaktivierungsstatus …………………. 100 Tabelle 22 Assoziationen des PTEN Inaktivierungs-Status zu klinischpathologischen Parametern …………………. 102 Tabelle 23 Cox Regressions-Analyse von Tumorstadium, Gleason Grad, präoperativem PSA Wert und PTEN Inaktivierung …………………. 103 Tabelle 24 Ergebnisse der PTEN Sequenzierung und Zuordnung zum PTEN FISH Status …………………. 104 Tabelle 25 Identifizierte PTEN Mutationen …………………. 105 Tabelle 26 Korrelation von FOXP1 FISH Deletions- und FISH Breakapart-Sonde …………………. 117 Tabelle 27 Assoziationen von FOXP1 Deletionen und Translokationen zu klinisch-pathologischen Parametern …………………. 119 Tabelle 28 Korrelation von FOXP1 Aberrationen, PTEN Inaktivierung und deren Verteilung in den Teilmengen der ERG negativen und ERG positiven Tumoren …………………. 122 Tabelle A 1 Assoziationen klinisch-pathologischer Parameter zur ERG FISH, aufgeteilt nach Art der genomischen Aberration …………………. Anhang I Tabelle A 2 Teilmenge des Prognose-TMAs …………………. II VII Anhang Herstellernachweise Firma/Hersteller Abbott Molecular GmbH & Co. KG Abcam AG ABM Greiffenberger Antriebstechnik GmbH Addgene Affymetrix Inc. Affymetrix USB Inc. AppliChem GmbH Applied Biosystems (Life Technologies) Beckman-Coulter GmbH Berthold Technologies GmbH & Co.KG Biorad Laboratories GmbH Brandt GmbH & Co. KG Carl Zeiss AG Clontech/Takara Bio Holding Inc. Dako Deutschland GmbH Eppendorf AG Eurofins MWG GmbH Falcon (BD Bioscience N.V.) Fermentas (Thermo Fisher Scientific GmbH) GFL Gesellschaft für Labortechnik GmbH Gibco (Life Technologies) Greiner Bio-One GmbH Haep Labor Consult (HLC) Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH Helmut Hund GmbH Heraeus Holding GmbH Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co. KG Hoffmann-La Roche AG IKA Werke GmbH & Co. KG Invitrogen (Life Technologies) J.T. Baker (Avantor™ Performance Materials) Knick Elektronische Messgeräte GmbH & Co. KG Macherey & Nagel GmbH & Co. KG Marabu GmbH & Co. KG Medax GmbH & Co. KG MembraPure GmbH Merck KGaA Mettler-Toledo GmbH Millipore (Merck KGaA) MJ Research Inc. New England Biolabs GmbH OriGene Technologies Inc. PAA Laboratories GmbH Paul Marienfeld GmbH & Co. KG Peqlab GmbH Polysciences Europe GmbH Promega GmbH Qiagen N.V. Roth Carl Roth GmbH & Co. KG Sarstedt AG & Co. Schott Duran GmbH Schult Biotec GmbH Sigma-Aldrich Biochemie GmbH Sigma-Aldrich Laborchemikalien Source Bioscience Switchgear Genomics Tecnomara AG Th. Geyer GmbH & Co. KG Thermo Fisher Scientific Inc. TMG Technische und Medizinische Gas GmbH VACUUBRAND GmbH + Co. KG Sitz Wiesbaden Cambridge Marktredwitz Cambridge, MA Santa Clara, Ca Cleveland, OH Darmstadt Darmstadt Krefeld Bad Wildbad München Wertheim Oberkochen Shiga Hamburg Hamburg Ebersberg Heidelberg Schwerte Burgwedel Darmstadt Frickenhausen Borenden Hamburg Wetzlar Hanau Eberstadt Basel Staufen Darmstadt Center Valley, PA Berlin Düren Tamm Neumünster Hennigsdorf Darmstadt Gießen Darmstadt Quebec Frankfurt am Main Rockville, MD Cölbe Lauda Königshofen Erlangen Eppelheim Mannheim Hilden Karlsruhe Nümbrecht Wertheim/Main Göttingen Hamburg Seelze Nottingham Menlo Park, CA Zürich Renningen Waltham, MA Krefeld Wertheim VIII Land Deutschland Großbritannien Deutschland USA USA USA Deutschland Deutschland Deutschland Deutschland Deutschland Deutschland Deutschland Japan Deutschland Deutschland Deutschland Deutschland Deutschland Deutschland Deutschland Deutschland Deutschland Deutschland Deutschland Deutschland Deutschland Schweiz Deutschland Deutschland USA Deutschland Deutschland Deutschland Deutschland Deutschland Deutschland Deutschland Deutschland Canada Deutschland USA Deutschland Deutschland Deutschland Deutschland Deutschland Deutschland Deutschland Deutschland Deutschland Deutschland Deutschland Deutschland Großbritannien USA Schweiz Deutschland USA Deutschland Deutschland Anhang Vector Laboratories Inc. VWR GmbH Burlingame, CA Darmstadt USA Deutschland Verbrauchsmaterialien, Kits und Reagenzien Verbrauchsmaterial Genome-Wide Human SNP Array 6.0 MicroAmp® 96- & 384-Well Klebefolie MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaktions-Platte 0,2 ml 8er-Strips PCR-Gefäße 0,2 ml PCR-Gefäße Deckel-Streifen für 0,2 ml 8er-Strips PCR-Gefäße 0,5 ml Safe-Lock Reaktions-Gefäße, amber 1,5 ml Safe-Lock Reaktions-Gefäße, amber 10 ml serologische Pipetten 15 ml Reaktions-Gefäße 25 ml serologische Pipetten 5 ml serologische Pipetten 50 ml Reaktions-Gefäße Deckgläser No.1 (18 x 18 mm) Deckgläser No.1 (24 x 60 mm) 33 mm Millex Filter Units Cellometer Einmal-Zählkammern 2 ml Sammel-Gefäße Rotor Adaptoren 0,5 ml SafeSeal Reaktions-Gefäße 1,5 ml SafeSeal Reaktions-Gefäße 10 µl Biosphere Filtertips 100 µl Biosphere Filtertips 1000 µl Biosphere Filtertips 2 ml SafeSeal Reaktions-Gefäße 2,5 µl Biosphere Filtertips 200 µl Biosphere Filtertips 6-Well Zellkulturplatten Zellkulturflaschen T25 Zellkulturflaschen T75 0,2 µm Filtereinheiten 1,8 ml Cryoröhrchen 2ml 96er Deep Well Storage Platte 8er PCR-Streifen 9 cm Petrischalen Tough-Spots (9,5 mm) Hersteller/Lieferant Affymetrix Applied Biosystems Applied Biosystems Brand Brand Brand Eppendorf Eppendorf Falcon Falcon Falcon Falcon Greiner BioOne Marienfeld Marienfeld Millipore Peqlab Qiagen Qiagen Sarstedt Sarstedt Sarstedt Sarstedt Sarstedt Sarstedt Sarstedt Sarstedt Sarstedt Sarstedt Sarstedt VWR VWR VWR VWR VWR VWR Bestell-ID #901150 #4311971 #4346906 #781320 #781300 #781334 #0030 121.155 #0030 120.191 #356551 #352095 #356525 #356543 #227261 #0101030 #0101242 #SLGP033RB #91-CMCCP-01 #19201 #990394 #72.704 #72.706 #70.1115.210 #70.760.212 #70.762.211 #72.695 #70.1130.212 #70.760.211 #831839 #83.1810.002 #83.1813.002 #514-0025 #479-6843 #37001-518 #211-3263 #391-0455 #817-2141 Kits Nick Translations Reagent Kit High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor TaqMan® Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG Genome-Wide Human SNP Nsp/Sty Assay Kit 6.0 BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit Titanium™ DNA Amplification Kit NucleoBond® BAC 100 NucleoSpin® RNA II Dual Luciferase® Reporter Assay System QIAamp® DNA FFPE Tissue Kit QIAamp® DNA Mini Kit Qiagen Plasmid Plus Maxi Kit QIAquick® Nucleotide Removal Kit Hersteller/Lieferant Bestell-ID Abbott #7J00-01 ABI ABI Affymetrix Applied Biosystems Clontech Macherey & Nagel Macherey & Nagel Promega Qiagen Qiagen Qiagen Qiagen #4374967 #4326614 #901015 #4336778 #639243 #740579 #740955.250 #E1910 #56404 #51306 #12963 #28304 IX Anhang QIAxcel® DNA Screening Kit RNeasy® FFPE Kit Rneasy® Mini Qiacube Kit Qiagen Qiagen Qiagen #929004 #74404 #74116 Reagenzien CEP 10 Spectrum Aqua CEP 10 SpectrumGreen CEP 3 SpectrumOrange NP-40 Pretreatment Lösung Protease I Protease Puffer SpectrumGreen dUTP (50nmol, lyophylisiert) SpectrumOrange dUTP (50 nmol, lyophylisiert) SSC (20x) Genome-Wide Human SNP Array 6.0 ExoSap-IT® Natrium-Acetat (3 M) Ampli Taq Gold PCR Master Mix TaqMan® Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG Agencourt AMPure XP Tween-20 (10%) D-PBS w/o Ca/Mg MEM Non Essential Amino Acids (100X) Natrium Pyruvat MEM (100 mM) RPMI 1640 Medium DMEM (1X), liquid (High Glucose) Lipofectamine®2000 Standard Plasmid Transfection Opti-MEM® I Penicillin / Streptomycin Streptavidin, R-Phycoerythrin Konjugat (SAPE) TRIzol® Reagent Trypsin (2,5%) Xylol Fixogum Chloroform Ethanol abolut Formamid pro analysi Giemsas Azur-Eosin-Methylenblau Lösung Isopropanol Methanol zur Synthese NspI Restriktionsenzym Sty I Restriktionsenzym T4 DNA Ligase Fetal Bovine Serum "GOLD" Origin: Australia Polyethylenimine, Linear (MW 25,000) Herring Sperm DNA (10µg/µl) dNTP Set (100 mM) EB Puffer QX Alignment Marker 15bp/1kb QX DNA Size Marker 50-800bp Human COT DNA Ampicillin Natriumsalz Dextransulfat Agarose Chloramphenicol Denhardt´s Lösung (50x) DHT (5α-Androstan-17β-ol-3-one Diethyl Pyrocarbonat (DEPC) Hersteller/Lieferant Abbott Abbott Abbott Abbott Abbott Abbott Abbott Abbott Abbott Abbott Affymetrix Affymetrix USB AppliChem Applied Biosystems Applied Biosystems Beckman-Coulter Biorad Gibco Gibco Gibco Gibco Invitrogen Invitrogen Invitrogen Invitrogen Invitrogen Invitrogen Invitrogen J.T. Baker Marabu Merck Merck Merck Merck Merck Merck New England BioLabs New England BioLabs New England BioLabs PAA Polysciences Promega Promega Qiagen Qiagen Qiagen Roche Roth Roth Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Bestell-ID #06J54-010 #6J37-010 #6J36-03 #7J05-01 #2J06-30 #2J08-32 #2J07-30 #2N32-50 #2N33-50 #2J10-032 #901150 #78205 #A3947,0100 #4327058 #4326614 #A63881 #161-0781 #14190-169 #11140-035 #11360-039 #72400-021 #32430-100 #11668-027 #11058-021 #15070-063 #S-866 #15596-018 #15090-046 #8118.2500 #290110 #1.02445.1000 #1.00983.1000 #1.09684.1000 #1.09204.1000 #1.09634.2500 #8.22283.2500 #R0602L #R0500L #M0202L #A15-551 #23966-2 #D1815 #U1240 #19086 #929521 #929556 #11581074001 #K029.2 #5956.4 #A9414-250G #C0378-25G #D2532-5X5ML #10300-5g-F #D5758-50ML X Anhang Dimethylsulfoxid (DMSO) Ethidiumbromid Glycerol, wasserfrei LB broth, Miller MES Hydrat MES Natriumsalz Natriumchlorid Lösung (5M) Nuklease-freies H2O Puromycin Puromycin Dihydrochlorid RNaseZAP Sodium pyrophosphate SSPE (20x) Tetramethylammoniumchlorid (TMACL) Tris Acetate-EDTA buffer (10x) Tris EDTA Puffer Ethanol, 80% (vergällt) Ethanol, 96% (vergällt) DNA Loading Dye (6X ) GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, ready-to-use GeneRuler 50 bp DNA Ladder, ready-to-use Flüssig-Stickstoff Anti-Streptavidin Antikörper, biotinyliert Mounting Medium with DAPI Ammonium Hydroxid (27-30%) Immersol Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Th. Geyer Th. Geyer Thermo Fisher Scientific Thermo Fisher Scientific Thermo Fisher Scientific TMG Vector Laboratories Vector Laboratories VWR Zeiss XI #41639-500ML #E1510-10ML #49767-100 ml #L3152-1KG #M5287-250G #M3058-500G #S6546-1L #W4502 #P8833-100MG #P8833-10MG #R2020-250ML #71501 #S2015-1L #T19526-500G #T8280-1L #93283-500ML #RW/ETV80/005000 #RW/ETV96/005000 #R0611 #SM0323 #SM0373 #250210 #BA-0500 #H-1200 #JT9726-5 #518F Anhang Erstautorenschaften 1. Krohn A, Diedler T, Burkhardt L, Mayer PS, De Silva C, Meyer-Kornblum M, Kötschau D, Tennstedt P, Huang J, Gerhäuser C, Mader M, Kurtz S, Sirma H, Saad F, Steuber T, Graefen M, Plass C, Sauter G, Simon R, Minner S, Schlomm T Genomic deletion of PTEN is associated with tumor progression and early PSA recurrence in ERG fusion-positive and fusion-negative prostate cancer. Am J Pathol. 2012 Aug; 181(2) PMID: 22705054 2. Krohn A, Seidel A, Burkhardt L, Bachmann F, Grupp K, Becker A, Adam M, Graefen M, Huland H, Steurer S, Tsoulakis MC, Minner S, Michl U, Schlomm T, Sauter S, Simon R, Sirma H Recurrent deletion of 3p13 targets multiple tumor suppressor genes and defines a distinct subgroup of aggressive ERG-fusion positive prostate cancers. J Pathol. 2013 Sep; 231(1):130-41, PMID: 23794398 3. Krohn A, Freudenthaler F, Harasimowicz S, Kluth M, Fuchs S, Burkhardt L, Stahl P, Tsourlakis MC, Bauer M, Tennstedt P, Graefen M, Steurer S, Sirma H, Sauter G, Schlomm T, Simon R, Minner S Heterogeneity and sequel of PTEN deletion and ERG fusion in prostate cancer. Mod Pathol [2014, Manuskript # MP-2014-0016, in Revision] XII Anhang Danksagung Eine wissenschaftliche Arbeit kann nur selten das Werk einer einzelnen Person sein, deshalb ist es für mich nun an der Zeit, all den guten Menschen meinen Dank zukommen zu lassen, die mir die Fertigung meiner Dissertation ermöglicht haben. ~ Vielen Dank, Herr Prof. Dr. med. Guido Sauter, dass ich an Ihrem Institut „akademisch heranwachsen“ und meine wissenschaftliche Arbeits- und Denkweise in vielen Forschungsbesprechungen nachhaltig prägen durfte. ~ Herzlichst danke ich meinem Doktorvater, meinem Captain, Herrn PD Dr. rer. nat. Ronald Simon, der mir bei Problemen, selbst in arbeitsintensiven Zeiten, immer zur Seite stand und nie müde wurde Sachverhalte auf seine unvergleichliche Art und Weise verständlich zu machen. ~ Für die vielen Anregungen, ihre konstruktive Kritik und das Teilen ihrer Erfahrung danke ich außerdem Herrn PD Dr. med. Hüseyin Sirma und Herrn PD Dr. rer. nat. Olaf J.C. Hellwinkel sehr. ~ Herrn Prof. Dr. rer. nat. Christoph Plass und seiner Arbeitsgruppe am Deutschen Krebsforschungszentrum (DFKZ Heidelberg) in der Abteilung für Epigenetik und Krebsfaktorforschung bedanke ich mich für die Kooperation. ~ Des Weiteren möchte ich meinen Dank der Werner Otto Stiftung und der Heinrich Warner Stiftung für ihr Vertrauen und die finanzielle Unterstützung aussprechen. ~ Viel zu oft werden diejenigen vergessen, ohne die ein Labor und schon gar kein Wissenschaftler funktionieren könnte, die technischen Angestellten. Das Institut für Pathologie beschäftigt eine ganze Rige von ausgezeichneten Menschen, von deren Wissen und Erfahrungen ich von Anfang an profitieren durfte. Vielen Dank, Ihr Lieben! ~ XIII
