Mausmodelle für Taubheit und progressiven

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Genetik des Hörens
Mausmodelle für Taubheit und
progressiven Gehörverlust
HELMUT FUCHS 1 , SIBYLLE WAGNER 1 , VALERIE GAILUS-DURNER 1 ,
MARTIN HRABE DE ANGELIS 1, 2
1 INSTITUT FÜR EXPERIMENTELLE GENETIK, HELMHOLTZ ZENTRUM MÜNCHEN
2 LEHRSTUHL FÜR EXPERIMENTELLE GENETIK, TU MÜNCHEN
Im ENU-Maus-Mutagenese-Projekt des Instituts für Experimentelle
Genetik am Helmholtz Zentrum München werden interessante Mausmutanten als Modellsysteme für menschliche Krankheiten erzeugt.
Darunter befinden sich Mausmodelle, die dazu dienen, progressiven
Gehörverlust und Taubheit genauer zu untersuchen.
In the ENU mouse mutagenesis project at the Helmholtz Zentrum
München valuable mouse mutant lines for the investigation of deafness,
progressive hearing loss and vestibular defects are generated and
analyzed. The mutant lines from the project are highly requested by the
scientific community.
Screening nach Mausmutanten
ó Im ENU-Maus-Mutagenese-Projekt des
Instituts für Experimentelle Genetik am
Helmholtz Zentrum München werden mittels
ENU(Ethylnitrosoharnstoff)-Mutagenese
Mausmutantenlinien erzeugt. Insgesamt wur-
den mit dieser Technologie nahezu 1.000
Mausmutantenlinien generiert. Im Dysmorphologie-Screen des Projekts [1] werden
Mausmutanten mittels anatomischer Untersuchungen auf offensichtliche Krankheitssymptome verschiedener Organsysteme identifiziert. Dabei wird auch darauf geachtet, ob
die Mäuse charakteristische Bewegungen zeigen, welche auf Veränderungen des Innenohrs schließen lassen: Dies können eine
abnormale Gangart, das Stereotypie-artige im
Kreis Laufen oder ein Kopfnicken sein. Mittels
einer Clickbox (ein Gerät, welches für einen
Sekundenbruchteil einen Ton einer Frequenz
von 20 Kilohertz abgibt) wird ein Hörtest
durchgeführt (Abb. 1). Eine normal hörende
Maus sollte bei diesem Test einen sogenannten „Preyer-Reflex“ zeigen. Dies ist ein kurzes
Zucken der Maus, bei dem die Ohren leicht
nach hinten gekippt werden. Eine abweichende Reaktion der Maus lässt auf ein verändertes Hörvermögen schließen.
Internationale Zusammenarbeit
Die weitere Charakterisierung der Mausmutanten mit Hörverlust und Innenohrdefekten
erfolgt in Zusammenarbeit mit anderen wissenschaftlichen Instituten. Ursprünglich wurde in zwei ENU-Mutagenese-Projekten am
Helmholtz Zentrum München und am Medical Research Council (MRC) in Harwell nach
interessanten Mutanten geforscht. Diese werden an das Institut Pasteur in Paris bzw. an
die Universität Tel Aviv zu weiteren Untersuchungen weitergeleitet. Am Medical Research
Council in Nottingham bzw. am Sanger-Zentrum in Hinxton können zusätzlich spezielle
Untersuchungen durchgeführt werden.
Methoden für die detaillierte
Charakterisierung von Mausmodellen
˚ Abb. 1: Maus beim Hörtest mit einer Clickbox.
In Bezug auf die Gehörmutanten können zu
deren genaueren Charakterisierung als
weiterführende Tests die Präparation des Ossiculums (Hammer, Amboss, Steigbügel),
elektrophysiologische Untersuchungen, die
elektronenmikroskopische Untersuchung des
Cortischen Organs, der ABR(auditory brainBIOspektrum | 04.10 | 16. Jahrgang
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Tab. 1: Überblick über die bisher veröffentlichten Gehör-Mutantenlinien aus dem Münchner
ENU-Projekt.
Name
Abkürzung
Chromosom
Gen
Referenz
Tailchaiser
Tlc
9
Myo6
[8], [9]
Headturner,
Headchuck
Htu,
Hdck
2
Jagged1
[10]
Catweasel
Cwe
12
Six1
[11]
Headbanger
Hdb
7
Myo7a
[12]
Beethoven
Bth
19
Tmc1
[2]
Doarad
Dor
13
AP-2alpha = Tcfap2a
[13]
Hush Puppy
8
[5]
Diminuendo
Dmdo
6
miR-96
[3]
Oblivion
Obl
6
Atp2b2
[14]
Whirligig,
Floncer,
Carousel (n. c.)
Whi,
Flo,
Crsl
4
Chd7
[15]
[16]
[15]
n. c.: Die Mutation wurde nicht explizit nachgewiesen.
Tab. 2: Verknüpfung der mutierten Gene mit den beim Menschen bekannten Krankheiten.
Gen
Kategorie
Assoziierte Krankheit beim
Menschen
(www.genecards.org, OMIM)
Myosin VI (Myo6)
Myosin
Taubheit
Myosin VIIa (Myo7)
Myosin
Usher-Syndrom
Jagged1 (Jag1)
Ligand des Notch-Rezeptors
Alagille-Syndrom
sine oculis homeobox 1 (Six1)
Homeobox-Protein
DFNA23, Branchio-Otic-Syndrom
BOS3
chromodomain helicase DNA
binding protein 7 (Chd7)
Transkriptionsregulator
CHARGE-Syndrom
transmembrane channel-like 1
(früher transmembrane cochlea
expressed 1) (Tmc1)
Transmembranprotein
fortschreitender Gehörverlust und
prälinguale Taubheit
transcription factor AP-2 alpha
(AP-2alpha = Tcfap2a)
Transkriptionsaktivierung
Branchio-Oculo-Facial-Syndrom
mikro-RNA 96 (miR-96)
mikro-RNA
ATPase Ca transporting plasma
membrane 2 (Atp2b2)
Transport ATPase
stem response)-Test und die paint filling-Technik am Innenohr durchgeführt werden.
Mausmutanten ermöglichen
Erkenntnisse zur Biologie des Hörens
Zu den bedeutendsten Mausmodellen, die
über das Gehörmutanten-Projekt erzeugt wurden, zählen die Beethoven- und die Diminuendo-Mauslinie [2, 3]. Darüber hinaus sind
aber unzählige andere Linien erzeugt worden. Bereits in den ersten Jahren des Projekts
konnte die Anzahl der zur Verfügung ste-
Taubheit
henden Mausmodelle für Gehörverlust und
Taubheit verdoppelt werden.
Eines der ersten und bekanntesten Modelle stellt die Beethoven-Mutante dar. Heterozygote Mäuse haben einen progressiven
Gehörverlust. Es konnte am Mausmodell
gezeigt werden, dass der Gehörverlust mit
einer Degeneration sowohl der inneren als
auch der äußeren Haarzellen im Cortischen
Organ einhergeht. Die Kartierung auf Chromosom 19 im Mausgenom machte eine Mutation im Tmc1-Gen (transmembrane channel-
like 1) wahrscheinlich [2]. Eine T→A-Transversion in Exon 13 des Tmc1-Gens konnte letztendlich nachgewiesen werden. In einer backto-back-Veröffentlichung wurden die Daten
des Mausmodells Beethoven mit einer Tmc1Mutation [2] zusammen mit Daten aus einer
Humanstudie mit Patienten mit TMC1-Punktmutationen [4] gezeigt. Die Arbeit von Kurima et al. zeigte eine TMC1-Mutation in einer
DFNA36(DEAFNESS, AUTOSOMAL DOMINANT 36)-Familie sowie in elf DFNB7/
B11(DEAFNESS, AUTOSOMAL RECESSIVE 7
bzw. 11)-Familien auf. Der funktionelle Zusammenhang zwischen der Tmc1-Mutation
und der Haarzelldegeneration konnte jedoch
nur durch die Studien am Mausmodell Beethoven herausgefunden werden.
Mit der Mausmutante Diminuendo konnte
zum ersten Mal nachgewiesen werden, dass
mikro-RNAs auch eine Funktion für das
Hören ausüben [3]. Bei den Diminuendo-Mäusen liegt eine Mutation im miR-96-Gen vor.
Heterozygote Diminuendo-Mäuse haben progressiven Hörverlust, der mit Haarzellanomalien einhergeht. Homozygote Mutanten
zeigen überhaupt keine Cochlea-Reaktion
mehr. Für die in den Diminuendo-Mutanten
veränderte miR-96 gibt es 132 erwartete Zielmoleküle. Davon konnten fünf Gene (Aqp5,
Celsr2, Myrip, Odf2 und Ryk) experimentell
als Targets nachgewiesen werden. Alle fünf
Gene sind in den Diminuendo-Mäusen hochreguliert. Dagegen haben die in Diminuendo
herunterregulierten Gene, von denen ein
Zusammenhang mit dem Hören bekannt ist,
keine Zielsequenz für miR-96.
Aufgrund der großen Anzahl an Genen, die
eine veränderte Genexpression in der Diminuendo-Mutante zeigen, der Komplexität der
aufgetretenen Interaktionen sowie der Tatsache, dass viele regulierte Gene keine direkte
Zielsequenz zu miR-96 aufweisen, wurde
geschlossen, dass die molekularen Mechanismen, die in den Diminuendo-Mutanten
ablaufen, nicht auf ein simples Wirkschema
zurückzuführen sein werden. Vielmehr ist zu
erwarten, dass es sich um vielfältige kleine
Effekte handelt, die in einem komplexen Netz
zusammenspielen.
Zahlreiche weitere Mutanten wurden durch
das Konsortium untersucht. Hierbei konnten
die unterschiedlichsten Anomalien gezeigt
werden. In der Hush-Puppy-Mutante konnten
z. B. bereits äußerlich sichtbare morphologische Phänotypen beobachtet werden: eine
Veränderung der Ohrmuschel sowie Veränderungen der Schädelform. Bei den Mäusen,
die bereits in jungem Alter eine VermindeBIOspektrum | 04.10 | 16. Jahrgang
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rung des Hörvermögens aufweisen, konnte
gezeigt werden, dass Amboss und Steigbügel
nicht richtig entwickelt sind [5].
Tabelle 1 zeigt einen Überblick der bisher
veröffentlichten Mutantenlinien. In Tabelle
2 sind die Verknüpfungen der betroffenen
Gene mit Krankheitssyndromen beim Menschen zusammengestellt.
Hotspots
Aus den Angaben in Tabelle 1 deutet sich die
Tendenz an, dass es bezüglich der ENU-Mutagenese auf Chromosom 2 und Chromosom 4 zu
sogenannten hotspots kommt. Sowohl unter
den in München erzeugten Mutanten als auch
bei anderen Projekten sind mehrere Mauslinien mit Veränderungen im Jag1-Gen und
Chd7-Gen gefunden worden. Chd7 ist aber
nicht nur in Bezug auf ENU-Mutagenese ein
hotspot, sondern grundsätzlich ein Gen, von
dem es schon eine große Anzahl an Mutanten
gibt (siehe www.informatics.jax.org). Dies kann
einerseits darauf zurückzuführen sein, dass
die entstandenen Mutanten aufgrund ihres
deutlichen Phänotyps (starkes Kreislaufen)
sehr einfach zu erkennen sind. Da es aber eine
große Menge an gene-trap-Mutanten an diesem Locus gibt, und gene-trap-Mutanten Phänotyp-unabhängig generiert werden, spricht
dies dafür, dass es sich bei Chd7 tatsächlich
um einen echten hotspot handelt.
einem weiteren Schritt konnten zwei modifier-Loci auf Chromosom 7 und 14 gefunden
werden.
Der Einfluss des genetischen Hintergrunds
auf den Phänotyp einer Mausmutante wurde
auch in einem anderen Projekt genutzt: Da
der genetische Hintergrund einen Pool von
modifier-Genen darstellen kann, wurde die
Beethoven-Mutante dazu verwendet, systematisch nach Genen zu suchen, die mit dem
Tmc1-Gen in Wechselwirkung stehen. In einer
Studie von Noguchi et al. konnten insgesamt
sechs Loci auf sechs Chromosomen kartiert
werden, die mit dem „Beethoven-Gen“ Tmc1
interagieren [7].
Ausblick
Die bisherige Arbeit mit Mausmutanten konnte einen erheblichen Beitrag dazu leisten,
wichtige Informationen über die molekularen Mechanismen von Taubheit, progressiven Gehörverlust und anderen Innenohrdefekten zu gewinnen. Die Erkenntnisse aus
diesen Forschungsarbeiten, sowie die dadurch
verfügbaren Mausmodelle stoßen weltweit
auf großes Interesse. Beethoven wurde von
mehreren Gruppen angefragt, um weiterführende Arbeiten durchzuführen. Darunter sind
bereits erste Versuche, Ansätze für Therapien
auszuloten.
ó
[5] Pau H, Fuchs H, de Angelis MH et al. (2005) Hush puppy:
a new mouse mutant with pinna, ossicle, and inner ear
defects. Laryngoscope 115:116–124
[6] Kiernan AE, Li R, Hawes NL et al. (2007) Genetic background modifies inner ear and eye phenotypes of jag1 heterozygous mice. Genetics 177:307–311
[7] Noguchi Y, Kurima K, Makishima T et al. (2006) Multiple
quantitative trait loci modify cochlear hair cell degeneration
in the Beethoven (Tmc1Bth) mouse model of progressive
hearing loss DFNA36. Genetics, im Druck
[8] Hertzano R, Shalit E, Agnieszka K et al. (2008) A Myo6
mutation destroys coordination between the myosin heads,
revealing new functions of myosin VI in the stereocilia of
mammalian inner ear hair cells. PLoS Genet 4:e1000207
[9] Kiernan AE, Zalzman M, Fuchs H et al. (1999) Tailchaser
(Tlc): a new mouse mutation affecting hair bundle differentiation and hair cell survival. J Neurocytol 28:969–985
[10] Kiernan AE, Ahituv N, Fuchs H et al. (2001) The Notch
ligand Jagged1 is required for inner ear sensory development.
Proc Natl Acad Sci USA 98:3873–3878
[11] Bosman EA, Quint E, Fuchs H et al. (2009) Catweasel
mice: a novel role for Six1 in sensory patch development and
a model for branchio-oto-renal syndrome. Dev Biol 328:285–
296
[12] Rhodes CR, Hertzano R, Fuchs H et al. (2004) A Myo7a
mutation cosegregates with stereocilia defects and low-frequency hearing impairment. Mamm Genome 15: 686–697
[13] Ahituv N, Erven A, Fuchs H et al. (2004) An ENUinduced mutation in AP-2alpha leads to middle ear and ocular
defects in Doarad mice. Mamm Genome 15:424–432
[14] Spiden SL, Bortolozzi M, Di Leva F et al. (2008) The novel
mouse mutation Oblivion inactivates the PMCA2 pump and
causes progressive hearing loss. PLoS Genet 4:e1000238
[15] Hawker K, Fuchs H, Angelis MH et al. (2005) Two new
mouse mutants with vestibular defects that map to the highly
mutable locus on chromosome 4. Int J Audiol 44:171–177
[16] Pau H, Hawker K, Fuchs H et al. (2004) Characterization
of a new mouse mutant, flouncer, with a balance defect and
inner ear malformation. Otol Neurotol 25:707–713
Literatur
Der Einfluss des genetischen
Hintergrunds auf den Phänotyp
Ein weiteres interessantes Ergebnis der bisherigen Arbeiten ist die Abhängigkeit des
Phänotyps vom genetischen Hintergrund, auf
dem sich die Mutation befindet: Es gab bereits
vor der ersten ENU-Mutante eines Jagged1Gens eine Knock-out-Maus zu diesem Gen.
Allerdings wurde diese Maus auf einem anderen genetischen Hintergrund erzeugt. Während die Jag1-Mutantenlinie aus dem ENUProjekt durch einen deutlichen „Kopfnicker“Phänotyp charakterisiert ist, ist dieses Verhalten bei der Knock-out-Maus nicht zu erkennen. Um den Einfluss des genetischen Hintergrunds auf den Phänotyp einer Mutantenlinie
zu untersuchen, wurden in einem Experiment
die Knock-out-Maus und die ENU-Mutante
über mehrere Generationen gekreuzt. Kiernan et al. konnten darin zeigen, dass auch
32 Prozent der Knock-out-Tiere in der N2Generation auf C3H das charakteristische
Kopfnicken aufweisen d. h. es wurde eine
Rückkreuzung auf den Elternstamm durchgeführt, bei dem das Kopfnicken in den
Mutanten beobachtet werden konnte [6]. In
[1] Fuchs H, Schughart K, Wolf E et al. (2000) Screening for
dysmorphological abnormalities – a powerful tool to isolate
new mouse mutants. Mamm Genome 11:528–530
[2] Vreugde S, Erven A, Kros CJ et al. (2002) Beethoven, a
mouse model for dominant, progressive hearing loss DFNA36.
Nat Genet 30:257–258
[3] Lewis MA, Quint E, Glazier AM et al. (2009) An ENUinduced mutation of miR-96 associated with progressive hearing loss in mice. Nat Genet 41:614–618
[4] Kurima K, Peters LM, Yang Y et al. (2002) Dominant and
recessive deafness caused by mutations of a novel gene,
TMC1, required for cochlear hair-cell functions. Nat Genet
30:277–284
Kontaktadresse:
Dr. Helmut Fuchs
Helmholtz Zentrum München
Institut für Experimentelle Genetik
Ingolstädter Landstraße 1
D-85764 Neuherberg
Tel.: 089-3187-3151
Fax: 089-3187-3500
[email protected]
AUTOREN
Helmut Fuchs
Sibylle Wagner
Wissenschaftlich-technischer
Leiter der German Mouse Clinic
am Institut für Experimentelle
Genetik des Helmholtz Zentrums München.
Leiterin des ENU-MutageneseProjekts am Institut für Experimentelle Genetik des Helmholtz Zentrum München.
Valerie Gailus-Durner
Martin Hrabe de Angelis
Wissenschaftlich-administrative
Leiterin der German Mouse
Clinic am Institut für Experimentelle Genetik des Helmholtz
Zentrums München.
Direktor des Instituts für
Experimentelle Genetik am
Helmholtz Zentrum München
und Lehrstuhl für Experimentelle Genetik an der Technischen Universität München
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