Informationsmakromoleküle 1

Alexander McLennan, Andy Bates,
Phil Turner und Mike White
Molekularbiologie
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Fletcher, H., Hickey, I.
Genetik
für Biologen, Biochemiker, Pharmazeuten und Mediziner
2013
978-3-527-33475-9, auch als E-Book
Alberts, B., Bray, D., Hopkin, K., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P.
Lehrbuch der Molekularen Zellbiologie
4. Auflage
2012
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Wink, M. (Hrsg.)
Molekulare Biotechnologie
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2011
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Gottschalk, G.
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6. Auflage
2012
978-3-527-33192-5
Alexander McLennan, Andy Bates, Phil Turner und Mike White
Molekularbiologie
für Biologen, Biochemiker, Pharmazeuten und Mediziner
Übersetzt von Bärbel Häcker
Titel der Originalausgabe
Molecular Biology, BIOS Instant Notes,
Fourth Edition
© 2013 by Garland Science, Taylor & Francis
Group, LLC
All Rights Reserved. Authorised translation from
the English language edition published by
Garland, a member of the Taylor & Francis Group.
1. Auflage 2013
n
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Alexander McLennan
University of Liverpool
Institute of Integrative Biology
Liverpool
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Andy Bates
University of Liverpool
Institute of Integrative Biology
Liverpool
United Kingdom
© 2013 Wiley-VCH Verlag & Co. KGaA,
Boschstr. 12, 69469 Weinheim, Germany
Phil Turner
University of Liverpool
Institute of Integrative Biology
Liverpool
United Kingdom
Mike White
University of Manchester
Faculty of Life Sciences
Manchester
United Kingdom
Übersetzt von
Dr. Bärbel Häcker
Feuerbacher Straße 14
71229 Leonberg
Cover
© Depositphotos.com/Daniel Cole;
Hintergrund: © Shutterstock
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978-3-527-67210-3
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Umschlaggestaltung Simone Benjamin, McLeese
Lake, Canada
Satz Reemers Publishing Services GmbH, Krefeld
Druck und Bindung betz-druck GmbH, Darmstadt
Gedruckt auf säurefreiem Papier.
V
Inhaltsverzeichnis
Vorwort XV
Liste der Abkürzungen
1
1.1
1.1.1
1.1.2
1.2
1.2.1
1.2.2
1.2.3
1.2.4
1.2.5
1.2.6
1.2.7
1.2.8
1.2.9
1.2.10
1.3
1.3.1
1.3.2
1.3.3
1.3.4
1.3.5
1.3.6
1.3.7
1.3.8
1.3.9
1.3.10
XVII
Informationsmakromoleküle 1
Informationsverarbeitung und Molekularbiologie
Das zentrale Dogma 1
Rekombinante DNA-Technologie 3
Nukleinsäurestruktur und -funktion 5
Basen 5
Nukleoside 5
Nukleotide 6
Phosphodiesterbindungen 6
DNA/RNA-Sequenz 7
DNA-Doppelhelix 7
A-, B- und Z-Helices 9
RNA-Sekundärstruktur 11
Modifizierte Nukleinsäuren 11
Nukleinsäurefunktion 11
Proteinstruktur und -funktion 14
Aminosäurestruktur 14
Proteingröße und -formen 16
Primärstruktur 16
Nichtkovalente Wechselwirkungen 17
Sekundärstruktur 18
Tertiärstruktur 19
Quartärstruktur 20
Prosthetische Gruppen 21
Domänen, Motive, Familien und Evolution 21
Proteinfunktion 23
1
VI
Inhaltsverzeichnis
2
2.1
2.1.1
2.1.2
2.1.3
2.1.3.1
2.1.3.2
2.1.4
2.1.5
2.1.6
2.2
2.2.1
2.2.2
2.2.3
2.2.4
2.2.5
2.2.6
2.3
2.3.1
2.3.2
2.3.3
2.3.4
2.3.5
2.3.6
2.3.7
2.4
2.4.1
2.4.2
2.4.3
2.4.4
2.4.5
2.4.6
2.4.7
2.5
2.5.1
2.5.2
2.5.3
2.5.4
2.5.5
2.5.6
2.5.7
2.5.8
2.5.9
Eigenschaften von Nukleinsäuren und eukaryotische Chromosomenstruktur 29
Chemische und physikalische Eigenschaften von Nukleinsäuren 29
Stabilität von Nukleinsäuren 29
Säureeffekt 30
Alkalieffekt 30
DNA 30
RNA 30
Chemische Denaturierung 32
Viskosität 32
Schwimmdichte 32
Spektroskopische und thermische Eigenschaften von
Nukleinsäuren 34
UV-Absorption 34
Extinktion und Struktur 34
Mengenbestimmung der Nukleinsäuren 35
Reinheit der DNA 35
Wärmedenaturierung 36
Hybridisierung 37
DNA-Superspiralisierung 38
Geschlossen-zirkuläre DNA 38
Superspiralisierung 38
Topoisomer 39
Helikale und superhelikale Windungszahl 39
Interkalatoren 40
Superspiralisierungsenergie 41
Topoisomerasen 41
Chromatinstruktur 44
Chromatin 44
Histone 44
Nukleosomen 45
Die Rolle von H1 46
Linker-DNA 47
Die 30 nm-Faser 48
Höher geordnete Struktur 48
Eukaryotische Chromosomenstruktur 50
Das Mitosechromosom 50
Das Centromer 51
Telomere 51
Interphasechromosomen 51
Heterochromatin 52
Euchromatin 52
DNase-I-Überempfindlichkeit 52
CpG-Methylierung 52
Histonvarianten und -modifikation 54
Inhaltsverzeichnis
3
3.1
3.1.1
3.1.2
3.1.3
3.1.4
3.2
3.2.1
3.2.2
3.2.3
3.2.4
3.2.5
3.3
3.3.1
3.3.2
3.3.3
3.3.4
3.3.5
DNA-Replikation 59
DNA-Replikation: eine Übersicht 59
Semikonservativer Mechanismus 59
Replikons, Ursprünge und Termini 61
Semidiskontinuierliche Replikation 62
RNA-Primer 63
Bakterielle DNA-Replikation 64
Experimentelle Systeme 64
Initiation 65
Strangentwindung 67
Elongation 67
Termination und Aufteilung 69
Eukaryotische DNA-Replikation 70
Experimentelle Systeme 70
Ursprünge und Initiation 70
Replikationsgabeln 71
Kernmatrix 72
Telomerreplikation 72
4
4.1
4.1.1
4.1.2
4.1.3
4.1.4
4.2
4.2.1
4.2.2
4.2.3
4.2.4
4.2.5
4.2.6
4.3
4.3.1
4.3.2
4.3.3
4.3.4
4.3.5
4.3.6
DNA-Schäden, -Reparatur und -Rekombination 77
DNA-Schäden 77
DNA-Defekte 77
Oxidative Schäden 78
Alkylierung 79
Sperrige Addukte 79
Mutagenese 81
Mutation 81
Replikationsgenauigkeit 82
Physikalische Mutagene 83
Chemische Mutagene 83
Direkte Mutagenese 83
Indirekte Mutagenese und Transläsions-DNA-Synthese
DNA-Reparatur 87
Photoreaktivierung 87
Alkyltransferase 87
Reparatur von Strangbrüchen 87
Exzisionsreparatur 88
Fehlpaarungsreparatur 90
Erbliche Reparaturdefekte 90
5
5.1
5.1.1
5.1.2
5.1.3
Transkription in Bakterien 95
Grundlagen der Transkription 95
Transkription: eine Übersicht 95
Initiation 95
Elongation 97
84
VII
VIII
Inhaltsverzeichnis
5.1.4
5.2
5.2.1
5.2.2
5.2.3
5.2.4
5.2.5
5.3
5.3.1
5.3.2
5.3.3
5.3.4
5.3.5
5.4
5.4.1
5.4.2
5.4.3
5.4.4
5.4.5
5.4.6
Termination 97
Escherichia coli-RNA-Polymerase 99
RNA-Polymerase-Holoenzym von E. coli 99
a-Untereinheit 99
b-Untereinheit 99
b’-Untereinheit 100
s-Faktor 100
Der s70-Promotor von E. coli 101
Promotorsequenzen 101
Promotorgröße 102
−10-Sequenz 102
−35-Sequenz 102
Promotoreffizienz 103
Transkriptionsinitiation, -elongation und -termination
Promotorbindung 104
DNA-Entwindung 105
Initiation der RNA-Kette 105
Elongation der RNA-Kette 105
Termination der RNA-Kette 106
Rho-abhängige Termination 108
6
6.1
6.1.1
6.1.2
6.1.3
6.1.4
6.1.5
6.2
6.2.1
6.2.2
6.2.3
6.2.4
6.2.5
6.2.6
6.2.7
Regulation der Transkription in Bakterien
Das lac-Operon 113
Das Operon 113
Das Lactose(lac)-Operon 113
Der Lac-Repressor 114
Induktion 115
Katabolit-Aktivatorprotein 116
Das trp-Operon 117
Das Tryptophan(trp)-Operon 117
Der Trp-Repressor 118
Der Attenuator 118
Struktur der RNA-Leitsequenz 119
Das Leitpeptid 119
Attenuation 119
Die Bedeutung der Attenuation 121
7
Transkription in Eukaryoten und Regulation der eukaryotischen
Transkription 125
Die drei RNA-Polymerasen: Charakterisierung und Funktion 125
Eukaryotische RNA-Polymerasen 125
RNA-Polymerase-Untereinheiten 126
Aktivitäten eukaryotischer RNA-Polymerasen 126
Die CTD der RNA-Pol II 126
7.1
7.1.1
7.1.2
7.1.3
7.1.4
104
113
Inhaltsverzeichnis
7.2
7.2.1
7.2.2
7.2.3
7.2.4
7.2.5
7.2.6
7.3
7.3.1
7.3.2
7.3.3
7.3.4
7.3.5
7.4
7.4.1
7.4.2
7.4.3
7.4.4
7.5
7.5.1
7.5.2
7.5.3
7.5.4
7.5.5
7.5.6
7.5.7
7.5.8
7.6
7.6.1
7.6.2
7.6.2.1
7.6.2.2
7.6.2.3
7.6.3
7.6.3.1
7.6.3.2
7.6.4
7.6.4.1
7.6.4.2
7.6.4.3
7.6.5
7.6.6
7.6.7
RNA-Pol-I-Gene: die ribosomale Wiederholung 128
Ribosomale RNA-Gene 128
Die Rolle des Nukleolus 128
RNA-Pol-I-Promotoren 129
Upstream binding factor 129
Selektivitätsfaktor 1 129
TBP und TAFIs 131
RNA-Pol-III-Gene: 5S- und tRNA-Transkription 132
RNA-Polymerase III 132
tRNA-Gene 132
5S-rRNA-Gene 133
Alternative RNA-Pol-III-Promotoren 135
RNA-Pol-III-Termination 135
RNA-Pol-II-Gene: Promotoren und Enhancer 136
RNA-Polymerase II 136
Promotoren 137
Stromaufwärtige Regulationselemente (URE) 137
Verstärkerelemente (Enhancer) 138
Allgemeine Transkriptionsfaktoren und RNA-Pol-II-Initiation
Basale RNA-Pol-II-Transkriptionsfaktoren 139
TFIID 139
TBP 141
TFIIA 141
TFIIB- und RNA-Polymerasebindung 141
Nach der RNA-Polymerase bindende Faktoren 141
CTD-Phosphorylierung durch TFIIH 142
Der Initiatortranskriptionskomplex 142
Eukaryotische Transkriptionsfaktoren 143
Transkriptionsfaktordomänenstruktur 143
DNA-Bindungsdomänen 144
Die Helix-Kehre-Helix-Domäne 144
Die Zinkfingerdomäne 145
Die basische Domäne 146
Dimerisierungsdomänen 146
Leucin-Zipper 146
Die Helix-Schleife-Helix-Domäne 147
Transkriptionsaktivierungsdomänen 147
Saure Aktivierungsdomänen 147
Glutaminreiche Domänen 147
Prolinreiche Domänen 147
Repressordomänen 148
Ziele von Transkriptionsregulatoren 148
Chromatinmodifikation 149
139
IX
X
Inhaltsverzeichnis
8
8.1
8.1.1
8.1.2
8.1.3
8.1.4
8.1.5
8.1.6
8.2
8.2.1
8.2.2
8.2.3
8.2.4
8.2.5
8.2.6
8.2.7
Der genetische Code und tRNA 155
Der genetische Code 155
Grundlagen 155
Entschlüsselung 156
Degeneriertheit, Universalität und Doppeldeutigkeit
Mutationswirkung 158
Offene Leseraster (ORFs) 159
Überlappende Gene 159
tRNA-Struktur und -funktion 161
tRNA-Primärstruktur 161
tRNA-Sekundärstruktur 161
tRNA-Tertiärstruktur 163
tRNA-Funktion 163
Aminoacylierung der tRNAs 164
Aminoacyl-tRNA-Synthetasen 164
Korrekturlesen 166
9
9.1
9.1.1
9.1.2
9.1.3
9.1.4
9.1.5
9.2
9.2.1
9.2.2
9.2.3
9.2.4
9.3
9.3.1
9.3.2
9.3.3
9.3.4
9.3.5
9.4
9.4.1
9.4.2
9.4.3
9.4.4
9.4.5
9.4.6
Proteinsynthese 169
Aspekte der Proteinsynthese 169
Codon-Anticodon-Wechselwirkung 169
Wobble 169
Ribosomenbindungsstelle 171
Initiator-tRNA 171
Polysomen 171
Proteinsynthesemechanismus 173
Übersicht 173
Initiation 174
Elongation 178
Termination 179
Initiation in Eukaryoten 181
Übersicht 181
Abtasten 182
Initiation 182
Elongation 184
Termination 185
Translationskontrolle und posttranslationale Ereignisse
Translationskontrolle in Bakterien 186
Translationskontrolle in Eukaryoten 187
Polyproteine 189
Protein-Targeting 189
Proteinfaltung und -modifikation 191
Proteinabbau 192
156
186
Inhaltsverzeichnis
10
10.1
10.1.1
10.1.2
10.1.3
10.1.4
10.1.5
10.1.6
10.2
10.2.1
10.2.2
10.2.3
10.2.4
10.2.5
10.2.6
10.3
10.3.1
10.3.2
10.3.3
10.3.4
10.3.5
10.3.6
10.4
10.4.1
10.4.2
10.4.3
10.4.4
10.4.5
10.4.6
10.4.7
10.4.8
10.4.9
10.4.10
10.4.11
Genmanipulation 197
DNA-Klonierung: eine Übersicht 197
DNA-Klonierung 197
Wirte und Vektoren 198
Subklonierung 199
DNA-Bibliotheken 200
Durchsuchen von Bibliotheken 200
Analyse eines Klons 201
Präparation von DNA-Plasmiden 203
Plasmide als Vektoren 203
Plasmid-Minipräparation 203
Alkalische Lyse 203
Plasmidreinigung 205
Ethanolfällung 205
Cäsiumchlorid-Gradient 205
Restriktionsenzyme und Elektrophorese 207
Restriktionsendonukleasen 207
Erkennungssequenzen 207
Kohäsive Enden 208
Restriktionsverdau 209
Agarose-Gelelektrophorese 210
Isolierung der Fragmente 212
Ligation, Transformation und Analyse von Rekombinanten
DNA-Ligation 213
Rekombinante DNA-Moleküle 214
Alkalische Phosphatase 215
Transformation 216
Selektion 217
Transformationseffizienz 217
Überprüfung auf Transformanten 217
Wachstum und Aufbewahrung der Transformanten 218
Gelanalyse 218
Fragmentausrichtung 218
Neue Subklonierungsmethoden 219
11
11.1
11.1.1
11.1.2
11.1.3
11.1.4
11.1.5
11.1.6
11.2
11.2.1
Klonierungsvektoren 223
Plasmidvektor-Design 223
Ligationsprodukte 223
Blau-weiß-Screening 223
Mehrfachklonierungsstellen 224
Transkription klonierter eingefügter Abschnitte 225
Expressionsvektoren 225
Gateway® – Subklonierung durch Rekombination 226
Bakteriophagen, Cosmide, YACs und BACs 229
Bakteriophage l 229
213
XI
XII
Inhaltsverzeichnis
11.2.2
11.2.3
11.2.4
11.2.5
11.2.6
11.2.7
11.2.8
11.2.9
11.2.10
11.2.11
11.3
11.3.1
11.3.2
11.3.3
11.3.4
11.3.5
11.3.6
11.3.7
l-Ersatzvektoren 230
Verpackung und Infektion 231
Plaquebildung 232
l-Lysogene 232
M13-Phage-Vektoren 233
Klonierung großer DNA-Fragmente 233
Cosmidvektoren 234
YAC-Vektoren 234
Selektion in Hefe 236
BAC-Vektoren 237
Eukaryotische Vektoren 239
Klonierung in Eukaryoten 239
Transfektion eukaryotischer Zellen 239
Pendelvektoren 240
Episomale Hefeplasmide 240
Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens 241
Virale Transduktion 242
Baculoviren 243
12
12.1
12.1.1
12.1.2
12.1.3
12.1.4
12.2
12.2.1
12.2.2
12.2.3
12.2.4
12.2.5
12.2.6
12.2.7
12.3
12.3.1
12.3.2
12.3.3
12.3.4
12.3.5
12.3.6
12.3.7
12.4
12.4.1
12.4.2
12.4.3
Analyse und Verwendung klonierter DNA 247
Charakterisierung von Klonen 247
Charakterisierung 247
Restriktionskartierung 248
Markierung von Nukleinsäuren 249
Southern und Northern Blot 250
Nukleinsäuresequenzierung 252
DNA-Sequenzierung nach Sanger 252
Schrotschusssequenzierung 254
Emulsion-PCR 255
Reversible Fluoreszenz-Abbruchsequenzierung 255
Pyrosequenzierung 256
Sequenzierung durch Ligation und andere Methoden
RNA-Sequenzierung 257
Polymerase-Kettenreaktion 259
PCR 259
Der PCR-Zyklus 259
Matrize und Primer 261
Enzyme 262
PCR-Optimierung 263
RT-PCR und RACE 263
Echtzeit- und quantitative PCR 264
Analyse klonierter Gene 266
Sequenzorganisation 266
S1-Nuklease-Kartierung 267
Primer-Verlängerung 268
257
Inhaltsverzeichnis
12.4.4
12.4.5
12.4.6
12.5
12.5.1
12.5.2
12.5.3
12.5.4
Gelverzögerung 268
DNase-I-Fußabdruck 269
Reportergene 269
Mutagenese klonierter Gene 271
Mutagenesearten 271
Ortsgerichtete Mutagenese 271
Insertions-/Deletionsmutagenese 272
Zufallsmutagenese durch PCR 273
13
13.1
13.1.1
13.1.2
13.1.3
13.1.4
13.1.5
13.2
13.2.1
13.2.2
13.2.3
13.2.4
13.2.5
13.3
13.3.1
13.3.2
13.3.3
13.3.4
13.4
13.4.1
13.4.2
13.4.3
13.4.4
13.5
13.5.1
13.5.2
13.5.3
13.5.4
13.6
13.6.1
13.6.2
13.6.3
13.6.4
13.6.5
13.6.6
13.7
Funktionelle Genomik und die neuen Technologien 277
Einführung in die ’Omik-Wissenschaften 277
Genomik 277
Transkriptomik 278
Proteomik 279
Metabolomik 280
Andere ’Omik-Wissenschaften 280
Allgemeine Genexpressionsanalyse 282
Genomweite Analyse 282
DNA-Mikroarrays 283
Chromatinimmunpräzipitation 285
Gen-Knockouts 286
RNA-Knockdown 288
Proteomik 290
Proteomik 290
Protein-Protein-Wechselwirkungen 292
Zwei-Hybrid-Analyse 293
Protein-Arrays 295
Zelluläre und molekulare Bildgebung 296
Zelluläre Bildgebung 296
Bildgebung biologischer Moleküle in fixierten Zellen 296
Detektion von Molekülen in lebenden Zellen und Geweben
Fluoreszierende Proteine und Reportergene 299
Transgene und Stammzelltechnologie 301
Genetisch veränderte und transgene Organismen 301
Stammzellen 302
Induzierte pluripotente Stammzellen 303
Gen- und Zelltherapie 304
Bioinformatik 306
Definition und Anwendungsbereich 306
Anwendungen der Bioinformatik 307
Suche nach Sequenzähnlichkeiten 309
Mehrfachsequenzvergleich 312
Phylogenetische Bäume 313
Strukturelle Bioinformatik 314
System- und synthetische Biologie 318
298
XIII
XIV
Inhaltsverzeichnis
13.7.1
13.7.2
13.7.3
13.7.4
13.7.5
13.7.6
13.7.7
Systembiologie 318
Netzwerkbiologie 319
Netzwerkmotive 319
Quantitative Biologie 320
Quantitative mathematische Modelle 321
Integration über biologische Größenordnungen hinweg
Synthetische Biologie 322
Richtig gelöst ...
Mehr zum Thema
327
331
Stichwortverzeichnis
337
321
XV
Vorwort
Es gibt nur wenige wissenschaftliche Disziplinen, die sich in den Jahren seit der
letzten Auflage so rasch entwickelt haben wie die Molekularbiologie. Unsere
Hoffnung, dass die Verbesserungen der letzten Auflage künftige Änderungen
einfacher machen würden, war somit ziemlich naiv. Unsere Bearbeitung und
Aktualisierung der 4. Auflage waren umfassend und betrafen alle Kapitel und
Themen, so groß war die Geschwindigkeit des Fortschritts. Die ersten beiden
Kapitel der 3. Auflage wurden kombiniert und vereinfacht, um Überlappungen mit
anderen Titeln aus der Reihe Instant Notes zu verringern; andere Kapitel wurden
neu geordnet und logischer umstrukturiert. Dies schuf Raum für die Betrachtung
von Fortschritten bei Themen wie der Next-Generation-DNA-Sequenzierung und
Genomik, der allgemeinen Genexpressionsanalyse, regulatorischer RNAs, Proteomik, Stammzellen, Systembiologie und vielen anderen Feldern. Eine Schwierigkeit bestand in der Beurteilung, was weggelassen werden konnte, um neuen Stoff
unterzubringen. Wenn das Wissen sich erweitert, die Technik Fortschritte macht
und die alten Methoden in „Ungnade fallen“, ist es eine Herausforderung, den
Leser mit neuen Entdeckungen und mit der Leistungsfähigkeit neuer Methoden
zu fesseln, jedoch gleichzeitig eine ausreichende Menge des traditionellen Hintergrundwissens beizubehalten, damit ein Thema vollständig verstanden werden
kann. Wir sind uns dessen voll bewusst, dass es sich hier um ein einführendes
Lehrbuch handelt, und haben deshalb versucht, unnötige Komplexität und Details
zu vermeiden. Wir hoffen, dass uns dies gelungen ist. Wie immer sind wir auch
diesmal den vielen Lesern, die Verbesserungsvorschläge gegenüber der Vorauflage
gemacht haben, sehr dankbar. Besonderen Dank schulden wir Liz Owen und Vicki
Noyes für ihre Geduld und ihr Verständnis während der Überarbeitung.
Alexander McLennan
Andy Bates
Phil Turner
Mike White
Molekularbiologie für Biologen, Biochemiker, Pharmazeuten und Mediziner, 1. Auflage. A. McLennan, A. Bates, P. Turner und
M. White © 2013 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Boschstr. 12, 69469 Weinheim, Germany
XVII
Liste der Abkürzungen
Wichtig zu wissen
In der Molekularbiologie und Genetik gibt es eine Reihe wichtiger Abkürzungen, die die Verständigung vereinfachen. Hier sind die in diesem Buch
verwendeten Abkürzungen aufgeführt.
Kurz erklärt
ADP
AIDS
AMP
AP
ARS
ATP
BAC
BER
bHLH
BLAST
Bp
BRF
BSE
BUdR
bZIP
cAMP
cDNA
CFTR
CHEF
ChIP
CJK
CMP
CTD
Adenosin-5’-diphosphat
erworbenes Immunschwächesyndrom (aquired immunodeficiency syndrome)
Adenosin-5’-monophosphat
apurinisch oder apyrimidinisch
autonom replizierende Sequenz
Adenosin-5’-triphosphat
künstliches Bakterienchromosom, bacterial artificial chromosome
Basenexzisionsreparatur
basische HLH
Basic Local Alignment Search
Basenpaare
TFIIB-verwandter Faktor
bovine spongiforme Enzephalopathie (Rinderwahnsinn)
Bromdesoxyuridin
basischer Leucin-Zipper
cyclisches Adenosinmonophosphat
komplementäre DNA
cystic fibrosis transmembran conductance regulator
contour clamped homogenous electric field, konturgespanntes elektrisches Feld
Chromatinimmunpräzipitation
Creutzfeld-Jakob-Krankheit
Cytidin-5’-monophosphat
carboxyterminale Domäne
XVIII
Liste der Abkürzungen
Da
dATP
dCTP
ddNTP
dGDP
dGTP
DNA
DNase I
dNTP
DOP-PCR
DSB
dsDNA
dsRNA
dTTP
EDTA
EF
eIF
ER
eRF
ES
ESI
EST
EtBr
FADH
FASTA
FIGE
FISH
GFP
GST
GTP
GVO
HAT
HDAC
HDL
HIV
HLH
hnRNA
hnRNP
HR
HSP
HSVTK
ICC
IF
IgG
Dalton
Desoxyadenosin-5’-triphosphat
Desoxycytidin-5’-triphosphat
Didesoxynukleotid-5’-triphosphat
Desoxyguanosin-5’-diphosphat
Desoxyguanosin-5’-triphosphat
Desoxyribonukleinsäure
Desoxyribonukease I
Desoxynukleosid-5’-triphosphat
PCR, die degenerierte Oligonukleotid-Primer verwendet
Doppelstrangbruch
doppelsträngige DNA
doppelsträngige RNA
Desoxythymidin-5’-triphosphat
Ethylendiamintetraessigsäure
Elongationsfaktor
eukaryotischer Initiationsfaktor
endoplasmatisches Retikulum
eukaryotischer Freisetzungsfaktor
embryonale Stammzelle
Elektrosprayionisation
exprimierte Sequenzmarkierung
Ethidiumbromid
Flavinadenindinukleotid
Fast-All
Feldinversionsgelelektrophorese
Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung
grün fluoreszierendes Protein
Glutathion-S-Transferase
Guanosin-5’-triphosphat
gentechnisch veränderter Organismus
Histonacetyltransferase
Histondeacetylase
Lipoprotein hoher Dichte
menschliches Immunschwächevirus
Helix-Schleife-Helix
heterogene nukleäre RNA
heterogenes nukleäres Ribonukleoprotein
homologe Rekombination
Hitzeschockprotein
Herpes-simplex-Virus-Thymidin-Kinase
Immuncytochemie
Initiationsfaktor
Immunglobulin G
Liste der Abkürzungen
IHC
Int
IP
iPS
IPTG
IRE
IRES
IS
ISH
ISP
KAP
kb
kDA
lncRNA
LTR
LUCA
MALDI
MBP
MCS
MDa
Met-tRNA
MFC
miRNA
MMS
mRNA
MS
NAD+
ncRNA
NER
NHEJ
NMD
NMN
NMR
Nt
NTP
NTPase
OE-PCR
OMIM®
ORC
ORF
PABI
PABII
pADPR
Immunhistochemie
Integrase
Immunpräzipitation
induzierte pluripotente Stammzelle
Isopropyl-b-d-thiogalactopyranosid
iron response element, Eisen-Response-Element
interne Ribosomeneintrittsstelle
Insertionssequenz
in situ-Hybridisierung
iron sensing protein, Eisen erfassendes Protein
Katabolit-Aktivatorprotein
Kilobasenpaare in doppelsträngiger Nukleinsäure, Kilobasen in einzelsträngiger Nukleinsäure
Kilo-Dalton
lange nicht codierende RNA
long terminal repeat, lange terminale Wiederholung
last universal common ancestor, letzter gemeinsamer Vorfahre
matrix assisted laser desorption/ionization
Maltose bindendes Protein
multiple Klonierungsstelle
Mega-Dalton
Methionyl-tRNA
Multifaktorkomplex
mikroRNA
Methylmethansulfonat
messenger RNA, Boten-RNA
Massenspektrometrie
Nikotinamidadenindinukleotid
nicht codierende RNA
Nukleotid-Exzisionsreparatur
nonhomologous end joining, nichthomologe Rekombination
nonsense mediated decay, Mechanismus zum Abbau mutierter RNA
Nikotinamidmononukleotid
Kernmagnetresonanz
Nukleotide
Nukleosid-5’-triphosphat
Nukleotidtriphosphatase
overlap extension PCR, Überhang-Extension-PCR
Online Mendelian Inheritance in Man-Datenbank
origin recognition complex, Ursprungerkennungskomplex
open reading frame, offenes Leseraster
Poly(A)-Bindeprotein I
Poly(A)-Bindeprotein II
Poly(ADP-Ribose)
XIX
XX
Liste der Abkürzungen
PAGE
PARPI
PCNA
PCR
PDB
PDGF
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Poly(ADP-Ribose)Polymerase I
Proliferationszellkernantigen
Polymerase-Kettenreaktion
Proteindatenbank
platelet-derived growth factor, von Thrombocyten freigesetzter Wachstumsfaktor
PFGE
Pulsfeldgelelektrophorese
piRNA
piwi-assoziierte RNA
PPi
Pyrophosphat
prä-mRNA mRNA-Vorläufer
pri-mRNA primäre miRNA
qPCR
quantitative PCR
RACE
rasche Amplifizierung (Vervielfältigung) von cDNA
RBI
Retinoblastom-Gen
RBS
Ribosomenbindungsstelle
RF
release factor, Freisetzungsfaktor
RFLP
Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus
RFP
rot fluoreszierendes Protein
RISC
RNA-induzierter Stilllegungskomplex
RITS
RNA-induzierte Transkriptionsstilllegung
RNA
Ribonukleinsäure
RNAi
RNA-Interferenz
RNA-Pol I RNA-Polymerase I
RNA-Pol II RNA-Polymerase II
RNA-Pol III RNA-Polymerase III
RNaseA
Ribonuklease A
RNP
Ribonukleoprotein
ROS
reaktive Sauerstoffspezies
RRF
Ribosomen-Recycling-Faktor
rRNA
ribosomale RNA
Rt
Reverse Transkriptase
RT-PCR
Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion
SCID
schwere kombinierte Immunschwäche
SCNT
somatischer Zellkerntransfer
SDA-PAGE Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
SDS
Natriumdodecylsulfat
SECIS
Selenocystein-Insertionssequenz
SILAC
stable isotop labeling with amino acids in culture, Markierung von
Aminosäuren in Zellkultur mit stabilen Isotopen
SINEs
short interspersed elements, kurze eingestreute Elemente
siRNA
kurze interferierende RNA
SL1
Selektionsfaktor 1
Liste der Abkürzungen
snoRNP
SSB
Ssb
ssDNA
SV40
TAF
TAFI
TBP
TdT
TLS
Tm
tmRNA
Tris
tRNA
UBF
UCE
URE
UTP
UTR
UV
Xist
XP
XP-V
YAC
Yep
Y-Gal
small nucleolar ribonucleoprotein particle, kleines nukleoläres Ribonukleoproteinpartikel
Einzelstrangbruch
einzelsträngiges Bindeprotein
einzelsträngige DNA
Simian(Affen)-Virus 40
TBP-assoziierter Faktor
TAFs für RNA-Pol I-Transkription
TATA-Bindeprotein
Terminale Desoxynukleotidyl-Transferase
Transläsions-DNA-Synthese
Schmelztemperatur
transfer-messenger-RNA
Tris(hydroxymethyl)aminomethan
Transfer-RNA
upstream binding factor, stromaufwärtiger Bindungsfaktor
upstream control element, stromaufwärtiges Kontrollelement
upstream regulatory element, stromaufwärtiges Regulationselement
Uridin-5’-triphosphat
nicht translatierte Region
ultraviolett
X-inaktives spezifisches Transkript
Xeroderma pigmentosum
Xeroderma pigmentosum-Variante
yeast artificial chromosome, künstliches Hefechromosom
yeast episomal plasmid, episomales Hefeplasmid
5-Brom-4-chlor-3-indolyl-b-d-galacto-pyranosid
XXI
1
Informationsmakromoleküle
1
In diesem Kapitel …
… geht es um diese Themen:
• Informationsverarbeitung und Molekularbiologie
• Nukleinsäurestruktur und -funktion
• Proteinstruktur und -funktion
1.1
1.1.1
Informationsverarbeitung und Molekularbiologie
Das zentrale Dogma
Die Molekularbiologie befasst sich mit den molekularen Wechselwirkungen, die
den biologischen Funktionen zugrunde liegen. Sie überschneidet sich beträchtlich
mit der Biochemie und der Genetik, und sie scheint sich hauptsächlich mit den
strukturellen Grundlagen und der Kontrolle der Informationsverarbeitung in der
Zelle zu beschäftigen sowie mit den für deren Untersuchung erforderlichen
Technologien. Durch die Pionierarbeiten von Avery, MacLeod und McCarty sowie
von Hershey und Chase in den 1940er- und 1950er-Jahren wurde klar bewiesen,
dass die genetischen Anweisungen zur Erschaffung einer Zelle im Zellkern sitzen,
innerhalb einer linearen Sequenz von Basen; diese wiederum sind Bestandteil der
Struktur eines langen chemischen Polymers, der Desoxyribonukleinsäure (DNA).
Im Jahre 1953 schlugen dann Crick und Watson die berühmte Doppelhelixstruktur
der DNA vor, die genau darlegte, wie diese Information gespeichert und an nachfolgende Generationen weitergegeben wird. Um zu erklären, wie Zellen die im
DNA-Genom verschlüsselten Anweisungen verwenden, postulierte Crick, dass der
Fluss der genetischen Information in nur eine Richtung verläuft: von der DNA
über eine zwischengeschaltete Nukleinsäure, die Ribonukleinsäure (RNA), zum
Protein – d. h. „DNA macht RNA macht Protein“. Diese Aussage wurde zum
zentralen Dogma der Molekularbiologie, ohne dass die einzelnen Schritte groß
bewiesen wurden. Wir wissen heute, dass diese Aussage des zentralen Dogmas
weitgehend korrekt ist, auch wenn das ursprüngliche Schema inzwischen mehrmals modifiziert worden ist. Abb. 1.1 zeigt ein Diagramm dieses Informationsflusses. Der Hauptweg führt von der DNA über die RNA zum Protein, und man
Molekularbiologie für Biologen, Biochemiker, Pharmazeuten und Mediziner, 1. Auflage. A. McLennan, A. Bates, P. Turner und
M. White © 2013 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Boschstr. 12, 69469 Weinheim, Germany
2
1 Informationsmakromoleküle
Abb. 1.1 Der Fluss der genetischen Information.
weiß heute, dass dies auch für die DNA in den kleinen unabhängigen Genomen
der Mitochondrien und Chloroplasten gilt. In allen Zellen wird die DNA konzeptionell (aber nicht physikalisch) in diskrete codierende Einheiten (Gene) eingeteilt,
die die Information für die einzelnen Proteine enthalten. Diese DNA wird transkribiert (Kap. 5 und 7), sodass RNA-Moleküle entstehen (Boten- oder messengerRNA, mRNA), die die gleiche Sequenzinformation wie die DNA enthalten; sie
können als Arbeitskopien der Gene angesehen werden, die in der Haupt-DNABlaupause vorhanden sind. Diese mRNAs werden dann entsprechend dem genetischen Code (Abschnitt 8.1) in Aminosäuresequenzen von Proteinen translatiert
(übersetzt) (Kap. 9). Die Kombination all dieser Prozesse, die erforderlich sind, um
die Information der DNA zu entschlüsseln und ein funktionsfähiges Molekül zu
erzeugen, heißt Genexpression. Wir können auch die DNA-Replikation (Kap. 3) in
Abb. 1.1 mit einschließen, bei der durch Verdoppelung der Information in der
Ausgangs-DNA zwei Tochter-DNA-Moleküle gebildet werden; dies hat den Informationsfluss und die Bewahrung der Information von einer Generation zur nächsten zur Folge.
Man hat jedoch einige Ausnahmen von diesem Grundschema identifiziert. Viele
RNA-Moleküle werden nicht in ein Protein translatiert, sondern funktionieren
eigenständig als RNAs (Abschnitt 9.4). Ihre Gene werden als RNA-Gene bezeichnet. Eine Reihe von Virusklassen besitzt keine DNA, sondern enthält ein Genom,
das aus einem oder mehreren RNA-Molekülen besteht. Bei den Retroviren, zu
denen auch das menschliche Immunschwächevirus (HIV, human immunodeficiency virus) gehört, der Verursacher des erworbenen Immunschwächesyndroms
(AIDS, aquired immunodeficiency syndrome), wird das einzelsträngige RNA-Molekül
1.1 Informationsverarbeitung und Molekularbiologie
in eine doppelsträngige DNA-Kopie überführt; diese wird dann in das Genom der
Wirtszelle eingebaut. Dieser Vorgang wird als reverse Transkription bezeichnet.
Man kennt auch eine Reihe von Viren, deren RNA-Genom direkt zu RNA kopiert
wird, ohne Zuhilfenahme der DNA als Zwischenstufe (RNA-Replikation). Dazu
zählen das Influenza- und das Hepatitis-C-Virus. Soweit bekannt, gibt es keine
Beispiele dafür, dass ein Protein „rückwärts translatiert“ wird, um eine spezifische
RNA- oder DNA-Sequenz zu erzeugen; somit scheint der Translationsschritt des
zentralen Dogmas in nur eine Richtung zu gehen. Schließlich gibt es noch eine
faszinierende Ausnahme von dem Dogma, dass die RNA- und Proteinsequenzen
eindeutig in der DNA verschlüsselt (codiert) sind: der Prozess des RNA-Editing.
Man kennt Beispiele (hauptsächlich in Eukaryoten), bei denen die Basensequenz
einer RNA tatsächlich nach der Transkription der DNA verändert wird, sodass sie,
und jedes Proteinprodukt im Falle einer mRNA, nicht mehr exakt der DNA
entspricht.
Die Erörterung dieser Systeme im vorliegenden Buch basiert auf dem biologischen Klassifizierungssystem der drei Domänen, bei dem der letzte gemeinsame
Vorfahre (LUCA, last universal common ancestor) allen Lebens sich zunächst in die
Bakterien (Bacteria) und den gemeinsamen Vorfahren der Archaea und Eukarya
aufspaltete. Die beiden Letztgenannten trennten sich später auf. Zwar sind Bakterien und Archaeen beide Prokaryoten, weil ihnen ein echter Zellkern fehlt,
hinsichtlich vieler Aspekte der Informationsverarbeitung haben die Archaeen
jedoch mehr Gemeinsamkeiten mit den kernhaltigen Eukaryoten. Die meisten
Beispiele stammen von Bakterien und Eukaryoten.
1.1.2
Rekombinante DNA-Technologie
In den späten 1970er-Jahren erlebte die Molekularbiologie große Fortschritte
durch die Entwicklung der rekombinanten DNA-Technologie (Gentechnik). Sie
erlaubte, dass Gene isoliert, sequenziert, modifiziert und von einem Organismus
auf einen anderen übertragen werden; sie war von größter Bedeutung für das
zunehmende Verständnis darüber, wie Zellen arbeiten. Zudem werden auf diese
Weise erzeugte transgene Mikroorganismen heute routinemäßig eingesetzt, um
menschliche Therapeutika im Großmaßstab herzustellen. Transgene Tiere und
Pflanzen verfügen über ein großes Potenzial, sowohl die Spannbreite nützlicher
Produkte zu vergrößern als auch verbessertes Wachstum, Krankheitsresistenz oder
Modelle für menschliche Krankheiten usw. zu erreichen (Abschnitt 13.5). Die
dauerhafte Korrektur einer Erbkrankheit mithilfe der Gentherapie ist jetzt ebenfalls eine realistische Möglichkeit. In den letzten Jahren ist die für die Bestimmung
der DNA-Basen verantwortliche Technologie vorangeschritten und die Kosten sind
so rasch gesunken, dass es schon bald praktikabel sein wird, das vollständige
Genom eines Individuums zu sequenzieren und die Krankheitsanfälligkeit im
Rahmen eines routinemäßigen Gesundheitsfürsorgeprogramms zu bestimmen.
Inzwischen können sogar neue Gene chemisch synthetisiert und zu vollständigen
Genomen zusammengefügt werden. Im Jahre 2010 bildeten J. Craig Venter und
seine Kollegen die vollständige chromosomale DNA eines kleinen Mykoplasma-
3
4
1 Informationsmakromoleküle
Bakteriums nach und fügten sie in eine „leere“ Zelle ein, deren eigenes Chromosom entfernt worden war; auf diese Weise schufen sie einen lebenden Organismus
(Abschnitt 13.7). Dieses DNA-Molekül besaß auch einige neue Eigenschaften und
ebnete damit den Weg für die zukünftige Möglichkeit, echtes synthetisches Leben
zu erschaffen – „Designer“-Organismen mit künstlichen Genomen, die neue
biochemische Funktionen ausführen können, die in der natürlichen Welt nicht
vorkommen. Ziel ist dabei die Herstellung neuer Medikamente, Brennstoffe und
anderer Produkte. Die Molekularbiologie und die um sie entstandenen Technologien haben eine zentrale Rolle bei der Entwicklung von Medikamenten für Mensch
und Tier, in der Landwirtschaft und in der biotechnologischen Industrie gespielt;
nun werden sie darauf angesetzt, die Herausforderungen der weltweiten Gesundheit, der Umweltveränderungen und der Lebensmittelsicherheit zu bewältigen,
mit denen wir im 21. Jahrhundert konfrontiert sind.
Noch einmal in Kürze
Das zentrale Dogma
Das zentrale Dogma besagte ursprünglich: „DNA macht RNA macht Protein.“
Dies geschieht mithilfe der Transkription bzw. der Translation. Dies stimmt im
Wesentlichen, obwohl es eine Reihe von Beispielen gibt, die Teilen davon
widersprechen. Retroviren schreiben RNA zurück in DNA, andere Viren können RNA direkt zu einer RNA-Kopie replizieren, wohingegen manche RNAs
nach ihrer Synthese editiert werden können, sodass die sich ergebende Sequenz
nicht direkt durch die DNA-Sequenz spezifiziert ist.
Rekombinante DNA-Technologie (Gentechnik)
Die Fähigkeit, die Genome von Mikroorganismen, Tieren und Pflanzen zu
manipulieren, hat große Fortschritte für das Verständnis der Zellbiologie
gebracht. Außerdem haben transgene Organismen, die DNA von anderen
Quellen enthalten, viele Anwendungen in der Medizin, der Landwirtschaft und
der Industrie gefunden. Die Fähigkeit, neue Genome zu synthetisieren, wird
noch größere Fortschritte auf diesen Gebieten mit sich bringen.
Tipp
Verwandte Themen:
• (Abschnitt 1.2) Nukleinsäurestruktur und ‑funktion
• (Abschnitt 1.3) Proteinstruktur und -funktion
• (Kap. 5) Transkription in Bakterien
• (Kap. 7) Transkription in Eukaryoten
• (Kap. 8) Der genetische Code und die tRNA
• (Kap. 9) Proteinsynthese
1.2 Nukleinsäurestruktur und -funktion
1.2
1.2.1
Nukleinsäurestruktur und -funktion
Basen
Die Basen der DNA und RNA sind heterozyklische (kohlenstoff- und stickstoffhaltige) aromatische Ringe, mit einer Reihe von Substituenten (Abb. 1.2). Bei
Adenin (A) und Guanin (G) handelt es sich um Purine, bizyklische Strukturen
mit zwei fusionierten Ringen; dagegen sind Cytosin (C), Uracil (U) und Thymin
(T) Pyrimidine mit nur einem Ring. In der DNA ist die Base Uracil, die in der RNA
vorkommt, durch Thymin ersetzt. Thymin unterscheidet sich von Uracil nur
bezüglich einer Methylgruppe in der 5-Position, d. h. Thymin ist ein 5-Methyluracil.
1.2.2
Nukleoside
In den Nukleinsäuren sind die Basen kovalent mit einem Pentosezuckerring an
der 1’-Position verknüpft und bilden dabei ein Nukleosid (Abb. 1.3). Bei RNA ist
der Zucker eine Ribose, bei DNA eine 2’-Desoxyribose, bei der die Hydroxylgruppe
an der 2’-Position durch ein Wasserstoffatom ersetzt ist. Die Verknüpfung mit der
Base findet an der 1-Position (N-1) der Pyrimidine und an der 9-Position (N-9) der
Purine statt (Abb. 1.2). Die Kennzahl der Atome im Ribosering wird mit 1’‑, 2’usw. bezeichnet, einfach nur um sie von den Atomen der Base zu unterscheiden.
Die Bindung zwischen den jeweiligen Basen und Zuckern ist eine glykosidische
oder Glykosidbindung. Handelt es sich bei dem Zucker um Ribose, dann heißen
die Nukleoside (technisch Ribonukleoside) Adenosin, Guanosin, Cytosin und
Uridin. Ist der Zucker aber Desoxyribose (wie in der DNA), dann sind die
Abb. 1.2 Nukleinsäurebasen.
Abb. 1.3 Nukleoside.
5
6
1 Informationsmakromoleküle
Nukleoside (2’-Desoxyribonukleoside) Desoxyadenosin, Desoxyguanosin usw. Die
Bezeichnungen „Thymidin“ und „Desoxythymidin“ können alternativ verwendet
werden.
1.2.3
Nukleotide
Ein Nukleotid ist ein Nukleosid mit einer oder mehreren Phosphatgruppen, die
kovalent an der 3’‑, 5’- oder (nur in manchen Ribonukleotiden) der 2’-Position
verknüpft sind. Ist der Zucker Desoxyribose, dann heißen die Verbindungen 2’Desoxyribonukleotide oder einfach Desoxyribonukleotide (Abb. 1.4). Chemisch
gesehen sind die Verbindungen Phosphatester. Im Falle der 5’-Position können
bis zu drei Phosphate verknüpft sein und bilden dann z. B. Adenosin-5’-triphosphat oder Desoxyguanosin-5’-triphosphat; die genannten Verbindungen werden
üblicherweise mit ATP bzw. dGTP abgekürzt. Auf die gleiche Weise erhalten wir
Desoxycytidintriphosphat (dCTP), Uridintriphosphat (UTP) und Desoxythymidintriphosphat (dTTP oder einfach TTP genannt). 5’-Mono- und -Diphosphate werden
beispielsweise als AMP bzw. dGDP abgekürzt. Nukleosid-5’-triphosphate (NTPs)
oder Desoxynukleosid-5’-triphosphate (dNTPs) sind die Bausteine der polymeren
Nukleinsäuren. Im Verlauf der DNA- oder RNA-Synthese werden zwei Phosphate
in Form von Pyrophosphat abgespalten und es verbleibt ein Phosphat pro Nukleotid, das in die Nukleinsäurekette eingebaut wird (Abschnitt 3.1 und 5.1). Damit ist
die sich wiederholende Einheit einer DNA- oder RNA-Kette ein Nukleotid.
1.2.4
Phosphodiesterbindungen
In einem DNA- oder RNA-Molekül sind die Desoxyribonukleotide bzw. die Ribonukleotide durch die kovalente Verknüpfung einer Phosphatgruppe mit der 5’Hydroxylgruppe einer Ribose und der 3’-Hydroxylgruppe der nächsten Ribose zu
einem Polymer verbunden (Abb. 1.5). Eine derartige Verknüpfung nennt man
Phosphodiesterbindung, da das Phosphat chemisch als ein Diester vorliegt. Damit
besitzt eine Nukleinsäure eine Richtung oder Polarität. Eine Nukleinsäurekette
egal welcher Länge (solange sie nicht ringförmig ist, Abschnitt 2.3) hat ein freies
5’-Ende – das mit einer Phosphatgruppe verknüpft sein kann oder auch nicht –
Abb. 1.4 Nukleotide.