Wärmetönung der Adenosintriphosphorsäure-Spaltung

A D E N O S I N T R I PHOS PHOR-SÄU RES PALTUNG
375
Wärmetönung der Adenosintriphosphorsäure-Spaltung
Von
C . KITZINGER u n d T . BENZINGER
U. S. Naval Medical Research Institute, Bethesda, Md., USA
(Z. Naturforsdig. 10 b, 375—382 [1955]; eingegangen am 14. März 1955)
Die Wärmetönung der Reaktion ATP4
f H2O — ADP3
b HPO;
b H+ wurde mit
Myosin als Ferment bei p H 8,0 gemessen. Nach Abzug der je nach dem Puffersystem ganz
verschiedenen Neutralisationswärme des Protons, die wir getrennt gemessen haben, bleibt für
die Spaltung der „energiereichen Phosphatbindung" AH = — 4800 cal. Folgerungen aus
diesem Ergebnis — verglichen mit klassischen Annahmen von ungefähr — 12 000 cal — werden kurz besprochen. Prinzip und Leistung der hier erstmals angewandten mikrokalorimetrischen Methode werden beschrieben.
D
ie Entdeckung der Rolle, welche die Adenosintriphosphorsäure (ATP) bei der Übertragung von
Energie in lebenden Systemen spielt, ist von einer
Wärmemessung durch M e y e r h o f und L o h m a n n 1 ausgegangen. In zwei umfassenden Arbeiten hat K r e b s 2 , 3 später die Energieverhältnisse
quantitativ dargestellt und gezeigt, wie der Haupt^
ström der nutzbaren Energie, gleichviel aus welchen
Quellen der Nahrungsstoffe er herkommt und welchen Verwendungen er zufließt, durch die Reaktion
des Aufbaus und der Hydrolyse von ATP hindurchgeleitet wird.
Die kalorimetrische Untersuchung von M e v e r h o f und L o h m a n n war mit Muskelextrakt als
Ferment an der Reaktion:
APT — Inosinphosphorsäure + Ammoniak
+ 2 Phosphorsäure ( — 32 600 cal)
vorgenommen worden. Durch die Kalorimetrie von
zwei weiteren Reaktionen, Adenylsäure — Inosinphosphorsäuie + Ammoniak ( — 8000 cal) und Inosinpyrophosphorsäure — Inosinphosphorsäure + 2
Phosphorsäure ( — 25 000 cal) konnte die Gesamtwärme der ersten Reaktion in ihre Komponenten aufgeteilt werden.
Zwei Umstände haben uns die Möglichkeit gegeben, AH der ATP-Spaltung erneut zu messen: Die
Verfügbarkeit eines Enzyms, das bei pn 8 die Reaktion:
A T P 4 - + H , 0 -> A D P 3 - + HPO^- + H +
katalysiert (Myosin nach W e b e r - E d s a l l modifiziert von B o 11 s 6 ), und der Abschluß der Entwicklung einer neuen Mikromethode zur Wärmemessung.
Das ATP-Myosin-System wurde als erstes Objekt auf
Anregung von Dr. M. F . Morales gewählt. In seiner
Abteilung wurden alle chemisch-präparativen und
chemisch-analytischen Arbeiten von Dr. R. J. P o d o 1 s k y geplant und ausgeführt. E r wird gesondert
über unsere gemeinsamen Versuche berichten (P o d o 1 s k y7).
Die hier erstmals angewandte Methode der Mikrokalorimetrie wurde früher 8 kurz beschrieben und
wird an anderer Stelle ausführlicher dargestellt. Zur
Beurteilung der Versuche mit ATP erscheint das Folgende wesentlich:
I. Wärmemessung
mit Prostataferment kalorimetrisch gemessen hat.
Bewährte Methoden messen oder kompensieren den
Temperaturunterschied, der in einer Lösung durch eine
chemische Reaktion entsteht. Wir messen den Wärmefluß,
in dem sich der entstandene Unterschied ausgleicht. Je
kräftiger dieser Fluß und je kürzer seine Dauer, desto
empfindlicher wird die Messung und desto weniger wird
sie von außen gestört. Bei diesem Verfahren ist die große
Wärmeleitfähigkeit einer höchstempfindlichen Thermosäule kein Nachteil. Man kann die Zahl der Thermoelemente in der Säule beliebig groß machen, solange es
nur gelingt, die Wärme aus allen Teilen der Versuchs-
1 O. M e y e r h o f
u. K. L o h m a n n , Bioehem. Z.
253,431 [1932],
2 H. A. K r e b s , Brit. med. J. 9, 97 [1953].
3 K. B u r t o n u. H. A. K r e b s , Bioehem. J. 54, 94
[1953].
4 O. M e y e r h o f , Ann. New York Acad. Sei. 45, 377
[1944].
s P. O h l m e y e r , Z. Naturforschg. 1, 30 [1946].
6 J. B o 11 s u. M. F. M o r a 1 e s , J. cellular comparat.
Physiol. 37, 27 [1951],
7 R. J. P o d o l s k y ,
J. biol. Chemistry, 1955, im
Drude.
8T. Benzinger
u. C. K i t z i n g e r , Fed. Proc.
13, 11 [1954].
M e y e r h o f 4 hat 1944 die Bindungswärme je
einer Phosphatbindung in ATP zu — 12 000 cal angenommen. Dies wurde von O h l m e v e r 5 bestätigt, der die Reaktionen:
ATP — Adenosin + 3 Phosphorsäure und
AMP — Adenosin +
Phosphorsäure
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C. K I T Z I N G E R U N D T. B E N Z I N G E R
376
antwortet, wird die Halbwertzeit im wesentlichen bestimmt von der Wärmeleitung und -kapazität des Gefäßes mit seinem Inhalt. Unabhängig von diesen Größen
ist die Fläche unter der Kurve proportional der Gesamtmenge der entwickelten Wärme. Für das hier verwendete
Instrument ergibt die Flächenauswertung eine Antwort
von
dauernd
W i r d in d e m G e f ä ß W ä r m e
flüssigkeit rasch genug an die schnell antwortende Säule
heranzubringen. Hierfür wurde dem Beaktionsgefäß eine
Gestalt gegeben, welche den Inhalt (15 bis 20 ccm) an
einer 100 qcm großen zylindrischen Oberfläche ausbreitet.
Mit dieser berührt sie die zylindrische Stirnfläche einer
3 mm langen Thermosäule aus 10 000 Kupfer-Konstantanelementen. Durch die Säule fließt die Reaktionswärme aus
dem Gefäß heraus in einen Kupferblock als Wärmereservoir. Das Antwortpotential der Thermosäule wird mit
Hilfe eines Gleichstromverstärkers auf einem registrierenden Potentiometer über der Zeit als Abszisse verzeichnet.
Der Kupferblock ist von der äußeren Umgebung ther-
und mit konstanter Geschwindigkeit entwickelt, so antwortet das Instrument nach exponentiellem Anstieg mit
einem konstanten Potential (Abb. 2).Nach Ausschalten der
Wärmequelle fällt dieses Potential auf Null mit der erwähnten Zeitkonstante. Hiervon wiederum unabhängig ist
30
^20
$
-
-
10
. 3715fiVolfsec
/ • 0,0117 cal
= 11500 cal/MolCl
1
-
Null-Zacke
0
500
1000
f
sec
1500
Abb. 1. Elektrische Eichung. Zufuhr: 0,01915 cal. Antwort: 1720 wV/sec. Empfindlichkeit: 89 800
.
misch isoliert. Solange seine Temperatur sich dennoch ändert, antwortet die Säule mit einer Störspannung. Diese
ist proportional der Temperaturänderung (Grad/sec) und
der Wärmekapazität des Gefäßes mit seinem Inhalt. Damit diese Störung kompensiert wird, liegt in demselben
Block eine zweite Säule identischer Bauart mit einem
zweiten Gefäß von gleicher Form mit gleichen Mengen
geeigneter Blindversuchslösungen als Inhalt. Die zweite
Thermosäule wird gegen die erste in Serie geschaltet.
Entsteht im Reaktionsgefäß eine plötzliche Temperaturerhöhung, so antwortet das Instrument mit einem Potentialsprung. Das Spitzenpotential fällt dann exponential auf Null (Abb. 1). Da die Säule selbst sehr schnell
0
500
1000
1500 sec
Abb. 3. HCl-Neutralisation in „Tris". 3,62 «Mol HCl.
20,00 ccm 0,1-m. „Tris". 3745 uVsec = 0,0417 cal.
11 500 cal/Mol HCl.
der Dauerausschlag über dem Nullpotential
1
90 '° m V
cal/sec
In den folgenden Experimenten finden sich beide Formen: Neutralisationswärmen (Abb. 3) als Begleiterscheinung einer schnellen Ionenreaktion entsprechen dem ersten Typ, langsam verlaufende Fermentreaktionen (Abb. 4)
nähern sich dem zweiten.
Zum Vergleich mit den biochemischen Messungen wurde
das Instrument über einen Bereich von vier Größenordnungen (IO-4 bis 10° cal) elektrisch und chemisch geprüft. Zur elektrischen Eichung wurden Ströme bekannter Stärke durch Drähte von bekanntem Widerstand im
Inneren des Gefäßes geschickt. Vergleichswiderstände und
Standardzellen waren vom National Bureau of Standards
Abb. 2. Elektrische Eichung. Zufuhr: 0,456 X IO"3 cal/sec. Antwort: 41 ,uV. Empfindlichkeit: 90 000
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A D E N O S I N T R I PHOS PHOR-SÄU R E S
mV
,
cal sec
Potential in
Wärmefluß in cal/sec
0,20
0,45
0,45
0,45
0,45
0,45
0,45
0,50
0,50
0,50
0,50
0,50
0,50
0,50
0,50
0.60
0,60
0,60
0,70
0,70
92,20
90,80
91,40
91,60
89,00
89,00
89,00
90,00
90,40
90,10
91,30
90,70
90,20
90,10
90,60
90,90
90,60
91,00
89,30
89,30
Mittelwert
90,0 ± 1 , 1 %
PALTUNG
Gesamtwärme in cal
xio~3
377
...
mV sec
Potential in
.
cal
760
570
26
26
19
19
13
13
10
6
6
5
5
4
4
3
3
2
2
90,70
88,50
90,30
89,20
89,00
90,90
90,20
91,80
89,00
87,60
89,60
90,30
88,50
91,70
88,60
89,80
93,00
88,40
92,00
Mittelwert
Tab. 1. Ergebnisse bei konstanter Wärmeentwicklung.
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
90,0 ± 1 , 6 %
Tab. 2. Ergebnisse bei stoßförmiger Wärmeentwicklung.
20
^
^
15 WO u Voltsee
-0,1717 cal
16660 ca//Mol ATP
I
§ 10
%
-
-0-
500
1000
1500
25
2000
2500
3000 see
50 min
3500
Abb. 4. ATP-Spaltung in Myosin und „Tris"-Puffer. 10,3 Mol ATP, 0,11% Myosin.
15 440 MV sec = 0,1717 cal. 16 660 cal/Mol ATP.
in Washington, D. C. geeicht. Als Potentiometer für die
Strommessung diente ein Instrument vom Typ K von
Leeds und Northrup. Die Gefäße waren wie zum chemischen Versuch mit Wasser gefüllt. Zwei Meßreihen wurden durchgeführt. Tab. 1 zeigt Ergebnisse bei konstanter
Wärmeentwicklung.
In dieser Reihe, deren Fehlerbreite abhängt von
der Reproduzierbarkeit je einer Strom- und Widerstandsmessung, der Gleichstromverstärkung und der
Spannungsmessung mit dem registrierenden Potentiometer, und die außerdem alle thermischen Fehlerquellen einschließt, wurde die Standardabweichung
o — ± 1,1% gefunden.
In Tab. 2 sind Ergebnisse
Wärmeentwicklung dargestellt.
bei
stoßförmiger
Hier kommen zwei neue Fehlerquellen hinzu: die
Planimetrie der Kurven und die Messung der Stromflußzeit in Millisekunden. Die mittlere Abweichung
ist o = ± 1,6%. Bei der Hälfte der Versuche (mit *
bezeichnet) ist während des Stromdurchgangs die
Drehbewegung vollzogen worden, welche im chemischen Versuch das Mischen der Reaktanten bewirkt.
Die Streubreite wurde dadurch nicht größer.
Die Eichungen waren über einen Bereich von
200 msec bis zu vielen Stdn. unabhängig von der
Zeitdauer des Wärmeflusses und von 2 X 1 0 - 3 bis
2 5 X 1 0 " cal unabhängig von der Gesamtwärmemenge.
Elektrische Eichungen zeigen zwar, daß Wärme,
die in den Gefäßen entsteht, richtig gemessen wird.
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C. K I T Z I N G E R U N D T .
378
Sie beweisen nidit, daß die Reaktanten genügend
gemischt werden, daß die Reaktion vollständig verläuft und daß keine anderen wärme-absorbierenden oder -produzierenden Prozesse mit den in Lösung befindlichen Ionen oder Molekülen vor sidi gehen *. Dies kann jedodi mit „chemischen Eichungen"
gezeigt werden. Wir verwendeten dazu die Neutralisation einer vollständig dissoziierten Säure (HCl)
mit einer vollständig dissoziierten Base (NaOH). Für
die Reaktion
H+ + O H - -
BENZINGER
fiMol HCl
neutralisiert
in 20 ccm
n/50—NaOH
Temperatur
[°C]
4—5
18
—
—
—
—
—
—
3—5
21
—
—
—
—
3—5
20
— 13 770
— 13 570
— 13 890
48—50
18
—
—
—
—
14
14
13
13
020
070
880
490
18
—
—
—
—
—
—
13
14
13
13
13
14
770
380
580
220
680
310
HoO
ist bei 18° AH = — 13 720 cal ( H a m e d und
O w e n 9 ) . Tab. 3 zeigt die Ergebnisse unserer Messungen.
90—100
Für diemisdie Eichungen und Enzymversuche wurden
zwei Gefäßformen verwendet. Die Methoden für ihre Füllung und für die Mischung der Reaktionsteilnehmer sind
verschieden. Das Zweikammergefäß (Abb. 5) aus Glas
oder Plexiglas hergestellt, faßt je 7 bis 8 ccm von zwei
Lösungen, z. B. Substrat und Enzym, die mit einer Pipette eingefüllt werden. Die Füllung des Tropfengefäßes
(Abb. 6) erfolgt mit größerer Genauigkeit gravimetrisch:
Ein aufgerollter Polyäthvlenschlaudi von 0,028 mm Öffnung und 0,016 mm Wandstärke, je nach der gewünschten Einwaage 5 bis 30 cm lang, wird mit 10 bis 100 mg
einer n/1-, n/10- oder n/100-HCl-Lösung gefüllt und auf
der Mikrowaage gewogen. Mit einer luftgefüllten Rekordspritze und Nadel wird der Inhalt des Schlauches in eine
vorgesehene Vertiefung der Innenwand des Gefäßes geblasen. Der Schlauch wird von der Nadel abgenommen
und zurückgewogen, das Gefäß im Hauptraum mit 20 ccm
des anderen Reagens, n/50-NaOH, beschickt, in das Kalorimeter eingeführt und verschlossen. Wenn nach ungefähr zwei Stunden das Potential des Kalorimeters konstant und kleiner als Vi0 «V oder 10"8 cal/sec geworden
ist, werden die Lösungen gemischt. Hierzu wird das
9 S. H a r n e d u. B. B. O w e n , The Physical Chemistry of Electrolvtic Solutions, p. 240, Reinhold
Publishing Corp., New York 1950.
Störungen durch die Bildung monomolekularer
Schichten an Glaswänden haben wir bei Reaktionen mit
10~5 bis 10"® molaren Lösungen beobachtet, wo die gesamte Temperaturänderung Viooo bis Vioooo0 C beträgt.
Hierüber wird später berichtet. Bei den ATP-Versuchen,
wo die Temperatur um mehrere Viooo0 steigt, stört diese
Erscheinung nidit.
cal/Mol
HCl
Mittelwert
für 18° C:*
* Temperaturkoeffizient:
14
13
13
14
13
13
260
910
460
110
660
460
13
13
13
13
860
560
390
180
AH = — 13 790 cal + 2,2 %
50 c a l / ° C .
Tab. 3. Neutralisationswärme von HCl mit NaOH bei Anwendung verschiedener Substanzmengen.
ganze Kalorimeter um die Achse des zylindrischen Gefäßes gedreht (180° vorwärts, 360° rückwärts, 180° vorwärts). Wenn die Ionen des Hauptraums im Überschuß
vorhanden sind, verläuft die Beaktion quantitativ**. Während des Mischens entsteht durch unvollständig kompensierte Flüssigkeitsreibung, Inversion kleiner Temperaturgradienten und Verdampfen und Rückkondensation infolge der hydrodynamischen Druckänderungen eine thermische „Nullzacke". Ihre Fläche entspricht bei Tropfengefäßen 0,1 bis 0,2 Millikalorien, beim Zweikammergefäß,
das eine kräftigere Mitbewegung verlangt, ungefähr
1 Millikalorie. Die „Nullzacke" wird als Korrektur je nach
ihrem Vorzeichen addiert oder subtrahiert. Ihre Flächengröße ist innerhalb ± 1 0 % reproduzierbar.
** Der Wärmefluß in die Säule hinein erfolgt in einer
ringförmigen Zone je nach der Ausgangslage des Tropfens. Zwei Tropfen am Ende des ersten und zweiten
Drittels der Gefäßlänge ergeben Eichungen entsprechend
Tab. 1 und 2. Die Mittellage und die beiden Endlagen
haben eine um + 5 % und — 5 % abweidiende Eichung,
was wir durdi elektrisdie Messungen mit entsprediend
gelagerten ringförmigen Widerstandsdrähten verifiziert
und für die Werte der Tab. 3 berücksiditigt haben.
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Datum
Enzym:
No.
PALTUNG
379
Myosin
[%]
Substrat: ATP bzw. P
Mol X 10~ 6
Wärme
cal X 10~ 3
AH
cal/Mol ATP
4. Dez. 1953
18. Dez. 1953
19. Dez. 1953
21
21
21
0,05
0,07
0,035
15,20
15,20
7,60
— 236,0
— 247,5
—124,5
— 15530*
— 16270*
— 16400*
5. Mai 1954
6. Mai 1954
7. Mai 1954
11. Mai 1954
20. Mai 1954
21. Mai 1954
27. Mai 1954
28. Mai 1954
7. Juni 1954
8. Juni 1954
23. Juli 1954
23. Juli 1954
24. Juli 1954
24. Juli 1954
12. Nov. 1954
19. Nov. 1954
6. Dez. 1954
7. Dez. 1954
37
37
37
37
38
38
38
38
40
40
43
43
43
43
47
47
48
48
0,10
0,10
0,10
0,05
0,05
0,06
0,06
0,06
0,07
0,07
0,11
0,11
0,11
0,11
0,18
0,04
0,07
0,07
3,80
7,60
7,60
7,60
7,60
7,60
7,60
7,60
15,20
15,20
11,40
10,44
5,22
5,22
5,70
6,65
26,60
2,70
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
* mit 0,001 —m • CaClo
61,4
127,1
124,4
121,8
122,5
130,0
126,8
127,9
259,0
253,8
187,5
171,7
87,1
86,8
93,6
112,5
411,0
42,7
Mittelwert
16150
16770
16400
16000
16130
17100
16680*
16820*
17030*
16930*
16440
16420
16690
16630
16420
16900
15450
15800
— 16360 + 2,6 %
Tab. 4. Versuche mit ATP in „Tris"-Puffer.
II. Lösungen und diemische Analysen für Versuche
mit Myosin und ATP
Myosin wurde nach W e b e r - E d s a l l (modifiziert
von J. B o 11 s) aus Kaninchenmuskeln gewonnen. Vier
Fällungen erwiesen sich als notwendig, um Spuren des
Enzyms Myokinase zu entfernen. Der Erfolg dieses Vorgehens wurde kalorimetrisch geprüft: nur in Abwesenheit
von Myokinase hört die enzymatische Wärmebildung nach
Abspaltung des ersten Phosphorsäuremoleküls mit scharfem Endpunkt auf. Die Konzentration des Proteins war
0,055 bis 0,18% (1% = 10 g Protein oder 10/6 g N im
Liter). Myosin- und ATP waren in 0,6-m. KCl, in einigen
Kontrollversuchen in 0,15 und 0,01-m. KCl gelöst. 0,001-m.
CaCl., wurde in einem Teil der Versuche zugesetzt. Die
Temperatur war 20° C. Genauere Festlegung erfolgte bei
Versuchen in Phosphatpuffer, dessen Neutralisationswärme von der Reaktionstemperatur abhängt. Puffersubstanzen wurden in 0,05 bis 0,1-m. Stärke zum Myosin
zugegeben. Das gesamte Ionenmilieu wurde in Fermentund Substratlösungen sorgfältig gleichgehalten, um Fehler durch Verdünnungswärmen bei der Mischung zu vermeiden. p H war stets 8,0 ± 0,1. Während der Hydrolyse
trat keine potentiometrisch meßbare pH-Änderung ein.
Folgende Puffersysteme wurden verwendet: „Tris" (Trihvdroxyaminomethan) mit einer Neutralisationswärme von
— 11 600 cal, Phosphatpuffer mit einer Neutralisationswärme von — 1800 cal und in einigen Kontrollversuchen
Glykokollpuffer mit einer Neutralisationswärme von
— 1 1 600 cal. Bei der Wahl von Puffersystemen so verschiedener Neutralisationswärmen mußten die individualen Anteile der Neutralisationswärme und der Pyro-
phosphatspaltung besonders gut erkennbar werden. Als
Substrat wurden Lösungen aus drei verschiedenen kristallinen ATP-Präparaten von Sigma und Pabst in 0,001
und 0,002 molarer Konzentration verwendet. Der genaue ATP-Gehalt dieser Lösungen wurde mittels Bestimmung des durch Myosin abgespaltenen Phosphats festgestellt. Ein Teil des Ansatzes wurde unmittelbar nach
Zusatz von Myosin, ein anderer nach vollständiger Hydrolyse (kalorimetrische Kontrolle) enteiweißt. Die beiden
Proben wurden auf anorganisches Phosphat nach Fiske
und Subbarow analysiert. Die Differenz dieser Werte entsprach im Mittel 95% der Einwaage an ATP, mit einer
Standardabweichung von ± 1,7%. Der Mittelwert wurde
der Berechnung von AH zugrunde gelegt. Berücksichtigung der einzelnen Phosphatanalysen verminderte die
Streuung der AH-Werte nicht, woraus wir schließen, daß
Unterschiede im ATP-Gehalt der Lösungen innerhalb der
Genauigkeitsgrenzen der Phosphatbestimmung lagen.
III. Wärmemessungen am ATP-Myosinsystein
In Tab. 4 sind die Versuche mit ATP in „Tris"Puffer aufgeführt.
Sie ergaben für AH einschließlich der Ionisierung
und Neutralisation — 16 360 cal ± 2,6%.
Tab. 5 enthält die zugehörigen Werte für die Neutralisation eines Protons aus HCl in „Tris"-Puffer bei
PH 8,0. Sie ergaben — 11 580 cal ± 1,4%. Zugabe
von Myosin in 4 Versuchen hatte keinen Einfluß auf
die Neutralisationswärme. Für die Wärmetönung der
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C. K I T Z I N G E R U N D T. B E N Z I N G E R
380
«Mol HCl neutralisiert
in 0 • 1-m • „Tris"
(0,6-m • KCL
in beiden Lösungen)
4,38
3,76
3,62
3,81
3,83
3,72
3,75
4,46
Mittelwert: AH =
AH cal/Mol
—
—
—
—
—
—
—
—
11 480
11 320
11 500
11 710
11 810
11 760
11 400
11 660
— 11 580 ± 1,4%
Tab. 5. Werte für die Neutralisation eines Protons aus
HCl in „Tris"-Puffer bei p H 8,0.
Phosphatbindung in ATP folgt also aus den Versuchen in „Tris' -Puffer: AH = — 4780 cal ± 8,8%.
Dieser Wert schließt den unerheblichen Beitrag für
die Ionisierung ein ( P o d o l s k y 7 , B e r n h a r d 10 ).
Entsprechende Versuche in Phosphatpuffer sind
durch zwei Umstände kompliziert: Die Neutralisationswärme hat einen Temperaturkoeffizienten von
300 cal/0 C ( B e r n h a r d 10 ). Ferner fanden wir die
Neutralisationswärme in Phosphatpuffer erhöht in
Gegenwart einiger Myosinpräparate *. Daher wurden
Bestimmungen der Spaltungswärme und der Neutralisationswärme paarweise vorgenommen und die
Neutralisationswärme auf die Versuchstemperatur
des zugehörigen Spaltungsversuchs
umgerechnet
(Tab. 6).
Es folgt für die W 7 ärmetönung der „energiereichen
Phosphatbindung" in ATP aus den Phosphatpufferversuchen, wiederum einschließlich
Ionisierungswärme, AH = — 4 9 8 0 cal ± 2,7%. Die Differenz unserer Mittelwerte für „Tris"- und Phosphatpuffer
ist zur Hälfte durch einen auffallend hohen Wert
vom 3. Dezember in Tab. 6 bedingt. Eine Aufklärung dieser Unstimmigkeit muß späteren Versuchen
überlassen bleiben.
ADP wird von dem verwendeten Enzym nicht
meßbar angegriffen. Tab. 7 zeigt zwei Spaltungsversuche mit ADP-ATP-Gemischen. Wenn die gesamte
Spaltungswärme auf den ATP-Anteil bezogen wird,
fallen die Resultate mit denen der ATP-Spaltung in
Tab. 4 zusammen. Inosinpyrophosphat liefert bei der
A. B e r n h a r d , J. biol. Chemistry 1955, im Druck.
H. G i r a n , C. R. hebd. Seances Acad. Sei. 135, 961
[1902],
M e y e r h o f u. L o h m a n n 1 haben bei der Desaminierung der Adenvlsäure ebenfalls einen Einfluß des
Hydrolyse ungefähr die gleiche Wärme je Mol wie
ATP (Tab. 7). Bei niederer Ionenstärke, 0,15 und
0,01-m. KCl im Ansatz, war AH nicht erkennbar verschieden von den in 0,6-m. KCl gemessenen Werten
(Tab. 8).
IV. Besprechung
Abschließend vergleichen wir die vorgelegten
Wärmemessungen erst untereinander, dann mit Messungen anderer Untersucher, und zuletzt mit Werten, welche für die freie Energie der ATP-Spaltung
berechnet worden sind.
Die Übereinstimmung unserer Spaltungswerte erfüllt nicht ganz, was die Präzision der kalorimetrischen Methode erhoffen ließ. Die mittlere Abweichung ö, bei elektrischen Eichungen ± 1,6% und bei
chemischen Eichungen und Bestimmungen von Neutralisationswärmen ± 2,2%, steigt in den Enzymversuchen auf ± 2,7%. Diese Streuung mußte in einer
über 11/2 Jahre ausgedehnten Versuchsreihe mit neun
verschiedenen Myosinpräparaten und drei verschiedenen Substratpräparaten in Kauf genommen werden. Bezogen auf AH der Spaltung der Pvrophosphatbindung allein streuen die Werte prozentual
mehr. Dies ist da unvermeidlich, wo eine Meßgröße
durch Subtraktion zweier größerer Quantitäten erhalten wird.
In diesem Zusammenhang muß auch die Übereinstimmung der Resultate gesehen werden. Sie beziehen sich auf zwei Puffersysteme, deren Neutralisationswärmen sich um fast 10 000 cal unterscheiden, und auf Lösungen, deren Ionenstärke, Enzvmund Substratkonzentrationen um je eine Größenordnung variiert wurden. Damit wird es unwahrscheinlich, daß ein Teil der Spaltungswärme durch
Bindung von Reaktionsprodukten am Protein festgelegt war und dadurch der Messung entgangen sein
könnte. Schließlich fanden wir für ein verwandtes
Molekül, Inosinphosphorsäure, nahezu denselben
Wert. Für die Spaltung einer Pyrophosphatbindung
in anorganischem Pvrophosphat hat G i r a n 11
— 4300 cal gefunden.
Mit den experimentellen Befunden von M e y e r h o f für ATP 1 ist AH = — 4800 cal nicht unvereinbar. Der L i e r s c h i e d liegt in der Berücksichtigung
der Neutralisation des Protons. Wenn man dessen
Wärmetönung nicht subtrahiert, kann jeder Wert
zwischen — 6500 und — 16 500 cal richtig gemessen
10
11
Eiweißgehaltes ihrer Enzymlösungen auf die Spaltungswärme beobachtet und als Ursache angenommen, daß
bei erhöhtem Eiweißgehalt mehr Aminogruppen die Pufferung übernehmen.
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ATP-Spaltung in Phosphatpuffer
Dez.
Dez.
Dez.
Dez.
[%]
[°C]
0,28
0,28
0,28
0,09
6,65
6,75
6,46
6,65
19.19
19.20
19,30
18,49
£ 3
—
—
—
—
45,9
46,2
43,6
45,0
T
f
0)2
§X
[°C]
£ s
—
—
—
—
4,47
4,52
4,52
4,57
19,44
19,41
18,26
18,65
6900
6840
6750
6770
—
—
—
—
8,7
8,9
8,8
8,95
"o
s
no
£
n
—
—
—
—
1850
1880
1850
1870
—
—
—
—
AH cal/Mol
nach Abzug
der Neutral.Wärme
48
48
48
48
T
CS 1—1
icaX
O
cn S
T
o
1—1
X
U "3
KS
AH cal/Mol
umgeredmet
auf T der entspr. Spaltung
No.
i
o
<U rH
AH cal/Mol
einschließlich
Neutralisation
Datum
1.
2.
3.
4.
•§
g
S°
381
HCl-Neutralisation in Phosphatpuffer
CM
s
fi
w
PALTUNG
Wärmetönung
der Phosphatbindung in ATP
A D E N O S I N T R I PHOS PHOR-SÄU R E S
1925
1940
1550
1920
—
—
—
—
4975
4900
5200
4850
Mittelwert: — 4 9 8 0
+
2,7 %
Tab. 6. Spaltungs- und Neutralisationswärme. Neutralisationswärme auf Versuchstemperatur
des Spaltungsversuches umgerechnet.
/«Mol
ADP
ATP
5,6
14,2
7,98
5,70
—
—
—
—
—
—
ATP
[ßMol]
cal/Mol
ITP
—
11,90
5,95
5,95
ADP
—
—
—
—
—
—
—
cal/Mol ATP
ITP
ATP
— 16 600
— 16 400
Molare Konzentration
von KCl und Puffer
—
— 16 900
— 16 300
— 16 000
Tab. 7. Spaltungsversuche mit ADP-ATP-Gemischen.
6,65
6,70
6,65
6,65
0,15
0,15
0,15
0,01
0,05
0,05
0,05
0,05
—
—
—
—
15
15
15
15
870
680
900
900
Tab. 8. Spaltungsversuche bei niederer Ionenstärke.
sein, je nachdem Phosphat, Bicarbonat oder Aminogruppen als Puffer im Muskelextrakt vorwiegend
wirksam waren. M e y e r h o f fand — 12 000 cal.
Äquivalente Entropieänderungen begleiten den Vorgang. Für die energetische Ökonomie im Organismus
ist also die Änderung der freien Energie bei der
Spaltung der Pyrophosphatbindung allein bestimmend.
Ausschaltung des wechselnden Beitrags der Neutralisation bei energetischen Betrachtungen des ATPSystems erscheint aus einem weiteren Grunde zweckmäßig: die Änderung der freien Energie bei Neutralisation ohne pH-Änderung in einem Puffersystem
am Gleichgewichtspunkt ist Null (vgl. O e s p e r 1 2 ) .
D e r Neutralisationsvorgang leistet keine Arbeit.
Seine Umkehrung bei der Synthese von ATP erfordert keine freie Energie. Die Wärme wird aus der
Wärmekapazität des Körpers genommen und kehrt
dorthin während der Hydrolyse von ATP zurück.
Zur Berechnung der freien Energie der Pyrophosphatspaltung aus der gemessenen Wärmetönung
fehlt uns die Kenntnis der Entropieänderung der Reaktion. Direkte, von der Wärmetönung unabhängige
Bestimmungen der freien Energie aus Gleichgewichtsmessungen an gekoppelten Reaktionen sind
vielfach versucht worden. L i p m a n n 13 hat 1941
und M e y e r h o f 4 1944 einen Wert nahe — 12 000
cal gefunden. O e s p e r 1 4 nahm 1951 — 10 500 cal
an, und W u r m s e r 1 5 schätzte 1951 — 9 0 0 0 cal.
B u r t o n und K r e b s 3 geben eine kritische Über-
12 P. O e s p e r ,
Arch. Bioehem. Biophysics 27, 254
[1950],
13 F. L i p m a n n , Advances in Enzymol. 1, 99 [1941].
14 P. O e s p e r , in Phosphate Metabolism, p. 523, ed.
by McElroy and Glass, Johns Hopkins [1951].
15 R. W u r m s e r , Annu. Rev. Biochem. 20, 1 [1951].
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G. G E R B E R
382
sieht der bis 1953 verfügbaren Daten. Eine neuere
Bestimmung (1954) von L e v i n t o v v ,
Meister
und M o r a l e s 1 6 ergab — 7900 cal und die letzte
von M o r a l e s et al. 1 7 ungefähr — 7000 cal. Mit
diesem Wert und AH = — 4800 cal würde T J S
= — 2200 cal, und die Entropieänderung der Reaktion wäre rund 7 Einheiten. M e y e r h o f 4 hat angenommen, daß Wärmetönung und freie Energie
der ATP-Spaltung sich wenig unterscheiden. Mutatis
mutandis scheint dies noch heute zu gelten.
Für die Synthese von ATP mit Hilfe oxydativer
Reaktionen im Citronensäurezvklus werden rund
15 000 cal freier Energie aufgewendet. Wenn die
klassischen AH- und AF-Werte von — 12 000 bis
— 16 000 cal zugrunde gelegt werden, ergibt sich
ein ungewöhnlich hoher Nutzeffekt der ATP-ADPReaktion, in welcher sich alle Hauptlinien des Energiestoffwechsels begegnen. Mit den neueren Bestimmungen liegt der geschätzte Nutzeffekt näher
an 50 als an 100 Prozent.
16 L. L e v i n t o w u. A. M e i s t e r , mit Anhang von
M. F. Morales, J. biol. Chemistry 209, 265 [1954].
" M. F. M o r a 1 e s , J. B o 11 s , J. J. B 1 u m u. T. L.
H i l l , Physiol. Rev., im Druck [1955].
Vermehrungsweise beim A-Organismus aus der Pleuropneumonie-Gruppe
Von
G.
GERBER
Aus dem Max-Planck-Institut für Virusforschung, Tübingen
(Z. Naturforschg. 10 b, 382—384 [1955]; eingegangen am 2. F e b r u a r 1955)
Herrn Prof. Dr. J. W. Harms
zum 70. Geburtstag
gewidmet
Der Erreger der Pleuropneumonie der Rinder und eine Reihe ähnlicher Organismen gehören zu den kleinsten bekannten Lebewesen. Sie sind auf Bakterien-Nährböden züditbar,
doch wie große Virusarten durdi grobe Bakterienfilter filtrierbar. Sie stehen an der Grenze
der mikroskopisdien Sichtbarkeit. In die Gruppe der pleuropneumonie-ähnlichen Organismen
(PPLO = pleuropneumonia like organisms) werden audi Formen gestellt, von denen nicht
bekannt ist, ob sie als Krankheitserreger eine Rolle spielen können. Derartige Organismen
wurden von L a i d I a w und E 1 f o r d 1 1936 aus Londoner Abwasser isoliert und von
S e i f f e r t 2 1937 aus Komposterde. In den letzten Jahren wurden eine größere Anzahl
verschiedener PPLO-Arten aus dem Genitaltrakt und der Konjunktiva des Menschen und aus
dem Genitaltrakt von Rindern und Hunden isoliert 3 .
Bei allen diesen Organismen ist ihre Stellung im System unklar. Von D i e n e s und
G ö n n e r t sowie von R u s k a und P o p p e 4 werden sie mit den großen Virusarten der
Lymphogranuloma-Psittacose-Gruppe in Zusammenhang gebracht 5, andererseits läßt die Entdeckung der L-Formen bei den Bakterien auch einen Anschluß in dieser Richtung als möglidi
erscheinen 6> Über die Vermehrungsweise der PPLO bestehen nur Untersuchungen, die sich
auf die mikroskopische Beobachtung stützen 8 > 9 . K a n d i e r 1 1 sah bei seinen licht- und
elektronenmikroskopischen Untersuchungen multi- und unipolare Sprossung und in flüssigem
Nährmedium das Auftreten von traubigen Verbänden. Danadi besteht eine Art Entwicklungscyclus. Naturgemäß sind diese Untersuchungen sehr schwierig, da die Teilchengröße an der
Auflösungsgrenze des Lichtmikroskops liegt.
D
ie Absicht der im Folgenden kurz zusammengefaßten Untersuchungen war, durch Anwendung
verschiedener, voneinander unabhängiger Methoden
die
Vermehrungsweise
eines
Angehörigen
dieser
Gruppe näher zu untersuchen, insbesondere zu klären, ob eine Vermehrung durch Zweiteilung erfolgt
oder ein anderer Vermehrungscyclus vorliegt.
Für alle Untersuchungen wurde der von
Laid-
1 a w und E 1 f o r d 1 aus dem Londoner Abwasser
gezüchtete Stamm A verwendet *. Die Versuche wurden mit einem einheitlichen Klon durchgeführt, der
durch Abimpfen aus einer Einzelkultur gewonnen
war. Das Nährmedium hatte folgende Zusammensetzung: 2 % Bakteriocym (von der Firma Blaes &
Co., München), 20% Pferdeserum mit 10% Hefekoch, " n Fußnoten 1 bis 11 s. Seite 383.
* Der Stamm wurde mir von Herrn Dr. K. L i e b e r m e i s t e r zur Verfügung gestellt, dem idi dafür herzlidi danke.
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