DISSERTATION
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Quorum sensing Rezeptorprotein LuxP – gentechnisches Design von LuxP-Derivaten zur Anwendung in der Biosensorik DISSERTATION zur Erlangung des akademischen Grades Doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften der Technischen Universität Dresden von Dipl.-Biotechnol. Karolina Ihle geboren am 28. 12. 1980 in Danzig/Polen Eingereicht am 21. 10. 2010 Verteidigt am 20. 12. 2010 Gutachter: 1. Prof. Dr. rer. nat. habil. Gerhard Rödel 2. Prof. Dr. rer. nat. habil. Wolfgang Pompe Inhaltverzeichnis Inhaltsverzeichnis Abkürzungen .................................................................................... iii 1. Einleitung ................................................................................... 1 1.1. Quorum sensing – Kommunikation zwischen Bakterien ........................ 1 1.1.1. Intraspezies-Kommunikation bei Gram-negativen Bakterien .........................2 1.1.2. Intraspezies-Kommunikation bei Gram-positiven Bakterien...........................6 1.1.3. Parallele QS Wege in Vibrio harveyi .................................................................8 1.1.4. Interspezieskommunikation .............................................................................9 1.1.4.1. Autoinducer-2: universelles QS-Signalmolekül................................................. 10 1.1.4.2. AI-2 Rezeptorproteine ...................................................................................... 12 1.1.4.3. Regulation der AI-2 Gene in Escherichia coli .................................................... 14 1.2. Detektion von AI-2 .............................................................................. 15 1.2.1. Vibrio harveyi Bioassay ..................................................................................15 1.2.2. LuxP-FRET-basierter AI-2 Assay ......................................................................16 1.2.3. Rezeptor-basierter AI-2 Fluoreszenzsensor ...................................................16 1.2.4. Detektion von AI-2 mittels GC-MS .................................................................17 1.3. Biosensorik ......................................................................................... 17 1.4. Strategien der Gendeaktivierung in Escherichia coli ............................ 19 1.5. Zielsetzung.......................................................................................... 21 2. Material und Methoden............................................................ 22 2.1. Material .............................................................................................. 22 2.1.1. Geräte .............................................................................................................22 2.1.2. Chemikalien/Reagenzien ................................................................................23 2.1.3. Enzyme ...........................................................................................................23 2.1.4. Größenstandards ............................................................................................24 2.1.5. Primer .............................................................................................................25 2.1.5.1. Klonierungsprimer ............................................................................................ 25 2.1.5.2. Sequenzierungsprimer ...................................................................................... 29 ii Inhaltverzeichnis 2.1.5.3. Andere Primer ................................................................................................... 30 2.1.6. Antikörper ......................................................................................................31 2.1.6.1. Antikörper – primär .......................................................................................... 31 2.1.6.2. Antikörper – sekundär ...................................................................................... 31 2.1.7. Kultivierungsmedien ......................................................................................31 2.1.7.1. Kultivierung von Escherichia coli (E. coli) .......................................................... 31 2.1.7.2. Kultivierung von Vibrio fischeri (V. fischeri) ...................................................... 32 2.1.8. Stämme ..........................................................................................................33 2.1.9. Vektoren .........................................................................................................35 2.2. Methoden........................................................................................... 37 2.2.1. Kultivierung von Zellen ...................................................................................37 2.2.1.1. Kultivierung von E. coli ...................................................................................... 37 2.2.1.2. Kultivierung von V. fischeri ............................................................................... 37 2.2.2. Isolation von DNA ...........................................................................................37 2.2.2.1. Plasmid-Minipräparation aus E. coli mittels alkalischen Lyse (nach Birnboim und Doly (1979) [17], modifiziert) .................................................................... 37 2.2.2.2. Plasmid-Mini- und Midiprepäration unter Verwendung von Kitsystemen ...... 38 2.2.2.3. Isolation genomischer DNA aus E. coli und V. fischeri ...................................... 38 2.2.3. Aufreinigung von DNA ....................................................................................39 2.2.3.1. Aufreinigung von PCR-Produkten aus dem Restriktionsansatz ........................ 39 2.2.3.2. DNA-Extraktion aus den Agarosegelen ............................................................. 39 2.2.3.3. Ethanol – Fällung............................................................................................... 40 2.2.4. Bestimmung der DNA-Konzentration mittels UV-Absorptionspektrometrie 40 2.2.5. Amplifikation der DNA-Sequenzen unter Verwendung der PolymeraseKettenreaktion (PCR) ......................................................................................40 2.2.6. Overlap-extension PCR ...................................................................................41 2.2.7. DNA – Restriktionsverdau ..............................................................................43 2.2.8. DNA – Agarose – Gelelektrophorese .............................................................43 2.2.9. Ligation von DNA – Fragmenten ....................................................................44 2.2.10. DNA-Sequenzierung .......................................................................................44 2.2.11. Transformation von E. coli .............................................................................45 iii Inhaltverzeichnis 2.2.12. Gen-Knock-out in chromosomaler DNA von E. coli .......................................47 2.2.13. Southern Blot .................................................................................................47 2.2.14. Heterologe Expression der Proteine in E. coli ................................................50 2.2.15. Aufreinigung der His-getaggten Proteine unter nativen Bedingungen mittels Metallionenaffinitätchromatographie ...........................................................51 2.2.16. Präparation und Regenerierung der Ni2+-IDA-Sepharose-Säule ....................52 2.2.17. Aufreinigung der GST-getaggten Proteine .....................................................52 2.2.18. Präparation der Dialyseschläuche ..................................................................52 2.2.19. Konzentrationsbestimmung von Proteinen ...................................................53 2.2.20. Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelekrophorese nach Laemmli (1970) [85] ......................................................................................................53 2.2.21. Färbung der Proteine im Polyacrylamidgel ....................................................54 2.2.22. Western Blot ..................................................................................................54 2.2.23. In-vitro Synthese des AI-2 ..............................................................................56 2.2.24. Bestimmung der AI-2 Konzentration .............................................................56 2.2.25. Fluoreszenzmessung der Bioassaykonstrukte ...............................................57 2.2.26. Bestimmung der AI-2 Bindeaktivität der LuxP-Derivate ................................57 3. Ergebnisse ................................................................................ 59 3.1. Herstellung der Escherichia coli luxS – Deletionsstämme .................... 59 3.1.1. Herstellung der Gen-Knock-out-Kassette ......................................................59 3.1.1.1. Herstellung eines neues Helfer-Plasmids mit Zeocin-Resistenz ....................... 59 3.1.1.2. Amplifizierung der Gen-KO-Kassette ................................................................ 60 3.1.1.3. Transformation mit der Gen-KO-Kassette und Analyse positiver Klone .......... 60 3.1.1. Eliminierung der Bleomycin-Resistenz ...........................................................62 3.2. Klonierung, heterologe Expression und Aufreinigung der LuxPRezeptorproteine .......................................................................................... 65 3.2.1. Vibrio harveyi LuxP - Fusionsproteine ............................................................65 3.2.1.1. V. harveyi LuxP mit Signalsequenz (VhLuxP) .................................................... 66 3.2.1.2. V. harveyi LuxP ohne Sinalsequenz ................................................................... 70 3.2.1.3. Grün fluoreszierende V. harveyi LuxP Proteine ................................................ 75 3.2.1.4. V. harveyi LuxP-Proteine mit starker Ladung ................................................... 83 iv Inhaltverzeichnis 3.2.1.5. GST- V. harveyi LuxP (GST-VhLuxP) ................................................................... 85 3.2.2. Vibrio harveyi LuxP-Derivate mit veränderter Affinität zur AI-2 ...................88 3.2.3. Vibrio fischeri LuxP – Fusionsproteine ...........................................................95 3.2.3.1. V. fischeri LuxP mit Signalsequenz (VfLuxP)...................................................... 95 3.2.3.2. V. fischeri LuxP ohne Signalsequenz (VfLuxP 27)............................................. 97 3.2.3.3. Grün fluoreszierende V. fischeri LuxP Proteine ................................................ 99 3.2.3.3.1. V. fischeri LuxP(aa 28-372) -EGFP (VfLuxP-EGFP) .............................................. 99 3.2.3.3.2. EGFP - V. fischeri LuxP(aa 28-372) (EGFP-VfLuxP) .............................................. 99 3.2.4. 3.3. Escherichia coli LsrB – Fusionsprotein ........................................................ 102 Etablierung des AI-2-Bioassays ......................................................... 105 3.3.1. In-vitro Synthese von AI-2 ........................................................................... 105 3.3.2. Konstruktion der Bioassay-Reporter-Plasmide ........................................... 106 3.3.3. Etablierung der Bioassay – Bedingungen .................................................... 108 3.4. Untersuchung der AI-2 Bindeaktivität der VhLuxP-Derivate .............. 113 4. Diskussion .............................................................................. 116 5. Zusammenfassung .................................................................. 129 6. Literatur ................................................................................. 131 Anhang ........................................................................................... A1 v Abkürzungsverzeichnis Abkürzungen aa Aminosäure (amino acid) AHL Acyl-Homoserinlakton Amp Ampicillin APS Ammoniumperoxodisulfat bla ß-Lactamase-Gen ble Bleomycin-Resistenzgen bp Basenpaare (base pairs) BSA Rinder-Serumalbumin (bovine-serum albumin) cat Chloramphenicol-Acethyltransferase-Gen C-terminus Carboxylterminus ddH2O bidestiliertes Wasser dH2O einfach destiliertes Wasser DIG Digoxigenin DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxynukleosidtriphosphat DsRed rot fluoreszierendes Protein (Discosoma sp. red fluorescent protein) DTT Dithiothreitol EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EGFP verstärkt grün fluoreszierendes Protein (enhanced green fluorescent protein) EtOH Ethanol GFP grün fluoreszierendes Protein (green fluorescent protein) Glc Glukose Gua-HCl Guanidin-Hydrochlorid HRP Meerrettich-Peroxidase (horseradish-peroxidase) HSL Homoserinlakton IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid iii Abkürzungsverzeichnis kbp Kilobasenpaare kDa Kilodalton KO Knock-out LB Luria Bertani MCS multiple Klonierungsstelle (multiple cloning site) min Minute(n) Mut. Mutante MW Molekulargewicht (molecular weight) nt Nukleotide N-Terminus Aminoterminus OD optische Dichte ORF offener Leserahmen (open reading frame) PAA Polyacrylamid PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PCR Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction) PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid PVDF Polyvinyliden-difluorid Ref. Referenz/Referenzen Rif Rifampicin RNA Ribnonukleinsäure RNAse Ribonuklease rpm Umdrehungen pro Minute (rounds per minute) RT Raumtemperatur s Sekunde(n) SDS Natriumdodecylsulfat TBS Tris-gepufferte Salzlösung (Tris-buffered saline) TBS/T Tris-gepufferte Salzlösung mit Tween 20 TEMED N,N,N´,N´-Tetramethylendiamin Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan U Einheit (unit) ü. N. über Nacht iv Abkürzungsverzeichnis v/v Volumenanteil/Volumenanteil w/v Gewichtsanteil/Volumenanteil Zeo Zeocin Buchstabencode der Aminosäuren: Aminosäure Ein- Drei- Buchstaben- Aminosäure Ein- Drei- Buchstaben- Buchstaben- Buchstaben- Code Code Code Code Alanin A Ala Leucin L Leu Arginin R Arg Lysin K Lys Asparagin N Asn Methionin M Met Aspartat D Asp Phenylalanin F Phe Cystein C Cys Prolin P Pro Glutamat E Glu Serin S Ser Glutamin Q Gln Threonin T Thr Glycin G Gly Tryptophan W Trp Histidin H His Tyrosin Y Tyr Isoleucin I Ile Valin V Val v Anmerkungen Anmerkungen: Geschützte Warennamen (Markenzeichen) wurden nicht immer besonders kenntlich gemacht. Aus dem Fehlen eines solchen Hinweises kann also nicht geschlossen werden, dass es sich um einen freien Warennamen handelt. Aus dem englischen Sprachgebrauch stammende Fachbegriffe, deren Übersetzung entweder keinen Sinn ergeben würde oder zu einem falschen Verständnis geführt hätte, wurden im Text kursiv dargestellt. Bei Prozentangaben im Bezug auf Konzentration, wenn nicht anders vermerkt, handelt es sich um Angaben in Gewichtsanteil auf Volumenanteil (w/v). vi Einleitung 1. Einleitung 1.1. Quorum sensing – Kommunikation zwischen Bakterien Bakterien haben die Fähigkeit, miteinander zu kommunizieren und somit ihr Verhalten zu regulieren und Funktionen zu übernehmen, die einem mehrzelligen Organismus entsprechen würden. Dieses Phänomen der Kommunikation der Mikroorganismen wird als Quorum Sensing (QS) bezeichnet [153]. Die „Sprache“ der Bakterien basiert auf kleinen Signalmolekülen. Diese Moleküle, bezeichnet als Autoinducer (AI), werden von den Bakterien produziert und sekretiert, im Medium akkumuliert und anschließend detektiert. Mithilfe von AI können Mikroorganismen zwischen niedriger und hoher Zelldichte unterscheiden und entsprechend die Expression der Gene regulieren. Die einzelnen Bakterien einer Population koordinieren auf dieser Basis ihr Verhalten und agieren somit wie ein mehrzelliger Organismus mit Fähigkeiten, die kein einzelnes Bakterium aufbringen könnte. Durch QS werden viele Verhaltensweisen der Bakterien reguliert. Dazu gehören unter anderem Symbiose, Virulenz, Produktion von Antibiotika und das Bilden von Biofilmen. In zahlreichen Studien wurde nachgewiesen, dass es sowohl hoch spezifische als auch universelle „Bakteriensprachen“ gibt. Die Interaktionen von Prokaryonten und Eukaryonten werden ebenfalls zum Teil durch QS reguliert. Die interzelluläre Kommunikation wurde zuerst für das marine Bakterium Vibrio fischeri beschrieben [67, 116]. V. fischeri lebt in Symbiose mit dem Tintenfisch Euprymna scolopes. In diesem Zusammenleben benutzt der Wirt das von V. fischeri produzierte Licht unter anderem bei der Beschaffung von Beute, als Schutz oder auch bei der Partnersuche. Als Gegenleistung bekommen die Bakterien eine nahrungsreiche Umgebung [150, 182]. Für die Biolumineszenz, für die in V. fischeri der Luciferase-Komplex verantwortlich ist, ist eine hohe Zelldichte notwendig. Dementsprechend wird die Biolumineszenz durch QS reguliert. Die Bakterien produzieren acetylierte Homoserinlaktone (AHL), diese akkumulieren im Medium. Wenn ein Konzentrationsschwellenwert an AHL erreicht wurde, werden die für die Lumineszenz verantwortlichen Gene aktiviert, und die Bakterien emittieren Licht. Dieser Prozess kann nur in dem Licht-Organ des Tintenfisches stattfinden. Bei frei lebenden Bakterien kann die notwendige Zelldichte nicht erreicht werden, außerdem verhindert die Diffusion der produzierten Autoinducer, dass der Schwellenwert erreicht werden kann. 1 Einleitung Die Regulierung des QS in V. fischeri wurde zuerst von der Forschungsgruppe um Engebrecht und Silvermann untersucht [45, 46, 47]. Es wurde gezeigt, dass es in diesem Prozess zwei regulatorische Komponenten gibt, LuxI und LuxR. Das LuxI - Protein ist für die Synthese der AHL-Autoinducer verantwortlich. Bei einer hohen Zelldichte bindet das LuxR-Protein die AHL und aktiviert die Transkription der Gene des Luciferase-Operons (luxICDABE). Engebrecht und Silvermann konnten nachweisen, dass der Anstieg der Konzentration der Autoinducer mit dem Anstieg der Zelldichte korreliert [47]. Das V. fischeri LuxI /LuxR System der Bakterienkommunikation zwecks Symbiose mit dem Tintenfisch galt für mehr als 10 Jahre als einzigartig. Heutzutage ist aber bekannt, dass die meisten Bakterien mithilfe kleiner Signalmoleküle miteinander kommunizieren und so das Gruppenverhalten beeinflussen zu können. Die Kommunikation findet nicht nur zwischen Bakterien einer Spezies statt, sondern kann auch zwischen verschiedenen Spezies stattfinden 1.1.1. Intraspezies-Kommunikation bei Gram-negativen Bakterien Gram-negative Bakterien, wie V. fischeri, kommunizieren über AHL-Autoinducer mithilfe der LuxI-Homologen als Autoinducer-Synthetasen und LuxR-Homologen als AutoinducerRezeptoren. Dieses Kommunikationssystem konnte bei über 20 verschiedenen Bakterienspezies gefunden werden. Eine Übersicht über diese Spezies sowie die dazugehörigen LuxI/LuxR Homologe und AHL-Autoinducer ist in der Tabelle 1-1 dargestellt. Ein allgemeines Schema des LuxI/LuxR Systems zeigt die Abbildung 1-1. Die Acyl-HSL Moleküle werden von dem LuxIHomologen synthetisiert. Das LuxR-Homolog wiederum erkennt diese Autoinducer und aktiviert die QS-regulierten Gene. Der Mechanismus der Zusammenarbeit von LuxI/LuxR ist streng konserviert. Das LuxIHomolog ist verantwortlich für die Synthese von acetylierten HSL. Die Acyl-Kette wird von dem spezifischen Acyl-Acyl-Transportprotein (Acyl-ACP, acyl-acyl carrier protein) aus der FettsäurenBiosynthese auf den Homocysteinrest des S-Adenosylmethionin (SAM) übertragen. Es folgt eine Laktonbildung zur Acyl-HSL und Methylthioadenosin, das freigesetzt wird [64, 128, 110, 179], Abbildung 1-2. Eine Auswahl an AHL-Autoinducer ist in Abbildung 1-3 dargestellt. 2 Einleitung Organismus Autoinducer LuxI/LuxR Homologe QS-regulierte Eigenschaften Referenzen Vibrio fischeri 3-Oxo-C6-HSL LuxI/LuxR Biolumineszenz [40, 46] Aeromonas hydrophila C4-HSL AhyI/AhyR Produktion von Serinprotease und Metalloprotease [171] Aeromonas salmonicida C4-HSL AsaI/AsaR Extrazelluläre Protease [171] Agrobacterium tumefaciens 3-Oxo-C8-HSL TraI/TraR Konjugation des Ti-Plasmids [70, 192] Burkholderia cepacia C8-HSL CepI/CepR Produktion Siderophors Chromobacterium violaceum C6-HSL CviI/CviR Produktion von Violacein, Exoprotease, Antibiotika, Zyanids sowie chitinolitischer Enzyme [23, 101] Enterobacter agglomerans 3-Oxo-C6-HSL EagI/EagR Unbekannt [172] Erwinia carotovora subsp. carotorova 3-Oxo-C6-HSL ExpI/ExpR Exoenzyme [8, 75, 138] CarI/CarR Synthese von Carbapenem -Antibiotika [8, 9, 102] Erwinia chrysanthemi 3-Oxo-C6-HSL ExpI/ExpR Regulierung der Pektinase (pecS) von [115, 145] Erwinia stewartii 3-Oxo-C6-HSL EsaI/EsaR Virulenz, Synthese Exopolisacchriden von [15] Escherichia coli Keine eigene -/SdiA Zellteilung, Chromosom - Replikation [56, 89, 92, 157, 188] Pseudomonas aeruginosa 3-Oxo-C12-HSL LasI/LasR Mehrere extrazelluläre Enzyme, RhlR, Xcp, Bildung von Biofilmen C4-HSL RhlI/RhlR Mehrere extrazelluläre Enzyme, Rhamnolipid, RpoS, sekundäre Metabolite [21, 32, 54, 55, 129, 131, 177] [19, 87, 123, 124, 132, 187] Pseudomonas aureofaciens C6-HSL PhzI/PhzR Synthese des Antibiotikums Phenazyne (phz) [136, 189] Ralstonia solanacearum C6-HSL, C8-HSL SolI/SolR Unbekannt [49] Rhizobium etli Multiple RaiI/RaiR Beschränkung der Zahl der Knöllchen [149] CinI/CinR Symbiotische Stickstoff-Bindung [30] C6-HSL, RhiI/RhiR RhiABC – Gene der Rhizosphere – Expression, Knöllchenbildung [28, 58, 146] C8-HSL, 3-Hydroxy-7-cisC14-HSL CinI/CinR Regulierung der QS Gene [94] Rhodobacter sphaeroides 7-cis-C14-HSL CerI/CerR Schutz von Aggregation der Bakterien [143] Salmonella enterica Serovar Typhimurium Keine eigene -/SdiA Regulierung der rck (resistance to competence killing) – Gene, ORF auf dem Virulenz-Plasmid [1] Rhizobium leguminosarum von Protease Synthese und 137, [91] 3 Einleitung Serratia liquefaciens C4-HSL SwrI/SwrR Differenzierung der Zellen Schwarmbildung, Exoprotease bei [41, 42, 57] Vibrio anguillarum 3-Oxo-C10-HSL VanI/VanR unbekannt [106] Vibrio harveyi 3-Hydroxy-C4HSL LuxM*/LuxN** Biolumineszenz [12, 20, 99, 166] Yersinia enterolitica C6-HSL, 3-Oxo-C6-HSL YenI/YenR unbekannt [176] Yersinia pseudotuberculosis 3-Oxo-C6-HSL YpsI/YpsR [7] C8-HSL YtbI/YtbR Regulierung der Bakterienaggregation sowie Zellmotilität Tabelle 1-1: Quorum sensing bei Gram-negativen Bakterien: Autoinducer, LuxI/LuxR Homologe und resultierende Eigenschaften im Überblick [zusammengestellt nach 37, 53, 104]. *LuxM hat keine Homologie mit dem LuxI Proteinen, katalysiert aber eine identische biochemische Reaktion **LuxN ist eine Sensor-Kinase, ähnlich wie im QS Mechanismus der Gram-positiven Bakterien Abbildung 1-1: LuxI/LuxR Quorum Sensing-System bei Gram-negativen Bakterien [153]. Bei den meisten Gram-negativen Bakterien gibt es zwei regulatorische Proteine. LuxI katalysiert die Synthese von spezifischen AHL-Autoinducer (grüne Fünfecke). Die Autoinducer diffundieren frei in das Zellmedium, deren Konzentration nimmt mit steigender optischer Dichte zu. Wenn eine Schwellenkonzentration an AHL erreicht wird, bindet dieses an das Rezeptorprotein LuxR. Der LuxR-Autoinducer Komplex aktiviert die entsprechenden Zielgene. Acyl-Homoserinlaktone können frei über die Zellmembran in das umliegende Medium diffundieren. Dort nimmt die AHL Konzentration mit steigender Zellzahl zu [136]. Die AHLAutoinducer werden entsprechend von einem LuxR-Homolog gebunden. An der Bindung von AHL ist der N-terminale Teil des Rezeptors beteiligt. Der C-terminale Teil des Proteins bindet an die DNA an der Promotorstelle und reguliert die Expression der entsprechenden Zielgene. Dieser Mechanismus ist bei allen LuxR-Homologen ähnlich [24, 139, 158, 163, 164, 165]. 4 Einleitung Abbildung 1-2: LuxI-gesteuerte Biosynthese von AHL-Autoinducer [138]. Als Substrate in dieser Reaktion dienen S-Adenosylhomocystein (SAM) und das Acyl-ACP. LuxI katalysiert die Bildung der Amidbindung zwischen SAM und Acyl-ACP (1). Es folgt eine Laktonbildung (2) und die Freisetzung von Methylthioadenosin. Es entsteht AHL-Autoinducer (3). AHL in der Abbildung entspricht dem 3-Oxo-C8-HSL, der von dem TraI-Protein von A. tumefaciens produziert wird. Abbildung 1-3: AHL-Autoinducer von verschiedenen Gram-negativen Bakterien [153]. Das LuxI/LuxR Signal-System weist eine sehr hohe Spezifität auf [59], obwohl zwischen den LuxR-Proteinen und auch den AHL-Molekülen von verschiedenen Bakterien eine sehr große Ähnlichkeit besteht. Diese Spezifität basiert auf der hohen Selektivität, mit der AHL-Moleküle an den LuxR-Rezeptor binden. Die Bindung des LuxI-Homologes an den bestimmten Acyl-ACP ist ebenfalls sehr spezifisch, so dass nur ein Autoinducer produziert wird. Bei den Bakterienspezies, die mehrere AHL-Autoinducer produzieren, findet man auch mehrere LuxI/LuxR-Paare. Bei dem opportunistischen Humanpathogen Pseudomonas aeruginosa gibt es zwei solche Paare (LasI/LasR, RhlI/RhlR), die hierarchisch geordnet sind und verschiedene Funktionen kontrollieren [19, 37, 127, 129]. Die Produktion von Signalmolekülen wird vom LasI/LasR System induziert, nach dem Erreichen einer bestimmten optischen Dichte wird die Transkription der Virulenzgene aktiviert [32, 75, 129]. Parallel dazu wird von LasI/LasR 5 Einleitung die Expression der rhlI/rhlR Gene induziert [123]. Durch RhlI/RhlR werden weitere spezifische Gene aktiviert [19, 66, 86, 127, 130, 135, 186]. Die Regulierung des RhlI/RhlR Systems durch LasI/LasR gewährleistet, dass die Aktivierung der Gene in einer korrekten Abfolge stattfindet. In der hierarchischen Abfolge des P. aeruginosa QS-Systems ist ein weiterer Regulator - ChinolonSignal (PQS – Pseudomonas quinolone signal) - beteiligt. PQS agiert als weiterer Link zwischen den beiden Proteinpaaren [134]. Darüber hinaus wurde in P. aeruginosa ein weiteres LuxRHomolog (QscR) gefunden, das jedoch keine eigene Autoinducer-Synthetase besitzt. Die Funktion von QscR besteht in der Regulierung der Synthese der Autoinducer durch LasI [25]. Derart komplexe Kontrolle verschiedener QS-Systeme garantiert eine optimale zeitliche Steuerung der Transkription der Zielgene in P. aeruginosa. 1.1.2. Intraspezies-Kommunikation bei Gram-positiven Bakterien Gram-positive Bakterien regulieren ebenfalls mehrere Funktionen in Abhängigkeit von der Zelldichte [10, 61, 82, 88]. Der Mechanismus der Kommunikation bei Gram-positiven unterscheidet sich jedoch entscheidend von dem der Gram-negativen Bakterien. Als Signalmoleküle werden keine HSL, sondern modifizierte Oligopeptide benutzt. Diese entstehen aus einem Präkursorprotein, das entsprechend prozessiert und modifiziert wurde. Die Oligopeptid-Autoinducer werden, anders als AHL-Autoinducer, aktiv in das umliegende Medium sezerniert. Für diesen Prozess verantwortlich ist der ATP-Binding-Cassette (ABC) – Transporter [82]. Die Konzentration des QS-Signalmoleküls steigt mit wachsender optischer Dichte an. Nachdem eine Schwellenkonzentration von Autoinducern erreicht ist, werden diese durch ein Zwei-Komponenten-Signal-Transduktion-System detektiert. Der Autoinducer wird zuerst durch eine Sensor-Kinase erkannt, es folgt eine Reihe an Phosphorylierungen, die mit der Phosphorylierung der zweiten Komponente, des Antwort-Regulationsproteins, endet. Durch die Phosphorylierung des Antwort-Regulationsproteins wird dieses aktiviert und bindet an die DNA und aktiviert die QS-regulierten Gene. Eine schematische Darstellung der an QS in Grampositiven Bakterien beteiligten Komponenten zeigt die Abbildung 1-4. Das QS System in dem pathogenen Bakterium Staphylococcus aureus ist einer der am besten erforschten QS Systeme in Gram-positiven Bakterien und reguliert die verantwortlichen agr Virulenzgene. Die Oligopeptid-Autoinducer werden in S. aureus aus einem 46 aa umfassenden Präkursorprotein durch Verdau und Einführung einer Thiolaktongruppe 6 Einleitung synthetisiert und ins umliegende Medium sezerniert [73, 74]. Nachdem eine Schwellenkonzentration von Autoinducer erreicht wurde, wird dieser von dem SensorKinase/Antwort-Regulator Proteinpaar AgrC/AgrA erkannt [112, 121, 133]. Phosphoryliertes AgrA stimuliert die Synthese eines mRNA-Effektormoleküls RNAIII. RNAIII hat einen positiven Einfluss auf die Produktion der Virulenzfaktoren [111]. Desweiteren aktiviert das Phospho-AgrA die Expression des agrBCDA Operons und induziert somit die Synthese von weiteren PeptidAutoinducern, was für eine S. aureus Population einen Wechsel zwischen dem niedrigeZelldichte Status zu dem hohe-Zelldichte Status bedeutet. Aufgrund der spezifischen Autoinducer kann man die S. aureus Stämme in vier verschiedene Gruppen einteilen (Abbildung 1-5). Jede der Autoinducer-Gruppen aktiviert für sich spezifische arg Gene und blockiert gleichzeitig die spezifischen arg Gene der anderen Gruppe [74, 100, 126]. Somit kann gewährleistet werden, dass während einer Invasion sich jener S. aureus Stamm durchsetzt, der zuerst die QS – Kaskade aktivieren kann. Abbildung 1-4: Quorum sensing in Gram-positiven Bakterien via Oligopeptid-Autoinducer [153]. Die Autoinducer-Synthese beginnt in Gram-positiven Bakterien mit der Translation eines Präkursor-Proteins (langes blaues Rechteck). Dieses wird prozessiert, modifiziert (kleine blaue Rechtecke) und anschließend von dem ABC-Transporter sezerniert. Die Autoinducer akkumulieren im Zellmedium. Wenn ein Konzentrationsschwellenwert erreicht wird, werden die Autoinducer durch ein Zwei-Komponenten-Signal-Transduktion-System detektiert. Die Sensor-Kinase erkennt das Signal und autophosphoryliert den konservierten Histidin-Rest (H). Anschließend wird die Phosphor-Gruppe auf den konservierten Aspartat-Rest (D) des Antwort-Regulationsproteins übertragen. Das phosphorylierte Antwort-Regulationsprotein aktiviert die Transkription der Zielgene. Mit P wurde die Phosphorylierungskaskade markiert. Abbildung 1-5: Vier Gruppen von Oligopeptid-Autoinducer bei Staphylococcus aureus [153]. 7 Einleitung 1.1.3. Parallele QS Wege in Vibrio harveyi Das marine Bakterium Vibrio harveyi war der erste Mikroorganismus, bei dem mehrere Arten von QS Signalmolekülen entdeckt wurden. Das QS System in V. harveyi besteht aus drei Autoinducermolekülen mit den entsprechenden Rezeptorproteinen. Diese bilden drei parallele Kanäle der Signalleitung an das gemeinsame Antwort-Regulations-System (Abbildung 1-6). V. harveyi produziert, wie auch andere Gram-negative Bakterien, AHL Autoinducer (HAI-1, 3-Hydroxy-C4-HSL) [20]. Die Autoinducer-Synthetase besitzt jedoch keine Homologie zu den LuxI-Synthetasen, katalysiert aber eine identische biochemische Reaktion, die zur Synthese von spezifischen AHL führt [12]. HAI-1 bindet an die Membran-gebundene Sensor-Kinase LuxN, die den bei der Signalübertragung bei Gram-positiven Bakterien beteiligten Sensor-Kinasen ähnelt [12, 52]. Der zweite von V. harveyi produzierte Autoinducer (CAI-1) wurde bis jetzt nicht genau identifiziert. CAI-1 wird von dem Enzym CqsA synthetisiert und interagiert mit der Membrangebundener Sensor-Kinase CsqS [69]. Der dritte Autoinducer von V. harveyi, ein Furanosyl-Borat-Diester ist unter der Bezeichnung AI-2 bekannt [13, 22] und wird von dem Enzym LuxS produziert [167, 190]. AI-2 wird von dem periplasmatischen Rezeptor LuxP gebunden und interagiert durch Konformationsänderung mit der Membran-gebundener Sensor-Kinase LuxQ [13, 117, 118]. Bei einer niedrigen Zelldichte und somit einer nicht nennenswerten Konzentration an Autoinducer agieren die drei Sensorproteine LuxN, CqsA und LuxQ als Kinasen, autophosphorylieren und übertragen anschließend die Phosphatgruppe auf das cytoplasmatische Protein LuxU. Von LuxU wird das Phosphat an das DNA-bindende AntwortRegulator-Protein LuxO [14, 50, 51, 52] transferiert. Das Phospho-LuxO aktiviert in Verbindung mit dem Transkriptionsfaktor 54 die Transkription der Qrr (Quorum Regulatory RNA) Gene, die fünf regulatorische sRNAs (small RNAs), Qrr1-5, kodieren. Die Qrr sRNAs binden in Zusammenarbeit mit dem RNA-Chaperon Hfq an die mRNA des Transkriptionsaktivators LuxR (keine Ähnlichkeit mit dem LuxR von V. fischeri) und destabilisieren diese [90]. Die Degradierung der LuxR-kodierenden mRNA verhindert die Expression der Gene des LuciferaseOperons luxCDABE, da für diese eine Aktivierung durch das LuxR-Protein notwendig ist [170]. Bei einer niedrigen Zelldichte wird dementsprechend keine Biolumineszenz erzeugt, da die mRNA des Aktivators LuxR degradiert wird. 8 Einleitung Bei einer hohen Zelldichte ist auch die Konzentration der Autoinducer hoch, so dass die Signalmoleküle an die Sensor-Kinasen binden. Daraufhin wechseln die Sensor-Kinasen ihre Aktivität in Phosphatasen und übernehmen die Phosphatgruppen von LuxO über LuxU. Das nicht phosphorylierte LuxO Protein kann die Expression der Qrr sRNAs nicht induzieren. Somit wird die mRNA des Transkriptionsaktivators LuxR nicht degradiert, die Expression des Luciferase-Operons luxCDABE findet statt und die Bakterien emittieren Licht. Neben dem Luciferase-Operon werden noch weitere Gene aktiviert [68, 109]. Abbildung 1-6: QS Wege in Vibrio harveyi [185]. V. harveyi produziert und antwortet auf drei verschiedene Autoinducer: CAI-1 (grüne Kreise), HAI-1 (rote Dreiecke) und AI-2 (blaue doppelte Fünfecke). Die sensorische Information wird von den entsprechenden Sensorkinasen (CqsS, LuxN, LuxQ) auf den gemeinsamen zwei-Komponenten-Antwort-Regulationssystem (LuxU/LuxO) weitergeleitet. Die halbrunden Pfeile zeigen die Übertragung der Phosphatgruppe bei einer niedrigen Zelldichte. OM – Äußere Membran; IM – Innere Membran. 1.1.4. Interspezieskommunikation Im Jahr 1979 berichteten Greenberg et al. [60] zum ersten Mal über die Induktion der Lumineszenz bei V. harveyi durch zellfreie Kulturüberstände der nichtlumineszierenden Bakterien diverser Spezies. Bis zu diesem Zeitpunkt wurde angenommen, dass die Lumineszenz nur durch Autoinduktion ausgelöst werden kann und die Induktoren, genannt Autoinducer, nur Spezifität für eine Spezies aufweisen [39]. Somit war es die erste Beobachtung einer Interspezieskommunikation. 9 Einleitung Mit dem neuen Wissen, dass V. harveyi mehrere Autoinducer produziert, wurde die Studie von Greenberg et al. [60] 1997 von Bassler et al. [11] wiederholt. Neben dem von Greenberg et al. verwendeten V. harveyi Reporterstamm wurden zwei weitere V. harveyi Deletionsstämme als Reporter benutzt, bei denen die Lumineszenz nur durch einen Typ Autoinducer (Autoinducer-1 (HAI-1) oder Autoinducer-2 (AI-2)) induziert werden kann. In der neuen Studie konnte bewiesen werden, dass die Interspezieskommunikation nur auf dem Weg des AI-2 möglich ist. Die Theorie der Universalität der AI-2 verstärkte sich, nachdem die Gene der AI-2 Synthetase LuxS in V. fischeri, E. coli sowie Salmonella enterica Serovar Typhimurium identifiziert und kloniert werden konnten [167]. Desweiteren konnten auf dem Weg der Datenbankanalyse bakterieller Genome LuxS-Homologe in mehr als 50 weiteren Spezies identifiziert werden. Zu diesen Spezies gehören unter anderen Salmonella typhi, Salmonella parathypi, Shigella flexneri, Haemiphilus influenzae, Helicobacter pylori, Bacillus subtilis, Borrelia burgdorferi, Camphylobacter Neisseria jejuni, Vibrio meningitidis, cholerae, Neisseria Vibrio gonorrhoeae, vulnificus, Yersinia Deinococcus pestis, radiodurans, Mycobacterium tuberculosis, Enterococcus faecalis, S. aureus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyrogenes, Clostridium perfringenes, Clostridium difficile und Klebsiella pneumoniae [10, 167, 190]. Bei den meisten der aufgelisteten Spezies konnte auch die Produktion von AI-2 festgestellt werden. Es wurden luxS Deletionsmutanten von E. coli, S. enterica Serovar Typhimurium, H. pylori, S. flexneri, V. vulnificus sowie S. aureus hergestellt, bei denen die AI-2-Synthese nicht mehr nachgewiesen werden konnte [34, 76, 80, 97, 161]. Unter den AI-2-produzierenden Bakterien sind sowohl Gram-negative als auch Grampositive Bakterien, was die große Verbreitung der Interspezieskommunikation beweist. Ähnlich dem V. harveyi besitzen interessanterweise auch andere Bakterien wie z.B. B. subtilis oder S. aureus mehrere QS-Wege, von denen meistens eine für die Intraspezies-, die andere für Interspezieskommunikation verwendet werden kann. Somit können die Bakterien Informationen über die eigene Spezies und gleichzeitig auch über andere Spezies gewinnen. 1.1.4.1. Autoinducer-2: universelles QS-Signalmolekül Die Verbreitung von AI-2 als Signalmolekül bei diversen Bakterienspezies sowie die Identifizierung AI-2-regulierten Gene in diesen waren die Indikatoren für die Annahme, dass AI2 ein „universelles“ QS-Signal sei [154]. Um die Universalität des AI-2 als Signalmoleküles zu 10 Einleitung verstehen, muss man sich mit dessen chemischer Struktur auseinandersetzen. AI-2 ist ein Furanon, das auf dem Weg einer spontaner Zyklisierung von 4,5-Dihydroxy-2,3-Pentadion (DPD), dem Produkt LuxS-katalysierten Spaltung von S-Ribosyl-Homocystein, entsteht. Die Synthese von DPD verläuft bei allen Bakterienspezies sehr ähnlich [167, 190], Abbildung 1-7 (A). Als Ausgangsmetabolit dient das S-Adenosyl-Methionin (SAM), das als Donor der Methylgruppe für die Methyltransferasen agiert und auf diesem Weg in S-Adenosyl-Homocystein (SAH) umgewandelt wird. Im weiteren Schritt wird das SAH von dem Enzym Pfs zur S-RibosylHomocystein (SRH) und Adenin zerlegt. SRH dient letztendlich dem Enzym LuxS als Substrat für die Synthese von DPD sowie des Nebenprodukts Homocystein. Abbildung 1-7: Chemie der AI-2 Signalmoleküle [105]. A - Metabolischer Weg der Synthese von DPD, wobei DPD im letzten Schritt von dem Enzym LuxS produziert wird. B - Spontane Konformationsänderungen von DPD, die zu Entstehung von zwei biologisch-aktiven Formen von AI-2 führen. STHMF-Borat wird erkannt von V. fischeri, R-THMF dagegen von S. enterica Serovar Typhimurium. Die spontane Zyklisierung führt zur Entstehung von zwei epimerischen Furanonen: (2S,4S)2,4-Dihydroxy-2-Methyl-Dihydrofuran-3-on (S-DHMF) und (2R,4S)-2,4-Dihydroxy-2-MethylDihydrofuran-3-on (R-DHMF) (Abbildung 1-7 (B)). Die Hydratation von S- und R-DHMF ergibt entsprechend (2S,4S)- und (2R,4S)-2-Methyl-2,3,3,4-Tetrahydroxy-Tetrahydrofuran (S- und RTHMF). Bei Zusatz von Bor (B(OH)4-), das für eine marine Lebensumwelt sehr charakteristisch ist, entsteht spontan S-THMF-Borat [105]. Alle Konformationsänderungen des DPDs sind interkonvertibel und befinden sich in einem Gleichgewicht, was die Ursache für die 11 Einleitung Universalität des AI-2 ist. Als biologisch-aktive Formen der AI-2 gelten R-THMF (unter anderen bei Enterobakterien wie E. coli oder S. enterica Serovar Typhimurium) sowie S-THMF-Borat (bei marinen Bakterien wie V. harveyi). 1.1.4.2. AI-2 Rezeptorproteine Die für die Interspezieskommunikation verwendeten AI-2 Moleküle werden bei allen Bakterien von einem Konformationsänderung periplasmatischen resultiert [105, Rezeptor 118]. Es gebunden, gibt zwei was Gruppen in von einer AI-2 Rezeptorproteinen, LuxP und LsrB, die entsprechend entweder S-THMF-Borat oder R-THMF binden. Beide Rezeptoren gehören zu der Familie der bakteriellen periplasmatischen Bindeproteine, bPBPs (bacterial periplasmic binding proteins) [36]. Das Reporterprotein LuxP aus V. harveyi war das erste, dessen Kristallstruktur ermittelt wurde [22, 118].Nachdem auch die Struktur von S. enterica Serovar Typhimurium LsrB untersucht wurde, konnte bewiesen werden, dass die zwei Rezeptoren nur die für eigene Spezies charakteristische Form von AI-2 binden können [105]. Durch die Anbindung von AI-2 verändert sich die Konformation des Proteins. Das ApoLuxP und ApoLsrB haben eine „offene Form“, HoloLuxP und HoloLsrB dagegen eine „geschlossene Form“ (Abbildung 1-8 und Abbildung 1-9). In V. harveyi LuxP sind neun Aminosäuren an der Bindung von AI-2 beteiligt, in S. enterica Serovar Typhimurium sind es sechs Aminosäuren. Die Bindestellen von AI-2 in beiden Rezeptorproteinen sind in der Abbildung 1-10 dargestellt. Die Bindung von jeweiligen Autoinducer ist sehr spezifisch. In vivo Bindestudien haben erwiesen, dass S-THMF-Borat nicht an den Rezeptor LsrB binden kann [105]. Eine in vitro Studie belegte, dass nur S-THMF-Borat, nicht aber R-THMF an LuxP binden kann [144]. 12 Einleitung HoloLuxP ApoLuxP Abbildung 1-8: Vergleich der Kristallstruktur von Apo- und HoloLuxP von V. harveyi [118]. ApoLsrB Abbildung 1-9: A Abbildung 1-10: HoloLsrB Vergleich der Kristallstruktur von Apo- und HoloLsrB von S. enterica Serovar Typhimurium [105]. B Vergleich der AI-2 Bindestellen von V. harveyi LuxP (A)[22] und S. enterica Serovar Typhimurium LsrB (B) [105]. 13 Einleitung 1.1.4.3. Regulation der AI-2 Gene in Escherichia coli In V. harveyi wird AI-2 vom Rezeptor LuxP gebunden und das QS-Signal über Konformationsänderungen an die Sensor-Kinase LuxQ weitergeleitet (Punkt 1.1.3) [117, 118]. In E. coli und S. enterica Serovar Typhimurium dagegen wird AI-2 in die Zellen transportiert, phosphoryliert und ist direkt an der Regulierung des lsr (luxS-regulated) Operons beteiligt [173, 174, 184]. Die an der Aufnahme und den Modifikationen von AI-2 beteiligten Proteine in E. coli werden von dem lsrACDBFGE Operon kodiert (Abbildung 1-11) [173, 174]. Die Produkte der ersten fünf Gene (lsrA, lsrC, lsrD und lsrB) bilden einen ABC (ATP binding cassette)-Transporter und sind somit an dem Transport des AI-2 in die Zelle beteiligt. Nach der Aufnahme in die Zelle wird AI-2 von der Kinase LsrK phosphoryliert. Phospo-AI-2 induziert die Expression der Gene des lsr Operons durch die Derepression des Transkriptionsrepressors LsrR [174]. An dem Abbau von Phospo-AI-2 sind die Produkte von lsrF und lsrG beteiligt [174]. Die Synthese und Aufnahme von AI-2 in E. coli hängt mit der Konzentration von Glukose, bzw. anderer Phosphotransferase-System-Zuckerstoffe (phosphotransferase system (PTS) sugars), zusammen [65, 168]. Maximale AI-2-Aktivität wurde in der mittleren und späten exponentiellen Wachstumsphase beobachtet. Nachdem die Glukose aus dem Medium verbraucht wurde, nahm die AI-2 Aktivität drastisch ab [168]. Der Einfluss von Glukose bzw. PTS-Zuckerstoffe auf die Synthese und Aufnahme von AI-2 in E. coli hängt mit der katabolischen Repression des cAMP (cyclic AMP)-cAMP-RezeptorProtein (CRP) Komplexes zusammen [184]. Der cAMP-CRP Komplex bindet in der 5`-Region des lsr Promotors und reguliert in der direkten Kooperation mit dem Repressor LsrR die Aufnahme von AI-2. Bei Anwesenheit von Glukose ist der Level des cAMP-CRP Komplexes niedrig und es findet keine Expression des lsr Operons statt. Gleichzeitig wird die Synthese von luxS hochreguliert, wodurch AI-2 synthetisiert wird und ins extrazelluläre Medium diffundiert [184]. Bei Abwesenheit von Glukose und somit hohen Konzentration von cAMP-CRP-Komplex bindet dieser an den 5´-Region des lsr Promotors. Wenn in dieser Situation Phospho-AI-2 in der Zelle vorhanden sind, kommt es zu Derepression des Repressors LsrR und Transkription der lsrACDBFGE Gene (Abbildung 1-11) [184]. 14 Einleitung Abbildung 1-11: Schematische Darstellung der Synthese und Aufnahme von AI-2 in E. coli [184]. In Anwesenheit von Glc ist der cAMP-CRP Level niedrig und es findet keine Expression des lsr Operons statt. Indirekt wird die Expression von LuxS und somit die Synthese von AI-2 hochreguliert. AI-2 akkumuliert im extrazellulären Medium. In Abwesenheit von Glc steigt bindet cAMP-CRP an die 5´-Region des lsr-Promotors. Sind keine Phospho-AI-2 vorhanden, ist die Expression der lsr Gene durch den Repressor LsrR blockiert. Bei Anwesenheit von Phospho-AI-2 findet Derepression des LsrR und somit die Expression des lsrACDBFG Operons statt. S Während der spät-exponentiellen Phase wird die Expression der lsr Gene zusätzlich von negativ beeinflusst. Die Expression von Pfs ist bei Anwesenheit von Glc herunterreguliert. Mit +/- wurde positive/negative Regulierung gekennzeichnet. 1.2. Detektion von AI-2 1.2.1. Vibrio harveyi Bioassay Seit der Entdeckung der Interspezieskommunikation [60] wurde V. harveyi als Reporterorganismus zur Detektion des AI-2 in zellfreien Kulturüberständen von Bakterien verwendet. Bei der Untersuchungen der Quorum Sensing – regulierten Gene bei V. harveyi wurden diverse Mutationsstämme erzeugt [12, 13]. Aus dem wt-Stamm BB120 wurden, unter anderen, der Stamm BB886 (luxQ-Mutante) und der Stamm BB170 (luxN-Mutante) entwickelt, die später in einem V. harveyi Bioassay verwendet wurden [11]. Die Lumineszenz in V. harveyi BB886 kann ausschließlich durch Zugabe des HAI-1 induziert werden, in BB170 dagegen nur bei der Zugabe von AI-2. Der auf dem Reporterstamm BB170 basierte Bioassay ist zu einer Standartmethode im Nachweis des AI-2 geworden und wurde in zahlreichen Studien benutzt [z. B. 27, 96]. Eine Einschränkung in Verwendung des Assays ist Abhängigkeit von Glukose [178]. Bei einer GlcKonzentration höher als 0,4 g/l wird die Lumineszenz teilweise gehemmt, bei höher als 2 g/l dagegen völlig ausgeschaltet. Für eine AI-2 Messung ist die Glc-Konzentration von 0,06 – 0,08 g/l optimal [178]. Somit ist der V. harveyi-Bioassay eine qualitative, aber keine quantitative Methode der Detektion von AI-2 [178]. 15 Einleitung 1.2.2. LuxP-FRET-basierter AI-2 Assay Die Konformationsänderungen des LuxP-Rezeptors nach der Anbindung des AI-2 waren die Grundlage für die Konstruktion eines FRET (fluorescence resonance energy transfer)-basierten AI-2 Assays [144]. Das V. harveyi LuxP-Protein wurde für diesen Zweck N-terminal mit CFP (cyan fluorescent protein) und C-terminal mit YFP (yellow fluorescent protein) fusioniert und in E. coli heterolog exprimiert. Nach der Anbindung des AI-2 vergrößert sich der Abstand zwischen den beiden Termini, was eine Abnahme des FRET-Signals zur Folge hat [144]. Mithilfe des FRET-basierten AI-2 Assays konnte die spezifische Bindung von S-THMF-Borat an V. harveyi LuxP nachgewiesen werden [144]. Die Vorteile des FRET-basierten Assay gegenüber dem V. harveyi Bioassay sind auf jeden Fall die Unabhängigkeit von Metaboliten wie Glukose oder der Fitness der Zellen. Andererseits ist der FRET-Assay nur auf das S-THMF-Borat eingeschränkt. Mittels des Assays wurde die Konzentration des S-THMF-Borats in zellfreien Kulturüberständen auf 4,2 µM quantifiziert. 1.2.3. Die Rezeptor-basierter AI-2 Fluoreszenzsensor Konformationsänderungen der AI-2-Rezeptorproteine waren auch bei der Konstruktion eines AI-2-Fluoreszenzsensor entscheiden [193]. Hierfür wurden in den Rezeptorproteinen von V. harveyi (LuxP) und S. enterica Serovar Typhimurium (LsrB) diverse Aminosäurengruppen gegen Cys ausgetauscht und anschließend mit verschiedenen fluoreszierenden Farbstoffen gekoppelt. Alle 72 so hergestellten Protein-Farbstoffpaare wurden auf die sensorische Qualitäten überprüft, wobei zwei für die weitere Verwendung als Biosensor ausgewählt wurden: die Dapoxyl-markierte T137C LuxP-Mutante (LuxP137Dap) sowie die Dansyl-markierte S161C LsrB-Mutante (Lsr161Dan). Bei einer Anregung bei 374 nm weist ApoLuxP137Dap eine Emission von Fluoreszenz mit einem Maximum von 535 nm auf, das Emissionsmaximum von HoloLuxP137Dap ist dagegen bis 494 nm verschoben. Bei Lsr161Dan konnte kein Shift des Emissionsmaximums gemessen werden. Sowohl Apo- als auch HoloLsr161Dan emittieren, angeregt bei 340 nm, Fluoreszenz mit Maximum bei 495 nm. Bei der Anbindung von AI-2 kann aber die Abnahme der Fluoreszenz gemessen werden [193]. Mithilfe des AI-2-Fluoreszenzsensors konnte wiederholt die hohe Spezifität der QSRezeptoren bewiesen werden. Es konnten zum ersten Mal die Konzentrationen des AI-2 im extrazellulären Medium bestimmt werden. Diese betrugen 100 – 150 µM für E. coli BL21(DE3) 16 Einleitung und 12 – 36 µM für Gram-positive Bakterien (Enterococcus faecalis, Staphylococcus epidermidis und Bacillus subtilis) [193]. Es wurde auch die intrazelluläre AI-2 Konzentration von E. coli BL21(DE3) gemessen. Diese betrug 2 ± 0,2 mM, was dem 20-fachen der extrazellulären AI-2 Konzentration entspricht. Das wiederum kann als Hinweis gegen die bisher angenommene Theorie der freien Diffusion von AI-2 ins Medium interpretiert werden [193]. Die Vorteile des AI-2-Fluoreszenzsensors gegenüber den vorgehenden Methoden sind die hohe Sensivität, kurze Messzeit (5 min.) und relativ einfache Handhabung [193]. 1.2.4. Detektion von AI-2 mittels GC-MS Eine direkte Detektion von AI-2 mittels chromatographischen Methoden erwies sich als sehr kompliziert. Die AI-2-Konzentration in den biologischen Proben ist relativ niedrig, gleichzeitig erweist DPD eine sehr hohe Polarität und ist in Wasser sehr gut löslich, was eine Extraktion schwierig macht [175]. Eine Möglichkeit der Stabilisierung des DPD für chromatographische Analysen ist die Chinoxalin-Derivatisierug [35]. Eine Methode der Detektion sowie Quantifizierung von DPD mittels Gaschromatographie mit Massenspektrometrie-Kopplung (GC-MS) wurde von Thiel et al. 2009 publiziert [175]. Die Derivatisierung von DPD erfolgt hier in zwei Schritten, zuerst findet die ChinoxalinDerivatisierung statt, anschließend die Trimethylsilylierung. Im Massenspektrum entsprechen dann die Peaks m/z 245 und m/z 348 den Produkten der Derivatisierung [175]. Mithilfe eines radioaktiv-markierten Standards konnte neben der Detektion auch eine Quantifizierung von DPD durchgeführt werden. Es wurde eine DPD-Konzentration von 0,86 µM bei V. harveyi BB152 sowie 0,22 µM bei Streptococcus Mutant gemessen [175]. Im Vergleich zu den anderen Methoden der Detektion von AI-2 ist diese sehr aufwendig. Die Etablierung des Messverfahrens ist sehr langwierig (Information von Prof. Dr. S. Schulz, TU Braunschweig). GC-MS kann somit nur bedingt zu einer Standardmethode der DPDBestimmung entwickelt werden. 1.3. Biosensorik Als Biosensor definiert man eine geschlossene einheitliche Vorrichtung, die aus einem biologischen Erkennungselement (Enzym, Antikörper, Rezeptor, DNA, Organelle, Mikroorganismus) und daran gekoppelten analytischen Instrument (Signalwandler) besteht und 17 Einleitung reversibel auf die Konzentrationsveränderungen des Analyts reagiert [147]. Das erste biosensorische System wurde bereits 1962 von Clark und Lyons entwickelt [26] und wurde für die Bestimmung von Glukose im Blut verwendet. Als biologisches Element wurde bei diesem Sensor die Glukose-Oxydase zwischen zwei Membranen aufgebracht und an eine Sauerstoffelektrode bzw. pH-Elektrode gekoppelt. Die wichtigsten Anwendungsgebiete der Biosensoren sind heutzutage Medizintechnik sowie Umweltmonitoring. Als biologische Erkennungselemente werden am häufigsten Enzyme verwendet. Diese werden meistens mit gentechnischen Methoden für die Verwendung in Biosensorik modifiziert [148]. Als biologische Komponenten von Biosensoren können auch Antikörper benutzt werden und z. B. der Detektion bakterieller Toxine dienen. Auch ganze Mikroorganismen können auf eine Sensoroberfläche integriert werden, wobei die meisten bisher konstruierten Ganzzellsensoren genetisch modifizierte Bakterien beinhalten [148]. Ausgehend von dem Messprinzip des Signalwandlers kann man mehrere Arten von Biosensoren unterscheiden [43]. Dazu gehören, unter anderen, optische, piezoelektrische, elektrochemische und ISFET – Sensoren. Eine Auflistung dieser Sensoren ist in der Tabelle 1-2 dargestellt. Art des Messvorrichtung Messtechnik Beispiel Ref. Optischer Sensor Lichtwellenleiter mit gekoppeltem Indikator Fluoreszenzsensor zur Messung der Sauerstoffgehalts in Flüssigkeiten [43] Piezoelektrischer Sensor Elektrochemischer Sensor Beschichtete Quarzkristalle Elektroden Absorptions-, Fluoreszenz-, Lumineszenz-, InfrarotSpektroskopie, Oberflächenplasmonresonanz, Lichtstreuung Messung der Schwingung (Mikrowaage) Amperometrie, Potentiometrie [43] ISFET (Ionensensitive Feldeffekttransistoren) -Sensor Silicium-Chip Oberflächenwellensensor (surface acoustic wave, SAW) Messung von leicht oxidierenden/reduzierenden Stoffwechselprodukten pH-Messung Biosensors Tabelle 1-2: Potentiometrie [43] [43, 125] Arten von Biosensoren im Bezug auf das Messprinzip. 18 Einleitung 1.4. Strategien der Gendeaktivierung in Escherichia coli In Folge der Erforschung des Chromosoms von E. coli wurden zahlreiche Methoden der Gendeaktivierung entwickelt. Eine der zuerst entwickelten Techniken war die Transformation mit linearisierten Plasmiden eines E. coli recD Stammes. Auf dem Weg der homologen Rekombination wurden die linearen DNA-Fragmente samt Markergen in dem E. coli Chromosom integriert [151]. Lineare DNA-Fragmente können auch über die Chi-Stellen (5´GCTGGTGG 3´) in das E. coli Chromosom integriert werden [29]. Eine andere Möglichkeit des genomischen Knock-outs besteht in der Transformation mit einem Plasmid, welches das zu deaktivierende Gen in mutierter Form beinhaltet. Nach einer erfolgten Rekombination wird die vom Plasmid stammende DNA (Cointegrat) ausgeschlossen [62, 79, 93, 141]. Die Anwesenheit von Antibiotikum-Resistenz-Marker im Cointegrat sowie die Verwendung von Plasmiden mit temperatursensitivem Replikationsursprung vereinfacht die Analyse der positiven Klone [62, 79, 93]. Eine deutlich weniger aufwändige Methode der Genaktivierung von E. coli wurde 2000 von Datsenko und Wanner publiziert [31] und basiert auf der Red-Rekombinase des Phages ( - Red Gendeaktivierungssystem). Die -Red Rekombinase benötigt für die Rekombination nur kurze Homologiefragmente (36-50 bp), was eine direkte Verwendung von PCR-Produkten für die Transformation und die darauf folgende Rekombination ermöglicht. Eine weitere Rekombinase, die ebenfalls in diesem System verwendet wird, ist die FLP-Rekombinase. Die Strategie des Knock-out Verfahrens ist relativ simpel (Abbildung 1-12). Im ersten Schritt wird mittels PCR ein FRT (FLP-recombinase recognition target)-flankiertes Antibiotikumresistenzgen amplifiziert. Mithilfe der Primer werden somit homologe 36 bis 50 nt lange Überhänge erzeugt, die der Sequenz des 5´und 3´ Bereichs des zu deaktivierenden Gens entsprechen. Das PCR Produkt wird in einem weiteren Schritt in -Red-Rekombinase- exprimierende E. coli Zellen transformiert. Die Expression der -Red-Rekombinase erfolgt von einem Helferplasmid (pKD20 oder PKD46), mit dem die Zellen vorab modifiziert wurden. Im nächsten Schritt werden Antibiotikum-resistente Klone analysiert. Diese werden anschließend mit dem FLP-Rekombinase exprimierenden Helferplasmid pCP20 transformiert und auf Verlust der Antibiotikum-Resistenz selektiert. Alle verwendeten Helferplasmide besitzen einen temperatursensitiven Replikationsursprung, was deren Eliminierung aus E. coli Zellen ermöglicht. In Rahmen dieses Knock-out Verfahrens wurden drei Templateplasmide entwickelt, 19 Einleitung die ein FRT-flankiertes Antibiotikum-Resistenz-Gen beinhalten: pKD3 (ChloramphenicolResistenz), pKD4 sowie pDK13 (jeweils Kanamycin-Resistenz). Schritt 1. PCR Amplifizierung des FRT-flankierten Antibiotikum-Resistenz-Gens Schritt 2. Transformation eines Red-Rekombinase exprimierendes E. coli Stammes Schritt 3. Selektion der Antibiotikum - resistenten Transformanten Schritt 4. Eliminierung der Resistenz-Kassette mithilfe des FLPExpressions-Plasmids Abbildung 1-12: Strategie des -Red-Rekombinase Systems [31]. H1 und H2 entsprechen den Homologie-Bereichen im E. coli Chromosom; P1 und P2 sind die Primer-Bindestellen FRT ist die Erkennungsequenz der FLP-Rekombinase. Das -Red-System ist eine sehr effektive Gendeaktivierungsmethode. Dreizehn verschiedene Deletionsmutanten konnten bereits bei der Entwicklung des Verfahrens erzeugt werden [31]. 20 Einleitung 1.5. Zielsetzung Im Rahmen dieser Arbeit sollen die molekularbiologischen Grundlagen zur Entwicklung eines Biosensors für Autoinducer-2 gelegt werden. Im Fokus steht das V. harveyi AI-2Rezeptorprotein LuxP, das auf die Eignung zur Anwendung in der Biosensorik überprüft werden sollte. Sowohl die Sequenz als auch die Kristallstruktur des Proteins sind bekannt, es gibt auch Hinweise, dass das Protein in Cytoplasma von E. coli löslich sei [22]. Auf dieser Basis sollte die Möglichkeit einer high level Expression des Rezeptors in E. coli untersucht sowie dessen Löslichkeit und Aufreinigungsmöglichkeit überprüft werden. Desweiteren sollten Fusionskonstrukte mit diversen Funktionsdomänen entwickelt werden und diese ebenfalls auf die Möglichkeit der Expression, Löslichkeit und Aufreinigungsmöglichkeit überprüft werden. Dabei soll die Einsatzmöglichkeit des Proteins für die Verwendung in optischen Sensoren (fluoreszierende Domänen) oder ISFET-Sensoren (Domänen mit starker Ladung) von größter Priorität sein. Desweiteren sollen Derivate des V. harveyi LuxP-Rezeptors hergestellt werden, die eine veränderte Affinität zur AI-2 erweisen. Anhand der Kristallstruktur sollten diese geplant werden und auf dem Weg der gerichteten Mutagenese hergestellt werden. Auch Rezeptorproteine anderer Bakterien (V. fischeri, E. coli) sollen im Rahmen der Arbeit heterolog hergestellt werden. Für die Expression der Rezeptorproteine sollten E. coli Stämme hergestellt werden, die eine Deletion des Gens der Autoinducer-2 Synthetase LuxS aufweisen und somit keine eigenen AI-2 Moleküle produzieren. Im zweiten Teil der Arbeit sollte auf Basis der luxS Deletionsstämme ein Bioassay zur Detektion von AI-2 entwickelt und somit auch die Grundlagen für einen Ganzzellsensor gelegt werden. Dazu sollen Markergene unter die Kontrolle des lsr-Promotors gebracht und in Plasmide integriert werden. Für die Verwendung im Bioassay sollte eine in-vitro Synthese des AI-2 durchgeführt werden. Hierfür müssen die Enzyme Pfs und LuxS kloniert, heterolog exprimiert und aufgereinigt werden. Desweiteren sollten die Assay-Bedingungen zwecks Konzentration von Glukose sowie AI-2 und geeigneten E. coli Deletionsstammes überprüft werden. Nach Etablierung der Assaybedingungen sollte dieser für die Untersuchung der AI-2 Bindeaktivität der Mutanten verwendet werden. Dabei sollte die Validität des Assays für Proteinuntersuchung bestimmt werden. 21 Material und Methoden 2. Material und Methoden 2.1. Material 2.1.1. Geräte Folgende Geräte wurden genutzt: Gerät Modell Firma Agarose-Gelelektrophorese- PerfectBlue Mini S/Mini L System Blockthermostat BT 100/MBT 250 PEQLAB Brutschrank B/BD WTB BINDER Elektroporationsgerät Gene Pulser II BIO-RAD Gefriertrockner Alpha 1-4 LSC CHRIST Gel-Archivierungsystem Alphamager IS-3400 ALPHA INNOTECH Gel-Trockner SE1160/GD2000 HOEFER Hybridisierungsofen HB-1000 Hybridiser UVP LABORATORY PRODUCTS Magnetrührer MR 3001 HEIDOLPH Mikroliterzentrifuge Biofuge fresco/pico HERAEUS 1-15 K/1-14 SIGMA Zentrifuge 5417R EPPENDORF Mikroplattenreader FluoStar Optima BMG LABTECH Minishaker MS1 IKA DNA-Sequenzierer LI-COR, Model 4000/4200 MWG BIOTECH pH-Meter 766 Calimatic KNICK PolyacrylamidGelelektrophoresesysteme PerfectBlue Doppelgelsystem Twin ExW S Mighty Small II PEQLAB EV231 CONSORT EPS 600 PHARMACIA BIOTECH Power Pac 1000/3000 BIO-RAD Series25/ Innova 4200 NEW BRUINSWICK SCIENIFIC AK-82 INFORS Promax 1020/ Duomax 1030 HEIDOLPH Power-Supply Schüttelinkubatoren Schüttler KLEINFELD HOEFER 22 Material und Methoden Semy-dry-Blotter PEQLAB Spektrophotometer Ultrospec 3000 PHARMACIA BIOTECH Sterilbank Herasafe HERAEUS Thermocycler Primus/Primus96plus MWG BIOTECH Cyclone 96 PEQLAB Mastercycler epgradient S EPPENDORF Thermoschüttler Thermomixer compact EPPENDORF Ultraschallgerät Sonoplus UW2070 BANDELIN Vakuum - Konzentrator speed vac 5301 EPPENDORF Wasserbad 1083 GFL Zentrifuge 3K30/3-18K SIGMA Avanti J-30I BECKMAN 2.1.2. Chemikalien/Reagenzien Wenn nicht gesondert angegeben, wurden Chemikalien von folgenden Firmen verwendet: APPLICHEM GmbH (Darmstadt, Deutschland); BIO-RAD LABORATORIES (Richmond, USA); CARL ROTH GmbH & Co (Karlsruhe, Deutschland); FLUKA AG (Buchs, Schweiz); GE HEALTH CARE (New York, USA); ICN BIOMEDICALS INC. (Ohio, USA); INVITROGEN (Gaithersburg, USA); SERVA (Heidelberg, Deutschland); SIGMA-ALDRICH (St. Louis, USA); VWR INTERNATIONAL GmbH (Darmstadt, Deutschland). 2.1.3. Enzyme Folgende Enzyme wurden nach Angaben der Hersteller genutzt: Enzym Firma Combizyme-DNA-Polymerase INVITEK 23 Material und Methoden Taq-DNA-Polymerase INVITROGEN Restriktionsnukleasen INVITROGEN; NEW ENGLAND BIOLABS; MBI-FERMENTAS DNAse I ROTH RNAse A ROTH Lysozym (aus Hühnerei) ROTH T4-DNA-Ligase PROMEGA Proteinase K ROTH 2.1.4. Größenstandards DNA-Größenstandards: /HindIII + EcoRV (MBI-FERMENTAS) - -DNA verdaut mit den Endonukleasen HindIII und EcoRV, enthält DNA-Fragmente in folgender Größen (bp): 21226, 5148, 4973, 4268, 3530, 2027, 1904, 1584, 1375, 947, 831, 564, 125; pUC19/MspI (MBI-FERMENTAS) – pUC19 verdaut mit der Endonuklease MspI, enthält DNA-Fragmente in folgender Größen (bp): 501, 489, 404, 331, 242, 190, 147, 111, 110, 67, 34x2, 26. Proteingrößenstandards Roti-MarkTM standart (ROTH); Proteinstandardgrößen (kDa): 200, 119, 66, 43, 29, 20, 14.3; Roti-MarkTM prestained (ROTH), Proteinstandardgrößen (kDa): 245, 123, 77, 42, 30, 25.4, 17; BenchMarkTM prestained (INVITROGEN), Proteinstandartgrößen (kDa): 170.8, 109.5, 78.9, 60.4*, 47.2, 35.1, 24.9, 18.3, 13.7, 5.7; PageRulerTM Plus Prestained Protein Ladder (FERMENTAS), Proteinstandartgrößen (kDa): ~250, ~130, ~100, ~70*, ~55, ~35, ~27*, ~15, ~10; 24 Material und Methoden Broad Range Protein Marker (NEB), Proteinstandartgrößen (kDa): 212, 158, 116, 97.2, 66.4, 55.6, 42.7, 36.5, 26.7, 20, 14.3, 6.5. Mit * markierten Banden sind zwecks Orientierung rot gefärbt. 2.1.5. Primer 2.1.5.1. Klonierungsprimer Folgende Primer wurden von den Firmen BIOMERS oder MWG BIOTECH synthetisiert und in der Arbeit eingesetzt. Für jeweilige Sequenz (5´ 3´) Quelle Klonierung verwendete Oligonuleotide Klonierung VhluxP in pET23b fluxPNheI GCAATGGCTAGCATGAAGAAAGCGTTACTATTTT MWG BIOTECH rluxPXhoI ATTGCTCTCGAGATTATCTGAATATCTAAATGCG MWG BIOTECH Klonierung VhluxP 21 in pET23b fluxPdel21NdeI ATCATACATATGACACAAGTTTTGAATGGGT MWG BIOTECH rluxPXhoI ATTGCTCTCGAGATTATCTGAATATCTAAATGCG MWG BIOTECH Klonierung VhluxP 23 in pET23b fluxPdel23NheI AAAATTGCTAGCGTTTTGAATGGGTACTGGGGTTAT MWG BIOTECH rluxPXhoI ATTGCTCTCGAGATTATCTGAATATCTAAATGCG MWG BIOTECH Klonierung GST-VhluxP in pET23b fgstNdeI GCAGCACATATGTCCCTTATACTAGGTTA MWG BIOTECH rgstBamHI GCAGCAGGATCCACGCGGAACCAGATC MWG BIOTECH fdel23gstBamHI GCAGCAGGATCCGTTTTGAATGGCTACTGG MWG BIOTECH rluxPgstXhoI GCAGCACTCGAGTCAATTATCTGAATATCT MWG BIOTECH 25 Material und Methoden Klonierung EGFP-VhluxP in pET23b ELuxPNdeIfor GCGCCACATATGGTGAGCAAGGGC BIOMERS ELuxPOEPrev AGTACCCATTCAAAACCTTGTACAGCTCGTCCAT BIOMERS ELuxPOEPfor GACGAGCTGTACAAGGTTTTGAATGGGTACTGG BIOMERS ELuxPXhoIrev GCGGCTCTCGAGATTATCTGAATATCTAAATGCG BIOMERS Klonierung VhluxP-EGFP in pET23b LEGFPNdeIfor GCGGTCCATATGGTTTTGAATGGGTACTGG BIOMERS LEGFPOEPrev GCCCTTGCTCACCATATTATCTGAATATCTAAATGCG BIOMERS LEGFPOEPfor GCATTTAGATATTCAGATAATATGGTGAGCAAGGGC BIOMERS LEGFPXhoIrev CAGTGTCTCGAGCTTGTACAGCTCGTCCAT BIOMERS Klonierung VhluxP-R16 in pET23b LuxP 23HisNdeIfor ATAATACATATGCATCACCACCATCATCACGTTTTGAATGGGT BIOMERS ACTGG LuxArgnewXhoIrev TATTATCTCGAGTTAACGACGGCGACGACGGCGACGACGGC BIOMERS GACGACGGCGACGACGGCGACGATTATCTGAATATCTAAAT GCG Klonierung VhluxP-DE16 in pET23b LuxP 23HisNdeIfor ATAATACATATGCATCACCACCATCATCACGTTTTGAATGGGT BIOMERS ACTGG LuxAspGluOEP1rev TATTATCTCGAGTTATCTTCTACGTCTACGTCTCGTCTACGCCT BIOMERS ACGCC LuxAspGluOEP2rev TATTATCTCGAGTATTCGTCTTCCTCATCGTCTTCGTCCTCGTC (XhoI) CTCGT BIOMERS Klonierung EclsrB in pET23d fLsrBNcoI ATAATACCATGGCAGAGCGTATTGCATTTA MWG BIOTECH rLsrBXhoI ATAATACTCGAGGAAATCGTATTTGCCGATAT MWG BIOTECH Klonierung VfluxP in pET23d VfLuxPfullNcoFor ATAATACCATGGAATAAATGCGCAACGGTAGAT MWG BIOTECH 26 Material und Methoden VfLuxPXhorev ATAATACTCGAGGTGTTCTACACCAGAATAACG MWG BIOTECH Klonierung VfluxP 27 in pET23d VfLuxPNcofor CTAATACCATGGATCCTGTTTTAGTTGGATATT MWG BIOTECH VfLuxPXhorev ATAATACTCGAGGTGTTCTACACCAGAATAACG MWG BIOTECH Klonierung VfluxP-EGFP in pET23b VfLuxP-EGFPNhefor ATAATAGCTAGCTGAATGGATCCTGTTTTAGTTGG MWG BIOTECH VfLuxP-EGFPXhorev ATAATACTCGAGCTTGTACAGCTCGTCCATG MWG BIOTECH VfLEThrOEPfor TTCTGGTGTAGAACACCTGGTTCCGCGTGGATCCATGGTGAG MWG BIOTECH CAAGGGCG VfLEThrOEPrev CCCGTTCTCACCATGGATCCACGCGGAACCAGGTGTTCTACA MWG BIOTECH CCAGAATAACGT Klonierung EGFP-VfluxP 27 in pET23d EGFP-VfLuxPNcofor ATAATACCATGGTGAGCAAGGGC MWG BIOTECH EGFP-VfLuxPXhorev ATAATACTCGAGGTGTTCTACACCAGAATAACG MWG BIOTECH EVfLThrOEPfor GACGAGCTGTACAAGCTGGTTCCGCGTGGATCCGATCCTGTT MWG BIOTECH TTAGTTGGAAT EVfLThrOEPrev AACTAAAACAGGATCGGATCCACGCGGAACCAGCTTGTACA MWG BIOTECH GCTCGTCCAT Klonierung VfluxS in pET23b VfluxSNdefor CCAATACATATGCCATTGTTAGATATGTTTACT MWG BIOTECH VfluxSXhorev ATAATACTCGAGATGATTAGATAATTCTTTTAGCATT MWG BIOTECH Klonierung Vfpfs in pET23b VfpfsNdefor CTCCTACATATGAAAATTGGCATTATTGGC MWG BIOTECH VfpfsXhorev ATAATACTCGAGTTTAATAAAGTAACCATGTTTAATACCA MWG BIOTECH Klonierung EcluxS in pET23b EcluxSNdefor GCGAGACATATGCCGTTGTTAGATAGCTTCA MWG BIOTECH 27 Material und Methoden EcluxSXhorev TATTATCTCGAGGATGTGCAGTTCCTGCAACT MWG BIOTECH Klonierung Ecpfs in pET23b EcpfsNdefor CGCAGACATATGAAAATCGGCATCATTGGTG MWG BIOTECH EcpfsXhorev TATTATCTCGAGGGCTGGACTGTTTAGCGGCA MWG BIOTECH Klonierung der VhluxP Derivaten in pET23b Arg215/Alafor TAGCGATGTGGCCGGTGATACTT MWG BIOTECH Arg215/Alarev AAGTATCACCGGCCACATCGCTA MWG BIOTECH Arg215/Aspfor ATTAGCGATGTGGACGGTGATACTTTT MWG BIOTECH Arg215/Asprev AAAAGTATCACCGTCCACATCGCTAAT MWG BIOTECH Arg310/Alafor CACCGTCATGGCCATGAATGATG MWG BIOTECH Arg310/Alarev CATCATTCATGGCCATGACGGTG MWG BIOTECH Arg310/Aspfor TCACCGTCATGGACATGAATGATGA MWG BIOTECH Arg310/Asprev TCATCATTCATGTCCATGACGGTGA MWG BIOTECH Gln77/Alafor ACCCAGGACAGGCTGTTTCAGATTA MWG BIOTECH Gln77/Alarev TAATCTGAAACAGCCTGTCCTGGGT MWG BIOTECH Asp267/Alafor ATGTTCGACCGCCGTAGCATTAG MWG BIOTECH Asp267/Alarev CTAATGCTACGGCGGTCGAACAT MWG BIOTECH Asp267/Argfor ATGTTCGACCCGCGTAGCATTAG MWG BIOTECH Asp267/Argrev CTAATGCTACGCGGGTCGAACAT MWG BIOTECH Thr266/Alafor TGCATGTTCGGCAGACGTAGCAT MWG BIOTECH Thr266/Alarev ATGCTACGTCTGCCGAACATGCA MWG BIOTECH Gln+Trpfor CCAGGACAGGCAGTTTCAGATTACGCAGTAAGAAAT MWG BIOTECH Gln+Trprev ATTTCTTACTGCGTAATCTGAAACTGCCTGTCCTGG MWG BIOTECH markierte Basenfolgen zeigen die Codons für ausgetauschte Aminosäuren Klonierung des lsr-Promotors in pUC18/pBR322 LsrEcoRIfor ATAATAGAATTCGAGTTTCATATTCCAGACAGCCTTC MWG BIOTECH LsrHindIIIrev ATAATAAAGCTTGAACTGGCGTTAATCTGACGTAGTT MWG BIOTECH Klonierung dsRed in pUC19/pBR322 28 Material und Methoden fDsRedHindIII ATAATAAAGCTTGAAGAAGATATTATTATATGATGGCCTCCT MWG BIOTECH CCGAGAACGT rDsRedEcoRV TCGTCTGATATCCTACAGGAACAGGTGGTGGCG MWG BIOTECH Klonierung lsrR in pUC19 flsrRPstI ATAATACTGCAGATGGACAATCAACGATTCGGC BIOMERS rlsrRBamHI CTCATAGGATCCTTAACTACGTAAAATCGCCGC BIOMERS Klonierung lsrR in pUCDsRed ATAATAGTCGACGTAAGAAGGAGATATACATATGACAATCA flsrRRBSSalI BIOMERS ACGATTCGGCAA rlsrRHABamHI ATAATAGGATCCTTACGCATAGTCAGGAACATCGTATGGGTA BIOMERS flsrRClaI CTCATCATCGATGCCTTTCAGGACAT BIOMERS rlsrREcoRI ATAATAGAATTCTTAACTACGTAAAATCGCCGC BIOMERS Klonierung zeoR in pUC18 Kas1for CGCCGCGGATCCAGATTGCAGCATTACACGTCTTGAGCGAT MWG BIOTECH (BamHI) Kas1rev TGGCCGAGGAGCAGGACTGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAAG MWG BIOTECH Kas2forzeo CCTTACGCCCCGCCTGCCACTCAGTCCTGCTCCTCGGCCA MWG BIOTECH Kas2revzeo CAGGAGCTAAGGAAGTCAAAATGGCCAAGTTGACCAGTGCC MWG BIOTECH Kas3for GCACTGGTCAACTTGGCCATTTTAGCTTCCTTAGTCCTGAAA MWG BIOTECH Kas3rev CGCAGAGGTACCGGAATTAGCCATGGTCCA MWG BIOTECH (KpnI) unterstrichene Basenfolgen zeigen die Erkennungssequenz für die jeweils links angegebenen Typ II- Restriktionsendonukleasen 2.1.5.2. Sequenzierungsprimer Die Oligonukleotide wurden von der Firma MWG BIOTECH synthetisiert. 29 Material und Methoden Oligonukleotid; Sequenz (5´ 3´) 5`-IRD-800 markiert pET3a/17for CACTATAGGGAGACCACAACG T7prim-rev GCTAGTTATTGCTCAGCGGTGG LuxPseqIfor CTTGTCATTAATGGAAGCGCTC LuxPseqIIfor TTATGATCAATGGCTGGGGTGG LuxPseqIIIrev GTGTCTTGTCGTATCAAGCGTG LuxPseqIVrev GGTTGATGTTTGTCCCACTCACG pBRseqfor ACGGGTGCGCATAGAAATTG pBRseqrev ATTTCCCCGAAAAGTGCCAC 2.1.5.3. Andere Primer Anwendung/Primer Sequenz (5´ 3´) Quelle Primer für die Amplifizierung der Knock-out Kassette KORevnew GAACCGTTTGCGGTGTGGCTGGAAAAACACGCCTGACA MWG BIOTECH TATGAATATCCTCCTTAG KOFornew TTTGGCGCAGGTGGCGGCGGAGGCGGTGCGCACTAAGT MWG BIOTECH GTAGGCTGGAGCTGCTTC KOfor+14 TTGCTAAACCGCCATTTGGCGCAGGTGGC MWG BIOTECH KOrev+14 AAGCCGCTGATACCGAACCGTTTGCGGTGTG MWG BIOTECH Primer für die Herstellung der ClaI – Sonde für die Southernblotanalyse SondClaIrev ACGCACCTCTGGATTAGCCA BIOMERS SondClaIfor GGATATGGGCACAGGTAGCG BIOMERS Primer für die Herstellung der EcoRV – Sonde für die Southernblotanalyse SondEcoRVfor GCAACTTCACCATCGGCTGCT MWG BIOTECH SondEcoRVrev GACAGCGTAATGGTGGTCAGCG MWG BIOTECH Primer für die PCR-Analyse der Knock-out Mutanten 30 Material und Methoden testemrB GCGGAGGCGGTGGTCACTAA MWG BIOTECH RKOkontr AAGCCGCTGATACCGAACCG MWG BIOTECH 2.1.6. Antikörper Folgende Antikörper wurden in der vom Hersteller empfohlenen Verdünnung eingesetzt. 2.1.6.1. Antikörper – primär Antikörper Firma Verdünnung Anwendung (monoklonal) QIAGEN 1:2000 Westernblotanalyse mouse-anti-EGFP (monoklonal) INVITROGEN 1:10000 Westernblotanalyse goat-anti-GST (polyklonal) GE HEALTHCARE 1:100 Westernblotanalyse sheep-anti-DIG-AP (polyklonal) ROCHE 1:1000 Southernblotanalyse Verdünnung Anwendung HR- GE HEALTHCARE 1:5000 Westernblotanalyse HR- SIGMA-ALDRICH 1:80000 Westernblotanalyse mouse-anti-tetra-His 2.1.6.2. Antikörper – sekundär Antikörper Firma sheep-anti-mouse IgG, Peroxidase gekoppelt rabbit-anti-goat IgG, Peroxidase gekoppelt 2.1.7. Kultivierungsmedien 2.1.7.1. Kultivierung von Escherichia coli (E. coli) Die Kultivierung von E. coli erfolgte in LB-Medium oder in low-salt LB-Medium. Für Agarplatten wurde dem jeweiligen Medium vor dem Autoklavieren Agar in einer Endkonzentration von 2% (w/v) zugesetzt. LB Low-salt LB 0,5% (w/v) Hefeextrakt 0,5% (w/v) Hefeextrakt 1% (w/v) Trypton / Pepton 1% (w/v) Trypton / Pepton 31 Material und Methoden 1% (w/v) NaCl 0,5% (w/v) NaCl ggf. mit NaOH auf pH 7,2 einstellen; autoklavieren. Die Kultivierung der E. coli Zellen im Bioassay erfolgte im Autoinducer Bioassay (AB) Medium [12 ,60]. AB Medium: 0,3M NaCl 0,05M MgSO4 0,2% (w/v) Vitamin-freie Casaminosäuren pH mit KOH auf 7,5 einstellen; autoklavieren. Vor dem Gebrauch wurden je 100 ml Medium mit sterilen: - 1 ml 1M Kalium-Phosphat-Puffer pH 7,0 - 1 ml 0,1M L-Arginin - 2 ml 50% Glycerol versetzt. Zu den Kultivierungsmedien wurden nach Bedarf Antibiotika in folgenden Endkonzentrationen zugesetzt: - Ampicillin 100 µg/ml; - Chloramphenicol 25 µg/ml oder 34 µg/ml; - Rifampicin 200 µg/ml; - Tetracyclin 12,5 µg/ml oder 25 µg/ml; - Zeocin 12,5 µg/ml. 2.1.7.2. Kultivierung von Vibrio fischeri (V. fischeri) Kultivierung von V. fischeri erfolgte in Meerwasser-Flüssigmedium, bzw. auf MeerwasserAgar – Platten. Meerwasser – Flüssigmedium Meerwasser - Agar 10 g Fleischextrakt 10 g Fleischextrakt 10 g Pepton 10 g Pepton 32 Material und Methoden durch Erhitzen in 250 ml Leitungswasser durch Erhitzen in 250 ml Leitungswasser auflösen; abkühlen; auf pH 7,8 einstellen; 10 auflösen; abkühlen; auf pH 7,8 einstellen; 10 min kochen und wieder abkühlen; auf pH 7,3 min kochen und wieder abkühlen; auf pH 7,3 neu einstellen; neu einstellen; autoklavieren; abkühlen; 20 g Agar zugeben; autoklavieren; mit 750 ml sterilem Meerwasser verdünnen. auf ca. 50°C abkühlen und 750 ml heißes, steriles Meerwasser zugeben. Da kein natürliches Meerwasser verfügbar war, musste es durch künstliches Meerwasser ersetzt werden [nach Angaben der Deutschen Stammsammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweig, Germany]. Künstliches Meerwasser NaCl 28,13 g KCl 0,77 g CaCl2×2H2O 1,6 g MgCl2×6H2O 4,8 g NaHCO3 0,11 g MgSO4×7H2O 3,5 g mit dH2o auf 1l auffüllen und autoklavieren. 2.1.8. Stämme Stamm Genotyp Bezugsquelle E. coli TOP10F` F´, mcrA, Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC), INVITROGEN φ80lacZΔM15, ΔlacX74, recA1, araD139, galU, galK, Δ(ara-leu)7697, rpsL (StrR), endA1, nupG, 33 Material und Methoden E. coli KIT1 F´, mcrA, Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC), diese Arbeit φ80lacZΔM15, ΔlacX74, recA1, araD139, galU, galK, Δ(ara-leu)7697, rpsL (StrR), endA1, nupG, luxS :: ble (BleR) E. coli KIT2 F´, mcrA, Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC), diese Arbeit φ80lacZΔM15, ΔlacX74, recA1, araD139, galU, galK, Δ(ara-leu)7697, rpsL (StrR), endA1, nupG, luxS E. coli BL21(DE3) F–, ompT, hsdSB(rB– mB–), gal, dcm, (DE3) NOVAGEN E. coli BL21(DE3) pLysS F–, ompT, hsdSB(rB– mB–), gal, dcm, NOVAGEN (DE3), pLysS (CamR) F–, ompT, hsdSB(rB– mB–), gal, dcm, E. coli KIB1 diese Arbeit (DE3), luxS : : ble (BleR) F–, ompT, hsdSB(rB– mB–), gal, dcm, E. coli KIB2 diese Arbeit (DE3), luxS :: ble (BleR), pLysS (CamR) F–, recA1, hsdR(rK12– mK12+), (DE3), (Rif R) NOVAGEN HMS174(DE3) F–, recA1, hsdR(rK12– mK12+), (DE3), pLysS NOVAGEN E. coli HMS174(DE3) E. coli pLysS (CamR ,Rif R) E. coli KIH1 F–, recA1, hsdR(rK12– mK12+), (DE3), luxS : diese Arbeit ble (BleR), (Rif R) E. coli KIH2 F–, recA1, hsdR(rK12– mK12+), (DE3), luxS, diese Arbeit (Rif R) E. coli KIH3 F–, recA1, hsdR(rK12– mK12+), (DE3), luxS, diese Arbeit pLysS, (CamR, Rif R) E. coli RossettaBlue(DE3) endA, hsdR17(rK12– mK12+), supE44, thi-1, NOVAGEN recA1, gyrA96, relA1, lac, (DE3), [F' proA+B+ lacI qZΔM15 ::Tn10] pRARE2 (CamR, TetR) 34 Material und Methoden E. coli K-12 Wildtyp-Isolat; DSM – Nr. 498 V. fischeri Wildtyp-Isolat; DSM 507, ATCC 7744 Deutsche Stammsammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweig, Germany Deutsche Stammsammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweig, Germany 2.1.9. Vektoren Vektor Beschreibung/Anwendung Bezugsquelle/ Referenzen pET23b/ Vektoren der pET-Reihe für die „high-level“ T7-Expression der NOVAGEN pET23d Proteine in E. coli; Größe: 3565 bp pUC18/ Beide Vektoren unterscheiden sich ausschließlich in der [103, 120, 191] pUC19 Orientierung der multiplen Klonierungsstelle; Größe: 2686 bp; Klonierungsvektor für blau/weiß Selektion pBR322 Größe: 4360 bp; Klonierung erfolgt [18, 169] im Bereich eines der Antibiotikum- resistenzgene (AmpR, TetR); Selektion der rekombinanten Klone über den Verlust der Resistenz. pKD3 Template-Plasmid für die PCR-Synthese der Knock-out Kassette. [31] pKD46 Helfer – Plasmid für den Gen-Knock-out; [31] Enthält die Gene der Red – Rekombinase ( , , exo) unter der Kontrolle des Arabinose-Promotors; Temperatur-sensitiver Replikationsursprung. 35 Material und Methoden pCP20 Helfer – Plasmid für den Gen-Knock-out; [31] enthält das Gen der FLP-Rekombinase; Temperatur-sensitiver Replikationsorigin. pGEX-4T3 Vektor für die Klonierung und Expression von N-terminal GST- AMERSHAM markierten Proteinen; BIOSCIENCES in dieser Arbeit benutzt als Template für das GST-Gen. pPIC B Vektor für die Proteinexpression in Pichia pastoris; INVITROGEN In dieser Arbeit benutzt als Template für das Zeocinresistenzgen. pLysS pLysS Plasmid wird bei der T7-Proteinexpression benutzt; es NOVAGEN kodiert T7-Lysosym, den natürlichen Inhibitor der T7-RNAPolymerase. pEGFP-N1 pTPQ128 E. coli – HeLa shuttle Vektor; CLONTECH In dieser Arbeit benutzt als Template für das EGFP-Gen. LABORATORIES Quelle des dsRed - Gens [142] pET17luxP Enthält das V. harveyi luxP – Gen unter der Kontrolle des T7- [113] Promotors 36 Material und Methoden 2.2. Methoden 2.2.1. Kultivierung von Zellen 2.2.1.1. Kultivierung von E. coli Die Kultivierung von E. coli erfolgte in LB-Flüssigmedium in Schüttelinkubatoren bei ca. 140 rpm/min oder auf LB-Agarplatten in Brutschränken bei 37°C. Die Selektion von Transformanden erfolgte durch Zusatz eines entsprechenden Antibiotikums zum Nährmedium. Die Kultivierung der E. coli Zellen, die Plasmide mit temperatursensitivem Replikationsorigin trugen, erfolgte bei 30°C. Für die Expression rekombinanter Proteine wurden die Zellen bei 30°C kultiviert. 2.2.1.2. Kultivierung von V. fischeri Die Anzucht von V. fischeri erfolgte im Meerwasser-Flüssigmedium auf dem Schüttler bei ca. 140 rpm/min oder auf Meerwasser-Agarplatten bei Raumtemperatur. 2.2.2. Isolation von DNA 2.2.2.1. Plasmid-Minipräparation aus E. coli mittels alkalischen Lyse (nach Birnboim und Doly (1979) [17], modifiziert) Nach der Transformation wurden Einzelkolonien gepickt und in ca. 5 ml Medium mit Zugabe entsprechenden Antibiotikums über Nacht kultiviert. 2 bis 4 ml der Kultur wurden in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß bei 16.000 g für 1 min bei RT abzentrifugiert. Nach Abnahme des Überstandes wurde das Pellet in 200 µl L1 resuspendiert. Es wurden 200 µl L2 zugegeben und durch Schwenken des Reaktionsgefäßes vorsichtig gemischt. Die Zelllyse erfolgte für 3 min bei RT. Anschließend wurden 200 µl L3 zugegeben und somit die alkalische Lyse neutralisiert. Es folgte die Zentrifugation für 10 min bei 16000 g/4°C und Abnahme des Plasmid-DNA-haltigen Überstandes. Durch erneute Zentrifugation des Überstandes wurde ein höherer Reinigungsgrad erreicht. Nach dem zweiten Zentrifugationsschritt wurde der Überstand wieder abgenommen und mit 500 µl eiskalten Isopropanol gemischt und anschließend bei 16000 g/4°C für 20 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, dem erhaltenen Pellet wurde 300 µl eiskalten, 70% (v/v) Ethanols zugegeben. Es folgte ein neuer Zentrifugationsschritt bei 16000 g/4°C für 10 min. Der 37 Material und Methoden Überstand wurde erneut verworfen. Das Pellet wurde für ca. 15 min bei 60°C in einem Vakuum - Konzentrator getrocknet und in 50 µl TE-Puffer gelöst. Material: L1: 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 10 mM EDTA 100 µg/ml RNAse A 0,2 M NaOH 1% (w/v) SDS L3: 3M CH3COOK TE: 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 1 mM EDTA L2: 2.2.2.2. Plasmid-Mini- und Midiprepäration unter Verwendung von Kitsystemen Plasmid-DNA aus einer E. coli Übernachtkultur wurde mit folgenden Kitsystemen nach dem Herstellerprotokoll isoliert: - „NukleoSpin Plasmid Kit“ (MACHEREY-NAGEL) - „NukleoSpin Plasmid-Quick Kit“ (MACHEREY-NAGEL) - „Nucleobond AK“ (MACHEREY-NAGEL). 2.2.2.3. Isolation genomischer DNA aus E. coli und V. fischeri 2 bis 4 ml einer E. coli oder V. fischeri Kultur wurden in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß bei 16000 g für 1 min bei RT abzentrifugiert. Nach Abnahme des Überstandes wurde das Pellet in 100 µl TB-Puffer resuspendiert. Es wurden 200µl LT-Puffer und 20 µl Proteinase K (20µg/µl) zugegeben und 20 s mithilfe des Vortexer gemischt. Danach wurde die Suspension für 20 min bei 37°C inkubiert, gefolgt von der Inkubation für 5 min bei 70°C. Anschließend wurde der Probe 600µl Lösung G zugegeben und 20 s mithilfe des Vortexers gemischt. Nach der Zentrifugation für 10 min bei 16000 g wurde der Überstand abgenommen und auf eine Silikamembran-Minisäule (PROMEGA oder MACHEREY-NAGEL) aufgetragen. Es folgten zwei Waschschritte mit 600 µl und 400 µl Lösung W. Anschließend wurden die Minisäulen bei 75°C 38 Material und Methoden für 5 min getrocknet, um die Isopropanol-Reste zu entfernen. Die genomische DNA wurde mit 50µl TE-Puffers eluiert. Material: LT: 10mM Tris-HCl, pH 8,0 1mM EDTA 1% (w/v) SDS 10mM Tris-HCl, pH 8,5 1mM EDTA G: 6M Gua-HCl W: 60% (w/v) Isopropanol 100mM NaCl 10mM Tris-HCl, pH 8,0 1mM EDTA TB: TE: 2.2.3. Aufreinigung von DNA 2.2.3.1. Aufreinigung von PCR-Produkten aus dem Restriktionsansatz Die Aufreinigung der PCR-Produkte von Primern, Salzen und Nukleotiden, sowie der DNAFragmente nach dem Restriktionsverdau erfolgte unter Verwendung der folgenden Kitsysteme nach Angeben des Herstellers: „Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System” (PROMEGA); “Invisorb Fragment Clean-Up” (INVITEK); “MSB Vario Clean-Up” (INVITEK). 2.2.3.2. DNA-Extraktion aus den Agarosegelen Die zu aufreinigenden DNA-Fragmente wurden nach der Agarose-Elektrophorese unter langwelligem UV (365nm) aus dem Gel ausgeschnitten. Die Extraktion der DNA aus dem GelBlock erfolgte unter Verwendung folgender Kitsysteme nach Angaben des Herstellers: “Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System” (PROMEGA); 39 Material und Methoden “Invisorb Fragment Clean-Up” (INVITEK). 2.2.3.3. Ethanol – Fällung Für die DNA Präzipitation wurde zu je 50µl DNA-haltiger Lösung 2µl Glikogen (20mg/ml), 5µl 3M CH3COONa (pH 5,0) sowie 100µl eiskalten Ethanols zugesetzt. Die Fällung erfolgte über Nacht bei -20°C. Durch die Zentrifugation für 30 min bei 16000 g, 4°C wurde die DNA anschließend sedimentiert und nach Abnahme des Überstandes mit 300µl eiskaltem, 70%-igem (v/v) Ethanol gewaschen. Der DNA-Pellet wurde im Vakuumkonzentrator für 10 min bei 60°C getrocknet und in 20µl TE-Puffer oder ddH2O aufgenommen. 2.2.4. Bestimmung der DNA-Konzentration mittels UV- Absorptionspektrometrie Für die Bestimmung der DNA-Konzentration wurde zuerst von 50µl ddH2O ein kontinuierliches Absorptionsspektrum von 230 bis 340nm aufgenommen, welches als Referenz für die folgenden Messungen diente. Von der isolierten DNA wurde eine 1:25 Verdünnung in ddH2O hergestellt und ebenfalls ein Absorptionsspektrum aufgenommen. Bei einer OD260 von 1 liegt eine Konzentration von 50ng DNA/µl Lösung vor. 2.2.5. Amplifikation der DNA-Sequenzen unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Zur Amplifikation von DNA-Sequenzen wurde die Standard-Polymerase-Kettenreaktion verwendet [114]. 50µl Ansätze wurden wie folgt zusammenpipettiert: Komponenten Eingesetzte Volumina in µl Endkonzentration Primer forward (10mM) 2 0,01mM Primer reverse (10mM) 2 0,01mM 1-2 0,2 bis 0,4mM dNTPs (10mM; dATP, dCTP, dGTP, dTTP je 2,5mM) 40 Material und Methoden PCR-Puffer, 10 konzentriert 5 1 Template x 0,2 bis 1 ng/µl 0,25-0,5 0,025 bis 0,05 U/µl Thermostabile-DNAPolymerase (5U/µl) DNA-freies ddH2O auf 50µl auffüllen Die PCR-Reaktion erfolgte in einem Termocycler. Die DNA-Sequenzen wurden nach folgendem Algorithmus amplifiziert: - Denaturierung der DNA-Matrize: 95°C; 5 min - Denaturierung: 95°C; 0,5-1 min - Annealing der Primer; Temperatur primerabhängig*; 0,5 min - Elongation: 72°C; Zeit abhängig von der Länge 10 Zyklen des zu amplifizierenden Fragments in bp - Denaturierung: 95°C; 0,5-1 min - Annealing der Primer: Temperatur primerabhängig**; 0,5 min - Elongation: 72°C; Zeit abhängig von der Länge 20 Zyklen des zu amplifizierenden Fragments in bp - Terminale Elongation: 72°C; 3 min - Lagerung: 10°C (*)/(**) Die Annealing - Temperatur wurde mit der Software Vector NTI Advance 10 (INVITROGEN) berechnet. (*) entspricht der Annealing – Temperatur der komplementären Teils des Primers, (**) entspricht der Annealing – Temperatur des ganzen Primers. ( ) Die Syntheserate der verwendeten Polymerasen beträgt etwa 1000 bp pro Minute. 2.2.6. Overlap-extension PCR Sowohl bei der Klonierung der EGFP-markierten LuxP-Konstrukte und der mutierten LuxPDerivate, als auch bei der Herstellung des Helfer-Plasmids für den Gen-Knock-Out wurde die overlap-extension PCR (OEP) [140] angewendet. Zuerst wurden mittels Standard-Polymerase-Kettenreaktion (2.2.5) einzelne Fragmente amplifiziert. Je zwei Fragmente wurden dann mithilfe der OEP miteinander fusioniert. Bei 41 Material und Methoden Klonierungen, bei denen das Endkonstrukt aus mehr als zwei Fragmenten zusammengesetzt war, wurde die OEP schrittweise durchgeführt. 50µl OEP Ansätze wurden wie folgt zusammenpipettiert: Komponenten Eingesetzte Volumina in µl Endkonzentration Primer forward (10mM) 2 0,01mM Primer reverse (10mM) 2 0,01mM 1-2 0,2 bis 0,4mM PCR-Puffer, 10 konzentriert 5 1 OEP Fragment 1 x 0,2 bis 1 ng/µl OEP Fragment 2 y 0,2 bis 1 ng/µl 0,25-0,5 0,025 bis 0,05 U/µl dNTPs (10mM; dATP, dCTP, dGTP, dTTP je 2,5mM) Thermostabile-DNAPolymerase (5U/µl) DNA-freies ddH2O auf 50µl auffüllen Die OEP erfolgte in einem Termocykler. Die DNA-Sequenzen wurden nach folgendem Algorithmus amplifiziert: - Denaturierung der DNA-Matrize: 95°C; 5 min - Denaturierung: 95°C; 1 min - Annealing der einzelner Fragmente; Temperatur fragmentabhängig*; 1 min - Elongation: 72°C; Zeit abhängig von der Länge 10 Zyklen des zu amplifizierenden Fragments in bp - Denaturierung: 95°C; 1 min - Annealing der Primer: Temperatur primerabhängig**; 1 min - Elongation: 72°C; Zeit abhängig von der Länge 20 Zyklen des zu amplifizierenden Fragments in bp - Terminale Elongation: 72°C; 5 min - Lagerung: 10°C 42 Material und Methoden (*)/(**) Die Annealing - Temperatur wurde mit der Software Vector NTI Advance 10 (INVITROGEN) berechnet. (*) entspricht der Annealing-Temperatur der komplementären Teils der zwei Templatefragmente, (**) entspricht der Annealing – Temperatur des Primers. ( ) Die Syntheserate der verwendeten Polymerasen beträgt etwa 1000 bp pro Minute. 2.2.7. DNA – Restriktionsverdau Der Restriktionsverdau der DNA erfolgte unter Verwendung von mindestens 2 U eines Restriktionsenzyms pro 1 µg DNA. Die Reaktionstemperaturen sowie der Reaktionspuffer wurden gemäß den Angaben des Herstellers (INVITROGEN; NEW ENGLAND BIOLABS; MBI-FERMENTAS) gewählt. Die Reaktionsdauer betrag 4 h bis ü. N. für Spaltung der PCR-Fragmente sowie der Vektor-DNA, 30 min bis 2h für den Kontrollverdau. Die Aufreinigung der DNA nach dem Verdau erfolgte nach der in Punkt 2.2.3 beschriebenen Methoden. 2.2.8. DNA – Agarose – Gelelektrophorese Zur Analyse der DNA wurde die Agarose – Gelelekrophorese angewandt. Die Auftrennung der DNA-Fragmente nach ihrer Größe erfolgte bei Agarose Konzentrationen von 0,8 % bis 2% (w/v) in 1 TBE als Elektrophorese-Puffer. Zur Visualisierung der DNA unter UV-Licht wurden zu je 10 ml Gel 1µl Ethidiumbromidlösung (1mg/ml) zugegeben. Die Elektrophorese erfolgte bei Gleichspannung von 5 bis 10 V pro cm Gel in der Gelkammer. Die in der Arbeit benutzten Größenstandards sind in dem Punkt 2 aufgelistet. Vor dem Probenauftrag wurden die DNA Proben mit 6 Gelladepuffer (Endkonzentration 1 ) versetzt. Material: Agarosegel: 0,8 % bis 2% (w/v) Agarose wurde in 1 TBE-Puffer aufgekocht; nach dem Abkühlen auf ca. 55°C wurde Ethidiumbromid zugesetzt und das Gel gegossen. EtBr-Stammlösung: 1mg Ethidiumbromid in 1 ml ddH2O gelöst 10×TBE-Puffer (pH 8,3): 55 g Borsäure 43 Material und Methoden 108 g Tris 9,3 g EDTA dH2O auf 1l 6 Ladepuffer 0,25 % (w/v) Bromophenolblau 40 % (w/v) Saccharose in ddH20 2.2.9. Ligation von DNA – Fragmenten Für die Ligation wurde die Vektor – DNA (50-200 ng), die Insert-DNA (200-500 ng), sowie 1U der T4 DNA-Ligase und der von dem Hersteller (PROMEGA) mitgelieferte Puffer eingesetzt. Die Ligationsansätze wurden für 2h bei 17°C oder ü. N. bei 4°C inkubiert. 2.2.10. DNA-Sequenzierung Die DNA-Sequenzierung erfolgte entweder direkt bei der Firma MWG-BIOTECH oder mit dem LI-COR 4000/4200 Sequenzer (MWG-BIOTECH) nach der Kettenterminationsmethode [152] unter der Verwendung des „Thermo-Sequenase fluorescent labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP“ (GE HEALTHCARE) und 5`-seitig IRD-800 markierter Primer (MWG BIOTECH). Die Sequenzierung erfolgte nach folgendem Protokoll: Gelelektrophorese Herstellung des Sequenziergels: 30,0 ml Acrylamid-/Bisacrylamid-Lösung (Sequagel-XR, BIOZYM) 7,5 ml Puffer (Sequagel-XR, BIOZYM) 0,4 ml DMSO (SIGMA) Die Gellösung wurde mit Hilfe eines Faltenfilters filtriert. Durch Zugabe von 200µl 10% (w/v) APS wurde die Polymerisation initiiert und das Gel gegossen. Nach ca. 2h Polymerisationszeit wurde der Gelvorlauf gestartet und für 30 min bei 1500V, 45mA, 50W durchgeführt. Als Elektrophorese-Puffer wurde 1×TBE verwendet. Nach dem Erreichen der Temperatur von 50°C wurde die Lasereinheit justiert. Die Sequenzproben wurden nach dem Erreichen von einer Spannung von ca. 1400V aufgetragen. 44 Material und Methoden Sequenzierreaktion Unter der Verwendung der im Punkt 2.2.2.2 beschriebenen Kitsysteme wurde hochreine Plasmid-DNA präpariert. Die Sequenzierreaktion wurde in 96-well-Mikrotiterplatten im Thermocycler durchgeführt. Zuerst wurde die zu sequenzierende DNA mit dem Sequenzierprimer nach folgendem Protokoll gemischt: DNA (ca. 150 ng pro 100 bp): x µl Primer (1pmol/µl): 2 µl ddH2O: y µl 21 µl In eine Mikrotiterplatte wurden je 1 µl A/C/G/T Reagenz pro Probe pipettiert. Dazu wurden je 5 µl des DNA-Primer-Gemisches pipettiert und jeder Ansatz mit ca. 15 µl Mineralöl überschichtet. Die Sequenzierreaktion erfolgte unter folgenden Parametern: - Denaturierung der DNA-Matrize: 94°C; 4 min - Denaturierung: 94°C; 0,5 min - Annealing der Primer; Temperatur primerabhängig*; 0,5 min - Elongation: 70°C; 0,5 min 30 Zyklen (*) Die Annealing - Temperatur wurde mit der Software Vector NTI Advance 10 (INVITROGEN) berechnet. Nach der Reaktion wurden zu jeder Probe 3 µl STOPP-Lösung zugegeben. Es wurde je 1 µl pro Sequenzierprobe aufs Gel aufgetragen. Die online-Sequenzierung erfolgte mit einem LI-COR Sequenziergerät der 4000er Serie von MWG BIOTECH. Material: 10×TBE-Puffer (pH 8,3) für die Sequenzierung: 55 g Borsäure 108 g Tris 9,3 g EDTA dH2O auf 1l 2.2.11. Transformation von E. coli Herstellung elektrokompetenter E. coli Zellen 45 Material und Methoden 400 ml LB wurden mit 1/100 Volumen einer E. coli ü. N.-Kultur inokuliert. Die Zellen wurden bei 37°C oder 30°C unter Schütteln bis zu einer OD 600 von 0,5 bis 0,6 kultiviert. Danach wurde die Kultur für ca. 15 min auf Eis gekühlt. Die Zellen wurden durch die Zentrifugation für 10 min bei 4000×g, 4°C geerntet. Es folgten zwei Waschschritte mit 400 und 200 ml eiskaltem Wasser und ein Waschschritt mit 200 ml eiskaltem 10% (w/v) Glycerol. Danach wurden die Zellen in 2-3 ml 10% (w/v) Glycerol aufgenommen, wobei die Zelldichte mindestens 3×1010 Zellen pro ml betragen sollte. Die Zellsuspension wurde in 40µl Aliquots bei -80°C gelagert. Transformation von E. coli durch Elektroporation Für die Transformation der E. coli Zellen mit Plasmid-DNA, linearer DNA oder Ligationsansätzen wurde die Elektroporation angewandt. Die elektrokompetenten Zellen wurden auf Eis aufgetaut. 5 µl der DNA-Lösung wurden mit einer MILLIPORE VS Membran (Porendurchmesser 0,0025 µm) 15 min gegen dH2O dialysiert. Zu 40µl Zellsuspension wurde dann die dialysierte DNA zugegeben. Anschließend wurde die Suspension in eine vorgekühlte Elektroporationsküvette (Plattenabstand 0,2 cm, B IO-RAD) überführt und mithilfe des „Gene Pulser II“ (BIO-RAD) ein Impuls unter den gegebenen Einstellungen (Spannung: 2,5 kV, Kapazität: 25 µF, Widerstand: 200 ) ausgelöst. Die Entladungsdauer zwischen den Kondensatorplatten sollte 4,5 bis 5,0 ms betragen. Anschließend wurden die Zellen sofort in 1 ml SOC Medium resuspendiert, in ein steriles Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und für 1h bei 37°C (30°C bei der Transformation mit Temperatur-sensitiven Plasmiden) inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen auf LBPlatten mit entsprechenden Antibiotika ausplattiert und bei 37°C/30°C kultiviert. Material: SOC – Medium: 10 mM NaCl 2,5 mM KCl 10 mM MgCl2 10 mM MgSO4 20 mM Glukose 2 % (w/v) Trypton 0,5 % (w/v) Hefeextrakt 46 Material und Methoden 2.2.12. Gen-Knock-out in chromosomaler DNA von E. coli Für die Inaktivierung des luxS Gens in E. coli wurde das von Datsenko & Wanner (2000) beschriebene -Red.-Rekombinase-System benutzt [31]. Die E. coli Zellen, in denen das Gen deaktiviert werden sollte, wurden zuerst mit dem pKD46 Plasmid transformiert und nach der Kultivierung in LB-Medium mit 1 mM L-Arabinose, wie unter 2.2.11 beschrieben, elektrokompetent gemacht. Für die Herstellung der Gen-Knock-out-Kassette wurde das dafür erzeugte Helfer-Plasmid pUCzeo als Template benutzt. In zwei PCR-Schritten (2.2.5) wurde eine Gen-Knock-out-Kassette mit 50-nt Homologie zu dem das luxS-Gen flankierenden Bereich auf dem E. coli Chromosom amplifiziert. Mit so entstandener linearer DNA wurden die zuvor vorbereiteten E. coli Zellen transformiert (2.2.11). Nach Zugabe des SOC-Mediums zu dem Transformationsansatz wurde die Suspension für 1 h bei 37°C inkubiert. Danach wurde die Hälfte der Suspension auf LBPlatten mit Zeocin ausplattiert. Die andere Hälfte des Ansatzes wurde ü. N. bei RT inkubiert und dann ebenfalls auf LB-Zeo Platten ausplattiert. Zeocin-resistente Transformanden wurden gepickt und in 5 ml LB-Zeo-Medium ü. N. kultiviert. Es folgte die Isolierung der genomischen DNA wie unter 2.2.2.3 beschrieben. Die genomische DNA wurde mittels PCR und Southern - Blots auf die Integration der Gen-Knockout-Kassette untersucht. Die positiv analysierten Transformanden wurden auf Verlust des pKD46 Plasmids (Verlust der Ampicillinresistenz) untersucht. Dazu wurden diese bei 43°C in LB kultiviert und auf LBPlatten ausplattiert. Die Kolonien wurden anschließend gepickt und auf LB-Amp und LB-Platten ausgestrichen. Von jeder Transformande wurde der Klon ausgesucht, der nur auf LB und nicht auf LB-Amp wuchs. Um das Bleomycinresistenzgen zu eliminieren wurden die nicht gegen Ampicillin resistenten Klone mit dem Plasmid pCP20 transformiert und auf Ampicillin-Platten bei 30°C selektiert. Anschließend wurden die Transformanden bei 43°C in LB kultiviert und auf Verlust der Ampicillin- und Zeocinresistenz überprüft. 2.2.13. Southern Blot Die Analyse der Knock-out-Mutanten erfolgte mittels Southern Blots [160]. Gelelektrophorese der verdauten genomischen DNA 47 Material und Methoden Für die Analyse der genomischen DNA mittels Southern Blot wurde die DNA zuerst mit einer Restriktionsnuklease ü. N. verdaut (Punkt 2.2.6). Für einen Verdau wurden zwischen 2000 und 5000 ng DNA verwendet. Die DNA Proben wurden anschließend auf ein 1%-iges Agarosegel aufgetragen und bei einer Spannung von 5V pro cm Gel elektrophoretisch aufgetrennt (Punkt 2.2.8). Nach der Elektrophorese wurde die DNA unter UV mithilfe des Alphamager IS-3400 (ALPHA INNOTECH) visualisiert und das Gel dokumentiert. Southern-Transfer Das Agarose-Gel mit aufgetrennten Fragmenten der genomischen DNA wurde nach der Dokumentation kurz mit dH2O gewaschen. Danach wurde das Gel für 10 min in der Depurinierungslösung geschwenkt und wieder kurz mit dH2O gewaschen. Dann wurde das Gel zwei Mal für je 20 min in der Denaturierungslösung geschwenkt und wieder mit dH2O gespült. Anschließend wurde das Gel zwei Mal für je 30 min in der Neutralisierungslösung geschwenkt und erneut mit dH2O gespült. Nach den Waschschritten wurde der Kapillarblot entsprechend der Abbildung 2-1 aufgebaut. Der Tank wurde mit ca. 1 l Transferpuffer (20×SSC) gefüllt. Die langen Papierbahnen wurden in 20×SSC getränkt und so auf eine Glasplatte aufgelegt, dass die beiden Enden der Bahnen in Transferpuffer tauchen. Auf die zwei Papierbahnen wurden 4 bis 5 weitere Lagen von in 20×SSC getränktem Blottingpapier aufgelegt. Das Gel wurde ebenfalls in 20×SSC getränkt und auf das Blottingpapier aufgelegt. Die Nylonmembran wurde zuerst in ddH2O, dann in 20×SSC gespült und luftblasenfrei auf das Gel aufgelegt. Um zu gewährleisten, dass der Kapillarstrom nur durch das Gel fließt, wurden alle nicht vom Gel bedeckte Flächen mit Folie abgedeckt. Anschließend wurden auf die Membran 4-5 Lagen Blottingpapier und ein 8 cm hoher Stapel Papierhandtücher aufgelegt. Der Blot wurde mit einer Glasplatte und einem Gewicht von ca. 500g beschwert. Der Transfer folgte über Nacht (ca. 16 h). Nach dem Transfer über Nacht wurden die im Puffer tauchenden Blottingpapierbahnen abgeschnitten. Es folgte ein Trockentransfer für weitere 2-3 Stunden. Nach Beendigung des Transfers wurden die Geltaschen und die „DNA-Seite“ auf der Membran markiert. Die Membran wurde dann luftgetrocknet. Anschließend wurde die auf die Membran transferierte DNA für 4 min im UV-Licht fixiert. 48 Material und Methoden Glasplatte Papierhandtücher (8 cm) 5-8 Lagen Blottingpapier 500g Nylonmembran Gel 4-5 Lagen Blottingpapier 2 lange Blottingpapierbahnen Glasplatte 20 × SCC Abbildung 2-1: Aufbau des Kapillarblots. Genaue Erklärung im Text. Material: Depurinierungslösung: 0,25N HCl Denaturierungslösung: 0,5M NaOH 1M NaCl 0,5M Tris-HCl, pH 7,5 3M NaCl Neutralisierungslösung: Blottingpapier Nylonmembran: Hybond-N+ (AMERSHAM BIOSCIENCES) 20×SSC: 3M NaCl 0,3M Trinatriumcitrat Herstellung der DIG-markierter DNA-Sonde Die DNA-Sonde wurde mittels PCR (2.2.5) unter Anwendung des „PCR DIG Probe Synthesis Kits“ (ROCHE) amplifiziert. In diesem Verfahren wurde die DNA nichtradioaktiv, mit dem SteroidHapten – Dioxygenin, markiert. Hybridisierung Die Nylonmembran mit der immobilisierten DNA wurde kurz mit 2×SSC gewaschen und mit der DNA-Seite nach innen gerollt, in eine mit auf 68°C vorgewärmten Hybridisierungslösung gefüllte Hybridisierungsröhre eingebracht. Die Hybridisierungsröhre wurde in das Rondell eines 49 Material und Methoden ebenfalls auf 68°C vorgewärmten Hybridisierungsofens eingesetzt. Es folgte eine Prähybridisierung für 2h bei 68°C. Ca. 500 ng der DIG-markierten DNA-Sonde wurden mit dem TE-Puffer auf 50 µl aufgefüllt. Die DNA-Lösung wurde für 10 min bei 95°C denaturiert und anschließend sofort auf Eis gestellt. 25 ml einer auf 68°C vorgewärmten Hybridisierungslösung wurde mit der denaturierten Sonde versetzt. Die Prähybridisierungslösung wurde durch die Hybridisierungslösung mit der Sonde ersetzt. Es folgte eine Hybridisierung der Sonde ü. N. bei 68°C. Nach der Hybridisierung wurde die Membran zwei Mal für 30 min bei 65°C in 2×SSC/ 0,1 % (w/v) und zwei Mal für 15 min bei 65°C in 0,5×SSC/ 0,1 % (w/v) gewaschen. Dabei wurde es darauf geachtet, dass die Membran nach der Hybridisierung der Sonde nicht trocknet. Material: Hybridisierungslösung: 5× SSC 0,1 % (w/v) N-Lauroylssarcosine 0,1 % (w/v) SDS 1 % (w/v) Blocking Reagent Immunologische Detektion DIG-markierter DNA Die Membran wurde zuerst für 5 min in 1×Maleinsäurepuffer gewaschen. Danach wurde die Membran für 30 min in 1×Blockierungslösung beim leichten Schütteln inkubiert. Währenddessen wurde der sheep-anti-DIG-AP- Antikörper mit 1×Blockierungslösung 1:20000 verdünnt. Es folgte eine Inkubation der Membran mit der Antikörper-Blockierungslösung für 30 min. Danach wurde die Membran zwei Mal für 15 min mit 1×Maleinsäurepuffer gewaschen und anschließend für 5 min im Detektionspuffer äqulibriert. Danach wurde auf die Membran das mit dem Detektionspuffer 1:100 verdünnten CDP-Star Reagenz (ROCHE) aufgetragen und im Dunkeln für 5 min inkubiert. Es folgte eine Detektion der chemilumineszenten Signale durch die Exposition des Röntgenfilms. 2.2.14. Heterologe Expression der Proteine in E. coli Für die heterologe Expression aller Proteine wurde das pET-System verwendet. Eine mit rekombinantem pET-Vektor transformierte E. coli (HMS174(DE3) pLysS, BL21(DE3) pLysS, KIB2, KIH3) Kolonie wurde in 10 ml LB mit Ampicillin und Chloramphenicol (34 µg/ml) (LB-Amp/Chl) ü. 50 Material und Methoden N. bei 30°C im Schüttler inkubiert. 5 ml der Vorkultur wurden zum 500 ml LB-(Amp/Chl) zugegeben und in einem 2 l-Schikanen-Kolben im Schüttler bei 30°C bis zur einer OD600 von 0,30,4 kultiviert. Für die Induktion der Expression wurde IPTG in der Endkonzentration von 0,4 mM zugegeben. Es folgte eine Inkubation der Kultur für weitere 3h bei 30°C (4h bei der Expression von Pfs und LuxS Proteinen). Danach wurden die Zellen durch d Zentrifugation für 10 min bei 6000×g geerntet. Die Zellpellets wurden bei –20°C gelagert. 2.2.15. Aufreinigung der His-getaggten Proteine unter nativen Bedingungen mittels Metallionenaffinitätchromatographie Die Zellpellets von 500 ml (LuxP-Proteine) oder 250 ml (LuxS und Pfs Proteine) E. coli Expressionskultur wurden in 35 ml kaltem Puffer B gelöst. Die Suspension wurde mit je einer Spatelspitze von Lysozym, DNase II und RNAse A versetzt und für 30 min bei 37°C im Schüttler inkubiert. Anschließend wurde das Lysat für 20 min auf Eis gekühlt. Um vollständigen Zellaufschluss zu gewährleisten, folgte dem Lysosymaufschluss ein Aufschluss mit Ultraschall (4 × 1 min) im Eisbad. Nach der Ultraschallbehandlung wurde die Suspension auf 50 ml mit Puffer B aufgefüllt. So entstandenes Gesamtlysat wurde für 25 min bei 15000×g, 4°C abzentrifugiert. Der Überstand (klares Lysat) wurde auf die mit Puffer B äquilibrierte Ni2+-IDA-Sepharose-Säule aufgetragen. Der Durchfluss wurde gesammelt, um später mit der SDS-PAGE analysiert werden können. Die Säule wurde anschließend mit 2× 25 ml Puffer B, 2× 25 ml Puffer W1 und 2× 25 ml Puffer W2 gewaschen. Nach dem Waschen wurde das aufgereinigte Protein vier Mal mit je 5 ml Puffer E eluiert. Alle Arbeitsschritte ab der Zentrifugation wurden in einem Kühlraum bei einer Temperatur von 4-6°C durchgeführt. Material: Puffer B Puffer W1 20mM Tris-HCl, pH 7,9 0,5M NaCl 5mM Imidazol 0,1 % Triton X-100 20mM Tris-HCl, pH 7,9 0,5M NaCl 20mM Imidazol 0,1 % Triton X-100 51 Material und Methoden Puffer W2 Puffer E 20mM Tris-HCl, pH 7,9 0,5M NaCl 40mM Imidazol 0,1 % Triton X-100 20mM Tris-HCl, pH 7,9 0,5M NaCl 1M Imidazol 0,1 % Triton X-100 2.2.16. Präparation und Regenerierung der Ni2+-IDA-Sepharose-Säule 12,5 ml eines His-Bind® Resins (settlet volumne) (NOVAGEN) wurden in eine leere 35 ml Chromatographie-Säule eingebracht. Das Resin wurde mit 3×25 ml dH2O gewaschen. Danach wurden auf die Säule 15 ml einer gesättigten Ni2+ Lösung aufgetragen. Anschließend wurde das Resin mit mindestens 70 ml Puffer B äquilibriert. Nach der Proteinaufreinigung wurde das Resin mit 25 ml 1% (w/v) SDS und 25 ml 100 mM EDTA (pH 8,0) gewaschen. Danach wurde es mit mindestens 70 ml dH2O gespült. Gelagert wurde das Resin in 30% (v/v) Isopropanol. 2.2.17. Aufreinigung der GST-getaggten Proteine Die Aufreinigung der GST-getaggten Proteine erfolgte mittels BugBuster®GST-Bind™ Purification Kits (NOVAGEN) nach Angaben des Herstellers. Für die Aufreinigung wurden Zellpellets von 100 ml E. coli Expressionskultur verwendet. 2.2.18. Präparation der Dialyseschläuche Dialyseschläuche von ca. 20 cm Länge wurden zuerst für 10 min in 2% (w/v) NaHCO 3, 1 mM EDTA, pH 8,0 gekocht, gründlich mit dH2O gespült und erneut in 1 mM EDTA, pH 8,0 für weitere 10 min gekocht und anschließend in dH2O gewaschen. Gelagert wurden die so vorbereiteten Dialysemembranen in 1 mM EDTA, pH 8,0 bei 4°C. Unmittelbar vor der Dialyse wurden die Schläuche nochmals mit dH2O gewaschen. 52 Material und Methoden 2.2.19. Konzentrationsbestimmung von Proteinen Für die Konzentrationsbestimmung der Proteine wurde das BIO-RAD DC-Protein Assay nach Angaben des Herstellers benutzt. Für die Kalibrierung wurde BSA verwendet. 2.2.20. Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelekrophorese nach Laemmli (1970) [85] Die Gelelektrophorese wurde in der Mini-Elektrophoreseeinheiten (Plattengröße 10,0 × 8,0 cm) der Firma HOEFER oder in der Midi-Elektrophoresekammer (Plattengröße 20,0 × 10,0 cm) der Firma PEQ-LAB durchgeführt. Es wurden Trenngele in einer Konzentration von 10% bzw. 12% (w/v) Acrylamid und 5%ige Sammelgele verwendet. Die Proteinproben (Probenvolumen ca. 520 µl; Proteinmenge 2-10 µg je Probe) wurden vor dem Auftragen mit 2× oder 6× SDSLadepuffer (Endkonzentration 1×) und für 5 min bei 95°C hitzedenaturiert. Die Elektrophorese der Proteine erfolgte bei 80 V (Sammelgel) bzw. 100-120 V (Trenngel) in 1×Laufpuffer. Material: Acrylamidlösung (APPLICHEM): 29,3% (w/v) Acrylamid 0,7% (w/v) Bisacrylamid APS – Lösung: 10% (w/v) Ammoniumperoxidsulfat Trenngelpuffer: 1,5M Tris-HCl, pH 8,8 Sammelgelpuffer: 1,0M Tris-HCl, pH 6,8 2×SDS-Ladepuffer: 100 mM Tris-HCl, pH 6,8 200 mM Dithiothreitiol 4% (w/v) SDS 0,2% (w/v) Bromophenolblau 15,1 g Tris 5×Laufpuffer: 72 g Glycin 5 g SDS mit dH2O auf 1l auffüllen. Die Gellösungen wurden wie folgt zusammenpipettiert: 53 Material und Methoden Trenngel 10% [ml] 12%[ml] Sammelgel dH2O 4,0 3,3 dH2O 3,4 Acrylamidlösung 3,3 4,0 Acrylamidlösung 0,83 Trenngelpuffer 2,5 2,5 Sammelgelpuffer 0,63 10% (w/v) SDS 0,1 0,1 10% (w/v) SDS 0,05 10% (w/v) APS (frisch) TEMED 0,1 0,1 0,05 0,004 0,004 10% (w/v) APS (frisch) TEMED Gesamtvolumen 10 10 Gesamtvolumen 5%[ml] 0,005 5 2.2.21. Färbung der Proteine im Polyacrylamidgel Zur Visualisierung der Proteinbanden nach erfolgter elektrophoretischer Auftrennung wurden die Gele mit Commassie® Brillantblau gefärbt. Dazu wurden die Gele in Färbelösung für 30 min bis 1h unter leichten Schwenken bei RT inkubiert. Anschließend wurde der unspezifisch gebundene Farbstoff unter Anwendung der Entfärbelösung ü. N. ausgewaschen. Material: Färbelösung: Entfärbelösung: 42% (v/v) Methanol 17% (v/v) Essigsäure 0,1% (w/v) Commassie® Brillantblau G250 25% (v/v) Methanol 7% (v/v) Essigsäure 2.2.22. Western Blot Western - Transfer Nach der elektrophoretischen Auftrennung wurden die Proteine mittels eines Semi-dry- Blotters (PEQLAB) auf eine PVDF - Membran (ImmobilonTM-P, MILLIPORE) transferiert. Dazu wurden vier Lagen Blottingpapiers (Whatman, SCHLEICHER & SCHUELL) und die PVDF - Membran in Größe des Gels zugeschnitten. Die Membran wurde zuerst kurz in 100% (v/v) Methanol äquilibriert. Danach wurden die Membran und die Blottigpapierstücke in 1×Transferpuffer getränkt. Das Gel wurde bis zum Zusammenbau des Transfers ebenfalls in 1×Transferpuffer gelagert. 54 Material und Methoden Auf die Anodenplatte des Blotters wurden zuerst zwei Lagen des puffergetränkten Whatmanpapiers gelegt und die Membran darauf platziert. Auf die Membran wurde das Gel luftblasenfrei aufgelegt. Auf das Gel wurden zwei weitere Lagen Whatmanpapier aufgeschichtet. Das Blot wurde mit der Kathodenplatte verschlossen. Der Proteintransfer erfolgte für 1 bis 1,5 h bei 25V und 1,5 mA pro cm² Gelfläche. Material: 1×Transferpuffer: 200 ml 5×Laufpuffer (siehe 2.2.20) 200 ml 100 % (v/v) Methanol mit dH2O auf 1l auffüllen. Immunologischer Nachweis Die Membran wurde nach dem Transfer der Proteine in Blockierungslösung für 1h bei RT oder ü. N. bei 4°C blockiert. Danach wurde Membran für 1h bei RT mit dem primären Antikörper (Antikörper-Verdünnung nach Angaben des Herstellers in Blockierungslösung) inkubiert und anschließend 3 Mal für 10 min in 1×TBST gewaschen. Dann wurde die Membran für 0,5 bis 1h mit dem HRP - gekoppelten sekundären Antikörper (Antikörper-Verdünnung nach Angaben des Herstellers in Blockierungslösung) inkubiert und erneut 3 Mal für 10 min in 1×TBST gewaschen. Die Detektion wurde mit dem Kit: ECLplus-SystemTM (GE HEALTH CARE) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Material: 10×TBS: 24,3 g Tris 80,1 g NaCl mit dH2O auf 1l auffüllen; pH-Wert auf 7,6 mit HCl einstellen. 1×TBST: 100 ml 10×TBS 1 ml Tween 20 (Endkonzentration 0,1% (v/v)) mit dH2O auf 1l auffüllen. Blokierungslösung: 5% (w/v) Magermilchpulver in 1×TBST. 55 Material und Methoden Stripping und Reprobing der Membran Die Membran wurde für 30 min bei 55°C unter leichten Schwenken in Stripping – Puffer inkubiert und anschließend 3 Mal für 10 min in 1×TBST gewaschen. Danach wurde die Membran in der Blokierungslösung für 1h bei RT oder ü. N. bei 4°C blockiert. Anschließend wurden, wie zuvor beschrieben, die Antikörperinkubation und die Detektion der Membran durchgeführt. Material: Stripping-Puffer: 62,5mM Tris-HCl, pH 6,7 2% (w/v) SDS 100mM ß-Mercaptoethanol (frisch zugesetzt) 2.2.23. In-vitro Synthese des AI-2 Die in vitro Synthese von AI-2 wurde zuerst beschrieben von Schauder et al. (2001). Die für die Synthese benötigten Enzyme Pfs und LuxS wurden wie unter 2.2.14 beschrieben exprimiert und wie im Punkt 2.2.15 aufgereinigt. Nach der Aufreinigung wurden die Proteine mittels des Amicon Ultra – Konzentrators (Ausschlussgrenze 10 kDa, MILLIPORE) ca. 7-fach konzentriert und mithilfe der PD-10 Sephadex – Säulen (GE HEALTHCARE) gegen 50 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7,5 dialysiert. Die Konzentration der Proteine wurde wie unter 2.2.18. beschrieben, gemessen. Die in vitro Synthese-Reaktion wurde für 1 h bei 37°C durchgeführt. Der Reaktionsansatz enthielt 1 mM Substrat (S-Adenosyl-Homocystein, SIGMA), 10 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7,5) und je 1 mg/ml aufgereinigter Enzyme. Nach der Inkubation wurden die Reaktionsansätze mittels Biomax-5-Ultrafiltrationseinheiten (MILLIPORE) filtriert, um die Proteine von den Reaktionsprodukten zu entfernen. 2.2.24. Bestimmung der AI-2 Konzentration Die Konzentration des AI-2 nach der Synthese wurde indirekt durch Messung der Konzentration des Nebenprodukts Homocystein mittels Ellman´s Tests [44, 154] bestimmt. Dazu wurde aus dem Reaktionsansatz nach 15 Minuten Inkubation eine Probe abgenommen und 20 mit Ellman´s Puffer verdünnt. 200 µl der Verdünnung wurden mit 100 µl 56 Material und Methoden des Ellman´s Reagenz versetzt. Es folgte eine Absorptionsmessung bei 412 nm. Die Konzentration des in der Reaktion entstehenden 2-Nitro-5-Thiobenzoats (TBN) wurde anhand der Molarabsorptionskoeffizienten (14 150 M-1 cm-1) ermittelt. Material: Ellman´s Puffer: 100 mM Natrium-Phosphat pH 7,2 0,1 mM EDTA Ellman´s Reagenz: 5 mM 5,5´-Dithio-Bis-(2-Nitrobenzoesäure) - Lösung in Ellman´s Puffer 2.2.25. Fluoreszenzmessung der Bioassaykonstrukte Die Fluoreszenz der Bioassaykonstrukte wurde in Mikrotiterplatten mithilfe des Plattenreaders FluoStar Optima (BMG LABTECH) gemessen. Ein mit dem entsprechenden Konstrukt transformierter E. coli – Stamm wurde ü. N. bei 37°C bis OD600 von ca. 1,2 im AB – Medium kultiviert und mit frischem AB-Medium 1:100 verdünnt. Für eine Fluoreszenzmessung nach Zugabe von AI-2 oder AI-2-haltigen Proben wurden je 450 µl 1:100 verdünnter Kultur mit 50 µl Probe versetzt. In die Mikrotiterplatten wurden Aliquots von 200 µl pipettiert. Für gleiche Probe wurden immer mindestens zwei Aliquots pipettiert. Es wurde der Anstieg der Fluoreszenz im Zeitraum von 14 h gemessen. Während der Messung wurde die Platte bei 37°C unter Schütteln im Plattenreader inkubiert und die Fluoreszenz ca. alle 20 min gemessen. 2.2.26. Bestimmung der AI-2 Bindeaktivität der LuxP-Derivate Für die Bestimmung der LuxP-Aktivität wurde das jeweilige Mutantenprotein und als Referenz EGFP-VhLuxP wie unter 2.2.14 beschrieben exprimiert und aufgereinigt (2.2.15). Anschließend wurden die Proteine über Nacht gegen 50mM Tris-HCl, pH 8,5, 250mM NaCl Puffer dialysiert und mithilfe Von Amicon Ultra – Konzentratoren (Ausschlussgrenze 10 kDa oder 30 kDa, MILLIPORE) ca. 7-fach aufkonzentriert. Die Konzentration der Proteine wurde wie unter 2.2.18 beschrieben gemessen. Für den Test benötigtes AI-2 wurde wie unter 2.2.23 beschrieben in-vitro synthetisiert. 57 Material und Methoden Für die Titrierung des AI-2 mit Protein wurde ca. 340 µg/ml Protein und 1,32 µg/ml AI-2 in 50mM Tris-HCl, pH 8,5, 250mM NaCl, 0,1mM H3BO3 Puffer für 30 min bei 20°C inkubiert. Anschließend wurden die Ansätze mittels Biomax-5-Ultrafiltrationseinheiten (MILLIPORE) filtriert, um die Proteine mit dem gebundenen AI-2 von freiem AI-2 zu entfernen. 26,6 µl des Filtrats wurden mit ddH2O auf 50 µl verdünnt und für die Fluoreszenzmessung wie unter 2.2.25 beschrieben verwendet. Die durch die Proben aus der Titrierung mit jeweiligen Derivat induzierte Fluoreszenz wurde mit der Fluoreszenz nach der Induktion mit den Proben aus der Titrierung mit EGFG-VhLuxP in einer Messung verglichen. Die Aktivität eines Derivats wurde nach folgendem Schema berechnet: AktivitätDer. [%]= FluoreszenzEGFP-VhLuxP FluoreszenzDer. · 100 % 58 Ergebnisse 3. Ergebnisse 3.1. Herstellung der Escherichia coli luxS – Deletionsstämme 3.1.1. Herstellung der Gen-Knock-out-Kassette 3.1.1.1. Auf der Grundlage Herstellung eines neues Helfer-Plasmids mit Zeocin-Resistenz des von Datsenko & Wanner [31] publizierten Geninaktivationsverfahren sollte ein E. coli luxS-Deletionsstamm erzeugt werden. Trotz mehrerer Versuche konnten keine Deletionsmutanten mit dem zu Verfügung stehenden pKD3 Helfer-Plasmid erzeugt werden. Die Selektion der Transformanden auf chloramphenicolhaltigen LB-Platten war nicht möglich, da diese als Rasen wuchsen. Wurden aus diesem Rasen einzelne Kolonien gepickt, konnten diese im LB-Medium mit Chloramphenicol nicht kultiviert werden. Es war deswegen notwendig, ein neues Helfer-Plasmid zu entwickeln, das eine Resistenz gegen ein toxisches und nicht bakteriostatisches Antibiotikum (Chloramphenicol) vermittelt. Als Resistenzmarker wurde das Bleomycinresistenzgen [16] gewählt. Es vermittelt unter anderem die Resistenz gegen Zeocin. Für die Konstruktion des Helfer-Plasmids wurden mittels PCR drei Fragmente amplifiziert. Das erste Fragment (OEP1, 165 bp) wurde mithilfe der Primer Kas1for und Kas1rev sowie des Plasmids pKD3 als Template amplifiziert und enthält die P1/FRT Stellen. Das zweite Fragment (OEP2-zeo, 415 bp) wurde mithilfe der Primer Kas2forzeo/Kas2revzeo und des Plasmids pPICZ B als Template amplifiziert. Es enthält das Bleomycinresistenzgen. Das dritte Fragment (OEP3, 320 bp) wurde mithilfe der Kas3for/Kas3rev Primer und des Plasmids pKD3 amplifiziert und enthält die FRT/P2 Stellen (Abbildung 1-12). Mittels overlap-extension-PCR (2.2.6) wurden zuerst die Fragmente OEP1 und OEP2-zeo miteinander fusioniert. In einem weiteren OEP-Schritt wurde anschließend das Fragment OEP3 hinzugefügt. Das so erzeugter DNA-Fragment (Abbildung 3-1) wurde über die Restriktionstellen BamHI und KpnI in die MCS des Klonierungvektors pUC18 integriert. Das aus der Klonierung resultierende Plasmid (pUCzeo) wurde nach der Sequenzierung für die Herstellung der GenKnock-out-Kassette benutzt. 59 Ergebnisse P1 OEP2-zeo OEP3 ble FRT FRT P2 KpnI BamHI OEP1 820 bp Abbildung 3-1: Schematische Darstellung des OEP-Produktes zur Klonierung des KO-Helfer-Plasmids. Die DNA-Fragmente OEP1, OEP2-zeo und OEP3 wurden in zwei overlap-extension PCR Schritten zu einem Fragment fusioniert. Das Fragment enthält die Erkennungssequenzen für Endonukleasen BamHI sowie KpnI. P1/P2 – Primerbindestellen FRT – Erkennungssequenzen der FLP-Rekombinase ble – Bleomycin-Resistenzgen 3.1.1.2. Amplifizierung der Gen-KO-Kassette Die Herstellung der Gen-Knock-out-Kassette erfolgte in zwei PCR-Schritten. Zuerst wurde mithilfe der Primer KOfornew und KOrevnew ein Fragment erzeugt, das 36-nt Homologie zu dem das luxS-Gen flankierenden Bereich auf dem E. coli Chromosom aufweist. In zweiten PCRSchritt wurde mittels Primer KO+14for/KO+14rev die homologe Sequenz auf 50-nt verlängert. 3.1.1.3. Transformation mit der Gen-KO-Kassette und Analyse positiver Klone Die Eliminierung des luxS-Gens sollte in drei E. coli Stämmen durchgeführt werden: E. coli HMS174(DE3) und E. coli BL21(DE3) - für die Expression der Rezeptorproteine, sowie E. coli TOP10F´, - für die Entwicklung des AI-2 Bioassays. Alle drei Stämme wurden wie unter 2.2.12 beschrieben vorbereitet und mit der Gen-KO-Kassette transformiert. Zeocinresistente Transformanden wurden gepickt und auf die Integration der Gen-KO-Kassette analysiert. Für die Analyse der KO-Mutanten wurde zuerst eine PCR mit dem Primerpaar testemrR/RKOkontr durchgeführt. Es ergeben sich PCR-Produkte mit einer Größe von 820 bp bei positiven Klonen und 794 bp bei negativen Klonen. Da diese in einem Agarose-Gel kaum unterschieden werden können, wurden die PCR-Produkte anschließend mit der Restriktionsendonuklease ClaI verdaut. Die ClaI-Schnittstelle ist bei Knock-out Mutanten im PCR-Produkt nicht mehr vorhanden, somit kann es nicht verdaut werden. Die Ergebnisse der PCR-Analyse sowie des ClaI-Verdaus sind im Anhang (Abbildung A-1 sowie Abbildung A-2) gezeigt. Es konnten drei positive Knock-out Mutanten des Stammes HMS174(DE3) gefunden werden. Bei dem Stamm TOP10F´ wurde ein Klon positiv analysiert und bei dem Stamm BL21(DE3) elf Klone. 60 Ergebnisse Für eine Bestätigung des erfolgreichen Gen-Knock-outs wurde eine Southern-Blot Analyse durchgeführt. Für diesen Zweck wurden zwei DIG-markierte DNA-Sonden hergestellt: die ClaI Sonde mittels der Primer SondClaIfor/SondClaIrev und die EcoRV Sonde mittels der Primer SondEcoRVfor/SondEcoRVrev. Als Template wurde die genomische DNA von E. coli HMS174(DE3) verwendet. Die genomische DNA der einzelnen Klone wurde sowohl mit dem Restriktionsenzym EcoRV als auch mit ClaI verdaut, elektrophoretisch aufgetrennt und auf eine Nylonmembran transferiert. Die Membran wurde anschließend mit ClaI-Sonde oder EcoRV-Sonde hybridysiert. Die gebundenen Sonden wurden mithilfe der Anti-DIG-Antikörper detektiert. In der Abbildung 3-2 wurden die Bindestellen der beiden Sonden in genomischen DNA dargestellt. In der wt-DNA bindet die ClaI-Sonde an ein Fragment der Größe 7017 bp, die EcoRV-Sonde an ein 1925 bp großes Fragment. Durch das Ersetzen des luxS-Gens durch ble kommt es zum Verlust der ClaI und EcoRV Schnittstellen innerhalb des luxS. Die Sonden binden dann entsprechend an Fragmente der Größe 16385 bp (ClaI-Sonde) und 3651 bp (EcoRVSonde). A: Wild-type EcoRV ClaI EcoRV ClaI emrB ClaI-Sonde luxS EcoRV ClaI gshA EcoRV-Sonde 7017 bp 1928 bp B: luxS::ble ClaI EcoRV EcoRV emrB ClaI-Sonde ble ClaI gshA EcoRV-Sonde 16385 bp 3651 bp Abbildung 3-2: Schematische Darstellung der genomischen DNA von E. coli. A- wild-type, B – nach Knock-out des luxSGens. Bindestellen der Sonden sind gekennzeichnet. Bei dem wt-Stamm bindet die ClaI-Sonde an Fragment von 7017 bp, die EcoRV-Sonde an ein 1925 bp. Nach dem erfolgten Knock-out sind die ClaI sowie EcoRV Schnittstellen aus dem luxS-Gen nicht mehr vorhanden. Die Sonden binden dann entsprechend an Fragmente der Größe 16385 bp (ClaI-Sonde) und 3651 bp (EcoRV-Sonde). 61 Ergebnisse Die Ergebnisse des immunologischen Nachweises sind in der Abbildung 3-3 sowie in der Abbildung 3-4 dargestellt. Bei den Knock-out Mutanten des E. coli Stammes HMS174(DE3) (Abbildung 3-3) konnte mit der EcoRV-Sonde eine Bande mit 3651 bp nachgewiesen werden. Mit der ClaI-Sonde konnte nur eine schwache Bande detektiert werden, die aber eindeutig die erwartete Größe von 16385 bp aufweist. Somit konnte bewiesen werden, dass alle drei untersuchten Klone kein luxS-Gen mehr enthalten und stattdessen das Bleomycin-Resistenzgen tragen. Bei den E. coli Stämmen TOP10F´und BL21(DE3) konnten sowohl mit der EcoRV-Sonde als auch mit der ClaI-Sonde eindeutige Signale nachgewiesen werden (Abbildung 3-4). Mit der EcoRV-Sonde konnte eine klare Bande in Größe von 3651 bp detektiert werden. Mit der ClaISonde wurden neben der 16358 bp-Bande auch größere Banden detektiert, was auf einen partiellen Verdau der genomischen DNA hinweist. Trotzdem ist der Beweis des Knock-outs des luxS-Genes bei allen untersuchten Mutanten eindeutig. Von jedem Stamm wurde ein Klon ausgesucht und für das weitere Vorgehen ausgewählt. Die Klone wurden zuerst auf Verlust des Plasmids pKD46 untersucht (2.2.12). Die so erzeugten Stämme wurden entsprechend KIH1 (HMS173(DE3) luxS::ble), KIT1 (TOP10F´luxS::ble) und KIB1 (BL21(DE3) luxS::ble) genannt. 3.1.1. Eliminierung der Bleomycin-Resistenz Das Bleomycin-Resistenzgen wird in den neu erzeugten E. coli Stämmen KIH1, KIT1 und KIB1 von Erkennungssequenzen der FLP-Rekombinase (FRT) flankiert. Das ermöglicht die Eliminierung von ble. Dazu wurden die E. coli-Zellen entsprechend elektrokompetent gemacht und mit dem Helferplasmid pCP20 transformiert (2.2.12). Anschließend wurden die Stämme auf Verlust der Ampicillin- sowie Bleomycin-Resistenz überprüft. Sowohl für den E. coli Stamm KIH1 als auch KIT1 konnten Transformanden gefunden werden, die keine Ampicillin- und Bleomycin-Resistenz besaßen. Diese wurden entsprechend E. coli KIH2 und E. coli KIT2 genannt. Für die Verwendung bei der Expression der LuxP-Proteine wurden die E. coli Stämme KIH2 und KIB1 mit dem Plasmid pLysS transformiert. Die daraus erfolgten Transformanden wurden E. coli KIH3 und E. coli KIB2 genannt. Die Transformation des E. coli Stammes KIB1 mit dem Helferplasmid pCP20 ergab, trotz mehrerer Versuche, keine Klone ohne Bleomycin-Resistenz. Da die Eliminierung der Bleomycin62 Ergebnisse Resistenz für die weitere Verwendung des Stammes nicht unbedingt erforderlich ist, wurde der Stamm KIB1 weiter benutzt. 21226 Kl. 23 #2 Kl. 23 #1 Kl. 10 #2 Kl. 10 #1 Kl. 3 #2 Kl. 3 #1 WT #2 WT #1 Genomische DNA verdaut mit ClaI und hybridisiert mit ClaI-Sonde Kl. 23 #2 Marker Kl. 23 #1 Kl. 10 #2 Kl. 10 #1 Kl. 3 #2 Kl. 3 #1 WT #2 WT #1 Genomische DNA verdaut mit EcoRV und hybridisiert mit EcoRV-Sonde 16385 bp 7017 bp 5148 4268 3651 bp 2027 1904 1928 bp 1584 1373 947 Abbildung 3-3: Southern-Blot Analyse der Knock-out Mutanten des Stammes HMS174(DE3). Die genomische DNA wurde mit EcoRV (links) oder mit ClaI (rechts) verdaut, elektrophoretisch aufgetrennt, geblottet und mit der entsprechenden Sonde hybridisiert. Es wurde entsprechend 2 µg (#1) oder 4 µg (#2) DNA für den Verdau eingesetzt. WT – Wildtyp DNA des E. coli Stammes HMS174(DE3) Kl. 3/ Kl. 10 / Kl. 23 – analysierte Klone. Marker - /HindIII+EcoRI. Bei dem wt-Stamm konnten Banden in Größe 1928 bp (EcoRV) und 7017 bp (ClaI) nachgewiesen werden. Bei den KO-Mutanten wurden mit der EcoRV-Sonde Banden mit einer Größe von 3651 bp nachgewiesen. Mit der ClaI-Sonde konnte bei den KOMutanten eine schwache Bande von 16385 bp nachgewiesen werden. 63 Ergebnisse 21266 5148 4268 3530 2027 Nicht markierte Sonde BL21(DE3) Kl. 10 TOP10 Kl. 2 BL21(DE3) Kl. 3 BL21(DE3) Kl. 5 BL21(DE3) HMS 174(DE3) Genomische DNA verdaut mit ClaI und hybridisiert mit ClaI-Sonde Marker BL21(DE3) Kl. 5 BL21(DE3) Kl. 10 Nicht markierte Sonde BL21(DE3) Kl. 3 TOP10 Kl. 2 BL21(DE3) HMS 174(DE3) Genomische DNA verdaut mit EcoRV und hybridisiert mit EcoRV-Sonde 16385 bp 7017 bp 3651 bp 1928 bp 1904 1584 1375 947 831 Abbildung 3-4: Southern-Blot Analyse der Knock-out Mutanten der Stämme TOP10F´und BL21(DE3). Die genomische DNA wurde mit EcoRV (links) oder mit ClaI (rechts) verdaut, elektrophoretisch aufgetrennt, geblottet und mit der entsprechenden Sonde hybridisiert. Für den Verdau wurden 4 µg DNA eingesetzt. HMS174(DE3) – Wildtyp DNA des E. coli Stammes HMS174(DE3) BL21(DE3) – Wildtyp DNA des E. coli Stammes BL21(DE3) TOP10 Kl. 2 / BL21(DE3) Kl.5 /BL21(DE3) Kl. 10 - analysierte Klone. Marker - /HindIII+EcoRI. Bei den wt-Stämmen konnten Banden von 1928 bp (EcoRV) und 7017 bp (ClaI) nachgewiesen werden. Bei den KO-Mutanten wurden mit der EcoRV-Sonde Banden mit einer Größe von 3651 bp und mit der ClaI-Sonde von 16385 bp nachgewiesen. 64 Ergebnisse 3.2. Klonierung, heterologe Expression und Aufreinigung der LuxPRezeptorproteine 3.2.1. Vibrio harveyi LuxP - Fusionsproteine Die Analyse der Kristallstruktur des Vibrio harveyi LuxP-Proteins ergab, dass sowohl der NTerminus als auch der C-Terminus frei liegen und an der Bindung des AI-2 nicht teilnehmen [22]. Somit können beide Termini durch Fusionen verschiedener Funktionsdomänen modifiziert werden. Die für die Expression in E. coli kreierten Konstrukte wurden in der Abbildung 3-5 dargestellt. 23 VhLuxP (aa 24-365) VhLuxP (aa 22-365) 6 His 6 His VhLuxP (aa 24-365) 6 His VhLuxP (aa 24-365) 6 His VhLuxP (aa 24-365) EGFP 6 His VhLuxP (aa 24-365) R16 6 His VhLuxP (aa 24-365) DE16 EGFP GST 6 His VhLuxP (aa 24-365) Abbildung 3-5: Schematische Darstellung heterolog in E. coli synthetisierter VhLuxP-Konstrukte. Die für die abgebildeten Fusionsproteine kodierenden Leseraster wurden in den Vektor pET23b kloniert. Die heterologe Expression erfolgte in E. coli BL21(DE3) pLysS, HMS174(DE3) pLysS, KIB2 oder KIH3. 23- Signalsequenz des maturen VhLuxP; 23 aa, 2,4 kDa 6 His – Histidin-Hexapeptid (His6-Tag); 6 aa, 0,8 kDa EGFP – enhanced green fluorescent protein; 239 aa, 27 kDa R16 – Arginin-Hexadecapeptid; 16 aa, 2,5 kDa DE16- (Aspartat/Glutamat) – Hexadecapeptid; 16 aa, 2 kDa GST – Glutation-S-Transferase, 220 aa, 25,7 kDa 65 Ergebnisse 3.2.1.1. V. harveyi LuxP mit Signalsequenz (VhLuxP) Der für das VhLuxP(aa 1-365) Protein kodierende Leserahmen ohne Stoppcodon wurde mit den Primern fluxPNheI und rluxPXhoI sowie des Plasmids pET17luxP amplifiziert, über die Restriktionstellen NdeI und BamHI in die MCS des Expressionsvektors pET23b integriert und somit mit dem auf dem Vektor vorhandenen Leserahmen für den His6-Tag fusioniert. Das aus der Klonierung resultierende Plasmid (pETVhluxP) wurde sequenziert und für die Expression des VhLuxP-Proteins in E. coli verwendet. Das VhLuxP ist ein 376 aa umfassendes Protein mit einem theoretischen Molekulargewicht von 42,8 kDa, in dem die Primärstrukturen von LuxP und His6-Tag durch die von der XhoI-Restriktionsstelle des Vektor kodierte Leu-Glu-Sequenz getrennt sind. Die Expression des VhLuxP erfolgte nach der Zugabe von 0,4 mM IPTG zu einer exponentiell wachsender E. coli Kultur. Nach dieser Induktion wurden in angemessenen Abständen Proben entnommen, um so die Expression des Proteins während der Kultivierung beobachten zu können. Die maximale Expressionsdauer betrug ca. 16 h (ü. N.). Die Expressionsanalyse des Proteins wurde für E. coli Stämme HMS174(DE3) pLysS, KIH3, BL21(DE3) pLysS sowie KIB2 durchgeführt. Die Ergebnisse der Expressionsanalyse von VhLuxP in E. coli HMS174(DE3) pLysS sowie in dem luxS-Knock-out Stamm KIH3 wurden in der Abbildung 3-6 dargestellt. Sowohl in der Commassie-Blau Färbung als auch in der anti-tetra-His Westernblotanalyse kann man eine prominente Doppelbande in der Größe von ca. 40 kDa erkennen. Derartige VhLuxP Doppelbande konnte auch von Neiditch et al., 2005 [118] beobachtet werden. Ein Teil des in E. coli exprimierten VhLuxP Proteins unterliegt höchstwahrscheinlich Modifizierung, was in zwei nahe beieinander migrierende Banden in SDS-PAGE resultiert. Das maximale Expressionsniveau kann bereits nach einer Expressionsdauer von 2 – 3 h erreicht werden. Die Synthese von VhLuxP scheint im Falle des Stammes KIH3 etwas geringfügiger auszufallen, als die Expression in Stamm HMS174(DE3) pLysS. Die Ergebnisse der Expressionsanalyse von VhLuxP in dem E. coli Stamm BL21(DE3) pLysS sowie dem Knock-out Stamm KIB2 wurden in der Abbildung 3-7 sowie in der Abbildung 3-8 dargestellt. In E. coli BL21(DE3) pLysS wird das VhLuxP sehr stark exprimiert. Sowohl in der Commassie-Blau Färbung als in der anti-tetra-his Westernblotanalyse kann man die prominente 40 kDa Doppelbande erkennen. Bei der Expression von VhLuxP in E. coli KIB2 ist das Expressionslevel deutlich niedriger, die dem Protein entsprechende Bande ist jedoch sowohl in 66 Ergebnisse der Commassie-Blau Färbung klar erkennbar als auch in der Westernblotanalyse deutlich nachweisbar. Auch hier kann das Maximum der Proteinsynthese bereits 2-3 h nach der BSA (2µg) ü. N. 4h 3h 2h 1h Induktion VhLuxP / KIH3 Marker ü. N. 4h 3h 2h 1h VhLuxP / HMS174(DE3) pLysS Induktion HMS174(DE3) pLysS Induktion erreicht werden. ~110 ~79 ~60 ~47 ~35 ~25 A ~110 ~79 ~60 ~47 ~35 ~25 B Abbildung 3-6: Expressionsanalyse des VhLuxP in E. coli HMS174(DE3) pLysS sowie E. coli KIH3. Die E. coli Stämme HMS174(DE3) pLysS und KIH3 wurden mit dem VhLuxP kodierenden Plasmid pETVhluxP transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG zu der Kultur wurde die Expression des VhLuxP induziert. Die Probenentnahme erfolgte bei der Induktion, nach 1, 2, 3 bzw. 4 h sowie nach der Kultivierung ü. N.. Die Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli HMS174(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Zur Einschätzung des Expressionsniveau wurde auf die Gele 2 µg BSA aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde BenchMark prestained (INVITROGEN) verwendet. 67 ü. N. 4h 3h 2h 1h Induktion ü. N. EGFP-VhLuxP 4h 3h 2h 1h Induktion ü. N. VhLuxP 21 4h 3h 2h 1h VhLuxP Induktion BL21(DE3) pLysS Marker Ergebnisse ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 A ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 B Abbildung 3-7: Expressionsanalyse von VhLuxP, VhLuxP 21 sowie EGFP-VhLuxP in E. coli BL21(DE3) pLysS Der E. coli Stamm BL21(DE3) pLysS wurde entsprechend mit dem VhLuxP kodierenden Plasmid pETVhluxP, mit dem VhLuxP 21 kodierenden Plasmid pETVhluxP 21 oder mit dem EGFP-VhLuxP kodierenden Plasmid pETegfp-VhluxP transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG zu der Kultur wurde die Expression der Proteine induziert. Die Probenentnahme erfolgte bei der Induktion, nach 1, 2, 3 bzw. 4 h sowie nach der Kultivierung ü. N.. Die Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (FERMENTAS) verwendet. Um Erkenntnisse über die Löslichkeit des VhLuxP Proteins zu gewinnen, aber auch um ein sauberes, für weitere Untersuchungen und Anwendungen geeignetes Protein herzustellen, wurde eine Aufreinigung mittels Metallionenaffinitätschromatografie (Punkt 2.2.15) vorgenommen. Nach der Induktion der Expression bei einer OD 600 von ca. 0,4 wurden die E. coli Zellen für 3 h bei 30°C kultiviert, anschließend geerntet und im Puffer B aufgenommen. Der Zellaufschluss erfolgte über Zugabe von Lysozym und Ultraschallbehandlung. Das Gesamtlysat wurde im darauf folgenden Zentrifugationsschritt in lösliche (Klarlysat) und unlösliche Proteine 68 Ergebnisse aufgetrennt. Das Klarlysat wurde auf eine Ni2+-IDA-Sepharosesäule aufgetragen, wobei die Proteine, die keine Metallionenaffinität aufwiesen, im Durchfluss blieben. Nach mehreren ü. N. 4h 3h 2h 1h Induktion ü. N. EGFP-VhLuxP 4h 3h 1h Induktion ü. N. 4h 3h 2h 1h 2h VhLuxP 21 VhLuxP Induktion BL21(DE3) pLysS Marker Waschschritten wurde das VhLuxP Protein mittels Puffer E eluiert. ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 A ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 B Abbildung 3-8: Expressionsanalyse von VhLuxP, VhLuxP 21 sowie EGFP-VhLuxP in E. coli KIB2. Der E. coli Stamm KIB2 wurde entsprechend mit dem VhLuxP kodierenden Plasmid pETVhluxP, mit dem VhLuxP 21 kodierenden Plasmid pETVhluxP 21 oder mit dem EGFP-VhLuxP kodierenden Plasmid pETegfp-VhluxP transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG zu der Kultur wurde die Expression der Proteine induziert. Die Probenentnahme erfolgte bei der Induktion, nach 1, 2, 3 bzw. 4 h sowie nach der Kultivierung ü. N.. Die Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde PageRule Plus Prestained Protein Ladder (FERMENTAS) verwendet. Die Ergebnisse einer Aufreinigung des VhLuxP aus E. coli BL21(DE3) pLysS wurden in der Abbildung 3-9 dargestellt. Die dem Protein entsprechende ca. 40 kDa große Bande ist in allen Faktionen der Aufreinigung gut zu erkennen. Aus der im Gesamtlysat vorhandenen Menge des Proteins ist nur ein kleiner Teil löslich. Der Hauptanteil des exprimierten Proteins ist unlöslich und kann für die Aufreinigung unter nativen Bedingungen nicht verwendet werden. Im Klarlysat 69 Ergebnisse ist jedoch genug des VhLuxP Proteins vorhanden, um es aufreinigen zu können. Im Eluat konnte eine klare VhLuxP Doppelbande detektiert werden. Das VhLuxP wies keine lange Lagerstabilität auf. Bereits nach einer Lagerung von 24h bei 4°C konnten in der Proteinlösung Aggregate beobachtet werden. Diese Aggregate konnten nur unter denaturierenden Bedingungen (6 M Guanidin-Hydrochlorid oder 8 M Harnstoff) in Lösung überführt werden. BSA (2 µg) BL21(DE3) pLysS Eluat Durchfluss Unlösliche Proteine Gesamtlysat Marker Eluat Durchfluss Unlösliche Proteine Klarlysat Gesamtlysat Klarlysat VhLuxP 23 VhLuxP ~123 ~77 ~42 ~30 ~25 24 A ~123 ~77 ~42 ~30 ~25 B Abbildung 3-9: Aufreinigung der Proteine VhLuxP und VhLuxP 23 aus E. coli BL21(DE3) pLysS. Der E. coli Stamm BL21(DE3) pLysS wurde entsprechend mit dem VhLuxP kodierenden Plasmid pETVhluxP oder mit dem VhLuxP 23 kodierenden Plasmid pETVhluxP 23 transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Nach der Induktion der Expression durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG wurde die Kultivierung für 3 h fortgesetzt. Danach wurden die Zellen geerntet, in Puffer B (2.2.15) aufgenommen und aufgeschlossen (Gesamtlysat). Durch die Zentrifugation wurde das lösliche 2+ Klarlysat von den unlöslichen Proteinen getrennt. Das Klarlysat wurde auf eine Ni -IDA-Sepharose-Säule aufgetragen, wobei das nicht angebundene Material (Durchfluss) aufgefangen wurde. Nach mehreren Waschschritten erfolgte die Elution mit Puffer E (Eluat). Alle Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Zur Einschätzung der Proteinmenge wurde auf die Gele 2 µg BSA aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde Roti-Mark prestained (ROTH) verwendet. 3.2.1.2. V. harveyi LuxP ohne Sinalsequenz Das LuxP-Protein wird in V. harveyi in Cytoplasma synthetisiert und anschließend in das Periplasma transportiert, wobei die Signalsequenz des Proteins abgeschnitten wird. Die Länge 70 Ergebnisse der Signalsequenz konnte nicht eindeutig bestimmt werden, es handelt sich entweder um aa 123 [22] oder um aa 1-21 [118]. Diese Signalsequenz weist nur geringe Homologie mit der Signalsequenz auf, die bei E. coli den Transport ins Preriplasma gewährleistet, und wird aus diesem Grund in E. coli höchstwahrscheinlich nicht erkannt. Um das V. harveyi LuxP in der Form zu exprimieren, in der es in Periplasma vorkommt, wurden zwei Konstrukte ohne Signalsequenz kloniert: VhLuxP 21 (aa 22-365) und VhLuxP 23 (aa 24-365). 3.2.1.2.1. V. harveyi LuxP(aa 22-365) (VhLuxP 21) Die Klonierung des VhLuxP 21 Proteins erfolgte durch die Amplifizierung des kodierenden Leserahmens (aa 22-365, ohne Stoppcodon) mittels Primer pluxPdel21NdeI und rluxPXhoI sowie des Plasmids pET17luxP und die Integration durch die Restrtiktionsstellen NdeI und XhoI in die MCS des Vektors pET23b. Die resultierenden Klone (pETVhluxP 21) wurden nach der Sequenzierung des integrierten Leserasters für die Expression des VhLuxP 21 Proteins in E. coli verwendet. Das heterologe VhLuxP 21 Protein enthält, wie bei dem VhLuxP, einen aus dem Vektor stammenden His6-Tag, der von der LuxP Domäne durch Leu-Glu-Sequenz getrennt ist. Das Protein umfasst 355 aa und hat eine theoretische Größe von 40,6 kDa. Die Expression des VhLuxP 21 Proteins erfolgte durch die Zugabe von 0,4 MM IPTG zu einer exponentiell wachsenden E. coli Kultur. Die Expressionsanalyse von VhLuxP 21 wurde für E. coli Stämme HMS174(DE3) pLysS, KIH3, BL21(DE3) pLysS sowie KIB2 durchgeführt. Die Ergebnisse der Expressionsanalyse von VhLuxP 21 in E. coli BL21(DE3) pLysS sowie dem Knock-out Stamm KIB2 wurden in der Abbildung 3-7 sowie in der Abbildung 3-8 dargestellt. In beiden Stämmen kann das Protein überexprimiert werden, was an der prominenten Doppelbande in Größe von etwa 40 kDa in der Commassie-Blau Färbung (A) und dem starken Signal bei der anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) deutlich zu erkennen ist. Das Maximum der Proteinsyntheserate wird nach einer Expressionsdauer von etwa 3-4 h erreicht. Expression von VhLuxP 21 in E. coli HMS174(DE3) pLysS sowie E. coli KIH3 konnte ebenfalls erfolgreich durchgeführt werden (Ergebnisse sehe Anhang, Abbildung A-3). Die Expressionsrate im Knock-out Stamm KIH3 übersteigt die im Stamm HMS174(DE3). Für die Aufreinigung von VhLuxP 21 wurde das Protein in Knock-out Stämme KIB2 sowie KIH3 exprimiert. So konnte gewährleistet werden, dass das synthetisierte VhLuxP 21 nicht bereits mit AI-2 beladen war. Die Ergebnisse der Aufreinigung aus E. coli KIB2 wurden in der Abbildung 3-10 dargestellt. Auch dieses Protein ist zum Großteil unlöslich und somit für die 71 Ergebnisse Aufreinigung in der nativen Form nicht verfügbar. Das Klarlysat enthält jedoch genug von löslichem VhLuxP 21 um es erfolgreich zu reinigen. Im Eluat kann man eine saubere VhLuxP 21-Doppelbande erkennen. Das Protein wurde anschließend gegen 50 mM Tris-HCl, pH 8,5, 250 mM NaCl – Puffer dialysiert. Dadurch konnte das im Elutionspuffer vorhandene Imidazol entfernt werden, was eine positive Auswirkung auf die Lagerstabilität des Proteins hat. Die Lagerstabilität des VhLuxP 21 Proteins konnte durch diesen Dialyseschritt zwar etwas verbessert werden, nach wenigen Tagen konnten jedoch die Bildung von Proteinaggregaten beobachtet werden. BSA (5 µg) BSA (2,5 µg) Eluat dialysiert Eluat Durchfluss Unlösliche Proteine Klarlysat Gesamtlysat BL21(DE3) pLysS Marker VhLuxP 21 ~70 ~55 ~35 ~27 A ~70 ~55 ~35 ~27 B Abbildung 3-10: Aufreinigung von VhLuxP 21 aus E. coli KIB2. Der E. coli Stamm KIB2 wurde mit dem VhLuxP 21 kodierenden Plasmid pETVhluxP 21 transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Nach der Induktion der Expression durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG wurde die Kultivierung für 3 h fortgesetzt. Danach wurden die Zellen geerntet, in Puffer B (2.2.15) aufgenommen und aufgeschlossen (Gesamtlysat). Durch 2+ die Zentrifugation wurde das lösliche Klarlysat von den unlöslichen Proteinen getrennt. Das Klarlysat wurde auf eine Ni -IDASepharose-Säule aufgetragen, wobei das nicht angebundene Material (Durchfluss) aufgefangen wurde. Nach mehreren Waschschritten erfolgte die Elution mit Puffer E (Eluat). Das Eluat wurde gegen 50 mM Tris-HCl, pH 8,5, 250 mM NaCl dialysiert. Alle Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Zur Einschätzung der Proteinmenge wurde auf die Gele 2,5 und 5 µg BSA aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (FERMENTAS) verwendet. 72 Ergebnisse Auch bei der Expression von VhLuxP 21 in E. coli KIH3 befindet sich das Protein hauptsächlich in der unlöslichen Fraktion (Anhang, Abbildung A-4). Das in dem Klarlysat vorhandene VhLuxP 21 konnte aber erfolgreich gewonnen werden. 3.2.1.2.2. V. harveyi LuxP(aa 24-365) (VhLuxP 23) Mittels Primer fluxPdel23NheI und rluxPXhoI und des Plasmids pET17luxP wurde der VhluxP 23 kodierende Leserahmen (aa 24-365, ohne Stoppcodons) amplifiziert und über die Restriktionsstellen NheI und XhoI in die MCS des Expressionsvektors pET23b integriert. Das aus dieser Klonierung resultierende Plasmid (pETVhluxP 23) wurde mittels Sequenzierung auf die korrekte Integration des Leserasters überprüft und für die Expression des VhluxP 23 Proteins in E. coli verwendet. Das heterologe VhLuxP 23 hat einen C-terminalen, von dem Expressionsvektor stammenden His6-tag, der von dem LuxP-Teil von einer Leu-Glu-Sequenz getrennt ist. Das Protein umfasst 352 aa und hat ein theoretisches Molekulargewicht von 40,4 kDa. Die Expression des VhLuxP 23 Proteins erfolgte durch die Zugabe von 0,4 µM IPTG zu einer exponentiell wachsenden E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur. Die Ergebnisse der Expressionsanalyse stellt die Abbildung 3-11 dar. Die ca. 40 kDa große, VhLuxP 23 entsprechende Proteinbande ist sowohl in der Commassie-Blau-Färbung (A) als auch in der Tetra-His-Westernblotanalyse (B) klar zu erkennen. Das Maximum des Expressionsniveaus kann bereits nach ca. 2 h erreicht werden. Das VhLuxP 23 Protein wurde ebenfalls auf die Löslichkeit überprüft (Abbildung 3-11). Die Zellen nach der Expression ü. N. wurden in Puffer B mittels Ultraschall aufgeschlossen. Das so entstandene Gesamtlysat wurde anschließend bei 15000×g abzentrifugiert, wobei die löslichen Proteine in Überstand (Klarlysat) bleiben und die unlöslichen als Pellet ausfallen. Bei diesem Zellaufschluss konnte nur ein geringfügiger Teil des VhLuxP 23 Proteins ins Klarlysat überführt werden. Es konnte daher angenommen werden, dass bei einer Expressionsdauer von 16 h (Kultivierung ü. N.) VhLuxP 23 in der E. coli Zellen fast ausschließlich inclusion bodys bildet. Trotz schlechter Löslichkeitseigenschaften wurde ein Reinigungsversuch des VhLuxP 23 vorgenommen (Abbildung 3-9). Die E. coli Zellen wurden bei 30°C bis OD600 von ca. 0,4 angezogen, mit IPTG induziert und für weitere 3h bei 30°C kultiviert und anschließend geerntet. Der Zellaufschluss erfolgte über die Zugabe von Lysozym und Ultraschall. Das im Gesamtlysat vorhandene VhLuxP 23 Protein konnte unter diesen Bedingungen partiell in das Klarlysat 73 Ergebnisse überführt und für die Ni2+-Affinitätschromatographie benutzt werden. Das im Klarlysat vorhandene Protein konnte erfolgreich aufgereinigt werden, auch wenn im Eluat noch wenige Verunreinigungen vorhanden sind. Ähnlich wie die Proteine VhLuxP und VhLuxP 21 wies das VhLuxP 23 keine lange Klarlysat Gesamtlysat ü. N. 3,5 h 2h 1h VhLuxP 23 Induktion BL21(DE3) pLysS Marker Lagerstabilität aus. Die Proteinaggregate konnten bereits nach 24h beobachtet werden. ~116 ~97 ~66 ~56 ~43 ~35 ~27 A ~79 ~60 ~47 ~35 ~25 B Abbildung 3-11: Analyse der Expression sowie Löslichkeit von VhLuxP 23 in E. coli BL21(DE3) pLysS. Der E. coli Stamm BL21(DE3) pLysS wurde mit dem VhLuxP 23 kodierenden Plasmid pETVhluxP 23 transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG zu der Kultur wurde die Expression der Proteine induziert. Die Probenentnahme erfolgte bei der Induktion, nach 1, 2 bzw. 3,5 h sowie nach der Kultivierung ü. N.. Die Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Um die Löslichkeit des Proteins zu überprüfen wurden die ü. N. kultivierte Zellen in Puffer B aufgeschlossen (2.2.15) (Gesamtlysat) und die löslichen Proteine (Klarlysat) von den unlöslichen mittels Zentrifugation getrennt. Als Molekulargewichtstandard wurde Broad Range Protein Marker (NEB) (A) sowie BenchMark prestained (INVITROGEN) (B) verwendet. 74 Ergebnisse 3.2.1.3. Grün fluoreszierende V. harveyi LuxP Proteine Für eine Verwendung der LuxP-Proteine als biologische Komponenten eines optischen Biosensors müssen diese fluoreszent markiert werden. Das kann entweder durch direkte Anbindung eines Farbstoffes oder durch die Fusionierung eines fluoreszierenden Proteins erfolgen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Konstrukte des V. harveyi LuxP mit dem grün fluoszierenden Protein (EGFP) entwickelt, bei denen das EGFP entweder an den N-Terminus (EGFP-VhLuxP) oder an den C-Terminus (VhLuxP-EGFP) des Rezeptors gekoppelt wurde. Die Fähigkeit zur Fluoreszenz von GFP in einem Fusionsprotein kann von der Anordnung der einzelnen Domänen abhängen [162]. Aus diesem Grund wurden zwei unterschiedlich angeordnete Fusionen von EGFP und V. harveyi LuxP konstruiert. 3.2.1.3.1. EGFP- V. harveyi LuxP(aa 24-365) (EGFP-VhLuxP) Für die Klonierung des N-terminal EGFP-markierten VhLuxP wurden zuerst die Leserahmen (ohne Stoppcodon) von EGFP und VhLuxP (aa 24-365) mittels Primerpaare ELuxPNdeIfor/ELuxPOEPrev und ELuxPOEPfor/EluxPXhoIrev und Templateplasmide pEGFP-N1 sowie pETluxP amplifiziert. Die resultierenden DNA-Fragmente wurden anschließend mittels overlap-extension PCR zusammengeführt und durch die Restriktionsstellen NdeI und XhoI in die MCS des Expressionsvektor pET23b integriert. Die korrekte Integration des Leserahmes wurde durch Sequenzierung bestätigt. Die korrekten Klone wurden pETegfp-VhluxP genannt. Das heterologe EGFP-VhLuxP Protein umfasst 589 aa und hat ein theoretisches Molekulargewicht von 67,0 kDa. Es enthält einen aus dem Vektor stammenden C-terminalen His6-tag, das von LuxP durch eine Leu-Glu-Sequenz getrennt ist. Die Expression des EGFP-VhLuxP Proteins erfolgte durch die Zugabe von 0,4 µM IPTG zu einer exponentiell wachsender E. coli Kultur bei 30°C. Die Expressionsanalyse von EGFP-VhLuxP wurde für E. coli Stämme HMS174(DE3) pLysS, KIH3, BL21(DE3) pLysS sowie KIB2 durchgeführt. Die Ergebnisse der Expressionsanalyse von EGFP-VhLuxP wurden in der Abbildung 3-7 für E. coli BL21(DE3) pLysS und in der Abbildung 3-8 für E. coli KIB2 dargestellt. Sowohl in der Commassie-Färbung als auch in der Western-Blot Analyse kann die ca. 67 kDa schwere Proteindoppelbande erkannt werden. Für beide Stämme wird ein Expressionsmaximum nach ca. 2 h erreicht. Die Proteinmenge bleibt konstant auch nach einer Expressionsdauer von über 16 h (ü. N.). 75 BSA ü. N. 4h 3h 2h 1h Induktion EGFP-VhLuxP / KIH3 Marker ü. N. 4h 3h 2h 1h EGFP-VhLuxP/ HMS174(DE3) pLysS Induktion HMS174(DE3) pLysS Ergebnisse ~110 ~79 ~60 ~47 ~35 A ~110 ~79 ~60 ~47 ~35 B Abbildung 3-12: Expressionsanalyse des EGFP-VhLuxP in E. coli HMS174(DE3) pLysS sowie E. coli KIH3. Die E. coli Stämme HMS174(DE3) pLysS und KIH3 wurden mit dem EGFP-VhLuxP kodierenden Plasmid pETegfpVhluxP transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG zu der Kultur wurde die Expression des EGFP-VhLuxP induziert. Die Probenentnahme erfolgte bei der Induktion, nach 1, 2, 3 bzw. 4 h sowie nach der Kultivierung ü. N.. Die Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli HMS174(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Zur Einschätzung des Expressionsniveau wurde auf die Gele 2 µg BSA aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde BenchMark prestained (INVITROGEN) verwendet. Etwas anders verläuft die Expression in E. coli HMS174(DE3) pLysS und in dem E. coli KO Stamm KIH3 (Abbildung 3-12). Auch hier ist die ca. 67 kDa schwere Doppelbande für beide E. coli Stämme gut erkennbar, aber bereits nach einer Expressionsdauer von 2 h nimmt die Proteinmenge ab. Nach einer Kultivierung ü. N. kann kein Protein mehr detektiert werden. Im Gegensatz zu dem Stamm BL21(DE3) pLysS enthält der Stamm HMS174 (DE3) pLysS E. coli eigene Proteasen, die für den Abbau der Proteine verantwortlich sind. Da die Aktivität der Proteasen auch durch die Temperatur beeinflusst werden kann, wurde die Stabilität des EGFPVhLuxP bei einer Expression bei unterschiedlichen Temperaturen (RT, 30°C, 37°C) getestet (Abbildung 3-13). Für den Stamm E. coli BL21(DE3) pLysS konnten keine Unterschiede in der 76 Ergebnisse Expression festgestellt werden. Der Einfluss von Temperatur auf die Expression von EGFPVhLuxP in E. coli HMS174(DE3) pLysS ist dagegen deutlich erkennbar. Bei der Expression bei RT kann kein signifikanter Abbau des Proteins festgestellt werden. Bei der Expression bei 30°C und 37°C wird EGFP-VhLuxP abgebaut. Die E. coli - eigene Proteasen scheinen bei der Kultivierungstemperatur von 30°C am meisten aktiv zu sein. Marker ü. N. Induktion 37 °C ü. N. 3h Induktion 30 °C ü. N. 3h Induktion RT ü. N. 3h Induktion 37 °C ü. N. 3h Induktion ü. N. 3h Induktion Marker HMS174(DE3) pLysS 30 °C 3h BL21(DE3) pLysS RT ~123 ~77 ~42 ~30 ~25 A ~110 ~79 ~60 ~47 ~35 ~25 B Abbildung 3-13: Untersuchung des Temperatureinflusses auf die Stabilität von EGFP-VhLuxP in E. coli BL21(DE3) pLysS sowie E. coli HMS174(DE3) pLysS. Die E. coli Stämme BL21(DE3) pLysS und HMS174(DE3) pLysS wurden mit dem EGFP-VhLuxP kodierenden Plasmid pETegfpVhluxP transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei RT, 30°C bzw. 37°C kultiviert. Durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG zu der Kultur wurde die Expression des EGFP-VhLuxP induziert. Die Probenentnahme erfolgte bei der Induktion, nach 1, 2, 3 bzw. 4 h sowie nach der Kultivierung ü. N.. Die Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) TM verwendet. Als Molekulargewichtstandard wurde BenchMark prestained (INVITROGEN) verwendet. 77 Ergebnisse Für die Gewinnung des EGFP-VhLuxP ist aufgrund der Proteinstabilität der E. coli Stamm BL21(DE3) pLysS bzw. der KO Stamm KIB2 besser geeignet als der Stamm HMS174(DE3) pLysS. Für die Expression und Aufreinigung von EGFP-VhLuxP wurde in weiteren Versuchen der Stamm KIB2 verwendet, um AI-2 freies Protein herzustellen. Die Expression des Proteins für die Aufreinigung erfolgte für 3h bei 30°C nach der Induktion mit IPTG. Die Zellen wurden anschließend geerntet, im Puffer B aufgenommen und aufgeschlossen. Das Gesamtlysat wurde im darauf folgenden Zentrifugationsschritt in lösliche (Klarlysat) und unlösliche Proteine aufgetrennt. Das Klarlysat wurde auf eine Ni 2+-IDASepharosesäule aufgetragen, wobei die Proteine, die keine Metallionenaffinität aufwiesen, im Durchfluss blieben. Nach mehreren Waschschritten wurde das EGFP-VhLuxP Protein mittels Puffer E eluiert. Die Ergebnisse der Aufreinigung von EGFP-VhLuxP aus E. coli KIB2 wurden in der Abbildung 3-14 dargestellt. Von dem im Gesamtlysat vorhandenen Protein ist nur ein Teil löslich. Aus dem Klarlysat kann aber ein relativ sauberes Protein gewonnen werden. Ein signifikanter Teil des Proteins ist jedoch unlöslich und kann nicht für die Aufreinigung unter nativen Bedingungen verwendet werden. Im Gegenteil zu VhLuxP, VhLuxP 21 und VhLuxP 23 weist das EGFP-VhLuxP deutlich höhere Lagerstabilität auf. Die Proteinaggregate werden zwar auch beobachtet, entstehen aber erst nach ca. 1 Woche Lagerung bei 4°C. Für eine technische Verwendung des Proteins ist die höhere Lagerstabilität von großem Vorteil. 3.2.1.3.2. V. harveyi LuxP(aa 24-365)-EGFP (VhLuxP-EGFP) Für die Klonierung des VhLuxP mit C-terminalem EGFP wurden die Leserahmen (ohne Stoppcodons) von VhLuxP (aa 24-365) und EGFP mittels der Primerpaare LEGFPNdeIfor/LEGFPOEPrev und LEGFPOEPfor/LEGFPXhoIrev und Templateplasmide pETluxP sowie pEGFP-N1 amplifiziert, anschließend mittels overlap-extension PCR zusammengeführt und über die Restriktionstellen NdeI und XhoI in die MCS des Expressionsvektor pET23b integriert. Die Klone wurden auf die korrekte Integration des Leserahmes mittels Sequenzierung überprüft. Das aus der Klonierung stammende Plasmid pETVhluxP-egfp kodiert ein 590 aa umfassendes Protein (VhLuxP-EGFP) mit einem theoretischen Molekulargewicht von 67,1 kDa. 78 Ergebnisse VhLuxP-EGFP enthält einen aus dem Vektor stammenden C-terminalen His6-tag, das von EGFP durch eine Leu-Glu-Sequenz getrennt ist. Eluat Durchfluss Unlösliche Proteine Klarlysat Gesamtlysat BL21(DE3) pLysS Marker EGFP-VhLuxP ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 A ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 B Abbildung 3-14: Aufreinigung von EGFP-VhLuxP aus E. coli KIB2. Der E. coli Stamm KIB2 wurde mit dem EGFP-VhLuxP kodierenden Plasmid pET egfp-VhluxP transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Nach der Induktion der Expression durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG wurde die Kultivierung für 3 h fortgesetzt. Danach wurden die Zellen geerntet, in Puffer B (2.2.15) aufgenommen und aufgeschlossen (Gesamtlysat). Durch 2+ die Zentrifugation wurde das lösliche Klarlysat von den unlöslichen Proteinen getrennt. Das Klarlysat wurde auf eine Ni -IDASepharose-Säule aufgetragen, wobei das nicht angebundene Material (Durchfluss) aufgefangen wurde. Nach mehreren Waschschritten erfolgte die Elution mit Puffer E (Eluat). Alle Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde PageRuler™ Plus Prestained Protein Ladder (FERMENTAS) verwendet. Die Expression des VhLuxP-EGFP Protein erfolgte durch die Zugabe von 0,4 µM IPTG zu einer exponentiell wachsenden E. coli Kultur. Die Expressionsanalyse des Proteins wurde für E. coli Stämme HMS174(DE3) pLysS, KIH3, BL21(DE3) pLysS sowie KIB2 durchgeführt. Im Gegenteil zu EGFP-VhLuxP ist das VhLuxP-EGFP Protein stabil bei der Expression in E. coli HMS174(DE3) pLysS bzw. KIH3. Die Ergebnisse der Expression von VhLuxP-EGFP in den beiden Stämmen sind in der Abbildung 3-15 dargestellt. Die dem Protein entsprechende, ca. 67 kDa 79 Ergebnisse schwere Bande ist sowohl in der Commassie-Färbung (A) als auch in der Western-Blot Analyse (B) sehr gut zu erkennen. Die Synthese des Proteins erreicht ein Maximum ca. 2-3 h nach der Induktion mit IPTG. Die Proteinmenge bleibt konstant, es kann kein Abbau festgestellt werden. Bei der Expression von VhLuxP-EGFP in E. coli BL21(DE3) pLysS (Anhang, Abbildung A-5) und KIB2 (Abbildung 3-16) konnten keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden. Auch hier sind die prominenten Proteinbanden, sowohl in der Commassie-Färbung, als auch in der Western-Blot Analyse, sehr gut zu erkennen. Das Maximum der Expression wird ca. 3 h nach BSA ü. N. 4h 3h 2h 1h Induktion Marker VhLuxP-EGFP / KIH3 ü. N. 4h 3h 2h 1h VhLuxP-EGFP / HMS174(DE3) pLysS Induktion HMS174(DE3) pLysS der Induktion erreicht. ~110 ~79 ~60 ~47 ~35 A ~110 ~79 ~60 ~47 ~35 B 25 Abbildung 3-15: Expressionsanalyse des VhLuxP-EGFP in E. coli HMS174(DE3) pLysS sowie E. coli KIH3. Die E. coli Stämme HMS174(DE3) pLysS und KIH3 wurden mit dem VhLuxP-EGFP kodierenden Plasmid pETVhluxPegfp transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG zu der Kultur wurde die Expression des VhLuxP-EGFP induziert. Die Probenentnahme erfolgte bei der Induktion, nach 1, 2, 3 bzw. 4 h sowie nach der Kultivierung ü. N.. Die Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli HMS174(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Zur Einschätzung des Expressionsniveau wurde auf die Gele 2 µg BSA aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde BenchMark prestained (INVITROGEN) verwendet. 80 ü. N. 4h 3h 2h 1h Induktion ü. N. VhLuxP-EGFP 4h 3h 2h 1h Induktion ü. N. VhLuxP-R16 4h 3h 2h 1h VhLuxP-(DE)16 Induktion BL21(DE3) pLysS Marker Ergebnisse ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 A ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 B Abbildung 3-16: Expressionsanalyse von VhLuxP-(DE)16, VhLuxP-R16 sowie VhLuxP-EGFP in E. coli KIB2. Der E. coli Stamm KIB2 wurde entsprechend mit dem VhLuxP-(DE)16 kodierenden Plasmid pETVhluxP-(DE)16, mit dem VhLuxPR16 kodierenden Plasmid pETVhluxP-R16 oder mit dem VhLuxP-EGFP kodierenden Plasmid pETVhluxP-egfp transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG zu der Kultur wurde die Expression der Proteine induziert. Die Probenentnahme erfolgte bei der Induktion, nach 1, 2, 3 bzw. 4 h sowie nach der Kultivierung ü. N.. Die Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (FERMENTAS) verwende Um feststellen zu können ob das VhLuxP-EGFP in E. coli in einer löslichen Form vorliegt, wurde das Protein wie unter 2.2.14 beschrieben exprimiert und wie unter 2.2.15 beschrieben aufgereinigt. Dieser Versuch wurde für E. coli KIH3 und BL21(DE3) pLysS vorgenommen. Bei der Aufreinigung des VhLuxP-EGFP Proteins aus E. coli KIH3 befand sich das im Gesamtlysat vorhandene Protein vollständig in der unlöslichen Form (Ergebnisse sehe Anhang, Abbildung A-4). Es konnte kein VhLuxP-EGFP in dem Klarlysat detektiert werden und somit auch nicht im Eluat. Eine Aufreinigung von VhLuxP-EGFP aus E. coli KIH3 ist unter nativen Bedingungen nicht möglich. 81 Ergebnisse In der Abbildung 3-17 sind die Ergebnisse einer Aufreinigung von VhLuxP-EGFP aus E. coli BL21(DE3) pLysS dargestellt. Aus dem im Gesamtlysat vorhandenen Protein ist nur ein geringfügiger Teil löslich, der Großteil bildet inclusion bodys. Das lösliche Protein kann jedoch unter nativen Bedingungen aufgereinigt werden. Neben der ca. 67 kDa schweren VhLuxP-EGFP Bande sind im Eluat noch diverse Abbaubanden vorhanden, die darauf hinweisen, dass das BSA (2 µg) Eluat Waschfra ktion Durchfluss Unlösliche Proteine Klarlysat VhLuxP-EGFP Gesamtlysat BL21(DE3) pLysS Marker lösliche Protein keine hohe Stabilität aufweist. ~119 ~66 ~43 ~29 A ~79 ~60 ~47 ~35 ~25 ~18 25 B Abbildung 3-17: Aufreinigung von VhLuxP-EGFP aus E. coli BL21(DE3) pLysS Der E. coli Stamm BL21(DE3) pLysS wurde mit dem VhLuxP-EGFP kodierenden Plasmid pETVhluxP- egfp transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Nach der Induktion der Expression durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG wurde die Kultivierung für 3 h fortgesetzt. Danach wurden die Zellen geerntet, in Puffer B (2.2.15) aufgenommen und aufgeschlossen (Gesamtlysat). Durch die Zentrifugation wurde das lösliche Klarlysat von den unlöslichen Proteinen getrennt. Das Klarlysat 2+ wurde auf eine Ni -IDA-Sepharose-Säule aufgetragen, wobei das nicht angebundene Material (Durchfluss) aufgefangen wurde. Nach mehreren Waschschritten (Waschfraktion) erfolgte die Elution mit Puffer E (Eluat). Alle Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Als Molekulargewichtstandards wurden Roti-Mark standart (ROTH) (A) sowie BenchMark prestained (INVITROGEN) (B) verwendet. 82 Ergebnisse 3.2.1.4. V. harveyi LuxP-Proteine mit starker Ladung Um die Eigenschaften eines Proteins für die Verwendung als biologische Komponente eines ISFET-basierten Biosensors zu verbessern, muss man dem Protein eine zusätzliche Ladung zufügen. In Rahmen dieser Arbeit wurden Fusionen des V. harveyi LuxP mit einem ArgininHexadecapaptid und mit einem Aspartat/Glutamat-Hexadecapeptid konstruiert, die in physiologischen pH entprechend eine positive oder negative Ladung tragen. 3.2.1.4.1. V. harveyi LuxP(aa 24-365) mit Arginin-Hexadecapeptid (VhLuxP-R16) Für die Klonierung von VhLuxP-R16 wurde der VhLuxP kodierende Leserahmen mittels Primer LuxP 23HisNdeIfor/LuxPArgnewXhoIrev und des Plasmids pETluxP als Template amplifiziert. Auf diesem Wege wurden die kodierenden Sequenzen für einen N-terminalen His6Tag und ein C-terminales Arginin-Hexadecapepid hinzugefügt. Über die Restriktionsstellen NdeI und XhoI wurde die DNA in die MCS des Vektors pET23b integriert. Das aus der Klonierung resultierende Plasmid (pETVhluxP-R16) wurde mittels Sequenzierung auf die korrekte Integration des Leserahmens überprüft. Das heterologe Protein VhLuxP-R16 hat ein theoretisches Molekulargewicht von 42,3 kDa und umfasst 364 aa. Durch die Fusionierung eines positiv geladenen Oligopeptids wurde der isoelektrische Punkt des Proteins von pI 5,72 (VhLuxP 21) bis pI 9,19 (VhLuxP-R16) verschoben. Die Expression des VhLuxP-R16 erfolgte durch die Zugabe von 0,4 µM IPTG zu einer exponentiell wachsenden E. coli Kultur. Für die Expressionsanalyse wurden E. coli BL21(DE3) pLysS sowie E. coli KIB2 verwendet. Die Ergebnisse dieser Analyse wurden in der Abbildung 3-16 und in der Abbildung A-5 im Anhang dargestellt. In keinem der verwendeten E. coli Stämme konnte die Expression von VhLuxP-R16 nachgewiesen werden. 3.2.1.4.2. V. harveyi LuxP(aa 24-365) mit Aspartat/Glutamat-Hexadecapeptid (VhLuxP-(DE)16) Die Amplifizierung des kodierenden Leserahmens für die Klonierung von VhLuxP-(DE)16 erfolgte in zwei Schritten. Im ersten Schritt wurde eine PCR mit Primer LuxP 23HisNdeIfor/LuxAspGluOEP1rev und dem Plasmid pETluxP als Template durchgeführt. Im zweiten PCR-Schritt wurden Primer LuxP 23HisNdeIfor/LuxAspGluOEP2rev sowie das erste PCR-Produkt als Template verwendet. Somit wurden zu dem VhLuxP Leserahmen die 83 Ergebnisse kodierenden Sequenzen für einen N-terminalen His6-Tag und ein C-terminaler Aspartat/Glutamat-Hexadecapepid hinzugefügt. Die Integration der Kassette in den Vektor pET23b, die über die Restriktionsstellen NdeI und XhoI erfolgte, wurde anschließend mittels Sequenzierung überprüft. Das aus der Klonierung resultierende Plasmid pETVhluxP-(DE)16 kodiert ein 364 aa umfassendes Protein mit einem theoretischen Molekulargewicht von 41,8 kDa. Durch die negative Ladung des Aspartat/Glutamat-Hexadecapepids wurde der isoelektrische Punkt des Proteins auf pI 4,87 verschoben. Die Expression von VhLuxP-(DE)16 wurde durch die Zugabe von 0,4 µM IPTG zu einer exponentiell wachsenden E. coli Kultur induziert. Die Expressionsanalyse wurde für E. coli BL21(DE3) pLysS sowie E. coli KIB2 durchgeführt. Die Ergebnisse wurden in der der Abbildung 3-16 und in der Abbildung A-5 im Anhang dargestellt. Die etwa 42 kDa schwere prominente Proteinbande in der Commassie-Färbung und die starken Signale in der Western-Blot-Analyse sind sowohl in E. coli BL21(DE3) pLysS als auch in E. coli KIB2 vorhanden. Das Expressionsmaximum wird etwa 3 bis 4 h nach der Induktion erreicht. Das Protein bleibt auch nach einer Inkubationszeit von über 16 h stabil (ü. N.). Neben den elektrochemischen Eigenschaften von VhLuxP-(DE)16 ist auch die Löslichkeit von wesentlicher Bedeutung für eventuelle technische Anwendung des Proteins. Um diese Frage zu klären wurde eine Aufreinigung des Proteins aus E. coli BL21(DE) pLysS, wie unter 2.2.15 beschrieben, durchgeführt. Die Ergebnisse dieses Versuchs wurden in der Abbildung 3-18 dargestellt. Von dem im Gesamtlysat vorhandenen VhLuxP-(DE)16 Protein konnte ein bedeutender Anteil ins Klarlysat überführt werden, ein großer Teil des Proteins bleibt jedoch unlöslich. Aus dem Klarlysat kann nach der Aufreinigung ein relativ sauberes VhLuxP-(DE)16 gewonnen werden (Eluat). 84 BSA (2 µg) Eluat Waschfra ktion Durchfluss Unlösliche Proteine Klarlysat VhLuxP-(DE)16 Gesamtlysat Marker BL21(DE3) pLysS Ergebnisse ~66 ~43 ~29 ~20 ~14 A ~77 ~42 ~30 ~25 ~17 B 25 Abbildung 3-18: Aufreinigung von VhLuxP-(DE)16 aus E. coli BL21(DE3) pLysS. Der E. coli Stamm BL21(DE3) pLysS wurde mit dem VhLuxP-(DE)16 kodierenden Plasmid pETVhluxP-(de)16 transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Nach der Induktion der Expression durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG wurde die Kultivierung für 3 h fortgesetzt. Danach wurden die Zellen geerntet, in Puffer B (2.2.15) aufgenommen und aufgeschlossen (Gesamtlysat). Durch die Zentrifugation wurde das lösliche Klarlysat von den unlöslichen Proteinen getrennt. Das Klarlysat 2+ wurde auf eine Ni -IDA-Sepharose-Säule aufgetragen, wobei das nicht angebundene Material (Durchfluss) aufgefangen wurde. Nach mehreren Waschschritten (Waschfraktion) erfolgte die Elution mit Puffer E (Eluat). Alle Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde Roti-Mark prestained (ROTH) verwendet. 3.2.1.5. GST- V. harveyi LuxP (GST-VhLuxP) Eine Alternative zur Aufreinigung via His6-Tag mittels Metallionenaffinitätchromatografie ist die Aufreinigung über GST (Glutation-S-Transferase) auf einer Chromatographiesäule mit immobilisierten Glutation. Darüber hinaus kann GST die Löslichkeit des Fusionspartners positiv beeinflussen [5]. Bei den Untersuchungen zur Bestimmung der Kristallstruktur von V. harveyi LuxP wurde dises als Fusionkontrukt mit GST exprimiert und sei löslich gewesen [22]. Mit der Konstruktion eines GST-VhLuxP Fusionsproteins im Rahmen dieser Arbeit sollte demnach ein 85 Ergebnisse weiterer Aufreinigungsweg überprüft und gleichzeitig der Einfluss von GST auf die Löslichkeit von VhLuxP untersucht werden. Für die Expression eines GST - VhLuxP Fusionskonstrukts wurde der GST kodierende Leserahmen ohne Stoppcodon mit Primer fgstNdeI/ rgstBamHI und des Plasmids pGEX-4T3 als Template amplifiziert. Das VhLuxP kodierende ORF (aa 24-365) wurde in einem separaten PCRSchritt mithilfe der Primer fdel23gstBamHI/rluxPgstXhoI und des Plasmids pET17luxP als Template amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden entsprechend mit den Restriktionsendonukleasen NdeI und BamHI (gst) oder BamHI und XhoI (VhluxP) verdaut und über die Restriktionsstellen NdeI und XhoI in die MCS des Vektors pET23b integriert, wobei die Leserahmen von gst und VhluxP über die kohäsiven BamHI Enden fusioniert wurden. Die korrekte Integration des kompletten Leserahmens wurde mittels Sequenzierung überprüft. Das in der Klonierung konstruierte Plasmid (pETgst-VhluxP) kodiert ein 568 aa umfassendes Fusionsprotein mit einem theoretischen Molekulargewicht von 65,3 kDa. Die Domänen GST und VhLuxP sind in diesem Konstrukt von einer Thrombin-Schnittstelle (LVPRGS) getrennt, somit kann VhLuxP von GST getrennt werden. Die Expression von GST-VhLuxP erfolgte nach Zugabe von 0,4 µM IPTG zu einer exponentiell wachsenden, zuvor mit dem Plasmid pETgst-VhluxP transformierten E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur. Bereits nach 1 h Expression kann man eine sehr starke Proteinbande, die der Größe des GST-VhLuxP entspricht, erkennen (Abbildung 3-20). Nach ca. 2,5 h wird das Maximum der Expression erreicht, auch bei weiterer Kultivierung bleibt das Protein stabil. Für eine Aufreinigung von GST-VhLuxP wurde eine Expression für 3 h nach der Induktion durchgeführt (Abbildung 3-20). Die geernteten Zellen wurden im BugBuster® Puffer (NOVAGEN) aufgenommen und aufgeschlossen (Gesamtlysat). In anschließender Zentrifugation wurden die unlöslichen Zellteile und Proteine (unlösliche Proteine) von den löslichen (Klarlysat) getrennt. Das Klarlysat wurde für die Aufreinigung, wie unter 2.2.17 beschrieben, verwendet. Wie andere VhLuxP-Fusionsproteine befindet sich das GST-VhLuxP vorwiegend in Form von inclusion bodys. Nur ein Teil des Proteins konnte in das lösliche Klarlysat überführt werden. Ein Teil von GST-VhLuxP wurde bereits während der Waschschritte aus der Säule ausgespült (Waschfraktion). Somit ist im Eluat nur ein Teil des löslichen GST-VhLuxP vorhanden. Die Abbaubanden, die in allen Aufreinigungsfraktionen in der Western-Blot- Analyse detektiert worden sind, signalisieren, dass das GST-VhLuxP in E. coli keine große Stabilität aufweist. 86 Marker ü. N. 6h 4h 2,5 h 1h Induktion GST-VhLuxP BL21(DE3) pLysS Ergebnisse A B Abbildung 3-19: Expressionsanalyse von GST-VhLuxP in E. coli BL21(DE3) pLysS. Der E. coli Stamm BL21(DE3) pLysS wurde mit dem GST-VhLuxP kodierenden Plasmid pETgstVhluxP transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG zu der Kultur wurde die Expression der Proteine induziert. Die Probenentnahme erfolgte bei der Induktion, nach 1, 2,5, 4 bzw. 6 h sowie nach der Kultivierung ü. N.. Die Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-GST Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Als Molekulargewichtstandards wurden Roti-Mark standart (ROTH) (A) sowie BenchMark prestained (INVITROGEN) (B) verwendet. 87 BSA (2 µg) Eluat Waschfra ktion Unlösliche Proteine Klarlysat GST-VhLuxP Gesamtlysat BL21(DE3) pLysS Marker Ergebnisse ~119 ~66 ~43 ~20 A ~123 ~77 ~42 ~30 ~25 B Abbildung 3-20: Aufreinigung von GST-VhLuxP aus E. coli BL21(DE3) pLysS. Der E. coli Stamm BL21(DE3) pLysS wurde mit dem GST-VhLuxP kodierenden Plasmid pETgst-VhluxP transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Nach der Induktion der Expression durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG wurde die Kultivierung für 3 h fortgesetzt. Danach wurden die Zellen geerntet, in BugBuster-Puffer (2.2.17) aufgenommen und aufgeschlossen (Gesamtlysat). Durch die Zentrifugation wurde das lösliche Klarlysat von den unlöslichen Proteinen getrennt. Das Klarlysat wurde auf eine GST-Bind-Resin-Säule aufgetragen, wobei das nicht angebundene Material (Durchfluss) aufgefangen wurde. Nach mehreren Waschschritten (Waschfraktion) erfolgte die Elution mit einem glutationhaltigen Elutionspuffer (Eluat). Alle Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-GST Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurden Roti-Mark standart (ROTH) (A) und Roti-Mark prestained (ROTH) (B) verwendet. 3.2.2. Vibrio harveyi LuxP-Derivate mit veränderter Affinität zur AI-2 An der Bindung von AI-2 sind in dem maturen VhLuxP neun Aminosäuren beteiligt [22] (Abbildung 1-10). Die Konformation des Proteins ändert sich mit der Anbindung des AI-2 von einer offener ApoLuxP zu einer geschlossenen HoloLuxP-Struktur [118]. In den ersten Studien, in denen die Bindung des heterologen VhLuxP Proteins an auf einer Oberfläche immobilisiertem Autoinducer untersucht wurde, konnte das Protein zwar angebunden, nicht aber wieder von der Oberfläche gelöst werden. Eine Erklärung hierfür könnte die Annahme sein, dass die Bindung von AI-2 an das Rezeptorprotein so stark sei, dass 88 Ergebnisse der AI-2 nur schwer von dem Protein wieder gelöst werden kann. Diese Theorie konnte durch Literaturrecherche weder bestätigt noch widerlegt werden. Für eine Anwendung des VhLuxP Proteins in der Biosensorik wäre es von großer Wichtigkeit, dass die Bindung von AI-2 an VhLuxP nur so stark ist, dass die Regenerierung des Sensors durch Ablösen des Proteins möglich ist. Da die an der AI-2-Bindung beteiligten Aminosäuren bekannt sind [22], können diese gezielt ausgetauscht werden, um so VhLuxPDerivate mit veränderter Affinität zur AI-2 zu kreieren. Sechs V. harveyi LuxP Derivate (mit einem N-terminalen EGFP) wurden bereits von D. Walther kloniert, in E. coli BL21(DE3) pLysS exprimiert und aufgereinigt [183], Tabelle 3-1. Bedauerliche Weise beinhaltete das von D. Walther verwendete Template (pETegfp-luxP) und somit auch alle Derivate eine Punktmutation in dem Leserahmen von VhLuxP (C264H). In Rahmen dieser Arbeit musste die Klonierung dieser Derivate wiederholt werden. Es wurden ebenfalls sieben weitere Derivate entworfen, die Mutationen der an der AI-2-Bindung beteiligten Aminosäuren enthalten. Alle Derivate werden im weiteren Teil dieser Arbeit vereinfacht als Mutanten bezeichnet und von 1 bis 13 nummeriert. Eine Übersicht dieser Mutanten wurde in der Tabelle 3-1 (Derivate entwickelt von D. Walter [183]) sowie in der Tabelle 3-2 (Derivate entwickelt in Rahmen dieser Arbeit) dargestellt. Aufgrund der im Vergleich zu anderen VhLuxP-Proteinen besseren Lagerstabilität von EGFP-VhLuxP werden die Mutanten ebenfalls mit einem N-terminalen EGFP exprimiert. Mutante: Art der Mutation: 1 Einzelmutation R215A 2 Einzelmutation R215D 3 Einzelmutation R310A 4 Einzelmutation R310D 5 Doppelmutation R215A + R310A 6 Doppelmutation R215D + R310D Tabelle 3-1: Übersicht der von D. Walther entwickelten VhLuxP-Derivate [183]. Diese Derivate werden vereinfacht als Mutante 1 bis 6 bezeichnet. 89 Ergebnisse Mutante: Art der Mutation: 7 Einzelmutation Q77A 8 Einzelmutation D267A 9 Einzelmutation D267R 10 Einzelmutation T266A 11 Doppelmutation Q77A + W82A 12 Doppelmutation R215A + T266A 13 Doppelmutation Q77A + R310A Tabelle 3-2: Übersicht der in Rahmen dieser Arbeit entwickelten VhLuxP-Derivate. Diese Derivate werden vereinfacht als Mutante 7 bis 13 bezeichnet. Der Austausch der Aminosäuren erfolgte durch gerichtete Mutagenese. Zuerst wurden einzelne Fragmente des Leserahmens mithilfe mutagener Primer und des Plasmids pETegfpVhluxP als Template amplifiziert. Bei allen Einzelmutanten und der Doppelmutante 11 (Q77Q + W82A) wurden zwei DNA Fragmente amplifiziert und anschließend mittels overlap-extension PCR (OEP) zusammengefügt. Für alle anderen Doppelmutanten erfolgte die Amplifizierung von 3 Einzelfragmenten, die in zwei weiteren (OEP) Schritten zu einem Fragment fusioniert wurden. Die gerichtete Mutagenese des egfp-VhluxP Leserahmens wurde in der Abbildung 3-21 schematisch dargestellt. Die für die Amplifizierung der DNA Fragmente und in der overlapextension PCR verwendeten Primer wurden in der Tabelle 3-3 aufgelistet. Die mittels overlap-extension PCR hergestellten DNA-Fragmente wurden über die Restriktionsstellen NdeI und XhoI in die MCS des Vektors pET23b integriert und anschließend durch Sequenzierung überprüft. Aus diesen Klonierungen entstanden 13 Plasmide (pETelm1 – pETelm13). All diese Plasmide kodieren 589 aa umfassende chimäre Proteine mit einem theoretischen Molekulargewicht von ca. 67 kDa, die C-terminal mit einem aus dem Vektor stammenden His6-Tag fusioniert sind. pETelm1, pETelm2, pETelm3, pETelm4, pETelm5 sowie pETelm6 entsprechen dem von D. Walther klonierten Konstrukten I bis VI [183], enthalten jedoch keine Punktmutation C264H in VhLuxP-ORF. 90 Ergebnisse A B PCR 1 PCR 1 PCR 2 PCR 2 PCR 3 OEP OEP 1 OEP 2 Abbildung 3-21: Schematische Darstellung der gerichteten Mutagenese des egfp-VhluxP Leserahmens. A – Austausch von einer (bzw. zwei nebeneinander liegender) Aminosäure B – Austausch von zwei Aminosäuren Erklärung der Symbole: grünes Rechteck – egfp gelbes Rechteck – VhluxP bzw. Fragmente rote/blaue Markierung – entsprechende Mutation weißer Pfeil – PCR-Primer weißer Pfeil mit roter/blauer Markierung – mutagener Primer Mut.: 1* 2* 3* 4* 5* 6* 7 8 9 10 11 12 13 PCR 1 Primer: PCR 2 Primer: EluxPNdeIfor Arg215/Alarev EluxPNdeIfor Arg215/Asprev EluxPNdeIfor Arg310/Alarev EluxPNdeIfor Arg310/Aspfor EluxPNdeIfor Arg215/Alarev EluxPNdeIfor Arg215/Asprev EluxPNdeIfor Gln77/Alarev EluxPNdeIfor Asp267/Alarev EluxPNdeIfor Asp267/Alarev EluxPNdeIfor Thr266/Alarev EluxPNdeIfor Gln+Trprev EluxPNdeIfor Arg215/Alarev EluxPNdeIfor Gln77/Alarev Arg215/Alafor ELuxPXhoIrev Arg215/Aspfor ELuxPXhoIrev Arg310/Alafor ELuxPXhoIrev Arg310/Asprev ELuxPXhoIrev Arg215/Alafor Arg310/Alarev Arg215/Aspfor Arg310/Asprev Gln77/Alafor ELuxPXhoIrev Asp267/Alafor ELuxPXhoIrev Asp267/Argfor ELuxPXhoIrev Thr266/Alafor ELuxPXhoIrev Gln+Trpfor ELuxPXhoIrev Arg215/Alafor Thr266/Alarev Gln77/Alafor Arg310/Alarev PCR 3 Primer: Arg310/Alafor ELuxPXhoIrev Arg310/Aspfor ELuxPXhoIrev Thr266/Alafor ELuxPXhoIrev Arg310/Alafor ELuxPXhoIrev Primer: OEP 1 Template: EluxPNdeIfor ELuxPXhoIrev EluxPNdeIfor ELuxPXhoIrev EluxPNdeIfor ELuxPXhoIrev EluxPNdeIfor ELuxPXhoIrev Arg215/Alafor ELuxPXhoIrev Arg215/Aspfor ELuxPXhoIrev EluxPNdeIfor ELuxPXhoIrev EluxPNdeIfor ELuxPXhoIrev EluxPNdeIfor ELuxPXhoIrev EluxPNdeIfor ELuxPXhoIrev EluxPNdeIfor ELuxPXhoIrev Arg215/Alafor ELuxPXhoIrev Gln77/Alafor ELuxPXhoIrev Produkte PCR 1 /PCR 2 Produkte PCR 1 /PCR 2 Produkte PCR 1 /PCR 2 Produkte PCR 1 /PCR 2 Produkte PCR2 /PCR 3 Produkte PCR2 /PCR 3 Produkte PCR 1 /PCR 2 Produkte PCR 1 /PCR 2 Produkte PCR 1 /PCR 2 Produkte PCR 1 /PCR 2 Produkte PCR 1 /PCR 2 Produkte PCR2 /PCR 3 Produkte PCR2 /PCR 3 Primer: OEP 2 Template: EluxPNdeIfor ELuxPXhoIrev EluxPNdeIfor ELuxPXhoIrev Produkte PCR 1/ OEP 1 Produkte PCR 1/ OEP 1 EluxPNdeIfor ELuxPXhoIrev EluxPNdeIfor ELuxPXhoIrev Produkte PCR 1/ OEP 1 Produkte PCR 1/ OEP 1 Tabelle 3-3: Auflistung der für die Klonierung von Mutanten verwendeten Primer. In der PCR 1, PCR 2 und PCR 3 wurde das Plasmid pETegfp-VhluxP als Template verwendet. In den overlap-extension PCRs wurden die Produkte der vorgehenden PCRs als Template verwendet. *Bei der Wiederholung der Klonierung von Mutanten 1-6 wurden die gleichen Primer verwendet wie von D. Walther [183]. 91 Ergebnisse Die Mutanten 1 bis 6 wurden bereits in E. coli BL21(DE3) pLysS von D. Walther exprimiert [183]. Da die Klonierung der Mutanten wiederholt werden musste, war auch eine erneute Expressionsanalyse dieser notwendig. Darüberhinaus sollte auch die Expression dieser Mutanten in E. coli KIB2 untersucht werden. Für die Expression der Mutanten wurden die Plasmide in E. coli BL21(DE3) pLysS sowie in E. coli KIB2 transformiert. Die Induktion der Expression erfolgte durch die Zugabe von 0,4 µM ü. N. 4h 3h 2h 1h Induktion ü. N. Mut. 9 4h 3h 2h 1h Induktion ü. N. Mut. 8 4h 3h 2h 1h Mut. 7 Induktion BL21(DE3) pLysS Marker IPTG zu einer exponentiell bei 30°C wachsenden Kultur. ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 A ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 B Abbildung 3-22: Expressionsanalyse von Mutanten 7, 8 und 9 in E. coli BL21(DE3) pLysS. Der E. coli Stamm BL21(DE3) pLysS wurde entsprechend mit dem jeweilige Mutante kodierenden Plasmid (pETelm7, pETelm8 oder pETelm9) transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG zu der Kultur wurde die Expression der Proteine induziert. Die Probenentnahme erfolgte bei der Induktion, nach 1, 2, 3 bzw. 4 h sowie nach der Kultivierung ü. N.. Die Proben wurden auf zwei SDS-PAGE Gele aufgetragen und aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (FERMENTAS) verwendet. Als Beispiel einer Expressionsanalyse wurde die Expression von Mutanten 7, 8 und 9 in E. coli BL21(DE3) pLysS und in E. coli KIB2 in der Abbildung 3-22 sowie in der Abbildung 3-23 92 Ergebnisse dargestellt. Es ist kaum ein Unterschied in der Expression für die beiden Stämme feststellbar. Dem Mutanten entsprechende Proteinbanden (ca. 67 kDa) können in der Coomassie-Blau Färbung erkannt und in der Westernblot-Analyse detektiert werden. Die Western-Blot Signale für die Mutante 7 sind in beiden E. coli Stämmen etwas stärker als die der Mutanten 8 und 9, was auf einen Unterschied in der Expressionsrate hindeutet. Ein Maximum der Proteinsynthese wird ca. 3 bis 4 h nach der Induktion erreicht. Bei einer Expression ü. N. wird ein Teil des ü. N. 4h 3h 2h 1h Induktion ü. N. Mut. 9 4h 3h 2h 1h Induktion ü. N. Mut. 8 4h 3h 2h 1h Mut. 7 Induktion BL21(DE3) pLysS Marker Proteins abgebaut. ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 A ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 B Abbildung 3-23: Expressionsanalyse von Mutanten 7, 8 und 9 in E. coli KIB2. Der E. coli Stamm KIB2 wurde entsprechend mit dem jeweilige Mutante kodierenden Plasmid (pETelm7, pETelm8 oder pETelm9) transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG zu der Kultur wurde die Expression der Proteine induziert. Die Probenentnahme erfolgte bei der Induktion, nach 1, 2, 3 bzw. 4 h sowie nach der Kultivierung ü. N.. Die Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (FERMENTAS) verwendet. 93 Ergebnisse Die Ergebnisse der Expressionsanalysen von weiteren Mutanten sind similär zu den von Mutanten 7, 8 und 9 und wurden dem Anhang beigefügt. Für eine Aufreinigung wurden die Mutanten in E. coli KIB2 für 3h nach der Induktion mit IPTG exprimiert. Die geernteten Zellen wurden aufgeschlossen (Gesamtlysat) und mittels Zentrifugation in lösliches Klarlysat sowie unlösliche Proteine aufgeteilt. Das Klarlysat würde für die Aufreinigung, wie unter 2.2.15 beschrieben, verwendet. Eluat dialysiert Eluat Waschfra ktion Durchfluss Unlösliche Proteine Klarlysat Gesamtlysat Eluat dialysiert Mut. 11 Eluat Waschfra ktion Durchfluss Unlösliche Proteine Klarlysat Gesamtlysat Marker BSA (5µg) Mut. 10 ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 A ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 B Abbildung 3-24: Aufreinigung von Mutanten 10 und 11 aus E. coli KIB2. Der E. coli Stamm KIB2 wurde entsprechend mit dem jeweilige Mutante kodierenden Plasmid (pETelm10 oder pETelm11) transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Nach der Induktion der Expression durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG wurde die Kultivierung für 3 h fortgesetzt. Danach wurden die Zellen geerntet, in Puffer B (2.2.15) aufgenommen und aufgeschlossen (Gesamtlysat). Durch die Zentrifugation wurde das lösliche Klarlysat von den unlöslichen Proteinen getrennt. 2+ Das Klarlysat wurde auf eine Ni -IDA-Sepharose-Säule aufgetragen, wobei das nicht angebundene Material (Durchfluss) aufgefangen wurde. Nach mehreren Waschschritten erfolgte die Elution mit Puffer E (Eluat). Das Eluat wurde gegen 50 mM Tris-HCl, pH 8,5, 250 mM NaCl dialysiert. Alle Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Zur Einschätzung der Proteinmenge wurde auf die Gele 5 µg BSA aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (FERMENTAS) verwendet. 94 Ergebnisse In der Abbildung 3-24 wurde die Aufreinigung von Mutanten 10 und 11 dargestellt. Wie auch andere VhLuxP-Proteine sind die Mutanten nur teilweise löslich. Der Großteil des Proteins befindet sich in Form von inclusion bodys. Nichtsdestotrotz kann aus dem Klarlysat nach der Aufreinigung sauberes Protein gewonnen werden (Eluat). Um eine höhere Stabilität der Proteine zu erzeugen und um sie für weitere Untersuchungen verwenden zu können wurden diese gegen 50 mM Tris-HCl, pH 8,5, 250 mM NaCl dialysiert. Bei der Aufreinigung von anderen Mutanten könnten ähnliche Ergebnisse erzeugt werden. Der Großteil des exprimierten Proteins ist immer unlöslich, trotzdem kann aus dem Klarlysat sauberes Protein gewonnen werden. Die Ergebnisse dieser Aufreinigungsversuche wurden dem Anhang beigefügt. 3.2.3. Vibrio fischeri LuxP – Fusionsproteine Das AI-2 Rezeptorprotein von V. fischeri wurde bis jetzt in keinen publizierten Studien heterolog exprimiert. In Rahmen dieser Arbeit wurde die Expression der V. fischeri LuxPFusionsproteine in E. coli analysiert. Das Ziel war hier alternative Rezeptorvarianten zu dem V. harveyi LuxP herzustellen. Die Analyse der Aminosäurensequenz des V. fischeri LuxP Proteins ergab eine sehr hohe Homologie zu dem V. harveyi LuxP [3]. Die in VhLuxP an der AI-2-Bindung beteiligten Aminosäuren sind auch in VfLuxP konserviert, was auf Ähnlichkeit in der Struktur hindeutet. Die Signalsequenz des VfLuxP wurde mittels SignalP ermittelt [1] und umfasst 27 aa. Für die Expression in E. coli wurden vier VfLuxP – Fusionskonstrukte kreiert, die in der Abbildung 3-25 dargestellt worden sind. 3.2.3.1. V. fischeri LuxP mit Signalsequenz (VfLuxP) Für die Expression des VfLuxP(aa 1-372) wurde der Leserahmen (ohne Stoppcodon) mittels Primer VfLuxPfullNcofor und VfLuxPXhorev sowie der genomischen DNA des Vibrio fischeri DSM 507 als Template amplifiziert und über die Restriktionsstellen NcoI und XhoI in die MCS des Vektors pET23d integriert. Aus der Klonierung stammende Plasmid pETVfluxP wurde auf die korrekte Integration des Leserasters mittels Sequenzierung überprüft und für die Expression des VfLuxP in E. coli verwendet. 95 Ergebnisse 27 EGFP VfLuxP (aa 28-372) 6 His VfLuxP (aa 28-372) 6 His VfLuxP (aa 28-372) EGFP VfLuxP (aa 28-372) 6 His 6 His Abbildung 3-25: Schematische Darstellung heterolog in E. coli synthetisierter VfLuxP-Konstrukte. Die für die abgebildeten Fusionsproteine kodierenden Leseraster wurden in den Vektor pET23d (VfLuxP, VfLuxP 27 und VfLuxPEGFP) oder pET23b (EGFP-VfLuxP) kloniert. Die heterologe Expression erfolgte in E. coli BL21(DE3) pLysS, KIB2 und HMS174(DE3) pLysS. 27- Signalsequenz des maturen VhLuxP; 23 aa, 2,4 kDa 6 His – Histidin-Hexapeptid (His6-Tag); 6 aa, 0,8 kDa EGFP – enhanced green fluorescent protein; 239 aa, 27 kDa. Das heterologe VfLuxP Protein umfasst 380 aa, hat ein theoretisches Molekulargewicht von 43,2 kDa und ist C-terminal mit einem aus dem Vektor stammenden Histidin-Hexapeptid getaggt. Die Primärstrukturen von LuxP und His6-tag sind durch die Leu-Glu-Sequenz getrennt (XhoI-Schnittstelle des Vektors). Die heterologe Expression von VfLuxP erfolgte in E. coli HMS 174(DE3) pLysS, E. coli BL21(DE3) pLysS sowie E. coli KIB2 nach der Induktion mit 0,4 µM IPTG. In E. coli HMS174(DE3) pLysS konnte eine sehr geringe Menge des Proteins nach einer Expressionsdauer von 4 h detektiert werden (Abbildung 3-26). Eine sehr schwache Bande ist in der Anti-Tetra-HisWesternblotanalyse feststellbar. Bei der Expressionsanalyse von VfLuxP E. coli KIB2 (Abbildung 3-27) und in E. coli BL21(DE3) pLysS (Abbildung A-19 im Anhang) konnte kein Protein nachgewiesen werden. Die Ursache hierfür könnte der Abbau des Proteins nach der Translation sein. Nicht sehr wahrscheinlich dagegen ist die Möglichkeit, dass das Protein auf Grund der Signalsequenz in das Periplasma transportiert wird. Einerseits weist die Signalsequenz keine Homologie mit der Sequenz auf, die in E. coli den Transport in das Periplasma bestimmt. Andererseits sind auch die periplasmatischen Proteine im Zelllysat vorhanden. Bei einem Transport in das Periplasma dürfte die synthetisierte Menge des Proteins geringfügiger ausfallen, nichtdestotrotz müsse das Protein detektierbar sein. 96 BSA (2 µg) ü. N. 4h 2,5 h 1h VfLuxP Induktion HMS174(DE3) pLysS Marker Ergebnisse ~110 ~79 ~60 ~47 ~35 ~25 A ~110 ~79 ~60 ~47 ~35 ~25 B Abbildung 3-26: Expressionsanalyse von VfLuxP in E. coli HMS174(DE3) pLysS. Der E. coli Stamm HMS174(DE3) pLysS wurde mit dem VfLuxP kodierenden Plasmid pETVfluxP transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG zu der Kultur wurde die Expression der Proteine induziert. Die Probenentnahme erfolgte bei der Induktion, nach 1, 2,5 bzw. 4 h sowie nach der Kultivierung ü. N.. Die Proben wurden auf zwei zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli HMS174(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde BenchMark prestained (INVITROGEN) verwendet. 3.2.3.2. V. fischeri LuxP ohne Signalsequenz (VfLuxP 27) Auch das V. fischeri LuxP sollte in Form ohne Signalsequenz exprimiert werden, in der es in Periplasma vorkommt. Für die Expression von VfLuxP 27 (aa 28-372) wurde der kodierende Leserahmen aus der genomischen DNA von V. fischeri DSM 507 mittels Primer VfLuxPNcofor/VfLuxPXhorev amplifiziert und über die Schnittstellen NcoI und XhoI in die MCS des Vektors pET23d integriert. Nach der Sequenzierung des Leserasters wurde das so entstandene Plasmid pETVfluxP 27 für die Expression in E. coli verwendet. Es kodiert ein 354 aa umfassendes Protein mit einem theoretischen Molekulargewicht von 40,3 kDa und einem Cterminalen His6-Tag. 97 Ergebnisse Die Expression des Proteins erfolgte nach einer Zugabe von 0,4 µM IPTG zu einer exponentiell wachsenden E. coli Kultur. Es wurden E. coli Stämme HMS174(DE3) pLysS, BL21(DE3) pLysS sowie KIB2 getestet. Im Unterschied zu VfLuxP konnte das VfLuxP 27 in allen verwendeten Stämmen überexprimiert werden. Die Ergebnisse dieser Expressionsanalysen sind in der Abbildung 3-27 (E. coli KIB2) sowie im Anhang (E. coli BL21(DE3) pLysS, E. coli HMS174(DE3) pLysS, Abbildung A19 und Abbildung A-20) dargestellt. Auf den Commassie-Blau gefärbten Gelen kann man die prominenten Banden erkennen, die der Größe von ca. 40 kDa entsprechen. Auch in der Western-Blot Analyse konnte das VfLuxP 27 in allen drei Stämmen detektiert werden. Die ü. N. 4h 3h 1h Induktion ü. N. 4h 3h 2h 1h 2h VfLuxP 27 VfLuxP Induktion BL21(DE3) pLysS Marker Proteinmenge nimmt mit der fortschreitenden Expressionsdauer zu. ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 A ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 B Abbildung 3-27: Expressionsanalyse von VfLuxP und VfLuxP 27 in E. coli KIB2. Der E. coli Stamm KIB2 wurde entsprechend mit dem VfLuxP kodierenden Plasmid pETVfluxP oder mit dem VfLuxP 27 kodierenden Plasmid pETVfluxP 27 transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG zu der Kultur wurde die Expression der Proteine induziert. Die Probenentnahme erfolgte bei der Induktion, nach 1, 2, 3 bzw. 4 h sowie nach der Kultivierung ü. N.. Die Proben wurden auf zwei zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (FERMENTAS) verwendet. 98 Ergebnisse 3.2.3.3. Grün fluoreszierende V. fischeri LuxP Proteine V. fischeri AI-2-Rezeptorprotein sollte, wie auch VhLuxP, für die Verwendung als biologische Komponente eines optischen Biosensors optimiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei VfLuxP Fusionskonstrukte mit EGFP (C- und N- terminal) kloniert und in E. coli exprimiert. 3.2.3.3.1. V. fischeri LuxP(aa 28-372) -EGFP (VfLuxP-EGFP) Für die Klonierung von VfLuxP mit einem C-terminalen EGFP wurden zuerst die Leserahmen für VfLuxP (aa 28-372) und EGFP (ohne der Stoppcodons) mithilfe der Primerpaare VfLuxP-EGFPNhefor/VfLEThrOEPrev und EVfThrOEPfor/EGFP-VfLuxPXhorev und der genomischen DNA von V. fischeri DSM 507 sowie des Plasmids pETegfp-VhluxP als Template amplifiziert und anschließend mittels overlap-extension PCR zusammengeführt. Die DNA wurde über die Restriktionsstellen NheI und XhoI in frame mit dem His6-Tag des Vektors pET23b fusioniert. Die korrekte Integration des Leserasters wurde mittels Sequenzierung überprüft. Das aus der Klonierung stammende Plasmid pETVfluxP-egfp kodiert ein 599 aa umfassendes VfLuxPEGFP Protein mit einem theoretischen Molekulargewicht von 67,8 kDa. Die Primärstrukturen von VfLuxP und EGFP sind in diesem Fusionskonstrukt durch eine Erkennungssequenz für Thrombin getrennt. Für die heterologe Expression von VfLuxP-EGFP wurde das Plasmid pETVfluxP-egfp in E. coli HMS174(DE3) pLysS, E. coli BL21(DE3) pLysS sowie E. coli KIB2 transformiert. Die Induktion der Expression erfolgte nach der Zugabe von 0,4 µM IPTG zu einer exponentiell wachsenden Kultur. In E. coli HMS174(DE3) pLysS konnte keine Synthese des VfLuxP-EGFP nachgewiesen werden. Das Protein konnte aber sowohl in E. coli BL21(DE3) pLysS (Abbildung 3-28) als auch in E. coli KIB2 (Abbildung 3-29) nachgewiesen werden. In der anti-EGFP Westernblotanalyse kann man Signale erkennen, die der Größe des Proteins (67,8 kDa) in etwa entsprechen. In E. coli BL21(DE3) pLysS erreicht die Proteinsynthese ein Maximum ca. 2-3 h nach der Induktion, danach nimmt die Proteinmenge ab. In E. coli KIB2 wird das Maximum der Expression nach ca. 4 h erreicht, das Protein wird auch hier abgebaut, so dass nach einer Expressionsdauer von über 16 h (ü. N.) kein VfLuxP-EGFP mehr detektiert werden kann. 3.2.3.3.2. EGFP - V. fischeri LuxP(aa 28-372) (EGFP-VfLuxP) Für die Expression des VfLuxP mit einem N-terminalen EGFP wurden mithilfe Primerpaaren EGFP-VfLuxPNcofor/EVfLThrOEPrev und EVfLThrOEPfor/EGFP-VfLuxPNcofor sowie der 99 Ergebnisse genomischen DNA von V. fischeri DSM 507 und des Plasmids pETegfp-VhluxP als Template die ORFs von EGFP und VfLuxP(aa 28-372) (ohne der Stoppcodons) amplifiziert. Anschließend wurden die Einzelfragmente mittels overlap-extension PCR zusammengeführt, so dass zwischen die Leserahmen von EGFP und VfLuxP die Erkennungssequenz für Thrombin hinzugefügt wurde. Die DNA wurde über die Restriktionsstellen NcoI und XhoI in die MCS des Vektors pET23d integriert und dadurch mit der Kodierungssequenz für den C-terminalen His6-Tag fusioniert. Die Klone wurden anschließend mittels Sequenzierung überprüft. Das aus der Klonierung resultierende Plasmid pETegfp-VfluxP wurde für die Expression des 598 aa umfassendes EGFPVfLuxP Proteins mit einem theoretischen Molekulargewicht von 67,7 kDa in E. coli verwendet. Bei der Expression von EGFP-VfLuxP in E. coli HMS174(DE3) pLysS (ohne Abbildung) konnte kein Protein mit der entsprechenden Größe detektiert werden. In einer Western-Blot Analyse mit einem Anti-EGFP Antikörper konnte nur ein Protein mit einem Molekulargewicht von ca. 27 kDa detektiert werden, dass dem EGFP entspricht und auf ein Abbau des Fusionskonstrukts hindeutet. Bei der Expression von EGFP-VfLuxP in E. coli BL21(DE3) pLysS (Abbildung 3-28) sowie E. coli KIB2 (Abbildung 3-29) konnten ähnliche Resultate erzielt werden. Auch hier konnte nur das EGFP, aber kein Protein in der Größe von 67,7 kDa, detektiert werden. 100 ü. N. 4h 3h 2h 1h Induktion ü. N. VfLuxp-EGFP 4h 3h 2h 1h EGFP-VfLuxP Induktion BL21(DE3) pLysS Marker Ergebnisse ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 A ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 B Abbildung 3-28: Expressionsanalyse von EGFP-VfLuxP und VfLuxP-EGFP in E. coli BL21(DE3) pLysS. Der E. coli Stamm BL21(DE3) pLysS wurde entsprechend mit dem EGFP-VfLuxP kodierenden Plasmid pETegfp-VfluxP oder mit dem VfLuxP-EGFP kodierenden Plasmid pETVfluxP-egfp transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG zu der Kultur wurde die Expression der Proteine induziert. Die Probenentnahme erfolgte bei der Induktion, nach 1, 2, 3 bzw. 4 h sowie nach der Kultivierung ü. N.. Die Proben wurden auf zwei zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-EGFP Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (FERMENTAS) verwendet. 101 ü. N. 4h 3h 2h 1h Induktion ü. N. VfLuxp-EGFP 4h 3h 2h 1h EGFP-VfLuxP Induktion BL21(DE3) pLysS Marker Ergebnisse ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 A ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 B Abbildung 3-29: Expressionsanalyse von EGFP-VfLuxP und VfLuxP-EGFP in E. coli KIB2. Der E. coli Stamm KIB2 wurde entsprechend mit dem EGFP-VfLuxP kodierenden Plasmid pETegfp-VfluxP oder mit dem VfLuxPEGFP kodierenden Plasmid pETVfluxP-egfp transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG zu der Kultur wurde die Expression der Proteine induziert. Die Probenentnahme erfolgte bei der Induktion, nach 1, 2, 3 bzw. 4 h sowie nach der Kultivierung ü. N.. Die Proben wurden auf zwei zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-EGFP Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (FERMENTAS) verwendet. 3.2.4. Escherichia coli LsrB – Fusionsprotein Das E. coli AI-2 Rezeptorprotein LsrB (EcLsrB) weist eine sehr hohe Homologie zu dem AI-2 Rezeptorproteins LsrB von Salmonella enterica Serovar Typhimurium (StLsrB) auf [3, 105]. In StLsrB liegen sowohl der N-Terminus als auch der C-Terminus frei und nehmen nicht an der Bindung von AI-2 teil, es wurde deswegen angenommen, dass in EcLsrB die Termini auch an der AI-2 Bindung nicht beteiligt sind. Die Signalsequenz des EcLsrB wurde online mittels SignalP ermittelt [1] und umfasst 26 aa. In Rahmen dieser Arbeit wurde das E. coli LsrB Protein ohne 102 Ergebnisse Signalsequenz exprimiert (EcLsrB 26). Ein Protein mit Signalsequenz wäre von E. coli in das Periplasma transportiert worden und könnte nicht mehr aus Cytoplasma gewonnen werden. Für die Expression von EcLsrB 26 wurde der kodierende Leserahmen (aa 27-340, ohne Stoppcodon) mittels Primer fLsrBNcoI und rLsrBXhoI sowie der genomischen DNA von E. coli K12 als Template amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde anschließend über die Restriktionsstellen NcoI/XhoI in die MCS des Vektors pET23d integriert und somit in frame mit der His6-Tag kodierenden Sequenz des Vektors fusioniert. Das aus der Klonierung resultierende Plasmid pETEclsrB 26 kodiert ein 323 aa umfassendes Protein mit einem theoretischen Molekulargewicht von 35 kDa. Die Expression des EcLsrB 26 Proteins erfolgte in E. coli BL21(DE3)pLysS, E. coli KIB2 und E. coli HMS174(DE3) pLysS. Bei der Expressionsanalyse in E. coli KIB2 (Abbildung 3-30) und in E. coli BL21(DE3) pLysS (Anhang, Abbildung A-21) kann man bereits 1 h nach der Induktion eine prominente Bande in der Coomassie Färbung (jeweils A) erkennen. In beiden Stämmen wird das Expressionsmaximum ca. 3-4 h nach der Induktion erreicht. Es gibt keine Hinweise auf Abbau des Proteins während der Expression. In der anti-Tetra-His Westernblotanalyse konnten neben den dem Protein entsprechenden Banden in der Größe von 35 kDa auch schwache Signale von ca. 70 kDa detektiert werden. Diese könnten einem Dimer des Proteins entsprechen. EcLsrB 26 konnte auch in E. coli HMS174(DE3) pLysS erfolgreich exprimiert werden (Anhang, Abbildung A22). Um Informationen über die Löslichkeit des EcLsrB 26 zu gewinnen, wurde das Protein in E. coli HMS174(DE3) pLysS exprimiert und wie unter 2.2.15 beschrieben, aufgereinigt (Abbildung 3-31). Aus dem im Gesamtlysat vorhandenen Protein konnte nur ein Teil in den löslichen Klarlysat überführt werden. Wie auch VhLuxP Proteine ist das EcLsrB 26 im großen Teil unlöslich. Nichtsdestotrotz reicht die im Klarlysat vorhandene Proteinmenge aus um es unter nativen Bedingungen aufreinigen zu können. Im Eluat kann nur sauberes EcLsrB 26 detektiert werden. 103 ü. N. 4h 3h 2h 1h EcLrsB 26 Induktion BL21(DE3) pLysS Marker Ergebnisse ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 Abbildung 3-30: Expressionsanalyse von EcLsrB 26 in E. coli KIB2 Der E. coli Stamm KIB2 wurde mit dem EcLsrB 26 kodierenden Plasmid pETEclsrB 26 transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG zu der Kultur wurde die Expression der Proteine induziert. Die Probenentnahme erfolgte bei der Induktion, nach 1, 2, 3 bzw. 4 h sowie nach der Kultivierung ü. N.. Die Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die antiTetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (FERMENTAS) verwendet. A ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 B BSA (2,5 µg) BSA (5 µg) Eluat Waschfra ktion Durchfluss Unlösliche Proteine Klarlysat Gesamtlysat Marker EcLsrB ~70 ~55 ~35 ~27 A ~70 ~55 ~35 ~27 B Abbildung 3-31: Aufreinigung von EcLsrB 26 aus E. coli HMS174(DE3) pLysS Der E. coli Stamm HMS174(DE3) pLysS wurde mit dem EcLsrB 26 kodierenden Plasmid pETEclsrB 26 transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Nach der Induktion der Expression durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG wurde die Kultivierung für 3 h fortgesetzt. Danach wurden die Zellen geerntet, in Puffer B (2.2.15) aufgenommen und aufgeschlossen (Gesamtlysat). Durch die Zentrifugation wurde das lösliche Klarlysat von den unlöslichen Proteinen 2+ getrennt. Das Klarlysat wurde auf eine Ni -IDA-SepharoseSäule aufgetragen, wobei das nicht angebundene Material (Durchfluss) aufgefangen wurde. Nach mehreren Waschschritten (Waschfraktion) erfolgte die Elution mit Puffer E (Eluat). Alle Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Zur Einschätzung der Proteinmenge wurde auf die Gele 2,5 und 5 µg BSA aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (FERMENTAS) verwendet. 104 Ergebnisse 3.3. Etablierung des AI-2-Bioassays 3.3.1. In-vitro Synthese von AI-2 Für die in-vitro Synthese des AI-2 sind die Enzyme LuxS und Pfs notwendig [154]. Im Rahmen dieser Arbeit wurden LuxS und Pfs aus E. coli und aus V. fischeri kloniert, exprimiert und aufgereinigt. Die Amplifizierung der Leserahmen (ohne Stoppcodon) erfolgte mittels folgender Primerpaare: EcluxSNdefor/EcluxSXhorev (E. coli LuxS (EcLuxS)), EcpfsNdefor/EcpfsXhorev (E. coli Pfs (EcPfs)), VfluxSNdefor/VfluxSXhorev (V. fischeri LuxS (VfLuxS)) und VfpfsNdefor/ VfpfsXhorev (V. fischeri Pfs (VfPfs)). Als Template wurde entsprechend genomische DNA von E. coli K-12 oder V. fischeri DSM 507 verwendet. Über die Restiktionsstellen NdeI und XhoI wurden die PCR Produkte in die MCS des Vektors pET23b integriert und somit mit der His6-Tag kodierenden Sequenz fusioniert. Anschließend wurden die resultierenden Plasmide (pETEcluxS, pETEcpfs, pETVfluxS, pETVfpfs) mittels Sequenzierung überprüft und für die Expression von EcLuxS, EcPfs, VfLuxS und VfPfs in E. coli BL21(DE3) pLysS verwendet. Alle vier Enzyme konnten in E. coli überexprimiert werden (Ergebnisse siehe Anhang). Nach einem Aufreinigungsversuch erwies sich EcPfs als unlöslich, und somit als nicht geeignet für die AI-2 in-vitro Synthese. Das VfLuxS Protein kann ebenfalls in der AI-2 Synthese nicht verwendet werden, da es instabil ist und unmittelbar nach der Elution ausfällt. In der Abbildung 3-32 sind die Ergebnisse der Aufreinigung der Enzyme EcLuxS sowie VfPfs dargestellt. Die dem Proteinen entsprechenden Banden in der Größe von ca. 20 kDa (EcLuxS) und ca. 27 kDa (VfPfs) sind sowohl in der Commassie Blau Färbung, als auch in der WesternBlot-Analyse sehr gut zu erkennen. Beide Proteine sind löslich, befinden sich somit vorwiegend im Klarlysat und können problemlos aufgereinigt werden, da im Eluat keine Verunreinigungen festgestellt wurden. Die ca. 40 kDa großen Banden bei der Aufreinigung von EcLuxS entsprechen einem Dimer. Sowohl EcLuxS als auch VfPfs waren nach der Aufreinigung stabil und wurden bei der invitro AI-2 Synthese verwendet. Da LuxS und Pfs unterschiedliche Reaktionen in der AI-2 Synthese katalysieren [154], ist die Verwendung von Enzymen aus verschiedenen Organismen in der Synthese möglich. Unter der Verwendung von EcLuxS und VfPfs konnte, ausgehend von 1 mM Substrat SAH, in der in-vitro AI-2 Synthese (Punkt 2.2.23) ca. 0,7 mM DPD erzeugt werden. Nach der 105 Ergebnisse Entfernung der Enzyme durch Filtration wurden die Reaktionssätze gefriergetrocknet, wobei das Lyophilisat aus weißen bis leicht gelblichen, flockigen Kristallen bestand. Marker BSA (5 µg) BSA (2,5 µg) Eluat Durchfluss Unlösliche Proteine Klarlysat Gesamtlysat Eluat VfPfs Durchfluss Unlösliche Proteine Klarlysat Gesamtlysat BL21(DE3) pLysS Marker EcLuxS ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 A ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 ~15 B Abbildung 3-32: Aufreinigung von EcLuxS und VfPfs aus E. coli BL21(DE3) pLysS. Der E. coli Stamm BL21(DE3) pLysS wurde entsprechend mit dem EcLuxS kodierenden Plasmid pETEcluxS oder mit dem VfPfs kodierenden Plasmid pETVfpfs transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Nach der Induktion der Expression durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG wurde die Kultivierung für 3 h fortgesetzt. Danach wurden die Zellen geerntet, in Puffer B (2.2.15) aufgenommen und aufgeschlossen (Gesamtlysat). Durch die Zentrifugation wurde das lösliche Klarlysat von den 2+ unlöslichen Proteinen getrennt. Das Klarlysat wurde auf eine Ni -IDA-Sepharose-Säule aufgetragen, wobei das nicht angebundene Material (Durchfluss) aufgefangen wurde. Nach mehreren Waschschritten (Waschfraktion) erfolgte die Elution mit Puffer E (Eluat). Alle Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Zur Einschätzung der Proteinmenge wurde auf die Gele 2,5 bzw. 5 µg BSA aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde BenchMark prestained (INVITROGEN) verwendet. 3.3.2. Konstruktion der Bioassay-Reporter-Plasmide Die Konstruktion der Bioassay-Reporter-Plasmide beinhaltet die Klonierung eines Reportergens unter Kontrolle des von AI-2 regulierten Promotors lsr aus E. coli. Mittels Primer LsrEcoRIfor/LsrHindIIIrev und der genomischen DNA von E. coli K-12 als Template wurde der Promotorbereich des lsr-Operons amplifiziert. Als Reportergen wurde der Leserahmen von DsRed (Discosoma sp. red fluorescent protein) aus dem Plasmid pTPQ128 mit Hilfe der Primer 106 Ergebnisse fDsRedHindIII/rDsRedEcoRV amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden entsprechend mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und HindIII (lsr) oder HindIII und EcoRV (DsRed) verdaut und über die Restriktionsstellen EcoRI/EcoRV in den Vektor pBR322 bzw. über die Restiktionsstellen EcoRI/SmaI in den Vektor pUC18 integriert. Die korrekte Integration des kompletten lsr Promotors sowie des DsRed-Gens wurde mittels Sequenzierung überprüft. Auf diesem Weg wurden zwei Reporter-Plasmide konstruiert, pBRDsRed – ein low copy Plasmid sowie pUCDsRed – ein high copy Plasmid. An der Regulierung des lsr-Promotors ist der Repressor LsrR beteiligt. Dieser bindet bei entsprechend hoher Konzentration von cAMP/CRP im Promotorbereich bei Abwesenheit von Phospo-AI-2 und blockiert die Expression der lsr-Gene [184]. Die Verwendung eines high-copy Plasmids als Reporter bringt das Risiko mit sich, dass in der E. coli Zelle nicht genug vom Repressor vorhanden ist, um den Promotor im Abwesenheit von Phospo-AI-2 effektiv zu blockieren, was die Expression von DsRed unabhängig von AI-2 als Konsequenz hätte. Um dies zu vermeiden, wurden auf Basis von pUCDsRed weitere Plasmide konstruiert, die auch das Gen des Repressors, lsrR, beinhalten. Die Klonierung eines Reporterplasmids mit induzierbaren Repressor LsrR, pUCDSLR1, erfolgte in mehreren Schritten. Mittels Primer flsrRPstI/rlsrRBamHI und der genomischen DNA von E. coli K-12 als Template wurde zuerst der kodierende Leserahmen für LsrR amplifiziert und über die Restriktionsstellen PstI und BamHI in die MCS der Vektor pUC19 integriert. Das resultierende Plasmid pUClsrR wurde als Template für eine weitere Amplifizierung des Leserahmens mit Hilfe der Primer flsrRRBSSalI/rlsrRHABamHI benutzt. Der lsrR-Leserahmen wurde somit mit einem RBS (ribosom binding site) sowie einem C-terminalen HA-Tag versehen und anschließend über die Restiktionsstellen SalI und BamHI hinter dem lacZ-Promotorbereich des Plasmids pUCDsRed integriert. In einem weiteren Reporterplasmid, pUCDSLR2 wurde das Gen des Repressors unter die Kontrolle des nativen Promotors lsr gebracht. Dazu wurde der Leserahmen für LsrR mit Hilfe der Primer flsrRClaI/rlsrREcoRI und der genomischen DNA von E. coli K-12 amplifiziert und über die Restriktionsstellen ClaI und EcoRI in den Plasmid pUCDsRed integriert. Eine Übersicht der konstruierten Bioassay-Reporter-Plasmide ist in der Abbildung 3-33 dargestellt. 107 Ergebnisse pUCDsRed (high copy) lsr lsrR lacZ DsRed pBRDsRed (low copy) lsr pUCDSLR1 (high copy) lsr DsRed pUCDSLR2 (high copy) DsRed lsrR lsr DsRed Abbildung 3-33: Schematische Darstellung der Bioassay-Reporter-Plasmide. lsr – Promotorbereich des lsr-Operons; DsRed - rot fluoreszierendes Protein; lacZ – lacZ-Promotor, induzierbar durch Laktose bzw. andere Galaktopiranoside (IPTG). 3.3.3. Etablierung der Bioassay – Bedingungen Der lsr-Promotor wird von Phospho-AI-2 sowie dem cAMP-CRP-Komplex reguliert [184]. Dementsprechend hat die Konzentration von Glukose direkt Einfluss auf die Fluoreszenz des Reporterproteins. In unterschiedlichen E. coli Stämmen kann die Aufnahmefähigkeit von Glukose variieren. Aus diesen Gründen müssen die konstruierten Bioassay-Reporterplasmide auf deren Fluoreszenzeigenschaften in Bezug auf E. coli Stamm, Glc-Konzentration sowie AI-2 Konzentration überprüft werden. Für die Bestimmung einer optimalen Glc-Konzentration wurden die BioassayReporterplasmide in E. coli transformiert. Anschließend wurden die Transformanden in ABMedium mit Zugabe einer entsprechenden Konzentration von Glc kultiviert, wobei der Anstieg der Fluoreszenz in einem Zeitraum von ca. 14 h mittels Mikroplattenreader (FluoStar Optima, BMG LABTECH) gemessen wurde. Es wurden E. coli Stämme BL21(DE3), KIB1, TOP10 sowie KIT2 verwendet, wobei die Fluoreszenz eines wt-Stammes mit dem abkommenden luxSDeletionsstamm verglichen wurde. Bei einer geeigneten Glc-Konzentration sollte es einen deutlichen Unterschied in der Fluoreszenz des wt- und KO Stammes geben. Die optimale GlcKonzentration für den jeweiligen Stamm wäre somit solche, bei der keine Fluoreszenz bei dem KO Stamm und eine hohe Fluoreszenz bei dem wt-Stamm gemessen werden könnte. In den Messungen wurden Glc-Konzentrationen aus dem Bereich zwischen 0 bis 0,5% verwendet. 108 Ergebnisse Als erstes Bioassay-Konstrukt wurde der pUCDsRed überprüft. Bei der Untersuchung des Fluoreszenzanstiegs in E. coli TOP10 und in E. coli KIT2 (Abbildung 3-34) konnten Unterschiede in der Fluoreszenz bei einer Glc-Konzentration von 0,05% beobachtet werden. Demnach stieg die Fluoreszenz nach ca. 14 h bei dem wt-Stamm bis auf 1000 Einheiten, bei dem KO Stamm dagegen nur auf 600 Einheiten. E. coli TOP10 pUCDsRed Fluoreszenz 1200,0 1000,0 800,0 600,0 400,0 200,0 -200,0 0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2,4 2,7 3,1 3,5 3,9 4,3 4,7 5,1 5,5 5,9 6,3 6,7 7,1 7,5 7,8 8,2 8,6 9,0 9,4 9,8 10,2 10,6 11,0 11,4 11,8 12,2 12,6 12,9 13,3 13,7 14,1 14,5 0,0 ohne Glc 0,05% Glc 0,1% Glc Zeit [h] E. coli KIT2 pUCDsRed Fluoreszenz 1400,0 1200,0 1000,0 800,0 600,0 400,0 200,0 0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2,4 2,7 3,1 3,5 3,9 4,3 4,7 5,1 5,5 5,9 6,3 6,7 7,1 7,5 7,8 8,2 8,6 9,0 9,4 9,8 10,2 10,6 11,0 11,4 11,8 12,2 12,6 12,9 13,3 13,7 14,1 14,5 0,0 ohne Glc 0,05% Glc 0,1% Glc Zeit [h] Abbildung 3-34: Anstieg der Fluoreszenz von E. coli TOP10 pUCDsRed sowie E. coli KIT2 pUCDsRed bei Glukosekonzentration von 0, 0.05 und 0.1%. Das mit einer entsprechenden Menge an Glc versetzte AB-Medium wurde 1:100 mit einer E. coli Vorkultur versetzt und in eine Mikrotiterplatte aliquotiert. Der Anstieg der Fluoreszenz wurde in einem Zeitraum von ca. 14 h gemessen. Die Untersuchung des Fluoreszenzanstiegs in E. coli BL21(DE3)/KIB1 pUCDsRed (ohne Abbildung) ergab bei keiner der untersuchten Glc-Konzentrationen wesentliche Unterschiede in der Fluoreszenz der beiden Stämme. Aus diesem Grund wurden diese Stämme in Zusammenhang mit dem Reporterplasmid pUCDsRed für die weitere Verwendung verworfen. Nachdem der geeignete E. coli Stamm (KIT2) sowie die adäquate Glc-Konzentration (0,05%) für die Verwendung des Reporterplasmids pUCDsRed bestimmt wurden, wurde die Fluoreszenz in Abhängigkeit von AI-2 untersucht. Dazu wurde das AB-Medium mit 0,05% Glc 109 Ergebnisse 1:100 mit einer E. coli KIT2 pUCDsRed ü. N. Kultur angeimpft, aliquotiert und mit AI-2 bis einer Endkonzentration von 0, 12,5, 50, 100 oder 200 µM versetzt. Die Fluoreszenz der Proben wurde nach einer Inkubationszeit von 4, 6, 8 sowie 10 h festgehalten [Abbildung 3-35]. Idealerweise sollte bei dieser Messung keine signifikante Fluoreszenz detektierbar sein, wenn kein AI-2 zugegeben wurde. Dies ist bei dieser Messung nicht der Fall gewesen. Nach einer Kultivierungszeit von 10 h ist der Fluoreszenzlevel in den ohne AI-2 inkubierten Zellen sehr hoch (1200 Einheiten). Die niedrigste Fluoreszenz konnte für eine AI-2 Konzentration von 100 µM gemessen werden. Aufgrund dieser Daten wurde der Reporterplasmid pUCDsRed als nicht geeignet deklariert und für weitere Untersuchungen verworfen. Fluoreszenz E. coli KIT2 pUCDsRed - Zugabe von AI-2 bei 0,05% Glc 1600,0 1400,0 1200,0 1000,0 800,0 600,0 400,0 200,0 0,0 0 20 40 4h 60 6h 80 8h 100 120 140 10h 160 180 200 AI-2 Konzentration [µM] Abbildung 3-35: Fluoreszenz von E. coli KIT2 pUCDsRed in Abhängigkeit von der AI-2 Konzentration bei einer GlcKonzentration von 0,05%. Das AB-Medium mit 0,05% Glc wurde 1:100 mit einer E. coli KIT2 pUCDsRed ü. N. Kultur angeimpft, aliquotiert und mit AI-2 bis einer Endkonzentration von 12,5, 50, 100 oder 200 µM versetzt. Es wurde die Fluoreszenz der Proben nach 4, 6, 8 sowie 10 h gemessen. Bei der Untersuchung des weiteren Reporterplasmids pUCDSLR1 wurde keine signifikante Fluoreszenz gemessen. Diese wurde für E. coli Stämme TOP10, KIT2, BL21(DE3) und KIB1 sowie Glc-Konzentration von 0 bis 0,5% überprüft (ohne Abbildung), wobei die Synthese des Repressors LsrR in den Messungen gar nicht induziert wurde. Somit musste die auch dieser Konstrukt für die Verwendung im Bioassay verworfen werden. Eine vielversprechende Situation konnte bei der Untersuchung des Reporterplasmids pUCDSLR2 in E. coli TOP10/KIT2 und 0,05 % Glc beobachtet werden (Abbildung 3-36). Demnach betrug die Fluoreszenz nach ca. 14 h etwa 600 Einheiten bei dem wt-Stamm, bei dem KO Stamm waren es dagegen lediglich 200 Einheiten. Die Zugabe von AI-2 in einer Konzentration von bis zu 250 µM konnte jedoch keine Fluoreszenz in E. coli KIT1 pUCDSLR2 induzieren (ohne 110 Ergebnisse Abbildung). Aus diesem Grund wurde auch dieses Konstrukt für die weitere Verwendung ausgeschlossen. E. coli TOP10 pUCDSLR2 Fluoreszenz 800,0 700,0 600,0 500,0 400,0 300,0 200,0 100,0 -100,0 0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2,4 2,7 3,1 3,5 3,9 4,3 4,7 5,1 5,5 5,9 6,3 6,7 7,1 7,5 7,8 8,2 8,6 9,0 9,4 9,8 10,2 10,6 11,0 11,4 11,8 12,2 12,6 12,9 13,3 13,7 14,1 14,5 0,0 0,5% Glc 0,1% Glc 0,05% Glc 0,01% Glc Zeit [h] E. coli KIT2 pUCDSLR2 Fluoreszenz 250,0 200,0 150,0 100,0 50,0 0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2,4 2,7 3,1 3,5 3,9 4,3 4,7 5,1 5,5 5,9 6,3 6,7 7,1 7,5 7,8 8,2 8,6 9,0 9,4 9,8 10,2 10,6 11,0 11,4 11,8 12,2 12,6 12,9 13,3 13,7 14,1 14,5 0,0 -50,0 0,5% Glc 0,1% Glc 0,05% Glc 0,01% Glc Zeit [h] Abbildung 3-36: Anstieg der Fluoreszenz von E. coli TOP10 pUCDSLR2 sowie E. coli KIT2 pUCDSLR2 bei Glukosekonzentration von 0,01, 0,05 und 0,1 und 0,5 %. Das mit einer entsprechenden Menge an Glc versetzte AB-Medium wurde 1:100 mit einer E. coli Vorkultur versetzt und in eine Mikrotiterplatte aliquotiert. Der Anstieg der Fluoreszenz wurde in einem Zeitraum von ca. 14 h gemessen. Bei der Überprüfung des low-copy Reporterplasmids pBRDsRed in den E. coli Stämmen TOP10/KIT2 konnte kein signifikanter Unterschied in Fluoreszenz bei den verwendeten GlcKonzentrationen gemessen werden (ohne Abbildung). In E. coli BL21(DE3)/KIB1 pBRDsRed (Abbildung 3-37) konnte für 0,05% Glc eine Differenz von ca. 150 Einheiten detektiert werden. Bei einer Glc-Konzentration von 0,1% war auch ein Unterschied von etwa 30 Einheiten messbar. 111 Ergebnisse E. coli BL21(DE3) pBRDsRed Fluoreszenz 500,0 400,0 300,0 200,0 100,0 0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2,4 2,7 3,1 3,5 3,9 4,3 4,7 5,1 5,5 5,9 6,3 6,7 7,1 7,5 7,8 8,2 8,6 9,0 9,4 9,8 10,2 10,6 11,0 11,4 11,8 12,2 12,6 12,9 13,3 13,7 14,1 14,5 0,0 -100,0 0,5% Glc 0,1% Glc 0,05% Glc Zeit [h] E.coli KIB1 pBRDsRed Fluoreszenz 350,0 300,0 250,0 200,0 150,0 100,0 50,0 -50,0 0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2,4 2,7 3,1 3,5 3,9 4,3 4,7 5,1 5,5 5,9 6,3 6,7 7,1 7,5 7,8 8,2 8,6 9,0 9,4 9,8 10,2 10,6 11,0 11,4 11,8 12,2 12,6 12,9 13,3 13,7 14,1 14,5 0,0 0,5% Glc 0,1% Glc 0,05% Glc Zeit [h] Abbildung 3-37: Anstieg der Fluoreszenz von E. coli BL21(DE3) pBRDsRed sowie E. coli KIB1 pBRDsRed bei Glukosekonzentration von 0,05 und 0,1 und 0,5 %. Das mit einer entsprechenden Menge an Glc versetzte AB-Medium wurde 1:100 mit einer E. coli Vorkultur versetzt und in eine Mikrotiterplatte aliquotiert. Der Anstieg der Fluoreszenz wurde in einem Zeitraum von ca. 14 h gemessen. Im weiteren Schritt wurde die Fluoreszenz von E. coli KIB1 pBRDsRed in Abhängigkeit von AI-2 untersucht, wobei bei den Messungen Glc-Konzentrationen von 0,05 sowie 0,1% verwendet wurden. Die Proben wurden mit AI-2 bis einer Endkonzentration von 0, 50, 75, 100 oder 200 µM versetzt und die Fluoreszenz nach einer Inkubationszeit von 4, 6, 8 sowie 10 h festgehalten (Abbildung 3-38). Bei 0,05% Glc konnte ein Maximum der Fluoreszenz für die AI-2Konzentration von 50 µM bestimmt werden, wobei die Fluoreszenz auch ohne Zugabe von AI-2 relativ hoch (400 Einheiten nach 10 h) war. Bei der Verwendung von 0,1% Glc war keine signifikante Fluoreszenz ohne Zugabe von AI-2 detektierbar. Ein Maximum war hier bei Zugabe von 100 µM AI-2 messbar. Von den konstruierten Reporterplasmiden ist somit der pBRDsRed der Einzige, der für die Verwendung im Bioassay in Frage kommt. Der E. coli Stamm, der mit diesem Plasmid 112 Ergebnisse verwendet werden kann ist der Stamm KIB1. Die für den Assay adäquate Glc-Konzentration beträgt 0,1 %, denn nur bei dieser Konzentration konnte keine Autoinduktion der Fluoreszenz gemessen werden. E. coli KIB1 pBRDsRed - Zugabe von AI-2 bei 0,05% Glc Fluoreszenz 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 0 20 40 4h 60 6h 80 8h 100 120 140 160 180 200 AI-2 Konzentration [µM] 10h E. coli KIB1 pBRDsRed - Zugabe von AI-2 bei 0,1% Glc Fluoreszenz 1200 1000 800 600 400 200 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 -200 4h 6h 8h 10h AI-2 Konzentration [µM] Abbildung 3-38: Fluoreszenz von E. coli KIB1 pBRDsRed in Abhängigkeit von der AI-2 Konzentration bei einer GlcKonzentration von 0,05 oder 0,1 %. Das AB-Medium mit 0,05 oder 0,1 % Glc wurde 1:100 mit einer E. coli KIT2 pUCDsRed ü. N. Kultur angeimpft, aliquotiert und mit AI-2 bis einer Endkonzentration von 12,5, 50, 100 oder 200 µM versetzt. Es wurde die Fluoreszenz der Proben nach 4, 6, 8 sowie 10 h gemessen. 3.4. Untersuchung der AI-2 Bindeaktivität der VhLuxP-Derivate Die Untersuchung der AI-2-Bindeaktivität der LuxP-Mutanten basiert auf der Titrierung der in-vitro hergestellten AI-2 mit jeweiligen LuxP-Derivat. Die AI-2-Protein Komplexe werden anschließend abfiltriert, wodurch Konzentration der freien AI-2 in der Lösung abnimmt. Je stärker die Bindung zwischen AI-2 und Protein, desto mehr AI-2 können titriert werden und desto geringer ist die Konzentration der freien AI-2. Die Abnahme der AI-2 Konzentration wurde mittels Bioassay unter der Verwendung des Reporterstamms E. coli KIB1 pBRDsRed gemessen (Abbildung 3-40). Die Startkonzentration der AI-2 vor der Titration wurde so bestimmt, dass im 113 Ergebnisse Fall, wenn keine AI-2-Moleküle titriert werden, eine Endkonzentration von 100 µM erreicht wird. P P Fluoreszenz A AI-2 P Keine Fluoreszenz LuxP P B Phosphatgruppe Abbildung 3-39: Vereinfachte Darstellung der Untersuchung der AI-2 Bindeaktivität der Mutanten mittels E. coli KIB1 pBRDsRed Bioassay. A: Nach der Zugabe von in-vitro hergestellten AI-2 zu einer E. coli KIB1 pBRDsRed Kultur werden diese in die Zellen transportiert, phosphoryliert und aktivieren durch die Derpression von LsrR die Expression von DsRed. B: Werden die in-vitro hergestellten AI-2 zuvor mit dem LuxP-Protein titriert, stehen keine freie AI-2 Moleküle mehr zu Verfügung und können nicht in die Zellen transportiert werden. Der Repressor LuxR blockiert die Expression von DsRed und es kann keine Fluoreszenz gemessen werden. Wird die Bindung von LuxP und AI-2 durch die Einführung der Mutationen gestört, werden weniger AI-2 Moleküle aus der Lösung titriert. Die freien AI-2 können in die Zellen transportiert werden und die Fluoreszenz induzieren, die aber geringer ausfällt als in Situation A. Die in-vitro hergestellten AI-2 wurden in parallel ablaufenden Versuchen mit dem jeweiligen Derivat und mit EGFP-VhLuxP als Kontrolle titriert. Da diese sich in der Bindeaktivität unterscheiden, ist auch die Konzentration der AI-2 Moleküle nach der Titration verschieden, was letztendlich bei der Induktion eines Reporterstamms eine Differenz in Fluoreszenz ergibt. Die Aktivität der jeweiligen Mutante wurde als Verhältnis der resultierenden Fluoreszenzen bestimmt (Punkt 2.2.26). Die ermittelten AI-2 Bindeaktivitäten der Mutanten sind in der Abbildung 3-40 zusammengefasst. Als Kontrolle wurde auch die Bindeaktivität des 114 Ergebnisse hitzedenaturierten EGFP-VhLuxP gemessen. Diese betrug ca. 70 % der Aktivität von EGFPVhLuxP (ohne Abbildung). AI-2 Bindeaktivität der Mutanten % Aktivität 140,0 120,0 100,0 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0 Mut. 1 Mut. 2 Mut. 3 Mut. 4 Mut. 5 Mut. 6 Mut. 7 Mut. 8 Mut. 9 Mut.10 Mut. 11 Mut. 12 Mut. 13 % Aktivität 98,6 89,6 94,6 89,1 84,4 82,5 78,6 78,2 ±% 5,5 1,2 3,6 6,2 4,5 10,5 8,3 5,6 84,2 118,1 120,9 96,0 115,7 8,3 11,3 7,2 3,3 6,1 Abbildung 3-40: AI-2 Bindeaktivität der VhLuxP-Mutanten ermittelt mithilfe des Bioassays unter der Verwendung des Reporterstamms E. coli KIB1 pBRDsRed, in % der Aktivität von EGFP-VhLuxP Die ermittelten Bindeaktivitäten sowie die Standartabweichungen wurden in der Tabelle unten aufgelistet. Die Daten wurden anhand drei bis fünf unabhängig durchgeführter Versuche ermittelt. Für die Mutanten 1-9 sowie 12 war die ermittelte Bindeaktivität niedriger als die Aktivität von EGFP-VhLuxP. Widererwarten fiel aber die Aktivität von Mutanten 10, 11 und 13 höher als die von EGFP-VhLuxP. Die Standardabweichungen lagen zwischen 1,2 % (Mut. 2) bis 11,3 % (Mut. 10). 115 Diskussion 4. Diskussion Auch wenn die erste Beobachtung eines bakteriellen Biofilms (Zahnbelags) von Antoni van Leeuwenhoek (1683) schon über 300 Jahre in der Vergangenheit liegt, bereitet die Biofilmbildung heute immer noch Schwierigkeiten. Bakterielle Biofilme sind nicht nur ein großes Problem in der Implantologie, sondern auch bei der Zubereitung von Trinkwasser und bei diversen biotechnologischen Verfahren. Die Detektion der biofilmbildenden Bakterien kann sowohl auf dem Weg der mikrobiologischen Analysen (Probennahme und Anzucht an Selektivnährböden) als auch über molekularbiologische Verfahren (u.a. PCR-Analyse) nur bedingt erfolgen. Diese Nachweismethoden sind sehr zeitaufwendig und weisen keine ausreichende Sensitivität auf. Es ist gleichzeitig bekannt, dass die Entstehung von Biofilmen über Quorum sensing reguliert wird [81]. Die Entwicklung eines Biosensors zur Detektion des Autoinducer-2 könnte somit eine indirekte Detektion der biofilmbildenden Bakterien ermöglichen und einen enormen Fortschritt in der Umwelttechnologie, Medizintechnik und Biotechnologie bedeuten. Derartiger Sensor könnte vorwiegend zur online-Überwachung von bakteriellen Kontanimationen in biotechnologischen Verfahren werwentet werden. Als biologische Komponente des Biosensors könnte der AI-2 Rezeptor LuxP verwendet werden, auch die Verwendung ganzer Zellen ist denkbar. In dieser Arbeit wurden die molekularbiologische Grundlagen zur Entwicklung eines AI-2 Biosensors gelegt. Es wurden E. coli luxS Deletionsstämme hergestellt, die keine AI-2 produzieren und somit sowohl für die Expression der Rezeptorproteine als auch für die Entwicklung eines AI-2 Bioassays und perspektivisch eines Ganzzellsensors geeignet sind. Es wurden diverse AI-2 Rezeptorproteine mit unterschiedlichen Fusionsdomänen funktionalisiert. Die Anfusionierung eines Histidin-Hexapeptid ermöglicht eine schnelle und einfache chromatographische Aufreinigung der Proteine. Grün fluoreszierende Rezeptorproteine können für eine Entwicklung von optischen Biosensoren verwendet werden. Die Modifizierung von LuxP mit Aspartat/Glutamat-Hexadecapeptid vereinfacht die Verwendung von dieser in Verbindung mit ISFET-Sensoren. Zusammen mit den von K. Zirpel für die massensensitive Sensorik entwickelten LuxP-ß-Galaktosidase-Fusionskonstrukte [195] steht eine große Auswahl an Rezeptorproteinen zur Verfügung, die als biolgische Komponente eines AI-2 Sensors Anwendung finden können. Weitergehende Studien, die Immobilisierug der LuxP-Proteine bzw. 116 Diskussion AI-2 an Sensoroberfächen beinhalten und zur Entwicklung eines AI-2-Biosensor führen sollten, werden zur Zeit am Institut für Werkstoffwissenschaften der Technischen Universität Dresden und am Max-Bergmann-Zentrum für Biomaterialien, Dresden durchgeführt. Der in Rahmen dieser Arbeit entablierter AI-2 Bioassay könnte als Werkzeug für die Untersuchung der AI-2-Bindeaktivität von LuxP-Derivaten verwendet werden. Der hierfür entwickelte E. coli Reporterstam könnte als Grundlage für eine Ganzzellbiorensor dienen. Herstellung der E. coli luxS – Deletionsstämme Mit dem von Datsenko und Wanner publizierten -Red-Rekombinase System [31] wurde eine hoch effektive und simple Methode der Gendeaktivierung für Escherichia coli beschrieben. Aufgrund von intrazellulären Exonukleasen ist die Transformation von E. coli mit linearer DNA sehr ineffizient [95]. Der System von Datsenko und Wanner basiert auf dem Rekombinationssystem des Bakteriophagen . Er ermöglicht eine Gendeaktivierung in einem Transformationsschritt mithilfe DNA-Fragmenten, die eine sehr kurze (ab 36 bp) Homologie zur chromosomalen DNA aufweisen [31]. Das -Red-Rekombinase System wurde auch bei der Herstellung der Escherichia coli luxS Deletionsstämme verwendet. Von den von Datsenko and Wanner benutzten Helferplasmiden [31] stand für diese Arbeit lediglich das Plasmid pKD3 zur Verfügung. E. coli Zellen mit weiterem Helferplasmid (pKD4) konnten trotz mehrerer Versuche nicht kultiviert werden, eine Isolierung dieses Plasmids war somit nicht möglich. Es wurden mehrere Knock-out Versuche mit der Chloramphenicol-Resistenz-KO-Kassette unternommen. Dabei wurden DNA-Fragmente benutzt, die eine Homologie von 36 nt und 50 nt erwiesen. Nach der Transformation von E. coli mit dieser Kassette wuchsen die Bakterien auf Chloramphenicol-haltigen Platten stehts als Rasen. Einzelne Kolonien konnten nur schwer gepickt werden und wuchsen nur schwach in Chloramphenicol-haltigem Medium. Chloramphenicol wirkt hemmend auf die Peptidyltransferaseaktivität. Es bindet die 50SUntereinheit der Ribosomen und wirkt somit bakteriostatisch [156]. Aus diesem Grund ist ein geringes Wachstum der Zellen möglich, was bei der Selektion positiver Klone von großem Nachteil ist. Um eine höhere Selektivität bei der Transformation mit der Gen-KO-Kassette zu erzeugen, wurde ein neuer Helferplasmid konstruiert, in dem als Resistenzmarker das Bleomycin117 Diskussion Resistenzgen (ble) gewählt wurde. Als Antibiotikum wurde Zeocin verwendet. Zeocin ist ein kupferhaltiges Antibiotikum. Bei dem Transport in die Zelle wird Cu2+ zu Cu1+ reduziert und aufgenommen. Zeocin wird durch das Entfernen von Kupfer aktiviert und bindet an DNA, schneidet diese und verursacht den Zelltod. Es wirkt somit hoch toxisch. Mit der Konstruktion des Helferplasmids pUCzeo wurde ein neuartiger und universell anwendbarer Helferplasmid für Gen-Knock-out Versuche in E. coli kreiert. Dieser kann auf der Basis von -Red-Rekombiase-System [31] alternativ zum pKD3 oder pKD4 verwendet werden. Auf dessen Basis wurde in zwei PCR Schritten eine Gen-Knock-out-Kassette synthetisiert, mit der, nach je nur einem Versuch, drei neue E. coli Stämme konstruiert werden konnten. Für eine erfolgreiche Rekombination mit dem -Red-System wurden 50 nt-lange, zu genomischen DNA homologe Überhangsequenzen benötigt. Die richtige Integration der Gen-KO-Kassette wurde für die erzeugten E. coli Stämme KIH1, KIB1 und KIT2 sowohl mittels PCR als auch mittels Southern-Blots nachgewiesen. Im weiteren Schritt sollte mithilfe des Plasmids pCP20 das Bleomycin-Resistenzgen eliminiert werden. Dies wäre vor allem dann zwingend notwendig, wenn im gleichen Stamm weitere Gene ausgeknockt werden sollten. Bei den E. coli Stämmen KIH1 und KIT1 konnte ble eliminiert und Stämme KIH2 und KIT2 konstruiert werden. Bei dem Stamm KIB1 wurden alle Ausschlussversuche von ble nicht erfolgreich. Die Ursache dafür kann in dem Genotyp von BL21(DE3) liegen. Es is möglich, dass in BL21(DE3) es zur Einschrenkungen in der Expression oder Aktivität der FLP-Rekombinase kommt. Der Verbleib des ble-Genes in E. coli KIB1 ist für die weitere Verwendung des Stammes nicht von Nachteil, deswegen wurden die Versuche dessen Eliminierung nach mehreren Misserfolgen aufgegeben. Klonierung, heterologe Expression und Aufreinigung der LuxP-Rezeptorproteine Für die Verwendung der LuxP-Rezeptorproteine als Biokomponente in einem Biosensor müssen diese heterolog hergestellt werden. Anhand der Kristallstruktur von V. harveyi LuxP [22] konnten keine Hinweise gefunden werden, die gegen Expression der Proteine in der Cytoplasma von E. coli in löslicher Form sprechen würden. Ein solcher Hinweis wäre die Anwesenheit von Disulfidbrücken, da diese in Cytoplasma von E. coli nur bedingt entstehen 118 Diskussion können [5]. Eine Alternative wäre ein gezielter Export des heterologen Proteins in das Periplasma. Die Expression der Proteine in Periplasma ist allerdings weniger effizient [5]. Die Expression der Rezeptorproteine erfolgte in E. coli BL21(DE3) pLysS, E. coli KIB2, E. coli HMS174(DE3) pLysS sowie E. coli KIH3. Dabei wurden die Stämme auf die Effektivität der Synthese der Rezeptorproteine verglichen. Die Expressionslevels zwischen wt-Stamm und KOStamm wurden gegenübergestellt, um so den Einfluss der luxS-Deletion auf die Proteinsynthese zu untersuchen. Das VhLuxP konnte in E. coli BL21(DE3) pLysS deutlich höher synthetisiert werden als in E. coli KIB2 (Abbildung 3-7 und Abbildung 3-8). In der Commassie Blau Färbung ist eine prominente Bande nur bei der Expression in BL21(DE3) pLysS zu sehen. Auch die Expression des Proteins in E. coli KIH3 war etwas niedriger als in E. coli HMS174(DE3) pLysS (Abbildung 3-6). Das VhLuxP enthält als einziges V. harveyi Konstrukt die Signalsequenz, die den Transport in das Periplasma ermöglicht. Ob diese allerdings auch bei E. coli erkannt wird, ist nicht wahrscheinlich. Die Signalsequenz von V. harveyi weist nur geringe Homologie mit der Signalsequenz auf, die bei E. coli den Transport ins Preriplasma gewährleistet. Nichtdestotrotz verringert sich die Expression des VhLuxP nach der Deletion der luxS Gens. Da dieses Phänomen nur für dieses Protein beobachtet werden konnte, muss man die Erklärung hierfür in der Präsenz der Signalsequenz suchen. Die Expression des EGFP-VhLuxP Proteins war bei allen verwendeten E. coli Stämmen deutlich niedriger als die Expression der anderen VhLuxP-Konstrukte (Abbildung 3-7, Abbildung 3-8 sowie Abbildung 3-12), was als Hinweis auf den proteolitischen Abbau des Proteins interpretiert werden könnte. Bei der Expression in E. coli HMS174(DE3) pLysS konnte der Abbau des Proteins festgestellt werden (Abbildung 3-13), was die Theorie der Proteolyse verstärkte. Durch die Fusionierung der Primärstrukturen von EGFP und VhLuxP könnte eine Erkennungssequenz für eine der E. coli Proteasen entstanden sein. In E. coli BL21(DE3) pLysS sind die zwei Proteasen (lon, ompT) inaktiv [5], somit ist die Proteolyse in diesem Stamm nur geringfügig. In E. coli HMS174(DE3) pLysS sind alle Proteasen aktiv und an dem Abbau der Proteine beteiligt. Aus diesem Grund ist der Stamm BL21(DE3) pLysS bzw. dessen luxSDeletionsstamm KIB2 für die Expression der Proteine besser geeignet. Die Expression von VhLuxP-R16 konnte in keinem der verwendeten E. coli Stämme nachgewiesen werden (Abbildung 3-16, Abbildung A-5/Anhang). Die Ursache dafür könnte in einer zu geringen Menge an L-Arginin in dem Kulturmedium liegen. Aber auch nach der Zugabe 119 Diskussion von L-Arginin zu dem Medium konnte das Protein nicht exprimiert werden. Die Synthese von einem Protein, das sechzehn nebeneinander liegende Argininreste enthält, könnte für die E. coli Zellen eine sehr große Herausforderung bedeuten. Einerseits wurde das Protein in physiologischen pH starke positive Ladung tragen, was die Stabilität des Protein negativ beeinflussen würde. Andererseits ist in E. coli nur eine begrenzte Anzahl von tRNA für den Arginin-Transport verfügbar. Auch die Aufnahme von Arginin aus Kulturmedium ist nur bis einem gewissen Level möglich. All dies kann Grund dafür sein, dass die Expression von VhLuxPR16 in E. coli nicht möglich ist. Das VhLuxP-(DE)16 Protein enthält sechzehn negativ geladene Aspartat/Glutamat-Reste. Die unterschiedliche Länge der beiden Aminogruppen kann die Verteilung der Ladung und somit auch die Stabilität positiv beeinflussen. Auch die Nachfrage nach einer Aminosäure sowie deren tRNA ist bei einem Aspartat/Glutamat-Hexadecapeptid geringer als bei dem ArgininHexadecapeptid. Aus diesen Gründen konnte die Expression des VhLuxP-(DE)16 Proteins sowohl in E. coli BL21 (DE3) pLysS als auch in E. coli KIB2 erfolgen (Abbildung A-5 im Anhang, Abbildung 3-16). Die heterologe Expression der VhLuxP-Derivate mit veränderter Affinität zur AI-2 (Mutanten 1-13) verläuft in E. coli BL21(DE3) pLysS sowie E. coli KIB2 similär zu der Expression von EGFP-VhLuxP. Bei beiden Stämmen kann man ein Abbau der Proteine nach einer ü. N. Expression beobachten. Anhand der Signalstärke in der anti-tetra-His Westernblotanalyse konnten jedoch Unterschiede im Expressionsniveau der einzelnen Mutanten festgestellt werden. So wurden die Mutanten 7 (Abbildung 3-23) und 3 (Abbildung A-7 im Anhang) in E. coli KIB2 etwas höher exprimiert als andere Mutanten, auch der Abbau dieser Mutanten bei Expression ü. N. fällt etwas geringer aus. Die Veränderung von einer Aminogruppe kann also die Interaktion des exprimierten Proteins mit intrazellulären Proteasen erschweren oder gar verhindern und somit eine bessere Stabilität des Proteins gewähren. Bei der Expression von VhLuxP, VhLuxP 21, VhLuxP 23, EGFP-VhLuxP, VhLuxP-(DE)16 sowie GST-VhLuxP konnten die Proteine in SDS-PAGE in Form einer Doppelbande nachgewiesen werden. Diese VhLuxP Doppelbande konnte auch von Neiditch et al., 2005 [118] beobachtet werden. Es kann ausgeschlossen werden, dass es sich bei den Banden um eine vollständige und verkürzte Form handelt, da beide Formen sowohl bei der Verwendung eines N-terminalen als auch C-terminalen His6-Tags nachgewiesen werden. Als einzige plausible Erklärung der Anwesenheit der Doppelbande sind posttranslationelle Modifikationen der Proteine. Da bei der 120 Diskussion Expression von VhLuxP-EGFP keine Doppelbande beobachtet werden konnte, handelt es sich vermutlich um Modifikationen im Bereich des C-Terminus. Durch die Kopplung einer relativ großen Domäne an dem C-Terminus können modifizierende Enzyme sterisch gehindert werden. Die Expression der V. fischeri LuxP-Konstrukte in E. coli war weniger erfolgreich als die Expression der V. harveyi LuxP-Konstrukte. Das VfLuxP konnte nur in einer sehr geringen Menge nachgewiesen werden (Abbildung 3-26). Die Ursache dafür kann man in der Stabilität des Peptids nach der Translation vermuten. Im VfLuxP folgt nach der ersten N-Formylomethionine (fMet) eine Arginingruppe. fMet wird in diesem Fall von der Methionin-Aminopeptidase zwar ineffektiv geschnitten (16%), ein Peptid mit Arginin an dem C-Terminus ist aber äußerst instabil mit einer Halbwertszeit von ca. 2 min. [122]. Die besten Expressionsergebnisse der V. fischeri Konstrukte konnten für VfLuxP 27 erzielt werden (Abbildung 3-27 sowie Abbildung A-19 und Abbildung A-20 im Anhang). Das Protein konnte in allen untersuchten E. coli Stämmen hoch exprimiert werden, es gibt auch keine Hinweise auf einen proteolytischen Abbau des Proteins. Die Fusionskonstrukte EGFP-VfLuxP und VfLuxP-EGFP werden in E. coli abgebaut (Abbildung 3-28, Abbildung 3-29). Bei der Expression von EGFP-VhLuxP konnte nur eine EGFPAbbaubande nachgewiesen werden. Bei VfLuxP-EGFP kann man zwar das vollständige Protein detektieren, dessen Menge ist aber gering und nimmt mit der fortschreitenden Expressionsdauer ab. Bei der Expression der V. fischeri LuxP-Konstrukte sowie des E. coli Rezeptors LsrB konnten keine Proteindoppelbanden detektiert werden. Demnach werden diese in E. coli nicht modifiziert. Alle in der Arbeit untersuchten Rezeptorproteine sowie dessen Fusionsproteine wiesen eine sehr geringe Löslichkeit auf. Nach dem Zellaufschluss und Zentrifugation bei 15000 × g befanden sich die Proteine fast vollständig in der Pelletfraktion. Dabei lag die online-ermittelte Wahrscheinlichkeit der Löslichkeit bei der Expression in E. coli [1] für alle Konstrukte (außer VhLuxP-R16) bei über 50 %, für VhLuxP-(DE)16 sogar bei über 80%. Bei der Untersuchung der Kristallstruktur von V. harveyi LuxP verwendetes GST-LuxP sei in E. coli BL21(DE3) luxS- löslich gewesen [22]. In dieser Arbeit exprimiertes GST-VhLuxP war jedoch nur zum Teil löslich (Abbildung 3-20). 121 Diskussion Unlösliche inclusion bodys entstehen sehr häufig bei einer Überexpression eines Proteins in E. coli, vorwiegend dann, wenn das exprimierte Protein mehr als 50% der gesamten Proteine der Zelle ausmacht [122]. Über 90% eines inclusion body bildet das exprimierte Protein, das aufgrund von Proteolyse, Abwesenheit von Chaperonen oder fehlenden posttranslationellen Modifizierungen fehlerhaft gefaltet ist. Desweiteren beinhalten inclusion bodys E. coli Chaperone wie GroEL, DnaK, IbpA und IbpB, die in vivo an der Solubierisierung der Proteine beteiligt sind [122]. Die Entstehung von inclusion bodys während der Expression kann darauf hindeuten, dass entweder zu viel Protein synthetisiert wird und die E. coli Zelle somit überfordert ist, oder dass das exprimierte Protein keine korrekte Faltung annehmen kann, weil die benötigten Chaperone bzw. modifizierende Enzyme nicht vorhanden sind. Im Falle der LuxP-Konstrukte konnte ein Teil des Proteins in der löslichen Form isoliert werden. Das könnte als Hinweis gelten, dass zu viel Protein exprimiert wird. Die Faltung des Proteins kann nicht immer durch Chaperonproteine begleitet werden, somit bildet ein Großteil des Proteins inclusion bodys. Die beste Löslichkeit demnach wies das EGFP-VhLuxP auf, dessen Expression in E. coli fiel am geringsten aus. Leider gelang es nicht die Menge des produzierten Proteins für andere V. harveyi LuxP-Konstrukte zu drosseln um somit die Löslichkeit zu verbessern, weder durch die Reduzierung der Expressionstemperatur noch durch die Induktion mit niedrigeren Konzentrationen von IPTG. Dabei kann die Reduzierung der Temperatur häufig die Bildung von inclusion bodys verhindern [71, 159]. Bei einer Temperatur von 30°C sind die Chaperone deutlich aktiver als bei 37°C und werden auch stärker exprimiert [48, 108]. Damit ein Protein industriell verwendet werden kann, muss es einfach und hocheffizient synthetisiert werden können, sich leicht aufreinigen lassen und eine angemessene Lagerstabilität erweisen. In den bisherigen Versuchen konnten diese Qualitäten für keines der Fusionskonstrukte festgestellt werden. Die Proteine konnten zwar sehr effektiv produziert werden, auf Grund der Unlöslichkeit ist aber die Gewinnung des Proteins schwierig. Eine Solubilisierung von inclusion bodys ist zwar möglich, erfordert aber eine aufwendige Renaturierung des Proteins und ist somit unwirtschaftlich. Eine Verbesserung der Löslichkeit der Proteine könnte eine Verwendung von E. coli Stämmen C41(DE3) oder C43(DE3) bzw. dessen luxS-Deletionsmutanten bringen. Diese wurden bereits für die Expression von löslichen Membranproteinen verwendet, die in E. coli BL21(DE3) ausschließlich in Form von inclusion bodies vorlagen [107, 180]. Zwar sind weder LuxP noch LsrB 122 Diskussion direkt Membranproteine, bilden aber ein Teil eines membrangebundenes Komplexes (LuxOP, LsrABCD). Eine Verbesserung der Löslichkeit der Proteine könnte man auch durch die Koexpression der Chaperone wie TF (trigger factor), GroESL, DraKJ, GrpE, Skp, IbpA/B, ClpB sowie DegP erzeugen [83]. In E. coli wird ein neu synthetisiertes Protein direkt nach der Translation von dem TF-Chaperon gebunden, wodurch die hydrophoben Gruppen des Peptids von unspezifischen Interaktionen geschützt werden [38]. Der Folding des Proteins kann nach dem Abdocken des TF stattfinden. Die Koexpression von TF konnte die Entstehung von inclusion bodys bei der Expression von Maus-Endostatin sowie Meerschweinchenleber-Transglutaminase in E. coli verhindern [72, 119]. Das Chaperon GroEL bewirkt den Übergang zwischen den unlöslichen und löslichen Formen des exprimierten Proteins und nimmt somit sowohl an der Disaggregation als auch an der Bildung von inclusion bodys teil [159]. Aufgrund der Expression von GroELS und TF konnte die Löslichkeit von humanem ORP150-Protein (oxygen-regulated protein) und humanem Lysozym deutlich verbessert werden [119]. Die E. coli Chaperone IbpA und IbpB haben eine wichtige Schutzfunktion gegen dauerhafte Aggregation falsch gefalteter Proteine und besitzen eine Fähigkeit die Proteinaggregate zu solubilisieren [84, 108]. So gelang es auch die Menge des löslichen Proteins bei der Expression von Malat-Decarboxylase, EGFP, humanem IGF-If, Interferon γ sowie ß-Kette des Interferons 12 in E. coli durch die Koexpression von IbpA/B um das 1,3 bis 2-fache zu erhöhen [63]. Eine andere Strategie der Solubilisierung von Proteinen ist die Expression mit einem Fusionspartner, dessen Eigenschaften sich positiv auf die Löslichkeit des Fusionskonstrukts auswirken. Zu den Domänen, die die Löslichkeit der Proteine erhöhen können, zählen unter anderen das Maltose-Bindeprotein (MBP, maltose binding protein), NusA (N-utilizing substance A) sowie SUMO (small ubiquitin-related modifier) [33, 78, 98]. Die Verwendung dieser drei Fusionsdomänen ermöglichte z. B. die Expression in E. coli von löslichen MatrixMetalloprotease 13 (MMP13) sowie Myostatin (growth differentiating factor-8, GDF8), die sich ohne des Fusionspartners nur schwer exprimieren ließen [98]. Auch GST (Glutation-STransferase) hat einen positiven Einfluss auf die Löslichkeit der Proteine [5]. Allerdings war das in der Arbeit konstruierte Fusionsprotein GST-VhLuxP im Großteil unlöslich. Neben den oben beschriebenen Möglichkeiten gibt es noch unzählige Optionen, die Expression und Aufreinigung der Proteine so zu optimieren und somit dessen Attraktivität für die Industrie zu steigern. 123 Diskussion In dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass die AI-2 Rezeptorproteine von V. harveyi, V. fischeri sowie E. coli in heterolog in E. coli hergestellt werden können. Es konnten diverse Fusionsproteine sowie Derivate mit veränderter Affinität zu AI-2 entwickelt werden, die auch erfolgreich aufgereinigt werden konnten. Die Mengen der hergestellten Proteine sind für die Versuche, die zu der Entwicklung eines AI-2 Biosensors führen würden, ausreichend. Für die Produktion der Rezeptorproteine in industriellen Maßstab müsste die Löslichkeit der Proteine auf einer der oben beschriebenen Wege noch verbessert werden. Etablierung des AI-2-Bioassays Die Standartmethode für den Nachweis des AI-2 ist der V. harveyi Bioassay [11]. Mit der Zugabe von AI-2 zu den Reporterzellen wird Lumineszenz induziert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein neuer, auf E. coli basierender AI-2-Bioassay entwickelt, bei dem, anstatt von Lumineszenz, Fluoreszenz induziert wird. Mittels dieses Bioassays können AI-2 in einer Konzentration von ca. 25 µM bis 100 µM nachgewiesen werden. Im Gegensatz zu V. harveyi kann E. coli uneingeschränkt in den meisten Laboren verwendet werden, was die Einsetzbarkeit des Assays erweitert. Durch die Verwendung von Fluoreszenz können die Reporterbakterien perspektivisch für die Konstruktion eines optischen Ganzzellsensors genützt werden. Die Etablierung des AI-2-Bioassays erforderte die Synthese von AI-2. Ausgehend von 1 mM SAH und je 1 mg/ml von EcLuxS und VfPfs konnte eine DPD Konzentration von 0,7 mM erreicht werden. Im Angesicht, dass die Entwickler der Methode der in-vitro Synthese von AI-2 (Schauder et al. [154]) bei ähnlichen Bedingungen (jedoch mit Verwendung von GST-Pfs und GST-LuxS) eine AI-2 Konzentration von maximal 0,4 mM erreichen konnten, sind in dieser Arbeit erzeugte Ergebnisse deutlich besser. Trotzdem ist die AI-2-Konzentration von 0,7 mM nicht ausreichend für die Verwendung im Bioassay. Um diese zu erhöhen, wurden die Reaktionssätze gefriergetrocknet. Eine Lyophilisierung bringt mit sich natürlich das Risiko, das die Autoinducer zerstört oder deaktiviert werden. Es gibt auch Hinweise, dass enzymatisch hergestellter AI-2, ähnlich wie laurencione, bei einer Gefriertrocknung ein orangenes Präzipitat bilde und seine biologische Aktivität verliere [155]. Allerdings konnte dies hier nicht bestätigt werden, da das Lyophilisat stehst aus weißen bis leicht gelblichen, flockigen Kristallen bestand. Orangene Präzipitate konnten in keinem der Versuche beobachtet werden. Demnach wurde der gefriergetrocknete AI-2 bei der Entwicklung des Bioassays verwendet. 124 Diskussion Bei der Konstruktion von Bioassay-Reporter-Plasmiden wurden mehrere Strategien verfolgt. Das Plasmid pUCDsRed sollte eine möglichst hohe Fluoreszenz bringen, weil, aufgrund der hohen Kopienzahl in der E. coli Zelle, die Induktion des DsRed relativ stark ausfallen würde. Als problematisch erwies sich die relativ hohe Fluoreszenz der pUCDsRed tragenden E. coli luxSZellen. Das kann nur damit erklärt werden, dass zu wenig des Repressors LuxR in den Zellen vorhanden ist, um alle verfügbare lsr-Operone zu blockieren. In einer E. coli Zelle befinden sich 500 bis 700 Kopien von pUC19, ähnlich hoch kann die Anzahl des Plasmids pUCDsRed sein. Dass die Zelle so hohe Menge des Repressors produziert, ist ausgeschlossen. Deswegen wurden auch weitere Bioassay-Reporterplasmide entwickelt, in denen auch der Repressor kloniert wurde. Bei der Konstruktion von pUCDSLR1 wurde der in pUC19 vorhandene lac-Promotor benutzt. Unter dessen Kontrolle wurde das lsrR kloniert. Der Promotor lac ist einer der stärksten Promotoren in E. coli und wird auch bei der Expression von Proteinen im pET-System benutzt [5]. Auch wenn bei der Messung der Fluoreszenz das AB-Medium verwendet wurde [12], das keine Laktose bzw. Substitute enthält, konnte für das Konstrukt pUCDSLR1 keine signifikante Fluoreszenz gemessen werden, weder für E. coli BL21(DE3) noch für E. coli TOP10. Die Erklärung kann nur daran liegen, dass die Expression von LsrR, auch wenn nur gering, induziert wird. Dabei sind die E. coli Zellen nicht in der Lage so viel AI-2 zu produzieren und aufzunehmen um der Repression entgegenzuwirken. Bei der Konstruktion von pUCDSLR2 wurde der native Promotor des LsrR, der in pUCDsRed bereits enthalten ist, verwendet. Der Promotor des LsrR befindet sich in dem Bereich des lsrPromotors auf dem komplementären Strang [184]. Obwohl für pUCDSLR2 bei der Verwendung von 0,05 % Glc deutliche Unterschiede in der Fluoreszenz von E. coli TOP10 und KIT2 gemessen wurden, konnte keine Induktion von Fluoreszenz in E. coli KIT2 pUCDSLR2 mit den in-vitro hergestellten AI-2 erfolgen. Um das zu erklären kann man wieder auf die hohe Anzahl der Plasmidkopien in der E. coli Zelle verweisen. Es ist durchaus nachvollziehbar, dass eine AI-2 Konzentration von 250 µM nicht ausreichend ist, um die Repression von LsrR aufzuheben. Auch denkbar ist, dass während der Lyophilisierung ein Teil des in-vitro hergestellten AI-2 zerstört wurde und somit die verwendete Konzentration niedriger als 250 µM ist. Auch die etwaige Anwesenheit von Nebenprodukten der AI-2-Synthese könnte hemmend auf die Fluoreszenz der E. coli Zellen wirken. Mit der Konstruktion von pBRDsRed sollte ein Reporterplasmid mit einer niedrigen Kopienzahl in E. coli (15-20) entwickelt werden. Somit sollte vorgebeugt werden, dass nicht 125 Diskussion genug von Repressor LsrR in den Zellen vorhanden ist. Unter der Verwendung von pBRDsRed konnten Bioassay-Bedingungen etabliert werden, bei denen der Nachweis von AI-2 möglich ist: - E. coli KIB1, - 0,1 % Glc, - 10 h Inkubationszeit. Unter diesen Bedingungen konnte ein Fluoreszenzmaximum bei Zugabe von 100 µM AI-2 festgestellt werden (Abbildung 3-38). Diese Bedingungen sind vergleichbar mit dem V. harveyi Assay, wo die Optimale Glc-Konzentration 0,6-0,8 % beträgt [178] und die maximale Lumineszenz bei Zugabe von 15-35 µM AI-2 beobachtet werden kann [35, 181]. Die höhere AI2-Konzentration in dem pBRDsRed Assay liegt an der Anwesenheit von mehreren Kopien des Reporterplasmids. Die Induktion der Fluoreszenz von E. coli KIB1 pBRDsRed steigt nicht linear mit der steigenden AI-2 Konzentration an (Abbildung 3-38). Bei der Zugabe von 200 µM AI-2 nimmt die Fluoreszenz drastisch ab. Auch in dem V. harveyi Bioassay verläuft das Verhältnis zwischen Induktion der Lumineszenz und der Konzentration von AI-2 nicht linear. Die Lumineszenz steigt an ab der Zugabe von 0,4 bis 35 µM AI-2 und nimmt bei höheren AI-2 Konzentrationen ab [181]. Die Ursache der Inhibierung von Lumineszenz von V. harveyi bei hohen AI-2 Konzentrationen konnte bisher noch nicht genau erklärt werden. Da bei der Untersuchungen von Vilchez et al. [181] DPD aus einer chemischen Synthese verwendet wurde, dessen Reinheit per NMR bestätigt wurde, kann man nicht annehmen, dass die Hemmung der Lumineszenz durch etwaige Verunreinigungen verursacht wird. Die Inhibierung der Fluoreszenz von E. coli KIB2 pBRDsRed bei der Zugabe von 200 µM AI-2 kann man also auch nicht mit der Anwesenheit von Metaboliten aus der in-vitro AI-2-Synthese erklären. Vielmehr muss es einen physiologischen Grund geben, warum die Bakterien, nach dem die AI-2-Konzentration einen gewissen Wert überschritten hat, die Induktion der AI-2-Gene blockieren. Es scheint so, als würden sich die Bakterien auf diese Weise vom zu großen Lärm schützen wollen. Mit der Entwicklung des AI-2 Bioassays wurde eine weitere Methode für die Detektion von AI-2 etabliert, dass mit dem V. harveyi Assay vergleichbar ist. Der E. coli Reporterstamm KIB1 pBRDsRed kann in der Konstruktion eines AI-2 Ganzellsensors von Nutzen sein. Auch die gentechnische Weiterentwicklung des Reporterstammes ist möglich. Es wäre von großem Vorteil, wenn die Abhängigkeit von Glukose reduziert werden könnte. Dies könnte auf dem Weg der gerichteten Mutagenese des lsr-Promotors erfolgen. Ein weiterer Schritt wäre die 126 Diskussion Anpassung des verwendeten Fluoreszenzmarkergenes an die Bedürfnisse des Detektors. So könnten an Stelle von DsRed auch gelb oder grün fluoreszierende Proteine verwendet werden. Die Vollendung des Reporterstammes wurde mit der Integration des Fluoreszenzgenes samt lsr -Promotors in den E. coli KIB1 Chromosom, um somit dem etwaigen Verlust des Plasmids vorzubeugen. Untersuchung der AI-2 -Bindeaktivität der VhLuxP-Derivate Mit dem Design der VhLuxP-Derivate mit veränderter Affinität zu AI-2 entstand auch die Notwendigkeit ein Verfahren zur Bestimmung der AI-2-Bindeaktivität zu entwickeln. Bisher wurden keinerlei Assays oder Messverfahren etabliert, mit dessen Hilfe heterolog exprimierte LuxP Proteine auf die Aktivität überprüft werden könnten. Das in dieser Arbeit entwickelte Messprinzip basiert auf der Titration der AI-2-Moleküle mit aufgereinigtem Protein. Nachdem die AI-2 an LuxP gebunden haben, werden diese samt Protein abfiltriert, dass letztendlich eine Abnahme der AI-2 Konzentration im Filtrat zu Folge hat, die wiederrum im Bioassay gemessen wird. AI-2 wurde in gleichen Versuch mit dem jeweiligen Derivat sowie mit EGFP-VhLuxP titriert und die resultierenden Fluoreszenzen vergleichen. Die Aktivität wurde als Verhältnis der Fluoreszenzen von Proben aus der Titrierung mit EGFP-VhLuxP und Proben aus der Titrierung mit den Mutanten bestimmt und in % ausgedrückt. Dabei ist es zu beachten, das immer ein großer Überschuss an AI-2 verwendet wurde, und somit selbst mit EGFP-VhLuxP niemals alle AI-2 titriert werden konnten. Demnach wurde keine Aktivität von 0% erwartet. Das als Kontrolle verwendete hitzedenaturierte EGFPVhLuxP weist eine Aktivität von 70% auf, somit sollte die Aktivität der Mutanten bei über 70 % liegen. Tatsächlich lag diese bei allen Derivaten bei über 70% (Abbildung 3-40). Die verwendete AI-2-Startkonzentration bei der Titrierung wurde so angesetzt, dass im Fall, wenn kein AI-2 an das Protein bindet, im Assay eine Endkonzentration von 100 µM erreicht wird. Somit sollte die Hemmung von Fluoreszenz durch zu hohe Konzentration von AI-2 verhindert werden. Anhand der mittels Bioassay erfolgten Bestimmung der AI-2-Bindeaktivität konnten zwei Mutanten identifiziert werden, dessen AI-2-Affinität kaum verändert war (Mut. 1 (R215A) und Mut. 12 (R215A+T266A)). Für sieben Mutanten war die Bindeaktivität niedriger als die von EGFP-VhLuxP (Mut. 2 (R215D), Mut. 3 (R310A), Mut. 4 (R310D), Mut. 5 (R215A+R310A), Mut. 6 (R215D+R310D), Mut. 7 (Q77A), Mut. 8 (D267R) und Mut. 9 (D267R)). Wiedererwartet war für 127 Diskussion drei Mutanten (Mut. 10 (T266A), Mut. 11 (Q77A+W82A) und Mut. 13 (Q77A+R310A)) die AI-2Affinität höher als bei EGFP-VhLuxP. Es gibt bisher nur eine Vergleichstudie, in denen die Veränderungen der an die AI-2-Bindung teilnehmenden Aminosäuren im Bezug auf die Bindeaktivität untersucht worden wären. Bei der Etablierung des FRET-basierten AI-2 Assay wurden zwei LuxP Mutanten verwendet (Doppelmutante Q77A+S79A sowie Dreifachmutante Q77A+S79A+W82F), bei denen die Abnahme des FRET-Signals deutlich geringer als bei dem unveränderten LuxP war, was auf dessen niedrigere Affinität zu AI-2 hindeutet. Es wurden jedoch keine Bindeaktivitäten dieser Mutanten bestimmt [144]. Die Bindung von AI-2 in LuxP ist sehr komplex. Dabei spielen alle daran beteiligten Aminosäuren eine wichtige Rolle. Eine Veränderung einer oder mehrerer der Aminosäuren bringt den AI-2-LuxP-Komplex aus dem Gleichgewicht. So verringert sich die Affinität zu AI-2 wenn z.B. Q77 gegen A ausgetauscht wird. Kommen aber noch weitere Mutationen dazu (W82A/R310A), kann die AI-2-Affinität steigen. Es kann natürlich nicht ausgeschlossen werden, dass Veränderungen der Aminosäuren wie z. B. bei den Mutanten 10, 11 und 13 die Struktur des Rezeptors sehr stark beeinflussen und somit die unspezifische Bindung des AI-2 ermöglichen. Eine Aussage, welche der neun Aminosäuren, die an der Bindung teilnehmen, für diese am wichtigsten ist, kann nicht getroffen werden. Die Reproduzierbarkeit der aus dem Bioassay resultierenden Daten war relativ hoch. Die aus drei bis fünf unabhängigen Messungen ermittelten Standartabweichungen lagen zwischen 1,2 und 11,3%. In der Regel werden in Bioassay-Verfahren selten gut reproduzierbare Daten erzeugt. Standartabweichungen von 30 bis 40% sind nicht selten [178]. Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse spricht sehr für den AI-2-Bioassay als Mittel zu Bestimmung der LuxP-Aktivität. Über das hinaus können die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse über die Affinität der Mutanten bei der Konstruktion eines AI-2-Biosensors von Nutzen sein. 128 Zusammenfassung 5. Zusammenfassung Als Quorum sensing (QS) wird die Kommunikation zwischen Bakterien bezeichnet. Diese basiert auf kleinen Signalmolekülen, die Autoinducer (AI) genannt werden. Durch QS werden von Bakterien Verhaltensweisen wie Fähigkeit zur Symbiose, Virulenz, Produktion von Antibiotika und Bildung von Biofilmen reguliert. Die Kommunikation kann innerhalb einer Spezies (Intraspezies-Kommunikation) oder mehreren Spezies (Interspezies-Kommunikation) erfolgen. Gram-negative Bakterien kommunizieren über acetylierte Homoserinlaktone (AHL), Gram-positive Bakterien dagegen benutzen modifizierte Oligopeptide als Autoinducer. Für die Interspezies-Kommunikation dient der Autoinducer-2 (AI-2). AI-2 entsteht auf dem Weg der spontanen Zyklisierung von 4,5-Dihydroxy-2,3-Pentadion (DPD), der von LuxS synthetisiert wird. Die Universalität des AI-2 als Signalmoleküls basiert auf dessen chemischen Eigenschaften. Als biologisch aktive Formen von DPD gelten S-THMF-Borat (bei marinen Bakterien wie Vibrio harveyi) und R-THMF (z.B. bei Enterobakterien wie Escherichia coli oder Salmonella enterica Serovar Typhimurium). AI-2 wird bei allen Bakterien von einem periplasmatischen Rezeptor gebunden. S-THMF-Borat bindet spezifisch an den Rezeptor LuxP, R-THMF dagegen an den Rezeptor LsrR. Durch die Anbindung des AI-2 verändert sich die Konformation des Rezeptors, was als Signal über weitere Proteine in die Zelle weitergeleitet wird. In E. coli ist die Expression des Operons lsrACDBFGE von AI-2 abhängig. Der lsr-Promotor wird von dem Repressor LuxR, Phospo-AI-2 sowie dem cAMP-CRP-Komplex reguliert. In dieser Arbeit wurden die molekularbiologische Grundlagen zur Entwicklung eines AI-2Biosensors gelegt. Es wurden mehrere Fusionskonstrukte des V. harveyi AI-2 Rezeptors LuxP sowie dessen Derivate mit veränderter Affinität zur AI-2 kreiert, in E. coli exprimiert und aufgereinigt. Auch Rezeptorproteine von Vibrio fischeri sowie E. coli konnten erfolgreich exprimiert werden. Die Expression der Proteine erfolgte in E. coli luxS- Deletionsstämmen, die hierfür konstruiert worden sind. Die AI-2-Rezeptorproteine werden in E. coli vorwiegend in Form von inclusion bodys exprimiert. Nur ein Teil des Proteins ist löslich und kann für die Aufreinigung unter nativen Bedingungen verwendet werden. Auf der Basis von E. coli luxS- Deletionsstämmen wurde ein Bioassay entwickelt, der für die Detektion von AI-2 verwendet werden kann. Hierfür wurden mehrere Reporterplasmide 129 Zusammenfassung konstruiert, in denen das rot fluoreszierende Protein DsRed unter die Kontrolle des lsrPromotors von E. coli kloniert wurden. Dabei konnte unter Verwendung einer dieser Reporterplasmide (pBRDsRed) sowie des luxS-Deletionsstammes KIB1 Bioassay-Bedingungen etabliert werden, die einen Nachweis von AI-2 ermöglichen. Die für den Assay benötigten AI-2Moleküle wurden in vitro mithilfe der Enzyme Pfs und LuxS und S-Adenosyl-Homocystein (SAH) als Substrat hergestellt. Der entwickelte AI-2-Bioassay wurde für die Bestimmung der Bindeaktivität der V. harveyi LuxP-Derivate verwendet. Die resultierenden Ergebnisse wiesen eine hohe Reproduzierbarkeit (1,2 bis 11,3 % Standartabweichung) auf. 130 Literaturverzeichnis 6. Literatur 1. http://www.biotech.ou.edu/ [Online] 2. http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ [Online] 3. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ [Online] 4. http://www.scripps.edu/~cdputnam/protcalc.html [Online] 5. Novagen. pET System Manual, 11th Edition. (2006) Merck KGaA, 64293 Darmstadt. 6. Ahmer, B.M., J. van Reeuwijk, C.D. Timmers, P.J. Valentine & F. Heffron. 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Zirpel, K. (2005) Klonierung und Expression von LuxP-ß-Galaktosidase Fusionen in Escherichia coli. Baccalaureatarbeit. Technische Universität Dresden. 144 Anhang Anhang A- 1: Vektorenkarten der Knock-out-Helferplasmide bla: ß-Laktamase; vermittelt Ampicilin-Resistenz; , ß, exo: Strukturgene der Red-Rekombinase; P1/P2: Primer-Bindestellen; FRT: Erkennungssequenzen der FLP-Rekombinase; cat: Chloramphenicol-Acetyltranspherase ; vermittelt Chloramphenicol-Resistenz; ble: Bleomycin-Resistenzgen, vermittelt Zeocin-Resistenz. Plasmid pKD46: Plasmid pKD3: SwaI AscI EcoRV BssHII P1 ClaI FRT bla 6000 BamHI SacI 2500 0 1000 cat 500 5000 pKD3 pKD46 NotI 6329 bps 2000 2000 SalI 2804 bps bla ß 4000 1000 3000 1500 0 exo FRT P2 BsmFI AscI BssHII DraIII SmaI XmaI NcoI Plasmid pUCzeo: NdeI HincII BamHI P1 FRT 3000 500 bla ble pUCzeo 3479 bps 2500 HincII 1000 2000 1500 FRT P2 NdeI KpnI A1 Anhang A- 2: Analyse der Knock-out Tranformanden mittels PCR und darauf folgenden ClaI-Verdau M1 1 2 3 4 5 6 7 8 PCR-Produkte 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 M2 M1 19 20 21 M1 1 2 3* 4 5 6 7 8 PCR-Produkte verdaut mit ClaI 9 10* 11 12 13 14 15 16 17 18 M2 M1 19 20 21 22 22 23 24 23* 24 25 25 WT M2 WT M2 Abbildung A- 1: Analyse der Knock-out Klone des E. coli Stammes HMS174(DE3). Oben – PCR-Produkte, unten – PCR-Produkte verdaut mit ClaI. M1- DNA-Größenstandard /HindIII + EcoRV; M2- DNA-Größenstandard pUC19/MspI; WT- Wild-Typ DNA E. coli HMS174(DE3); 1-25-untersuchte Klone. Positiv analysierte Klone wurden im unteren Bild mit * markiert. A2 Anhang PCR-Produkte BL21(DE3) TOP10 M1 1 2 3 1 2 3 4 1 2* 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 M2 10* 11* 12* 13* 14* 15* M2 PCR-Produkte verdaut mit ClaI BL21(DE3) TOP10 M1 5 3 1 2 3* 4 5* 6* 7* 8* 9 Abbildung A- 2: Analyse der Knock-out Klone der E. coli Stämme TOP10F´sowie BL21(DE3). Oben – PCR-Produkte, unten – PCR-Produkte verdaut mit ClaI. M1- DNA-Größenstandard /HindIII + EcoRV; M2- DNA-Größenstandard pUC19/MspI; 1-3/1-15-untersuchte Klone. Positiv analysierte Klone wurden im unteren Bild mit * markiert. A- 3: Sequenzen der heterologen Vibrio harveyi LuxP Proteinen Proteindomänen wurden entsprechend farbig markiert: XXX – aus dem Vektor stammende Aminosäuren XXX – Signalsequenz XXX – His6-Tag XXX – EGFP A3 Anhang XXX – GST XXX – Erkennungssequenz für Thrombin XXX – Arginin-Hexadecapeptid XXX – Aspartat/Glutamat-Hexadecapeptid XXX – veränderte Aminosäuren in Mutanten VhLuxP MASMKKALLFSLISMVGFSPASQATQVLNGYWGYQEFLDEFPEQRNLTNALSEAVRAQPVPL SKPTQRPIKISVVYPGQQVSDYWVRNIASFEKRLYKLNINYQLNQVFTRPNADIKQQSLSLM EALKSKSDYLIFTLDTTRHRKFVEHVLDSTNTKLILQNITTPVREWDKHQPFLYVGFDHAEG SRELATEFGKFFPKHTYYSVLYFSEGYISDVRGDTFIHQVNRDNNFELQSAYYTKATKQSGY DAAKASLAKHPDVDFIYACSTDVALGAVDALAELGREDIMINGWGGGSAELDAIQKGDLDIT VMRMNDDTGIAMAEAIKWDLEDKPVPTVYSGDFEIVTKADSPERIEALKKRAFRYSDNLEHH HHHH pI = 5,92 MW = 42812,27 Da VhLuxPΔ21 MASTQVLNGYWGYQEFLDEFPEQRNLTNALSEAVRAQPVPLSKPTQRPIKISVVYPGQQVSD YWVRNIASFEKRLYKLNINYQLNQVFTRPNADIKQQSLSLMEALKSKSDYLIFTLDTTRHRK FVEHVLDSTNTKLILQNITTPVREWDKHQPFLYVGFDHAEGSRELATEFGKFFPKHTYYSVL YFSEGYISDVRGDTFIHQVNRDNNFELQSAYYTKATKQSGYDAAKASLAKHPDVDFIYACST DVALGAVDALAELGREDIMINGWGGGSAELDAIQKGDLDITVMRMNDDTGIAMAEAIKWDLE DKPVPTVYSGDFEIVTKADSPERIEALKKRAFRYSDNLEHHHHHH pI = 5,72 MW = 40603,56 Da VhLuxPΔ23 MASVLNGYWGYQEFLDEFPEQRNLTNALSEAVRAQPVPLSKPTQRPIKISVVYPGQQVSDYW VRNIASFEKRLYKLNINYQLNQVFTRPNADIKQQSLSLMEALKSKSDYLIFTLDTTRHRKFV EHVLDSTNTKLILQNITTPVREWDKHQPFLYVGFDHAEGSRELATEFGKFFPKHTYYSVLYF SEGYISDVRGDTFIHQVNRDNNFELQSAYYTKATKQSGYDAAKASLAKHPDVDFIYACSTDV ALGAVDALAELGREDIMINGWGGGSAELDAIQKGDLDITVMRMNDDTGIAMAEAIKWDLEDK PVPTVYSGDFEIVTKADSPERIEALKKRAFRYSDNLEHHHHH pI = 5,72 MW = 40374,33 Da A4 Anhang EGFP-VhLuxP MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLV TTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRI ELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQN TPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKVLNGYWGYQ EFLDEFPEQRNLTNALSEAVRAQPVPLSKPTQRPIKISVVYPGQQVSDYWVRNIASFEKRLY KLNINYQLNQVFTRPNADIKQQSLSLMEALKSKSDYLIFTLDTTRHRKFVEHVLDSTNTKLI LQNITTPVREWDKHQPFLYVGFDHAEGSRELATEFGKFFPKHTYYSVLYFSEGYISDVRGDT FIHQVNRDNNFELQSAYYTKATKQSGYDAAKASLAKHPDVDFIYACSTDVALGAVDALAELG REDIMINGWGGGSAELDAIQKGDLDITVMRMNDDTGIAMAEAIKWDLEDKPVPTVYSGDFEI VTKADSPERIEALKKRAFRYSDNLEHHHHHH pI = 5,67 MW = 67008,44 Da VhLuxP-EGFP MVLNGYWGYQEFLDEFPEQRNLTNALSEAVRAQPVPLSKPTQRPIKISVVYPGQQVSDYWVR NIASFEKRLYKLNINYQLNQVFTRPNADIKQQSLSLMEALKSKSDYLIFTLDTTRHRKFVEH VLDSTNTKLILQNITTPVREWDKHQPFLYVGFDHAEGSRELATEFGKFFPKHTYYSVLYFSE GYISDVRGDTFIHQVNRDNNFELQSAYYTKATKQSGYDAAKASLAKHPDVDFIYACSTDVAL GAVDALAELGREDIMINGWGGGSAELDAIQKGDLDITVMRMNDDTGIAMAEAIKWDLEDKPV PTVYSGDFEIVTKADSPERIEALKKRAFRYSDNMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFS VSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPE GYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYI MADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEK RDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKLEHHHHHH pI = 5,67 MW = 67139,64 Da VhLuxP-R16 MHHHHHHVLNGYWGYQEFLDEFPEQRNLTNALSEAVRAQPVPLSKPTQRPIKISVVYPGQQV SDYWVRNIASFEKRLYKLNINYQLNQVFTRPNADIKQQSLSLMEALKSKSDYLIFTLDTTRH RKFVEHVLDSTNTKLILQNITTPVREWDKHQPFLYVGFDHAEGSRELATEFGKFFPKHTYYS VLYFSEGYISDVRGDTFIHQVNRDNNFELQSAYYTKATKQSGYDAAKASLAKHPDVDFIYAC STDVALGAVDALAELGREDIMINGWGGGSAELDAIQKGDLDITVMRMNDDTGIAMAEAIKWD LEDKPVPTVYSGDFEIVTKADSPERIEALKKRAFRYSDNRRRRRRRRRRRRRRRR pI = 9,19 MW = 42341,70 Da VhLuxP-DE16 MHHHHHHVLNGYWGYQEFLDEFPEQRNLTNALSEAVRAQPVPLSKPTQRPIKISVVYPGQQV SDYWVRNIASFEKRLYKLNINYQLNQVFTRPNADIKQQSLSLMEALKSKSDYLIFTLDTTRH RKFVEHVLDSTNTKLILQNITTPVREWDKHQPFLYVGFDHAEGSRELATEFGKFFPKHTYYS VLYFSEGYISDVRGDTFIHQVNRDNNFELQSAYYTKATKQSGYDAAKASLAKHPDVDFIYAC STDVALGAVDALAELGREDIMINGWGGGSAELDAIQKGDLDITVMRMNDDTGIAMAEAIKWD LEDKPVPTVYSGDFEIVTKADSPERIEALKKRAFRYSDNEDEDDEDEDEDEDEDE pI = 4,87 MW = 41796,23 Da A5 Anhang GST-VhLuxP MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGD VKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLS KLPEMLKMFEDLRCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAI PQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLVPRGSVLNGYWGYQEFLDEFPEQRNLT NALSEAVRAQPVPLSKPTQRPIKISVVYPGQQVSDYWVRNIASFEKRLYKLNINYQLNQVFT RPNADIKQQSLSLMEALKSKSDYLIFTLDTTRHRKFVEHVLDSTNTKLILQNITTPVREWDK HQPFLYVGFDHAEGSRELATEFGKFFPKHTYYSVLYFSEGYISDVRGDTFIHQVNRDNNFEL QSAYYTKATKQSGYDAAKASLAKHPDVDFIYACSTDVALGAVDALAELGREDIMINGWGGGS AELDAIQKGDLDITVMRMNDDTGIAMAEAIKWDLEDKPVPTVYSGDFEIVTKADSPERIEAL KKRAFRYSDN pI = 5,66 MW = 65312,41 Da Mut. 1(R215A) MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLV TTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRI ELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQN TPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKVLNGYWGYQ EFLDEFPEQRNLTNALSEAVRAQPVPLSKPTQRPIKISVVYPGQQVSDYWVRNIASFEKRLY KLNINYQLNQVFTRPNADIKQQSLSLMEALKSKSDYLIFTLDTTRHRKFVEHVLDSTNTKLI LQNITTPVREWDKHQPFLYVGFDHAEGSRELATEFGKFFPKHTYYSVLYFSEGYISDVAGDT FIHQVNRDNNFELQSAYYTKATKQSGYDAAKASLAKHPDVDFIYACSTDVALGAVDALAELG REDIMINGWGGGSAELDAIQKGDLDITVMRMNDDTGIAMAEAIKWDLEDKPVPTVYSGDFEI VTKADSPERIEALKKRAFRYSDNLEHHHHHH pI = 5,61 MW = 66923,33 Da Mut. 2(R215N) MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLV TTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRI ELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQN TPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKVLNGYWGYQ EFLDEFPEQRNLTNALSEAVRAQPVPLSKPTQRPIKISVVYPGQQVSDYWVRNIASFEKRLY KLNINYQLNQVFTRPNADIKQQSLSLMEALKSKSDYLIFTLDTTRHRKFVEHVLDSTNTKLI LQNITTPVREWDKHQPFLYVGFDHAEGSRELATEFGKFFPKHTYYSVLYFSEGYISDVNGDT FIHQVNRDNNFELQSAYYTKATKQSGYDAAKASLAKHPDVDFIYACSTDVALGAVDALAELG REDIMINGWGGGSAELDAIQKGDLDITVMRMNDDTGIAMAEAIKWDLEDKPVPTVYSGDFEI VTKADSPERIEALKKRAFRYSDNLEHHHHHH pI = 5,61 MW = 66966,36 Da A6 Anhang Mut. 3 (R310A) MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLV TTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRI ELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQN TPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKVLNGYWGYQ EFLDEFPEQRNLTNALSEAVRAQPVPLSKPTQRPIKISVVYPGQQVSDYWVRNIASFEKRLY KLNINYQLNQVFTRPNADIKQQSLSLMEALKSKSDYLIFTLDTTRHRKFVEHVLDSTNTKLI LQNITTPVREWDKHQPFLYVGFDHAEGSRELATEFGKFFPKHTYYSVLYFSEGYISDVRGDT FIHQVNRDNNFELQSAYYTKATKQSGYDAAKASLAKHPDVDFIYACSTDVALGAVDALAELG REDIMINGWGGGSAELDAIQKGDLDITVMAMNDDTGIAMAEAIKWDLEDKPVPTVYSGDFEI VTKADSPERIEALKKRAFRYSDNLEHHHHHH pI = 5,61 MW = 66923,33 Da Mut. 4 (R310N) MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLV TTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRI ELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQN TPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKVLNGYWGYQ EFLDEFPEQRNLTNALSEAVRAQPVPLSKPTQRPIKISVVYPGQQVSDYWVRNIASFEKRLY KLNINYQLNQVFTRPNADIKQQSLSLMEALKSKSDYLIFTLDTTRHRKFVEHVLDSTNTKLI LQNITTPVREWDKHQPFLYVGFDHAEGSRELATEFGKFFPKHTYYSVLYFSEGYISDVRGDT FIHQVNRDNNFELQSAYYTKATKQSGYDAAKASLAKHPDVDFIYACSTDVALGAVDALAELG REDIMINGWGGGSAELDAIQKGDLDITVMNMNDDTGIAMAEAIKWDLEDKPVPTVYSGDFEI VTKADSPERIEALKKRAFRYSDNLEHHHHHH pI = 5,61 MW = 66966,36 Da Mut. 5 (R215A + R310A) MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLV TTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRI ELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQN TPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKVLNGYWGYQ EFLDEFPEQRNLTNALSEAVRAQPVPLSKPTQRPIKISVVYPGQQVSDYWVRNIASFEKRLY KLNINYQLNQVFTRPNADIKQQSLSLMEALKSKSDYLIFTLDTTRHRKFVEHVLDSTNTKLI LQNITTPVREWDKHQPFLYVGFDHAEGSRELATEFGKFFPKHTYYSVLYFSEGYISDVAGDT FIHQVNRDNNFELQSAYYTKATKQSGYDAAKASLAKHPDVDFIYACSTDVALGAVDALAELG REDIMINGWGGGSAELDAIQKGDLDITVMAMNDDTGIAMAEAIKWDLEDKPVPTVYSGDFEI VTKADSPERIEALKKRAFRYSDNLEHHHHHH pI = 5,56 MW = 66838,23 Da A7 Anhang Mut. 6 (R215N + R310N) MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLV TTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRI ELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQN TPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKVLNGYWGYQ EFLDEFPEQRNLTNALSEAVRAQPVPLSKPTQRPIKISVVYPGQQVSDYWVRNIASFEKRLY KLNINYQLNQVFTRPNADIKQQSLSLMEALKSKSDYLIFTLDTTRHRKFVEHVLDSTNTKLI LQNITTPVREWDKHQPFLYVGFDHAEGSRELATEFGKFFPKHTYYSVLYFSEGYISDVNGDT FIHQVNRDNNFELQSAYYTKATKQSGYDAAKASLAKHPDVDFIYACSTDVALGAVDALAELG REDIMINGWGGGSAELDAIQKGDLDITVMNMNDDTGIAMAEAIKWDLEDKPVPTVYSGDFEI VTKADSPERIEALKKRAFRYSDNLEHHHHHH pI = 5,56 MW = 66924,28 Da Mut. 7 (Q77A) MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLV TTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRI ELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQN TPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKVLNGYWGYQ EFLDEFPEQRNLTNALSEAVRAQPVPLSKPTQRPIKISVVYPGQAVSDYWVRNIASFEKRLY KLNINYQLNQVFTRPNADIKQQSLSLMEALKSKSDYLIFTLDTTRHRKFVEHVLDSTNTKLI LQNITTPVREWDKHQPFLYVGFDHAEGSRELATEFGKFFPKHTYYSVLYFSEGYISDVRGDT FIHQVNRDNNFELQSAYYTKATKQSGYDAAKASLAKHPDVDFIYACSTDVALGAVDALAELG REDIMINGWGGGSAELDAIQKGDLDITVMRMNDDTGIAMAEAIKWDLEDKPVPTVYSGDFEI VTKADSPERIEALKKRAFRYSDNLEHHHHHH pI = 5,67 MW = 66951,39 Da Mut. 8 (D267A) MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLV TTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRI ELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQN TPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKVLNGYWGYQ EFLDEFPEQRNLTNALSEAVRAQPVPLSKPTQRPIKISVVYPGQQVSDYWVRNIASFEKRLY KLNINYQLNQVFTRPNADIKQQSLSLMEALKSKSDYLIFTLDTTRHRKFVEHVLDSTNTKLI LQNITTPVREWDKHQPFLYVGFDHAEGSRELATEFGKFFPKHTYYSVLYFSEGYISDVRGDT FIHQVNRDNNFELQSAYYTKATKQSGYDAAKASLAKHPDVDFIYACSTAVALGAVDALAELG REDIMINGWGGGSAELDAIQKGDLDITVMRMNDDTGIAMAEAIKWDLEDKPVPTVYSGDFEI VTKADSPERIEALKKRAFRYSDNLEHHHHHH pI = 5,72 MW = 66964,43 Da A8 Anhang Mut. 9 (D267R) MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLV TTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRI ELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQN TPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKVLNGYWGYQ EFLDEFPEQRNLTNALSEAVRAQPVPLSKPTQRPIKISVVYPGQQVSDYWVRNIASFEKRLY KLNINYQLNQVFTRPNADIKQQSLSLMEALKSKSDYLIFTLDTTRHRKFVEHVLDSTNTKLI LQNITTPVREWDKHQPFLYVGFDHAEGSRELATEFGKFFPKHTYYSVLYFSEGYISDVRGDT FIHQVNRDNNFELQSAYYTKATKQSGYDAAKASLAKHPDVDFIYACSTRVALGAVDALAELG REDIMINGWGGGSAELDAIQKGDLDITVMRMNDDTGIAMAEAIKWDLEDKPVPTVYSGDFEI VTKADSPERIEALKKRAFRYSDNLEHHHHHH pI = 5,78 MW = 67049,54 Da Mut. 10 (T266A) MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLV TTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRI ELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQN TPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKVLNGYWGYQ EFLDEFPEQRNLTNALSEAVRAQPVPLSKPTQRPIKISVVYPGQQVSDYWVRNIASFEKRLY KLNINYQLNQVFTRPNADIKQQSLSLMEALKSKSDYLIFTLDTTRHRKFVEHVLDSTNTKLI LQNITTPVREWDKHQPFLYVGFDHAEGSRELATEFGKFFPKHTYYSVLYFSEGYISDVRGDT FIHQVNRDNNFELQSAYYTKATKQSGYDAAKASLAKHPDVDFIYACSADVALGAVDALAELG REDIMINGWGGGSAELDAIQKGDLDITVMRMNDDTGIAMAEAIKWDLEDKPVPTVYSGDFEI VTKADSPERIEALKKRAFRYSDNLEHHHHHH pI = 5,67 MW = 66978,42 Da Mut. 11 (Q77A + W82A) MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLV TTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRI ELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQN TPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKVLNGYWGYQ EFLDEFPEQRNLTNALSEAVRAQPVPLSKPTQRPIKISVVYPGQAVSDYAVRNIASFEKRLY KLNINYQLNQVFTRPNADIKQQSLSLMEALKSKSDYLIFTLDTTRHRKFVEHVLDSTNTKLI LQNITTPVREWDKHQPFLYVGFDHAEGSRELATEFGKFFPKHTYYSVLYFSEGYISDVRGDT FIHQVNRDNNFELQSAYYTKATKQSGYDAAKASLAKHPDVDFIYACSTDVALGAVDALAELG REDIMINGWGGGSAELDAIQKGDLDITVMRMNDDTGIAMAEAIKWDLEDKPVPTVYSGDFEI VTKADSPERIEALKKRAFRYSDNLEHHHHHH pI = 5,67 MW = 66836,26 Da A9 Anhang Mut. 12 (T266A + R215A) MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLV TTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRI ELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQN TPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKVLNGYWGYQ EFLDEFPEQRNLTNALSEAVRAQPVPLSKPTQRPIKISVVYPGQQVSDYWVRNIASFEKRLY KLNINYQLNQVFTRPNADIKQQSLSLMEALKSKSDYLIFTLDTTRHRKFVEHVLDSTNTKLI LQNITTPVREWDKHQPFLYVGFDHAEGSRELATEFGKFFPKHTYYSVLYFSEGYISDVAGDT FIHQVNRDNNFELQSAYYTKATKQSGYDAAKASLAKHPDVDFIYACSADVALGAVDALAELG REDIMINGWGGGSAELDAIQKGDLDITVMRMNDDTGIAMAEAIKWDLEDKPVPTVYSGDFEI VTKADSPERIEALKKRAFRYSDNLEHHHHHH pI = 5,61 MW = 66893,31 Da Mut. 13 (Q77A + R310A) MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLV TTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRI ELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQN TPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKVLNGYWGYQ EFLDEFPEQRNLTNALSEAVRAQPVPLSKPTQRPIKISVVYPGQAVSDYWVRNIASFEKRLY KLNINYQLNQVFTRPNADIKQQSLSLMEALKSKSDYLIFTLDTTRHRKFVEHVLDSTNTKLI LQNITTPVREWDKHQPFLYVGFDHAEGSRELATEFGKFFPKHTYYSVLYFSEGYISDVRGDT FIHQVNRDNNFELQSAYYTKATKQSGYDAAKASLAKHPDVDFIYACSTDVALGAVDALAELG REDIMINGWGGGSAELDAIQKGDLDITVMAMNDDTGIAMAEAIKWDLEDKPVPTVYSGDFEI VTKADSPERIEALKKRAFRYSDNLEHHHHHH pI = 5,61 MW = 66866,28 Da A10 Anhang A- 4: Sequenzen der heterologen Vibrio fischeri LuxP Proteinen Proteindomänen wurden entsprechend farbig markiert: XXX – aus dem Vektor stammende Aminosäuren XXX – Signalsequenz XXX – His6-Tag XXX – EGFP XXX – Erkennungssequenz für Thrombin VfLuxP MRNGRLLLSFLFISLISFFCTSKLVLADPVLVGYWGYNEYLDLYPEEKALTNTLKETVRGEP VPLAIKQTKPIKISFVYPGEQSSDYWQRNIVALESRLKALNIQYELTPVSTRLNVDFKEQSR SLHKAIEQKSDYLIFTLNTTRHRKFIEHVLQNPETKIILQNITTPVKAWHGSQPLLYVGFDH VIGTKLLANYFQHRFPEHANYGMLYYSYGYLSTARGDVFVQSMDSDKYTLTSSFYTEATEES AYAATQDILKDNPDIDFIYSSSTDIALGAIDAINDNKNTKTVINGWGGGSLELKAIENGELD VTVMRMTDDTGIAMAEAIKLDLENKPVATVYSGEFELVTSDTSEETLNTLKQRAFRYSGVEH LEHHHHHH pI=5,98 MW=43244,74 Da VfLuxP 27 MDPVLVGYWGYNEYLDLYPEEKALTNTLKETVRGEPVPLAIKQTKPIKISFVYPGEQSSDYW QRNIVALESRLKALNIQYELTPVSTRLNVDFKEQSRSLHKAIEQKSDYLIFTLNTTRHRKFI EHVLQNPETKIILQNITTPVKAWHGSQPLLYVGFDHVIGTKLLANYFQHRFPEHANYGMLYY SYGYLSTARGDVFVQSMDSDKYTLTSSFYTEATEESAYAATQDILKDNPDIDFIYSSSTDIA LGAIDAINDNKNTKTVINGWGGGSLELKAIENGELDVTVMRMTDDTGIAMAEAIKLDLENKP VATVYSGEFELVTSDTSEETLNTLKQRAFRYSGVEHLEHHHHHH pI=5,63 MW=40303,13 Da VfLuxP-EGFP MDPVLVGYWGYNEYLDLYPEEKALTNTLKETVRGEPVPLAIKQTKPIKISFVYPGEQSSDYW QRNIVALESRLKALNIQYELTPVSTRLNVDFKEQSRSLHKAIEQKSDYLIFTLNTTRHRKFI EHVLQNPETKIILQNITTPVKAWHGSQPLLYVGFDHVIGTKLLANYFQHRFPEHANYGMLYY SYGYLSTARGDVFVQSMDSDKYTLTSSFYTEATEESAYAATQDILKDNPDIDFIYSSSTDIA LGAIDAINDNKNTKTVINGWGGGSLELKAIENGELDVTVMRMTDDTGIAMAEAIKLDLENKP VATVYSGEFELVTSDTSEETLNTLKQRAFRYSGVEHLVPRGSMVSKGEELFTGVVPILVELD GDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQH DFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEY NYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQS ALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKLEHHHHHH pI=5,82 MW=67836,24 Da A11 Anhang EGFP-VfLuxP MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLV TTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRI ELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQN TPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKLVPRGSDPV LVGYWGYNEYLDLYPEEKALTNTLKETVRGEPVPLAIKQTKPIKISFVYPGEQSSDYWQRNI VALESRLKALNIQYELTPVSTRLNVDFKEQSRSLHKAIEQKSDYLIFTLNTTRHRKFIEHVL QNPETKIILQNITTPVKAWHGSQPLLYVGFDHVIGTKLLANYFQHRFPEHANYGMLYYSYGY LSTARGDVFVQSMDSDKYTLTSSFYTEATEESAYAATQDILKDNPDIDFIYSSSTDIALGAI DAINDNKNTKTVINGWGGGSLELKAIENGELDVTVMRMTDDTGIAMAEAIKLDLENKPVATV YSGEFELVTSDTSEETLNTLKQRAFRYSGVEHLEHHHHHH pI=5,82 MW=67705,05 Da pI=5,75 MW=67226,52 A- 5: Sequenz des heterologen Escherichia coli LsrB Proteins Proteindomänen wurden entsprechend farbig markiert: XXX – aus dem Vektor stammende Aminosäuren XXX – His6-Tag EcLsrB 26 MAERIAFIPKLVGVGFFTSGGNGAQQAGKELGVDVTYDGPTEPSVSGQVQLINNFVNQGYNA IIVSAVSPDGLCPALKRAMQRGVRVLTWDSDTKPECRSYYINQGTPAQLGGMLVDMAARQVN KDKAKVAFFYSSPTVTDQNQWVKEAKAKIAKEHPGWEIVTTQFGYNDATKSLQTAEGILKAY SDLDAIIAPDANALPAAAQAAENLKNDKVAIVGFSTPNVMRPYVERGTVKEFGLWDVVQQGK ISVYVADALLKKGSMKTGDKLDIKGVGQVEVSPNSVQGYDYEADGNGIVLLPERVIFNKENI GKYDFLEHHHHHH pI=6,65 MW=35100,65 kDa A12 Anhang Expressionsanalyse sowie Aufreinigung der V. harveyi LuxP-Fusionsproteine BSA (2µg) ü. N. 4h 3h 2h 1h Induktion Marker LuxP 21 / KIH3 ü. N. 4h 3h 2h 1h LuxP 21 / HMS174(DE3) pLysS Induktion HMS174(DE3) pLysS A- 6: ~110 ~79 ~60 ~77 ~35 ~25 A ~110 ~79 ~60 ~47 ~35 ~25 B Abbildung A- 3: Expressionsanalyse des VhLuxP 21 in E. coli HMS174(DE3) pLysS sowie E. coli KIH3. Die E. coli Stämme HMS174(DE3) pLysS und KIH3 wurden mit dem VhLuxP 21 kodierenden Plasmid pETVhluxP 21 transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG zu der Kultur wurde die Expression des VhLuxP induziert. Die Probenentnahme erfolgte bei der Induktion, nach 1, 2, 3 bzw. 4 h sowie nach der Kultivierung ü. N.. Die Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli HMS174(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Zur Einschätzung des Expressionsniveau wurde auf die Gele 2 µg BSA aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde BenchMark prestained (INVITROGEN) verwendet. A13 Eluat Waschfra ktion Durchfluss Unlösliche Proteine Klarlysat Gesamtlysat VhLuxP-EGFP BSA (2µg) Marker Eluat Waschfraktion Durchfluss Unlösliche Proteine Klarlysat Gesamtlysat VhLuxP 21 HMS174(DE3) pLysS Anhang ~80 ~60 ~47 ~35 ~24 A ~80 ~60 ~47 ~35 ~24 B Abbildung A- 4: Aufreinigung von VhLuxP 21 und VhLuxP-EGFP aus E. coli KIH3. Der E. coli Stamm KIH3 wurde entsprechend mit dem VhLuxP 21 kodierenden Plasmid pETVhluxP 21 oder mit dem VhLuxPEGFP kodierenden Plasmid pETVhluxP-egfp transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Nach der Induktion der Expression durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG wurde die Kultivierung für 3 h fortgesetzt. Danach wurden die Zellen geerntet, in Puffer B (2.2.15) aufgenommen und aufgeschlossen (Gesamtlysat). Durch die Zentrifugation wurde das lösliche Klarlysat von 2+ den unlöslichen Proteinen getrennt. Das Klarlysat wurde auf eine Ni -IDA-Sepharose-Säule aufgetragen, wobei das nicht angebundene Material (Durchfluss) aufgefangen wurde. Nach mehreren Waschschritten (Waschfraktion) erfolgte die Elution mit Puffer E (Eluat). Alle Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli HMS174(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Zur Einschätzung der Proteinmenge wurde auf die Gele 2 µg BSA aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde BenchMark prestained (INVITROGEN) verwendet. A14 ü. N. 4h 3h 2h 1h Induktion ü. N. VhLuxP-EGFP 4h 3h 2h 1h Induktion ü. N. VhLuxP-R16 4h 3h 2h 1h VhLuxP-(DE)16 Induktion BL21(DE3) pLysS Marker Anhang ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 A ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 B Abbildung A- 5: Expressionsanalyse von VhLuxP-(DE)16, VhLuxP-R16 sowie VhLuxP-EGFP in E. coli BL21(DE3) pLysS. Der E. coli Stamm BL21(DE3) pLysS wurde entsprechend mit dem VhLuxP-(DE)16 kodierenden Plasmid pETVhluxP-(DE)16, mit dem VhLuxP-R16 kodierenden Plasmid pETVhluxP-R16 oder mit dem VhLuxP-EGFP kodierenden Plasmid pETVhluxP-egfp transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG zu der Kultur wurde die Expression der Proteine induziert. Die Probenentnahme erfolgte bei der Induktion, nach 1, 2, 3 bzw. 4 h sowie nach der Kultivierung ü. N.. Die Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (FERMENTAS) verwendet. A15 Anhang Expressionsanalyse sowie Aufreinigung der V. harveyi LuxP-Derivate ü. N. 4h 3h 2h 1h Induktion ü. N. Mut. 3 4h 3h 2h 1h Induktion ü. N. Mut. 2 4h 3h 2h 1h Mut. 1 Induktion BL21(DE3) pLysS Marker A- 7: ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 A ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 B Abbildung A- 6: Expressionsanalyse von Mutanten 1, 2 und 3 in E. coli BL21(DE3) pLysS. Der E. coli Stamm BL21(DE3) pLysS wurde entsprechend mit dem jeweilige Mutante kodierenden Plasmid (pETelm1, pETelm2 oder pETelm3) transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG zu der Kultur wurde die Expression der Proteine induziert. Die Probenentnahme erfolgte bei der Induktion, nach 1, 2, 3 bzw. 4 h sowie nach der Kultivierung ü. N.. Die Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (FERMENTAS) verwendet. A16 ü. N. 4h 3h 2h 1h Induktion ü. N. Mut. 3 4h 3h 2h 1h Induktion ü. N. Mut. 2 4h 3h 2h 1h Mut. 1 Induktion BL21(DE3) pLysS Marker Anhang ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 A ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 B Abbildung A- 7: Expressionsanalyse von Mutanten 1, 2 und 3 in E. coli KIB2. Der E. coli Stamm KIB2 wurde entsprechend mit dem jeweilige Mutante kodierenden Plasmid (pETelm1, pETelm2 oder pETelm3) transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG zu der Kultur wurde die Expression der Proteine induziert. Die Probenentnahme erfolgte bei der Induktion, nach 1, 2, 3 bzw. 4 h sowie nach der Kultivierung ü. N.. Die Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (FERMENTAS) verwendet. A17 ü. N. 4h 3h 2h 1h Induktion ü. N. Mut. 6 4h 3h 2h 1h Induktion ü. N. Mut. 5 4h 3h 2h 1h Mut. 4 Induktion BL21(DE3) pLysS Marker Anhang ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 A ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 B Abbildung A- 8: Expressionsanalyse von Mutanten 4, 5 und 6 in E. coli BL21(DE3) pLysS. Der E. coli Stamm BL21(DE3) pLysS wurde entsprechend mit dem jeweilige Mutante kodierenden Plasmid (pETelm4, pETelm5 oder pETelm6) transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG zu der Kultur wurde die Expression der Proteine induziert. Die Probenentnahme erfolgte bei der Induktion, nach 1, 2, 3 bzw. 4 h sowie nach der Kultivierung ü. N.. Die Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (FERMENTAS) verwendet. A18 ü. N. 4h 3h 2h 1h Induktion ü. N. Mut. 6 4h 3h 2h 1h Induktion ü. N. Mut. 5 4h 3h 2h 1h Mut. 4 Induktion BL21(DE3) pLysS Marker Anhang ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 A ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 B Abbildung A- 9: Expressionsanalyse von Mutanten 4, 5 und 6 in E. coli KIB2. Der E. coli Stamm KIB2 wurde entsprechend mit dem jeweilige Mutante kodierenden Plasmid (pETelm4, pETelm5 oder pETelm6) transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG zu der Kultur wurde die Expression der Proteine induziert. Die Probenentnahme erfolgte bei der Induktion, nach 1, 2, 3 bzw. 4 h sowie nach der Kultivierung ü. N.. Die Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (FERMENTAS) verwendet. A19 ü. N. 4h 3h 2h 1h Induktion ü. N. Mut. 12 4h 3h 2h 1h Induktion ü. N. Mut. 11 4h 3h 2h 1h Mut. 10 Induktion BL21(DE3) pLysS Marker Anhang ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 A ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 B Abbildung A- 10: Expressionsanalyse von Mutanten 10, 11 und 12 in E. coli BL21(DE3) pLysS. Der E. coli Stamm BL21(DE3) pLysS wurde entsprechend mit dem jeweilige Mutante kodierenden Plasmid (pETelm10, pETelm11 oder pETelm12) transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG zu der Kultur wurde die Expression der Proteine induziert. Die Probenentnahme erfolgte bei der Induktion, nach 1, 2, 3 bzw. 4 h sowie nach der Kultivierung ü. N.. Die Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (FERMENTAS) verwendet. A20 ü. N. 4h 3h 2h 1h Induktion ü. N. Mut. 12 4h 3h 2h 1h Induktion ü. N. Mut. 11 4h 3h 2h 1h Mut. 10 Induktion BL21(DE3) pLysS Marker Anhang ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 A ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 B Abbildung A- 11: Expressionsanalyse von Mutanten 10, 11 und 12 in E. coli KIB2. Der E. coli Stamm KIB2 wurde entsprechend mit dem jeweilige Mutante kodierenden Plasmid (pETelm10, pETelm11 oder pETelm12) transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG zu der Kultur wurde die Expression der Proteine induziert. Die Probenentnahme erfolgte bei der Induktion, nach 1, 2, 3 bzw. 4 h sowie nach der Kultivierung ü. N.. Die Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (FERMENTAS) verwendet. A21 ü. N. 4h 3h 2h 1h Mut. 13 Induktion BL21(DE3) pLysS Marker Anhang ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 A ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 B Abbildung A- 12: Expressionsanalyse von Mutante 13 in E. coli BL21(DE3) pLysS. Der E. coli Stamm BL21(DE3) pLysS wurde entsprechend mit dem Mutante 13 kodierenden Plasmid pETelm13 transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG zu der Kultur wurde die Expression der Proteine induziert. Die Probenentnahme erfolgte bei der Induktion, nach 1, 2, 3 bzw. 4 h sowie nach der Kultivierung ü. N.. Die Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (FERMENTAS) verwendet. A22 ü. N. 4h 3h 2h 1h Mut. 13 Induktion BL21(DE3) pLysS Marker Anhang ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 A ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 B Abbildung A- 13: Expressionsanalyse von Mutante 13 in E. coli KIB2. Der E. coli Stamm KIB2 wurde entsprechend mit dem Mutante 13 kodierenden Plasmid pETelm13 transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG zu der Kultur wurde die Expression der Proteine induziert. Die Probenentnahme erfolgte bei der Induktion, nach 1, 2, 3 bzw. 4 h sowie nach der Kultivierung ü. N.. Die Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (FERMENTAS) verwendet. A23 Marker BSA (2,5µg) BSA (5µg) Eluat Durchfluss Unlösliche Proteine Klarlysat Gesamtlysat Eluat Mut. 5 Durchfluss Unlösliche Proteine Klarlysat Gesamtlysat Mut. 1 Eluat Durchfluss Unlösliche Proteine Klarlysat EGFP-VhLuxP Gesamtlysat BL21(DE3) pLysS Marker Anhang ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 A ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 B Abbildung A- 14: Aufreinigung von EGFP-VhLuxP sowie Mutanten 1 und 5 aus E. coli KIB2. Der E. coli Stamm KIB2 wurde entsprechend mit dem das jeweilige Protein kodierenden Plasmid (pETegfp-VhluxP, pETelm1 oder pETelm5) transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Nach der Induktion der Expression durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG wurde die Kultivierung für 3 h fortgesetzt. Danach wurden die Zellen geerntet, in Puffer B (2.2.15) aufgenommen und aufgeschlossen (Gesamtlysat). Durch die Zentrifugation wurde das lösliche Klarlysat von den unlöslichen Proteinen 2+ getrennt. Das Klarlysat wurde auf eine Ni -IDA-Sepharose-Säule aufgetragen, wobei das nicht angebundene Material (Durchfluss) aufgefangen wurde. Nach mehreren Waschschritten erfolgte die Elution mit Puffer E (Eluat). Alle Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Zur Einschätzung der Proteinmenge wurde auf die Gele 2,5 und 5 µg BSA aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (FERMENTAS) verwendet. A24 Marker BSA (2,5µg) BSA (5µg) Eluat Durchfluss Unlösliche Proteine Klarlysat Gesamtlysat Eluat Mut. 4 Durchfluss Unlösliche Proteine Klarlysat Gesamtlysat Eluat Mut. 3 Durchfluss Unlösliche Proteine Klarlysat Mut. 2 Gesamtlysat BL21(DE3) pLysS Marker Anhang ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 A ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 B Abbildung A- 15: Aufreinigung von Mutanten 2, 3 und 4 aus E. coli KIB2. Der E. coli Stamm KIB2 wurde entsprechend mit dem die jeweilige Mutante kodierenden Plasmid (pETelm2, pETelm3 oder pETelm4) transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Nach der Induktion der Expression durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG wurde die Kultivierung für 3 h fortgesetzt. Danach wurden die Zellen geerntet, in Puffer B (2.2.15) aufgenommen und aufgeschlossen (Gesamtlysat). Durch die Zentrifugation wurde das lösliche Klarlysat von den unlöslichen Proteinen 2+ getrennt. Das Klarlysat wurde auf eine Ni -IDA-Sepharose-Säule aufgetragen, wobei das nicht angebundene Material (Durchfluss) aufgefangen wurde. Nach mehreren Waschschritten erfolgte die Elution mit Puffer E (Eluat). Alle Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Zur Einschätzung der Proteinmenge wurde auf die Gele 2,5 und 5 µg BSA aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (FERMENTAS) verwendet. A25 Anhang Eluat Waschfra ktion Durchfluss Unlösliche Proteine Klarlysat Gesamtlysat Eluat Mut. 8 Waschfra ktion Durchfluss Unlösliche Proteine Klarlysat Gesamtlysat Eluat Mut. 7 Waschfra ktion Durchfluss Unlösliche Proteine Klarlysat Gesamtlysat Marker BSA (5µg) Mut. 6 ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 A ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 B Abbildung A- 16: Aufreinigung von Mutanten 6, 7 und 8 aus E. coli KIB2. Der E. coli Stamm KIB2 wurde entsprechend mit dem die jeweilige Mutante kodierenden Plasmid (pETelm6, pETelm7 oder pETelm8) transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Nach der Induktion der Expression durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG wurde die Kultivierung für 3 h fortgesetzt. Danach wurden die Zellen geerntet, in Puffer B (2.2.15) aufgenommen und aufgeschlossen (Gesamtlysat). Durch die Zentrifugation wurde das lösliche Klarlysat von den unlöslichen Proteinen 2+ getrennt. Das Klarlysat wurde auf eine Ni -IDA-Sepharose-Säule aufgetragen, wobei das nicht angebundene Material (Durchfluss) aufgefangen wurde. Nach mehreren Waschschritten erfolgte die Elution mit Puffer E (Eluat). Alle Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Zur Einschätzung der Proteinmenge wurde auf die Gele 2,5 und 5 µg BSA aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (FERMENTAS) verwendet. A26 Anhang Eluat Waschfra ktion Durchfluss Unlösliche Proteine Klarlysat Gesamtlysat Marker BSA (5 µg) Mut.9 ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 A ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 B Abbildung A- 17: Aufreinigung von Mutante 9 aus E. coli KIB2. Der E. coli Stamm KIB2 wurde mit dem Mutante9 kodierenden Plasmid pETelm9 transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Nach der Induktion der Expression durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG wurde die Kultivierung für 3 h fortgesetzt. Danach wurden die Zellen geerntet, in Puffer B (2.2.15) aufgenommen und aufgeschlossen (Gesamtlysat). Durch 2+ die Zentrifugation wurde das lösliche Klarlysat von den unlöslichen Proteinen getrennt. Das Klarlysat wurde auf eine Ni -IDASepharose-Säule aufgetragen, wobei das nicht angebundene Material (Durchfluss) aufgefangen wurde. Nach mehreren Waschschritten erfolgte die Elution mit Puffer E (Eluat). Alle Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Zur Einschätzung der Proteinmenge wurde auf die Gele 2,5 und 5 µg BSA aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (FERMENTAS) verwendet. A27 Anhang Marker Eluat dialysiert Eluat Waschfra ktion Durchfluss Unlösliche Proteine Klarlysat Gesamtlysat Eluat dialysiert Mut. 13 Eluat Waschfra ktion Durchfluss Unlösliche Proteine Klarlysat Gesamtlysat Marker BSA (5µg) Mut. 12 ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 A ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 B Abbildung A- 18: Aufreinigung von Mutanten 12 und 13 aus E. coli KIB2. Der E. coli Stamm KIB2 wurde entsprechend mit dem jeweilige Mutante kodierenden Plasmid (pETelm12 oder pETelm13) transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Nach der Induktion der Expression durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG wurde die Kultivierung für 3 h fortgesetzt. Danach wurden die Zellen geerntet, in Puffer B (2.2.15) aufgenommen und aufgeschlossen (Gesamtlysat). Durch die Zentrifugation wurde das lösliche Klarlysat von den unlöslichen Proteinen getrennt. 2+ Das Klarlysat wurde auf eine Ni -IDA-Sepharose-Säule aufgetragen, wobei das nicht angebundene Material (Durchfluss) aufgefangen wurde. Nach mehreren Waschschritten erfolgte die Elution mit Puffer E (Eluat). Das Eluat wurde gegen 50 mM Tris-HCl, pH 8,5, 250 mM NaCl dialysiert. Alle Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Zur Einschätzung der Proteinmenge wurde auf die Gele 5 µg BSA aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (FERMENTAS) verwendet. A28 Anhang ü. N. 4h 3h 1h Induktion ü. N. 4h 3h 2h 1h 2h VfLuxP 27 VfLuxP Induktion BL21(DE3) pLysS Expressionsanalyse sowie Aufreinigung der V. fischeri LuxP-Fusionsproteine Marker A- 8: ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 A ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 B Abbildung A- 19: Expressionsanalyse von VfLuxP und VfLuxP 27 in E. coli BL21(DE3) pLysS. Der E. coli Stamm BL21(DE3) pLysS wurde entsprechend mit dem VfLuxP kodierenden Plasmid pETVfluxP oder mit dem VfLuxP 27 kodierenden Plasmid pETVfluxP 27 transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG zu der Kultur wurde die Expression der Proteine induziert. Die Probenentnahme erfolgte bei der Induktion, nach 1, 2, 3 bzw. 4 h sowie nach der Kultivierung ü. N.. Die Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (FERMENTAS) verwendet. A29 BSA (2 µg) ü. N. 4h 2,5 h 1h VfLuxP 27 Induktion HMS174(DE3) pLysS Marker Anhang ~110 ~79 ~60 ~47 ~35 ~25 A ~110 ~79 ~60 ~47 ~35 ~25 B Abbildung A- 20: Expressionsanalyse von VfLuxP 27 in E. coli HMS174(DE3) pLysS. Der E. coli Stamm HMS174(DE3) pLysS wurde mit dem VfLuxP 27 kodierenden Plasmid pETVfluxP 27 transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG zu der Kultur wurde die Expression der Proteine induziert. Die Probenentnahme erfolgte bei der Induktion, nach 1, 2,5 bzw. 4 h sowie nach der Kultivierung ü. N.. Die Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli HMS174(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde BenchMark prestained (INVITROGEN) verwendet. A30 Anhang ü. N. 4h 3h 2h 1h EcLrsB 26 Induktion BL21(DE3) pLysS Expressionsanalyse von EcLsrB 26 Marker A- 9: ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 A ~100 ~70 ~55 ~35 ~27 B Abbildung A- 21: Expressionsanalyse von EcLsrB 26 in E. coli BL21(DE3) pLysS. Der E. coli Stamm BL21(DE3) pLysS wurde mit dem EcLsrB 26 kodierenden Plasmid pETEclsrB 26 transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG zu der Kultur wurde die Expression der Proteine induziert. Die Probenentnahme erfolgte bei der Induktion, nach 1, 2, 3 bzw. 4 h sowie nach der Kultivierung ü. N.. Die Proben wurden auf zwei zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die CommassieBlau Färbung (A) oder für die anti-Tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (FERMENTAS) verwendet. A31 BSA (2 µg) ü. N. 6h 4h 2,5 h 1h Induktion Marker EcLsrB 26 HMS174(DE3) Anhang ~70 ~55 ~35 ~27 A ~70 ~55 ~35 ~27 B Abbildung A- 22: Expressionsanalyse von EcLsrB 26 in E. coli HMS174(DE3) pLysS. Der E. coli Stamm HMS174(DE3) pLysS wurde mit dem EcLsrB 26 kodierenden Plasmid pETEclsrB 26 transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG zu der Kultur wurde die Expression der Proteine induziert. Die Probenentnahme erfolgte bei der Induktion, nach 1, 2.5, 4 bzw. 6 h sowie nach der Kultivierung ü. N.. Die Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-Tetra-His Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli HMS174(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Als Molekulargewichtstandard wurde PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (FERMENTAS) verwendet. A32 Anhang BSA ü. N. 4h 3h 2h 1h Induktion ü. N. VfPfs 4h 3h 2h 1h Induktion Marker VfLuxS BL21(DE3) pLysS A- 10: Expressionsanalyse der Enzyme Pfs und LuxS A ~110 ~79 ~60 ~47 ~35 ~25 ~18 B Abbildung A- 23: Expressionsanalyse von VfLuxS und VfPfs in E. coli BL21(DE3) pLysS. Der E. coli Stamm BL21(DE3) pLysS wurde entsprechend mit dem VfLuxS kodierenden Plasmid pETVfluxS oder mit dem VfPfs kodierenden Plasmid pETVfpfs transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG zu der Kultur wurde die Expression der Proteine induziert. Die Probenentnahme erfolgte bei der Induktion, nach 1, 2, 3 bzw. 4 h sowie nach der Kultivierung ü. N.. Die Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-EGFP Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Als Molekulargewichtstandards wurden Roti-Mark prestained (ROTH) (A) sowie BenchMark prestained (INVITROGEN) (B) verwendet. A33 BSA ü. N. 4h 3h 2h 1h Induktion ü. N. EcPfs 4h 3h 2h 1h Induktion Marker EcLuxS BL21(DE3) pLysS Anhang ~123 ~77 ~42 ~30 ~25 A ~110 ~79 ~60 ~47 ~35 ~25 ~18 B Abbildung A- 24: Expressionsanalyse von EcLuxS und EcPfs in E. coli BL21(DE3) pLysS. Der E. coli Stamm BL21(DE3) pLysS wurde entsprechend mit dem EcLuxS kodierenden Plasmid pETEcluxS oder mit dem EcPfs kodierenden Plasmid pETEcpfs transformiert und bis OD600 von ca. 0,4 bei 30°C kultiviert. Durch die Zugabe von 0,4 mM IPTG zu der Kultur wurde die Expression der Proteine induziert. Die Probenentnahme erfolgte bei der Induktion, nach 1, 2, 3 bzw. 4 h sowie nach der Kultivierung ü. N.. Die Proben wurden auf zwei SDS-PAA Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Je ein Gel wurden anschließend für die Commassie-Blau Färbung (A) oder für die anti-EGFP Westernblotanalyse (B) verwendet. Als Negativkontrolle wurde eine Probe aus einer E. coli BL21(DE3) pLysS Kultur (ohne des Expressionsplasmids), die ebenfalls induziert und ü. N. kultiviert wurde, aufgetragen. Als Molekulargewichtstandards wurden Roti-Mark prestained (ROTH) (A) sowie BenchMark prestained (INVITROGEN) (B) verwendet. A34 Anhang A- 11: Vergleich der Proteinsequenzen von VhLuxP und VfLuxP mittels BLAST [3] VhLuxP 23 VfLuxP 27 VhLuxP 83 VfLuxP 87 ATQVLNGYWGYQEFLDEFPEQRNLTNALSEAVRAQPVPLSKPTQRPIKISVVYPGQQVSD 82 A VL GYWGY E+LD +PE++ LTN L E VR +PVPL+ +PIKIS VYPG+Q SD ADPVLVGYWGYNEYLDLYPEEKALTNTLKETVRGEPVPLAIKQTKPIKISFVYPGEQSSD 86 YWVRNIASFEKRLYKLNINYQLNQVFTRPNADIKQQSLSLMEALKSKSDYLIFTLDTTRH 142 YW RNI + E RL LNI Y+L V TR N D K+QS SL +A++ KSDYLIFTL+TTRH YWQRNIVALESRLKALNIQYELTPVSTRLNVDFKEQSRSLHKAIEQKSDYLIFTLNTTRH 146 VhLuxP 143 RKFVEHVLDSTNTKLILQNITTPVREWDKHQPFLYVGFDHAEGSRELATEFGKFFPKHTY 202 RKF+EHVL + TK+ILQNITTPV+ W QP LYVGFDH G++ LA F FP+H VfLuxP 147 RKFIEHVLQNPETKIILQNITTPVKAWHGSQPLLYVGFDHVIGTKLLANYFQHRFPEHAN 206 VhLuxP 203 YSVLYFSEGYISDVRGDTFIHQVNRDNNFELQSAYYTKATKQSGYDAAKASLAKHPDVDF 262 Y +LY+S GY+S RGD F+ ++ D + L S++YT+AT++S Y A + L +PD+DF VfLuxP 207 YGMLYYSYGYLSTARGDVFVQSMDSD-KYTLTSSFYTEATEESAYAATQDILKDNPDIDF 265 VhLuxP 263 IYACSTDVALGAVDALAELGREDIMINGWGGGSAELDAIQKGDLDITVMRMNDDTGIAMA 322 IY+ STD+ALGA+DA+ + +INGWGGGS EL AI+ G+LD+TVMRM DDTGIAMA VfLuxP 266 IYSSSTDIALGAIDAINDNKNTKTVINGWGGGSLELKAIENGELDVTVMRMTDDTGIAMA 325 VhLuxP 323 EAIKWDLEDKPVPTVYSGDFEIVTKADSPERIEALKKRAFRYS EAIK DLE+KPV TVYSG+FE+VT S E + LK+RAFRYS VfLuxP 326 EAIKLDLENKPVATVYSGEFELVTSDTSEETLNTLKQRAFRYS 365 368 A35 Danksagung Danksagung Am Ende dieser Arbeit gilt mein Dank: - Herrn Prof. Gerhard Rödel für die Betreuung dieser Arbeit sowie für die sehr lehrreichen Jahre, die ich am Institut für Genetik verbracht habe; - Herrn Prof. Wolfgang Pompe für die großartige Unterstützung; - Kai für die Ideen, die zu dieser Arbeit beigetragen haben und für das Lesen des Manuskriptes; - Herrn Dr. Paweł Sachadyn und Frau Dr. Anna Stanisławska-Sachadyn dafür, dass Sie am Beginn dieser Arbeit mich nicht nur mit vielen Ratschlägen sondern auch mit den zu Verfügung gestellten Plasmiden pET23b und pET23d sowie E. coli Stämmen TOP10F´ und BL21(DE3) pLysS unterstützt haben; - Fuat, Msau, Nuriye, Kevin, Melinda, Karina und Dagmar, die ich auch als Freunde gewinnen dürfte, für die schönen Momente außerhalb des Instituts; Karina danke ich ganz besonderes für die Einführung in das „Institutsleben“ und die Hilfsbereitschaft am Anfang meiner Tätigkeit am Institut für Genetik; Dagmar danke ich für nette Zusammenarbeit in den gemeinsamen Projekten; - André für die großartige Unterstützung im Labor, vor allem während meiner Schwangerschaft und der Babyzeit; - Marlis für die unzähligen Minis, LB-Platten und Agarose-Gele; - Meiner Familie für die Geduld mit mir; meiner kleinen Nike, dafür dass sie da ist. Selbständigkeitserklärung Selbständigkeitserklärung Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht. Die Arbeit wurde bisher weder im In- noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt. Die vorliegende Arbeit wurde am Institut für Genetik der TU Dresden unter wissenschaftlicher Betreuung von Herrn Prof. Dr. rer. nat. habil. Gerhard Rödel angefertigt. Die Promotionsordnung wird anerkannt. Dresden, 21. 10. 2010 Karolina Ihle
