Expression der ID-Proteine im Hepatozellulärem

Aus der Medizinischen Universitätsklinik Abteilung Innere Medizin II
und dem Institut für Pathologie
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
Expression der ID-Proteine im Hepatozellulärem Karzinom und
deren Bedeutung bezüglich des Gesamtüberlebens
Inaugural - Dissertation
Zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
Vorgelegt 2012
von Matthias Fuchs
geboren in Ulm
I
Dekan:
Prof. Dr. Dr. h.c. mult. H. E. Blum
1. Gutachter:
PD Dr. J. Harder
2. Gutachter:
Prof. Dr. A. Schmitt-Gräff
Jahr der Promotion: 2013
II
Widmung
Diese Dissertation möchte ich meinen Eltern, Dr. Reinhart Fuchs und Heidi Fuchs,
widmen. Sie haben mir meine sehr wertvolle schulische Ausbildung und das Studium
der Medizin erst ermöglicht. Für ihre Führsorge und ständige Hilfe möchte ich ihnen
danken. Sie waren immer für mich da und haben mich nach all ihren Möglichkeiten
unterstützt.
III
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung
1
1.1
Das Hepatozelluläre Karzinom
1
1.1.1
Epidemiologie
1
1.1.2
Ätiologie und Klinik
2
1.1.3
Diagnostik, Screening, Monitoring, Staging und Prognose
5
1.1.4
Therapie
7
1.1.5
Makro-, Mikroskopie und Pathologie
8
1.1.6
Molekulare Pathogenese
12
1.2
ID-Proteine: „Inhibitors of differentiation”
15
1.2.1
basic-Helix-Loop-Helix Proteine (bHLH)
15
1.2.2
ID-Proteine: Einführung
16
1.2.3
ID-Proteine im gesunden Gewebe
17
1.2.3.1
ID-Proteine regulieren negativ die Differenzierung
17
1.2.3.2
ID-Proteine: Zellzykluskontrolle und Zellschicksal
18
1.2.3.3
Zellen könnten von ID-Proteinen aus der stabilen Gı-Phase
zurück in die proliferative S-Phase überführt werden
19
1.2.3.4
ID-Proteine und Karzinogenese in gesunden Zellen
20
1.2.4
ID-Proteine: Karzinogenese und Expression in Tumoren
21
1.2.5
ID-Proteine und Tumorprogression
25
1.2.6
ID-Proteine im HCC
28
1.2.6.1
ID Proteine in der Leberentwicklung
29
1.2.6.2
ID1 in Hepatitis- und Zirrhosegewebe
29
1.2.6.3
ID1-, ID2- und ID3-Expression im HCC und klinische Parameter
30
1.2.6.4
ID1-Expression und Proliferation
30
1.2.6.5
ID2-Expression und Metastasierung
31
2
Fragestellung
33
IV
3
Material und Methoden
34
3.1
Patientenkollektiv
34
3.1.1
Geschlecht, Alter bei Erstdiagnose und Überleben
35
3.1.2
Uni- oder multilokuläre Tumorausbreitung und
36
Differenzierungsgrad
3.1.3
Ätiologie und Therapie
36
3.1.4
AFP-Wert, Child-Pugh- und Meld-Score
38
3.2
Immunohistochemische Färbung
39
3.2.1
Arbeitsschritte der immunohistochemischen Färbung
40
3.2.2
Austestung der Färbung
44
3.3
Kontrollen
46
3.3.1
Kontrollgewebe von nicht erkrankten Lebern
46
3.3.2
Positiv Kontrollen und negativ Kontrollen
46
3.3.3
Blocking Peptides
47
3.4
Reagenzien & Materialien
48
3.5
Auswertung
50
3.5.1
Auswertungskriterien
50
3.5.2
Statistische Auswertung
54
4
Ergebnisse
55
4.1
Spezifitätsnachweis immunohistochemischer Färbung
55
4.1.1
Kontrollen: Blocking Peptides
55
4.1.2
Sytemkontrollen
56
4.1.3
Positiv Kontrollen
58
4.2
ID-Expression in normalen Lebergewebe
60
4.3
ID-Expression im Hepatozellulären Karzinom
62
4.3.1
ID1 Expression im HCC
64
4.3.2
ID2-Expression im HCC
67
4.3.3
ID3-Expression im HCC
69
V
4.3.4
ID4-Expression im HCC
71
4.4
Vergleich der ID-Expression im Tumor und Normalgewebe
74
4.4.1
ID1 Expression im HCC und Normalgewebe
79
4.4.2
ID2 Expression im HCC und Normalgewebe
81
4.4.3
ID3 Expression im HCC und Normalgewebe
83
4.4.4
ID4 Expression im HCC und Normalgewebe
85
4.5
Korrelationen der ID-Expression mit klinischen Variablen
87
4.5.1
ID-Expression und Gesamtüberleben
87
4.5.1.1
ID1-Expression und Gesamtüberleben
91
4.5.1.2
ID2-Expression und Gesamtüberleben
93
4.5.1.3
ID3-Expression und Gesamtüberleben
95
4.5.1.4
ID4-Expression und Gesamtüberleben
97
4.5.2
ID-Expression und weitere klinische Parameter
99
4.5.2.1
ID-Expression und MELD-Score sowie Child-Stadium
99
4.5.2.2.
ID-Expression und Therapieansprechen
103
4.5.2.3
ID-Expression und Lokalisation
105
4.5.2.4
ID-Expression und Differenzierungsgrad
106
4.5.2.5
ID-Expression und Erkrankungsalter, Ätiologie, Geschlecht
107
5
Diskusion
108
5.1
Bedeutung der ID Expression im neoplastischen Gewebe
108
5.2
Differenter Expressionsstatus der ID-Proteine im HCC und gesundem
Gewebe: sind die ID-Proteine an der Onkogenese beteiligt?
110
5.2.1
ID1-Expression im HCC und dessen Bedeutung bei der Onkogenese
111
5.2.2
ID2-Expression im HCC und dessen Bedeutung bei der Onkogenese
114
5.2.3
ID3-Expression im HCC und dessen Bedeutung bei der Onkogenese
116
5.2.4
ID4-Expression im HCC und dessen Bedeutung bei der Onkogenese
118
5.3
ID-Proteine könnten über ihre Lokalisation innerhalb der Zelle reguliert
120
werden und in den Zellzyklus unterschiedlich eingreifen
5.3.1
Subzelluläre Translokalistaion von ID1
121
VI
5.3.2
Subzelluläre Translokalistaion von ID2
122
5.3.3
Subzelluläre Translokalistaion von ID3
124
5.3.4
Subzelluläre Translokalistaion von ID4
124
5.4
Korrelationen der ID-Expression mit klinisch-pathologischen Variablen
125
5.4.1
Kaplan-Meier Berechung: ID-Expression und Gesamtüberleben
126
5.4.1.1
ID1 und Gesamtüberleben
127
5.4.1.2
ID2 und Gesamtüberleben
130
5.4.1.3
ID3 und Gesamtüberleben
133
5.4.1.4
ID4 und Gesamtüberleben
135
5.4.2
Korrelation mit weitern klinischen Parametern
136
5.4.2.1
ID-Expression und Differenzierungsgrad
137
5.4.2.2
ID-Expression und intrahepatische Metastasen
138
5.4.2.3
ID-Expression und MELD-Score
139
5.4.2.4
ID-Expression und Therapieansprechen
140
5.4.2.5
ID-Expression und weitere klinisch-pathologische Parameter
140
5.5
Die subzelluläre Lokalisation der ID-Proteine als molekularer
Marker und Prognosefaktoren im HCC
141
5.6
Ausblick
141
6
Zusammenfassung
144
7
Abkürzungsverzeichnis
146
8
Literaturverzeichnis
148
9
Danksagung
157
10
Lebenslauf
159
VII
Expression der ID-Proteine im Hepatozellulärem Karzinom und
deren Bedeutung bezüglich des Gesamtüberlebens
1. Einleitung
1.1 Das Hepatozelluläre Karzinom
1.1.1 Epidemiologie
Das Hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist die häufigste primäre, also von
lebereigenen Zellen ausgehende, Neoplasie der Leber. Ebenso stellt das HCC die
dritthäufigste Todesursache weltweit unter den Krebserkrankungen dar. Auf der Liste
der häufigsten Krebserkrankungen weltweit findet man das HCC auf dem fünften
Platz
6,35,36,75,101
. Hierbei müssen aber die zum Teil deutlichen geographischen
Unterschiede genannt werden (siehe Abbildung 1). So kommen über 80 % der HCC
Fälle im mittleren und südlichen Afrika oder in Ostasien vor. In manchen dieser
Länder kann das HCC die häufigste Todesursache durch Tumore darstellen
75
.
Demgegenüber stehen Länder der westlichen Welt (West- und Mitteleuropa,
Nordamerika, Australien, Neuseeland), in denen das HCC eher eine untergeordnete
Rolle spielt, die aber im Gegensatz zu den Ländern mit hoher Prävalenz eine starke
Zunahme der Inzidenz aufzeigen 35. So stieg zum Beispiel die Inzidenz in den USA in
den letzten 20-30 Jahren um ca. 80 % 6 wodurch das HCC auch bei uns immer mehr
an Bedeutung gewinnt. Interessanterweise ist die ungleiche Verteilung unter den
Geschlechtern zulasten der Männer weltweit mit 2:1 bis 4:1 ähnlich 35,36.
1
Abbildung 1: Regionale Variationen der Mortalitätsraten des HCC: kategorisiert nach dem Alter
angepasste Mortalitätsraten pro 100,000 Personen
35
.
1.1.2 Ätiologie und Klinik
Im Gegensatz zu vielen anderen Tumoren sind die Hauptrisikofaktoren des HCC
sehr gut definiert. Bei über 80 % liegt eine Leberzirrhose der Tumorentstehung
zugrunde
75
(in der westlichen Welt sogar bei über 95 %). Das Hepatitis-C-Virus
(HCV) ist vor allem in der westlichen Welt der wichtigste Risikofaktor, der zur
Entstehung einer Zirrhose und somit zum wichtigsten prädisponierenden Faktor des
HCC, führt
35
. In der Abbildung 2 wird wiedergegeben wie eine HCV Infektion zur
Entstehung eines HCC führen kann. Durch die steigende HCV Prävalenz kann man
sich
auch
die
pathoätiologische
steigende
Faktoren
Inzidenz
sind
des
HCC
erklären.
regelmäßiger
Weitere
Alkoholkonsum
Stoffwechselerkrankungen wie zum Beispiel die Hämochromatose
wichtige
und
35
. In Ländern mit
hoher HCC Inzidenz (in Afrika und Asien) ist als wichtigster Risikofaktor die HepatitisB-Virusinfektion (HBV) zu nennen. Typischerweise infizieren sich in diesen Ländern
Patienten schon perinatal oder früh in ihrer Kindheit. Hinzu kommt die häufigere
Verunreinigung der Lebensmittel mit dem hepatotoxischen Aflatoxin B1. Ebenso
2
kann in diesen Ländern die Durchseuchung mit dem HCV sehr hoch sein und somit
zur Entstehung des HCC beitragen.
Diese
Unterschiede
der
Ätiologie
machen
sich
durch
Unterschiede
im
Erkrankungsalter bemerkbar. Während in den westlichen Ländern die Patienten
meist erst in einem mittleren (> 45 Jahre) Alter und mit schon länger bestehender
Zirrhose an einem HCC erkranken, sind die Erkrankten in den Ländern mit hoher
Inzidenz häufig junge (< 40 Jahre) Patienten mit bis zu 40 % ohne Zirrhose
75
.
Auffallend ist ebenso, dass mehrere Risikofaktoren zusammen verstärkt wirken und
eine Karzinogenese beschleunigen können. Genetische Faktoren scheinen im
Vergleich zu den geographisch bedingten (HCV, HBV, Aflatoxin, …) eine
untergeordnete Rolle zu spielen, wobei stets mehr Ergebnisse in der Forschung über
die genetische Veranlagung und Entstehung eines HCC erzielt und zukünftige
sicherlich noch besser zu Verständnis der HCC Ätiologie beitragen werden
35
.
Weitere, hier noch nicht genannte Risikofaktoren, die direkt oder als Kofaktoren zu
einer chronischen Hepatitis und/ oder einer Leberzirrhose und somit zu einem HCC
beitragen können, sind zum Beispiel Diabetes mellitus oder Obesitas, die mit einem
Stoffwechseldefekt einhergehen und zu nicht alkoholischer Steatohepatitis führen.
Ebenso sind Lebensalter und männliches Geschlecht anerkannte Risikofaktoren und
bei der Ätiologie des HCC beteiligt. Dies dürfte wohl einerseits an der stärkeren
Exposition
der
männlichen
Bevölkerung
gegenüber
Risikofaktoren
liegen,
andererseits wird aber auch ein Einfluss der Androgene auf die Entstehung des HCC
angenommen. Es konnte ebenfalls eine höhere Syntheserate der DNA in
Hepatozyten bei Männern nachgewiesen werden. Dies führt wiederum zu einem
wahrscheinlicheren Erwerb von Mutationen, welche eine HCC Entwicklung
begünstigen können 35,36,77.
3
Abbildung 2: Beispiel der Entstehung eines HCC auf Basis einer HCV-Infektion. Es wird prozentuell
angegeben wie viel Patienten den Weg von der primären HCV-Infektion bis zum manifesten HCC
durchlaufen und wie lange diese Entwicklung ungefähr dauert
35
.
Klassische Symptome für ein HCC sind Schmerzen im rechten Oberbauch und
Gewichtsverlust. Weitere Symptome, die zu einem HCC passen, ergeben sich aus
einer sich verschlechternden Leberfunktion 6. Diese können sich über eine erhöhte
Blutungsneigung oder vermehrtes Auftreten von Hämatomen äußern. Ebenso
passen dazu Ödeme, Aszites und eine erhöhte Infektanfälligkeit. Zusätzlich können
eine Leberruptur, extrahepatische Manifestationen oder in fortgeschritteneren Fällen
eine hepatische Encephalopathie auftreten. Dennoch werden immer häufiger
aufgrund von Monitoring-Untersuchungen HCC in einem frühen asymptomatischen
Stadium diagnostiziert
6
. Interessanterweise machen sich die geographisch
bedingten Unterschiede der Ätiologie auch klinisch bemerkbar. So besteht in
westlichen Ländern häufig sehr lange eine Zirrhose vor dem Auftreten eines HCC. In
Süd-Ost Asien und Afrika dagegen tritt das HCC häufig ohne die ersten Anzeichen
einer Zirrhose auf 77.
4
1.1.3 Diagnostik, Screening, Monitoring, Staging und Prognose
Da gerade Tumore in frühen Stadien erfolgreich und mit guter Prognose behandelt
werden können, ist eine frühe Erkennung von großer Bedeutung. Bildgebende
Verfahren spielen bei der Diagnostik des HCC eine Schlüsselrolle. Hierbei hat die
Sonographie den Vorteil der unbedenklichen häufigen Anwendungsmöglichkeit und
kommt somit als Screeninginstrument bei Zirrhosepatienten zur Anwendung (siehe
Abbildung 3). Die Sonographie ist aber aufgrund der geringen Sensitivität bezüglich
der
Detektion
kleiner
Tumore
der
Computertomographie
Magnetresonanztomographie (MRT) unterlegen
(CT)
und
der
75
. Ein weiteres Hilfsmittel ist die
Bestimmung des α-Fetoprotein (AFP) im Serum. In über 70 % der Fälle ist dieser
Tumormarker bei Vorliegen eines HCC erhöht (> 20 ng/ml). Man muss aber
bedenken, dass die Spezifität erhöhter AFP-Werte niedrig ist, weil falsch positive
Werte, zum Beispiel bei einer aktiven Hepatitis, vorkommen 6.
Die American Association for the Study of Liver Diseases (AASLD) hat genaue
Diagnoserichtlinien erarbeitet, nach denen vor allem die Größe der Raumforderung
als auch die früh arterielle Anreicherung von Kontrastmittel (KM) sowie venöse
Auswaschung von KM (bei CT oder MRT Untersuchungen) und der Serum AFP-Wert
eine entscheidende Rolle spielen. Ein HCC gilt dementsprechend zum Beispiel als
gesichert bei Vorliegen einer Leberzirrhose und einem HCC-typischen fokalen
Leberbefund größer 2 cm in der Schnittbildgebung (MRT, Spiral-CT) oder einem
AFP-Wert größer 200 ng/ml. Aufgrund der Möglichkeit einer nicht invasiven
Diagnosestellung sollte eine Feinnadelbiopsie somit niemals Mittel der ersten Wahl
sein und nur als weitere Möglichkeit bei unklarer Diagnose betrachtet werden, da die
Möglichkeit der Tumorzellverschleppung im Stichkanal (circa 1 %)75 einen
anschließenden kurativen Therapieansatz in Frage stellen kann.
Bei bekannter
Leberzirrhose wird alle sechs Monate eine Sonographie zur Früherkennung
empfohlen 10,37,75,132.
5
Abbildung 3: HCC-Diagnose-Algorithmus
Das
HCC
bildet
unter
den
10
.
Tumoren
eine
Ausnahme
bezüglich
der
Ausbreitungsdiagnostik. Dies beruht darauf, dass die Prognose nicht nur auf der
Biologie des Tumors basiert sondern auch von der Leberfunktion abhängig ist. Zur
Zeit sind mehrere Staging- und Prognose-Systeme vorhanden: pTNM-6, Okuda,
Cancer of the Liver Italian Program (CLIP), Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC),
und weitere hier nicht genannte Einteilungen. Ebenso sind der Child-Pugh Score
sowie der MELD (Model of Endstage Liver Disease) Score bedeutsame
Einteilungssysteme, die die Prognose der zugrunde liegende Leberzirrhose
bestimmen. Der PST (preformance statement test) wiederum gibt eine gute Auskunft
über die allgemeine Verfassung des Patienten. Jedes einzelne System hat seine
Stärken und Schwächen.
Die Einteilung nach Okuda war die erste, welche die Tumorgröße zusammen mit
klinischen Parametern der Leberfunktion (Aszites, Serum Albumin, gesamt Billirubin)
kombiniert hat. Sie kann sehr gut ein besonders weit vorgeschrittenes Tumorstadium
(Okuda Stadium 3) von frühen und wenig vorgeschrittenen (Stadium 1&2)
6
abgrenzen. Demgegenüber steht zum Beispiel die BCLC, welche sich vor allem bei
der Unterscheidung früher Stadien bewährt hat. Der CLIP-Score weist rein
mathematisch gesehen die beste prognostische Wertigkeit auf. Der Child-PughScore berücksichtigt die Parameter Serum Albumin, gesamt Bilirubin, INR, Aszites
und hepatische Enzephalopathie. Somit gibt er eine gute Übersicht über die
Restfunktion der Leber und ist dadurch zum Beispiel bei der Entscheidung, ob
reseziert werden kann, entscheidend. Auch zur Dringlichkeitsbestimmung einer
Transplantation kann er verwendet werden, wobei sich hier der neuere, dafür
evaluierte, MELD Score immer mehr durchsetzt. Zusammenfassend muss gesagt
werden, dass ein einziges Einteilungssystem nicht ausreicht um verschiedene
Tumorstadien ganzheitlich gut zu erfassen und bezüglich ihrer Prognose und
Therapieoptionen in sinnvolle Gruppen einzuteilen. Erst die Kombination von
mehreren Systemen bringt hier befriedigende Ergebnisse 6,16,95,96,103.
Das fünf-Jahres-Überleben (5-JÜ) eines frühen Stadiums mit einem Child-Plug-Score
A bei nur einem Tumorherd beträgt derzeit 50-70 % 75.
1.1.4 Therapie
Es stehen verschiedene Therapieoptionen zur Verfügung und es ist von
entscheidender Bedeutung über ein sorgfältiges Staging die jeweils optimale
Therapie für einen Patienten herauszusuchen. Patienten in einem sehr frühen
Stadium profitieren am meisten von einem radikalen Ansatz. So sollte die Resektion
oder die Transplantation bei passenden Rahmenbedingungen die erste Wahl sein.
Für die Wahl zu einer radikalen Therapie haben sich die folgende Unterteilungen als
praktikabel erwiesen. So wird eine Transplantation bei einem singulären Tumor bis
zu einem Durchmesser von maximal 5 cm oder bei maximal drei Tumoren bis zu
einem jeweiligen maximalen Durchmesser von 3 cm empfohlen sofern auf Grund
einer eingeschränkten Restleberfunktion nicht reseziert werden kann. Weitere häufig
angewandte Therapieformen stellen die lokalen Therapien dar. Dazu gehören als
wichtigste Vertreter die perkutane Ethanol-Injektion (PEI) und die transkutane
7
Radiofrequenzablation (RFA). Diese eignen sich besonders bei kleinen, auf die
Leber begrenzte nicht resezierbare Tumore oder bei langer Wartezeit auf eine
Transplantation. Für Patienten in fortgeschrittenen Stadien mit extrahepatischem
Befall (BCLC-Stadium: C) stehen neue systemische Therapien zur Verfügung,
ebenso kann als palliative Maßnahme eine transarterielle Chemoembolisation
(TACE) in Betracht gezogen werden um die Tumormasse zu verringern. Und bei
Patienten in fortgeschrittenen Stadien mit zusätzlich schlechter Leberfunktion (BCLCStadium: D), sollten, wegen des fehlenden Nutzens, keine weiteren Therapien als die
Behandlung von symptomatischen Beschwerden durchgeführt werden 75.
Präventiv lässt sich durch großflächig angelegte Impfprogramme gegen HBV die
Inzidenz gerade in den Ländern Afrikas und Südostasiens sehr effektiv reduzieren
75
.
Da noch kein Impfstoff gegen das HCV zur Verfügung steht, gilt es hier vor allem
über verbesserte Hygienemaßnahmen die Zahl der Neuinfektionen zu senken.
1.1.5 Makro-, Mikroskopie und Pathologie
In der Makroskopie finden sich sowohl infiltrativ, als auch expansiv wachsende
Tumore und es kommen ebenso Mischformen von beiden vor. Diese drei Typen
können als große massive Wucherungen imponieren. Des Weiteren kommt ein
diffuser Typ vor, welcher sich mit vielen kleinen Tumoren manifestiert und häufig in
zirrhotischem Gewebe entsteht. Man kann makroskopisch häufig Nekrosen,
Hämorrhagien, eine gute Vaskularisation und eine Kapsel um das Tumorgewebe
vorfinden (siehe Abbildung 4) 77,106.
8
A
B
Abbildung 4:
Makroskopischer Schnitt einer zirrhotisch veränderten Leber: A: multilokuläre
Tumorausbreitung B: unilokulärer, eingekapselter Tumor
77
.
Mikroskopisch kommen häufig gut differenzierte Tumoren vor, die pseudoglanduläre
Strukturen ausbilden, zum Teil sogar Galle bilden und so normalen Hepatozyten sehr
ähnlich sind. Aber auch sehr undifferenzierte Tumoren mit oft unterschiedlichen
Morphen und aufgelöster Struktureinheit sind anzutreffen. Das histologische
Aussehen ist dementsprechend variabel. Nach Goodman und Terracciano sind in
Anlehnung an Ishak verschiedene histologische Wachstumsmuster zu unterscheiden
29,38,47,77
, diese sind in der Abbildung 5 wiedergegeben.
Trabekulärer Typ: Er stellt das häufigste histologische Wachstumsmuster dar. Es
handelt
sich
meist
um
hochdifferenzierte
Karzinome.
Die
polyglonalen,
hepatozytenähnlichen Tumorzellen wachsen in mehrschichtigen Zellbalken und
umschließen weite, endothelausgekleidete Bluträume.
Pseudoglandulärer Typ: Auch hier finden sich überwiegend hochdifferenzierte Zellen,
die drüsenartige, glanduläre Strukturen ausbilden. Die drüsenähnlichen Lichtungen
enthalten Zelldetritus, Makrophagen, fibrinreiches Exudat und zum Teil sogar Galle.
Dieser histologische Wachstumstyp kommt meist in Kombination mit dem
trabekulären Typ vor.
Szirrhöser Typ: Dieser seltene Wachstumstyp des HCC zeichnet sich durch einen
hohen Anteil desmoplastischer Stromareaktion aus. Zwischen den Stromazellen
liegen in Inseln die neoplastischen teils trabekulär angeordneten Tumorzellen.
9
Solider oder kompakter Typ: Hier handelt es sich um meist schlecht differenzierte
Zellen, welche eine dicht gepackte Zellanordung mit zum Teil sehr prominenten
Kernen mit nur schmalem Plasmasaum aufweisen und durch Verlust des
trabekulären Gewebemusters charakterisiert werden. Die Tumorzellen weisen eine
erhebliche Zellpolymorphie auf. Kompressionsartefakte oder eine regressive
Vernarbung
nach
Spontannekrosen
oder
Chemo-
/Strahlentherapie
können
Ursachen dieses histologischen Typus sein.
Klarzelliger Typ: Der klare Aspekt des Zytoplasma entsteht durch zytoplasmatische
Fett- oder Glykogeneinlagerungen, die bei der Gewebsaufarbeitung herausgelöst
werden. Besonders in der PAS Färbung kommt dies gut zum Vorschein.
Einen Spezialtyp bildet das sehr seltene fibrolamelläre Karzinom. Es grenzt sich
durch seine Morphologie, Prognose und Genese gegenüber den anderen Typen
deutlich ab. Die Karzinomzellen sind in hohem Anteil von Kollagenfasern regelrecht
eingemauert. Es tritt vor allem in nicht zirrhotischem Gewebe auf und kommt viel
häufiger bei Kindern und Jugendlichen (40 %) als bei Erwachsenen (5 %) in den
westlichen Ländern vor. Die Prognose ist mit einem 5-JÜ von 50 % im Allgemeinen
wesentlich besser als bei anderen HCC Typen.
Interessanterweise kommen verschiedene Wachstumsmuster parallel innerhalb
desselben Tumors vor. So finden sich trabekuläre neben pseudoglandulären Anteilen
oder
hellzellige
Tumorabschnitte
neben
hepatozytenähnlich
differenzierten
Tumorzellen. Diese Beispiele stehen somit repräsentativ für eine auffallende
intratumoröse Heterogenität, welche sehr häufig anzutreffen ist und eine exakte
Befundung der Präparate oft schwierig macht. Zytologisch zeigen Tumorzellen des
HCC
im
Allgemeinen
ein
feingranuliertes,
eosinophiles
Zytoplasma
mit
hyperchromatischen, vergrößerten Zellkernen und prominenten Nukleolen auf.
Die Einteilung von Edmondson und Steiner kann für die pathologisch-histologische
Graduierung („Grading“) des HCC verwendet werden (siehe Abbildung 6). Sie richtet
sich nach folgenden Kriterien: die Kern-Plasma Relation, der Chromatingehalt, das
Ausmaß der Azidophilie, die zelluläre Funktion (Gallenbildung), sowie die
histologische Architektur (Zelladhäsionen, trabekuläre oder pseudoglanduläre
Differenzierung). So ist in gut differenzierten Tumoren noch eine Anordnung der
Zellen in Balken mit zum Teil einer Ausbildung von Sinusoiden dazwischen sichtbar
10
(Grad 1). Mit zunehmender Dedifferenzierung nimmt die Unordnung im Zellverband
zu und die Zellen selbst bilden zum Teil sehr große Zellkerne aus. Das
Graduierungssystem von Edmondson und Steiner unterteilt in „gut differenzierte“ (1),
„mäßig
differenzierte“
(2),
33
differenzierte“ (4) Tumore
„schlecht
differenzierte“
(3)
II. Pseudoglandulär
III. Szirrhös
IV. Solide
V. Klarzellig
VI. Fibrolamellär
5: Mikroskopie
„sehr
schlecht
(siehe Abbildung 6).
I. Trabekulär
Abbildung
und
unterschiedlicher
histologischer
Wachstumsmuster
des
HCC
(Vergrößerung 20 bis 40 fach, HE-Färbung): I: trabekulär; II: pseudoglandulär; III: szirrhös; IV: solide;
V: klarzellig; VI: fibrolamellär
77
.
11
Grad 1
Grad 2
Grad 3
Grad 4
Abbildung
6:
Mikroskopie unterschiedlicher
Vergrößerung 40 fach)
Differenzierungsgrade des
HCC
(HE-Färbung,
77
.
1.1.6 Molekulare Pathogenese
Die Pathogenese des HCC basiert in der überwiegenden Anzahl der Fälle auf einem
chronischen Leberschaden. Interessanterweise aber ist eine, durch zum Beispiel
HCV entstandene Zirrhose, stärker prädisponierend für eine HCC Entwicklung, als
eine durch Alkoholkonsum hervorgerufene Zirrhose. Diese Befunde weisen bereits
auf die sehr komplexe und heterogene Pathogenese des HCC hin. So sind heute auf
molekularer Ebene viele unterschiedliche Mechanismen bekannt, die zur Entstehung
des HCC beitragen. Abhängig von dem ätiologischen Agens weisen die HCC eine
große morphologische wie auch molekulare Heterogenität auf
36
. Der Verlust von
Tumorsuppressorgenen, die Aktivierung verschiedener Onkogene, der Verlust von
Zellzyklus-Checkpoints und immunologische Mechanismen sind nur einige dieser
pathogenetischen Faktoren, die zu Tumoren unterschiedlicher Morphe führen 35,75.
12
Entscheidender Schritt in der Karzinogenese des HCC ist die Entwicklung einer
Leberzirrhose und der Faktor Zeit (siehe Abbildung 2). Die überwiegende Mehrzahl
aller HCC entwickelt sich aus einer Leberzirrhose innerhalb von 20 bis 40 Jahren. Zu
den
wichtigen
molekularen
Mechanismen,
welche
im
Zirrhosestadium
die
Karzinogenese des HCC begünstigen, gehören drei entscheidende Schritte. Zum
einen eine Telomeraseverkürzung, welche zur Aneuploidie des Chromosomensatzes
führen kann. Ebenso eine verminderte Proliferationsfähigkeit der Hepatozyten,
wodurch die Konkurrenz für neoplastisch veränderte Zellen verringert wird und sie
sich leichter ungehemmt ausbreiten können. Und letztlich könnten leberspezifische
Wachstumsfaktoren
als
Antwort
der
verminderten
Leberfunktion
des
Zirrhosestadiums ausgeschüttet werden, welche eigentlich dazu dienen sollten, das
funktionelle Lebergewebe zu vergrößern, nun aber vor allem, auf Grund der
erschöpften Regenerationsfähigkeit gesunder Hepatozyten, auf die Tumorzellen
stimulierenden Einfluss nehmen. Alle drei Mechanismen, Telomeraseverkürzung,
verminderte
Proliferationsfähigkeit
gesunder
Hepatozyten
und
wachstumsstimulierende Faktoren führen letztlich zu einer Selektion der Tumorzellen
(siehe Abbildung 7).
Des Weiteren sind bei der Tumorentstehung und Progression vornehmlich die im
Folgenden genannten Tumorsupressor- und Onkogene beteiligt. So nimmt der p53Signalweg eine zentrale Rolle in der Entstehung des HCC ein und ist häufig in frühen
HCC Zellen dysreguliert. Eine weitere prominente Signalwegkaskade, welche in
80 % der HCC Zellen gestört ist, ist der p16/Rb-Signalweg. Die Unterdrückung des
Tumorsuppressorgens p16 kann vor allem im Zirrhosestadium zur Entstehung eines
HCC über Verlust des Rb-Checkpoints im Zellzyklus beitragen. Auch wird häufig eine
Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs gefunden, welcher direkt auf das
Zellwachstum und die Proliferation als Onkogen Einfluss nimmt. Allerdings kann dies
erst sehr spät in der Entstehung des HCC beobachtet werden und spielt vielleicht
eher in der Tumorprogression als in der Tumorentstehung eine Rolle 35.
13
Abbildung 7: Molekulare Mechanismen, die die Entstehung des HCC im Zirrhosestadium
herbeiführen. Es werden sowohl die intrinsischen Vorgänge in den Zellen als auch die extrinsischen
Faktoren des gesamten Organismus veranschaulicht
35
.
14
1.2 ID-Proteine: „Inhibitors of differentiation”
1.2.1 basic-Helix-Loop-Helix-Proteine (bHLH)
Als Transkriptionsfaktoren regulieren die bHLH-Proteine über die Expression von
Genen die Koordination des Zell Zyklus, die Zelldifferenzierung und die
Spezialisierung der Zellen 93.
Die Einteilung der verschiedenen bHLH-Proteine erfolgt in 6 Gruppen mit insgesamt
44 Familien
110
. Homodimere der Gruppe B , zum Beispiel MyoD, NeuroD und viele
weitere, aktivieren besonders gewebespezifische Gene. BHLH Proteine aus diesen
gewebespezifischen Familien der Gruppe B dimerisieren typischerweise mit den
ubiquitär vorkommenden Vertretern der Gruppe A (Genprodukte von E2A, E2-2, HEB
und weiteren bHLH kodierenden Genen), auch E-Proteine genannt und bilden mit
ihnen Heterodimere. Diese Heterodimere wiederum aktivieren die Transkription von
Genen, welche mit der Differenzierung der Zellen zusammenhängen 93.
Die bHLH-Proteine weisen hierbei einen typischen Aufbau auf (siehe Abbildung 8).
So besitzen sie stets zwei alpha-Helices, einen sie verbindenden Loop und die so
genannte „basic domain“. Die beiden hoch konservierten alpha-Helices dienen der
Dimerisation mit einem weiteren bHLH-Protein. Somit können unter gleichen bHLHProteinen
Homodimere
und
zwischen
unterschiedlichen
bHLH-Proteinen
Heterodimere gebildet werden. Die „basic domain“ wiederum trägt Abschnitte mit
basischen Aminosäureresten, die eine Bindung an die DNA ermöglicht. Diese
Bindung an die DNA erfolgt nach der Dimerisation zweier bHLH-Proteine.
Verschiedene Hetero- und Homodimere binden hierbei mit unterschiedlich großer
Affinität an die DNA. Als Dimere docken sie typischerweise an eine so genannte E11,15
box auf der DNA an
. Diese E-Box besteht gewöhnlich aus einer
charakteristischen Hexanukleotidsequenz (CANNTG für die Gruppe A, oder
CACGTG für Gruppe B)
93
. Nachdem ein bHLH-Dimer an die DNA gebunden hat,
wird der auf die E-Box folgende DNA-Abschnitt nun vermehrt transkribiert.
15
Abbildung 8: Motiv eines Proteins mit einer basic-helix-loop-helix Struktur: Die zwei alpha-Helices
(blau) sind über einen „Loop“ (rot) mit einander verbunden (die sogenannte basic-domain ist in dieser
Grafik nicht abgebildet, aus: „Card PB, Erbel PJ, Gardner KH (2005). Structural basis of ARNT PAS-B
dimerization: use of a common beta-sheet interface for hetero- and homodimerization. J. Mol. Biol.
353 (3): 664–77“)
1.2.2 ID-Proteine: Einführung
Inhibitors of Differentiation/ Inhibitors of DNA binding (ID) Proteine formen eine
eigene Gruppe (Gruppe D) unter den HLH-Proteinen und treten als negative
Inhibitoren anderer HLH-Proteine auf. Da auch sie zwei alpha-Helices besitzen
können sie mit anderen bHLH-Proteinen Heterodimere bilden. Im Gegensatz zu den
übrigen bHLH-Proteinen fehlt den ID-Proteinen jedoch die zur Bindung an die DNA
notwendige „basic domain“. Dadurch wird eine Bindung des Heterodimers an die
DNA unmöglich. Somit verhindern die ID-Proteine, dass die bHLH-Proteine
funktionelle Dimere bilden und als Transkriptionsfaktoren aktiv werden (siehe
Abbildung 9). Über die Dimerisation mit bHLH-Proteinen (zum Beispiel E-Proteinen:
E12, E47 oder E2-2) können sie so Einfluss auf die Differenzierung nehmen (siehe
16
oben). Ebenso sind Interaktionen mit weiteren, den Zellzyklus regulierenden
Faktoren bekannt
1,9,40,63,105,119,137,144
. Vier einzelne Proteine können bisher dieser
Gruppe zugerechnet werden. Sie wurden chronologisch nach der Reihenfolge ihrer
Entdeckung ID1 bis ID4 genannt.
Abbildung 9: A: Homodimer zweier bHLH führen zur Transskription B: Auf Grund ihrer fehlenden
basic domain kann nach der Heterodimerisierung eines ID-Proteins mit einem bHLH-Protein dieser
Komplex nicht an die DNA binden und die Transkribtion des Gens wird unterdrückt
115
.
1.2.3 ID-Proteine im gesunden Gewebe
1.2.3.1 ID-Proteine regulieren negativ die Differenzierung
Im normalen Zellzyklus haben die ID-Proteine verschieden Aufgaben. Aufgrund vieler
Untersuchungen kann man annehmen, dass ID-Proteine bei der Zelldifferenzierung
eine entscheidende Rolle spielen woher sich ihr Name „inhibitor of differentation“
ableitet. So konnte an Zelllinien von Keratinozyten gezeigt werden, dass einerseits
eine im Experiment künstlich induzierte Differenzierung mit einem Sinken der ID1-,
17
ID2- & ID3-Expression einhergeht und andererseits auf eine Stimulation der
Zellteilung
eine
erhöhte
ID-Expression
folgt
61
.
Dementsprechend
zeigten
proliferierende Zellen im Stratum basale eine starke ID-Expression, während in
ausdifferenzierten Keratinozyten keine ID-Expression mehr nachzuweisen war. Auf
eine Induktion der ID-Proteine konnte eine Verlängerung der normalen in vitro
Lebenszeit erreicht werden
Mäusen betrachtet,
1,23,90,123
. Wenn man Fibroblasten von ID1-knockout-
kann man eine verfrühte Seneszenz im Gegensatz zum
normalen Wachstumsmuster feststellen
2
. Auch konnte an einer Brustzelllinie
demonstriert werden, dass zu dem Zeitpunkt der Ausdifferenzierung, und dem
Erlangen der Fähigkeit Milchproteine zu produzieren, ID1 stark runter reguliert
wurde. Die Zellen spezialisieren sich und proliferieren nicht mehr 30. Ähnliches wurde
bei transgenen Mäusen beobachtet, bei denen ID2 künstlich hoch reguliert wurde.
Hier konnte man kein normales Ausdifferenzieren der Thymozyten finden.
Stattdessen blieben sie in einem proliferativen Status und viele entwickelten sogar
eine aggressive T-Zell Hyperproliferation
Vektoren
eingebrachte
cDNA,
88
. Auch kann durch eine künstlich, durch
verstärkte
Expression
der
ID-Proteine
die
Proliferationsrate einer Brustzelllinie erhöht werden.
1.2.3.2 ID-Proteine: Zellzykluskontrolle und Zellschicksal
Nicht nur die negative Kontrolle der Differenzierung von Zellen konnte den IDProteinen nachgewiesen werden
105
. So wurden ihnen in den letzten Jahren weitere
bedeutsame Funktionen bei der Regulation des Zellzyklus, der Bestimmung des
Zellschicksals und der Zellalterung zugeschrieben. Entsprechend ihrem Namen
führen sie vornehmlich zu einer Inhibition der Differenzierung, wobei sie selten in
spezifischen Zelllinien oder zu spezifischen Entwicklungszeitpunkten auch zu einer
Induktion der Differenzierung führen können
17
. Ebenso spielen sie bereits ab der
frühen Embryogenese eine wichtige Rolle in der Entwicklung des Organismus
1,93,119
.
Es fällt auf, dass ID1 und ID3 hierbei ein sehr ähnlicher Funktionsbereich zukommt
und sie auch häufig in ähnlich starker Expression vorkommen. Beide werden sehr oft
18
und in vielen unterschiedlichen Geweben angetroffen und wirken dadurch auch
häufig unspezifisch auf die Differenzierung von Zellen. ID4 dagegen zeigt ein sehr
individuelles Muster und wird zum Beispiel bei der Entwicklung des Nervensystems
9,105
nachgewiesen
. Ebenso ist ID2 bisher nicht so häufig in unterschiedlichen
Geweben gefunden worden und weist ein restriktiveres Erscheinungsmuster auf
44,105
. So zeigt sich auch, dass die verschiedenen Mitglieder der ID-Familie
unterschiedliche Funktionen in der Regulation spezifischer Signalwege der
Entwicklung haben. Obwohl alle vier ID-Proteine klar miteinander verwandt sind,
haben Untersuchungen gezeigt, dass sie alle einzelne, spezielle biologische
Funktionen für sich besitzen. Weil ein bestimmtes Expressionsmuster der jeweiligen
ID-Proteine
in
jedem
einzelnen
Zelltyp
zu
individuellen
Reaktionen
auf
unterschiedliche Stimuli führen kann, ist es wichtig, dass jeder Zelltyp für sich
betrachtet werden muss
44,93
. Die alleinige Inaktivierung eines einzigen ID-Proteins
reicht meist nicht aus, um bei Knockout-Mäusen eine ernsthafte Störung der frühen
Embryogenese zu bewirken
44,76
. So nimmt man zum Beispiel für ID1 und ID3 sich
zum Teil überschneidende und ergänzende Funktionen an, was beim Wegfallen
eines der beiden ID-Proteine teilweise über eine funktionelle Redundanz durch das
entsprechend andere ausgeglichen werden kann
93
. Die ID2-null-Maus dagegen
weist phänotypische Abnormalitäten, beziehungsweise retardiertes Wachstum und
neonatale Morbidität auf 141.
1.2.3.3 Zellen könnten von ID-Proteinen aus der stabilen Gı-Phase zurück in die
proliferative S-Phase überführt werden
Eine weitere Folge der veränderten Expression der ID-Proteine kann ein
Überführung
der
Zellen
aus
dem
Status
der
Zellalterung
mit
verlorener
Teilungsfähigkeit, so genannte stabile Gı-Phase, zurück in die S-Phase, also zu
wieder proliferierenden Zellen, sein. Dies konnte an Leberzellen von Ratten gezeigt
werden. Nach einer Teilresektion der Leber konnte man in den ersten 48h einen
signifikanten Anstieg von ID1 in den belassenen Leberzellen beobachten.
19
Gleichzeitig begannen sich Leberzellen, die eigentlich bereits ausdifferenziert waren,
wieder zu teilen und es konnten dementsprechend
mehr Zellen in der S-Phase
nachgewiesen werden 65.
1.2.3.4 ID-Proteine und Karzinogenese in gesunden Zellen
Auf Grundlage der soeben beschriebenen Aufgaben und Wirkungen im Zellzyklus,
sowie den genannten Mechanismen, über die ID-Proteine auf die Zellen wirken,
wurde von vielen Forschungsgruppen untersucht, ob man den ID-Proteinen auch
eine mögliche Funktion in der Karzinogenese zuordnen kann.
Bei ID2-transgenen-Mäusen konnten häufig T-Zell-Lymphome gefunden werden.
Interessanterweise waren diese aber nicht monoklonal. Man nimmt an, dass eine
ID2-Überexpression die Zellen zu einem hoch proliferativen Zeitpunkt in ihrer
Entwicklung fixieren. Somit können sie nicht weiter differenzieren, sie leben aber
länger und proliferieren somit stets weiter. Dadurch sind diese Zellen prädisponiert
über weitere molekulare Ereignisse maligne zu transformieren 88.
Ähnliche Zusammenhänge konnten für Melanozyten in vitro gezeigt werden. Hier
verlängert
eine
Überexpression
von
ID1
die
Lebensspanne
der primären
Melanozyten während p16/INK4a gleichzeitig vermindert exprimiert wurde. Einen
direkten Einfluss von ID1 auf die Telomerasenaktivität oder deformiertes Wachstum
der Zellen konnte nicht beobachtet werden. Durch den Anstieg der Zellteilungszyklen
und durch eine verzögerte Seneszenz könnte die Wahrscheinlichkeit einer malignen
Transformation erhöht werden
23
. Als Bestätigung für diese Annahme konnte vor
allem in frühen Stadien des Melanoms eine hohe ID1-Expression bei gleichzeitig
verminderter p16/INK4a Expression gefunden werden. Da bei fortgeschrittenen
Tumoren zusätzlich eine ID1 unabhängige p16/INK4a-Promotor-Methylierung
gefunden wurde, wird angenommen, dass, nach einer initialen Hemmung von
p16/INK4a durch ID1, weitere darauf folgende Schritte zu einem irreversiblen
epigenetischen „genosilencing“ durch Promotor Methylierung führen
102
. Die gleiche
These wurde von den Arbeitsgruppen um Matsuda et al. so wie Lee et al. für das
HCC formuliert, weil auch hier hohe ID1 Expressionen bevorzugt in der frühen
20
Karzinogenese gefunden wurden und man in reifen Tumoren vor allem nur noch p16
Methylierungen findet (siehe unten) 68,82.
Bedenkt man nun, dass auch eine Dysregulation der Apoptose (siehe oben) bei
erhöhter ID-Expression beschrieben wurde, ist es möglich, dass neu erworbene
Mutationen akkumulieren können, weil die Zelle nicht wie geplant in den Zelltod
überführt wird 90,110,123.
Zusammengefasst kann man annehmen, dass ID-Proteine über eine Induktion oder
den Erhalt eines proliferativen Status, sowie durch eine Verlängerung der
Lebensspanne und eventuell einer Behinderung der Apoptose in gesunden Zellen
eine Tumorentstehung begünstigen. Entweder schaffen sie hier nur die Grundlage
für den Erwerb weiterer molekularer Ereignisse und Mutationen, oder sie sind selber
bei der malignen Transformation direkt beteiligt.
1.2.4 ID-Proteine: Karzinogenese und Expression in Tumoren
Aber nicht nur auf Grund der gerade beschriebenen Funktionen und Mechanismen,
über die ID-Proteine im gesunden Gewebe wirken können, sind sie für die
medizinische Forschung so interessant geworden. Es konnte auch gezeigt werden,
dass in vielen verschiedenen Neoplasien eine verstärkte Expression von IDProteinen gefunden werden kann (siehe Tabelle 1)
40,119,137
. Somit stellt sich die
Frage, ob es sich hierbei lediglich um ein Epiphänomen oder einen Tumormarker
44
oder aber um ein konkret an der Tumorgenese und Tumorprogression beteiligtes
Onkogen handelt
81,137
. In den letzten Jahren wurden zahlreiche Arbeiten
veröffentlicht, welche die Funktion der ID-Proteine bei der Tumorentstehung und
Tumorprogression untersuchen. Ebenso wurden interessante Zusammenhänge von
ID-Proteinen und klinischen Parametern aufgezeigt. Im Folgenden soll gezeigt
werden,
welche
Zusammenhänge
zwischen
ID-Proteinen
und
Tumoren
beziehungsweise Tumorzelllinien bestehen. Tabelle 1 zeigt exemplarisch in welchen
21
Geweben und Tumoren die entsprechenden ID-Proteine bisher nachgewiesen
wurden.
Neoplasie
Dysreguliertes ID-Proteine
Referenz
Mammakarzinom
ID1
(Lin et al., 2000;
Schoppmann et al., 2003)
Prostatakarzinom
ID1
(Ouyang et al., 2002)
Kolorektales Karzinom
ID1, ID2, ID3
(Wilson et al., 2001)
Hodenseminome
ID1, ID2, ID3, ID4
(Sablitzky et al., 1998)
Schilddrüsenkarzinom
ID1
(Kebebew et al., 2000)
Zervixkarzinom
ID1
(Schindl et al., 2001)
Plattenepithelkarzinom
ID1
(Wang et al., 2002)
ID1
(Hu et al., 2001)
Ovarialkarzinom
ID1
(Schindl et al., 2003)
Endometriumkarzinom
ID1
(Takai et al., 2001)
Astrocytärer Tumor
ID2, ID3
(Vandeputte et al., 2002)
Pancreaskarzinom
ID1, ID2, ID3
(Maruyama et al., 1999)
Ewing sarcoma
ID2
(Fukuma et al., 2003; Nishimori
(Nasopharynx)
Plattenepithelkarzinom
(Ösophagus)
et al., 2002)
Plattenepithelkarzinom (Kopf
ID1, ID2, ID3
(Langlands et al., 2000)
Melanom
ID1
(Polsky et al., 2001)
Hepatozelluläres Karzinom
ID1, ID2, ID3
(Damdinsuren et al., 2005)
Gallengangskarzinom
ID1, ID2, ID3, ID4
eigene Arbeitsgruppe
und Nacken)
Tabelle 1: Übersicht über Tumore unterschiedlicher Gewebe, in welchen eine veränderte IDExpression gegenüber dem gesunden Gewebe gefunden werden konnte
119,137
.
Ein Zusammenhang zwischen der ID-Proteinexpression und der Tumormorphologie
oder dem Wachstumsverhalten von Tumorzellen konnte mehrfach nachgewiesen
werden.
Bei Plattenepithelkarzinomen des Kopfes und Halses konnte ein Zusammenhang
zwischen stärkerer Expression von ID1- und ID3-Proteinen und schlechterem
Differenzierungsgrad gezeigt werden. Die Tumore mit schlechter Differenzierung und
somit stärkerer Tendenz zur Metastasierung und der entsprechend schlechteren
22
61
Prognose zeigten die höchste ID1- und ID3-Expression
. Die gleiche Korrelation
von Differenzierungsgrad sowie aggressiverem Wachstumsverhalten und IDExpression zeigt sich auch bei Ovarialkarzinomen
Brusttumoren
114
, Prostatatumoren
98
oder
31
. In einer Studie an Karzinomen der Cervix konnte eine schwache
Korrelation zwischen ID2 und dem histologischen Grad gefunden werden
113
.
Gleiches fand sich bei Zellen des Endometriumkarzinoms. Auch hier korrelierte eine
hohe Expression des ID1-Proteines mit einer stärkeren Invasion des Tumors ins
Myometrium und einem schlechteren histologischen Grad 122.
In Karzinomen der Prostata findet man eine hohe Expression von ID1- und ID2Proteinen. Ebenso geht auch hier ein hoher Gleason-Score, also eine schlechte
Differenzierung, mit einer hohen Expression an ID1-, ID2- und ID4-Proteinen einher
98
. Dazu gegensätzlich verhält sich ID3, welches bei hoher Expression in
Tumorzellen der Prostata mit weniger maligne transformierten Zellen und
verminderter Tumorprogression korreliert 143.
Auch konnte an Brustzelllinien gezeigt werden, dass einerseits ein aggressiverer
Phänotyp, gemessen an Zellwachstumsrate und Invasivität, durch ID1-Induktion
erzeugt werden kann und dass andererseits bereits maligne, invasive Zelllinien
immer eine starke ID1-Expression aufweisen. Daraus kann gefolgert werden, dass
zumindest manche Brusttumore durch eine erhöhte ID1-Expression phänotypisch
aggressiver werden 48,70,115.
Zusammenhänge zwischen Tumorgenese und progredienter ID-Expression in
verschiedenen Tumorstadien ergaben verschieden Studien. So zeigte sich bei
Ovarialkarzinom
eine signifikant höhere Expression
in
Karzinomen
als
in
Borderlinetumoren. In Zystadenomen konnte gar keine ID-Expression mehr gefunden
werden 114.
Auch bei Prostata Karzinomen nimmt die Stärke der ID1-Expression mit
zunehmendem Tumor Grading vom Adenom über low grad zu high grad Tumor zu 98.
Bei der chronischen Pankreatitis konnte nur eine gegenüber gesunden Zellen leichte
Zunahme der ID-Expression (ID1 und ID2) gezeigt werden. Dagegen war sie bei
dysplastischen
und
atypischen
papillären
Drüsengängen
der
chronischen
Pankreatitis signifikant erhöht und das Tumorgewebe zeigte ebenso signifikant
höhere Werte für die ID1- und ID2-Expression 82.
23
Bei verschiedenen Tumoren konnte gezeigt werden, dass eine verstärkte IDExpression mit der Prognose des jeweiligen Tumors korrelierte.
So konnte eine Korrelation zwischen erhöhter ID1-Expression und der Prognose von
Patienten mit einem Zervixkarzinom gezeigt werden
113
. Entsprechend hatten
Patienten mit hoher ID1-Expression eine signifikant schlechtere Prognose bezüglich
des Gesammtüberlebens (OS) und des krankheitsfreihen Überlebens (DFS).
Interessanterweise konnte für eine ID3-Überexpression in der gleichen Studie ein
nicht signifikanter Trend für eine bessere Prognose gefunden werden.
Die Prognose von Patienten mit einem Ovarialkarzinom korreliert ebenso mit einer
ID1-Überexpression. Dies erklären die Autoren über die Korrelation der ID1Expression mit einem schlechteren Differenzierungsgrad des Tumors und einem
schlechteren Ansprechen auf Chemotherapie 114.
Die Überexpression von ID1 ist bei nodal negativen Brusttumoren (Tx M0 N0) ein
guter Prognosefaktor – vor allem in Östrogenrezeptor negativen Tumoren. Also
jenen, die vor allem ohne Hormonstimulation „aus eigener Kraft“ proliferieren können
115
.
Für ID2 konnte eine höhere Expression im Zytoplasma mit einer besseren Prognose
bei
Patienten
mit
Brusttumor
korreliert
werden.
Zellen,
die
eine
hohe
zytoplasmatische Expression für ID2 zeigen, zeigen sich weniger invasiv in ihrem
Wachstum 121. So differenzieren Epithelzellen der Brust, bei denen ID2 hoch reguliert
ist, aus und verlieren die Möglichkeit der Proliferation. Dies konnte sowohl in vitro als
auch in vivo gezeigt werden. Auch kann eine Überexpression von ID2 in hoch
malignen Brustzelllinien das Wachstum hemmen, die Exkretion von Metalloproteasen
senken und die Syndekan-1 Expression erhöhen. Somit induziert eine ID2Expression in Mammakarzinom Zelllinien einen weniger invasiven und dadurch
weniger malignen Phänotyp und verhält sich somit gegenläufig zu ID1 48.
24
1.2.5 ID-Proteine und Tumorprogression
ID-Proteine können interessanterweise nicht nur, wie bereits erwähnt (s.o.), gesunde
Zellen, sondern auch Tumorzellen übermäßig proliferieren lassen, indem sie den
Zelltod verhindern.
Bei Prostata Tumorzelllinien wird die Aktivierung des NF-kB Signalweges durch ID1
angenommen. Dadurch könnten diese Zellen gegenüber Apoptose resistenter
werden. Wahrscheinlich wird dies über die hemmende Wirkung von hoch reguliertem
NF-kB und Bcl-xL auf den p53, Bax und Caspase 3 Signalweg vermittelt 73.
Auch konnte beim Adenokarzinom des Kolons eine erniedrigte p53 Expression bei
hoher ID1, ID2 oder ID3 Expression gefunden werden. Und eine hohe ID-Expression
korrelierte mit einer hohen unkontrollierten Proliferation dieser Tumorzellen 136.
Ein Zusammenhang zwischen aggressivem Wachstum von Tumoren und IDProteinen konnte mehrfach gefunden werden.
Bei ektoper ID1-Induktion konnte man an Prostata Tumorzelllinien bei vorhandener
übermäßiger
ID1-Proteinexpression
eine
erhöhte
Proliferation
feststellen.
Andererseits war das Wachstum der Zelllinien verlangsamt und weniger Zellen
wurden in der S-Phase angetroffen, wenn ID1 runter reguliert wurde 71,99.
Auch konnte bei Zelllinien von Prostata Tumoren gezeigt werden, dass die ID1Expression in androgenunabhängigen, somit progressiveren und aggressiven,
Tumorzellen auffällig hoch ist. Zusätzlich hat die gleiche Forschungsgruppe den
Beweis erbringen können, dass eine von außen induzierte ID1-Expression eine
Tumorzelle androgenunabhängig, also aggressiver, machen und somit einen
wichtigen Beitrag zur Tumorprogression leisten kann
72,73
. Bei Tumorzelllinien des
Prostatakarzinoms, die selber kein ID1 exprimieren, konnte durch ektopes ID1 ein
Anstieg der Zellwachstumsrate erreicht werden 99.
Ähnliche Ergebnisse liefern Untersuchungen an Zelllinien von Brusttumoren. Hierbei
konnte gezeigt werden, dass eine Östrogenabhängige Proliferation mit einer
25
gesteigerten ID1-Expression einher geht und auf der anderen Seite eine durch
Progesteron induzierte Wachstumshemmung auch eine Verminderung der ID1Expression mit sich führt. Zusätzlich wurden diese Ergebnisse dadurch bekräftigt,
dass im Experiment eine künstliche Reduktion der ID1-Expression einen das
Wachstum fördernden Effekt abschwächen kann. Und eine Induktion der ID1Expression konnte andererseits zu einer verminderten Wachstumshemmung durch
Progesteron führen 70.
Besonders in den letzten Jahren sind immer mehr Studien über verschiedene
Neoplasien veröffentlicht worden, die zeigen, dass die ID-Expression mit der
Vaskularisierung und Angiogenese zusammenhängen kann.
Während der Embryogenese und der Fetalzeit sind ID-Proteine an der Entwicklung
der Gefäße zum Beispiel im Frontalhirn oder der Niere beteiligt. Doch konnte man in
den letzten Jahren auch immer mehr Beweise sammeln, die eine Beteiligung der IDProteine bei der Angiogenese von Tumoren vermuten lassen 9,111,118.
Die viel versprechenden Ergebnisse einer Studie, bei welcher Tumore als
Xenotransplantation in Mäuse eingebracht wurden
76
, suggerieren, dass schon
bereits das Fehlen eines ID-Protein-Allels eine Metastasierung verhindert. Im Jahre
2003 wurden diese Ergebnisse jedoch durch drei neue Studien eingeschränkt 3.
Trotzdem konnte in mehreren Studien ein Zusammenhang zwischen ID-Expression
und der Vaskularisation von Tumoren gezeigt werden
54,67,111,118,126
. So bleibt die
Überzeugung, dass die Angiogenese bei einer Xenotransplantation von Tumorzellen
sehr stark abhängig ist von den ID-Proteinen, und diese auch bei autochthonen
Tumoren eine wichtige Rolle bei der Angiogenese spielen.
Eine wichtige Grundlage der Tumorprogression ist die Möglichkeit der Zellen invasiv
ins umgebende Gewebe zu wachsen. ID-Proteine könnten hier eine wichtige Rolle
spielen.
26
Eine starke Korrelation der Invasivität mit der ID-Expressionsstärke konnte zum
Beispiel
bei
sieben
ID1
positiven
im
Vergleich
zu
drei
ID1
negativen
Brusttumorzelllinien deutlich gemacht werden. Alle ID1 positive Tumore zeigten auch
eine vaskuläre Invasion und entsprechend konnte keine vaskuläre Invasion bei den
ID1 negativen Tumoren gefunden werden 70.
Über viele ID1 Induktionsversuche konnte bewiesen werden, dass ID1 nicht nur
Zellproliferation unterstützt, sondern auch direkt Zellvermehrung bei Tumorzellen
begünstigt und ihre Invasivität und Malignität steigern kann
70,123
. So wurde eine
Proportionalität der ID1-Expression mit der Invasivität von Brusttumorzelllinien
festgestellt. Auch ein von Wachstumsfaktoren unabhängiger Wachstumsvorteil
konnte für diese Zelllinien mit ektoper ID1-Expression gezeigt werden
70
. Ebenso
können nicht malignen Brustzelllinien bei einer erhöhten ID1-Expression die
Möglichkeit zur Migration und Invasion der Basalmembran verliehen werden. Bei
diesem Vorgang wurde eine starke Korrelation zwischen dem Auftreten von ID1 und
einer neu entdeckten Metalloprotease gefunden. Somit könnten ID-Proteine auch
über Induktion von Proteinen, welche für die Invasion und Metastasierung wichtig
sind, die Tumorprogression fördern 31.
Angiogenese und invasives Wachstum sind zwei unentbehrliche Voraussetzungen
für die Metastasierung eines Tumors. Da bereits gezeigt werden konnte, dass IDProteine sowohl bei der Invasivität als auch der Angiogenese von Tumoren eine
Rolle spielen können, ist es umso interessanter, dass auch ein Zusammenhang von
ID-Proteinen und der Metastasierung von Tumoren gezeigt werden konnte.
Die ID4-Expression scheint bei Prostatakarzinomen eine Aussage über die
Metastasierung machen zu können. Bei Überexpression von ID4 konnte ein erhöhtes
Risiko zur Metastasenentwicklung entdeckt werden. Diesen Zusammenhang könnte
man nutzen und ID4 als Prognose Faktor beim Prostatakarzinom einsetzen 142.
Auch in Magentumorzellen führt eine Suppression der ID1-Expression zu einer
signifikanten Verminderung der Metastasierung dieser Zellen in die Bauchhöhle.
Sowohl die Proliferations- als auch die Migrationseigenschaften dieser Zellen wurde
durch verminderte ID1-Expression herabgesetzt 125.
27
ID-Proteine sind in die Kontrolle von vielen essentiellen Signalwegen eingegliedert,
die zur Tumorentstehung und Progression führen können. So spielen sie eine Rolle
bei der Angiogenese, der Invasivität und Agressivität, bei der Zellproliferation und bei
der Zellalterung sowie der Apoptose. Diese Befunde legen nahe, dass ID-Proteine
nicht nur Tumorentstehung begünstigen, sondern direkt an der Tumorentstehung und
auch der Tumorprogression beteiligt sind 40.
1.2.6 ID-Proteine im HCC
Bisher wurden nur wenige und in ihrer Methodik sehr unterschiedliche Arbeiten über
die
Expression
von
immunhistochemische
ID-Proteinen
im
Färbungen,
teils
HCC
verfasst.
Western
Blots
So
wurden
oder
teils
RT-PCR
Untersuchungen sowohl an Patientenpräparaten (Tumorresektaten), als auch an
Zelllinien oder Zirrhose-/Hepatitisgewebe durchgeführt. Auch untersuchte eine
Arbeitsgruppe die Expression von drei ID-Proteinen (ID1, ID2 und ID3) während sich
die anderen Arbeitsgruppen ausschließlich mit nur einem ID-Protein befasst haben
(ID1 oder ID2)
21,25,26,67,68,82,126,127
. Zu dem ID4-Protein ist nach unserem
Kenntnisstand noch keine Arbeit zur Expression im HCC veröffentlicht worden. Hinzu
kommt, dass sich die Patientenkollektive auf Grund der Ätiologie unterschieden und
meist nur kleine Kollektive untersucht wurden. Aufgrund dieser Heterogenität unter
den bisher veröffentlichten Arbeiten sind ein Vergleich und eine Evaluation der
Ergebnisse untereinander nur sehr bedingt möglich und wenig aussagekräftig.
Deswegen soll die Besprechung der Expression und Funktionen, die den IDProteinen bisher in der Leber nachgewiesen wurden und über welche Mechanismen
sie auf eine Tumorentstehung beim HCC wirken können, im Folgenden gegliedert in
unterschiedliche Themen einzeln dargestellt werden.
28
1.2.6.1 ID Proteine in der Leberentwicklung
Während der Leberentwicklung zeigt sich für ID1 eine geringe Expression. Bei
terminal differenzierten Hepatozyten konnte sogar keine ID1-Transkription mehr
gefunden werden
Zellen
21,67,68,146
oder eine nur sehr schwache Färbeintensität in wenigen
82
. Trotzdem kann eine sehr starke ID1-Expression bei der Aktivierung und
Proliferation von Hepatozyten beobachtet werden
65
. Vor allem zeigt sich diese
Aktivierung von ID1 in der mittleren und späten Gı-Phase des Zellzyklus der
Hepatozyten (bei Leberzellen der Maus) 21.
Eine weitere Funktion des ID1-Proteins konnte in hepatischen Sternzellen (HSC) bei
der Entwicklung einer Zirrhose festgestellt werden. ID1 wirkt hierbei wahrscheinlich
als wichtiger Co-Faktor in dem TGF-β/Smad7 Signalweg und begünstigt eine
Transdifferenzierung der HSC zu Myofibroblasten und könnte somit positiv auf die
Entstehung einer Fibrose wirken 135.
1.2.6.2 ID1 in Hepatitis- und Zirrhosegewebe
Welchen Stellenwert ID1 in Hepatitislebern und bei der Genese einer Zirrhose sowie
der Weiterentwicklung zum HCC einnimmt, wurde in einer weiteren Studie
untersucht. Viele Patienten mit Zirrhose zeigten hierbei eine positive ID1-Expression
mit unterschiedlichen Färbeintensitäten. Es konnte keine signifikante Korrelation von
ID1 mit klinischen Standartparametern (Alter, Geschlecht, Thrombozytenzahl, Serum
ALT oder AFP Werte) gefunden werden. Ein sehr guter und hoch signifikanter (p=
0.0008) Unterschied zeigte sich aber zwischen der Gruppe mit hoher ID1-Expression
und der mit niederer bezüglich dem kumulativen Risiko ein HCC zu entwickeln. Das
relative Risiko, ein HCC bei einer Zirrhose mit starker ID1-Expression zu bekommen,
war im Durchschnitt 2,75-mal höher (p= 0,003). ID1 könnte somit als guter
Prognosefaktor für Zirrhosepatienten bezüglich des Risikos ein HCC zu entwickeln
dienen 82.
29
1.2.6.3 ID1-, ID2- und ID3-Expression im HCC und klinische Parameter
Eine andere Arbeitsgruppe hat eine hohe Expression von ID1, ID2 und ID3 in
Hepatitis und tendenziell eine noch stärkere, wenn auch nicht signifikant erhöhte,
Expression in Zirrhosegewebe nachgewiesen. Interessanterweise konnte jedoch mit
hoher Signifikanz gezeigt werden, dass ID1, ID2 und ID3 stärker in Zirrhose- und
Hepatitisgewebe vorkommen als in Tumorgewebe. In dieser Studie wurden
Korrelationen von ID-Proteinen mit klinischen sowie pathologischen Parametern
aufgezeigt. So ergab diese Studie Ergebnisse dafür, dass eine hohe Expression von
ID1, ID2 und ID3 mit höherem Differenzierungsgrad des Tumors und weniger
vorkommender portaler Venenthrombose (PVT) signifikant korreliert. Auch korrelierte
eine hohe ID1 Expression invers mit Tumorgröße (p= 0,01), Stadium (p= 0,02) und
dem Vorhandensein von Metastasen (p= 0,001). Eine hohe ID2 Expression
korrelierte invers mit Größe (p= 0,035) des HCC und dem Vorhandensein
intrahepatischer Metastasen (p= 0,047). Und eine ID3 Expression war signifikant
verringert bei Vorhandensein einer Tumorkapsel. Aus diesen verschiedenen
Zusammenhängen zwischen ID-Proteinen und klinischen sowie pathologischen
Parametern kann man zusammenfassend sagen, dass die ID-Proteinüberexpression
beim HCC anscheinend im Gegensatz zu vielen anderen Tumoren für eine gute
Prognose steht. So konnte speziell für ID1 signifikant gezeigt werden, dass bei hoher
Expression eine bessere Prognose bezüglich des krankheitsfreihen Überlebens
(DFS) besteht. Die Autoren schlussfolgern dementsprechend, dass ID-Proteine vor
allem in der frühen Karzinogenese des HCC eine Rolle spielen und in
fortgeschrittenen Tumoren eher für eine bessere Prognose stehen könnten 25,26.
1.2.6.4 ID1-Expression und Proliferation
Ein hoch signifikanter Zusammenhang zwischen ID1-Expression und Proliferation
(unter anderem gemessen über „proliferating cell nuclear antigen“ (PCNA), und
30
Vorkommen von Zellen in S-Phase) konnte in einer weiteren Studie gezeigt werden.
Ebenso war die ID1-Expression in Hepatitis- und Zirrhosegewebe wenig bis stark
anzutreffen. In HCC Zellen jedoch konnte eine stärkere Expression als im nicht
neoplastischen Gewebe von ID1 festgestellt werden und über 60 % der Zellen
zeigten eine moderate bis starke Färbung. Auch konnte an in vivo Präparaten und an
Zelllinien, in denen ID1 überexprimiert wurde, eine hoch signifikante Korrelation von
ID1-Expression und der Suppression von p16/INK4a gezeigt werden. Diese
Ergebnisse führen zu der Annahme, dass ID1 eine Verminderung der p16/INK4a
Expression bewirkt und somit zu einer Zellproliferation und verminderten Seneszenz
führt. Dadurch könnte ID1 zu einem frühen Zeitpunkt der Karzinogenese Leberzellen
prädisponieren weiter epigenetische Veränderungen, wie zum Beispiel DNA
Methylierungen, zu erhalten und somit zur Tumorentstehung beizutragen. Die selbe
Gruppe konnte in einer späteren Studie zeigen, dass ID1 signifikant höher in HCC
Metastasen als in primären HCC Zellen anzutreffen ist. Ebenso korrelierte ID1
signifikant mit dem Auftreten von VEGF. Unterstützt wurden diese Ergebnisse durch
Experimente
an
Zelllinien.
Es
konnte
ein
Zusammenhang zwischen
ID1-
Überexpression und VEGF sowie ID1-Überexpression und Angiogenese gefunden
werden. Auf der anderen Seite konnte man zeigen, dass eine reduzierte Expression
von ID1 die Angiogenese im HCC inhibiert 67,68.
1.2.6.5 ID2-Expression und Metastasierung
Tsunedomi et al. wiederum konnten feststellen, dass eine verminderte Id2
Expression eine verstärkte Metastasierung eines HCC (vor allem HCV assoziierte
HCC) begünstigen kann. Auch hierbei wurden erhöhte VEGF Werte gefunden. ID2
mRNA-Spiegel korrelieren invers mit einer portalen Veneninvasion (PVI) (P < 0.001),
Lymphknotenmetastasen (P < 0,001), Tumorgröße (P < 0,001), und einer frühen
intrahepatischen Rekurrenz des Tumors nach Therapie (P < 0,05). Wurden die
Ergebnisse auf eine Untergruppe von alleinigen HCV assoziierten HCC beschränkt,
hatten Patienten mit hoher ID2-Expression ein längeres DFS als Patienten mit
31
niederer ID2-Expression. Das invasive Potential von Zellen mit hoher ektoper ID2Expression war niedriger als jenes von Zellen ohne ektope ID2-Expression.
Hervorgehoben werden müssen die unterschiedlichen Ergebnisse bezüglich des
DFS und der PVI bei einerseits HCV und andererseits HBV assoziierten
Lebertumoren. Der Autor betont hierbei ausdrücklich eventuelle Unterschiede der
HCC Zellen aufgrund unterschiedlicher Genese (HBV vs. HCV und weitere).
32
2. Fragestellung
In den letzten Jahren wurden zahlreiche Studien veröffentlicht, in denen Karzinome
unterschiedlichen Ursprungs eine veränderte ID-Proteinexpression im Vergleich zum
gesunden Gewebe aufweisen. Korrelationen der ID-Expression mit unterschiedlichen
klinisch-pathologischen Parametern wie Gesamtüberleben, Metastasierung oder dem
Tumorstadium wurden gefunden. Somit scheinen die ID-Proteine bei der Entstehung
von Tumoren und ihrer Progression eine wichtige Rolle zu spielen. Unter anderem
konnten aufschlussreiche Ergebnisse an Kolonkarzinomen, Pankreaskarzinomen
oder
Zervixkarzinomen
publiziert
werden.
Über
die
ID-Expression
im
hepatozellulären Karzinom gibt es bis heute nur wenige Studien mit unterschiedlicher
Methodik und kleinen Patientenkollektiven.
In dieser Arbeit wird mit Hilfe einer speziell entwickelten Färbemethode der IDExpressionsstatus im HCC von 150 Patienten mit der ID-Expression im gesunden
Lebergewebe verglichen. Zudem soll die Frage geklärt werden, ob die Expression
der ID-Proteine im HCC mit klinisch-pathologischen Parametern korreliert. Primär
wurde als wichtigster Parameter das Gesamtüberleben im Zusammenhang mit der
ID-Proteinexpression untersucht. Weitere Korrelationen mit klinisch-pathologischen
Parametern wie MELD-Score und Child-Stadium, uni- oder multilokuläres Auftreten,
Lebensalter bei Erstdiagnose, Differenzierungsgrad, Ätiologie, Geschlecht und
Therapieansprechen sollen genauer betrachtet werden.
Ziel dieser Dissertation ist es die Bedeutung der ID-Expression im hepatozellulären
Karzinom zu untersuchen und eventuelle Aussagen über ihre Bedeutung bei der
Entstehung, der Prognose oder der Therapie des HCC machen zu können.
33
3. Material und Methoden
3.1 Patientenkollektiv
Das Kollektiv setzt sich aus 150 Patienten zusammen, bei welchen anhand von
histopathologischem Material in den Jahren 1997 bis 2007 die Diagnose eines HCC
in der Pathologie des Universitätsklinikums Freiburg gestellt werden konnte. Bei 125
der Patienten wurde die Diagnose mit Hilfe einer Stanzbiopsie gestellt und bei 25
Patienten nach Untersuchung eines Operationsresektates (siehe Tabelle). Das in
Parafin eingebettete Gewebe diente der Studie zum Erstellen von histologischen
Schnitten. Somit war eine primäre Voraussetzung zum Einschluss in die Studie das
Vorhandensein von genügend Gewebe. Ebenso mussten Patienten nachträglich
ausgeschlossen werden, bei welchen sich beim Betrachten der neu erstellten
Gewebeschnitte kein oder unzureichendes Tumorgewebe darstellen ließ. Aus diesen
Gründen waren für ID2 bei 5 Patienten und für ID4 bei 4 Patienten wegen zu wenig
Material keine Auswertungen möglich. Das Kollektiv wurde neu für diese Studie
etabliert.
Gewebe
Biopsie
ResektatRe Resektat
Gesamt
Häufigkeit
125
Prozent
83,3
25
16,7
150
100,0
Tabelle 2: Übersicht über den Aufbau des Patientenkollektivs: es wurden Präparate von
Patienten, welche biopsiert beziehungsweise operiert wurden, angefertigt
Folgende klinische Daten konnten bei allen Patienten erhoben werden: Geschlecht,
Alter bei Erstdiagnose, Überlebensstatus, uni- oder multilokuläre Tumorausbreitung
sowie Differenzierungsgrad des Tumors. Bei über 93% der Patienten konnte
zusätzlich die Ätiologie, die Art der Therapie, der AFP-Wert vor Therapiebeginn und
der Child-Pugh-Score sowie der Meld-Score ermittelt werden.
34
3.1.1 Geschlecht, Alter bei Erstdiagnose und Überleben
28 (18,7 %) Patienten waren weiblich und 122 (81,3 %) Patienten männlich. Das
Durchschnittsalter bei Erstdiagnose (ED) betrug bei den Frauen 63,1 Jahre und bei
den Männern 64,9 Jahre. Der Durchschnittswert für das gesamte Kollektiv lag bei
64,5 Jahren (Median 66 Jahre). Der jüngste Patient war 27 Jahre alt und der älteste
Patient 88 Jahre. Der Erkrankungsgipfel lag in der siebten Lebensdekade (siehe
Abbildung 10). 78% der Patienten waren zum Stichtag der Datenerhebung (15. Juli
2009) bereits verstorben und 16,7% der Patienten lebten zu diesem Zeitpunkt noch.
5,3% der Patienten mussten als „verzogen“ in die Berechungen mit aufgenommen
werden. Es ergab sich ein mittlerer Nachbeobachtungszeitraum von 893 Tagen. Das
mediane Überleben betrug 636 Tage (1,7 Jahre).
Abbildung 10: Altersverteilung des Kollektivs (n = 150) zum Zeitpunkt der Erstdiagnose
35
3.1.2 Uni- oder multilokuläre Tumorausbreitung und Differenzierungsgrad
Bei 53 Patienten (35,3%) konnte intrahepatisch ein unilokulär und bei 97 Patienten
(64,7%) ein multilokulär wachsendes HCC gefunden werden. Das histologische
Grading nach Edmondson und Steiner
33
umfasst vier Einteilungen. Bei 23 der
Patienten konnte ein hochdifferenziertes, bei 67 Patienten ein mäßig differenziertes,
bei 39 Patienten ein wenig differenziertes und bei 21 Patienten ein sehr schlecht
differenziertes HCC gefunden werden (siehe Tabelle 3).
A: Lokalisation
Häufigkeit
Prozent
unilokulär
53
35,3
multilokulär
97
64,7
Gesamt
150
100,0
Häufigkeit
Prozent
1
23
15,3
2
67
44,7
3
39
26,0
4
21
14,0
Gesamt
150
100,0
B: DiffGrad
Tabelle 3: A: Verteilung nach uni- oder multilokulärem Auftreten B: Verteilung nach
Differenzierungsgrade (entsprechend Edmondson und Steiner)
3.1.3 Ätiologie und Therapie
Bei vielen Patienten konnten mehr als eine ätiologisch zugrunde liegende
Grunderkrankung gefunden werden, wobei bei 43 Patienten eine Hepatitis-C (HCV)
36
Infektion und bei 26 Patienten eine Hepatitis-B (HBV) Infektion vorlag. Bei den HBV
infizierten Patienten wurde noch zwischen einer chronischen Infektion (15 Patienten)
und einer durchgemachten Infektion (11 Patienten) unterschieden. Übermäßiger
Alkoholkonsum fand sich bei 55 Patienten. Weitere seltenere vorliegende Ätiologien
waren eine Hämochromatose oder ein Adenom. Keine Grunderkrankung konnte bei
31 Patienten gefunden werden (siehe Tabelle 4 und Abbildung 11).
Ätiologie
Fehlend
Gesamt
Häufigkeit
Prozent
Virushepatitis
52
34,7
Kryptogen
31
20,7
Äthyltoxisch
55
36,7
Adenom
1
0,7
mehrere Grunderkrankungen
10
6,7
Gesamt
149
99,3
System
1
0,7
150
100,0
Tabelle 4: Ätiologie des jeweils nachgewiesenen HCC und deren Häufigkeitsverteilung
Abbildung 11: Verteilung der zugrunde liegenden Ätiologie.
37
Die Therapieoptionen im Patientenkollektiv waren einerseits invasiver Art, wie zum
Beispiel
eine
operative
Leberteilresektion
oder
eine
trans-arterielle-
Chemoembolisation (TACE). Andererseits wurden Patienten konservativ mittels einer
Chemotherapie oder lediglich symptomatisch behandelt. Einzelheiten sind der
Tabelle fünf zu entnehmen. Das Therapieansprechen der Patienten, die mit einer
minimal invasiven Therapie (TACE, RFTA, PEI, TAC), einer Chemotherapie, oder
symptomatisch behandelt wurden, ist ebenfalls erfasst worden. Es wurde hierzu die
übliche Nomenklatur: „progressive oder stable disease“ beziehungsweise „partial
oder complete remission“ verwendet (Beurteilung nach RECIST 34).
primäre Therapie
Fehlend
Häufigkeit
Prozent
Minimal-Invasiv
89
59,3
Teilresektion
33
22,0
Transplantation
3
2,0
Chemotherapie
13
8,7
Symptomatisch
10
6,7
Gesamt
148
98,7
System
2
1,3
150
100,0
Gesamt
Tabelle 5: Aufteilung nach verschiedenen Therapieformen
3.1.4 AFP-Wert, Child-Pugh- und Meld-Score
Von 140 Patienten konnte ein Alpha-Fetoprotein-Wert (AFP) vor Therapiebeginn
ermittelt werden. Hierbei ergab sich ein medianer Wert von 23,2 ng/ml. Bei weiteren
140
Patienten
lagen
die
Daten
zur
Ermittlung
eines
Child-Pugh-Score,
beziehungsweise bei 146 Patienten eines Meld-Score vor (Tabelle 6).
38
A: Child-Pugh-Score
Fehlend
Häufigkeit
Prozent
keine Zirrhose
6
4,0
Child-A
103
68,7
Child-B
27
18,0
Child-C
4
2,7
Gesamt
140
93,3
System
10
6,7
150
100,0
Gesamt
B: MELD-Score
N
Gültig
146
Fehlend
4
Mittelwert
9,75
Median
8,50
Tabelle 6: Verteilung der Child-Pugh-Klassifikation im Patientenkollektiv (n = 146): A:
Verteilung auf die verschiedenen Klassifikationen; B: Gesamtzahl der Patienten bei denen ein
MELD-Score erhoben wurde sowie Mittelwert und Median
3.2 Immunhistochemische Färbung
Alle Arbeitsschritte wurden in dem Zeitraum von August 2008 bis August 2010 im
Pathologischen Institut des Universitätsklinikums Freiburg durchgeführt. Bei den
immunohistochemischen (IHC) Färbungen konnte auf interne Erfahrungen der Arbeit
von Michael Müller, die im Zuge einer Dissertation in der gleichen Arbeitsgruppe
gemacht wurden, zurückgegriffen werden. Dennoch wurde zur Optimierung der
Färbeergebnisse eine eigenständige neue und individuell an den jeweiligen
Antikörper angepasste Vorbehandlung etabliert und ein neues Detektionssystem
ausgetestet und eingesetzt. Diese Anpassungen waren nötig, um ein optimales
Färbeergebnis auf den Schnitten zu erhalten.
39
3.2.1. Arbeitsschritte der immunohistochemischen Färbung
Zur Vorbereitung auf die IHC-Färbung wurden von dem in Formalin fixierten und in
Paraffin eingebetteten Patientengewebe 4µm dicke Schnitte angefertigt. Diese
wurden über Nacht bei 50°C in einem Wärmeschrank inkubiert. Entparaffinierung,
Rehydration
und
hitzeinduzierte
Epitopdemaskierung
wurden
auf
zwei
unterschiedliche Methoden durchgeführt. ID1, ID3 und ID4 wurden mit Hilfe eines 3in-1 Verfahrens mit einem Dako PT-Link der Dako Group Denmark (Glostrup, DK)
vorbehandelt, wobei unterschiedliche Target Retrieval Solutions mit entweder pH 9
oder pH 6.1 verwendet wurden. Für ID2 wurden getrennte manuelle Arbeitsschritte
angewandt und die Epitopdemaskierung erfolgte durch Dampfgaren. Hierdurch
konnte jeweils für jedes einzelne ID-Protein das bestmögliche Färbeergebnis erzielt
werden (siehe Tabelle 7, unter: 3.2.2 „Austestung der Färbung“).
Das Nachweissystem EnVision™ FLEX+ sowie der Autostainer Plus des Herstellers
Dako Group Denmark (Glostrup, DK) wurde zur weiteren IHC-Färbung der Präparate
verwendet. Als erster Schritt wurde das Gewebe mit einem Peroxidase-BlockingReagent zum Blockieren der endogenen Peroxidase behandelt. Dies ist bedeutend,
da Hepatozyten ebenso wie zum Beispiel Nierengewebe, eine relevante Menge an
endogener Peroxidase aufweist. Diese würde zu einer unspezifischen Färbung
führen (siehe Abbildung 12). Im zweiten Schritt wurde mit einem optimal verdünnten,
polyklonalen
Kaninchenantikörper
(Primärantikörper)
für
60
Minuten
bei
Raumtemperatur inkubiert. Der dritte Schritt bestand in einer fünfzehnminütigen
Inkubation mit einem zusätzlich verstärkenden sekundären Antikörper, so genannter
EnVision™ FLEX+ Rabbit (LINKER). Dieser EnVision™ FLEX+ Rabbit (LINKER)
führt zu einer Verstärkung des Signals um das circa Zwei- bis Dreifache 24. Im vierten
Arbeitsschritt erfolgte die Zugabe des Dako EnVision™ FLEX/HRP Detection
Reagent mit einer Einwirkzeit von zwanzig Minuten. Hierbei handelt es sich um ein
Dextran-Backbone, an das zahlreiche Meerrettich Peroxidase (HRP) Moleküle und
mehrere sekundäre Antikörper gekoppelt sind. Als letzter Schritt wurde zur
Entwicklung der IHC-Färbung mit EnVision™ FLEX DAB+ Chromogen zusammen
mit EnVision™ FLEX Substrate Buffer für 10 Minuten inkubiert. Das Chromogen
40
fungiert
hierbei
als
Elektronendonator
und
wird
unter
Anwesenheit
von
Wasserstoffperoxid von der Peroxidase des HRP oxidiert. Diese Oxidation führt zu
einem typischen braunen Farbausschlag des Chromogens. Zusätzlich wird dieses
dadurch unlöslich, was dafür sorgt, dass es an dem Ort der Farbreaktion verbleibt.
Zwischen den einzelnen Arbeitsschritten wurden die Gewebeschnitte mit Wash
Buffer gespült und abgeblasen. In den folgenden Abbildungen 12 und 13 sind die
einzelnen Arbeitsschritte zum besseren Verständnis nochmals als Grafiken
schematisch dargestellt und erklärt.
Abbildung 12: Schematische Darstellung der Immunohistochemischen Färbungen: Freigelegte
Epitope der Antigene (blau), an diese kann der primäre Antikörper (grün) binden, (der dritte
Zwischenschritt mit dem zusätzlich verstärkenden Antikörper wurde hier der Einfachheit halber
weggelassen), als folgenden Schritt erkennt man das Dextrane Backbone Gerüst mit den sekundär
Antikörpern und den Enzymen der HRP, welche nach Zugabe von Chromogen dieses oxidiert und
somit die erwünschte Farbreaktion auslöst
79
.
41
1
2
3
42
4
Abbildung 13: Problematik der endogenen Peroxidase: In Anlehnung an Abbildung 12 sind auch hier
die Epitope der Antigene in blau abgebildet. Wiederum hat der primäre Antikörper (grün) an sein
Epitop (blau) gebunden und es hat bereits die Bindung des sekundären Antikörpers (gelb), welcher
an dem Dextrane Backbone gekoppelt ist, stattgefunden (1.). Gibt man bei vorhandener endogener
Peroxidase („E“) das Chromogen hinzu, so wird dieses, wie hier dargestellt, nicht nur spezifisch am
Ort der Antikörperbindung einen Farbausschlag (braun) aufgrund der Oxidation durch das Enzym
Peroxidase bewirken, sondern auch die endogene Peroxidase kann das Chromogen oxidieren und
somit unspezifisch im Gewebe Farbreaktionen auslösen (2.). Die Lösung dieses Problems ist in 3.
wiedergegeben. Hier wurde zu Beginn noch vor der Bindung des primären Antikörpers ein
Peroxidaseblock („S“) durchgeführt (3.). Als Ergebnis dieser Vorbehandlung erhält man die
gewünschte spezifische Färbung allein an dem Ort der Bindung eines primären Antikörpers mit
seinem Epitop (blau) (4.)
79
.
Zur Gegenfärbung wurden die Objektträger in eine Hämalaunlösung getaucht, was
zu einer Blaufärbung der Zellkerne führt. Anschließend wurde das Gewebe kurz mit
Wasser gespült und in einer aufsteigenden Alkoholreihe entwässert, bevor es mit
einer Schutzfolie überzogen werden konnte.
43
3.2.2. Austestung der Färbung
Da mehrere Faktoren Einfluss auf das Resultat einer IHC-Färbung nehmen können,
musste bei der experimentellen Austestung der Färbung Rücksicht auf mehrere
Variablen genommen werden
79
. So erwies sich für jeden ID-Antikörper eine eigene
Vorbehandlung zur Freilegung der Epitope (Antigen Retrieval) als optimal (siehe
Tabelle 7).
Antigen Retrieval
ID-Protein
Methode
pH-Wert
Zeit (min)
ID1
PT Modul, 95°C
9
20
ID2
Dampfgarer
6.1
30
ID3
PT Modul, 95°C
9
20
ID4
PT Modul, 95°C
6.1
20
Tabelle 7: Vorbehandlung der Gewebeschnitte: Target Retrieval bedeutet die Freilegung der zu
detektierenden Epitope im Gewebe, wodurch der primäre Antikörper sich an das Epitop anlagern
kann. Hierbei ist die Art des Verfahrens, der pH-Wert und die Temperatur zusammen mit der Zeit
entscheidend. Man versucht die bestmögliche Freilegung der Epitope zu erreichen, ohne jedoch
dabei, durch zu aggressives Vorgehen, die nachzuweisenden Proteine zu denaturieren.
Es stellte sich heraus, dass als primäre Antikörper mit den Antikörpern für ID1, ID3
und ID4 von Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Kalifornien, USA) und mit dem
Antikörper für ID2 von Cytomed Systems (Berlin) die jeweils besten Färbeergebnisse
erzielt werden konnten. In einem weiteren wichtigen Schritt musste die optimale
Verdünnung des jeweiligen Antikörpers gefunden werden. Hierzu wurde von
Zytomed Systems (Berlin) das Antibody Diluent ZUC025 verwendet (siehe hierzu
auch Tabelle 8)
44
verwendete AK
Antikörper
ID-Protein
Katalognummer
Hersteller-Firma
Verdünnung
ID1
C-20: sc-488
Santa Cruz
1:800
ID2
509 – 16414
Zytomed
1:50
ID3
C-20: sc-490
Santa Cruz
1:600
ID4
H-70: sc-13047
Santa Cruz
1:100
Tabelle 8: Verschiedene Antikörper mit ihrer jeweiligen Verdünnung.
Das Dako EnVision™ FLEX+ Nachweissystem wurde gewählt, da es nicht, wie viele
herkömmliche
Nachweissysteme,
auf
einer
Biotin-Avidin
Reaktion
beruht.
Hepatozyten weisen im Vergleich zu anderem Gewebe einen höheren Gehalt an
endogenem Biotin auf. Dadurch kann es zu einer unspezifischen Färbung oder
Hintergrundfärbung kommen, die eine gute Auswertung der IHC-Färbungen
schwierig oder sogar unmöglich macht. Das von uns verwendete Nachweissystem
basiert auf der Reaktion einer Peroxidase (HRP) mit Wasserstoffperoxid in
Anwesenheit eines Elektronen-Donators (DAB). Der Elektronen-Donator ist in
diesem Fall das eigentliche Chromogen welches durch die Peroxidase oxidiert wird
und dadurch seine typische braune Farbe entwickelt und zusätzlich in eine unlösliche
Form übergeht. Endogene Peroxidasen, welche wiederum das Ergebnis verfälschen
könnten, wurden im Ersten Schritt der IHC-Färbung blockiert (siehe hierzu Abbildung
12 & 13). Ebenso konnte man sich zu Nutzen machen, dass das verwendete
Nachweissystem eine Verstärkung mittels eines zusätzlichen Antikörpers besitzt,
dem so genannten EnVision™ FLEX+ Rabbit (LINKER). Hierdurch konnte das
Färbeergebnis weiter optimiert und zusätzlich mit zum Teil sehr hohen und somit
sparsamen Verdünnungen der primären Antikörper gearbeitet werden.
45
3.3 Kontrollen
Verschiedene Kontrollen wurden zur Evaluation der IHC-Färbungen angewandt.
Jede Kontrollfärbung wurde immer zusammen mit normalen Färbungen im gleichen
Färbedurchgang durchgeführt.
3.3.1 Kontrollgewebe von nicht erkrankten Lebern
Hierzu wurden histologische Schnitte von insgesamt 13 verschiedenen Patienten
herangezogen. Es handelt sich hierbei um 10 Biopsien und 3 Resektate von
gesunden Lebern. Diese stammen alle aus dem Archiv des Pathologischen Institutes
der Universitätsklinik Freiburg aus den Jahren 2009 und 2010. Bei den Biopsien
handelt sich um Patienten bei denen auf Grund einer vermuteten Lebererkrankung
eine Leberpunktion durchgeführt wurde. Es wurden nur Schnitte ausgewählt, welche,
sowohl
im
originalen
Befund,
mikroskopischen Kontrolle,
als
auch
erneut
keine Leberpathologie
in
der
stattgefundenen
aufwiesen. Bei den
drei
Resektaten handelt es sich um peripher gelegenes Gewebe eines Leberresektates
bei einer Lebermetastase von einem nicht lebereigenen Tumor. Auch hier wurde
erneut
mikroskopisch
von
einem
erfahrenen
Pathologen
eine
manifeste
Lebererkrankung ausgeschlossen.
3.3.2 Positivkontrollen und Negativkontrolle
Tonsillen, Haut, Hodengewebe und Gewebe eines Mammakarzinom (M-CA) wurden
als Positivkontrolle bei den Färbegängen im Autostainer mitgefärbt, wobei nicht für
46
alle ID-Antikörper die gleichen Gewebe verwendet wurden. Als interne Kontrollen
eines Präparates diente das Färbeverhalten der Lymphozyten (LZ), Sternzellen (SC)
sowie der Gallengänge (GG) (siehe Tabelle 9).
Kontrollgewebe
Positivkontrollen
ID-Antikörper
Interne Kontrolle
Kontrollgewebe von
ID1
SC
M-Ca, Haut
ID2
GG, SMC, LZ
M-Ca, Haut, Hoden
ID3
SC
LG
ID4
LZ, GG
LG
Tabelle 9: Kontrollgewebe aufgelistet nach ID-Antikörper: Kontrollgewebe wurde im Vorfeld zur
Austestung der Färbebedingungen und während der Färbung des Patientenkollektives als positive
Kontrolle verwendet. Die internen Kontrollen dienten hervorragend zur Evaluation der Färbung jedes
einzelnen Präparates. Folgende Abkürzungen werden in der Tabelle verwendet: SC: Stellate Cells;
GG: Gallengang, SMC: glatte Muskelzellen; LZ: Lymphozyten; LG: Lymphatisches Gewebe; M-Ca:
Gewebe eines Mammakarzinoms.
Für die Negativkontrollen, beziehungsweise Systemkontrollen, wurden Schnitte
gefärbt ohne jedoch Primärantikörper gegen ID-Proteine hinzuzugeben. Parallel
wurden zur Kontrolle im selben Färbedurchgang normale IHC-Färbungen mit
Primärantikörper mitgefärbt. Somit wurde überprüft, ob Schritte der Vorbehandlung
und des Nachweissystems unspezifische Färbungen verursachen können.
3.3.3 Blocking Peptides
Zum Nachweis einer spezifischen Färbung wurde für den ID1-Antikörper und ID3Antikörper eine Testfärbung an Gewebe, von welchem bereits gut gefärbte Schnitte
vorlagen, wiederholt. Dabei wurden die Primärantikörper in einem vorgeschalteten
Schritt mit spezifischen Blocking Peptides (BP) inkubiert. Die BP binden genau an
den Teil des Antikörpers der eigentlich für die Anhaftung an das ID-Proteinepitop
zuständig wäre. Somit wird eine Anlagerung des Primärantikörpers an sein
47
Zielprotein verhindert. Dazu wurden ID-Antikörper zusammen mit einer fünffach
höheren Konzentration an Blocking Peptides bei 4°C über Nacht inkubiert. Am
folgenden Morgen wurde auf eine normale Antikörperkonzentration verdünnt und die
gewöhnlichen Schritte der IHC-Färbung angewandt. Parallel wurden in der gleichen
Färbereihe Schnitte vom selben Präparat im Autostainer mitgefärbt. Da kommerziell
nur für die ID-Antikörper gegen ID1 und ID3 ein spezifisches BP zu erwerben war
konnte dieser Test nur an diesen beiden Antikörpern durchgeführt werden.
3.4 Reagenzien & Materialien
Eine Auflistung von Reagenzien, Materialien und Geräte, die bei der Durchführung
der IHC-Färbungen und zur Auswertung der Gewebeschnitte verwendet wurden, ist
in Tabelle 10 und 11 zu finden.
48
Bezeichnung
Hersteller
Primärantikörper
ID1 (C-20): sc-488
Santa Cruz Biotechnology. INC; CA USA
ID2 509-16414
Zytomed Systems, Berlin, D
ID3 (C-20): sc-490
Santa Cruz Biotechnology. INC; CA USA
ID4 (H-70): sc-13047
Biotechnology. INC; CA USA
Nachweissystem
EnVision™ Flex+
Dako Group, Glostrup DK
Blocking Peptides
ID1 (C-20): sc-488 P
Santa Cruz Biotechnology. INC; CA USA
ID3 (C-20): sc-490 P
Santa Cruz Biotechnology. INC; CA USA
Weitere Reagenzien
Hämalaun nach Meyer
Waldeck GmbH & Co., Münster, D
Antibody Diluent
Zytomed Systems, Berlin, D
Target Rertieval Solution, Low pH (10x)
Dako Group, Glostrup DK
Target Rertieval Solution, Hight pH (10x)
Dako Group, Glostrup DK
Tabelle 10: Auflistung der verwendeten Reagenzien (Reagenzien, welche in dem EnVision™ Flex+
Nachweissystem enthalten sind, wurden hier nicht einzeln aufgeführt).
49
Gerät
Produktname
Hersteller
Mikroskop
Imager. M1
Carl Zeiss AG, Göttingen, D
Kamera
AxioCam MRc
Carl Zeiss AG, Göttingen, D
Entparaphinierungsgerät
Tissue Stainer COT 20
MEDITE GmbH, Burgdorf, D
Eindeckungsmaschine
Tissue Tek SCA
Sakura Finetek Germany GmbH,
Heppenheim, D
Wärmeschrank
Brutschrank
Memmert GmbH + Co. KG,
Schwabach, D
Rotationsmikrotom
RM 2255
Leica
Mikrosystems
GmbH,
Wetzlar, D
Färbegerät
Autostainer Plus
Dako Group,Glostrup DK
Dampfgarer
MultiGourmet
Braun, Kronberg im Taunus, D
Objektträger
SuperFrost Plus
Gerhard
Menzel
Glasbearneitungswerk GmbH &
Co. KG, Braunschweig, D
PASW/ SPSS 18
IBM SPSS Statistics 18
IBM, New York USA
3-in-1 Vorbehandlung
PT-Link
Dako Group, Glostrup DK
Tabelle 11: Auflistung der Geräte, welche verwendet wurden.
3.5 Auswertung
3.5.1 Auswertungskriterien
Die Auswertung der Färbungen wurde voneinander unabhängig durch zwei
Untersucher ohne Kenntnis der klinischen Patientend aten erhoben. In gemeinsamen
Konsenssitzungen wurden dann die endgültigen Scores vergeben.
In Anlehnung an vorausgegangene Arbeiten
26,89,98,121,143
wurden das Färbeverhalten
des Zytoplasma und der Zellkerne getrennt beurteilt. Für das Zytoplasma galten vier
Kategorien „Negativ“ (0), „Schwach“ (1), „Moderat“ (2) und „Stark“ (3). Für die
Auswertung der Kerne wurden 100 Zellen ausgezählt und je nach prozentualer
50
Anzahl der abgefärbten Kerne eine der aufgelisteten vier Kategorien vergeben: 0-10
% (0), 11-50 % (1), 51-80 % (2) und 81-100 % (3). Sowohl für die Betrachtung der
Zellkerne, als auch für die Auswertung der zytoplasmatischen Färbeintensität wurde
jeweils das gleiche, für das ganze Präparat repräsentative Areal, gewählt. In Tabelle
12 sind die Auswertungskriterien tabellarisch dargestellt.
Kategorie
Zytoplasma:
Zellkerne.
(Intensität)
(prozentual)
0
Negativ
0-10%
1
Schwach
11-50%
2
Moderat
51-80%
3
Stark
81-100%
Tabelle 12: Auswertungskriterien für Zytoplasma und Kerne: Das Zytoplasma und die Kerne wurden
jeweils separat ausgewertet. Bei der Beurteilung des Zytoplasma wurden die Gewebeschnitte je nach
Intensität der zytoplasmatischen Anfärbung in vier Kategorien gestuft; bei der Beurteilung der Kerne
wurde das nukleäre Färbeverhalten von 100 Tumorzellen angeschaut und die Anzahl der angefärbten
Kerne gezählt; entsprechend der prozentualen nukleären Expression erfolgte die Zuordnung in
Kategorien
In den folgenden Abbildungen 14 A bis 14 P sind exemplarisch alle vier
Auswertungskriterien der zytoplasmatischen Färbeintensität und der prozentualen
Anfärbung der Zellkerne aufgeführt.
A: ID4 ZP0 ZK0 20x
B: ID4 ZP0 ZK0 40x
51
C: ID1 ZP1 ZK0 20x
D: ID1 ZP1 ZK0 40x
E: ID1 ZP2 ZK0 20x
F: ID1 ZP2 ZK0 40x
G: ID1 ZP3 ZK0 20x
H: ID1 ZP3 ZK0 40x
I: ID4 ZP0 ZK0 20x
J: ID4 ZP0 ZK0 40x
52
K: ID2 ZP0 ZK1 20x
L: ID2 ZP0 ZK1 40x
M: ID2 ZP0 ZK2 20x
N: ID2 ZP0 ZK2 40x
O: ID4 ZP0 ZK3 20x
P: ID4 ZP0 ZK3 40x
Abbildung 14: A bis H: Beispiele für Auswertungskategorien zur Bewertung des Zytoplasmas im
Tumorgewebe:
Angabe
zum
verwendeten
Antikörper
(ID1-4),
ZP
=
zytoplasmatische
Färbekategorie, ZK = nukleäre Färbekategorie, jeweils in 20x und 40x Vergrößerung
I bis P: Beispiele für Auswertungskategorien zur Bewertung der Zellkerne: jeweils in 20x und 40x
Vergrößerung
53
3.5.2 Statistische Auswertung
Alle statistischen Berechnungen wurde mit Hilfe der Software IBM SPSS Statistics 18
der Firma IBM ausgeführt. HCC-bezogene Überlebenskurven wurden mit der
Kaplan-Meier-Methode konstruiert. Die statistischen Berechnungen von Überleben
und ID-Proteinexpression, beziehungsweise klinischen Parametern wurden anhand
des Log-Rank Testes berechnet. Korrelationen zwischen klinischen Parametern und
ID-Proteinexpression wurden mit dem Chi-Quadrat Test, Fisher´s Exact Test oder
Spearmans Rho berechnet. Unterschiedsberechnungen zwischen zwei Gruppen mit
unabhängigen, nicht parametrischen Variablen wurden mit Hilfe des Mann-WhitneyU Testes durchgeführt. Die p-Werte beruhen alle auf zweiseitigen Tests mit
unabhängigen Variablen. Ein Signifikanz-Niveau von p = 0,05 bei einem
Konvidenzintervall von 95 % wurde für alle Berechnungen festgelegt. Ein p-Wert ≤
0,01 mit einem Konvidenzintervall von 99 % wurde als sehr signifikant und ein p-Wert
≤ 0,001 als hoch signifikant gewertet.
54
4 Ergebnisse
4.1 Spezifitätsnachweis immunohistochemischer Färbungen
4.1.1 Kontrollen: Blocking-Peptides
A: ID1 Normale Färbung, 20x
C: ID3 Normale Färbung, 40x
B: Färbung mit BP-Vorbehandlung
D: Färbung mit BP-Vorbehandlung
Abbildung 15: A: normale standardisierte Färbung für ein HCC Präparat mit ID1-Antikörper
(zytoplasmatischer Färbe-Score = 2, nukleärer Färbe-Score = 3), 20x Vergrößerung; B: gleiches
Präparat, Vorbehandlung mit Blocking-Peptide (BP): es ist keine unspezifische Färbung erkennbar;
C: normale standardisierte Färbung für ein HCC Präparat mit ID3-Antikörper (zytoplasmatischer
Färbe-Score = 2, nukleärer Färbe-Score = 3), 40x Vergrößerung; D: gleiches Präparat,
Vorbehandlung mit Blocking-Peptide (BP): es ist keine unspezifische Färbung erkennbar
Da nur für die ID1- und ID3-Antikörper von Santa Cruz Blocking-Paptides (BP) zur
Verfügung standen, wurden nur für diese zwei Antikörper jeweils vier Schnitte von
unterschiedlichen Patientengewebeblöcken jeweils mit und ohne Vorbehandlung
55
durch BP im selben Färbegang gefärbt. In Abbildung 15 wird exemplarisch das
Ergebnis dieser Färbungen anhand eines Gewebeschnittes von ID1 (Bild A und B)
und ID3 (Bild C und D) wiedergegeben.
Es zeigt sich, dass durch die mit BP vorbehandelten Antikörper überhaupt keine
Färbung mehr hervorgebracht wurde. In den Kontrollfärbungen ohne Vorbehandlung
durch BP zeigt sich das übliche und in vorheriger Färbung bereits bestätigte
Färbeverhalten. Die BP binden nur an die Region des Primärantikörpers, der für die
Bindung mit dem ID-Protein verantwortlich ist. Es wird nur dieser Bereich des
Antikörpers geblockt. Somit ist der Beweis erbracht, dass die Antikörper von ID1 und
ID3 spezifisch nur mit ihrer Bindungsstelle gegen ID-Proteine am Gewebe binden
und sonst keine weiteren unspezifischen Bindungen mit dem Gewebe der HCC
Schnitte eingehen.
4.1.2 Sytemkontrollen
Die Systemkontrollen oder auch Negativkontrollen für alle vier ID-Antikörper zeigen
das erwartete Ergebnis eines ganzheitlichen Fehlens der Anfärbung. Es wurden für
alle vier ID-Antikörper jeweils Paare von zwei Schnitten, welche denselben
Parafinblöcken entstammen, gefärbt. Bei einem Schnitt des Paares wurde der
Primärantikörper weggelassen. Der andere Schnitt wurde entsprechend dem
Standardprotokoll gefärbt. Durch die negativen Färbeergebnisse kann bewiesen
werden, dass das Nachweissystem der Färbung ohne Primärantikörper zu keiner
unspezifischen Färbung führt und nur dort eine Farbreaktion auslöst, wo der
Primärantikörper spezifisch an sein Epitop gebunden hat. Lediglich die blau
erscheinende Kerngegenfärbung durch Hämalaun ist zu sehen (siehe Abbildung 16).
56
A: ID1: ZP2 ZK2, 20x
Systemkontrolle ID1: ZP0 ZK0
B: ID2: ZP1 ZK3, 20x
Systemkontrolle ID2: ZP0 ZK0
C: ID3: ZP1 ZK3, 30x
D: ID4: ZP0 ZK2, 30x
Systemkontrolle ID3: ZP0 ZK0
Systemkontrolle ID4: ZP0 ZK0
Abbildung 16: Normale standardisierte Färbungen für HCC Präparate mit ID1-, ID2-, ID3- und
ID4-Antikörpern (ZP = zytoplasmatischer Färbe-Score, ZK = nukleärer Färbe-Score), die
rechten Abbildungen zeigen Färbeergebnisse des gleichen Präparates ohne Zugabe des
primären Antikörpers; es sind keine unspezifischen Färbungen erkennbar: A: Färbung für ID1;
B: Färbung für ID2; C: Färbung für ID3; D: Färbung für ID4.
57
4.1.3 Positivkontrollen
Als Positivkontrollen wurde für jeden ID-Antikörper geeignetes Gewebe gemäß der
vorhandenen Literatur und den Erfahrungen der Arbeitsgruppe ausgewählt. Die
Abbildungen 17 A bis 17 D zeigen für jeden ID-Antikörper beispielhaft
Kontrollfärbungen an für diesen Antikörper passenden Geweben.
A, 1
A, 2
B, 1
B, 2
B, 3
58
C, 1
C, 2
D, 1
D, 2
Abbildung 17: Kontrollfärbungen für ID1, 2, 3 und ID4, jeweils mit Literaturangaben: A (alle für ID1)
1: Keratinozyten der Epidermis, 20x
2: Haut, B 3: Mamma-Ca, 20x
1: Gallengang 40x
1,61
; A 2: Mammakarzinomgewebe
115
; B (alle für ID2) 1: Hoden, B
61,112,147
; C (alle für ID3) 1: Stellate Cells 20x; C 2: 10x; D (alle für ID4)
89
; D 2: ID4, Tonsille 20x
59
4.2 ID-Expression im normalen Lebergewebe
Für alle vier ID-Proteine wurde normales Lebergewebe von dreizehn verschiedenen
Personen angefärbt. Die Färbungen innerhalb der Präparate sind insgesamt sehr
homogen ausgefallen.
In Abbildung 18 zeigt sich gesundes Kontrollgewebe. Es wurden exemplarisch Fälle
aus den prozentual stärksten Gruppen für jedes ID-Protein ausgewählt.
Zwölf von dreizehn Präparaten zeigten bei der Färbung für ID1 eine starke
zytoplasmatische Färbung und ein Präparat eine moderate Färbeexpression.
Dagegen wurden die Zellkerne überwiegend nicht angefärbt.
A: ID1, ZP3 ZK0
B: ID2, ZP0, ZK2
C: ID3, ZP2 ZK3
D: ID4, ZP0, ZK3
Abbildung 18: A bis D sind Färbungen des gesunden Kontrollgewebes für ID1-4: ZP = Intensität der
zytoplasmatischen Färbung; ZK = Prozentuale Anzahl der gefärbten Zellkerne, alle Abbildungen
wurde bei einer 40 fachen Vergrößerung aufgenommen; A: ID1, ZP3, ZK0, 40x; B: ID2, ZP0, ZK2,
40x; C: ID3, ZP2, ZK3, 40x; D: ID 4, ZP0, ZK3, 40x
60
Bei der Färbung für ID2 streute das zytoplasmatische Färbeverhalten zwischen
keiner und mäßiger Färbexpression. wobei der Großteil in der Kategorie schwach
und mäßig gefunden wurde. Bei der Färbung der Kerne waren in ungefähr zwei
Drittel der Präparate 50-80% der Kerne angefärbt und somit in Kategorie 2
angesiedelt.
Kategorien (Angaben in %)
Gesamt
ID-Expression für Ko:
IdProt
0
1
2
3
N
ZP
0,0
0,0
7,7
92,3
13
ZK
92,3
7,7
0,0
0,0
13
ZP
15,4
38,5
46,2
0,0
13
ZK
0,0
23,1
69,2
7,7
13
ZP
0,0
0,0
53,8
46,2
13
ZK
0,0
7,7
7,7
84,6
13
ZP
46,2
53,8
0,0
0,0
13
ZK
0,0
0,0
46,2
53,8
13
ID1
eine
ID2
ID3
ID4
Tabelle 13: ID-Expression für 13 gesunde Kontrollebern: N = Gesamtanzahl in absoluten Zahlen. Für
die ID-Expression wird nur die prozentuale Verteilung angegeben; Ko = gesundes Kontrollgewebe; ZP
= Intensität der zytoplasmatischen Färbung; ZK = prozentuale Anzahl der gefärbten Zellkerne
Für die zytoplasmatische Färbung von ID3 ergab sich eine ungefähr gleichmäßige
Verteilung auf die Kategorie zwei und drei, wobei die Beurteilung der Färbung der
Zellkerne in den überwiegenden Fällen über 80% der Kerne als positiv (Kategorie 3)
ergab.
61
Für ID4 lag das Ergebnis der zytoplasmatische ID-Expression nahezu gleichmäßig in
den zwei unteren Kategorien. Dagegen färbten sich die Zellkerne gut an und somit
sind nur die Kategorien zwei und drei in annähernd gleich starker Gruppengröße
vertreten (siehe Tabelle 13)
4.3 ID-Expression im hepatozellulären Karzinom
Nachdem für jeden ID Proteinantikörper ein individuelles Färbeprotokoll ausgetestet
und festgelegt wurde, wurden die Färbungen im Autostainer nach Standardprotokoll
(siehe
Methoden)
durchgeführt.
Es
konnten
für
ID1
und
ID3
alle
150
Patientengewebeschnitte gefärbt werden. Für ID2 konnten 145 und für ID4 146
Patientengewebeschnitte angefertigt und gefärbt werden, da die verwendeten
Gewebeblöcke zum Teil aufgebraucht waren. Danach wurden alle Präparate unter
dem Mikroskop betrachtet und nach erwähnten Kriterien ausgewertet. Tabelle 14 gibt
die Ergebnisse für alle vier ID-Proteine wieder.
62
Kategorien (Angaben in %)
ID-Expression für
HCC
IDProt
Gesamt
0
1
2
3
N
ZP
0,7
22,7
47,3
29,3
150
ZK
52,0
26,7
17,3
4,0
150
ZP
62,1
24,1
12,4
1,4
145
ZK
0,0
13,8
51,7
34,5
145
ZP
20,0
46,0
27,3
6,7
150
ZK
4,0
12,0
30,0
54,0
150
ZP
89,7
10,3
0,0
0,0
146
ZK
11,6
36,3
46,6
5,5
146
ID1
eine
ID2
ID3
ID4
Tabelle 14: ID-Expression für 150 beziehungsweise 145 oder 146 Gewebeproben von Patienten mit
HCC: N = Gesamtanzahl in absoluten Zahlen. Für die ID-Expression wird nur die prozentuale
Verteilung angegeben. ZP = Intensität der zytoplasmatischen Färbung; ZK = Prozentuale Anzahl der
gefärbten Zellkerne
Statistiken
N
ZP_Id1
ZK_Id1
ZP_Id2
ZK_Id2
ZP_Id3
ZK_Id3
ZP_Id4
ZK_Id4
Gültig
150
150
145
145
150
150
146
146
Fehlend
0
0
5
5
0
0
4
4
2,05
,73
,53
2,21
1,21
2,34
,10
1,46
Mittelwert
Tabelle 15: Fallzahlen für jede Färbung mit dem jeweiligen ID-Antikörper: Aufgeteilt in
zytoplasmatische (ZP) und nukleäre (ZK) Färbung, Angabe der Mittelwerte
63
4.3.1 ID1 Expression im HCC
Für die Färbung mit dem ID1 Antikörper konnte sowohl eine zytoplasmatische
Färbung als auch eine Anfärbung der Nuklei beobachtet werden. Die Mehrzahl der
Schnitte zeigte hierbei eine mäßige bis starke Anfärbung des Zytoplasmas (s.
Abbildung 19). Somit ergab sich hier für die vergebenen Kategorien 0-3 ein Mittelwert
von 2,05. Nur bei einem Schnitt wurde gar keine zytoplasmatische Anfärbung
beobachtet. Dagegen waren bei fast 80 % der Schnitte keine oder nur wenige
Zellkerne gefärbt. Nur bei ungefähr einem Fünftel der Schnitte sind mehr als 50 %
der Zellkerne gefärbt und der mittlere Score liegt bei 0,73 (s. Abbildung 20).
A
C
B
D
Abbildung 19: Exemplarische Färbeergebnisse für ID1 (ZP = Wert für zytoplasmatische Färbung, ZK
= Wert für gefärbte Zellkerne): A: ID1 ZP1 ZK0 40x, B: ID1 ZP2 ZK0 40x, C: ID1 ZP3 ZK0 40x, D: ID1
ZP1 ZK2 40x
64
In den Abbildungen 21 A bis 21 D sind Beispiele für die am häufigsten beobachteten
Kategorien wiedergegeben. Man kann in den Kategorien mit hoher zytoplasmatischer
ID-Expression erkennen, dass eine perinukleäre Konzentration der Färbung zu
beobachten ist. Dies konnte in einem großen Anteil der Schnitte dieser Kategorie,
wenn auch nicht bei allen, beobachtet werden.
Abbildung 20:
Färbeergebnis für ID1: Säulendiagramme, Verteilung der Kategorien für die
zytoplasmatische Färbung (= ZP_Id1) und die nukleäre Färbung (= ZK_Id1)
Abbildung 21: Neuverteilung von ID1 nach Bildung neuer Überkategorien: Säulendiagramme
Da es sich für einige der statistischen Berechnungen als nicht sinnvoll oder gar
unmöglich erwies, mit allen vier Unterkategorien für die zytoplasmatische
beziehungsweise nukleäre Färbungen Berechnungen anzustellen, wird hier nun
vorausgreifend erläutert, auf welche Weise neue Gruppen für die Berechnungen
65
gebildet wurden. Das größte Problem für die Berechnungen war primär die zu kleine
Fallzahl in einigen Unterkategorien. So umfasst zum Beispiel die Kategorie „keine
Färbung“ für die zytoplasmatische Färbung von Id1 nur einen Fall. Deswegen
wurden mit dem Ziel möglichst zwei gleich starke Gruppen zu bilden die Kategorien
neu zusammengefasst. Für ID1 ergaben sich somit die neue Verteilung für die
zytoplasmatischen Färbungen in „Id1_ZP_neu high“ und „-low“ und für die nukleären
Färbungen in „Id1_ZK_neu high“ und „-low“. Wobei „Id1_ZP_neu low“ Kategorie 0-2
und „Id1_ZP_neu high“ die Kategorie 3 beinhaltet. „Id1_ZK_neu high“ fasst Kategorie
1-3
zusammen
während
„Id1_ZK_neu
low“
für
Kategorie
0
steht.
Die
Säulendiagramme in Abbildung 21 sowie Tabelle 16 veranschaulichen die neue
Verteilung.
Kategorien (Angaben in %)
ID1-Expression für
Gesamt
HCC: neue Verteilung
0
1
2
3
0
ID-
ZP
0,7
22,7
47,3
29,3
150
ZK
52,0
26,7
17,3
4,0
150
Id1_ZP_neu
low: 60,7
high: 29,3
150
Id1_ZK_neu
low: 52
Prot
eine
ID1
alt
ID1
neu
high: 48
150
Tabelle 16: Neuverteilung der Färbescores für ID1 auf nur noch zwei Kategorien
66
4.3.2 ID2-Expression im HCC
Auch bei der Färbung mit dem Antikörper gegen das ID2-Protein konnte eine
zytoplasmatische Färbung und eine Färbung der Zellkerne gesehen werden (siehe
Abbildung 22). Jedoch weisen hier 62 % der Fälle keine zytoplasmatische Färbung
auf und in etwa nur einem Siebtel der Fälle ist eine mäßige oder starke
zytoplasmatische Färbung zu beobachten. Somit ist das Zytoplasma mit einem
Mittelwert von 0,53 insgesamt viel schwächer gefärbt, als dies bei ID1 der Fall war.
Dagegen gibt es keine Schnitte ohne nukleäre Anfärbung und über 85 % weisen
selbst eine Anfärbung von über 50 % der Kerne oder mehr auf (Mittelwert: 2,21)
(siehe Abbildung 23 & 24 und Tabelle 17).
A
C
B
D
Abbildung 22: Exemplarische Färbeergebnisse für ID2 (ZP = Wert für zytoplasmatische Färbung,
ZK = Wert für gefärbte Zellkerne): A: ID2 ZP0 ZK1 40x, B: ID2 ZP0 ZK2 40x, C: ID2 ZP0 ZK3 40x,
D: ID2 ZP1 ZK2
67
Abbildung 23: Exemplarische Färbeergebnisse für ID2 (ZP = Score für zytoplasmatische Färbung,
ZK = Score für gefärbte Zellkerne): Ebenso wurden für die Färbungen des ID2-Proteins neue Gruppen
für die statistischen Berechnungen gebildet. In den neuen Kategorien für die zytoplasmatischen
Färbungen fasst somit „Id2_ZP_neu high“ die Kategorien 1-3 zusammen und „Id2_ZP_neu low“ steht
für Kategorie 0. Bei den Kategorien der nukleären ID-Expression ergab sich „Id2_ZK_neu low“ für
Kategorie 0-2 und die neue Gruppe „Id2_ZK_neu high“ für Kategorie 3 (siehe Abbildung 24 und
Tabelle 17)
Abbildung 24: Neuverteilung von ID2 nach Bildung neuer Überkategorien: Säulendiagramme
68
Kategorien (Angaben in %)
ID2-Expression für
Gesamt
HCC: neue Verteilung
0
1
2
3
0
ID-
ZP
62,1
24,1
12,4
1,4
145
ZK
0,0
13,8
51,7
34,5
145
Id2_ZP_neu
low: 62,1
high: 37,9
Id2_ZK_neu
low: 65,5
Prot
eine
ID2
alt
ID2
neu
145
-high: 34,5
145
Tabelle 17: Neuverteilung der Färbescores für ID2 auf nur noch zwei Kategorien
4.3.3 ID3-Expression im HCC
Wie zuvor bei der Betrachtung der ID1- und ID2-Expression findet sich auch bei der
ID3-Expression eine sowohl zytoplasmatische, als auch nukleäre Färbung. Ähnlich
den Färbungen von ID2 finden sich auch hier vor allem zytoplasmatisch schwache
Färbeergebnisse und ein mittlerer Wert für die zytoplasmatische Färbeintensität von
1,21. Dieser Wert liegt nur knapp unter dem theoretischen Mittel von 1,5 und es fällt
auf, dass knapp die Hälfte der Fälle in die zweite Kategorie (wenig zytoplasmatische
Färbung) fallen. Dafür war auch hier eine stärkere Färbung der Zellkerne zu sehen.
Die Verteilung der Häufigkeit nimmt exponentiell mit der Anzahl der gefärbten Kerne
zu und ein Mittelwert von 2,34 unterstreicht diese Verteilung zugunsten der hohen
Werte (siehe Abbildungen 26 & 27 und Tabelle 18). Die folgenden Abbildungen 25 A
bis C unterstreichen die starke Färbung der Zellkerne und geben ein Beispiel für die
Kategorie des schwach gefärbten Zytoplasmas.
69
A
B
C
Abbildung 25: Exemplarische Färbeergebnisse für ID3 (ZP = Wert für zytoplasmatische Färbung, ZK
= Wert für gefärbte Zellkerne): A: ID3 ZP0 ZK2, 40x, B: ID3 ZP0 ZK3, 40x, C: ID3 ZP1 ZK2, 20x
Abbildung 26: Exemplarische Färbeergebnisse für ID3 (ZP = Score für zytoplasmatische Färbung,
ZK = Score für gefärbte Zellkerne): Für die neu zusammengefassten Kategorien ergaben sich bei der
Expression der ID3-Proteine im Zytoplasma für „Id3_ZP_HL low“ die Kategorien 0+1 und für
Id3_ZP_HL high“ die Kategorien 2+3. Die nukleäre ID3-Expression wurde auf dieselbe Weise neu
verteilt. (Abbildung 26 und Tabelle 17)
70
Abbildung 27: Neuverteilung von ID3 nach Bildung neuer Überkategorien: Säulendiagramme
Kategorien (Angaben in %)
ID3-Expression für
HCC: neue Verteilung
IDProt
ID3
alt
eine
ID3
neu
Gesamt
0
1
2
3
0
ZP
20,0
46,0
27,3
6,7
150
ZK
4,0
12,0
30,0
54,0
150
Id3_ZP_HL
low: 66
high: 34
150
Id3_ZP_HL
low: 16
high: 84
150
Tabelle 18: Neuverteilung der Färbescores für ID3 auf nur noch zwei Kategorien
4.3.4 ID4-Expression im HCC
Bereits bei der Auswertung der Färbungen für ID4 ist beiden Betrachtern unabhängig
voneinander eine ausgeprägt schwache Färbung des Zytoplasmas aufgefallen.
Somit wurden alle Fälle in die unterste Kategorie „keine Färbung“ oder in die
71
zweitunterste Kategorie „schwache Färbung“ eingeteilt, wobei beinah 90 % der Fälle
in der schwächsten Kategorie zu finden sind (Mittelwert 0,1). Es ist fraglich ob
überhaupt von einer spezifischen zytoplasmatischen Färbung auszugehen ist.
Dagegen färbten sich die Zellkerne schön an und mit einem Mittelwert von 1,49
konnte eine Verteilung gefunden werden, die sich mit der Mehrzahl der Fälle (83 %)
in den zwei mittleren Kategorien wieder findet (s.Abbildung 29 & 30 und Tabelle 19).
Doch gab es auch wenige Fälle mit sehr vielen gefärbten Kernen auf der einen Seite
und einige Fälle mit sehr wenig gefärbten Kernen auf der anderen Seite. In den
Abbildungen 28 A bis 30 D wurden noch mal für alle vier Kategorien der nukleären
Färbung Beispiele angeführt.
A
B
C
D
Abbildung 28: Exemplarische Färbeergebnisse für ID4 (ZP = Wert für zytoplasmatische Färbung, ZK
= Wert für gefärbte Zellkerne): A: ID4 ZP0 ZK0, 40x, B: ID4 ZP0 ZK1, 40x C: ID4 ZP0 ZK2, 40x, D:
ID4 ZP0 ZK3, 40x,
72
Abbildung 29: Exemplarische Färbeergebnisse für ID4: Säulendiagramme, (ZP = Score für
zytoplasmatische Färbung, ZK = Score für gefärbte Zellkerne): Für die zytoplasmatische Färbung von
ID4 mussten keine neuen Gruppen zusammengestellt werden, da es sich bereits um lediglich zwei
Kategorien handelte. Für die nukleäre Expression von ID4 wurde Kategorien 0+1 als „Id4_ZP_HL low“
zusammengefasst Kategorie 2+3 als „Id4_ZP_HL high“ definiert. Auch hierzu wurden zum besseren
Verständnis nochmals die Säulendiagramme (Abbildung 30) und die Tabelle 19 abgebildet.
Abbildung 30: Neuverteilung von ID4 nach Bildung neuer Überkategorien: Säulendiagramme
73
Kategorien (Angaben in %)
ID4-Expression für
HCC: neue Verteilung
IDProt
ID4
alt
eine
ID4
neu
Gesamt
0
1
2
3
0
ZP
89,7
10,3
0,0
0,0
146
ZK
11,6
36,3
46,6
5,5
146
Id4_ZP_neu
low: 89,7
Id4_ZK_HL
high: 10,3
low: 47,9
high: 52,1
146
146
Tabelle 19: Neuverteilung der Färbescores für ID4 auf nur noch zwei Kategorien
4.4 Vergleich der ID-Expression im Tumor und Normalgewebe
Nachdem
gezeigt
Lebergewebe
als
werden
auch
in
konnte, dass ID-Proteine
Gewebeproben
des
sowohl im
hepatozellulären
gesunden
Karzinoms
vorkommen, wurde untersucht ob auch hier, wie bereits bei vielen anderen
Tumorentitäten, ein deutlicher Unterschied dieser Expression besteht.
Primär war auffällig, dass das gesunde Gewebe teilweise eine sehr deutliche
zytoplasmatische ID-Expression aufweist. Bereits in kleiner Vergrößerung konnte auf
Grund des typischen Färbeverhaltens die Bereiche mit neoplastischem Gewebe von
den nicht neoplastischen unterschieden werden. wobei die nicht neoplastischen
Bereiche sich stärker im Zytoplasma anfärbten. Dies traf vor allem auf die Färbungen
von ID1, ID2 und ID3 zu (siehe hierzu Abbildung 31 A bis G).
74
A
B
C
D
E
F
75
G
Abbildung 31: Vergleich von Tumorgewebe (Tu) und Normalgewebe (No) nebeneinander auf
demselben histologischen Präparat (ZP = Wert für zytoplasmatische Färbung, ZK = Wert für gefärbte
Zellkerne): A: ID1-Expression in No: ZP3 ZK0 20x, B: ID1-Expression im Tu: ZP1 ZK0 20x, C: ID2
Expression in No: ZP2 ZK1 20x, D: ID2 Expression im Tu: ZP0 ZK3 20x, E: ID3 Expression in No:
ZP3 ZK0, F: ID3 Expression im Tu: ZP1 ZK3 20x, G: ID1 Expression, rechts unten Tumor, links oben
gesundes Gewebe
Diese Beobachtung wird von der Auswertung der Färbeintensitäten untermauert. In
Tabelle 20 ist eine Übersicht über die ID-Proteinexpression im HCC und gesunden
Lebergewebe wiedergegeben.
Ein Vergleich der neu definierten Gruppen für die Expression der ID-Proteine in
lediglich zwei Kategorien für die zytoplasmatische und nukleäre Färbungen lässt
einen noch deutlicher erscheinenden Unterschied zwischen der Expression der IDProteine im gesunden Gewebe und Gewebe des HCC zu (siehe hierzu Tabelle 21
und die Balkendiagramme bei der Besprechung des jeweiligen ID-Proteins:
Abbildungen 21, 24, 27 und 30).
76
ID-Expression für
Kategorien (Angaben in %)
HCC und Ko:
0
1
2
3
N
HCC
0,7
22,7
47,3
29,3
150
Ko
0,0
0,0
7,7
92,3
13
HCC
52,0
26,7
17,3
4,0
150
Ko
92,3
7,7
0,0
0,0
13
HCC
62,1
24,1
12,4
1,4
145
Ko
15,4
38,5
46,2
0,0
13
HCC
0,0
13,8
51,7
34,5
145
Ko
0,0
23,1
69,2
7,7
13
HCC
20,0
46,0
27,3
6,7
150
Ko
0,0
0,0
53,8
46,2
13
HCC
4,0
12,0
30,0
54,0
150
Ko
0,0
7,7
7,7
84,6
13
HCC
89,7
10,3
0,0
0,0
146
Ko
46,2
53,8
0,0
0,0
13
HCC
11,6
36,3
46,6
5,5
146
Ko
0,0
0,0
46,2
53,8
13
IDZP
Prot
eine
Gesamt
ID1
ZK
ZP
ID2
ZK
ZP
ID3
ZK
ZP
ID4
ZK
Tabelle 20: ID-Expression für 150 beziehungsweise 145 oder 146 Patienten mit HCC und 13 Proben
aus gesundem Lebergewebe. N = Gesamtanzahl in absoluten Zahlen. Für die ID-Expression wird nur
die prozentuale Verteilung angegeben. ZP = Intensität der zytoplasmatischen Färbung; ZK =
Prozentuale Anzahl der gefärbten Zellkerne
77
ID1, 2, 3 und 4-Expression für
Kategorien (Angaben in %)
Gesamt
HCC und Ko
Low
ID-
n
HCC
71,3
28,7
150
Ko
7,7
92,3
13
HCC
52,0
48,0
150
Ko
92,3
7,7
13
HCC
62,1
37,9
145
Ko
15,4
84,6
13
HCC
65,5
34,5
145
Ko
92,3
7,7
13
HCC
65,3
34,7
150
Ko
0,0
100,0
13
HCC
16,0
84,0
150
Ko
7,7
92,3
13
HCC
89,7
10,3
146
Ko
46,2
53,8
13
HCC
47,9
52,1
146
Ko
0,0
100
13
ZP
Prot
eine
High
ID1
ZK
ZP
ID2
ZK
ZP
ID3
ZK
ZP
ID4
ZK
Tabelle 21: Neu zusammengefasste Gruppen für ID1, 2, 3 und 4: Die Gruppen „low“ und „high“
wurden wie folgt zusammengefasst: ID1 ZP: low = 0-2, high = 3 und ID1 ZK: low = 0, high = 1-3; ID2
ZP: low = 0, high = 1-3 und ID2 ZK: low = 1+2, high = 3; ID3 ZP: low = 0+1, high =2+3 und ID3 ZK:
low = 0+1, high = 2+3; ID4 ZP: low = 0, high = 1-3 und ID4 ZK: low = 0+1, high = 2+3
78
4.4.1 ID1 Expression im HCC und Normalgewebe
Während bei den Kontrollen für das gesunde Gewebe der Färbungen für ID1
ausschließlich eine starke zytoplasmatische Färbung und nur sehr wenig gefärbte
Kerne gefunden werden konnte, zeigten Schnitte von Patienten mit HCC ein mehr
inhomogenes Bild mit einer weiter gestreuten Verteilung über die Kategorien, wobei
auffällt, dass für die zytoplasmatische Expression der Unterschied zwischen
gesundem und neoplastischen Gewebe deutlicher ausfällt als bei der Färbung der
Kerne (siehe Abbildung 32 und Tabelle 20).
A: zytoplasmatische Färbung für ID1
79
B: nukleäre Färbung für ID1
Abbildung 32: Färbeergebnisse für ID1 in den Proben von Patenten mit HCC und gesunden
Kontrollen: A: Zytoplasmatische Färbung (ZP_Id1); B: Färbung der Zellkerne (ZK_Id1)
Bei Betrachtung der neu definierten Kategorien mit lediglich zwei unterschiedlichen
Kategorien kommt dieser Unterschied zwischen gesundem Gewebe und
Tumorgewebe noch besser zu Geltung (siehe Abbildung 33 und Tabelle 21).
100%
A
Id1_ ZP 0-2 vs 1
80%
100%
Gesund
HCC
Id1_ZK 0 vs 1-3
80%
60%
60%
40%
40%
20%
20%
0%
B
Gesund
HCC
0%
Schwache bis mäßige-
Starke ZP-Färbung
keine ZK-Färbung
wenig bis viele
Abbildung 33: Färbeergebnis für ID1 in Proben von Patienten mit HCC und gesundem Gewebe
nach Zusammenfassung der Kategorien in „high“ und „low“: A: Zytoplasmatische Färbung (ZP_Id1);
B: Färbung der Zellkerne (ZK_Id1)
80
4.4.2 ID2-Expression im HCC und Normalgewebe
Die zytoplasmatischen ID2 Färbungen der Proben von Patienten mit HCC waren im
Gegensatz zu den gesunden Kontrollen schwächer. Für die zusammengefassten
Kategorien gilt dieser Unterschied noch deutlicher. Dafür zeigten die Proben von
Patienten mit HCC eine stärkere nukleäre Färbung. Diese Unterschiede sind aber,
wie in den Balkendiagrammen der Abbildung 34 zu sehen, nicht sehr drastisch und
auch für die zusammengefassten Kategorien nicht sehr eindeutig (siehe auch
Tabelle 20 und 21).
A: zytoplasmatische Färbung für ID2
81
B: nukleäre Färbung für ID2
100%
C
Id2_ ZP 0 vs 1-3
80%
100%
Gesund
HCC
Id2_ZK 1-2 vs 3
80%
60%
60%
40%
40%
20%
20%
0%
D
Gesund
HCC
0%
keine ZP-Färbung
Gering bis starke
keine bis wenig ZK-
viel ZK-Färbung
Abbildung 34: Färbeergebnisse für ID2 in den Proben von Patenten mit HCC und gesunden
Kontrollen: A: Zytoplasmatisches Färbeergebnis (ZP_Id2) mit allen vier Kategorien; B: Färbeergebnis
der Zellkerne (ZK_Id2) mit allen vier Kategorien, C und D: Färbeergebnis für ID2 nach
Zusammenfassung der Kategorien in „high“ und „low“
82
4.4.3 ID3-Expression im HCC und Normalgewebe
Bei der Betrachtung der Färbungen für ID3 im gesunden Gewebe und im HCC
konnte man erkennen, dass die zytoplasmatische Färbung der gesunden Kontrollen
deutlich in den zwei hohen Kategorien vertreten sind. Bei den Proben von Patienten
mit HCC ist die Verteilung eher auf die unteren und mittleren Scores beschränkt.
Dagegen findet man für die nukleäre Expression von ID3 eine ähnliche Verteilung im
gesunden und neoplastischen Gewebe (siehe Abbildung 35 und Tabelle 20).
Betrachtet man die Diagramme für die neu definierten Kategorien für Id3_ZK_HL und
Id3_ZP_HL (Abbildung 36) so wird der zytoplasmatische Unterschied in der ID3Expression zwischen gesundem Gewebe und Tumorgewebe noch eindrücklicher.
Dagegen erscheint die zytoplasmatische Expression fast identisch (siehe auch
Tabelle 21).
A: zytoplasmatische Färbung für ID3
83
B: nukleäre Färbung für ID3
Abbildung 35: Färbeergebnisse für ID3 in den Proben von Patenten mit HCC und gesunden
Kontrollen: A: Zytoplasmatische Färbung (ZP_Id3); B: Färbung der Zellkerne (ZK_Id3)
100%
A
Id3_ZP 0-1 vs 2-3
80%
100%
Gesund
HCC
Id3_ZK 0-1 vs 2-3
80%
60%
60%
40%
40%
20%
20%
0%
B
Gesund
HCC
0%
keine bis Schwache-
mäßig bis starke ZP-Färbung
keine bis Schwache-
mäßig bis starke ZP-Färbung
Abbildung 36: Färbeergebnis für ID3 in Proben von Patienten mit HCC und gesundem Gewebe
nach Zusammenfassung der Kategorien in „high“ und „low“: A: Zytoplasmatische Färbung (ZP_Id3);
B: Färbung der Zellkerne (ZK_Id3)
84
4.4.4 ID4-Expression im HCC und Normalgewebe
Für die Expression von ID4 konnten in den gesunden Kontrollen häufiger Fälle mit
zumindest schwacher zytoplasmatischer Expression gefunden werden, während die
Proben von Patienten mit HCC fast ausschließlich keine zytoplasmatische Färbung
aufwiesen. Dagegen zeigten die Kontrollschnitte eine starke Färbung der Zellkerne,
unterscheiden sich damit aber nur wenig von den Proben von Patienten mit HCC, bei
welchen über die Hälfte mindestens 50-80 % der Kerne positiv gefärbt haben (siehe
Abbildung 37 und Tabelle 20)
A: zytoplasmatische Färbung für ID4
85
B: nukleäre Färbung für ID4
Abbildung 37: Färbeergebnisse für ID4 in den Proben von Patenten mit HCC und gesunden
Kontrollen: A: Zytoplasmatische Färbung (ZP_Id4); B: Färbung der Zellkerne (ZK_Id4)
Die Konzentration der nukleären Expression auf die hohen Kategorien im gesunden
Gewebe wird in der Abbildung für die Kategorien von Id4_ZK_HL noch deutlicher.
Dagegen verteilt sich die ID4-Expression der Zellkerne im HCC ungefähr identisch
auf die Kategorien „low“ und „high“ (siehe Abbildung 38 und Tabelle 21).
100%
A
Id4_ZP 0-1 vs 2-3
80%
100%
Gesund
HCC
Id4_ZK 0-1 vs 2-3
80%
60%
60%
40%
40%
20%
20%
0%
B
Gesund
HCC
0%
keine bis Schwache-
mäßig bis starke ZP-Färbung
keine bis Schwache-
mäßig bis starke ZP-Färbung
Abbildung 38: Färbeergebnis für ID4 in Proben von Patienten mit HCC und gesundem Gewebe
nach Zusammenfassung der Kategorien in „high“ und „low“: A: Zytoplasmatische Färbung (ZP_Id4);
B: Färbung der Zellkerne (ZK_Id4)
86
4.5 Korrelationen der ID-Expression mit klinischen Variablen
4.5.1 ID-Expression und Gesamtüberleben
Als primär zu betrachtenden und stärksten klinischen Parameter wurde beim Planen
des Designs der Studie das Gesamtüberleben (OAS) gewählt. Es stellt einen gut zu
erfassenden und aussagekräftigen Parameter dar und wurde so auch bereits in
vielen anderen Studien zur ID-Proteinexpression verwendet
89,113,114,121
. Das OAS
wurde an Hand von Kaplan-Meier-Kurven berechnet und abgebildet. Es erfolgte die
Korrelation des Gesamtüberlebens und der Expression der vier ID-Proteine mit Hilfe
des Logrank-Testes (Mantel-Cox-Test). Zuerst wurde mit allen vier Kategorien (0-3)
für die zytoplasmatische und nukleäre Expression gerechnet. Wie in Tabelle 21 zu
sehen ist, konnte für drei der acht verschiedenen Berechnungen eine nicht zufällige
und sehr signifikante (p < 0,01) Verteilung des OAS auf die verschiedenen Stufen der
ID-Protein Expression gefunden werden. Es ergaben sich somit signifikante
Ergebnisse für die zytoplasmatische Expression von ID1 und ID3 sowie für die
nukleäre Expression von ID4. Das Ergebnis für die zytoplasmatische Expression von
ID2 war für das zuvor definierte Signifikanzniveau ≤ 0,05 nicht signifikant (p-Wert =
0,098), aber wie man der Kaplan-Meier-Kurve etnehmen kann, ergaben sich auch
hier vielversprechende Ergebnisse (siehe Abbildung 39).
Log Rank (Mantel-Cox)
ID-Proteine
Chi-Quadrat
Freiheitsgrade
Sig.
ZP_Id1
32,126
3
0,000
ZP_Id2
6,287
3
0,098
ZP_Id3
12,738
3
0,005
ZK_Id4
14,577
3
0,002
Tabelle 22: Test auf Gleichheit der Überlebensverteilungen für die verschiedenen Stufen von: ZP_Id1,
ZP_Id2, ZP_Id3, ZK_Id4. ZP = zytoplasmatische Expression, ZK = nukleäre Expression, das
Signifikanzniveau beträgt 95%.
87
A
n1=1 n2=34 n3=71 n4=44 p = 0,000
Median OAS:
n1: 23
n2: 524
n3: 552
n4: 1233
B
n1=90 n2=35 n3=18 n4=2 p = 0,098
Median OAS:
n1: 439
n2: 825
n3: 1020
n4: 414
88
C
n1=30 n2=69 n3=41 n4=10 p = 0,005
Median OAS:
n1: 439
n2: 575
n3: 1607
n4: 405
D
n1=17 n2=53 n3=68 n4=8 p = 0,002
Median OAS:
n1: 1427
n2: 997
n3: 422
n4: 328
Abbildung 39: Gesamtüberleben wiedergegeben an Hand von Kaplan-Meier-Kurven für die
zytoplasmatische Färbung von ID1 (= ZP_Id1; Abb.: A), ID2 (= ZP_Id2; Abb.: B) und ID3 (= ZP_Id3;
Abb.: C) und Färbung der Kerne für ID4 (= ZK_Id4; Abb.: D); Das kumulative Überleben (in Prozent
des gesamten Kollektives) zum jeweiligen Zeitpunkt in Jahren (OAS) wird wiedergegeben. Zensierte
Fälle beinhalten Patienten die zum Abschluss der Datenerhebung noch gelebt haben oder während
des Beobachtungszeitraumes verzogen sind und keine weiteren Daten mehr verfügbar waren. „n“ =
Anzahl der Fälle für die Kurve in der jeweiligen Farbe.
89
Wie bereits erwähnt wurden die vier Kategorien für die zytoplasmatische und
nukleäre Expression zu jeweils zwei Kategorien „low“ und „high“ mit homogener
Fallzahlverteilung zusammengefasst. Dadurch wurden manche Berechnungen
überhaupt erst ermöglicht, oder konnten die Ergebnisse verdeutlicht werden. Gerade
bei der Anwendung des Log-Rank-Tests können Kategorien mit sehr kleiner Fallzahl
die Ergebnisse verfälschen. Für die Korrelation des OAS mit der ID-Expression
ergeben sich dadurch folgende neue Kaplan-Meier-Kurven (siehe Abbildungen 40,
41, 42 und 43) mit den in Tabelle 23 wiedergegebenen Signifikanzen gemäß des
Log-Rank-Testes.
Log Rank (Mantel-Cox)
ID-Proteine
Chi-Quadrat
Freiheitsgrade
p-Wert
Id1_ZP_neu
6,126
1
0,013
Id1_ZK_neu
0,404
1
0,525
Id2_ZP_neu
5,569
1
0,018
Id2_ZK_neu
1,359
1
0,244
Id3_ZP_HL
8,018
1
0,005
Id3_ZK_HL
3,139
1
0,076
Id4_ZP_neu
0,362
1
0,548
Id4_ZK_HL
11,549
1
0,001
Tabelle 23: Test auf Gleichheit der Überlebensverteilungen für die verschiedenen Stufen von:
Id1_ZP_neu,
Id1_ZK_neu,
Id2_ZP_neu,
Id2_ZK_neu,
Id3_ZP_HL,
Id3_ZK_HL,
Id4_ZP_neu,
Id4_ZK_HL. ZP = zytoplasmatische Expression, ZK = nukleäre Expression, es wurde ein
Signifikanzniveau von 95% festgelegt (p < 0,05).
In den folgenden Kapiteln wird für jedes der vier ID-Proteine die Korrelation der IDExpression im Zytoplasma oder den Zellkernen mit dem OAS anhand der
dazugehörenden Kaplan-Meier-Kurven besprochen. Es wird nur auf die Kurven
90
eingegangen, welche mit Hilfe der zusammengefassten Kategorien „low“ und „high“
generiert wurde.
4.5.1.1 ID1-Expression und Gesamtüberleben
Betrachtet man die Korrelation der ID1-Expression mit dem Gesamtüberleben, (OAS)
so ergibt sich, wie bereits erwähnt wurde (Tabelle 21), eine hoch signifikante
(p<0,001), nicht zufällige Verteilung des OAS auf die unterschiedliche Expression
des ID1-Proteins im Zytoplasma. Mit einer Zunahme der zytoplasmatischen Färbung
nimmt auch die durchschnittliche Überlebenszeit der Patienten zu. Dieser
Zusammenhang bleibt bestehen, wenn man die vier Kategorien in zwei möglichst
gleichgroße Kategorien zusammenfasst. Patienten mit schwacher bis mäßiger
zytoplasmatischer ID1-Expression haben ein signifikant (p<0,05) kürzeres OAS als
Patienten mit starker zytoplasmatischer ID1-Expression. Für die Betrachtung der
Zellkerne ergibt sich kein signifikanter Zusammenhang. Dies bestätigt sich beim
Betrachten der entsprechenden Kaplan-Meier-Kurve (Tabelle 23 und Abbildung 40 A
& B).
A
n¹=106 n²=44 p = 0,013
Median OAS:
n1: 546
n2: 1233
91
B
n¹=78 n²=72 p = 0,525 (keine Sig.)
Median OAS:
n1: 546
n2: 640
Abbildung 40: Gesamtüberleben wiedergegeben anhand von Kaplan-Meier-Kurven für ID1Expression: A: blaue Kurve = Überleben der Patienten mit einer geringen bis mäßigen ID1-Expression
im Zytoplasma, grüne Kurve = Überleben der Patienten mit einer starken ID1-Expression im
Zytoplasma; B: grüne Kurve = Überleben der Patienten mit gefärbten Zellkernen, blaue Kurve =
Überleben der Patienten ohne gefärbte Zellkerne
Das Gesamtüberleben (OAS) wird in Prozent des gesamten Kollektivs in Jahren wiedergegeben.
Zensierte Fälle beinhalten Patienten die zum Abschluss der Datenerhebung noch gelebt haben oder
während des Beobachtungszeitraumes verzogen sind und keine weiteren Daten mehr verfügbar
waren. „n“ = Anzahl der Fälle für die Kurve in der jeweiligen Farbe
92
4.5.1.2 ID2-Expression und Gesamtüberleben
Für die Korrelation der zytoplasmatischen ID2-Expression mit dem OAS konnte für
die Betrachtung mit allen vier Kategorien ein nicht signifikanter Zusammenhang
gefunden werden. Betrachtet man jedoch die zytoplasmatische ID2-Expression mit
neu zusammengefassten Gruppen in „low“ (keine zytoplasmatische ID-Expression)
und „hight“ (geringe bis starke ID-Expression) so ergibt sich ein signifikanter
Unterschied bezüglich des Gesamtüberlebens der Patienten. Wie bereits bei ID1
leben auch bei der zytoplasmatischen ID2-Expression die Patienten mit einer
höheren zytoplasmatischen ID-Expression signifikant (p < 0,05) länger. Für die
nukleäre ID2-Expression ergibt sich keine signifikante Verteilung des OAS auf den
Expressionsstaus. Allenfalls könnte man vermuten, dass eine starke nukleäre
Expression mit einem kürzeren Überleben einhergeht (siehe Tabelle 23 und
Abbildung 41 A & B).
A
n¹=90 n²=55 p = 0,018
Median OAS:
n1: 439
n2: 826
93
B
n¹=95 n²=50 p = 0,244 (keine Sig.)
Median OAS:
n1: 640
n2: 575
Abbildung 41: Gesamtüberleben wiedergegeben anhand von Kaplan-Meier-Kurven für ID2Expression: A: blaue Kurve = Überleben der Patienten ohne ID2-Expression im Zytoplasma, grüne
Kurve = Überleben der Patienten mit einer geringen bis starken ID2-Expression im Zytoplasma; B:
grüne Kurve = Überleben der Patienten mit viel gefärbten Zellkernen, blaue Kurve = Überleben der
Patienten mit wenig bis mäßig vielen gefärbten Zellkernen.
Das Gesamtüberleben (OAS) wird in Prozent des gesamten Kollektivs in Jahren wiedergegeben.
Zensierte Fälle beinhalten Patienten die zum Abschluss der Datenerhebung noch gelebt haben oder
während des Beobachtungszeitraumes verzogen sind und keine weiteren Daten mehr verfügbar
waren. „n“ = Anzahl der Fälle für die Kurve in der jeweiligen Farbe
94
4.5.1.3 ID3-Expression und OAS
Für die zytoplasmatische ID3-Expression kann sehr signifikant (p = 0,005) gezeigt
werden, dass eine nicht zufällige Verteilung des OAS auf die zusammengefassten
Kategorien keine und schwache, beziehungsweise mäßige und starke ID3Expression vorliegt. Patienten mit mäßig bis starker ID3-Expression leben im
Durchschnitt länger als Patienten mit keiner bis nur schwacher ID3-Expression im
Zytoplasma.
Für die nukleäre ID3-Expression konnte gezeigt werden, dass Patienten ohne
beziehungsweise mit schwacher Färbung der Zellkerne länger leben als solche mit
mäßiger bis starker nukleärer ID3-Expression. Diese Verteilung des OAS auf die
zwei Kategorien keine bis schwach nukleäre Expression (low) und mäßige bis starke
nukleäre Expression (high) ist bei einem 95 %-Konfidenzintervall mit einem P-Wert
von 0,078 nur knapp nicht signifikant (siehe Tabelle 23 und Abbildung 42 A & B).
A
n¹=99 n²=51 p = 0,005
Median OAS:
n1: 552
n2: 986
95
B
n¹=24 n²=126 p = 0,078 (keine Sig.)
Median OAS:
n1: 1164
n2: 546
Abbildung 42: Gesamtüberleben wiedergegeben anhand von Kaplan-Meier-Kurven für ID3Expression: A: grüne Kurve = Überleben der Patienten mit mäßig bis starker ID3-Expression im
Zytoplasma, blaue Kurve = Überleben der Patienten mit keiner, bzw. geringer ID3-Expression im
Zytoplasma; B: grüne Kurve = Überleben der Patienten mit mäßig und viel gefärbten Zellkernen, blaue
Kurve = Überleben der Patienten mit keinen, bzw. wenig gefärbten Zellkernen.
Das Gesamtüberleben (OAS) wird in Prozent des gesamten Kollektivs in Jahren wiedergegeben.
Zensierte Fälle beinhalten Patienten die zum Abschluss der Datenerhebung noch gelebt haben oder
während des Beobachtungszeitraumes verzogen sind und keine weiteren Daten mehr verfügbar
waren. „n“ = Anzahl der Fälle für die Kurve in der jeweiligen Farbe
96
4.5.1.4 ID4-Expression und OAS
Bei der Betrachtung der Färbungen für das ID4-Protein wurde bereits erwähnt, dass
die zytoplasmatische Anfärbung des ID4-Proteins nur sehr schwach oder gar nicht
möglich war. Auch bei der Betrachtung der dazugehörenden Kaplan-Meier-Kurve ist
von einer zufälligen Verteilung des OAS auf die zwei Gruppen keine oder schwache
zytoplasmatische ID4-Färbung aus zu gehen. Dagegen konnte für die nukleäre
Anfärbung des ID4-Proteins eine hoch signifikante Verteilung (p = 0,001) des OAS
auf die Gruppe „low“ mit wenig gefärbten Zellkernen und die Gruppe „high“ mit vielen
gefärbten Zellkernen gezeigt werden. (siehe Tabelle 23 und Abbildung 43 A & B).
A
n¹=131 n²=15 p = 0,548 (keine Sig.)
Median OAS:
n1: 640
n2: 493
97
B
n¹=70 n²=76 p = 0,001
Median OAS:
n1: 1164
n2: 422
Abbildung 43: Gesamtüberleben wiedergegeben anhand von Kaplan-Meier-Kurven für ID4Expression, A: grüne Kurve = Überleben der Patienten mit einer geringen ID4-Expression im
Zytoplasma, blaue Kurve = Überleben der Patienten ohne ID4-Expression im Zytoplasma; B: grüne
Kurve = Überleben der Patienten mit mäßig und viel gefärbten Zellkernen, blaue Kurve = Überleben
der Patienten mit keinen, beziehungsweise wenig gefärbten Zellkernen
Das Gesamtüberleben (OAS) wird in Prozent des gesamten Kollektivss in Jahren wiedergegeben.
Zensierte Fälle beinhalten Patienten die zum Abschluss der Datenerhebung noch gelebt haben oder
während des Beobachtungszeitraumes verzogen sind und keine weiteren Daten mehr verfügbar
waren. „n“ = Anzahl der Fälle für die Kurve in der jeweiligen Farbe
98
4.5.2 ID-Expression und weitere klinische Parameter
Nachdem die ID-Expression der vier ID-Proteine mit dem Gesamtüberleben korreliert
wurde, wurden weitere Korrelationen mit zusätzlichen klinischen Parametern
erhoben. Es wurden vor Beginn der Studie aus den vielen vorliegenden Parametern
folgende als klinisch relevant ausgewählt und mit der zytoplasmatischen und
nukleären ID-Expression aller vier ID-Proteine auf Korrelationen geprüft: MELDScore und Child-Stadium, uni- oder multilokuläres Auftreten, Lebensalter bei
Erstdiagnose, Differenzierungsgrad, Ätiologie, Therapieansprechen.
4.5.2.1 ID-Expression und MELD-Score sowie Child-Stadium
Zuerst wurde mit Hilfe des Mann-Whitney-U-Test bei unabhängigen Stichproben für
alle vier ID-Proteinexpressionen untersucht, ob die Verteilung des MELD-Scores in
den zwei Kategorien high und low der jeweiligen Färbungen identisch ist (=
Nullhypothese). Für das festgesetzte Signifikanzniveau von p ≤ 0,05 konnte für vier
ID-Expressionen
die
Nullhypothese
verworfen
werden.
Für
Id1_ZP_neu,
Id2_ZK_neu, Id3_ZK_HL und Id4_ZK_HL konnte eine signifikant nicht identische
Verteilung des MELD-Scores gefunden werden (siehe Tabelle 24)
99
Mann-Whitney-U-Test
ID-Proteine
Sig.
Nullhypothese verwerfen
Id1_ZP_neu
0,021
Ja
Id1_ZK_neu
0,161
Nein
Id2_ZP_neu
0,437
Nein
Id2_ZK_neu
0,037
Ja
Id3_ZP_HL
0,817
Nein
Id3_ZK_HL
0,015
Ja
Id4_ZP_neu
0,295
Nein
Id4_ZK_HL
0,014
Ja
Tabelle 24: Korrelation des MELD-Scores mit der ID-Expression anhand des Mann-Whitney-U-Test:
Signifikanzniveau 5%; Nullhypothese = „Verteilung des MELD-Score ist in den Kategorien der IDExpression identisch“. Wird die Nullhypothese verworfen so ist von einer signifikant ungleichen
Verteilung des MELD-Score unter den Kategorien der ID-Expression auszugehen
Um diese Ergebnis weiter zu untersuchen und somit besser interpretieren zu können,
worin dieser signifikante Unterschied, der bei vier ID-Expressionen gefunden wurde,
besteht, wurden weitere Berechnungen durchgeführt. Zuerst wurde der Median des
MELD-Scores, welcher bei 146 Patienten vorlag, berechnet (Median = 8,50). Es
wurden eine neue Variable (MELD_neu) mit zwei Kategorien („MELD-Score größer
Median“ und „MELD-Score kleiner Median“) festgelegt. Daraufhin wurden für die „IDExpression high/low“ und den „MELD_neu“ Kreuztabellen angefertigt. Mit Hilfe des
Chi-Quadrat nach Pearson wurde untersucht ob ein signifikanter Zusammenhang
zwischen der ID-Expression und dem MELD-Score besteht. Für die nukleäre IDExpression von ID3 und ID4 konnte gezeigt werden, dass ein signifikanter
100
Zusammenhang zwischen der ID-Expression und dem MELD-Score besteht. Für die
zytoplasmatische ID-Expression von ID1 und die nukleäre ID-Expression von ID2
konnten keine signifikanten Zusammenhänge bestimmt werden (siehe Tabelle 25).
Chi-Quadrat nach Pearson
ID-Proteine
Sig.
Korrelation zw. MELD-Score
und ID-Expression
Id1_ZP_neu
0,197
Nein
Id2_ZK_neu
0,66
Nein
Id3_ZK_HL
0,003
Ja
Id4_ZK_HL
0,001
Ja
Tabelle 25: Untersuchung nach einem Zusammenhang zwischen dem MELD-Score mit der IDExpression anhand von Kreuztabellen: Signifikanzniveau 5%
Um diese Ergebnisse zu veranschaulichen werden auch die dazugehörenden
Balkendiagramme vorgestellt (siehe Abbildung 45). Man kann gut erkennen, dass für
die nukleäre ID3-Expression der Großteil (78,3 %) der Fälle mit wenig gefärbten
Zellkernen auf die Kategorie mit einem MELD-Score kleiner des Median (8,50) fällt.
Andererseits sind mehr Fälle (55,3 %) mit stark gefärbten Zellkernen in der Kategorie
mit einem MELD-Score größer des Median (8,50). Für die nukleäre ID4-Expression
ist derselbe Sachverhalt noch deutlicher zu erkennen. Hier sind 64,7 % der Fälle mit
wenig gefärbten Zellkernen und 37,8 % der Fälle mit stark gefärbten Zellkernen in
der Kategorie mit einem niederen MELD-Score zu finden. Für die nukleäre ID2Expression ist wiederum der gleiche Zusammenhang zu erkennen. Dieser kann
jedoch nicht statistisch mit signifikanten Ergebnissen untermauert werden. Für die
zytoplasmatische ID1-Expression kann kein signifikanter Zusammenhang von IDExpression und dem MELD-Score über oder unter dem Median gezeigt werden.
101
A
B
C
D
Abbildung 44: Korrelation des MELD-Scores mit der ID-Expression anhand des Mann-Whitney-UTest; Abb. A: für zytoplasmatische Expression von ID1; Abb. B: für nukleäre Expression von ID2; Abb.
C: für nukleäre Expression von ID3; Abb. D: für nukleäre Expression von ID4; Signifikanzniveau ≤
0,05; Nullhypothese = „Verteilung des MELD-Score ist in den Kategorien der ID-Expression identisch“.
Wird die Nullhypothese verworfen, so ist von einer signifikant ungleichen Verteilung des MELD-Score
unter den Kategorien der ID-Expression auszugehen.
Zusätzlich
konnte
gezeigt
werden,
dass
die
erfassten
MELD-Scores
des
Studienkollektivs gut mit dem Gesamtüberleben (OAS) korrelieren. Hierzu wurden,
wie bereits für die ID-Expression, mit Hilfe von Kaplan-Meier-Kurven und des LogRang-Test die Berechnungen erstellt (siehe Abbildung 45).
102
p = 0,006
Median OAS:
n1: 972
n2: 524
Abbildung 45: Vergleich von Gesamtüberleben (OAS) der Patienten mit einem MELD-Score über
dem Median von 8,50 (grüne Kurve) und Patienten mit einem MELD-Score unterhalb des Median
(blaue Kurve): Patienten aus der Gruppe mit einem MELD-Score unterhalb des Median leben
signifikant länger (p ≤ 0,006, Log-Rang-Test), Signifikanzniveau 5%
Bei den Berechnungen zur ID-Expression und dem Child-Stadium konnten keine
aussagekräftigen Ergebnisse gefunden werden.
4.5.2.2 ID-Expression und Therapieansprechen
Diese Berechnung wurde nur für die Patienten durchgeführt, von welchen Schnitte
eines Biopsates gefärbt wurden und primär mit einer minimal invasiven Technik
(TACE, RFTA, PEI, siehe hierzu Kapitel 1.1.6.) behandelt wurden. Insgesamt
erfüllten 81 Patienten diese Kriterien. Zusätzlich wurde bei diesen Patienten das
Ansprechen der primären Therapie (Kontrolle erfolgte ein bis zwei Monate nach
Therapie mittels Kontrastmittel-CT oder MRT) erfasst. Eine signifikante Korrelation
103
der nukleären ID4-Expression und des Therapieansprechens nach primärer minimal
invasiver Therapie kann sowohl mit dem Chi-Quadrat-Test (p = 0,024) als auch dem
Exakt-Test nach Fisher (p = 0,042) gefunden werden. Fälle, welche viele gefärbte
Zellkerne aufweisen, finden sich hierbei stärker in der Gruppe mit schlechtem
Therapieansprechen (PD + SD), dagegen sind die Fälle mit wenig gefärbten
Zellkernen mehr auf die Gruppe mit gutem Ansprechen auf die Therapie konzentriert
(siehe Abbildung 46).
Abbildung 46: Therapieansprechen und ID-Expression: PD = „progressiv disease“, steht für eine
Größenzunahme oder stärkere Kontrastmittelanreicherung im Kontroll-CT/ -MRT nach Therapie; SD =
„stable disease“, keine Veränderung der Bildgebung vor und nach Therapie; PR = „partial remission“,
Größenabnahme und/ oder weniger Kontrastmittelspeicherung in der Kontrollaufnahme; CR =
„complete
remission“,
kein
Nachweis
von
vitalem
Tumorgewebe,
bzw.
keine
Kontrastmittelspeicherung mehr in der Bildgebung nach Therapie; die Kontrollaufnahmen wurden
meist ein bis zwei Monate nach Therapie angefertigt.
104
4.5.2.3 ID-Expression und Lokalisation
Bei den Korrelationen der ID-Expression mit dem uni- oder multilokulärem Auftreten
konnte für die zytoplasmatische ID3-Expression ein signifikanter Zusammenhang
gefunden werden (Fisher´s Exact Test, p < 0,05). Die Fälle mit einer geringen IDExpression im Zytoplasma sind auffällig häufig in der Gruppe mit einem
multilokulären Tumorbefund bereits bei Erstdiagnose vertreten. Fälle mit hoher
zytoplasmatischer ID3-Expression verteilen sich nahezu gleichmäßig auf die zwei
Gruppen mit uni- beziehungsweise multilokulärem Auftreten der Tumore (siehe
Abbildung 47).
Abbildung 47: ID-Expression und Uni- beziehungsweise Multilokuläres Auftreten des HCC: Proben
mit intermediärer und starker zytoplasmatischer Färbung weisen signifikant häufiger ein multilokuläres
Auftreten des HCC auf
105
4.5.2.4 ID-Expression und Differenzierungsgrad
Es konnte für die nukleäre ID4-Expression eine signifikante Korrelation mit dem
histologischen Differenzierungsgrad gefunden werden (Chi-Quadrat-Test, p ≤ 0,05).
Dieser Zusammenhang besteht nur, wenn die Differenzierungsgrade eins und zwei
als Gruppe zusammengefasst werden, sowie die Grade drei und vier als eine Gruppe
geführt werden. Die Fälle mit wenigen gefärbten Zellkernen befinden sich stärker in
der Gruppe mit einem guten bis mäßigen Differenzierungsgrad. Auch kann für das in
die Studie eingeschlossene Kollektiv gezeigt werden, dass der Differenzierungsgrad
mit dem Gesamtüberleben signifikant korreliert und ein besser differenzierter Tumor
mit einer durchschnittlich längeren Überlebenszeit zusammenhängt (logrank test: p =
0,008). Die Kaplan-Meier-Kurven für die wie oben beschrieben in zwei Gruppen
zusammengefasste Differenzierungsgrade wird hier wiedergegeben (siehe Abbildung
48).
p = 0,008
Median OAS:
n1: 846
n2: 422
Abbildung 48: Vergleich von Gesamtüberleben (OAS) der Patienten mit gut/mäßig differenziertem
HCC und Patienten mit schlecht/undifferenziertem HCC: Patienten aus der Gruppe mit einem
gut/mäßig differenzierten HCC leben signifikant länger (p < 0,05) als Patienten mit einem schlecht
oder undifferenzierten HCC.
106
4.5.2.5 ID-Expression und Erkrankungsalter, Ätiologie, Geschlecht
Es konnte für keines der ID-Proteine, weder für die zytoplasmatische noch für die
nukleäre Expression, ein signifikanter Zusammenhang zwischen der Expression und
dem Alter bei Erstdiagnose gefunden werden. Ebenso ergaben sich keine
signifikanten Korrelationen bei der Betrachtung der ID-Expression und der Ätiologie
der zugrunde liegenden Leberpathologie. Kein Zusammenhang zwischen der
Expression der ID-Proteine und dem Geschlecht konnten gefunden werden.
107
5. Diskussion
5.1 Bedeutung der ID-Expression im neoplastischen Gewebe
In Neoplasien von vielen unterschiedlichen Geweben konnte ein veränderter
Expressionsstatus der ID-Proteine im Vergleich zum
werden
gesunden Gewebe gezeigt
26,61,69,70,92,112,114,115,119,133,137
. Korrelationen des Expressionsstatus der ID-
Proteine mit klinisch-pathologischen Parametern ergaben viel versprechende
Ergebnisse. So konnten bezüglich des Gesamtüberlebens (OAS), beziehungsweise
des krankheitsfreihen Überlebens (DFS), der histologischen Tumordifferenzierung,
der Metastasierung, der Angiogenese, des Therapieansprechens und vielen weiteren
Parametern signifikante Zusammenhänge mit der ID-Expression gefunden werden
9,26,43,48,51,69,98,113–115,121,142,143
.
kolorektalen Karzinom
Vorausgegangene
107,131,136
Forschungsarbeiten
, dem Pankreaskarzinom
55,66,81
zum
und einer Arbeit aus
der eigenen Forschungsgruppe zum cholangiozellulären Karzinom (CCC)
89
zeigen
interessante Ergebnisse, sowohl zum Expressionsstaus der ID-Proteine, sowie deren
Bedeutung in der Tumorentwicklung und Progression.
Bisher wurde jedoch keine umfassende Studie über den Expressionsstatus aller vier
ID-Proteine im HCC durchgeführt. Es fehlt eine Studie, welche an einem genügend
großen Patientenkollektiv dieser Frage nachgeht. Bisherige Studien zur IDExpression im HCC stammen außerdem alle aus dem asiatischen Raum.
Dementsprechend weisen sie ein Patientenkollektiv auf, welches asiatische
Besonderheiten, vor allem bezüglich der Ätiologie, widerspiegelt. So finden sich in
diesen Studien viele Patienten mit einer HBV- und/oder HCV-Infektion als zu Grunde
liegender Genese des HCC. Dafür sind Patienten mit einer äthyltoxischen
Leberpathologie im Vergleich zu Europa relativ schwach vertreten. Ebenso finden
sich in den Studien aus Asien verhältnismäßig viele hepatozelluläre Karzinome, die
ohne vorherige Leberzirrhose entstanden sind. Bisher wurde nur eine Studie
veröffentlicht, die den ID1-, ID2- und ID3-Expressionsstaus im HCC untersucht
26
.
Diese Studie betrachtet hierbei ausschließlich Färbungen, welche an Geweben
108
gemacht wurden, die nur aus Resektaten von operierten HCC Patienten stammen.
Drei weitere Arbeiten befassen sich ausschließlich mit der Expression von ID1 oder
ID2
68,82,127
.
Nach
unserem
Kenntnisstand
ist
bisher
keine
Arbeit
zum
Expressionsstatus von ID4 im HCC veröffentlicht worden.
Es fehlt somit eine Studie, welche den Expressionsstatus aller vier ID-Proteine an
demselben Patientenkollektiv untersucht. In dieser Studie wurde ein, im Vergleich zu
bisherigen Arbeiten, verhältnismäßig großes Patientenkollektiv analysiert. Hierbei
handelt es sich um ein für Mitteleuropa repräsentatives Kollektiv. Bei vielen Patienten
ist dem HCC eine zirrhotische Lebererkrankung unterschiedlicher Äthiopathogenese
voraus gegangen. Es sollten nicht nur Patienten eingeschlossen werden, welche in
einem kurativen Setting operiert wurden, sondern auch Patienten in einem
fortgeschrittenen Stadium, bei denen anhand einer Leberpunktion ein HCCNachweis
erfolgte
und
daraufhin
eine
minimal-invasive
Therapie,
eine
Chemotherapie oder eine palliative Behandlung eingeleitet wurde.
Es erschien somit sinnvoll und viel versprechend in einer Studie die Expression der
vier verschiedenen ID-Proteine im Hepatozellulären Karzinom zu untersuchen und
sowohl mit der Expression im gesunden Gewebe zu vergleichen als auch mit
klinisch-pathologischen Parametern zu korrelieren.
Ebenso profitiert diese Arbeit aus den Erfahrungen der Arbeitsgruppe, welche durch
die Untersuchung der ID-Expression bei Gallengangskarzinomen (CCC) gemacht
wurden, da auch hier mit ID-Antikörpern eine immunohistochemische Färbungen an
Feinschnitten der Leber durchgeführt wurde
89
. Die Färbemethode wurde in der
vorliegenden Arbeit mit einem neuen und noch spezifischeren Nachweissystem
verbessert
und,
um
optimale
Färbeergebnisse
zu
erhalten,
wurden
die
Vorbehandlung sowie die Verdünnung der jeweiligen ID-Antikörper erneut ausgiebig
ausgetestet und optimiert. Unter anderem konnte gezeigt werden, dass mit dem
hochspezifischen Antikörper der Firma Zytomed (Berlin) gegen das ID2-Protein ein
noch aussagekräftigeres Färbeergebnis erzielt werden konnte. Im Gegensatz zu dem
bisher in vielen Arbeiten verwendeten Antikörper gegen das ID2-Protein von Santa
Cruz (sc-489) wurden die Kaninchen zu Herstellung dieses Antikörpers nicht mit
einem Peptid des C-Terminals eines ID2 Proteins der Maus sondern mit einem
synthetisch hergestellten Peptid des C-Terminals eines humanen ID2-Proteins
geimpft.
109
5.2 Differenter Expressionsstatus der ID-Proteine im HCC und gesundem
Gewebe: sind die ID-Proteine an der Onkogenese beteiligt?
In vielen Neoplasien konnte ein im Vergleich zum gesunden Gewebe erhöhter IDExpressionsstatus nachgewiesen werden
20,43,51,98,100,102,113,115,122
. Jedoch konnten in
bereits drei Studien zum HCC eine im Vergleich zum Normalgewebe erniedrigte IDExpression gezeigt werden, was sich von anderen Tumoren unterscheidet. Beim
Mammakarzinom und dem papillären Schilddrüsenkarzinom konnte ebenfalls eine
erniedrigte ID-Expression im Vergleich zu gesunden Kontrollgewebe nachgewiesen
werden
26,28,48,82,121,126
. Diese Ergebnisse einer verminderten ID-Expression im
Tumorgewebe gegenüber dem Normalgewebe konnten auch in unserer Arbeit für die
Expression der ID1, ID2 und ID3 Proteine beim HCC gefunden werden.
Bei der Auswertung des Expressionsstatus der ID-Proteine wurden neue Gruppen
gebildet in denen die Scores der Auswertung anstatt auf vier Gruppen auf nur zwei
Gruppen zusammengefasst werden. Dadurch konnten bezüglich der Größe
homogene Gruppen erzeugt werden, welche sich unter anderem für anschließende
statistische Berechnungen besser eigneten. Grund für diesen Schritt ist die
Tatsache, dass Gruppen mit sehr wenigen Fällen zu falschen Berechnungen führen
können. Ebenso sind manche statistischen Berechnungen unter disproportionalen
Gruppen mit stark unterschiedlicher Größe unmöglich oder nicht sinnvoll. In vielen
vorausgegangenen Arbeiten wurde ein ähnliches Vorgehen gewählt 26,68,82,89,121,143.
Das gesunde Kontrollgewebe stammt von Patienten, die auf den Verdacht hin, dass
eine
Leberpathologie
vorliegt,
feinnadelpunktiert
worden
sind.
Dieses
Patientengewebe wurden nur dann als gesundes Kontrollgewebe deklariert, wenn im
Punktionspräparat keine deutliche Pathologie des Lebergewebes sichtbar war.
Trotzdem bleibt die Frage offen, ob nicht bereits auf molekularer Ebene, und somit
dem Betrachter des histopathologischen Präparates unter dem Mikroskop verborgen,
schon
pathologische
Prozesse
im
Gange
sind.
Leider fehlen
Daten
zur
Vorgeschichte und Verlauf dieser Patienten. Somit dürfen die Aussagen bezüglich
dieser als gesunde Kontrollen gewerteten Schnitte nicht unkritisch betrachtet werden.
110
5.2.1 ID1-Expression im HCC und dessen Bedeutung bei der Onkogenese
In den 13 gesunden Kontrollen ist ID1 einheitlich im Zytoplasma sehr stark exprimiert
und weist nahezu keine Färbung der Zellkerne auf. Dagegen konnte beim HCC ein
inhomogenes Verteilungsmuster der ID-Expression gefunden werden. So ist in den
meisten Fällen das Zytoplasma nur mäßig angefärbt und über 50 % der Zellkerne
weisen keine Färbung auf. Es kommen jedoch, im Unterschied zu dem
Kontrollgewebe, auch Fälle mit einer mäßigen oder sogar starken Färbung der
Zellkerne vor. Einen deutlicheren Unterschied erhält man, wenn man die Gruppen 02 zusammenfasst („low“) und gegen die Gruppe 3 („high“) abgrenzt. Nun befinden
sich bei den Kontrollen bezüglich der zytoplasmatischen ID-Expression fast 100 % in
der Gruppe „high“ und dagegen fallen über 70 % der HCC Fälle in die Gruppe „low“.
Auch für die Färbung der Zellkerne ergibt sich mit der Einteilung in die Gruppen
„high“ und „low“ deutlichere Unterschiede zwischen den gesunden Kontrollen und
den Patienten mit HCC.
Die Expression des ID1-Proteins im HCC ist im Vergleich zum gesunden Gewebe
verändert. Es überrascht allerdings, dass das gesunde Gewebe eine stärkere
zytoplasmatische ID1-Expression aufweist als das Tumorgewebe. Dagegen ist die
nukleäre Expression von ID1 in den Präparaten von Patienten mit HCC erhöht.
In der überwiegenden Anzahl der bisherigen Studien über den Expressionsstatus
von ID1 im neoplastischen Gewebe wurde eine stärkere zytoplasmatische Färbung
im Tumorgewebe im Vergleich zum gesunden Gewebe gefunden. Ebenso konnten
mit Western Blot, PCR und Northern Blot Analysen bestätigt werden, dass in
Tumoren
mehr
ID1
als
im
gesunden
Gewebe
gefunden
werden
kann
43,51,61,63,69,113,114
. Unter anderem wurde im Magenkarzinom, Pankreaskarzinom,
Kolonkarzinom oder dem Cholangiokarzinom ein stärkerer zytoplasmatischer ID1Expressionsstatus gefunden
43,49,66,89,133,136,140
. Und in nur wenigen Studien konnte
überhaupt eine nukleäre Färbung von ID1 nachgewiesen werden 122,142.
Vor diesem Hintergrund überraschen die Ergebnisse unserer Studie über den
Expressionsstatus des ID1-Proteins im HCC umso mehr. Vergleicht man jedoch
unsere Ergebnisse mit Ergebnissen aus vorausgegangenen Studien zum HCC ergibt
sich ein einheitliches Bild.
111
Damdinsuren et al. wiesen in allen Gewebeschnitten, welche kein Tumorgewebe
enthielten, eine moderate bis starke zytoplasmatische ID1-Expression nach. Hierzu
wurde das umliegende Gewebe der Tumorresektate verwendet und es handelte sich
immer um ein durch Hepatitis (HBV und/oder HCV) oder Zirrhose verändertes
Lebergewebe. Die Intensität der zytoplasmatischen ID1-Expression war im
Tumorgewebe niedriger als in dem umgebenden nicht neoplastischen Gewebe und
es konnte eine Abnahme der Expression von gut differenzierten zu schlecht
differenzierten Tumoren gefunden werden 26.
Eine
schwache
bis
starke
zytoplasmatische
ID1-Expression
in
zirrhotisch
veränderten Lebergewebe und eine nur sehr schwache ID1-Expression in gesunden
Lebern ergab eine Studie von Matsuda et al. 82.
Sowohl die Gruppe um Damdinsuren als auch die Ergebnisse der Studie von
Matsuda et al. konnten eine schwache bis starke ID1-Expression in pathologisch
verändertem nicht neoplastischem Lebergewebe nachweisen. Lee et al. konnten
keine zytoplasmatische ID1 Färbung in normalem Lebergewebe nachweisen.
Dagegen konnte keine, beziehungsweise eine nur schwache ID1-Expression im
zirrhotisch veränderten Lebergewebe oder Lebergewebe mit chronischer Hepatitis
gefunden werden. Im HCC ergaben sich bei 40% keine bis schwache und bei 60%
eine mäßige bis starke ID1-Expression 68.
Alle bisher erschienenen Studien haben gemeinsam, dass ID1 im gesunden
Lebergewebe nicht oder nur sehr schwach exprimiert wird. Dagegen findet sich im
pathologisch veränderten nicht neoplastischen Lebergewebe eine schwache bis
starke
ID1-Expression
(Damdinsuren,
Matsuda)
beziehungsweise
keine
bis
schwache ID1-Expression (Lee). Die ID1-Expression im HCC ist inhomogen und es
kommen keine bis stark gefärbte Fälle vor (Damdinsuren, Lee) 25,26,66,67,68,82,126,127.
Diese Ergebnisse decken sich zu einem großen Teil mit den Ergebnissen unserer
Arbeitsgruppe. Die Tatsache, dass die in unserer Studie als gesunde Kontrollen
verwendeten Lebern eventuell bereits auf molekularer Ebene eine pathologische
Veränderung erfahren haben, könnte den Unterschied bezüglich der gesunden
Kontrollen erklären.
Es bleibt somit festzuhalten, dass alle bisherigen Studien zum Expressionsstatus des
ID1-Proteins, eine schwache bis starke ID1-Expression im pathologisch verändertem
112
Lebergewebe oder HCC Gewebe nachweisen konnten. Auch in dieser Studie wurde
eine unterschiedlich starke ID1-Expression im HCC Gewebe gefunden. ID1 könnte
im pathologisch veränderten Lebergewebe auf Grund der Aktivierung der
Hepatozyten und deren proliferativen Verhaltens überexprimiert werden. Eine Studie
über ID1 in Lebern von Mäusen ergab, dass vor allem in aktivierten, proliferierenden
Hepatozyten ID1 stark exprimiert wird
65
. Diesen aktivierten und proliferativen Status
könnte ID1 über seine Funktion als Inhibitor of Differentiation einleiten oder
unterhalten.
Ebenso könnte ID1 in der frühen Tumorentwicklung über die Hemmung von
p16/INK4a
eine
entscheidende
Rolle
spielen.
So
wurde
in
einer
Arbeit
nachgewiesen, dass Proben mit einer hohen ID1-Expression einen nachweislich
signifikant niedrigeren p16/INK4a Spiegel hatten als Proben mit niederer ID1Expression 68.
Eine Erklärung für die diskontinuierliche ID1-Expression und ein vermehrtes
Vorkommen in frühen Tumorstadien könnte auch mit TGF-β1 zusammenhängen.
Dies wurde in undifferenzierten HCC-Zellen vermehrt nachgewiesen und eine
Unterdrückung der ID1-Expression durch TGF-β1 konnte ebenfalls gezeigt werden
25
. Somit würde TGF-β1 in schlecht differenzierten Tumoren die Expression von ID1
unterdrücken.
Ein weiterer wichtiger Aspekt dieser Arbeit ist die Tatsache, dass sowohl die
zytoplasmatische als auch nukleäre Expression von ID1 untersucht wurde. ID1
konnte in den Zellkerne nachgewiesen werden und somit unterscheidet sich dieses
Ergebnis von allen bisherigen Arbeiten zur ID1-Expression im HCC. Das gesunde
Gewebe zeigt fast einheitlich keine nukleäre ID1-Expression. Dagegen konnte in den
Präparaten von Patienten mit HCC durchaus Zellen mit deutlich gefärbten Zellkernen
gefunden werden. Auf die Möglichkeit, dass das ID1-Protein durch seine Lokalisation
in der Zelle reguliert werden könnte und entsprechend der Lokalisation auf
unterschiedliche Weise in den Zellzyklus eingreift, wird im Kapitel 5.3.1 weiter
diskutiert werden (siehe unten) 27,93,112,117.
113
5.2.2 ID2-Expression im HCC und dessen Bedeutung bei der Onkogenese
Das
gesunde
Kontrollgewebe
weist
eine
meist
schwache
bis
mäßige
zytoplasmatische ID2-Expression auf und nur wenige Fälle zeigen kein gefärbtes
Zytoplasma.
Im Gegensatz zu dem Kontrollgewebe zeigen über 60 % der
Präparaten von Patienten mit HCC keine zytoplasmatische ID2-Expression. Weniger
als 15 % der Fälle weisen eine mäßig bis starke Expression des Zytoplasmas auf.
Die nukleäre ID2-Expression der HCC-Fälle und des gesunden Kontrollgewebes ist
inhomogen zwischen wenigen bis vielen gefärbten Zellkernen verstreut und ähnelt
einander. Weder bei den Kontrollen noch den Präparaten von Patienten mit HCC
kommen Schnitte ohne gefärbte Zellkerne vor. Das HCC Gewebe weist mehr Fälle
mit einer starken nukleären Färbung auf. Dieser Unterschied ist jedoch nicht sehr
deutlich. Vergleicht man die ID2-Expression von HCC-Gewebe und gesundem
Gewebe anhand zusammengefasster Gruppen mit homogenerer Fallzahlverteilung,
dann ergeben sich zumindest für die zytoplasmatische Expression deutlichere
Unterschiede. So fallen über 60 % der HCC Fälle in die Gruppe „low“ (keine
zytoplasmatische Expression) und mehr als 80 % der Kontrollen finden sich in der
Gruppe „high“ (wenig bis starke zytoplasmatische Expression) wieder. Betrachtet
man die zusammengefassten Gruppen „low“ (wenig bis mäßig viel gefärbte
Zellkerne) und „high“ (viel gefärbte Zellkerne) für die nukleäre Expression von ID2 so
haben sowohl die Kontrollen als auch die Patienten mit HCC meist eine Expression
entsprechend der Gruppe „low“ ( 65,5 % HCC vs. 92,3 % gesunde Kontrollen).
Somit kann man für die ID2-Expression festhalten, dass eine unterschiedliche
Expression im Vergleich zum gesunden Kontrollgewebe vorliegt, wobei sich vor
allem die zytoplasmatische Expression unterscheidet. Auf Präparaten von Patienten
mit HCC ist das ID2-Protein meist weniger stark im Zytoplasma exprimiert als auf
Präparaten des Kontrollgewebes, und die HCC-Präparate zeigen eine geringfügig
stärkere nukleäre ID2-Expression.
Ein veränderter Expressionsstatus des ID2-Proteins gegenüber gesundem Gewebe
konnte in vielen Tumoren nachgewiesen werden. In Pankreaskarzinomzellen konnte
eine verstärkte Expression von ID2 mRNA nachgewiesen werden. Mit Hilfe einer
immunohistochemischen Färbung konnte eine stärkere zytoplasmatische ID2114
Expression im Pankreaskarzinom und Gewebe von chronischer Pankreatitis
gegenüber gesundem Gewebe gefunden werden
55,81
. Ebenfalls eine im Vergleich
zum Kontrollgewebe stärkere Expression von ID2 konnte in Zellen des kleinzelligen
Lungenkarzinoms,
Plattenepithelkarzinoms
Kolonkarzinoms gezeigt werden
des
Ösophagus
und
des
51,107,142
. Sowohl starke zytoplasmatische als auch
nukleäre ID2-Expression konnte in über 60% der Fälle beim Ewing-Sarkom gefunden
werden
100
. In stark proliferativen T-Zell-Lymphomen konnte eine verstärkte nukleäre
ID2-Expression nachgewiesen werden
22
. Und in Reed-Sternberg-Zellen des
Hodgkin-Lymphoms konnte bei über 80 % eine Überexpression von ID2 sowohl im
Zellkern als auch im Zytoplasma gefunden werden
145
. Dieselbe Beobachtung mit
erhöhter ID2-Expression sowohl im Zytoplasma als auch im Zellkern konnte für das
Plattenepithelkarzinom des Ösophagus gemacht werden 142.
Dagegen konnte ein verminderte ID2-Expression in schlecht differenzierten
Mammakarzinomzellen gegenüber gut differenzierten Tumoren nachgewiesen
werden, und eine starke ID2-Expression wurde in gut differenziertem Brustgewebe
während der Laktation gefunden
48
. Damdinsuren et al. konnten eine verminderte
zytoplasmatische ID2-Expression in HCC-Zellen im Vergleich zu dem nicht
neoplastisch veränderten Gewebe finden. Und es konnte gezeigt werden, dass mit
dem Grad der Dedifferenzierung die ID2-Expression zunehmend geringer wurde
26
.
Ein vergleichbares Ergebnis erbrachten die Untersuchungen von Tsunedomi et al. In
dieser Arbeit exprimieren durch HCV entstandene HCC Zellen aus invasiven
Tumoren mit bereits nachweisbarer Portalveneninvasion deutlich weniger ID2 als
weniger invasives Tumorgewebe
127
. Somit decken sich die Ergebnisse unserer
Arbeit mit den Ergebnissen der Arbeiten von Damdinsuren und Tsunedomi et al.
Beide Arbeitsgruppen konnten eine verminderte zytoplasmatische ID2-Expression in
HCC-Zellen gegenüber nicht malignem Gewebe finden.
Eine nicht signifikant veränderte ID2-Expression im Brustgewebe und im Gewebe
des Ovars im Vergleich zu dem neoplastischen Gewebe konnte von Maw et al.
nachgewiesen werden 83,84.
Eine hohe ID2-Expression kann das Retinoblastom-Protein (pRb, Rb), ein
Tumorsuppressor-Protein, funktionell inhibieren
51,63,63
. Ein häufig beobachtetes
Ereignis, das zu Beginn der Tumorentstehung vieler Tumore vorkommt. Verstärkte
ID2-Expression, beziehungsweise eine intrazelluläre ID2-Translokalisation könnte
115
somit das Wachstumspotential sich entwickelnder Krebszellen entscheidend
beeinflussen. So könnte ID2 auch in Leberzellen oder sich entwickelnden HCC
Zellen über eine verstärkte nukleäre Expression und somit Inhibition des Rb-Proteins
zu einer Tumorentstehung beziehungsweise Progression beitragen (siehe hierzu
auch 5.3.2).
5.2.3 ID3-Expression im HCC und dessen Bedeutung bei der Onkogenese
In Zellen des gesunden Kontrollgewebes wird ID3 vorwiegend mäßig stark bis sehr
stark im Zytoplasma mittels IHC nachgewiesen. Dagegen findet sich in dem
Tumorgewebe bei 20 % der Fälle keine zytoplasmatische ID3-Expression und fast 50
% weisen eine nur schwache ID3-Expression auf. Die nukleäre Färbung für das ID3Protein ist sowohl in den Kontrollfällen als auch in den Tumorzellen meist stark bis
sehr stark, wobei unter den Präparaten von Patienten mit HCC auch Fälle ohne (4
%), beziehungsweise schwacher (12 %) nukleärer Expression vorkommen.
Betrachtet man die Unterschiede zwischen dem gesunden Gewebe und den
Präparaten von Patienten mit HCC in zusammengefassten Gruppen, so wird ein
deutlicher zytoplasmatischer Expressionsunterschied sichtbar. 66 % der Präparate
von Patienten mit HCC fallen in die Gruppe „low“ und 100 % der Kontrollfälle finden
sich in der Gruppe „high“ wieder. Für die nukleäre Färbung kann man nur den sehr
schwachen Trend beobachten, dass die Präparaten von Patienten mit HCC etwas
häufiger keine oder eine nur schwache nukleäre Färbung vorweisen. Somit findet
sich eine deutlich veränderte zytoplasmatische ID3-Expression zwischen gesundem
Gewebe und Präparaten von Patienten mit HCC.
Auch in vielen anderen Tumorentitäten konnte ein veränderter Expressionsstatus des
ID3-Proteins im Tumorgewebe verglichen mit Normalgewebe gefunden werden. In
Zellen des kleinzelligen Bronchialkarzinoms konnte eine verstärkte ID3-Expression
gegenüber gesundem Gewebe nachgewiesen werden
51
. Eine nukleäre Expression
116
konnte in Plattenepithelzellen gefunden werden. Bei Plattenepithelkarzinomen des
Kopfes und Halses ergab sich ein stärkeres Färbeergebnis in schlecht differenzierten
Tumoren als in gut differenzierten Tumoren. Auch in diesem Gewebe wurde ID3
ausschließlich im Zellkern nachgewiesen
61
. Auch konnte in Färbungen an Schnitten
des kolorektalen Karzinoms eine stärkere nukleäre Färbung für das ID3-Protein
gefunden werden
136
. Im Adenokarzinomen des Magens konnte ebenfalls eine
erhöhte ID3-Expression nachgewiesen werden 140.
Ebenso konnte im papillären Schilddrüsenkarzinom eine nukleäre ID3-Expression
entdeckt werden, wobei sich hier eine verminderte ID3-Expression im Vergleich zum
gesunden Gewebe zeigt
28
. Auch in Tumorzelllinien und primären Tumorzellen des
Ovarialkarzinoms und des Prostatakarzinoms konnte eine verminderte ID3Expression gegenüber nicht neoplastischem Gewebe gefunden werden
4,143
. Hierzu
passen auch die Ergebnisse von Damdinsuren et al., welche ebenso eine
verminderte zytoplasmatische ID3-Expression in Zellen des HCC gegenüber dem
Normalgewebe nachgewiesen haben
26
. Somit kann man zusammenfassend sagen,
dass die ID3-Expression in mehreren Tumorentitäten gegenüber Normalgewebe
verändert ist. In einigen Neoplasien, unter anderem dem HCC, konnte eine
verminderte zytoplasmatische ID3-Expression gegenüber dem Normalgewebe
gefunden werden.
Das ID3-Protein kann bei der Entstehung von Tumoren, ähnlich dem ID1-Protein,
einen proliferativen Status über Hemmung der bHLH-Proteine induzieren
93,110,119
.
Dies kann zum Beispiel über die Wirkung von ID3 auf den TGF-β Signalweg erklärt
werden 53,57. TGF-β ist ein wichtiges Protein, welches Einfluss auf die Differenzierung
von Zellen nimmt. ID3 scheint eine wichtige Funktion in diesem Signalweg
einzunehmen und die Differenzierung von Zellen zu hemmen oder einen
proliferativen Status zu induzieren oder erhalten.
Ebenso konnte gezeigt werden, dass ID3 (ebenso wie ID1) bei der Angiogenese,
einer äußerst wichtigen Voraussetzung für Tumorwachstum und Metastasierung,
eine entscheidende Rolle spielt 63,76.
117
5.2.4 ID4-Expression im HCC und dessen Bedeutung bei der Onkogenese
Bei der Betrachtung der ID4-Expression konnte bei über 80 % der Präparaten von
Patienten mit HCC keine Färbereaktion im Zytoplasma beobachtet werden und nur
zirka 10 % zeigten eine fragliche schwache Färbung des Zytoplasma. Auch die
gesunden Kontrollen zeigten keine oder nur schwache zytoplasmatische Färbungen.
Für den verwendeten hochspezifischen Antikörper gegen das ID4-Protein ist zurzeit
noch kein sogenanntes „Blocking-Peptide“ (siehe hierzu Kapitel 3.3.3 und 4.1.1) auf
dem Markt zu erhalten. Somit kann ein Nachweis der Spezifität für diesen Antikörper
mit
Hilfe
eines
„Blocking-Peptides“
nicht
erfolgen.
Darum
wird
auf
die
zytoplasmatischen Färbeergebnisse, welche nur sehr schwach ausgefallen sind,
nicht weiter eingegangen, da hier nicht sicher von einer spezifischen Färbung des
Zytoplasma ausgegangen werden kann.
Alle Präparate von Normalgewebe weisen eine starke Färbung der Zellkerne auf. Die
kräftige Färbung der Zellkerne erscheint überzeugend homogen auf allen Färbungen
und muss als spezifisch angenommen werden.
Ebenso waren in den meisten Präparaten von Patienten mit HCC kräftig gefärbte
Zellkerne zu beobachten und in knapp mehr als der Hälfte der Präparate von
Patienten mit HCC konnten viele bis sehr viele gefärbte Kerne gefunden werden.
Somit verteilen sich ungefähr jeweils die Hälfte der Präparaten von Patienten mit
HCC bezüglich der nukleären ID4-Expression auf die zusammengefassten Gruppen
„high“ und „low“. Dagegen fallen alle Präparate der gesunden Kontrollen in die
Kategorie „high“. Somit findet sich auch für die nukläre Färbung des ID4-Proteins ein
deutlicher Unterschied zwischen HCC-Gewebe und gesunden Kontrollen.
Bisherige Studien über die ID4-Expression weisen unterschiedliche Ergebnisse
untereinander auf. So konnte kein Unterschied in der ID4-Expression zwischen
Tumor- und Kontrollgewebe in einer Studie zu dem Plattenepithelkarzinom des
Ösophagus gefunden werden 142.
In mehreren unterschiedlichen Tumoren war die ID4-Expression auf mRNA- und
Proteinebene
gegenüber
dem
gesunden
Kontrollgewebe
auf
Grund
von
118
Promotermethylierung des ID4-Gens vermindert. Dies konnte für das Kolorektale
131
Karzinom
12,92,130
, das Brustkarzinom
, das Prostatakarzinom
13
und für das
Magenkarzinom 14 nachgewiesen werden.
Erhöhte ID4-Expression gegenüber gesunden Kontrollen konnte in Brusttumoren von
Ratten
116
, in Prostatakarzinomen
50,60
Glioblastoma-Tumoren
,
143
51
in
Leukämie
und
, im kleinzelligen Lungenkarzinom
in
prolymphozytischen T-Zell-Lymphomen
akuter
8
lymphatischer
,
gefunden werden. Bei den meisten
Studien, welche eine IHC-Färbung für das ID4-Protein durchführten, wurde
ausschließlich eine nukleäre Färbung für das ID4-Protein gefunden 51,116,143.
Bisher wurde
nach unserem
Kenntnisstand noch
keine Arbeit
über den
Expressionsstatus des ID4-Proteins im HCC veröffentlicht. So kann in dieser Arbeit
zum ersten Mal gezeigt werden, dass ID4 im HCC fraglich im Zytoplasma und
deutlich in den Zellkernen exprimiert wird. Auffallend ist die Ähnlichkeit unseres
Ergebnisses mit anderen Studien zum Beispiel zum Prostatakarzinom oder dem
Mammakarzinom
108,143
. Sowohl in diesen als auch in der vorliegenden Arbeit konnte
in zirka der Hälfte aller Präparaten des neoplastischen Gewebes keine ID4Expression nachgewiesen werden. Und genau wie im Prostatakarzinomzellen
konnten auch in den Zellen des HCC keine zytoplasmatische sondern nur eine
spezifische nukleäre Färbung gefunden werden, welche schwach bis mäßig stark
gewertet werden konnte.
In Typ A Spermatogonien konnte eine gute zytoplasmatische Expression von ID4
gefunden werden. Dagegen wiesen Zellen des malignen Seminoms deutliche
nukleäre Färbungen für das ID4-Protein auf
112
. Diese Entdeckung könnte wiederum,
wie bereits bei den übrigen drei ID-Proteinen (ID1, ID2 und ID3) dargestellt, Grund
zur Annahme geben, dass auch bei dem ID4-Protein die Funktion des Proteins von
der subzellulären Lokalisation abhängt und eventuell über diese reguliert wird.
ID4 ist das bisher noch am wenigsten erforschte Protein seiner Gruppe. Im
Gegensatz zu seinem Verwandten, dem ID1-Protein, sind in den letzten Jahren sehr
unterschiedliche Ergebnisse bezüglich einerseits der Expression und andererseits
seiner Funktion im neoplastischen Gewebe gefunden worden.
In Tumoren, in denen es auf Grund einer Promotormethylierung vermindert
vorgefunden werden kann, konnte dem ID4-Protein eine tumorsuppressive Wirkung
119
nachgewiesen werden
12–14,92,130,131
. Auch konnte am cholangiozellulären Karzinom
gezeigt werden, dass eine fehlende zytoplasmatische ID4-Expression mit einem
schlechteren Überleben korreliert 89.
Dagegen hat es in anderen Tumorentitäten eine onkogene Wirkung. So konnte es,
passend zu seinem Namen, als Inhibitor der Differenzierung bei der Entwicklung von
Oligodendrozyten
56
identifiziert werden. Aber auch in die Neoangiogenese über den
p53-E2F1-Signalweg 42 zum Beispiel beim Glioblastom 60 könnte es involviert sein.
5.3 ID-Proteine könnten über ihre Lokalisation innerhalb der Zelle reguliert
werden und in den Zellzyklus unterschiedlich eingreifen
Um den Expressionsstatus der einzelnen ID-Proteine zu erheben wurden alle
Präparate von zwei unabhängigen Untersuchern unter dem Mikroskop ausgewertet.
Hierzu wurde zuerst anhand von HE-Schnitten das Tumorgewebe auf den
Präparaten aufgesucht. Daraufhin wurde in den entsprechenden Schnitten, auf
denen sich die ID-Protein-Färbungen befanden, die Färbeintensität des Zytoplasmas
und die prozentuale Anzahl der gefärbten Zellkerne innerhalb des Tumorgewebes
getrennt
ausgewertet
histopathologischen
und
Schnitt
dokumentiert.
eines
Somit
Patienten
für
ergaben
sich
alle
ID-Proteine
vier
für
jeden
ein
zytoplasmatischer und ein nukleärer Färbewert. Mit diesem Vorgehen kann man sich
die Vorteile der Immunhistochemie (IHC) im Vergleich zu anderer Verfahren, wie
zum Beispiel dem Western Blot, Northern Blot oder der PCR zu Nutzen machen.
Man kann nicht nur eine quantitative Aussage über den Expressionsstatus der IDProteine machen, sondern erhält auch über deren Lokalisation innerhalb der Zelle
eine Information. Bisher konnten alle vier ID-Proteine entweder im Zytoplasma oder
im Zellkern, zum Teil sogar in beiden Zellkompartimenten, in verschiedenen
Geweben nachgewiesen werden
5,20,26,51,81,112,117,121,122,143
. Einige Arbeiten gehen
davon aus, dass die ID-Proteine unter anderem über ihre Lokalisation in der Zelle
reguliert werden
27,93,112,117
. Aufgrund ihrer Molekülgröße wäre eine passive
Translokalisation der ID-Proteine durch Poren des Zellkerns in und aus dem Zellkern
120
möglich
78,93
. Aktuelle Studien liefern aber Hinweise, dass die intrazelluläre
Lokalisation der ID-Proteine fein reguliert wird. Dies kann durch Heterodimerisation
mit bHLH-Proteinen erfolgen
27
. Aber auch verschiedene nukleäre Importsignale
(NLS) und nukleäre Exportsignale (NES) für den nukleo-zytoplasmatischen Transport
von ID1 und ID2 konnten identifiziert werden
59,78,124
. Entsprechend ihrer Lokalisation
könnten ID-Proteine innerhalb der Zelle auf unterschiedliche Weise in die Regulation
des Zellzyklus eingreifen 51,63,78,117,134
5.3.1 Subzelluläre Translokalisation von ID1
In verschiedenen Neoplasien konnte das ID1-Protein entweder im Zytoplasma, im
Nukleus
oder
Unterschiedliche
aber
in
beiden
Zellkompartimenten
Zusammenhänge
zwischen
nachgewiesen
der
werden.
Expression
und
klinischpathologischen Parametern konnten hierbei gefunden wurden. So wurde zum
Beispiel eine rein zytoplasmatische ID1-Expression in Zellen des Zervixkarzinoms
gefunden und als möglicher Prognosefaktor bezüglich des Gesamtüberlebens
identifiziert
113
. Takai et al. konnten eine ID1-Expression primär im Zellkern von
Endometriumkarzinomen nachweisen und die ID1-Expression mit der Invasivität und
dem histologischen Grad dieser Tumoren korrelieren
122
des
Pankreatitis
Pankreaskarzinoms
zytoplasmatische
und
der
chronischen
ID1-Expression
. Ebenso konnte in Zellen
nachgewiesen
werden
eine
erhöhte
81
.
In
Nierenzellkarzinomzellen konnte eine erhöhte zytoplasmatische ID1-Expression
nachgewiesen und eine positive Korrelation mit der EGFR-Expression und einer
schlechteren Prognose gefunden werden
nukleäre
und
erhöhte
69
. Kamalian et al. wiesen eine verminderte
zytoplasmatische
ID1-Expression
im
kleinzelligen
Bronchialkarzinom nach und konnten zeigen, dass sich die ID-Expression innerhalb
der Zelle während der Tumorentstehung verändert. Somit könnte die subzelluläre
Lokalisation der ID-Expression und deren Veränderung (beim Bronchialkarzinom:
vom Zellkern zum Zytoplasma hin) eine entscheidende Rolle in der Entstehung des
kleinzelligen Bronchialkarzinoms spielen 51.
121
Für das ID1-Protein konnte ein eigenes nukleäres Exportsignal (NES) gefunden
werden, welches für eine präzise Regulierung der Lokalisation des ID1-Proteins
spricht
78
. Nicht nur über den Transport in und aus dem Zellkern könnte die
unterschiedliche ID-Expression erklärt werden. Trausch-Azar et al. wiesen einen
Ubiquitin-Proteasom-vermittelten Abbau des ID1-Proteins im Zellkern nach. Somit
könnte eine Überexpression des ID1-Proteins im Zellkern zu einem verstärkten
Abbau des Proteins führen. Zusätzlich wird dieser Abbau des ID1-Proteins über
MyoD gesteuert und kontrolliert 124.
Diese Entdeckungen sprechen für eine fein regulierte Lokalisation des ID1-Proteins
innerhalb der Zelle. Ist die subzellulären Lokalisation des ID1-Proteins gehemmt oder
dysreguliert könnte dies auf unterschiedliche Weise auf den Zellzyklus Einfluss
nehmen
und
somit
auf
verschiedenen Wegen
einen
proliferativen
Status
begünstigen, beziehungsweise eine Tumorentstehung herbeiführen. Wie dies auf
molekularer Ebene für das hepatozelluläre Karzinom aussehen könnte, muss in
folgenden Arbeiten weiter untersucht werden.
5.3.2 Subzelluläre Translokalisation von ID2
Betrachtet man die intrazelluläre Verteilung des ID2-Proteins genauer, so erkennt
man auch hier Unterschiede in der Lokalisation der Expression von ID2 in
verschiedenen Tumoren. Ebenso können Rückschlüsse auf die Regulation und
Funktion von ID2 über dessen intrazelluläre Lokalisation getroffen werden.
Es konnte während der Entwicklung und Differenzierung von Oligodendrozyten in
einer Studie von Wang et al. gezeigt werden, dass ID2 sowohl in nicht
ausdifferenzierten, sich teilenden Vorläuferzellen als auch in voll differenzierten
Oligodendrozyten nachgewiesen werden kann. Die Lokalisation der ID2-Expression
unterschied sich jedoch in den unterschiedlichen Zellstadien voneinander. So wurde
nachgewiesen, dass eine nukleäre ID2-Expression mit einem proliferativen Status
zusammen auftritt und kurz vor der Differenzierung eine Translokalisation des ID2122
Proteins aus dem Nukleus in das Zytoplasma stattfindet. In den ausdifferenzierten
Oligodendrozyten konnte keine nukleäre ID2-Expression mehr nachgewiesen
werden, dafür aber eine ID2-Expression im Zytoplasma
63,134
. Darüber hinaus wird
ID2 in Astrozyten-Zelllinien vom Zytoplasma zum Zellkern hin transloziert, als Antwort
auf eine Zuführung von Serum 129.
ID2 könnte über die Dimerisation mit einem bHLH-Protein, zum Beispiel E47, über
dessen „nuclear localization signal“ in den Zellkern transportiert werden und somit
über die Anwesenheit von E47 reguliert werden
27,134
. ID2 konnte in Zellen des
Prostatakarzinoms nachgewiesen werden. Es konnte nicht nur eine höhere ID2Expression in Tumoren mit höherem Gleason-Score, sondern auch eine verstärkte
nukleäre ID2-Expression in schlecht differenzierten Tumoren nachgewiesen werden.
So könnte in der Entstehung des Prostatakarzinoms die Expression und
intrazelluläre Lokalisation von ID2 eine entscheidende Rolle spielen
20
. Eine weitere
Studie von Kurooka et al. konnte nachweisen, dass ID2 nicht nur über eine freie
Diffusion in den Zellkern hinein und aus dem Zellkern heraus gelangt, sondern auch
über seine Dimerisation mit anderen bHLH-Proteinen beziehungsweise eines
eigenen NES (nuclear export signal) intrazellulär transportiert und somit reguliert wird
18,59
. Auch an Zelllinien des Kolonkarzinoms konnte eine verstärkte nukleäre Färbung
des ID2-Proteins in der IHC nachgewiesen werden, wenn exogenes E47 in diesen
Zellen exprimiert wurde 136.
Über die Hemmung des Retinoblastom-Proteins (pRb, Rb), ein TumorsuppressorProtein, könnte ID2 auf die Tumorentstehung einwirken
51,63,63
. Da das Rb-Protein
regulatorisch auf den Zellzyklus über die Bindung von Transskriptionsfaktoren im
Zellkern eingreift, lässt sich auch nachvollziehen, dass vor allem nucleär exprimiertes
ID2 eine onkogene Wirkung auf die Zelle ausüben kann. Eine intrazelluläre ID2
Translokalisation aus dem Zytoplasma in den Zellkern könnte somit das
Wachstumspotential sich entwickelnder Krebszellen bei der Entstehung des HCC
entscheidend beeinflussen.
123
5.3.3 Subzelluläre Translokalisation von ID3
Wie bereits erwähnt konnten bisher sowohl zytoplasmatische als auch nukleäre
Färbungen für das ID3-Protein mittels der IHC gezeigt werden. ID3 kann über die
Dimerisation mit E-Proteinen in den Nukleus transportiert werden. Bei der
Abwesenheit von E-Proteinen findet sich für das ID3-Protein ausschließlich eine
zytoplasmatische und perinukleäre Färbung
27
. Eine Möglichkeit, wie das ID3-Protein
in der Zelle über seine subzelluläre Lokalisation die Zellproliferation mitregulieren
könnte, deckte O'Toole et al. auf. ID3 könnte im Zellkern bHLH-Proteine binden und
somit deren Wirkung auf die Differenzierung der Zelle verhindern 97.
Die Steuerung der subzellulären Lokalisation von ID3 kann, wie bereits für ID1 und
ID2 dargestellt, über die Dimerisation mit bHLH-Proteinen und den Transport in den
Nukleus erfolgen. Dies konnte sehr schön an Zelllinien des Kolonkarzinoms gezeigt
werden. In Zellen, in denen E47 durch einen Vektor überexprimiert wurde, konnte
eine stärkere nukleäre ID3-Expression nachgewiesen werden 136.
5.3.4 Subzelluläre Translokalisation von ID4
Auch
das
ID4-Protein
könnte
über
seine
Lokalisation
zwischen
den
Zellkompartimenten reguliert werden und entsprechend unterschiedlich auf die
Zellzyklusprozesse eingreifen. Dafür sprechen unter anderem die Ergebnisse
unserer Arbeitsgruppe zum CCC. Hier konnte gezeigt werden, dass eine starke
zytoplasmatische
Expression
mit
einem
besseren
Gesamtüberleben
(OAS)
zusammenhängt. Bei der Korrelation des OAS mit der ID4-Expression im HCC
(s.Kapitel 5.4.1.4) wurde ein signifikanter Zusammenhang der nukleären ID4Expression mit einem verminderten OAS gefunden. Eine Translokalisation des ID4Proteins aus dem Zytoplasma in den Zellkern könnte diese Ergebnisse erklären.
124
Gleiches konnte für Zellen des Seminoms gezeigt werden. Auch hier findet sich in
gesunden A-Spermatogonien eine starke zytoplasmatische ID4-Expression, während
in neoplastisch veränderten Seminomzellen vor allem eine nukleäre ID4-Expression
vorhanden war. Auf welche Weise die Translokalisation des ID4-Proteins geschieht
muss zukünftig noch genauer untersucht werden.
5.4 Korrelationen der ID-Expression mit klinisch-pathologischen Variablen
Nach dem Nachweis einer Expression der ID-Proteine in Zellen des gesunden
Gewebes der Leber und Zellen des HCC und der Beobachtung einer, wenn auch
zum Teil nur geringfügig, veränderten Expression zwischen gesundem und
neoplastischem Gewebe, wurde der Frage nachgegangen, ob ein Zusammenhang
der ID-Expression im HCC und klinisch-pathologischen Parametern besteht. Primär
wurde hierbei nach einer Korrelation der Expression und dem Gesamtüberleben
(OAS) gesucht. Die Entscheidung, das OAS als wichtigsten klinischen Parameter in
den Vordergrund der Betrachtung zu stellen, hat mehrere Gründe. Erstens handelt
es sich um einen sehr eindeutig zu messenden Parameter mit hoher klinischer
Relevanz. Zweitens wurden bisher eine große Anzahl an Studien zur ID-Expression
und dem OAS mit viel versprechenden Ergebnissen veröffentlicht
26,51,89,113–115,121,131
.
Drittens ist die Funktion und Wirkweise der ID-Proteine im neoplastischen Gewebe
(und vor allem dem HCC) bisher noch wenig verstanden. Das OAS ist Ausdruck
vieler verschiedener Prozesse, die sich in dem Körper des Patienten abspielen. So
fließen Malignität, Metastasierung, Beeinträchtigung der Organfunktion und viele
weitere Eigenschaften der Neoplasie und deren Wirkung auf den Körper hier mit ein.
Und viertens kann bei einem eindeutigen Zusammenhang der Expression der IDProteine mit dem OAS eine Aussage über deren Funktion als Prognosefaktor bei der
Diagnostik und Therapie des HCC gemacht und eventuell zukünftig in der Klinik als
solcher eingesetzt werden.
125
5.4.1 Kaplan-Meier-Berechung: ID-Expression und Gesamtüberleben
Bisher ist nach unserem Kenntnisstand nur eine einzige Studie zur Korrelation der
ID-Proteine und dem krankheitsfreien Überleben (DFS) nach Resektion bezüglich
des HCC an einem asiatischen Patientenkollektiv von Damdinsuren et al.
veröffentlicht worden
26
. Eine Untersuchung des Expressionsstatus des ID4-Proteins
im HCC ist nach unserem Kenntnisstand bisher noch nicht publiziert worden und wird
hiermit zum ersten Mal veröffentlicht.
In unserer Arbeitsgruppe konnten kürzlich sehr interessante und signifikante
Ergebnisse bezüglich der ID-Expression und dem Gesamtüberleben (OAS) des
Gallengangkarzinoms (CCC), einem dem HCC verwandten Tumor, veröffentlicht
werden.
Da hier nicht nur Patienten eingeschlossen wurden, bei welchen eine Resektion des
HCC im Sinne einer kurativen Heilung möglich war (s. Damdinsuren et al.26), sondern
bei dem Großteil der Patienten (83,3 %) auf Grund einer Leberbiopsie der
histopathologische Nachweis des HCC erfolgte, wird hier ein Patientenkollektiv
untersucht, welches sich zum Großteil in einem fortgeschritten Stadium der
Erkrankung befindet. Diese Patienten wurden im weiteren Verlauf mit minimal
invasiven Techniken, wie zum Beispiel einer RFTA, behandelt. Einige Patienten
(15,4 %) konnten lediglich noch mit einer palliativen Zielsetzung behandelt werden.
Somit ist das untersuchte Patientenkollektiv repräsentativ für Patienten mit HCC in
Europa. Die Aussagen bezüglich des OAS schließen somit nicht nur Kriterien der
Therapie und des Zustandes des Patienten ein, sondern auch die verschiedenen
Stadien der Erkrankung (siehe hierzu Kapitel 3.1).
Es konnten eindeutige Korrelationen aller vier ID-Proteine und dem OAS in unserer
Studie gefunden werden. Hierbei wurde wiederum zwischen der nukleären und
zytoplasmatischen
Sublokalisation
der
ID-Proteine
innerhalb
der
Zellen
unterschieden. So zeigte sich für die zytoplasmatische Expression der ID-Proteine 1
bis 3 eine positive Korrelation mit dem OAS (p = 0,000; p = 0,098; p = 0,005;
respektive). Es geht eine starke zytoplasmatische Expression dieser drei ID-Proteine
mit einem besseren OAS einher. Für das ID4-Protein konnte eine starke inverse
126
Korrelation der nukleären ID4-Expression und dem OAS nachgewiesen werden (p =
0,002).
Der
gleiche
Zusammenhang
zwischen
nukleärer
Expression
und
schlechterem OAS zeigt sich auch für die nukleäre ID2- und ID3-Expression, wobei
hier keine Signifikanz erreicht wurde (p = 0,2 respektive p = 0,076; siehe hierzu
Abbildung 40 bis 44 und Tabelle 21 und 22).
Diese Ergebnisse decken sich mit bereits veröffentlichten Ergebnissen über die
Korrelation der ID-Expression und dem OAS. So konnte in mehreren Studien sowohl
ein positiver als auch negativer Zusammenhang der ID-Proteinexpression und dem
OAS gefunden werden.
Bei der Betrachtung des CCC, in der dieser Studie vorausgegangenen Arbeit,
konnten gute Korrelationen vor allem an der Subgruppe der chemotherapierten
Patienten mit dem OAS nachgewiesen werden. Da es noch keine etablierte
Chemotherapie für das HCC gibt, war diese Betrachtung demnach in dieser Studie
nicht sinnvoll und es wurden deshalb die Subgruppen der minimal invasiv
behandelten Patienten getrennt betrachtet.
5.4.1.1 ID1 und Gesamtüberleben
Bei den Berechnungen bezüglich der ID1-Expression und dem Gesamtüberleben
(OAS) konnte für die zytoplasmatische ID1-Expression sowohl bei der Betrachtung
aller vier Expressionsgrade, als auch bei den homogen zusammengefassten
Gruppen in „high“ und „low“ eine signifikante Korrelation gefunden werden (siehe
Tabelle 21 und 22). Überraschenderweise konnte ein Zusammenhang hoher ID1Expression mit einem längeren Gesamtüberleben nach Erstdiagnose gefunden
werden.
In mehreren bisher veröffentlichten Studien wurde eine negative Korrelation der
zytoplasmatischen ID1-Expression und dem OAS berechnet und stellen somit
konträre Ergebnisse zu den unsrigen dar. Dies konnte zum Beispiel für das
127
Zervixkarzinom
83,113
, das Ovarialkarzinom
84,114
, das (Lymphknoten-negative-)
Mammakarzinom 115,139 und für das HBV assoziierte HCC 32 gezeigt werden.
Jedoch kein signifikanter Zusammenhang (p= 0,08) zwischen ID1-Expression und
dem OAS konnte in einer Studie zu dem Pankreaskarzinom gefunden werden. Es
konnte allerdings eine Korrelation der Expression und der Angiogenese innerhalb
des Tumors nachgewiesen werden. Dabei weisen die Autoren darauf hin, dass
Aussagen zum OAS beim Pankreaskarzinom auf Grund des schnellen Progresses
und der allgemein sehr schlechten Prognose nicht so einfach zu treffen sind und sich
vor allem das Tumorstadium entscheidend auf die Prognose auswirkt. Auch die oft
erst sehr spät erfolgende Erstdiagnose schränken Aussagen bei diesem Tumor zu
dem OAS ein 66.
In einer Studie zum hepatozellulären Karzinom konnte ein längeres krankheitsfreies
Überleben nach kurativer Operation mit einer höheren ID1-Expression korreliert
werden. Diese Ergebnisse von Damdinsuren et al. zu der ID1-Expression im HCC
und dem OAS passen somit sehr gut zu den Resultaten unserer Untersuchung. Des
Weiteren konnte ein Zusammenhang zwischen verminderter ID1-Expression und
dem Auftreten von portaler Venenthrombose, Tumorgröße und intrahepatischer
Metastasen und auch abnehmendem Differenzierungsgrad des Tumors gefunden
werden
26
. Alle zuletzt genannten klinisch-pathologischen Parameter können das
bessere Überleben der Patienten mit hoher ID1-Expression begründen. Der
molekulare Mechanismus, über welchen das ID1-Protein letztlich zu diesen Effekten
führt, ist noch unklar.
Bisher konnten in vielen Studien verschiedene biochemische Mechanismen
nachgewiesen werden über die ID1 einen proliferativen Status begünstigt oder direkt
onkogene Effekte bewirken kann (siehe Einleitung).
ID1 könnte im HCC eventuell über TGF-ß1, welches in schlecht differenzierten HCCTumoren verstärkt nachgewiesen wurde, unterdrückt werden, was eine Erklärung
dafür darstellt, dass eine ID1-Expression in gut differenzierten Tumoren verstärkt
nachzuweisen ist und somit mit einem längerem OAS korreliert
25,71
. Eine weitere
Erklärung könnte über die Blutversorgung und damit verbundene Exposition des
Tumors gegenüber Zytokinen, die eine ID1-Expression verstärken können, gehen.
Frühe HCC werden vor allem venös mit Blut versorgt, welches viel Zytokine, wie zum
128
Beispiel Tumornekrosefaktor-α, enthält. TNF-α kann nachweislich die ID1-Expression
steigern
128
. Dagegen ist die Blutversorgung in fortgeschrittenen HCC-Tumoren
verstärkt arteriell und somit weniger mit Zytokinen angereichert.
Auch die subzelluläre Lokalisation des ID1-Proteins könnte eine Erklärung für unsere
Ergebnisse sein. Im Gallengangskarzinom (CCC) konnte eine nukleäre ID1Expression mit einem schlechteren OAS korreliert werden
89
. Gleiches wurde im
Plattenepithelkarzinom des Ösophagus gefunden werden. Auch hier korrelierte eine
hohe nukleäre ID1-Expression mit einem schlechteren OAS
142
. ID1 könnte in diesen
Tumoren und auch dem HCC vor allem bei einer nukleären Lokalisation eine
onkogene
Wirkung
haben
und
somit
das
bessere
Überleben
bei
einer
Translokalisation von ID1 aus dem Zellkern in das Zytoplasma der HCC Zellen
erklären (siehe hierzu auch 5.2 und 5.2.1).
ID1 könnte ebenso primär in der frühen Onkogenese eine Rolle spielen und in
fortgeschrittenen, somit maligneren, Tumoren bereits wieder vermindert exprimiert
werden. So konnte eine Studie darstellen, dass ID1 in Gewebe
von gesunden
Lebern weniger als in entzündetem Gewebe und noch stärker in zirrhotisch
verändertem Lebergewebe exprimiert wird. Ebenso konnte gezeigt werden, dass bei
Patienten mit zirrhotisch veränderter Leber mit hoher ID1-Expression das Risiko.
später ein HCC zu entwickeln, höher ist
82
. Auch wurde indirekt über gemeinsame
IHC-Färbungen für ID1 und PCNA (proliferating cell nuclear antigen) ein signifikanter
Zusammenhang
der
ID1-Expression
und
dem
proliferativen
Verhalten
der
Tumorzellen gefunden. Des Weiteren konnte eine Inaktivierung des p16-INK4a/RBSignalwegs signifikant mit der ID1-Expression in frühen HCC Tumorzellen korreliert
werden
68
. Zusätzlich könnte das ID1-Protein einen Einfluss auf die Metastasierung
und Angiogenese des HCC ausüben 67.
Eine Studie, welche an Resektaten durchgeführt wurde, die von HBV assoziierten
HCC stammen, konnte eine hohe ID1-Expression mit einem schlechteren Überleben
in Zusammenhang gebracht werden. Hierbei wurde eine Verbindung des ID1Proteins und dem HBx-Protein nachgewiesen. HBx bindet nicht selbst direkt an die
DNA, kann aber über eine Reihe von Signalwegen in der Zelle Einfluss nehmen und
es wurde auch okogene Signalwege nachgewiesen, an denen HBx beteiligt ist 32.
129
5.4.1.2 ID2 und Gesamtüberleben
Ein positiver, aber nicht signifikanter Zusammenhang der zytoplasmatischen ID2Expression und dem OAS konnte für alle vier Kategorien der ID2-Expression (p =
0,098) gefunden werden. Eine signifikante Korrelation konnte für die homogen
zusammengefassten Gruppen “low” and “high” (p = 0,018) gefunden werden. Eine
starke Färbung für ID2 im Zytoplasma der HCC-Zellen geht somit signifikant mit
einem besseren Überleben der Patienten einher. Für die nukleäre Färbung von ID2
konnten dagegen nur nicht signifikante Resultate erzielt werden, wobei eine Tendenz
zu erkennen ist, dass eine hohe nukleäre ID2-Expression mit einem schlechteren
OAS zusammenhängen könnte (p = 0,244).
Somit sprechen unsere Ergebnisse dafür, dass eine erhöhte ID2-Expression vor
allem im Zytoplasma mit weniger malignen Tumoren und einer besseren Prognose
des Überlebens der Patienten vergesellschaftet ist. Dieser Zusammenhang konnte
bereits in mehreren Studien an anderen Neoplasien gefunden werden.
In dem Plattenepithelkarzinom des Ösophagus konnte eine stärkere ID2-Expression
im Zytoplasma und den Zellkernen als unabhängiger positiver Prognosefaktor,
welcher für längeres OAS der Patienten steht, entdeckt werden 142.
Eine hohe zytoplasmatische ID2-Expression geht mit weniger aggressiven Tumor
und einer besseren Prognose bei Patienten mit Mammakarzinom einher. Ein
Zusammenhang der nukleären Expression und dem OAS konnte auch hier nicht
gefunden werden 121.
ID2 konnte als wichtiger Faktor für den Erhalt eines nicht invasiven und wenig
proliferativen Zustandes von sowohl nicht malignem Gewebe, als auch Tumorzellen
der Mamma identifiziert werden. Somit ist ID2 hier wichtig für die Differenzierung und
den Erhalt eines differenzierten, nicht malignen Zustandes. Gesteuert werden könnte
dieser Effekt über die Interaktion mit so genannten Ets-Proteinen, welche keine HLH
Proteine sind und auch als Transkriptionsfaktoren fungieren. Somit könnte ID2 im
Gewebe der Brust als positiver Prognosefaktor gesehen werden 48.
130
Ebenfalls hängt eine erhöhte ID2-Expression im Zytoplasma signifikant mit einem
besseren Überleben von Patienten mit einem SCLC zusammen. IHC Färbungen an
Biopsien des SCLC zeigten, dass eine zytoplasmatische Färbung der Tumorzellen
mit einem verlängerten Überleben der Patienten einher ging 51.
Und in durch HCV verursachten HCC-Tumoren konnte eine geringere ID2Expression mit verstärkter Pfortaderinvasion (PVI) und Metastasierung und somit
kürzerem DFS korreliert werden. Im Umkehrschluss kann also auch von einem
positiven Zusammenhang der ID2-Expression und dem DFS ausgegangen werden
126,127
.
Der gleiche Zusammenhang, welcher in unserer Studie nachgewiesen werden
konnte, wurde bereits von Damdinsuren et al. an Resektaten des HCC gezeigt. Es
konnte für das ID2-Protein jedoch nur ein Trend für ein besseres OAS bei starker
zytoplasmatischer Expression gezeigt werden
26
. Grund für das nicht signifikante
Ergebnis könnte einerseits die Selektion des Patientenkollektivs von ausschließlich
Patienten, welche resiziert wurden, und andererseits die kleine Anzahl von nur 44
untersuchten Patientenpräparaten sein.
Eine weitere Erklärung auf welche Weise eine zytoplasmatische ID2-Expression zu
einem besseren OAS führen könnte, liefert eine Studie an Oligodendrozyten. Es
konnte nachgewiesen werden, dass in proliferierenden Oligodendrozyten eine starke
ID2-Expression ausschließlich im Zellkern nachgewiesen wurde. Dagegen konnte
eine Translokalisation des ID2-Proteins aus dem Zellkern in das Zytoplasma kurz vor
der Differenzierung gezeigt werden. Eine ektope Überexpression von ID2 inhibierte
effektiv die Differenzierung der Oligodendrozyten. Es wird von den Autoren daher
angenommen, dass ID2 nur im Zellkern seine die Differenzierung hemmenden
Effekte bewirken kann 134.
In Zellen des Neuroblastoms konnte ID2 nur nukleär nachgewiesen werden und als
stark prädiktiver Faktor für eine schlechte Prognose identifiziert werden
64
. Es könnte
sein, dass ID2 seine proliferative und onkogene Wirkung über die direkte Hemmung
des Rb-Proteins
46,62
ausübt. Diese direkte Inhibierung kann sich nur im Zellkern
abspielen und wäre bei einer Translokalisation von ID2 aus dem Zellkern in das
Zytoplasma folglich gehemmt. Dieser Shift von ID2 aus dem Zellkern ins Zytoplasma
könnte somit das bessere OAS der Patienten erklärt
51
. Passend zu dieser Theorie
131
sind die Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe zur nukleären ID2-Expression bei
chemotherapierten Patienten mit CCC und dem OAS. Es zeigt sich bei starker
nukleärer Expression ein signifikanter Zusammenhang mit einem schlechteren OAS
dieser Patienten 89.
Ein weiterer Grund, warum eine schwächere ID2-Expression in malignen Tumoren
als in gut differenzierten Tumoren gefunden werden kann, wurde am Kolonkarzinom
untersucht. Es zeigte sich, dass mutiertes p53, ein Onkogen, zu einer verminderten
Expression von ID2-Proteinen im Kolonkarzinom führen kann
138
. Mutiertes p53
wiederum spielt eine wichtige Rolle in der Entstehung des malignen Kolonkarzinoms
und es kann angenommen werden, dass es seine sogenannte „gain of function“
unter anderem über die Suppression von ID2 erwirbt.
Und es konnten dem ID2-Protein in intestinalen Epithelzellen tumorsuppressive
Eigenschaften nachgewiesen werden
109
. Auch könnte ID2 nicht über Hemmung der
bHLH-Proteine, sondern einem neuen, noch nicht gut erforschten Weg, Apoptose
induzieren. Die Möglichkeit den Zelltod herbeizuführen trägt das ID2-Protein auf
seiner N-Terminal Region und ist assoziiert mit der verstärkten Expression des BAXGens 39.
Es muss abschließend dennoch darauf hingewiesen werden, dass dem ID2-Protein
auch Funktionen in der Onkogenese und Tumorprogression nachgewiesen wurde.
So wurde eine nur schwache ID2-Expression im gesunden Prostatagewebe und
dafür eine sehr starke in den am schlechtesten differenzierten Drüsenzellen des
Prostatakarzinoms gefunden. Außerdem konnte nachgewiesen werden, dass eine
Überexprimierung von ID2 in Prostatatumorzelllinien zu einem invasiveren und
proliferativerem
Zelltyp
führt und mit einer vermehrten
Ausschüttung von
Metalloproteasen einher geht. Somit könnte ID2 in diesem Fall als molekularer
Marker für aggressivere Prostatatumore dienen 20.
132
5.4.1.3 ID3 und Gesamtüberleben
Bei der Betrachtung der ID3-Expression
und
dem OAS konnte für die
zytoplasmatische Expression des ID3-Proteins sowohl für alle vier Färbe-Scores als
auch für die zusammengefassten Gruppen „high“ und „low“ eine signifikante
Korrelation gefunden werden (p = 0,005 für beide Berechnungen), wobei eine starke
zytoplasmatische ID3-Expression mit einem besseren Überleben einhergeht. Für die
nukleäre Expression von ID3 bei zusammengefassten Gruppen konnte ein nicht
signifikanter Zusammenhang zwischen einer stärkeren Färbung der Zellkerne und
kürzerem Überleben gefunden werden (p = 0,076). Diese Ergebnisse decken sich mit
den bisherigen Ergebnissen für ID1 und ID2.
Insgesamt konnten nur wenige Arbeiten zur ID3-Expression und dem OAS gefunden
werden. Eine Studie zum HCC kann lediglich eine nicht signifikante Tendenz für ID3
als positiven Prognosefaktor feststellen. Wie bereits bei ID2 handelt es sich hier um
eine Arbeit, die ausschließlich kurativ resezierte HCC beinhaltet und eine relativ
kleine Fallzahl (44 Patienten) untersuchte
26
. Ähnliche Ergebnisse konnten für das
Zervixkarzinom gefunden werden. Auch hier konnte nur eine Tendenz erkannt
werden, indem die Gruppe mit hoher ID3-Expression mit der Gruppe mit niedriger
ID3-Expression bezüglich des OAS verglichen wurden. Es zeigte sich auch hier ein
Trend, dass keine oder eine nur schwache ID3-Expression mit einem schlechteren
Überleben einhergeht
113
. Ebenso für das ovariale Adenokarzinom konnte der Trend
einer besseren Prognose bei stärkerer ID3-Expression nachgewiesen werden 4.
Im Prostatakarzinom konnte eine signifikant verminderte zytoplasmatische ID3Expression verglichen mit dem Gewebe der benignen nodulären Hyperplasie
gefunden werden. Eine inverse Beziehung von ID3 und der neoplastischen
Transformation des Prostatagewebes (p = 0,002), sowie der Tumorprogression (p =
0,022) wurden berechnet. Zusätzlich konnte nachgewiesen werden, dass auch der
Gleason Score negativ mit der ID3-Expression zusammenhängt, wobei hier keine
signifikanten Resultate vorlagen (p = 0,169) 143. Diese Ergebnisse passen gut zu den
hier vorgelegten und zeigen, dass eine starke zytoplasmatische ID3-Expression auch
in anderen Neoplasien mit einem weniger malignen Tumor und besserer Prognose
einhergehen kann.
133
Eine Erklärung für diese Resultate könnte zum einen die Beziehung von ID3 zu
Kaskaden, welche den Zelltod beeinflussen, sein. Es konnte anhand von
Keratinozyten gezeigt werden, dass ID3 bei der UVB induzierten Apoptose von
immortalisierten Zellen beteiligt sein könnten
Sarkomazellen spielt ID3 eine Rolle
Fibroblasten bei Ratten den Zelltod
120
. Auch bei der Apoptose von
58
. Eine ektope ID3-Expression induziert in
94
. In B-Lymphozyten könnte ID3 am TGF-β-
Signalweg beteiligt sein und dadurch Einfluss auf Zellwachstum und Apoptose
nehmen
53
. Somit könnte man erklären, dass eine verminderte oder fehlende ID3-
Expression zumindest teilweise eine Schwächung der Zelltod-Kaskade bewirken und
damit eine neoplastische Transformation begünstigen könnte.
Eine weitere Möglichkeit, wodurch ID3 bei einer starken zytoplasmatischen
Expression das OAS positiv beeinflusst, könnte seine intrazelluläre Lokalisation
betreffen. Wie bereits für ID1 und ID2 erläutert, könnte es auch für ID3 von äußerst
wichtiger Bedeutung sein, in welchem Zellkompartiment es sich befindet und welche
Auswirkung auf den Zellzyklus es dadurch hat. So könnte auch hier eine
Translokalisation des ID3-Proteins aus dem Zellkern in das Zytoplasma seinen
Einfluss
auf
Proliferation
und
maligne
Transformation
stoppen.
Zusammenhang konnte bei Untersuchung des Neuroblastoms gezeigt werden
Dieser
45
und
auch in der hier vorliegenden Studie konnte ein, wenn auch nicht signifikanter,
Zusammenhang
zwischen
der
nukleären
ID3-Expression
und
dem
OAS
nachgewiesen werden.
Des Weiteren konnte keine Korrelation zwischen der ID3-Expression und dem OAS
beim SCLC gefunden werden
51
. Ein negativer Zusammenhang der ID3-Expression
mit dem OAS wurde für das Magenkarzinom gefunden. Hier kann ID3 als
unabhängiger Prognosefaktor für eine schlechte Prognose angesehen werden
140
.
Auch passen die Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe zum verwandten CCC nicht zu
den hier veröffentlichten Ergebnissen am HCC. Es zeigte sich, dass beim CCC bei
chemotherapierten Patienten eine stärkere zytoplasmatische ID3-Expression mit
einem kürzeren Überleben einhergeht
89
. Insgesamt sind die molekularen Prozesse,
welche ID3 in der Zelle bewirken kann, noch wenig erforscht und weitere
Untersuchungen hierzu sind nötig.
134
5.4.1.4 ID4 und Gesamtüberleben
Die Berechnungen der Korrelation der ID4-Expression und dem OAS erbrachten für
die nukleäre Expression von ID4 sehr signifikante Ergebnisse. Sowohl bei der
Betrachtung
aller
vier
Färbeintensitäten
(p
=
0,002)
als
auch
bei
den
zusammengefassten Fällen (p = 0,001) zeigt sich, dass eine starke nukleäre
Expression von ID4 mit einem signifikant schlechteren Überleben zusammenhängt.
In vielen Studien konnte gezeigt werden, dass ID4 mit der Tumorentstehung, dem
Tumorprogress
und
einem
schlechteren
Überleben
zusammen
hängt.
Im
Prostatakarzinom wurde ein Zusammenhang der nukleären ID4-Expression und
einem gesteigerten Risiko der Entwicklung von Metastasen gefunden
143
. Bei
Brusttumorzellen ist ID4 ein Ziel des p53 Proteins und hängt von dessen
Transkriptionsaktivität ab. So wurde gezeigt, dass der Proteinkomplex aus mutiertem
p53 und E2F1 sich an spezifischen Regionen des ID4 Promoters anheftet und positiv
dessen Expression kontrolliert. Das ID4-Protein bindet an und stabilisiert mRNAs, die
proangiogenetische Faktoren (IL8 and GRO-alpha) kodieren und gehört somit zu
einer transkriptionalen Achse, die zu Angiogenese führen kann
42
. Auch kann ID4,
wenn es in NIH 3T3 Fibroblasten und Brusttumorzellen überexprimiert wird, über
eine Transformation der Zellen ermöglichen, dass diese Zellen daraufhin in
Weichagar wachsen können
7,64
. Eine positive Regulation des Zellwachstums und
eine negative Steuerung der Zelldifferenzierung konnte dem ID-Protein in
verschiedenen Geweben nachgewiesen werden, unter anderem im Epithel der
Brustdrüse
7
. In Mammakarzinomen könnte ID4 als negativer Prognosefaktor
angesehen werden, da es invers zu BRCA1, einem Tumorsuppressorgen, exprimiert
wird 108. Des Weiteren fungiert ID4 in einigen Leukämien, wie zum Beispiel der B-Zell
ALL und einigen T-Zell Leukämien als Onkogen 8.
Jedoch gibt es auch einige Studien, welche sich nicht mit der unsrigen decken. So
konnte
ID4
als
ein
positiver
prognostischer
Tumormarker
in
mehreren
unterschiedlichen Neoplasien gefunden werden. Eine starke ID4-Expression konnte
mit einer besseren Prognose beim Mammakarzinom korreliert werden
139
. Auch für
das CCC konnte eine positive Korrelation einer zytoplasmatischen ID4-Expression
mit einem besseren Überleben gezeigt werden (p = 0,001) 89. Gleiches wurde für das
135
OAS beim Kolonkarzinom
92
131
, beziehungsweise dem DSF bei Karzinomen der Brust
nachgewiesen. ID4 könnte als Tumorsuppressor bei der Entstehung von Tumoren
des Brustgewebes eine Rolle spielen 12.
Keine Korrelation zwischen der Expression und dem OAS konnte bei dem SCLC für
die ID4-Expression nachgewiesen werden 51.
Neben den bereits angeführten molekularen Mechanismen könnte es für das ID4Protein auch hier wieder entscheidend sein, in welchem Zellkompartiment es sich
befindet und welche Funktion ihm dadurch innerhalb der Zelle zukommt. So zeigen
Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe, dass im HCC eine nukleäre Expression negativ
mit dem Überleben zusammenhängt, wohingegen eine zytoplasmatische Expression
positiv mit dem Überleben bei Patienten mit einem CCC korreliert. Unterstützt wird
diese Überlegung durch Ergebnisse an Spermatozyten. Das Färbemuster von ID4
war in Zellen des Seminoms ausschließlich nukleär. Dagegen konnte in normalen ASpermatogonienzellen nur schwache Färbungen für ID4 gefunden werden und diese
waren auf das Zytoplasma beschränkt 112.
Unklarheit besteht hier über die Gegebenheit, dass in den gesunden Kontrollen eine
stärkere nukleäre Färbung als in den HCC-Fällen nachgewiesen wurde, obwohl
nukleär exprimiertes ID4-Protein als negativer Prognosefaktor für schlechtes
Überleben zu fungieren scheint. Zukünftig muss bei weiteren Forschungsarbeiten zu
der ID4-Expression noch mehr auf die intrazelluläre Lokalisation geachtet und bei
den Auswertungen mitberücksichtigt werden.
5.4.2 Korrelationen mit weiteren klinischen Variablen
Nachdem der Expressionsstatus der ID-Proteine im gesunden Gewebe der Leber
und dem HCC untersucht wurde und äußerst interessante Ergebnisse bei der
Korrelation des OAS, der wichtigste und stärkste klinische Parameter dieser Studie,
mit der ID-Expression erzielt werden konnten, wurden weitere Zusammenhänge mit
anderen klinisch-pathologischen Parametern gesucht.
136
5.4.2.1 ID-Expression und Differenzierungsgrad
Für die nukleäre ID4-Expression und den Differenzierungsgrad des Tumors konnte
ein signifikanter (Fisher´s-Exact-Test: p = 0,036) positiver Zusammenhang gezeigt
werden.
In mehreren Studien konnte ein signifikanter Zusammenhang zwischen dem
Differenzierungsgrad und der ID-Expression nachgewiesen werden. Dies überrascht
nicht, wenn man sich die bereits vielfach nachgewiesenen und namensgebenden
Effekte der ID-Proteine bezüglich der Differenzierung der Zelle vor Augen führt. Für
das HCC
26,68
, das Plattenepithelkarzinom des Kopfes und Halses
Ovarialkarzinom
114
, das Prostatakarzinom
kolorektale Karzinom
87,131
20,98,143
, das Mammakarzinom
und das Endometrium-CA
122
61
, das
48,74
, das
war es möglich, diesen
Zusammenhang zwischen Differenzierungsgrad des Tumors und der ID-Expression
zu zeigen.
Bedenkt man die gute Korrelation einer hohen ID4-Expression und dem OAS, so
könnte man unterstellen, dass das ID4-Protein bei nukleärer Expression unter
anderem zu einer Dedifferenzierung der Zelle führt und einen weniger gut
differenzierten und dadurch vielleicht auch maligneren Zelltyp begünstigen könnte.
So konnte für das HCC bereits in einer Studie nachgewiesen werden, dass ID1 mit
dem „proliferating cell nuclear antigen“ (PCNA), einem Indikator für Zellproliferation,
positiv Korreliert (p = 0,033) und ebenso mit einer verminderten p16/INK4aExpression zusammenhängt
68
. Beide Ergebnisse sprechen für einen Einfluss des
ID-Proteins auf die Differenzierung und das maligne Wachstumverhalten des
Tumors.
137
5.4.2.2 ID-Expression und intrahepatische Metastasen
Eine verringerte zytoplasmatische ID3-Expression konnte mit einem schlechteren
OAS korreliert werden. Ebenso konnte ein signifikanter (Fisher´s-Exact-Test: p <
0,05)
Zusammenhang
der
zytoplasmatischen
ID3-Expression
und
dem
multilokulärem Auftreten des HCC nachgewiesen werden.
Der
Nachweis
eines
multilokulären
HCC,
beziehungsweise
intrahepatischer
Metastasen, geht signifikant mit einem schlechteren Überleben der Patienten einher.
Einerseits
schränkt
ein
multilokuläres
Auftreten
des
HCC
die
kurativen
Therapieoptionen der Leberteilresektion und Lebertransplantation deutlich ein,
andererseits sind nicht kurative Therapien weniger wirkungsvoll, wenn bereits ein
multilokuläres Auftreten vorliegt. Die Prognose der Patienten nimmt mit dem
Wachstum und der Ausbreitung des Tumors in der Leber deutlich ab 6,52,75,104.
Für die ID-Proteine gibt es eine Fülle an Studien, welche ihnen einen Einfluss auf
das maligne Wachstumverhalten, Proliferation und Angiogenese nachweisen. So
beeinflussen sie die Invasivität von Brusttumorzellen
Fähigkeit in die extrazelluläre Matrix einzudringen
31
, und verleihen ihnen die
41
. Ebenso wird die Angiogenese
und Vaskularisation induziert, welche grundlegend zur Metastasierung beitragen
76
.
Die Zellmigration und Invasion der Tumorzellen in fremdes Gewebe wird durch IDProteine gefördert
19,91
. Das schlechtere Überleben der Patienten mit geringerer
zytoplasmatischer ID3-Expression könnte somit mit dem verstärkt multilokulären
Auftreten
des
HCC
bei
verringerter
ID3-Expression
im
Zytoplasma
zusammenhängen.
Für das ID2-Protein konnte Tsunedomi et al. zeigen, dass geringere mRNA-Spiegel
mit einem gesteigerten Potential zur Metastasierung einhergehen. So konnte eine
inverse Korrelation der ID2-mRNA mit der portalen Veneninvasion des Tumors, der
Tumorgröße und intrahepatischen Rekurrenz
nachgewiesen werden
126
. Dieses
Ergebnis konnte in unserer Studie nicht bestätigt werden, jedoch muss man sich die
jeweils angewandte Methodik vor Augen führen. Unsere Untersuchung betrachtet
nicht das absolute Vorkommen von ID2 auf mRNA-Ebene, sondern untersucht auf
Protein-Ebene getrennt die zytoplasmatische und nukleäre Expression von ID2.
Dadurch könnte der Unterschied der gefundenen Ergebnisse erklärt werden.
138
5.4.2.3 ID-Expression und MELD-Score
Bei der Untersuchung, ob einzelne klinisch-pathologische Parameter mit der IDExpression
zusammenhängen,
konnten
interessante
Ergebnisse
über
den
Zusammenhang des MELD-Score und der ID1-, 2-, 3- und 4-Expression gefunden
werden. Für die nukleäre Expression von ID2, ID3 und ID4 zeigt sich ein signifikantes
gemeinsames Auftreten von hoher nukleärer ID-Expression und einem erhöhten
MELD-Score (Mann-Whitney-U-Test: p = 0,037, p = 0,015, p = 0,014 respektive).
Der MELD-Score wurde jeweils, soweit die Daten vorlagen, zum Zeitpunkt der
Erstdiagnose errechnet. Der MELD-Score basiert auf drei Laborparametern, die von
Wissenschaftlern der Mayo-Klinik in den USA als die zuverlässigsten Prädiktoren des
Verlaufs einer schweren, transplantationspflichtigen Lebererkrankung und damit der
relativen Schwere der Krankheit und der erwarteten verbleibenden Lebensdauer
herausgefiltert wurden: Bilirubin, Kreatinin und Blutgerinnungszeit. Der Score liegt
zwischen 6 und 40 Punkten, je höher der Wert, desto höher ist die
Wahrscheinlichkeit binnen drei Monaten ohne Transplantation zu sterben. Er ist ein
zuverlässiges Messinstrument bezüglich des Mortalitätsrisikos und eignet sich als
Index für die Schwere der Erkrankung bei Patienten mit einer Lebererkrankung im
fortgeschrittenen Stadium
52
. Es existieren Anpassungen für Patienten mit Tumoren.
So konnte gezeigt werden, dass ein MELD-Score größer als „10“ einen
unabhängigen Prognosefaktor für das HCC darstellt 80.
In unsere Studie konnte bezüglich des Patientenkollektivs ein sehr signifikanter
Zusammenhang des MELD-Scores und dem OAS festgestellt werden. Hierzu wurde
das Patientenkollektiv mittels des berechneten Medians für den MELD-Score (8,5) in
zwei Gruppen eingeteilt. Die Gruppe mit MELD-Score-Werten größer 8,5 zeigte wie
zu erwarten ein schlechteres Gesamtüberleben verglichen mit der Gruppe mit einem
MELD-Score kleiner 8,5 auf (p = 0,006). Deshalb sollte es auch nicht überraschen,
dass ein Zusammenhang einer erhöhten nukleären, beziehungsweise verminderten
zytoplasmatischen ID-Expression mit einem erhöhten MELD-Score einhergeht.
139
5.4.2.4 ID-Expression und Therapieansprechen
Bei der Analyse des OAS und dem Therapieansprechen wurde lediglich auf 81
Patienten zurückgegriffen, bei welchen aufgrund einer Feinnadelbiopsie der
histologische
Nachweis
eines
HCC
erfolgte
und
die
daraufhin
mit
einer
minimalinvasiven Therapie, wie zum Beispiel der Radiofrequenz-Thermoablation
(RFTA) oder der Transarteriellen Chemoembolisation (TACE), behandelt wurde. Für
diese Patienten wurde nach einem Zeitraum von ein bis zwei Monate nach Therapie
die Kontrastmittelaufnahme im Angio-CT oder Angio-MRT mit den Aufnahmen vor,
beziehungsweise während der Therapie verglichen. Für die nukleäre Färbung des
ID4-Proteins konnte ein signifikanter Zusammenhang (Fisher´s-Exact-Test: p =
0,042) mit dem Therapieansprechen gefunden werden. Patienten mit einer hohen
nukleären ID4-Expression fanden sich signifikant häufiger in der Gruppe mit einem
schlechteren Ansprechen auf eine minimalinvasive Therapie. Somit könnte sich die
ID4-Expression auf das Ansprechen der Tumorzellen auf eine Therapie auswirken.
Ein Zusammenhang der ID-Expression und dem Therapieansprechen nach
Chemotherapie wurde bereits an dem HCC verwandten cholangiozellulären
Karzinom untersucht und es konnten hierbei keine signifikanten Ergebnisse
gefunden werden 89.
5.4.2.5 ID-Expression und weitere klinisch-pathologische Parameter
Es konnte kein signifikanter Zusammenhang zwischen der ID-Proteinexpression und
dem Child-Pugh-Score, dem Erkrankungsalter, des AFP-Werts und der Ätiologie der
zugrundeliegenden Leberzirrhose gefunden werden.
140
5.5 Die subzelluläre Lokalisation der ID-Proteine als molekularer Marker und
Prognosefaktoren im HCC
Die Expression der ID-Proteine im HCC ist im Vergleich zum gesunden Gewebe
verändert. Diese Veränderung könnte, wie bereits an vielen anderen Neoplasien
nachgewiesen, mit der Tumorentstehung oder Tumorprogression des HCC in
direktem Zusammenhang stehen. Des Weiteren konnte in unserer Studie starke
Indizien gefunden werden, die dafür sprechen, dass die ID-Proteine über ihre
subzelluläre Lokalisation auf unterschiedliche Weise in den Zellzyklus oder Prozesse
innerhalb der Zelle, welche die Tumorentstehung begünstigen, Einfluss nehmen. Bei
dem HCC scheint eine starke nukleäre ID-Expression kanzerogenen Einfluss auf die
Zelle auszuüben, wohingegen eine zytoplasmatische ID-Expression eher mit einem
besseren Gesamtüberleben einhergeht. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass
die subzelluläre Lokalisation der ID-Proteine als Prognosefaktoren für das HCC
dienen kann. Es wurden signifikant längere Überlebenszeiten für eine starke
zytoplasmatische Expression von ID1, ID2 und ID3 gefunden. Für die nukleäre
Expression von ID4 wurde gezeigt, dass eine starke Expression in den Zellkernen
hoch signifikant mit einem schlechteren Überleben einhergeht. Hierbei überzeugen
vor allem die Ergebnisse für ID3 und ID4 (Zusätzlich konnte für das ID4-Protein eine
prädiktive Aussagekraft bezüglich der minimalinvasiven Therapie nachgewiesen
werden; siehe Kapitel 5.4.2.4). Betrachtet man die Ergebnisse in dieser Arbeit, so
können die ID-Proteine sowohl als molekularer Marker als auch als Prognosefaktor
für das HCC zukünftig dienen.
5.6 Ausblick
Die Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe zur ID-Expression im HCC erfolgten
ausschließlich mit Hilfe der Immunohistochemie (IHC). Untersuchungen anhand von
Western-Blot-Analysen
und
PCR-Analysen
zur
weiteren
Evaluation
unserer
Ergebnisse könnten diese untermauern und validieren. Somit könnte man bestätigen,
dass
das
Färbeergebnis
der
IHC
ein
realistisches
Bild
der
absoluten
141
Proteinproduktion auf mRNA- und Proteinebene der ID-Proteine in den Zellen
widerspiegelt.
Ebenso wäre es interessant anhand ausreichender Gewebeproben von Patienten mit
einer Hepatitis oder Leberzirrhose die Dynamik der ID-Expression in der
Karzinogenese des HCC zu verfolgen. In unserer Studie konnten bereits interessante
Ansätze hierzu entdeckt werden (siehe hierzu Kapitel 4.4 und Matsuda 2005
82
),
weitere Untersuchungen hierzu wären sicherlich äußerst interessant.
Über die molekulare Funktion und Wirkweise der ID-Proteine in der Entstehung und
Progression des HCC ist bisher nur wenig bekannt. Mit Hilfe von Experimenten an
HCC-Zelllinien könnte durch eine ID-Induktion und Knockout-Experimenten hierzu
neue Entdeckungen gemacht werden.
Des Weiteren bleibt festzuhalten, dass bisher viele Studien veröffentlicht wurden, die
lediglich über PCR- und Western-Plot-Analysen eine quantitative Betrachtung der IDExpression im neoplastischen Gewebe untersucht haben. Aufgrund der hier
gestellten Vermutung, dass die intrazelluläre Lokalisation der ID-Proteine von
enormer Bedeutung bezüglich der Wirkung der ID-Proteine auf den Zellzyklus und
die Entstehung von Tumoren sein könnte, wäre es äußerst interessant in zukünftigen
Studien ein größeres Augenmerk auf die intrazelluläre Lokalisation der ID-Proteine in
den zellulären Subkompartimenten (Zellkern versus Zytoplasma) zu werfen und dies
in die Ergebnisauswertung mit einfließen zu lassen. Dadurch könnte zukünftig der
Mechanismus, über den die ID-Proteine in den Zellzyklus eingreifen, vielleicht noch
besser verstanden werden.
Zuletzt bleibt anzumerken, dass die ID-Proteine zukünftig auch zur Therapie
verschiedener Tumore herangezogen werden könnten. Bereits an vielen Tumoren
konnte, wie auch in der vorliegenden Arbeit, eine Korrelation der ID-Proteine mit dem
Gesamtüberleben (OAS) gefunden werden. Arbeiten an anderen Neoplasien liefern
vielversprechende Ergebnisse, die den ID-Proteinen zukünftig eine therapeutische
Funktion zukommen lassen könnten. Inhibierung von ID1 kann zum Beispiel Zellen
des Prostatakarzinoms sensibler gegenüber Chemotherapie machen und an ID1und ID3-knockout-Mäusen konnte gezeigt werden, dass die Neovaskularisierung von
Tumor-Xenograft des Prostatakarzinoms gemindert ist
40
. Eine verminderte
Expression von ID1 hemmt das Wachstum und die Metastasierung von
142
Brusttumorzellen in Mäusen
41,85
. Ebenso konnte an Tumorzellen des Ovars gezeigt
werden, dass eine Blockierung von ID1 und ID3 über ein spezifisches Aptamer einen
Stopp
des
Zellzyklus
und
eine
Apoptose
herbeiführen
kann
86
.
Beim
Prostatakarzinom konnte gezeigt werden, dass ID1 an der Aktivierung des NFkappaB-Signalweges beteiligt ist und die Zellen vor Apoptose schützt. Somit könnten
Zellen des Prostatakarzinoms nach Inhibition von ID1 besser auf Chemotherapie
ansprechen 73,137.
Somit wäre es durchaus denkbar, dass eine Blockierung der Genexpression der IDProteine, oder eine Unterbindung des Transports, beziehungsweise der Diffusion der
ID-Proteine in den Zellkern vielversprechende therapeutische Optionen für das HCC
darstellen können. In zukünftigen Studien sollte somit geprüft werden, ob eine
Blockierung der Genexpression oder bereits eine verminderte Translokalisation der
ID-Proteine in den Zellkern als Therapieoption für das HCC dienen kann.
143
6 Zusammenfassung
Die ID-Proteine (inhibitor of DNA-binding/ differentiation), welche zur Gruppe der
basic Helix-Loop-Helix Proteine (bHLH) gehören, wurden in verschiedenen
Neoplasien, wie z. B. dem Kolon-, Pankreas- und Gallenwegskarzinom in
veränderter Expression im Vergleich zum gesunden Gewebe nachgewiesen.
Mehrere Untersuchungen deuten auf die funktionelle Bedeutung der ID-Proteine bei
der Tumorentstehung und -progression hin. In dieser Studie wurde die Expression
aller vier ID-Proteine im hepatozellulären Karzinom (HCC) und die Korrelation dieser
mit klinisch-pathologischen Parametern untersucht.
Sowohl die nukleäre als auch die zytoplasmatische Expression des ID1-, ID2-, ID3und ID4-Proteins wurden an 145 Tumorproben von Patienten mit HCC und 13
gesunden Kontrollen immunohistochemisch untersucht. Die Expression wurde mit
unterschiedlichen klinisch-pathologischen Parametern, wie dem Gesamtüberleben,
Alter, MELD-Score, intrahepatischer Metastasierung, AFP und histologischem
Grading korreliert.
Für alle vier ID-Proteine wurde im HCC im Vergleich zu den Kontrollen ein differentes
Expressionsmuster gefunden. Die zytoplasmatische Expression von ID1, ID2 und
ID3 korrelierte signifikant mit einem längeren Gesamtüberleben (p = 0,013; p =
0,018; bzw. p = 0,005). Dagegen konnte für die nukleäre Expression von ID4 eine
hoch signifikante inverse Korrelation mit dem Gesamtüberleben gezeigt werden (p =
0,001). Ebenfalls korrelierte die nukleäre ID2, ID3 und ID4 Expression mit einem
erhöhten MELD-Score. Die zytoplasmatische ID1-Expression wiederum wies einen
signifikanten inversen Zusammenhang mit der intrahepatischen Metastasierung auf.
Keine signifikanten Korrelationen der ID-Expression bestanden mit den übrigen oben
genannten klinischen Parametern.
Zusammenfassend konnte eine differente Expression aller vier ID-Proteine im HCC
im Vergleich zu Kontrollen nachgewiesen werden. Die ID-Proteine könnten, mit
besonderer Beobachtung der subzellulären Lokalisation, eine wahrscheinliche
Bedeutung bei der Hepatokarzinogenese haben. ID1, ID2, ID3 und ID4 wurden als
Prognoseparameter beim HCC identifiziert.
144
6 Abstract:
The subcellular expression of Id protein 1, 2, 3 and 4 in hepatocellular
carcinoma and their prognostic value
Introduction: Inhibitor of DNA-binding/ Differentiation family, a group of basic-helix-loop-helix (bHLH)
transcription factors, has been shown to be involved in carcinogenesis and cancer progression in
several human cancers such as colon, bile duct and pancreas carcinoma. In this study we examined
the expression of all four ID proteins in hepatocellular carcinoma (HCC) and their correlation with
clinical pathological parameters – focussing specifically on overall survival.
Methods: The nuclear and cytoplasmic expression of the ID1, ID2, ID3 and IDd4 protein was
examined separately by immunohistochemical (IHC) staining in human hepatocellular carcinoma (n =
145) and healthy liver samples (n = 13). Subsequently, we investigated the relationship of lD
expression with clinical pathological parameters, such as overall survival, age, intrahepatic metastasis,
histological grade, MELD-score and AFP.
Results: All four ID proteins were variously expressed in HCC and showed different expression
compared to healthy liver samples. Cytoplasmic ID1, ID2 and ID3 expression correlated positively with
overall survival (p = 0,013; p = 0,018; p = 0,005 respectively) however nuclear ID4 expression showed
a very high inverse correlation (p = 0,001). A significant relationship between the nuclear expression of
ID2, ID3 and ID4 or a cytoplasmic expression of ID1 and the MELD-score was found. The cytoplasmic
expression of ID3 but not the other three ID proteins, correlated negatively with intrahepatic
metastasis. No relationship between histological grade, age or AFP and ID expression was found. All
four ID proteins could be used as prognostic markers for hepatocellular carcinoma.
Conclusion: Taken together the subcellular expression of ID proteins could be of importance for their
function in carcinogenesis of hepatocellular carcinoma. The intracellular expression patterns had
different and crucial effects on overall survival. A shift out of the nucleus to the cytoplasm could play a
important role in the regulation of ID protein function. In addition our results suggest that the
subcellular expression of ID1, ID2, ID3 and IDd4 possibly can be used as prognostic markers in
hepatocellular carcinoma.
145
7 Abkürzungsverzeichnis
AK
Antikörper
AFP
Alpha-1-Fetoprotein
BCLC
Barcelona Staging and Treatment Schedule
Bcl-xL
B-cell lymphoma-extra large
bHLH
Basic Helix-Loop-Helix-Proteine
BP
Blocking Peptid
CCC
Gallengangskarzinom (cholangiozelluläre Karzinom)
CR
Erkrankung nicht mehr nachweisbar (complet remisson)
DFS
Krankheitsfreies Überleben (Disease-free survival)
DNA
Desoxyribonukleinsäure
ED
Erstdiagnose
EGFR
Epidermal-Growth-Factor-Receptor
GG
Gallengang
HBV
Hepatitis-B-Virus
HCC
Hepatozelluläres Karzinom
HCV
Hepatitis-C-Virus
HLH
Helix-Loop-Helix-Proteine
HSC
Hepatische Stern Zellen
ID
Inhibitor of Differentiation
IHC
Immunohistochemie
KO
Kontrollgewebe
LG
Lymphatisches Gewebe
146
LZ
Leukozyten
M-Ca
Mammakarzinom
MELD
Model for End-stage Liver Disease
MRT
Magnetresonanztomographie
NF-kB
Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells
OAS
Gesamtüberleben (Overall Survival)
p16
CDK-Inhibitor 2A (cyclin dependent kinase inhibitor 2A)
p53
tumor protein 53
PAS
Periodic acid-Schiff
PCNA
Proliferating cell nuclear antigen
PCR
Polymerase chain reaction
PD
Fortschreitende Erkrankung (Progressive Disease)
PEI
Perkutane Ethanol-Injektion
PR
Teilweiser Rückgang der Erkrankung (partial Remission)
PST
Preformance statement test
PVT
Portale Venenthrombose
PVI
Portalveneninvasion
RF(T)A
Transkutane Radiofrequenz(termo)ablation
RT-PCR
Reverse transcription polymerase chain reaction
SC
Sternzellen (stellate cells)
SD
Stabile Erkrankung (stable disease)
SMC
Glatte Muskelzelle (smooth muscle cells)
TACE
Transarterielle Chemoembolisation
VEGF
Vascular Endothelial Growth Factor
ZK
Im Zellkern/ nukleär
ZP
Zytoplasmatisch
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ZYTOMED Systems GmbH, Formblatt für Id2 Antikörper , Cat. No.: 509-16411
156
9 Danksagungen
Diese Arbeit basiert auf der Zusammenarbeit des Tumorzentrums Ludwig Heilmeyer
– CCCF und dem Institut für Pathologie des Universitätsklinikums Freiburg. Allen
Beteiligten möchte ich hiermit ein großes Dankeschön zukommen lassen, da ohne
ihre Mitarbeit und Zusammenarbeit die Erstellung meiner Dissertation nicht möglich
gewesen wäre. Vielen Dank!
Namentlich möchte ich zuerst meinem Betreuer und Mentor, Herrn PD Dr. med. Jan
Harder für seine herzliche und professionelle Betreuung danken. Trotz der großen
Arbeitsbelastung als neuer Chef der Medizinischen Klinik II im Hegau-BodenseeKlinikum (HBK) Singen, hat er sich (erneut) mit meiner Arbeit ausgiebig beschäftigt
und die Erstkorrektur gelesen.
Ebenso gebührt Frau Prof. Dr. med. A. Schmitt-Gräff mein größter Dank. In
stundenlangen Sitzungen haben wir gemeinsam weit über 600 Präparate unter dem
Mikroskop betrachtet und ausgewertet. Eine sehr mühevolle Aufgabe, die fast
ausschließlich in ihrer Freizeit stattfinden musste. Auch als Zweitkorrektorin konnte
sie mit ihrer enormen Erfahrung entscheidend zur Entstehung der Arbeit beitragen.
Vielen Dank auch Herrn Prof. Dr. med. O. G. Opitz, welcher als Leiter unserer
Arbeitsgruppe mir mit guten Tipps und großzügiger Hilfe stets beistehen konnte.
Ebenso konnte Herr PD Dr. med. Jens Hasskarl mit seinem fundierten Fachwissen
zu dem Themengebiet der ID-Proteine nützliche und unentbehrliche Hilfestellung
bieten.
Auch möchte ich mich bei Frau B. Weinhold, der leitenden Medizinisch-Technischen
Assistentin (MTA) des Instituts für Pathologie, und ihrem Team bedanken. Sie alle
haben den praktischen Teil meiner Arbeit im Labor erst ermöglicht und vor allem
erleichtert. Geduldig und immer ansprechbar war Frau Weinhold mit gutem Rat und
Hilfe zur Stelle. Dem großen Team aller weiteren MTAs möchte ich meinen Dank
aussprechen für ihre Hilfe. Ebenso bedanken möchte ich mich bei Herrn Peter Hilbert
für seine Hilfe im riesigen Archiv.
157
Frau Vera Gumpp (Leiterin klinisches Krebsregister, Comprehensiv Cancer Center
Freiburg) konnte mit Überlebensdaten des Krebsregisters Baden-Württemberg sehr
hilfreich die Patientendaten vervollständigen und kontrollieren. Ohne diese Hilfe wäre
die Datenerhebung bezüglich der Sterbedaten in diesem Umfang nicht möglich
gewesen. Ebenfalls konnte sie bei den statistischen Berechnungen unterstützend
mitwirken. Für ihre Hilfe möchte ich mich sehr herzlich bedanken.
Speziellen Dank für die überaus fruchtbare und freundschaftliche Zusammenarbeit
möchte ich Herrn Dr. med. Michael Müller aussprechen. Als mein „Vorgänger“ konnte
ich sehr von seiner Arbeit und seinen Kontakten profitieren und hoffe, über den einen
oder anderen Literaturaustausch ein wenig zu dem Gelingen seiner Arbeit
beigetragen zu haben.
Zuletzt möchte ich mich bei meiner Familie und speziell bei meiner Frau, Marjloijn
Fuchs-Van Dijk bedanken. Von allen habe ich immer positiven Zuspruch erhalten
und auch in stressigen Zeiten konnte ich immer auf ihre Unterstützung bauen –
vielen Dank an euch alle!
158
10. Lebenslauf
Persönliche Informationen
Name:
Fuchs, Matthias Johannes
Geburtsdatum:
16 September 1981
Geburtsort:
Ulm
Familienstand:
verheiratet seit 2011
Nationalität:
deutsch
Emailadresse:
[email protected]
Ausbildung
Aug. 2010
Berufsstart als Assistenzarzt
Anästhesiologie, städtisches Klinikum Bogenhausen
Mai. 2010
Zweites Staatsexamen
mit der Note 2,5 bestanden
Okt. 2009 – Jan. 2010
Drittes Trimester Praktisches Jahr
Wahlfach Anästhesie, Academisch Medisch Centrum, Amsterdam
Mai. 2009 – Okt. 2009
Zweites Trimester Praktisches Jahr
Chirurgie, 8 Wochen Vrije Universiteit, Amsterdam; 8 Wochen
Heliosklinik, Titisee-Neustadt
Feb. 2009 – Mai 2009
Erstes Trimester Praktisches Jahr
Innere Medizin, Heliosklinik, Titisee-Neustadt
Okt. 2007- Feb. 2009
Weiterführung des Medizinstudiums in Freiburg
Albert-Ludwigs-Universität, Freiburg
Sept. 2006- Juli 2007
Auslandsjahr in den Niederlanden (Sokrates Stipendium)
Medizinische Fakultät der Vrije Universiteit (VU), Amsterdam
Sept. 2005
Erstes Staatsexamen (Physikum)
Mit der Note 2,0 bestanden
Sept. 2003
Beginn Medizinstudium
Albert-Ludwigs-Universität, Freiburg
159
April 2003- Aug. 2003
Beginn Studium Englisch und Sport
Universität Konstanz
Sept. 1996- Juli 2001
Humanistisches Gymnasium
Seminar Blaubeuren/ Maulbronn
Griechisch (5 Jahre), Latein (7 Jahre), Abiturnote: 1,4
Doktorarbeit
April 2008 – Mai 2013
„Expression der ID-Proteine im Hepatozellulärem Karzinom und
deren Bedeutung bezüglich des Gesamtüberlebens“
Sept. 2011
Poster Vorstellung auf der DGVS-Jahrestagung in Leipzig
Praktika
März 2008
Famulatur in der Notaufnahme (30 Tage)
Kreiskrankenhaus Biberach
Nov. 2007 – Dez. 2008
Intensivstation/ Normalstation
Aushilfskraft für Nacht- und Abenddienste im Pflegeteam,
Diakoniekrankenhaus Freiburg
Sept. 2007
Famulatur Chirurgie (30 Tage) (BVMD Stipendium)
Universitair Medisch Centrum, Leiden (Niederlande)
Gefäßchirurgie, Traumatologie und Notaufnahme
Juni 2007
Famulatur Innere Medizin (30 Tage)
Krankenhaus Amstelland, Amstelveen (Niederlande)
Jan. 2007
Famulatur Anästhesie/ Intensivmedizin (30 Tage)
St. Joseph Krankenhaus, Freiburg
März 2005
Freiwilliges Labor Praktikum (zwei Wochen)
Spaarne Krankenhaus, Hoofddorp (Niederlande)
März 2004
Pflegepraktikum (30 Tage)
De Hartekampgroep, Heemstede (Niederlande)
Sept. 2004
Pflegepraktikum (30 Tage)
Kreiskrankenhaus Blaubeuren
Zivildienst
Sept. 2001- Juni 2002
Häusliche Pflege und Betreuung von alten und kranken Menschen,
bei der Arbeiter Wohlfahrt, Konstanz
160