Rolle der lysosomalen Protease Cathepsin L bei experimentell

1
Rolle der lysosomalen Protease Cathepsin L bei
experimentell- induzierter epidermaler
Karzinogenese
Dissertation
zur Erlangen der Doktorwürde
der Fakultät für Biologie
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
vorgelegt von
Tobias Lohmüller
Freiburg im September 2006
2
Prüfer:
Prof. Dr. Peters
Prof. Dr. Sippel
Prof. Dr. Neubüser
Prüfungvorsitzender : Prof. Dr. Rossel
Bekanntgabe des Prüfungsergebnisses: 03.05.2007
3
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ______________________________________________________ 1
1
Einleitung ________________________________________________________ 5
1.1
Ursachen der Tumorzellentwicklung___________________________________ 5
1.2
Die Bedeutung des Tumorstromas für die Karzinomentsehung _____________ 8
1.3
Lysosomale Cystein-Cathepsine _______________________________________ 9
1.4
Biologische Funktionen von Cathepsin L ______________________________ 10
1.5
Einführung des Tg(K14HPV16) Mausmodells __________________________ 11
1.6
Einführung des Chemische Karzinogenese (DMBA/TPA) Mausmodells_____ 13
2
Zielsetzung der Arbeit ______________________________________________ 15
3
Materialien und Methoden __________________________________________ 16
3.1
3.1.1
3.1.2
3.1.3
3.1.4
3.1.5
3.2
Materialien _______________________________________________________ 16
Geräte________________________________________________________________
Software ______________________________________________________________
Antikörper (primär/sekundär) _____________________________________________
Primer Sequenzen ______________________________________________________
Statistik ______________________________________________________________
16
19
19
20
20
Methoden ________________________________________________________ 21
3.2.1
Tierexperimentelle Methoden _____________________________________________
3.2.1.1
Maushaltung ______________________________________________________
3.2.1.2
Progressions- und Inzidenzstudie ______________________________________
3.2.1.3
Chemische Karzinogenese ___________________________________________
3.2.2
Zellkultur _____________________________________________________________
3.2.2.1
Primäre Zellkultur _________________________________________________
3.2.2.2
Primäre Keratinozyten ______________________________________________
3.2.2.3
Primäre Fibroblasten _______________________________________________
3.2.3
Molekularbiologische Methoden ___________________________________________
3.2.3.1
Genomische DNA Isolierung aus Mausschwanzenbiopsien _________________
3.2.3.2
DNA-Isolierung durch Isopropanol Fällung______________________________
3.2.3.3
Schnellverfahren zur Genotypisierung __________________________________
3.2.3.4
Genotypisierung ___________________________________________________
3.2.3.5
Auftrennung der amplifizierten DNA___________________________________
3.2.3.6
Probenaufbereitung für die RT-PCR ___________________________________
3.2.3.7
Konzentrationsbestimmung von DNA und RNA __________________________
3.2.3.8
cDNA Synthese aus RNA ___________________________________________
3.2.3.9
RT-PCR _________________________________________________________
3.2.3.10
Quantitative real time PCR___________________________________________
3.2.4
Biochemische Methoden _________________________________________________
3.2.4.1
Aufschluss von Gewebe und Zellen ____________________________________
3.2.4.2
Proteinbestimmung_________________________________________________
3.2.4.3
Cathepsin Aktivitätsbestimmung ______________________________________
3.2.4.4
β-Hexosamidase-Aktivitätsbestimmung_________________________________
3.2.4.5
Ras-Aktivitäts-Assay _______________________________________________
3.2.4.6
Proteinnachweis mittels Western Blot Analyse ___________________________
3.2.4.7
LysoTracker® und MitoTracker® Färbung _______________________________
3.2.5
Histologie und Immunhistologie ___________________________________________
3.2.5.1
Kryokonservierung von Gewebe ______________________________________
3.2.5.2
Gewebefixierung durch Formalin-Vernetzung____________________________
3.2.5.3
Produktion der Gewebeschnitte _______________________________________
3.2.6
Entparaffinierung _______________________________________________________
3.2.7
Hämalaun/Eosin-Färbung ________________________________________________
3.2.8
Methode zur Antigen-Demaskierung________________________________________
3.2.8.1
Saure Demaskierung mittels Citrat Puffer _______________________________
3.2.8.2
Alkalische Demaskierung mittels Tris-EDTA Buffer ______________________
3.2.8.3
Endogene Peroxidase Inaktivierung: ___________________________________
21
21
21
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36
37
37
37
37
4
3.2.8.4
Immunhistologische Färbung durch Peroxidase___________________________
3.2.8.5
TUNEL__________________________________________________________
3.2.9
Immunfluoreszenz-Färbung von Endothelzellen mit CD31 ____________________
3.2.10
Zellvereinzelung der Haut und Immunfärbung ______________________________
4
38
39
39
40
Ergebnisse _______________________________________________________ 42
4.1
Cathepsin L in der Entwicklung von Tumorvorstufen im Tg(K14HPV16)
Mausmodell _____________________________________________________________ 42
4.1.1
Expressionsanalyse von relevante Cathepsinen im Tg(K14HPV16) Mausmodell CTSH,
CTSL, CTSB, CTSD und CTSX _________________________________________ 42
4.1.1.1
Cathepsin L Expression _____________________________________________ 43
4.1.1.2
Cathepsin B Expression _____________________________________________ 45
4.1.1.3
Cathepsin X Expression _____________________________________________ 46
4.1.1.4
Cathepsin D Expression _____________________________________________ 48
4.1.1.5
Cathepsin H Expression _____________________________________________ 49
4.1.1.6
Cathepsin E Expression _____________________________________________ 50
4.1.2
Histomorphologische Veränderung der Epidermis im Tg(K14HPV16) Mausmodell ___ 50
4.1.3
Keratinozyten Proliferation und apoptotische im Tg(K14HPV16) Mäusenmodell _____ 52
4.1.4
Differenzierung der Keratinozyten _________________________________________ 54
4.1.5
Angiogenese___________________________________________________________ 55
4.2
4.2.1
4.2.2
4.2.3
4.2.4
4.3
4.3.1
4.3.2
4.4
Inzidenz Studie von Tg(K14HPV16);ctsl+/+, ctsl+/-, und ctsl-/-_______________ 59
Karzinomentwicklung und Mortalitätsverlauf _________________________________
Plattenepithelkarzinom Graduierung ________________________________________
Epithelial-Mesenchymalen-Transiton in Tg(K14HPV16) Plattenepithelkarzinom _____
Lymphknotenmetastasierung im Tg(K14HPV16) Mausmodell ___________________
DMBA/TPA induzierte Karzinogenese ________________________________ 65
Tumorprogression in der chemischen Karzinogenese ___________________________ 66
Metastasenbildung in der chemischen Karzinogenese___________________________ 67
Untersuchung der intrazellularen Veränderungen und Mechanismen ______ 68
4.4.1
Verifizierung des Maus Genotyps __________________________________________
4.4.2
Analyse der Zelluläre Mechanismen ________________________________________
4.4.2.1
Evaluation des ensosomal/lysosomalen Kompartiment _____________________
4.4.2.2
Evaluation der intrazelluläre EGF-Signalkaskade _________________________
5
6
59
61
62
64
68
69
70
72
Diskussion _______________________________________________________ 74
5.1
Morphologische Veränderungen im endosomalen/lysosomalen Kompartiment
von CTSL-defizienten Keratinozyten und Gewebe ______________________ 76
5.2
Funktionelle Veränderung im endosomalen/lysosomalen Kompartiment und
die daraus resultierenden Konsequenzen für die Signaltransduktion _______ 76
5.3
Verstärkte Epitheliale-Mesenchymale-Transiton in Tg(K14HPV16);ctsl-/Mäusen __________________________________________________________ 78
5.4
Auswirkung der CTSL-Defizienz auf andere Cathepsine und deren Einfluss auf
die Tumorprogression ______________________________________________ 79
5.5
Tumorangiogenese/Neovaskularisierung im Tg(K14HPV16) Mausmodell ___ 80
5.6
Chemische Karzinogenese___________________________________________ 80
5.7
Vergleich der Ergebnisse aus dem Tg(K14HPV16) und (DMBA/TPA)
Mausmodell ______________________________________________________ 81
5.8
Synopsis und Ausblick______________________________________________ 83
Zusammenfassung ________________________________________________ 84
Abkürzungsverzeichnis _________________________________________________ 85
7
Literaturverzeichnis _______________________________________________ 87
5
1 Einleitung
1.1
Ursachen der Tumorzellentwicklung
Bisher sind über 100 verschiedene Tumorentitäten bekannt. Dabei kann man Krebs als
eine komplexe Krankheit, resultierend aus einer Akkumulation von Mutationen im
Genom beschreiben (Beckman and Loeb, 2005; Di Nicolantonio and Bardelli, 2006;
Hanahan and Weinberg, 2000; Kinzler and Vogelstein, 1996). Die zur Karzinombildung
erforderlichen genetischen Mutationen werden meist durch Alterationen gefördert, die
die genomische Instabilität erhöhten (Beckman and Loeb, 2005; Loeb, 1991). Die
bekannteste und am häufigsten in Tumoren auftretende Mutation ist das p53 Tumor
Suppressor-Protein, welches im funktionsfähigen Zustand bei DNA Schädigung zum
Zellzyklus-Stopp und dadurch zur DNA Korrektur oder zum Zelltod (Apoptose) führt
(Artandi and Attardi, 2005; Levine, 1997). Eine Akkumulation von Mutationen, die
zum Beispiel aus dem p53 Defekt resultierenden kann, führt schließlich zur
Karzinombildung, die man in sechs essentielle zellphysiologische Veränderungen
unterteilen kann (Hanahan and Weinberg, 2000) (Abbildung 1).
Abbildung 1: Genetische Mutationen in verschiedenen zellbiologischen Prozessen führen zur
Tumorzelle
Wachstumsfaktor-Unabhängikeit
Es ist bekannt, dass Wachstumsfaktor-gesteuerte Signalwege eine entscheidende Rolle
in der Tumorigenese ausüben (Arteaga, 2006; Durai et al., 2005; Hanahan and
Weinberg, 2000) (Abbildung 1). Bereits vor über 25 Jahre wurde beschrieben, dass
Tumorzellen vermehrt autokrine Wachstumsfaktoren sezernieren und so unabhängig
von exogenen Stimuli werden (Todaro et al., 1978). Dieser Effekt kann durch die
Fähigkeit der Eigenproduktion von Wachstumsfaktor-Peptiden, und zum anderen durch
6
eine erhöhte Expression von Wachstumsfaktor-Rezeptoren erreicht werden. Dies führt
zu Selbststimulation oder zu einer erhöhten Sensitivität auf externe Stimuli.
Diesbezüglich werden einige Wachstumsfaktoren, Wachstumsfaktor-Rezeptoren oder
Proteine
der
intrazellulären
Signaltransduktion
als
Protoonkogene
bezeichnet
(Aaronson, 1991; Cogoi and Xodo, 2006; Goustin et al., 1986). Einige der in einer
Vielzahl von Tumoren am häufigsten detektierten Mutationen verursachen die
Überexpression von Wachstumsfaktor-Rezeptoren, wie zum Beispiel des EGFR
(epidermal growth factor receptor), ein 170 kDa Transmembrane Glykoprotein, mit
einer Vielzahl von intrazellulären Tyrosinkinase-Domänen (Carpenter and Cohen, 1990;
Fedi et al., 1997; Normanno et al., 2006). Das Signal kann sowohl über die Aktivierung
der SOS/Ras/Raf/MAPK Kaskade wirken, die zu einer der am häufigsten mutierten
Signalabfolgen in Tumoren zählt (Medema et al., 1993; Wang et al., 2006), als auch
über die PI3 Kinase, welche bei ca. 30% der festen Tumore eine Mutation aufweist
(Samuels and Ericson, 2006).
Abkopplung vom Wachstumsstoppsignal
Ein weiterer Faktor, den die Tumorzellen überwinden müssen, sind die verschiedenen
Wachstumstoppsignale, die Zellen an der Proliferation hindern sollen, um das Gewebe
in Homöostase zu halten (Abbildung 1). Diese erfolgt durch Proliferation-initiierende
als auch durch gezielten Abbau solcher Proliferation-inhibierenden Faktoren. Dabei gibt
es sowohl lösliche als auch immobilisierte Inhibitoren/Aktivatoren, die in der
extrazellulären Matrix (EZM) oder an der Zelloberfläche von Gewebe bzw. Zellen
vorzufinden sind (DeClerck et al., 2004; Santos-Garcia et al., 2006). Diese können die
Zellen aus dem Proliferationszyklus durch Einleiten der postmitotischen Phase zu einem
partiellen
(wieder
aktivierbaren)
oder
permanenten
inaktivierten
Status
der
Proliferationsmöglichkeit, wie es in der Zelldifferenzierung erfolgt, führen. Zu diesen
löslichen Faktoren gehört auch der „Transformierende Wachstums Faktor“ (TGF-ß),
welcher durch Binden an membrangebundenen Heteromer-Serin-Threonin Kinase
Rezeptor einen Komplex bildet, der durch Phosphorylierung der cytoplasmatischen
Proteine der Familie Smad spezifische Gen Expression regulieren kann. Die TGFß/Smad Signalkaskade ist wiederum stark mit weiteren intrazellulären SignalMechanismen wie mit Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK) vernetzt, die die TGFß induzierten regulatorischen Signale unterstützend oder entgegenwirkend beeinflussen
können (Javelaud and Mauviel, 2005).
7
Eines der bekanntesten Proliferationsregulationsproteine ist das Retinoblastoma (Rb)
Tumorsuppressor-Gen, welches als negativer Regulator des Zellzyklus’ durch Bindung
an Transkriptionsfaktoren von E2F1, PU1, ATF2, UBF, Elf1 und cAbl, gilt. Die
Regulation von Rb auf die Transkription erfolgt durch Phosphorylierungen von Cyclin
abhängigen Proteinkinasen (cdks), die für das Ablesen der Gene zur Weiterführung des
Zellzyklus’ in die G1 und S Phase verantwortlich sind (Harbour and Dean, 2000;
Weinberg, 1995; Yamasaki, 2003).
Apoptose-Unempfindlichkeit
Um eine Zellzahlanhäufung zu erreichen, wie sie bei Tumoren stattfindet, muss nicht
nur die proliferative Kapazität erhöht, sondern auch die Apoptose der Zellen
unterbunden werden (Abbildung1). Die Steuerung der Apoptose in der Zelle kann durch
extrazelluläre oder intrazelluläre Signale erfolgen, die zum Beispiel Apoptoseschutz
durch Überlebensfaktoren wie IGF-1 (insulin-like growth factor 1) (Surmacz and
Bartucci, 2004) oder durch direkte Induzierung des Zelltods durch Binden von FAS am
FAS-Rezeptor erreicht werden kann (Ashkenazi and Dixit, 1999; Huerta et al., 2006).
Unlimitierte Replikationsfähigkeit
Eine weitere Anforderung, die eine Tumorzelle zu bewältigen hat, ist die Fähigkeit der
nicht limitierten Zellteilungsanzahl, die durch Erhaltung der kritischen Telomer
Wiederholungen (Länge) erreicht wird (Bryan and Cech, 1999; Shin et al., 2006)
(Abbildung 1).
Fähigkeit zur Angiogenese Induzierung
Zellanhäufungen, wie sie bei Tumoren stattfinden, erfordert Sauerstoff zum Wachstum,
was eine Vaskularisierung voraussetzt (Abbildung 1). Dabei sind für eine erforderliche
Versorgung der Tumorzellen mit Nährstoffen Abstände von maximal 100 μm von Zelle
zum Blutgefäß möglich. Da normale Zellen nicht die Fähigkeit der Induzierung von
Vaskularisierung besitzen, müssen Tumorzellen, um die erforderliche Kapillardichte zu
erhalten, die Fähigkeit der Angiogenese-Aktivierung durch Mutationen erhalten haben
(Bouck, 1996; Folkman, 1997; Hanahan and Folkman, 1996a; Rak et al., 2006). Dabei
verändert der Tumor das Verhältnis zwischen proangiogenen und inhibitorischen
Faktoren so, dass dies zur Aktivierung der Blutgefäßbildung führt (DeClerck et al.,
2004; Hanahan and Folkman, 1996a).
8
Fähigkeit zur Invasion und Metastasierung
Im Verlauf des Tumorwachstums kann es zur Invasion der Tumorzellen in gesundes
Gewebe und später zur Koloniebildung an anderer Stelle kommen. Diesen Vorgang
nennt man Metastasierung. Diese ist verantwortlich für 90% der Krebsmortalität (Sporn,
1996). Damit sich Tumorzellen vom Verband lösen können, müssen Zell-Zell
Adhäsionsproteine und Zell-EZM Proteine, die auch regulatorische Funktionen
innehaben können, überwunden werden. Die häufigste im Tumor gefundene Alteration
in der Zell-Zell Adhäsion betrifft E-cadherin, ein Zell-Zell Verbindungsmolekül in
Epithelzellen. Diese Zellverbindung induziert unter anderem einen Wachstumsstopp.
Erfolgt ein Verlust des extrazellulären membrangebunden E-cadherins, erfolgt eine
Translokation von cytosolischem ß-catenin in den Nukleus, die sich in einer TCF/Lef-1
Transkriptionsaktivität äußert, die dadurch den Wachstumsstopp aufhebt (Christofori
and Semb, 1999; Lu et al., 2003).
1.2 Die Bedeutung des Tumorstromas für die Karzinomentsehung
Ein weiterer wichtiger Faktor in der Tumorprogression ist die gesamte Mikroumgebung,
welche stromale Zellen (Hill et al., 2005) und Zellen des Immunsystems mit
dendritischen Zellen, Makrophagen, Granulozyten, Mastzellen und natürlichen
Killerzellen beinhaltet, die sowohl eine Anti- als auch einen die Karzinogenese
fördernden Effekt aufweisen können. Insbesondere durch Ausschüttungen von
Mediatoren können die umliegenden Zellen wie z.B. Immunzellen das Überleben, die
Proliferation, die Umstrukturierung der EZM als auch die Blutgefäßbildung fördern
(Coussens and Werb, 2002; Dalgleish and O'Byrne, 2006; de Visser et al., 2006). Unter
den abgegebenen Faktoren befinden sich Wachstum und Angiogenese induzierende
Proteine, aber auch Proteasen wie Serin Proteasen (z.B. Urokinase Plasminogen
Aktivator (uPA), Thrombin) Cathepsine (z.B. CTSB, CTSD, CTSL) und Matrix
Metalloproteinasen (MMPs), die verantwortlich für den Umbau der EZM sind.
Dabei können Proteasen durch Abbau der EZM, Tumorzellen und Blutgefäßen die
Penetration des umliegenden Gewebes ermöglichen, aber auch durch Prozessierung von
Wachstumsfaktoren, Wachstumsfaktoren-Rezeptoren und Zytokine die Tumorprogression beeinflussen und auf zellphysiologischen kritischen Abläufe eingreifen
(DeClerck et al., 2004).
So wurde gezeigt, dass das Gleichgewicht zwischen pro- und anti-angiogenen Faktoren
in Richtung Blutgefäßbildung verschoben wird, in dem MMP-9 Tumor-assoziierter
Entzündungszellen latenten VEGF solubilisiert und aktiviert (DeClerck et al., 2004).
Weiter konnte auch die Fähigkeit zur Invasion, Metastasierung und Zell-Proliferation
9
durch Prozessierung von E-cadherin durch MMP-7 (Ii et al., 2006), aber auch die
Möglichkeit zur Apoptose Induktion durch die Mobilisierung von FasL (Fas Ligand),
und eine MMP-7 Konzentration abhängige Initiierung einer Apoptose Resistenz gezeigt
werden (DeClerck et al., 2004). Diese und weitere Ergebnisse führen zur Erkenntnis,
dass Proteasen zwar keine klassischen Tumorsuppressoren oder Onkogene darstellen,
aber dennoch bedeutende Mediatoren der Tumorprogression sein können.
1.3
Lysosomale Cystein-Cathepsine
Lysosomale
Cysteinproteasen
gehören
zur
Proteinfamilie
Papainähnlicher
proteolytischer Enzyme mit Lokalisation im endosomal/lysosomalen Kompartiment.
Sieben dieser Proteasen, die Cathepsine B, C, F, H, L, O und Z werden ubiquitär
exprimiert, während die Cathepsine W und S in lymphatischen Geweben, Cathepsin K
in Osteoklasten und Cathepsin V in Thymus, Testis und Cornealepithel nachgewiesen
wurden (Rawlings and Barrett, 2000; Turk et al., 2000). Eine seit langem bekannte
Funktion lysosomaler Cysteinproteasen stellt die terminale Degradation von Proteinen
("Bulk"-Proteolyse) im Lysosom dar (Barrett, 1992). Zusätzlich zu diesen
unspezifischen proteolytischen Prozessen wurden in der vergangenen Dekade
zunehmend Hinweise auf spezifische in vivo Funktionen Papain-ähnlicher Cathepsine in
physiologischen und pathologischen Prozessen gefunden. Zu diesen Prozessen gehören
die Antigenpräsentation über MHC Klasse II (Zavasnik-Bergant et al., 2001), der
Knochenumbau (Troen, 2006), die Alzheimersche Erkrankung (Riemenschneider et al.,
2006), die rheumatoide Arthritis (Skoumal et al., 2005) sowie Tumorprogression und
Metastasierung (Jean et al., 2006; Joyce and Hanahan, 2004; Sloane et al., 2005;
Vasiljeva et al., 2006).
Durch diese Vielzahl der unterschiedlichen biologisch relevanten Einflüsse von
Cystein-Cathepsinen ist die Identifikation spezifischer Protease Funktionen zunehmend
interessanter geworden, zumal den Cathepsinen ein diagnostisches und therapeutisches
Potenzial, gerade auch an Krebspatienten, zugesprochen wird (Jagodic et al., 2005;
Niedergethmann et al., 2004; Turk et al., 2000) (Fröhlich et al., 2001; Harbeck et al.,
2001; (Jean et al., 2006).
Ein wesentliches Problem bei der Analyse der Funktionen einzelner lysosomaler
Cysteinproteasen besteht in der geringen Spezifität und der Verfügbarkeit von
spezifischen Inhibitoren. Daher stellt die gezielte Generierung und Analyse von
Protease-defizienten Mauslinien eine der besten Möglichkeiten zur genauen
Untersuchung von in vivo Funktionen lysosomaler Cysteinproteasen dar.
10
1.4
Biologische Funktionen von Cathepsin L
CTSL ist eine ubiquitär exprimierte Protease, deren Expressionshöhe jedoch
zellabhängig stark schwankt. Um die Rolle der lysosomalen Cysteinprotease Cathepsin
L (CTSL) im Säuger weiter zu entschlüsseln, wurde ein CTSL-defizienter Mausstamm
generiert (Roth et al., 2000), durch den man unter anderem zeigen konnte, dass CTSLDefizienz in Mäusen zu einer dilatative Kardiomyopathie führt (Petermann et al., 2006;
Stypmann et al., 2002). Eine Störung in der Fortpflanzung (Afonso et al., 1997; Wright
et al., 2003), sowie ein Defekt in der Keratinozyten und Melanozyten Differenzierung
während des Haarwachstum-Zyklus konnte ebenso detektiert werden (Roth et al., 2000;
Tobin et al., 2002).
Es konnte auch eine 60-80% reduzierte Anzahl CD4 positiven T-Helferzellen in CTSLdefizienten Mäusen gezeigt werden. Dieser Phänotyp wird auf eine Reifungsstörung des
MHCII Komplex in den Epithelzellen des Thymuscortex zurückgeführt. Dabei wird die
invariante Kette des MHCII Komplex während der Antigenbeladung in Abwesenheit
von
CTSL
nicht
vollständig
prozessiert.
Dies
führt
zu
einer
gestörten
Antigenpräsentation und einer verminderten positiven Selektion von T-Lymphozyten
(Nakagawa et al., 1998).
In Zellkultur konnten ebenso gezeigt werden, dass CTSL durch die Prozessierung von
Interleukin 8 (IL8) eine Funktion in der inflammatorischen Immunantwort spielt
(Ohashi et al., 2003).
Eine Aktivierung des Neurotransmitters Peptid Proenkephalin in sekretorischen
Vesikeln, den Chromaffin Granula, kann auch dem CTSL zugeschrieben werden (Hook
et al., 2004; Yasothornsrikul et al., 2003).
Insbesondere in karzinogeneserelevanten Prozessen kann dem CTSL ein Einfluss in
morphologischen und biochemischen Vorgängen nachgewiesen werden. Im Prozess der
Angiogenese kann CTSL durch die Prozessierung von Kollagen XVIII in den
Angiogeneseinhibitor Endostatin (Felbor et al., 2000) sowohl einen negativen als auch
in der Neovaskularisierung durch den Einfluss auf das „homing“ der EndothelVorläuferzellen (EPCs) bei Blutgefäß-Neubildung (Urbich et al., 2005) einen positiven
Einfluss auf die Blutgefäßbildung ausüben. Eine proliferationsfördernde Eigenschaft
von CTSL konnte an Keratinozyten nachgewiesen werden, die über eine erhöhte Anzahl
des „Epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors“ (EGFR) beschrieben kann. Dabei
kommt eine Anreicherung von EGF durch eine Störung im Recycling von CTSLdefizienten Keratinozyten zustande (Reinheckel et al., 2005). Um die biologische
11
Funktion von CTSL im Bezug auf die Tumorentwicklung genauer untersuchen zu
können, wurden in dieser Arbeit zwei verschiedene Mausmodelle genutzt.
1.5
Einführung des Tg(K14HPV16) Mausmodells
24 Wochen
8 Wochen
Geb. 4 Wochen
4 Wochen
8 Wochen
Angiogenese
16 Wochen
24 Wochen
52 Wochen
Angiogenese
Induktion
Abbildung 2: Zeitverlauf der Progression von transgenen K14HPV16 positiven Mäusen von Geburt
bis zur 52. Woche.
Die Infektionen durch humane Papillomaviren (HPV) kann benigne Tumore in der Haut
induzieren. Insbesondere die "high risk"-Typen wie HPV 16, 18, 31 und 45 besitzen ein
hohes Risiko zur malignen Konversion (Longworth and Laimins, 2004). Dabei
verursachen
die
Hochrisiko-Typen
humaner
Papillomavirentypen
eine
Hyperproliferation und führen zur morphologischen Veränderungen von Präneoplasie
zur Neoplasie (zur Hausen, 1987) (Abbildung 2). Insbesondere im Auslösen von
Cervixkarzinomen spielen die HPV 16, 18, 31 und 45 durch die Infektion der basalen
Epithelzellen eine große Rolle. Dabei konnte man in 99,7% der diagnostizierten
Cervixkarzinome eine HPV-Sequenzen finden, wobei 50% davon zum HPV Typ 16
gehörten (Walboomers et al., 1999; zur Hausen, 1989; zur Hausen and de Villiers,
1994). Die Tg(K14HPV16) Mausmodell exprimiert verschiedene „early region“ Gene
(E) des humanen Papillomavirus Type 16 (HPV16) unter der Kontrolle des humanen
Cytokeratin 14 (K14) Promotors.
12
Tabelle 1: Genkonstrukt des Tg(K14HPV16) Mausmodells
K14 Cytokeratin 14 Promotor
E6
führt durch Komplexbildung zwischen dem Tumorsuppressorprotein p53 und der
Ubiquitinligase E6AP zum p53 Abbau (Nomine et al., 2006; zur Hausen, 2002)
E7
führt zu einer Komplexbildung mit dem Retinoblastom Protein (pRB),wodurch
ein konstitutives Ablesen der E2F/DPIU abhängigen S-Phase Gene erfolgt (Sdek
et al., 2006).
E1
hat eine DNA Helikase Aktivität und wird für die virale Replikation benötigt
(Doorbar, 2005; Hebner and Laimins, 2006).
E2
spielt eine Rolle in der viralen Replikation und Translation (Hebner and Laimins,
2006).
E4
spielt eine Rolle in der viralen Transformation und Replikation. Das E4 Protein
ist mit dem Cytokeratingerüst assoziiert, und ist für die virale Freisetzung mit
verantwortlich (Brown et al., 2006; Fang et al., 2006).
E5
Steigert die Aktivierung der EGFR Signalkaskade durch die Verstärkung des
EGFR Recyclings (Kim and Yang, 2006)
Der K14-Promotor erreicht eine spezifische Expression von E1, E2, E4, E5, E6 und E7
in den basalen Keratinozyten, die zur stufenweisen Tumorprogression führt. Bei der
Generierung des Tg(K14HPV16) Mausmodells wurden verschiedene Mausstämme
untersucht, wobei Unterschiede in der Tumorprogression in Abhängigkeit vom
genetischen Hintergrund der Mäuse festgestellt wurde (Coussens et al., 1996). Es zeigte
sich, dass C57BL/6 und BALB/c gegenüber der Expression der „early region“ Gene in
Hinblick auf eine Karzinombildung resistent sind, wohingegen im genetische FVB
Hintergrund nach 52 Wochen 50% Plattenepitheltumore detektiert wurden (Arbeit et al.,
1994).
Das Tg(K14HPV16)/FVB Mausmodell entwickelt nach ca. 4 Wochen zunehmende
Hyperplasie, die mit einer Mastzelleninfiltration einhergeht und zur Dysplasie (16.
Woche) führt. In der 16 Woche im Intraepithelialer prä/neoplastie konnte eine
Aktivierung der Blutgefäßbildung festgestellt werden, die durch Mastzelleninfiltration
induziert wird (Coussens et al., 1999). Ungefähr 50% der 52 Wochen alten Mäuse
entwickeln epidermale Plattenepithelkarzinome und davon zeigten ca. 20% Metastasen
in den Lymphknoten (Arbeit et al., 1996; Arbeit et al., 1994; Coussens et al., 1996;
13
Coussens et al., 1999; Coussens et al., 2000). Weitere am Tg(K14HPV16) Mausmodell
durchgeführte Untersuchungen zeigten sowohl die Funktion von CD4 positiven und
Mastzellen (Coussens et al., 1999; Daniel et al., 2003) als auch die Proteine wie MMP-9
und TIMP-1 (Coussens et al., 2000; Rhee et al., 2004) während der Tumorprogression .
Die ausführliche Beschreibung des Tg(K14HPV16) Mausmodells in der Literatur und
die langsame Entwicklung der prämalignen Läsionen gewährleisten eine sorgfältige
Analyse unserer Fragestellung. Hierfür wurden CTSL-defiziente Mause in die
Tg(K14HPV16) Maus eingekreuzt, so dass folgende Genotypen Tg(K14HPV16);ctsl-/-,
Tg(K14HPV16);ctsl+/-, Tg(K14HPV16);ctsl-/- zur Verfügung standen.
1.6
Einführung des Chemische Karzinogenese (DMBA/TPA)
Mausmodells
Abbildung 3: Darstellung des zeitlichen Verlaufs und der erforderlichen Applikationen, die für eine
chemische Karzinogenese erforderlich sind.
Eine chemische Karzinogenese (2-Schritt-Karzinogenese) kann in verschiedene Phasen
unterteilt werden. Dabei unterscheidet man eine Initiationsphase von der Promotionsund der Progressionsphase. Die für die Karzinogenese entscheidende Mutation, die
durch einzelne Mutationsereignisse erreicht werden kann, erfolgt in der Initiationsphase.
Die hierfür am häufigsten gefundene Mutation in der Epidermis befindet sich im H-rasGen im Exon 2 des Codons 61, die zu einer permanenten Ras-Aktivierung führt (Leder
et al., 1990; Zhao et al., 2006). Das durch Mutation permanent aktivierte Ras-Protein
wird für die epidermale Tumorinduktion in der chemischen Karzinogenese
verantwortlich gemacht. In der Tumorpromotion erfolgt die positiv Selektionierung der
mutierten Zellen (Song et al., 1999).
Die Initiation der sequenziellen epidermalen Karzinogenese erfolgt in diesem
Mausmodell durch eine 7,12-Dimethylbenz[a]-anthracen (DMBA) Behandlung, ein
14
genotoxisches Karzinogen (Hecker, 1987; Zhao et al., 2006) und die Tumorpromotion
durch die kontinuierliche Applikation von 12-OTetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA)
eine entzündungsfördernde Substanz (Gemsa et al., 1984; Ridd et al., 2006).
Das DMBA/TPA Mausmodell simuliert dabei Karzinogene Faktoren, die durch
Umwelteinflüsse induziert werden können. Die Applikation der Chemikalien DMBA
und TPA erfolgt sowohl an ctsl+/+ als auch ctsl-/- Mäusen. Für die chemische
Karzinogenese sowie für das Tg(K14HPV16) Mausmodell wurde der genetische MausHintergrund (FVB) verwendet. Dieser Mausstamm ist bekannt für seine sensitive
Veranlagung (Hennings et al., 1993; Ridd et al., 2006) bezüglich der DMBA/TPA
Behandlung.
15
2 Zielsetzung der Arbeit
Die Expression lysosomaler Cysteinproteasen (Cystein-Cathepsine) korreliert in einer
Vielzahl klinischer Studien positiv mit einer schlechten Prognose von Patienten. Jedoch
ist wenig über spezifische tumorbiologische Funktionen von Cystein-Cathepsinen
bekannt.
In dieser Arbeit soll die Rolle der lysosomalen Cysteinprotease Cathepsin L bei der
Progression und Metastasierung von Karzinomen der Epidermis mit Hilfe von
Cathepsin L-defizienten „knockout“ Mäusen untersucht werden. Dazu werden zwei
Tumormodelle der Maus, das transgene Tg(K14HPV16) Modell und die DMBA/TPA
induzierte chemische Karzinogenese, in An- und Abwesenheit von Cathepsin L
analysiert.
Dazu sollen folgende Untersuchungen an Cathepsin L defizienten Mäusen und
entsprechenden Kontrollen erfolgen:
•
Expressionsanalyse
Aktivitätsebene
relevanter
während
der
Cathepsine
auf
mRNA-,
Tumorprogression
im
Protein-
und
Tg(K14HPV16)
Mausmodell.
•
Histomorphologie, Proliferation und Differenzierung von Keratinozyten sowie
die Angiogenese im Verlauf der Tg(K14HPV16) induzierten Karzinogenese.
•
Inzidenz, Wachstum, Differenzierung und Metastasierung von Karzinomen im
Tg(K14HPV16) Mausmodell und bei chemischer Karzinogenese
•
Analyse von Primärzellkulturen Cathepsin L-defizienter Mäuse zur Aufklärung
zellbiologischer Funktionen von Cathepsin L.
16
3 Materialien und Methoden
3.1
Materialien
3.1.1 Geräte
-20°C Kühlschrank
Siemens Hausgeräte GmbH (GER)
-80°C Kühlschrank
-86C ULT Freezer
Thermo Electron Co. (USA)
1D PAGE System
Protean III
Biorad Inc.( USA)
Abzug
FAZ2
Waldner GmbH & Co. KG (GER)
Autoklav
Autoklav 23
MELAG (GER)
Feinwaage
BP110 S, LP6200S
Sartorius AG (GER)
Fluoreszenzreader
SpectraMax GeminiEM
Molecular Devices Co. (USA)
Gradientengießer
SG50 gradient maker, Pump P-1
Amersham Pharmacia Biotech Inc. (USA)
Schütteltisch
KS 260 basic
IKA Werke GmbH (GER)
Semidry Blotkammer
Transblot SD transfer cell
Biorad Inc.(Hercules ,USA)
Speedvac
Concentrator 5301
Eppendorf AG (GER)
96-Well-Photometer
SLI Rainbow thermo
Thermo Electron Co. (USA)
Brutschrank, 37°C
Heraeus Function Line, Kendro Laboratory
Products GmbH (GER)
Elektrophorese und
IEF-Kühlung
MultiTempIII Thermostatic Circulator
Amersham Pharmacia Biotech Inc. (USA)
Elektrophoresekammer
Hoefer DALT Vertical System
Amersham Pharmacia Biotech Inc. (USA)
Eismaschine
MF30
Scotsman (USA)
Heizmagnet-Rührer
RCT basic
IKA Werke GmbH ( GER)
IEF-Systeme
IPGphor IEF System, Multiphor II IEF System
Amersham Pharmacia Biotech Inc.(New Jersey, USA)
17
Leuchttisch
REX-Leuchtplatte
Rex Messinstrumentenbau (Badenhausen, GER)
Netzgerät (IEF)
Bruker Daltonics (GER)
Electrophoresis Power Supply EPS 350 XL
Amersham Pharmacia Biotech Inc. (USA)
Netzgerät (SDS-PAGE)
Electrophorisis Powers Supply, ESP 2A200 Power Supply
Amersham Pharmacia Biotech Inc. (USA)
pH-Meter
766 Calimatic
Knick (GER)
Photometer
Spectrophotometer DU 640
Beckman Inst. GmbH (GER)
Scanner
ImmageScanner
Amersham Pharmacia Biotech Inc. (USA)
Thermomixer
Thermomixer comfort
Eppendorf AG (GER)
Ultraschallbad
Transsonic 310/H
Elma GmbH (GER)
Ultrazentrifuge
OptimaTM LE-80K Preperative Ultracentrifuge,
Beckman Inst. GmbH (GER)
Vortex
KS250 basic
IKA Werke GmbH (GER)
Zentrifuge
Biofuge fresco
Heraus Instruments GmbH (GER)
Einbettautomat
Microm HMP 300
MICROM International GmbH (GER)
Einbettstation
Micom AP280
MICROM International GmbH (GER)
Entwicklermaschine
Typ 9462-105
Agfa-Gevaert AG (GER)
FACSScan flow cytometer
FACsCalibur
BD bioscience (USA)
Geldokumentationsstation
Digi-Print R3000
PEQLAB Biotechnologie GmbH
Heiztisch
StörkTronic
MEDAX GmbH & Co. KG (GER)
Kryostat
Kryostat 1720 Digital
Ernst Leitz Wetzlar GmbH (GER).
Agarose-Gelelektrophorese-Kammer
Hans Thomas(GER)
Lichtmikroskop
Axioskope MOT
Carl Zeiss MicroSystems GmbH (GER)
Invert-Fluoreszenz-Mikroskop
Axiovert 200 LSM
Carl Zeiss MicroSystems GmbH (GER)
18
Laser-Scan-Mikroskop
Axiovert 100 LSM
Carl Zeiss MicroSystems GmbH (GER)
LumiImager
Lumi-Imager F1TM
Roche Diagnostics (GER)
Mikrotom
Micom HM 355S
MICROM International GmbH (GER)
PCR-Maschine
PTC-225 Peltier Thermal Cycler
MJ Research (USA)
Single Colour Real-Time PCR
MYiQ
Bio-Rad Laboratories (USA)
Pipetten
Pipetten 2-20 µl; 20-200 µl; 200-1000 µl
Eppendorf AG (GER)
Pipetboy
RAININ
INTEGRA Biosciences GmbH (GER)
Sterilbank
Merasave
Heraeus Holding GmbH (GER)
Ultrathurrax
Ultrathurrax Rotor-Stator-Homogenisator
Ika Werke GmbH (GER)
Spektrophotometer
Ultrospec 2100 pro
Amersham Pharmacia Biotech GmbH (GER)
Vortex
K-550-GE
Bender & Hobein AG (GER)
Wasserbad für Paraffinschnitte
SB 80
MICROM International GmbH (GER)
Zentrifugen
Zentrifugen 5415 D, 5415 R, 5810R
Eppendorf AG (GER)
Semidry-Kammer
Trans-Blot SD
Bio-Rad Laboratories (USA)
19
3.1.2 Software
EndNote 6.0
Thompson ISI Researchsoft (Carlsbad, USA)
Image Master 1D Program
Amersham Pharmacia Biotech Inc. (New Jersey, USA)
MS Office 2000
Microsoft Corporation (USA)
Origin 6.0
Microcal Software, Inc. (Northhampton, USA)
Photoshop 5.5
Adobe Systems, Inc. (San Jose, USA)
Z3 2D PAGE Analysis
AxioVision 4.4
Z3 Version 2.2.1, Compugen (Tel Aviv, ISR)
Carl Zeiss MicroImaging GmbH (Jena; GER)
LumiAnalyst
Roche Diagnostics (GER)
Cell Quest
BD immunocytometry systems (USA)
MyiQ
Bio-Rad Laboratories (USA)
Tierbase
SAP
3.1.3 Antikörper (primär/sekundär)
Primärantikörper
• Pan-Cytokeratin
• Cytokeratin-5
• Cytokeratin-10
• CTSD
• CTSB
• CTSE
• CTSL
• CTSH
• CTSX
• Ki67
• PCNA
• Vimentin
• Aktin
• Neutrophile
Rabbit;
Rabbit;
Rabbit;
Goat;
Goat;
Goat;
Goat
Goat;
Goat;
Rat;
Rabbit;
Mous;
Mous;
Rat;
(BioGenex PU071-UP)
(BioGenex PRB-160P)
(BioGenex PRB-159P)
(R&D Systems AF1029)
(R&D Systems AF965)
(R&D Systems AF1030)
(R&D Systems AF1515)
(R&D Systems AF1013)
(R&D Systems BAF1033)
(DakoCytomation M7249)
(Abcam, ab2426)
(DakoCytomation M7020)
(ICN 3630F)
(Cedarlane CL8993AP)
Sekundärantikörper
•
•
•
•
•
•
Anti-Goat
Anti-Rabbit
Anti-Sheep
Anti-Rat
Anti-Rabbit-HRP
Anti-Mouse-HPR
ABC Elite Kit (PK-6105 Vectastain)
ABC Elite Kit (PK-6101 Vectastain)
ABC Elite Kit (PK-4006 Vectastain)
ABC Elite Kit (PK-4004 Vectastain)
(Chemicon AP304P)
(Rockland 610-1302)
20
3.1.4 Primer Sequenzen
Genotypisierung
Primer CTSL
• MCL-5
• MCL-9a
• Neo 756-777
5' GGA-GGA-GAG-CGA-TAT-GGG 3'
5' TTC-CTC-ATT-GGT-CTT-CCG-G 3'
5' CGG-AGA-ACC-TGC-GTG-CAA-TCC 3'
Primer HPV16 Transgen
• EG1
• EG2
• β2-1
• β2-2
5'-AGA ACT GCA ATG TTT CAG GAC CCA 3'
5´-TCT GCA ACA AGA CAT ACA TCG ACC GG 3'
5´-CAC CGG AGA ATG GGA AGC CGA A-3´
5´-TCC ACA CAG ATG GAG CGT CCA G-3´
RT-PCR
Primer CTSH
• CTSH(f)
• CTSH(r)
5´ - CATGGCTGCAAAGGAGGTCT- 3´
5´ - CTGTCTTCTTCCATGATGCCC- 3´
Primer CTSB
• CTSB(f)
• CTSB(r)
5´ - TGCGTTCGGTGAGGACATAG- 3´
5´ - CGGGCAGTTGGACCATTG- 3´
Primer CTSL
• CTSL(f)
• CTSL(r)
5´ - GCACGGCTTTTCCATGGA- 3
5´ - CCACCTGCCTGAATTCCTCA- 3´
Primer CTSD
• CTSD(f)
• CTSD(r)
5´ - GTGCACATGGACCAGTTGGA- 3´
5´ - CAATAGCCTCACAGCCTCCCT- 3´
Primer CTSX
• CTSX(f)
• CTSX(r)
5´ - TATGCCAGCGTCACCAGGAAC- 3´
5´ - CCTCTTGATGTTGATTCGGTCTGC- 3´
3.1.5 Statistik
•
Parametrische Test wurde mittels Student’s T-Test bestimmt. Als signifikant
wurden p-Wert ≤ 0,05 gewertet.
•
Nicht parameterische Test Statistik erfolgte über den Chi-square Test. Als
signifikant wurden p-Wert ≤ 0,05 gewertet.
21
3.2
Methoden
3.2.1 Tierexperimentelle Methoden
3.2.1.1 Maushaltung
Die Mäuse wurden unter spezifiziert pathogenfreien (SPF)-Bedingungen gehalten. Die
Temperatur in den Räumen betrug 21-23°C, die Luftfeuchtigkeit 45-60%. Die Haltung
und
Analyse
von
Wildtyp,
Cathepsin
L-defizienter,
Tg(K14HPV16);ctsl+/+,
Tg(K14HPV16);ctsl+/- und Tg(K14HPV16);ctsl-/- Mäuse, erfolgte entsprechend der
Genehmigung G-03/80 und G02/56 durch das Regierungspräsidium Freiburg.
3.2.1.2 Progressions- und Inzidenzstudie
Für die Inzidenz-Studie wurden Tg(K14HPV16)/FVB; Tg(K14HPV16);ctsl+/-/FVB und
Tg(K14HPV16);ctsl-/-/FVB, unter (SPF)-Bedingungen gezüchtet und im Alter von 20
Wochen in die konventionelle Haltung transferiert. Es erfolgte eine zweimal
wöchentlich Palpation. Bei Erreichen des Tumorvolumens von 1cm3 wurde eine
zervikale Dislokation durchgeführt und Tumor, Ohrhaut, Rückenhaut sowie
Lymphknoten entnommen. Es erfolgte sowohl eine Paraffin- und/oder Kryo- Fixierung
als auch für biochemische Untersuchungen eine Stickstoff-Schockgefrierung.
Für die Progressionsstudie wurden Mäuse im vom Alter von 4, 8, 16 und 24 Wochen
untersucht und aufgearbeitet. (siehe oben)
3.2.1.3 Chemische Karzinogenese
Chemikalien
• DMBA (25 μg/200 μl Aceton)
• TPA ( 4 μg/ 200 μl Aceton)
(Sigma)
(Sigma)
Für diese Anwendungen wurden ctsl+/+
und CTSL defiziente Mäuse im FVB
Hintergrund herangezogen. Der Rücken wurde rasiert und mit Hilfe einer Pipette
erfolgte eine einmaligen DMBA Applikation von 25 μg DMBA in 200 μl in Aceton
gelöst.
In
der
darauf
folgenden
Woche
wurde
zweimal
wöchentlich
die
Rückenbeträufelung mit 4 μg TPA in 200 μl Aceton gelöst über einen Zeitraum von 16
22
Wochen ausgeführt. Die Mäuse wurden bis max. zur 52. Woche observiert und bei einer
Tumorgröße von 1cm3 aufgearbeitet (siehe Progression- und Inzidenz Studie 3.2.1.2).
3.2.2 Zellkultur
3.2.2.1 Primäre Zellkultur
Tag 1
Chemikalien
• 70% EtOH
• PBS
• 0,25% Trypsinlösung
• Collagen type IV (human Placenta)
o 5 ml 0,5 M Essigsäure
o 45 ml 1x PBS
Gibco (Kat. Nr. 25050-014)
Sigma (Kat. Nr. C-5533)
Postnatale Mäuse (p3) wurden dekapitiert und abwechselnd 3x mit PBS und 70% EtOH
gewaschen. Der auf Eis gekühlte Körper wurde unter der sterilen Werkbank zum Torso
reduziert und die Haut vom Rücken aus vorsichtig abgelöst. Der Transfer der Haut
erfolgte in eine Zellkulturschale mit Dermis Richtung Schale. Die ausgebreitete Haut
wurde mit einer 0,25% Trypsinlösung unterspült. Der tryptische Verdau erfolgt über 24
Stunden bei 4°C.
Für die Keratinozyten-Kultur wurden Zellkulturschalen mit Zugabe von 0,01%iger
Collagen IV (v/w) unter 4°C beschichtet.
3.2.2.2 Primäre Keratinozyten
Tag 2
Chemikalien
• Murine EGF-Lösung
o 100µg in 10 ml BMKM
• Salts (10 x)
o 4g
KCl;
o 2g
MgSO4-7H20;
o 68 g NaCl;
o 22 g NAHCO3;
o 1,4 g NaH2PO4-H20
auf 1l auffüllen
Gibco (Kat.Nr. 533008-018)
23
•
Chelex serum
o 50 ml FCS Aliquot
PAN (Kat. Nr. P30-1802)
o 2,5 g Chelex 100 Resin
Biorad (Kat. Nr. 142-2842)
auf Rollrad bei 4°C über Nacht laufen lassen. Chelexierung wurde 4x wiederholt
•
BMKM Keratinozyten Medium
o MilliQ H2O
784,5 ml
o Salts(10 x)
100 ml Merck
o Glucose 100g/l
10 ml Sigma (G-6152)
o Glutamin 200 mM
10 ml
o Phenol red1g/ 500ml
5 ml
o Mem NE AA (100 x)
10 ml Gibco (Kat. Nr. 11140-035)
o Mem Vitamins (100 x )
10 ml Gibco (Kat. Nr. 11120-037)
o Mem AA(50 x)
20 ml Gibco (Kat. Nr. 21135-033)
o Chelex serum
40 ml
o Antib./ antimycotics
10 ml Gibco (Kat. Nr. 15140-114)
o CaCl2 100 mM
500 µl
pH-Wert wurde mit 5 N NaOH auf pH 7,0 bis 7,2 eingestellt und dann mit einer 0,2 µm
Filterflasche filtriert.
Die trypsinierte Haut wurde nach Abtropfen in eine weitere Zellkulturschale überführt
und mit der Epidermis nach unten ausgebreitet. Die Trennung der Epidermis von der
Dermis wurde mittels zweier Pinzetten vollzogen. Die zerkleinerte Epidermis wurde in
einen autoklavierten, mit Magnetrührer und 6 ml BMKM-Medium versehenen 50 ml
Erlenmeyerkolben überführt und für eine Stunde bei einer Drehzahl von 100-200 rpm
bei 4°C gerührt. Die Zellsuspension wurde filtriert und in 6 cm mit Collagen IV
beschichtete Zellkulturschalen gegeben. Die Kultivierung erfolgte bei 37°C-7% CO2
mit täglichem Medienwechsel. Das BMKM Medium muss vor jeder Anwendung mit
1/1000 Volumenanteil EGF-Lösung versetzt werden.
3.2.2.3 Primäre Fibroblasten
Tag 2
Chemikalien
• DMEM Eagles Fibroblasten Medium
o 10%
FCS
o 1%
Penicillin/Streptomycin
o 1%
L-Glutamin
• Kollagenase-Lösung
o 50 ml
M199-Medium
o 175 mg
Collagenase
• 100mM CaCl2
PAN (Kat. Nr. P30-1802)
Gibco (Kat. Nr. 15140-114)
Gibco (Kat. Nr. 31153)
Die trypsinierte Haut wurde nach Abtropfen in eine weitere Zellkulturschale überführt
mit der Epidermis nach unten ausgebreitet und durch Pinzetten-Einsatz Dermis von der
24
Epidermis voneinander getrennt. Die zerkleinerte Dermis wurde in einen autoklavierten,
mit Magnetrührer und 5 ml Collagenase-Lösung versehenen Erlenmeyerkolben
überführt und mit restlicher Collagenase-Lösung (45 ml) aufgefüllt. Bei mittlerer
Drehzahl und 37°C erfolgte die 30-45 min. Inkubation. Anschließend wurde filtriert
(100 μm) und bei 300 g für 5 min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 50 ml
Fibroblasten Medium (+ 640 μl 100mM CaCl2) aufgenommen und resuspendiert. Die
Ausplattierung erfolgte durch Zugabe der resuspendierten Zellen und dem Fibroblasten
Medium in einem Volumenanteilverhältnis von 1:1 in einer Zellkulturschale. Die
Kultivierung erfolgte bei 37°C unter 5% CO2.
3.2.3 Molekularbiologische Methoden
3.2.3.1 Genomische DNA Isolierung aus Mausschwanzenbiopsien
Chemikalien
• DNA-Lyse Puffer:
o 100 mM
o 5M
o 0,2%
o 200 M
Tris
EDTA
SDS
MnCl
•
10mM Tris-Puffer (pH 8,5)
•
•
•
Proteinase K (20 mg/ml)
Ethanol
N-Isopropanol
3.2.3.2 DNA-Isolierung durch Isopropanol Fällung
Die Mausschwanzbiopsie (max. 0,5 cm) wurde in 500 µl DNA-Lyse Puffer mit 20 µl
Proteinase K (20 mg/ml) bei 56°C im Wasserbad für 12 Stunden geschüttelt. Nach der
Inaktivierung der Proteinase K durch Erhitzung der Probe auf 95°C für 15 min wurde
die Probe auf 4°C gekühlt und bei 11000g abzentrifugiert. Der Überstand wurde
überführt und durch Zugabe von 500 µl Isopropanol die genomische DNA gefällt. Die
DNA wurde dann mit Hilfe einer abgerundeten Pasteurpipette gefischt, in 70% Ethanol
gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet. Anschließend wurde die DNA in 100µl
- 200μl 10mM Tris pH 8,5 für 1h bei 37 °C gelöst. Die optische Dichte (OD) und die
Reinheit der DNA wurde photometrisch bei 260nm & 260/280nm bestimmt. Der
Extinktionswert sollte zwischen 0,1-1 sowie dem Quotienten von 260/280nm ≥ 1,5
liegen.
25
3.2.3.3 Schnellverfahren zur Genotypisierung
Die Mausschwanzbiopsie (0,5 cm) wurde in 100 µl DNA-Lyse Puffer mit 10 µl
Proteinase K (20 mg/ml) bei 56°C im Wasserbad für 12 Stunden inkubiert. Die
Inaktivierung der Proteinase K erfolgte durch Erhitzung der Probe auf 95°C für 15 min.
Eine 1:10 Verdünnung der Probe wurde zu Genotypisierung verwendet.
3.2.3.4 Genotypisierung
Primer CTSL
•
•
•
MCL-5
MCL-9a
Neo 756-777
Primer (MCL-5)
Primer (MCL-9)
Primer (Neo 756-777)
Puffer
dNTP
Taq
Wasser (steril)
Probe
Total Volumen
5' GGA-GGA-GAG-CGA-TAT-GGG 3'
5' TTC-CTC-ATT-GGT-CTT-CCG-G 3'
5' CGG-AGA-ACC-TGC-GTG-CAA-TCC 3'
Pro Probe/μl
0,5
0,5
Konzentration
(100 pmol)
(100 pmol)
0,5
10
2
0,25
84,25
(100 pmol)
(10x)
(10 mM)
(5 U/μl)
2
100
(125ng)
PCR Programm
Vorheizen
95°C
Zyklen
35
Denaturierung
95°C
15’
Annealing
Amplifikation
30’’
1’
51°C
72°C
1’
Gesamt Dauer 35 Zyklen
Zyklen-Ende
72°C
7’
Kühlung
∞
4°C
Primer HPV16 Transgen
•
•
•
•
EG1
EG2
β2-1
β2-2
Primer (EG1)
Primer (EG2)
5'-AGA ACT GCA ATG TTT CAG GAC CCA 3'
5´-TCT GCA ACA AGA CAT ACA TCG ACC GG 3'
5´-CAC CGG AGA ATG GGA AGC CGA A-3´
5´-TCC ACA CAG ATG GAG CGT CCA G-3´
Pro Probe/μl
0,2
0,2
Konzentration
(100 pmol)
(100 pmol)
Primer (β2-1)
0,1
(100 pmol)
Primer (β2-2)
Puffer
0,1
10
(100 pmol)
(10x)
dNTP
Taq
2
0,25
(10 mM)
(5 U/μl)
Wasser (steril)
Probe
Total Volumen
84,25
2
100
PCR Programm
Vorheizen
95°C
Zyklen
35
Denaturierung
95°C
15’
Annealing
Amplifikation
30’’
1’
62°C
72°C
1’
Gesamt Dauer Zyclen
(125ng)
Zyklen-Ende
Kühlung
72°C
4°C
7’
∞
26
3.2.3.5 Auftrennung der amplifizierten DNA
Chemikalien
• Loading Buffer (blau):
o 0,125% Bromphenolblau
o 0,125% Xylencyanol (Sigma, X - 4 126)
o 12,5% Ficoll Typ 400 (Calbiochem, 341691)
• 20xSB-Puffer
o 8g NaOH
o Borsäure (zur Einstellung von pH 8)
Auf 1 Liter mit dest. Wasser Auffüllen
•
50x TAE-Puffer
o 121,14 g Tris-Base
o 18,6 g EDTA
o Eisessig (zur Einstellung von pH 8)
Auffüllen auf 500 ml mit dest. Wasser
•
•
Aragose-Gelelektrophorese
2% Agarose (Cambrex)
1% Agarose (Cambrex)
1 x TAE Puffer:
1 x Sodium Borat-Puffer
(SB-Puffer)
NaOH 200mM
24,2 % Tris-Base
3,72 % EDTA
Æ pH mit Eisessig auf 8,0
einstellen
einstellen
Stromspannung: ca. 100V
Stromspannung: ca. 160-180V
Æ pH mit Borsäure auf 8,0
100 bp Ladder (0,1 μg /μl)
o 10 mM
Tris-HCl (pH 7,5)
o 1 mM
EDTA
o 100 bp Ladder
(Gibco BRL, Cat.no: 15628 – 050)
Zur Auftrennung des PCR Produktes wurde ein 1%iges Agarose-Gel/SodiumBorat oder
ein 2%iges Agarose-Gel/TAE hergestellt und verwendet. Zur Visualisierung der DNA
wurden 5µl Ethidium Bromid auf 400 ml Gel zugegeben.
Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte in einer Gel-Elekrophoresekammer, gefüllt
mit der korrespondierenden Pufferlösung. Die Dokumentation erfolgt durch Aufnahme
des Gels nach Anregung des in der DNA interkalierten Ethidium Bromids mittels UVLicht.
27
3.2.3.6 Probenaufbereitung für die RT-PCR
Chemikalien
• SV Total RNA Isolation System
o RNA Lysis Buffer
o RNA Dilution Buffer
o RNA Wash Solution
o DNase Stop Solution
o Nuclease-Free Water
• EtOH
(Pomega)
Die Gewebeprobe von ca. 170 mg wurde mit dem beigefügten „RNA Lysis Buffer“
aufgenommen und homogenisiert. Davon wurden 175 μl entnommen und 350 μl „RNA
Dilution Buffer“ zugegeben, mehrfach invertiert und 3 min lang bei 70°C inkubiert.
Anschließend wurde das Lysat unter 14000 g bei Raumtemperatur zentrifugiert, der
Überstand abgenommen und 200 μl 95% Ethanol unter Mischen zugegeben.
Anschließend erfolgte das Auftragen der Lösung auf eine Säule, die bei 14000g für 1
min zentrifugiert wurde. Durch die Applikation von 600 μl „RNA Wash Solution“ und
eine erneute Zentrifugation bei 14000g wurde die Säule gewaschen. Die Säule wurde
mit 50 μl frisch hergestellter DNase I Lösung beladen und bei Raumtemperatur (RT) 15
min inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 200 μl „DNase Stop Solution“
beendet. Eine weitere Zentrifugation und eine anschließende Behandlung der Säule mit
600 μl „RNA Wash Solution“ folgten. Der Waschschritt wurde durch Zugabe von 250
μl „RNA Wash Solution“ bei einer Zentrifugationszeit von 2 Minuten wiederholt.
Die Elution erfolgt durch Zugabe von 100 μl „Nuclease-Free Water“ und einer
einminütigen Zentrifugation. Die Konzentration der RNA Lösung wurde durch ein UVMeter bestimmt und bei -80°C gelagert.
3.2.3.7 Konzentrationsbestimmung von DNA und RNA
Chemikalien
• 10 mM Tris pH 8,5
Die RNA/DNA Konzentrations-Bestimmung erfolgt bei 260 nm gegen 10 mM Tris pH
8,5 in einer Quarzküvette.
28
3.2.3.8 cDNA Synthese aus RNA
Chemikalien
• SuperScript first-strand Synthesis System
o SuperScript
o random hexamer Primer
o 10 x RT Puffer
o 25 mM MgCl2
o 0,1 M DTT
o RNaseOut Recombinant Ribonuclease Inhibitor
o DEPC Wasser
(Invitrogen)
Die isolierte RNA wurde mittels SuperScript first-strand synthesis system for RT-PCR
(Invitrogen) in cDNA umgeschrieben.
Pro Probe/μl
Konentration
random hexamer Primer
0,5
(50 ng/µl)
dNTP
2
(10 mM)
Æ Auf 10 µl mit DEPC behandeltem Wasser auffüllen, mixen und bei 65°C für 5min
inkubieren.
Æ Anschließend wird der Ansatz auf Eis abgekühlt und folgende Reagenzien
zugegeben
RT-Puffer
2
(10x)
MgCl2
4
25 mM
DTT
0,25
0,1 M
RNaseOut
1
Æ Der Ansatz wird für 12 min bei 25°C inkubiert
Æ Anschließend 50 min unter 42°C
Æ Weitere 70 min unter 70°C
Æ Ansatz auf Eis abkühlen
Æ bei 37°C Zugabe
von RNase H
1
Æ Inkubation 20 min bei 37°C, Abbau vorhandene RNA/DNA Hybride.
3.2.3.9 RT-PCR
Chemikalien
• 12,5 µl
• 0,5 µl
• 0,5 µl
• 1,5 µl
• 10 µl
SYBR Green Mix (Invitrogen)
10 mM Primer A
10 mM Primer B
RNase freies Wasser
entsprechende cDNA/RNA Verdünnung
29
Primer
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
CTSH(f)
CTSH(r)
CTSB(f)
CTSB(r)
CTSL(f)
CTSL(r)
CTSD(f)
CTSD(r)
CTSX(f)
CTSX(r)
5´ - CATGGCTGCAAAGGAGGTCT- 3´
5´ - CTGTCTTCTTCCATGATGCCC- 3´
5´ - TGCGTTCGGTGAGGACATAG- 3´
5´ - CGGGCAGTTGGACCATTG- 3´
5´ - GCACGGCTTTTCCATGGA- 3
5´ - CCACCTGCCTGAATTCCTCA- 3´
5´ - GTGCACATGGACCAGTTGGA- 3´
5´ - CAATAGCCTCACAGCCTCCCT- 3´
5´ - TATGCCAGCGTCACCAGGAAC- 3´
5´ - CCTCTTGATGTTGATTCGGTCTGC- 3´
3.2.3.10 Quantitative real time PCR
Chemikalien
• SYBR Green Mix
• Optical Adhesive Covers
(Invitrogen)
(Applied Biosystems)
Die real time PCR wurde zur Untersuchung der transkriptionalen Ebene von
Ohrhautgewebe durchgeführt. Dabei wurde die erworbene cDNA amplifiziert und durch
zeitgleiche Messung der neuen Reaktionsprodukte die Quantifizierung erreicht. Die
Konzentrationsbestimmung erfolgte am CT Wert, bei dem die Reporterfluoreszenz
überschritten wurde. Für jede Probe erfolgte eine Dreifachbestimmung, wohingegen
eine Doppelbestimmung für die Kontrollen („no template control“ ohne cDNA oder
RNA als Test auf Primer Dimerbildung; „no amplification control“ nur RNA)
durchgeführt wurde. Die 96 well Platte wurde nach Beladung durch „Optical Adhesive
Covers” (Applied Biosystems) versiegelt und 5 min bei 1200 rpm zentrifugiert. Die
anschließende Amplifikation erfolgte mit dem MyIQ Cycler.
Pro Probe/μl
Konzentration
PCR Programm
Vorheizen
95°C
Zyklen
50
1’
SYBR Green Mix
12,5
Primer (forward)
0,5
(10 pmol)
Denaturierung
95°C
15’
Primer (reverse)
0,5
(10 pmol)
Annealing
60°C
30’’
Probe
10
(0,1 ng)
Amplifikation
72°C
30’’
Wasser (RNase frei)
1,5
1x
90°C
60’’
1x
60°C
60’
80x
+ 0,5°C
10’’
Ende
10°C
∞
Total Volumen
25
30
3.2.4 Biochemische Methoden
3.2.4.1 Aufschluss von Gewebe und Zellen
Chemikalien
• Lysiespuffer:
o
o
o
o
o
o
•
Thioharnstoff
Harnstoff
CHAPS
Pefabloc
EDTA
Leupeptin
2M
6M
65 mM
100 mM
100 mM
10 mM
Homogenisierungspuffer
Für die Western-Blot Analyse wurde der Lysiespuffer und für den Aktivitätsassays der
Homogenisierungspuffer verwendet. In beiden Fällen erfolgte die Proteinbestimmung
mittels Bradford-Reagenz.
Gewebevorbereitung:
Das Gewebe wurde in flüssigem Stickstoff zermörsert und anschließend im
entsprechendem Puffer aufgenommen. Mittels Ultraturax (1-3 min eisgekühlt) und
Dounce Homogenisator (30 Hübe, eisgekühlt) erfolgte der Zellaufschluss. Um den
postnuklearen Überstand (PNS) zu erhalten, erfolgte eine Zentrifugation von 800-1000 g
für 30 min bei 4°C.
Zellkulturvorbereitung:
Mittels eines Zellschabers und dem entsprechendem Puffer wurden die Zellen von der
Kulturschale gelöst. Der Zellaufschluss erfolgte eisgekühlt mit dem Dounce
Homogenisator und die PNS Gewinnung über einer Zentrifugation von 800-1000 g für 30
min bei 4°C.
3.2.4.2 Proteinbestimmung
Farbstoff-Assay nach Bradford
• Farbstoffkonzentrat
• BSA-Lösung
(BioRad Kat. Nr.: 500-0006)
1mg/ml
Zur Quantifizierung der Proteinkonzentrationen in den verschiedenen Proteinproben
wurde das Komlettsystem von Biorad basierend auf dem Protokoll nach Bradford
(Bradford, 1976) verwendet. Es wurde eine doppelte Standardreihe mit entsprechendem
Puffer von 0; 2,5; 5; 7,5 und 10 µg BSA zur 100 µl zur Kalibrierung erstellt. Die
31
Probenverdünnung wurde so gewählt, dass die bei 595 nm gemessene Extinktion
zwischen 0,1 und 1 lag. Dazu wurden 100 μl der verdünnten Probe mit 1 ml, der 1:5
verdünntem Bradfordlösung zugegeben. Nach 20 min wurde die Extinktion mit dem
Photometer bei 595 nm unter RT gemessen.
Durch die Bestimmung der Standardgeraden wurde die Proteinkonzentration der Proben
bestimmt.
3.2.4.3 Cathepsin Aktivitätsbestimmung
Chemikalien
• Acetatpuffer
o Natriumacetat
o EDTA
o Brij
Auf pH 5,5 eingestellt
•
•
•
Z-Phe-Arg-AMC
Ca074
DTT
100 mM
100 mM
1 mM
0,05% (v/v)
25 µM
150 nM
100 mM
Zur Cathepsin B-und L-Messung wurden jeweils 10µl Probelösung mit 90 µl 100 mM
Acetatpuffer in eine schwarze nich fluoreszierende 96-Well-Platte pipettiert und mit
DTT (2 mM) für 30 min bei 37°C inkubiert. Nach Zugabe von Z-Phe-Arg-AMC die
eine Endkonzentration von 25 µM hat, wurde die Messung gestartet (Tchoupe et al.,
1991). Zur Cathepsin L Aktivitätsmessung wurde Z-Phe-Arg-AMC, das CTSB –
Aktivität mit 150 nM CA074, ein CTSB spezifischer Inhibitor, gestoppt (Murata et al.,
1991). Die Messung erfolgte bei einer Anregungswellenlänge 370 nm und einer
Emission von 470 nm und wurde kontinuierlich bis zur 90. Minute detektiert. Die
Auswertung erfolgte im linearen Bereich des Fluoreszenzanstiegs und wurde auf die
Proteinkonzentration normiert.
3.2.4.4 β-Hexosamidase-Aktivitätsbestimmung
Chemikalien
• Substratlösung
o 100 mM
Natriumcitrat
o 10 µM
p-Nitrophenyl-N-acetyl-ß-D-Glucosaminid
Auf pH 4,6 eingestellt
•
Stopplösung
o 400 mM
Glycin
mit NaOH auf pH 10,4 eingestellt
32
Die Aktivität des lysosomalen Proteins β-Hexosamidase wurde photometrisch
bestimmt. Dazu wurden 10µl Probe mit 100µl Substratlösung für 20 min im Wasserbad
bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch 500 µl Stopplösung beendet und
anschließend bei 405 nm die Extinktion bestimmt und auf die Proteinkonzentration
normiert.
3.2.4.5 Ras-Aktivitäts-Assay
Chemikalien
• Ras GTPase chemi ELISA Kit
(Activ Motif)
o 96-Well Assay Platte
o Lysis/ Binding Buffer
o Protease Inhibitor Cocktail
FA 1:100 In Lysis/ Binding
o GST-Raf-RBD
( 2 mg/ml )
o 10xWash Buffer AM2
o HeLa whole-cell extract
( EGF treated 2,5 μg/μl)
o H-Ras Antibody
(1:500)
o 10x Antibody Binding Buffer,
o Anti-rat HRP-conjugated IgG
(1:5000)
o Chemiluminescent Reagent, Reaction Buffer
ƒ Ein Volumenanteil Chemiluminescent Reagent
ƒ Zwei Volumenanteile Reaction Buffer
Probenvorbereitungen erfolgten wie in ELISA-Kit beschrieben, nur dass der interne
Lysis/ Binding Buffer verwendet wurde. Nach der Proteinabgleichung auf 70 μg Protein
je Probe wurde die Glutathion-beschichtete 96-Well Assay Platte mit je 2 μg GST-RafRBD pro Well für 1 h bei 4°C mit 100 rpm inkubiert. Anschließend wurden die Wells
3x mit je 200 μl 1x Wash Buffer AM2 gewaschen und die Proben inklusiv einer
Positivkontrolle (HeLa whole-cell extract) bei RT für 1 Stunde unter leichter Rotation
inkubiert. Nach erneutem Waschen (3x) wurde der H-Ras Antikörper einer 1:500
Verdünnung appliziert und für eine Stunde unter RT inkubiert. Anschließend erfolgten
eine Wiederholung der Waschschritte, und die Inkubation mit Anti-rat HRP-conjugated
IgG wurde eingeleitet (1 Stunde; RT). Vor der Detektion wurden die Wells 4x
gewaschen und 50 μl der Chemiluminescent Working Solution zugegeben. Die
Quantifizierung erfolgte mittels LumiImagers.
33
3.2.4.6 Proteinnachweis mittels Western Blot Analyse
Chemikalien
• SDS-Laemmlipuffer reduzierend
o 62,5 mM
Tris
o 10% (v/v)
Glycerol
o 4% (w/v)
SDS
o 2% (v/v)
Mercaptoethanol
o 0,01%
Coomassie Blau
•
4%;10%; 12,5%; 16% Polyacrylamid-Gele und 10-16% Gradientengel
o 4%;10%; 12,5%; 16% (w/v) Polyacrylamid
o 1M
Tris
o 0,1% (w/v)
SDS
o bei pH 8,45
•
Anodenpuffer
o 0,2 M
Tris
Auf pH 8,9 eingestellt
•
Kathodenpuffer
o 0,1 M
o 0,1 M
o 0,1% (w/v)
Tris
Tricin
SDS
PBS-Tween-Puffer
o PBS
o 0,2% (v/v)
Gibco
Tween 20
•
•
•
•
•
Transferpuffer
o 25 mM
o 190 mM
o 20% (v/v)
o
ECL-Lösung
Röntgenfilm
Hybond-P PVDF
(Kat. Nr. 20012043)
Tris
Glyzin
Methanol
(Amersham Kat. Nr. RPN3103K)
(Amersham Kat. Nr. RPN3103K)
(Amersham Kat. Nr. RPN303F)
Je nach Größe des zu detektierenden Poteins wurde ein erforderliches PolyacrylamidGel gegossen. Die Probenvorbereitung beinhaltete das Reduzieren der Proben, die eine
Mindestproteinkonzentration von 25 μg vorweisen und durch Zugabe von SDS
Laemmlipuffer bei 95°C für 5 min reduziert werden. Die Trennung der Proteine erfolgt
über das Polyacrylamid-Gel und wurde anschließend durch „Semidry“ Verfahren auf
eine Hybond-P PVDF Membran mit dem Transferpuffer mit 40 mA in 2 h überführt.
Die Membran wurde anschließend mit 3% Milchpulver, gelöst in PBS-Tween,
abgeblockt. Die Membran wurde mit dem Primärantikörper, in entsprechender
34
Verdünnung in PBS-Tween für 90 min bei RT oder über Nacht (üN) bei 4°C inkubiert.
Nach dreimaligem Waschen mit PBS-Tween wurde der Sekundärantikörper in der
erforderlichen Konzentration für 45 min bei RT auf die Membran gegeben. Nach
erneutem dreimaligem Waschen erfolgte die Detektion mittels ECL- Lösung und
anschließendem Auflegen eines Röntgenfilms. Zur Beladungskontrolle wurde über eine
ß-Aktin Antikörper eingesetzt.
3.2.4.7 LysoTracker® und MitoTracker® Färbung
Chemikalien
• LysoTracker®-DND26
• MitoTracker® Red CMXRos
Molecular Probes
Molecular Probes
Die Zellen in Kultur (MFs und Keras) wurde mit einer 1 μM Konzentration von
LysoTracker®-DND26 oder LysoTracker®-DND26 und MitoTracker® Red CMXRos für
2 Stunden unter Kultivierungsbedingungen inkubiert. Daraufhin wurde die Zellkultur
mit Medium gewaschen und entweder in einem Invertier-Fluoreszenz-Mikroskop direkt
auf der Zellkulturplatte oder mit einem Laser-Scan-Mikroskop auf Objektträger
transferierte Zellen analysiert.
3.2.5 Histologie und Immunhistologie
3.2.5.1 Kryokonservierung von Gewebe
Chemikalien
• Tissue-Tek®
• Flüssiger Stickstoff
Das Gewebe wurde sorgfältig vorbereitet und vollständig mit Tissue-Tek® bedeckt. Das
mit Tissue-Tek® umschlossene Gewebe wurde in flüssigem Stickstoff schockgefroren
und bei –80°C gelagert.
35
3.2.5.2 Gewebefixierung durch Formalin-Vernetzung
Chemikalien
• Fixierlösung
o 6,5 g
Nartriumphosphat
o 4g
Natriumdihydrogenphosphat
o 100 ml
Formalin(40%)
________________________
Mit Aqua dest. auf 1000 ml und gegebenenfalls pH 7,4 einstellen
•
Ethanol
Die gewonnenen Gewebeproben wurden in 4% Formaldehyd für 24h bei
Raumtemperatur fixiert und anschließend in 70% Ethanol gelagert. Die fixierten Proben
wurden in einen Einbettautomaten transferiert. In den ersten zwei Phasen wurden die
Gewebestücke je eine Stunde in 70% Ethanol getränkt. Die Alkoholreihe wurde
daraufhin über die Konzentrationen 80%, 2x 95%; 3x 100% für je eine Stunde erhöht.
Darauf folgte eine einstündige, dann zweistündige Xylol-Tränkung. Eine zweimalige
Paraffin-Inkubation für die Dauer von zwei Stunden schloss den Einbettvorgang im
Automaten ab. Das Einbetten in den entsprechenden Formen erfolgt manuell, um die
korrekte Orientierung des Gewebes zu gewährleisten.
3.2.5.3 Produktion der Gewebeschnitte
Paraffin Schnitte
Paraffinblöcke mit Gewebe wurde vor der Bespannung in der MICROM
Schneidemaschine bei –20°C für 1 Stunde vorgekühlt. Bei der Bespannung wurde
sowohl auf die Schnittebene als auch auf die Orientierung des Gewebes geachtet. Die
Schnittdicke der Proben betrug 5 μm. Die Schnitte wurden durch den Transfer in ein
39°C warmes Wasserbad geglättet, anschließend mit einem Superfrost-Deckglas
aufgefischt und für 12 h auf einer 39°C warmen Wärmeplatte getrocknet.
Kryokonservierte Schnitte
Die kryokonservierten Proben wurden bei –30°C im Kryostat auf die entsprechende
Vorrichtung mittels Tissue-Tek® in der richtigen Gewebeorientierung angebracht, in 5
μm dicke Schnitte geschnitten und auf Deckgläser übertragen und bei –80°C gelagert.
36
3.2.6 Entparaffinierung
Chemikalien
• Xylol
• Ethanol
Für die Entparaffinierung, wurde eine Ethanolverdünnungsreihe (3x 99%; 1x 96%; 1x;
70%; 1x 50%) angesetzt. Die Objektträger mit den Paraffin-Schnitten wurden dreimal 5
min lang mit Xylol gewaschen und für 5 min in den absteigende Ethanol-Verdünnungen
inkubiert. Nach dem 50%igen Ethanolschritt wurden die Objektträger in Wasser
überführt.
3.2.7 Hämalaun/Eosin-Färbung
Chemikalien
• Eosin 1%ig
Vor Gebrauch je 50-100 µl Eisessig zugeben.
• Hämalaun:
1:3 mit Leitungswasser verdünnen und vor Gebrauch filtrieren
•
•
•
Entellan (Merck)
Xylol
EtOH
Gewebeschnitte wurden 3x je 5 min in Xylol gegeben, um eine Entparaffinierung zu
erlangen.
Anschließend
folgte
eine
Ethanol-Reihe,
wobei
die
ersten
zwei
Inkubationsschritte in 100% EtOH für 5 min und die darauf folgenden je 1 min in
auf/abfallenden EtOH Konzentrationen (96%; 80%; 70%; 50%; 30% und 0% (H2O)
erfolgten. Die Schnitte wurden 3 min. Hämalaunlösung gefärbt. Anschließend für 15
min in Wasser inkubiert und 1 min in der Eosin-Lösung gefärbt. Es folgte eine
aufsteigende EtOH Reihe. Ausgehend von H2O wurden die Schnitte je 1 min in 70%,
80%, 96% und zweimal in 100% Ethanol überführt. Die Inkubationszeit der 100%igen
Ethanolinkubation betrug 4 und 5 min. Beendet wurde die Färbung durch eine
dreimalige 5 min-Inkubation in Xylol. Das Gewebe wurde mit Entellan eingedeckelt.
37
3.2.8 Methode zur Antigen-Demaskierung
3.2.8.1 Saure Demaskierung mittels Citrat Puffer
Chemikalien
• Citrat-Puffer 0,01 M; pH 6
o LSG A (21,01g Zitronensäure/1000ml H2O) 0,1M
o LSG B (29,41g Natriumcitrat/1000ml H2O) 0,1M
9 ml
+ 41 ml
Stock-Lösung A
Stock-Lösung B
___________________________
auf pH 6 mit NaOH einstellen und auf 500 ml mit destilliertem Wasser auffüllen
Entparaffinierte Schnitte wurden 15 min in Citrat-Puffer 0,01M; pH 6 in der Mikrowelle
gekocht.
3.2.8.2 Alkalische Demaskierung mittels Tris-EDTA Buffer
Chemikalien
• Tris-EDTA Puffer
o 1.21 g
Tris Base
o 0.37 g
EDTA
o 0,5 ml
Tween 20
_______________________________
auf pH 9 einstellen und auf 1000 ml mit destilliertem Wasser auffüllen
Entparaffinierte Schnitte wurden 20 min in Tris-EDTA Puffer pH gekocht.
3.2.8.3 Endogene Peroxidase Inaktivierung:
Chemikalien
• Lösung A:
• Lösung B:
15 ml
Methanol
30% Wasserstoffperoxid
Stock-Lösung A
+ 15 ml
Stock-Lösung B
______________________________
auf 150 ml mit H2O auffüllen und mischen
Die entparaffinierten Gewebeschnitte wurden in frisch angesetzter Lösung für 20 min
inkubiert und anschließend gewaschen
38
3.2.8.4 Immunhistologische Färbung durch Peroxidase
Antikörper
• Pan-Cytokeratin
• Cytokeratin-5
• Cytokeratin-10
• CTSD
• CTSB
• CTSE
• CTSL
• CTSH
• CTSX
• Ki67
• PCNA
• Vimentin
• Neutrophile
Rabbit; 1:250
Rabbit; 1:250
Rabbit; 1:1000
Goat; 1:500
Goat; 1:700
Goat; 1:500
Goat 1:700
Goat; 1:500
Goat; 1:1000
Rat; 1:10
Rabbit;1:700
Mouse; 1:10
Rat; 1:80
Vectastain Kit
• Anti-Goat
• Anti-Rabbit
• Anti-Sheep
• Anti-Rat
Chemikalien
• Hämalaun
• DAB (3,3´-Diaminobenzidine)
• Wasserstoff-Peroxid
• Methanol
• Aquatex
(BioGenex PU071-UP)
(BioGenex PRB-160P)
(BioGenex PRB-159P)
(R&D Systems AF1029)
(R&D Systems AF965)
(R&D Systems AF1030)
(R&D Systems AF1515)
(R&D Systems AF1013)
(R&D Systems BAF1033)
(DakoCytomation M7249)
(Abcam, ab2426)
(DakoCytomation M7020)
(Cedarlane CL8993AP)
ABC Elite Kit (PK-6105 Vectastain)
ABC Elite Kit (PK-6101 Vectastain)
ABC Elite Kit (PK-4006 Vectastain)
ABC Elite Kit (PK-4004 Vectastain)
(Sigma Aldrich)
(Sigma Aldrich)
(Merck)
Die 5 μm dicken Gewebeschnitte wurden entparaffiniert. Durch eine Behandlung mit
Methanol-Wasserstoffperoxid Lösung wurde die endogene Peroxydase geblockt. Eine
saure Demaskierung wurde für die Antigene von Ki67, PCNA und PAN durchgeführt.
Zur Absättigung der unspezifischen Bindungen wurde entsprechendes Block-Serum
(Vectastain Kit) in PBS Tween mit einer Verdünnung von 1:200 in PBS-Tween 20 für
45 min bei Raumtemperatur auf die Gewebeschnitte gegeben. Nach der Blockierung der
unspezifischen Bindungen wurde der Erst-Antikörper des zu detektierenden Proteins
appliziert. Die Inkubation erfolgt in einer feuchten Kammer je nach Antikörper (AK)
über Nacht bei 4 °C oder bei 2 Stunden unter RT. Nach dreimaligem Waschen der
Gewebeschnitte mit PBS-Tween 20 wurde der zweite Antikörper vom entsprechendem
Vectastain Kit zugegeben. Währenddessen wurde die ABC–Lösung vorbereitet und
nach den wiederholten Waschschritten auf die Gewebeschnitte aufgegeben. Die
Inkubation wurde bei RT für 45 min durchgeführt. Nach weiterem dreimaligen
Waschen erfolgte die Färbung durch die Zugabe von DAB. Diese wurde mit Wasser
39
abgestoppt. Die Hämalaun-Färbung wurde für 7 min und anschließend bei 15 min
Bläuung in Wasser durchgeführt. Das Eindeckeln erfolgte mit Aquatex.
3.2.8.5 TUNEL
(Terminal Desoxyribosyl –Transferase mediated dUTP Nick End Labeling)
Chemikalien
•
ApopTag Peroxidase in situ Apoptosis Detection Kit
o
o
o
o
o
o
(Biotech)
Stopp/Wasch Puffer
FA1:34 in aqua dest.
TdT Enzym
FA 1:6 in Reaktionspuffer
Peroxidase Substrat
FA 1:50 in DAB Dilution Buffer
Proteinase K
(20 µg/ml)
anti-Digoxigenin Peroxidase Antikörper
DNase I
Die entparaffinierten Gewebeschnitte wurden mit Proteinase K zur Demaskierung für
15 min bei RT inkubiert und anschließend mit Wasser gewaschen. Die endogene
Peroxidase wurde durch Inkubation mit Wassersoffperoxid und Methanol eliminiert
(Methoden 3.2.26) und anschließend zweimal gewaschen.
Eine Positiv-Kontrolle wurde mittels Inkubation von DNase I auf ein Kontrollgewebe
erzeugt. Anschließend wurden die Gewebeschnitte mit TdT Enzym für eine Stunde bei
37°C in einer feuchten Kammer behandelt. Die Reaktion wurde durch eine 10 min
Inkubation mit Stop/Wasch Puffer bei RT und leichtem Schütteln beendet. Die
Präparate wurden dreimal je eine Minute lang mit PBS gewaschen und 30 min lang mit
anti-Digoxigenin Peroxidase Antikörper bei RT in einer feuchten Kammer inkubiert.
Anschließend folgten weitere dreimalige PBS Waschschritte und eine 15-minütige
Färbereaktion bei RT durch das Peroxidase Substrat. Die Gegenfärbung wurde mit einer
5 min Hämalaun und 15 min langen Bläuung im Wasser durchgeführt.
3.2.9 Immunfluoreszenz-Färbung von Endothelzellen mit CD31
Chemikalien
• CD31
• Hoechst
• rat IgG2a,κ
• PBS-Tween 20
o 2 l PBS
o 4 ml Tween 20
• Block-Lösung
o PBS-Tween
o 3% BSA
Rat anti-mouse CD31 (Pharmingen)
Hoechst (# 33342)
Alexa Fluor 647 rat IgG2a,κ (Pharmingen)
40
Die Kryoschnitte (5 µm) wurden an der Luft bei RT getrocknet (ca. 10 min) und
anschließend 5 min mit PBS-Tween 20 gewaschen. Die Absättigung unspezifischer
Bindungen erfolgt in Block-Lösung für 1 Stunde bei 37°C. Anschließend wurde das
Gewebe für 2 Stunden bei 37°C mit dem Primärenantikörper CD31 (Verdünnung 1:250
in PBS-Tween 20) inkubiert. Nach einem dreimal 5min. Waschschritt in PBS-Tween 20
erfolgte die Zweitantikörper Behandlung mit rat IgG2a,κ (Verdünnung 1:250 in PBSTween 20) für 45 min bei RT. Anschließend wurden die Präparate erneut in PBS-Tween
20 gewaschen. Die Detektion erfolgte an einem Invertier-Fluoreszenz-Mikroskop.
3.2.10 Zellvereinzelung der Haut und Immunfärbung
Chemikalien
• Propidiumiodid (PI)
• Ammoniumchlorid-Lysepuffer
o Ammoniumchlorid
o Kaliumhydrogencarbonat
o Dinatrium EDTA (Tritiplex III)
Auf 1l mit H2O
•
Kollagenase-Lösung
o Kollagenase Typ II
o Kollagenase Typ V
o Deoxyribonuklease I
Auf 20 ml FACS Puffer
•
FACS Puffer
o 1x PBS
o 1% BSA
•
DMEM-Stopplösung
o 10% FCS
•
Resuspensionslödung
o DMEM
o 5% FCS
Antikörper
• anti-Maus CD31 APC
• anti-Maus IgGκ APC
• anti-Maus CD16/CD32
10 mg/ml
8,29 g
1g
37 mg
0,1 g
0,1 g
0,01 g
(0,5 mg/ml)
(1 mg/ml)
(0,5 mg/ml)
Die Mäuse wurden durch zervikale Dislokation getötet, die Rückenhaut der Tiere
abpräpariert und auf Eis zerkleinert. Die zerkleinerte Haut wurde in mit 10 ml
Kollagenase-Lösung überführt und eine halbstündigen 37°C warmen Inkubation unter
41
Rühren durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 15 ml 4°C kaltem DMEM
+ 10% FCS gestoppt. Durch mehrmaliges Auf- und Abpettieren der Suspension mit
einer 25 ml Pipette wurde durch mechanischen Stress eine weitere Zellvereinzelung
erreicht, die Zellsuspension wurde durch einen 70 µm Zellsieb-filtriert.
Das Filtrat wurde anschließend bei 4°C unter 1200 rpm für 5 min zentrifugiert. Das
Zellpellet wurde in 5 ml 4°C kaltem Erythrozyten-Lysepuffer resuspendiert und
eisgekühlt für 5 min zur Erythrozyten Eliminierung inkubiert. Diese Reaktion wurde
durch Zugabe von kaltem DMEM-Stopplösung gestoppt und durch einen weiteren
Zentrifugationschritt (1200 rpm; 4°C) pelletiert. Das Pellet wurde in 2-7 ml kalter
Resuspensionslösung aufgenommen, die Zellen in einer Neubauer Zählkammer gezählt
und durch eine erneute Zentrifugation pelletiert. Das Zellpellet wurde mit FACS Puffer
zu einer Konzentration von 0,5x106 Zellen/50µl resuspendiert und in eine 96 Well Platte
gegeben. Nach Zentrifugation bei 1200 rpm bei 4°C für 5 min wurde der Überstand
ausgeklopft und die unspezifischen Bindungen mit CD16/CD32 (Verrdünnung 1:200)
Antikörper 10 min lange geblockt. Eine weitere Zentrifugation Pelletierung erfolgte.
Anschließend wurde die CD31 Färbung (Verdünnung von 1:200) in einem Volumen
von 100 μl im Dunkeln für 20 min auf Eis durchgeführt. Für die Isotypenkontrolle
wurden IgGκ mit einer Verdünnung von 1:200 genutzt. Die Proben wurden mit
10 mg/ml PI zur Bestimmung der Anzahl der toten Zellen behandelt und mit FACSPuffer gewaschen. Nach anschließender Zentrifugation wurden die Zellen in 200 μl
FACS-Puffer aufgenommen und in FACS-Röhrchen überführt. Mittels ForwardSideward-Scatters, Totzellenausschluss (PI), Kompenstation der Autofluoreszenz und
der Isotypenkontrollen wurden die CD31 positiven Zellen auf die gesamt PI-negativen
Zell von 20-40 k normiert. (Siehe Diplomarbeit J. Dennemärker)
42
4 Ergebnisse
4.1
Cathepsin L in der Entwicklung von Tumorvorstufen im
Tg(K14HPV16) Mausmodell
Um die Funktion von Cathepsin L (CTSL) in der Tumorprogression untersuchen zu
können, wurden CTSL-defiziente Mäuse mit Tg(K14HPV16); ctsl+/+ Mäusen gekreuzt.
Die so erhaltenen Genotypen Tg(K14HPV16); ctsl+/+, Tg(K14HPV16); ctsl+/- und
Tg(K14HPV16); ctsl-/- wurden im Alter von 8, 16 und 24 Wochen histologisch und mit
biochemischen Verfahren untersucht.
Diese Zeitpunkte spiegeln konsekutiv Stadien der epidermalen Karzinogenese wieder,
die ausgewählt wurden, um den Einfluss von CTSL im Verlauf der Tumorprogression
untersuchen zu können. Dabei wurden je Genotyp und Zeitpunkt etwa 10 Mäuse
aufgearbeitet.
4.1.1 Expressionsanalyse von relevante Cathepsinen im Tg(K14HPV16)
Mausmodell CTSH, CTSL, CTSB, CTSD und CTSX
Sowohl den lysosomalen Cysteinprotease Cathepsin L (CTSL), Cathepsin H (CTSH),
Cathepsin B (CTSB) und Cathepsin X (CTSX) (Joyce and Hanahan, 2004) als auch den
Aspartylprotease Cathepsin D (CTSD) werden redundante Funktion während der
Tumorprogession zugesprochen. Um die Bedeutung von CTSL in der Karzinogenese
genauer bewerten zu können, wurden daher zusätzlich die Cathepsine CTSH, CTSB,
CTSD und CTSX untersucht, um einen eventuell vorhandenen kompensatorischen
Effekt durch diese Cathepsine erkennen zu können. Um mögliche RelokalisationsEffekte zu erkennen wurde sowohl die Expression der Proteasen als auch deren
Lokalisation im Gewebe untersucht.
43
4.1.1.1 Cathepsin L Expression
Die CTSL Expression wurde in der Ohrhaut sowohl auf der Transkriptionsebene durch
RT-PCR, als auch auf Proteinebene durch immunhistologische Färbung und CTSLAktivitätsassay untersucht (Abbildung 4, 5 und 6).
Abbildung 4: CTSL Expression
+/+
mRNA Cathepsin L / mRNA β-Aktin
Quantitative PCR von
Tg(K14HPV16);ctsl+/+ und
Tg(K14HPV16);ctsl-/- Mäusen im
Alter von 8, 16 und 24 Wochen.
Als interner Standard wurde ßAktin in einer Standardverdünnungsreihe von cDNA (0,1
ng; 1 ng; 10 ng; 100 ng) eingesetzt.
Die Quantifizierung des Cathepsin
L erfolgte anhand der ß-Aktin
Standardkurve. Zur ß-Aktin und
CTSL Amplifikation wurden
spezifische Primer benutzt. Die
eingesetzte Probenmenge war 1ng
cDNA.
Tg(K14-HPV16);ctsl
-/Tg(K14-HPV16);ctsl
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
8 weeks
16 weeks
24 weeks
Abbildung 5: CTSL Histologie
Tg(K14HPV16);ctsl-/-
Tg(K14HPV16);ctsl+/+
Enzymatischer Umsatz + Ca074
(Z-Phe-Arg-AMC umol/min*ug Protein)
2,5
Immunhistologische Färbung von
CTSL (braun) in den 5 μm dicken
Ohrhautschnitten von 16 Wochen
alten Mäusen. Die linke Seite
beschreibt den Genotyp
Tg(K14HPV16);ctsl+/+, die rechte
den Tg(K14HPV16);ctsl-/-.
+/+
Abbildung 6: CTSL Aktivität
Tg(K14-HPV16);ctsl
-/Tg(K14-HPV16);ctsl
Aktivitätsbestimmung von CTSL
erfolgte durch die Prozessierung
vom Substrat Z-Phe-Arg-AMC bei
zeitgleicher Inhibierung der
lysosomalen Cysteinprotease
CTSB durch Ca074. Mittels einer
AMC Eichgerade wurde der
Substratumsatz pro min auf die
Proteinkonzentration berechnet.
Durch die Zugabe von 150 nM
Inhibitor E64 erfolgte eine interne
Cysteinprotease Kontrolle.
2,0
1,5
1,0
0,5
0
0
0,0
8 Wochen
16
24 Wochen
Wochen
16 Wochen
Wochen 24
-E64
44
Dabei zeigte sich in der Tg(K14HPV16);ctsl+/+ eine deutliche mRNA-Expression, von
CTSL in der Haut, die während des untersuchten Zeitverlauf eine gleich bleibend starke
mRNA
Expression
aufweist
(Abbildung
4).
In
der
korrespondierenden
immunhistologischen Färbung sind deutliche Zell- und lokalistationsabhängige
Unterschiede von CTSL zu erkennen. Die stärkste Anfärbung befindet sich am Stratum
Corneum der Epidermis und phasenweise in der Dermis. In den Tg(K14HPV16);ctsl-/hingegen ist erwartungsgemäß keine CTSL mRNA in der RT-PCR, als auch in der
Immunhistologischern Untersuchung vorzufinden (Abbildung 4; 5). Bei der CTSL
Aktivitätsbestimmung konnte überraschenderweise in der Tg(K14HPV16);ctsl-/- Maus
eine leichte Prozessierungs-Aktivität gegenüber dem Substrat Z-Phe-Arg-AMC nach
spezifischer CTSB Inhibierung mit dem etablierten CTSB Ca074 Inhibitor
nachgewiesen werden. Durch Zugabe eines bekannten spezifischen Cathepsin
Cysteinprotease
Inhibitors
E64
konnte
die
gemessene
Substrat-Prozessierung
vollständig verhindert werden, sodass die zuvor detektierte Substratspaltung einer
Cathepsin Cysteinprotease Protease zugeschrieben werden kann.
Zudem ist die gemessene unspezifische Prozessierung im Tg(K14HPV16);ctsl-/Genotyp gering.
Der Aktivitätsverlauf über die drei Zeitpunkte 8, 16 und 24 Wochen zeigte eine dreifach
erhöhte CTSL Aktivität in der 16. Woche im Vergleich zur 8. und 24. Woche
(Abbildung 6). Da eine eindeutige Expressionszuordnung in der Epidermis der Haut
von CTSL im Stratum Corneum stattfindet, stellt sich die Frage, ob sich das CTSL
Expressionsmuster
über
den
Zeitraum
der
prämalignen
Läsionen
und
im
Plattenepithelkarzinom mit verschiedene Differenzierungsgrad ändert (Abbildung 5; 7).
Es wurde festgestellt, dass bei steigendem Tumorgrad die CTSL immunhistologische
Färbung abnimmt und dem CTSL kein eindeutiges Expressionsmuster unter
verschiedener Anaplasie aufweist (Abbildung 7).
45
Abbildung 7: HE-Färbungen und CTSL Immunhistologie von 5 μm dicken Ohrhautschnitten und
steigender Anaplasie der Plattenepithelkarzinomen von Tg(K14HPV16);ctsl+/+ Mäusen.
4.1.1.2 Cathepsin B Expression
Die mRNA Expressionsanalyse von CTSB zeigt in Tg(K14HPV16);ctsl+/+ und
Tg(K14HPV16);ctsl-/- Mäusen eine abnehmende CTSB Expression von der 8. zur 16.
Woche, die sich dann bis zur 24. Woche stabilisiert. Auffallend hierbei ist, dass keine
kategorische Expressionsniveau-Unterschied in CTSB im Tg(K14HPV16);ctsl+/+ und
Tg(K14HPV16);ctsl-/- Gewebe vorliegt (Abbildung 8).
+/+
Tg(K14-HPV16);ctsl
-/Tg(K14-HPV16);ctsl
mRNA Cathepsin B / mRNA β-Aktin
6
Quantitative PCR von
Tg(K14HPV16);ctsl+/+ und
Tg(K14HPV16);ctsl-/- Mäusen im Alter
von 8, 16 und 24 Wochen. Als interner
Standard wurde ß-Aktin in einer
Standardverdünnungsreihe von cDNA
(0,1 ng; 1 ng; 10 ng; 100 ng) eingesetzt.
Die Quantifizierung des Cathepsin B
erfolgte anhand der ß-Aktin
Standardkurve. Zur ß-Aktin und CTSB
Amplifikation wurden spezifische
Primer benutzt. Die eingesetzte
Probenmenge war 1 ng cDNA.
5
4
3
2
1
0
Abbildung 8: CTSB Expression &
Aktivitätsverhältnis zu CTSL
8 weeks
16 weeks
24 weeks
46
Abbildung 9: CTSB Histologie
Immunhistologische Färbung von CTSB
(braun) in den 5 μm dicken
Ohrhautschnitten von 16 Wochen alten
Mäusen. Linke Seite zeigt den Genotyp
Tg(K14HPV16);ctsl+/+, die rechte den
Tg(K14HPV16);ctsl-/- .
Tg(K14HPV16);ctsl-/-
Tg(K14HPV16);ctsl+/+
+/+
Tg(K14-HPV16);ctsl
-/Tg(K14-HPV16);ctsl
p<0,01
Enzymatischer Umsatz (CTSB)
(Z-Phe-Arg-AMC umol/min*ug Protein)
18
Abbildung 10: CTSB Aktivität
16
Aktivitätsbestimmung von CTSB
erfolgte durch die Prozessierung vom
Substrat Z-Phe-Arg-AMC bei
zeitgleicher Inhibierung der lysosomalen
Cysteinprotease CTSB durch Ca074.
Der so inhibierte Anteil entspricht der
CTSB Aktivität und wurde mittels einer
AMC Eichgerade als Substrat Umsatz
pro min pro Protein berechnet und
dargestellt.
14
12
10
8
6
4
2
0
8 Wochen
16 Wochen
24 Wochen
Im Gegensatz zu CTSL (Abbildung 5) zeigt die immunhistologische Färbung in der
Hornschicht der Ohrepidermis kaum eine CSTB positive Färbung, wohingegen die
Expression ubiquitär in den anderen Schichten der Epidermis vorzufinden sind.
(Abbildung 9). Vergleicht man die CTSB Aktivität zwischen beiden Genotypen,
erkennt man im zunehmenden Alter eine signifikante (p< 0,01) Aktivitätsabnahme von
CTSB in den Tg(K14HPV16);ctsl+/+, im Vergleich der 8. zur 24. Woche (Abbildung
10).
4.1.1.3 Cathepsin X Expression
Die CTSX mRNA Expression zeigt sowohl zwischen den verschiedenen Genotypen als
auch über den untersuchten Zeitraum keine signifikanten Unterschiede (Abbildung 11).
Es kam jedoch zu einer eindeutige Abnahme der CTSX mRNA Konzentration, die
bereits in der 16 Woche im Tg(K14HPV16);ctsl-/- Genotyp stattfand. Wohingegen die
Reduktion der CTSX mRNA Konzentration in dem Tg(K14HPV16);ctsl+/+ Genotyp erst
in
der
24.
Woche
auf
das
gleiche
CTSX
mRNA
Niveau
sank.
Die
Gewebezellzuordnung des CTSX erfolgte über die immunhistologische Untersuchung.
Es kam vorwiegend zur Stromalen CTSX Anfärbung vereinzelter Zellen. Wohingegen
47
nur eine geringe Anzahl von Postiv gefärbten CTSX Zellen in der Epidermis
forzufinden sind. (Abbildung 12).
Abbildung 11: CTSX Expression
+/+
mRNA Cathepsin X / mRNA β-Aktin
Tg(K14-HPV16);ctsl
-/Tg(K14-HPV16);ctsl
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
8 Wochen
16 Wochen
24 Wochen
Quantitative PCR von
Tg(K14HPV16);ctsl+/+ und
Tg(K14HPV16);ctsl-/- Mäusen im
Alter von 8, 16 und 24 Wochen.
Als interner Standard wurde ßAktin in einer Standardverdünnungsreihe von cDNA (0,1
ng; 1 ng; 10 ng; 100 ng) eingesetzt.
Die Quantifizierung des CTSX
erfolgte anhand der ß-Aktin
Standardkurve. Zur ß-Aktin und
CTSX Amplifikation wurden
spezifische Primer benutzt. Die
eingesetzte Probenmenge war 1 ng
cDNA.
Abbildung 12: CTSX Histologie
Immunhistologische Färbung von
CTSX (braun) in den 5 μm dicke
Ohrhautschnitten von 16 Wochen
alten Mäusen. Die linke Seite
beschreibt den Genotyp
Tg(K14HPV16);ctsl+/+, die rechte
den Tg(K14HPV16);ctsl-/-.
Tg(K14HPV16);ctsl+/+
Tg(K14HPV16);ctsl-/-
Abbildung 13:
CTSX Western Blot
Western-Blot von Hautlysaten, mit
den zwei unterschiedlichen
Genotypen Tg(K14HPV16);ctsl+/+
und Tg(K14HPV16);ctsl-/- im Alter
von der 8. bis zur 24. Woche.
Detektiert mit CTSX Antikörper.
ß-Aktin dient als BeladungsKontrolle.
Die Proteinanalyse mittels Western-Blot zeigt keinen systematische Unterschied in der
CTSX Proteinkonzentrationen zwischen den Genotypen Tg(K14HPV16);ctsl+/+ und
Tg(K14HPV16);ctsl-/-. Einzig Auffällig ist der ansteigende CTSX Gehalt mit
zunehmendem
Alter
der
Mäuse
(Abbildung
13).
Betrachtet
man
die
immunhistologische Färbung und der stark gefärbte Einzelzellen, könnte der
ansteigende CTSX Proteinanteil von Entzündungszellen herrühren (Abbildung 12).
48
4.1.1.4 Cathepsin D Expression
Abbildung 14: CTSD Expression
+/+
Tg(K14-HPV16);ctsl
-/Tg(K14-HPV16);ctsl
mRNA Cathepsin D / mRNA β-Aktin
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
8 Wochen
16 Wochen
24 Wochen
Quantitative PCR von
Tg(K14HPV16);ctsl+/+ und
Tg(K14HPV16);ctsl-/- Mäusen im
Alter von 8, 16 und 24 Wochen.
Als interner Standard wurde ßAktin in einer Standardverdünnungsreihe von cDNA (0,1
ng; 1 ng; 10 ng; 100 ng) eingesetzt.
Die Quantifizierung des Cathepsin
D erfolgte anhand der ß-Aktin
Standardkurve. Zur ß-Aktin und
CTSD Amplifikation wurden
spezifische Primer benutzt. Die
eingesetzte Probenmenge war 1 ng
cDNA.
Abbildung 15: CTSD Histologie
Tg(K14HPV16);ctsl+/+
Tg(K14HPV16);ctsl-/-
Immunhistologische Färbung von
CTSD (braun) in den 5 μm dicke
Ohrhautschnitten von 16 Wochen
alten Mäusen. Die linke Seite
beschreibt den Genotyp
Tg(K14HPV16);ctsl+/+, die rechte
den Tg(K14HPV16);ctsl-/-.
Abbildung 16:
CTSD Western Blot Analyse
Western-Blot von Hautlysaten mit
den zwei verschiedenen Genotypen
Tg(K14HPV16);ctsl+/+ und
Tg(K14HPV16);ctsl-/- im Alter von
der 8. bis zur 24. Woche.
Detektiert mit CTSD Antikörper.
Die mRNA Quantifizierung von CTSD zeigt keinen signifikanten Unterschied, weder
bezüglich der verschiedenen Tg(K14HPV16) Genotypen als auch im Zeitverlauf.
(Abbildung 14). Die immunhistochemische Untersuchung zeigt eine zunehmende
Intensität der CTSD Färbung vom basalen zum suprabasalen Epidermisanteil
(Abbildung 15). Der Western-Blot zeigt eine höhere CTSD Konzentration im
Tg(K14HPV16);ctsl-/- als im Tg(K14HPV16);ctsl+/+ Gewebe, bei gleich bleibendem
Konzentrationsverhältnis über den Zeitverlauf (Abbildung 16). Der erhöhte CTSD
Proteinkonzentrations- Befund konnte bereits an CTSL-defizienten Schilddrüsen und
Lungenepithelzellen nachgewiesen werden und wird durch die fehlende Prozessierung
von CTSL am CTSD erklärt (Abbildung 16) (Friedrichs et al., 2003; Wille et al., 2004).
49
4.1.1.5 Cathepsin H Expression
Abbildung 17: CTSH Expression
+/+
Tg(K14-HPV16);ctsl
-/Tg(K14-HPV16);ctsl
mRNA Cathepsin H / mRNA β-Aktin
2,0
1,6
1,2
0,8
0,4
0,0
8 Wochen
16 Wochen
Quantitative PCR von
Tg(K14HPV16);ctsl+/+ und
Tg(K14HPV16);ctsl-/- Mäusen im
Alter von 8, 16 und 24 Wochen
alten Mäusen. Als interner
Standard wurde ß-Aktin in einer
Standardverdünnungsreihe von
cDNA (0,1 ng; 1 ng; 10 ng; 100
ng) eingesetzt. Die Quantifizierung
des Cathepsin L erfolgte anhand
der ß-Aktin Standardkurve. Zur ßAktin und CTSH Amplifikation
wurden spezifische Primer benutzt.
Die eingesetzte Probenmenge war
1 ng cDNA.
24 Wochen
Abbildung 18: CTSH Histologie
Tg(K14HPV16);ctsl+/+
Tg(K14HPV16);ctsl-/-
Immunhistologische Färbung von
CTSH (braun) in den 5 μm dicken
Ohrhautschnitten von 16 Wochen
alten Mäusen. Die linke Seite
beschreibt den Genotyp
Tg(K14HPV16);ctsl+/+, die rechte
den Tg(K14HPV16);ctsl-/-.
Bei der CTSH mRNA Konzentrationsbestimmung konnte kein systematischer
Unterschied in den beiden analysierten Genotypen sowohl im Zeitverlauf als auch im
Tg(K14HPV16) Genotypen Vergleich festgestellt werden (Abbildung 17). In der
immunhistologischen Analyse konnte eine ubiquitäre Verteilung von CTSH in der
Epidermis gezeigt werden (Abbildung 18).
50
4.1.1.6 Cathepsin E Expression
In der immunhistologischen Untersuchung von CTSE konnte eine schwache Expression
der Protease in der gesamten Epidermis festgestellt werden (Abbildung 19). Vereinzelte
Zellen zeigen hingegen eine sehr starke CTSE Färbung, die überwiegend im Stroma
befindlich und nur vereinzelt in der Epidermis vorliegt. Hierbei könnte es sich und
aufgrund der Morphologie um neutrophile Granulozyten handeln (Abbildung 19; links).
Um dies zu verifizieren, wurde eine immunologische Färbung der neutrophilen
Granulozyten durchgeführt (Abbildung 19 rechts). Die Ergebnisse zeigen ein ähnliches
Zell-positiv Muster wie die, der CTSE positiv gefärbten Zellen (Abbildung 19; rechts).
Eine kolokalisation-Studie wurde bisher noch nicht durchgeführt.
CTSE
CTSE
Tg(K14HPV16);ctsl-/-
Tg(K14HPV16);ctsl+/+
Neutrophile
Tg(K14HPV16);ctsl-/-
Abbildung 19: Immunhistologie zur Detektion von CTSE und Neutrophile Granulozyten
Immunhistologische Färbung von CTSE mit den Genotyp Tg(K14HPV16);ctsl+/+ und
Tg(K14HPV16);ctsl-/- (linke Seite). Eine neutrophile Granulozyten Färbunge wird rechts dargestellt.
4.1.2 Histomorphologische Veränderung der Epidermis im Tg(K14HPV16)
Mausmodell
Die Tumorentwicklung der transgenen K14HPV16 Mäuse durchläuft verschiedene
morphologische
Stadien,
die
über
Hyperproliferation,
Dysplasie
hin
zum
Plattenepithelkarzinom führen. Um die Auswirkungen der CTSL-Defizienz auf diese
verschiedenen prämalignen Stadien untersuchen zu können, wurde eine systematische
histomorphologische Bewertung an Tg(K14HPV16);ctsl+/+ und Tg(K14HPV16);ctsl-/des Ohrhautgewebes der verschiedenen Altersstufen von 8, 16 und 24 Wochen
durchgeführt.
16 Wochen
8 Wochen
24 Wochen
Abbildung 20:
Analyse der
neoplastischen
Läsionen
HE-Färbungen
von 5 μm dicken
Ohrhautschnitten
an Mäusen im
Alter von 8, 16
und 24 Wochen
mit den
Genotypen von
Tg(K14HPV16);
ctsl+/+ und
Tg(K14HPV16);
ctsl-/-.
Tg(K14HPV16);ctsl-/-
Tg(K14HPV16);ctsl+/+
51
Betrachtet man den Verlauf der morphologischen Veränderung der Epidermis über die
Zeit, wird eine deutliche Änderung des Hyperplasie-Stadiums (8. Woche) hin zum
Dyplasie-Stadium feststellbar. Die an der Ohrhaut angewandten Bewertungskriterien
beinhalten die Analyse der morphologischen Charakteristika der Epidermis und die
zelluläre Veränderungen der Keratinozyten, die durch eine HE-Färbung sichtbar
gemacht wurden (Abbildung 20).
+/+
100
Tg(K14HPV16);ctsl p<0,05
-/Tg(K14HPV16);ctsl
n.s
Abbildung 21: Zeitbezogener DysplasieAnteil im Ohrhautgewebe
Dysplasie (%)
90
80
70
60
Darstellung der analysierten Genotypen und
altersbezogen Dysplasiefälle. Eine HEFärbung wurde mit 5 μm dicken
Ohrhautschnitten durchgeführt. Mittels
Mikroskopie ist sowohl die Morphologie
der Keratinozyten als auch die Struktur der
Epidermis bewertet worden, um die
epidermale Veränderung bestimmen zu
können. p<0,05 (Student T-Test).
p<0,1
50
40
30
20
10
0
1
8 Wochen
2
16 Wochen
3
24 Wochen
Dabei wurde deutlich, dass im Tg(K14HPV16),ctsl-/- Gewebe die Ausbildung der
prämalignen Läsionen schneller voranschreitet als im Tg(K14HPV16),ctsl+/+ Genotyp.
Insbesondere in der 16. Woche zeigt sich ein signifikanter Unterschied (p<0,05). 50%
der Tg(K14HPV16);ctsl+/+ weisen dysplastische Merkmale auf, wohingegen Genotyp
Tg(K14HPV16);ctsl-/- Mäuse bereits zu 100% Dysplasien Vorliegen (Abbildung 21).
52
4.1.3 Keratinozyten Proliferation und apoptotische im Tg(K14HPV16)
Mäusenmodell
Um ein genaueres Verständnis für die epidermalen Veränderungen zwischen den
untersuchten Genotypen zu erhalten, wurden die Proliferation und die Apoptose in der
Epidermis untersucht. Die Proliferation wurde durch eine immunhistologische Färbung
mit den Proliferationsmarkern Ki67-Antigen (Ki67) und Proliferation Zell nukleäres
Antigen (PCNA) an den Ohrgewebeschnitten durchgeführt. In beiden Fällen zeigten die
88Wochen
Wochen
16
Woche
16Wochen
Wochen
16
24
Wochen
24 Wochen
Abbildung 22:
Proliferation
der Ohrhaut
+/+
Tg(K14HPV16);ctsl
Tg(K14HPV16);ctsl-/-Tg(K14HPV16);ctsl
+/+
Proliferationsmarker gleiche Ergebnisse.
Ki67-Färbungen
(braun) von 5 μm
dicken
Ohrhautschnitten
im Alter 8, 16
und 24 Wochen
mit den Maus
Genotypen von
Tg(K14HPV16);
ctsl+/+ und
Tg(K14HPV16);
ctsl-/-.
Die immunhistologisch mit Ki67 oder PCNA gefärbten Keratinozyten wurden dabei in
den Ohrhautschnitten ausgezählt (Abbildung 22). Die Normalisierung der positiv
gefärbten
Keratinozyten
erfolgte
über
die
Gesamtzellzahl
der
epidermalen
Basalzellschicht. Die Darstellung des genotypischen Unterschieds der Proliferation
erfolgt über das Verhältnis zwischen positiv gefärbten versus negativ detektierten
Keratinozyten. Die beiden Genotypen weisen unterschiedliche Zellteilungsraten auf.
Insbesondere in der 16. und der 24. Woche kam es zu einer signifikanten Erhöhung im
Tg(K14HPV16);ctsl-/- Gewebe (Abbildung 23).
53
Abbildung_23:
Ki67 positiv/negativ
Verhältnis (Ki67 positiv/Ki67 negativ)
+/+
K14HPV16;ctsl
-/K14HPV16;ctsl
p<0,0001
Darstellung von Ki67
positiven/Ki67 negativen Zellen in
Ohrpräparaten von Maus
Genotypen Tg(K14HPV16);ctsl+/+
und Tg(K14HPV16);ctsl-/- Im
Alter von 8, 16 und 24 Wochen.
Die epidermalen Zellen wurden
ausgezählt und auf die basale
Zellschicht normiert. (Student TTest)
p<0,0001
5
p<0,1
4
3
2
1
0
8 Wochen
8 Wochen
16 Wochen
16
Wochen
24 Wochen
24
Wochen
Da die Tumor-Entstehung eine Akkumulation der Zellen und somit eine zelluläre
Expansion darstellt, die nicht nur definitionsgemäß von der zellulären Proliferation
abhängig ist, sondern auch durch eine Zelltod-Resistenz (Bergers et al., 1998) erreicht
werden kann, wurde der Zelltod in der Epidermis und Karzinomen von
Tg(K14HPV16);ctsl+/+ und Tg(K14HPV16);ctsl-/- Mäusen untersucht. Die Detektion der
Apoptose erfolgte mittels TUNEL-Färbung, hierbei erfolgt der Nachweis des Zelltods
über die DNA-Fragmentierung. (Gavrieli et al., 1992; Rojo and Gonzalez, 1998).
A
D
B
E
C
F
G
Abbildung 24: Apoptotische Zellen in der Epidermis und Plattenepithelkarzinom
Die Detektion von Apoptose erfolgte anhand der DNA-Fragmentierung mittels TUNEL-Färbung (braun)
(Gavrieli et al., 1992; Rojo and Gonzalez, 1998): Dargestellt sind eine Negativkontrolle (A) als auch eine
Positivkontrolle, die durch eine DNAse I Behandlung und die daraus resultierende DNA Fragmentierung
von Maus Ohrhaut (B) und Tumor Gewebe (C) erzeugt worden. Es sind 16 Wochen alte 5µm dicken
Maus-Ohrhaut und Tumor Schnitte von K14HPV16 (D),(F) und K14HPV16; ctsl-/- (E), (G) dargestellt.
54
Dabei wurde eine geringe Anzahl an TUNEL-positiven Zellen in der Epidermis
gefunden, die nahezu vollständig im Corneum oder in der suprabasalen Zellschicht
detektiert wurden. Weiter konnten keine Unterschiede zwischen den Genotypen
Tg(K14HPV16);ctsl-/- und Tg(K14HPV16);ctsl+/+ festgestellt werden (Abbildung 24 D,
E). Im Tumor konnte man vereinzelten TUNEL-positiven Zellen detektieren, denen
aber kein Zusammenhang mit dem CTSL-Genotyp nachgewiesen werden konnte.
4.1.4 Differenzierung der Keratinozyten
Es folgte nach der Untersuchung von Proliferation und der Apoptose die Betrachtung
der Differenzierung von Keratinozyten in der Epidermis. Es konnte da bereits gezeigt
werden, dass die Differenzierung der Keratinozyten und deren Strukturproteine einen
direkten Einfluss auf die Signaltransduktion und somit auch auf die Zellteilung ausüben
können (Fuchs and Green, 1980; Gilbert et al., 2001; Inada et al., 2001; Liao and
Omary, 1996; Marceau et al., 2001). Um einen Einduck zu erhalten, ob der in dem
jeweiligen Genotyp detektierte spezifische Unterschied der Zellteilungsrate auf die
Keratinozytenausdifferenzierung
zurückzuführen
ist,
wurde
der
Keratinozyten
Differenzierungsgrad im Verlauf der Tumorprogression untersucht. Dies erfolgte durch
immunhistochemische Färbung gegen Cytokeratin 5 (K5) und Cytokeratin 10 (K10)
von Tg(K14HPV16);ctsl-/- und Tg(K14HPV16);ctsl+/+ Gewebe im Alter von 8, 16 und
Tg(K14HPV16);ctsl+/+
24 Wochen (Abbildung 25, 26)
8 Wochen
16
16Woche
Wochen
24 Wochen
Abbildung 25:
Keratinozyten
Differenzierung
Tg(K14HPV16);ctsl-/-
Cytokeratin 5
immunhistochemische
Färbungen
(braun) von 5 μm
dicken Ohrhautschnitten im
Alter von 8, 16
und 24 Wochen,
mit den
Genotypen von
Tg(K14HPV16);
ctsl+/+ und
Tg(K14HPV16);
ctsl-/-.
Die Cytokeratin 5 immunhistochemische Färbung zeigt eine unveränderte basale K5
Expression
in
der
Epidermis.
Sowohl
der
Genotyp-Vergleich
zwischen
55
Tg(K14HPV16);ctsl-/- und Tg(K14HPV16);ctsl+/+ als auch die untersuchten Zeitpunkte
von 8, 16 und 24 Wochen zeigten keine positionelle Veränderung der Cytokeratin 5
positiven Keratinozyten. Sie und sind weiterhin im basalen Anteil der Epidermis
8 Wochen
Tg(K14HPV16);ctsl-/-
Tg(K14HPV16);ctsl+/+
vorzufinden (Abbildung 25).
16
16Woche
Wochen
24 Wochen
Abbildung 26:
Keratinozyten
Differenzierung
Cytokeratin 10
immunhistochemische
Färbungen
(braun) von 5μm
dicken Ohrhautschnitten im
Alter von 8, 16
und 24 Wochen,
mit den
Genotypen von
Tg(K14HPV16);
ctsl+/+ und
Tg(K14HPV16);
ctsl-/-.
Auch die Cytokeratin 10 Färbung zeigt im Zeitverlauf keinen Unterschied sowohl
zwischen den CTSL Genotypen als auch den analysierten Zeitpunkten. Die positiv
gefärbten Keratinozyten befinden sich erwartungsgemäß im suprabasalen Anteil der
Epidermis (Abbildung 26).
4.1.5 Angiogenese
Die Vaskularisierung eines Tumors ist ab einer gewissen Größe zwingend notwendig.
Dabei unterschiedet man zwischen einer Vor-Vaskularisierungsphase und einer
Vaskularisierungsphase, die bei bereits gebildetem Tumor stattfindet (Folkman, 1992).
In dem in dieser Studie angewandten Tg(K14HPV16) Mausmodell ist bekannt, dass in
den prämalignen Tumorstadien die Angiogenese insbesondere um die 16. Lebenswoche
stattfindet (Coussens et al., 1999). Da CTSL ebenfalls eine Rolle in der Angiogenese
(Felbor et al., 2000) und der Neovaskularisierung (Urbich et al., 2005) zugeschrieben
wird, wurden die Ohrhautgewebe- und Tumorschnitte auf die Expression von CD31
platelet-endothelial cell adhesion molecule (PECAM)-1 und dem Von Willebrand
Faktor (vwf) untersucht, welche beide spezifisch auf Kapillar-Endothelzellen und
56
gegebenenfalls Lymphgefäßen, exprimiert werden (Abbildung 27, 28) (DeLisser et al.,
16
16 Wochen
Woche
8 Wochen
Tumor
24 Wochen
Tg(K14HPV16);ctsl-/-
Tg(K14HPV16);ctsl+/+
1993).
Abbildung 27: CD 31 Färbung
CD31 immunhistochemische Färbungen (rot) von 5μm dicken kryokonserviertem Ohrhautgewebe im
Alter von 8, 16 und 24 Wochen und Tumorgewebeschnitte, mit den Genotypen von
Tg(K14HPV16);ctsl+/+ und Tg(K14HPV16);ctsl-/-
Tg(K14HPV16);ctsl+/+
Tg(K14HPV16);ctsl-/-
Abbildung 28: Immunhistologische Färbung der Blutgefäße an Ohrhaut.
Die Blutgefäße wurden mittels einer vwf immunhistochemische Färbungen (braun) von 5μm dicken
Ohrhautschnitten im Alter von 16 Wochen, mit den Genotypen von Tg(K14HPV16);ctsl+/+ und
Tg(K14HPV16);ctsl-/- visualisiert. In beiden Schnitten sind deutliche kleine Blutgefäße insbesondere nahe
der Basalzellschicht sichtbar (Siehe Pfeil)
Dabei konnte festgestellt werden, dass die Anzahl der CD31 positiven Zellen und somit
der Kapillarisierungsgrad in den Gewebeschnitte von der 8. bis zur 24. Woche zunimmt.
Insbesondere nimmt die Anzahl der CD31 positiven gefärbten Endothelzellen nahe der
basalen
Keratinozytenschicht
in
der 16.
Woche
zu.
Beim
Vergleich
von
Tg(K14HPV16);ctsl+/+ und Tg(K14HPV16);ctsl-/- Mausgewebe mittels der CD31
Färbung wurde kein offensichtlicher Unterschied sowohl in den prämalignen Läsionen
57
als auch dem Tumorgewebe nachgewiesen (Abbildung 27). Aufgrund des schnellen
Ausbleichens der Floureszens im Gewebe der CD31 Färbung und der Schwierigkeit der
zeitgleichen Observierung der Gewebemorphologie während einer Floureszensfärbung
wurde eine weitere Antikörper-Färbung gegen den „Von Willebrand Faktor“ (vwf)
etabliert. Die Anfärbung erfolgte hierbei über eine Peroxidase-Reaktion, die sowohl
eine zeitgleiche Detektion der Blutgefäße als auch eine vollständige Betrachtung der
Gewebemorphologie gewährleistet. Dabei stand der zuvor ermittelte kritische Zeitpunkt
der Angiogenese in der 16. Woche im Fokus. Mittels der durchgeführten vwf
immunhistochemischen Färbung konnte festgestellt werden, dass kleinste Blutgefäße im
Bereich der basalen Zellschicht in größerer Anzahl im 16 Wochen altem
Tg(K14HPV16);ctsl-/-
Gewebe
vorzufinden
sind
als
Tg(K14HPV16);ctsl+/+
Gewebe
(Abbildung
28).
Die
im
Vergleich
erhöhte
Anzahl
zum
der
Mikroblutgefäße könnte von dem des schnelleren Fortschreiten der prämalignen Läsion
in Tg(K14HPV16);ctsl-/- Mäusen herrühren beziehungsweise auf einen direkten Einfluss
von CTSL in der Initiation der Angiogenese schließen lassen. Um die genaue Ursache
der erhöhten Anzahl der Mikroblutgefäße nahe der basalen Keratinozyten untersuchen
zu können, bedarf es weiterer Analysen.
Aufgrund der limitierten quantitativen Aussagekraft der immunhistologischen
Untersuchung wurde eine FACS Analyse an frischen Hautzellen mittels CD31
Antikörperfärbung durchgeführt (Abbildung 29).
58
% PI negativer Zellen
7
+/+
ctsl
-/ctsl
6
CD 31
A
5
4
3
2
1
0
B
TgWT
PI
ctsl+/+
ctsl-/-
+/+
Tg(K14HPV16)ctsl
-/Tg(K14HPV16)ctsl
5
CD 31
% PI negativer Zellen
6
4
3
2
1
0
wt oben
PI
Abbildung 29: FACS-Analyse von CD31 positiven Zellen
Frisches Mausohrgewebe von 16 Wochen alten Mäusen mit den Genotypen wt (n=3) und ko (n=6) [A]
und Tg(K14HPV16);ctsl+/+ und Tg(K14HPV16);ctsl-/- [B] wurden für die FACS Analyse verwendet. Der
prozentuale Anteil der CD31 positiven Lebendzellen der oberen Fraktionen, oberer Quader des Dotplots,
wurde mittels eines Balkendiagramms dargestellt
Dabei erfolgte die Normalisierung der positiv gefärbten Zellen auf die GesamtLebendzellzahl. Tote Zellen wurden durch Propidium Jodid (PI) positive Färbung
ausgeschlossen. Betrachtet man die detektierten CD31 positiven Zellen, konnten zwei
unterschiedliche
CD31
positive
Populationen
durch
die
Fluoreszenzintensität
differenziert werden. Aufgrund der schlechten Darstellung der CD31 Population im
schwachen Fluoreszenzbereich und der dadurch erschwerten Selektion durch Setzen
eines Zählfensters wurden ausschließlich die stark fluoreszierenden CD31 positiven
Zellen quantifiziert (Abbildung 29). Beim Vergleich von ctsl+/+ und cts-/- Hautgewebe
konnte eine leicht erhöhte Anzahl der CD31 positiven Zellen in den cts-/- Mäusen
festgestellt werden (Abbildung 29A). Vergleicht man diesen Befund bei den
Tg(K14HPV16);ctsl+/+ und den Tg(K14HPV16);ctsl-/- Mäusen, ist auch hier ein leicht
erhöhter CD31 positiver Zelleanteil feststellbar (Abbildung 29B). Ein Vergleich
zwischen transgenem und nicht-transgenem Gewebe kann aufgrund der Normalisierung
auf die Gesamtzellzahl nicht durchgeführt werden.
59
Inzidenz Studie von Tg(K14HPV16);ctsl+/+, ctsl+/-, und ctsl-/-
4.2
Um einen vollständigen Eindruck des Effekts von CTSL in der Tumorigenese in dem
Tg(K14HPV16) Mäusemodell zu erhalten, wurden Untersuchungen an den über die Zeit
entwickelten Plattenepithelkarzinomen selbst durchgeführt. Dabei wurden die Mäuse
über einen maximalen Zeitraum von 52 Wochen beobachtet und während diesem
Zeitraum auf den ersten palpablen Tumor hin untersucht. Der Wachstumsverlauf eines
Tumors wurde bis zu einem Endvolumen von 1cm3 verfolgt. Bei Erreichen des TumorEndvolumens wurden Gewebeproben des Tumors, der Ohrhaut, der Rückenhaut und
Lymphknoten gesammelt und analysiert.
4.2.1 Karzinomentwicklung und Mortalitätsverlauf
Die Observierung des Tg(K14HPV16) Mausmodells zeigte Unterschiede im TumorErstauftreten, im altersbezogenen Zeitpunkt des Auftretens von 1cm3 Tumoren, der
Wachstumsgeschwindigkeit der Tumore und der Mortalitätsrate zwischen den
Tg(K14HPV16);ctsl+/+, Tg(K14HPV16);ctsl+/- und Tg(K14HPV16);ctsl-/- Genotypen
(Abbildung 30).
B
A
90
-/-
100
Tg(K14-HPV16); ctsl (n=9)
+/Tg(K14-HPV16); ctsl (n=16)
+/+
Tg(K14-HPV16); ctsl (n=35)
90
3
(Erster papabl Tumor) (%)
Tg(K14-HPV16); ctsl (n=14)
+/Tg(K14-HPV16); ctsl (n=19)
+/+
Tg(K14-HPV16); ctsl (n=26)
Tumors Größe von 1.0 cm (%)
-/-
100
80
70
60
50
40
30
20
ht vs. ko p<0.01
wt vs. ko p<0.001
ht vs. wt n.s.
10
0
0
16
20
24
28
32
36
Alter (Wochen)
40
44
48
52
80
70
60
50
40
30
20
ht vs. ko p<0.001
wt vs. ko p<0.01
ht vs. wt n.s.
10
0
0
16
20
24
28
32
36
40
44
48
52
Alter (Wochen)
Abbildung 30: Beide Graphen beinhalten die Genotypen Tg(K14HPV16);ctsl+/+, Tg(K14HPV16);ctsl+/-,
und Tg(K14HPV16);ctsl-/-. Graph A beschreibt das Erstauftreten der Tumore bezüglich des Genotyps und
der Zeit. Graph B beschreibt das Alter der Mäuse bis zum Erreichen des Tumorvolumens von 1cm3.
60
A
100
wt vs. ko p<0.001
ht vs. ko p<0.001
wt vs. ht n.s.
90
8
Mortalität Verlauf (%)
Zeitdauer zum erreichen von 1cm
grossen Tumoren (Wochen)
3
B
10
6
4
2
80
70
60
50
40
30
-/-
20
Tg(K14-HPV16); ctsl (n=50)
+/Tg(K14-HPV16); ctsl (n=38)
+/+
Tg(K14-HPV16); ctsl (n=88)
10
0
0
1
2
3
-/+/Tg(K14HPV16)
Tg(K14HPV16);ctsl Tg(K14HPV16);ctsl
0
16
20
24
28
32
36
40
44
48
52
Alter (Wochen)
Abbildung 31: Zeitverlauf des Tumorwachstums und die Mortalitätsrate
In Graph (A) wird die durchschnittlich benötigte Zeit beschrieben, um einen Tumor der Größe von 1cm3
zu erreichen. In Graph (B) wird die Sterblichkeitsrate der verschiedenen Genotypen dargestellt.
Dabei zeigte sich ein signifikanter Unterschied zwischen den untersuchten transgenen
Mäusen im Bezug des Tumorerstauftretens, sodass es in den Tg(K14HPV16);ctsl-/schneller zu äußerlich erkennbaren Tumorformation im Vergleich zu den neun Wochen
später
detektierbaren
Tg(K14HPV16);ctsl
+/+
Tumoren
(p<0,001)
in
Tg(K14HPV16);ctsl+/-
Mäusen
kommt.
Das
(p<0,01)
hierbei
und
ermittelte
Durchschnittsalter der Tg(K14HPV16);ctsl-/- Mäuse bei Erreichen des 1cm3
Tumorvolumens beläuft sich auf 32 Wochen, wohingegen die Tg(K14HPV16);ctsl+/und Tg(K14HPV16);ctsl+/+ Mäuse ein durchschnittliches Alter von 43 Wochen
(p<0,001) und 42 Wochen (p<0,01) aufweisen (Abbildung 30).
Die Wachstumsgeschwindigkeit des Tumors hin zum 1cm3 Karzinom zeigt keinen
signifikanten Unterschied zwischen den analysierten Genotypen, obschon ein leichter
Trend zum schnelleren Tumorwachstum über den Tg(K14HPV16);ctsl+/+ hin zum
Tg(K14HPV16);ctsl-/- Genotyp erkennbar ist. Die Sterblichkeitsrate weist ein
signifikant früheres Versterben der Tg(K14HPV16);ctsl-/- Maus im Vergleich zu den
beiden
Tg(K14HPV16);ctsl+/- (p<0,001)
und
Tg(K14HPV16);ctsl+/+
Genotypen auf. Ferner weist die Lebenszeit in den Tg(K14HPV16);ctsl
Woche
ebenfalls
eine
höhere
Sterblichkeitstendenz
im
+/-
Vergleich
(p<0,001)
ab der 44.
zu
den
Tg(K14HPV16);ctsl+/+ Mäusen auf. Eine pathologische Untersuchung zeigte keine
auffällige
Merkmale
an
den
untersuchten
Tg(K14HPV16);ctsl-/- Mäusen (Abbildung 31).
Organen
der
verstorbenen
61
4.2.2 Plattenepithelkarzinom Graduierung
Die Präparation der Mäuse, die das Tumorendvolumen von 1 cm3 erreicht hatten,
beinhaltete die Entnahme der Karzinome, der oberen Achsel-Lymphknoten sowie der
Rücken- und Ohrhaut. Die Tumore werden mit 4% Formaldehyd fixiert, paraffiniert und
die histologischen Präparate mittels histologischer und immunhistochemischer
Verfahren klassifiziert.
C
H&E Färbung
80
B
D
Grad I
Grad II
60
Grad III
Grad IV
p < 0,001
70
Plattenepithelkarzinom (%)
A
n.s.
p < 0,025
50
40
30
20
10
MK10 Färbung
0
+/+
1
Tg(HPV16);ctsl
+/-
2
Tg(HPV16);ctsl
-/-
3
Tg(HPV16);ctsl
Abbildung 32: Graduierung der Karzinome:
Darstellung einer HE-Färbung (A), (C) und Cytokeratin 10 immunhistochemischen Färbung (braun) (B),
(D) eines Plattenepithelkarzinom vom Grade I und Grad IV an einem 5 μm dicken Tumorschnitt.
Das Balkendiagramm
Tabelle 2: Graduierungs-Bewertungs-Tabelle
Die erforderlichen immunhistochemischen Färbungen, zur
Bestimmung der verschiedenen Karzinomdifferenzierungs
Grade.
Die Graduierung der Karzinome erfolgte mittels immunhistochemischer Färbung der
Intermediärenfilamente,
welche
den
Differenzierungsgrad
der
Keratinozyten
widerspiegeln. Gut differenzierte Plattenepithelkarzinome (Grad I) weisen oft
perlenähnliche Strukturen auf und zeigen eine positive Färbung des suprabasalen
Cytokeratin 10 (K10) (Abbildung 32 A, B), wohingegen keine Cytokeratin 8 (K8) und
eine Mindestanfärbung von 75% Pan-Keratin stattfinden sollte. Ein Grad II
Plattenepithelkarzinom hingegen ist weniger gut differenziert und zeigt eine Färbung
von K8, K10 und 50-75% Pan-Keratin positiv gefärbten Zellen. Die schlecht
differenzierte Plattenepithelkarzinome Grad III haben die Fähigkeit zur terminalen
62
Differenzierung verloren und zeigen daher nur noch eine K8 und zu 25-50% PanKeratin positiv Färbung (Tabelle 3). Der Grad IV zeigt eine Spindel-Zell-ähnliche
Morphologie, die kaum mehr ein positives Cytokeratin Signal erkennen lässt,
wohingegen das mesenchymale intermediäre Filament Protein Vimentin gefunden
werden kann. (Abbildung 32 C, D Tabelle 2).
Betrachtet man die graduierten Karzinome; erhält man eine kontinuierliche, signifikante
(Shi-Square-Test)
Verschlechterung
der
Tumordifferenzierung,
über
den
Tg(K14HPV16);ctsl+/+, Tg(K14HPV16);ctsl+/- hin zum Tg(K14HPV16);ctsl-/- Genotyp
(Abbildung 32; Graph).
4.2.3 Epithelial-Mesenchymalen-Transiton in Tg(K14HPV16)
Plattenepithelkarzinom
Einer der meist genutzten Marker zur Bestimmung der Tumorinvasion ist das Ecadherin, ein Zell-Adhäsionsprotein, welches nicht- oder in reduziertem Maße im
invasiven Tumor vorkommt. Dabei erfolgt die Reduzierung des E-cadherin entweder
durch Mutationen, transkriptioneller Regulation oder Protease induzierter Spaltung an
der Ektodomäne des Proteins (Beavon, 2000; Gocheva et al., 2006; Noe et al., 2001;
Perl et al., 1998; Vleminckx et al., 1991). E-cadherin spielt dabei eine mitentscheidende
Rolle in der Differenzierung, Proliferation und Migration in gesunden Zellen, und
insbesondere bei maligner Erkrankung stellt der Verlust von E-cadherin einen
wesentlichen Schritt in der Tumorprogression, Metastasierung und schlechterer
Prognose in Patienten dar (Adams and Nelson, 1998; Koenig et al., 2006; Miyazaki et
al., 2006; Perl et al., 1998).
Transgen Karzinome mit dem Differenzierungsgrad III wurden mittels E-cadherin, ßcatenin und p-120ctn spezifischen fluoreszierenden Antikörpern untersucht. Um einen
genaueren Eindruck einer möglichen Relokalisierung von E-cadherin und p120ctn zu
erhalten, wurde ein Bewertungsschema (Score) angewandt, die von 0 bis 3 reicht. Dabei
stellt die 0 keine Färbung und 3 starke Färbung dar. Die Bewertung der jeweils fünf
verschieden Grad III Plattenepitheltumore wurden von zwei unabhängigen Personen
ohne Informationen zum Maus-Genotyp durchgeführt. Bei Unstimmigkeit wurde eine
dritte Person hinzugezogen
+/+
Tg(K14PV16);ctsl-/- Tg(K14PV16);ctsl+/+ Tg(K14HPV16);ctsl
Epidel
Grad III
Grad III
63
E-cadherin
ß-catenin
p-120ctn
Abbildung 33: Immunhistologische Färbung von E-cadherin, ß-catenin und p-120ctn
Immunhistologische Färbung von E-cadherin, ß-catenin und p120ctn in 16 Wochen alter Ohrhaut
Tg(K14HPV16)ctsl+/+ Epidermis und Plattenepithelkarzionom Differenzierungsgrades III in
Tg(K14HPV16); ctsl+/+ und Tg(K14HPV16); ctsl-/-. Die Epidermis Tg(K14HPV16)ctsl+/+ weist sowohl
Membran gebundenes E-cadherin (A), ß-catenin (B) als auch p120ctn (C) auf. Panel (D) und (E) zeigt die
korrespondierende immunhistochemische Färbung an Tg(K14HPV16);ctsl+/+ Tumore des Grades III. Die
Bilder (G), (H) und (I) beschreiben die E-cadherin, ß-catenin und p120ctn immunhistologische Färbung
von Tg(K14HPV16)ctsl-/- Tumor Grad III Gewebe. Starke zytoplasmatische und eventuelle positive
Zellkernfärbung von E-cadherin kann in Tg(K14HPV16)ctsl-/- gesehen werden (Inlet G).
Die immunhistologische Färbung von E-cadherin, ß-catenin und p-120ctn an
hyperplastisch/dysplastischer
Mausohrhaut
zeigen
eine
zelltypische
Membran-
Lokalisation (Abbildung 33; A-C). Die E-cadherin Färbung im Plattenepithelkarzinom
des Grades III dagegen weist im Vergleich von Tg(K14HPV16);ctsl+/+ zu
Tg(K14HPV16);ctsl-/- eine Umverteilung auf, die zu einer Verringerung des
membrangebundenen E-cadherin Anteils führt. Durch die Graduierung konnte diese
Abnahme als ein signifikanter Befund in den Tg(K14HPV16);ctsl-/- Genotyp erkannt
werden (Abbildung 33D und G; 34A). Ein weiterer spezifischer immunhistologischer
Befund in den Tg(K14HPV16);ctsl-/- Grad III Plattenepitelkazinomen ist die Detektion
von einer möglichen Zellkern-Akkumulation von E-cadherin (Abbildung 33
G(Ausschnitt)). Betrachtet man die immunhistologische Färbung von p120ctn, konnte
ein signifikant stärkeres Signal im Cytoplasma in den Tg(K14HPV16);ctsl-/- Grad III
Plattenepithelkazinomen festgestellt werden (Abbildung 33 F und I; 34 B). Die ß-
64
catenin immunhistochemische Färbung ist mit der p120ctn Färbung vergleichbar
Stärke der Anfärbung
(Score)
Stärke der Anfärbung
(Score)
(Abbildung 33 E, H, F, I).
Abbildung 34: Quantifizierung von E-cadherin und p120ctn
Die quantitative Auswertung erfolgte an 5 Grad III Tg(K14HPV16);ctsl+/+ und 5 Tg(K14HPV16);ctsl-/-.
Plattenepithelkarzinomen. Durch immunhistologische Färbung wurde der E-cadherin und der p120ctn
Anteil sichtbar gemacht und bezüglich der zellulären Lokation ausgewertet und quantifiziert. Die
Quantifikation erfolgte durch eine Graduierung mit den Werten 0 bis 3: von keiner - über schwache moderate und starke Anfärbung.
4.2.4 Lymphknotenmetastasierung im Tg(K14HPV16) Mausmodell
CTSL zählt als einer der tumorrelevanten Faktoren und wurde insbesondere im
Zusammenhang mit Invasion und Metastasierung oft zitiert. In klinischen Studien wird
die CTSL Expression als prognostischer Faktor, im Brustkrebs genutzt wird (Jagodic et
al., 2005; Nomura and Katunuma, 2005).
Um den Einfluss von CTSL auf das Metastasierungspotential untersuchen zu können,
wurden
die
Genotypen
Tg(K14HPV16);ctsl+/+,
Tg(K14HPV16);ctsl+/-
-/-
und
3
Tg(K14HPV16);ctsl nach Entwicklung eines Plattenepitheltumors der Größe 1cm auf
Metastasenbildung im Lymphknoten untersucht. Dabei wird eine immunhistochemische
Färbung basierend auf den Intermediärfilamenten der Keratinozyten spezifischen
Strukturproteine dem Cytokeratin 5 (K5) und K10 im Lymphknoten durchgeführt.
MK5&MK10
negativ
Mäuse mit Lymphknotenmetastatsen (%)
65
p<0,025
n.s.
70
60
n.s.
50
40
30
20
10
0
Tg(HPV16);ctsl
+/+
+/-
Tg(HPV16);ctsl
Tg(HPV16);ctsl
-/-
MK5&MK10
positiv
Abbildung 35: Metastasierung
Immunhistochemische Färbung (braun) von 5 μm dicken Lymphknotenschnitte mit Cytokeratin 5 und
Cytokeratin 10. Der Graph stellt die Anzahl der positiven Metastasenbefunde der verschiedenen
Genotypen dar. (Shi-Square Test)
Die Metastasierung im Lymphknoten zeigte eine schrittweise Erhöhung, vom
Tg(K14HPV16);ctsl+/+ über Tg(K14HPV16);ctsl-/+ hin zum Tg(K14HPV16);ctsl-/Genotyp. Ferner wurde eine signifikante 2,5 Fach erhöhte Metastasierung im
Tg(K14HPV16);ctsl-/- im Vergleich zum Tg(K14HPV16);ctsl+/+ Genotyp festgestellt
(Abbildung 35).
4.3
DMBA/TPA induzierte Karzinogenese
Als Hauptursache der Entstehung von Hautkrebs und Melanomen werden
Umwelteinflüsse, wie ultraviolettes Licht sowie diverse in der Umwelt vorliegende
chemische Substanzen verantwortlich gemacht (Zinkel and Fuchs, 1994). Um die
Bedeutung von CTSL für die Entstehung und Progression durch Umwelteinflüsse
entstandener Tumore untersuchen zu können, wurden ctsl-/- und ctsl+/+ Mäuse mit
chemischen Agenzien behandelt. Diese Behandlung simuliert die umweltbedingte
Tumorentstehung durch die Applikation von DMBA und TPA (Gemsa et al., 1984;
Ridd et al., 2006).
66
4.3.1 Tumorprogression in der chemischen Karzinogenese
Die Tumorinitiation an der Haut erfolgte durch eine einmalige DMBA-Applikation auf
der rasierten Rückenhaut. Anschließend erfolgte eine TPA Behandlung, die eine
Selektion auf onkogene Mutanten, die zur Tumorpromotion an der behandelten Stelle
zur folge hat (Gemsa et al., 1984; Ridd et al., 2006). Die Tumorinitiation stellt dabei
den Startpunkt der chemischen Zweistufen-Karzinogenese dar und wurde als Startpunkt
aller folgenden Zeitrechnungen im DMBA/TPA Mausmodell genutzt.
B
Zeitdauer zum erreichen von 1cm
grossen Tumoren (Wochen)
3
A
100
90
Inzidenz (%)
80
70
60
50
40
30
20
-/-
Tg(K14-HPV16); ctsl (n=18)
+/+
Tg(K14-HPV16); ctsl (n=24)
10
0
35
30
25
20
15
10
5
0
0
8
12
16
20
24
+/+
ctsl
Alter (Wochen nach der DMBA Applikation)
wt
-/-
ctsl
Abbildung 36: Tumor Inzidenz und Tumor Progression
In Abbildung (A) ist der Inzidenzverlauf von beiden Genotypen (ctsl+/+ und ctsl-/-) nach der DMBA
Applikation beschrieben. Graph (B) beschreibt die durchschnittlich benötigte Zeit, nach der DMBA
Applikation zum Erreichen eines Tumorvolumens von 1cm3 Größe in den Genotypen ctsl+/+ und ctsl-/-.
70
20
Plattenepizhelkarzinom
positive Mäuse (%)
Anzahl an Papilome & Karzinomen
je Maus
A
18
16
14
12
10
8
Grad I-II
Grad III-IV
60
50
40
30
6
20
4
10
2
0
0
+/+
ctsl
+/+
ctsl
-/-
ctsl
(n=16)
wt
-/-
ko
ctsl
(n=19)
Abbildung 37: Tumor Auftreten und Tumor Graduierung
Graph (A) zeigt die Anzahl der gebildeten Tumore bezogen auf den Genotyp (ctsl+/+ und ctsl-/-). Dabei
wird in (A) der Median, die 25% bzw. 75% Quartile, Ausreißer Extremwerte und die Nicht-AusreißerSpanne dargestellt. Die Mausgenotyp (ctsl+/+ und ctsl-/-) bezogene prozentuale Darstellung des
Differenzierunggrades von 1 cm3 großen Plattenepithelkarzinomen ist in (B) aufgeführt.
Die Tumor-Erst-Detektion von DMBA und TPA behandelten Mäusen weist zwischen
ctsl+/+ und ctsl-/- Mausen keinen systematischen Unterschied auf. Die Inzidenz von ctsl-/Mäusen beträgt dabei ab der 25. Woche 100%, wohingegen die ctsl+/+ Mäuse eine
67
83%ige Tumoranfälligkeit aufweisen (Abbildung 36). Die Wachstumsgeschwindigkeit
der Tumore bis zu einer Größe von 1cm3 im Volumen unterscheidet sich nicht
signifikant zwischen ctsl+/+ und dem ctsl-/- Genotyp (Abbildung 36 B). Ferner konnte
eine 1/3 erhöhte Tumoranzahl je behandelte Maus in ctsl+/+ im Vergleich zum ctsl-/Mäusen gefunden werden (Abbildung 37A). Eine Tendenz zu erhöhten Anaplasie
konnte im ctsl-/- im Vergleich zum ctsl+/+ Plattenepithelkarzinome detektiert werden
(Abbildung 37B).
4.3.2 Metastasenbildung in der chemischen Karzinogenese
Die häufig zitierte Rolle von CTSL insbesondere in der Invasion und Metastasierung
(Jagodic et al., 2005; Nomura and Katunuma, 2005) weist auf die Wichtigkeit der
Analyse der Metastasenbildung von ctsl-/- Mäusen hin. Diese Untersuchung erfolgte an
ctsl+/+ und an ctsl-/- Maus-Lymphknoten, die bereits einen Plattenepitheltumor der Größe
1cm 3 auf der Haut aufweisen konnte. Dabei wird eine immunhistochemische Färbung
basierend
auf
den
Intermediärfilamenten
der
Keratinozyten
spezifischen
Strukturproteine dem Cytokeratin 5 (K5) und Cytokeratin 10 (K10) im Lymphknoten
durchgeführt (Abbildung 38).
p<0,05
Metastasen (in Protzent)
80
Abbildung 38: Metastasierung
Die Bestimmung der Metastasen
erfolgte nach dem Erreichen des
Tumorvolumens von 1cm3 Größe.
Es folgte eine
immunhistochemische Färbung
von 5 μm dicken Lymphknoten
mit Cytokeratin 5 und
Cytokeratin 10. Der Graph stellt
die prozentuale Anzahl der
Metastasenbefunde der
verschiedenen Genotypen dar.
Die Statistik erfolgte über die
Bestimmung.
70
60
50
40
30
20
10
0
wt
+/+
ctsl
(n=16)
ko-/ctsl
(n=19)
Dabei konnte eine signifikante Erhöhung der Metastasierungsanzahl in den ctsl-/Mäusen im Vergleich zum ctsl+/+ Befund, beobachtet werden (Abbildung 38)
68
4.4
Untersuchung der intrazellularen Veränderungen und Mechanismen
Anknüpfend an die vorliegenden deskriptiven Befunde des Tg(K14HPV16)
Mausmodells und der chemischen Karzinogenese wurden intrazelluläre Untersuchungen
durchgeführt, um eine zellphysiologische Erklärung für die gefundenen Genotypspezifischen Phänotypen zu erhalten.
4.4.1 Verifizierung des Maus Genotyps
Um zu gewährleisten, dass die CTSL-defiziente Maus kein funktionelles CTSL zur
Verfügung hat, erfolgte eine Verifizierung der CTSL-Defizienz durch eine
Genotypisierung von CTSL und einer Western-Blot Analyse. Dabei wurde die
Genotypisierung mit einem CTSL spezifischen Primerpaar und einem NeomycinResistenzkassetten Primer durchgeführt. Mit diesen Primern konnte die Unterbrechung
des ctsl Gens mittels PCR verifiziert und die PCR durch die in Exon 3 integrierten
Neomycin-Resistenzkassette kontrolliert werden (Roth et al., 2000). Die durchgeführte
ctsl-/-
ctsl+/+
ctsl-/-
ctsl+/+
ctsl-/-
ctsl+/+
H2O
100bp
Marker
ctsl-/-
ctsl+/-
ctsl+/-
ctsl+/+
Western-Blot Analyse bestätigt die CTSL-Defizienz auf Proteinebene (Abbildung 39).
35 kDa
24 kDa
19 kDa
Abbildung 39: Genotypisierung von CTSL-Defizienten Mäusen und Western-Blot Analyse.
Das linke Bild zeigt die Genotypisierungsergebnisse einer ctsl+/+ Maus, zwei ctsl heterozygote, einer ctsl-/Maus gefolgt von einer Wasser Kontrolle und einem 100 kb Marker. Aufgetragen wurden die Proben auf
ein 1%es Agarosegel. Das kleinere PCR Produkt, erkennbar beim wildtyp und ctsl heterozygoten
Genotypisierung, resultiert aus dem CTSL Gen, wohingegen das größere PCR Produkt, vorzufinden in
ctsl heterozygoten und ctsl-/- Mäusen, von der Neomycin-Resistenzkassette herrührt. Die mittlere
Abbildung zeigt die CTSL Western-Blot Analyse mit dem Antikörper 0600008. Es sind deutlich drei
detektierte Banden in der ctsl+/+ Spur erkennbar, wohingegen keine Detektion von CTSL in der ctsl-/Maus festgestellt werden konnte. Das rechte Bild zeigt 16 Wochen alte ctsl wt und ko Mäuse.
Das Transgen in den Tg(K14HPV16) Mäusen wurde durch spezifische Primer
identifiziert. Es wurden ausschließlich Tg(K14HPV16) hemizygote Mäuse in dieser
Studie genutzt. (Abbildung 40).
69
Abbildung 40: Tg(K14HPV16)
Genotypisierung
Links sind 16 Wochen alte wt und
Tg(K14HPV16) Mäuse gezeigt. Eine
interene PCR Kontrolle erfolgte über
spezischen h2-microglobulin Primer. Die
Genotypisierung erfolgte mit spezifischen
Primer die nach der Amplifikation auf ein
1% Agarosegel aufgetragen wurden. In der
ersten Bande ist eine wt Probe gefolgt von
zwei Transgenpositiven Proben, einer
Wasserkontrolle und einem 100kb Marker
aufgetragen worden.
4.4.2 Analyse der Zelluläre Mechanismen
Bereits beim Vergleich zwischen CTSL wiltdyp und knock-out Mäusen konnten diverse
bereits publizierte Phänotypen bestätigt werden (siehe Einleitung). Dabei scheint
insbesondere der Defekt des korrekten Rezeptor Recyclings, wie im Falle von EGFRezeptors (EGFR) gezeigt (Reinheckel et al., 2005), von Interesse zu sein. Die
detektierten phänotypischen Unterschiede zwischen dem Tg(K14HPV16);ctsl+/+ und
Tg(K14HPV16);ctsl-/- Genotyp wie die der erhöhten Keratinozyten Proliferation, der
verstärkten Ausbildung von Dysplasien, der stärkeren Dedifferenzierung des Tumors
und des größeren Potentials zur Metastasierung könnten auf eine Dysregulation von
Wachstumsfaktor-Signalkaskaden zurückzuführen sein. Auch die Ergebnisse der
chemischen Karzinogenese weisen in dieselbe Richtung. Der Verlauf des korrekten
Recyclings erfolgt über den Transport der Wachstumsfaktorrezeptoren und deren
Liganden zum frühen endosomalen/lysosomalen Kompartiment. Dabei unterliegt jeder
Transportprozess, insbesondere der der Signalwege, höchster Kontrolle, um eine
korrekte Regulation unzähliger Prozesse, wie Zellteilung, Zelldifferenzierung, Zelltod
und Migration (Floyd and De Camilli, 1998) zu erreichen. Da der Prozess des
Recyclings in CTSL–defiziente Keratinozyten (Reinheckel et al., 2005) gestört ist,
wurde
das
endosomalen/lysosomalen
Kompartiment
von
ctsl+/+,
ctsl-/-
und
Tg(K14HPV16); ctsl+/+, Tg(K14HPV16); ctsl-/- Keratinozyten und Fibroblasten näher
untersucht.
70
4.4.2.1 Evaluation des endsosomal/lysosomalen Kompartiment
Die Analyse des endosomalen/lysosomalen Kompartiments wurde an ctsl-/-, ctsl+/+,
Tg(K14HPV16);ctsl+/+ und Tg(K14HPV16);ctsl-/- durchgeführt. Dabei wurden primäre
Zellkulturen wie Maus Fibroblasten (MFs) und Maus Keratinozyten (Keras) hergestellt
und sowohl das Lysosomale Kompartiment mittels LysoTracker® sichtbar gemacht, ein
fluoreszierendes Molekül, welches im sauren Kompartiment der Zelle akkumuliert, als
auch Mitochondrien mittels eines MitoTrackers® (Abbildung 31). Ferner wurde ein
Beta-Hexosaminidase Aktivitäts-Assay an Haut-Lysaten durchgeführt.
p<0,1
B
1,6
(ß-Hexoaminidase Aktivity in Hautgewebe)
(A.U./ug Protein))
Fluoreszenze der MFs
(LysoTracker A.U. / ug Protein)
A
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
+/+
ctsl
-/-
ctsl
0,70
0,65
0,60
0,55
0,50
0,45
0,40
0,35
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
ctsl
+/+
wt
ctsl
-/-
C
Abbildung 41: Endosomal/lysosomales Kompartiment
(A) Primäre MFs wurden von drei Tage postnatalen Mäusen mit dem Genotyp ctsl+/+ und ctsl-/- generiert
und bis zur Konfluenz kultiviert. Die MFs wurden für zwei Stunden mit LysoTracker® – DND26 (grün)
behandelt, anschließend gewaschen und lysiert. Die Fluoreszenz des Lysates wurde bestimmt und auf die
Proteinkonzentration abgeglichen. (B) Auf Proteinkonzentration normierte Beta-Hexosaminidase
Aktivität im ctsl wild und knock-out Hautgewebe. (C) Zeigt Primäre wild und knock-out Keratinozyten
Lysosome und Mitochondrien, die durch zweistündige Inkubation mittels LysoTracker® – DND26 (grün)
MitoTracker® Red CMXRos (rot) durch Konfokalmikroskopie visualisiert wurden.
71
Vergleicht man ctsl+/+ versus ctsl-/- MFs, kann eine erhöhte Fluoreszenz-Intensität in den
ctsl-/- Zellen sowohl im Zell-Lysat (Abbildung 41A) als auch mittels LaserscanKonfokalmikroskopie detektiert werden. Bei Betrachtung der Keratinozytenkultur
beider Genotypen wurde eine erhöhte Anzahl von „sauren“ Vesikeln in den ctsl-/- Zellen
durch Nutzung von LysoTracker® festgestellt (Abbildung 41C).
Die Untersuchung eines weiteren lysosomalen Markers, der Beta-Hexosaminidase, zeigt
ebenfalls eine erhöhte Aktivität in ctsl-/- Hautgewebe (Abbildung 41B) und bestätigt
einen
Unterschied
im
endosomalen/lysosmalen
Kompartiment
zwischen
den
untersuchten Genotypen. Die Untersuchung der Kompartimente im Tg(K14HPV16)
Tumor Maus-Modell konnte sowohl mittels LysoTracker® Färbung in den
Tg(K14HPV16);ctsl+/+ und Tg(K14HPV16);ctsl-/- Keratinozyten als auch anhand der
Beta-Hexosaminidase Aktivitätsbestimmung in der Haut von Tg(K14HPV16);ctsl+/+,
Tg(K14HPV16);ctsl+/- und Tg(K14HPV16);ctsl-/- die oben erhaltenen Ergebnisse
ß-Hexoaminidase Aktivität in Hautgewebe
(A.U./ug Protein))
bestätigen (Abbildung 42 und 43).
Abbildung 42:
Lysosomales Kompartiment
0,60
0,55
Bestimmung von BetaHexosaminidase Aktivität in
Tg(K14HPV16);ctsl+/+,
Tg(K14HPV16);ctsl+/- und
Tg(K14HPV16);ctsl-/- Maus
Hautgewebe. Die bestimmte
Prozessierungsaktivität wurde auf
die Proteinkonzentration normiert.
0,50
0,45
0,40
0,35
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
+/+
Tg(K14HPV16);ctsl
wt_T (n=3)
Tg(K14HPV16);ctsl
+/-
Tg(K14HPV16);ctsl
-/-
Abbildung 43:
Lysosomales Kompartiment
LysoTracker® – DND26 (grün)
und Hoechst® (blau) gefärbte
primäre Tg(K14HPV16);ctsl+/+ und
Tg(K14HPV16);ctsl-/Keratinozyten.
72
4.4.2.2 Evaluation der intrazelluläre EGF-Signalkaskade
Die pathologische Aktivierung der EGF-EGFR Signalkaskade ist ein wesentlicher
oncogener Faktor in einer Vielzahl von Karzinomen (Scartozzi et al., 2006). Der
Signalverlauf des aktivierten EGFR beinhaltet wenigstens zwei Hauptsignalwege, der
über Ras/Raf/MEK/MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) oder den über PI3-K
(Phosphatidylinositol 3-Kinase)(Muthuswamy et al., 1999; Scartozzi et al., 2006)
erfolgt. Zur Bestimmung des Ras/MAPK Signalweg wurde das aktivierte Ras, welches
durch eine Phosphorylierung vom gebundenen GDP (Guanosin-5'-diphosphat) zu GTP
(Guanintriphosphat)
Tg(K14HPV16);ctsl
aktiviert
+/+
wird,
sowohl
und Tg(K14HPV16);ctsl
-/-
in
ctsl+/+/ctsl-/-
als
auch
in
gemessen. Die Reproduzierbarkeit
des verwendeten Ras-GTP ELISA wurde durch eine Titrationskurve mit EGFaktivierten Hela-Zellen-Lysat in aufsteigender Proteinkonzentration getestet und zeigte
einen stabilen linearen proteinkonzentrationsabhängigen Anstieg, der im Bereich der zu
detektierenden Probenkonzentration liegt.
p<0,05
Abbildung 44:
Ras-GTP von ctsl+/+ &
ctsl-/- Gewebe
25Wochen WT
Bestimmung von RasGTP an ctsl+/+ und ctsl-/Ohrhautgewebe im Alter
von 16 Wochen. Dabei
wurde die Ohrhaut lysiert
und mittels einem GTPase
ELISA, welcher über
einen spezifischen RasGTP AK das, dass aktive
Ras bestimmt, und auf die
Proteinkonezentration
normiert. Die Quantifizierung erfolgte über ein
Luminometer.
Ras-Aktivität
(RAS-GTP)
25000
20000
15000
10000
5000
0
+/+
ctsl
-/-
ctsl
Die Analyse der ctsl+/+ und ctsl-/- Mausohrhaut zeigt einen dreifach erhöhten
signifikanten Anstieg von aktivierten Ras (Abbildung 44). In dem transgenen
(K14HPV16) Modell konnte ein 40% Anstieg der Ras-GTP Konzentration im
Tg(K14HPV16);ctsl-/- Gewebe festgestellt werden (Abbildung 45).
73
Abbildung 45: Ras-GTP
von
Tg(K14HPV16);ctsl+/+ &
Tg(K14HPV16);ctsl-/Gewebe
80000
70000
Bestimmung von RasGTP an
Tg(K14HPV16);ctsl+/+
und Tg(K14HPV16);ctsl-/Ohrhautgewebe im Alter
von 16 Wochen. Dabei
wurde die Ohrhaut lysiert
und mittels einem GTPase
ELISA das, dass aktive
Ras bestimmt und auf die
Proteinkonzentration
normiert. Die Quantifizierung erfolgte über ein
Luminometer.
Ras-Aktivität
(RAS-GTP)
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
+/+
Tg(K14HPV16);ctsl
wt
-/-
Tg(K14HPV16);ctsl
Um eine genaueren Eindruck des EGFR Einflusses auf die Keratinozyten Ras-Aktivität
zu erhalten, wurden primäre Tg(K14HPV16);ctsl+/+ und Tg(K14HPV16);ctsl-/Keratinozyten kultiviert und untersucht. Dabei konnte eine dreifache erhöhte Ras
Aktivität
von
Tg(K14HPV16);ctsl-/-
im
Vergleich
zu
Tg(K14HPV16);ctsl+/+
Keratinozyten festgestellt werden. Dieser Versuch bedarf auf Grund der geringen
Probenzahl zu weiterer Wiederholungen, um eine gefestigte systematische Aussage
treffen zu können (Abbildung 46).
Abbildung 46: Ras-GTP
von
Transgenen
Keratinozyten
20000
18000
16000
Ras-Aktivität
(RAS-GTP)
14000
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0
+/+
Tg(K14HPV16);ctsl
HPV
-/-
Tg(K14HPV16);ctsl
Bestimmung von RasGTP an
Tg(K14HPV16);ctsl+/+
und Tg(K14HPV16);ctsl-/primäre Keratinozyten im
Alter von 16 Wochen.
Dabei wurden die
Keratinozyten 6 h vor der
Lysis im EGF freien
Medium gehungert und
mittels einem GTPase
ELISA das, dass aktive
Ras bestimmt und auf die
Proteinkonzentration
normiert. Die Quantifizierung erfolgte über ein
Luminometer.
74
5 Diskussion
In den vergangenen Jahren wurden Cathepsine in zunehmendem Maße als ein
prognostischer Faktor entdeckt, der auf einen schlechten Krankheitsverlauf von
Patienten mit den verschiedenen Malignomen hinweist (Jean et al., 2006; Tardy et al.,
2006). Dieses Konzept wurde durch eine Reihe von Untersuchungen zu Inhibition von
Cathepsinen in Zellkultur gestützt (Colella et al., 2004). Erst in den letzen Jahren wurde
auf Cathepsin knock-out Tiermodelle zurückgegriffen, um nicht nur eine vollständige
und gezielte Cathepsin „Inaktivierung“ zu erhalten, sondern auch um die komplexen
physiologischen Abläufe zu untersuchen, die während einer Tumorprogression in vivo
nicht nur in der Tumorzelle, sondern auch in der Tumor-Mikroumgebung ablaufen. In
neuesten Experimenten wurde die Rolle von CTSL in der Karzinogenese am RIP1-Tag2
ctsl-/- Modell untersucht (Gocheva et al., 2006). Dabei entwickeln sich im Tg(RIP1Tag2);ctsl+/+ Modell zwischen der 12. und 16. Woche invasive Inselzellkarzinome
(Hanahan, 1985; Hanahan and Folkman, 1996b), die durchweg eine verbesserte
pathologische Tumor-Situation unter CTSL-Defizienz im Tg(RIP1-Tag2);ctsl-/aufweisen (Tabelle 3) (Gocheva et al., 2006).
In der vorliegenden Arbeit wird wird die Funktion von CTSL in einer sequenziellen
epidermalen Karzinogenese an zwei experimentellen Mausmodellen untersucht. In
einem Mausmodell erfolgt eine epithelspezifische Expression der Onkogene E6 und E7
des humanen Papillomavirus 16 (HPV16) unter der Kontrolle eines Cytokeratin 14
(K14) Promotors, was zur Bildung von Plattenepithelkarzinomen in den Mäusen führen
kann (Arbeit et al., 1994; Coussens et al., 1996). Das zweite Tumor-Maus-Modell
erfolgt
durch
eine
chemisch
induzierte
Karzinogenese
mit
7,12-
Dimethylbenz(a)anthrazen (DMBA) als Initiator und 12-o-Tetradecanoylphorbol-13acetat (TMP) als Tumorpromotor (Gemsa et al., 1984; Ridd et al., 2006). Für die
genetisch
induzierte
Karzinogenese
wurden
CTSL-defiziente
Mäuse
in
das
Tg(K14HPV16);ctsl+/+ Maus-Modell, mit dem Ziel folgende Mausgenotypen zu
erhalten: Tg(K14HPV16);ctsl+/+, Tg(K14HPV16);ctsl+/- und Tg(K14HPV16);ctsl-/eingekreuzt. Für die chemisch induzierte Karzinogenese wurden ctsl+/+ und ctsl-/- Mäuse
für die Analysen verwendet (Gemsa et al., 1984; Ridd et al., 2006). Dabei wurden
sowohl primäre Zellen der verschiedenen Genotypen analysiert, als auch eine
systematische Untersuchung an verschieden stark ausgeprägten prämalignen Läsionen
der Haut im Tg(K14HPV16) Maus-Modell durchgeführt. Ferner wurden die
75
Plattenepithelkarzinome beider Tumor-Mausmodelle und deren Genotypen auf den
Differenzierungsgrad bewertet und auf mögliche Metastasierung hin analysiert. Wider
Erwarten zeigte sich im Tg(K14HPV16); ctsl-/- und nach der chemischen Karzinogenese
eine Verschlechterung der Tumorsituation (Tabelle 5.3). Im Folgenden sollen
zellbiologische Erklärungsmöglichkeiten für die beschleunigte Karzinogenese in den
Tg(K14HPV)ctsl-/- diskutiert werden. Hierfür muss die besondere Rolle von CTSL in
der Haut berücksichtigt werden, die durchaus einen verstärkenden Einfluss auf die
Tumorigenese der Haut ausüben kann.
Tabelle 3: Vergleich von RIP1-Tag2, Tg(K14HPV16) Mausmodellen und chemischer
Karzinogenese unter CTSL-Defizienz.
Der Vergleich erfolgte im Bezug auf das entsprechende Standard-Tumormodell mit funktionstüchtigem
CTSL. Die RIP1-Tag2 Ergebnisse wurden aus folgender Publikation zusammengefasst: (Gocheva et al.,
2006).
Tg(RIP1-Tag2); ctsl-/-
Tg(K14HPV16); ctsl-/-
Chemische
Physiologische
Maus Modell
Maus Modell
Karzinogenese
Parameter
(Inselzellkarzinome)
(SSC)
(SSC)
Tumor Progression
Reduziert/Verspätet
Erhöht
---
Proliferation
Reduziert
Erhöht
---
Apoptose
Erhöht
Unverändert
---
Angiogenese
Unverändert
Unverändert
---
Tumors
Besser
Schlechter
Schlechter
---
Erhöht
Erhöht
Differenzierungsgrad
Metastasierung
76
5.1
Morphologische Veränderungen im endosomalen/lysosomalen
Kompartiment von CTSL-defizienten Keratinozyten und Gewebe
In CTSL-defizenten Mäusen konnte ein lysosomaler Defekt sowohl in Form von
vergrößerten Lysosomen im Herzmuskel (Stypmann et al., 2002) als auch im
lysosomalen/endosomalen Kompartiment in Hautkeratinozyten festgestellt werden
(Tobin
et
al.,
2002).
Eine
erhöhte
Anzahl
von
LysoTracker®
positiven
Zellkompartimenten konnte in ctsl-/- und Tg(K14HPV16);ctsl-/- im Vergleich zu ctsl+/+
und Tg(K14HPV16);ctsl+/+ primären Keratinozyten detektiert werden (Abbildung 41 C,
43). Die Änderung am endosomalen/lysosomalen Kompartiment, resultierend aus der
CTSL-Defizienz
und
konnte
auch
indirekt,
durch
Beta-Hexosaminidase
Aktivitätsmessung am Hautgewebe bestätigt werden. Diese weist eine erhöhte Aktivität
im CTSL-defizienten Hautgewebe der Genotypen ctsl-/- und Tg(K14HPV16);ctsl-/- im
Vergleich zu ctsl+/+ und Tg(K14HPV16);ctsl+/+ auf, die auf eine Erhöhung der
endosomalen/lysosomalen Vesikeln im Hautgewebe hinweist kann (Abbildung 41; 42).
Dabei gilt zu klären zu welchen funktionellen Konsequenzen, die strukturelle
Veränderung im endosomalen/lysosomalen Kompartiment in der Zelle führen.
5.2
Funktionelle Veränderung im endosomalen/lysosomalen
Kompartiment und die daraus resultierenden Konsequenzen für die
Signaltransduktion
Das endosomale/lysosomale Kompartiment ist in verschiedenen elementaren Aufgaben
der Zelle beteiligt. Insbesondere im Prozess der Signaltransduktion durch Regulation
von Wachstumsfaktoren und -rezeptoren durch Termination des Signals durch
Dissoziation, Degradation oder Recycling von Rezeptoren und Liganden erfolgt
maßgeblich durch das endosomale/lysosomale Kompartiment (Ceresa, 2006; Dunn et
al., 1989). Dabei sind die Cathepsine als lysosomale Proteasen entscheidend beteiligt.
Zusätzlich wurde in den Keratinozyten der ctsl-/- Maus eine erhöhte Proliferation
gemessen, die auf eine bessere EGF-Induzierung durch erhöhte EGFR Konzentration
zurückzuführen ist, die wiederum aus einem erhöhtem EGF Recycling in der CTSLDefizienz resultiert, (Reinheckel et al., 2005). In der vorliegenden Arbeit wurde das in
der EGFR Signalkaskade involvierte Protein Ras (Faivre et al., 2006) in seiner aktiven
Form im Hautgewebe und in primären Keratinozyten gemessen. Dabei konnte eine 5fach höhere Konzentration von Ras-GTP Protein im ctsl-/-, im Vergleich zum ctsl+/+
77
Hautgewebe gemessen werden (Abbildung 44). Da bekannt war, dass das im HPV16
Transgenkonstruktes befindliche E5-Genes zu einem reduzierten EGFR Abbau führt
(Kim and Yang, 2006) und dadurch mit der CTSL-Defizienz auf den selben Phänotyp
wirkt, wurde die Ras-Aktivität nicht nur im Gewebe sondern auch in primären
Keratinozyten gemessen. Dabei konnte im Gewebe eine 40%ige Erhöhung der RasAktivität in Tg(K14HPV16);ctsl-/- im Vergleich zum Tg(K14HPV16);ctsl+/+ detektiert
werden (Abbildung 45). Die Ras-Aktivitätsbestimmung in den primären Keratinozyten
zeigten eine dreifach erhöhte Ras-GTP Konzentration in den Tg(K14HPV16);ctsl-/(Abbildung 46), so dass auch im Tg(K14HPV16) Tumor-Maus-Modell von einer
erhöhten EGFR-Signalübertragung bei CTSL-Defizienz gesprochen werden kann.
Dieser Effekt der erhöhten EGF-Antwort führt in vivo im ctsl-/- Hautgewebe zu einer
erhöhten Proliferation der basalen Keratinozyten, woraus eine Verdickung der
Epidermis resultiert (Reinheckel et al., 2005; Roth et al., 2000). Dass dieser Phänotyp
spezifisch durch eine CTSL-Defizienz in Keratinozyten verursacht wird, konnte durch
eine gezielte Re-Expression von CTSL unter der Kontrolle eines K14 Promotors in
CTSL-defizienten Mäusen nachgewiesen werden (Abbildung 47) (Reinheckel et al.,
2005).
A
B
C
Abbildung 47: Haut- Haarphänotyp der CTSL-defizienten Maus
Der in ctsl-/- Mäusen detektierte spezifische Haut- und Haarphänotyp konnte durch eine Keratinozytenspezifische-CTSL-Re-Expression verhindert werden. Die immunhistochemische Färbung des
Proliferationsmarker Ki67 zeigt eine Rückbildung der Proliferation der positiven basalen
Keratinozytenanzahl durch eine Re-Expression von CTSL in den Keratinozyten, vergleich dem ctsl+/+
Zustand, in ctsl-/- Gewebe (A-C). Eine quantitative Analyse der Epidermisdicke zeigt den Rückgang der
erhöhten Epidermisdicke in ctsl-/- Haut zurück zum ctsl+/+ Zustand nach spezifischer CTSL
Keratinozyten-Re-Expression (Balken 20 μm) (A-C). Bilder und Ergebnisse sind in der Publikation
(Reinheckel et al., 2005) beschrieben.
Die erhöhte Proliferation der Keratinozyten konnte auch im Tg(K14HPV16);ctsl-/Hautgewebe in allen drei untersuchten Progressionszeitpunkten (4 Wochen, 8 Wochen,
12 Wochen) reproduziert und nachgewiesen werden. Insbesondere in der 16. und 24.
78
Woche zeigte sich eine signifikante Verdopplung der Proliferationsrate in
Tg(K14HPV16);ctsl-/-
Keratinozyten
im
Vergleich
zur
Kontrolle
(Tg(K14HPV16);ctsl+/+) (Tabelle 3, Abbildung 22 und 23).
5.3
Verstärkte Epitheliale-Mesenchymale-Transiton in
Tg(K14HPV16);ctsl-/- Mäusen
Es wurde bereits beschrieben, dass eine Verstärkung des EGF/EGFR-Signalweges und
eine damit einhergehende Ras-Aktivierung zu einer generellen Erhöhung aller malignen
Phänotypen, wie die der zellulären Transformation, Invasion und Metastasierung führen
kann (Bianco et al., 2006; Thiery, 2002; Woodworth et al., 2000). Aufgrund der
erhöhten EGF/EGFR-Antwort in den Tg(K14HPV16);ctsl-/- konnte eine signifikante
Verschlechterung der pathologischen Befunde in den Mäusen festgestellt werden. Dabei
gehören Zelladhäsions- und Invasionsprozesse zu den wichtigsten und wesentlichsten
Gradmessern in der Progression für Metastasierung maligner Tumore. Während der
Invasion und Metastasierung von soliden Tumoren stellt die epithelial-mesenchymale
Transition
(EMT)
einen
Schlüsselmechanismus
für
entscheidende
zelluläre
Veränderungen dar (Beavon, 2000; Thiery, 2002). Schlüsselregulatoren, wie zum
Beispiel SNAIL1, ein Transkriptionsrepressor, sind während der EMT erhöht (Lee et
al., 2006). Die Reduktion der Epithelintegrität an Adhäsionskontaktstellen und
Desmosomen (Lu et al., 2003; Maschler et al., 2005; Thiery, 2002; Thiery and Sleeman,
2006)
ist
ein
weiteres
Adhäsionskontaktstellen
Kennzeichen
(E-cadherin,
von
ß-catenin
EMT.
und
Die
p120ctn)
Messung
in
Grad
von
III
Plattenepithelkarzinomen von Tg(K14HPV16);ctsl+/+ und Tg(K14HPV16);ctsl-/- zeigte
eine signifikante Reduzierung von membrangebundenem E-cadherin und eine
ansteigende cytoplasmatische p120ctn Konzentration in den Tg(K14HPV16);ctsl-/Tumoren (Abbildung 34, 33). Dies hat zur Folge, dass es in den Tg(K14HPV16);ctsl-/Mäusen zu einer schnelleren Progression der neoplastischen Läsionen (Abbildung 20,
21), einem früheres Auftreten und eine schlechtere Tumordifferenzierung des
Plattenepithelkarzinoms (Abbildung 30, 32), sowie einer erhöhten Metastasierung in
den Lymphknoten (Abbildung 35) kommt.
79
5.4
Auswirkung der CTSL-Defizienz auf andere Cathepsine und deren
Einfluss auf die Tumorprogression
Proteasen, die Proteine der extrazellulären Matrix (EZM) zu prozessieren vermögen,
werden häufig in Verbindung mit EMT-Modulierung und somit mit Invasion und
Metastasierung gebracht (Afonso et al., 1997). Dabei korreliert die CTSB und CTSD
Expression in verschiedenen Karzinomentitäten mit dem Malignitätsgrad (Nomura and
Katunuma, 2005). Die detektierte Diskrepanz im Tg(K14HPV16);ctsl-/- Gewebe
bezüglich der CTSB Expressionsdaten zwischen mRNA Konzentration und der
gemessenen Aktivität zeigt möglicherweise einen direkten Einfluss von CTSL auf die
Deaktivierung von CTSB. Die über die Zeit immer höher werdende CTSB
Aktivitätsdifferenz zwischen Tg(K14HPV16);ctsl+/+ und Tg(K14HPV16);ctsl-/- in den
späten neoplastischen Läsionen könnte das Invasions- und Metastasierungspotential
durch die EZM Prozessierung in den Tg(K14HPV16);ctsl-/- erhöhen (Abbildung 8, 10)
(Kielan et al., 2004). Auch in der CTSD Analyse konnte eine systematische Erhöhung
der CTSD Proteinkonzentration zu allen gemessen Progressionszeitpunkten im
Tg(K14HPV16);ctsl-/- Gewebe detektiert werden (Abbildung 16). Dieser CTSLDefizienz bedingte CTSD Konzentrationserhöhung resultiert aus dem reduzierten
Abbau durch Spaltung von CTSD von CTSL (Friedrichs et al., 2003; Wille et al., 2004).
Dabei ist bekannt, dass CTSD als mitogener-Faktor eine erhöhte Proliferation
induzieren (Berchem et al., 2002; Nomura and Katunuma, 2005; Tardy et al., 2006) und
auch zur Invasivität von Zellen beiträgt kann (Nomura and Katunuma, 2005). Dieser
Befund zeigt weiterhin, dass CTSL eine wichtige Rolle in der Regulation von Proteasen
durch Inaktivierung/Aktivierung ausüben kann, die sich auch auf die Tumorpathogenese
auswirkt.
80
5.5
Tumorangiogenese/Neovaskularisierung im Tg(K14HPV16)
Mausmodell
Es wurde bereits beschrieben, dass CTSL in der Angiogenese und Neovaskularisierung
eine Rolle spielen kann. Dabei kann CTSL durch den „homing“ Prozess der
Endothelprogenitorzellen auf die Blutgefäßbildung einwirken (Felbor et al., 2000),
sowohl in positiver Weise durch die Neovaskularisierung (Gondi et al., 2004) (Urbich et
al., 2005), als auch in negativer Weise durch die Prozessierung von Collagen XVIII zu
Endostatin,
welches
ein
Angiogeneseinhibitor
ist,
Die
CD31
Färbung
des
Tg(K14HPV16) Gewebes zeigte, dass die Initiation der Angiogenese in der 16. Woche
sowohl in Tg(K14HPV16);ctsl+/+ als auch in Tg(K14HPV16);ctsl-/- stattfindet. In beiden
Genotypen konnte kein signifikanter Unterschied in der Gesamtendothelzellzahl
festgestellt werden (Abbildung 27, 29). Es kam jedoch zu einer erhöhten Anzahl von
Mikroblutgefäßen nahe der basalen Keratinozytenzellschicht im Tg(K14HPV16);ctsl-/Hautgewebe
(Abbildung
28).
Die
erhöhte
Mikroblutgefäßanzahl
im
Tg(K14HPV16);ctsl-/- Genotyp könnte Ursache für das schnellere Tumorauftreten im
Tg(K14HPV16);ctsl-/- Genotyp sein (Abbildung 30). Ungeklärt bleibt dabei, ob die
schnellere Progression der neonatalen Läsion die Blutgefäßbildung fördert oder die
erhöhte Blutgefäßbildung eine schnellere prämaligne Läsion bedingt. Die erhöhte
Mikroblutgefäßanzahl
nahe
der
basalen
Keratinozytenschicht
könnte
einen
Schlüsselmechanismus in der signifikant schneller verlaufenden Tumorprogression der
Tg(K14PV16);ctsl-/- Mäuse darstellen.
5.6
Chemische Karzinogenese
In der chemisch induzierten Karzinogenese-Studie wurden die Parameter Inzidenz,
sowie
Tumorauftreten,
Anzahl
der
entstandenen
Tumore,
Tumor-
Wachstumsgeschwindigkeit, Tumordifferenzierung und Metastasenkapazität untersucht.
Dabei konnte nach der Applikation der chemischen Agenzien auf der Haut kein
Unterschied in der Inzidenz und der Wachstumsgeschwindigkeit der Tumore in ctsl-/und ctsl+/+ Mäusen detektiert werden (Abbildung 35A). Ein Trend zur erhöhten
Entwicklung von Plattenepithelkarzinomen wurde in ctsl+/+ im Vergleich zu ctsl-/Mäusen
festgestellt
(Abbildung
37A).
Die
histologische
Untersuchung
der
Plattenepitheltumore weist hingegen eine tendenziell stärkere Anaplasie in ctsl-/-
81
Mäusen auf (Abbildung 37B). Die Metastasierungsanalyse zeigte im ctsl-/- Genotyp
signifikant mehr Lymphknotenmetastasen als in ctsl+/+ Mäusen (Abbildung 38).
5.7
Vergleich der Ergebnisse aus dem Tg(K14HPV16) und (DMBA/TPA)
Mausmodell
Sowohl in dem transgenen Mausmodell, als auch in dem Modell mit der chemisch
induzierten Karzinogenese, führte eine CTSL-Defizienz im Gewebe zu einer
Verschlechterung des Tumorbefundes. Dabei scheint allerdings die Tumoraggressivität
im Tg(K14HPV16);ctsl+/+ Genotyp milder zu sein als in der chemischen Karzinogenese
der ctsl+/+ Maus. Dies äußert sich in der starken Anaplasie der Plattenepithelkarzinome,
die dazu führt, dass 50% der DMBA/TPA ctsl+/+ Karzinome eine schlechte
Tumordifferenzierung (Grad III-IV) aufweisen, wohingegen nur 20% diesen Grad im
Tg(K14HPV16);ctsl+/+ Genotyp aufweisen. Betrachtet man dagegen die Metastasierung,
findet nur eine moderate Verschlechterung der chemischen Karzinogenese im Vergleich
zum Tg(K14HPV16) Mausmodell statt. So detektiert man in Tg(K14HPV16);ctsl-/Genotyp ca. 70% und im chemischen Karzinogenese ctsl-/- Genotyp ca. 75%
metastasierte Lymphknoten. Beim Vergleich der Genotypen Tg(K14HPV16);ctsl+/+ und
der chemisch induzierten Karzinogenese am ctsl+/+ zeigte sich eine leichte Erhöhung der
metastasierten Lymphknoten von 20% auf 30%.
Zusammenfassend ist in beiden Modellenmodellen eine deutlich signifikante Erhöhung
der Metastasierung in den Lymphknoten durch die CTSL-Defizienz erkennbar. Die
detektierte Verschlechterung der Tumorsituation im Tg(K14HPV16) und dem
chemischen Karzinogenese Tumor-Maus-Modell könnte mit der in der chemischen
Karzinogenese erfolgenten Ras-aktivierenden Mutation erklärt werden (Leder et al.,
1990; Zhao et al., 2006). Diese Ras-Mutation führt zu einer permanenten RasAktivierung, die einer Abkopplung gegenüber dem EGF induzierten Signal
gleichkommt. Eine EGFR Signalverstärkung, beispielsweise durch eine EGFR
Konzentrationserhöhung hätte damit, keinen Einfluss mehr auf den Ras-Signalweg.
Jedoch kann eine EGFR Signalverstärkung weiterhin durch Quervernetzung auf andere
intrazelluläre Signalwege, wie auf PI3K wirken (Abbildung 48). Die durch die
chemische
Karzinogenese
möglicherweise
hervorgerufene
verantwortlich
für
den
permanente
Ras-Aktivierung
ähnlichen
Differenzierungsgrad von Karzinomen in ctsl+/+ und ctsl-/- Mäusen.
ist
histopathologischen
82
Abbildung 48: EGFR Signalkaskade im Tg(K14HPV16) (rechts) und dem chemischen
Karzinogenese (links) Mausmodell unter ctsl+/+ und ctsl-/- Bedingungen.
Die Pfeilstärken stehen für die Intensität des Signals. Das in der chemischen Karzinogenese permanent
durch Mutation aktivierte Ras wurde durch einen roten Blitz gekennzeichnet.
Allerdings scheint die Metastasierung in beiden Tumor-Maus Modellen relativ Rasaktivitätsunabhängig zu sein. Dabei könnte die erhöhte Metastasierung in den ctsl-/Mäusen durch indirekte Effekte zustande kommen. So kann beispielsweise die erhöhte
CTSB- und CTSD-Konzentration in ctsl-/- Keratinozyten für die Metastasierung
fördernd sein.
83
5.8
Synopsis und Ausblick
Die unterschiedlichen Auswirkungen der CTSL-Defizienz im Befund zwischen den
Hautkrebsmodellen und dem RIP1-Tag2 (Tabelle 3) Mausmodell erklären sich aus der
unterschiedlichen Funktion von CTSL in den Inselzellen des Pankreas und
Keratinozyten. CTSL hat in Keratinozyten sowohl eine entscheidende Funktion für die
Homöostase des endosomalen/lysosomalen Kompartimentes als auch in der
Signaltransduktion durch die Regulation von Wachstumfaktorendegradation und dem
Wachstumsfaktorrezeptorrecycling.
Dabei gilt es sowohl die molekularbiologische Funktion von CTSL in der Regulation
der endosomalen/lysosomalen Kompartimenthomöostase als auch den Defekt im
Prozess des Rezeptorrecyclings genauer zu analysieren. Weitere Untersuchungen sind
zur Festigung der molekularbiologischen Funktion bezüglich der detektierten
Unterschiede in den malignen Phänotypen der Mausmodelle geplant, die die Analysen
der Schlüsselproteine in der EGFR Signalkaskade sowie Marker der EMT, wie das
SNAIL, beinhalten. Ferner soll gezielt festgestellt werden, welche der pathologischen
Tumorphänotypen durch die Keratinozyten CTSL-Defizienz induziert werden. Aus
diesen Anlass wurde bereits ein Experiment zur gezielten Keratinozyten CTSL
Normalisierung in Tg(K14HPV16);ctsl-/- Mäusen durch eine Expression von humanem
CTSV vorbereitet. Dabei wurde gezeigt, dass zwischen humanem CTSV und murinen
CTSL nicht nur eine starke Sequenzhomologie existiert, sondern auch eine
Normalisierung des CTSL-defizienten Keratinozytenhautphänotyps durch gezielte
hCTSV Expression erreicht werden kann (Hagemann et al., 2004). Ferner könnten
weitere Proteasen wie CTSD und möglicherweise CTSB durch Prozessierung von
CTSL aktiviert oder inaktiviert werden und damit einen Einfluss auf die Karzinogenese
ausüben.
84
6 Zusammenfassung
Wachstum, Invasion und Metastasierung von Karzinomen ist ein multifaktorieller
Prozess, in dem proteolytische Enzyme, wie die lysosomalen Cystein- und AspartylCathepsine entscheidende Schritte der Pathogenese kontrollieren. In dieser Arbeit
wurde die Funktion von Cathepsin L (CTSL) bei epidermaler Karzinogenese an zwei
experimentellen
Mausmodellen
untersucht.
Dabei
erfolgt
die
Initiation
der
Karzinogenese im Tg(K14HPV16) Mausmodell durch epithelspezifische Expression der
„early region“ Gene des humanen Papillomavirus 16 (HPV16) unter der Kontrolle des
Cytokeratin 14 (K14) Promotors. Die chemisch induzierte Karzinogenese erfolgte durch
Applikation von DMBA als Tumorinitiator und TPA als Tumorpromotor. Bei
Tg(K14HPV16);ctsl-/- Mäusen wurde ein früheres Tumorauftreten (p<0,001) und ein
schnelleres Erreichen des Tumorendvolumens von 1 cm3 (p<0,01) detektiert. Ferner
zeigten Tg(K14HPV16);ctsl-/- Mäuse eine stärkere Anaplasie der Tumore (p<0,001), die
von einer erhöhte Epithelial-Mesenchymalen-Transition (EMT), und einer verstärkten
Metastasierung (p<0,01) begleitet wurde. Während der Tumorprogression wurde bei
CTSL-Defizienz eine frühere Ausbildung von Dysplasien und eine signifikant höhere
Keratinozytenproliferation, die sowohl von einer erhöhten Cathepsin B Aktivität und
Cathepsin D Konzentration, als auch einer höheren Anzahl von Mikroblutgefäßen nahe
der basalen Keratinozytenschicht in der 16. Woche begleitet werden, beobachtet. Weiter
wurde eine höhere Ras-Aktivität und eine erhöhte Anzahl endosomal/lysosomaler
Vesikel in Tg(K14HPV16);ctsl-/- und ctsl-/- Keratinozyten detektiert. In der chemischen
Karzinogenese
zeigten
die
ctsl-/-
Mäuse
eine
tendenziell
schlechtere
Tumordifferenzierung und eine erhöhte Metastasierung (p<0,05).
Es ist bekannt, dass ctsl-/- Keratinozyten eine erhöhte EGF-induzierte Proliferation und
ein verstärktes EGF-Recycling aufweisen. Dies führt zu einer verstärkten EGF-Signalkaskade und zu einer erhöhten Ras-Aktivität, die die schnellere Tumorprogression und
die anaplastischen Karzinome in den Tg(K14HPV16);ctsl-/- Mäusen erklären könnten.
Zusätzlich könnte die erhöhte Aktivität von Cathepsin B und Cathepsin D in den
Tg(K14HPV16);ctsl-/- und ctsl-/- Mäusen die Tumorzellmetastasierung unterstützen.
Diese Ergebnisse belegen eine Funktion von CTSL in der Epidermis, die im Sinne eines
Tumorsupressor-Mechanismus interpretiert werden kann. Der ursächliche molekulare
Zusammenhang ist wahrscheinlich in einer kritischen Funktion von CTSL bei der
Termination Rezeptor-vermittelter zellulärer Signalübertragung durch Abbau und
Recycling internalisierter Wachstumsfaktoren und ihrer Rezeptoren zu finden.
85
Abkürzungsverzeichnis
AMC
APS
ATP
BSA
CA074
CHAPS
ctsl/CTSL
dpi
DTT
EDTA
IEF
MMP
NCBI
PAGE
PBS
SD
SF
SDS
TEMED
TRIS
wt
ht
ko
RT
üN
CTSL
CTSB
CTSD
CTSH
CTSE
CTSX
hCTSV
MAPK
EGF
EGFR
TUNEL
FCS
KDa
PI3-K
PIP3
PDK1
GRB2
FAS
PCNA
IGF-1
Cdks
E2F1
Rb
TIMP-1
7-Amido-4-Methylcoumarin
Ammonium-Persulphat
Adenosin-Triphosphat
Rinderserumalbumin
N-L-3-trans-Propylcarbamoyloxiran-2-Carbonyl-L-Isoleucyl-L-Prolin
Cholamidopropyl-Dimethylammonio-1-Propansulfonat
Cathepsin L Gen/Protein
“dots per inch”
Dithiothreitol
Dinatriumethyldiamintetraacetat
isoelektrische Fokussierung
Matrix Metalloprotease
National Center for Biotechnology Information
Polyacrylamid Gel Electrophorese
Phosphate buffered saline (Phosphatpuffer)
Standardabweichung
Standardfehler
Natrium-Dodecylsulfat
Tetramethyl-Ethylenediamin
Tris(hydroxymethyl)-Aminoethan
“Wildtyp ” Mauslaborstamm
heterozygot
knock-out
Raum Temperatur
über Nacht
Cathepsin L
Cathepsin B
Cathepsin D
Cathepsin H
Cathepsin E
Cathepsin X
humanes Cathepsin V (hCTSL2)
Mitogen-aktivierte Proteinkinase
Epidermal Wachstumsfaktor
Epidermal Wachstumsfaktor Rezeptor
Terminal Desoxyribosyl –Transferase mediated dUTP Nick End
Labeling
Fetal Kälber Serum
Kilodalton
Phosphatidylinosidol 3 Kinase
Phosphatidylinositol(3,4,5)triphospate
Phosphatidylinositol-dependent Kinase 1
Growth factor receptor-bound protein 2
Tumor Nekrosisfaktor
Proliferation Zell Nukleräres Antigen
Insulin-Ähnlicher Wachstumsfaktor 1
Cyclin abhängige Proteinkinasen
Transkriptionsfaktor 1
retinoblastom
Gewebe Inhibitor von Metalloproteasen 1
86
VWF
TGF-ß
EMT
EZM
ATF2
Von Willebrand Faktor
Tranformierende Wachstums Faktor
Epithermale-Mesenchymale Transition
Extrazelluläre Matrix
Aktivierender Transkriptionsfaktor 2
87
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Danksagung
Ich bedanke mich für die großartige Zeit, die ich im Freiburger Labor in der
Arbeitsgruppe Reinheckel verbringen durfte. Ein Labor mit gutem Laborleben, bei dem
es Spaß gemacht hat, morgens aufzustehen und zur Arbeit zu gehen.
Ich bedanke mich ganz besonders bei Dr. Thomas Reinheckel, der mir nicht nur
ermöglichte, meine Doktorarbeit in seiner Arbeitsgruppe zu erstellen, sondern auch eine
Vielzahl positiver Erlebnisse wie fruchtbare Diskussionen, konstruktive Gespräche und
ein erfülltes Kongressnachtleben zu erfahren.
Ich möchte mich herzlich bei Prof. Dr. Christoph Peters bedanken, für die Möglichkeit,
in diesem Institut meine Arbeit anfertigen zu können. Beeindruckend ist seine
begeisterungsfähigkeit für naturwissenschaftliche Zusammenhänge, die er auf sein
Team übertragen kann.
Ich bedanke mich ganz besonders bei Sascha für die so oft geführten Diskussionen, die
Inspiration beim Kaffetrinken und besonders für unsere Freundschaft.
Weiterhin gilt mein herzlicher Dank Ulrike Reif, ohne ihr Zutun wäre all’ dies nicht
möglich gewesen.
Mein ganz besonderer Dank gilt Susanne für die Ausdauer mit der real time PCR, das
geduldige Einlernen und ihre Allgegenwärtigkeit.
Speziellen Dank an Julia, die sich voller Begeisterung in das Projekt, inklusiv
erfolgreich abgeschlossener Diplomarbeit einbrachte.
Ein Lob an die fleißige Tierstallfacility, mit der unsere Arbeit steht oder fällt.
Ein kompliment an Marlene, mit der ich innerhalb kürzester Zeit sehr viel Spaß hatte
und bei der ich das von mir bearbeitete Projekt in guten Händen weiß.
Einen
besonderen
Dank
an
Wolfgang,
der
immer
bereit
ist,
bei
technischen/Computerproblemen zur Seite zu stehen.
Ein speziell herzlicher Dank an das gesamte Labor: Anne, Lisa, mit der ich manch eine
konstruktive Diskussion beim Salat führen durfte, Nicole, die unseren Außenposten
darstellte und all’ anderen.
Ein Dank, der mir persönlich besonders am Herzen liegt, gilt meiner Familie und
meiner Zukünftigen und allen, denen mein Wohl am Herzen liegt.